JP6470705B2 - 除草剤耐性植物及びそれを識別するための方法 - Google Patents

除草剤耐性植物及びそれを識別するための方法 Download PDF

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関連出願の相互参照
本出願は２０１０年７月２３日に出願された米国仮特許出願６１／３６７，２５１号；２００９年１１月２３日に出願された米国仮特許出願６１／２６３，７０７号；及び２００９年１１月２３日に出願された欧州特許出願ＥＰ０９０１４５６５．７号の優先権を主張し、これらの開示内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、各々ダイズゲノムの特異的箇所において、特異的形質転換イベントの少なくとも２つを保有することにより、特に、除草剤耐性を付与する蛋白をコードする遺伝子の少なくとも２セットの存在により特徴付けられる、トランスジェニックダイズ植物、植物性物質及び種子に関する。本発明のダイズ植物は除草剤の非存在下における非形質転換ダイズ系統と同等の種々異なる遺伝子的背景における作物学的性能、遺伝子的安定性及び機能に除草剤耐性表現型を組み合わせている。本発明は更に生物学的試料中に形質転換イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２又はＥＥ−ＧＭ１を特に含む植物性物質の存在を識別するための方法及びキットを提供する。
植物における導入遺伝子の表現型発現は遺伝子の構造又は遺伝子そのもの及び植物ゲノム中のそれ又はそれらの箇所の両方により決定される。同時に、ゲノム中の種々異なる箇所における導入遺伝子、即ち「外来性ＤＮＡ」の存在が種々異なる態様において植物の全体的表現型に影響することになる。遺伝子操作による植物中の商業的価値のある特質の作物学的又は工業的に成功する導入は種々異なる要因に依存する長い手順となる場合がある。遺伝子的に形質転換された植物の実際の形質転換及び再生は、広範な遺伝子特性化、繁殖、及び圃場試験における評価を包含し、そして最終的には優良イベントの選択に至る一連の選択工程の最初のものに過ぎない。
優良イベントの明確な識別はＮｏｖｅｌ Ｆｏｏｄ／Ｆｅｅｄにおける考察、ＧＭＯと非ＧＭＯ産物の分離、及び専売物質の識別を鑑みれば、よりいっそう重要になりつつある。理想的には、そのような識別方法は迅速かつ簡素であり、広範な実験設備を必要としない。更に又、方法は専門的な解釈を要せず優良イベントの明確な決定を可能にするが、必要に応じて専門的な精査検討の下にあり続ける結果をもたらすはずである。生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ１の識別において使用するための特異的ツールを本明細書に記載する。
本明細書において、ＥＥ−ＧＭ３は、４−ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤に対する耐性を付与する遺伝子と組み合わせてグリホセート耐性をコードする遺伝子を各々植物発現可能なプロモーターの制御下に含む除草剤耐性ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）の開発において、トランスジェニックダイズ植物の集団から優良イベントとして識別されている。
ＥＥ−ＧＭ１及びＥＥ−ＧＭ２はグルホシネート耐性をコードする遺伝子を共に植物発現可能なプロモーターの制御下に含む除草剤耐性ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）の開発において、トランスジェニックダイズ植物の集団から優良イベントとして識別されており、そして国際特許出願ＷＯ２００６／１０８６７４及びＷＯ２００６／１０８６７５に記載されている（共に参照により本明細書に組み込まれる）。
除草剤耐性遺伝子を含むダイズ植物は当該分野で開示されている。しかしながら従来技術の開示の何れも本発明を教示又は示唆するものではない。
許容できる作物学的性能を有し、収量を障害せず、そして確実に３種の異なるクラスの除草剤に対して十分な除草剤耐性をもたらすダイズ植物における商業的除草剤耐性優良形質転換イベントを得ることは決して単純ではない。
実際、除草剤耐性を有する市販の最初のダイズイベント（イベント４０−３−２は（近）同遺伝子系の系統と比較して顕著な収量障害があることが報告されている(Elmore et.al.,(2001)Agron.J.93:408-412)。
更に又、ＯｐｔｉｍｕｍＴＭＧＡＴＴＭダイズ（イベント３５６０４３）はグリホセートへの耐性をＡＬＳ除草剤に対する耐性と組み合わせるように開発されているが、これらのダイズはそれ自体ではグリホセート耐性に関する基準に合致しないと報告されている（別のグリホセート耐性ダイズイベント（例えばイベント４０−３−２）と組み合わせない場合（例えばwww.bloomberg.com/apps/news?pid=newsaixhive&sid=ad4L0hH9MKWE参照））。
国際特許出願ＷＯ２００６／１０８６７４ 国際特許出願ＷＯ２００６／１０８６７５
Elmore et.al.,(2001)Agron.J.93:408-412
本発明は２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子のコーディング配列を含む除草剤耐性遺伝子及びＨＰＰＤ−ＰｆＷ３３６のコーディング配列を含む別の除草剤耐性遺伝子（共に本明細書の実施例１．１において記載されており、そして配列番号１において示される通りである）を含む発現カセット、並びに、本明細書において実施例１に記載するとおり、そして配列番号１１に示すホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼのコーディング配列を含む除草剤耐性遺伝子を含む第２の発現カセットを、自身のゲノム内に安定に組み込まれた状態で含んでいる、トランスジェニックダイズ植物、又はその種子、細胞又は組織に関する。トランスジェニックのダイズ植物、又はその種子、細胞又は組織は、グリホセートに基づく、グルホシネートに基づく除草剤、及びＨＰＰＤ阻害剤除草剤、例えばイソキサフルトールに対して耐性であり、そして、除草剤の非存在下においては、非トランスジェニック同遺伝子系の系統と実質的に同等の作物学的性能を有する。付与された耐性に対する除草剤１つ以上の適用の後、植物は非トランスジェニック植物と比較して優れた作物学的表現型を有することになる。
本発明によれば、ダイズ植物又はその種子、細胞又は組織は優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含む。
より特定すれば、本発明は、それぞれＥＥ−ＧＭ３のＥＥ−ＧＭ３の５’又は３’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡに指向された２つのプライマーを用いて本明細書に記載したＰＣＲ識別プロトコルにおいて分析した場合に、ＥＥ−ＧＭ３に特異的なフラグメントを与え、そしてＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２の５’又は３’フランキング領域及びグルホシネート耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡに指向されたプライマーの２つを用いて本明細書に記載したＰＣＲ識別プロトコルにおいて分析した場合に、ＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２に特異的なフラグメントを与えるという事実により自身のゲノムＤＮＡが特徴付けられる、トランスジェニックのダイズ植物、その種子、細胞又は組織に関する。ＥＥ−ＧＭ３の検出のためのプライマーは配列番号２内部の５’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡにそれぞれ指向させて良い。ＥＥ−ＧＭ３の検出のためのプライマーは又配列番号３内部の３’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡにそれぞれ指向されて良く、例えばプライマーはそれぞれ配列番号５及び配列番号４又は配列番号７のヌクレオチド配列を含むか、（実質的に）それらよりなり、そして１００〜８００ｂｐのＤＮＡフラグメント、例えば約２６３ｂｐ又は７０６ｂｐのフラグメントをもたらす。ＥＥ−ＧＭ１の検出のためのプライマーは配列番号１２内部の５’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡにそれぞれ指向させて良い。ＥＥ−ＧＭ１の検出のためのプライマーは配列番号１３内部の３’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡにそれぞれ指向されて良く、例えばプライマーはそれぞれ配列番号１６及び配列番号１７のヌクレオチド配列を含むか、（実質的に）それらよりなり、そして１００〜５００ｂｐのＤＮＡフラグメント、例えば約１８３ｂｐのフラグメントをもたらす。ＥＥ−ＧＭ２の検出のためのプライマーは配列番号１４内部の５’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡにそれぞれ指向させて良い。ＥＥ−ＧＭ２の検出のためのプライマーは配列番号１５内部の３’フランキング領域及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡにそれぞれ指向されて良く、例えばプライマーはそれぞれ配列番号１８及び配列番号１９のヌクレオチド配列を含むか、（実質的に）それらよりなり、そして１００〜５００ｂｐのＤＮＡフラグメント、例えば約１５１ｂｐのフラグメントをもたらす。
本発明の優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含むレファレンス種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されている。本発明の優良イベントＥＥ−ＧＭ１を含むレファレンス種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５８の下にＮＣＩＭＢに寄託されている。本発明の優良イベントＥＥ−ＧＭ２を含むレファレンス種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６６０の下にＮＣＩＭＢに寄託されている。本発明の優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を含むレファレンス種子はアクセッション番号ＰＴＡ−１１０４１の下にＡＴＣＣに寄託されている。本発明の優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含むレファレンス種子はアクセッション番号ＰＴＡ−１１０４２の下にＡＴＣＣに寄託されている。
本発明の１つの実施形態は優良イベントＥＥ−ＧＭ３（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５９としてＮＣＩＭＢに寄託されている該イベントを含むレファレンス種子）を含み、そして更に優良イベントＥＥ−ＧＭ１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５８としてＮＣＩＭＢに寄託されている該イベントを含むレファレンス種子）を含む種子、又はイベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を含む種子（アクセッション番号ＰＴＡ−１１０４１の下にＡＴＣＣに寄託されている該イベントを含むレファレンス種子）を含む種子であり、これは除草剤に対して耐性である、特にグリホセート及び／又はＨＰＰＤ阻害剤、例えばイソキサフルトール及び／又はグルタミン合成酵素阻害剤、例えばグルホシネートに対して耐性であるダイズ植物に成長することになる。
本発明の１つの実施形態は優良イベントＥＥ−ＧＭ３（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５９としてＮＣＩＭＢに寄託されている該イベントを含むレファレンス種子）を含み、そして更に優良イベントＥＥ−ＧＭ２（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６６０としてＮＣＩＭＢに寄託されている該イベントを含むレファレンス種子）を含む種子、又はイベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含む種子（アクセッション番号ＰＴＡ−１１０４２の下にＡＴＣＣに寄託されている該イベントを含むレファレンス種子）を含む種子であり、これは除草剤に対して耐性である、特にグリホセート及び／又はＨＰＰＤ阻害剤、例えばイソキサフルトール及び／又はグルタミン合成酵素阻害剤、例えばグルホシネートに対して耐性であるダイズ植物に成長することになる。
ＮＣＩＭＢ寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の種子は、成長して除草剤耐性植物となる優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含むトランスジェニック種子の少なくとも約９５％よりなる種子ロットであり、ここで植物はグリホセート及び／又はイソキサフルトール耐性となる。寄託した種子から得ることが可能か得られている種子又は子孫種子（例えば異なる遺伝子的背景を有する他のダイズ植物との交雑の後）を播種することができ、そして成長植物を本明細書に記載する通りグリホセート又はＨＰＰＤ阻害剤、例えばイソキサフルトールで処理することにより優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含むグリホセート又はイソキサフルトール耐性植物を得ることができる。ＮＣＩＭＢ寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５８及びＮＣＩＭＢ４１６６０の種子は、成長して除草剤耐性植物となる優良イベントＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２をそれぞれ含むトランスジェニック種子の少なくとも約９５％よりなる種子ロットである。種子は播種することができ、そして成長植物を本明細書に記載する通りグルホシネートで処理することにより優良イベントＥＥ−ＧＭ１及びＥＥ−ＧＭ２を含むグルホシネート耐性植物を得ることができる。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１０４１の種子は、成長して除草剤耐性植物となる優良イベントＥＥ−ＧＭ３及び優良イベントＥＥ−ＧＭ１をホモ接合型において含むトランスジェニック種子の少なくとも約９５％よりなる種子ロットであり、ここで植物はグリホセート、グルホシネート及び／又はイソキサフルトール耐性となる。寄託した種子から得ることが可能か得られている種子又は子孫種子（例えば異なる遺伝子的背景を有する他のダイズ植物との交雑の後）を播種することができ、そして成長植物を本明細書に記載する通りグリホセート、グルホシネート又はＨＰＰＤ阻害剤、例えばイソキサフルトールで処理することにより優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を含むグリホセート、グルホシネート及び／又はイソキサフルトール耐性植物を得ることができる。ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１０４２の種子は、成長して除草剤耐性植物となる優良イベントＥＥ−ＧＭ３及び優良イベントＥＥ−ＧＭ２をホモ接合型において含むトランスジェニック種子の少なくとも約９５％よりなる種子ロットであり、ここで植物はグリホセート、グルホシネート及び／又はイソキサフルトール耐性となる。寄託した種子から得ることが可能か得られている種子又は子孫種子（例えば異なる遺伝子的背景を有する他のダイズ植物との交雑の後）を播種することができ、そして成長植物を本明細書に記載する通りグリホセート、グルホシネート又はＨＰＰＤ阻害剤、例えばイソキサフルトールで処理することにより優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含むグリホセート、グルホシネート及び／又はイソキサフルトール耐性植物を得ることができる
本発明は更に、優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含み、そして更に優良イベントＥＥ−ＧＭ１を含む細胞、組織、子孫、及び後継物に関する。そしてこれらをＰＴＡ−１１０４１としてＡＴＣＣに寄託されている優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を含む植物を生育させるか、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５９を有するＮＣＩＭＢに寄託されている種子から生育させた優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含む植物を生育させ、そして該植物をアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５８を有するＮＣＩＭＢに寄託されている種子から生育させた優良イベントＥＥ−ＧＭ１を含む植物と交雑させることにより得てよい。本発明は又、優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含む、細胞、組織、子孫、及び後継物に関する。そしてこれらを更に優良イベントＥＥ−ＧＭ２を含み、そしてＰＴＡ−１１０４２としてＡＴＣＣに寄託されている優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含む植物を生育させるか、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５９を有するＮＣＩＭＢに寄託されている種子から生育させた優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含む植物を生育させ、そして該植物をアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６６０を有するＮＣＩＭＢに寄託されている種子から生育させた優良イベントＥＥ−ＧＭ２を含む植物と交雑させることにより得てよい。本発明は更に直前に記載したダイズ植物又はダイズ種子から（例えばその増殖及び／又はそれとの繁殖によって）得ることが可能な植物に関する。本発明は又優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含むダイズ植物に関する。
本発明は更に優良イベントＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含むトランスジェニック植物、又はその細胞又は組織を識別するための方法に関し、その方法は、トランスジェニック植物、細胞又は組織における、特徴的ＤＮＡ配列又はそのようなＤＮＡによりコードされるアミノ酸の存在を識別することに基づいている。本発明の好ましい実施形態によれば、そのような特徴的ＤＮＡ配列は、少なくとも１５ｂｐ、１５ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、２０ｂｐ、又は３０ｂｐ以上の配列であり、これはイベントの挿入部位、即ち除草剤耐性遺伝子を含む挿入された外来性ＤＮＡの一部及びそれに隣接するダイズゲノムの一部（５’又は３’フランキング領域の何れか）の両方を含み、これにより優良イベントの特異的識別が可能になる。
本発明は更に、生物学的試料中の優良イベントＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を識別するための方法に関し、その方法はＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’及び／又は３’フランキング配列を特異的に認識するプライマー又はプローブに基づいている。
より特定すれば、本発明は、各々がプライマーの少なくとも２つによる２つのポリメラーゼ連鎖反応又は、プライマーの少なくとも４つによるポリメラーゼ連鎖反応の１つを用いて生物学的試料中に存在する２つの核酸の配列を増幅することを含む方法に関し、第１のプライマーはＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’又は３’フランキング領域を認識し、第２のプライマーはＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ内部の配列を認識し、第３のプライマーはＥＥ−ＧＭ３又はＥＥ−ＧＭ２の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’又は３’フランキング領域を認識し、そして第４のプライマーはＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ内部の配列を認識し、これにより好ましくは１００ｂｐ〜８００ｂｐのＤＮＡフラグメントが得られる。ＥＥ−ＧＭ３を識別するためのプライマーはＥＥ−ＧＭ３の５’フランキング領域内部（配列番号２、１位から１４５１位まで）又はＥＥ−ＧＭ３の３’フランキング領域内部（配列番号３の２４１位から１４０８位までの相補体）の配列及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ内部の配列（配列番号２の１４５２から１８４３位までの相補体又は配列番号３の１位から２４０位まで、又は配列番号３のヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８まで又はその相補体）をそれぞれ認識してよい。３’フランキング領域を認識するプライマーは配列番号５のヌクレオチド配列を含んでよく、そして、除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ内部の配列を認識するプライマーは本明細書に記載する配列番号４又は配列番号７のヌクレオチド配列を含んでよい。ＥＥ−ＧＭ１を識別するためのプライマーはＥＥ−ＧＭ１の５’フランキング領域内部（配列番号１２、１位から２０９位まで）又はＥＥ−ＧＭ１の３’フランキング領域内部（配列番号１３の５６９位から１０００位までの相補体）の配列及びＥＥ−ＧＭ１の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ内部の配列（配列番号１２の２１０から７２０位までの相補体又は配列番号１３の１位から５６８位まで）をそれぞれ認識してよい。ＥＥ−ＧＭ１の５’フランキング領域を認識するプライマーは配列番号１６のヌクレオチド配列を含んでよく、そして、ＥＥ−ＧＭ１の外来性ＤＮＡ内部の配列を認識するプライマーは本明細書に記載する配列番号１７のヌクレオチド配列を含んでよい。ＥＥ−ＧＭ２を識別するためのプライマーはＥＥ−ＧＭ２の５’フランキング領域内部（配列番号１４、１位から３１１位まで）又はＥＥ−ＧＭ２の３’フランキング領域内部（配列番号１５の５０８位から１８８０位までの相補体）の配列及びＥＥ−ＧＭ１の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ内部の配列（配列番号１４の３１２から８１０位までの相補体又は配列番号１５の１位から５０７位まで）をそれぞれ認識してよい。ＥＥ−ＧＭ２の３’フランキング領域を認識するプライマーは配列番号１８のヌクレオチド配列を含んでよく、そして、ＥＥ−ＧＭ２の外来性ＤＮＡ内部の配列を認識するプライマーは本明細書に記載する配列番号１９のヌクレオチド配列を含んでよい。ＰＣＲ増幅は同時又は逐次的に行ってよい。
本発明は生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を識別するための方法により特定的に関連しており、その方法は、約２６３ｂｐのＤＮＡフラグメントを得るためのそれぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に）なる２つのプライマーによるか、又は約７０６ｂｐのＤＮＡフラグメントを得るためのそれぞれ配列番号５及び配列番号７のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に）なる２つのプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応及び約１８３ｂｐのＤＮＡフラグメントを得るためのそれぞれ配列番号１６及び配列番号１７のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に）なる２つのプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する核酸の少なくとも２つの配列を増幅することを含む。２つのポリメラーゼ連鎖反応は同時又は逐次的に行ってよい。
本発明は生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を識別するための方法により特定的に関連しており、その方法は、約２６３ｂｐのＤＮＡフラグメントを得るためのそれぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に）なる２つのプライマーによるか、又は約７０６ｂｐのＤＮＡフラグメントを得るためのそれぞれ配列番号５及び配列番号７のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に）なる２つのプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応及び約１５１ｂｐのＤＮＡフラグメントを得るためのそれぞれ配列番号１８及び配列番号１９のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に）なる２つのプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する核酸少なくとも２つの配列を増幅することを含む。２つのポリメラーゼ連鎖反応は同時又は逐次的に行ってよい。
本発明は更に生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１の同時存在に関する特異的識別方法を開発するために使用できるＥＥ−ＧＭ１の特異的フランキング配列と組み合わせた本明細書に記載したＥＥ−ＧＭ３の特異的フランキング配列に関する。そのような複合的な特異的フランキング配列は識別アッセイにおいてレファレンス対照物質として使用してよい。より特記すれば、本発明は本明細書において更に記載する特異的プライマー及びプローブの開発のために使用できるＥＥ−ＧＭ１の５’及び／又は３’フランキング領域と組み合わせたＥＥ−ＧＭ３の５’及び／又は３’フランキング領域に関する。レファレンス物質として類似に適するものは、配列番号１６及び配列番号１７のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に）なるプライマーにより増幅できる配列を含む核酸分子と組み合わせて配列番号７及び配列番号５又は配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に）なるプライマーにより増幅できる配列を含む、好ましくは約１５０〜８５０ｂｐの核酸分子であり、特にそのような核酸分子はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を含む物質中でそのようなプライマーを使用して得られる。
本発明は更に又、生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２の同時存在に対する特異的識別方法を開発するために使用できるＥＥ−ＧＭ２の特異的フランキング配列と組み合わせた本明細書に記載したＥＥ−ＧＭ３の特異的フランキング配列に関する。そのような複合的な特異的フランキング配列は識別アッセイにおいてレファレンス対照物質として使用してよい。より特記すれば、本発明は本明細書において更に記載する特異的プライマー及びプローブの開発のために使用できるＥＥ−ＧＭ２の５’及び／又は３’フランキング領域と組み合わせたＥＥ−ＧＭ３の５’及び／又は３’フランキング領域に関する。レファレンス物質として類似に適するものは、配列番号１８及び配列番号１９のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に）なるプライマーにより増幅できる配列を含む核酸分子と組み合わせて配列番号７及び配列番号５又は配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を含むかそれより(本質的に）なるプライマーにより増幅できる配列を含む、好ましくは約１５０〜８５０ｂｐの核酸分子であり、特にそのような核酸分子はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含む物質中でそのようなプライマーを使用して得られる。
