KR20120107479A - 제초제 내성 대두 식물 및 그의 동정 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대두 게놈 내 특정 위치에 특이적 형질전환 이벤트의 스택을 포함하는 것을 특징으로 하는 특이적 유전자이식 대두 식물, 식물 물질 및 종자를 제공한다. 생물학적 시료 내의 이들 이벤트의 신속하고 명확한 동정을 허용하는 도구가 또한 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 특허 출원은 미국 가특허 출원 제61/367,251호(출원일: 2010년 7월 23일); 미국 가특허 출원 제61/263,707호(출원일: 2009년 11월 23일); 및 유럽 특허 출원 제09014565.7호(출원일: 2009년 11월 23일)에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각의 특허 출원 내용은 본 명세서에 이들 전문이 참조로 원용된다.
발명의 기술분야
본 발명은 적어도 2개의 특이적 형질전환 이벤트(specific transformation event)를 포함하며, 특히 제초제 내성을 부여하는 단백질을 암호화하며 각각 대두 게놈 내의 특정 장소에 위치하는 적어도 2 세트의 유전자가 존재하는 것을 특징으로 하는 유전자이식 대두 식물(transgenic soybean plant), 식물 물질(plant material) 및 종자에 관한 것이다. 본 발명의 대두 식물은 제초제(들)의 부재하에 형질전환되지 않은 대두 계통에 균등하고 상이한 유전적 배경하에 작물학적 성과(performance), 유전적 안정성 및 작용성과 함께 제초제 내성 표현형을 조합한다. 본 발명은 생물학적 시료 내에 형질전환 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2 또는 EE-GM1을 특이적으로 포함하는 식물 물질의 존재를 동정하기 위한 방법 및 키트를 추가로 제공한다.
식물 이식유전자의 표현형 발현은 유전자 또는 유전자들 자체의 구조 및 식물 게놈 내 그 또는 그들의 위치 둘 다에 의해 결정된다. 동시에 게놈 내 상이한 위치에서의 이식유전자 또는 "외래 DNA"의 존재는 상이한 방식으로 식물의 전체적인 표현형에 영향을 미친다. 유전자 조작에 의해 식물에 상업적으로 관심 있는 형질을 작물학적으로 또는 산업적으로 성공적으로 도입하는 것은 서로 다른 요인에 따라 매우 긴 작업이 될 수 있다. 유전적으로 형질전환된 식물의 실질적인 형질전환 및 재생(regeneration)은 일련의 선택의 첫 번째 단계일 뿐이며, 이는 광범위한 유전적 특성화(characterization), 육종(breeding) 및 현장 시험에서의 평가, 궁극적으로는 우량 이벤트(elite event)의 선택을 포함한다.
우량 이벤트의 명확한 동정은 신규 식품/사료의 논의, GMO 및 비-GMO 산물(product)의 분리 및 전매 물질의 동정에 비추어 점점 더 중요해지고 있다. 이상적으로, 이러한 동정 방법은 광범위한 실험실 계정(set-up)에 대한 필요없이 빠르고 단순하다. 또한, 이 방법은 전문가의 해석 없이, 그러나 필요하다면 전문가의 감독하에서도 유효한 우량 이벤트의 명확한 결정을 허용하는 결과를 제공하여야 한다. 생물학적 시료에서 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM2의 동정에 사용되는 특정 도구가 본 명세서에 기재되어 있다.
본 발명에서, EE-GM3는 각각 식물-발현성 프로모터의 제어하에 있는 4-하이드록시페닐피루베이트 다이옥시게나제(HPPD) 저해제에 대한 내성을 가지는 유전자와 조합된 글라이포세이트 내성을 암호화하는 유전자를 포함한 제초제 내성 대두(Glycine max)의 개발 중에 유전자이식 대두 식물 개체군으로부터 우량 이벤트로서 동정되었다.
EE-GM1 및 EE-GM2는 식물-발현성 프로모터의 제어하에 있는 글루포시네이트 내성을 암호화하는 유전자를 포함하는 제초제 내성 대두(Glycine max)의 개발 중에 유전자 이식 대두 식물 개체군으로부터 우량 이벤트로 이전에 동정되었으며, 국제 특허 공개 제06/108674호 및 국제 특허 공개 제2006/108675호 (공개공보가 둘 다 본 명세서에 참조에 의해 원용된다)에 기재되어 있다.
제초제 내성 유전자를 포함하는 대두 식물은 당업계에 개시되어 있다. 그러나, 선행기술에 개시된 것의 어느 것도 본 발명을 교시하거나 암시하지 않는다.
대두 식물에서, 수율의 감소 없이 확실히 3가지의 서로 다른 제초제 부류에 대해 충분한 제초제 내성을 제공하면서 허용가능한 작물학적 성과를 나타내는 상업적인 제초제 내성 우량 형질전환 이벤트를 얻는 것이 결코 수월한 일이 아님은 당업계에 공지되어 있다.
정말로, 제초제 내성을 지니는 것으로 시장에 방출된 최초의 대두 이벤트(이벤트 40-3-2)는 (근-)동질유전자 계통과 비교하여 심각한 수율 감소를 나타낸다는 것이 보고되었다(Elmore et al. (2001) Agron. J. 93:408-412).
또한, Optimum(상표명) GAT(상표명) 대두(이벤트 356043)가 글라이포세이트 내성과 ALS 제초제 내성을 조합하기 위하여 개발되었지만, 이들 대두는 단독으로(다른 글라이포세이트 내성 대두 이벤트(예를 들어, 이벤트 40-3-2)와의 조합없이 글라이포세이트 내성에 대한 기준을 충족시키지 못하는 것으로 보고되었다(예를 들어, www.bloomberg.com/apps/news?pid=newsarchive&sid=ad4L0hH9MKWE) 참조).
본 발명은 2mEPSPS 유전자의 암호화 서열을 포함하는 제초제 내성 유전자 및 HPPD-PF W336의 암호화 서열을 포함하는 다른 제초제 내성 유전자(둘 다 본 명세서의 실시예 1.1에 기재되어 있으며 서열번호 1로 나타냄)를 함유하는 발현 카세트와 함께 본 명세서의 실시예 1에 기재되고 서열번호 11로 나타낸 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제의 암호화 서열을 포함하는 제초제 내성 유전자를 함유하는 제2 발현 카세트가 안정하게 게놈에 통합되어 포함된 유전자이식 대두 식물, 또는 그의 종자, 세포 혹은 조직에 관한 것이다. 유전자이식 대두 식물, 또는 그의 종자, 세포 혹은 조직은 글라이포세이트(glyphosate)계, 글루포시네이트(glufosinate)계 및 HPPD 저해제 제초제, 예를 들어 아이소옥사플루톨(isoxaflutole)에 대해 내성을 나타내며, 제초제(들)의 부재하에, 비-유전자이식 동질유전자 계통과 실질적으로 균등한 작물학적 성과를 가진다. 그에 대하여 내성이 제공되는 하나 이상의 제초제를 적용한 후에, 식물은 비-유전자이식 식물과 비교하여 우수한 작물학적 표현형을 갖게 된다.
본 발명에 따르면, 대두 식물, 또는 그의 종자, 세포 혹은 조직은 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함한다.
좀더 구체적으로, 본 발명은 그의 게놈 DNA가 각각 EE-GM3 및 EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역(flanking region)에 지향된 2개의 프라이머(primer)를 사용하고 본 명세서에 기술된 PCR 동정 프로토콜에 의해 분석하는 경우 EE-GM3에 특이적인 단편을 생산하고, 또한 각각 EE-GM1 또는 EE-GM2 및 글루포시네이트 내성 유전자들을 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역에 지향된 2개의 프라이머를 사용하고 본 명세서에 기술된 PCR 동정 프로토콜에 의해 분석하는 경우 EE-GM1 또는 EE-GM2에 특이적인 단편을 생산하는 사실을 특징으로 하는 유전자이식 대두 식물, 그의 종자, 세포 또는 조직에 관한 것이다. EE-GM3 검출용 프라이머는 각각 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 및 서열번호 2 내의 5' 측면 영역에 대항하여 지향될 수 있다. EE-GM3 검출용 프라이머는 각각 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 및 서열번호 3 내의 3' 측면 영역에 대항하여 지향될 수 있는, 예를 들어, 각각 서열번호 5 및 서열번호 4 또는 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 프라이머일 수도 있으며, 100 내지 800 bp의 DNA 단편, 예를 들어, 약 263 bp 또는 약 706 bp의 단편을 생산한다. EE-GM1 검출용 프라이머는 각각 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 및 서열번호 12 내의 5' 측면 영역에 대항하여 지향될 수 있다. EE-GM1 검출용 프라이머는 각각 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 및 서열번호 13 내의 3' 측면 영역에 대항하여 지향될 수 있는, 예를 들어, 각각 서열번호 16 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 프라이머일 수도 있으며, 100 내지 500 bp의 DNA 단편, 예를 들어, 약 183 bp의 단편을 생산한다. EE-GM2 검출용 프라이머는 각각 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 및 서열번호 14 내의 5' 측면 영역에 대항하여 지향될 수 있다. EE-GM2 검출용 프라이머는 각각 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 및 서열번호 15 내의 3' 측면 영역에 대항하여 지향될 수 있는, 예를 들어, 각각 서열번호 18 및 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 프라이머일 수도 있으며, 100 내지 500 bp의 DNA 단편, 예를 들어, 약 151 bp의 단편을 생산한다.
본 발명의 우량 이벤트 EE-GM3를 포함하는 기준 종자는 NCIMB 41659의 수탁번호로 NCIMB에 기탁되어 있다. 본 발명의 우량 이벤트 EE-GM1을 포함하는 기준 종자는 NCIMB 41658의 수탁번호로 NCIMB에 기탁되어 있다. 본 발명의 우량 이벤트 EE-GM2를 포함하는 기준 종자는 NCIMB 41660의 수탁번호로 NCIMB에 기탁되어 있다. 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1을 포함하는 기준 종자는 PTA-11041의 수탁번호로 ATCC에 기탁되어 있다. 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 기준 종자는 PTA-11042의 수탁번호로 ATCC에 기탁되어 있다.
본 발명의 일 실시형태는 우량 이벤트 EE-GM3(NCIMB 41659의 수탁번호로 NCIMB에 기탁된 상기 이벤트를 포함하는 기준 종자) 및 추가로 우량 이벤트 EE-GM1 (NCIMB 41658의 수탁번호로 NCIMB에 기탁된 상기 이벤트를 포함하는 기준 종자)를 포함하는 종자, 또는 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1 (PTA-11041의 수탁번호로 ATCC에 기탁된 상기 이벤트들을 포함하는 기준 종자)를 포함하는 종자로서, 이는 성장하여 적어도 3가지 제초제, 특히 글라이포세이트 및/또는 HPPD 저해제, 예를 들어, 아이소옥사플루톨 및/또는 글루타민 신테타제 저해제, 예를 들어, 글루포시네이트에 내성을 지닌 대두 식물로 될 것이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 우량 이벤트 EE-GM3 (NCIMB 41659의 수탁번호로 NCIMB에 기탁된 상기 이벤트들을 포함하는 기준 종자) 및 추가로 우량 이벤트 EE-GM2 (NCIMB 41660의 수탁번호로 NCIMB에 기탁된 상기 이벤트를 포함하는 기준 종자)를 포함하는 종자, 또는 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2(PTA-11042의 수탁번호로 ATCC에 기탁된 상기 이벤트를 포함하는 기준 종자)를 포함하는 종자로서, 이들은 성장하여 적어도 3가지 제초제, 특히 글라이포세이트 및/또는 HPPD 저해제, 예를 들어, 아이소옥사플루톨 및/또는 글루타민 신테타제 저해제, 예를 들어, 글루포시네이트에 내성을 지닌 대두 식물이 된다.
NCIMB 수탁번호 NCIMB 41659의 종자는 적어도 약 95%의 유전자이식 종자로 구성되고, 우량 이벤트 EE-GM3를 포함하며, 제초제 내성 식물로 성장하여 글라이포세이트 및/또는 아이소옥사플루톨 내성 식물이 되는 종자 소집단(seed lot)이다. 기탁된 종자로부터 얻을 수 있거나 얻어지는 종자 또는 자손(progeny) 종자(예를 들어, 상이한 유전적 배경을 지닌 다른 대두 식물과의 교배의 결과)를 파종할 수 있으며, 성장하는 식물을 본 명세서에 언급된 바와 같이 글라이포세이트 또는 HPPD 저해제, 예를 들어, 아이소옥사플루톨로 처리하여 우량 이벤트 EE-GM3를 포함하는, 글라이포세이트 또는 아이소옥사플루톨-내성 식물을 얻을 수 있다. NCIMB 수탁번호 NCIMB 41658 및 NCIMB 41660의 종자는 적어도 약 95%의 유전자이식 종자로 구성되고, 각각 우량 이벤트 EE-GM1 또는 EE-GM2를 포함하며, 제초제 내성 식물로 성장하여 글루포시네이트-내성 식물이 되는 종자 소집단이다. 종자를 파종할 수 있으며, 성장하는 식물을 본 명세서에 언급된 글루포시네이트로 처리하여 우량 이벤트 EE-GM1 또는 EE-GM2를 포함하는, 글루포시네이트 내성 식물을 얻을 수 있다.
ATCC 수탁번호 PTA-11041의 종자는 적어도 약 95%의 유전자이식 종자로 구성되고, 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM1을 동형접합(homozygous) 형태로 포함하며, 제초제 내성 식물로 성장하여 글라이포세이트, 글루포시네이트 및/또는 아이소옥사플루톨 내성 식물이 되는 종자 소집단이다. 기탁된 종자로부터 얻을 수 있거나 얻어지는 종자 또는 자손 종자(예를 들어, 상이한 유전적 배경을 갖는 다른 대두 식물과의 교배의 결과)를 파종할 수 있으며, 성장하는 식물을 본 명세서에 언급된 바와 같이 글라이포세이트, 글루포시네이트 및/또는 HPPD 저해제, 예를 들어, 아이소옥사플루톨로 처리하여 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1을 포함하는, 글라이포세이트, 글루포시네이트 및/또는 아이소옥사플루톨-내성 식물을 얻을 수 있다.
ATCC 수탁번호 PTA-11042의 종자는 적어도 약 95%의 유전자이식 종자로 구성되고, 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM2를 동형접합 형태로 포함하며, 제초제 내성 식물로 성장하여 글라이포세이트, 글루포시네이트 및/또는 아이소옥사플루톨 내성 식물이 되는 종자 소집단이다. 기탁된 종자로부터 얻을 수 있거나 얻어지는 종자 또는 자손 종자(예를 들어, 상이한 유전적 배경을 갖는 다른 대두 식물과의 교배의 결과)를 파종할 수 있으며, 성장하는 식물을 본 명세서에 언급된 바와 같이 글라이포세이트, 글루포시네이트 및/또는 HPPD 저해제, 예를 들어, 아이소옥사플루톨로 처리하여 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는, 글라이포세이트, 글루포시네이트 및/또는 아이소옥사플루톨-내성 식물을 얻을 수 있다.
본 발명은 추가로, PTA-11041의 번호로 ATCC에 기탁된 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1을 포함하는 식물을 성장시키거나, NCIMB 41659의 수탁번호로 NCIMB에 기탁된 종자로부터 우량 이벤트 EE-GM3를 포함하는 식물을 성장시키고 상기 식물을 NCIMB 41658의 수탁번호로 NCIMB에 기탁된 종자로부터 성장시킨 우량 이벤트 EE-GM1을 포함하는 식물과 교배시킴으로써 얻어질 수 있으며 우량 이벤트 EE-GM3 및 추가로 우량 이벤트 EE-GM1을 포함하는 식물의 세포, 조직, 자손 및 후손(descendant)에 관한 것이다. 본 발명은 또한, PTA-11042의 번호로 ATCC에 기탁된 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 식물을 성장시키거나, NCIMB 41659의 수탁번호로 NCIMB에 기탁된 종자로부터 우량 이벤트 EE-GM3를 포함하는 식물을 성장시키고 상기 식물을 NCIMB 41660의 수탁번호로 NCIMB에 기탁된 종자로부터 성장시킨 우량 이벤트 EE-GM2를 포함하는 식물과 교배시킴으로써 얻어질 수 있으며 우량 이벤트 EE-GM3 및 추가로 우량 이벤트 EE-GM2를 포함하는 식물의 세포, 조직, 자손 및 후손에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 바로 위에 기술한 대두 식물 또는 종자로부터 얻어질 수 있는(예를 들어, 이들의 전파 및/또는 육종에 의해) 식물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 대두 식물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 유전자이식 식물, 세포 또는 조직 내의 특성화(characterizing) DNA 서열 또는 이러한 DNA 서열에 의해 암호화된 아미노산의 존재를 동정하는 것에 기초하여 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 유전자이식 식물, 또는 그의 세포 혹은 조직을 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직일 실시형태에 따르면, 이러한 특성화 DNA 서열은 적어도 15bp, 15bp, 적어도 20bp, 20bp, 또는 30bp 이상의 서열로서 이벤트의 삽입 부위, 즉, 제초제 내성 유전자를 포함하는 삽입된 외래 DNA의 일부 및 그와 인접한 대두 게놈(5' 또는 3' 측면 영역)의 일부를 모두 포함하여 우량 이벤트의 특이적 동정을 가능하게 한다.
본 발명은 추가로 EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM3 및 EE-GM2 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 및/또는 3' 측면 서열을 특이적으로 인식하는 프라이머 또는 프로브(probe)에 기초하여, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1 또는 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 동정하는 방법에 관한 것이다.
좀더 구체적으로, 본 발명은 각각 적어도 2개의 프라이머를 사용하는 2가지 중합효소 연쇄 반응 또는 적어도 4개의 프라이머를 사용하는 1가지 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 생물학적 시료 내에 존재하는 2개의 핵산 서열을 증폭시켜, 바람직하게는 100 내지 800 bp의 2개 DNA 단편을 얻는 것을 포함하며, 여기에서 첫 번째 프라이머는 EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 인식하고, 두 번째 프라이머는 EE-GM3의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 내의 서열을 인식하며, 세 번째 프라이머는 EE-GM1 또는 EE-GM2 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 인식하고, 네 번째 프라이머는 EE-GM1 또는 EE-GM2의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 방법에 관한 것이다. EE-GM3를 동정하기 위한 프라이머는 각각 EE-GM3의 5' 측면 영역(서열번호 2의 위치 1 내지 위치 1451) 내 또는 EE-GM3의 3' 측면 영역(서열번호 3의 위치 241 내지 위치 1408의 상보 서열(complement)) 내의 서열 및 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA(서열번호 2의 위치 1452 내지 1843의 상보 서열 또는 서열번호 3의 위치 1 내지 위치 240, 또는 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638 또는 상보 서열) 내의 서열을 인식할 수 있다. 3' 측면 영역을 인식하는 프라이머는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며, 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 프라이머는 본 명세서에 기술된 서열번호 4 또는 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. EE-GM1을 동정하기 위한 프라이머는 각각 EE-GM1의 5' 측면 영역 내의 서열(서열번호 12의 위치 1 내지 위치 209) 또는 EE-GM1의 3' 측면 영역(서열번호 13의 위치 569 내지 위치 1000의 상보 서열) 내의 서열 및 EE-GM1의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA(서열번호 12의 위치 210 내지 720의 상보 서열, 또는 서열번호 13의 위치 1 내지 위치 568) 내의 서열을 인식할 수 있다. EE-GM1의 5' 측면 영역을 인식하는 프라이머는 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며, EE-GM1의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 프라이머는 본 명세서에 기술된 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. EE-GM2를 동정하기 위한 프라이머는 각각 EE-GM2의 5' 측면 영역 내(서열번호 14의 위치 1 내지 위치 311) 또는 EE-GM2의 3' 측면 영역(서열번호 15의 위치 508 내지 위치 1880의 상보 서열) 내의 서열 및 EE-GM1의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA(서열번호 14의 위치 312 내지 810의 상보 서열, 또는 서열번호 15의 위치 1 내지 위치 507) 내의 서열을 인식할 수 있다. EE-GM2의 3' 측면 영역을 인식하는 프라이머는 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며, EE-GM2의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 프라이머는 본 명세서에 기술된 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. PCR 증폭은 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.
좀더 구체적으로, 본 발명은 각각 서열번호 4 및 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 2개의 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응으로 약 263 bp의 DNA 단편을 얻거나, 각각 서열번호 5 및 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 2개의 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄반응으로 약 706 bp의 DNA 단편을 얻고, 각각 서열번호 16 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 2개의 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응으로 약 183 bp의 DNA 단편을 얻어 생물학적 시료 내에 존재하는 적어도 2개의 핵산 서열을 증폭시키는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1을 동정하는 방법에 관한 것이다. 2가지 중합효소 연쇄 반응은 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.
좀더 구체적으로, 본 발명은 각각 서열번호 4 및 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 2개의 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응을 이용해서 생물학적 시료 내에 존재하는 적어도 2개의 핵산 서열을 증폭시켜 약 263 bp의 DNA 단편을 얻거나, 각각 서열번호 5 및 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 2개의 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄반응을 이용해서 생물학적 시료 내에 존재하는 적어도 2개의 핵산 서열을 증폭시켜 약 706 bp의 DNA 단편을 얻고, 또한 각각 서열번호 18 및 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 2개의 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응을 이용해서 생물학적 시료 내에 존재하는 적어도 2개의 핵산 서열을 증폭시켜 약 151 bp의 DNA 단편을 얻는 것을 포함하는, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 동정하는 방법에 관한 것이다. 2가지 중합효소 연쇄 반응은 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.
본 발명은 추가로 생물학적 시료 내 EE-GM3 및 EE-GM1의 동시 존재에 대한 특이적 동정 방법을 개발하기 위해 사용될 수 있으며, EE-GM1의 특이적 측면 서열과 조합된 본 명세서 기재의 EE-GM3의 특이적 측면 서열에 관한 것이다. 이와 같이 조합된 특이적 측면 서열은 동정 검정(identification assay)에서 기준 대조군 물질로서도 사용될 수 있다. 좀더 특히, 본 발명은 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같은 특이적 프라이머 및 프로브의 개발에 사용될 수 있는, EE-GM1의 5' 및/또는 3' 측면 영역과 조합된 EE-GM3의 5' 및/또는 3' 측면 영역에 관한 것이다. 또한 기준 물질로서 적합한 것은 서열번호 16 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 프라이머에 의해 증폭될 수 있는 서열을 포함하는 핵산 분자와 조합된, 서열번호 7 및 서열번호 5 또는 서열번호 4 및 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 프라이머에 의해 증폭될 수 있는 서열을 포함하며, 바람직하게는 약 150 내지 850 bp의 핵산 분자이며, 특히 이러한 핵산 분자는 EE-GM3 및 EE-GM1을 포함하는 물질 내의 이러한 프라이머를 사용하여 얻어진다.
본 발명은 또한 추가로 생물학적 시료 내 EE-GM3 및 EE-GM2의 동시 존재에 대한 특이적 동정 방법을 개발하기 위해 사용될 수 있으며, EE-GM2의 특이적 측면 서열과 조합된 본 명세서 기재의 EE-GM3의 특이적 측면 서열에 관한 것이다. 이와 같이 조합된 특이적 측면 서열은 동정 검정에서 기준 대조군 물질로서도 사용될 수 있다. 좀더 특히, 본 발명은 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같은 특이적 프라이머 및 프로브의 개발에 사용될 수 있는, EE-GM2의 5' 및/또는 3' 측면 영역과 조합된 EE-GM3의 5' 및/또는 3' 측면 영역에 관한 것이다. 또한 기준 물질로서 적합한 것은 서열번호 18 및 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 프라이머에 의해 증폭될 수 있는 서열을 포함하는 핵산 분자와 조합된, 서열번호 7 및 서열번호 5 또는 서열번호 4 및 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 프라이머에 의해 증폭될 수 있는 서열을 포함하며, 바람직하게는 약 150 내지 850 bp의 핵산 분자이며, 특히 이러한 핵산 분자는 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 물질 내의 이러한 프라이머를 사용하여 얻어진다.
본 발명은 추가로 이와 같이 특이적인 프라이머 또는 프로브를 사용함에 기초하여, 생물학적 시료에서 EE-GM3 및 EE-GM1의 동시 존재하는 것을 동정하는 방법에 관한 것이다. EE-GM3 검출에 대한 프라이머는, 예를 들어 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 약 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열과 같이, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 약 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나, 구성되거나, 필수적으로 구성된 프라이머와 조합된, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열로부터 선택된 17 내지 약 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나, 구성되거나, 필수적으로 구성될 수 있다. EE-GM1 검출에 대한 프라이머는, 예를 들어 서열번호 12의 뉴클레오타이드 219 내지 뉴클레오타이드 720의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열상보 서열 서열번호 13의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 568의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 약 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열과 같이, 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 약 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나, 구성되거나, 필수적으로 구성된 프라이머와 조합된, 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 209의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 뉴클레오타이드 1000의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열로부터 선택된 17 내지 약 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나, 구성되거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 프라이머는 또한 그들의 3' 최말단에 위치한 이들 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고, 관련없는 서열 또는 언급된 뉴클레오타이드 서열에서 유래하지만 불일치(mismatch)를 포함하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 이와 같이 특이적인 프라이머 또는 프로브의 사용에 기초하여, 생물학적 시료에서 EE-GM3 및 EE-GM2의 동시 존재를 동정하는 방법에 관한 것이다. EE-GM3 검출에 대한 프라이머는 이전 단락에 기술한 17 내지 약 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나, 구성되거나 필수적으로 구성될 수 있다. EE-GM2 검출에 대한 프라이머는, 예를 들어 서열번호 14의 뉴클레오타이드 312 내지 뉴클레오타이드 810의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 507의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 약 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열 등과 같이, 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 약 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나, 구성되거나, 필수적으로 구성된 프라이머와 조합된, 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 311의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 뉴클레오타이드 1880의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열로부터 선택된 17 내지 약 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나, 구성되거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 프라이머는 또한 그들의 3' 최말단에 위치한 이들 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고, 관련없는 서열 또는 언급된 뉴클레오타이드 서열에서 유래하지만 불일치를 포함하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 EE-GM3의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 적어도 하나의 프라이머 또는 프로브 및 EE-GM1의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 적어도 하나의 프라이머 또는 프로브를 포함하며, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1을 동정하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 EE-GM3의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 적어도 하나의 프라이머 또는 프로브 및 EE-GM2의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 적어도 하나의 프라이머 또는 프로브를 포함하며, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 동정하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 또한 EE-GM3의 5' 또는 3' 측면 영역 및 EE-GM1의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 프라이머 이외에, EE-GM3의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 내의 서열을 특이적으로 인식하는 추가의 프라이머 및 EE-GM1의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 내의 서열을 특이적으로 인식하는 추가의 프라이머를 포함할 수 있으며, PCR 동정 프로토콜에 사용된다.
본 발명의 키트는 EE-GM3의 5' 또는 3' 측면 영역 및 EE-GM2의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 프라이머 이외에, EE-GM3의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 내의 서열을 특이적으로 인식하는 추가의 프라이머 및 EE-GM2의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 내의 서열을 특이적으로 인식하는 추가의 프라이머를 포함할 수 있으며, PCR 동정 프로토콜에 사용된다.
EE-GM3의 3' 측면 영역을 인식하는 프라이머는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고, EE-GM3의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 또는 이식유전자를 인식하는 프라이머는 서열번호 4 또는 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며, 또는 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있는 EE-GM1의 5' 측면 영역을 인식하는 프라이머 및 EE-GM1의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 이식유전자를 인식하는 프라이머와 조합된, 본 명세서에 기술된 EE-GM3 검출용 임의의 기타 프라이머 또는 프라이머 조합은 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
EE-GM3의 3' 측면 영역을 인식하는 프라이머는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고, EE-GM3의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 또는 이식유전자를 인식하는 프라이머는 서열번호 4 또는 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며, 또는 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있는 EE-GM2의 5' 측면 영역을 인식하는 프라이머 및 EE-GM2의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 이식유전자를 인식하는 프라이머와 조합된, 본 명세서에 기술된 EE-GM3 검출용 임의의 기타 프라이머 또는 프라이머 조합은 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 서열번호 5 및 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 PCR 프라이머와 서열번호 16 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 PCR 프라이머를 포함하며, EE-GM3/EE-GM1 PCR에 기초한 동정에 사용하기 위한, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1을 동정하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 서열번호 5 및 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 PCR 프라이머와 서열번호 18 및 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 PCR 프라이머를 포함하며, EE-GM3/EE-GM2 PCR에 기초한 동정에 사용하기 위한, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 동정하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한, EE-GM3의 특이적 영역과 80% 내지 100%의 서열 동일성(identity)을 갖는 서열에 상응하는(또는 상보적인) 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 제1 프로브 및 EE-GM1의 특이적 영역과 80% 내지 100%의 서열 동일성을 지닌 서열에 상응하는(또는 상보적인) 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 제2 프로브의 2가지 특이적 프로브를 포함하며, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1를 동정하기 위한 키트에 관한 것이다. 바람직하게는, 제1 프로브 서열은 EE-GM3의 5' 또는 3' 측면 영역의 일부를 포함하는 특이적 영역에 상응하며, 제2 프로브는 EE-GM1의 5' 또는 3' 측면 영역의 일부를 포함하는 특이적 영역에 상응한다. 가장 바람직하게는, EE-GM3 특이적 프로브는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1441 내지 1462의 서열과 80% 내지 100%의 서열 동일성을 지닌 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 220 내지 260의 서열과 80% 내지 100%의 서열 동일성을 지닌 서열(또는 그에 상보적인 서열)을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성되며, EE-GM1 특이적 프로브는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 199 내지 220의 서열과 80% 내지 100%의 서열 동일성을 지닌 서열 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 558 내지 579의 서열과 80% 내지 100%의 서열 동일성을 지닌 서열(또는 그에 상보적인 서열)을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된다.
본 발명은 또한, EE-GM3의 특이적 영역과 80% 내지 100%의 서열 동일성을 지닌 서열에 상응하는(또는 상보적인) 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 제1 프로브 및 EE-GM2의 특이적 영역과 80% 내지 100%의 서열 동일성을 지닌 서열에 상응하는(또는 상보적인) 서열을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된 제2 프로브의 2가지 특이적 프로브를 포함하며, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 동정하기 위한 키트에 관한 것이다. 바람직하게는, 제1 프로브 서열은 EE-GM3의 5' 또는 3' 측면 영역의 일부를 포함하는 특이적 영역에 상응하며, 제2 프로브는 EE-GM2의 5' 또는 3' 측면 영역의 일부를 포함하는 특이적 영역에 상응한다. 가장 바람직하게는, EE-GM3 특이적 프로브는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1441 내지 1462의 서열과 80% 내지 100%의 서열 동일성을 지닌 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 220 내지 260의 서열과 80% 내지 100%의 서열 동일성을 지닌 서열(또는 그에 상보적인 서열)을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성되며, EE-GM2 특이적 프로브는 서열번호 14의 뉴클레오타이드 301 내지 322의 서열과 80% 내지 100%의 서열 동일성을 지닌 서열 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 497 내지 518의 서열과 80% 내지 100%의 서열 동일성을 지닌 서열(또는 그에 상보적인 서열)을/로 포함하거나 (필수적으로) 구성된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 이벤트의 접합(junction) 부위를 포함하며 대두 게놈 DNA 및 각 이벤트의 제초제 내성 유전자(이식유전자)를 포함하는 외래 DNA 모두의 폴리뉴클레오타이드를 충분한 길이로 포함함으로써 EE-GM3 및 EE-GM1의 검출에 프라이머 또는 프로브로서 유용한 DNA 서열이 개시된다. 이러한 서열은 각각 접합 부위의 각 면에서 대두 게놈 DNA의 적어도 9개의 뉴클레오타이드 및 EE-GM3 또는 EE-GM1의 제초제 내성 유전자(이식유전자)를 포함하는 외래 DNA의 유사한 수의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 이러한 DNA 서열은 대두 게놈 DNA의 적어도 9개의 뉴클레오타이드 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 내의 접합 부위와 인접한 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 유사한 수의 뉴클레오타이드, 및 대두 게놈 DNA의 적어도 9개의 뉴클레오타이드 및 서열번호 12 또는 서열번호 13 내의 접합 부위와 인접한 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 유사한 수의 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 이벤트의 접합 부위를 포함하며 대두 게놈 DNA 및 각 이벤트의 제초제 내성 유전자(이식유전자)를 포함하는 외래 DNA 모두의 폴리뉴클레오타이드를 충분한 길이로 포함함으로써 EE-GM3 및 EE-GM2의 검출에 프라이머 또는 프로브로서 유용한 DNA 서열이 개시된다. 이러한 서열은 각각 삽입 부위 각각의 면에서 대두 게놈 DNA의 적어도 9개의 뉴클레오타이드 및 EE-GM3 또는 EE-GM2의 제초제 내성 유전자(이식유전자)를 포함하는 외래 DNA의 유사한 수의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 이러한 DNA 서열은 대두 게놈 DNA의 적어도 9개의 뉴클레오타이드 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 내의 접합 부위와 인접한 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 유사한 수의 뉴클레오타이드, 및 대두 게놈 DNA의 적어도 9개의 뉴클레오타이드 및 서열번호 14 또는 서열번호 15 내의 접합 부위와 인접한 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 유사한 수의 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명에 포함되는 방법 및 키트는 예를 들어 식물, 식물 물질 또는 산물, 예를 들어, 식물 물질을 포함하거나 이로부터 유래된 식품 또는 사료 산물(신선 또는 가공) 내 EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM3 및 EE-GM2 존재의 동정 또는 (더 낮은) 기준점의 결정과 같이 상이한 목적에 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며; 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 방법 및 키트는 유전자이식 및 비유전자이식 물질 사이의 분리를 목적으로 유전자이식 식물 물질을 동정하기 위해 사용될 수 있고; 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 방법 및 키트는 EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM3 및 EE-GM1을 포함하는 식물 물질의 품질(즉, 순수 물질의 퍼센트)을 결정하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 EE-GM1 또는 EE-GM2의 5' 및/또는 3' 측면 서열로부터 개발된 특이적 프라이머 및 프로브와 조합된 EE-GM3 GM3의 5' 및/또는 3' 측면 영역뿐만 아니라, EE-GM1 또는 EE-GM2의 5' 및/또는 3' 측면 서열로부터 개발된 특이적 프라이머 및 프로브와 조합된 EE-GM3의 5' 및/또는 3' 측면 서열로부터 개발된 특이적 프라이머 및 프로브에 관한 것이다.
