JP6470705B2 - 除草剤耐性植物及びそれを識別するための方法 - Google Patents
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Description
本出願は2010年7月23日に出願された米国仮特許出願61/367,251号;2009年11月23日に出願された米国仮特許出願61/263,707号;及び2009年11月23日に出願された欧州特許出願EP09014565.7号の優先権を主張し、これらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、各々ダイズゲノムの特異的箇所において、特異的形質転換イベントの少なくとも2つを保有することにより、特に、除草剤耐性を付与する蛋白をコードする遺伝子の少なくとも2セットの存在により特徴付けられる、トランスジェニックダイズ植物、植物性物質及び種子に関する。本発明のダイズ植物は除草剤の非存在下における非形質転換ダイズ系統と同等の種々異なる遺伝子的背景における作物学的性能、遺伝子的安定性及び機能に除草剤耐性表現型を組み合わせている。本発明は更に生物学的試料中に形質転換イベントEE−GM3及びEE−GM2又はEE−GM1を特に含む植物性物質の存在を識別するための方法及びキットを提供する。
i)植物発現可能なプロモーターの制御下にグリホセート耐性EPSPS酵素をコードするトウモロコシ(Zea mays)に由来する修飾されたepsps遺伝子を含む第1のキメラ遺伝子;及び、
ii)植物発現可能なプロモーターの制御下にHPPD阻害剤除草剤耐性酵素をコードするシュードモナスフルオレスセンス(Pseudomonas fluorescens)に由来する修飾されたhppd遺伝子を含む第2のキメラ遺伝子;
を含む外来性DNAを含み、そして該第2の優良イベントは植物発現可能なプロモーターの制御下にグルホシネート(又はホスフィノスリシン)アセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするストレプトミセスビリドクロモゲンス(Streptomyces viridochromogenes)から誘導された修飾されたグルホシネート耐性遺伝子を含む(第3の)キメラ遺伝子を含む。
a)外来性DNAの存在が、植物の他の所望の特性、例えば作物学的性能に関するもの又は商業的価値を犠牲にしないこと;
b)安定に受け継がれ、そしてそのアイデンティティーの管理のための適切なツールを開発することのできる十分定義された分子配置によりイベントが特徴付けられること;
c)イベントを担持する植物が通常の作物学的使用において曝露される可能性のある環境条件の範囲において商業的に許容できるレベルで、イベントのヘテロ接合(又は半接合)及びホモ接合条件の両方において、正確、適切及び安定な空間的及び時間的な表現型の発現を目的の遺伝子が示すこと;
の1つ以上、好ましくは2つ以上、好都合には全てである。
− 自身の3’末端において5’フランキング配列(配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451まで)における植物DNAから選択される少なくとも17連続ヌクレオチド、好ましくは20連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む17ntから約200ntまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド(5’フランキング配列を認識するプライマー);又は、
− 自身の3’末端において3’フランキング配列(配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体)における植物DNAから選択される少なくとも17連続ヌクレオチド、好ましくは20連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む17ntから約200ntまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド(3’フランキング配列を認識するプライマー);又は、
− 自身の3’末端において挿入されたDNA配列(配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体)から選択される少なくとも17連続ヌクレオチド、好ましくは20連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む17ntから約200ntまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド(外来性DNAを認識するプライマー);又は、
− 挿入されたDNA配列(配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240まで)から選択される少なくとも17連続ヌクレオチド、好ましくは20連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む17ntから約200ntまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド;又は、
− 挿入されたDNAフラグメント又はその相補体(配列番号1又は配列番号20のヌクレオチド位置1452から16638まで)から選択される少なくとも17連続ヌクレオチド、好ましくは20連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む17ntから約200ntまでの長さの範囲の適当なオリゴヌクレオチド。
a.5’フランキング配列認識プライマー:
− 配列番号2のヌクレオチド264からヌクレオチド283までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド266からヌクレオチド285までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1240からヌクレオチド1259までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド265からヌクレオチド285までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド265からヌクレオチド283までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1239からヌクレオチド1259までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1241からヌクレオチド1259までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1244からヌクレオチド1263までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1248からヌクレオチド1267までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1250からヌクレオチド1269までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド262からヌクレオチド279までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド263からヌクレオチド279までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド264からヌクレオチド285までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド266からヌクレオチド283までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1238からヌクレオチド1259までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1242からヌクレオチド1259までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1243からヌクレオチド1263までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1245からヌクレオチド1263までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1247からヌクレオチド1267までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1249からヌクレオチド1269までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1249からヌクレオチド1267までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド263からヌクレオチド285までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド267からヌクレオチド283までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1242からヌクレオチド1263までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1243からヌクレオチド1259までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1246からヌクレオチド1267までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1246からヌクレオチド1263までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1248からヌクレオチド1269までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1250からヌクレオチド1271までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1250からヌクレオチド1267までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1241からヌクレオチド1263までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1245からヌクレオチド1267までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1247からヌクレオチド1269までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1247からヌクレオチド1263までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1249からヌクレオチド1271までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1242からヌクレオチド1261までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1241からヌクレオチド1261までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1243からヌクレオチド1261までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1240からヌクレオチド1261までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1244からヌクレオチド1261までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1239からヌクレオチド1261までのヌクレオチド配列
− 配列番号2のヌクレオチド1245からヌクレオチド1261までのヌクレオチド配列
b.5’フランキング配列認識プライマーと共に使用するための外来性DNA配列認識プライマー
− 配列番号2のヌクレオチド1732からヌクレオチド1751までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1735からヌクレオチド1754までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1731からヌクレオチド1750までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1732からヌクレオチド1750までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1732からヌクレオチド1752までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1731からヌクレオチド1749までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1732からヌクレオチド1749までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1731からヌクレオチド1751までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1732からヌクレオチド1753までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1731からヌクレオチド1748までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1732からヌクレオチド1748までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1735からヌクレオチド1751までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1731からヌクレオチド1752までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1732からヌクレオチド1754までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1731からヌクレオチド1747までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1731からヌクレオチド1753までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1727からヌクレオチド1746までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1727からヌクレオチド1745までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1727からヌクレオチド1747までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1727からヌクレオチド1744までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1727からヌクレオチド1748までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1727からヌクレオチド1749までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1726からヌクレオチド1745までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1726からヌクレオチド1744までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1726からヌクレオチド1746までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1726からヌクレオチド1747までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1726からヌクレオチド1748までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1724からヌクレオチド1744までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1724からヌクレオチド1745までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1724からヌクレオチド1746までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1461からヌクレオチド1478までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1670からヌクレオチド1686までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1469からヌクレオチド1486までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1508からヌクレオチド1527までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1667からヌクレオチド1686までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1670からヌクレオチド1687までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1673からヌクレオチド1689までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1688からヌクレオチド1704までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1688からヌクレオチド1705までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1692からヌクレオチド1709までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1467からヌクレオチド1486までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1481からヌクレオチド1497までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1481からヌクレオチド1498までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1491からヌクレオチド1507までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1491からヌクレオチド1508までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1672からヌクレオチド1688までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1673からヌクレオチド1690までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1673からヌクレオチド1691までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1688からヌクレオチド1706までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1691からヌクレオチド1707までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1691からヌクレオチド1708までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1469からヌクレオチド1487までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1481からヌクレオチド1499までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1489からヌクレオチド1505までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1489からヌクレオチド1506までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1489からヌクレオチド1507までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1489からヌクレオチド1508までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1666からヌクレオチド1686までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1667からヌクレオチド1687までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1670からヌクレオチド1688までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1672からヌクレオチド1689までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1688からヌクレオチド1707までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1691からヌクレオチド1709までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1692からヌクレオチド1710までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1481からヌクレオチド1500までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1491からヌクレオチド1509までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1670からヌクレオチド1689までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1672からヌクレオチド1690までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1672からヌクレオチド1691までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1687からヌクレオチド1705までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1687からヌクレオチド1706までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1691からヌクレオチド1710までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1472からヌクレオチド1488までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1488からヌクレオチド1507までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1491からヌクレオチド1510までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1495からヌクレオチド1512までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1495からヌクレオチド1513までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1495からヌクレオチド1514までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1673からヌクレオチド1692までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1678からヌクレオチド1694までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1678からヌクレオチド1695までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1678からヌクレオチド1696までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1687からヌクレオチド1703までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1687からヌクレオチド1704までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1692からヌクレオチド1711までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1469からヌクレオチド1488までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1488からヌクレオチド1506までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1491からヌクレオチド1511までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1670からヌクレオチド1690までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1678からヌクレオチド1697までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1688からヌクレオチド1709までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1467からヌクレオチド1487までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1488からヌクレオチド1508までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1495からヌクレオチド1511までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1491からヌクレオチド1512までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1666からヌクレオチド1687までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1667からヌクレオチド1688までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1672からヌクレオチド1692までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1673からヌクレオチド1693までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1687からヌクレオチド1707までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1472からヌクレオチド1490までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1472からヌクレオチド1491までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1481からヌクレオチド1501までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1489からヌクレオチド1509までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1495からヌクレオチド1515までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1670からヌクレオチド1691までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1673からヌクレオチド1694までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1678からヌクレオチド1698までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1469からヌクレオチド1489までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1667からヌクレオチド1689までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1687からヌクレオチド1708までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1688からヌクレオチド1710までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1691からヌクレオチド1711までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1472からヌクレオチド1492までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1489からヌクレオチド1510までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1666からヌクレオチド1688までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1687からヌクレオチド1709までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1692からヌクレオチド1712までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1467からヌクレオチド1488までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1469からヌクレオチド1490までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1488からヌクレオチド1509までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1489からヌクレオチド1511までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1678からヌクレオチド1699までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1472からヌクレオチド1493までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1472からヌクレオチド1494までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1481からヌクレオチド1502までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1670からヌクレオチド1692までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1469からヌクレオチド1491までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1488からヌクレオチド1510までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1691からヌクレオチド1712までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1692からヌクレオチド1713までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1692からヌクレオチド1714までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1467からヌクレオチド1489までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1678からヌクレオチド1700までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1481からヌクレオチド1503までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号2のヌクレオチド1691からヌクレオチド1713までのヌクレオチド配列の相補体
c.3’フランキング配列認識プライマー:
− 配列番号3のヌクレオチド828からヌクレオチド847までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド830からヌクレオチド849までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド828からヌクレオチド846までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド828からヌクレオチド848までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド830からヌクレオチド848までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド830からヌクレオチド850までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド828からヌクレオチド845までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド830からヌクレオチド847までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド828からヌクレオチド849までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド830からヌクレオチド851までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド828からヌクレオチド844までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド830からヌクレオチド846までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド828からヌクレオチド850までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド830からヌクレオチド852までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド992からヌクレオチド1009までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド731からヌクレオチド752までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド776からヌクレオチド795までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド731からヌクレオチド753までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド776からヌクレオチド794までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド776からヌクレオチド796までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド776からヌクレオチド793までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド776からヌクレオチド797までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド776からヌクレオチド792までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド776からヌクレオチド798までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド733からヌクレオチド752までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド733からヌクレオチド753までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド733からヌクレオチド754までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド733からヌクレオチド755までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド838からヌクレオチド854までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド246からヌクレオチド263までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド838からヌクレオチド855までのヌクレオチド配列の相補体
− 配列番号3のヌクレオチド245からヌクレオチド264までのヌクレオチド配列の相補体
d.3’フランキング配列認識プライマーと共に使用するための外来性DNA配列認識プライマー
− 配列番号3のヌクレオチド173からヌクレオチド192までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド22からヌクレオチド41までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド172からヌクレオチド192までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド174からヌクレオチド192までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド191からヌクレオチド210までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド171からヌクレオチド192までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド175からヌクレオチド192までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド190からヌクレオチド210までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド192からヌクレオチド210までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド176からヌクレオチド192までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド189からヌクレオチド210までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド193からヌクレオチド210までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド188からヌクレオチド210までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド194からヌクレオチド210までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド199からヌクレオチド218までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド200からヌクレオチド218までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド197からヌクレオチド218までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド201からヌクレオチド218までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド201からヌクレオチド220までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド200からヌクレオチド220までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド199からヌクレオチド220までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド200からヌクレオチド221までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド199からヌクレオチド221までのヌクレオチド配列
− 配列番号3のヌクレオチド150からヌクレオチド172までのヌクレオチド配列
本明細書において更に提供されるものは、そのようなイベントを含むそのような植物の種子、並びにそのような種子から生産されるダイズ製品であり、ここで該ダイズ製品はイベントEE−GM3及びEE−GM1又はEE−GM2を含む。そのようなダイズ製品は穀粉、粉砕種子、粉末食品、フレーク等であるか、それを含むことができる。特にそのようなダイズ製品はイベントEE−GM3及び優良イベントEE−GM1又はEE−GM2に対して診断的なアンプリコンを生産する核酸を含み、そのようなアンプリコンは配列番号2又は3、配列番号14又は15、及び/又は配列番号12又は13を含む。また本明細書において提供されるものはイベントEE−GM3及び優良イベントEE−GM1又はEE−GM2を含むダイズ種子を得ること、及び、それからダイズ製品を生産することを含む、そのようなダイズ製品を製造するための方法である。
アラクロル、ベンタゾン、トリフラリン、クロリムロン−エチル、クロランスラム−メチル、フェノキサプロプ、フォメサフェン、フルアジホップ、グリフォセート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、(S)メトラクロル、メトリブジン、ペンジメタリン、テプラロキシジム、イソキサフルトール、グルホシネート。
ラムダ−シハロスリン、メトミル、パラチオン、チオカルブ、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマネクチン−ベンゾエート、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルスリン、ガンマおよびラムダシハロスリン、4-[[(6-クロルピリジン-3-イル)メチル](2,2-ジフルオロエチル)アミノ]フラン-
2(5H)-オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、ベータ−シフルスリン。
アゾキシストロビン、シプロコナゾール、エポキシコナゾール、フルトリアフォル、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、テトラコナゾール。
配列番号1:ベクターpSF10のSalIフラグメントヌクレオチド配列
配列番号2:EE−GM3の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAにフランキングしている5’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号3:EE−GM3の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAにフランキングしている3’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号4:プライマーSOY028
配列番号5:プライマーSOY029
配列番号6:プライマーSMP187
配列番号7:プライマーSTV019
配列番号8:アンプリコンのヌクレオチド配列
配列番号9:対照フラグメントの増幅のためのプライマー1(SOY01)
配列番号10:対照フラグメントの増幅のためのプライマー2(SOY02)
配列番号11:pB2/P35SAcKのヌクレオチド配列
配列番号12:EE−GM1の外来性DNAにフランキングしている5’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号13:EE−GM1の外来性DNAにフランキングしている3’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号14:EE−GM2の外来性DNAにフランキングしている5’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号15:EE−GM2の外来性DNAにフランキングしている3’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号16:プライマーSOY06
配列番号17:プライマーSOY07
配列番号18:プライマーSOY09
配列番号19:プライマーSOY010
配列番号20:EE−GM3の外来性DNA及び植物フランキング配列のヌクレオチド配列
配列番号21:プライマーSHA130
配列番号22:プライマーSHA178
1.1 2mEPSPS及びHPPD-Pf-W336キメラ遺伝子を含む外来性DNAの説明
プラスミドpSF10は約7,3kbのSalIフラグメント上に所在するキメラ2mepsps遺伝子及びキメラhppd-Pf-W336遺伝子を含有するpUC19由来クローニングベクターである。2つのSal1制限部位の間に含まれるDNAの完全な説明を以下の表1に示す。ヌクレオチド配列は配列番号1に示す。
約7.3kbのHPLC精製SalI線状化pSF10フラグメント(2mEPSPSグリホセート耐性遺伝子及びHPPD阻害剤耐性遺伝子HPPD−Pf−W336を含有する)を用いてダイズJack種の細胞内への直接遺伝子転移(Nickell, C. D., G. R. Noel, D. J. Thomas, and R. Waller. Registration of 'Jack' soybean. Crop Sci 1365. 30.1990)、ついで、形質転換された植物細胞をトランスジェニック繁殖性ダイズ植物に再生することにより、形質転換されたダイズ植物を得た。
優良イベントEE−GM3は除草剤耐性遺伝子の良好な発現及び安定性に基づいて広範な選択手順に基づいて選択し、そして、植物の草丈、節までの高さ、起立性、活力、種子収量のような最適な作物学的特性とのその適合性を評価した。このイベントを含有するダイズ植物は同じキメラ遺伝子を用いて得られた種々異なる形質転換イベントの広範な範囲から選択した。本イベントの選択において使用したパラメーターは、以下の通り、即ち:a)圃場試験におけるイソキサフルトール除草剤適用への許容可能な耐性、b)圃場試験におけるグリホセート除草剤適用への許容可能な耐性、c)圃場試験におけるイソキサフルトール及びグリホセートの複合適用への許容可能な耐性、d)ベクター骨格の非存在下におけるダイズ植物ゲノムの単一の遺伝子座における除草剤耐性導入遺伝子の挿入、e)形質転換のために使用する親植物と類似の全体的作物性(成熟性、倒伏性、易罹患性等)、及び、f)形質転換DNAの挿入により生じる顕著な収量障害が無いこと(同じ条件下に生育させた形質転換に使用した植物系統のようなイベントを有さない同遺伝子系の系統と比較して)とした。
− Jackと比較して類似の植物形態及び種子特性、
− Jackと比較してダイズの病気に対して変化が無いこと、及び、
− Jackと比較して種子の発芽又は休眠に変化が無いこと、
を有することを示していた。
EE−GM3優良イベントにおける除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAにフランキングする領域の配列を以下の通り決定した。
5’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号2に示す。ヌクレオチド1〜1451の配列は植物DNAに相当し、ヌクレオチド1452〜1843の配列は外来性DNAに相当する。
3’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号3に示す。ヌクレオチド1〜240の配列は外来性DNAに相当し、ヌクレオチド241〜1408の配列は植物DNAに相当する。
種々異なる分子手法を用いて除草剤耐性遺伝子を含む優良イベントEE−GM3の外来性DNAがヘッドトゥーヘッド(head to head)方向の2つの部分的3’ヒストンAt配列とそれに続くヘッドトゥーテイル(head to tail)方向に配置したpSF10のSalIフラグメントの2つのほぼ完全なコピーを含有することが決定されている(図1参照)。
−ヌクレオチド1からヌクレオチド199まで:配列番号1のnt6760からnt6958までのヌクレオチド配列の相補体に相当するヌクレオチド配列;
−ヌクレオチド200からヌクレオチド624まで:配列番号1のnt6874からnt7298までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列;
−ヌクレオチド625からヌクレオチド7909まで:配列番号1のnt7からnt7291までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列;
−ヌクレオチド7910からヌクレオチド15163まで:配列番号1のnt12からnt7265までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列;及び、