本発明は更にこのような特異的プライマー又はプローブの使用に基づく生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１の同時存在に対する識別方法に関する。ＥＥ−ＧＭ３検出のためのプライマーは、配列番号１のヌクレオチド配列から選択される１７から約２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列、例えば配列番号２のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までのヌクレオチド配列の相補体又はヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までの配列番号３のヌクレオチド配列から選択される１７から約２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になるプライマーと組み合わせられた、配列番号２のヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までのヌクレオチド配列又は配列番号３のヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までのヌクレオチド配列の相補体から選択される連続ヌクレオチド１７から約２００のヌクレオチド配列を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になる。ＥＥ−ＧＭ１検出のためのプライマーは、配列番号１１のヌクレオチド配列から選択される１７から約２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列、例えば配列番号１２のヌクレオチド２１９からヌクレオチド７２０までのヌクレオチド配列の相補体又は配列番号１３のヌクレオチド１からヌクレオチド５６８までのヌクレオチド配列から選択される１７から約２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になるプライマーと組み合わせられた、配列番号１２のヌクレオチド１からヌクレオチド２０９までのヌクレオチド配列又は配列番号１３のヌクレオチド５６９からヌクレオチド１０００までのヌクレオチド配列の相補体から選択される連続ヌクレオチド１７から約２０のヌクレオチド配列を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になる。プライマーは又、それらの３’最末端に所在するこれらのヌクレオチド配列を含んでよく、そして更に無関係の配列又は記載したヌクレオチド配列から誘導されるが、ミスマッチを含む配列を含んでもよい。
本発明は更にこのような特異的プライマー又はプローブの使用に基づく生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２の同時存在に対する識別方法に関する。ＥＥ−ＧＭ３検出のためのプライマーは、前パラグラフに記載する通り１７から約２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になってよい。ＥＥ−ＧＭ２検出のためのプライマーは、配列番号１１のヌクレオチド配列から選択される１７から約２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列、例えば配列番号１４のヌクレオチド３１２からヌクレオチド８１０までのヌクレオチド配列の相補体又は配列番号１５のヌクレオチド１からヌクレオチド５０７までのヌクレオチド配列から選択される１７から約２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になるプライマーと組み合わせられた、配列番号１４のヌクレオチド１からヌクレオチド３１１までのヌクレオチド配列又は配列番号１５のヌクレオチド５０８からヌクレオチド１８８０までのヌクレオチド配列の相補体から選択される連続ヌクレオチド１７から約２０のヌクレオチド配列を含むか、それよりなるか、又はそれより本質的になる。プライマーは又、それらの３’最末端に所在するこれらのヌクレオチド配列を含んでよく、そして更に無関係の配列又は記載したヌクレオチド配列から誘導されるが、ミスマッチを含む配列を含んでもよい。
本発明は更に生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を識別するためのキットに関し、該キットはＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’又は３’フランキング領域を特異的に認識するプライマー又はプローブの少なくとも１つ及びＥＥ−ＧＭ１の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’又は３’フランキング領域を特異的に認識するプライマー又はプローブの少なくとも１つを含む。
本発明は更に生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を識別するためのキットに関し、該キットはＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’又は３’フランキング領域を特異的に認識するプライマー又はプローブの少なくとも１つ及びＥＥ−ＧＭ２の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’又は３’フランキング領域を特異的に認識するプライマー又はプローブの少なくとも１つを含む。
本発明のキットは、ＰＣＲ識別プロトコルにおける使用のために、ＥＥ−ＧＭ３の５’又は３’フランキング領域及びＥＥ−ＧＭ１の５’又は３’フランキング領域を特異的に認識するプライマーに加えて、ＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ内部の配列を特異的に認識する更なるプライマー、及び、ＥＥ−ＧＭ１の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ内部の配列を特異的に認識する更なるプライマーを含んでよい。
本発明のキットは、ＰＣＲ識別プロトコルにおける使用のために、ＥＥ−ＧＭ３の５’又は３’フランキング領域及びＥＥ−ＧＭ２の５’又は３’フランキング領域を特異的に認識するプライマーに加えて、ＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ内部の配列を特異的に認識する更なるプライマー、及び、ＥＥ−ＧＭ２の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ内部の配列を特異的に認識する更なるプライマーを含んでよい。
ＥＥ−ＧＭ３の３’フランキング領域を認識するプライマーは配列番号５のヌクレオチド配列を含んでよく、そして導入遺伝子即ちＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡを認識するプライマーは配列番号４又は７のヌクレオチド配列を含んでよく、或いは、本明細書に記載する何れかの他のプライマー又はプライマーの組み合わせは、配列番号１６のヌクレオチド配列を含んでよいＥＥ−ＧＭ１の５’フランキング領域を認識するプライマー、及び、ＥＥ−ＧＭ１の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの導入遺伝子を認識するプライマーと組み合わせられて、配列番号１７のヌクレオチド配列を含んでよい。
ＥＥ−ＧＭ３の３’フランキング領域を認識するプライマーは配列番号５のヌクレオチド配列を含んでよく、そして導入遺伝子即ちＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡを認識するプライマーは配列番号４又は７のヌクレオチド配列を含んでよく、或いは、本明細書に記載する何れかの他のプライマー又はプライマーの組み合わせは、配列番号１８のヌクレオチド配列を含んでよいＥＥ−ＧＭ２の５’フランキング領域を認識するプライマー、及び、ＥＥ−ＧＭ２の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの導入遺伝子を認識するプライマーと組み合わせられて、配列番号１９のヌクレオチド配列を含んでよい。
本発明は更に、ＥＥ−ＧＭ３／ＥＥ−ＧＭ１ＰＣＲに基づく識別における使用のための、配列番号５及び配列番号４のヌクレオチド配列を含むかそれより（本質的に）なるＰＣＲプライマー及び配列番号１６及び配列番号１７のヌクレオチド配列を含むかそれより（本質的に）なるＰＣＲプライマーをキットが含んでいる、生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を識別するための該キットに関する。
本発明は更に、ＥＥ−ＧＭ３／ＥＥ−ＧＭ２ＰＣＲに基づく識別における使用のための、配列番号５及び配列番号４のヌクレオチド配列を含むかそれより（本質的に）なるＰＣＲプライマー及び配列番号１８及び配列番号１９のヌクレオチド配列を含むかそれより（本質的に）なるＰＣＲプライマーをキットが含んでいる、生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を識別するための該キットに関する。
本発明は又、ＥＥ−ＧＭ３の特異的領域との８０％〜１００％配列同一性を有する配列に相当する（又はそれに相補な）配列を含むかそれより（本質的に）なる第１のプローブ及びＥＥ−ＧＭ１の特異的領域との８０％〜１００％配列同一性を有する配列に相当する（又はそれに相補な）配列を含むかそれより（本質的に）なる第２のプローブをキットが含む、生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を識別するための該キットに関する。好ましくは、第１のプローブの配列はＥＥ−ＧＭ３の５’又は３’フランキング領域の部分を含む特異的領域に相当し、そして第２のプローブの配列はＥＥ−ＧＭ１の５’又は３’フランキング領域の部分を含む特異的領域に相当する。より好ましくは、ＥＥ−ＧＭ３特異的プローブは配列番号２のヌクレオチド１４４１から１４６２の配列と８０％〜１００％の配列同一性を有する配列又は配列番号３のヌクレオチド２２０から２６０の配列と８０％〜１００％の配列同一性を有する配列含むかそれより（本質的に）なり（又はそれに相補であり）、そしてＥＥ−ＧＭ１特異的プローブは配列番号１２のヌクレオチド１９９から２２０の配列と８０％〜１００％の配列同一性を有する配列又は配列番号１３のヌクレオチド５５８から５７９の配列と８０％〜１００％の配列同一性を有する配列含むかそれより（本質的に）なる（又はそれに相補である）。
本発明は又、ＥＥ−ＧＭ３の特異的領域との８０％〜１００％配列同一性を有する配列（又はそれに相補な）に相当する配列を含むかそれより（本質的に）なる第１のプローブ及びＥＥ−ＧＭ２の特異的領域との８０％〜１００％配列同一性を有する配列に相当する（又はそれに相補な）配列を含むかそれより（本質的に）なる第２のプローブをキットが含む、生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を識別するための該キットに関する。好ましくは、第１のプローブの配列はＥＥ−ＧＭ３の５’又は３’フランキング領域の部分を含む特異的領域に相当し、そして第２のプローブの配列はＥＥ−ＧＭ２の５’又は３’フランキング領域の部分を含む特異的領域に相当する。より好ましくは、ＥＥ−ＧＭ３特異的プローブは配列番号２のヌクレオチド１４４１から１４６２の配列と８０％〜１００％の配列同一性を有する配列又は配列番号３のヌクレオチド２２０から２６０の配列と８０％〜１００％の配列同一性を有する配列含むかそれより（本質的に）なり（又はそれに相補であり）、そしてＥＥ−ＧＭ２特異的プローブは配列番号１４のヌクレオチド３０１から３２２の配列と８０％〜１００％の配列同一性を有する配列又は配列番号１５のヌクレオチド４９７から５１８の配列と８０％〜１００％の配列同一性を有する配列含むかそれより（本質的に）なる（又はそれに相補である）。
本発明の別の側面によれば、イベントのジャンクション部位、及び、各イベントのダイズゲノムＤＮＡ及び除草剤耐性遺伝子（導入遺伝子）を含む外来性ＤＮＡの両方のポリヌクレオチドの十分な長さを含み、これにより、ＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１の検出のためのプライマーとして有用であるＤＮＡ配列が開示される。そのような配列はＥＥ−ＧＭ３又はＥＥ−ＧＭ１のダイズゲノムＤＮＡのヌクレオチドの少なくとも９つ、及び、除草剤耐性遺伝子（導入遺伝子）を含む外来性ＤＮＡのヌクレオチドの類似数を、それぞれジャンクション部位の各側に含んでよい。最も好ましくは、そのようなＤＮＡ配列は配列番号２又は配列番号３のジャンクション部位に隣接するダイズゲノムＤＮＡのヌクレオチドの少なくとも９つ及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡのヌクレオチドの類似数、及び、配列番号１２又は配列番号１３のジャンクション部位に隣接するダイズゲノムＤＮＡのヌクレオチドの少なくとも９つ及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡのヌクレオチドの類似数を含む。
本発明の更に別の側面によれば、イベントのジャンクション部位、及び、各イベントのダイズゲノムＤＮＡ及び除草剤耐性遺伝子（導入遺伝子）を含む外来性ＤＮＡの両方のポリヌクレオチドの十分な長さを含み、これにより、ＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２の検出のためのプライマーとして有用であるＤＮＡ配列が開示される。そのような配列はＥＥ−ＧＭ３又はＥＥ−ＧＭ２のダイズゲノムＤＮＡのヌクレオチドの少なくとも９つ、及び、除草剤耐性遺伝子（導入遺伝子）を含む外来性ＤＮＡのヌクレオチドの類似数を、それぞれジャンクション部位の各側に含んでよい。最も好ましくは、そのようなＤＮＡ配列は配列番号２又は配列番号３のジャンクション部位に隣接するダイズゲノムＤＮＡのヌクレオチドの少なくとも９つ及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡのヌクレオチドの類似数、及び、配列番号１４又は配列番号１５のジャンクション部位に隣接するダイズゲノムＤＮＡのヌクレオチドの少なくとも９つ及び除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡのヌクレオチドの類似数を含む。
本発明により包含される方法及びキットは種々の目的、例えば限定しないが、植物、植物性物質又は製品、例えば限定しないが、植物性物質を含むかこれより誘導された食品又は飼料製品（生鮮品又は加工品）の中のＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２の存在を識別するかその（下限）閾値を決定するために使用することができ；追加的又は代替的に、本発明の方法及びキットはトランスジェニック及び非トランスジェニックの物質の間の分離を目的としてトランスジェニック植物を識別するために使用することができ；追加的又は代替的に、本発明の方法及びキットはＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を含む植物性物質の品質（即ちパーセンテージ純物質）を決定するために使用できる。
本発明は更に、ＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２の５’及び／又は３’フランキング配列から開発された特異的プライマー及びプローブと組み合わせたＥＥ−ＧＭ３の５’及び／又は３’フランキング領域、並びにＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２の５’及び／又は３’フランキング配列から発生させた特異的プライマー及びプローブと組み合わせたＥＥ−ＧＭ３の５’及び／又は３’フランキング配列から開発された特異的プライマー及びプローブに関する。
本発明は又、優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を含む植物又は優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含む植物から得られるゲノムＤＮＡに関する。そのようなゲノムＤＮＡは本明細書に記載する識別アッセイにおけるレファレンス対照物質として使用してよい。
ここでまた提供されるものは、優良イベントの少なくとも２つを各々が含むトランスジェニックの除草剤耐性ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫であり、該第１の優良イベントは下記：
ｉ）植物発現可能なプロモーターの制御下にグリホセート耐性ＥＰＳＰＳ酵素をコードするトウモロコシ（Zea mays）に由来する修飾されたepsps遺伝子を含む第１のキメラ遺伝子;及び、
ｉｉ）植物発現可能なプロモーターの制御下にＨＰＰＤ阻害剤除草剤耐性酵素をコードするシュードモナスフルオレスセンス（Pseudomonas fluorescens）に由来する修飾されたhppd遺伝子を含む第２のキメラ遺伝子;
を含む外来性ＤＮＡを含み、そして該第２の優良イベントは植物発現可能なプロモーターの制御下にグルホシネート（又はホスフィノスリシン）アセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするストレプトミセスビリドクロモゲンス（Streptomyces viridochromogenes）から誘導された修飾されたグルホシネート耐性遺伝子を含む（第３の）キメラ遺伝子を含む。
１つの実施形態において、該第１の優良イベントは該外来性ＤＮＡの直近上流にありそれに隣接している配列番号２のヌクレオチド１から１４５１及び該外来性ＤＮＡの直近下流に有りそれに隣接している配列番号３のヌクレオチド２４１から１４０８を含み、そして該第２の優良イベントは該外来性ＤＮＡの直近上流にありそれに隣接している配列番号１２のヌクレオチド１から２０９及び該外来性ＤＮＡの直近下流に有りそれに隣接している配列番号１３のヌクレオチド５６９から１０００を含むか、又は、該第２の優良イベントは該外来性ＤＮＡの直近上流にありそれに隣接している配列番号１４のヌクレオチド１から３１１及び該外来性ＤＮＡの直近下流に有りそれに隣接している配列番号１５のヌクレオチド５０８から１８８０を含む。
その他の実施形態においては、該優良イベントは、寄託番号ＰＴＡ−１１０４１又はＰＴＡ−１１０４２の下にＡＴＣＣに寄託されている該イベントを含むレファレンス種子から生育させたダイズ植物と繁殖させることにより得ることができ、或いは、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されている該第１のイベントを含むレファレンス種子から得ることができ、そして、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５８及びＮＣＩＭＢアクセッション番号４１６６０の下にＮＣＩＭＢに寄託されている該第２のイベントを含むレファレンス種子から得ることができる。
別の実施形態において、該ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫のゲノムＤＮＡは、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を含む２つのプライマーにより該第１の優良イベントに関する優良イベント識別プロトコルを用いて分析した場合に、約２６３ｂｐ又は２６３ｂｐのＤＮＡフラグメントを与え、そして、該第２の優良イベントに関する優良イベント識別プロトコルを用いて分析した場合に、それぞれ配列番号１６及び配列番号１７のヌクレオチド配列を含む２つのプライマーによれば約１８３ｂｐ又は１８３ｂｐのＤＮＡフラグメントを与えるか、それぞれ配列番号１８及び配列番号１９のヌクレオチド配列を含む２つのプライマーによれば約１５１ｂｐ又は１５１ｂｐのＤＮＡフラグメントを与える。
ここでまた提供されるものは、２つの優良イベントを含むトランスジェニックダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫を識別するための方法であり、ここで該植物、細胞、種子又は子孫は生物学的試料中のグリホセート、グルホシネートおよびＨＰＰＤ阻害剤除草剤（例えばイソキサフルトール）に対して耐性であり、該方法は、少なくとも２つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する該第１のイベントの核酸から１００〜５００ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅すること、ただしここで該プライマーの一方は、上記特定した第１の優良イベントの５’フランキング領域、ここで該５’フランキング領域は配列番号２のヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までのヌクレオチド配列を含む、又は、該第１の優良イベントの３’フランキング領域、ここで該３’フランキング領域は配列番号３のヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの相補体のヌクレオチド配列を含む、を認識し、該プライマーの他方のプライマーは、配列番号２のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号３のヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までのヌクレオチド配列を含む該第１のイベントの外来性ＤＮＡの配列を認識する、を含み、そして、少なくとも２つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する該第２のイベントの核酸から５０〜１０００ｂｐ、又は１００〜５００ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅すること、ただしここで該プライマーの一方は、上記特定した第２の優良イベントの５’フランキング領域、ここで該５’フランキング領域は配列番号１２のヌクレオチド１から２０９までのヌクレオチド配列を含む、又は、該第２の優良イベントの３’フランキング領域、ここで該３’フランキング領域は配列番号１３のヌクレオチド５６９から１０００までの相補体のヌクレオチド配列を含む、を認識し、該プライマーの他方のプライマーは、配列番号１２のヌクレオチド２１０からヌクレオチド７２０までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号１３のヌクレオチド１からヌクレオチド５６８までのヌクレオチド配列を含む該第２のイベントの外来性ＤＮＡ内部の配列を認識する、を含む。
ここでまた提供されるものは、２つの優良イベントを含むトランスジェニックダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫を識別するための方法であり、ここで該植物、細胞、種子又は子孫は生物学的試料中のグリホセート、グルホシネートおよびＨＰＰＤ阻害剤除草剤（例えばイソキサフルトール）に対して耐性であり、該方法は少なくとも２つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する該第１のイベントの核酸から５０〜１０００又は１００〜５００ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅すること、ただしここで該プライマーの一方は、上記特定した第１の優良イベントの５’フランキング領域、ここで該５’フランキング領域は配列番号２のヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までのヌクレオチド配列を含む、又は、該第１の優良イベントの３’フランキング領域、ここで該３’フランキング領域は配列番号３のヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの相補体のヌクレオチド配列を含む、を認識し、該プライマーの他方のプライマーは、配列番号２のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号３のヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までのヌクレオチド配列を含む該第１のイベントの外来性ＤＮＡ内部の配列を認識する、を含み、そして、少なくとも２つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する該第２のイベントの核酸から５０〜１０００ｂｐ、又は１００〜５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅すること、ただしここで該プライマーの一方は上記特定した第２の優良イベントの５’フランキング領域、ここで該５’フランキング領域は配列番号１４のヌクレオチド１から３１１までのヌクレオチド配列を含む、又は、該第２の優良イベントの３’フランキング領域、ここで該３’フランキング領域は配列番号１５のヌクレオチド５０８から１８８０までの相補体のヌクレオチド配列を含む、を認識し、該プライマーの他方のプライマーは、配列番号１４のヌクレオチド３１２からヌクレオチド８１０までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号１５のヌクレオチド１からヌクレオチド５０７までのヌクレオチド配列を含む該第２のイベントの外来性ＤＮＡ内部の配列を認識する、を含む。
ここでまた提供されるものは、２つの優良イベントを含みそして生物学的試料中のグリホセート、グルホシネート及びＨＰＰＤ阻害剤（例えばイソキサフルトール）に対して耐性なトランスジェニックダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫を識別するためのキットであり、該キットは上記特定した第１の優良イベントの５’フランキング領域を認識する１つのプライマー、ここで該５’フランキング領域は配列番号２のヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までのヌクレオチド配列を含む、又は、上記第１の優良イベントの３’フランキング領域を認識する１つのプライマー、ここで該３’フランキング領域は配列番号３のヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの相補体のヌクレオチド配列を含む、及び、該第１の外来性ＤＮＡ内部の配列を認識する１つのプライマー、ここで該外来性ＤＮＡは配列番号２のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号３のヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までのヌクレオチド配列を含む、を含み、そして、該キットは、上記特定した第２の優良イベントの５’フランキング領域を認識する１つのプライマー、ここで該５’フランキング領域は配列番号１２のヌクレオチド１から２０９までのヌクレオチド配列を含む、又は、上記第２の優良イベントの３’フランキング領域を認識する１つのプライマー、ここで該３’フランキング領域は配列番号１３のヌクレオチド５６９から１０００までの相補体のヌクレオチド配列を含む、及び、配列番号１２のヌクレオチド２１０からヌクレオチド７２０までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号１３のヌクレオチド１からヌクレオチド５６８までのヌクレオチド配列を含む該第２のイベントの外来性ＤＮＡ内部の配列を認識する該プライマーの他のプライマー、を含む。