본 발명은 또한 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1을 포함하는 식물 또는 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 식물로부터 얻어진 게놈 DNA에 관한 것이다. 이러한 게놈 DNA는 본 명세서에 기술된 동정 검정에서 기준 대조군 물질로 사용될 수 있다.
본 발명에서, 각각 적어도 2가지 우량 이벤트를 포함하는 유전자이식 제초제 내성 대두 식물 또는 그의 세포, 부분, 종자 또는 자손이 제공되며, 여기에서 제1 우량 이벤트는 i) 식물-발현성 프로모터의 제어하에서 글라이포세이트 내성 EPSPS 효소를 암호화하는 제아 메이즈(Zea mays) 유래의 개질된 epsps 유전자를 포함하는 제1 키메릭 유전자, 및 ii) 식물-발현성 프로모터의 제어하에서 HPPD 저해제 제초제 내성 효소를 암호화하는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 유래의 개질된 hppd 유전자를 포함하는 제2 키메릭 유전자를 포함하는 외래 DNA를 포함하고, 제2 우량 이벤트는 식물-발현성 프로모터의 제어하에서 글루포시네이트(또는 포스피노트리신) 아세틸트랜스퍼라제 효소를 암호화하는 스트렙토마이세스 비리도크로모겐즈(Streptomyces viridochromogenes) 유래의 개질된 글루포시네이트 내성 유전자를 포함하는 (제3) 키메릭 유전자를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 제1 우량 이벤트는 상기 외래 DNA의 바로 업스트림 위치에서 인접하고 있는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 1451 및 상기 외래 DNA의 바로 다운스트림 위치에서 인접하고 있는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 1408을 포함하며, 상기 제2이벤트는 상기 외래 DNA의 바로 업스트림 위치에서 인접하고 있는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 209 및 상기 외래 DNA의 바로 다운스트림 위치에서 인접하고 있는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 1000을 포함하거나, 상기 제2이벤트는 상기 외래 DNA의 바로 업스트림 위치에서 인접하고 있는 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 311 및 상기 외래 DNA의 바로 다운스트림 위치에서 인접하고 있는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 1880을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 상기 우량 이벤트는 PTA-11041 또는 PTA-11042의 수탁번호로 ATCC에 기탁된 이벤트를 포함하는 기준 종자로부터 성장한 대두 식물과 번식시켜 얻거나, NCIMB 41659의 수탁번호로 NCIMB에 기탁된 제1이벤트를 포함하는 기준 종자로부터 얻고, NCIMB 41658 또는 NCIMB 41660의 수탁번호로 NCIMB에 기탁된 제2이벤트를 포함하는 기준 종자로부터 얻을 수 있다.
다른 실시형태에서, 상기 대두 식물 또는 그의 세포, 부분, 종자 또는 자손의 게놈 DNA는 각각 서열번호 4 및 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 2가지 프라이머를 사용하여 제1 우량 이벤트에 대한 우량 이벤트 동정 프로토콜로 분석하는 경우 약 263 bp 또는 263 bp의 DNA 단편을 생산하며, 각각 서열번호 16 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 2가지 프라이머를 사용하여 제2 우량 이벤트에 대한 우량 이벤트 동정 프로토콜로 분석하는 경우 약 183 bp 또는 183 bp의 DNA 단편을 생산하고, 각각 서열번호 18 및 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 2가지 프라이머를 사용하는 경우 약 151 bp 또는 151 bp의 DNA 단편을 생산한다.
또한, 본 발명에 의해 2개의 우량 이벤트를 포함하는 유전자이식 대두 식물 또는 그의 세포, 부분, 종자 또는 자손을 동정하는 방법이 제공되며, 여기에서 상기 식물, 세포, 종자 또는 자손은 생물학적 시료 내의 글라이포세이트, 글루포시네이트 및 HPPD 저해제 제초제(예를 들어, 아이소옥사플루톨)에 대해 내성을 나타내며, 상기 방법은 적어도 2개의 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 생물학적 시료 내에 존재하는 제1이벤트의 핵산으로부터 100 내지 500 bp의 DNA 단편을 증폭시키는 것을 포함하며, 여기에서 상기 프라이머 중 하나는 상기 특정된 제1 우량 이벤트의 5' 측면 영역을 인식하고, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 제1 우량 이벤트의 3' 측면 영역을 인식하고, 상기 3' 측면 영역은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 프라이머 중 다른 하나의 프라이머는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 제1이벤트의 외래 DNA 내의 서열을 인식하며, 적어도 2개의 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 생물학적 시료 내에 존재하는 제2이벤트의 핵산으로부터 50 내지 1000 bp, 또는 100 내지 500 bp의 DNA 단편을 증폭시키는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 프라이머 중 하나는 상기 특정된 제2 우량 이벤트의 5' 측면 영역을 인식하고, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 209의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 제2 우량 이벤트의 3' 측면 영역을 인식하고, 상기 3' 측면 영역은 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 1000의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 프라이머 중 다른 하나의 프라이머는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 210 내지 뉴클레오타이드 720의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 568의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 제2이벤트의 외래 DNA 내의 서열을 인식한다.
또한, 본 발명에 의해 2개의 우량 이벤트를 포함하는 유전자이식 대두 식물 또는 그의 세포, 부분, 종자 또는 자손을 동정하는 방법이 제공되며, 여기에서 상기 식물, 세포, 종자 또는 자손은 생물학적 시료 내의 글라이포세이트, 글루포시네이트 및/또는 HPPD 저해제 제초제(예를 들어, 아이소옥사플루톨)에 대해 내성을 나타내며, 상기 방법은 적어도 2개의 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 생물학적 시료 내에 존재하는 제1이벤트의 핵산으로부터 50 내지 1000 또는 100 내지 500 bp의 DNA 단편을 증폭시키는 것을 포함하며, 여기에서 상기 프라이머 중 하나는 상기 특정된 제1 우량 이벤트의 5' 측면 영역을 인식하고, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 제1 우량 이벤트의 3' 측면 영역을 인식하고, 상기 3' 측면 영역은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 프라이머 중 다른 하나의 프라이머는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 제1이벤트의 외래 DNA 내의 서열을 인식하며, 적어도 2개의 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 생물학적 시료 내에 존재하는 제2이벤트의 핵산으로부터 50 내지 1000 bp, 또는 100 내지 500 bp의 DNA 단편을 증폭시키는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 프라이머 중 하나는 상기 특정된 제2 우량 이벤트의 5' 측면 영역을 인식하고, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 311의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 제2 우량 이벤트의 3' 측면 영역을 인식하고, 상기 3' 측면 영역은 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 1880의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 프라이머 중 다른 하나의 프라이머는 서열번호 14의 뉴클레오타이드 312 내지 뉴클레오타이드 810의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 507의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 제2이벤트의 외래 DNA 내의 서열을 인식한다.
또한, 본 발명에 의해 2개의 우량 이벤트를 포함하며 생물학적 시료 내의 글라이포세이트, 글루포시네이트 및 HPPD 저해제 제초제(예를 들어, 아이소옥사플루톨)에 대해 내성을 나타내는 유전자이식 대두 식물 또는 그의 세포, 부분, 종자 또는 자손을 동정하기 위한 키트가 제공되며, 상기 키트는 상기 특정된 제1 우량 이벤트의 5' 측면 영역을 인식하며 여기에서 5' 측면 영역은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나의 프라이머, 또는 제1 우량 이벤트의 3' 측면 영역을 인식하며 여기에서 3' 측면 영역은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나의 프라이머, 및 상기 제1이벤트의 외래 DNA 내의 서열을 인식하며 여기에서 외래 DNA는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나의 프라이머를 포함하고, 상기 키트는 상기 특정된 제2 우량 이벤트의 5' 측면 영역을 인식하며 여기에서 5' 측면 영역은 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 209의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나의 프라이머, 또는 제2 우량 이벤트의 3' 측면 영역을 인식하며 여기에서 3' 측면 영역은 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 1000의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나의 프라이머, 서열번호 12의 뉴클레오타이드 210 내지 뉴클레오타이드 720의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 568의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 제2이벤트의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머의 다른 프라이머를 포함한다.
또한, 본 발명에 의해 2개의 우량 이벤트를 포함하며 생물학적 시료 내의 글라이포세이트, 글루포시네이트 및 HPPD 저해제 제초제(예를 들어, 아이소옥사플루톨)에 대해 내성을 나타내는 유전자이식 대두 식물 또는 그의 세포, 부분, 종자 또는 자손을 동정하기 위한 키트가 제공되며, 상기 키트는 상기 특정된 제1 우량 이벤트의 5' 측면 영역을 인식하며 여기에서 5' 측면 영역은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나의 프라이머, 또는 제1 우량 이벤트의 3' 측면 영역을 인식하며 여기에서 3' 측면 영역은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나의 프라이머, 및 상기 제1이벤트의 외래 DNA 내의 서열을 인식하며 여기에서 외래 DNA는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나의 프라이머를 포함하고, 상기 키트는 상기 특정된 제2 우량 이벤트의 5' 측면 영역을 인식하며 여기에서 5' 측면 영역은 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 311의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나의 프라이머, 또는 제2 우량 이벤트의 3' 측면 영역을 인식하며 여기에서 3' 측면 영역은 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 1880의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나의 프라이머, 서열번호 14의 뉴클레오타이드 312 내지 뉴클레오타이드 810의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 507의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 제2이벤트의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머의 다른 프라이머를 포함한다.
또한, 본 발명에 의해 게놈 내에 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 97, 98, 또는 적어도 99% 또는 99.5%의 서열 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 2257 내지 뉴클레오타이드 위치 16601의 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 상보 서열, 또는 서열번호 20에 대해 적어도 97, 98, 또는 적어도 99% 또는 99.5%의 서열 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하고, 게놈 내에 EE-GM1 또는 EE-GM2의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열에 대해 적어도 97, 98, 또는 적어도 99% 또는 99.5%의 서열 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하며, EE-GM1을 포함하는 기준 종자는 NCIMB 41658의 수탁번호로 기탁되고, EE-GM2를 포함하는 기준 종자는 NCIMB 41660의 수탁번호로 기탁된, 대두 식물, 식물 세포, 조직 또는 종자가 제공된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 상기 식물, 식물 세포, 조직 또는 종자 내의 EE-GM1 또는 EE-GM2의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12 또는 13 내의 DNA 서열(예를 들어 외래 DNA 서열), 또는 서열번호 14 또는 15 내의 DNA 서열(예를 들어 외래 DNA 서열), 또는 서열번호 12 서열의 첫 번째 뉴클레오타이드와 서열번호 13 서열의 마지막 뉴클레오타이드 사이에 서열번호 12 및 13을 포함하는 식물 게놈(예를 들어 본 발명의 EE-GM1 또는 EE-GM2를 포함하는 기탁된 종자) 내의 DNA 서열, 또는 서열번호 14 서열의 첫 번째 뉴클레오타이드와 서열번호 15 서열의 마지막 뉴클레오타이드 사이에 서열번호 14 및 15를 포함하는 식물 게놈 내의 DNA 서열이다.
본 발명의 일 실시형태는 게놈 내에 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열에 혼성화되거나, 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열에 혼성화되거나, 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열에 혼성화되는 핵산 분자를 포함하고, 게놈 내에 EE-GM1 또는 EE-GM2의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열에 혼성화되는 핵산 분자를 포함하며, EE-GM1을 포함하는 기준 종자는 NCIMB 41658의 수탁번호로 기탁되고, EE-GM2를 포함하는 기준 종자는 NCIMB 41660의 수탁번호로 기탁된, 대두 식물, 식물 세포, 조직 또는 종자를 제공한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 상기 식물, 식물 세포, 조직 또는 종자 내의 EE-GM1 또는 EE-GM2의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12 또는 13 내의 외래 DNA, 또는 서열번호 14 또는 15 내의 외래 DNA, 또는 서열번호 12 서열의 첫 번째 뉴클레오타이드와 서열번호 13 서열의 마지막 뉴클레오타이드 사이에 서열번호 12 및 13을 포함하는 식물 게놈(예를 들어 본 발명의 EE-GM1 또는 EE-GM2를 포함하는 기탁된 종자) 내의 외래 DNA 서열, 또는 서열번호 14 서열의 첫 번째 뉴클레오타이드와 서열번호 15 서열의 마지막 뉴클레오타이드 사이에 서열번호 14 및 15를 포함하는 식물 게놈 내의 외래 DNA 서열이다.
기재된 특정 실시형태로 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는 하기 실시예는 참조로 본 명세서에 첨부된 도면과 연관지어 이해될 수 있다.
도 1: 언급된 뉴클레오타이드 서열 및 우량 이벤트 EE - GM3 에 대한 프라이머 간의 관계를 나타낸 개략도. 검정색 막대: 외래 DNA; 빗금친 막대: 식물 유래의 DNA; 바둑판무늬 화살표 (a): 키메릭 HPPD PF W366 암호화 유전자(키메릭 유전자의 조성에 대한 표 1 참조); 빗금친 화살표 (b): 키메릭 2mEPSPS 암호화 유전자(키메릭 유전자의 조성에 대한 표 1 참조); 검정색 화살표: 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 막대 밑의 숫자는 뉴클레오타이드 위치를 나타냄; (c)는 표시된 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열을 지칭함; 주: 도식은 축척에 따라 도시되지 않음.
도 2: EE - GM3 에 대해 개발된 PCR 동정 프로토콜에 의해 얻어진 결과. 겔의 로딩 순서: 레인 1: 분자량 마커(100 bp ladder); 레인 2 및 3: 유전자이식 이벤트 EE-GM3를 포함하는 대두 식물 유래의 DNA 시료; 레인 4-7: 우량 이벤트 EE-GM3를 포함하지 않고 동일한 제초제 내성 유전자(기타 형질전환 이벤트)를 포함하는 유전자이식 대두 식물 유래의 DNA 시료; 레인 8: 야생형 대두 유래의 DNA 시료; 레인 9: 주형 DNA 대조군 없음(no template DNA control); 레인 10: 분자량 마커.
도 3: 언급된 뉴클레오타이드 서열 및 우량 이벤트 EE - GM1 에 대한 프라이머 사이의 관계를 나타내는 도식. 검정색 막대: 외래 DNA; 빗금친 막대: 식물 유래의 DNA; 가로 줄무늬 화살표 (d): 키메릭 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 암호화 유전자(키메릭 유전자의 조성에 대한 서열번호 11 참조); 검정색 화살표: 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 막대 밑의 숫자는 뉴클레오타이드 위치를 나타냄; (c)는 표시된 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열을 지칭함; 주: 도식은 축척에 따라 도시되지 않음.
도 4: 언급된 뉴클레오타이드 서열 및 우량 이벤트 EE - GM2 에 대한 프라이머 사이의 관계를 나타내는 도식. 검정색 막대: 외래 DNA; 빗금친 막대: 식물 유래의 DNA; 가로 줄무늬 화살표 (d): 키메릭 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 암호화 유전자(키메릭 유전자의 조성에 대한 서열번호 11 참조); 검정색 화살표: 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 막대 밑의 숫자는 뉴클레오타이드 위치를 나타냄; (c)는 표시된 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열을 지칭함; NA: 해당 없음. 주: 도식은 축척에 따라 도시되지 않음.
도 5: EE - GM1 에 대해 개발된 PCR 동정 프로토콜. 겔의 로딩 순서: 레인 1: 유전자이식 이벤트 EE-GM1을 포함하는 대두 식물 유래의 DNA 시료; 레인 2: 우량 이벤트 EE-GM1을 포함하지 않는 유전자이식 대두 식물 유래의 DNA 시료; 레인 3: 야생형 대두 식물 유래의 대조군 DNA 시료; 레인 4: 주형 대조군 없음(no template control); 레인 5: 분자량 마커.
도 6: EE - GM2 에 대해 개발된 PCR 동정 프로토콜. 겔의 로딩 순서: 레인 1: 유전자이식 이벤트 EE-GM2를 포함하는 대두 식물 유래의 DNA 시료; 레인 2: 우량 이벤트 EE-GM2를 포함하지 않는 유전자이식 대두 식물 유래의 DNA 시료; 레인 3: 야생형 대두 식물 유래의 대조군 DNA 시료; 레인 4: 주형 대조군 없음; 레인 5: 분자량 마커.
도 1: 언급된 뉴클레오타이드 서열 및 우량 이벤트 EE - GM3 에 대한 프라이머 간의 관계를 나타낸 개략도. 검정색 막대: 외래 DNA; 빗금친 막대: 식물 유래의 DNA; 바둑판무늬 화살표 (a): 키메릭 HPPD PF W366 암호화 유전자(키메릭 유전자의 조성에 대한 표 1 참조); 빗금친 화살표 (b): 키메릭 2mEPSPS 암호화 유전자(키메릭 유전자의 조성에 대한 표 1 참조); 검정색 화살표: 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 막대 밑의 숫자는 뉴클레오타이드 위치를 나타냄; (c)는 표시된 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열을 지칭함; 주: 도식은 축척에 따라 도시되지 않음.
도 2: EE - GM3 에 대해 개발된 PCR 동정 프로토콜에 의해 얻어진 결과. 겔의 로딩 순서: 레인 1: 분자량 마커(100 bp ladder); 레인 2 및 3: 유전자이식 이벤트 EE-GM3를 포함하는 대두 식물 유래의 DNA 시료; 레인 4-7: 우량 이벤트 EE-GM3를 포함하지 않고 동일한 제초제 내성 유전자(기타 형질전환 이벤트)를 포함하는 유전자이식 대두 식물 유래의 DNA 시료; 레인 8: 야생형 대두 유래의 DNA 시료; 레인 9: 주형 DNA 대조군 없음(no template DNA control); 레인 10: 분자량 마커.
도 3: 언급된 뉴클레오타이드 서열 및 우량 이벤트 EE - GM1 에 대한 프라이머 사이의 관계를 나타내는 도식. 검정색 막대: 외래 DNA; 빗금친 막대: 식물 유래의 DNA; 가로 줄무늬 화살표 (d): 키메릭 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 암호화 유전자(키메릭 유전자의 조성에 대한 서열번호 11 참조); 검정색 화살표: 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 막대 밑의 숫자는 뉴클레오타이드 위치를 나타냄; (c)는 표시된 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열을 지칭함; 주: 도식은 축척에 따라 도시되지 않음.
도 4: 언급된 뉴클레오타이드 서열 및 우량 이벤트 EE - GM2 에 대한 프라이머 사이의 관계를 나타내는 도식. 검정색 막대: 외래 DNA; 빗금친 막대: 식물 유래의 DNA; 가로 줄무늬 화살표 (d): 키메릭 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 암호화 유전자(키메릭 유전자의 조성에 대한 서열번호 11 참조); 검정색 화살표: 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 막대 밑의 숫자는 뉴클레오타이드 위치를 나타냄; (c)는 표시된 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열을 지칭함; NA: 해당 없음. 주: 도식은 축척에 따라 도시되지 않음.
도 5: EE - GM1 에 대해 개발된 PCR 동정 프로토콜. 겔의 로딩 순서: 레인 1: 유전자이식 이벤트 EE-GM1을 포함하는 대두 식물 유래의 DNA 시료; 레인 2: 우량 이벤트 EE-GM1을 포함하지 않는 유전자이식 대두 식물 유래의 DNA 시료; 레인 3: 야생형 대두 식물 유래의 대조군 DNA 시료; 레인 4: 주형 대조군 없음(no template control); 레인 5: 분자량 마커.
도 6: EE - GM2 에 대해 개발된 PCR 동정 프로토콜. 겔의 로딩 순서: 레인 1: 유전자이식 이벤트 EE-GM2를 포함하는 대두 식물 유래의 DNA 시료; 레인 2: 우량 이벤트 EE-GM2를 포함하지 않는 유전자이식 대두 식물 유래의 DNA 시료; 레인 3: 야생형 대두 식물 유래의 대조군 DNA 시료; 레인 4: 주형 대조군 없음; 레인 5: 분자량 마커.
식물 게놈 내로 재조합 DNA 분자를 도입하는 것은 일반적으로 세포 또는 조직의 형질전환의 결과이다. 도입의 특정 부위는 보통 무작위 통합에 기인한다.
재조합 DNA 또는 "형질전환 DNA" 및 이러한 형질전환 DNA 유래의 것에 의해 식물 세포 또는 조직의 형질전환의 결과로 식물 게놈에 도입된 DNA를 이하에서는 하나 이상의 "이식유전자"를 포함하는 "외래 DNA"로 지칭한다. EE-GM3의 이식유전자는 글라이포세이트 및 HPPD 저해제 제초제 내성 유전자이다. 본 발명의 문맥에서 "식물 DNA"는 형질전환된 식물 유래의 DNA를 지칭한다. 식물 DNA는 보통 상응하는 야생형 식물 내의 동일한 유전자 좌위(locus)에서 발견된다. 외래 DNA는 식물 게놈 내의 재조합 DNA 분자의 도입 부위에서의 위치(location) 및 형태(configuration)에 의해 특징지어질 수 있다. 재조합 DNA가 삽입된 식물 게놈 내 부위는 "삽입 부위" 또는 "표적 부위"로도 지칭된다. "삽입 전 식물 DNA"로 지칭되는 식물 게놈의 영역 내로의 재조합 DNA 삽입은 "표적 부위 삭제"로 지칭되는 식물 DNA의 삭제를 수반할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "측면 영역" 또는 "측면 서열"은 도입된 DNA와 상이한 DNA, 바람직하게는 외래 DNA의 바로 업스트림 위치에서 인접하고 있거나 바로 다운스트림 위치에서 인접하고 있는 식물 게놈으로부터의 DNA의 적어도 20 bp, 바람직하게는 적어도 50 bp, 및 5000 bp 이하의 서열을 지칭한다. 외래 DNA의 무작위 통합에 이르는 형질전환 절차의 결과 각각의 형질전환체에 있어서 특징적이고 고유하며 상이한 측면 영역을 지닌 형질전환체가 얻어진다. 재조합 DNA가 전통적인 교배를 통해 식물 내로 도입되는 경우, 식물 게놈 내의 삽입 부위 또는 측면 영역은 일반적으로 바뀌지 않는다.
본 명세서에서 사용된 "분리된 핵산 (서열)" 또는 "분리된 DNA (서열)"은 더 이상 그것이 분리되어 나온 천연 환경 안에 있지 않은 핵산 또는 DNA (서열), 예를 들어, 다른 박테리아 숙주 또는 식물 게놈 내의 핵산 서열을 지칭하거나, 예를 들어, 식물-발현성 프로모터 제어 하의 키메릭 유전자 내에 포함된 경우 다른 출처 유래의 DNA 또는 핵산에 융합된 핵산 또는 DNA를 지칭한다.
이벤트는 유전자 공학의 결과 관심 있는 유전자 또는 유전자들의 적어도 하나의 복제물을 포함하는 외래 DNA 또는 이식유전자를 운반하는 (인공) 유전자 좌위로 정의된다. 이벤트의 전형적인 대립 형질 상태(allelic state)는 외래 DNA의 존재 또는 부재이다. 이벤트는 이식유전자의 발현에 의해 표현형적으로 특징을 나타낸다. 유전자 수준에서, 이벤트는 식물의 유전자 메이크업의 일부이다. 분자 수준에서, 이벤트는 제한효소 지도(restriction map)(예를 들어, 서던 블로팅에 의해 결정된)에 의해, 이식유전자의 업스트림 및/또는 다운스트림 측면 서열, 분자 마커의 위치 및/또는 이식유전자의 분자 형태에 의해 특징규명될 수 있다. 일반적으로 적어도 하나의 관심 유전자를 포함하는 형질전환 DNA에 의한 식물의 형질전환은 각기 고유한 다수의 분리된 이벤트를 포함하는 형질전환체 집단을 만들게 된다. 이벤트는 외래 DNA 및 적어도 하나의 측면 서열에 의해 특징규명된다.
본 명세서에서 사용된 우량 이벤트는 이식유전자(들)의 발현 및 안정성과 그것을 포함하는 식물의 최상의 작물학적 특성과의 적합성(compatibility)에 기초하여 동일한 형질전환 DNA로 형질전환시켜 얻어지는 일군의 이벤트로부터 선택된 이벤트이다. 따라서 우량 이벤트 선택에 대한 기준은 하나 이상, 바람직하게는 두 개 이상, 유리하게는 하기의 것 모두이다:
a) 외래 DNA의 존재가, 예를 들어, 작물학적 성과 또는 상업적 가치에 관한 것들과 같이, 식물의 기타 바람직한 특성과 타협하지 않음;
b) 이벤트가 안정적으로 계승되며 동일성 대조군에 적합한 도구가 개발될 수 있는, 잘 정의된 분자 형태에 의해 특징규명됨;
c) 관심 유전자(들)이 이벤트를 수반하는 식물이 보통의 작물학적 용도에서 노출되기 쉬운 일정 범위의 환경적 조건에서 상업적으로 허용되는 수준으로 이벤트의 이형접합 (또는 반접합) 및 동형접합의 조건 모두에 있어서 정확하고, 적당하며 안정적인 공간적이고 일시적인 표현형 발현을 나타냄.
외래 DNA는 목적하는 상업적 유전적 배경 내로 쉽게 이입될 수 있도록 식물 게놈의 한 위치에 연합되는 것이 바람직하다.
우량 이벤트로서 하나의 이벤트의 상태는 상이하며 연관된 유전적 배경 내로의 우량 이벤트의 유전자 침투(introgression)와 함께, 기준, 예를 들어 상기 a), b) 및 c)의 하나, 둘 또는 모두를 충족시키는지의 관찰에 의해 확인된다.
따라서 "우량 이벤트"는 상기 언급된 기준을 충족시키는, 외래 DNA를 포함하는 유전자 좌위를 지칭한다. 식물, 식물 물질 또는 자손, 예를 들어, 종자는 그의 게놈 내에 하나 이상의 우량 이벤트를 포함할 수 있다.
우량 이벤트 또는 우량 이벤트를 포함하는 식물 또는 식물 물질, 또는 우량 이벤트를 포함하는 식물 물질을 포함하는 산물을 동정하기 위해 개발된 도구는 우량 이벤트의 특이적 게놈 특성, 예를 들어, 외래 DNA를 포함하는 게놈 영역의 특이적 제한효소 지도, 외래 DNA의 측면 영역(들)의 서열 또는 분자 마커에 기초한다.
일단 외래 DNA의 측면 영역들 중 하나 또는 둘 다가 서열분석되면, 시료의 핵산(DNA 또는 RNA) 내 이(들) 서열을 특이적으로 인식하는 프라이머 및 프로브가 분자 생물학적 기술에 의해 개발될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 시료(예를 들어, 식물, 식물 물질 또는 식물 물질을 포함하는 산물 시료들)에서 우량 이벤트를 동정하기 위해 PCR 방법을 개발할 수 있다. 이러한 PCR은 하나는 우량 이벤트의 5' 또는 3' 측면 영역 내의 서열을 인식하고, 다른 하나는 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 적어도 두 개의 특이적 "프라이머들"에 기초한다. 바람직하게는, 프라이머는 최적화된 PCR 조건하에 각각 우량 이벤트 및 우량 이벤트의 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역 내의 서열을 "특이적으로 인식하는" 15 내지 35개의 뉴클레오타이드 서열을 가짐으로써 우량 이벤트를 포함하는 핵산 시료로부터 특이적 단편("통합 단편" 또는 차별화된 앰플리콘(amplicon))이 증폭된다. 이는 식물 게놈 또는 외래 DNA 내의 다른 서열이 아니라 표적 통합 단편만이 최적화된 PCR 조건하에 증폭된다는 것을 의미한다.
EE-GM3의 동정에 적합한 PCR 프라이머는 하기의 것일 수 있다:
- 길이가 17 nt 내지 약 200 nt 범위이며, 3' 말단에서 5' 측면 서열(서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451) 내의 식물 DNA로부터 선택된, 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드, 바람직하게는 20개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드(5' 측면 서열을 인식하는 프라이머); 또는
- 길이가 17 nt 내지 약 200 nt 범위이며, 3' 말단에서 3' 측면 서열(서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보 서열) 내의 식물 DNA로부터 선택된, 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드, 바람직하게는 20개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드(3' 측면 서열을 인식하는 프라이머); 또는
- 길이가 17 nt 내지 약 200 nt 범위이며, 3' 말단에서 삽입된 DNA 서열(서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보 서열)로부터 선택된, 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드, 바람직하게는 20개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드(외래 DNA를 인식하는 프라이머); 또는
- 길이가 17 nt 내지 약 200 nt 범위이며, 삽입된 DNA 서열(서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240)로부터 선택된, 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드, 바람직하게는 20개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드; 또는
- 길이가 17 nt 내지 약 200 nt 범위이며, 삽입된 DNA 단편 또는 그의 상보적 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1 또는 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 16638)로부터 선택된, 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드, 바람직하게는 20개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적합한 올리고뉴클레오타이드.
프라이머는 물론, 언급된 17개의 연속적인 뉴클레오타이드보다 더 길 수 있으며, 예를 들어, 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nt 길이 또는 훨씬 더 길 수 있다. 프라이머는 전체적으로 측면 서열 및 외래 DNA 서열의 언급된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 구성될 수 있다. 그러나, 5' 말단(즉, 3'-위치한 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 외부)에서 프라이머의 뉴클레오타이드 서열은 덜 임계적이다. 따라서, 필요한 경우, 프라이머의 5' 서열은 측면 서열 또는 외래 DNA로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나 구성될 수 있지만, 여러 개(예를 들어, 1, 2, 5 또는 10)의 불일치를 포함할 수 있다. 프라이머의 5' 서열은 전체적으로 측면 서열 또는 외래 DNA와 무관한(unrelated) 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 하나 이상의 제한 효소 인식 부위를 나타내는 뉴클레오타이드 서열일 수도 있다. 이와 같이 불일치를 포함하는 측면 DNA 서열 또는 무관한 서열은 바람직하게는 100보다 길지 않아야 하며, 더욱 바람직하게는 50 또는 25 뉴클레오타이드보다도 더 길지 않아야 한다.
또한, 적합한 프라이머는 식물 DNA 유래 서열과 외래 DNA 서열 사이의 연결 영역(EE-GM3에 대해서는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1451 내지 1452 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 240 내지 241에 위치)에 걸친 그들의 3' 말단에서의 뉴클레오타이드 서열을/로 포함하거나, 구성되거나 필수적으로 구성될 수 있으나, 단, 언급된 3'-위치의 17개 연속적인 뉴클레오타이드는 서열번호 2 또는 3에서의 식물-유래 서열 또는 외래 DNA로부터 전적으로 유래하지 않는다.
또한, 적절하게 선택된 PCR 프라이머 쌍이 서로에게 상보적인 서열을 포함하지 않아야 한다는 것은 당업자에게 즉시 명확할 것이다.
본 발명의 목적에 있어서, "서열번호 X에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열"은 샤가프의 법칙(Chargaff s rules; A ⇔ T; G ⇔ C)에 따른 상보적 뉴클레오타이드로 뉴클레오타이드를 대체하고 그 서열을 5'에서 3' 방향, 즉, 표시된 뉴클레오타이드 서열의 반대 방향으로 판독함으로써 표시된 뉴클레오타이드 서열로부터 유래될 수 있는 뉴클레오타이드 서열이다.
EE-GM3에 대한 적합한 프라이머의 예는 서열번호 5(3' 측면 서열 인식 프라이머), 서열번호 4(3' 측면 서열 인식 프라이머와 사용하기 위한 외래 DNA 인식 프라이머), 또는 서열번호 7(3' 측면 서열 인식 프라이머와 사용하기 위한 외래 DNA 인식 프라이머)의 올리고뉴클레오타이드 서열이다.