−ヌクレオチド15164からヌクレオチド15187まで:配列番号3のnt217からnt240までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列(この配列はpSF10プラスミドDNA又はwt植物DNAの何れにも相当せず、従ってフィラーDNAと標記する)。
本外来性DNAは、直近上流において外来性DNAと隣接して、配列番号2のヌクレオチド1から1451までの5’フランキング配列により先行されており、そして、直近下流において外来性DNAと隣接して、配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの3’フランキング配列により後続されている。
プラスミドpB2/P35SAcKはキメラpat遺伝子を含有するpUC19誘導クローニングベクターである。ベクターの説明は以下の表2に示す。そのヌクレオチド配列は配列番号11に示す。
1.4.1 EE−GM1の識別
除草剤抵抗性ダイズは直接遺伝子転移を用いながらベクターpB2/P35SAcKを用いる大豆の形質転換により発生させた。
優良イベントEE−GM1は除草剤抵抗性遺伝子の良好な発現及び安定性及び最適作物学的特性とのその適合性に基づいて広範な選択手順に基づいて選択した。
1.4.2.1. 右(5’)フランキング領域
5’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号12に示す。ヌクレオチド1〜209の配列は植物DNAに相当し、ヌクレオチド210〜720の配列は外来性DNAに相当する。
3’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号13に示す。ヌクレオチド1〜568の配列は外来性DNAに相当し、ヌクレオチド569〜1000の配列は植物DNAに相当する。
種々異なる分子手法を用いて除草剤耐性遺伝子を含む優良イベントEE−GM1の外来性DNAが直接リピート構造においてキメラpat遺伝子のコピー2つを含むことが決定されている(図3参照)。
−ヌクレオチド1からヌクレオチド3122まで:配列番号11のnt340からnt3461までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列;
−ヌクレオチド3123からヌクレオチド3458まで:配列番号11のnt1からnt336までのヌクレオチド配列の相補体に相当するヌクレオチド配列;
−ヌクレオチド3459からヌクレオチド4073まで:配列番号11のnt3462からnt4076までのヌクレオチド配列の相補体に相当するヌクレオチド配列;
−ヌクレオチド4074からヌクレオチド6780まで:配列番号11のnt337からnt3043までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列;及び、
−ヌクレオチド6781からヌクレオチド6790まで:配列番号13のnt559からnt568までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列(この配列はプラスミドDNA又はwt植物DNAの何れにも相当せず、従ってフィラーDNAと標記する)。
EE−GM1の本外来性DNAは、直近上流において外来性DNAと隣接して、配列番号12のヌクレオチド1から209までの5’フランキング配列において先行されており、そして、直近下流において外来性DNAと隣接して、配列番号13のヌクレオチド569からヌクレオチド1000までの3’フランキング配列において後続されている。
除草剤抵抗性ダイズは直接遺伝子転移を用いながらベクターpB2/P35SAcKを用いる大豆の形質転換により発生させた。
優良イベントEE−GM2は除草剤抵抗性遺伝子の良好な発現及び安定性及び最適作物学的特性とのその適合性に基づいて広範な選択手順に基づいて選択した。
1.5.1.1. 右(5’)フランキング領域
5’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号14に示す。ヌクレオチド1〜311の配列は植物DNAに相当し、ヌクレオチド312〜810の配列は外来性DNAに相当する。
3’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号15に示す。ヌクレオチド1〜507の配列は外来性DNAに相当し、ヌクレオチド569〜1880の配列は植物DNAに相当する。
種々異なる分子手法を用いて除草剤耐性遺伝子を含む優良イベントEE−GM2の外来性DNAがキメラpat遺伝子のコピー1つを含むことが決定されている(図4参照)。
−ヌクレオチド1からヌクレオチド391まで:配列番号11のnt3458からnt3848までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列;及び、
−ヌクレオチド392からヌクレオチド3436まで:配列番号11のnt413からnt3457までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列。
EE−GM2の本外来性DNAは、直近上流において外来性DNAと隣接して、配列番号14のヌクレオチド1から311までの5’フランキング配列において先行されており、そして、直近下流において外来性DNAと隣接して、配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までの3’フランキング配列において後続されている。
2.1. プライマー
優良イベント内部の配列を認識する特異的プライマーを開発した。
EE−GM3の3’フランキング領域内部の配列を認識するプライマーを開発した。次に第2のプライマーを、外来性DNAの配列内部において、プライマーが約263ヌクレオチドの配列に渡るように選択した。以下のプライマーがEE−GM3DNA上のPCR反応において特に明確で再現性のある結果をもたらすことがわかった。
SOY028: 5'-ATC.gCT.TTA.ACg.TCC.CTC.Ag -3 (配列番号 4)(標的:インサートDNA)
SOY029: 5' -CAA.ggC.CTC.gAg.ATT.ATC -3'(配列番号 5)(標的: 植物DNA)
内因性配列をターゲティングするプライマーは好ましくはPCRカクテルに包含される。これらのプライマーは未知試料において、そしてDNA陽性対照において、内部対照として使用される。内因性プライマー対を用いた場合の陽性結果(413bpのPCR増幅フラグメントの存在)は発生させるべきPCR産物のためのゲノムDNA調製において十分な品質のアンプルDNAがあることを示している。内因性プライマーは以下の内因性アクチンダイズ遺伝子を認識するように選択した。
SOY01 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT -3' (配列番号 9)
SOY02 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC -3' (配列番号 10)
PCR反応で予測される増幅されるフラグメントは以下の通りである。
プライマー対SOY01-SOY02の場合:413bp(内因性対照)
プライマー対SOY028-SOY029の場合:263bp(EE−GM3優良イベント)
鋳型DNAはEdwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991)に従ってリーフパンチ葉片から調製した。他の方法で調製したDNAを使用する場合、鋳型の種々異なる量を利用するテストランを実施しなければならない。通常はゲノム鋳型DNA50ngが最良の結果をもたらす。
誤った陽性又は陰性を回避するためには以下の陽性及び陰性対照がPCRランに包含されなければならない。
− マスターミックス対照(DNA陰性対照)。これは反応にDNAを加えないPCRである。予測される結果であるPCR産物無しが観察される場合、これはPCRカクテルに標的DNAが混在していなかったことを指す。
− DNA陽性対照(トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムDNA試料)。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にPCRがランされたことを示す。
− 野生型DNA対照。これは与えられた鋳型DNAが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムDNAであるPCRである。予測される結果であるトランスジェニックPCR産物の増幅無し、ただし内因性PCR産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムDNA試料中に検出可能な導入遺伝子のバックグラウンド増幅が無いことを示している。
最適な結果は以下の条件下に得られた(最適な結果のための種々の条件を記載する場合、そのような条件の例を与えることを意味する。当然ながら当業者は条件、試薬及びパラメーターを変更する場合があり、例えば他のTaqポリメラーゼを用いて所望の結果を達成しても良い)。
−25μl反応用PCRミックスは下記のものを含有する。
20ng鋳型DNA
2.5μLの10x増幅緩衝液(Taqポリメラーゼの製造元により供給)
0.5μLの10mMdNTP類
0.4μLのSOY01(10ピコモル/μL)
0.4μLのSOY02(10ピコモル/μL)
0.7μLのSOY028(10ピコモル/μL)
0.7μLのSOY029(10ピコモル/μL)
0.1μLのTaqDNAポリメラーゼ(5単位/μL)
25μL定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
95℃4分間
次いで: 95℃1分間
57℃1分間
72℃2分間
5サイクル
次いで: 92℃30秒
57℃30秒
72℃1分間
25サイクル
次いで: 72℃10分間
PCRの結果を最適に可視化するために、PCR試料10〜20μLを適切な分子量マーカー(例えば100bpラダーPharmacia)と共に1.5%アガロースゲル(Trisホウ酸塩緩衝液)上にアプライしなければならないとした。
単一のPCRラン及び単一のPCRカクテルの内部におけるトランスジェニック植物DNA試料から得られたデータは、1)DNA陽性対照が予測されたPCR産物(トランスジェニック及び内因性のフラグメント)を示し、2)DNA陰性対照がPCR増幅に関して陰性(フラグメント無し)であり、そして3)野生型DNA対照が予測された結果(内因性フラグメント増幅)を示すことが成立しない限り許容してはならないとした。
上記したEE−GM3に関するPCR識別プロトコルに従った場合、予測されるサイズのトランスジェニック及び内因性PCR産物の目視可能な量を示すレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物がEE−GM3優良イベントを受け継いでいることを示している。トランスジェニックPCR産物の何れかの目視可能な量を示さず、そして内因性PCR産物の目視可能な量を示しているレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物が優良イベントを含まないことを示している。内因性およびトランスジェニックのPCR産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムDNAの質及び/又は量がPCR産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムDNA調製は繰り返されなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなPCRランを実施しなければならない。
未知物のスクリーニングを試みる前に、全ての適切な対照を用いたテストランを実施する。開発されたプロトコルは実験室間で異なる要素のために最適化も必要とするかもしれない(鋳型DNA調製、TaqDNAポリメラーゼ、プライマーの品質、dNTP類、サーモサイクラー等)。
内因性配列の増幅はプロトコルにおける重要な役割を果たす。1つは既知トランスジェニックゲノムDNA鋳型における内因性及びトランスジェニックの配列の両方の等モル量を増幅するPCR及び熱サイクリングの条件を得ることである。ターゲティングされる内因性フラグメントが増幅されない場合、又は、ターゲティングされる配列がアガロースゲル電気泳動で判断した場合に同じ臭化エチジウム染色強度で増幅されない場合は、PCR条件の最適化が必要な場合がある。
一部がEE−GM3を含む多くのダイズ植物に由来する葉材料を上記したプロトコルに従って試験した。優良イベントEE−GM3由来及びダイズ野生型由来の試料をそれぞれ陽性及び陰性対照として採取した。
図2は多くのダイズ植物試料上のEE−GM3に関して、優良イベントPCR識別プロトコルを用いて得られた結果を示す。レーン2及び3の試料は263bpのバンドが検出されていることから優良イベントEE−GM3を含有することがわかり、レーン4〜8の試料はEE−GM3を含んでいない。レーン6及び7は同じ除草剤耐性キメラ遺伝子を用いて得られた他のダイズ形質転換イベントに由来する試料を含み;レーン8は野生型ダイズ植物由来のDNAを含有し、そしてレーン9は陰性対照(水)試料を示し、レーン1及び10は分子量マーカー(100bpラダー)を示す。
判別PCR(dPCR)アッセイをバルク化種子中のEE−GM3の低レベルの存在を検出するためにセットアップする。非トランスジェニック種子のバルク中のトランスジェニック種子の0.4%(w/w)の最低レベルが反復可能な条件下に良好に検出できた。従って検出限界を0.4%(w/w)と決定した。
以下のプライマーをこの標的PCR反応に適用する。
T−DNA配列にターゲティングされたフォワードプライマー:
SHA130 5'- CTA.TAT.TCT.ggT.TCC.AAT.TTA.TC -3' (配列番号l2)
3’フランキング配列にターゲティングされたリバースプライマー:
SMP178 5'- TgA.ggC.ACg.TAT.TgA.TgA.CC- 3'(配列番号13)
これらのプライマーからPCR反応において予測される増幅されたフラグメントは115bpである。
変更したGentra PuregeneDNA精製抽出キット(Qiagen)に従って粉砕バルク化種子から調製した鋳型DNA約200ngに対して標的PCR反応を実施した。他の方法で調製したDNAを使用する場合、EE−GM3の既知相対レベルを有する試料を用いたテストランを実施しなければならない。
内因性配列にターゲティングした検証されたレファレンス系のPCR反応は、理想的には、誤った陰性結果を回避するためにPCR分析に対するDNA試料の適性を検証するために、別個のPCRランにおいて実施しなければならない。
未知試験試料に関しては、PCR実験は理想的には適切な陽性及び陰性対照試料、即ち如何に記載するものを包含しなければならない。
− マスターミックス対照(DNA陰性対照)。これは反応にDNAを加えないPCRである。標的及びレファレンス系の反応の両方に関して予測される結果(PCR産物無し)が観察される場合、これはPCRカクテルに標的DNAが混在していなかったことを指す。
− DNA陽性対照(トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムDNA試料)。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にPCRがランされたことを示す。
− 類似に野生型DNA対照をこのPCRに加えることができる。これは与えられた鋳型DNAが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムDNAであるPCRである。予測される結果であるトランスジェニックPCR産物の増幅無し、ただし内因性PCR産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムDNA試料中に検出可能な導入遺伝子のバックグラウンド増幅が無いことを示している。
最適な結果は以下の条件下に得られる。
−25μl反応用PCRミックスは下記のものを含有する。
200ngの鋳型DNA
5μLの5x反応緩衝液
0.25μLの20mMdNTP類
0.7μLのSHA130(10ピコモル/L)
0.4μLのSMP178(10ピコモル/L)
0.1μLのGO−TaqDNAポリメラーゼ(5単位/L)
25μL定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
95℃4分間
次いで: 95℃1分間
57℃1分間
72℃2分間
5サイクル
次いで: 92℃30秒
57℃30秒
72℃1分間
30サイクル
次いで: 72℃10分間
PCRの結果を最適に可視化するために、PCR産物25μLを適切な分子量マーカー(例えば50bpラダー)と共に1.5%アガロースゲル(Trisホウ酸塩緩衝液)上にアプライしなければならないとした。
上記したPCR法に従う場合、予測されるサイズの標的及びレファレンス系のPCR産物の目視可能な量を示すレーンはゲノム鋳型DNAの調製元の被験試料が標的反応の検出限界より高いEE−GM3優良イベントのレベルを含有していたことを示す。
標的PCR産物の目視可能な量を示さないが、レファレンス系PCR産物の目視可能な量を示すレーンはゲノム鋳型DNAの調製元の被験試料が標的反応の検出限界より低いEE−GM3のレベル優良イベントを含有していたことを示す。