ここでまた提供されるものは、２つの優良イベントを含みそして生物学的試料中のグリホセート、グルホシネート及びＨＰＰＤ阻害剤（例えばイソキサフルトール）に対して耐性なトランスジェニックダイズ植物、又はその細胞、部分、種子又は子孫を識別するためのキットであり、該キットは上記特定した第１の優良イベントの５’フランキング領域を認識する１つのプライマー、ここで該５’フランキング領域は配列番号２のヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までのヌクレオチド配列を含む、又は、上記第１の優良イベントの３’フランキング領域を認識する１つのプライマー、ここで該３’フランキング領域は配列番号３のヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの相補体のヌクレオチド配列を含む、及び、該第１の外来性ＤＮＡ内部の配列を認識する１つのプライマー、ここで該外来性ＤＮＡは配列番号２のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号３のヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までのヌクレオチド配列を含む、を含み、そして、該キットは、上記特定した第２の優良イベントの５’フランキング領域、ここで該５’フランキング領域は配列番号１４のヌクレオチド１から３１１までのヌクレオチド配列を含む、又は、上記第２の優良イベントの３’フランキング領域、ここで該３’フランキング領域は配列番号１５のヌクレオチド５０８から１８８０までの相補体のヌクレオチド配列を含む、を認識する１つのプライマー、及び、配列番号１４のヌクレオチド３１２からヌクレオチド８１０までの相補体のヌクレオチド配列又は配列番号１５のヌクレオチド１からヌクレオチド５０７までのヌクレオチド配列を含む該第２のイベントの外来性ＤＮＡ内部の配列を認識する該プライマーの他のプライマー、を含む。
ここでまた提供されるものは、配列番号２０のヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８までのヌクレオチド配列との少なくとも９７、９８又は少なくとも９９％配列同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号２０のヌクレオチド位置２２５７からヌクレオチド位置１６６０１までのヌクレオチド配列又はその相補体、又は配列番号２０との少なくとも９７、９８又は少なくとも９９％又は９９．５％配列同一性を有するヌクレオチド配列、又はその相補体を含む核酸分子を自身のゲノム中に含み、そしてＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２のヌクレオチド配列との少なくとも９７、９８又は少なくとも９９％又は９９．５％配列同一性を有するヌクレオチド配列、又はその相補体を含む核酸分子を自身のゲノム中に含む、ダイズ植物、植物細胞、組織又は種子、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５８の下に寄託されているＥＥ−ＧＭ１を含むレファレンス種子、及び寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６６０の下に寄託されているＥＥ−ＧＭ２を含むレファレンス種子である。本発明の１つの実施形態において、該植物、植物細胞、組織又は種子におけるＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２のヌクレオチド配列は、配列番号１２又は１３中のＤＮＡ配列（例えば外来性ＤＮＡ配列）、又は配列番号１４又は１５中のＤＮＡ配列（例えば外来性ＤＮＡ配列）、又は配列番号１２の配列の第１のヌクレオチドと配列番号１３の配列の最後のヌクレオチドの間にある配列番号１２及び１３を含む植物ゲノム（例えば本発明のＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２を含む寄託された種子）中のＤＮＡ配列、又は配列番号１４の配列の第１のヌクレオチドと配列番号１５の配列の最後のヌクレオチドの間にある配列番号１４及び１５を含む植物ゲノム中のＤＮＡ配列である。
本発明の１つの実施形態は、配列番号２０のヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８までのヌクレオチド配列又はその相補体にハイブリダイズするか、又は、配列番号２０のヌクレオチド配列又はその相補体にハイブリダイズする核酸分子を自身のゲノム内に含み、そして、ＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２のヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸分子を自身のゲノム内に含む、ダイズ植物、植物細胞、組織又は種子、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５８の下に寄託されているＥＥ−ＧＭ１を含むレファレンス種子、及び寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６６０の下に寄託されているＥＥ−ＧＭ２を含むレファレンス種子である。本発明の１つの実施形態において、該植物、植物細胞、組織又は種子におけるＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２のヌクレオチド配列は、配列番号１２又は１３中の外来性ＤＮＡ配列、又は配列番号１４又は１５中の外来性ＤＮＡ配列、又は配列番号１２の配列の第１のヌクレオチドと配列番号１３の配列の最後のヌクレオチドの間にある配列番号１２及び１３を含む植物ゲノム（例えば本発明のＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２を含む寄託された種子）中の外来性ＤＮＡ配列、又は配列番号１４の配列の第１のヌクレオチドと配列番号１５の配列の最後のヌクレオチドの間にある配列番号１４及び１５を含む植物ゲノム中の外来性ＤＮＡ配列である。
以下の実施例は記載した特異的実施形態に本発明を限定する意図はなく、以下に示す参照により本明細書に組み込まれる添付の図面との関連において理解してよい。
図１は優良イベントＥＥ−ＧＭ３に関する引用したヌクレオチド配列とプライマーの間の関係の模式図である。黒色バー：外来性ＤＮＡ；線影バー：植物起源のＤＮＡ；チェッカー柄の矢印（ａ）:キメラＨＰＰＤ ＰＦＷ３６６コード遺伝子（キメラ遺伝子の組成については表１参照）；線影矢印（ｂ）：キメラ２ｍＥＰＳＰＳコード遺伝子（キメラ遺伝子の組成については表１参照）；黒矢印：オリゴヌクレオチドプライマー、バー下の数字はヌクレオチド位置を示す；（ｃ）は示したヌクレオチド配列の相補体を指す；注記：スキームは正確な縮尺で描かれていない。 図２はＥＥ−ＧＭ３に関して開発されたＰＣＲ識別プロトコルにより得られた結果を示す。ゲルにロードした配列：レーン１：分子量マーカー（１００ｂｐラダー）；レーン２及び３：トランスジェニックイベントＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物に由来するＤＮＡ試料；レーン４〜７：優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含まないが同じ除草剤耐性遺伝子を含む(他の形質転換イベント）トランスジェニックダイズ植物に由来するＤＮＡ試料；レーン８：野生型ダイズに由来するＤＮＡ試料；レーン９：無鋳型ＤＮＡ対照；レーン１０：分子量マーカー。 図３は優良イベントＥＥ−ＧＭ１に関する引用したヌクレオチド配列とプライマーの間の関係の模式図である。黒色バー：外来性ＤＮＡ；線影バー：植物起源のＤＮＡ；水平ストライプ矢印（ｄ）：キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子（キメラ遺伝子の組成に関しては配列番号１１参照）；黒矢印：オリゴヌクレオチドプライマー、バー下の数字はヌクレオチド位置を示す；（ｃ）は示したヌクレオチド配列の相補体を指す；注記：スキームは正確な縮尺で描かれていない。 図４は優良イベントＥＥ−ＧＭ２に関する引用したヌクレオチド配列とプライマーの間の関係の模式図である。黒色バー：外来性ＤＮＡ；線影バー：植物起源のＤＮＡ；水平ストライプ矢印（ｄ）：キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子（キメラ遺伝子の組成に関しては配列番号１１参照）；黒矢印：オリゴヌクレオチドプライマー、バー下の数字はヌクレオチド位置を示す；（ｃ）は示したヌクレオチド配列の相補体を指す；ＮＡ：適用外；注記：スキームは正確な縮尺で描かれていない。 図５はＥＥ−ＧＭ１に関して開発されたPCR 識別を示す。ゲルにロードした配列：レーン１：トランスジェニックイベントＥＥ−ＧＭ１を含むダイズ植物に由来するＤＮＡ試料；レーン２：優良イベントＥＥ−ＧＭ１を含まないトランスジェニックダイズ植物に由来するＤＮＡ試料；レーン３：野生型ダイズ植物に由来する対照ＤＮＡ試料；レーン４：無鋳型対照；レーン５：分子量マーカー。 図６はＥＥ−ＧＭ２に関して開発されたPCR 識別を示す。ゲルにロードした配列：レーン１：トランスジェニックイベントＥＥ−ＧＭ２を含むダイズ植物に由来するＤＮＡ試料；レーン２：優良イベントＥＥ−ＧＭ２を含まないトランスジェニックダイズ植物に由来するＤＮＡ試料；レーン３：野生型ダイズ植物に由来する対照ＤＮＡ試料；レーン４：無鋳型対照；レーン５：分子量マーカー。
植物ゲノム中の組み換えＤＮＡ分子の取り込みは典型的には細胞又は組織の形質転換から生じる。取り込みの特異的部位は通常はランダムな組み込みによる。
組み換えＤＮＡ又は「形質転換ＤＮＡ」による植物の細胞又は組織の形質転換の結果として植物ゲノム中に導入され、そしてそのような形質転換ＤＮＡを起源とするＤＮＡを本明細書においては、以後、「導入遺伝子」の１つ以上を含む「外来性ＤＮＡ」と称する。ＥＥ−ＧＭ３の導入遺伝子はグリホセート及びＨＰＰＤ阻害剤の除草剤耐性遺伝子である。本発明の文脈における「植物ＤＮＡ」は形質転換された植物を起源とするＤＮＡを指すことになる。植物ＤＮＡは通常は相当する野生型植物中の同じ遺伝子座に存在することになる。外来性ＤＮＡは植物ゲノム中の組み換えＤＮＡ分子の取り込みの部位における箇所及び配置により特徴付けることができる。組み換えＤＮＡが挿入されている植物ゲノム中の部位はまた、「挿入部位」又は「標的部位」とも称される。「前挿入植物ＤＮＡ」と称される植物ゲノムの領域内への組み換えＤＮＡの挿入は、「標的部位欠失」と称される植物ＤＮＡの欠失に関連する場合がある。「フランキング領域」又は「フランキング配列」とは本明細書においては、導入されたＤＮＡとは異なるＤＮＡ、好ましくは外来性ＤＮＡの直近上流にありそれに隣接して、又は直近下流にありそれと隣接して所在している植物ゲノム由来のＤＮＡの少なくとも２０ｂｐ、好ましくは少なくとも５０ｂｐ、そして５０００ｂｐまでの配列を指す。外来性ＤＮＡのランダムな組み込みをもたらす形質転換操作法は各形質転換体に特徴的でありユニークな、異なるフランキング領域を有する形質転換体をもたらすことになる。組み換えＤＮＡを伝統的な交雑を介して植物中に導入する場合、その植物ゲノム内の挿入部位、又はそのフランキング領域は一般的には変化しない。
「単離された核酸（配列）」又は「単離されたＤＮＡ（配列）」とは、本明細書においては、既に天然環境にはない核酸又はＤＮＡ（配列）を指し、それは、例えば別の細菌宿主中、又は植物ゲノム中の核酸配列、又は別の起源のＤＮＡ又は核酸に融合された核酸又はＤＮＡからは単離されている。
イベントは遺伝子工学の結果として、目的の遺伝子のコピー又は目的の遺伝子少なくとも１つを含む外来性ＤＮＡ又は導入遺伝子を担持する（人工の）遺伝子座として定義される。イベントの典型的な対立遺伝子状態は外来性ＤＮＡの存在又は非存在である。イベントは導入遺伝子の発現により表現型として特徴化される。遺伝子レベルにおいては、イベントは植物の遺伝子メイクアップの部分である。分子レベルにおいては、イベントは制限地図（例えばサザンブロッティングにより決定される）により、導入遺伝子の上流及び／又は下流のフランキング配列、分子マーカーの箇所及び／又は導入遺伝子の分子配置により特徴付けることができる。通常は目的の遺伝子の少なくとも１つを含む形質転換ＤＮＡを用いた植物の形質転換は各々がユニークである別個のイベントの多くを含む形質転換体の集団をもたらす。イベントは外来性ＤＮＡ及び少なくとも１つのフランキング配列により特徴付けられる。
優良イベントとは、本明細書においては、導入遺伝子の発現及び安定性、及び、それを含む植物の最適な作物学的特性とのその適合性に基づいて、同じ形質転換ＤＮＡを用いた形質転換により得られるイベントの群から選択されるイベントである。即ち、優良イベント選択の基準は下記、即ち：
ａ）外来性ＤＮＡの存在が、植物の他の所望の特性、例えば作物学的性能に関するもの又は商業的価値を犠牲にしないこと；
ｂ）安定に受け継がれ、そしてそのアイデンティティーの管理のための適切なツールを開発することのできる十分定義された分子配置によりイベントが特徴付けられること；
ｃ）イベントを担持する植物が通常の作物学的使用において曝露される可能性のある環境条件の範囲において商業的に許容できるレベルで、イベントのヘテロ接合（又は半接合）及びホモ接合条件の両方において、正確、適切及び安定な空間的及び時間的な表現型の発現を目的の遺伝子が示すこと；
の１つ以上、好ましくは２つ以上、好都合には全てである。
外来性ＤＮＡは、所望の商業的遺伝子背景内への容易な遺伝子移入を可能にする植物ゲノム中の位置に会合していることが好ましい。
優良イベントとしてのイベントのステータスは種々異なる関連遺伝子背景における優良イベントの遺伝子移入及び上記したａ）、ｂ）及びｃ）等の基準等の１つ、２つ又は全てへの準拠が見られることにより、確認される。
即ち「優良イベント」は上記した基準に合致する外来性ＤＮＡを含む遺伝子座を指す。植物、植物性物質又は子孫、例えば種子は、そのゲノム中に優良イベント１つ以上を含むことができる。
優良イベント又は優良イベントを含む植物又は植物性物質を識別するために開発されたツール、又は、優良イベントを含む植物性物質を含む製品は、優良イベントの特異的ゲノム特性、例えば外来性ＤＮＡ、分子マーカー又は外来性ＤＮＡのフランキング領域の配列を含むゲノムの領域の特異的制限地図に基づく。
外来性ＤＮＡのフランキング領域の一方又は両方が配列決定された後、分子生物学的手法を用いて試料の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）中のこの（これらの）配列を特異的に認識するプライマー及びプローブを開発することができる。例えば、生物学的試料（例えば植物、植物性物質又は植物性物質を含む製品のような試料）中の優良イベントを識別するためにＰＣＲ法を開発することができる。そのようなＰＣＲは、一方が優良イベントの５’又は３’フランキング領域内部の配列を認識し、そして他方が外来性ＤＮＡ内部の配列を認識する少なくとも２つの特異的「プライマー」に基づく。プライマーは好ましくは、最適化されたＰＣＲ条件下において、優良イベントの５’又は３’フランキング領域内部の配列及び優良イベントの外来性ＤＮＡをそれぞれ「特異的に認識する」、１５〜３５ヌクレオチドの配列を有することにより、特異的フラグメント（「組み込みフラグメント」又は判別アンプリコン）が優良イベントを含む核酸試料から増幅される。このことは、ターゲティングされた組み込みフラグメントのみが、植物ゲノム又は外来性ＤＮＡ中の如何なる他の配列をも排して、最適ＰＣＲ条件下に増幅されることを意味している。
ＥＥ−ＧＭ３の識別のために適するＰＣＲプライマーは以下の通りである。即ち：
− 自身の３’末端において５’フランキング配列（配列番号２のヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１まで）における植物ＤＮＡから選択される少なくとも１７連続ヌクレオチド、好ましくは２０連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む１７ｎｔから約２００ｎｔまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド（５’フランキング配列を認識するプライマー）；又は、
− 自身の３’末端において３’フランキング配列（配列番号３のヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの相補体）における植物ＤＮＡから選択される少なくとも１７連続ヌクレオチド、好ましくは２０連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む１７ｎｔから約２００ｎｔまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド（３’フランキング配列を認識するプライマー）；又は、
− 自身の３’末端において挿入されたＤＮＡ配列（配列番号２のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの相補体）から選択される少なくとも１７連続ヌクレオチド、好ましくは２０連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む１７ｎｔから約２００ｎｔまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド（外来性ＤＮＡを認識するプライマー）；又は、
− 挿入されたＤＮＡ配列（配列番号３のヌクレオチド１からヌクレオチド２４０まで）から選択される少なくとも１７連続ヌクレオチド、好ましくは２０連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む１７ｎｔから約２００ｎｔまでの長さの範囲のオリゴヌクレオチド；又は、
− 挿入されたＤＮＡフラグメント又はその相補体（配列番号１又は配列番号２０のヌクレオチド位置１４５２から１６６３８まで）から選択される少なくとも１７連続ヌクレオチド、好ましくは２０連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む１７ｎｔから約２００ｎｔまでの長さの範囲の適当なオリゴヌクレオチド。
プライマーは当然ながら記載した１７連続ヌクレオチドより長くてもよく、そして例えば２０、２１、３０、３５、５０、７５、１００、１５０、２００ｎｔ又は更に長くてもよい。プライマーはフランキング配列及び外来性ＤＮＡの配列の記載したヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列より完全になるものであってよい。しかしながら、自身の５’末端（即ち３’にある１７連続ヌクレオチドの外側）のプライマーのヌクレオチド配列の厳密性はより低い。即ち、プライマーの５’配列は、適宜、外来性ＤＮＡのフランキング配列から選択されるヌクレオチド配列を含むか、それよりなってよいが、数個（例えば１、２、５又は１０個）のミスマッチを含んでよい。プライマーの５’配列は寧ろ完全に、外来性ＤＮＡのフランキング配列とは無関係のヌクレオチド配列、例えば制限酵素認識部位の１つ以上を示すヌクレオチド配列であってよい。そのような無関係の配列又はミスマッチを有するフランキングＤＮＡ配列は好ましくは１００を超えない、より好ましくは５０、更には２５ヌクレオチドより長くならないはずである。
更に又、適当なプライマーは植物ＤＮＡ由来配列と外来性ＤＮＡ配列の間の接合領域（ＥＥ−ＧＭ３に関しては配列番号２のヌクレオチド１４５１〜１４５２及び配列番号３のヌクレオチド２４０〜２４１に所在する）に渡る自身の３’末端におけるヌクレオチド配列を含むかそれより本質的になってよいが、ただし、記載した３’にある１７連続ヌクレオチドは配列番号２又は３における外来性ＤＮＡ又は植物由来配列の何れかからのみに由来するものではない。
当業者にはまた明らかであるが、適切に選択されたＰＣＲプライマー対は相互に相補である配列を含んではならない。
本発明の目的のためには「配列番号Ｘに示すヌクレオチド配列の相補体」とはＣｈａｒｇａｆｆの規則に従ってヌクレオチドをその相補ヌクレオチドと置き換えること（Ａ⇔Ｔ；Ｇ⇔Ｃ）、及び、配列を５’から３’の方向に、即ち示されたヌクレオチド配列の逆方向に読むことにより、示されたヌクレオチド配列から誘導できるヌクレオチド配列である。
ＥＥ−ＧＭ３のため適当なプライマーの例は、配列番号５（３’フランキング配列認識プライマー）、配列番号４（３’フランキング配列認識プライマーと共に使用するための外来性ＤＮＡ認識プライマー）、又は配列番号７（３’フランキング配列認識プライマーと共に使用するための外来性ＤＮＡ認識プライマー）のオリゴヌクレオチド配列である。
ＥＥ−ＧＭ３のための適当なオリゴヌクレオチドプライマーの他の例は、自身の３’末端に次の配列を含むか、又はそのような配列より（本質的に）なるものである。
ａ．５’フランキング配列認識プライマー：
− 配列番号２のヌクレオチド２６４からヌクレオチド２８３までのヌクレオチド配列
− 配列番号２のヌクレオチド２６６からヌクレオチド２８５までのヌクレオチド配列
− 配列番号２のヌクレオチド１２４０からヌクレオチド１２５９までのヌクレオチド配列
− 配列番号２のヌクレオチド２６５からヌクレオチド２８５までのヌクレオチド配列
− 配列番号２のヌクレオチド２６５からヌクレオチド２８３までのヌクレオチド配列
− 配列番号２のヌクレオチド１２３９からヌクレオチド１２５９までのヌクレオチド配列
− 配列番号２のヌクレオチド１２４１からヌクレオチド１２５９までのヌクレオチド配列
− 配列番号２のヌクレオチド１２４４からヌクレオチド１２６３までのヌクレオチド配列
− 配列番号２のヌクレオチド１２４８からヌクレオチド１２６７までのヌクレオチド配列
− 配列番号２のヌクレオチド１２５０からヌクレオチド１２６９までのヌクレオチド配列
− 配列番号２のヌクレオチド２６２からヌクレオチド２７９までのヌクレオチド配列
− 配列番号２のヌクレオチド２６３からヌクレオチド２７９までのヌクレオチド配列
− 配列番号２のヌクレオチド２６４からヌクレオチド２８５までのヌクレオチド配列
− 配列番号２のヌクレオチド２６６からヌクレオチド２８３までのヌクレオチド配列
− 配列番号２のヌクレオチド１２３８からヌクレオチド１２５９までのヌクレオチド配列
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− 配列番号３のヌクレオチド１９７からヌクレオチド２１８までのヌクレオチド配列
− 配列番号３のヌクレオチド２０１からヌクレオチド２１８までのヌクレオチド配列
− 配列番号３のヌクレオチド２０１からヌクレオチド２２０までのヌクレオチド配列
− 配列番号３のヌクレオチド２００からヌクレオチド２２０までのヌクレオチド配列
− 配列番号３のヌクレオチド１９９からヌクレオチド２２０までのヌクレオチド配列
− 配列番号３のヌクレオチド２００からヌクレオチド２２１までのヌクレオチド配列
− 配列番号３のヌクレオチド１９９からヌクレオチド２２１までのヌクレオチド配列
− 配列番号３のヌクレオチド１５０からヌクレオチド１７２までのヌクレオチド配列
ＥＥ−ＧＭ１の識別のために適するＰＣＲプライマーは国際特許出願ＷＯ２００６／１０８６７４、特に８ページ４行目から２６ページ７行目に記載されている（参照により本明細書に組み込まれる）。
ＥＥ−ＧＭ２の識別のために適するＰＣＲプライマーは国際特許出願ＷＯ２００６／１０８６７５、特に８ページ４行目から３３ページ４行目に記載されている（参照により本明細書に組み込まれる）。
本明細書においては、「Ｘ位からＹ位までの配列番号Ｚのヌクレオチド配列」とは両方のヌクレオチド終点を包含するヌクレオチド配列を指す。
好ましくは、増幅されたフラグメントは５０〜５００ヌクレオチドの長さ、例えば１００〜３５０ヌクレオチドの長さを有する。特異的プライマーはそれぞれ優良イベントの５’又は３’フランキング領域及び優良イベントの外来性ＤＮＡ内部の配列と８０〜１００％同一である配列を有してよいが、ただし、ミスマッチはなお、最適なＰＣＲ条件下これらのプライマーによる優良イベントの特異的な識別を可能としなければならない。しかしながら許容可能なミスマッチの範囲は実験的に容易に決定でき、そして当該分野で知られている。
組み込みフラグメントの検出は種々の態様において、例えばゲル分析後のサイズ推定を介して行うことができる。組み込みフラグメントは又直接配列決定してもよい。増幅されたＤＮＡフラグメントの検出のための他の配列特異的方法も当該分野で知られている。
プライマーの配列及びそれらのゲノム内の相対的箇所は優良イベントにユニークであるため、組み込みフラグメントの増幅は優良イベント（の核酸）を含む生物学的試料においてのみ起こることになる。好ましくは、未知試料中のＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２の存在を識別するためのＰＣＲを実施する場合、イベントの植物種の「ハウスキーピング遺伝子」内のフラグメントが増幅できるプライマーのセットの対照品を含める。ハウスキーピング遺伝子は大部分の細胞型内で発現され、そして全ての細胞に共通した基礎代謝活動に関与する遺伝子である。好ましくは、ハウスキーピング遺伝子から増幅されるフラグメントは増幅される組み込みフラグメントよりも大型のフラグメントである。分析すべき試料に応じて他の対照品も包含させることができる。
標準ＰＣＲプロトコルは当該分野において、例えば「PCR Application Manual」(Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999)及び他の参考文献に記載されている。特異的プライマーの配列を包含するＰＣＲのための最適条件は各優良イベントに関する「PCR(またはPolymerase Chain Reaction)識別プロトコル」中に特定されている。しかしながら、ＰＣＲ識別プロトコル中のパラメーターの数は特異的実験室条件に対して調節する必要がある場合があり、そして、類似の結果を得るためには僅かに変更してよいと理解される。例えばＤＮＡの調製のための異なる方法の使用は、例えばプライマーの量、ポリメラーゼ及び使用するアニーリング条件の調節を必要とする場合がある。同様に他のプライマーの選択はＰＣＲ識別プロトコルのための他の最適条件を支配する場合がある。しかしながらこれらの調節は当業者には明らかであり、そして上記引用したもののような現在のPCRアプリケーションマニュアルに更に詳述されている。
或いは、生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を識別するための「特異的プローブ」として使用できる組み込みフラグメントを増幅するために特異的プライマーを用いることができる。生物学的試料中の核酸を、核酸中の相当するフラグメントとのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブに接触させることにより、核酸／プローブハイブリッドの形成がもたらされる。このハイブリッドの形成は検出可能であり（例えば核酸又はプローブの標識を介して）、これによりこのハイブリッドの形成がＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２の存在を示す。特異的プローブとのハイブリダイゼーションに基づくこのような識別方法（固相担体上又は溶液中の何れか）は当該分野で知られている。特異的プローブは好ましくは、最適条件下、優良イベントの５’又は３’フランキング領域内部であり、そして好ましくはそれに隣接する外来性ＤＮＡの部分も含んでいる領域に特異的にハイブリダイズする配列である。好ましくは、特異的プローブは特異的領域のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは８０〜８５％、より好ましくは８５〜９０％、特に好ましくは９０〜９５％、最も好ましくは９５％〜１００％同一（又は相補）である５０〜５００ｂｐ、好ましくは１００〜３５０ｂｐの配列を含む。好ましくは、特異的プローブは優良イベントの特異的領域に同一（又は相補）である約１５から約１００の隣接ヌクレオチドの配列を含むことになる。