EE-GM3에 대한 적합한 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 다른 예는 그들의 3' 말단에 하기 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 (필수적으로) 구성된다:
a. 5' 측면 서열 인식 프라이머:
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 264 내지 뉴클레오타이드 283의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 266 내지 뉴클레오타이드 285의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1240 내지 뉴클레오타이드 1259의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 265 내지 뉴클레오타이드 285의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 265 내지 뉴클레오타이드 283의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1239 내지 뉴클레오타이드 1259의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1241 내지 뉴클레오타이드 1259의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1244 내지 뉴클레오타이드 1263의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1248 내지 뉴클레오타이드 1267의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1250 내지 뉴클레오타이드 1269의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 262 내지 뉴클레오타이드 279의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 263 내지 뉴클레오타이드 279의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 264 내지 뉴클레오타이드 285의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 266 내지 뉴클레오타이드 283의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1238 내지 뉴클레오타이드 1259의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1242 내지 뉴클레오타이드 1259의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1243 내지 뉴클레오타이드 1263의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1245 내지 뉴클레오타이드 1263의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1247 내지 뉴클레오타이드 1267의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1249 내지 뉴클레오타이드 1269의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1249 내지 뉴클레오타이드 1267의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 263 내지 뉴클레오타이드 285의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 267 내지 뉴클레오타이드 283의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1242 내지 뉴클레오타이드 1263의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1243 내지 뉴클레오타이드 1259의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1246 내지 뉴클레오타이드 1267의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1246 내지 뉴클레오타이드 1263의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1248 내지 뉴클레오타이드 1269의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1250 내지 뉴클레오타이드 1271의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1250 내지 뉴클레오타이드 1267의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1241 내지 뉴클레오타이드 1263의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1245 내지 뉴클레오타이드 1267의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1247 내지 뉴클레오타이드 1269의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1247 내지 뉴클레오타이드 1263의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1249 내지 뉴클레오타이드 1271의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1242 내지 뉴클레오타이드 1261의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1241 내지 뉴클레오타이드 1261의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1243 내지 뉴클레오타이드 1261의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1240 내지 뉴클레오타이드 1261의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1244 내지 뉴클레오타이드 1261의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 뉴클레오타이드 1239 내지 뉴클레오타이드 1261
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 뉴클레오타이드 1245 내지 뉴클레오타이드 1261
b. 5' 측면 서열 인식 프라이머와 사용하기 위한 외래 DNA 서열 인식 프라이머
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1732 내지 뉴클레오타이드 1751의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1735 내지 뉴클레오타이드 1754의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1731 내지 뉴클레오타이드 1750의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1732 내지 뉴클레오타이드 1750의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1732 내지 뉴클레오타이드 1752의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1731 내지 뉴클레오타이드 1749의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1732 내지 뉴클레오타이드 1749의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1731 내지 뉴클레오타이드 1751의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1732 내지 뉴클레오타이드 1753의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1731 내지 뉴클레오타이드 1748의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1732 내지 뉴클레오타이드 1748의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1735 내지 뉴클레오타이드 1751의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1731 내지 뉴클레오타이드 1752의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1732 내지 뉴클레오타이드 1754의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1731 내지 뉴클레오타이드 1747의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1731 내지 뉴클레오타이드 1753의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1727 내지 뉴클레오타이드 1746의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1727 내지 뉴클레오타이드 1745의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1727 내지 뉴클레오타이드 1747의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1727 내지 뉴클레오타이드 1744의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1727 내지 뉴클레오타이드 1748의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1727 내지 뉴클레오타이드 1749의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1726 내지 뉴클레오타이드 1745의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1726 내지 뉴클레오타이드 1744의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1726 내지 뉴클레오타이드 1746의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1726 내지 뉴클레오타이드 1747의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1726 내지 뉴클레오타이드 1748의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1724 내지 뉴클레오타이드 1744의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1724 내지 뉴클레오타이드 1745의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1724 내지 뉴클레오타이드 1746의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1461 내지 뉴클레오타이드 1478의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1670 내지 뉴클레오타이드 1686의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1469 내지 뉴클레오타이드 1486의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1508 내지 뉴클레오타이드 1527의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1667 내지 뉴클레오타이드 1686의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1670 내지 뉴클레오타이드 1687의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1673 내지 뉴클레오타이드 1689의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1688 내지 뉴클레오타이드 1704의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1688 내지 뉴클레오타이드 1705의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1692 내지 뉴클레오타이드 1709의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1467 내지 뉴클레오타이드 1486의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1481 내지 뉴클레오타이드 1497의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1481 내지 뉴클레오타이드 1498의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1491 내지 뉴클레오타이드 1507의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1491 내지 뉴클레오타이드 1508의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1672 내지 뉴클레오타이드 1688의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1673 내지 뉴클레오타이드 1690의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1673 내지 뉴클레오타이드 1691의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1688 내지 뉴클레오타이드 1706의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1691 내지 뉴클레오타이드 1707의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
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- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1472 내지 뉴클레오타이드 1493의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
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- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1469 내지 뉴클레오타이드 1491의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1488 내지 뉴클레오타이드 1510의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1691 내지 뉴클레오타이드 1712의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1692 내지 뉴클레오타이드 1713의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1692 내지 뉴클레오타이드 1714의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1467 내지 뉴클레오타이드 1489의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1678 내지 뉴클레오타이드 1700의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1481 내지 뉴클레오타이드 1503의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1691 내지 뉴클레오타이드 1713의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
c. 3' 측면 서열 인식 프라이머:
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 828 내지 뉴클레오타이드 847의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 830 내지 뉴클레오타이드 849의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 828 내지 뉴클레오타이드 846의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 828 내지 뉴클레오타이드 848의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 830 내지 뉴클레오타이드 848의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 830 내지 뉴클레오타이드 850의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 828 내지 뉴클레오타이드 845의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 830 내지 뉴클레오타이드 847의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 828 내지 뉴클레오타이드 849의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 830 내지 뉴클레오타이드 851의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 828 내지 뉴클레오타이드 844의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 830 내지 뉴클레오타이드 846의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 828 내지 뉴클레오타이드 850의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 830 내지 뉴클레오타이드 852의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 992 내지 뉴클레오타이드 1009의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 731 내지 뉴클레오타이드 752의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 776 내지 뉴클레오타이드 795의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 731 내지 뉴클레오타이드 753의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 776 내지 뉴클레오타이드 794의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 776 내지 뉴클레오타이드 796의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 776 내지 뉴클레오타이드 793의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 776 내지 뉴클레오타이드 797의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 776 내지 뉴클레오타이드 792의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 776 내지 뉴클레오타이드 798의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 733 내지 뉴클레오타이드 752의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 733 내지 뉴클레오타이드 753의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 733 내지 뉴클레오타이드 754의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 733 내지 뉴클레오타이드 755의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 838 내지 뉴클레오타이드 854의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 246 내지 뉴클레오타이드 263의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 838 내지 뉴클레오타이드 855의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 245 내지 뉴클레오타이드 264의 상보 서열
d. 3' 측면 서열 인식 프라이머와 사용하기 위한 외래 DNA 서열 인식 프라이머:
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 173 내지 뉴클레오타이드 192의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 22 내지 뉴클레오타이드 41의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 172 내지 뉴클레오타이드 192의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 174 내지 뉴클레오타이드 192의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 191 내지 뉴클레오타이드 210의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 171 내지 뉴클레오타이드 192의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 175 내지 뉴클레오타이드 192의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 190 내지 뉴클레오타이드 210의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 192 내지 뉴클레오타이드 210의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 176 내지 뉴클레오타이드 192의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 189 내지 뉴클레오타이드 210의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 193 내지 뉴클레오타이드 210의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 188 내지 뉴클레오타이드 210의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 194 내지 뉴클레오타이드 210의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 199 내지 뉴클레오타이드 218의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 200 내지 뉴클레오타이드 218의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 197 내지 뉴클레오타이드 218의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 201 내지 뉴클레오타이드 218의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 201 내지 뉴클레오타이드 220의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 200 내지 뉴클레오타이드 220의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 199 내지 뉴클레오타이드 220의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 200 내지 뉴클레오타이드 221의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 199 내지 뉴클레오타이드 221의 뉴클레오타이드 서열
- 서열번호 3의 뉴클레오타이드 150 내지 뉴클레오타이드 172의 뉴클레오타이드 서열
EE-GMl의 동정에 적합한 PCR 프라이머는 국제 특허 공개 제2006/108674호, 특히 제8쪽 제4행 내지 제26쪽 제7행(참조에 의해 본 명세서에 원용됨)에 기재되어 있다.
EE-GM2의 동정에 적합한 PCR 프라이머는 국제 특허 공개 제2006/108675호, 특히 제8쪽 제4행 내지 제33쪽 제4행(참조에 의해 본 명세서에 원용됨)에 기재되어 있다.
본 명세서에서 "서열번호 Z 위치 X 내지 위치 Y의 뉴클레오타이드 서열"은 뉴클레오타이드 양쪽 말단점(endpoint)을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 가리킨다.
바람직하게는, 증폭된 단편은 50 내지 500 뉴클레오타이드의 길이, 예를 들어, 100 내지 350 뉴클레오타이드의 길이를 가진다. 특이적 프라이머는 우량 이벤트 및 우량 이벤트의 외래 DNA 각각의 5' 또는 3' 측면 영역 내 서열과 80 내지 100% 동일한 서열을 가질 수 있으나, 단, 불일치는 여전히 최적화된 PCR 조건하에 이들 프라이머를 이용한 우량 이벤트의 특이적 동정을 허용한다. 그러나, 허용되는 불일치의 범위는 실험적으로 용이하게 결정될 수 있으며 당업자에게 공지되어 있다.
통합 단편의 검출은 다양한 방법, 예를 들어, 겔 분석 후 크기 평가를 통해 이루어질 수 있다. 통합 단편은 직접적으로 서열분석될 수도 있다. 증폭된 DNA 단편의 검출을 위한 기타 서열 특이적 방법들도 당업계에 공지되어 있다.
프라이머의 서열 및 게놈 내 그들의 상대적 위치가 우량 이벤트의 경우 고유하기 때문에, 통합 단편의 증폭은 우량 이벤트(의 핵산)를 포함하는 생물학적 시료 내에서만 이루어진다. 바람직하게는, 미지 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GMl 또는 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 동정하기 위해 PCR을 수행하는 경우, 대조군은 이벤트의 식물 종의 "관리 유전자"(housekeeping gene) 내의 단편과 함께 증폭될 수 있는 일련의 프라이머를 포함한다. 관리 유전자는 대부분의 세포 유형에서 발현되는 유전자로서 모든 세포에 공통적인 기초 대사 활동과 관련되어 있다. 바람직하게는, 관리 유전자로부터 증폭된 단편은 증폭된 통합 단편보다 더 큰 단편이다. 분석할 시료에 따라 다른 대조군이 포함될 수 있다.
표준 PCR 프로토콜이 당업계, 예를 들어, "PCR 적용 매뉴얼"(Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999) 및 기타 문헌에 기재되어 있다. 특이적 프라이머 서열을 포함하여 PCR에 대한 최적 조건이 각각의 우량 이벤트에 대해 "PCR (또는 중합효소 연쇄 반응) 동정 프로토콜"에 구체적으로 기재되어 있다. 그러나, PCR 동정 프로토콜에서 다수의 파라미터가 특정 실험실 조건에 따라 조절될 필요가 있으며 유사한 결과를 얻기 위해 약간 변형될 수 있다. 예를 들어, DNA의 제조에 상이한 방법을 사용하면, 예를 들어, 사용되는 중합효소, 프라이머의 양, 어닐링(annealing) 조건의 조절이 요구될 수 있다. 유사하게, 다른 프라이머를 선택하면 PCR 동정 프로토콜에 대한 최적 조건이 달라질 수 있다. 그러나, 이러한 조절은 당업자에게 자명할 것이며, 또한 앞에 언급한 것과 같은 최신 PCR 적용 매뉴얼에 자세히 기재되어 있다.
대안적으로, 특이적 프라이머를 사용하여 생물학적 시료에서 EE-GM3 및 EE-GMl 또는 EE-GM3 및 EE-GM2를 동정하기 위한 "특이적 프로브"로서 사용할 수 있는 통합 단편을 증폭시킬 수 있다. 프로브가 시료 핵산 내의 상응하는 단편과 혼성화될 수 있는 조건 하에, 생물학적 시료의 핵산을 프로브와 접촉시키면 핵산/프로브 하이브리드의 형성이 이루어진다. 이러한 하이브리드의 형성을 검출할 수 있으며(예를 들어, 핵산 또는 프로브의 표지화를 통해), 그 결과 이들 하이브리드의 형성은 EE-GM3 및 EE-GMl 또는 EE-GM3 및 EE-GM2의 존재를 표시한다. 특이적 프로브와의 혼성화에 기초한 동정 방법(고체상 담체 상에서 또는 용액 내에서)은 당업계에 기술되어 있다. 바람직하게는, 특이적 프로브는 최적화된 조건 하에서 우량 이벤트의 5' 또는 3' 측면 영역 내의 영역으로서 바람직하게는 그와 인접한 외래 DNA의 일부도 포함하는 영역(이하, "특이적 영역"으로 지칭함)에 특이적으로 혼성화하는 서열이다. 바람직하게는, 특이적 프로브는 특이적 영역의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 80 내지 85%, 더욱 바람직하게는 85 내지 90%, 특히 바람직하게는 90 내지 95%, 가장 바람직하게는 95% 내지 100% 동일한(또는 상보적인) 50 내지 500 bp, 바람직하게는 100 내지 350 bp의 서열을 포함한다. 바람직하게는, 특이적 프로브는 우량 이벤트의 특이적 영역과 동일한(또는 상보적인) 약 15 내지 약 100개의 인접 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한, PCR 기반 증폭 방법과는 상이한, 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GMl 또는 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2에 특이적인 검출 방법은 본 명세서에서 제공되는 우량 이벤트 특이적인 서열 정보를 사용하여 개발할 수도 있다. 이와 같이 대안적인 검출 방법은 InvaderTM 기술로도 알려진 특정 핵산 구조의 침습 분해(invasive cleavage)를 기본으로 하는 선형 신호 증폭 검출 방법(예를 들어, 참조에 의해 본 명세서에 원용된 미국특허 제5,985,557호(발명의 명칭: "Invasive Cleavage of Nucleic Acids"), 제6,001,567호(발명의 명칭: "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage")에 기술됨)를 포함한다. 이 방법에 의한 EE-GM3 검출의 경우, 표적 서열은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1469의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 표지된 제1핵산 올리고뉴클레오타이드 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 223 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 상기 표지된 핵산 프로브와 혼성화될 수 있으며, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1434 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 제2핵산 올리고뉴클레오타이드 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 258의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 상기 표지된 핵산 프로브와 추가로 혼성화되고, 여기에서 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 뉴클레오타이드에 의해 중첩된다. 이 혼성화에 의해 생성된 이중(duplex) 또는 삼중(triplex) 구조는 효소(Cleavase(등록상표))에 의한 선택적 프로브 분해를 허용하며, 이로 인하여 표적 서열이 손상되지 않는다. 그 후, 분해된 표지 프로브가 검출되며, 잠재적으로 중간 단계를 거쳐 추가의 신호 증폭을 일으킨다. 이 방법에 의한 EE-GM1 검출의 경우, 표적 서열은 서열번호 12의 뉴클레오타이드 210 내지 뉴클레오타이드 227의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 표지된 제1핵산 올리고뉴클레오타이드 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 561 내지 뉴클레오타이드 568의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 상기 표지된 핵산 프로브와 혼성화될 수 있으며, 서열번호 12의 뉴클레오타이드 192 내지 뉴클레오타이드 209의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 제2핵산 올리고뉴클레오타이드 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 뉴클레오타이드 586의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 상기 표지된 핵산 프로브와 추가로 혼성화되고, 여기에서 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 뉴클레오타이드에 의해 중첩된다. 이 혼성화에 의해 생성된 이중 또는 삼중 구조는 효소(Cleavase(등록상표))에 의한 선택적 프로브 분해를 허용하며, 이로 인하여 표적 서열이 손상되지 않는다. 그 후, 분해된 표지 프로브가 검출되며, 잠재적으로 중간 단계를 거쳐 추가의 신호 증폭을 일으킨다. 이 방법에 의한 EE-GM2 검출의 경우, 표적 서열은 서열번호 14의 뉴클레오타이드 312 내지 뉴클레오타이드 329의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 표지된 제1핵산 올리고뉴클레오타이드 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 490 내지 뉴클레오타이드 507의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 상기 표지된 핵산 프로브와 혼성화될 수 있으며, 서열번호 14의 뉴클레오타이드 294 내지 뉴클레오타이드 311의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 제2핵산 올리고뉴클레오타이드 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 뉴클레오타이드 525의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 상기 표지된 핵산 프로브와 추가로 혼성화되고, 여기에서 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 뉴클레오타이드에 의해 중첩된다. 이 혼성화에 의해 생성된 이중 또는 삼중 구조는 효소(Cleavase(등록상표))에 의한 선택적 프로브 분해를 허용하며, 이로 인하여 표적 서열이 손상되지 않는다. 그 후, 분해된 표지 프로브가 검출되며, 잠재적으로 중간 단계를 거쳐 추가의 신호 증폭을 일으킨다.
본 명세서에서 사용된 "키트"는 본 발명의 방법, 더욱 특히, 생물학적 시료 내 우량 이벤트 EE-GM3의 동정 또는 EE-GM3 포함 식물 물질의 접합성(zygosity) 상태의 결정을 수행하기 위한 목적의 일습의 시약을 지칭한다. 더욱 특히, 본 발명의 키트의 바람직일 실시형태는 우량 이벤트의 동정을 위한 상기 적어도 1개 또는 2개의 특이적 프라이머, 또는 접합성 상태의 결정을 위한 3개의 특이적 프라이머를 포함한다. 임의로, 키트는 PCR 동정 프로토콜에 있어서 본 명세서에 기재된 임의의 기타 시약을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 키트는 그 안의 EE-GM3 존재를 동정하기 위한 생물학적 시료의 핵산과 특이적으로 혼성화되는 상기의 특이적 프로브를 포함할 수 있다. 임의로, 키트는 특이적 프로브를 사용하여 생물학적 시료 내의 EE-GM3 동정을 하기 위한 임의의 기타 시약(예를 들어 혼성화 완충액, 표지를 포함하나 이로 한정되지는 않음)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는, 예를 들어 식품 또는 사료 산물을 포함하지만 이로 한정되지는 않는, 식물 물질 또는 식물 물질을 포함하거나 이로부터 유래된 물질 내 우량 이벤트의 존재 또는 부재의 검출, 품질 관리(예를 들어, 종자 소집단의 순도)를 목적으로 사용될 수 있고, 그의 성분이 특이적으로 조절될 수 있다.
본 명세서에서 뉴클레오타이드 서열(DNA 또는 RNA)과 관련된 "서열 동일성"은 2개 서열 중 더 짧은 서열에서의 뉴클레오타이드 개수로 나눈 동일 뉴클레오타이드 위치의 개수를 지칭한다. 2개의 뉴클레오타이드 서열의 정렬은 20개의 뉴클레오타이드의 윈도 크기(window-size), 4개의 뉴클레오타이드의 단어 길이(word length), 및 4의 갭 패널티(gap penalty)를 사용하는 윌버 앤드 립만 알고리듬(Wilbur and Lipmann algorithm; Wilbur and Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:726)에 의해 수행된다. 상기 서열 정렬을 포함하여, 컴퓨터의 보조를 받아 서열 데이터를 분석하고 해석하는 것은 예를 들어 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group; GCG, University of Wisconsin Biotechnology Center)의 서열 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 편리하게 수행된다. 서열은 이러한 서열이 적어도 약 75%, 특히 적어도 약 80%, 더욱 특히 적어도 약 85%, 아주 특히 적어도 약 90%, 특별히 적어도 약 95%, 더욱 특별히 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 지니는 경우에 "본질적으로 유사한" 것으로 표시된다. RNA 서열이 본질적으로 유사하거나 DNA 서열과 어느 정도의 서열 동일성을 지닌다고 일컬어지는 경우 DNA 서열 중의 티미딘(T)이 RNA 서열 중의 우라실(U)과 균등한 것으로 고려되는 것은 명백하다. 시간 경과에 따라 DNA 서열 내에 작은 차이 또는 돌연변이가 나타나고 본 발명의 이벤트-특이적 프라이머 또는 프로브에 대해 일부 불일치가 허용될 수 있음은 명백하며, 따라서 본 발명의 임의의 3' 또는 5' 측면 DNA 또는 임의의 삽입물 또는 외래 DNA 또는 임의의 프라이머 또는 프로브에 대해 본 발명의 임의의 실시형태에서 표시된 임의의 DNA 서열은 본 명세서에서 제공된 서열, 예를 들어, 본 발명의 임의의 3' 또는 5' 측면 DNA, 임의의 프라이머 또는 프로브 또는 임의의 삽입물 또는 외래 DNA에 대해 주어진 서열과 혼성화되거나 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 지닌 서열과 본질적으로 유사한 서열도 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프라이머"는 PCR과 같은 주형-의존적 방법에서 발생기(nascent) 핵산 합성의 기폭제로 사용될 수 있는 임의의 핵산을 포함한다. 보통 프라이머는 10 내지 30개의 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드이지만 더 긴 서열도 사용될 수 있다. 프라이머는 이중 가닥 형태로 제공될 수 있지만, 단일 가닥 형태가 바람직하다. 프로브는 프라이머로 사용될 수 있지만 표적 DNA 또는 RNA에 결합하도록 고안되며 증폭 공정에서 사용될 필요가 없다.
본 명세서에서 사용된 용어 "인식하는"은, 특이적 프라이머와 관련하여, 특이적 프라이머가 당해 방법에서 언급된 조건(예를 들어, PCR 동정 프로토콜의 조건) 하에 우량 이벤트 내의 핵산 서열과 특이적으로 혼성화함으로써 양성 및 음성 대조군의 존재에 의해 특이성이 결정되는 사실을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 용어 "혼성화"는, 특이적 프로브와 관련하여, 프로브가 표준 엄격성(stringency) 조건 하에 우량 이벤트의 핵산 서열 내 특이적 영역과 결합하는 사실을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 표준 엄격성 조건은 본 명세서에 기술된 혼성화 조건 또는 예컨대 하기 단계를 포함할 수 있는 샘브룩(Sambrook) 등, 1989에 기재된 통상의 혼성화 조건((Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)을 나타낸다: 1) 식물 게놈 DNA 단편을 필터 상에 고정하는 단계, 2) 50% 포름아미드, 5 X SSPE, 2 X 덴하르트(Denhardt) 시약 및 0.1% SDS 중의 42℃에서 1 내지 2시간 동안, 또는 6 X SSC, 2 X 덴하르트 시약 및 0.1% SDS 중의 68℃에서 1 내지 2시간 동안 필터를 예비혼성화시키는 단계, 3) 표지된 혼성화 프로브를 첨가하는 단계, 4) 16 내지 24 시간 동안 인큐베이션시키는 단계, 5) 1 X SSC, 0.1 % SDS 중의 실온에서 20분간 필터를 세척하는 단계, 6) 0.2 X SSC, 0.1 % SDS 중의 68℃에서 각각 20분간 3회 필터를 세척하는 단계, 및 7) 강화 스크린과 함께 -70℃에서 X-선에 필터를 24 내지 48 시간 동안 노출시키는 단계.
본 명세서에서 사용된 생물학적 시료는 식물, 식물 물질 또는 식물 물질을 포함하는 산물의 시료이다. 용어 "식물"은 임의의 이들 식물로부터 채취되거나 유래된 임의의 세포, 조직, 또는 기관 뿐만 아니라 임의의 성숙 단계의 대두(Glycine max) 식물 조직을 포함하고자 하며, 예를 들어, 임의의 종자, 잎, 줄기, 꽃, 뿌리, 단일 세포, 생식체, 세포 배양물, 조직 배양물 또는 원형질체(protoplast)를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용된 "식물 물질"은 식물로부터 얻어지거나 유래된 물질을 지칭한다. 식물 물질을 포함하는 산물은 식품, 사료, 또는 식물 물질을 사용하여 생산되거나 식물 물질에 의해 오염될 수 있는 기타 산물에 관련된다. 본 발명과 관련하여, 이러한 생물학적 시료에 대해, 시료 내 핵산의 존재를 시사하는, EE-GM3, EE-GM1 및 EE-GM2에 특이적인 핵산의 존재를 시험하는 것으로 이해된다. 따라서, 생물학적 시료 내 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2 또는 EE-GM3 및 EE-GM1를 동정하기 위한 본 명세서의 방법은 우량 이벤트를 포함하는 핵산의 생물학적 시료 내 동정에 관련된다.
본 명세서에서 "포함하는"은 언급된 특징, 정수, 단계, 시약 또는 성분의 존재를 특정하는 것으로 해석되지만 하나 이상의 그의 특징, 정수, 단계 또는 성분 또는 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 따라서, 예를 들어, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 포함하는 핵산 또는 단백질은 실제로 언급된 것보다 더 많은 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 포함할 수 있으며, 구체적으로 더 큰 핵산 또는 단백질 안에 내재되어 있다. 기능적으로 또는 구조적으로 정의된 DNA 서열을 포함하는 키메릭 유전자는 추가의 DNA 서열, 예를 들어, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 대두에서 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM1의 스택(stack) 또는 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM2의 스택의 개발, 이들 이벤트의 스택을 포함하는 식물, 이들 식물로 부터 얻어진 자손 및 이들 스택을 포함하는 식물 유래의 식물 물질 또는 식물 세포에 관한 것이다. 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 식물은 실시예 1에 기재된 바와 같이 얻어질 수 있다. 스택은 통상의 육종 방법을 이용하여 단일 이벤트를 포함하는 식물을 교배시키고 두개의 상이한 이벤트를 포함하는 그의 자손을 동정함으로써 얻어진다.
EE-GM3 및 EE-GM1을 포함하는 대두 식물 또는 식물 물질은 실시예 2에서 EE-GM3 및 EE-GM1에 대해 기술하는 PCR 동정 프로토콜에 따라 동정될 수 있다. 간략히, 생물학적 시료 내에 존재하는 대두 게놈 DNA는 EE-GM3의 5' 또는 3' 측면 서열 내의 서열을 특이적으로 인식하는 프라이머, 예를 들어, 서열번호 5의 서열을 갖는 프라이머, 및 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 프라이머, 예를 들어, 서열번호 4의 서열을 갖는 프라이머이며, 및 추가로 EE-GM1의 5' 또는 3' 측면 서열 내 서열을 특이적으로 인식하는 프라이머, 예를 들어 서열번호 16의 서열을 갖는 프라이머, 및 외래 DNA 내 서열을 인식하는 프라이머, 예를 들어, 서열번호 17의 서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭시킨다.
EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 대두 식물 또는 식물 물질은 실시예 2에서 EE-GM3 및 EE-GM2에 대해 기술하는 PCR 동정 프로토콜에 따라 동정될 수 있다. 간략히, 생물학적 시료 내에 존재하는 대두 게놈 DNA는 EE-GM3의 5' 또는 3' 측면 서열 내의 서열을 특이적으로 인식하는 프라이머, 예를 들어, 서열번호 5의 서열을 갖는 프라이머, 및 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 프라이머, 예를 들어, 서열번호 4의 서열을 갖는 프라이머, 및 추가로 EE-GM2의 5' 또는 3' 측면 서열 내 서열을 특이적으로 인식하는 프라이머, 예를 들어 서열번호 18의 서열을 갖는 프라이머, 및 외래 DNA 내 서열을 인식하는 프라이머, 예를 들어, 서열번호 19의 서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭시킨다.
내인성 대두 서열의 일부를 증폭시키는 DNA 프라이머는 PCR 증폭에 대한 양성 대조군으로 사용된다. PCR 증폭 시, 상기 물질이 예측된 크기의 단편을 생산하면, 그 물질은 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1을 포함하는 대두 식물 또는 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 대두 식물 유래의 식물 물질을 함유한다.
EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 식물은 그들의 글라이포세이트 내성뿐만 아니라, 그들의 HPPD 저해제, 예를 들어, 아이소옥사플루톨에 대한 내성 및 추가로 그들의 글루포시네이트에 대한 내성을 특징으로 한다. 이벤트 스택을 포함하는 식물은 또한, 제초제를 적용하지 않는 경우에 상업적으로 이용가능한 대두 변종(variety)에 필적할만한 작물학적 특성을 가지는 것을 특징으로 한다. 본 명세서에 기술된 대두 식물 게놈의 삽입 영역 내 외래 DNA의 존재는 이 이벤트를 포함하는 식물에 특히 흥미로운 표현형 및 분자적 특성을 부여하는 것으로 관찰되었다.
본 발명의 일 실시형태는 대두 게놈 내 특정 위치에 이식유전자를 삽입하여 얻을 수 있는 대두 식물 내 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1 및/또는 EE-GM2의 조합을 제공하며, 여기에서 우량 이벤트는 대두 식물에 글라이포세이트, 글루포시네이트 및 HPPD 저해제 제초제, 예를 들어, 아이소옥사플루톨에 대한 내성을 부여하고, 여기에서 우량 이벤트는 대두의 작물학적 성과에 있어서 동질유전자 계통과 비교하여 대두 식물의 수확에 부정적으로 작용하는 어떠한 효과도 유발하지 않는다(본 명세서에서 사용된 "동질유전자 계통"(isogenic lines) 또는 "근동질유전자 계통"(near-isogenic lines)은 동일한 유전적 배경을 갖지만 이식유전자를 결여한 대두 계통, 예를 들어, 형질전환에 사용된 식물과 동일한 유전적 배경을 갖는 식물, 또는 이식유전자를 잃어버린 분리된 자매 계통이다). 특히, 본 발명은 대두 식물 내 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1 및/또는 EE-GM2의 조합을 제공하며, 여기에서 대두 식물의 게놈 내 상기 우량 이벤트의 삽입 또는 존재는 동질유전자 계통과 비교하여 대두 식물에서 질병에 대한 감수성 증가를 유발하지 않거나, 수확 감소를 유발하지 않거나, 쓰러짐(lodging) 증가를 유발하지 않는다. 따라서 본 발명은 EE-GM3 및 EE-GM1 및/또는 EE-GM2로 표시되는, 대두 식물 내 우량 이벤트의 조합을 제공하며, 그 결과 대두 식물은 동질유전자 계통과 비교하여 대두 식물의 수확에 부정적인 영향 없이 글라이포세이트, 글루포시네이트 및 HPPD 저해제 제초제(동시에 또는 별도로)에 견딜 수 있고, 대두 식물은 동질유전자 대두 식물과 비교하여 질병 감수성 또는 쓰러짐에 있어서 통계적으로 유의한 차이를 갖지 않는다. 이러한 특성에 의해 본 발명의 우량 이벤트 조합은 대두 밭에서 글라이포세이트-저항성 잡초를 방제하는데 매우 흥미롭게 이용되며, 대두 밭의 추가적인 글라이포세이트 저항성 발달을 방지하거나 지연시키는 연구에 있어서도 이용될 수 있다(예를 들어, 글라이포세이트 및 아이소옥사플루톨 및/또는 글루포시네이트의 적용에 의해, 또는 아이소옥사플루톨 및 글라이포세이트 및/또는 글루포시네이트의 적용에 의해, 또는 글루포시네이트 및 글라이포세이트 및/또는 아이소옥사플루톨의 적용에 의해, 대두 밭에 적용된 적어도 2 또는 3까지의 상이한 제초제 작용 모드를 확보한다).
본 명세서는 또한, 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM1 또는 EE-GM2를 포함하는 대두 식물 또는 그의 부분을 제공하며, 여기에서 이벤트 EE-GM3를 포함하는 대표적인 대두 종자는 41659의 수탁번호로 NC1MB에 기탁되어 있고, 우량 이벤트 EE-GM1을 포함하는 대표적인 대두 종자는 NCIMB 41658의 수탁번호로 NCIMB에 기탁되어 있으며, 우량 이벤트 EE-GM2를 포함하는 대표적인 종자는 NCIMB 41660의 수탁번호로 NCIMB에 기탁되어 있고, 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1를 포함하는 대표적인 대두 종자는 PTA-11041의 수탁번호로 ATCC에 기탁되어 있으며, 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 대표적인 대두 종자는 PTA-11042의 수탁번호로 ATCC에 기탁되어 있다.
EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 대두 식물 또는 그의 부분은 당업계에서 이용가능한 임의의 수단을 통해 각각의 기탁된 종자에서 발견될 수 있는 각각의 우량 이벤트를 조합하여 얻을 수 있으며, 예를 들어, 기탁된 종자 유래의 식물을 교배하거나, 그의 자손을 수집하거나, 우량 이벤트의 적합한 조합을 포함하는 자손 식물을 동정한다. 본 발명에 의해 이러한 이벤트를 포함하는 식물의 종자 뿐만 아니라 이러한 종자로부터 생산된 대두 산물이 추가로 제공되며, 여기에서 상기 대두 산물은 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM2를 포함한다. 이러한 대두 산물은 밀(meal), 빻은 종자, 가루(flour), 플레이크 등일 수 있거나 포함할 수 있다. 특히, 이러한 대두 산물은 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM1 또는 EE-GM2에 대한 진단용 앰플리콘을 생산하는 핵산을 포함하며, 이러한 앰플리콘은 서열번호 2 또는 3, 서열번호 14 또는 15 및/또는 서열번호 12 또는 13을 포함한다. 본 발명은 또한, 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM1 또는 EE-GM2를 포함하는 대두 종자를 얻고 이로부터 대두 산물을 생산하는 단계를 포함하는, 대두 산물의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 임의의 상기 대두 식물의 자손이며 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM2를 포함하는 대두 식물을 제공한다.
본 발명은 추가로, 특히 이벤트 EE-GM3를 함유하는 제1 대두 식물과 EE-GM1 및/또는 EE-GM2를 포함하는 대두 식물을 교배시켜 식물 이벤트 EE-GM3 및 이벤트 EE-GM1 또는 EE-GM2를 게놈 내로 도입하고, 글라이포세이트 및/또는 글루포시네이트 및/또는 아이소옥사플루톨에 내성을 가지는 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하는, 글라이포세이트 및/또는 글루포시네이트 및/또는 아이소옥사플루톨 제초제에 내성을 가지는 대두 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 특히 수확 감소 없이, 허용가능한 작물학적 특성을 지니며, 2mEPSPS, HPPD 및 PAT 단백질을 포함하고, 이벤트 EE-GM3 및 EE-GMl 또는 EE-GM3 및 EE-GM2에 대한 진단용 앰플리콘을 생산할 수 있는, 글라이포세이트 및 글루포시네이트 및/또는 아이소옥사플루톨 내성 식물을 제공한다.
본 발명은 추가로, 유효량의 아이소옥사플루톨계, 글라이포세이트계 및/또는 글루포시네이트계 제초제로 밭을 처리하는 것을 포함하여, 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 대두 식물 밭에서 잡초를 방제하는 방법, 또는 이러한 대두 식물을 재배하고자 하는 밭을 제공하며, 여기서 이러한 식물은 이러한 제초제(들)에 대해 내성을 지닌다.
본 발명은 추가로, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1431 내지 1472와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 220 내지 261과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열, 또는 상기 서열들의 상보 서열, 및 또한 서열번호 12의 뉴클레오타이드 199 내지 220과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열 및 서열번호 13의 뉴클레오타이드 558 내지 579와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열, 또는 상기 서열들의 상보 서열을 세포의 게놈 내에 포함하는 것을 특징으로 하는, EE-GM3 및 EE-GM1을 포함하는 대두 식물, 세포, 조직 또는 종자를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1431 내지 1472와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 220 내지 261과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열, 또는 상기 서열들의 상보 서열, 및 또한 서열번호 14의 뉴클레오타이드 301 내지 322와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열 및 서열번호 15의 뉴클레오타이드 497 내지 518과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열, 또는 상기 서열들의 상보 서열을 세포의 게놈 내에 포함하는 것을 특징으로 하는, EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 대두 식물, 세포, 조직 또는 종자를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "아이소옥사플루톨"은 제초제 아이소옥사플루톨[즉, (5-사이클로프로필-4-아이소옥사졸릴)[2-(메틸설포닐)-4-(트라이플루오로메틸)페닐]메탄온], 그의 활성 대사산물, 다이케토나이트릴, 및 상기 화합물을 포함하는 임의의 혼합물 또는 용액을 지칭한다. 본 발명의 이벤트를 포함하는 식물에 적용하기에 유용한 HPPD 저해제 제초제는 다이케토나이트릴, 예를 들어, 2-사이아노-3-사이클로프로필-1-(2-메틸설포닐-4-트라이플루오로메틸페닐)-프로판-1,3-다이온 및 2-사이아노-1-[4-(메틸설포닐)-2-트라이플루오로메틸페닐]-3-(1-메틸사이클로프로필)프로판-1,3-피온; 기타 아이소옥사졸; 및 피라졸리네이트, 예를 들어, 토프라메존[즉, [3-(4,5-다이하이드로-3-아이소옥사졸릴)-2-메틸-4-(메틸설포닐)페닐](5-하이드록시-1-메틸-lH-피라졸-4-일)메탄온], 및 피라설포톨[(5-하이드록시-1,3-다이메틸피라졸-4-일(2-메실-4-트라이플루아로메틸페닐)메탄온]; 또는 피라조펜[2-[4-(2,4-다이클로로벤조일)-1,3-다이메틸피라졸-5-일옥시]아세토페논]이다.