内因性及びトランスジェニックのPCR産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムDNAの質及び/又は量がPCR産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムDNA調製は繰り返されなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなPCRランを実施しなければならない。
EE−GM3の特異的組み込みフラグメントは、配列番号8のヌクレオチド配列を有するアンプリコンをもたらす特異的プライマーSOY028(配列番号4)及びSOY029(配列番号5)を用いたPCR増幅によるか、又は、化学合成により得られ、そして標識される。この組み込みフラグメントを、生物学的試料中のEE−GM3の検出のための特異的プローブとして使用する。核酸は標準的操作法に従って試料から抽出される。次にこの核酸をハイブリッドの形成を可能にするように最適化されたハイブリダイゼーション条件下に特異的プローブと接触させる。次にハイブリッドの形成が検出され、試料中のEE−GM3核酸の存在を示す。場合により、試料中の核酸は、特異的プローブとの接触よりも前に特異的プライマーを用いて増幅される。或いは、組み込みフラグメントの代わりに特異的プローブと接触させる前に核酸を標識する。場合により試料との接触の前に特異的プローブを固体担体(例えば限定しないがフィルター、ストリップ又はビーズ)に結合させる。
4.1.プライマー
優良イベント内部の配列を認識する特異的プライマーを開発した。より特記すれば、EE−GM1の5’フランキング領域内部の配列を認識するプライマーを開発した。次に第2のプライマーを、外来性DNAの配列の内部で、プライマーが約183ヌクレオチドの配列に渡るように選択した。以下のプライマーがEE−GM1DNA上のPCR反応において特に明確で再現性のある結果をもたらすことがわかった。
SOY06 5'-ggC.gTT.CgT.AgT.gAC.TgA.gg-3'(配列番号16)
(標的:植物DNA)
SOY07 5'-gTT.TTA.CAA.CgT.CgT.gAC.Tgg-3'(配列番号17)
(標的:インサートDNA)
内因性配列をターゲティングするプライマーは好ましくはPCRカクテルに包含される。これらのプライマーは未知試料において、そしてDNA陽性対照において、内部対照として使用される。内因性プライマー対を用いた場合の陽性結果は発生させるべきPCR産物のためのゲノムDNA調製において十分な品質のアンプルDNAがあることを示している。内因性プライマーはGlycine maxにおけるハウスキーピング遺伝子を認識するように選択した。
SOY01 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT -3' (配列番号 9)
(Glycine maxアクチン1遺伝子に所在(アクセッションJ01298))
SOY02 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC -3' (配列番号 10)
(Glycine maxアクチン1遺伝子に所在(アクセッションJ01298))
PCR反応で予測される増幅されるフラグメントは以下の通りである。
プライマー対SOY01-SOY02の場合:413bp(内因性対照)
プライマー対SOY06-SOY07の場合:183bp(EE−GM1優良イベント)
鋳型DNAはEdwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991)に従ってリーフパンチ葉片から調製した。他の方法で調製したDNAを使用する場合、鋳型の種々異なる量を利用するテストランを実施しなければならない。通常はゲノム鋳型DNA50ngが最良の結果をもたらす。
誤った陽性又は陰性を回避するためには以下の陽性及び陰性対照がPCRランに包含されなければならない。
− マスターミックス対照(DNA陰性対照)。これは反応にDNAを加えないPCRである。予測される結果であるPCR産物無しが観察される場合、これはPCRカクテルに標的DNAが混在していなかったことを指す。
− DNA陽性対照(トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムDNA試料)。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にPCRがランされたことを示す。
− 野生型DNA対照。これは与えられた鋳型DNAが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムDNAであるPCRである。予測される結果であるトランスジェニックPCR産物の増幅無し、ただし内因性PCR産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムDNA試料中に検出可能な導入遺伝子のバックグラウンド増幅が無いことを示している。
最適な結果は以下の条件下に得られた。
−25μl反応用PCRミックスは下記のものを含有する。
2.5μL鋳型DNA
2.5μLの10x増幅緩衝液(Taqポリメラーゼと共に供給)
0.5μLの10mMdNTP類
0.5μLのSOY06(10ピコモル/μL)
0.5μLのSOY07(10ピコモル/μL)
0.25μLのSOY01(10ピコモル/μL)
0.25μLのSOY02(10ピコモル/μL)
0.1μLのTaqDNAポリメラーゼ(5単位/μL)
25μL定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
95℃4分間
次いで: 95℃1分間
57℃1分間
72℃2分間
5サイクル
次いで: 92℃30秒
57℃30秒
72℃1分間
25サイクル
次いで: 72℃5分間
PCRの結果を最適に可視化するために、PCR試料10〜20μLを適切な分子量マーカー(例えば100bpラダーPharmacia)と共に1.5%アガロースゲル(Trisホウ酸塩緩衝液)上にアプライしなければならないとした。
単一のPCRラン及び単一のPCRカクテルの内部におけるトランスジェニック植物DNA試料から得られたデータは、1)DNA陽性対照が予測されたPCR産物(トランスジェニック及び内因性のフラグメント)を示し、2)DNA陰性対照がPCR増幅に関して陰性(フラグメント無し)であり、そして3)野生型DNA対照が予測された結果(内因性フラグメント増幅)を示すことが成立しない限り許容してはならないとした。
上記したEE−GM1に関するPCR識別プロトコルに従った場合、予測されるサイズのトランスジェニック及び内因性PCR産物の目視可能な量を示すレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物がEE−GM1優良イベントを受け継いでいることを示している。トランスジェニックPCR産物の何れかの目視可能な量を示さず、そして内因性PCR産物の目視可能な量を示しているレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物が優良イベントを含まないことを示している。内因性およびトランスジェニックのPCR産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムDNAの質及び/又は量がPCR産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムDNA調製は反復しなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなPCRランを実施しなければならない。
未知物のスクリーニングを試みる前に、全ての適切な対照を用いたテストランを実施する。開発されたプロトコルは実験室間で異なる要素のために最適化を必要とするかもしれない(鋳型DNA調製、TaqDNAポリメラーゼ、プライマーの品質、dNTP類、サーモサイクラー等)。
内因性配列の増幅はプロトコルにおける重要な役割を果たす。1つは既知トランスジェニックゲノムDNA鋳型における内因性及びトランスジェニックの配列の両方の等モル量を増幅するPCR及び熱サイクリングの条件を得ることである。ターゲティングされる内因性フラグメントが増幅されない場合、又は、ターゲティングされる配列がアガロースゲル電気泳動で判断した場合に同じ臭化エチジウム染色強度で増幅されない場合は、PCR条件の最適化が必要な場合がある。
一部がEE−GM1を含む多くの植物に由来するGlycine max葉材料を上記したプロトコルに従って試験した。優良イベントEE−GM1由来及びGlycine max野生型由来の試料をそれぞれ陽性及び陰性対照として採取した。
図5は多くのダイズ植物試料上のEE−GM1に関して、優良イベントPCR識別プロトコルを用いて得られた結果を示す(レーン1〜14)。レーン1の試料は185bpのバンドが検出されていることから優良イベントを含有することがわかり、レーン2、3及び4の試料はEE−GM1を含んでいない。レーン2は別のダイズ優良イベントを含み、レーン3は非トランスジェニックのGlycine max対照をあらわし;レーン4は陰性対照(水)試料を示し、そしてレーン5は分子量マーカー(100bp)を示す。
EE−GM1の特異的組み込みフラグメントは、特異的プライマーSOY06(配列番号16)及びSOY07(配列番号17)を用いたPCR増幅によるか、又は、化学合成により得られ、そして標識される。この組み込みフラグメントを、生物学的試料中のEE−GM1の検出のための特異的プローブとして使用する。核酸は標準的操作法に従って試料から抽出される。次にこの核酸をハイブリッドの形成を可能にするように最適化されたハイブリダイゼーション条件下に特異的プローブと接触させる。次にハイブリッドの形成が検出され、試料中のEE−GM1核酸の存在を示す。場合により、試料中の核酸は、特異的プローブとの接触よりも前に特異的プライマーを用いて増幅される。或いは、組み込みフラグメントの代わりに特異的プローブと接触させる前に核酸を標識する。場合により試料との接触の前に特異的プローブを固体担体(例えば限定しないがフィルター、ストリップ又はビーズ)に結合させる。
6.1.プライマー
優良イベント内部の配列を認識する特異的プライマーを開発した。より特記すれば、EE−GM2の3’フランキング領域内部の配列を認識するプライマーを開発した。次に第2のプライマーを、外来性DNAの配列の内部で、プライマーが約150ヌクレオチドの配列に渡るように選択した。以下のプライマーがEE−GM2DNA上のPCR反応において特に明確で再現性のある結果をもたらすことがわかった。
SOY09 5'-TgT.ggT.TAT.ggC.ggT.gCC.ATC-3'(配列番号18)
(標的:植物DNA)
SOY010 5'-TgC.TAC.Agg.CAT.CgT.ggT.gTC-3'(配列番号19)
(標的:インサートDNA)
内因性配列をターゲティングするプライマーは好ましくはPCRカクテルに包含される。これらのプライマーは未知試料において、そしてDNA陽性対照において、内部対照として使用される。内因性プライマー対を用いた場合の陽性結果は発生させるべきPCR産物のためのゲノムDNA調製において十分な品質のアンプルDNAがあることを示している。内因性プライマーはGlycine maxにおけるハウスキーピング遺伝子を認識するように選択した。
SOY01 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT -3' (配列番号 9)
(Glycine maxアクチン1遺伝子に所在(アクセッションJ01298))
SOY02 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC -3' (配列番号 10)
(Glycine maxアクチン1遺伝子に所在(アクセッションJ01298))
PCR反応で予測される増幅されるフラグメントは以下の通りである。
プライマー対SOY01-SOY02の場合:413bp(内因性対照)
プライマー対SOY09-SOY010の場合:151bp(EE−GM2優良イベント)
鋳型DNAはEdwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991)に従ってリーフパンチ葉片から調製した。他の方法で調製したDNAを使用する場合、鋳型の種々異なる量を利用するテストランを実施しなければならない。通常はゲノム鋳型DNA50ngが最良の結果をもたらす。
誤った陽性又は陰性を回避するためには以下の陽性及び陰性対照がPCRランに包含されなければならない。
− マスターミックス対照(DNA陰性対照)。これは反応にDNAを加えないPCRである。予測される結果であるPCR産物無しが観察される場合、これはPCRカクテルに標的DNAが混在していなかったことを指す。
− DNA陽性対照(トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムDNA試料)。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にPCRがランされたことを示す。
− 野生型DNA対照。これは与えられた鋳型DNAが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムDNAであるPCRである。予測される結果であるトランスジェニックPCR産物の増幅無し、ただし内因性PCR産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムDNA試料中に検出可能な導入遺伝子のバックグラウンド増幅が無いことを示している。
最適な結果は以下の条件下に得られた。
−25μl反応用PCRミックスは下記のものを含有する。
2.5μL鋳型DNA
2.5μLの10x増幅緩衝液(Taqポリメラーゼと共に供給)
0.5μLの10mMdNTP類
0.5μLのSOY09(10ピコモル/μL)
0.5μLのSOY010(10ピコモル/μL)
0.25μLのSOY01(10ピコモル/μL)
0.25μLのSOY02(10ピコモル/μL)
0.1μLのTaqDNAポリメラーゼ(5単位/μL)
25μL定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
95℃4分間
次いで: 95℃1分間
57℃1分間
72℃2分間
5サイクル
次いで: 92℃30秒
57℃30秒
72℃1分間
25サイクル
次いで: 72℃5分間
PCRの結果を最適に可視化するために、PCR試料10〜20μLを適切な分子量マーカー(例えば100bpラダーPharmacia)と共に1.5%アガロースゲル(Trisホウ酸塩緩衝液)上にアプライしなければならないとした。
単一のPCRラン及び単一のPCRカクテルの内部におけるトランスジェニック植物DNA試料から得られたデータは、1)DNA陽性対照が予測されたPCR産物(トランスジェニック及び内因性のフラグメント)を示し、2)DNA陰性対照がPCR増幅に関して陰性(フラグメント無し)であり、そして3)野生型DNA対照が予測された結果(内因性フラグメント増幅)を示すことが成立しない限り許容してはならないとした。
上記したEE−GM2に関するPCR識別プロトコルに従った場合、予測されるサイズのトランスジェニック及び内因性PCR産物の目視可能な量を示すレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物がEE−GM2優良イベントを受け継いでいることを示している。トランスジェニックPCR産物の何れかの目視可能な量を示さず、そして内因性PCR産物の目視可能な量を示しているレーンは、ゲノム鋳型DNAの調製元の相当する植物が優良イベントを含まないことを示している。内因性およびトランスジェニックのPCR産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムDNAの質及び/又は量がPCR産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムDNA調製は繰り返されなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなPCRランを実施しなければならない。
未知物のスクリーニングを試みる前に、全ての適切な対照を用いたテストランを実施する。開発されたプロトコルは実験室間で異なる要素のために最適化を必要とするかもしれない(鋳型DNA調製、TaqDNAポリメラーゼ、プライマーの品質、dNTP類、サーモサイクラー等)。
内因性配列の増幅はプロトコルにおける重要な役割を果たす。1つは既知トランスジェニックゲノムDNA鋳型における内因性及びトランスジェニックの配列の両方の等モル量を増幅するPCR及び熱サイクリングの条件を得ることである。ターゲティングされる内因性フラグメントが増幅されない場合、又は、ターゲティングされる配列がアガロースゲル電気泳動で判断した場合に同じ臭化エチジウム染色強度で増幅されない場合は、PCR条件の最適化が必要な場合がある。