更に又、ＰＣＲ系増幅方法とは異なる優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又は優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２に特異的な検出方法もまた本明細書に記載した優良イベント特異的配列情報を用いて開発できる。そのような代替的な検出方法はＩｎｖａｄｅｒＴＭテクノロジーとしても知られている特異的核酸構造の侵襲的切断に基づくリニアシグナル増幅検出方法を包含する（例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許５、９８５、５５７号 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", ６、００１、５６７号 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage"に記載）。この方法によるＥＥ−ＧＭ３検出のために、標的配列はヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１４６９までの配列番号２のヌクレオチド配列又はその相補体を含む標識された第１の核酸オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチド２２３からヌクレオチド２４０までの配列番号３のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該標識核酸プローブにハイブリダイズされ、そして更に、ヌクレオチド１４３４からヌクレオチド１４５１までの配列番号２のヌクレオチド配列又はその相補体を含む標識された第２の核酸オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチド２４１からヌクレオチド２５８までの配列番号３のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該標識核酸プローブにハイブリダイズされ、ここで、第１及び第２のオリゴヌクレオチドはヌクレオチドの少なくとも１つで重複する。このハイブリダイゼーションにより生じるデュプレックス又はトリプレックスの構造は標的配列を未損傷としたまま酵素（Cleavase（登録商標））による選択的プローブ切断を可能とする。切断された標識プローブはその後、潜在的には更なるシグナル増幅をもたらす中間的工程を介して検出される。この方法によるＥＥ−ＧＭ１検出のために、標的配列はヌクレオチド２１０からヌクレオチド２２７までの配列番号１２のヌクレオチド配列又はその相補体を含む標識された第１の核酸オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチド５６１からヌクレオチド５６８までの配列番号１３のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該標識核酸プローブにハイブリダイズされ、そして更に、ヌクレオチド１９２からヌクレオチド２０９までの配列番号１２のヌクレオチド配列又はその相補体を含む標識された第２の核酸オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチド５６９からヌクレオチド５８６までの配列番号１３のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該標識核酸プローブにハイブリダイズされ、ここで、第１及び第２のオリゴヌクレオチドはヌクレオチドの少なくとも１つで重複する。このハイブリダイゼーションにより生じるデュプレックス又はトリプレックスの構造は標的配列を未損傷としたまま酵素（Cleavase（登録商標））による選択的プローブ切断を可能とする。切断された標識プローブはその後、潜在的には更なるシグナル増幅をもたらす中間的工程を介して検出される。この方法によるＥＥ−ＧＭ２検出のために、標的配列はヌクレオチド３１２からヌクレオチド３２９までの配列番号１４のヌクレオチド配列又はその相補体を含む標識された第１の核酸オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチド４９０からヌクレオチド５０７までの配列番号１５のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該標識核酸プローブにハイブリダイズされ、そして更に、ヌクレオチド２９４からヌクレオチド３１１までの配列番号１４のヌクレオチド配列又はその相補体を含む標識された第２の核酸オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチド５０８からヌクレオチド５２５までの配列番号１５のヌクレオチド配列又はその相補体を含む該標識核酸プローブにハイブリダイズされ、ここで、第１及び第２のオリゴヌクレオチドはヌクレオチドの少なくとも１つで重複する。このハイブリダイゼーションにより生じるデュプレックス又はトリプレックスの構造は標的配列を未損傷としたまま酵素（Cleavase（登録商標））による選択的プローブ切断を可能とする。切断された標識プローブはその後、潜在的には更なるシグナル増幅をもたらす中間的工程を介して検出される。
「キット」とは本明細書においては、本発明の方法、より特記すれば生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３の識別、又はＥＥ−ＧＭ３含有植物性物質の接合生殖性の測定を実施する目的のための試薬のセットを指す。より特記すれば、本発明のキットの好ましい実施形態は優良イベントの識別のための上記した少なくとも１つ又は２つの特異的プライマー、又は、接合生殖性ステータスの測定のための３つの特異的プライマーを含む。場合により、キットはＰＣＲ識別プロトコルにおいて本明細書に記載した何れかの他の試薬を更に含むことができる。あるいは、本発明の別の実施形態によれば、キットは生物学的試料の核酸に特異的にハイブリダイズしてその中のＥＥ−ＧＭ３の存在を識別する上記した特異的プローブを含むことができる。場合により、キットは更に、特異的プローブを用いる生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ３の識別のための何れかの他の試薬（例えば限定しないがハイブリダイゼーション緩衝液、標識）を含むことができる。
品質管理（例えば種子ロットの純度）、植物性物質、又は例えば限定しないが食品又は飼料製品のような植物性物質を含むかそれより誘導された物質の中の優良イベントの存在又は非存在の検出を目的として、本発明のキットを使用することができ、そしてその成分を特別に調節することができる。
本明細書においては、ヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に関する「配列同一性」とは配列の２つのうち短い方のヌクレオチドの数で同じヌクレオチドを有する位置の数を割ったものを指す。ヌクレオチド配列の２つのアライメントはWilbur and Lipmannのアルゴリズム（Wilbur and Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:726）により、ウインドウサイズ２０ヌクレオチド、ワードレングス４ヌクレオチド及びギャップペナルティー４を用いて実施される。上記した配列アライメントを包含する配列データのコンピューター支援の分析及び解釈は、例えばGenetics Computer Group (GCG, University of Wisconsin Biotechnology Center)の配列分析ソフトウエアパッケージを用いながら簡便に実施してよい。配列は、その配列が少なくとも約７５％、特に少なくとも約８０％、より特記すれば少なくとも約８５％、非常に特記すれば少なくとも約９０％、とりわけ少なくとも約９５％、よりとりわけ少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する場合に、「本質的に類似」と示される。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と本質的に類似であるか、又はある程度の配列同一性を有すると言われる場合、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）はＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等しいと考えられることは明らかである。更に又、僅かな相違又は突然変異は経時的にＤＮＡ配列中に生じる場合があること、そして、一部のミスマッチは本発明のイベント特異的プライマー又はプローブに関しては許容できることは明らかであり、そのため、本発明の何れかの３’又は５’フランキングＤＮＡに関する、又は何れかのインサート又は外来性ＤＮＡ又はプライマー又はプローブに関する本発明の何れかの実施形態において本明細書に示した何れかのＤＮＡ配列もまた、本明細書に提示した配列と本質的に類似の配列、例えば本発明の何れかの３’又は５’フランキングＤＮＡについて、又は何れかのプライマー又はプローブについて、又は、何れかのインサート又は外来性ＤＮＡについて与えられる配列に、ハイブリダイズするか、又はそれと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列も包含する。
「プライマー」という用語は、本明細書においては、ＰＣＲのような鋳型依存性のプロセスにおいて新生核酸の合成をプライミングすることができる如何なる核酸も包含する。典型的には、プライマーは１０から３０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列も使用できる。プライマーは１本鎖型が好ましいが、２本鎖型で提供しても良い。
プローブはプライマーとして使用できるが、標的ＤＮＡ又はＲＮＡに結合するように設計され、そして増幅プロセスにおいて使用しなくても良い。
「認識する」という用語は本明細書においては、特異的プライマーが、方法において示される条件（ＰＣＲ識別プロトコルの条件等）の下に、優良イベント中の核酸配列に特異的にハイブリダイズし、これにより陽性および陰性対照の存在により特異性を決定できるという事実を指す。
「ハイブリダイズする」という用語は本明細書においては、特異的プローブに言及している場合は、プローブが、標準的なストリンジェンシー条件下に優良イベントの核酸配列中の特異的領域に結合するという事実を指す。標準的なストリンジェンシー条件とは、本明細書においては、本明細書に記載するハイブリダイゼーションのための条件、又は、Sambrook et.al.,1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)により記載されるような従来のハイブリダイズ条件を指し、それは例えば以下の工程、即ち：１）フィルター上に植物ゲノムＤＮＡフラグメントを固定化すること、２）１から２時間、４２℃において、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬及び０．１％ＳＤＳ中、又は１から２時間、６８℃において６×ＳＳＣ、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬及び０．１％ＳＤＳ中、フィルターを予備ハイブリダイズすること、３）標識してあるハイブリダイゼーションプローブを添加すること、４）１６から２４時間インキュベートすること、５）２０分間室温で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でフィルターを洗浄すること、６）２０分間、各々６８℃において０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でフィルターを３回洗浄すること、及び、７）フィルターを２４から４８時間、×線フィルムに−７０℃において増感紙を用いて露光することを含むことができる。
本明細書においては、生物学的試料は植物、植物性物質又は植物性物質を含む製品の試料である。「植物」という用語は、何れかの段階の成熟度にあるダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）植物組織、並びに何れかのそのような植物から採取した、或いは誘導した何れかの細胞、組織、又は器官、例えば限定しないが、何れかの種子、葉、幹、花、根、単細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物又はプロトプラストを包含することを意図している。「植物性物質」とは、本明細書においては、植物から得られる、又は誘導される物質を指す。植物性物質を含む製品は、植物性物質を用いて生産されるか、又は植物性物質により汚染される場合がある食品、飼料又は他の製品に関する。本発明の文脈においては、そのような生物学的試料は試料中の核酸の存在を意味するＥＥ−ＧＭ３、ＥＥ−ＧＭ１及びＥＥ−ＧＭ２に対して特異的な核酸の存在に関して試験される。即ち生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を識別するための本明細書において言及する方法は、優良イベントを含む核酸の生物学的試料中の識別に関する。
本明細書においては、「含む」とは、明示された特徴、整数、工程、試薬又は成分を示されるとおりに特定するものとして解釈されるべきであるが、１つより多い特徴、整数、工程又は成分、又はその群の存在又は追加を排除するものではない。即ち、例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸の配列を含む核酸又は蛋白は実際に挙げられているものよりも多くのヌクレオチド又はアミノ酸を含んでよく、即ち、より大きい核酸又は蛋白に包埋されていて良い。機能的又は構造的に定義されているＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子は、追加的なＤＮＡ配列、例えばプロモーター及び転写終止配列を含んでよい。
本発明は又、ダイズにおける優良イベントＥＥ−ＧＭ３及び優良イベントＥＥ−ＧＭ１又は優良イベントＥＥ−ＧＭ３及び優良イベントＥＥ−ＧＭ２のスタック（stack）の発生、これらのイベントのスタックを含む植物、これらの植物から得られる子孫、及び、これらのスタックを含む植物から誘導された植物性物質に関する。優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含む植物は実施例１に記載する通り得ることができる。スタックは従来の繁殖方法を用いて単独イベントを含む植物を交雑すること、及び、２つの異なるイベントを含むその子孫を識別することにより得られる。
ＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を含むダイズ植物又は植物性物質は実施例２におけるＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１に関して記載したＰＣＲ識別プロトコルに従って識別できる。簡潔に言えば、生物学的試料中に存在するダイズゲノムＤＮＡを、配列番号５の配列番号を有するプライマーのようなＥＥ−ＧＭ３の５’又は３’フランキング配列内部の配列を特異的に認識するプライマー及び配列番号４の配列番号を有するプライマーのような外来性ＤＮＡの配列を特異的に認識するプライマーを用い、そして更に、配列番号１６の配列を有するプライマーのようなＥＥ−ＧＭ１の５’又は３’フランキング配列内部の配列を特異的に認識するプライマー及び配列番号１７の配列を有するプライマーのような外来性ＤＮＡの配列を特異的に認識するプライマーを用いたＰＣＲにより増幅する。
ＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含むダイズ植物又は植物性物質は実施例２におけるＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２に関して記載したＰＣＲ識別プロトコルに従って識別できる。簡潔に言えば、生物学的試料中に存在するダイズゲノムＤＮＡを、配列番号５の配列番号を有するプライマーのようなＥＥ−ＧＭ３の５’又は３’フランキング配列内部の配列を特異的に認識するプライマー及び配列番号４の配列番号を有するプライマーのような外来性ＤＮＡの配列を特異的に認識するプライマーを用い、そして更に、配列番号１８の配列を有するプライマーのようなＥＥ−ＧＭ２の５’又は３’フランキング配列内部の配列を特異的に認識するプライマー及び配列番号１９の配列を有するプライマーのような外来性ＤＮＡの配列を特異的に認識するプライマーを用いたＰＣＲにより増幅する。
内因性ダイズ配列の部分を増幅するＤＮＡプライマーをＰＣＲ増幅のための陽性対照として使用する。ＰＣＲ増幅時に物質が予測されたサイズのフラグメントをもたらす場合、物質は優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を保有しているダイズ植物に由来するか、又は優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を保有しているダイズ植物に由来する植物性物質を含有する。
ＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を保有している植物はそれらのグリホセート耐性並びにイソキサフルトールのようなＨＰＰＤ阻害剤に対するそれらの耐性によりそして更にグルホシネートに対するそれらの耐性により、特徴付けられる。イベントスタックを保有している植物は又、除草剤適用の非存在下でダイズの市販品種と同等の作物学的特性を有することにより特徴付けられる。本明細書に記載したダイズ植物ゲノムの挿入領域における外来性ＤＮＡの存在は、このイベントを含む植物に対して、特に有利な表現型及び分子の特性を付与する。
本発明の１つの実施形態は、ダイズゲノム中の特異的箇所における導入遺伝子の挿入により得ることができるダイズ植物中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１及び／又はＥＥ−ＧＭ２の組み合わせをもたらし、その優良イベントはそのようなダイズ植物に対して、グリホセート、グルホシネート及びイソキサフルトールのようなＨＰＰＤ阻害剤除草剤に対する耐性を与え、そしてその場合、そのような優良イベントは同遺伝子系の系統と比較してそのようなダイズ植物の収量に悪影響するそのダイズの作物学的性能に対する如何なる作用も誘発しない（本明細書においては、「同遺伝子系の系統」又は「近同遺伝子系の系統」とは、同じ遺伝子的背景であるが導入遺伝子を欠いているダイズの系統、例えば形質転換のために使用される植物と同じ遺伝子的背景の植物、又は導入遺伝子を失っている分離姉妹系統である）。特に、本発明は、ダイズ植物のゲノム中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１及び／又はＥＥ−ＧＭ２の挿入又は存在が、同遺伝子系の系統と比較してそのようなダイズ植物において増大した易罹患性を誘発せず、収量障害を誘発せず、又は増大した倒伏を誘発しない、そのダイズ植物中の該優良イベントの組み合わせを提供する。従って、本発明は同遺伝子系の系統と比較してダイズ植物の収量に悪影響を及ぼすことなくグリホセート、グルホシネート及びＨＰＰＤ阻害剤除草剤の適用（同時又は別途）に耐性できるそのようなダイズ植物をもたらすＥＥ−ＧＭ３およびＥＥ−ＧＭ１及び／又はＥＥ−ＧＭ２と標記されるダイズ植物中の優良イベントの組み合わせを提供し、そのダイズ植物は同遺伝子系のダイズ植物とそれらの易罹患性又は倒伏性において統計学的有意差を有さない。これらの特性は本発明の優良イベントの組み合わせをダイズ圃場におけるグリホセート耐性雑草の抑制のために極めて有利なものとしており、そしてダイズ圃場における更なるグリホセート抵抗性の発生を防止又は遅延させる手法においても使用できる（例えばダイズ圃場に対して適用される除草剤の作用の少なくとも２つ又は更には３つの異なる様式を確保する、グリホセート及びイソキサフルトール及び／又はグルホシネートの適用によるか、又は、イソキサフルトール及びグリホセート及び／又はグルホシネートの適用によるか、又は、グルホシネート及びグリホセート及び／又はイソキサフルトールの適用による）。
本明細書においてまた提供されるものは、イベントＥＥ−ＧＭ３を含む代表的なダイズ種子がＮＣＩＭＢアクセッション番号４１６５９の下に寄託されている、優良イベントＥＥ−ＧＭ１を含む代表的なダイズ種子がアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５８の下にＮＣＩＭＢに寄託されている、優良イベントＥＥ−ＧＭ２を含む代表的な種子がアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６６０の下にＮＣＩＭＢに寄託されている、イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を含む代表的なダイズ種子がアクセッション番号ＰＴＡ−１１０４１の下にＡＴＣＣに寄託されている、そして、イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含む代表的なダイズ種子がアクセッション番号ＰＴＡ−１１０４２の下にＡＴＣＣに寄託されている、イベントＥＥ−ＧＭ３及び優良イベントＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２を含むダイズ植物又はその部分である。
ＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含むダイズ植物又はその部分は、当該分野で知られている何れかの手段を介してそれぞれの寄託種子中に検出できるそれぞれの優良イベントを組み合わせることにより、例えば寄託種子由来の植物を交雑させ、その子孫を収集し、そして優良イベントの適切な組み合わせを含む子孫植物を識別することにより得てよい。
本明細書において更に提供されるものは、そのようなイベントを含むそのような植物の種子、並びにそのような種子から生産されるダイズ製品であり、ここで該ダイズ製品はイベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２を含む。そのようなダイズ製品は穀粉、粉砕種子、粉末食品、フレーク等であるか、それを含むことができる。特にそのようなダイズ製品はイベントＥＥ−ＧＭ３及び優良イベントＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２に対して診断的なアンプリコンを生産する核酸を含み、そのようなアンプリコンは配列番号２又は３、配列番号１４又は１５、及び／又は配列番号１２又は１３を含む。また本明細書において提供されるものはイベントＥＥ−ＧＭ３及び優良イベントＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２を含むダイズ種子を得ること、及び、それからダイズ製品を生産することを含む、そのようなダイズ製品を製造するための方法である。
また本明細書において提供されるものは、上記ダイズ植物の何れかの子孫であり、そしてイベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２を含む、ダイズ植物である。
本明細書において更に提供されるものは、特に、イベントＥＥ−ＧＭ３を含む第１のダイズ植物をＥＥ−ＧＭ１及び／又はＥＥ−ＧＭ２を含むダイズ植物と交雑すること、及び、グリホセート及び／又はグルホシネート及び／又はイソキサフルトールに対して耐性である子孫植物を選択することにより、イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２をダイズ植物のゲノム内に導入することを含む、グリホセート及び／又はグルホシネート及び／又はイソキサフルトール除草剤に対して耐性であるそのような植物を製造するための方法である。
また本明細書において提供されるものは、特に収量障害を伴わず、そして２ｍＥＰＳＰＳ、ＨＰＰＤ及びＰＡＴ蛋白を含む許容可能な作物学的特性を有し、そしてイベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２に対して診断的なアンプリコンを生成することができるグリホセート及びグルホシネート及び／又はイソキサフルトール耐性植物である。
本明細書において更に提供されるものは、圃場をイソキサフルトール系、グリホセート系、及び／又は、グルホシネート系の除草剤の有効量で処理することを含む、イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含むダイズ植物の圃場又はそのようなダイズ植物を植栽するべき圃場における雑草を抑制するための方法であり、この場合、そのような植物はそのような除草剤に対して耐性である。
本明細書において更に提供されるものは、配列番号２のヌクレオチド１４３１から１４７２までと少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列及び配列番号３のヌクレオチド２２０から２６１までと少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、又は該配列の相補体、そして更に配列番号１２のヌクレオチド１１９から２２０までと少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列及び配列番号１３のヌクレオチド５５８から５７９までと少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、又は該配列の相補体を自身の細胞のゲノム内に含むことにより特徴付けられる、ＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を含むダイズ植物、細胞、組織又は種子である。
本明細書において更に提供されるものは、配列番号２のヌクレオチド１４３１から１４７２までと少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列及び配列番号３のヌクレオチド２２０から２６１までと少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、又は該配列の相補体、そして更に配列番号１４のヌクレオチド３０１から３２２までと少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列及び配列番号１５のヌクレオチド４９７から５１８までと少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、又は該配列の相補体を自身の細胞のゲノム内に含むことにより特徴付けられる、ＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含むダイズ植物、細胞、組織又は種子である。
「イソキサフルトール」という用語は本明細書においては、除草剤イソキサフルトール［即ち(5-シクロプロピル−4−イソキサゾリル）[2-(メチルスルホニル)-4-(トリフルオロメチル）フェニル］メタノン］、その活性代謝産物、ジケトニトリル、及び該化合物を含む何れかの混合物又は溶液を指す。本発明のイベントを含む植物への適用のために有用なＨＰＰＤ阻害剤除草剤はジケトニトリル、例えば２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−４−トリフルオロメチルフェニル）−プロパン−１，３−ジオン及び２−シアノ−１−ｌ４−（メチルスルホニル）−２−トリフルオロメチルフェニル］−３−（１−メチルシクロプロピル）プロパン−１，３−ジオン；他のイソキサゾール類；及びピラゾリネート類、例えばトプラメゾン［即ち［３−（４，５−ジヒドロ−３−イソキサゾリル）−２−メチル−４−（メチルスルホニル）フェニル］（５−ヒドロキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾル−４−イル）メタノン］、及びピラスルホトール［（５−ヒドロキシ−１，３−ジメチルピラゾル−４−イル（２−メシル−４−トリフルオロメチルフェニルフェニル）メタノン］；又はピラゾフェン［２−［４−（２，４−ジクロロベンゾイル）−１，３−ジメチルピラゾル−５−イルオキシ］アセトフェノン］である。
本発明の１つの実施形態においてＥＥ−ＧＭ３イベントを含有するダイズ植物を植栽するべき圃場は、ダイズ植物を植栽するか、又は種子を播く前に、イソキサフルトール（ＩＦＴ）のようなＨＰＰＤ阻害剤除草剤で処理することができ、これによりＨＰＰＤ阻害剤により殺傷される雑草を圃場から駆逐し、これにより無耕作業が可能となり、続いて、同じ予備処理された圃場に後日ダイズを植栽するか播種できるようになる（ＨＰＰＤ阻害剤除草剤を用いたバーンダウン適用）。ＩＦＴの残存活性もまた早期生育段階において雑草による競合から出芽成長中のダイズ植物を保護することになる。ダイズ植物があるサイズを有し、そして雑草が再出現の傾向を見せるようになった後、グリホセート又はＨＰＰＤ阻害剤−グリホセート混合物を植物の上面に出芽後除草剤として適用することができる。