본 발명의 일 실시형태에서, EE-GM3 이벤트를 함유하는 대두 식물을 식재하고자 하는 밭은 대두 식물을 식재하거나 종자를 파종하기 전에 HPPD 저해제 제초제, 예를 들어, 아이소옥사플루톨('IFT')을 사용하여 처리할 수 있으며, 이는 HPPD 저해제에 의해 살해당하는 잡초 밭을 정화시켜 무경간농법(no-till)을 실시하는 경우 이후 동일한 예비-처리 밭에서 대두의 식재 또는 파종을 가능케한다(HPPD 저해제 제초제를 사용한 전소(burndown) 적용). IFT의 잔류 활성은 또한 초기 성장 단계에서 잡초와 경쟁하는 것으로부터 대두 식물의 발아 및 성장을 보호하게 된다. 일단 대두 식물이 일정 크기로 자라나고 잡초가 다시 나타나려 하면, 글라이포세이트, 또는 HPPD 저해제-글라이포세이트 혼합물을 발아 후 제초제로서 식물의 상단에 적용할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, EE-GM3 이벤트를 함유하는 종자를 파종하고자 하는 밭은 대두 식물이 발아하기 전, 그러나 종자를 파종한 후에 HPPD 저해제 제초제, 예를 들어, IFT를 사용하여 처리할 수 있으며(다른 수단, 전형적으로 통상의 경작 실행, 예를 들어, 쟁기질, 끌(chissel) 쟁기질, 또는 파종상 준비(seed bed preparation)를 이용하여 파종 전에 잡초가 없는 밭을 만들 수 있음), 여기에서 잔류 활성은 제초제에 의해 살해된 잡초가 없는 밭을 유지시켜 대두 식물의 발아 및 성장이 잡초와 경쟁할 필요가 없게 한다(HPPD 저해제 제초제의 발아 전 적용). 일단 대두 식물이 일정 크기로 자라나고 잡초가 다시 나타나려 하면, 글라이포세이트, 또는 HPPD 저해제-글라이포세이트 혼합물을 발아 후 제초제로서 식물의 상단에 적용할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, EE-GM3 이벤트를 함유하는 식물은 파종된 종자로부터 발아된 대두 식물의 상단에 HPPD 저해제 제초제, 예를 들어, IFT로 처리될 수 있으며, 이는 HPPD 저해제에 의해 살해된 잡초 밭을 정화시키고, 식물의 상단에 발아 후 제초제로서 글라이포세이트를 처리함과 함께 (예를 들어, 스프레이 탱크 믹스 내에서), 처리 전 또는 처리 후에 적용((글라이포세이트 존재 또는 부재하에) HPPD 저해제 제초제의 발아 후 적용)될 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM2를 포함하는 대두 식물을 하기 살충제, 제초제 또는 살진균제로 처리할 수 있으며, EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM2를 포함하는 대두 종자를 하기 살충제, 제초제 또는 살진균제를 포함하는 종자 코팅으로 코팅할 수 있다:
대두 제초제:
알라클로르, 벤타존, 트라이플루랄린, 클로리무론-에틸, 클로란설람-메틸, 페녹사프로프(Fenoxaprop), 포메사펜(Fomesafen), 플루아지폽(Fluazifop), 글라이포세이트, 이마자목스, 이마자퀸, 이마제타피르, (S-)메톨라클로르, 메트리부진, 펜다이메탈린(Pendimethalin), 테프랄록시딤, 아이소옥사플루톨, 글루포시네이트.
대두 살충제:
람다-사이할로트린(Lambda-cyhalothrin), 메토밀, 파라티온, 티오카브, 이미다클로프리드, 클로티아니딘, 티아메톡삼, 티아클로프리드, 아세트아미프리드, 디네토푸란, 플루벤다이아마이드, 리낙시피르(Rynaxypyr), 시아지피르(Cyazypyr), 스피노사드, 스피노토람, 에마멕틴-벤조에이트, 피프로닐(Fipronil), 에티프롤, 델타메트린, β-사이플루트린(β-Cyfluthrin), 감마 및 람다 사이할로트린, 4-[[(6-클로르피리딘-3-일)메틸](2,2-다이플루오르에틸)아미노]푸란-2(5H)-온, 스피로테트라매트, 스피노다이클로펜, 트라이플루무론, 플로니카미드, 티오디카브, 베타-사이플루트린.
대두 살진균제:
아족시스트로빈, 사이프로코나졸, 에폭시코나졸, 플루트리아폴, 피라클로스트로빈, 테부코나졸, 트라이플록시스트로빈, 프로티오코나졸, 테트라코나졸.
하기 실시예는 우량 이벤트 EE-GM3, EE-GM1 및 EE-GM2의 동정, 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1 또는 EE-GM3 및 EE-GM2의 스택을 함유하는 식물의 동정, 및 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3, EE-GM1 또는 EE-GM2 및 그의 스택의 특이적 동정을 위한 도구의 개발을 기술한다.
실시예에서 달리 언급하지 않는 한, 모든 재조합 기술은 문헌("Sambrook J and Russell DW (eds.) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York" 및 "Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K (eds.) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York")에 기재된 표준 프로토콜에 따라 수행되었다.
표준 물질 및 기준은 문헌("Croy RDD (ed.) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford and Blackwell Scientific Publications, Oxford" 및 "Brown TA, (1998) Molecular Biology LabFax, 2nd Edition, Academic Press, San Diego")에 기재되어 있다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 대한 표준 물질 및 방법은 문헌("McPherson MJ and Mφller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford" 및 "PCR Applications Manual, 3rd Edition (2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim or www.roche-applied-science.com")에서 찾을 수 있다.
임의의 실험(lab) 프로토콜, 예를 들어, 하기 실시예의 PCR 프로토콜에서 다수의 파라미터는 특정 실험실 조건에 따라 조정될 필요가 있을 것이며, 유사한 결과를 얻기 위해 약간 변형될 수도 있다. 예를 들어, DNA를 제조하는데 다른 방법을 사용하거나 PCR 방법에서 다른 프라이머를 선택하는 경우에 PCR 프로토콜을 수행하기 위해 상이한 최적의 조건이 필요할 수도 있다. 그러나 이러한 조정은 당업자에게 자명하며, 또한 최신 PCR 적용 매뉴얼에 구체적으로 기재되어 있다.
상세한 설명 및 실시예에서 하기 서열을 참조한다:
서열번호 1: 벡터 pSFlO의 SalI 단편 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 2: EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 3: EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 3' 측면 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 4: 프라이머 SOY028
서열번호 5: 프라이머 SOY029
서열번호 6: 프라이머 SMP187
서열번호 7: 프라이머 STV019
서열번호 8: 앰플리콘의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 9: 대조군 단편(SOY01) 증폭용 프라이머 1
서열번호 10: 대조군 단편(SOY02) 증폭용 프라이머 2
서열번호 11: pB2/P35SAcK의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 12: EE-GM1 내의 외래 DNA의 5' 측면 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 13: EE-GM1 내의 외래 DNA의 3' 측면 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 14: EE-GM2 내의 외래 DNA의 5' 측면 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 15: EE-GM2 내의 외래 DNA의 3' 측면 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 16: 프라이머 SOY06
서열번호 17: 프라이머 SOY07
서열번호 18: 프라이머 SOY09
서열번호 19: 프라이머 SOY010
서열번호 20: EE-GM3 내의 식물 측면 서열 및 외래 DNA의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 21: 프라이머 SHA130
서열번호 22: 프라이머 SHA178
실시예
1. 제초제 내성 유전자에 의한 글라이신
맥스(Glycine max)의
형질전환
1.1. 2
mEPSPS
및
HPPD
-
Pf
-
W336
키메릭
유전자를 포함하는 외래
DNA
의 설명
플라스미드 pSF10은 약 7.3 kb의 SalI 단편에 위치한 키메릭 hppd - Pf-W336 유전자 및 키메릭 2mepsps 유전자를 함유하는 pUC 19 유래의 클로닝 벡터이다. 2개의 SalI 제한효소 부위 사이에 포함된 DNA에 대한 전체 설명이 하기 표 1에 기재되어 있다. 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1로 표시된다.
| pSFlO의 SalI 제한효소 부위 사이에 포함된 DNA 의 뉴클레오타이드 위치(서열번호 1) | ||
| 뉴클레오타이드 위치 | 배향(Orientation) | 설명 및 참조 |
| 188-479 | 상보 서열 | 3'nos: 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 pTiT37의 T-DNA 유래의 노팔린 신타제 유전자의 3' 비번역 영역을 포함하는 서열(Depicker et al., 1982, Journal of Molecular and Applied Genetics, 1, 561-573) |
| 480-1556 | 상보 서열 | hppdPf W336: 보우덱 등(Boudec et al.) (2001)의 미국특허 제6245968B1호에 기술된 바와 같은, 아미노산 글라이신 336이 트립토판으로 대체됨으로써 개질된 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 균주 A32의 4-하이드록시페닐피루베이트 다이옥시게나제의 암호화 서열 |
| 1557-1928 | 상보 서열 | TPotp Y: 레브룬 등(Lebrun et al.) (1996)의 미국특허 제5510471호에 기술된 바와 같은, 제아 메이즈(Zea mays)(옥수수) 및 헬리안투스 안누스(해바라기)의 RuBisCO 스몰 서브유닛 유전자의 서열을 함유하는, 최적화된 운반 펩티드 유도체(위치 55가 타이로신으로 변화됨)의 암호화 서열 |
| 1929-2069 | 상보 서열 | 5'tev: 문헌(Carrington and Freed (1990) Journal of Virology, 64, 1590-1597)에 기술된 바와 같은 담배 식각 바이러스의 선도 서열(leader sequence)을 포함하는 서열 |
| 2070-3359 | 상보 서열 | Ph4a748 ABBC: 내부 중복(internal duplication)을 함유하는, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 히스톤 H4 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 서열 (Chaboute et al., 1987, Plant Molecular Biology, 8, 179-191) |
| 3360-4374 | Ph4a748: 아라비돕시스 탈리아나 히스톤 H4 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 서열(Chaboute et al., 1987, Plant Molecular Biology, 8, 179-191) | |
| 4375-4855 | intron1 h3At: 아라비돕시스 탈리아나 히스톤 H3.III 변이체의 유전자 II의 제1 인트론(Chaboute et al., 1992, Journal of Molecular Biology, 225, 569-574) | |
| 4856-5227 | TPotp C: 레브룬 등(Lebrun et al.) (1996) 미국특허 제5510471호에 기술된 바와 같은, 제아 메이즈(옥수수) 및 헬리안투스 안누스(해바라기)의 RuBisCO 스몰 서브유닛 유전자의 서열을 함유하는, 최적화된 운반 펩티드의 암호화 서열 | |
| 5228-6565 | 2mepsps: 제아 메이즈(옥수수)의 이중 돌연변이 5-에놀-피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 유전자의 암호화 서열(Lebrun et al., 1997, 국제 특허 공개 제9704103-A1호) | |
| 6566-7252 | 3'histonAt: 아라비돕시스 탈리아나 히스톤 H4 유전자의 3' 비번역 영역을 포함하는 서열(Chaboute et al., 1987, Plant Molecular Biology, 8, 179-191) | |
1.2. 이벤트
EE
-
GM3
약 7.3 kb의 HPLC 정제된 SalI-선형화된 pSF10 단편(2 mEPSPS 글라이포세이트-내성 유전자 및 HPPD 저해제 내성 유전자 HPPD - Pf - W336을 함유함)을 사용하여 대두 유형 잭(Jack)의 세포 내로 유전자의 직접적인 전달을 통해 형질전환된 대두 식물을 얻은 다음(Nickell, C. D., G. R. Noel, D. J. Thomas, and R. Waller. Registration of 'Jack' soybean. Crop Sci 1365. 30. 1990), 형질전환된 식물 세포의 재생(regeneration)을 통해 유전자이식 번식성 대두 식물을 얻었다.
1.2.1 우량 이벤트
EE
-
GM3
의 동정
제초제 내성 유전자의 양호한 발현 및 안정성에 기초한 집중적인 선택과정을 거쳐 우량 이벤트 EE-GM3를 선택하고, 최선의 작물학적 특성, 예를 들어, 식물 높이, 마디까지의 높이, 저항성(stand), 활력(vigor), 종자 수확과의 순응성(compatibility)을 평가하였다. 동일한 키메릭 유전자를 사용하여 얻어진, 광범위하고 상이한 형질전환 이벤트로부터 이 이벤트를 함유하는 대두 식물을 선택하였다. 이 이벤트의 선택에 사용되는 파라미터들은 다음과 같다: a) 현장 시험(field trial)에서 아이소옥사플루톨 제초제 적용에 대한 허용가능한 내성, b) 현장 시험에서 글라이포세이트 제초제 적용에 대한 허용가능한 내성, c) 현장 시험에서 아이소옥사플루톨 및 글라이포세이트 제초제의 조합 적용에 대한 허용가능한 내성, d) 벡터 골격(vector backbone)의 부재하에, 대두 식물 게놈 내 단일 좌위에서 제초제 내성 이식유전자의 삽입, e) 형질전환에 사용된 어버이 식물과 유사한 전체적인 작물학(성숙도, 쓰러짐, 질병 감수성 등), 및 f) (이벤트 부재하의 동질유전자 계통, 예를 들어, 동일 조건하에 성장한 형질전환에 사용된 식물 계통과 비교하여) 형질전환 DNA의 삽입에 의해 유발된 유의한 수확 감소 없음.
T3 세대에서, 대두 형질전환 이벤트 EE-GM3의 동형접합 계통을 종자 생산을 위해 선택하였다. 다중-위치 복제된 작물학적 현장 연구를 어버이 변종, 잭(Jack)의 적응(adaptation) 영역에서 수행하였다. 현장 평가는 제초제 내성 및 작물학적 성과를 포함하였다. EE-GM3를 포함하는 식물의 작물학적 성과를 (제초제가 적용되지 않은 경우에) 잭과 비교하여 구하였다.
현장 평가는 또한, EE-GM3 이벤트를 수반하는 식물이
- 잭과 비교하여 유사한 식물 형태 및 종자 특성,
- 잭과 비교하여 대두 질병에 대한 반응의 무변화, 및
- 잭과 비교하여 종자 발아(germination) 또는 휴지 상태(dormancy)의 무변화를 나타낸다는 것을 보여주었다.
온실에서 초기 형질전환체(T0) 식물(작제물로 형질전환되어 이벤트 EE-GM3를 생산하는 식물)로부터 수확된 종자(T1 또는 S1 세대)를 밭에 식재하였다. 3개의 블록에 식재하고 0, 2, 또는 4 kg/ha 글라이포세이트를 분무하였다. 제초제 글라이포세이트에 대해 목적하는 수준의 내성을 나타내는 식물로부터 종자를 수확하였다.
밭에서 자란 자가-수분된 T1 식물로부터 수확된 종자(T2 세대)를 "플랜트 투 로우(plant to row)" 파종하였다. 로우(완전히 또는 부분적으로 내성인)에 대한 분리(segregation) 데이터 및 로우 내의 개별적인 식물(내성 또는 감수성인)의 치 스퀘어(Chi aquare) 분석은 EE-GM3에 대한 단일 삽입의 예측된 멘델 유전을 입증하고 있다.
선택 및 종자 증가는 계통이 형질전환 이벤트 EE-GM3에 대해 동형접합인 것으로 결정되고, 제4 세대에서 코어 종자 생산을 위해 선택될 때까지 계속되었다. 그 후, T5 세대 종자가 상이한 변종의 개발을 위한 후보자로 사용되었다. 제6 세대(T6 세대)에서, 상업적인 대두 배원질(germplasm)의 더 넓은 베이스 내로 이벤트를 이동시키기 위해 고안된 유전자 침투 프로그램에서 식물을 통상의 대두 육종 계통과 교배시켰다. F1 하이브리드 식물(EE-GM3 계통 x 통상의 계통)을 성숙할 때까지 성장시키고 F2 종자를 식재하였다. 901 F2 식물의 잎 시료를 EE-GM3 삽입물의 접합성을 동정하기 위해 고안된 PCR 프라이머로 분석하였다. 맨델의 법칙에 의한 단일 삽입 분리에 대해 예측된 비율 1:2:1을 관찰하였다.
상이하고 상업적인 유전적 배경에 선택된 이벤트 EE-GM3를 도입하고, 상이한 위치에서의 현장 시험 결과를 비교하였다. 상이한 처리를 사용하여 글라이포세이트 제초제 및/또는 아이소옥사플루톨 제초제로 식물을 공격하였다. 식물은 양호한 제초제 내성을 나타내었다. 이벤트 EE-GM3를 함유하는 수백 가지의 상이한 대두 재배품종(soybean cultivar)을 유전 연구에 사용하였고, 제초제를 적용하였다. 이 시험으로부터 선택된 계통은 추후 밭에서 증가시키고, 또한 제초제로 처리하였다. 이 시험에서 50개의 선택된 계통을 증가시켰고, 이들을 또한 제초제로 처리하였다. 아이소옥사플루톨 및 글라이포세이트로 분무된 후자 계통에 대한 식물 독성 점수는 반응에 있어서 어느 정도의 다양성을 나타내었지만, 계통 사이의 반응 범위는 동일한 처리 및 환경 조건하에 성장한 오리지널 잭 배경에서 EE-GM3 이벤트의 4회 복제를 통해 관찰된 바와 같이 유사한 다양성을 반영하였다. 따라서, 광범위한 배원질에 걸친 관련 제초제에 대한 내성이 EE-GM3를 포함하는 식물에 대해 관찰되었다.
또한, 이벤트 EE-GM3를 함유하는 식물은 정상적인 잎, 꽃 및 꼬투리 형태, 우수한 번식성을 가지며, 다중 유전적 배경에서 질병을 보이거나 비정상적인 곤충 감수성을 보이지 않았다. 다중 유전적 배경 내로의 유전자 침투 중에 비정상적인 문제나 변칙성이 관찰되지 않았다.
한 계절 중에, 10-개소 연구를 고안하여 형질전환 이벤트 EE-GM3를 포함하는 이중 제초제 내성 대두의 작물학적 성과를 형질전환 어버이 변종, 잭 및 일부 비-유전자이식 대두 변종과 비교하였다. 무작위 완전 블록 고안을 사용하여, 통상의 잡초 방제가 이루어진, 또는 의도된 제초제 글라이포세이트 및 아이소옥사플루톨로 처리된 반복된 플롯(replicated plot)에서 EE-GM3 식물을 자라게 하였다. 형질전환 이벤트 EE-GM3를 함유하는 대두 식물을 가진 플롯에 아이소옥사플루톨 제초제를 70 그램 활성성분/Ha의 목표율로 분무하고 글라이포세이트 제초제를 1060 그램 활성성분/Ha의 목표율로 분무하였다. 대략 V4-V5 식물 성장 단계에서 잎의 분무로 이들 식물에 제초제를 적용하였다. 계절의 초기, 중기 및 후기에 작물학적 관찰을 수행하였다. 식물 밀도(파라미터; 저항성 카운트)는 1 표준 편차(one standard deviation)만큼 이벤트 EE-GM3 플롯에 비해 잭 및 비-유전자이식 변종 플롯의 경우 더 높았다. EE-GM3 심기 종자(planting seed)가 반대 계절 모판(nursery)에서 생산되는 반면 비-유전자이식 변종의 종자는 정상적인 생산 계절, 인접한 US에서 생산되기 때문에 초기 저항성 카운트 차이는 종자 소집단 품질의 결과일 수 있다. 그러나, 50% 발아 및 식물 활력 등급을 달성하기 위한 일(day) 수가 동일하며, 이는 종자 소집단이 이들 성과 파라미터에 있어서 필적할만하다는 것을 나타낸다. 늦은 계절 저항성 카운트에서, 잭 및 비-유전자이식 변종은 EE-GM3 식물과 여전히 1 표준 편차만큼 상이한 상태였다. EE-GM3 이벤트 식물의 플롯 수확도, 아마도 EE-GM3 이벤트 플롯의 더 낮은 식물 밀도의 결과로, 1 표준 편차만큼 잭의 수확에 비해 더 적었다. 비-유전자이식 변종의 수확은 잭보다 더 많았는데, 이는 좀더 최근의 변종에서 발견되는 수확 잠재성의 향상으로 인하여 예측될 수 있는 것이었다.
하나의 시험에서, 식물 건강 등급은 V4-5, R1 및 완전 성숙의 3가지 성장 단계에서 수행되었다. 첫 번째 평가는 의도된 제초제 적용 직후에 이루어졌다. 최종 식물 건강 평가시, 두 가지 제초제에 의해 분무된 EE-GM3-함유 식물은 분무되지 않은 잭 식물 또는 분무되지 않은 EE-GM3 포함 식물과 동일한 점수를 받았다. 작물학 스태프에 의한 등급에서, 제초제-분무된 식물은 V4-5 및 R1 식물 성장 단계에서 3-4 (중간정도의 손상)의 건강 등급을 받았다. 분무되지 않은 식물(형질전환되지 않은 잭 또는 EE-GM3를 함유한 대두 식물)은 4.6-4.8 (등급 5는 손상이 없음을 나타낸다)로 등급이 매겨졌다. 최종 식물 건강 등급시, 모든 플롯은 동일하게 등급 5(손상 없음)를 받았다.
한 시험 계절은 예외적인 강우를 겪은 계절 중 하나로서 의도된 제초제를 적용한 후에 EE-GM3 식물에서의 작물 손상이 다른 계절에서 관찰된 것보다 더욱 명백하였다. 현장 평가는 또한, 건강(fitness) 특성들(생식, 질병 저항성, 다산성, 종자 유포, 휴지 상태, 지속성)의 점검을 포함하였다. 생식 특성; 발아까지의 일수, 50% 개화까지의 일수 및 90% 꼬투리 성숙까지의 일수의 경우에, EE-GM3 및 잭 식물은 다르지 않았다. 식물 질병 및 곤충 해충의 자연적인 감염에 대한 반응에 있어서도 차이점이 보이지 않았다. 비록 EE-GM3가 잭에 비해 더 적은 최종 수확량을 보였지만, 다산성(100 종자 무게)에 있어서도 차이점이 발견되지 않았다. 종자 유포 파라미터(꼬투리 터짐 및 식물 쓰러짐)의 평가에 있어서도 EE-GM3와 잭은 동일한 꼬투리 터짐 점수를 가지는 것으로 발견되었지만, EE-GM3 식물이 덜 쓰러지는 경향이 있는 것으로 발견되었다. 10개 개소로부터 수확된 종자를 평가한 결과 발아 또는 휴지 상태 시험의 경우 어떤 문제도 발견되지 않았다.
예외적인 강우를 겪은 계절 중의 이들 시험에서, EE-GM3 식물의 최종 수확은 잡초 방제 처리와 무관하게 (아마도 EE-GM3 이벤트 플롯의 더 낮은 식물 밀도의 결과로) 1 표준 편차만큼 잭의 수확보다 적었다. 예외적으로 습한 계절 중에, 글라이포세이트 및 아이소옥사플루톨 제초제를 잎에 적용한 후 6주 이내 동안 EE-GM3 플롯에 대해 작물 손상(10-30% 작물 면적의 표백)이 보고되었다. 그러나, 성숙에 의해, "손상 없음"의 식물 건강 등급이 모든 플롯에 매겨졌다. 이식유전자를 함유하지 않는 근동질유전자 자매 계통과 비교할 때, 우량 대두 재배품종 배경 내에 EE-GM3 유전자 침투된 것에 대한 반복된 다중-위치 현장 시험은 이벤트 EE-GM3을 함유하는 식물과 근동질유전자 계통 사이에 (제초제 처리의 부재하에) 수확의 차이를 보이지 않을 것으로 예측된다.
또한, 반복된 현장 시험에서 EE-GM3를 포함하는 대두 식물은 발아 전 또는 후에 IFT(0.5% NIS, Agridex와 함께 70 그램 활성성분/ha)로 처리된 경우 유의한 작물 내성(10% 미만의 표백)을 보였지만, 또한 EE-GM3를 포함하는 대두 식물은 발아 후에 또 다른 HPPD 저해제 제초제인 피라설포톨(0.5% NIS, Agridex와 함께 35 그램 활성성분/ha)로 처리된 경우 유의한 작물 내성(10% 미만의 표백)을 보였다.
1.2.2 우량 이벤트
EE
-
GM3
의 외래
DNA
및 측면 영역의 동정
EE-GM3 우량 이벤트에서 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 측면 영역의 서열을 다음과 같이 결정하였다.
1.2.2.1. 오른쪽 (5') 측면 영역
5' 측면 영역을 포함하는 것으로 동정된 단편을 서열분석하고 그의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 2로 나타낸다. 뉴클레오타이드 1 내지 1451 사이의 서열이 식물 DNA에 상응하는 반면, 뉴클레오타이드 1452 내지 1843 사이의 서열이 외래 DNA에 상응한다.
1.2.2.2. 왼쪽 (3') 측면 영역
3' 측면 영역을 포함하는 것으로 동정된 단편을 서열분석하고 그의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 3으로 나타낸다. 뉴클레오타이드 1 내지 240 사이의 서열이 외래 DNA에 상응하는 반면, 뉴클레오타이드 241 내지 1408 사이의 서열이 식물 DNA에 상응한다.
1.2.2.3. EE-GM3의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA
상이한 분자 기술을 사용하여, 제초제 내성 유전자를 포함하는 우량 이벤트 EE-GM3의 외래 DNA가 머리-대-머리(head-to-head) 방향으로 2개의 부분적인 3' histonAt 서열을 함유하며, 이어서 머리-대-꼬리(head-to-tail) 방향으로 배열된 pSF10의 SalI 단편의 거의 완전한 2개의 복제물을 함유하는 것을 확인하였다(도 1 참조).
따라서 EE-GM3의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA는 하기 서열을 순서대로 함유한다:
- 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 199: 서열번호 1의 nt 6760 내지 nt 6958의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열;
- 뉴클레오타이드 200 내지 뉴클레오타이드 624: 서열번호 1의 nt 6874 내지 nt 7298의 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열;
- 뉴클레오타이드 625 내지 뉴클레오타이드 7909: 서열번호 1의 nt 7 내지 nt 7291의 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열;
- 뉴클레오타이드 7910 내지 뉴클레오타이드 15163: 서열번호 1의 nt 12 내지 nt 7265의 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열; 및
- 뉴클레오타이드 15164 내지 뉴클레오타이드 15187: 서열번호 3의 nt 217 내지 nt 240의 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열(이 서열은 pSFlO 플라스미드 DNA 또는 야생형 식물 DNA에 상응하지 않으며, 따라서 충진재 DNA로 표시된다).
이 외래 DNA의 앞에는 바로 업스트림에 외래 DNA와 인접하여 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 1451의 5' 측면 서열이 존재하고, 뒤에는 바로 다운스트림에 외래 DNA와 인접하여 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 3' 측면 서열이 존재한다.
EE-GM3에서 측면 DNA 서열 및 외래 DNA의 전체 DNA 서열분석을 통해 확인한 결과 서열번호 20의 서열이 보고되었다. 이 서열에서, 삽입된 DNA는 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638이고, 머리-대-꼬리 방향으로 배열된 2개의 거의 완전한 pSF10 유래의 복제물은 뉴클레오타이드 위치 2257 내지 뉴클레오타이드 위치 16601이다. 서열번호 20의 5' 측면 DNA 서열은 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1 내지 뉴클레오타이드 위치 1451의 서열이고, 서열번호 20의 3' 측면 DNA 서열은 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 16639 내지 뉴클레오타이드 위치 17806의 서열이다.
1.3.
포스피노트리신아세틸트랜스퍼라제
키메릭
유전자를 포함하는 외래
DNA
의 설명
플라스미드 pB2/P35SAcK는 키메릭 pat 유전자를 함유하는 pUC19 유래 클로닝 벡터이다. 벡터의 설명이 하기 표 2에 제공된다. 그의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 11에 나타내었다.
| pB2/P35SAcK (서열번호 11)의 구성 요소의 뉴클레오타이드 위치 | |
| 뉴클레오타이드 위치 | 설명 및 참조 |
| 461-1003 | 콜리플라워 모자이크 바이러스 유래의 35S 프로모터 |
| 1004-1011 | 합성 폴리링커 유래의 서열 |
| 1012-1563 | 합성 pat 유전자(스트렙토마이세스 비리도크로모겐즈 유래의 아미노산 서열) |
| 1564-1581 | 합성 폴리링커 유래의 서열 |
| 1582-1784 | 콜리플라워 모자이크 바이러스 유래의 35S 터미네이터 |
1.4. 이벤트
EE
-
GMl
1.4.1 EE-GMl의 동정
유전자의 직접적인 전달을 통해 대두를 벡터 pB2/P35SAcK로 형질전환시켜 제초제-저항성 대두를 개발하였다.
제초제 저항성 유전자의 양호한 발현 및 안정성과 최선의 작물학적 특성과의 순응성에 기초한 집중적인 선택과정을 거쳐 우량 이벤트 EE-GM1을 선택하였다.
1.4.2 우량 이벤트 EE-GM1의 외래 DNA 및 측면 영역의 동정
1.4.2.1. 오른쪽 (5') 측면 영역
5' 측면 영역을 포함하는 것으로 동정된 단편을 서열분석하고 그의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 12로 나타낸다. 뉴클레오타이드 1 내지 209 사이의 서열이 식물 DNA에 상응하는 반면, 뉴클레오타이드 210 내지 720 사이의 서열이 외래 DNA에 상응한다.
1.4.2.2. 왼쪽 (3') 측면 영역
3' 측면 영역을 포함하는 것으로 동정된 단편을 서열분석하고 그의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 13으로 나타낸다. 뉴클레오타이드 1 내지 568 사이의 서열이 외래 DNA에 상응하는 반면, 뉴클레오타이드 569 내지 1000 사이의 서열이 식물 DNA에 상응한다.
1.4.2.3. EE-GM1의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA
상이한 분자 기술을 사용하여, 제초제 내성 유전자를 포함하는 우량 이벤트 EE-GM1의 외래 DNA가 직접적인 반복 구조로 키메릭 pat 유전자의 2개 복제물을 포함하는지 확인하였다(도 3 참조).
따라서 EE-GM1의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA는 하기 서열을 순서대로 함유한다:
- 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 3122: 서열번호 11의 nt 340 내지 nt 3461의 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열;
- 뉴클레오타이드 3123 내지 뉴클레오타이드 3458: 서열번호 11의 nt 1 내지 nt 336의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열;
- 뉴클레오타이드 3459 내지 뉴클레오타이드 4073: 서열번호 11의 nt 3462 내지 nt 4076의 뉴클레오타이드 서열의 상보 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열;
- 뉴클레오타이드 4074 내지 뉴클레오타이드 6780: 서열번호 11의 nt 337 내지 nt 3043의 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열; 및
- 뉴클레오타이드 6781 내지 뉴클레오타이드 6790: 서열번호 13의 nt 559 내지 nt 568의 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열(이 서열은 플라스미드 DNA 또는 야생형 식물 DNA에 상응하지 않으며, 따라서 충진재 DNA로 표시된다).
이 EE-GM1의 외래 DNA의 앞에는 바로 업스트림에 외래 DNA와 인접하여 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 209의 5' 측면 서열이 존재하고, 뒤에는 바로 다운스트림에 외래 DNA와 인접하여 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 뉴클레오타이드 1000의 3' 측면 서열이 존재한다.
1.5. 이벤트
EE
-
GM2
유전자의 직접적인 전달을 통해 대두를 벡터 pB2/P35SAcK로 형질전환시켜 제초제-저항성 대두를 개발하였다.
제초제 저항성 유전자의 양호한 발현 및 안정성과 최선의 작물학적 특성과의 순응성에 기초한 집중적인 선택과정을 거쳐 우량 이벤트 EE-GM2를 선택하였다.
1.5.1 우량 이벤트 EE-GM2의 외래 DNA 및 측면 영역의 동정
1.5.1.1. 오른쪽 (5') 측면 영역
5' 측면 영역을 포함하는 것으로 동정된 단편을 서열분석하고 그의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 14로 나타낸다. 뉴클레오타이드 1 내지 311 사이의 서열이 식물 DNA에 상응하는 반면, 뉴클레오타이드 312 내지 810 사이의 서열이 외래 DNA에 상응한다.
1.5.1.2. 왼쪽 (3') 측면 영역
3' 측면 영역을 포함하는 것으로 동정된 단편을 서열분석하고 그의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 15로 나타낸다. 뉴클레오타이드 1 내지 507 사이의 서열이 외래 DNA에 상응하는 반면, 뉴클레오타이드 569 내지 1880 사이의 서열이 식물 DNA에 상응한다.
1.5.1.3. EE-GM2의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA
상이한 분자 기술을 사용하여, 제초제 내성 유전자를 포함하는 우량 이벤트 EE-GM2의 외래 DNA가 키메릭 pat 유전자의 1개 복제물을 포함하는지 확인하였다(도 4 참조).
따라서 EE-GM2의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA는 하기 서열을 순서대로 함유한다:
- 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 391: 서열번호 11의 nt 3458 내지 nt 3848의 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열; 및
- 뉴클레오타이드 392 내지 뉴클레오타이드 3436: 서열번호 11의 nt 413 내지 nt 3457의 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열.
이 EE-GM2의 외래 DNA의 앞에는 바로 업스트림에 외래 DNA와 인접하여 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 311의 5' 측면 서열이 존재하고, 뒤에는 바로 다운스트림에 외래 DNA와 인접하여 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 뉴클레오타이드 1880의 3' 측면 서열이 존재한다.
2.
EE
-
GM3
에 대한 중합효소 연쇄 반응 동정 프로토콜의 개발
2.1.
프라이머
우량 이벤트 내의 서열을 인식하는 특이적 프라이머를 개발하였다.
EE-GM3의 3' 측면 영역 내 서열을 인식하는 프라이머를 개발하였다. 그 후, 제2프라이머를 외래 DNA 서열 내에서 선택하여 프라이머가 약 263개의 뉴클레오타이드 서열에 걸치게 하였다. 하기 프라이머가 EE-GM3 DNA에 대한 PCR 반응에서 특히 명확하고 재현성 있는 결과를 주는 것으로 확인되었다.