一部がEE−GM2を含む多くの植物に由来するGlycine max葉材料を上記したプロトコルに従って試験した。優良イベントEE−GM2由来及びGlycine max野生型由来の試料をそれぞれ陽性及び陰性対照として採取した。
図6は多くのダイズ植物試料上のEE−GM2に関して、優良イベントPCR識別プロトコルを用いて得られた結果を示す(レーン1〜14)。レーン1の試料は185bpのバンドが検出されていることから優良イベントを含有することがわかり、レーン2、3及び4の試料はEE−GM2を含んでいない。レーン2は別のダイズ優良イベントを含み、レーン3は非トランスジェニックのGlycine max対照をあらわし;レーン4は陰性対照(水)試料を示し、そしてレーン5は分子量マーカー(100bp)を示す。
EE−GM2の特異的組み込みフラグメントは、特異的プライマーSOY09(配列番号18)及びSOY10(配列番号19)を用いたPCR増幅によるか、又は、化学合成により得られ、そして標識される。この組み込みフラグメントを、生物学的試料中のEE−GM2の検出のための特異的プローブとして使用する。核酸は標準的操作法に従って試料から抽出される。次にこの核酸をハイブリッドの形成を可能にするように最適化されたハイブリダイゼーション条件下に特異的プローブと接触させる。次にハイブリッドの形成が検出され、試料中のEE−GM2核酸の存在を示す。場合により、試料中の核酸は、特異的プローブとの接触よりも前に特異的プライマーを用いて増幅される。或いは、組み込みフラグメントの代わりに特異的プローブと接触させる前に核酸を標識する。場合により試料との接触の前に特異的プローブを固体担体(例えば限定しないがフィルター、ストリップ又はビーズ)に結合させる。
優良イベントEE−GM3及びEE−GM1の組み合わせを含有するダイズ植物は、EE−GM3を含む親ダイズ植物とEE−GM1を含む親ダイズ植物の間の従来の交雑により得られている。両方のイベントを含む子孫植物は、本明細書に記載するとおり、EE−GM1及びEE−GM3に関するPCR識別プロトコルを用いながら識別される。具体的には、EE−GM3及び幾つかのEE−GM1系統を含有する植物を用いて交雑を行った。得られたF1植物を生育させ、グリホセート及びグルホシネートを噴霧した。F2種子をF1植物から収穫し、そして植栽した(F2植物には噴霧しなかった)。F2単独植物を引き抜いた。F2:F3植物の列を生育させ、そしてグリホセート及びグルホシネートを噴霧した。EE−GM3及びEE−GM1の両方に関してホモ接合である列を識別し、そして後に収穫した。本試行から得られた分離データは予測されたメンデルのイベント分離を呈していた。
優良イベントEE−GM3及び優良イベントEE−GM1又はEE−GM2は反復逆交雑により、商業的なダイズ栽培品種、例えば限定しないがダイズ栽培品種(Soybean Cultivar)7631014 (US2009252860); ダイズ栽培品種 7431014 (US2009252859); ダイズ栽培品種7925084 (US2009252858); ダイズ栽培品種 7311153 (US2009252857); ダイズ栽培品種 S070159 (US2009252856); ダイズ栽培品種 7535357 (US2009246353); ダイズ栽培品種 S070160 (US2009246352); ダイズ栽培品種 26074414 (US2009249508); ダイズ栽培品種 7509171 (US2009249507); ダイズ栽培品種 S070158 (US2009246351); ダイズ栽培品種 7511119 (US2009249506); ダイズ栽培品種 7113111 (US2009238945); ダイズ栽培品種S06-02RM018047 (US7592518); ダイズ栽培品種 7013345 (US2009232957); ダイズ栽培品種 7041461 (US2009235376); ダイズ栽培品種 7549450 (US2009232956); ダイズ栽培品種7317090 (US2009232955); ダイズ栽培品種 2N2V58015 (US2009226597); ダイズ栽培品種 7243182 (US2009226596); ダイズ栽培品種 7143182 (US2009226595); ダイズ栽培品種7043182 (US2009220673); ダイズ栽培品種 S070157 (US2009222950); ダイズ栽培品種 306924721 (US2009220672); ダイズ栽培品種 7614385 (US2009220671); ダイズ栽培品種 7925118 (US2009214750); ダイズ栽培品種 7821295 (US2009214749); ダイズ栽培品種 7811336 (US2009214748); ダイズ栽培品種 S070150 (US2009214747); ダイズ栽培品種 6214260 (US2009214746); ダイズ栽培品種 S070152 (US2009214745); ダイズ栽培品種7429331 (US2009214751); ダイズ栽培品種 26034631 (US2009208634); ダイズ栽培品種 S07-03JR108674 (US7560621); ダイズ栽培品種 S07-03KL016279 (US7560620); ダイズ栽培品種S06-CL959411 (US7554017); ダイズ栽培品種 SG3870NRR (US2009158453); ダイズ栽培品種 HFPR-G (CA2645702); ダイズ栽培品種 S06-02JR423016 (US7521606); ダイズ栽培品種 S06-01JR119814 (US7518039); ダイズ栽培品種 S06-01JR119448 (US7518038); ダイズ栽培品種 6540220 (US2009055960); ダイズ栽培品種 S060292 (US2009055959); ダイズ栽培品種 S050228 (US2009055958); ダイズ栽培品種 S06-02JR423003 (US7491873); ダイズ栽培品種S06-02JR423005 (US7491872); ダイズ栽培品種 S06-02JR409114 (US7485782); ダイズ栽培品種 S06-SJ144056 (US7473823);
ダイズ栽培品種(US7470835); ダイズ栽培品種 6910450 (US2008282369); ダイズ栽培品種 6223012 (US7446246); ダイズ栽培品種 6549250 (US7446245); ダイズ栽培品種 17731225 (US2008271204); ダイズ栽培品種 6928285 (US2008271203); ダイズ栽培品種6736054 (US2008271169); ダイズ栽培品種 S060299 (US2008271199); ダイズ栽培品種 S060294 (US2008271202); ダイズ栽培品種 6943322 (US2008271201); ダイズ栽培品種 5343260 (US2008263719); ダイズ栽培品種 6439359 (US2008263704); ダイズ栽培品種 6238359 (US2008263703); ダイズ栽培品種 6547272 (US2008263702); ダイズ栽培品種 6929431 (US2008263701); ダイズ栽培品種 6703392 (US2008263700); ダイズ栽培品種6044483 (US2008263699); ダイズ栽培品種 S050224 (US2008263698); ダイズ栽培品種 6719022 (US2008263697); ダイズ栽培品種 5826056 (US2008263696); ダイズ栽培品種 6265047 (US2008263724); ダイズ栽培品種 6928331 (US2008263695); ダイズ栽培品種 6719331 (US2008263694); ダイズ栽培品種 6636454 (US2008263693); ダイズ栽培品種 6226454 (US2008263718); ダイズ栽培品種 Q0073801 (US2008256657); ダイズ栽培品種6326393 (US2008256652); ダイズ栽培品種 6408448 (US2008256651); ダイズ栽培品種 6449315 (US2008250524); ダイズ栽培品種 S060296 (US2008250523); ダイズ栽培品種 6012078 (US2008250522); ダイズ栽培品種 6342078 (US2008250521); ダイズ栽培品種 6419156 (US2008250520); ダイズ栽培品種 5723264 (US2008250519); ダイズ栽培品種 S050225 (US2008250518); ダイズ栽培品種 S060298 (US2008244783); ダイズ栽培品種6935331 (US2008244782); ダイズ栽培品種 6819456 (US2008244787); ダイズ栽培品種 S060297 (US2008244781); ダイズ栽培品種 6135319 (US2008244786); ダイズ栽培品種 6819331 (US2008244780); ダイズ栽培品種 6137445 (US2008244779); ダイズ栽培品種 6917445 (US2008244778); ダイズ栽培品種 6111333 (US2008244777); ダイズ栽培品種 S050229 (US2008244776); ダイズ栽培品種 6114011 (US2008244775); ダイズ栽培品種 6900358 (US2008244784); ダイズ栽培品種 6345184 (US2008244774); ダイズ栽培品種 6836085 (US2008244773); ダイズ栽培品種 6635047 (US2008244772); ダイズ栽培品種 6139105 (US2008244771); ダイズ栽培品種 6434385 (US2008244770); ダイズ栽培品種 S060295 (US2008244769); ダイズ栽培品種 6035184 (US2008244768); ダイズ栽培品種 S060293 (US2008209590); ダイズ栽培品種 6733322 (US2008209594); ダイズ栽培品種 6421326 (US2008209593); ダイズ栽培品種 S060077 (US2008209589); ダイズ栽培品種 6600375 (US2008209592); ダイズ栽培品種 S06-CL821457 (US7420104); ダイズ栽培品種 S07-02KG294306 (US7414178); ダイズ栽培品種S06-BA046119 (US7414175); ダイズ栽培品種 S07-02KG294307 (US7411114); ダイズ栽培品種 SG3865N (US2008189802); ダイズ栽培品種 6701475 (US7408097); ダイズ栽培品種 1335025 (US2008178316); ダイズ栽培品種 1686017 (US2008178315); ダイズ栽培品種 2388028 (US2008178314); ダイズ栽培品種 2387029 (US2008178313); ダイズ栽培品種 S06-WW152330 (US7388129); ダイズ栽培品種 6424090 (US7385118); ダイズ栽培品種 6723322 (US7385115); ダイズ栽培品種 SG4377NRR (US7385114); ダイズ栽培品種 S06-02JR111334 (US7381864); ダイズ栽培品種 6141287 (US7378577);
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ATCC(American Type Culture Collection, 10801 University Blvd.,Manassas, Va.20110-2209,USA)に111606ダイズとして寄託されている。
ATCC(American Type Culture Collection, 10801 University Blvd.,Manassas, Va.20110-2209,USA)に05SHX2XEBダイズとして寄託されている。
Claims (38)
- 第1の核酸分子が配列番号2のヌクレオチド1431からヌクレオチド1462までのヌクレオチド配列またはその相補体を含み、第2の核酸分子が配列番号14のヌクレオチド301からヌクレオチド322までのヌクレオチド配列またはその相補体を含む、核酸分子の対。
- 第1の核酸分子が配列番号3のヌクレオチド220からヌクレオチド261までのヌクレオチド配列またはその相補体を含み、第2の核酸分子が配列番号15のヌクレオチド497からヌクレオチド518までのヌクレオチド配列またはその相補体を含む、核酸分子の対。
- 第1の核酸分子が配列番号2のヌクレオチド配列またはその相補体を含み、第2の核酸分子が配列番号14のヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項1に記載の核酸分子の対。
- 第1の核酸分子が配列番号3のヌクレオチド配列またはその相補体を含み、第2の核酸分子が配列番号15のヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項2に記載の核酸分子の対。
- 第1の核酸分子が、配列番号20のヌクレオチド配列または配列番号20と少なくとも99%配列同一性を有する核酸配列を含み、該第1の核酸分子はHPPD阻害剤除草剤および/またはグリホセートに対する耐性をもたらす、ならびに
第2の核酸分子が、以下のヌクレオチド配列:
a)配列番号14のヌクレオチド1から311までのヌクレオチド配列、
b)配列番号11のヌクレオチド3458からヌクレオチド3848までのヌクレオチド配列、
c)配列番号11のヌクレオチド413からヌクレオチド3457までのヌクレオチド配列、および
d)配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までのヌクレオチド配列
を順次含むか、または前記配列a)〜d)と少なくとも99%配列同一性を有する核酸配列を含み、グルホシネートに対する耐性をもたらす、
核酸分子の対。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸分子の対を含む、ダイズゲノムDNAであって、
ここで第1の核酸分子はEE−GM3遺伝子座にあり、第2の核酸分子はEE−GM2遺伝子座にあり、
前記EE−GM3遺伝子座は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
前記EE−GM2遺伝子座は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
前記ダイズゲノムDNA。 - ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫であって、それぞれがHPPD阻害剤除草剤及び/又はグルホシネート及び/又はグリホセートに対して耐性であり、それぞれが以下のヌクレオチド配列:
・EE−GM3遺伝子座において配列番号2のヌクレオチド1431からヌクレオチド1462までのヌクレオチド配列を、
・EE−GM3遺伝子座において配列番号3のヌクレオチド220から261までのヌクレオチド配列を、
・EE−GM2遺伝子座において配列番号14のヌクレオチド301からヌクレオチド322のヌクレオチド配列を、および
・EE−GM2遺伝子座において配列番号15のヌクレオチド497から518のヌクレオチド配列を
そのゲノム中に含み、
前記EE−GM3遺伝子座は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
前記EE−GM2遺伝子座は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
前記ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫。 - 配列番号2、3、14および15の配列を含む、請求項7記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫。
- 請求項7記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫であって、
配列番号20のヌクレオチド配列、ならびに
順次以下のヌクレオチド配列:
a)配列番号14のヌクレオチド1から311までのヌクレオチド配列、
b)配列番号11のヌクレオチド3458からヌクレオチド3848までのヌクレオチド配列、
c)配列番号11のヌクレオチド413からヌクレオチド3457までのヌクレオチド配列、および
d)配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までのヌクレオチド配列
を含む、前記ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫。 - ダイズ植物、細胞、部分、又は種子であって、それぞれがHPPD阻害剤除草剤及び/又はグルホシネート及び/又はグリホセートに対して耐性であり、そしてそれぞれが優良イベントEE−GM3及び優良イベントEE−GM2をそのゲノム中に含み、