本発明の別の実施形態においては、ＥＥ−ＧＭ３イベントを含有する種子を播種する圃場を、ダイズ植物が出芽する前であるが種子を播種した後に、ＩＦＴのようなＨＰＰＤ阻害剤除草剤で処理することができ（圃場は他の手段、典型的には鍬入れ、鋤き入れ、又は種子床作成のような従来の耕作作業を用いて播種前に無雑草とすることができる）、その場合、残存活性により圃場は除草剤により殺傷された雑草が存在しない状態に維持されることになり、これにより出芽成長中のダイズ植物は雑草と競合しない（ＨＰＰＤ阻害剤除草剤の出芽前適用）。ダイズ植物があるサイズを有し、そして雑草が再出現の傾向を見せるようになった後、グリホセート又はＨＰＰＤ阻害剤−グリホセート混合物を植物の上面に出芽後除草剤として適用することができる。
本発明の別の実施形態においては、ＥＥ−ＧＭ３イベントを含有するダイズ植物は播種された種子から出芽しているダイズ植物の上面にＩＦＴのようなＨＰＰＤ阻害剤除草剤で処理することができ、これによりＨＰＰＤ阻害剤により殺傷される雑草を圃場から駆逐し、この適用は植物の上面への出芽後除草剤としてグリホセートの処理と共に（例えばスプレータンクミックス中で）、その後、又はそれに先立って行うことができる（ＨＰＰＤ阻害剤除草剤の出芽後適用（グリホセート併用又は無併用））。
更に又本発明によれば、ＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２を保有するダイズ植物は以下の殺虫剤、除草剤又は殺カビ剤で処理してよく、或いは、ＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２を保有するダイズ種子は以下の殺虫剤、除草剤又は殺カビ剤を含む種子コーティング剤でコーティングして良い。
ダイズ除草剤：
アラクロル、ベンタゾン、トリフラリン、クロリムロン−エチル、クロランスラム−メチル、フェノキサプロプ、フォメサフェン、フルアジホップ、グリフォセート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、（Ｓ）メトラクロル、メトリブジン、ペンジメタリン、テプラロキシジム、イソキサフルトール、グルホシネート。
ダイズ殺虫剤：
ラムダ−シハロスリン、メトミル、パラチオン、チオカルブ、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマネクチン−ベンゾエート、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルスリン、ガンマおよびラムダシハロスリン、4-[[(6-クロルピリジン-3-イル)メチル](2,2-ジフルオロエチル)アミノ]フラン-
2(5H)-オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、ベータ−シフルスリン。
ダイズ殺カビ剤：
アゾキシストロビン、シプロコナゾール、エポキシコナゾール、フルトリアフォル、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、テトラコナゾール。
以下の実施例は優良イベントＥＥ−ＧＭ３、ＥＥ−ＧＭ１及びＥＥ−ＧＭ２及びイベントＥＥ−ＧＭ３とＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３とＥＥ−ＧＭ２のスタックを含有する植物の識別、及び、生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３、ＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２及びこれらのスタックの特異的識別のためのツールの開発を記載している。
実施例においては、特段の記載が無い限り、全ての組み換え手法は「Sambrook 1 and Russell DW (eds.) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York" and in "Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K (eds.) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York」に記載されているような標準的なプロトコルに従って実施した。
標準物質及びレファレンスは「Croy RDD (ed.) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford and Blackwell Scientific Publications, Oxford" and in "Brown TA, (1998) Molecular Biology LabFax, 2nd Edition, Academic Press, San Diego」に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための標準物質及び方法は「McPherson MJ and M¢ller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford" and in "PCR Applications Manual, 3rd Edition (2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim or www.roche-applied-science.com」に記載されている。
以下の実施例におけるＰＣＲプロトコルのようないずれかの実験室プロトコルにおける多くのパラメーターは特異的実験室条件に合わせることが必要な場合があり、そして類似の結果を得るために僅かに変更してよいと理解しなければならない。例えばＤＮＡの調製のための異なる方法の使用又はＰＣＲ法における他のプライマーの選択が、ＰＣＲプロトコルに関する他の最適な条件を支配する場合がある。しかしながらこれらの調節は当業者には明らかであり、そして現在のＰＣＲ適用マニュアルに更に詳述されている。
説明及び例においは以下の配列を参照する。
配列番号１：ベクターｐＳＦ１０のＳａｌＩフラグメントヌクレオチド配列
配列番号２：ＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡにフランキングしている５’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号３：ＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡにフランキングしている３’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号４：プライマーＳＯＹ０２８
配列番号５：プライマーＳＯＹ０２９
配列番号６：プライマーＳＭＰ１８７
配列番号７：プライマーＳＴＶ０１９
配列番号８：アンプリコンのヌクレオチド配列
配列番号９：対照フラグメントの増幅のためのプライマー１（ＳＯＹ０１）
配列番号１０：対照フラグメントの増幅のためのプライマー２（ＳＯＹ０２）
配列番号１１：ｐＢ２／Ｐ３５ＳＡｃＫのヌクレオチド配列
配列番号１２：ＥＥ−ＧＭ１の外来性ＤＮＡにフランキングしている５’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号１３：ＥＥ−ＧＭ１の外来性ＤＮＡにフランキングしている３’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号１４：ＥＥ−ＧＭ２の外来性ＤＮＡにフランキングしている５’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号１５：ＥＥ−ＧＭ２の外来性ＤＮＡにフランキングしている３’領域を含むヌクレオチド配列
配列番号１６：プライマーＳＯＹ０６
配列番号１７：プライマーＳＯＹ０７
配列番号１８：プライマーＳＯＹ０９
配列番号１９：プライマーＳＯＹ０１０
配列番号２０：ＥＥ−ＧＭ３の外来性ＤＮＡ及び植物フランキング配列のヌクレオチド配列
配列番号２１：プライマーＳＨＡ１３０
配列番号２２：プライマーＳＨＡ１７８
１． 除草剤耐性遺伝子によるGlycine maxの形質転換
１．１ 2mEPSPS及びHPPD-Pf-W336キメラ遺伝子を含む外来性ＤＮＡの説明
プラスミドｐＳＦ１０は約７，３ｋｂのＳａｌＩフラグメント上に所在するキメラ2mepsps遺伝子及びキメラhppd-Pf-W336遺伝子を含有するｐＵＣ１９由来クローニングベクターである。２つのＳａｌ１制限部位の間に含まれるＤＮＡの完全な説明を以下の表１に示す。ヌクレオチド配列は配列番号１に示す。
Figure 0006470705
１．２ イベントＥＥ−ＧＭ３
約７．３ｋｂのＨＰＬＣ精製ＳａｌＩ線状化ｐＳＦ１０フラグメント（２ｍＥＰＳＰＳグリホセート耐性遺伝子及びＨＰＰＤ阻害剤耐性遺伝子ＨＰＰＤ−Ｐｆ−Ｗ３３６を含有する）を用いてダイズＪａｃｋ種の細胞内への直接遺伝子転移（Nickell, C. D., G. R. Noel, D. J. Thomas, and R. Waller. Registration of 'Jack' soybean. Crop Sci 1365. 30.1990）、ついで、形質転換された植物細胞をトランスジェニック繁殖性ダイズ植物に再生することにより、形質転換されたダイズ植物を得た。
１．２．１ エリートイベントＥＥ−ＧＭ３の同定
優良イベントＥＥ−ＧＭ３は除草剤耐性遺伝子の良好な発現及び安定性に基づいて広範な選択手順に基づいて選択し、そして、植物の草丈、節までの高さ、起立性、活力、種子収量のような最適な作物学的特性とのその適合性を評価した。このイベントを含有するダイズ植物は同じキメラ遺伝子を用いて得られた種々異なる形質転換イベントの広範な範囲から選択した。本イベントの選択において使用したパラメーターは、以下の通り、即ち：ａ）圃場試験におけるイソキサフルトール除草剤適用への許容可能な耐性、ｂ）圃場試験におけるグリホセート除草剤適用への許容可能な耐性、ｃ）圃場試験におけるイソキサフルトール及びグリホセートの複合適用への許容可能な耐性、ｄ）ベクター骨格の非存在下におけるダイズ植物ゲノムの単一の遺伝子座における除草剤耐性導入遺伝子の挿入、ｅ）形質転換のために使用する親植物と類似の全体的作物性（成熟性、倒伏性、易罹患性等）、及び、ｆ）形質転換ＤＮＡの挿入により生じる顕著な収量障害が無いこと（同じ条件下に生育させた形質転換に使用した植物系統のようなイベントを有さない同遺伝子系の系統と比較して）とした。
Ｔ３世代において、ダイズ形質転換優良イベントＥＥ−ＧＭ３のホモ接合系統を種子生産用に選択した。多箇所反復の作物学的圃場試験を親品種であるＪａｃｋの順応の領域において実施した。圃場評価は除草剤耐性及び作物学的性能を包含させた。ＥＥ−ＧＭ３を含む植物の作物学的性能はＪａｃｋに匹敵することがわかった（除草剤を適用しない場合）。圃場評価は又、ＥＥ−ＧＭ３イベントを担持する植物が以下のもの：
− Ｊａｃｋと比較して類似の植物形態及び種子特性、
− Ｊａｃｋと比較してダイズの病気に対して変化が無いこと、及び、
− Ｊａｃｋと比較して種子の発芽又は休眠に変化が無いこと、
を有することを示していた。
グリーンハウス中初回形質転換体（Ｔ０）植物（イベントＥＥ−ＧＭ３を生産するようにコンストラクトで形質転換された植物）から収穫した種子（Ｔ１又はＳ１世代）を圃場に植栽した。３ブロックに植栽し、そして０、２又は４ｋｇ／ｈａのグリホセートを噴霧した。除草剤グリホセートに対して所望のレベルの耐性を呈している植物から種子を収穫した。
圃場に生育した自己受粉したＴ１植物から収穫した種子（Ｔ２世代）を「一個体一列（ｐｌａｎｔ ｔｏ ｒｏｗ）」となるように播種した。列の分離データ（完全又は部分的に耐性）及び列内部の個体植物（耐性性又は感受性）のカイ自乗分析は、ＥＥ−ＧＭ３の単一の挿入の予測されたメンデル遺伝を示している。
選択及び種子増大は、系統が形質転換イベントＥＥ−ＧＭ３に関してホモ接合であると決定され、そして第４世代におけるコア種子生産のために選択されるまで継続した。次に、Ｔ５世代の種子を種々の品種の開発のための候補として使用した。第６世代（Ｔ６世代）の植物を、商業用ダイズ生殖質により広範にイベントを移動させるように設計された遺伝子移入プログラムにおいて従来のダイズ繁殖系統と交雑させた。Ｆ１雑種植物（ＥＥ−ＧＭ３系統ｘ従来系統）を成熟するまで生育させ、そしてＦ２種子を植栽した。９０１Ｆ２植物の葉試料をＥＥ−ＧＭ３インサートの接合生殖性を識別するために設計されたＰＣＲプライマーにより分析した。メンデルの法則による単一挿入分離に関する１：２：１の予測比が観察された。
選択されたイベントＥＥ−ＧＭ３を種々異なる商業的遺伝子背景において導入し、そして種々異なる箇所における圃場試験の結果を比較した。種々異なる処理を用いながらグリホセート除草剤及び／又はイソキサフルトール除草剤で植物を攻撃した。植物は良好な除草剤耐性を示した。イベントＥＥ−ＧＭ３を含有する数百種の異なるダイズ栽培品種を遺伝試験において使用し、そして除草剤を適用した。この試行から選択された系統を後に圃場で増大させ、そして類似に除草剤で処理した。その試行から、５０の選択された系統を増大させ、そしてこれらもまた除草剤処理した。イソキサ フルトール及びグリホセートを噴霧した後者の系統に関する植物毒性評点は応答においてある程度の変動性を示したが、系統間の応答の範囲は同じ処理及び環境の条件下に生育させた元のＪａｃｋの背景におけるＥＥ−ＧＭ３イベントの４反復に渡って観察されたとおり類似の変動性を示していた。従って広範な生殖質に渡る該当除草剤に対する耐性がＥＥ−ＧＭ３を含む植物で観察された。
更に又、イベントＥＥ−ＧＭ３を含有する植物は正常な葉、花及び鞘の形態、優れた繁殖性を示し、そして多数の遺伝子的背景において疾患又は異常な昆虫への感受性を示さなかった。多数の遺伝子的背景内への遺伝子移入の間、異変の問題や異常は観察されなかった。
１季節において、１０箇所の試験を設計することにより、形質転換親品種Ｊａｃｋ及び幾つかの非トランスジェニックのダイズ栽培品種への形質転換イベントＥＥ−ＧＭ３を含む二重除草剤耐性ダイズの作物学的性能を比較した。無作為完全ブロック設計を用いながら、ＥＥ−ＧＭ３植物を従来の雑草制御によるか、又は意図する除草剤であるグリホセート及びイソキサフルトールを用いながら、重複の区画において生育させた。形質転換イベントＥＥ−ＧＭ３を含有するダイズ植物の区画にイソキサフルトール除草剤を目標比率７０グラムａｉ／Ｈａで、そしてグリホセート除草剤を目標比率１０６０グラムａｉ／Ｈａで噴霧した。除草剤適用は、概ねＶ４−Ｖ５の植物成長段階において葉面噴霧としてこれらの植物に対して行った。作物学的観察は、季節の早期、中期及び後期の季節に実施した。植物密度（パラメーター；起立数）はＪａｃｋ及び非トランスジェニックの品種の区画のほうが、イベントＥＥ−ＧＭ３区画よりも、１標準偏差分高値であった。早期の起立数の差は種子ロットの品質の結果であったと考えられ、その理由は、ＥＥ−ＧＭ３植栽種子は逆季節苗床において生産され、非トランスジェニック品種の種子は隣接した合衆国通常生産季節に生産されたためである。しかしながら、５０％出芽及び植物活力格付けを達成するための日数は同じであり、種子ロットがそれらの性能パラメーターに関しては同等であることを示していた。後期の季節の起立数においては、Ｊａｃｋ及び非トランスジェニック品種はＥＥ−ＧＭ３植物とは１標準偏差分異なったままであった。ＥＥ−ＧＭ３イベント植物の区画収量はやはり１標準偏差分Ｊａｃｋのものよりも低値であり、恐らくはＥＥ−ＧＭ３イベント区画の低い植物密度の結果であると考えられた。非トランスジェニック品種の収量は、より最近の品種において観察される収穫力における進歩から予測される通り、Ｊａｃｋよりも高値であった。
１つの試行において、植物健康状態格付けは３つの生育段階、即ちＶ４−５、Ｒ１及び完全成熟において行った。初回評価は意図する除草剤適用後、早期に実施した。最終植物健康状態評価の時点において、両方の除草剤を噴霧されたＥＥ−ＧＭ３含有植物は未噴霧Ｊａｃｋ植物、又はＥＥ−ＧＭ３を含む未噴霧植物と同じ評点を有していた。作物学的担当者による格付けにおいて、除草剤噴霧植物はＶ４−５及びＲ１の植物生育段階において３〜４（中等度の傷害）の健康状態格付けを受けた。未噴霧の植物（未形質転換Ｊａｃｋ又はＥＥ−ＧＭ３含有ダイズ植物）は４．６〜４．８に格付けされた（格付け５は無傷害を意味する）。最終植物健康状態格付け時には、全ての区画が同じ格付け５（無傷害）を受けた。
１試行季節は並外れた降雨の季節であり、意図する除草剤の後のＥＥ−ＧＭ３植物における作物傷害は他の季節で観察されたものより明白であった。圃場評価は又、健常性（繁殖、疾患抵抗性、肥沃度、種子分散性、休眠状態、永続性）のモニタリングを包含していた。繁殖特性、即ち出芽までの日数、５０％開花までの日数、及び９０％鞘成熟までの日数に関しては、ＥＥ−ＧＭ３及びＪａｃｋ植物は差がなかった。植物疾患及び害虫の天然の蔓延に対する反応においては差は観察されなかった。ＥＥ−ＧＭ３はＪａｃｋより低値の究極的収量をもたらしたが、肥沃度（１００種重量）における差は観察されなかった。種子分散パラメーターの検定（鞘崩壊及び植物倒伏）においては、ＥＥ−ＧＭ３及びＪａｃｋは同じ鞘崩壊評点を有していたが、ＥＥ−ＧＭ３植物が倒伏しにくかった。１０箇所から収穫された種子の評価では発芽又は休眠状態の試験により生じた懸念はなかった。
並外れた降雨のあった季節の間のこれらの試行の間、ＥＥ−ＧＭ３植物の最終収量は雑草抑制処理に関わらず１標準偏差分Ｊａｃｋより低値であった（恐らくはＥＥ−ＧＭ３イベント区画のより低値の植物密度の結果）。並外れた湿潤季節においては、作物傷害（作物区域の１０〜３０％において白化）がグリホセート及びイソキサフルトール除草剤の葉面適用後６週間までＥＥ−ＧＭ３区画では報告された。しかしながら、成熟時までに、「無傷害」の植物の健康状態の格付けは全ての区画に割り付けられた。優良ダイズ栽培品種背景において遺伝子移入されたＥＥ−ＧＭ３を用いた重複多数箇所圃場試行は、導入遺伝子を含有しない近−同遺伝子系の姉妹系統と比較して、イベントＥＥ−ＧＭ３を含有する植物と近−同遺伝子系の系統の間に収量の差がないことを示すと期待される（除草剤処理の非存在下）。
更に又、重複圃場試行において、ＩＦＴ（７０グラムａｉ／ｈａ＋０．５％ＮＩＳ，Ａｇｒｉｄｅｘ）で出芽前又は出芽後に処理した場合に、顕著な作物耐性（１０％未満の白化）がＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物で観察されたが、別のＨＰＰＤ阻害剤除草剤であるピラスルフォトール（３５グラムａｉ／ｈａ＋０．５％ＮＩＳ，Ａｇｒｉｄｅｘ）の出芽後適用により処理した場合に、ＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物でまた顕著な作物耐性（１０％未満の白化）が観察された。
１．２．２ フランキング領域及び優良イベントＥＥ−ＧＭ３の外来性ＤＮＡの識別
ＥＥ−ＧＭ３優良イベントにおける除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡにフランキングする領域の配列を以下の通り決定した。
１．２．２．１． 右（５’）フランキング領域
５’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号２に示す。ヌクレオチド１〜１４５１の配列は植物ＤＮＡに相当し、ヌクレオチド１４５２〜１８４３の配列は外来性ＤＮＡに相当する。
１．２．２．２． 左（３’）フランキング領域
３’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号３に示す。ヌクレオチド１〜２４０の配列は外来性ＤＮＡに相当し、ヌクレオチド２４１〜１４０８の配列は植物ＤＮＡに相当する。
１．２．２．３． ＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ
種々異なる分子手法を用いて除草剤耐性遺伝子を含む優良イベントＥＥ−ＧＭ３の外来性ＤＮＡがヘッドトゥーヘッド（head to head）方向の２つの部分的３’ヒストンＡｔ配列とそれに続くヘッドトゥーテイル（head to tail）方向に配置したｐＳＦ１０のＳａｌＩフラグメントの２つのほぼ完全なコピーを含有することが決定されている（図１参照）。
即ち、ＥＥ−ＧＭ３の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡは順次以下の配列を含有する。
−ヌクレオチド１からヌクレオチド１９９まで：配列番号１のｎｔ６７６０からｎｔ６９５８までのヌクレオチド配列の相補体に相当するヌクレオチド配列；
−ヌクレオチド２００からヌクレオチド６２４まで：配列番号１のｎｔ６８７４からｎｔ７２９８までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列；
−ヌクレオチド６２５からヌクレオチド７９０９まで：配列番号１のｎｔ７からｎｔ７２９１までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列；
−ヌクレオチド７９１０からヌクレオチド１５１６３まで：配列番号１のｎｔ１２からｎｔ７２６５までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列；及び、
−ヌクレオチド１５１６４からヌクレオチド１５１８７まで：配列番号３のｎｔ２１７からｎｔ２４０までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列（この配列はｐＳＦ１０プラスミドＤＮＡ又はｗｔ植物ＤＮＡの何れにも相当せず、従ってフィラーＤＮＡと標記する）。
本外来性ＤＮＡは、直近上流において外来性ＤＮＡと隣接して、配列番号２のヌクレオチド１から１４５１までの５’フランキング配列により先行されており、そして、直近下流において外来性ＤＮＡと隣接して、配列番号３のヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの３’フランキング配列により後続されている。
ＥＥ−ＧＭ３中の外来性ＤＮＡ及びフランキングＤＮＡ配列の確認された完全ＤＮＡ配列決定によれば、配列番号２０に報告されている配列が得られている。この配列において、挿入されたＤＮＡはヌクレオチド位置１４５２からヌクレオチド位置１６６３８であり、そしてヘッドトゥーテイル方向に配置したｐＳＦ１０由来の２つのほぼ完全なコピーはヌクレオチド位置２２５７からヌクレオチド位置１６６０１である。配列番号２０の５’フランキングＤＮＡ配列は配列番号２０のヌクレオチド位置１からヌクレオチド位置１４５１までの配列であり、配列番号２０の３’フランキングＤＮＡ配列は配列番号２０のヌクレオチド位置１６６３９からヌクレオチド位置１７８０６までの配列である。
１．３．ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼキメラ遺伝子を含む外来性ＤＮＡの説明
プラスミドｐＢ２／Ｐ３５ＳＡｃＫはキメラｐａｔ遺伝子を含有するｐＵＣ１９誘導クローニングベクターである。ベクターの説明は以下の表２に示す。そのヌクレオチド配列は配列番号１１に示す。
Figure 0006470705
１．４ イベントＥＥ−ＧＭ１
１．４．１ ＥＥ−ＧＭ１の識別
除草剤抵抗性ダイズは直接遺伝子転移を用いながらベクターｐＢ２／Ｐ３５ＳＡｃＫを用いる大豆の形質転換により発生させた。
優良イベントＥＥ−ＧＭ１は除草剤抵抗性遺伝子の良好な発現及び安定性及び最適作物学的特性とのその適合性に基づいて広範な選択手順に基づいて選択した。
１．４．２ 優良イベントＥＥ−ＧＭ１のフランキング領域及び外来性ＤＮＡの識別
１．４．２．１． 右（５’）フランキング領域
５’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号１２に示す。ヌクレオチド１〜２０９の配列は植物ＤＮＡに相当し、ヌクレオチド２１０〜７２０の配列は外来性ＤＮＡに相当する。
１．４．２．２． 左（３’）フランキング領域
３’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号１３に示す。ヌクレオチド１〜５６８の配列は外来性ＤＮＡに相当し、ヌクレオチド５６９〜１０００の配列は植物ＤＮＡに相当する。
１．４．２．３． ＥＥ−ＧＭ１の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ
種々異なる分子手法を用いて除草剤耐性遺伝子を含む優良イベントＥＥ−ＧＭ１の外来性ＤＮＡが直接リピート構造においてキメラｐａｔ遺伝子のコピー２つを含むことが決定されている（図３参照）。
即ち、ＥＥ−ＧＭ１の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡは順次以下の配列を含有する。
−ヌクレオチド１からヌクレオチド３１２２まで：配列番号１１のｎｔ３４０からｎｔ３４６１までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列；
−ヌクレオチド３１２３からヌクレオチド３４５８まで：配列番号１１のｎｔ１からｎｔ３３６までのヌクレオチド配列の相補体に相当するヌクレオチド配列；
−ヌクレオチド３４５９からヌクレオチド４０７３まで：配列番号１１のｎｔ３４６２からｎｔ４０７６までのヌクレオチド配列の相補体に相当するヌクレオチド配列；
−ヌクレオチド４０７４からヌクレオチド６７８０まで：配列番号１１のｎｔ３３７からｎｔ３０４３までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列；及び、
−ヌクレオチド６７８１からヌクレオチド６７９０まで：配列番号１３のｎｔ５５９からｎｔ５６８までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列（この配列はプラスミドＤＮＡ又はｗｔ植物ＤＮＡの何れにも相当せず、従ってフィラーＤＮＡと標記する）。
ＥＥ−ＧＭ１の本外来性ＤＮＡは、直近上流において外来性ＤＮＡと隣接して、配列番号１２のヌクレオチド１から２０９までの５’フランキング配列において先行されており、そして、直近下流において外来性ＤＮＡと隣接して、配列番号１３のヌクレオチド５６９からヌクレオチド１０００までの３’フランキング配列において後続されている。
１．５．イベントＥＥ−ＧＭ２
除草剤抵抗性ダイズは直接遺伝子転移を用いながらベクターｐＢ２／Ｐ３５ＳＡｃＫを用いる大豆の形質転換により発生させた。
優良イベントＥＥ−ＧＭ２は除草剤抵抗性遺伝子の良好な発現及び安定性及び最適作物学的特性とのその適合性に基づいて広範な選択手順に基づいて選択した。
１．５．１ 優良イベントＥＥ−ＧＭ２のフランキング領域及び外来性ＤＮＡの識別
１．５．１．１． 右（５’）フランキング領域
５’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号１４に示す。ヌクレオチド１〜３１１の配列は植物ＤＮＡに相当し、ヌクレオチド３１２〜８１０の配列は外来性ＤＮＡに相当する。
１．５．１．２． 左（３’）フランキング領域
３’フランキング領域を含むと識別されるフラグメントを配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列を配列番号１５に示す。ヌクレオチド１〜５０７の配列は外来性ＤＮＡに相当し、ヌクレオチド５６９〜１８８０の配列は植物ＤＮＡに相当する。
１．５．１．３． ＥＥ−ＧＭ２の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡ
種々異なる分子手法を用いて除草剤耐性遺伝子を含む優良イベントＥＥ−ＧＭ２の外来性ＤＮＡがキメラｐａｔ遺伝子のコピー１つを含むことが決定されている（図４参照）。
即ち、ＥＥ−ＧＭ２の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡは順次以下の配列を含有する。
−ヌクレオチド１からヌクレオチド３９１まで：配列番号１１のｎｔ３４５８からｎｔ３８４８までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列；及び、