SOY028: 5'-ATC.gCT.TTA.ACg.TCC.CTC.Ag-3 (서열번호 4)
(표적: 삽입 DNA)
SOY029: 5'-CAA.ggC.CTC.gAg.ATT.ATC-3' (서열번호 5)
(표적: 식물 DNA)
내인성(endogenous) 서열을 표적으로 하는 프라이머는 바람직하게는 PCR 칵테일에 포함된다. 이들 프라이머는 미지 시료 및 DNA 양성 대조군에서 내부 대조군으로 작용한다. 내인성 프라이머-쌍에 의한 양성 결과(PCR 증폭된 413 bp의 단편의 존재)는 생성하고자 하는 PCR 산물용 게놈 DNA 준비물 내에 적합한 품질을 가진 충분한 DNA가 존재하는 것을 입증한다. 내인성 프라이머는 내인성 액틴(actin) 대두 유전자를 인식하기 위해 선택되었다.
SOY01 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT-3' (서열번호 9)
SOY02 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC-3' (서열번호 10)
2.2. 증폭된 단편
PCR 반응에서 예측된 증폭된 단편은 다음과 같다:
프라이머쌍 SOY01-SOY02의 경우: 413bp (내인성 대조군)
프라이머쌍 SOY028-SOY029의 경우: 263bp (EE-GM3 우량 이벤트)
2.3. 주형
DNA
주형 DNA를 에드워즈 등(Edwards et al., Nucleic Acid Research, 19, pl349, 1991)에 따라 잎 펀치(leaf punch)로 부터 제조하였다. 다른 방법으로 제조된 DNA를 사용하는 경우, 상이한 양의 주형을 이용한 시험 실행(test run)을 수행하여야 한다. 보통 50 ng의 게놈 주형 DNA가 최선의 결과를 나타낸다.
2.4. 배정된 양성 및 음성 대조군(
Assigned
positive
and
negative
controls
)
허위의 양성 또는 음성을 피하기 위하여, 하기 양성 및 음성 대조군이 PCR 실행에 포함되어야 하는 것으로 결정하였다:
- 마스터 믹스 대조군(DNA 음성 대조군). 이것은 반응에 DNA가 첨가되지 않은 PCR이다. PCR 산물의 부재라는 예측된 결과가 관찰되는 경우, 이는 PCR 칵테일이 표적 DNA에 의해 오염되지 않았음을 의미한다.
- DNA 양성 대조군(이식유전자 서열을 함유하는 것으로 알려진 게놈 DNA 시료). 본 양성 대조군의 성공적인 증폭은 PCR이 표적 서열의 증폭을 허용하는 조건 하에 실행되었음을 입증한다.
- 야생형 DNA 대조군. 이것은 제공된 주형 DNA가 비-유전자이식 식물로부터 제조된 게놈 DNA인 PCR이다. 이식유전자 PCR 산물의 증폭은 없지만 내인성 PCR 산물의 증폭이 있다는 예측된 결과가 관찰되는 경우, 이는 게놈 DNA 시료 내에 이식유전자 배경 증폭이 검출되지 않음을 의미한다.
2.5.
PCR
조건
하기 조건 하에 최상의 결과를 얻었다(최상의 결과를 위한 다양한 조건을 기술하는 것은 그러한 조건의 예시를 제공하는 것을 의미한다. 명백히, 당업자는 다른 Taq 중합효소를 사용하는 것과 같이, 조건, 시약 및 파라미터를 변화시켜 목적하는 결과를 달성할 수 있다).
- 25 ㎕ 반응을 위한 PCR 믹스는 다음을 포함한다:
20 ng 주형 DNA
2.5 ㎕ lOx 증폭 완충액(Taq 중합효소와 함께 제조업자에 의해 공급됨)
0.5 ㎕ 10 mM dNTP's
0.4 ㎕ SOY01 (10p㏖/㎕)
0.4 ㎕ SOY02 (10p㏖/㎕)
0.7 ㎕ SOY028 (10p㏖/㎕)
0.7 ㎕ SOY029 (10p㏖/㎕)
0.1 ㎕ Taq DNA 중합효소 (5 유닛/㎕)
25 ㎕까지의 물
- 최상의 결과를 얻기 위해 따라야 하는 열변환(thermocycling) 프로파일은 다음과 같다:
95℃에서 4분
이어서 5 사이클 동안
95℃에서 1분
57℃에서 1분
72℃에서 2분
이어서 25 사이클 동안
92℃에서 30초
57℃에서 30초
72℃에서 1분
이어서 72℃에서 10분
2.6.
아가로즈
겔 분석
PCR 결과를 최상으로 가시화하기 위하여, 적합한 분자량 마커(예를 들어 100 bp ladder Pharmacia)와 함께 1.5% 아가로즈 겔(트리스-보레이트 완충액) 상에 PCR 시료 10 내지 20 ㎕가 적용되어야 한다고 결정하였다.
2.7. 결과의 검증
1) DNA 양성 대조군이 예측된 PCR 산물(유전자이식 및 내인성 단편)을 보이고, 2) DNA 음성 대조군이 PCR 증폭에 대해 음성이며(단편 없음), 3) 야생형 DNA 대조군이 예측된 결과(내인성 단편 증폭)를 보이는 경우를 제외하고, 단일 PCR 실행 및 단일 PCR 칵테일 내의 유전자이식 식물 DNA 시료로부터의 데이터는 받아들여져서는 안 되는 것으로 결정되었다.
전술한 바와 같은 EE-GM3에 대한 PCR 동정 프로토콜에 따르는 경우, 예측된 크기의 유전자이식 및 내인성 PCR 산물의 가시적인 양을 보이는 레인은 그로부터 게놈 주형 DNA가 제조된 상응하는 식물이 EE-GM3 우량 이벤트를 물려받았음을 나타낸다. 유전자이식 PCR 산물의 어느 하나의 가시적 양을 보이지 않고 내인성 PCR 산물의 가시적 양을 보이는 레인은 그로부터 게놈 주형 DNA가 제조된 상응하는 식물이 우량 이벤트를 포함하지 않음을 나타낸다. 내인성 및 유전자이식 PCR 산물의 가시적 양을 보이지 않는 레인은 게놈 DNA의 질 및/또는 양이 PCR 산물이 생성되는 것을 허용하지 않았음을 나타낸다. 이들 식물은 점수를 매길 수 없다. 게놈 DNA 제조를 반복하여야 하며, 적합한 대조군을 포함하는 새로운 PCR 실행을 수행하여야 한다.
2.8.
EE
-
GM3
를 동정하기 위한 식별
PCR
프로토콜의 이용
미지 시료를 선별하고자 시도하기 전에, 모든 적합한 대조군을 사용하여 시험 실행을 수행한다. 개발된 프로토콜은 실험실마다 상이할 수 있는 성분들에 대한 최적화를 요구할 수도 있다(주형 DNA 제조, Taq DNA 중합효소, 프라이머의 질, dNTP's, 열변환 등).
내인성 서열의 증폭은 프로토콜에서 중심적인 역할을 한다. 당업자는 공지의 유전자이식 게놈 DNA 주형 내의 내인성 및 유전자이식 서열 모두의 동몰량을 증폭시키는 PCR 및 열변환 조건을 얻어야만 한다. 아가로즈 겔 전기영동에 의해 판단하여, 표적 내인성 단편이 증폭되지 않거나 표적 서열이 동일한 에티듐 브로마이드 염색 강도로 증폭되지 않을 때는 언제든지 PCR 조건의 최적화가 요구될 수 있다.
다수의 대두 식물로부터 유래되며 이들 중의 일부는 EE-GM3를 포함하는 잎 물질을 상기 프로토콜에 따라 시험하였다. 우량 이벤트 EE-GM3 및 야생형 대두로부터의 시료를 각각 양성 및 음성 대조군으로 선정하였다.
도 2는 다수의 대두 식물 시료 상의 EE-GM3에 대한 우량 이벤트 PCR 동정 프로토콜을 사용하여 얻어진 결과를 설명하고 있다. 레인 2 및 3의 시료는 263 bp 밴드가 검출되었으므로 우량 이벤트 EE-GM3를 함유하는 것으로 밝혀진 반면, 레인 4 내지 8의 시료는 EE-GM3를 포함하지 않는다. 레인 6 및 7은 동일한 제초제 내성 키메릭 유전자를 사용하여 얻어진 기타 대두 형질전환 이벤트로부터의 시료를 포함하고; 레인 8은 야생형 대두 식물로부터의 DNA를 함유하며, 레인 9는 음성 대조군(물) 시료를 나타내고, 레인 1 및 10은 분자량 마커(100 bp ladder)를 나타낸다.
2.9. 벌크 종자 내의
EE
-
GM3
검출을 위한
dPCR
검정
식별용 PCR(dPCR) 어세이를 확립하여 벌크 종자 내의 낮은 수준의 EE-GM3 존재를 검출한다. 비 유전자이식 종자의 벌크 내의 유전자이식 종자의 최소 수준 0.4%(w/w)를 반복가능한 조건 하에 성공적으로 검출하였다. 따라서 검출 한도는 0.4%(w/w)인 것으로 결정되었다.
본 표적 PCR 반응에는 하기 프라이머를 적용한다:
T-DNA 서열을 표적으로 하는 전방향(forward) 프라이머:
SHA130 5'-CTA.TAT.TCT.ggT.TCC.AAT.TTA.TC-3' (서열번호 12)
3' 측면 서열을 표적으로 하는 역방향(reverse) 프라이머:
SMP178 5'-TgA.ggC.ACg.TAT.TgA.TgA.CC-3' (서열번호 13)
이들 프라이머로부터 PCR 반응에서 예측된 증폭 단편은 115 bp이다.
변형된 젠트라 퓨어젠(Gentra Puregene) DNA 정제 추출 키트(Qiagen)에 따라 그라운드 벌크 종자로부터 제조된 약 200 ng의 주형 DNA에 대해 표적 PCR 반응을 수행한다. 다른 방법으로 제조된 DNA를 사용하는 경우, 공지의 상대적인 수준의 EE-GM3 시료를 사용하는 시험 실행을 수행하여야 한다.
내인성 서열을 표적으로 하는, 검증된 기준 시스템 PCR 반응은 이상적으로 별개의 PCR 실행에서 수행되어 PCR 분석용 DNA 시료의 적합성을 확인함으로써 허위의 음성적 결과를 피하여야 한다.
미지의 시험 시료를 위하여 PCR 실험은 이상적으로 적합한 양성 및 음성 대조군 시료, 즉, 하기의 것을 포함하여야 한다:
- 마스터 믹스 대조군(DNA 음성 대조군). 이것은 반응에 DNA가 첨가되지 않은 PCR이다. 예측된 결과(PCR 산물의 부재)가 표적 및 기준 시스템 반응 모두에서 관찰되는 경우, 이는 PCR 칵테일이 표적 DNA에 의해 오염되지 않았음을 의미한다.
- DNA 양성 대조군(이식유전자 서열을 함유하는 것으로 알려진 게놈 DNA 시료). 본 양성 대조군의 성공적인 증폭은 PCR이 표적 서열의 증폭을 허용하는 조건 하에 실행되었음을 입증한다.
- 또한, 야생형 DNA 대조군이 본 PCR에 첨가될 수 있다. 이것은 제공된 주형 DNA가 비-유전자이식 식물로부터 제조된 게놈 DNA인 PCR이다. 이식유전자 PCR 산물의 증폭은 없지만 내인성 PCR 산물의 증폭이 있다는 예측된 결과가 관찰되는 경우, 이는 게놈 DNA 시료 내에 이식유전자 배경 증폭이 검출되지 않음을 의미한다.
하기 조건 하에 최상의 결과가 얻어진다.
- 25 ㎕ 반응을 위한 PCR 믹스는 다음을 포함한다:
200 ng 주형 DNA
5 ㎕ 5x 반응 완충액
0.25 ㎕ 20 mM dNTP's
0.7 ㎕ SHA130 (10p㏖/ℓ)
0.4 ㎕ SMP178 (10p㏖/ℓ)
0.1 ㎕ GO-Taq DNA 중합효소 (5 유닛/ℓ)
25 ㎕까지 물을 첨가
- 최상의 결과를 얻기 위해 따라야 하는 열변환 프로파일은 다음과 같다:
95℃에서 4분
이어서 5 사이클 동안
95℃에서 1분
57℃에서 1분
72℃에서 2분
이어서 30 사이클 동안
92℃에서 30초
57℃에서 30초
72℃에서 1분
이어서 72℃에서 10분
PCR 결과를 최상으로 가시화하기 위하여, 적합한 분자량 마커(예를 들어 50 bp ladder)와 함께 1.5% 아가로즈 겔(트리스-보레이트 완충액) 상에 PCR 산물 25 ㎕가 적용되어야 한다고 결정하였다.
상기 PCR 방법에 따르는 경우, 예측된 크기의 표적 및 기준 시스템 PCR 산물의 가시적인 양을 보이는 레인은 그로부터 게놈 주형 DNA가 제조된 시험 시료가 표적 반응의 검출 한도 초과로 EE-GM3 우량 이벤트의 수준을 함유하는 것을 나타낸다.
표적 PCR 산물의 가시적 양을 보이지 않고 기준 시스템 PCR 산물의 가시적 양을 보이는 레인은 그로부터 게놈 주형 DNA가 제조된 시험 시료가 표적 반응의 검출 한도 미만으로 EE-GM3 우량 이벤트의 수준을 함유하는 것을 나타낸다.
내인성 및 유전자이식 PCR 산물의 가시적 양을 보이지 않는 레인은 게놈 DNA의 질 및/또는 양이 PCR 산물이 생성되는 것을 허용하지 않았음을 나타낸다. 이들 식물은 점수를 매길 수 없다. 게놈 DNA 제조를 반복하여야 하며, 적합한 대조군을 포함하는 새로운 PCR 실행을 수행하여야 한다.
3.
EE
-
GM3
를 포함하는 물질의 검출용
프로브로서
특이적 통합 단편의 이용
특이적 프라이머 SOY028(서열번호 4) 및 SOY029(서열번호 5)를 사용하는 PCR 증폭에 의해 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 앰플리콘을 제조하거나 화학적 합성에 의해 EE-GM3의 특이적 통합(integration) 단편을 얻고 표지하였다. 이 통합 단편을 생물학적 시료 내의 EE-GM3 검출용 특이적 프로브로 사용한다. 표준 절차에 따라 시료로부터 핵산을 추출한다. 그 후, 이 핵산을 하이브리드의 형성을 허용하기 위해 최적화된 혼성화 조건 하에 특이적 프로브와 접촉시킨다. 그 후, 하이브리드의 형성을 검출하여 시료 내 EE-GM3 핵산의 존재를 나타낸다. 임의로, 특이적 프로브와 접촉시키기 전에 특이적 프라이머를 사용하여 시료 내 핵산을 증폭시킨다. 대안적으로, 통합 단편 대신에 특이적 프로브와 접촉시키기 전에 핵산을 표지한다. 임의로, 시료와 접촉시키기 전에 특이적 프로브를 고체 담체(예를 들어 필터, 스트립 또는 비드를 예시할 수 있지만 이들로 한정되지는 않음)에 부착시킨다.
4.
EE
-
GMl
에 대한 중합효소 연쇄 반응 동정 프로토콜
4.1.
프라이머
우량 이벤트 내의 서열을 인식하는 특이적 프라이머를 제작하였다. 더욱 특히, EE-GM1의 5' 측면 영역 내의 서열을 인식하는 프라이머를 제작하였다. 그 다음 외래 DNA의 서열 내에서 제2의 프라이머를 선택하여 프라이머가 약 183개의 뉴클레오타이드 서열에 걸치도록 하였다. 하기 프라이머가 EE-GM1 DNA에 대한 PCR 반응에서 특히 명확하고 재현성 있는 결과를 주는 것으로 확인되었다.
SOY06: 5'-ggC.gTT.CgT.AgT.gAC.TgA.gg-3' (서열번호 16)
(표적: 식물 DNA)
SOY07: 5'-gTT.TTA.CAA.CgT.CgT.gAC.Tgg-3' (서열번호 17)
(표적: 삽입 DNA)
내인성 서열을 표적으로 하는 프라이머는 바람직하게 PCR 칵테일에 포함된다. 이들 프라이머는 미지 시료 및 DNA 양성 대조군에서 내부 대조군으로 작용한다. 내인성 프라이머-쌍에 의한 양성 결과는 생성하고자 하는 PCR 산물용 게놈 DNA 준비물 내에 적합한 품질을 가진 충분한 DNA가 존재하는 것을 입증한다. 내인성 프라이머는 글라이신 맥스(Glycine max) 내의 관리 유전자를 인식하도록 선택되었다.
SOY01: 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT-3' (서열번호 9)
(글라이신 맥스 액틴 1 유전자 (수탁번호 J01298)에 위치)
SOY02: 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC-3' (서열번호 10)
(글라이신 맥스 액틴 1 유전자 (수탁번호 J01298)에 위치)
4.2. 증폭된 단편
PCR 반응에서 예측된 증폭된 단편은 다음과 같다:
프라이머쌍 SOY01-SOY02의 경우: 413bp (내인성 대조군)
프라이머쌍 SOY06-SOY07의 경우: 183bp (EE-GM1 우량 이벤트)
4.3. 주형
DNA
주형 DNA를 에드워즈 등(Edwards et al., Nucleic Acid Research, 19, pl349, 1991)에 따라 잎 펀치(leaf punch)로 부터 제조하였다. 다른 방법으로 제조된 DNA를 사용하는 경우, 상이한 양의 주형을 이용한 시험 실행을 수행하여야 한다. 보통 50 ng의 게놈 주형 DNA가 최선의 결과를 나타낸다.
4.4. 배정된 양성 및 음성 대조군
허위의 양성 또는 음성을 피하기 위하여, 하기 양성 및 음성 대조군이 PCR 실행에 포함되어야 하는 것으로 결정하였다:
- 마스터 믹스 대조군(DNA 음성 대조군). 이것은 반응에 DNA가 첨가되지 않은 PCR이다. PCR 산물의 부재라는 예측된 결과가 관찰되는 경우, 이는 PCR 칵테일이 표적 DNA에 의해 오염되지 않았음을 의미한다.
- DNA 양성 대조군(이식유전자 서열을 함유하는 것으로 알려진 게놈 DNA 시료). 본 양성 대조군의 성공적인 증폭은 PCR이 표적 서열의 증폭을 허용하는 조건 하에 실행되었음을 입증한다.
- 야생형 DNA 대조군. 이것은 제공된 주형 DNA가 비-유전자이식 식물로부터 제조된 게놈 DNA인 PCR이다. 이식유전자 PCR 산물의 증폭은 없지만 내인성 PCR 산물의 증폭이 있다는 예측된 결과가 관찰되는 경우, 이는 게놈 DNA 시료 내에 이식유전자 배경 증폭이 검출되지 않음을 의미한다.
4.5.
PCR
조건
하기 조건 하에 최상의 결과를 얻었다:
- 25 ㎕ 반응을 위한 PCR 믹스는 다음을 포함한다:
2.5 ㎕ 주형 DNA
2.5 ㎕ lOx 증폭 완충액(Taq 중합효소와 함께 공급됨)
0.5 ㎕ 10 mM dNTP's
0.5 ㎕ SOY06 (10p㏖/㎕)
0.5 ㎕ SOY07 (10p㏖/㎕)
0.25 ㎕ SOY01 (10p㏖/㎕)
0.25 ㎕ SOY02 (10p㏖/㎕)
0.1 ㎕ Taq DNA 중합효소 (5 유닛/㎕)
25 ㎕까지의 물
- 최상의 결과를 얻기 위해 따라야 하는 열변환 프로파일은 다음과 같다:
95℃에서 4분
이어서 5 사이클 동안
95℃에서 1분
57℃에서 1분
72℃에서 2분
이어서 25 사이클 동안
92℃에서 30초
57℃에서 30초
72℃에서 1분
이어서 72℃에서 5분
4.6.
아가로즈
겔 분석
PCR 결과를 최상으로 가시화하기 위하여, 적합한 분자량 마커(예를 들어 100 bp ladder Pharmacia)와 함께 1.5% 아가로즈 겔(트리스-보레이트 완충액) 상에 PCR 시료 10 내지 20 ㎕가 적용되어야 한다고 결정하였다.
4.7. 결과의 검증
1) DNA 양성 대조군이 예측된 PCR 산물(유전자이식 및 내인성 단편)을 보이고, 2) DNA 음성 대조군이 PCR 증폭에 대해 음성이며(단편 없음), 3) 야생형 DNA 대조군이 예측된 결과(내인성 단편 증폭)를 보인다면, 단일 PCR 실행 및 단일 PCR 칵테일 내의 유전자이식 식물 DNA 시료로부터의 데이터가 받아들여지는 것으로 결정되었다.
상기 EE-GM1에 대한 PCR 동정 프로토콜에 따르는 경우, 예측된 크기의 유전자이식 및 내인성 PCR 산물의 가시적인 양을 보이는 레인은 그로부터 게놈 주형 DNA가 제조된 상응하는 식물이 EE-GM1 우량 이벤트를 물려받았음을 나타낸다. 유전자이식 PCR 산물의 어느 하나의 가시적 양을 보이지 않고 내인성 PCR 산물의 가시적 양을 보이는 레인은 그로부터 게놈 주형 DNA가 제조된 상응하는 식물이 우량 이벤트를 포함하지 않음을 나타낸다. 내인성 및 유전자이식 PCR 산물의 가시적 양을 보이지 않는 레인은 게놈 DNA의 질 및/또는 양이 PCR 산물이 생성되는 것을 허용하지 않았음을 나타낸다. 이들 식물은 점수를 매길 수 없다. 게놈 DNA 제조를 반복하여야 하며, 적합한 대조군을 포함하는 새로운 PCR 실행을 수행하여야 한다.
4.8.
EE
-
GM1
을 동정하기 위한 식별
PCR
프로토콜의 이용
미지 시료를 선별하고자 시도하기 전에, 모든 적합한 대조군을 사용하여 시험 실행을 수행하여야 한다. 개발된 프로토콜은 실험실마다 상이할 수 있는 성분들에 대한 최적화를 요구할 수 있다(주형 DNA 제조, Taq DNA 중합효소, 프라이머의 질, dNTP's, 열변환 등).
내인성 서열의 증폭은 프로토콜에서 중심적인 역할을 한다. 당업자는 공지의 유전자이식 게놈 DNA 주형 내의 내인성 및 유전자이식 서열 모두의 동몰량을 증폭시키는 PCR 및 열변환 조건을 얻어야만 한다. 아가로즈 겔 전기영동에 의해 판단하여, 표적 내인성 단편이 증폭되지 않거나 표적 서열이 동일한 에티듐 브로마이드 염색 강도로 증폭되지 않을 때는 언제든지 PCR 조건의 최적화가 요구될 수 있다.
다수의 식물로부터 유래되며 이들 중의 일부는 EE-GM1을 포함하는 글라이신 맥스 잎 물질을 상기 프로토콜에 따라 시험하였다. 우량 이벤트 EE-GM1 및 야생형 글라이신 맥스로부터의 시료를 각각 양성 및 음성 대조군으로 선정하였다.
도 5는 다수의 대두 식물 시료 상의 EE-GM1에 대한 우량 이벤트 PCR 동정 프로토콜을 사용하여 얻어진 결과를 설명하고 있다(레인 1 내지 14). 레인 1의 시료는 185 bp 밴드가 검출되었으므로 우량 이벤트를 함유하는 것으로 밝혀진 반면, 레인 2, 3 및 4의 시료는 EE-GM1을 포함하지 않는다. 레인 2는 다른 대두 우량 이벤트를 포함하고, 레인 3은 비-유전자이식 글라이신 맥스 대조군을 나타내며, 레인 4는 음성 대조군(물) 시료를 나타내고, 레인 5는 분자량 마커(100 bp)를 나타낸다.
5.
EE
-
GM1
을 포함하는 물질의 검출용
프로브로서
특이적 통합 단편의 이용
EE-GM1의 특이적 통합 단편을 특이적 프라이머 SOY06(서열번호 16) 및 SOY07(서열번호 17)을 사용하는 PCR 증폭에 의해 얻거나 화학적 합성에 의해 얻고 표지하였다. 이 통합 단편을 생물학적 시료 내의 EE-GM1 검출용 특이적 프로브로 사용한다. 표준 절차에 따라 시료로부터 핵산을 추출한다. 그 후, 이 핵산을 하이브리드의 형성을 허용하기 위해 최적화된 혼성화 조건 하에 특이적 프로브와 접촉시킨다. 그 후, 하이브리드의 형성을 검출하여 시료 내 EE-GM1 핵산의 존재를 나타낸다. 임의로, 특이적 프로브와 접촉시키기 전에 특이적 프라이머를 사용하여 시료 내 핵산을 증폭시킨다. 대안적으로, 통합 단편 대신에 특이적 프로브와 접촉시키기 전에 핵산을 표지한다. 임의로, 시료와 접촉시키기 전에 특이적 프로브를 고체 담체(예를 들어 필터, 스트립 또는 비드를 예시할 수 있지만 이들로 한정되지는 않음)에 부착시킨다.
6.
EE
-
GM2
에 대한 중합효소 연쇄 반응 동정 프로토콜
6.1.
프라이머
우량 이벤트 내의 서열을 인식하는 특이적 프라이머를 제작하였다. 더욱 특히, EE-GM2의 3' 측면 영역 내의 서열을 인식하는 프라이머를 제작하였다. 그 다음 외래 DNA의 서열 내에서 제2의 프라이머를 선택하여 프라이머가 약 150개의 뉴클레오타이드 서열에 걸치도록 하였다. 하기 프라이머가 EE-GM2 DNA에 대한 PCR 반응에서 특히 명확하고 재현성 있는 결과를 주는 것으로 확인되었다.
SOY09: 5'-TgT.ggT.TAT.ggC.ggT.gCC.ATC-3' (서열번호 18)
(표적: 식물 DNA)
SOY010: 5'-TgC.TAC.Agg.CAT.CgT.ggT.gTC-3' (서열번호 19)
(표적: 삽입 DNA)
내인성 서열을 표적으로 하는 프라이머는 바람직하게 PCR 칵테일에 포함된다. 이들 프라이머는 미지 시료 및 DNA 양성 대조군에서 내부 대조군으로 작용한다. 내인성 프라이머-쌍에 의한 양성 결과는 생성하고자 하는 PCR 산물용 게놈 DNA 준비물 내에 적합한 품질을 가진 충분한 DNA가 존재하는 것을 입증한다. 내인성 프라이머는 글라이신 맥스 내의 관리 유전자를 인식하도록 선택되었다.
SOY01: 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT-3' (서열번호 9)
(글라이신 맥스 액틴 1 유전자 (수탁번호 JO1298)에 위치)
SOY02: 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC-3' (서열번호 10)
(글라이신 맥스 액틴 1 유전자 (수탁번호 JO1298)에 위치)
6.2. 증폭된 단편
PCR 반응에서 예측된 증폭된 단편은 다음과 같다:
프라이머쌍 SOY01-SOY02의 경우: 413bp (내인성 대조군)
프라이머쌍 SOY09-SOY010의 경우: 151bp (EE-GM2 우량 이벤트)
6.3. 주형
DNA
주형 DNA를 에드워즈 등(Edwards et al., Nucleic Acid Research, 19, pl349, 1991)에 따라 잎 펀치(leaf punch)로 부터 제조하였다. 다른 방법으로 제조된 DNA를 사용하는 경우, 상이한 양의 주형을 이용한 시험 실행을 수행하여야 한다. 보통 50 ng의 게놈 주형 DNA가 최선의 결과를 나타낸다.
6.4. 배정된 양성 및 음성 대조군
허위의 양성 또는 음성을 피하기 위하여, 하기 양성 및 음성 대조군이 PCR 실행에 포함되어야 하는 것으로 결정하였다:
- 마스터 믹스 대조군(DNA 음성 대조군). 이것은 반응에 DNA가 첨가되지 않은 PCR이다. PCR 산물의 부재라는 예측된 결과가 관찰되는 경우, 이는 PCR 칵테일이 표적 DNA에 의해 오염되지 않았음을 의미한다.
- DNA 양성 대조군(이식유전자 서열을 함유하는 것으로 알려진 게놈 DNA 시료). 본 양성 대조군의 성공적인 증폭은 PCR이 표적 서열의 증폭을 허용하는 조건 하에 실행되었음을 입증한다.
- 야생형 DNA 대조군. 이것은 제공된 주형 DNA가 비-유전자이식 식물로부터 제조된 게놈 DNA인 PCR이다. 이식유전자 PCR 산물의 증폭은 없지만 내인성 PCR 산물의 증폭이 있다는 예측된 결과가 관찰되는 경우, 이는 게놈 DNA 시료 내에 이식유전자 배경 증폭이 검출되지 않음을 의미한다.
6.5.
PCR
조건
하기 조건 하에 최상의 결과를 얻었다:
- 25 ㎕ 반응을 위한 PCR 믹스는 다음을 포함한다:
2.5 ㎕ 주형 DNA
2.5 ㎕ lOx 증폭 완충액(Taq 중합효소와 함께 공급됨)
0.5 ㎕ 10 mM dNTP's
0.5 ㎕ SOY09 (10p㏖/㎕)
0.5 ㎕ SOY010 (10p㏖/㎕)
0.25 ㎕ SOY01 (10p㏖/㎕)
0.25 ㎕ SOY02 (lOp㏖/㎕)
0.1 ㎕ Taq DNA 중합효소 (5 유닛/㎕)
25 ㎕까지의 물
- 최상의 결과를 얻기 위해 따라야 하는 열변환 프로파일은 다음과 같다:
95℃에서 4분
이어서 5 사이클 동안
95℃에서 1분
57℃에서 1분
72℃에서 2분
이어서 25 사이클 동안
92℃에서 30초
57℃에서 30초
72℃에서 1분
이어서 72℃에서 5분
6.6.
아가로즈
겔 분석
PCR 결과를 최상으로 가시화하기 위하여, 적합한 분자량 마커(예를 들어 100 bp ladder Pharmacia)와 함께 1.5% 아가로즈 겔(트리스-보레이트 완충액) 상에 PCR 시료 10 내지 20 ㎕가 적용되어야 한다고 결정하였다.
6.7. 결과의 검증
1) DNA 양성 대조군이 예측된 PCR 산물(유전자이식 및 내인성 단편)을 보이고, 2) DNA 음성 대조군이 PCR 증폭에 대해 음성이며(단편 없음), 3) 야생형 DNA 대조군이 예측된 결과(내인성 단편 증폭)를 보인다면, 단일 PCR 실행 및 단일 PCR 칵테일 내의 유전자이식 식물 DNA 시료로부터의 데이터가 받아들여지는 것으로 결정되었다.
상기 EE-GM2에 대한 PCR 동정 프로토콜에 따르는 경우, 예측된 크기의 유전자이식 및 내인성 PCR 산물의 가시적인 양을 보이는 레인은 그로부터 게놈 주형 DNA가 제조된 상응하는 식물이 EE-GM2 우량 이벤트를 물려받았음을 나타낸다. 유전자이식 PCR 산물의 어느 하나의 가시적 양을 보이지 않고 내인성 PCR 산물의 가시적 양을 보이는 레인은 그로부터 게놈 주형 DNA가 제조된 상응하는 식물이 우량 이벤트를 포함하지 않음을 나타낸다. 내인성 및 유전자이식 PCR 산물의 가시적 양을 보이지 않는 레인은 게놈 DNA의 질 및/또는 양이 PCR 산물이 생성되는 것을 허용하지 않았음을 나타낸다. 이들 식물은 점수를 매길 수 없다. 게놈 DNA 제조를 반복하여야 하며, 적합한 대조군을 포함하는 새로운 PCR 실행을 수행하여야 한다.
6.8.
EE
-
GM2
를 동정하기 위한 식별
PCR
프로토콜의 이용
미지 시료를 선별하고자 시도하기 전에, 모든 적합한 대조군을 사용하여 시험 실행을 수행하여야 한다. 개발된 프로토콜은 실험실마다 상이할 수 있는 성분들에 대한 최적화를 요구할 수 있다(주형 DNA 제조, Taq DNA 중합효소, 프라이머의 질, dNTP's, 열변환 등).
내인성 서열의 증폭은 프로토콜에서 중심적인 역할을 한다. 당업자는 공지의 유전자이식 게놈 DNA 주형 내의 내인성 및 유전자이식 서열 모두의 동몰량을 증폭시키는 PCR 및 열변환 조건을 얻어야만 한다. 아가로즈 겔 전기영동에 의해 판단하여, 표적 내인성 단편이 증폭되지 않거나 표적 서열이 동일한 에티듐 브로마이드 염색 강도로 증폭되지 않을 때는 언제든지 PCR 조건의 최적화가 요구될 수 있다.
다수의 식물로부터 유래되며 이들 중의 일부는 EE-GM2를 포함하는 글라이신 맥스 잎 물질을 상기 프로토콜에 따라 시험하였다. 우량 이벤트 EE-GM2 및 야생형 글라이신 맥스로부터의 시료를 각각 양성 및 음성 대조군으로 선정하였다.
도 6은 다수의 대두 식물 시료 상의 EE-GM2에 대한 우량 이벤트 PCR 동정 프로토콜을 사용하여 얻어진 결과를 설명하고 있다(레인 1 내지 14). 레인 1의 시료는 185 bp 밴드가 검출되었으므로 우량 이벤트를 함유하는 것으로 밝혀진 반면, 레인 2, 3 및 4의 시료는 EE-GM2를 포함하지 않는다. 레인 2는 다른 대두 우량 이벤트를 포함하고, 레인 3은 비-유전자이식 글라이신 맥스 대조군을 나타내며, 레인 4는 음성 대조군(물) 시료를 나타내고, 레인 5는 분자량 마커(100 bp)를 나타낸다.
7.
EE
-
GM2
를 포함하는 물질의 검출용
프로브로서
특이적 통합 단편의 이용
EE-GM2의 특이적 통합 단편을 특이적 프라이머 SOY09(서열번호 18) 및 SOY010(서열번호 19)을 사용하는 PCR 증폭에 의해 얻거나 화학적 합성에 의해 얻고 표지하였다. 이 통합 단편을 생물학적 시료 내의 EE-GM2 검출용 특이적 프로브로 사용한다. 표준 절차에 따라 시료로부터 핵산을 추출한다. 그 후, 이 핵산을 하이브리드의 형성을 허용하기 위해 최적화된 혼성화 조건 하에 특이적 프로브와 접촉시킨다. 그 후, 하이브리드의 형성을 검출하여 시료 내 EE-GM2 핵산의 존재를 나타낸다. 임의로, 특이적 프로브와 접촉시키기 전에 특이적 프라이머를 사용하여 시료 내 핵산을 증폭시킨다. 대안적으로, 통합 단편 대신에 특이적 프로브와 접촉시키기 전에 핵산을 표지한다. 임의로, 시료와 접촉시키기 전에 특이적 프로브를 고체 담체(예를 들어 필터, 스트립 또는 비드를 예시할 수 있지만 이들로 한정되지는 않음)에 부착시킨다.