ここで前記優良イベントEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
前記優良イベントEE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
前記ダイズ植物、細胞、部分、又は種子。 - 請求項10記載のダイズ植物、細胞、部分、又は種子の子孫植物、細胞、部分、又は種子であって、
それぞれがHPPD阻害剤除草剤及び/又はグルホシネート及び/又はグリホセートに対して耐性であり、
配列番号2のヌクレオチド1431からヌクレオチド1462までのヌクレオチド配列、配列番号3のヌクレオチド220から261までのヌクレオチド配列、配列番号14のヌクレオチド301からヌクレオチド322のヌクレオチド配列、および配列番号15のヌクレオチド497から518のヌクレオチド配列を含む、
前記子孫植物、細胞、部分、又は種子。 - 請求項10記載のダイズ植物、細胞、部分、又は種子であって、
そのゲノムDNAが、それぞれ配列番号4及び配列番号5のヌクレオチド配列を含む2つのプライマーによるPCRを使用して分析した場合に、263bpのDNAフラグメントを与え、かつ
そのゲノムDNAが、それぞれ配列番号18及び配列番号19のヌクレオチド配列を含む2つのプライマーによるPCRを使用して分析した場合に、151bpのDNAフラグメントを与える、前記ダイズ植物、細胞、部分、又は種子。 - 請求項7〜12のいずれか一項に記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫から製造される、ダイズ製品。
- ダイズ穀粉、粉砕種子、ダイズ粉末、若しくはダイズフレークであるか、又はそれを含む、請求項13記載のダイズ製品。
- イベントEE−GM3に対して特異的であるアンプリコンを生成する核酸及びイベントEE−GM2に対して特異的であるアンプリコンを生成する核酸を含む、請求項13又は14記載のダイズ製品。
- 請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫を得ること、及びそれからダイズ製品を製造することを含む、ダイズ製品を製造する方法。
- 前記ダイズ製品が、ダイズ穀粉、粉砕種子、ダイズ粉末、若しくはダイズフレークであるか、又はそれを含む、請求項16記載の方法。
- 前記ダイズ製品が、イベントEE−GM3に対して特異的であるアンプリコンを生成する核酸及びイベントEE−GM2に対して特異的であるアンプリコンを生成する核酸を含む、請求項16又は17記載の方法。
- 請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ植物又は種子を植栽又は播種した圃場において雑草を抑制する方法であって、
該圃場を、有効量のHPPD阻害剤除草剤系及び/又はグルホシネート系及び/又はグリホセート系の除草剤で処理することを含み、
前記植物又は種子は、前記HPPD阻害剤除草剤系、グルホシネート系及びグリホセート系の除草剤に耐性である、
前記方法。 - 発芽成長中の請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ植物を雑草による競合から保護する方法であって、前記ダイズ植物を植栽すべき圃場を、前記ダイズ植物を植栽するか又は種子を播く前に、HPPD阻害剤除草剤で処理し、続いて、予備処理された前記圃場に前記ダイズ植物を植栽するか又は種子を播くことを含む、前記方法。
- 雑草を抑制する方法であって、
請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ種子を播種した圃場を、ダイズ植物が出芽する前であるが種子を播種した後に、有効量のHPPD阻害剤除草剤で処理することを含み、
前記種子及び前記植物は、前記HPPD阻害剤除草剤に耐性である、
前記方法。 - 請求項7〜12のいずれか一項記載のダイズ植物又は種子を植栽又は播種すべき圃場において雑草を抑制する方法であって、
前記植物又は種子を植栽又は播種すべき圃場を、有効量のHPPD阻害剤除草剤及び/又はグリホセート及び/又はグルホシネートで処理し、続いて、前記圃場に前記植物又は種子を植栽又は播種することを含み、
前記植物又は種子は、前記HPPD阻害剤除草剤及びグリホセート及びグルホシネートに耐性である、
前記方法。 - 前記HPPD阻害剤除草剤がイソキサフルトールであり、ここで前記処理の後、グリホセート及び/又はグルホシネートあるいはHPPD阻害剤とグリホセート及び/又はグルホシネートとの混合物を植物の上面から出芽後除草剤として適用する、請求項20又は22記載の方法。
- グルホシネート、HPPD阻害剤除草剤およびグリホセートに耐性であるダイズ植物を製造する方法であって、
(i)優良イベントEE−GM3を含むダイズ植物を優良イベントEE−GM2を含むダイズ植物と交雑させることにより、グルホシネートに対して耐性である植物に、HPPD阻害剤除草剤およびグリホセートに対する耐性を導入すること、
ここで優良イベントEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
優良イベントEE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、および
優良イベントEE−GM3およびEE−GM2を含む子孫を選択すること、または
(ii)HPPD阻害剤除草剤、グリホセートおよびグルホシネートに対する耐性を欠く異なる遺伝的背景を有するダイズ植物に、優良イベントEE−GM3およびEE−GM2を含むダイズ植物を交雑させることにより、HPPD阻害剤除草剤、グリホセートおよびグルホシネートに対する耐性を導入すること、
ここで優良イベントEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
優良イベントEE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、および
優良イベントEE−GM3およびEE−GM2を含む子孫を選択すること
を含む、前記方法。 - 生物学的試料中の優良イベントEE−GM3及びEE−GM2の同時存在又は非存在を検出する方法であって、
前記方法は、少なくとも2つの特異的プライマーを用いたEE−GM3特異的領域の検出、ここで該少なくとも2つの特異的プライマーの一方は、EE−GM3中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’又は3’フランキング領域内の配列を特異的に認識し、他方のプライマーは、EE−GM3の前記5’又は3’フランキング領域に隣接する外来性DNA内の配列を特異的に認識する、及び
2つの特異的プライマーを用いたEE−GM2特異的領域の検出、ここで該2つの特異的プライマーの一方は、EE−GM2中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’又は3’フランキング領域内の配列を特異的に認識し、他方のプライマーは、EE−GM2の前記5’又は3’フランキング領域に隣接する外来性DNA内の配列を特異的に認識する、
を含み、
ここでEE−GM3の前記5’フランキング領域は、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列を含み、
EE−GM3の前記3’フランキング領域は、配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列を含むか、または前記5’もしくは3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号20のヌクレオチド1452からヌクレオチド16638までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含み、
EE−GM2の前記5’フランキング領域は、配列番号14のヌクレオチド1からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列を含み、
EE−GM2の前記3’フランキング領域は、配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド810までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号15のヌクレオチド1からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記5’または3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号11のヌクレオチド3458からヌクレオチド3848までのヌクレオチド配列および配列番号11のヌクレオチド413からヌクレオチド3457のヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を含み、
ここで前記優良イベントEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
前記優良イベントEE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
前記方法。 - 請求項25記載の方法であって、
少なくとも2つのプライマーを用いた第1のポリメラーゼ連鎖反応、ここで前記プライマーの一方は、EE−GM3中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’または3’フランキング領域を認識し、前記プライマーの他方のプライマーは、前記5’または3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の外来性DNA内の配列を認識する、および
少なくとも2つのプライマーを用いた第2のポリメラーゼ連鎖反応、ここで前記プライマーの一方は、EE−GM2中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’または3’フランキング領域を認識し、前記プライマーの他方のプライマーは、前記5’または3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の外来性DNA内の配列を認識する、
を使用して、前記生物学的試料中に存在する核酸から50〜1000bpの2つのDNAフラグメントを増幅させることを含み、ここで前記第1および第2のポリメラーゼ反応は逐次的であっても同時であってもよい、前記方法。 - 請求項26記載の方法であって、
EE−GM3の5’フランキング領域を認識する前記プライマーが、その最3’末端において、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
EE−GM3の3’フランキング領域を認識する前記プライマーが、その最3’末端において、配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
EE−GM3の外来性DNA内の配列を認識する前記プライマーが、その最3’末端において、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列、または配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列、または配列番号20のヌクレオチド1452からヌクレオチド16638までのヌクレオチド配列もしくはその相補体から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドを含み、
EE−GM2の5’フランキング領域を認識する前記プライマーが、その最3’末端において、配列番号14のヌクレオチド1からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
EE−GM2の3’フランキング領域を認識する前記プライマーが、その最3’末端において、配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までの相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
EE−GM2の外来性DNA内の配列を認識する前記プライマーが、その最3’末端において、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド810までの相補体のヌクレオチド配列、または配列番号15のヌクレオチド1からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列、または配列番号11のヌクレオチド3458からヌクレオチド3848までのヌクレオチド配列および配列番号11のヌクレオチド413からヌクレオチド3457までのヌクレオチド配列もしくはそれらの相補体から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドを含む、
前記方法。 - 前記EE−GM3特異的プライマーが、それぞれ配列番号5および配列番号4の配列、またはそれぞれ配列番号7および配列番号5の配列を含み、前記EE−GM2特異的プライマーが、それぞれ配列番号18および配列番号19の配列を含む、請求項27記載の方法。
- EE−GM3およびEE−GM2の特異的検出における使用に適する2つのプライマー対であって、
EE−GM3およびEE−GM2のそれぞれは、5’フランキング領域、外来性DNAおよび3’フランキング領域を含み、5’フランキング領域は外来性DNAの直近上流にありそれに隣接しており、3’フランキング領域は外来性DNAの直近下流にありそれに隣接しており、
第1のプライマー対の一方のプライマーは、EE−GM3中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’または3’フランキング領域内の配列を認識する配列を含み、第1のプライマー対の他方のプライマーは、EE−GM3中の前記5’または3’フランキング領域に隣接する外来性DNA内の配列を認識する配列を含み、
第2のプライマー対の一方のプライマーは、EE−GM2中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’または3’フランキング領域内の配列を認識する配列を含み、第2のプライマー対の他方のプライマーは、EE−GM2の前記5’または3’フランキング領域に隣接する外来性DNA内の配列を認識する配列を含み、
EE−GM3の前記5’フランキング領域は、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列を含み、
EE−GM3の前記3’フランキング領域は、配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列を含むか、または前記5’もしくは3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号20のヌクレオチド1452からヌクレオチド16638までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含み、
EE−GM2の前記5’フランキング領域は、配列番号14のヌクレオチド1からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列を含み、
EE−GM2の前記3’フランキング領域は、配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド810までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号15のヌクレオチド1からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記5’または3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号11のヌクレオチド3458からヌクレオチド3848までのヌクレオチド配列および配列番号11のヌクレオチド413からヌクレオチド3457のヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を含み、
ここでEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
EE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
前記プライマー対。 - 請求項29記載のプライマー対であって、
前記第1のプライマー対の一方のプライマーが、その最3’末端において、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列または配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
前記第1のプライマー対の他方のプライマーが、その最3’末端において、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列または配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