−ヌクレオチド３９２からヌクレオチド３４３６まで：配列番号１１のｎｔ４１３からｎｔ３４５７までのヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列。
ＥＥ−ＧＭ２の本外来性ＤＮＡは、直近上流において外来性ＤＮＡと隣接して、配列番号１４のヌクレオチド１から３１１までの５’フランキング配列において先行されており、そして、直近下流において外来性ＤＮＡと隣接して、配列番号１５のヌクレオチド５０８からヌクレオチド１８８０までの３’フランキング配列において後続されている。
２．ＥＥ−ＧＭ３に関するポリメラーゼ連鎖反応識別プロトコルの開発
２．１. プライマー
優良イベント内部の配列を認識する特異的プライマーを開発した。
ＥＥ−ＧＭ３の３’フランキング領域内部の配列を認識するプライマーを開発した。次に第２のプライマーを、外来性ＤＮＡの配列内部において、プライマーが約２６３ヌクレオチドの配列に渡るように選択した。以下のプライマーがＥＥ−ＧＭ３ＤＮＡ上のＰＣＲ反応において特に明確で再現性のある結果をもたらすことがわかった。
SOY028: 5'-ATC.gCT.TTA.ACg.TCC.CTC.Ag -3 (配列番号 4)(標的:インサートDNA)
SOY029: 5' -CAA.ggC.CTC.gAg.ATT.ATC -3'(配列番号 5）(標的: 植物DNA)
内因性配列をターゲティングするプライマーは好ましくはＰＣＲカクテルに包含される。これらのプライマーは未知試料において、そしてＤＮＡ陽性対照において、内部対照として使用される。内因性プライマー対を用いた場合の陽性結果（４１３ｂｐのＰＣＲ増幅フラグメントの存在）は発生させるべきＰＣＲ産物のためのゲノムＤＮＡ調製において十分な品質のアンプルＤＮＡがあることを示している。内因性プライマーは以下の内因性アクチンダイズ遺伝子を認識するように選択した。
SOY01 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT -3' (配列番号 9)
SOY02 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC -3' (配列番号 10)
２．２．増幅されるフラグメント
ＰＣＲ反応で予測される増幅されるフラグメントは以下の通りである。
プライマー対SOY01-SOY02の場合:４１３ｂｐ（内因性対照）
プライマー対SOY028-SOY029の場合:２６３ｂｐ（ＥＥ−ＧＭ３優良イベント）
２．３．鋳型ＤＮＡ
鋳型ＤＮＡはEdwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991)に従ってリーフパンチ葉片から調製した。他の方法で調製したＤＮＡを使用する場合、鋳型の種々異なる量を利用するテストランを実施しなければならない。通常はゲノム鋳型ＤＮＡ５０ｎｇが最良の結果をもたらす。
２．４．割り付ける陽性及び陰性対照
誤った陽性又は陰性を回避するためには以下の陽性及び陰性対照がＰＣＲランに包含されなければならない。
− マスターミックス対照（ＤＮＡ陰性対照）。これは反応にＤＮＡを加えないＰＣＲである。予測される結果であるＰＣＲ産物無しが観察される場合、これはＰＣＲカクテルに標的ＤＮＡが混在していなかったことを指す。
− ＤＮＡ陽性対照（トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムＤＮＡ試料）。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にＰＣＲがランされたことを示す。
− 野生型ＤＮＡ対照。これは与えられた鋳型ＤＮＡが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムＤＮＡであるＰＣＲである。予測される結果であるトランスジェニックＰＣＲ産物の増幅無し、ただし内因性ＰＣＲ産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムＤＮＡ試料中に検出可能な導入遺伝子のバックグラウンド増幅が無いことを示している。
２．５．ＰＣＲ条件
最適な結果は以下の条件下に得られた（最適な結果のための種々の条件を記載する場合、そのような条件の例を与えることを意味する。当然ながら当業者は条件、試薬及びパラメーターを変更する場合があり、例えば他のＴａｑポリメラーゼを用いて所望の結果を達成しても良い）。
−２５μｌ反応用ＰＣＲミックスは下記のものを含有する。
２０ｎｇ鋳型ＤＮＡ
２．５μＬの１０ｘ増幅緩衝液（Ｔａｑポリメラーゼの製造元により供給）
０．５μＬの１０ｍＭｄＮＴＰ類
０．４μＬのＳＯＹ０１（１０ピコモル／μＬ）
０．４μＬのＳＯＹ０２（１０ピコモル／μＬ）
０．７μＬのＳＯＹ０２８（１０ピコモル／μＬ）
０．７μＬのＳＯＹ０２９（１０ピコモル／μＬ）
０．１μＬのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５単位／μＬ）
２５μＬ定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
９５℃４分間
次いで： ９５℃１分間
５７℃１分間
７２℃２分間
５サイクル
次いで： ９２℃３０秒
５７℃３０秒
７２℃１分間
２５サイクル
次いで： ７２℃１０分間
２．６．アガロースゲル分析
ＰＣＲの結果を最適に可視化するために、ＰＣＲ試料１０〜２０μＬを適切な分子量マーカー（例えば１００ｂｐラダーＰｈａｒｍａｃｉａ）と共に１．５％アガロースゲル（Ｔｒｉｓホウ酸塩緩衝液）上にアプライしなければならないとした。
２．７．結果の検証
単一のＰＣＲラン及び単一のＰＣＲカクテルの内部におけるトランスジェニック植物ＤＮＡ試料から得られたデータは、１）ＤＮＡ陽性対照が予測されたＰＣＲ産物（トランスジェニック及び内因性のフラグメント）を示し、２）ＤＮＡ陰性対照がＰＣＲ増幅に関して陰性（フラグメント無し）であり、そして３）野生型ＤＮＡ対照が予測された結果（内因性フラグメント増幅）を示すことが成立しない限り許容してはならないとした。
上記したＥＥ−ＧＭ３に関するＰＣＲ識別プロトコルに従った場合、予測されるサイズのトランスジェニック及び内因性ＰＣＲ産物の目視可能な量を示すレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡの調製元の相当する植物がＥＥ−ＧＭ３優良イベントを受け継いでいることを示している。トランスジェニックＰＣＲ産物の何れかの目視可能な量を示さず、そして内因性ＰＣＲ産物の目視可能な量を示しているレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡの調製元の相当する植物が優良イベントを含まないことを示している。内因性およびトランスジェニックのＰＣＲ産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムＤＮＡの質及び／又は量がＰＣＲ産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムＤＮＡ調製は繰り返されなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなＰＣＲランを実施しなければならない。
２．８．ＥＥ−ＧＭ３を識別するための判別ＰＣＲプロトコルの使用
未知物のスクリーニングを試みる前に、全ての適切な対照を用いたテストランを実施する。開発されたプロトコルは実験室間で異なる要素のために最適化も必要とするかもしれない（鋳型ＤＮＡ調製、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、プライマーの品質、ｄＮＴＰ類、サーモサイクラー等）。
内因性配列の増幅はプロトコルにおける重要な役割を果たす。１つは既知トランスジェニックゲノムＤＮＡ鋳型における内因性及びトランスジェニックの配列の両方の等モル量を増幅するＰＣＲ及び熱サイクリングの条件を得ることである。ターゲティングされる内因性フラグメントが増幅されない場合、又は、ターゲティングされる配列がアガロースゲル電気泳動で判断した場合に同じ臭化エチジウム染色強度で増幅されない場合は、ＰＣＲ条件の最適化が必要な場合がある。
一部がＥＥ−ＧＭ３を含む多くのダイズ植物に由来する葉材料を上記したプロトコルに従って試験した。優良イベントＥＥ−ＧＭ３由来及びダイズ野生型由来の試料をそれぞれ陽性及び陰性対照として採取した。
図２は多くのダイズ植物試料上のＥＥ−ＧＭ３に関して、優良イベントＰＣＲ識別プロトコルを用いて得られた結果を示す。レーン２及び３の試料は２６３ｂｐのバンドが検出されていることから優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含有することがわかり、レーン４〜８の試料はＥＥ−ＧＭ３を含んでいない。レーン６及び７は同じ除草剤耐性キメラ遺伝子を用いて得られた他のダイズ形質転換イベントに由来する試料を含み；レーン８は野生型ダイズ植物由来のＤＮＡを含有し、そしてレーン９は陰性対照（水）試料を示し、レーン１及び１０は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）を示す。
２．９．バルク化種子におけるＥＥ−ＧＭ３検出のためのｄＰＣＲアッセイ
判別ＰＣＲ（ｄＰＣＲ）アッセイをバルク化種子中のＥＥ−ＧＭ３の低レベルの存在を検出するためにセットアップする。非トランスジェニック種子のバルク中のトランスジェニック種子の０．４％（ｗ／ｗ）の最低レベルが反復可能な条件下に良好に検出できた。従って検出限界を０．４％（ｗ／ｗ）と決定した。
以下のプライマーをこの標的ＰＣＲ反応に適用する。
Ｔ−ＤＮＡ配列にターゲティングされたフォワードプライマー：
SHA130 5'- CTA.TAT.TCT.ggT.TCC.AAT.TTA.TC -3' (配列番号l2)
３’フランキング配列にターゲティングされたリバースプライマー：
SMP178 5'- TgA.ggC.ACg.TAT.TgA.TgA.CC- 3'（配列番号13)
これらのプライマーからＰＣＲ反応において予測される増幅されたフラグメントは１１５ｂｐである。
変更したＧｅｎｔｒａ ＰｕｒｅｇｅｎｅＤＮＡ精製抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）に従って粉砕バルク化種子から調製した鋳型ＤＮＡ約２００ｎｇに対して標的ＰＣＲ反応を実施した。他の方法で調製したＤＮＡを使用する場合、ＥＥ−ＧＭ３の既知相対レベルを有する試料を用いたテストランを実施しなければならない。
内因性配列にターゲティングした検証されたレファレンス系のＰＣＲ反応は、理想的には、誤った陰性結果を回避するためにＰＣＲ分析に対するＤＮＡ試料の適性を検証するために、別個のＰＣＲランにおいて実施しなければならない。
未知試験試料に関しては、ＰＣＲ実験は理想的には適切な陽性及び陰性対照試料、即ち如何に記載するものを包含しなければならない。
− マスターミックス対照（ＤＮＡ陰性対照）。これは反応にＤＮＡを加えないＰＣＲである。標的及びレファレンス系の反応の両方に関して予測される結果（ＰＣＲ産物無し）が観察される場合、これはＰＣＲカクテルに標的ＤＮＡが混在していなかったことを指す。
− ＤＮＡ陽性対照（トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムＤＮＡ試料）。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にＰＣＲがランされたことを示す。
− 類似に野生型ＤＮＡ対照をこのＰＣＲに加えることができる。これは与えられた鋳型ＤＮＡが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムＤＮＡであるＰＣＲである。予測される結果であるトランスジェニックＰＣＲ産物の増幅無し、ただし内因性ＰＣＲ産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムＤＮＡ試料中に検出可能な導入遺伝子のバックグラウンド増幅が無いことを示している。
最適な結果は以下の条件下に得られる。
−２５μｌ反応用ＰＣＲミックスは下記のものを含有する。
２００ｎｇの鋳型ＤＮＡ
５μＬの５ｘ反応緩衝液
０．２５μＬの２０ｍＭｄＮＴＰ類
０．７μＬのＳＨＡ１３０（１０ピコモル／Ｌ）
０．４μＬのＳＭＰ１７８（１０ピコモル／Ｌ）
０．１μＬのＧＯ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５単位／Ｌ）
２５μＬ定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
９５℃４分間
次いで： ９５℃１分間
５７℃１分間
７２℃２分間
５サイクル
次いで： ９２℃３０秒
５７℃３０秒
７２℃１分間
３０サイクル
次いで： ７２℃１０分間
ＰＣＲの結果を最適に可視化するために、ＰＣＲ産物２５μＬを適切な分子量マーカー（例えば５０ｂｐラダー）と共に１．５％アガロースゲル（Ｔｒｉｓホウ酸塩緩衝液）上にアプライしなければならないとした。
上記したＰＣＲ法に従う場合、予測されるサイズの標的及びレファレンス系のＰＣＲ産物の目視可能な量を示すレーンはゲノム鋳型ＤＮＡの調製元の被験試料が標的反応の検出限界より高いＥＥ−ＧＭ３優良イベントのレベルを含有していたことを示す。
標的ＰＣＲ産物の目視可能な量を示さないが、レファレンス系ＰＣＲ産物の目視可能な量を示すレーンはゲノム鋳型ＤＮＡの調製元の被験試料が標的反応の検出限界より低いＥＥ−ＧＭ３のレベル優良イベントを含有していたことを示す。
内因性及びトランスジェニックのＰＣＲ産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムＤＮＡの質及び／又は量がＰＣＲ産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムＤＮＡ調製は繰り返されなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなＰＣＲランを実施しなければならない。
３．ＥＥ−ＧＭ３を含む物質の検出のためのプローブとしての特異的組み込みフラグメントの使用
ＥＥ−ＧＭ３の特異的組み込みフラグメントは、配列番号８のヌクレオチド配列を有するアンプリコンをもたらす特異的プライマーＳＯＹ０２８（配列番号４）及びＳＯＹ０２９（配列番号５）を用いたＰＣＲ増幅によるか、又は、化学合成により得られ、そして標識される。この組み込みフラグメントを、生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ３の検出のための特異的プローブとして使用する。核酸は標準的操作法に従って試料から抽出される。次にこの核酸をハイブリッドの形成を可能にするように最適化されたハイブリダイゼーション条件下に特異的プローブと接触させる。次にハイブリッドの形成が検出され、試料中のＥＥ−ＧＭ３核酸の存在を示す。場合により、試料中の核酸は、特異的プローブとの接触よりも前に特異的プライマーを用いて増幅される。或いは、組み込みフラグメントの代わりに特異的プローブと接触させる前に核酸を標識する。場合により試料との接触の前に特異的プローブを固体担体（例えば限定しないがフィルター、ストリップ又はビーズ）に結合させる。
４．ＥＥ−ＧＭ１に関するポリメラーゼ連鎖反応識別プロトコル
４．１．プライマー
優良イベント内部の配列を認識する特異的プライマーを開発した。より特記すれば、ＥＥ−ＧＭ１の５’フランキング領域内部の配列を認識するプライマーを開発した。次に第２のプライマーを、外来性ＤＮＡの配列の内部で、プライマーが約１８３ヌクレオチドの配列に渡るように選択した。以下のプライマーがＥＥ−ＧＭ１ＤＮＡ上のＰＣＲ反応において特に明確で再現性のある結果をもたらすことがわかった。
SOY06 5'-ggC.gTT.CgT.AgT.gAC.TgA.gg-3'（配列番号１６）
(標的:植物ＤＮＡ)
SOY07 5'-gTT.TTA.CAA.CgT.CgT.gAC.Tgg-3'（配列番号１７）
(標的:インサートＤＮＡ)
内因性配列をターゲティングするプライマーは好ましくはＰＣＲカクテルに包含される。これらのプライマーは未知試料において、そしてＤＮＡ陽性対照において、内部対照として使用される。内因性プライマー対を用いた場合の陽性結果は発生させるべきＰＣＲ産物のためのゲノムＤＮＡ調製において十分な品質のアンプルＤＮＡがあることを示している。内因性プライマーはＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘにおけるハウスキーピング遺伝子を認識するように選択した。
SOY01 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT -3' (配列番号 9)
（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘアクチン１遺伝子に所在（アクセッションＪ０１２９８））
SOY02 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC -3' (配列番号 10)
（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘアクチン１遺伝子に所在（アクセッションＪ０１２９８））
４．２．増幅されるフラグメント
ＰＣＲ反応で予測される増幅されるフラグメントは以下の通りである。
プライマー対SOY01-SOY02の場合:４１３ｂｐ（内因性対照）
プライマー対SOY06-SOY07の場合:１８３ｂｐ（ＥＥ−ＧＭ１優良イベント）
４．３．鋳型ＤＮＡ
鋳型ＤＮＡはEdwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991)に従ってリーフパンチ葉片から調製した。他の方法で調製したＤＮＡを使用する場合、鋳型の種々異なる量を利用するテストランを実施しなければならない。通常はゲノム鋳型ＤＮＡ５０ｎｇが最良の結果をもたらす。
４．４．割り付ける陽性及び陰性対照
誤った陽性又は陰性を回避するためには以下の陽性及び陰性対照がＰＣＲランに包含されなければならない。
− マスターミックス対照（ＤＮＡ陰性対照）。これは反応にＤＮＡを加えないＰＣＲである。予測される結果であるＰＣＲ産物無しが観察される場合、これはＰＣＲカクテルに標的ＤＮＡが混在していなかったことを指す。
− ＤＮＡ陽性対照（トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムＤＮＡ試料）。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にＰＣＲがランされたことを示す。
− 野生型ＤＮＡ対照。これは与えられた鋳型ＤＮＡが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムＤＮＡであるＰＣＲである。予測される結果であるトランスジェニックＰＣＲ産物の増幅無し、ただし内因性ＰＣＲ産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムＤＮＡ試料中に検出可能な導入遺伝子のバックグラウンド増幅が無いことを示している。
４．５．ＰＣＲ条件
最適な結果は以下の条件下に得られた。
−２５μｌ反応用ＰＣＲミックスは下記のものを含有する。
２．５μＬ鋳型ＤＮＡ
２．５μＬの１０ｘ増幅緩衝液（Ｔａｑポリメラーゼと共に供給）
０．５μＬの１０ｍＭｄＮＴＰ類
０．５μＬのＳＯＹ０６（１０ピコモル／μＬ）
０．５μＬのＳＯＹ０７（１０ピコモル／μＬ）
０．２５μＬのＳＯＹ０１（１０ピコモル／μＬ）
０．２５μＬのＳＯＹ０２（１０ピコモル／μＬ）
０．１μＬのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５単位／μＬ）
２５μＬ定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
９５℃４分間
次いで： ９５℃１分間
５７℃１分間
７２℃２分間
５サイクル
次いで： ９２℃３０秒
５７℃３０秒
７２℃１分間
２５サイクル
次いで： ７２℃５分間
４．６．アガロースゲル分析
ＰＣＲの結果を最適に可視化するために、ＰＣＲ試料１０〜２０μＬを適切な分子量マーカー（例えば１００ｂｐラダーＰｈａｒｍａｃｉａ）と共に１．５％アガロースゲル（Ｔｒｉｓホウ酸塩緩衝液）上にアプライしなければならないとした。
４．７．結果の検証
単一のＰＣＲラン及び単一のＰＣＲカクテルの内部におけるトランスジェニック植物ＤＮＡ試料から得られたデータは、１）ＤＮＡ陽性対照が予測されたＰＣＲ産物（トランスジェニック及び内因性のフラグメント）を示し、２）ＤＮＡ陰性対照がＰＣＲ増幅に関して陰性（フラグメント無し）であり、そして３）野生型ＤＮＡ対照が予測された結果（内因性フラグメント増幅）を示すことが成立しない限り許容してはならないとした。
上記したＥＥ−ＧＭ１に関するＰＣＲ識別プロトコルに従った場合、予測されるサイズのトランスジェニック及び内因性ＰＣＲ産物の目視可能な量を示すレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡの調製元の相当する植物がＥＥ−ＧＭ１優良イベントを受け継いでいることを示している。トランスジェニックＰＣＲ産物の何れかの目視可能な量を示さず、そして内因性ＰＣＲ産物の目視可能な量を示しているレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡの調製元の相当する植物が優良イベントを含まないことを示している。内因性およびトランスジェニックのＰＣＲ産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムＤＮＡの質及び／又は量がＰＣＲ産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムＤＮＡ調製は反復しなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなＰＣＲランを実施しなければならない。
４．８．ＥＥ−ＧＭ１を識別するための判別ＰＣＲプロトコルの使用
未知物のスクリーニングを試みる前に、全ての適切な対照を用いたテストランを実施する。開発されたプロトコルは実験室間で異なる要素のために最適化を必要とするかもしれない（鋳型ＤＮＡ調製、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、プライマーの品質、ｄＮＴＰ類、サーモサイクラー等）。
内因性配列の増幅はプロトコルにおける重要な役割を果たす。１つは既知トランスジェニックゲノムＤＮＡ鋳型における内因性及びトランスジェニックの配列の両方の等モル量を増幅するＰＣＲ及び熱サイクリングの条件を得ることである。ターゲティングされる内因性フラグメントが増幅されない場合、又は、ターゲティングされる配列がアガロースゲル電気泳動で判断した場合に同じ臭化エチジウム染色強度で増幅されない場合は、ＰＣＲ条件の最適化が必要な場合がある。
一部がＥＥ−ＧＭ１を含む多くの植物に由来するＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ葉材料を上記したプロトコルに従って試験した。優良イベントＥＥ−ＧＭ１由来及びＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ野生型由来の試料をそれぞれ陽性及び陰性対照として採取した。
図５は多くのダイズ植物試料上のＥＥ−ＧＭ１に関して、優良イベントＰＣＲ識別プロトコルを用いて得られた結果を示す（レーン１〜１４）。レーン１の試料は１８５ｂｐのバンドが検出されていることから優良イベントを含有することがわかり、レーン２、３及び４の試料はＥＥ−ＧＭ１を含んでいない。レーン２は別のダイズ優良イベントを含み、レーン３は非トランスジェニックのＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ対照をあらわし；レーン４は陰性対照（水）試料を示し、そしてレーン５は分子量マーカー（１００ｂｐ）を示す。
５．ＥＥ−ＧＭ３を含む物質の検出のためのプローブとしての特異的組み込みフラグメントの使用
ＥＥ−ＧＭ１の特異的組み込みフラグメントは、特異的プライマーＳＯＹ０６（配列番号１６）及びＳＯＹ０７（配列番号１７）を用いたＰＣＲ増幅によるか、又は、化学合成により得られ、そして標識される。この組み込みフラグメントを、生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ１の検出のための特異的プローブとして使用する。核酸は標準的操作法に従って試料から抽出される。次にこの核酸をハイブリッドの形成を可能にするように最適化されたハイブリダイゼーション条件下に特異的プローブと接触させる。次にハイブリッドの形成が検出され、試料中のＥＥ−ＧＭ１核酸の存在を示す。場合により、試料中の核酸は、特異的プローブとの接触よりも前に特異的プライマーを用いて増幅される。或いは、組み込みフラグメントの代わりに特異的プローブと接触させる前に核酸を標識する。場合により試料との接触の前に特異的プローブを固体担体（例えば限定しないがフィルター、ストリップ又はビーズ）に結合させる。
６．ＥＥ−ＧＭ２に関するポリメラーゼ連鎖反応識別プロトコル
６．１．プライマー
優良イベント内部の配列を認識する特異的プライマーを開発した。より特記すれば、ＥＥ−ＧＭ２の３’フランキング領域内部の配列を認識するプライマーを開発した。次に第２のプライマーを、外来性ＤＮＡの配列の内部で、プライマーが約１５０ヌクレオチドの配列に渡るように選択した。以下のプライマーがＥＥ−ＧＭ２ＤＮＡ上のＰＣＲ反応において特に明確で再現性のある結果をもたらすことがわかった。
SOY09 5'-TgT.ggT.TAT.ggC.ggT.gCC.ATC-3'（配列番号１８）
(標的:植物ＤＮＡ)
SOY010 5'-TgC.TAC.Agg.CAT.CgT.ggT.gTC-3'（配列番号１９）
(標的:インサートＤＮＡ)
内因性配列をターゲティングするプライマーは好ましくはＰＣＲカクテルに包含される。これらのプライマーは未知試料において、そしてＤＮＡ陽性対照において、内部対照として使用される。内因性プライマー対を用いた場合の陽性結果は発生させるべきＰＣＲ産物のためのゲノムＤＮＡ調製において十分な品質のアンプルＤＮＡがあることを示している。内因性プライマーはＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘにおけるハウスキーピング遺伝子を認識するように選択した。
SOY01 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT -3' (配列番号 9)
（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘアクチン１遺伝子に所在（アクセッションＪ０１２９８））
SOY02 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC -3' (配列番号 10)
（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘアクチン１遺伝子に所在（アクセッションＪ０１２９８））
６．２．増幅されるフラグメント
ＰＣＲ反応で予測される増幅されるフラグメントは以下の通りである。
プライマー対SOY01-SOY02の場合:４１３ｂｐ（内因性対照）
プライマー対SOY09-SOY010の場合:１５１ｂｐ（ＥＥ−ＧＭ２優良イベント）
６．３．鋳型ＤＮＡ
鋳型ＤＮＡはEdwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991)に従ってリーフパンチ葉片から調製した。他の方法で調製したＤＮＡを使用する場合、鋳型の種々異なる量を利用するテストランを実施しなければならない。通常はゲノム鋳型ＤＮＡ５０ｎｇが最良の結果をもたらす。
６．４．割り付ける陽性及び陰性対照
誤った陽性又は陰性を回避するためには以下の陽性及び陰性対照がＰＣＲランに包含されなければならない。
− マスターミックス対照（ＤＮＡ陰性対照）。これは反応にＤＮＡを加えないＰＣＲである。予測される結果であるＰＣＲ産物無しが観察される場合、これはＰＣＲカクテルに標的ＤＮＡが混在していなかったことを指す。
− ＤＮＡ陽性対照（トランスジェニック配列を含有することがわかっているゲノムＤＮＡ試料）。この陽性対照の増幅の成功は標的配列の増幅を可能にする条件下にＰＣＲがランされたことを示す。