8.
EE
-
GM3
및
EE
-
GM1
또는
EE
-
GM3
및
EE
-
GM2
를 포함하는 대두 식물의 생성 및 이러한 식물의 작물학적 성과의 평가
우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1의 조합을 함유하는 대두 식물을 EE-GM3를 포함하는 어버이 대두 식물과 EE-GM1을 포함하는 어버이 대두 식물의 통상적인 교배에 의해 얻었다. 본 명세서에 기술된, EE-GM1 및 EE-GM3에 대한 PCR 동정 프로토콜을 이용하여 양쪽 이벤트를 포함하는 자손 식물을 동정한다. 구체적으로, EE-GM3 및 여러 EE-GM1 계통을 함유하는 식물들과의 교배가 이루어졌다. 생성된 Fl 식물을 성장시키고 글라이포세이트 및 글루포시네이트로 분무하였다. F1 식물로부터 F2 종자를 수확하고 식재하였다(F2 식물은 분무되지 않았다). F2 단일 식물을 뽑았다. F2:F3 식물 로우(row)를 성장시키고 글라이포세이트 및 글루포시네이트로 분무하였다. EE-GM3 및 EE-GM1 모두에 대해 동형접합인 로우를 동정하고 후에 수확하였다. 본 시험으로부터의 분리(segregation) 데이터는 이벤트의 예측된 멘델 분리를 보여주었다.
우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2의 조합을 함유하는 대두 식물을 EE-GM3를 포함하는 어버이 대두 식물과 EE-GM2를 포함하는 어버이 대두 식물의 통상적인 교배에 의해 얻었다. 본 명세서에 기술된, EE-GM2 및 EE-GM3에 대한 PCR 동정 프로토콜을 이용하여 양쪽 이벤트를 포함하는 자손 식물을 동정한다. 구체적으로, EE-GM3를 함유하는 식물 및 EE-GM2를 함유하는 식물과의 교배가 이루어졌다. 생성된 Fl 식물을 4개 통상의 계통으로 교배시켰다. 이들 교배로부터의 F1을 밭에서 성장시키고 글라이포세이트 및 글루포시네이트로 분무하였다. 그 후, 양쪽 제초제에 저항성인 F1 식물로부터 수확한 F2 종자를 식재하였다. F2 식물을 글라이포세이트 및 글루포시네이트 둘 다에 의해 분무하였다. 양쪽 제초제에 내성을 지닌 9백 개 식물을 수확하고 현장 시험에서 식재하였다. 본 시험에서 이벤트에 대해 예측된 멘델 분리 데이터를 얻었다. 추가 연구에서의 작물학적 균일성을 위해, 양쪽 제초제에 내성을 가지는 약 40개 동형접합 계통을 선택하였다. 이들 계통은 양호한 작물학적 특성과 함께 양쪽 제초제에 대해 양호한 내성을 가졌다.
다중의 장소에서 이와 같이 상이한 유형의 상업적 배원질 내에 이벤트 조합을 포함하는 대두 식물을 사용하여 현장 시험을 실시하고, 식물의 다양한 작물학적 파라미터, 예를 들어, 식물 높이, 마디까지의 높이, 저항성, 활력, 종자 수확, 및 글라이포세이트, 아이소옥사플루톨 및 글루포시네이트 내성 수준을 평가하였다.
9. 바람직한 재배품종으로의
EE
-
GM3
및
EE
-
GM1
또는
EE
-
GM2
의 유전자 침투
우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM1 또는 EE-GM2를 반복적인 역-교배에 의해 상업적인 대두 재배품종 내로 도입하였으며, 이는 다음에 열거하는 것들을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다:
대두 재배품종 7631014 (US2009252860); 대두 재배품종 7431014 (US2009252859); 대두 재배품종 7925084 (US2009252858); 대두 재배품종 7311153 (US2009252857); 대두 재배품종 S070159 (US2009252856); 대두 재배품종 7535357 (US2009246353); 대두 재배품종 S070160 (US2009246352); 대두 재배품종 26074414 (US2009249508); 대두 재배품종 7509171 (US2009249507); 대두 재배품종 S070158 (US2009246351); 대두 재배품종 7511119 (US2009249506); 대두 재배품종 7113111 (US2009238945); 대두 재배품종 S06-02RM018047 (US7592518); 대두 재배품종 7013345 (US2009232957); 대두 재배품종 7041461 (US2009235376); 대두 재배품종 7549450 (US2009232956); 대두 재배품종 7317090 (US2009232955); 대두 재배품종 2N2V58015 (US2009226597); 대두 재배품종 7243182 (US2009226596); 대두 재배품종 7143182 (US2009226595); 대두 재배품종 257043182 (US2009220673); 대두 재배품종 S070157 (US2009222950); 대두 재배품종 306924721 (US2009220672); 대두 재배품종 7614385 (US2009220671); 대두 재배품종 7925118 (US2009214750); 대두 재배품종 7821295 (US2009214749); 대두 재배품종 7811336 (US2009214748); 대두 재배품종 S070150 (US2009214747); 대두 재배품종 6214260 (US2009214746); 대두 재배품종 S070152 (US2009214745); 대두 재배품종 7429331 (US2009214751); 대두 재배품종 26034631 (US2009208634); 대두 재배품종 S07-03JR108674 (US7560621); 대두 재배품종 S07-03KL016279 (US7560620); 대두 재배품종 S06-CL959411 (US7554017); 대두 재배품종 SG3870NRR (US2009158453); 대두 재배품종 HFPR-G (CA2645702); 대두 재배품종 S06-02JR423016 (US7521606); 대두 재배품종 S06-0lJR119814 (US7518039); 대두 재배품종 S06-OlJR119448 (US7518038); 대두 재배품종 6540220 (US2009055960); 대두 재배품종 S060292 (US2009055959); 대두 재배품종 S050228 (US2009055958); 대두 재배품종 S06-02JR423003 (US7491873); 대두 재배품종 S06-02JR423005 (US7491872); 대두 재배품종 S06-02JR409114 (US7485782); 대두 재배품종 S06-SJ144056 (US7473823); 대두 재배품종 (US7470835); 대두 재배품종 6910450 (US2008282369); 대두 재배품종 6223012 (US7446246); 대두 재배품종 6549250 (US7446245); 대두 재배품종 17731225 (US2008271204); 대두 재배품종 6928285 (US2008271203); 대두 재배품종 6736054 (US2008271169); 대두 재배품종 S060299 (US2008271199); 대두 재배품종 S060294 (US2008271202); 대두 재배품종 6943322 (US2008271201); 대두 재배품종 5343260 (US2008263719); 대두 재배품종 6439359 (US2008263704); 대두 재배품종 6238359 (US2008263703); 대두 재배품종 6547272 (US2008263702); 대두 재배품종 6929431 (US2008263701); 대두 재배품종 6703392 (US2008263700); 대두 재배품종 6044483 (US2008263699); 대두 재배품종 S050224 (US2008263698); 대두 재배품종 6719022 (US2008263697); 대두 재배품종 5826056 (US2008263696); 대두 재배품종 6265047 (US2008263724); 대두 재배품종 6928331 (US2008263695); 대두 재배품종 6719331 (US2008263694); 대두 재배품종 6636454 (US2008263693); 대두 재배품종 6226454 (US2008263718); 대두 재배품종 Q0073801 (US2008256657); 대두 재배품종 6326393 (US2008256652); 대두 재배품종 6408448 (US2008256651); 대두 재배품종 6449315 (US2008250524); 대두 재배품종 S060296 (US2008250523); 대두 재배품종 6012078 (US2008250522); 대두 재배품종 6342078 (US2008250521); 대두 재배품종 6419156 (US2008250520); 대두 재배품종 5723264 (US2008250519); 대두 재배품종 S050225 (US2008250518); 대두 재배품종 S060298 (US2008244783); 대두 재배품종 6935331 (US2008244782); 대두 재배품종 6819456 (US2008244787); 대두 재배품종 S060297 (US2008244781); 대두 재배품종 6135319 (US2008244786); 대두 재배품종 6819331 (US2008244780); 대두 재배품종 6137445 (US2008244779); 대두 재배품종 6917445 (US2008244778); 대두 재배품종 6111333 (US2008244777);대두 재배품종 S050229 (US2008244776); 대두 재배품종 6114011 (US2008244775); 대두 재배품종 6900358 (US2008244784); 대두 재배품종 6345184 (US2008244774); 대두 재배품종 6836085 (US2008244773); 대두 재배품종 6635047 (US2008244772); 대두 재배품종 6139105 (US2008244771); 대두 재배품종 6434385 (US2008244770); 대두 재배품종 S060295 (US2008244769); 대두 재배품종 6035184 (US2008244768); 대두 재배품종 S060293 (US2008209590); 대두 재배품종 6733322 (US2008209594); 대두 재배품종 6421326 (US2008209593); 대두 재배품종 S060077 (US2008209589); 대두 재배품종 6600375 (US2008209592); 대두 재배품종 S06-CL821457 (US7420104); 대두 재배품종 S07-02KG294306 (US7414178); 대두 재배품종 S06-BA046119 (US7414175); 대두 재배품종 S07-02KG294307 (US7411114); 대두 재배품종 SG3865N (US2008189802); 대두 재배품종 6701475 (US7408097); 대두 재배품종 1335025 (US2008178316); 대두 재배품종 1686017 (US2008178315); 대두 재배품종 2388028 (US2008178314); 대두 재배품종 2387029 (US2008178313); 대두 재배품종 S06-WW152330 (US7388129); 대두 재배품종 6424090 (US7385118); 대두 재배품종 6723322 (US7385115); 대두 재배품종 SG4377NRR (US7385114); 대두 재배품종 S06-02JR111334 (US7381864); 대두 재배품종 6141287 (US7378577); 대두 재배품종 MT110501 (US7378576); 대두 재배품종 (US7378575); 대두 재배품종 S06-WW169267 (US7375261); 대두 재배품종 6223392 (US7371939); 대두 재배품종 S06-CL968413 (US7371937); 대두 재배품종 S06-CL951107 (US7368636); 대두 재배품종 S06-MT9152077 (US7361810); 대두 재배품종 4211676 (US2008092253); 대두 재배품종 S06-M059029 (US735510l); 대두 재배품종 6548193 (US7345228); 대두 재배품종 6440261 (US7345227); 대두 재배품종 S060291 (US7342151); 대두 재배품종 S06-MT9206166 (US7339094); 대두 재배품종 S06-WW013107 (US7339093); 대두 재배품종 S06-M03256 (US7335820); 대두 재배품종 6134466 (US7332656); 대두 재배품종 S06-0lJR123373 (US7329800); 대두 재배품종 S06-MT9211059 (US7326831); 대두 재배품종 26170838 (US2008016590); 대두 재배품종 306612412 (US2008016588); 대두 재배품종 26660135 (US2008016587); 대두 재배품종 306734323 (US2008016586); 대두 재배품종 S06-0lJR122235 (US7317144); 대두 재배품종 5900450 (US7314986); 대두 재배품종 S06-MT116260 (US7314984); 대두 재배품종 S06-S1143606 (US7312381); 대두 재배품종 S06-98181-G01-35167 (US7309819); 대두 재배품종 26082635 (US7304219); 대두 재배품종 BA922834 (US7304217); 대두 재배품종 OlJR123480 (US7304216); 대두 재배품종 M061422 (US7304215); 대두 재배품종 17082821 (US2007277262); 대두 재배품종 17621620 (US2007277261); 대두 재배품종 00977706 (US2007277260); 대두 재배품종 S060182 (US2007277259); 대두 재배품종 26312034 (US7301078); 대두 재배품종 26143837 (US7301077); 대두 재배품종 435.TCS (US2007271626); 대두 재배품종 495.RC (US2007271625); 대두 재배품종 5306230 (US7297845); 대두 재배품종 S06-WW167686 (US7291772); 대두 재배품종 6141145 (US2007245426); 대두 재배품종 S050232 (US2007226829); 대두 재배품종 5333301 (US2007226828); 대두 재배품종 S050215 (US2007226827); 대두 재배품종 3235020 (US2007226826); 대두 재배품종 5720482 (US2007226825); 대두 재배품종 S050216 (US2007226824); 대두 재배품종 5512112 (US2007226823); 대두 재배품종 3233021 (US2007226822); 대두 재배품종 1336024 (US2007226821); 대두 재배품종 5348287 (US2007226820); 대두 재배품종 5204220 (US2007226819); 대두 재배품종 6188027 (US2007226818); 대두 재배품종 4183026 (US2007226817); 대두 재배품종 S06-WW157958 (US7271325); 대두 재배품종 5733056 (US2007209091); 대두 재배품종 90501911 (US2007209090); 대두 재배품종 S050221 (US2007204361); 대두 재배품종 5802205 (US2007204360); 대두 재배품종 1000642 (US2007204359); 대두 재배품종 5420128 (US2007204358); 대두 재배품종 S050222 (US2007199094); 대두 재배품종 S050217 (US2007199093); 대두 재배품종 S050223 (US2007199092); 대두 재배품종 S050218 (US2007199091); 대두 재배품종 5419227 (US2007199089); 대두 재배품종 5319227 (US2007199088); 대두 재배품종 5723045 (US2007199087); 대두 재배품종 5051007 (US2007199086); 대두 재배품종 5826175 (US2007192893); 대두 재배품종 S050231 (US2007192892); 대두 재배품종 5826376 (US2007192891); 대두 재배품종 5628386 (US2007192890); 대두 재배품종 5138236 (US2007186307); 대두 재배품종 5608398 (US2007186306); 대두 재배품종 S050230 (US2007186305); 대두 재배품종 5624126 (US2007180561); 대두 재배품종 5019225 (US2007180560); 대두 재배품종 5549483 (US2007180559); 대두 재배품종 4189010 (US2007180551); 대두 재배품종 1486018 (US2007180550); 대두 재배품종 S050235 (US2007180549); 대두 재배품종 5023230 (US2007180548); 대두 재배품종 S050238 (US2007174930); 대두 재배품종 5830261 (US2007174928); 대두 재배품종 S050226 (US7247772); 대두 재배품종 5806063 (US7247771); 대두 재배품종 S050233 (US7244881); 대두 재배품종 5726085 (US7241939); 대두 재배품종 MT000792 (US7238867); 대두 재배품종 5521161 (US7235718); 대두 재배품종 WW109447 (US7235717); 대두 재배품종 BA947474 (US7220898); 대두 재배품종 5939002 (US7217870); 대두 재배품종 5726175 (US7217869); 대두 재배품종 5432082 (US7217868); 대두 재배품종 SG0850RR (US7211715); 대두 재배품종 SG1750NRR (US7208658); 대두 재배품종 MT017827 (US7208657); 대두 재배품종 4N2V74028 (US7205458); 대두 재배품종 CL431203 (US7202400); 대두 재배품종 4N0S63222 (US7199288); 대두 재배품종 5520279 (US7196253); 대두 재배품종 5834401 (US7196252); 대두 재배품종 5621161 (US7196251); 대두 재배품종 CL722114 (US7196250); 대두 재배품종 5741081 (US7193140); 대두 재배품종 CL727422 ; (US7186895); 대두 재배품종 4N2V55022 (US7183468); 대두 재배품종 5083011 (US7173169); 대두 재배품종 5626085 (US7169976); 대두 재배품종 S050051 (US7169974); 대두 재배품종 4506816 (US2006294626); 대두 재배품종 WW152201 (US7132594); 대두 재배품종 CL727636 (US7132593); 대두 재배품종 M08851 (US7126047); 대두 재배품종 4324401 (US7105728); 대두 재배품종 S050164 (US7105727); 대두 재배품종 4136015 (US2006195931); 대두 재배품종 3133014 (US2006195930); 대두 재배품종 S040132 (US2006195929); 대두 재배품종 4328386 (US2006195928); 대두 재배품종 1339013 (US2006195927); 대두 재배품종 4423183 (US2006195925); 대두 재배품종 S040131 (US2006195924); 대두 재배품종 4929388 (US2006195923); 대두 재배품종 4817034 (US2006195922); 대두 재배품종 4916816 (US7098385); 대두 재배품종 4713487 (US2006191032); 대두 재배품종 4348019 (US2006191031); 대두 재배품종 S040122 (US2006191030); 대두 재배품종 S040133 (US2006185031); 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대두 변종 93B15 (US6617499); 대두 변종 94B54 (US6613965); 대두 변종 93B67 (US6573433); 대두 변종 93B87 (US6727410); 대두 변종 96B51 (US6613964); 대두 변종 92B84 (US6730829); 대두 변종 92B12 (US6605755); 대두 변종 90A07 (US6320105); 대두 변종 93B26 (US6342659); 대두 변종 96B21 (US6369301); 대두 변종 92B63 (US6326529); 대두 변종 93B46 (US6323402); 대두 변종 92B75 (US6362400); 대두 변종 93B08 (US6323401); 대두 변종 97B62 (US6323400); 대두 변종 92B37 (US6323399); 대두 변종 92B56 (US6339186); 대두 변종 93B66 (US6307131); 대두 변종 92B62 (US6346657); 대두 변종 92B36 (US6369300); 대두 변종 90B73 (US6316700); 대두 변종 95B95 (US6323398); 대두 변종 93B65 (US6229074); 대두 변종 92B24 (US6284950); 대두 변종 94B53 (US6235976); 대두 변종 94B22 (US6140557); 대두 변종 93B84 (US6143956); 대두 변종 95B32 (US6229073); 대두 변종 95B53 (US6147283); 대두 변종 93B35 (US6153816); 대두 변종 93B07 (US6143955); 대두 변종 92B74 (US6124526); 대두 변종 92B35 (US6166296); 대두 변종 94B45 (US6162968); 대두 변종 96B01 (US6143954); 대두 변종 93B53 (US6335197).
이들 재배품종으로의 우량 이벤트의 유전자 침투는 이들 재배품종의 바람직한 표현형 또는 작물학적 특성의 어느 것에도 유의한 영향을 미치지 못하는 한편(수확감소 없음), 글라이포세이트 및/또는 아이소옥사플루톨 또는 글루포시네이트 내성으로 결정되는 바와 같은 이식유전자의 발현은 상업적으로 허용되는 수준을 충족시킨다.
스택은 시장에서 이용가능한 하나 이상의 다른 대두 이벤트와 추가로 유리하게 조합될 수 있으며, 여기에서 다른 대두 이벤트는 예를 들어 하기의 다른 제초제 내성 이벤트를 포함하지만 이로 제한되지는 않는다: USDA-APHIS 신청(petitions): 09-349-0lp, 09-201-01p, 09-183-01p, 09-082-01p, 09-015-01p, 06-354-01p, 06-271-01p, 06-178-01p, 98-238-01p, 98-014-01p, 97-008-01p, 96-068-01p, 95-335-01p, 93-258-01p(예를 들어, www.aphis.usda.gov/brs/not_reg.html 참조) 또는 미국 특허 공개 제2006-282915호에 기재된 이벤트 MON89788(글라이포세이트 내성), 국제 특허 공개 제2008/054747호에 기재된 이벤트 DP-305423-1(고 올레산/ALS 저해제 내성), 미국 특허 공개 제2009130071호에 기재된 MON87701, 미국 특허 공개 제2009036308호에 기재된 이벤트 3560.4.3.5, 또는 미국 특허 공개 제2008312082호에 기재된 이벤트 DP-305423-1, 또는 국제 특허 공개 제2010/080829호의 이벤트 BPS-CV127-9(이벤트 127).
하기 청구범위에서 사용된 용어 "식물"은, 달리 명확하게 표시하지 않는 한, 임의의 성숙 단계의 식물 조직뿐만 아니라 임의의 이러한 식물로부터 채취하거나 유래된 임의의 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것이며, 임의의 종자, 잎, 줄기, 꽃, 뿌리, 단일 세포, 배우자(gamete), 세포 배양물, 조직 배양물 또는 원형질체를 제한 없이 포함한다.
우량 이벤트 EE-GM3를 포함하는 기준 종자가 2009년 10월 12일자로 NCIMB 수탁번호 NCIMB 41659 하에 32-RRMM-0531로 NCIMB(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Scotland)에 기탁되었으며, 그의 생육성(viability)이 확인되었다. EE-GM3에 대한 대안적인 명칭은 이벤트 FG-072 또는 MST-FG072-3이다.
우량 이벤트 EE-GM1을 포함하는 기준 종자가 2009년 10월 12일자로 NCIMB 수탁번호 NCIMB 41658 하에 32RRMM0368로 NCIMB(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Scotland)에 기탁되었다. EE-GM1에 대한 대안적인 명칭은 LL27, A2704-12, 또는 ACS-GM005-3이다.
우량 이벤트 EE-GM2를 포함하는 기준 종자가 2009년 10월 12일자로 NCIMB 수탁번호 NCIMB 41660 하에 32CON0688로 NCIMB(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Scotland)에 기탁되었다. EE-GM2에 대한 대안적인 명칭은 LL55, A5547-127, 또는 ACS-GM006-4이다.
우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1를 포함하는 기준 종자가 2010년 6월 11일자로 ATCC 수탁번호 PTA-11041하에 111606 대두로 ATCC(American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209, USA)에 기탁되었다.
우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 기준 종자가 2010년 6월 11일자로 ATCC 수탁번호 PTA-11042하에 05SHX2XEB 대두로 ATCC(American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209, USA)에 기탁되었다.
상기 본 발명의 설명은 설명을 위한 것이지 제한하고자 하는 것이 아니다.
설명된 실시형태에 있어서의 다양한 변화 또는 변형이 당업자에 의해 수행될 수 있다. 이들은 본 발명의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Bayer Biosciences N.V.
M.S Technologies LLP
MASON Justin Thomas
LETTOW Leslie James
EBY Mark Alan
EBY William H.
WELZ Gunter
VERHAEGHE Steven
DE BEUCKELEER Marc
HABEX Veerle
FERRULO Jean-Marc
<120> Herbicide tolerant soybean plants and methods for identifying
same
<130> 58764.000142
<140> PCTUS201057886
<141> 2010-11-23
<150> EP09014565.7
<151> 2009-11-23
<150> 61/263707
<151> 2009-11-23
<150> 61/367251
<151> 2010-07-23
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7296
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SalI fragment of vector pSF10
<220>
<221> terminator
<222> (188)..(479)
<223> 3?os: sequence including the 3' untranslated region of the
nopaline synthase gene from the T-DNA of pTiT37 of Agrobacterium
tumefaciens -complement
<220>
<221> misc_feature
<222> (480)..(1556)
<223> hppdPf W336: the coding sequence of the 4-hydroxyphenylpyruvate
dioxygenase of Pseudomonas fluorescens strain A32 modified by the
replacement of the amino acid Glycine 336 with a Tryptophane -
complement
<220>
<221> transit_peptide
<222> (1557)..(1928)
<223> TPotp Y: coding sequence of an optimized transit peptide
derivative (position 55 changed into Tyrosine), containing
sequence of the RuBisCO small subunit genes of Zea mays (corn)
and Helianthus annuus (sunflower)-complement
<220>
<221> 5'UTR
<222> (1929)..(2069)
<223> 5'tev: sequence including the leader sequence of the tobacco etch
virus - complement
<220>
<221> promoter
<222> (2070)..(3359)
<223> Ph4a748 ABBC: sequence including the promoter region of the
histone H4 gene of Arabidopsis thaliana, containing an internal
duplication - complement
<220>
<221> promoter
<222> (3360)..(4374)
<223> Ph4a748: sequence including the promoter region of the histone H4
gene of Arabidopsis thaliana
<220>
<221> Intron
<222> (4375)..(4855)
<223> intron1 h3At: first intron of gene II of the histone H3.III
variant of Arabidopsis thaliana
<220>
<221> transit_peptide
<222> (4856)..(5227)
<223> TPotp C: coding sequence of the optimized transit peptide,
containing sequence of the RuBisCO small subunit genes of Zea
mays (corn) and Helianthus annuus (sunflower)
<220>
<221> misc_feature
<222> (5228)..(6565)
<223> 2mepsps: the coding sequence of the double-mutant
5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene of Zea mays
(corn) (Lebrun et al., 1997)
<220>
<221> terminator
<222> (6566)..(7252)
<223> 3?istonAt: sequence including the 3 untranslated region of the
histone H4 gene of Arabidopsis thaliana (Chabout et al., 1987)
<400> 1
gtcgactcta gcagatctgg ccggcccacc ggtgggccat atgggcccgc ggccgcgaat 60
tcgagctcgg tacctacctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 120
cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattg cggccgcaat 180
tcccgatcta gtaacataga tgacaccgcg cgcgataatt tatcctagtt tgcgcgctat 240
attttgtttt ctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga ctctaatcat aaaaacccat 300
ctcataaata acgtcatgca ttacatgtta attattacat gcttaacgta attcaacaga 360
aattatatga taatcatcgc aagaccggca acaggattca atcttaagaa actttattgc 420
caaatgtttg aacgatcggg gaaattcgtc gagtcaccct cggccgggct ttttgacgct 480
taatcggcgg tcaatacacc acgacgcacc tggtcacgtt cgatggactc gaacagcgcc 540
ttgaagttcc actcgccaaa cccatcgtcg cccttgcgct ggatgaattc gaagaacacc 600
gggcccatca gggtttccga gaagatctgc agcagcaggc gtttgtcgcc ttccacggaa 660
gatccgtcca gcaggatacc gcgtgcctgc agttgatcca ccggctcgcc gtggtcaggc 720
aggcggcctt cgagcatttc gtaataagtg tctggcggcg cggtcatgaa gcgcatgccg 780
attttcttca acgcgtccca ggtcttgacc aggtcgtcgg tgaggaacgc cacgtgctgg 840
atgccttcgc cgttgaactg catcaggaac tcttcgatct gccccgcgcc cttggacgac 900
tcttcgttca gcgggatgcg gatcatgccg tccggcgcac tcatggcctt ggaagtcagg 960
ccggtgtact cgcccttgat atcgaagtaa cgcgcttcac ggaagttgaa caatttctcg 1020
tagaagttgg cccagtagac catgcggccg cgatagacgt tgtgggtcag gtggtcgatg 1080
actttgagac ctgcaccgac cggattgcgc tccacacctt cgaggtacac gaagtcgatg 1140
tcgtagatcg agctgccttc gccgaaacgg tcgatcaggt acaacggcgc gccgccgatg 1200
cccttgatcg ccggcaggtt caattccatc ggcccggtgt caatatggat cggctgggcg 1260
ccgagttcca gggcgcggtt gtaggccttt tgcgagtcct tcacgcggaa cgccatgccg 1320
cacaccgacg ggccgtgttc ggccgcaaag taggaggcga tgctgttggg ctcgttgttg 1380
aggatcaggt tgatctcgcc ctggcggtac aggtgcacgt tcttggaacg gtgggtcgcg 1440
actttggtga agcccatgat ctcgaagatc ggctccaggg tacccggcgt cggcgacgcg 1500
aattcgatga attcaaagcc catcaggccc attgggtttt cgtatagatc tgccatgcac 1560
cggatccttc cgccgttgct gacgttgccg aggcttctgg aggagcggcg ggcgacgggg 1620
aggctggcgg tggacttgag cccctggaac ggagcgacgg cggtggccga cgaggccatc 1680
atcacggtgg gcgccataga cagcggcggc aggtacgaca gcgtctcgaa cttcttgttg 1740
ccgtaggccg gccacacctg catatattga actcttccac cgttgctggg aagggtggag 1800
aagtcgttag ccttcttggt ggtggggaag gcggcgttgg acttaaggcc ggtgaacgga 1860
gccaccatgt tggcctgagc aggggcggtc cggctaacgg tcgcgactga ggaggagatc 1920
gaagccatgg ctatcgttcg taaatggtga aaattttcag aaaattgctt ttgctttaaa 1980
agaaatgatt taaattgctg caatagaagt agaatgcttg attgcttgag attcgtttgt 2040
tttgtatatg ttgtgtttcg aattctagag tcgagagaaa ttgatgtctg tagaagaaga 2100
agaacggtta agagtagatt tgggtgagaa agatgtgaaa ttgtttttat aggcaaagac 2160
ggagagtcta ttttttgagc aatcagatcg catattaaat ctaacggctg agatatcgat 2220
ccgtgtgtac aataaaatga tgtataaacc gtcgatctgt tttaatcgac ggttcatatt 2280
agtgatccgc gtgatggcag tgatagccac taagaatcgt cttttgtttt acatgtggcg 2340
ccacaaatta gggtaatgaa gcggcaatat tttggaactc ggaaaataaa attgcgccat 2400
cacattattt gaaaattttc acatgctttt attttaaaaa cccacgaatt acaagttaca 2460
accgaaaaag atttataata tagtgattta tactaatttt gtagtagctt aatgtatatt 2520
gatactggaa aaacaatgac aatcatacga tccgtgtgta caataaaatg atgtataaac 2580
cgtcgatctg ttttaatcga cggttcatat tagtgatccg cgtgatggca gtgatagcca 2640
ctaagaatcg tcttttgttt tacatgtggc gccacaaatt agggtaatga agcggcaata 2700
ttttggaact cggaaaataa aattgcgcca tcacattatt tgaaaatttt cacatgcttt 2760
tattttaaaa acccacgaat tacaagttac aaccgaaaaa gatttataat atagtgattt 2820
atactaattt tgtagtagct taatgtatat tgatactgga aaaacaatga caatcatatg 2880
ttagtattat caagttatcg tattgatatt gatattggaa catacaatgg gtattgcctt 2940
ctttcgacca taaatatcac caaatttaca aagtttgtgt ataccaagtt atcaattgta 3000
aatgggatgt caacatttta atttcccttt gagaaactat agaccacaag aacacacttc 3060
aatagataaa gtaactattt acataagagg ttttaaaatc acattaacaa aaataattac 3120
caaccggcac tcacaaatac aaacagagca cacgacatgt caaagccaca agtaaattcg 3180
ttgagtggtg gtttcattac aattgtgtca cttgcagcac aaactatctt gctctgggaa 3240
tcatctcagc atcaaagatc atgctcactt caggggaact tagtgtatcc atgcctcgac 3300
tcatatttct cctcgacctg caggcatgca agctctagag cggccgccac cgcggtggag 3360
gtactcgagt cgcgacgtac gttcgaacaa ttggttttaa aagcttgcat gcctgcaggt 3420
cgaggagaaa tatgagtcga ggcatggata cactaagttc ccctgaagtg agcatgatct 3480
ttgatgctga gatgattccc agagcaagat agtttgtgct gcaagtgaca caattgtaat 3540
gaaaccacca ctcaacgaat ttacttgtgg ctttgacatg tcgtgtgctc tgtttgtatt 3600
tgtgagtgcc ggttggtaat tatttttgtt aatgtgattt taaaacctct tatgtaaata 3660
gttactttat ctattgaagt gtgttcttgt ggtctatagt ttctcaaagg gaaattaaaa 3720
tgttgacatc ccatttacaa ttgataactt ggtatacaca aactttgtaa atttggtgat 3780
atttatggtc gaaagaaggc aatacccatt gtatgttcca atatcaatat caatacgata 3840
acttgataat actaacatat gattgtcatt gtttttccag tatcaatata cattaagcta 3900
ctacaaaatt agtataaatc actatattat aaatcttttt cggttgtaac ttgtaattcg 3960
tgggttttta aaataaaagc atgtgaaaat tttcaaataa tgtgatggcg caattttatt 4020
ttccgagttc caaaatattg ccgcttcatt accctaattt gtggcgccac atgtaaaaca 4080
aaagacgatt cttagtggct atcactgcca tcacgcggat cactaatatg aaccgtcgat 4140
taaaacagat cgacggttta tacatcattt tattgtacac acggatcgat atctcagccg 4200
ttagatttaa tatgcgatct gattgctcaa aaaatagact ctccgtcttt gcctataaaa 4260
acaatttcac atctttctca cccaaatcta ctcttaaccg ttcttcttct tctacagaca 4320
tcaatttctc tcgactctag aggatccaag cttatcgatt tcgaacccct caggcgaaga 4380
acaggtatga tttgtttgta attagatcag gggtttaggt ctttccatta ctttttaatg 4440
ttttttctgt tactgtctcc gcgatctgat tttacgacaa tagagtttcg ggttttgtcc 4500
cattccagtt tgaaaataaa ggtccgtctt ttaagtttgc tggatcgata aacctgtgaa 4560
gattgagtct agtcgattta ttggatgatc cattcttcat cgtttttttc ttgcttcgaa 4620
gttctgtata accagatttg tctgtgtgcg attgtcatta cctagccgtg tatcgagaac 4680
tagggttttc gagtcaattt tgcccctttt ggttatatct ggttcgataa cgattcatct 4740
ggattagggt tttaagtggt gacgtttagt attccaattt cttcaaaatt tagttatgga 4800
taatgaaaat ccccaattga ctgttcaatt tcttgttaaa tgcgcagatc cccatggctt 4860
cgatctcctc ctcagtcgcg accgttagcc ggaccgcccc tgctcaggcc aacatggtgg 4920
ctccgttcac cggccttaag tccaacgccg ccttccccac caccaagaag gctaacgact 4980
tctccaccct tcccagcaac ggtggaagag ttcaatgtat gcaggtgtgg ccggcctacg 5040
gcaacaagaa gttcgagacg ctgtcgtacc tgccgccgct gtctatggcg cccaccgtga 5100
tgatggcctc gtcggccacc gccgtcgctc cgttccaggg gctcaagtcc accgccagcc 5160
tccccgtcgc ccgccgctcc tccagaagcc tcggcaacgt cagcaacggc ggaaggatcc 5220
ggtgcatggc cggcgccgag gagatcgtgc tgcagcccat caaggagatc tccggcaccg 5280
tcaagctgcc ggggtccaag tcgctttcca accggatcct cctactcgcc gccctgtccg 5340
aggggacaac agtggttgat aacctgctga acagtgagga tgtccactac atgctcgggg 5400
ccttgaggac tcttggtctc tctgtcgaag cggacaaagc tgccaaaaga gctgtagttg 5460
ttggctgtgg tggaaagttc ccagttgagg atgctaaaga ggaagtgcag ctcttcttgg 5520
ggaatgctgg aatcgcaatg cggtccttga cagcagctgt tactgctgct ggtggaaatg 5580
caacttacgt gcttgatgga gtaccaagaa tgagggagag acccattggc gacttggttg 5640
tcggattgaa gcagcttggt gcagatgttg attgtttcct tggcactgac tgcccacctg 5700
ttcgtgtcaa tggaatcgga gggctacctg gtggcaaggt caagctgtct ggctccatca 5760
gcagtcagta cttgagtgcc ttgctgatgg ctgctccttt ggctcttggg gatgtggaga 5820
ttgaaatcat tgataaatta atctccattc cgtacgtcga aatgacattg agattgatgg 5880
agcgttttgg tgtgaaagca gagcattctg atagctggga cagattctac attaagggag 5940
gtcaaaaata caagtcccct aaaaatgcct atgttgaagg tgatgcctca agcgcaagct 6000
atttcttggc tggtgctgca attactggag ggactgtgac tgtggaaggt tgtggcacca 6060
ccagtttgca gggtgatgtg aagtttgctg aggtactgga gatgatggga gcgaaggtta 6120
catggaccga gactagcgta actgttactg gcccaccgcg ggagccattt gggaggaaac 6180
acctcaaggc gattgatgtc aacatgaaca agatgcctga tgtcgccatg actcttgctg 6240
tggttgccct ctttgccgat ggcccgacag ccatcagaga cgtggcttcc tggagagtaa 6300
aggagaccga gaggatggtt gcgatccgga cggagctaac caagctggga gcatctgttg 6360
aggaagggcc ggactactgc atcatcacgc cgccggagaa gctgaacgtg acggcgatcg 6420
acacgtacga cgaccacagg atggcgatgg ctttctccct tgccgcctgt gccgaggtcc 6480
ccgtcaccat ccgggaccct gggtgcaccc ggaagacctt ccccgactac ttcgatgtgc 6540
tgagcacttt cgtcaagaat taagctctag aactagtgga tcccccgatc cgcgtttgtg 6600
ttttctgggt ttctcactta agcgtctgcg ttttactttt gtattgggtt tggcgtttag 6660
tagtttgcgg tagcgttctt gttatgtgta attacgcttt ttcttcttgc ttcagcagtt 6720
tcggttgaaa tataaatcga atcaagtttc actttatcag cgttgtttta aattttggca 6780
ttaaattggt gaaaattgct tcaattttgt atctaaatag aagagacaac atgaaattcg 6840
acttttgacc tcaaatcttc gaacatttat ttcctgattt cacgatggat gaggataacg 6900
aaagggcggt tcctatgtcc gggaaagttc ccgtagaaga caatgagcaa agctactgaa 6960
acgcggacac gacgtcgcat tggtacggat atgagttaaa ccgactcaat tcctttatta 7020
agacataaac cgattttggt taaagtgtaa cagtgagctg atataaaacc gaaacaaacc 7080
ggtacaagtt tgattgagca acttgatgac aaacttcaga attttggtta ttgaatgaaa 7140
atcatagtct aatcgtaaaa aatgtacaga agaaaagcta gagcagaaca aagattctat 7200
attctggttc caatttatca tcgctttaac gtccctcaga tttgatcggg ctgcaggaat 7260
taaacgcccg ggcacgtggg atcctctaga gtcgac 7296
<210> 2
<211> 1843
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 5' flanking region of the foreign DNA comprising herbicide
tolerance genes in EE-GM3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1451)
<223> 5' flanking plant DNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1452)..(1843)
<223> insert or foreign DNA
<400> 2
gacttccatg tctagattca ttgtactaag atttcaaacg atatatatat atatatatat 60
atatatattc aattacatct ttttcaaaaa acatatatgc atcgtatttt ctaatacatt 120
tttttatata tgttattagt taaaatttat taaaaatcat aaaattaagt aagtttcaca 180
taacatccaa tgattttctc gtaattttaa gactggacta aagaatatag tagtaacact 240
tctcttcaaa taatatactt tatttgcccg aggaatagca ttgccatatt gaactattag 300
gaaagctgaa catcaattgg tacacttgga tggttcccac ggtttattat tgtctacatc 360
tggtcatcca agcagaggtt atatcttcta taactcgaca aatcttcgtt gtgcctatat 420
agagttgctt gtacgactaa aacgcttata ataatcgtta tacaatctat gattcacagt 480
tatgatacgt gtatgcaata aatgaataga tagataaata tgatacaatt atacaattat 540
tctaaaatat atagaataca atatatgtat gtataaaaaa ttcataaaac accaataagc 600
atataattgc aattttgcaa aaccaaatta agaatataac tcaaatatta ctagaaacaa 660
aaaaaattat aaatcattgt cttcataaat taattctaag tatctacaaa tagaaataat 720
atgaatttta tataaaaaag taatataaat tttattcctt tcttaaattt atgaaaaata 780
atacttctat atttctatac atgtttctat acatgcgttt caatgtctga tagtgatagg 840
aaactctact gtattttcaa aagttttttt ttgtttaaat atattttttg tcatgtaatt 900
gtgtgtgttt tcatttacgt ccatgtaaaa agaaaatatt ttagttctat taaaatattt 960
tttttatttt ttatccttaa aatactttaa ataatatttt ttcctattta aagcattttt 1020
tataatttaa agcgctattt aaaacgtttt tagaataaaa acataaaaca aacacatttt 1080
aaaatgattg aaatgaaaaa taaaactaat gaaaacgaaa acaatactaa attacaggaa 1140
agaaaaatat attcaaactt ttatgtttaa aggtttttga atatttctct gattcgtttg 1200
aaatatgtga agaaaattaa aatatcaagt agtaggttac aacagttcgg gtgcaacagt 1260
gactatgaca gcaagataat agggccaata tatttggata cctctcttaa gacgtaaaca 1320
ttttgagcga gaaaataatg gaaaaaaaat aagtcattca aatgataata gatatataaa 1380
ttatttttta ttttaaatat cttattaata tttttatttt tttatcatat tataaattat 1440
attatattta tgtagctttg ctcattgtct tctacgggaa ctttcccgga cataggaacc 1500
gccctttcgt tatcctcatc catcgtgaaa tcaggaaata aatgttcgaa gatttgaggt 1560
caaaagtcga atttcatgtt gtctcttcta tttagataca aaattgaagc aattttcacc 1620
aatttaatgc caaaatttaa aacaacgctg tcctgatttc acgatggatg aggataacga 1680
aagggcggtt cctatgtccg ggaaagttcc cgtagaagac aatgagcaaa gctactgaaa 1740
cgcggacacg acgtcgcatt ggtacggata tgagttaaac cgactcaatt cctttattaa 1800
gacataaacc gattttggtt aaagtgtaac agtgagctga tat 1843
<210> 3
<211> 1408
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 3' flanking sequence of foreign DNA comprising herbicide
tolerance genes in EE-GM3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(240)
<223> insert or foreign DNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (241)..(1408)
<223> plant DNA
<400> 3
taacagtgag ctgatataaa accgaaacaa accggtacaa gtttgattga gcaacttgat 60
gacaaacttc agaattttgg ttattgaatg aaaatcatag tctaatcgta aaaaatgtac 120
agaagaaaag ctagagcaga acaaagattc tatattctgg ttccaattta tcatcgcttt 180
aacgtccctc agatttgatc gggctgcagg aattaatgtg gttcatccgt ctttttgtta 240
atgcggtcat caatacgtgc ctcaaagatt gccaaataga ttaatgtggt tcatctccct 300
atatgttttg cttgttggat tttgctatca catgtttatt gctccaaact aattataata 360
aaatgacttt caaatgattg gtgttgacat tcttttcaaa ttgttcgctg aagaaaagat 420
aatctcgagg ccttgatttg ttaatgcttt cattaataaa taaataaaat aactctttcc 480
aaatttcaat tcatgctttt atattgtgtg gttcatcctc atcttatgtc actattatca 540
tttcatgttt gagactttac ttggccatat ttgagaagac cttcttcatt ataggcaatt 600
ttatctccac aataatataa gagaatatct tgaattaata attattgagg atatattata 660
gggttctatg tggaactaaa gacatggtta ccccattaag agagagtata gaggaattac 720
ttttatttgc cacgaggcga cgcgacttgt atttattttg gaattgtact tttgcgtgag 780
cagtgtggct ctatgttggg gcctccactt gttggtgttt tatatatgtg aaaggaggat 840
gagggtgatg gttcatttct ttgcattatt tttgttattc gcgcgaatga tatatgccct 900
gtttttgaag attgataggg aagtccatat ataggaattg aagtgtcaaa agggtgtgag 960
tatgtgctat gataatcacc caattaatgt acatctggtg tggtgtttga atttgtaggt 1020
cattaattaa tattcctctt ggtgaagttt ggagttcttt tgcaattaca attctgtttt 1080
gtaagtgatt atgatggact tttagatgtt tctcaaacag taggtgtaaa gaaaaatggg 1140