前記第2のプライマー対の一方のプライマーが、その最3’末端において、配列番号14のヌクレオチド1からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列または配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までの相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
前記第2のプライマー対の他方のプライマーが、その最3’末端において、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド810までのヌクレオチド配列の相補体または配列番号15のヌクレオチド1からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも17個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、
前記プライマー対。 - 請求項29記載のプライマー対であって、
前記第1のプライマー対の一方が、その最3’末端において、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列から選択される17〜200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列または配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までのヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列から選択される17〜200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
前記第2のプライマー対の一方が、その最3’末端において、配列番号14のヌクレオチド1からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列から選択される17〜200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列または配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までのヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列から選択される17〜200個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、
前記プライマー対。 - 請求項29記載のプライマー対であって、以下の4つのプライマー:
配列番号5の配列をその最3’末端に含む第1のプライマー;
配列番号4の配列をその最3’末端に含む第2のプライマー;
配列番号18の配列をその最3’末端に含む第3のプライマー;および、
配列番号19の配列をその最3’末端に含む第4のプライマー;
を含む、前記プライマー対。 - ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫由来の生物学的試料中の優良イベントEE−GM3およびEE−GM2の同時存在を識別する方法であって、
生物学的試料の核酸を、EE−GM3の5’または3’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性DNAの部分を含む領域に特異的にハイブリダイズするEE−GM3に対する第1の特異的プローブとハイブリダイズさせること、および
生物学的試料の核酸を、EE−GM2の5’または3’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性DNAの部分を含む領域に特異的にハイブリダイズするEE−GM2に対する第2の特異的プローブとハイブリダイズさせることを含み、
前記第1の特異的プローブの配列は、EE−GM3の5’フランキング領域または3’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性DNAの配列の部分を含む配列と少なくとも90%配列同一性を有し、
前記第2の特異的プローブの配列は、EE−GM2の5’フランキング領域または3’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性DNAの配列の部分を含む配列と少なくとも90%配列同一性を有し、
EE−GM3の前記5’フランキング領域は、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列を含み、
EE−GM3の前記3’フランキング領域は、配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列を含むか、または前記5’もしくは3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号20のヌクレオチド1452からヌクレオチド16638までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含み、
EE−GM2の前記5’フランキング領域は、配列番号14のヌクレオチド1からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列を含み、
EE−GM2の前記3’フランキング領域は、配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド810までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号15のヌクレオチド1からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記5’または3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号11のヌクレオチド3458からヌクレオチド3848までのヌクレオチド配列および配列番号11のヌクレオチド413からヌクレオチド3457のヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を含み、
ここで前記優良イベントEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
前記優良イベントEE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
前記方法。 - 請求項33記載の方法であって、
前記第1の特異的プローブの配列が、配列番号2のヌクレオチド1431から1472もしくは配列番号3のヌクレオチド220から261、またはその相補体と少なくとも90%配列同一性を有し、
前記第2の特異的プローブの配列が、配列番号14のヌクレオチド301から322もしくは配列番号15のヌクレオチド497から518、またはその相補体と少なくとも90%配列同一性を有する、
前記方法。 - 生物学的試料中の優良イベントEE−GM3および優良イベントEE−GM2の同時存在を識別するための一対の特異的プローブであって、
EE−GM3およびEE−GM2のそれぞれは、5’フランキング領域、外来性DNAおよび3’フランキング領域を含み、5’フランキング領域は外来性DNAの直近上流にありそれに隣接しており、3’フランキング領域は外来性DNAの直近下流にありそれに隣接しており、
EE−GM3中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’フランキング領域もしくは3’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性DNAの部分を含む配列と少なくとも90%配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む第1のプローブ、ならびにEE−GM2中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性DNAの5’フランキング領域もしくは3’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性DNAの部分を含む配列と少なくとも90%配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む第2のプローブを含み、例えば前記第1のプローブは、配列番号2のヌクレオチド1441から1462もしくは配列番号3のヌクレオチド230から251、またはその相補体と少なくとも90%配列同一性を有し、前記第2の特異的プローブの配列は、配列番号14のヌクレオチド301から322もしくは配列番号15のヌクレオチド497から518、またはその相補体と少なくとも90%配列同一性を有し、
EE−GM3の前記5’フランキング領域は、配列番号2のヌクレオチド1からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列を含み、
EE−GM3の前記3’フランキング領域は、配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド1408までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1843までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号3のヌクレオチド1からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列を含むか、または前記5’もしくは3’フランキング領域に隣接するEE−GM3の前記外来性DNAは、配列番号20のヌクレオチド1452からヌクレオチド16638までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含み、
EE−GM2の前記5’フランキング領域は、配列番号14のヌクレオチド1からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列を含み、
EE−GM2の前記3’フランキング領域は、配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド1880までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
前記5’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド810までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号15のヌクレオチド1からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記5’または3’フランキング領域に隣接するEE−GM2の前記外来性DNAは、配列番号11のヌクレオチド3458からヌクレオチド3848までのヌクレオチド配列および配列番号11のヌクレオチド413からヌクレオチド3457のヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を含み、
ここで前記優良イベントEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
前記優良イベントEE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
前記一対の特異的プローブ。 - EE−GM3およびEE−GM2を特異的に認識するプライマー対またはプローブを含むキットであって、
前記プライマー対は、請求項29〜32のいずれか一項に記載のプライマー対であり、
前記プローブは、請求項35に記載のプローブである、
前記キット。 - 請求項25または33記載の方法であって、
前記生物学的試料が種子試料であり、
種子の純度を確認するか、または優良イベントEE−GM3およびEE−GM2の存在または非存在に関して種子をスクリーニングするためであり、
前記種子試料における、特異的プライマー対またはプローブ対によるEE−GM3およびEE−GM2特異的領域の検出を含む、
前記方法。 - 実質的に相補な標識された核酸プローブとのハイブリダイゼーションを介してダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫由来の生物学的試料中の優良イベントEE−GM3およびEE−GM2の存在を検出する方法であって、
標的核酸配列の再利用を介して該標的核酸配列の検出シグナルが増幅され、
下記工程:
a)前記標的核酸配列を、配列番号2のヌクレオチド1452からヌクレオチド1469までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第1の核酸オリゴヌクレオチド、または配列番号3のヌクレオチド223からヌクレオチド240までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第1の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること;
b)前記標的核酸配列を、配列番号2のヌクレオチド1434からヌクレオチド1451までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第2の核酸オリゴヌクレオチド、または配列番号3のヌクレオチド241からヌクレオチド258までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第2の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること、ここで前記第1および第2のオリゴヌクレオチドは少なくとも1つのヌクレオチドで重複しており、そしてここで前記第1または該第2のオリゴヌクレオチドのいずれかが標識されて前記標識された核酸プローブとなる;
c)デュプレックス解離をもたらす選択的プローブ切断を起こす酵素により、プローブ:標的核酸配列デュプレックス内の標識されたプローブのみを切断し、標的配列は未損傷のままとすること;
d)工程(a)から(c)を反復することにより標的核酸配列を再利用すること;および
e)切断された標識されたプローブを検出することにより、標的核酸配列の存在を決定すること;ならびに
f)前記標的核酸配列を、配列番号14のヌクレオチド312からヌクレオチド329までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第3の核酸オリゴヌクレオチド、または配列番号15のヌクレオチド490からヌクレオチド507までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第3の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること;
g)前記標的核酸配列を、配列番号14のヌクレオチド294からヌクレオチド311までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第4の核酸オリゴヌクレオチド、または配列番号15のヌクレオチド508からヌクレオチド525までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第4の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること、ここで前記第3および第4のオリゴヌクレオチドは少なくとも1つのヌクレオチドで重複しており、そしてここで前記第3または該第4のオリゴヌクレオチドのいずれかが標識されて前記標識された核酸プローブとなる;
h)デュプレックス解離をもたらす選択的プローブ切断を起こす酵素により、プローブ:標的核酸配列デュプレックス内の標識されたプローブのみを切断し、標的配列は未損傷のままとすること;
i)工程(f)から(h)を反復することにより標的核酸配列を再利用すること;および
e)切断された標識されたプローブを検出することにより、標的核酸配列の存在を決定すること;
を含み、
ここで前記優良イベントEE−GM3は、寄託番号NCIMB41659の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラHPPD PfW336コード遺伝子及びキメラ2mEPSPSコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
前記優良イベントEE−GM2は、寄託番号NCIMB41660の下にNCIMBに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性DNA並びに前記外来性DNAに直接隣接する5’及び3’フランキング配列を含む遺伝子座である、
前記方法。
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