− 野生型ＤＮＡ対照。これは与えられた鋳型ＤＮＡが非トランスジェニック植物から調製されたゲノムＤＮＡであるＰＣＲである。予測される結果であるトランスジェニックＰＣＲ産物の増幅無し、ただし内因性ＰＣＲ産物の増幅有りが観察される場合、これはゲノムＤＮＡ試料中に検出可能な導入遺伝子のバックグラウンド増幅が無いことを示している。
６．５．ＰＣＲ条件
最適な結果は以下の条件下に得られた。
−２５μｌ反応用ＰＣＲミックスは下記のものを含有する。
２．５μＬ鋳型ＤＮＡ
２．５μＬの１０ｘ増幅緩衝液（Ｔａｑポリメラーゼと共に供給）
０．５μＬの１０ｍＭｄＮＴＰ類
０．５μＬのＳＯＹ０９（１０ピコモル／μＬ）
０．５μＬのＳＯＹ０１０（１０ピコモル／μＬ）
０．２５μＬのＳＯＹ０１（１０ピコモル／μＬ）
０．２５μＬのＳＯＹ０２（１０ピコモル／μＬ）
０．１μＬのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５単位／μＬ）
２５μＬ定容とする水
−最適な結果のために従うべき熱サイクリングプロファイルは以下の通りである。
９５℃４分間
次いで： ９５℃１分間
５７℃１分間
７２℃２分間
５サイクル
次いで： ９２℃３０秒
５７℃３０秒
７２℃１分間
２５サイクル
次いで： ７２℃５分間
６．６．アガロースゲル分析
ＰＣＲの結果を最適に可視化するために、ＰＣＲ試料１０〜２０μＬを適切な分子量マーカー（例えば１００ｂｐラダーＰｈａｒｍａｃｉａ）と共に１．５％アガロースゲル（Ｔｒｉｓホウ酸塩緩衝液）上にアプライしなければならないとした。
６．７．結果の検証
単一のＰＣＲラン及び単一のＰＣＲカクテルの内部におけるトランスジェニック植物ＤＮＡ試料から得られたデータは、１）ＤＮＡ陽性対照が予測されたＰＣＲ産物（トランスジェニック及び内因性のフラグメント）を示し、２）ＤＮＡ陰性対照がＰＣＲ増幅に関して陰性（フラグメント無し）であり、そして３）野生型ＤＮＡ対照が予測された結果（内因性フラグメント増幅）を示すことが成立しない限り許容してはならないとした。
上記したＥＥ−ＧＭ２に関するＰＣＲ識別プロトコルに従った場合、予測されるサイズのトランスジェニック及び内因性ＰＣＲ産物の目視可能な量を示すレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡの調製元の相当する植物がＥＥ−ＧＭ２優良イベントを受け継いでいることを示している。トランスジェニックＰＣＲ産物の何れかの目視可能な量を示さず、そして内因性ＰＣＲ産物の目視可能な量を示しているレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡの調製元の相当する植物が優良イベントを含まないことを示している。内因性およびトランスジェニックのＰＣＲ産物の目視可能な量を示さないレーンはゲノムＤＮＡの質及び／又は量がＰＣＲ産物を発生させることができなかったことを示している。これらの植物は採点することができない。ゲノムＤＮＡ調製は繰り返されなければならず、そして適切な対照を用いながら新たなＰＣＲランを実施しなければならない。
６．８．ＥＥ−ＧＭ２を識別するための判別ＰＣＲプロトコルの使用
未知物のスクリーニングを試みる前に、全ての適切な対照を用いたテストランを実施する。開発されたプロトコルは実験室間で異なる要素のために最適化を必要とするかもしれない（鋳型ＤＮＡ調製、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、プライマーの品質、ｄＮＴＰ類、サーモサイクラー等）。
内因性配列の増幅はプロトコルにおける重要な役割を果たす。１つは既知トランスジェニックゲノムＤＮＡ鋳型における内因性及びトランスジェニックの配列の両方の等モル量を増幅するＰＣＲ及び熱サイクリングの条件を得ることである。ターゲティングされる内因性フラグメントが増幅されない場合、又は、ターゲティングされる配列がアガロースゲル電気泳動で判断した場合に同じ臭化エチジウム染色強度で増幅されない場合は、ＰＣＲ条件の最適化が必要な場合がある。
一部がＥＥ−ＧＭ２を含む多くの植物に由来するＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ葉材料を上記したプロトコルに従って試験した。優良イベントＥＥ−ＧＭ２由来及びＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ野生型由来の試料をそれぞれ陽性及び陰性対照として採取した。
図６は多くのダイズ植物試料上のＥＥ−ＧＭ２に関して、優良イベントＰＣＲ識別プロトコルを用いて得られた結果を示す（レーン１〜１４）。レーン１の試料は１８５ｂｐのバンドが検出されていることから優良イベントを含有することがわかり、レーン２、３及び４の試料はＥＥ−ＧＭ２を含んでいない。レーン２は別のダイズ優良イベントを含み、レーン３は非トランスジェニックのＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ対照をあらわし；レーン４は陰性対照（水）試料を示し、そしてレーン５は分子量マーカー（１００ｂｐ）を示す。
７．ＥＥ−ＧＭ２を含む物質の検出のためのプローブとしての特異的組み込みフラグメントの使用
ＥＥ−ＧＭ２の特異的組み込みフラグメントは、特異的プライマーＳＯＹ０９（配列番号１８）及びＳＯＹ１０（配列番号１９）を用いたＰＣＲ増幅によるか、又は、化学合成により得られ、そして標識される。この組み込みフラグメントを、生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ２の検出のための特異的プローブとして使用する。核酸は標準的操作法に従って試料から抽出される。次にこの核酸をハイブリッドの形成を可能にするように最適化されたハイブリダイゼーション条件下に特異的プローブと接触させる。次にハイブリッドの形成が検出され、試料中のＥＥ−ＧＭ２核酸の存在を示す。場合により、試料中の核酸は、特異的プローブとの接触よりも前に特異的プライマーを用いて増幅される。或いは、組み込みフラグメントの代わりに特異的プローブと接触させる前に核酸を標識する。場合により試料との接触の前に特異的プローブを固体担体（例えば限定しないがフィルター、ストリップ又はビーズ）に結合させる。
８．ＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含むダイズ植物の発生及びそのような植物の作物学的性能のアセスメント
優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１の組み合わせを含有するダイズ植物は、ＥＥ−ＧＭ３を含む親ダイズ植物とＥＥ−ＧＭ１を含む親ダイズ植物の間の従来の交雑により得られている。両方のイベントを含む子孫植物は、本明細書に記載するとおり、ＥＥ−ＧＭ１及びＥＥ−ＧＭ３に関するＰＣＲ識別プロトコルを用いながら識別される。具体的には、ＥＥ−ＧＭ３及び幾つかのＥＥ−ＧＭ１系統を含有する植物を用いて交雑を行った。得られたＦ１植物を生育させ、グリホセート及びグルホシネートを噴霧した。Ｆ２種子をＦ１植物から収穫し、そして植栽した（Ｆ２植物には噴霧しなかった）。Ｆ２単独植物を引き抜いた。Ｆ２：Ｆ３植物の列を生育させ、そしてグリホセート及びグルホシネートを噴霧した。ＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１の両方に関してホモ接合である列を識別し、そして後に収穫した。本試行から得られた分離データは予測されたメンデルのイベント分離を呈していた。
優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２の組み合わせを含有するダイズ植物は、ＥＥ−ＧＭ３を含む親ダイズ植物とＥＥ−ＧＭ２を含む親ダイズ植物の間の従来の交雑により得られている。両方のイベントを含む子孫植物は、本明細書に記載するとおり、ＥＥ−ＧＭ２及びＥＥ−ＧＭ３に関するＰＣＲ識別プロトコルを用いながら識別される。具体的には、ＥＥ−ＧＭ３を含有する植物及びＥＥ−ＧＭ２を含有する植物を用いて交雑を行った。得られたＦ１植物を４つの従来系統に交雑させた。これらの交雑から得られたＦ１を圃場で生育させ、そしてグリホセート及びグルホシネートを噴霧した。次に両方の除草剤に対して抵抗性であるＦ１植物から収穫したＦ２種子を植栽した。Ｆ２植物にグリホセート及びグルホシネートの両方を噴霧した。両方の除草剤に対して耐性である９００個の植物を収穫し、そして圃場試験において植栽した。本試行において予測されたイベントに関するメンデル分離データが得られた。両方の除草剤に対する耐性に関してホモ接合である約４０系統を後の試験のために作物学的均一性に関して選択した。これらの系統は両方除草剤に対して良好な耐性及び良好な作物学的特性を有していた。
商業的生殖質の種々に異なる型において複合イベントを含んでいるこのようなダイズ植物を用いた圃場試験は多数の箇所において実施中であり、そして植物の種々の作物学的パラメーター、例えば植物の草丈、節までの高さ、起立性、活力、種子収量、及びグリホセート、イソキサフルトール及びグルホシネート耐性レベルが評価中である。
９．好ましい栽培植物内へのＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２の遺伝子移入
優良イベントＥＥ−ＧＭ３及び優良イベントＥＥ−ＧＭ１又はＥＥ−ＧＭ２は反復逆交雑により、商業的なダイズ栽培品種、例えば限定しないがダイズ栽培品種（Soybean Cultivar）7631014 (US2009252860); ダイズ栽培品種 7431014 (US2009252859); ダイズ栽培品種7925084 (US2009252858); ダイズ栽培品種 7311153 (US2009252857); ダイズ栽培品種 S070159 (US2009252856); ダイズ栽培品種 7535357 (US2009246353); ダイズ栽培品種 S070160 (US2009246352); ダイズ栽培品種 26074414 (US2009249508); ダイズ栽培品種 7509171 (US2009249507); ダイズ栽培品種 S070158 (US2009246351); ダイズ栽培品種 7511119 (US2009249506); ダイズ栽培品種 7113111 (US2009238945); ダイズ栽培品種S06-02RM018047 (US7592518); ダイズ栽培品種 7013345 (US2009232957); ダイズ栽培品種 7041461 (US2009235376); ダイズ栽培品種 7549450 (US2009232956); ダイズ栽培品種7317090 (US2009232955); ダイズ栽培品種 2N2V58015 (US2009226597); ダイズ栽培品種 7243182 (US2009226596); ダイズ栽培品種 7143182 (US2009226595); ダイズ栽培品種7043182 (US2009220673); ダイズ栽培品種 S070157 (US2009222950); ダイズ栽培品種 306924721 (US2009220672); ダイズ栽培品種 7614385 (US2009220671); ダイズ栽培品種 7925118 (US2009214750); ダイズ栽培品種 7821295 (US2009214749); ダイズ栽培品種 7811336 (US2009214748); ダイズ栽培品種 S070150 (US2009214747); ダイズ栽培品種 6214260 (US2009214746); ダイズ栽培品種 S070152 (US2009214745); ダイズ栽培品種7429331 (US2009214751); ダイズ栽培品種 26034631 (US2009208634); ダイズ栽培品種 S07-03JR108674 (US7560621); ダイズ栽培品種 S07-03KL016279 (US7560620); ダイズ栽培品種S06-CL959411 (US7554017); ダイズ栽培品種 SG3870NRR (US2009158453); ダイズ栽培品種 HFPR-G (CA2645702); ダイズ栽培品種 S06-02JR423016 (US7521606); ダイズ栽培品種 S06-01JR119814 (US7518039); ダイズ栽培品種 S06-01JR119448 (US7518038); ダイズ栽培品種 6540220 (US2009055960); ダイズ栽培品種 S060292 (US2009055959); ダイズ栽培品種 S050228 (US2009055958); ダイズ栽培品種 S06-02JR423003 (US7491873); ダイズ栽培品種S06-02JR423005 (US7491872); ダイズ栽培品種 S06-02JR409114 (US7485782); ダイズ栽培品種 S06-SJ144056 (US7473823);
ダイズ栽培品種(US7470835); ダイズ栽培品種 6910450 (US2008282369); ダイズ栽培品種 6223012 (US7446246); ダイズ栽培品種 6549250 (US7446245); ダイズ栽培品種 17731225 (US2008271204); ダイズ栽培品種 6928285 (US2008271203); ダイズ栽培品種6736054 (US2008271169); ダイズ栽培品種 S060299 (US2008271199); ダイズ栽培品種 S060294 (US2008271202); ダイズ栽培品種 6943322 (US2008271201); ダイズ栽培品種 5343260 (US2008263719); ダイズ栽培品種 6439359 (US2008263704); ダイズ栽培品種 6238359 (US2008263703); ダイズ栽培品種 6547272 (US2008263702); ダイズ栽培品種 6929431 (US2008263701); ダイズ栽培品種 6703392 (US2008263700); ダイズ栽培品種6044483 (US2008263699); ダイズ栽培品種 S050224 (US2008263698); ダイズ栽培品種 6719022 (US2008263697); ダイズ栽培品種 5826056 (US2008263696); ダイズ栽培品種 6265047 (US2008263724); ダイズ栽培品種 6928331 (US2008263695); ダイズ栽培品種 6719331 (US2008263694); ダイズ栽培品種 6636454 (US2008263693); ダイズ栽培品種 6226454 (US2008263718); ダイズ栽培品種 Q0073801 (US2008256657); ダイズ栽培品種6326393 (US2008256652); ダイズ栽培品種 6408448 (US2008256651); ダイズ栽培品種 6449315 (US2008250524); ダイズ栽培品種 S060296 (US2008250523); ダイズ栽培品種 6012078 (US2008250522); ダイズ栽培品種 6342078 (US2008250521); ダイズ栽培品種 6419156 (US2008250520); ダイズ栽培品種 5723264 (US2008250519); ダイズ栽培品種 S050225 (US2008250518); ダイズ栽培品種 S060298 (US2008244783); ダイズ栽培品種6935331 (US2008244782); ダイズ栽培品種 6819456 (US2008244787); ダイズ栽培品種 S060297 (US2008244781); ダイズ栽培品種 6135319 (US2008244786); ダイズ栽培品種 6819331 (US2008244780); ダイズ栽培品種 6137445 (US2008244779); ダイズ栽培品種 6917445 (US2008244778); ダイズ栽培品種 6111333 (US2008244777); ダイズ栽培品種 S050229 (US2008244776); ダイズ栽培品種 6114011 (US2008244775); ダイズ栽培品種 6900358 (US2008244784); ダイズ栽培品種 6345184 (US2008244774); ダイズ栽培品種 6836085 (US2008244773); ダイズ栽培品種 6635047 (US2008244772); ダイズ栽培品種 6139105 (US2008244771); ダイズ栽培品種 6434385 (US2008244770); ダイズ栽培品種 S060295 (US2008244769); ダイズ栽培品種 6035184 (US2008244768); ダイズ栽培品種 S060293 (US2008209590); ダイズ栽培品種 6733322 (US2008209594); ダイズ栽培品種 6421326 (US2008209593); ダイズ栽培品種 S060077 (US2008209589); ダイズ栽培品種 6600375 (US2008209592); ダイズ栽培品種 S06-CL821457 (US7420104); ダイズ栽培品種 S07-02KG294306 (US7414178); ダイズ栽培品種S06-BA046119 (US7414175); ダイズ栽培品種 S07-02KG294307 (US7411114); ダイズ栽培品種 SG3865N (US2008189802); ダイズ栽培品種 6701475 (US7408097); ダイズ栽培品種 1335025 (US2008178316); ダイズ栽培品種 1686017 (US2008178315); ダイズ栽培品種 2388028 (US2008178314); ダイズ栽培品種 2387029 (US2008178313); ダイズ栽培品種 S06-WW152330 (US7388129); ダイズ栽培品種 6424090 (US7385118); ダイズ栽培品種 6723322 (US7385115); ダイズ栽培品種 SG4377NRR (US7385114); ダイズ栽培品種 S06-02JR111334 (US7381864); ダイズ栽培品種 6141287 (US7378577);
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ダイズ品種0007583 (US2004010824); ダイズ品種 0008079 (US2004010823); ダイズ品種 S02-AP98041-2-333-01 (US2003121076); ダイズ品種S02-98041-2-251-01 (US2003182694); ダイズ品種S02-AP98041-2-262-02 (US2003196220); ダイズ品種S02-95021-55-240-BA (US2003188348); ダイズ品種 APA94-31572 (US2003061641); ダイズ品種 AP98041-1-203 (US2003056251); ダイズ品種 APA95-15294 (US2003061640); ダイズ品種 AP98041-4-117 (US2003056250); ダイズ品種 91B33 (US6580018); ダイズ品種 93B85 (US6605762); ダイズ品種 92B76 (US6610911); ダイズ品種 92B38 (US6605761); ダイズ品種 94B24 (US6613967); ダイズ品種 94B73 (US6605760); ダイズ品種93B86 (US6610910); ダイズ品種 91B12 (US6583343); ダイズ品種 95B34 (US6605759); ダイズ品種 94B23 (US6605758); ダイズ品種 90B11 (US6583342); ダイズ品種 91B92 (US6586659); ダイズ品種 95B96 (US6605757); ダイズ品種 93B72 (US6566589); ダイズ品種95B97 (US6613966); ダイズ品種 92B95 (US6608243); ダイズ品種 93B47 (US6583341); ダイズ品種 97B52 (US6605756); ダイズ品種 93B15 (US6617499); ダイズ品種94B54 (US6613965); ダイズ品種 93B67 (US6573433); ダイズ品種 93B87 (US6727410); ダイズ品種 96B51 (US6613964); ダイズ品種 92B84 (US6730829); ダイズ品種92B12 (US6605755); ダイズ品種 90A07 (US6320105); ダイズ品種 93B26 (US6342659); ダイズ品種 96B21 (US6369301); ダイズ品種 92B63 (US6326529); ダイズ品種 93B46 (US6323402); ダイズ品種 92B75 (US6362400); ダイズ品種 93B08 (US6323401); ダイズ品種 97B62 (US6323400); ダイズ品種 92B37 (US6323399); ダイズ品種92B56 (US6339186); ダイズ品種 93B66 (US6307131); ダイズ品種 92B62 (US6346657); ダイズ品種 92B36 (US6369300); ダイズ品種 90B73 (US6316700); ダイズ品種 95B95 (US6323398); ダイズ品種 93B65 (US6229074); ダイズ品種 92B24 (US6284950); ダイズ品種94B53 (US6235976); ダイズ品種 94B22 (US6140557); ダイズ品種 93B84 (US6143956); ダイズ品種 95B32 (US6229073); ダイズ品種 95B53 (US6147283); ダイズ品種93B35 (US6153816); ダイズ品種 93B07 (US6143955); ダイズ品種 92B74 (US6124526); ダイズ品種 92B35 (US6166296); ダイズ品種 94B45 (US6162968); ダイズ品種96B01 (US6143954); ダイズ品種 93B53 (US6335197)内に導入される。
これらの栽培植物内への優良イベントの遺伝子移入はこれらの栽培植物の所望の表現型又は作物学的な特性の何れにも大きく影響しない（収量障害無し）のに対し、グリホセート及び／又はイソキサフルトール又はグルホシネート耐性により測定される導入遺伝子の発現は商業的に許容できるレベルに合致していることがわかる。
スタックは市販されているその他のダイズイベントの１つ以上、例えば限定しないが他の除草剤耐性イベント、例えばＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ申立書：０９−３４９−０１ｐ、０９−２０１−０１ｐ、０９−１８３−０１ｐ、０９−０８２−０１ｐ、０９−０１５−０１ｐ、０６−３５４−０１ｐ、０６−２７１−０１ｐ、０６−１７８−０１ｐ、９８−２３８−０１ｐ、９８−０１４−０１ｐ、９７−００８−０１ｐ、９６−０６８−０１ｐ、９５−３３５−０１ｐ、９３−２５８−０１ｐに記載のイベント（例えばｗｗｗ．ａｐｈｉｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ｂｒｓ／ｎｏｔ＿ｒｅｇ．ｈｔｍｌ参照）、又はＵＳ２００６−２８２９１５に記載のイベントＭＯＮ８９７８８（グリホセート耐性）、ＷＯ２００８／０５４７４７に記載のイベントＤＰ−３０５４２３−１（高オレイン酸／ＡＬＳ阻害剤耐性）、ＵＳ２００９１３００７１に記載のＭＯＮ８７７０１、ＵＳ２００９０３６３０８に記載のイベント３５６０．４．３．５、ＵＳ２００８３１２０８２に記載のイベントＤＰ−３０５４２３−１、又はＷＯ２０１０／０８０８２９のイベントＢＰＳ−ＣＶ１２７−９（Ｅｖｅｎｔ１２７）と好都合に更に組み合わせてよい。
以下の請求項において使用する場合、特段の記載が無い限り、「植物」という用語は何れかの成熟段階の植物組織、並びに何れかのそのような植物から採取されるか誘導された何れかの細胞、組織、又は器官、例えば限定しないが、何れかの種子、葉、幹、花、根、単細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物又はプロトプラストを包含することを意図している。
優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含むレファレンス種子はＮＣＩＭＢアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下２００９年１０月１２日にＮＣＩＭＢ(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Scotland)に３２−ＲＲＭＭ−０５３１として寄託されており、そしてその品種は確認されている。ＥＥ−ＧＭ３の別名はイベントＦＧ−０７２、又はイベントＭＳＴ−ＦＧφ７２−３である。
優良イベントＥＥ−ＧＭ１を含むレファレンス種子はＮＣＩＭＢアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６５８の下２００９年１０月１２日にＮＣＩＭＢ(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Scotland)に３２ＲＲＭＭ０３６８として寄託されている。ＥＥ−ＧＭ１の別名はＬＬ２７、Ａ２７０４−１２、又はＡＣＳ−ＧＭφφ５−３である。
優良イベントＥＥ−ＧＭ２を含むレファレンス種子はＮＣＩＭＢアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１６６０の下２００９年１０月１２日にＮＣＩＭＢ(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Scotland)に３２ＣＯＮ０６８８として寄託されている。ＥＥ−ＧＭ２の別名はＬＬ５５、Ａ５５４７−１２７、又はＡＣＳ−ＧＭφφ６−４である。
優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ１を含むレファレンス種子はＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１０４１の下２０１０年６月１１日に
ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection, 10801 University Blvd.,Manassas, Va.20110-2209,USA)に１１１６０６ダイズとして寄託されている。
優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２を含むレファレンス種子はＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１０４２の下２０１０年６月１１日に
ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection, 10801 University Blvd.,Manassas, Va.20110-2209,USA)に０５ＳＨＸ２ＸＥＢダイズとして寄託されている。
本発明の上記記載は例示であって、限定的なものではない。
記載した実施形態における種々の変化又は変更は当業者が想到し得るものである。これらは本発明の精神又は範囲を逸脱することなく行うことができる。

Claims (38)

  1. 第１の核酸分子が配列番号２のヌクレオチド１４３１からヌクレオチド１４６２までのヌクレオチド配列またはその相補体を含み、第２の核酸分子が配列番号１４のヌクレオチド３０１からヌクレオチド３２２までのヌクレオチド配列またはその相補体を含む、核酸分子の対。
  2. 第１の核酸分子が配列番号３のヌクレオチド２２０からヌクレオチド２６１までのヌクレオチド配列またはその相補体を含み、第２の核酸分子が配列番号１５のヌクレオチド４９７からヌクレオチド５１８までのヌクレオチド配列またはその相補体を含む、核酸分子の対。
  3. 第１の核酸分子が配列番号２のヌクレオチド配列またはその相補体を含み、第２の核酸分子が配列番号１４のヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項１に記載の核酸分子の対。
  4. 第１の核酸分子が配列番号３のヌクレオチド配列またはその相補体を含み、第２の核酸分子が配列番号１５のヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項２に記載の核酸分子の対。