ccctggtatg aaaatttgtt ttcactcttt ctcattcata tctttaaaaa aagaatgata 1200
attttgtaat aaaaataaaa aaatattaaa tattttctca aatcaaacaa cctttatttt 1260
ttatgccaac aataattttg ttaaagatgg agatttcaat tattatataa gagttcatta 1320
tagttgaaaa ttgaatgaat gtatatgttt acgttttttg tctcaagtga aactaagatc 1380
aaatattcat atctattgag ctggtctt 1408
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer SOY028
<400> 4
atcgctttaa cgtccctcag 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer SOY029
<400> 5
caaggcctcg agattatc 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer SMP187
<400> 6
atatcaaccc gtagctcgac 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer STV019
<400> 7
ggcattaaat tggtgaaaat tgc 23
<210> 8
<211> 263
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleotide sequence of PCR amplicon using primers SOY028 - SOY029
<400> 8
atcgctttaa cgtccctcag atttgatcgg gctgcaggaa ttaatgtggt tcatccgtct 60
ttttgttaat gcggtcatca atacgtgcct caaagattgc caaatagatt aatgtggttc 120
atctccctat atgttttgct tgttggattt tgctatcaca tgtttattgc tccaaactaa 180
ttataataaa atgactttca aatgattggt gttgacattc ttttcaaatt gttcgctgaa 240
gaaaagataa tctcgaggcc ttg 263
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer 1 for amplication of control fragment (SOY01)
<400> 9
gtcagccaca cagtgcctat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer 2 for amplication of control fragment (SOY02)
<400> 10
gttaccgtac aggtctttcc 20
<210> 11
<211> 4076
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleotide sequence of pB2/P35SAcK
<220>
<221> promoter
<222> (461)..(1003)
<223> CamV35S promoter sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1004)..(1011)
<223> synthetic coding sequence for phosphinoacetyltransferase
<220>
<221> misc_feature
<222> (1582)..(1784)
<223> CaMV 35S terminator
<400> 11
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgca aacaaacata cacagcgact tatgctcaaa ttacaacggt atatatcctg 240
ccacatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc 300
cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta 360
ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg 420
ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tcccatggag tcaaagattc 480
aaatagagga cctaacagaa ctcgccgtaa agactggcga acagttcata cagagtctct 540
tacgactcaa tgacaagaag aaaatcttcg tcaacatggt ggagcacgac acgcttgtct 600
actccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggcaattgag acttttcaac 660
aaagggtaat atccggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cactttattg 720
tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg 780
ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga 840
gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgata 900
tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta 960
tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cagggtaccc ggggatccac catgtctccg 1020
gagaggagac cagttgagat taggccagct acagcagctg atatggccgc ggtttgtgat 1080
atcgttaacc attacattga gacgtctaca gtgaacttta ggacagagcc acaaacacca 1140
caagagtgga ttgatgatct agagaggttg caagatagat acccttggtt ggttgctgag 1200
gttgagggtg ttgtggctgg tattgcttac gctgggccct ggaaggctag gaacgcttac 1260
gattggacag ttgagagtac tgtttacgtg tcacataggc atcaaaggtt gggcctagga 1320
tccacattgt acacacattt gcttaagtct atggaggcgc aaggttttaa gtctgtggtt 1380
gctgttatag gccttccaaa cgatccatct gttaggttgc atgaggcttt gggatacaca 1440
gcccggggta cattgcgcgc agctggatac aagcatggtg gatggcatga tgttggtttt 1500
tggcaaaggg attttgagtt gccagctcct ccaaggccag ttaggccagt tacccagatc 1560
tgagtcgacc tgcaggcatg cccgctgaaa tcaccagtct ctctctacaa atctatctct 1620
ctctataata atgtgtgagt agttcccaga taagggaatt agggttctta tagggtttcg 1680
ctcatgtgtt gagcatataa gaaaccctta gtatgtattt gtatttgtaa aatacttcta 1740
tcaataaaat ttctaattcc taaaaccaaa atccagggcg agctcgaatt cgagctcggt 1800
acccggggat cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcgtaat catggtcata 1860
gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag 1920
cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg 1980
ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca 2040
acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 2100
gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 2160
gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 2220
ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 2280
cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 2340
ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 2400
taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 2460
ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 2520
ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 2580
aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 2640
tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac 2700
agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 2760
ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 2820
tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 2880
tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 2940
cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 3000
aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 3060
atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 3120
cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 3180
tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 3240
atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 3300
taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 3360
tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 3420
gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 3480
cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 3540
cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 3600
gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 3660
aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 3720
accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 3780
ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 3840
gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 3900
aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 3960
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac 4020
cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 4076
<210> 12
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleotide sequence comprising the 5' region flanking the foreign
DNA in EE-GM1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(209)
<223> plant DNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (210)..(720)
<223> foreign DNA
<400> 12
gagaagaaaa aggaaggcat taagagaccc tcctggcaca accctagaca ctctaagatc 60
ctttttcaaa cctgctccca ccatttcgag tcaagagata gataaataga cacatctcat 120
tgcaccgatc gggggcgttc gtagtgactg agggggtcaa agaccaagaa gtgagttatt 180
tatcagccaa gcattctatt cttcttatgt cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc 240
tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt 300
cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tcccatggag tcaaagattc aaatagagga 360
cctaacagaa ctcgccgtaa agactggcga acagttcata cagagtctct tacgactcaa 420
tgacaagaag aaaatcttcg tcaacatggt ggagcacgac acgcttgtct actccaaaaa 480
tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggcaattgag acttttcaac aaagggtaat 540
atccggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cactttattg tgaagatagt 600
ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ccatcgttga 660
agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga 720
<210> 13
<211> 1000
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleotide sequence comprising the 3' region flanking the foreign
DNA in EE-GM1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(568)
<223> foreign DNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (569)..(1000)
<223> plant DNA
<400> 13
ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 60
ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 120
gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 180
agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg 240
cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 300
aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 360
aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 420
ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 480
aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 540
ttaccaatgc ttaatcagtg aggcaccttt aatctagatg atctgtctca actttaccaa 600
aagttttgag cacatgtttg gattcacctt aaataatcta aaatcacagc ttgtttgatc 660
ccaaaggagt taattctaag taaaattgat tgagttaaaa caattgtgtt agatagagaa 720
attttctttg aataaaaaca tctagacaca aatcatttca cttcaaaata attttaaaca 780
aaataaattt tgcaattcat tcatccaaac aaacatttga attaactata atcaattcaa 840
attgttacag tgtgttgcat tcatatcatt cctaataagt ctacattaaa gattaagagt 900
gagaatgaga ggaagagaga acggtttcag ggttaaccct ttgtttggaa gaaccatcaa 960
acagtggcaa cggatcatcc ttgctgcaaa acatagcttt 1000
<210> 14
<211> 810
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleotide sequence comprising the 5' region flanking the foreign
DNA in EE-GM2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(311)
<223> plant DNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (312)..(810)
<223> foreign DNA
<400> 14
gtcatcgtcg tcgcgctgga gttcttgtgg tgccgctggt cgcactggag tttgggtgtt 60
gttgttcatg cttgcgctgc taatcccctt ttgtatgcga aaatcgggtt tgggtcgggt 120
cgggtcagcc caacacgacc taatttgtgt tacgaaaatt tcaacaaaaa aaaaaagtta 180
tcttccgcca ttatcgccat tccgccacga tcattaaggc tatggcggcc gcaatggcgc 240
cgccatatga aacccgcaat gccatcgcta tttggtggca tttttccaaa aacccgcaat 300
gtcataccgt catcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 360
cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 420
agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 480
cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 540
aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 600
aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 660
gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aacgccaggg ttttcccagt 720
cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tcccatggag tcaaagattc aaatagagga 780
cctaacagaa ctcgccgtaa agactggcga 810
<210> 15
<211> 1880
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleotide sequence comprising the 3' region flanking the foreign
DNA in EE-GM2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(507)
<223> foreign DNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (508)..(1880)
<223> plant DNA
<400> 15
cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 60
gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 120
tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 180
ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 240
ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 300
atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 360
cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 420
tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 480
aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatg gcaccgccat aaccacaatt taacaacttt 540
ataaatgact tagtatatta gcaatttatc ttgtcacatg cacatatttt ataactataa 600
taggagtttg agtttaaatg atgtaatgaa ttttggattg catgttgttt tgtactatat 660
tggtagcttt ttccaatgaa gtgttaaatt tgtatttttc atattcaggg tcacgtttga 720
ccttctctag tcactgccct aattaagccc tttctcttgc actcttgatg cttacttaac 780
ctgggcatca ggcatatgta atgttatcaa tcaaactatc acgtttcatg catttattaa 840
tcttcattga tgcccttgtc tcgctcttgc ccctttttcc aatttatgct tcaaatcttt 900
gacatgttcc atgtccttat tccttttctc tgtaactgtt cattttcgtt atgaaccatg 960
aagataaact actattgtta aagtctcggt tcaaatttaa cttttctgct tttccccata 1020
taattgaata agacttggtc gtggttgttc tcattgcata tacctttatt atatgcatag 1080
aagtgatttt tttgcctaac ttgtacattt ttttatggca gtgatganga tgtagagagg 1140
cttatcgagc ttgtgaaggg aatttcttgc aagattaatc taatctcatt caatccgcac 1200
agtggatcat tcttcaaacc aaccaaatat gaaaggatga ttgaattccg aaatacattg 1260
gctggggcag gattgatagt atttttaaga cttagtagag gtgatgatca attggcttcc 1320
tgtggtcaat tgggtaagcc tggcaccatt caagctccat ttcttcgtgt accagagcaa 1380
ttccaaatgg caattggaag ttcaacttga ttctttgtgg aggttctgtg gcaaattgat 1440
cttacagtta ttaacgaaga attatatagg acacttgtgg tgggggtagc tagggatgac 1500
ttcatactga caatgcaaga ccaagagcta aattaggggg atgtctgtct gttttcatat 1560
tgtacttttc cattttacag ttaattgata tatttttttt tattaatgtg acggatccag 1620
attacttact ggctaagaaa taagaaataa aaatgattta aatatatttt tagtcgaagt 1680
ctgtattttt tagtttccca aattaaaatt tgcatttttt aatctctcat ttataaaatg 1740
cctttttaag ttcttcttag ctgatttttg gcaacttgga tgcacaatgt gcaactatcg 1800
taacaatatt tttcttgaaa tttaaagaga ctaaaatata tgttttacca taacactcat 1860
gttagtaaaa ccattatttg 1880
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer SOY06
<400> 16
ggcgttcgta gtgactgagg 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer SOY 07
<400> 17
gttttacaac gtcgtgactg g 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer SOY 09
<400> 18
tgtggttatg gcggtgccat c 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SOY 010
<400> 19
tgctacaggc atcgtggtgt c 21
<210> 20
<211> 17806
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> nucleotide sequence of a foreign DNA and flanking plant sequences
in EE-GM3
<400> 20
gacttccatg tctagattca ttgtactaag atttcaaacg atatatatat atatatatat 60
atatatattc aattacatct ttttcaaaaa acatatatgc atcgtatttt ctaatacatt 120
tttttatata tgttattagt taaaatttat taaaaatcat aaaattaagt aagtttcaca 180
taacatccaa tgattttctc gtaattttaa gactggacta aagaatatag tagtaacact 240
tctcttcaaa taatatactt tatttgcccg aggaatagca ttgccatatt gaactattag 300
gaaagctgaa catcaattgg tacacttgga tggttcccac ggtttattat tgtctacatc 360
tggtcatcca agcagaggtt atatcttcta taactcgaca aatcttcgtt gtgcctatat 420
agagttgctt gtacgactaa aacgcttata ataatcgtta tacaatctat gattcacagt 480
tatgatacgt gtatgcaata aatgaataga tagataaata tgatacaatt atacaattat 540
tctaaaatat atagaataca atatatgtat gtataaaaaa ttcataaaac accaataagc 600
atataattgc aattttgcaa aaccaaatta agaatataac tcaaatatta ctagaaacaa 660
aaaaaattat aaatcattgt cttcataaat taattctaag tatctacaaa tagaaataat 720
atgaatttta tataaaaaag taatataaat tttattcctt tcttaaattt atgaaaaata 780
atacttctat atttctatac atgtttctat acatgcgttt caatgtctga tagtgatagg 840
aaactctact gtattttcaa aagttttttt ttgtttaaat atattttttg tcatgtaatt 900
gtgtgtgttt tcatttacgt ccatgtaaaa agaaaatatt ttagttctat taaaatattt 960
tttttatttt ttatccttaa aatactttaa ataatatttt ttcctattta aagcattttt 1020
tataatttaa agcgctattt aaaacgtttt tagaataaaa acataaaaca aacacatttt 1080
aaaatgattg aaatgaaaaa taaaactaat gaaaacgaaa acaatactaa attacaggaa 1140
agaaaaatat attcaaactt ttatgtttaa aggtttttga atatttctct gattcgtttg 1200
aaatatgtga agaaaattaa aatatcaagt agtaggttac aacagttcgg gtgcaacagt 1260
gactatgaca gcaagataat agggccaata tatttggata cctctcttaa gacgtaaaca 1320
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ttatttttta ttttaaatat cttattaata tttttatttt tttatcatat tataaattat 1440
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tcatagtcta atcgtaaaaa atgtacagaa gaaaagctag agcagaacaa agattctata 1980
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ccggcgcact catggccttg gaagtcaggc cggtgtactc gcccttgata tcgaagtaac 3060
gcgcttcacg gaagttgaac aatttctcgt agaagttggc ccagtagacc atgcggccgc 3120
gatagacgtt gtgggtcagg tggtcgatga ctttgagacc tgcaccgacc ggattgcgct 3180
ccacaccttc gaggtacacg aagtcgatgt cgtagatcga gctgccttcg ccgaaacggt 3240
cgatcaggta caacggcgcg ccgccgatgc ccttgatcgc cggcaggttc aattccatcg 3300
gcccggtgtc aatatggatc ggctgggcgc cgagttccag ggcgcggttg taggcctttt 3360
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aggaggcgat gctgttgggc tcgttgttga ggatcaggtt gatctcgccc tggcggtaca 3480
ggtgcacgtt cttggaacgg tgggtcgcga ctttggtgaa gcccatgatc tcgaagatcg 3540
gctccagggt acccggcgtc ggcgacgcga attcgatgaa ttcaaagccc atcaggccca 3600
ttgggttttc gtatagatct gccatgcacc ggatccttcc gccgttgctg acgttgccga 3660
ggcttctgga ggagcggcgg gcgacgggga ggctggcggt ggacttgagc ccctggaacg 3720
gagcgacggc ggtggccgac gaggccatca tcacggtggg cgccatagac agcggcggca 3780
ggtacgacag cgtctcgaac ttcttgttgc cgtaggccgg ccacacctgc atatattgaa 3840
ctcttccacc gttgctggga agggtggaga agtcgttagc cttcttggtg gtggggaagg 3900
cggcgttgga cttaaggccg gtgaacggag ccaccatgtt ggcctgagca ggggcggtcc 3960
ggctaacggt cgcgactgag gaggagatcg aagccatggc tatcgttcgt aaatggtgaa 4020
aattttcaga aaattgcttt tgctttaaaa gaaatgattt aaattgctgc aatagaagta 4080
gaatgcttga ttgcttgaga ttcgtttgtt ttgtatatgt tgtgttgaga attctagagt 4140
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ttgatactgg aaaaacaatg acaatcatat gttagtatta tcaagttatc gtattgatat 4980
tgatattgga acatacaatg ggtattgcct tctttcgacc ataaatatca ccaaatttac 5040
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gttttaaaat cacattaaca aaaataatta ccaaccggca ctcacaaata caaacagagc 5220
acacgacatg tcaaagccac aagtaaattc gttgagtggt ggtttcatta caattgtgtc 5280
acttgcagca caaactatct tgctctggga atcatctcag catcaaagat catgctcact 5340
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tgtatgttcc aatatcaata tcaatacgat aacttgataa tactaacata tgattgtcat 5940
tgtttttcca gtatcaatat acattaagct actacaaaat tagtataaat cactatatta 6000
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tagtcgattt attggatgat ccattcttca tcgttttttt cttgcttcga agttctgtat 13980
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cgagtcaatt ttgccccttt tggttatatc tggttcgata acgattcatc tggattaggg 14100
ttttaagtgg tgacgtttag tattccaatt tcttcaaaat ttagttatgg ataatgaaaa 14160
tccccaattg actgttcaat ttcttgttaa atgcgcagat ccccatggct tcgatctcct 14220
cctcagtcgc gaccgttagc cggaccgccc ctgctcaggc caacatggtg gctccgttca 14280
ccggccttaa gtccaacgcc gccttcccca ccaccaagaa ggctaacgac ttctccaccc 14340
ttcccagcaa cggtggaaga gttcaatgta tgcaggtgtg gccggcctac ggcaacaaga 14400
agttcgagac gctgtcgtac ctgccgccgc tgtctatggc gcccaccgtg atgatggcct 14460
cgtcggccac cgccgtcgct ccgttccagg ggctcaagtc caccgccagc ctccccgtcg 14520
cccgccgctc ctccagaagc ctcggcaacg tcagcaacgg cggaaggatc cggtgcatgg 14580
ccggcgccga ggagatcgtg ctgcagccca tcaaggagat ctccggcacc gtcaagctgc 14640
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gaatcgcaat gcggtccttg acagcagctg ttactgctgc tggtggaaat gcaacttacg 14940
tgcttgatgg agtaccaaga atgagggaga gacccattgg cgacttggtt gtcggattga 15000
agcagcttgg tgcagatgtt gattgtttcc ttggcactga ctgcccacct gttcgtgtca 15060
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acttgagtgc cttgctgatg gctgctcctt tggctcttgg ggatgtggag attgaaatca 15180
ttgataaatt aatctccatt ccgtacgtcg aaatgacatt gagattgatg gagcgttttg 15240
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acaagtcccc taaaaatgcc tatgttgaag gtgatgcctc aagcgcaagc tatttcttgg 15360
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tctttgccga tggcccgaca gccatcagag acgtggcttc ctggagagta aaggagaccg 15660
agaggatggt tgcgatccgg acggagctaa ccaagctggg agcatctgtt gaggaagggc 15720
cggactactg catcatcacg ccgccggaga agctgaacgt gacggcgatc gacacgtacg 15780
acgaccacag gatggcgatg gctttctccc ttgccgcctg tgccgaggtc cccgtcacca 15840
tccgggaccc tgggtgcacc cggaagacct tccccgacta cttcgatgtg ctgagcactt 15900
tcgtcaagaa ttaagctcta gaactagtgg atcccccgat ccgcgtttgt gttttctggg 15960
tttctcactt aagcgtctgc gttttacttt tgtattgggt ttggcgttta gtagtttgcg 16020
gtagcgttct tgttatgtgt aattacgctt tttcttcttg cttcagcagt ttcggttgaa 16080
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ttcctatgtc cgggaaagtt cccgtagaag acaatgagca aagctactga aacgcggaca 16320
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ccgattttgg ttaaagtgta acagtgagct gatataaaac cgaaacaaac cggtacaagt 16440
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taatcgtaaa aaatgtacag aagaaaagct agagcagaac aaagattcta tattctggtt 16560
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tattgaggat atattatagg gttctatgtg gaactaaaga catggttacc ccattaagag 17100
agagtataga ggaattactt ttatttgcca cgaggcgacg cgacttgtat ttattttgga 17160
attgtacttt tgcgtgagca gtgtggctct atgttggggc ctccacttgt tggtgtttta 17220
tatatgtgaa aggaggatga gggtgatggt tcatttcttt gcattatttt tgttattcgc 17280
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caattacaat tctgttttgt aagtgattat gatggacttt tagatgtttc tcaaacagta 17520
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<210> 21
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<212> DNA
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<213> Artificial
<220>
<223> primer SMP178
<400> 22
tgaggcacgt attgatgacc 20
Claims (82)
- 생물학적 시료 내의 우량 이벤트(elite event) EE-GM3 및 EE-GM1의 동시 존재를 동정하는 방법으로서,
EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역(flanking region)을 특이적으로 인식하는 특이적 프라이머 또는 프로브를 사용하여 EE-GM3 특이적 영역을 검출하는 단계; 및 EE-GM1 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 특이적 프라이머 또는 프로브를 사용하여 EE-GM1 특이적 영역을 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1의 동시 존재의 동정방법. - 제1항에 있어서, 적어도 2개의 프라이머를 사용하는 제1 중합효소 연쇄 반응과 적어도 2개의 프라이머를 사용하는 제2 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산으로부터 50 내지 1000 bp의 2개 DNA 단편을 증폭시키는 단계를 더 포함하되, 제1 중합효소 연쇄 반응에서 상기 프라이머 중 하나는 EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 영역을 인식하거나 EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 3' 측면 영역을 인식하고, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 3' 측면 영역은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 프라이머 중 다른 하나의 프라이머는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 EE-GM3의 외래 DNA 내의 서열을 인식하거나, 상기 프라이머 중 다른 하나의 프라이머는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하거나 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 EE-GM3의 외래 DNA 내의 서열을 인식하고, 제2 중합효소 연쇄 반응에서 상기 프라이머 중 하나는 EE-GM1 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 영역을 인식하거나 EE-GM1 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 3' 측면 영역을 인식하며, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 209의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 3' 측면 영역은 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 뉴클레오타이드 1000의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 프라이머 중 다른 하나의 프라이머는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 210 내지 뉴클레오타이드 720의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 568의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 EE-GM1의 외래 DNA 내의 서열을 인식하거나, 상기 프라이머 중 다른 하나의 프라이머는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 EE-GM1의 외래 DNA 내의 서열을 인식함으로써, 상기 제1 및 제2 중합효소 반응은 연속적이거나 동시에 이루어질 수 있는 것인, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1의 동시 존재의 동정방법.
- 제2항에 있어서, EE-GM3의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM3의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM3의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열, 또는 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하며, EE-GM1의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 209의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM3의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 뉴클레오타이드 1000의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM1의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 12의 뉴클레오타이드 210 내지 뉴클레오타이드 720의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 568의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1의 동시 존재의 동정방법.
- 제2항에 있어서, EE-GM3의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM3의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM3의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 3' 말단에 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열, 또는 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하며, EE-GM1의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 209의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM1의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 뉴클레오타이드 1000의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM1의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 3' 말단에 서열번호 12의 뉴클레오타이드 210 내지 뉴클레오타이드 720의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 568의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1의 동시 존재의 동정방법.
- 제4항에 있어서, 상기 EE-GM3 특이적 프라이머가 각각 서열번호 5 및 서열번호 4의 서열, 또는 각각 서열번호 5 및 서열번호 7의 서열을 포함하고, 상기 EE-GM1 특이적 프라이머가 각각 서열번호 16 및 서열번호 17의 서열을 포함하는 것인, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1의 동시 존재의 동정방법.
- 제5항에 있어서, 약 183 bp의 EE-GM1 특이적 단편 및 EE-GM3 PCR 동정 프로토콜을 이용한 약 263 또는 약 706 bp의 EE-GM3 특이적 단편을 증폭시키는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1의 동시 존재의 동정방법.
- 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM1의 동시 존재를 동정하기 위한 키트로서,
EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 영역을 인식하거나 EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 3' 측면 영역을 인식하는 하나의 프라이머를 포함하며, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 3' 측면 영역은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 하나의 프라이머를 포함하고, 상기 외래 DNA는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열, 또는 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하며, 추가로 EE-GM1 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 영역을 인식하거나 EE-GM1 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 3' 측면 영역을 인식하는 하나의 프라이머를 포함하고, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 209의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 3' 측면 영역은 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 뉴클레오타이드 1000의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, EE-GM1의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 하나의 프라이머를 포함하고, 상기 외래 DNA가 서열번호 12의 뉴클레오타이드 210 내지 뉴클레오타이드 720의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 568의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 것인 키트. - 제7항에 있어서, EE-GM3의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM3의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM3의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열, 또는 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하며, EE-GM1의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 209의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM1의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 뉴클레오타이드 1000의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM1의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 12의 뉴클레오타이드 210 내지 뉴클레오타이드 720의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 568의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 키트.
- 제7항에 있어서, EE-GM3의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM3의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM3의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 3' 말단에 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열, 또는 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하며, EE-GM1의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 209의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM1의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 뉴클레오타이드 1000의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM1의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 3' 말단에 서열번호 12의 뉴클레오타이드 210 내지 뉴클레오타이드 720의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 568의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 키트.
- 제7항에 있어서, 서열번호 4의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 5의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하거나 서열번호 5의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 7의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고, 추가로 서열번호 16의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 17의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하는 키트.
- 최적화된 검출 조건하에 EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역 내의 서열을 특이적으로 인식하는 서열을 포함하며, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 3' 측면 영역은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 프라이머와; 최적화된 검출 조건하에 EE-GM1 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역 내의 서열을 특이적으로 인식하는 서열을 포함하며, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 209의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 3' 측면 영역은 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 뉴클레오타이드 1000의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 프라이머의 프라이머 쌍.
- 제11항에 있어서, 상기 제1 프라이머가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 제2 프라이머가 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 209의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 뉴클레오타이드 1000의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍.
- 제11항에 있어서, 상기 제1 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 제2 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 209의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 뉴클레오타이드 1000의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍.
- 3' 최말단에 서열번호 5의 서열을 포함하는 제1 프라이머와 3' 최말단에 서열번호 16의 서열을 포함하는 제2 프라이머의 프라이머 쌍.
- 3' 최말단에 서열번호 5의 서열을 포함하는 제1 프라이머;
3' 최말단에 서열번호 4의 서열을 포함하는 제2 프라이머;
3' 최말단에 서열번호 16의 서열을 포함하는 제3 프라이머; 및
3' 최말단에 서열번호 17의 서열을 포함하는 제4 프라이머의 4개의 프라이머를 포함하는 세트. - 제1항에 있어서, 생물학적 시료의 핵산을 EE-GM3에 대한 제1 특이적 프로브 및 EE-GM1에 대한 제2 특이적 프로브와 혼성화시키는 단계를 포함하는 것인, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1의 동시 존재의 동정방법.
- 제16항에 있어서, 상기 제1 특이적 프로브의 서열이 EE-GM3의 5' 측면 서열 또는 3' 측면 서열의 부분을 포함하는 서열 및 그와 인접한 외래 DNA의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지며, 상기 제2 특이적 프로브의 서열이 EE-GM1의 5' 측면 서열 또는 3' 측면 서열의 부분을 포함하는 서열 및 그와 인접한 외래 DNA의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지닌 것인, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1의 동시 존재의 동정방법.
- 제17항에 있어서, 상기 제1 특이적 프로브의 서열이 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1431 내지 1472 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 220 내지 261, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지며, 상기 제2 특이적 프로브의 서열이 서열번호 12의 뉴클레오타이드 199 내지 220 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 558 내지 579, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지닌 것인, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1의 동시 존재의 동정방법.
- EE-GM3의 특이적 영역과 특이적으로 혼성화될 수 있는 제1 특이적 프로브 및 EE-GM1의 특이적 영역과 특이적으로 혼성화될 수 있는 제2 특이적 프로브를 포함하는, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM1의 동시 존재를 동정하기 위한 키트.
- 제19항에 있어서, 상기 제1 특이적 프로브의 서열이 EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 서열 또는 3' 측면 서열의 부분을 포함하는 서열 및 그와 인접한 외래 DNA의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지며, 상기 제2 특이적 프로브의 서열이 EE-GM1 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 서열 또는 3' 측면 서열의 부분을 포함하는 서열 및 그와 인접한 외래 DNA의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지닌 키트.
- 제20항에 있어서, 상기 제1 특이적 프로브의 서열이 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1441 내지 1462 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 230 내지 251, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지니는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 제2 특이적 프로브의 서열이 서열번호 12의 뉴클레오타이드 199 내지 220 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 558 내지 579, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지닌 키트.
- 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM1의 동시 존재를 동정하기 위한 특이적 프로브 쌍.
- 제22항에 있어서, EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 서열 또는 3' 측면 서열의 부분을 포함하는 서열 및 그와 인접한 외래 DNA의 서열 또는 그의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지니는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 프로브, 및 EE-GM1 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 서열 또는 3' 측면 서열의 부분을 포함하는 서열 및 그와 인접한 외래 DNA의 서열 또는 그의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 프로브를 포함하는 프로브 쌍.
- 제23항에 있어서, 상기 제1 프로브가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1441 내지 1462 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 230 내지 251, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지며, 상기 제2 프로브가 서열번호 12의 뉴클레오타이드 199 내지 220 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 558 내지 579, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지닌 프로브 쌍.
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1441 내지 1462 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 230 내지 251, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 본질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 서열을 지닌 제1 프로브 및 서열번호 12의 뉴클레오타이드 199 내지 220 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 558 내지 579, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 본질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 지닌 제2 프로브를 포함하는, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1의 동시 존재를 동정하기 위한 특이적 프로브 세트.
- 종자 순도를 확인하기 위한 방법으로서, 종자 시료 내에서, EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 특이적 프라이머 또는 프로브로 EE-GM3 특이적 영역을 검출하는 단계 및 EE-GM1 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 특이적 프라이머 또는 프로브로 EE-GM1 특이적 영역을 검출하는 단계를 포함하는, 종자 순도의 확인방법.
- 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1의 존재에 대해 종자를 선별(screening)하는 방법으로서, 종자 소집단 시료 내에서, EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 특이적 프라이머 또는 프로브로 EE-GM3 특이적 영역을 검출하는 단계 및 EE-GM1 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 특이적 프라이머 또는 프로브로 EE-GM1 특이적 영역을 검출하는 단계를 포함하는, 종자의 선별 방법.
- 프로브:표적 핵산 비율이 표적 핵산 서열의 재순환을 통해 증폭되는, 실질적으로 상보적인 표지된 핵산 프로브와의 혼성화를 통해 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1의 존재를 검출하는 방법으로서,
a) 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1469의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 제1핵산 올리고뉴클레오타이드 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 223 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 상기 제1핵산 올리고뉴클레오타이드에 표적 핵산 서열을 혼성화시키는 단계;
b) 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1434 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 제2핵산 올리고뉴클레오타이드 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 258의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 표지된 핵산 프로브에 표적 핵산 서열을 혼성화하는 단계로서, 상기 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드가 적어도 1개의 뉴클레오타이드에 의해 중첩되고 상기 제1 또는 상기 제2 올리고뉴클레오타이드가 상기 표지된 핵산 프로브로 되도록 표지되는 것인, 혼성화 단계;
c) 선택적 프로브 분해를 유발시켜 이중 구조의 해리(duplex disassociation)를 초래하는 효소를 사용하여 프로브:표적 핵산 서열 이중 구조 내의 표지된 프로브만을 분해하여 표적 서열을 온전하게 유지하는 단계;
d) 단계 (a) 내지 (c)를 반복하여 표적 핵산 서열을 재순환시키는 단계;
e) 표지된 프로브의 분해를 검출함으로써 상기 표적 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계;
f) 서열번호 12의 뉴클레오타이드 210 내지 뉴클레오타이드 227의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 제3핵산 올리고뉴클레오타이드 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 561 내지 뉴클레오타이드 568의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 상기 제3핵산 올리고뉴클레오타이드에 상기 표적 핵산 서열을 혼성화시키는 단계;
g) 서열번호 12의 뉴클레오타이드 192 내지 뉴클레오타이드 209의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 제4 핵산 올리고뉴클레오타이드 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 뉴클레오타이드 586의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 상기 표지된 핵산 프로브에 상기 표적 핵산 서열을 혼성화시키는 단계로서, 상기 제3 및 제4 올리고뉴클레오타이드가 적어도 1개의 뉴클레오타이드에 의해 중첩되고 상기 제3 또는 상기 제4 올리고뉴클레오타이드가 표지되어 상기 표지된 핵산 프로브가 되는, 혼성화 단계;
h) 선택적 프로브 분해를 유발시켜 이중 구조의 해리를 초래하는 효소를 사용하여 프로브:표적 핵산 서열 이중 구조 내의 표지된 프로브 만을 분해하여 표적 서열을 온전하게 유지하는 단계;
i) 단계 (f) 내지 (h)를 반복하여 표적 핵산 서열을 재순환시키는 단계; 및
j) 표지된 프로브의 분해를 검출함으로써 상기 표적 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1의 존재의 검출방법. - 각각 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM1을 게놈 내에 포함하며, 상기 이벤트 EE-GM3를 포함하는 기준 종자가 NCIMB 41659의 수탁번호로 NCIMB에 기탁되어 있고, 상기 이벤트 EE-GM1을 포함하는 기준 종자가 NCIMB 41658의 수탁번호로 NCIMB에 기탁되어 있거나, 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM1을 게놈 내에 포함하는 기준 종자가 PTA-11041의 수탁번호로 ATCC에 기탁되어 있는, 유전자이식 대두 식물 또는 그의 세포, 부분, 조직, 종자 또는 자손.
- 제29항에 있어서, 각각 서열번호 4 및 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 2개의 프라이머에 의해 EE-GM3에 대한 우량 이벤트 동정 프로토콜을 이용하여 분석하는 경우 게놈 DNA가 약 263 bp의 DNA 단편을 생성하고, 각각 서열번호 16 및 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 2개의 프라이머에 의해 EE-GM1에 대한 우량 이벤트 동정 프로토콜을 이용하여 분석하는 경우 게놈 DNA가 약 183 bp의 DNA 단편을 생성하는, 유전자이식 대두 식물, 종자, 세포, 조직, 부분 또는 자손.
- 각각 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM1을 게놈 내에 포함하되, 대두 식물이 NCIMB 41659의 수탁번호로 NCIMB에 기탁된 종자로부터 성장한 대두 식물에 의한 전파(propagation) 및/또는 육종에 의해 얻을 수 있으며 우량 이벤트 EE-GM3를 포함하는 대두 식물과 NCIMB 41658의 수탁번호로 NCIMB에 기탁된 종자로부터 성장한 대두 식물에 의한 전파 및/또는 육종에 의해 얻을 수 있으며 게놈 내에 우량 이벤트 EE-GM1을 포함하는 대두 식물의 교배에 의해 얻어지거나, PTA-11041의 수탁번호로 ATCC에 기탁된 종자로부터 성장한 대두 식물에 의한 전파 및/또는 육종에 의해 얻어질 수 있는, 대두 식물, 식물 부분, 또는 그의 종자, 세포 또는 조직.
- 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1을 포함하되, 이벤트 EE-GM3를 포함하는 기준 종자가 NCIMB 41659의 수탁번호로 NCIMB에 기탁되어 있고, 이벤트 EE-GM1을 포함하는 기준 종자가 NCIMB 41658의 수탁번호로 NCIMB에 기탁되어 있으며, 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1을 포함하는 기준 종자가 PTA-11041의 수탁번호로 ATCC에 기탁되어 있는 대두 종자.
- 제32항의 종자로부터 얻을 수 있는, 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1을 포함하는, 유전자이식 대두 식물, 식물 부분, 세포 또는 조직.
- 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 식물과 다른 대두 식물을 교배시키는 단계 및 상기 교배로부터 얻어진 종자를 식재하는 단계를 포함하는, 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1을 포함하는 대두 식물 또는 종자를 생산하는 방법.
- 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM1을 포함하는 대두 게놈 DNA.
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1441 내지 뉴클레오타이드 1452 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 230 내지 251, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 본질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 분자 및 서열번호 12의 뉴클레오타이드 199 내지 뉴클레오타이드 220 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 558 내지 579, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 본질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 분자를 포함하는, 분리된 핵산 분자의 쌍.
- 제36항에 있어서, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1431 내지 뉴클레오타이드 1462 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 220 내지 261, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 본질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 분자 및 서열번호 12의 뉴클레오타이드 189 내지 뉴클레오타이드 230 또는 서열번호 13의 뉴클레오타이드 548 내지 589, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 본질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 분자를 포함하는, 분리된 핵산 분자의 쌍.
- 게놈 내에 하기 뉴클레오타이드 서열을 순서대로 포함하고:
a) 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 1451의 뉴클레오타이드 서열;
b) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 6760 내지 뉴클레오타이드 6958의 뉴클레오타이드 서열의 상보적 뉴클레오타이드 서열;
c) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 6874 내지 뉴클레오타이드 7298의 뉴클레오타이드 서열;
d) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 7 내지 뉴클레오타이드 7291의 뉴클레오타이드 서열;
e) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 12 내지 뉴클레오타이드 7265의 뉴클레오타이드 서열;
f) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 217 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열; 및
g) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 뉴클레오타이드 서열: 및
추가로 하기 서열을 순서대로 포함하는 대두 식물:
h) 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 209의 뉴클레오타이드 서열;
i) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 340 내지 뉴클레오타이드 3461의 뉴클레오타이드 서열;
j) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 336의 뉴클레오타이드 서열의 상보적 뉴클레오타이드 서열;
k) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 3462 내지 뉴클레오타이드 4076의 뉴클레오타이드 서열의 상보적 뉴클레오타이드 서열;
1) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 337 내지 뉴클레오타이드 3043의 뉴클레오타이드 서열;
m) 서열번호 13의 뉴클레오타이드 559 내지 뉴클레오타이드 568의 뉴클레오타이드 서열; 및
n) 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 뉴클레오타이드 1000의 뉴클레오타이드 서열. - 하기 뉴클레오타이드 서열을 순서대로 포함하고:
a) 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 1451의 뉴클레오타이드 서열;
b) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 6760 내지 뉴클레오타이드 6958의 뉴클레오타이드 서열의 상보적 뉴클레오타이드 서열;
c) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 6874 내지 뉴클레오타이드 7298의 뉴클레오타이드 서열;
d) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 7 내지 뉴클레오타이드 7291의 뉴클레오타이드 서열;
e) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 12 내지 뉴클레오타이드 7265의 뉴클레오타이드 서열;
f) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 217 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열; 및
g) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 뉴클레오타이드 서열;
추가로 하기 서열을 순서대로 포함하는 DNA 분자:
h) 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1 내지 209의 뉴클레오타이드 서열;
i) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 340 내지 뉴클레오타이드 3461의 뉴클레오타이드 서열;
j) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 336의 뉴클레오타이드 서열의 상보적 뉴클레오타이드 서열;
k) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 3462 내지 뉴클레오타이드 4076의 뉴클레오타이드 서열의 상보적 뉴클레오타이드 서열;
1) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 337 내지 뉴클레오타이드 3043의 뉴클레오타이드 서열;
m) 서열번호 13의 뉴클레오타이드 559 내지 뉴클레오타이드 568의 뉴클레오타이드 서열; 및
n) 서열번호 13의 뉴클레오타이드 569 내지 뉴클레오타이드 1000의 뉴클레오타이드 서열. - 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2의 동시 존재를 동정하는 방법으로서,
EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 특이적 프라이머 또는 프로브를 사용하여 EE-GM3 특이적 영역을 검출하는 단계 및 EE-GM2 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 특이적 프라이머 또는 프로브를 사용하여 EE-GM2 특이적 영역을 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2의 동시 존재의 동정 방법. - 제40항에 있어서, 적어도 2개의 프라이머를 사용하는 제1 중합효소 연쇄 반응과 적어도 2개의 프라이머를 사용하는 제2 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산으로부터 50 내지 1000 bp의 2개 DNA 단편을 증폭시키는 단계를 더 포함하되, 제1 중합효소 연쇄 반응에서 상기 프라이머 중 하나는 EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 영역을 인식하거나 EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 3' 측면 영역을 인식하고, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 3' 측면 영역은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 프라이머 중 다른 하나의 프라이머는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 EE-GM3의 외래 DNA 내의 서열을 인식하거나, 상기 프라이머 중 다른 하나의 프라이머는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하거나 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 EE-GM3의 외래 DNA 내의 서열을 인식하고, 제2 중합효소 연쇄 반응에서 상기 프라이머 중 하나는 EE-GM2 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 영역을 인식하거나 EE-GM2 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 3' 측면 영역을 인식하며, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 311의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 3' 측면 영역은 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 뉴클레오타이드 1880의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 프라이머 중 다른 하나의 프라이머는 서열번호 14의 뉴클레오타이드 312 내지 뉴클레오타이드 810의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 507의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 EE-GM2의 외래 DNA 내의 서열을 인식하거나, 상기 프라이머 중 다른 하나의 프라이머는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 EE-GM2의 외래 DNA 내의 서열을 인식함으로써, 상기 제1 및 제2 중합효소 반응은 연속적이거나 동시에 이루어질 수 있는 것인, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2의 동시 존재의 동정 방법.
- 제41항에 있어서, EE-GM3의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM3의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM3의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열, 또는 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하며, EE-GM2의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 311의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM3의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 뉴클레오타이드 1880의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM2의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 14의 뉴클레오타이드 312 내지 뉴클레오타이드 810의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 507의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2의 동시 존재의 동정 방법.
- 제41항에 있어서, EE-GM3의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM3의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM3의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 3' 말단에 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열, 또는 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하며, EE-GM2의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 311의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM2의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 뉴클레오타이드 1880의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM2의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 3' 말단에 서열번호 14의 뉴클레오타이드 312 내지 뉴클레오타이드 810의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 507의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2의 동시 존재의 동정 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 EE-GM3 특이적 프라이머가 각각 서열번호 5 및 서열번호 4의 서열, 또는 각각 서열번호 7 및 서열번호 5의 서열을 포함하고, 상기 EE-GM2 특이적 프라이머가 각각 서열번호 18 및 서열번호 19의 서열을 포함하는 것인, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2의 동시 존재의 동정 방법.
- 제44항에 있어서, 약 151 bp의 EE-GM2 특이적 단편 및 EE-GM3 PCR 동정 프로토콜을 이용한 약 263 또는 706 bp의 EE-GM3 특이적 단편을 증폭시키는 단계를 더 포함하는, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2의 동시 존재의 동정 방법.
- 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM2의 동시 존재를 동정하기 위한 키트로서, EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 영역을 인식하거나 EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 3' 측면 영역을 인식하는 하나의 프라이머를 포함하되, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 3' 측면 영역은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 하나의 프라이머를 포함하고, 상기 외래 DNA는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열, 또는 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하며, 추가로 EE-GM2 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 영역을 인식하거나 EE-GM2 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 3' 측면 영역을 인식하는 하나의 프라이머를 포함하고, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 311의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 3' 측면 영역은 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 뉴클레오타이드 1880의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, EE-GM2의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 하나의 프라이머를 포함하고, 상기 외래 DNA가 서열번호 14의 뉴클레오타이드 312 내지 뉴클레오타이드 810의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 507의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 것인 키트.
- 제46항에 있어서, EE-GM3의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM3의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM3의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열, 또는 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하며, EE-GM2의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 311의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM2의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 뉴클레오타이드 1880의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM2의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 서열번호 14의 뉴클레오타이드 312 내지 뉴클레오타이드 810의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 507의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 키트.
- 제46항에 있어서, EE-GM3의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM3의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM3의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 3' 말단에 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1843의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열, 또는 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하며, EE-GM2의 5' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 311의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, EE-GM2의 3' 측면 영역을 인식하는 상기 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 뉴클레오타이드 1880의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, EE-GM2의 외래 DNA 내의 서열을 인식하는 상기 프라이머가 3' 말단에 서열번호 14의 뉴클레오타이드 312 내지 뉴클레오타이드 810의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 507의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 키트.
- 제46항에 있어서, 서열번호 4의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 5의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하거나 서열번호 5의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 7의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고, 추가로 서열번호 18의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 19의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하는 것인 키트.
- EE-GM3 및 EE-GM2 특이적 검출에서 이용하기에 적합한 프라미머 쌍으로서,
최적화된 검출 조건하에 EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역 내의 서열을 특이적으로 인식하는 서열을 포함하며, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 3' 측면 영역은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 프라이머와; 최적화된 검출 조건하에 EE-GM2 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역 내의 서열을 특이적으로 인식하는 서열을 포함하며, 상기 5' 측면 영역은 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 311의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 3' 측면 영역은 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 뉴클레오타이드 1880의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍. - 제50항에 있어서, 상기 제1 프라이머가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 제2 프라이머가 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 311의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 뉴클레오타이드 1880의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 17 내지 200개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍.
- 제50항에 있어서, 상기 제1 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 제2 프라이머가 3' 최말단에 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 311의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 뉴클레오타이드 1880의 상보적 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 17개의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍.
- 3' 최말단에 서열번호 5의 서열을 포함하는 제1 프라이머와 3' 최말단에 서열번호 18의 서열을 포함하는 제2 프라이머의 프라이머 쌍.
- 3' 최말단에 서열번호 5의 서열을 포함하는 제1 프라이머;
3' 최말단에 서열번호 4의 서열을 포함하는 제2 프라이머;
3' 최말단에 서열번호 18의 서열을 포함하는 제3 프라이머; 및
3' 최말단에 서열번호 19의 서열을 포함하는 제4 프라이머의 4개의 프라이머를 포함하는 세트. - 제40항에 있어서, 생물학적 시료의 핵산을 EE-GM3에 대한 제1 특이적 프로브 및 EE-GM2에 대한 제2 특이적 프로브와 혼성화시키는 단계를 더 포함하는, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2의 동시 존재의 동정 방법.
- 제55항에 있어서, 상기 제1 특이적 프로브의 서열이 EE-GM3의 5' 측면 서열 또는 3' 측면 서열의 부분을 포함하는 서열 및 그와 인접한 외래 DNA의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지며, 상기 제2 특이적 프로브의 서열이 EE-GM2의 5' 측면 서열 또는 3' 측면 서열의 부분을 포함하는 서열 및 그와 인접한 외래 DNA의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지닌 것인, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2의 동시 존재의 동정 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 제1 특이적 프로브의 서열이 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1431 내지 1472 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 220 내지 261, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지며, 상기 제2 특이적 프로브의 서열이 서열번호 14의 뉴클레오타이드 301 내지 322 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 497 내지 518, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지닌 것인, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2의 동시 존재의 동정 방법.
- 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM2의 동시 존재를 동정하기 위한 키트로서, EE-GM3의 특이적 영역과 특이적으로 혼성화될 수 있는 제1 특이적 프로브 및 EE-GM2의 특이적 영역과 특이적으로 혼성화될 수 있는 제2 특이적 프로브를 포함하는 키트.
- 제58항에 있어서, 상기 제1 특이적 프로브의 서열이 EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 서열 또는 3' 측면 서열의 부분을 포함하는 서열 및 그와 인접한 외래 DNA의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지며, 상기 제2 특이적 프로브의 서열이 EE-GM2 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 서열 또는 3' 측면 서열의 부분을 포함하는 서열 및 그와 인접한 외래 DNA의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지닌 것인 키트.
- 제59항에 있어서, 상기 제1 특이적 프로브의 서열이 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1441 내지 1462 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 230 내지 251, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지니는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 제2 특이적 프로브의 서열이 서열번호 14의 뉴클레오타이드 301 내지 322 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 497 내지 518, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지닌 것인 키트.
- 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM2의 동시 존재를 동정하기 위한 특이적 프로브 쌍.
- 제61항에 있어서, EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 서열 또는 3' 측면 서열의 부분을 포함하는 서열 및 그와 인접한 외래 DNA의 서열 또는 그의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지니는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 프로브, 및 EE-GM2 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 측면 서열 또는 3' 측면 서열의 부분을 포함하는 서열 및 그와 인접한 외래 DNA의 서열 또는 그의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 프로브를 포함하는 프로브 쌍.
- 제62항에 있어서, 상기 제1 프로브가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1441 내지 1462 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 230 내지 251, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지며, 상기 제2 프로브가 서열번호 14의 뉴클레오타이드 301 내지 322 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 497 내지 518, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 지닌 것인 프로브 쌍.
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1441 내지 1462 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 230 내지 251, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 본질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 서열을 지닌 제1 프로브 및 서열번호 14의 뉴클레오타이드 301 내지 322 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 497 내지 518, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 본질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 지닌 제2 프로브를 포함하는, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2의 동시 존재를 동정하기 위한 특이적 프로브 세트.
- 종자 시료 내에서, EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 특이적 프라이머 또는 프로브로 EE-GM3 특이적 영역을 검출하는 단계 및 EE-GM2 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 특이적 프라이머 또는 프로브로 EE-GM2 특이적 영역을 검출하는 단계를 포함하는, 종자 순도의 확인 방법.
- EE-GM3의 존재에 대해 종자를 선별하는 방법으로서, 종자 소집단 시료 내에서, EE-GM3 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 특이적 프라이머 또는 프로브로 EE-GM3 특이적 영역을 검출하고, EE-GM2 내의 제초제 내성 유전자를 포함하는 외래 DNA의 5' 또는 3' 측면 영역을 특이적으로 인식하는 특이적 프라이머 또는 프로브로 EE-GM2 특이적 영역을 검출하는 것을 포함하는, EE-GM3의 존재에 대해 종자를 선별하는 방법.
- 실질적으로 상보적인 표지된 핵산 프로브와 혼성화시키고 프로브:표적 핵산 비율이 표적 핵산 서열의 재순환을 통해 증폭되는 것을 통해 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2의 존재를 검출하는 방법으로서,
a) 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1452 내지 뉴클레오타이드 1469의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 제1핵산 올리고뉴클레오타이드 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 223 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 상기 제1핵산 올리고뉴클레오타이드에 표적 핵산 서열을 혼성화하는 단계;
b) 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1434 내지 뉴클레오타이드 1451의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 제2핵산 올리고뉴클레오타이드 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 258의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 표지된 핵산 프로브에 표적 핵산 서열을 혼성화하는 단계로서, 상기 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드가 적어도 1개의 뉴클레오타이드에 의해 중첩되고 상기 제1 또는 상기 제2 올리고뉴클레오타이드가 상기 표지된 핵산 프로브로 되도록 표지되는 것인 혼성화 단계;
c) 선택적 프로브 분해를 유발시켜 이중 구조의 해리를 초래하는 효소를 사용하여 프로브:표적 핵산 서열 이중 구조 내의 표지된 프로브 만을 분해하여 표적 서열을 온전하게 유지하는 단계;
d) 단계 (a) 내지 (c)를 반복하여 표적 핵산 서열을 재순환시키는 단계;
e) 표지된 프로브의 분해를 검출함으로써 상기 표적 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계;
f) 서열번호 14의 뉴클레오타이드 312 내지 뉴클레오타이드 329의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 제3핵산 올리고뉴클레오타이드 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 490 내지 뉴클레오타이드 507의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 상기 제3핵산 올리고뉴클레오타이드에 상기 표적 핵산 서열을 혼성화시키는 단계;
g) 서열번호 14의 뉴클레오타이드 294 내지 뉴클레오타이드 311의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 제4 핵산 올리고뉴클레오타이드 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 뉴클레오타이드 525의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열을 포함하는 상기 표지된 핵산 프로브에 상기 표적 핵산 서열을 혼성화시키는 단계로서, 상기 제3 및 제4 올리고뉴클레오타이드가 적어도 1개의 뉴클레오타이드에 의해 중첩되고 상기 제3 또는 상기 제4 올리고뉴클레오타이드가 표지되어 상기 표지된 핵산 프로브가 되는 것인 혼성화 단계;
h) 선택적 프로브 분해를 유발시켜 이중 구조의 해리를 초래하는 효소를 사용하여 프로브:표적 핵산 서열 이중 구조 내의 표지된 프로브만을 분해하여 표적 서열을 온전하게 유지하는 단계;
i) 단계 (f) 내지 (h)를 반복하여 표적 핵산 서열을 재순환시키는 단계;
j) 표지된 프로브의 분해를 검출함으로써 상기 표적 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내의 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2의 존재의 검출방법. - 각각 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM2를 게놈 내에 포함하며, 상기 이벤트 EE-GM3를 포함하는 기준 종자가 NCIMB 41659의 수탁번호로 NCIMB에 기탁되어 있고, 상기 이벤트 EE-GM2를 포함하는 기준 종자가 NCIMB 41660의 수탁번호로 NCIMB에 기탁되어 있거나, 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM2를 게놈 내에 포함하는 기준 종자가 PTA-11042의 수탁번호로 ATCC에 기탁되어 있는, 유전자이식 대두 식물 또는 그의 세포, 부분, 종자 또는 자손.
- 제68항에 있어서, 각각 서열번호 4 및 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 2개의 프라이머에 의해 EE-GM3에 대한 우량 이벤트 동정 프로토콜을 이용하여 분석하는 경우, 게놈 DNA가 약 263 bp의 DNA 단편을 생성하고, 각각 서열번호 18 및 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 2개의 프라이머에 의해 EE-GM2에 대한 우량 이벤트 동정 프로토콜을 이용하여 분석하는 경우 게놈 DNA가 약 151 bp의 DNA 단편을 생성하는, 유전자이식 대두 식물, 종자, 세포, 부분 또는 자손.
- 각각 우량 이벤트 EE-GM3 및 우량 이벤트 EE-GM2를 게놈 내에 포함하며, 대두 식물이 NCIMB 41659의 수탁번호로 NCIMB에 기탁된 종자로부터 성장한 대두 식물에 의한 전파 및/또는 육종에 의해 얻을 수 있으며 게놈 내에 우량 이벤트 EE-GM3를 포함하는 대두 식물과 NCIMB 41660의 수탁번호로 NCIMB에 기탁된 종자로부터 성장한 대두 식물에 의한 전파 및/또는 육종에 의해 얻을 수 있으며 게놈 내에 우량 이벤트 EE-GM2를 포함하는 대두 식물의 교배에 의해 얻어지거나, PTA-11042의 수탁번호로 ATCC에 기탁된 종자로부터 성장한 대두 식물에 의한 전파 및/또는 육종에 의해 얻어질 수 있는, 대두 식물, 또는 그의 종자, 세포 혹은 조직.
- 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하며, 이벤트 EE-GM3를 포함하는 기준 종자가 NCIMB 41659의 수탁번호로 NCIMB에 기탁되어 있고, 이벤트 EE-GM2를 포함하는 기준 종자가 NCIMB 41660의 수탁번호로 NCIMB에 기탁되어 있으며, 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 기준 종자가 PTA-11042의 수탁번호로 ATCC에 기탁되어 있는 대두 종자.
- 제71항의 종자로부터 생산되는, 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는, 유전자이식 대두 식물, 세포 또는 조직.
- 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 따른 식물과 다른 대두 식물을 교배시키는 단계 및 상기 교배로부터 얻어진 종자를 식재하는 단계를 포함하는, 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 대두 식물 또는 종자를 생산하는 방법.
- 우량 이벤트 EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 대두 게놈 DNA.
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1441 내지 뉴클레오타이드 1452 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 230 내지 251, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 본질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 분자 및 서열번호 14의 뉴클레오타이드 301 내지 뉴클레오타이드 322 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 497 내지 518, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 본질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 분자를 포함하는, 분리된 핵산 분자의 쌍.
- 제75항에 있어서, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1431 내지 뉴클레오타이드 1462 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 220 내지 261, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 본질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 분자 및 서열번호 14의 뉴클레오타이드 301 내지 뉴클레오타이드 322 또는 서열번호 15의 뉴클레오타이드 487 내지 518, 또는 상기 서열들의 상보 서열과 본질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 분자를 포함하는, 분리된 핵산 분자의 쌍.
- 게놈 내에 하기 뉴클레오타이드 서열을 순서대로 포함하고:
a) 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 1451의 뉴클레오타이드 서열;
b) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 6760 내지 뉴클레오타이드 6958의 뉴클레오타이드 서열의 상보적 뉴클레오타이드 서열;
c) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 6874 내지 뉴클레오타이드 7298의 뉴클레오타이드 서열;
d) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 7 내지 뉴클레오타이드 7291의 뉴클레오타이드 서열;
e) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 12 내지 뉴클레오타이드 7265의 뉴클레오타이드 서열;
f) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 217 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열; 및
g) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 뉴클레오타이드 서열;
추가로 하기 서열을 순서대로 포함하는 대두 식물:
h) 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 311의 뉴클레오타이드 서열;
i) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 3458 내지 뉴클레오타이드 3848의 뉴클레오타이드 서열;
j) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 413 내지 뉴클레오타이드 3457의 뉴클레오타이드 서열; 및
k) 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 뉴클레오타이드 1880의 뉴클레오타이드 서열. - 하기 뉴클레오타이드 서열을 순서대로 포함하고:
a) 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1 내지 1451의 뉴클레오타이드 서열;
b) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 6760 내지 뉴클레오타이드 6958의 뉴클레오타이드 서열의 상보적 뉴클레오타이드 서열;
c) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 6874 내지 뉴클레오타이드 7298의 뉴클레오타이드 서열;
d) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 7 내지 뉴클레오타이드 7291의 뉴클레오타이드 서열;
e) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 12 내지 뉴클레오타이드 7265의 뉴클레오타이드 서열;
f) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 217 내지 뉴클레오타이드 240의 뉴클레오타이드 서열; 및
g) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 241 내지 뉴클레오타이드 1408의 뉴클레오타이드 서열: 및
추가로 하기 서열을 순서대로 포함하는 DNA 분자:
h) 서열번호 14의 뉴클레오타이드 1 내지 311의 뉴클레오타이드 서열;
i) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 3458 내지 뉴클레오타이드 3848의 뉴클레오타이드 서열;
j) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 413 내지 뉴클레오타이드 3457의 뉴클레오타이드 서열; 및
k) 서열번호 15의 뉴클레오타이드 508 내지 뉴클레오타이드 1880의 뉴클레오타이드 서열. - 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1431 내지 1472와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 220 내지 261과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열, 또는 상기 서열들의 상보 서열, 및 또한 서열번호 12의 뉴클레오타이드 199 내지 220과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열 및 서열번호 13의 뉴클레오타이드 558 내지 579와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열, 또는 상기 서열들의 상보 서열을 세포의 게놈 내에 포함하는, EE-GM3 및 EE-GM1을 포함하는 대두 식물, 세포, 조직 또는 종자.
- 서열번호 2의 뉴클레오타이드 1431 내지 1472와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 220 내지 261과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열, 또는 상기 서열들의 상보 서열, 및 또한 서열번호 14의 뉴클레오타이드 301 내지 322와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열 및 서열번호 15의 뉴클레오타이드 497 내지 518과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 지닌 핵산 서열, 또는 상기 서열들의 상보 서열을 세포의 게놈 내에 포함하는 것인, EE-GM3 및 EE-GM2를 포함하는 대두 식물, 세포, 조직 또는 종자.
- 게놈 내에 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열에 대해 적어도 97, 98, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 20 또는 그의 상보 서열에 대해 적어도 97, 98, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하고, 게놈 내에 EE-GM1 또는 EE-GM2의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열에 대해 적어도 97, 98, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하며, EE-GM1을 포함하는 기준 종자가 NCIMB 41658의 수탁번호로 기탁되고, EE-GM2를 포함하는 기준 종자가 NCIMB 41660의 수탁번호로 기탁되며, 예를 들어, 상기 EE-GM1 또는 EE-GM2의 뉴클레오타이드 서열이 각각 서열번호 12 또는 13 내의 외래 DNA 서열, 또는 서열번호 14 또는 15 내의 외래 DNA 서열, 또는 각각 서열번호 12의 서열 및 서열번호 13의 서열 사이의 식물 게놈 내 외래 DNA 서열, 또는 서열번호 14의 서열 및 서열번호 15의 서열 사이의 식물 게놈 내 외래 DNA 서열을 포함하거나 서열인 것인, 대두 식물, 식물 세포, 조직 또는 종자.
- 게놈 내에 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열에 혼성화하거나, 서열번호 20의 뉴클레오타이드 위치 1452 내지 뉴클레오타이드 위치 16638의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열에 혼성화하거나, 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열에 혼성화하는 핵산 분자를 포함하고, 게놈 내에 EE-GM1 또는 EE-GM2의 뉴클레오타이드 서열 혹은 그의 상보 서열에 혼성화하는 핵산 분자를 포함하며, EE-GM1을 포함하는 기준 종자가 NCIMB 41658의 수탁번호로 기탁되고, EE-GM2를 포함하는 기준 종자가 NCIMB 41660의 수탁번호로 기탁되며, 예를 들어, 상기 EE-GM1 또는 EE-GM2의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 12 또는 13 내의 외래 DNA 서열, 또는 서열번호 14 또는 15 내의 외래 DNA 서열, 또는 서열번호 12의 서열 및 서열번호 13의 서열 사이의 식물 게놈 내 외래 DNA 서열, 또는 서열번호 14의 서열 및 서열번호 15의 서열 사이의 식물 게놈 내 외래 DNA 서열을 포함하거나 서열인 것인, 대두 식물, 식물 세포, 조직 또는 종자.
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