  5. 第１の核酸分子が、配列番号２０のヌクレオチド配列または配列番号２０と少なくとも９９％配列同一性を有する核酸配列を含み、該第１の核酸分子はＨＰＰＤ阻害剤除草剤および／またはグリホセートに対する耐性をもたらす、ならびに
    第２の核酸分子が、以下のヌクレオチド配列：
    ａ）配列番号１４のヌクレオチド１から３１１までのヌクレオチド配列、
    ｂ）配列番号１１のヌクレオチド３４５８からヌクレオチド３８４８までのヌクレオチド配列、
    ｃ）配列番号１１のヌクレオチド４１３からヌクレオチド３４５７までのヌクレオチド配列、および
    ｄ）配列番号１５のヌクレオチド５０８からヌクレオチド１８８０までのヌクレオチド配列
    を順次含むか、または前記配列ａ）〜ｄ）と少なくとも９９％配列同一性を有する核酸配列を含み、グルホシネートに対する耐性をもたらす、
    核酸分子の対。
  6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子の対を含む、ダイズゲノムＤＮＡであって、
    ここで第１の核酸分子はＥＥ−ＧＭ３遺伝子座にあり、第２の核酸分子はＥＥ−ＧＭ２遺伝子座にあり、
    前記ＥＥ−ＧＭ３遺伝子座は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラＨＰＰＤ ＰｆＷ３３６コード遺伝子及びキメラ２ｍＥＰＳＰＳコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    前記ＥＥ−ＧＭ２遺伝子座は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６６０の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記ダイズゲノムＤＮＡ。
  7. ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫であって、それぞれがＨＰＰＤ阻害剤除草剤及び／又はグルホシネート及び／又はグリホセートに対して耐性であり、それぞれが以下のヌクレオチド配列：
    ・ＥＥ−ＧＭ３遺伝子座において配列番号２のヌクレオチド１４３１からヌクレオチド１４６２までのヌクレオチド配列を、
    ・ＥＥ−ＧＭ３遺伝子座において配列番号３のヌクレオチド２２０から２６１までのヌクレオチド配列を、
    ・ＥＥ−ＧＭ２遺伝子座において配列番号１４のヌクレオチド３０１からヌクレオチド３２２のヌクレオチド配列を、および
    ・ＥＥ−ＧＭ２遺伝子座において配列番号１５のヌクレオチド４９７から５１８のヌクレオチド配列を
    そのゲノム中に含み、
    前記ＥＥ−ＧＭ３遺伝子座は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラＨＰＰＤ ＰｆＷ３３６コード遺伝子及びキメラ２ｍＥＰＳＰＳコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    前記ＥＥ−ＧＭ２遺伝子座は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６６０の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫。
  8. 配列番号２、３、１４および１５の配列を含む、請求項７記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫。
  9. 請求項７記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫であって、
    配列番号２０のヌクレオチド配列、ならびに
    順次以下のヌクレオチド配列：
    ａ）配列番号１４のヌクレオチド１から３１１までのヌクレオチド配列、
    ｂ）配列番号１１のヌクレオチド３４５８からヌクレオチド３８４８までのヌクレオチド配列、
    ｃ）配列番号１１のヌクレオチド４１３からヌクレオチド３４５７までのヌクレオチド配列、および
    ｄ）配列番号１５のヌクレオチド５０８からヌクレオチド１８８０までのヌクレオチド配列
    を含む、前記ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫。
  10. ダイズ植物、細胞、部分、又は種子であって、それぞれがＨＰＰＤ阻害剤除草剤及び／又はグルホシネート及び／又はグリホセートに対して耐性であり、そしてそれぞれが優良イベントＥＥ−ＧＭ３及び優良イベントＥＥ−ＧＭ２をそのゲノム中に含み、
    ここで前記優良イベントＥＥ−ＧＭ３は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラＨＰＰＤ ＰｆＷ３３６コード遺伝子及びキメラ２ｍＥＰＳＰＳコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    前記優良イベントＥＥ−ＧＭ２は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６６０の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記ダイズ植物、細胞、部分、又は種子。
  11. 請求項１０記載のダイズ植物、細胞、部分、又は種子の子孫植物、細胞、部分、又は種子であって、
    それぞれがＨＰＰＤ阻害剤除草剤及び／又はグルホシネート及び／又はグリホセートに対して耐性であり、
    配列番号２のヌクレオチド１４３１からヌクレオチド１４６２までのヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド２２０から２６１までのヌクレオチド配列、配列番号１４のヌクレオチド３０１からヌクレオチド３２２のヌクレオチド配列、および配列番号１５のヌクレオチド４９７から５１８のヌクレオチド配列を含む、
    前記子孫植物、細胞、部分、又は種子。
  12. 請求項１０記載のダイズ植物、細胞、部分、又は種子であって、
    そのゲノムＤＮＡが、それぞれ配列番号４及び配列番号５のヌクレオチド配列を含む２つのプライマーによるＰＣＲを使用して分析した場合に、２６３ｂｐのＤＮＡフラグメントを与え、かつ
    そのゲノムＤＮＡが、それぞれ配列番号１８及び配列番号１９のヌクレオチド配列を含む２つのプライマーによるＰＣＲを使用して分析した場合に、１５１ｂｐのＤＮＡフラグメントを与える、前記ダイズ植物、細胞、部分、又は種子。
  13. 請求項７〜１２のいずれか一項に記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫から製造される、ダイズ製品。
  14. ダイズ穀粉、粉砕種子、ダイズ粉末、若しくはダイズフレークであるか、又はそれを含む、請求項１３記載のダイズ製品。
  15. イベントＥＥ−ＧＭ３に対して特異的であるアンプリコンを生成する核酸及びイベントＥＥ−ＧＭ２に対して特異的であるアンプリコンを生成する核酸を含む、請求項１３又は１４記載のダイズ製品。
  16. 請求項７〜１２のいずれか一項記載のダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫を得ること、及びそれからダイズ製品を製造することを含む、ダイズ製品を製造する方法。
  17. 前記ダイズ製品が、ダイズ穀粉、粉砕種子、ダイズ粉末、若しくはダイズフレークであるか、又はそれを含む、請求項１６記載の方法。
  18. 前記ダイズ製品が、イベントＥＥ−ＧＭ３に対して特異的であるアンプリコンを生成する核酸及びイベントＥＥ−ＧＭ２に対して特異的であるアンプリコンを生成する核酸を含む、請求項１６又は１７記載の方法。
  19. 請求項７〜１２のいずれか一項記載のダイズ植物又は種子を植栽又は播種した圃場において雑草を抑制する方法であって、
    該圃場を、有効量のＨＰＰＤ阻害剤除草剤系及び／又はグルホシネート系及び／又はグリホセート系の除草剤で処理することを含み、
    前記植物又は種子は、前記ＨＰＰＤ阻害剤除草剤系、グルホシネート系及びグリホセート系の除草剤に耐性である、
    前記方法。
  20. 発芽成長中の請求項７〜１２のいずれか一項記載のダイズ植物を雑草による競合から保護する方法であって、前記ダイズ植物を植栽すべき圃場を、前記ダイズ植物を植栽するか又は種子を播く前に、ＨＰＰＤ阻害剤除草剤で処理し、続いて、予備処理された前記圃場に前記ダイズ植物を植栽するか又は種子を播くことを含む、前記方法。
  21. 雑草を抑制する方法であって、
    請求項７〜１２のいずれか一項記載のダイズ種子を播種した圃場を、ダイズ植物が出芽する前であるが種子を播種した後に、有効量のＨＰＰＤ阻害剤除草剤で処理することを含み、
    前記種子及び前記植物は、前記ＨＰＰＤ阻害剤除草剤に耐性である、
    前記方法。
  22. 請求項７〜１２のいずれか一項記載のダイズ植物又は種子を植栽又は播種すべき圃場において雑草を抑制する方法であって、
    前記植物又は種子を植栽又は播種すべき圃場を、有効量のＨＰＰＤ阻害剤除草剤及び／又はグリホセート及び／又はグルホシネートで処理し、続いて、前記圃場に前記植物又は種子を植栽又は播種することを含み、
    前記植物又は種子は、前記ＨＰＰＤ阻害剤除草剤及びグリホセート及びグルホシネートに耐性である、
    前記方法。
  23. 前記ＨＰＰＤ阻害剤除草剤がイソキサフルトールであり、ここで前記処理の後、グリホセート及び／又はグルホシネートあるいはＨＰＰＤ阻害剤とグリホセート及び／又はグルホシネートとの混合物を植物の上面から出芽後除草剤として適用する、請求項２０又は２２記載の方法。
  24. グルホシネート、ＨＰＰＤ阻害剤除草剤およびグリホセートに耐性であるダイズ植物を製造する方法であって、
    （ｉ）優良イベントＥＥ−ＧＭ３を含むダイズ植物を優良イベントＥＥ−ＧＭ２を含むダイズ植物と交雑させることにより、グルホシネートに対して耐性である植物に、ＨＰＰＤ阻害剤除草剤およびグリホセートに対する耐性を導入すること、
    ここで優良イベントＥＥ−ＧＭ３は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラＨＰＰＤ ＰｆＷ３３６コード遺伝子及びキメラ２ｍＥＰＳＰＳコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    優良イベントＥＥ−ＧＭ２は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６６０の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座である、および
    優良イベントＥＥ−ＧＭ３およびＥＥ−ＧＭ２を含む子孫を選択すること、または
    （ｉｉ）ＨＰＰＤ阻害剤除草剤、グリホセートおよびグルホシネートに対する耐性を欠く異なる遺伝的背景を有するダイズ植物に、優良イベントＥＥ−ＧＭ３およびＥＥ−ＧＭ２を含むダイズ植物を交雑させることにより、ＨＰＰＤ阻害剤除草剤、グリホセートおよびグルホシネートに対する耐性を導入すること、
    ここで優良イベントＥＥ−ＧＭ３は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラＨＰＰＤ ＰｆＷ３３６コード遺伝子及びキメラ２ｍＥＰＳＰＳコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    優良イベントＥＥ−ＧＭ２は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６６０の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座である、および
    優良イベントＥＥ−ＧＭ３およびＥＥ−ＧＭ２を含む子孫を選択すること
    を含む、前記方法。
  25. 生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３及びＥＥ−ＧＭ２の同時存在又は非存在を検出する方法であって、
    前記方法は、少なくとも２つの特異的プライマーを用いたＥＥ−ＧＭ３特異的領域の検出、ここで該少なくとも２つの特異的プライマーの一方は、ＥＥ−ＧＭ３中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’又は３’フランキング領域内の配列を特異的に認識し、他方のプライマーは、ＥＥ−ＧＭ３の前記５’又は３’フランキング領域に隣接する外来性ＤＮＡ内の配列を特異的に認識する、及び
    ２つの特異的プライマーを用いたＥＥ−ＧＭ２特異的領域の検出、ここで該２つの特異的プライマーの一方は、ＥＥ−ＧＭ２中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’又は３’フランキング領域内の配列を特異的に認識し、他方のプライマーは、ＥＥ−ＧＭ２の前記５’又は３’フランキング領域に隣接する外来性ＤＮＡ内の配列を特異的に認識する、
    を含み、
    ここでＥＥ−ＧＭ３の前記５’フランキング領域は、配列番号２のヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までのヌクレオチド配列を含み、
    ＥＥ−ＧＭ３の前記３’フランキング領域は、配列番号３のヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記５’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ３の前記外来性ＤＮＡは、配列番号２のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ３の前記外来性ＤＮＡは、配列番号３のヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までのヌクレオチド配列を含むか、または前記５’もしくは３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ３の前記外来性ＤＮＡは、配列番号２０のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１６６３８までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含み、
    ＥＥ−ＧＭ２の前記５’フランキング領域は、配列番号１４のヌクレオチド１からヌクレオチド３１１までのヌクレオチド配列を含み、
    ＥＥ−ＧＭ２の前記３’フランキング領域は、配列番号１５のヌクレオチド５０８からヌクレオチド１８８０までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記５’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ２の前記外来性ＤＮＡは、配列番号１４のヌクレオチド３１２からヌクレオチド８１０までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ２の前記外来性ＤＮＡは、配列番号１５のヌクレオチド１からヌクレオチド５０７までのヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記５’または３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ２の前記外来性ＤＮＡは、配列番号１１のヌクレオチド３４５８からヌクレオチド３８４８までのヌクレオチド配列および配列番号１１のヌクレオチド４１３からヌクレオチド３４５７のヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を含み、
    ここで前記優良イベントＥＥ−ＧＭ３は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラＨＰＰＤ ＰｆＷ３３６コード遺伝子及びキメラ２ｍＥＰＳＰＳコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    前記優良イベントＥＥ−ＧＭ２は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６６０の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記方法。
  26. 請求項２５記載の方法であって、
    少なくとも２つのプライマーを用いた第１のポリメラーゼ連鎖反応、ここで前記プライマーの一方は、ＥＥ−ＧＭ３中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’または３’フランキング領域を認識し、前記プライマーの他方のプライマーは、前記５’または３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ３の外来性ＤＮＡ内の配列を認識する、および
    少なくとも２つのプライマーを用いた第２のポリメラーゼ連鎖反応、ここで前記プライマーの一方は、ＥＥ−ＧＭ２中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’または３’フランキング領域を認識し、前記プライマーの他方のプライマーは、前記５’または３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ２の外来性ＤＮＡ内の配列を認識する、
    を使用して、前記生物学的試料中に存在する核酸から５０〜１０００ｂｐの２つのＤＮＡフラグメントを増幅させることを含み、ここで前記第１および第２のポリメラーゼ反応は逐次的であっても同時であってもよい、前記方法。
  27. 請求項２６記載の方法であって、
    ＥＥ−ＧＭ３の５’フランキング領域を認識する前記プライマーが、その最３’末端において、配列番号２のヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    ＥＥ−ＧＭ３の３’フランキング領域を認識する前記プライマーが、その最３’末端において、配列番号３のヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    ＥＥ−ＧＭ３の外来性ＤＮＡ内の配列を認識する前記プライマーが、その最３’末端において、配列番号２のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの相補体のヌクレオチド配列、または配列番号３のヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までのヌクレオチド配列、または配列番号２０のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１６６３８までのヌクレオチド配列もしくはその相補体から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドを含み、
    ＥＥ−ＧＭ２の５’フランキング領域を認識する前記プライマーが、その最３’末端において、配列番号１４のヌクレオチド１からヌクレオチド３１１までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    ＥＥ−ＧＭ２の３’フランキング領域を認識する前記プライマーが、その最３’末端において、配列番号１５のヌクレオチド５０８からヌクレオチド１８８０までの相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    ＥＥ−ＧＭ２の外来性ＤＮＡ内の配列を認識する前記プライマーが、その最３’末端において、配列番号１４のヌクレオチド３１２からヌクレオチド８１０までの相補体のヌクレオチド配列、または配列番号１５のヌクレオチド１からヌクレオチド５０７までのヌクレオチド配列、または配列番号１１のヌクレオチド３４５８からヌクレオチド３８４８までのヌクレオチド配列および配列番号１１のヌクレオチド４１３からヌクレオチド３４５７までのヌクレオチド配列もしくはそれらの相補体から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドを含む、
    前記方法。
  28. 前記ＥＥ−ＧＭ３特異的プライマーが、それぞれ配列番号５および配列番号４の配列、またはそれぞれ配列番号７および配列番号５の配列を含み、前記ＥＥ−ＧＭ２特異的プライマーが、それぞれ配列番号１８および配列番号１９の配列を含む、請求項２７記載の方法。
  29. ＥＥ−ＧＭ３およびＥＥ−ＧＭ２の特異的検出における使用に適する２つのプライマー対であって、
    ＥＥ−ＧＭ３およびＥＥ−ＧＭ２のそれぞれは、５’フランキング領域、外来性ＤＮＡおよび３’フランキング領域を含み、５’フランキング領域は外来性ＤＮＡの直近上流にありそれに隣接しており、３’フランキング領域は外来性ＤＮＡの直近下流にありそれに隣接しており、
    第１のプライマー対の一方のプライマーは、ＥＥ−ＧＭ３中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’または３’フランキング領域内の配列を認識する配列を含み、第１のプライマー対の他方のプライマーは、ＥＥ−ＧＭ３中の前記５’または３’フランキング領域に隣接する外来性ＤＮＡ内の配列を認識する配列を含み、
    第２のプライマー対の一方のプライマーは、ＥＥ−ＧＭ２中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’または３’フランキング領域内の配列を認識する配列を含み、第２のプライマー対の他方のプライマーは、ＥＥ−ＧＭ２の前記５’または３’フランキング領域に隣接する外来性ＤＮＡ内の配列を認識する配列を含み、
    ＥＥ−ＧＭ３の前記５’フランキング領域は、配列番号２のヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までのヌクレオチド配列を含み、
    ＥＥ−ＧＭ３の前記３’フランキング領域は、配列番号３のヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記５’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ３の前記外来性ＤＮＡは、配列番号２のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ３の前記外来性ＤＮＡは、配列番号３のヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までのヌクレオチド配列を含むか、または前記５’もしくは３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ３の前記外来性ＤＮＡは、配列番号２０のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１６６３８までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含み、
    ＥＥ−ＧＭ２の前記５’フランキング領域は、配列番号１４のヌクレオチド１からヌクレオチド３１１までのヌクレオチド配列を含み、
    ＥＥ−ＧＭ２の前記３’フランキング領域は、配列番号１５のヌクレオチド５０８からヌクレオチド１８８０までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記５’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ２の前記外来性ＤＮＡは、配列番号１４のヌクレオチド３１２からヌクレオチド８１０までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ２の前記外来性ＤＮＡは、配列番号１５のヌクレオチド１からヌクレオチド５０７までのヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記５’または３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ２の前記外来性ＤＮＡは、配列番号１１のヌクレオチド３４５８からヌクレオチド３８４８までのヌクレオチド配列および配列番号１１のヌクレオチド４１３からヌクレオチド３４５７のヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を含み、
    ここでＥＥ−ＧＭ３は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラＨＰＰＤ ＰｆＷ３３６コード遺伝子及びキメラ２ｍＥＰＳＰＳコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    ＥＥ−ＧＭ２は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６６０の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記プライマー対。
  30. 請求項２９記載のプライマー対であって、
    前記第１のプライマー対の一方のプライマーが、その最３’末端において、配列番号２のヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列または配列番号３のヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    前記第１のプライマー対の他方のプライマーが、その最３’末端において、配列番号２のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列または配列番号３のヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    前記第２のプライマー対の一方のプライマーが、その最３’末端において、配列番号１４のヌクレオチド１からヌクレオチド３１１までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列または配列番号１５のヌクレオチド５０８からヌクレオチド１８８０までの相補体のヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    前記第２のプライマー対の他方のプライマーが、その最３’末端において、配列番号１４のヌクレオチド３１２からヌクレオチド８１０までのヌクレオチド配列の相補体または配列番号１５のヌクレオチド１からヌクレオチド５０７までのヌクレオチド配列から選択される少なくとも１７個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、
    前記プライマー対。
  31. 請求項２９記載のプライマー対であって、
    前記第１のプライマー対の一方が、その最３’末端において、配列番号２のヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までのヌクレオチド配列から選択される１７〜２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列または配列番号３のヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までのヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列から選択される１７〜２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、
    前記第２のプライマー対の一方が、その最３’末端において、配列番号１４のヌクレオチド１からヌクレオチド３１１までのヌクレオチド配列から選択される１７〜２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列または配列番号１５のヌクレオチド５０８からヌクレオチド１８８０までのヌクレオチド配列の相補体のヌクレオチド配列から選択される１７〜２００個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、
    前記プライマー対。
  32. 請求項２９記載のプライマー対であって、以下の４つのプライマー：
    配列番号５の配列をその最３’末端に含む第１のプライマー；
    配列番号４の配列をその最３’末端に含む第２のプライマー；
    配列番号１８の配列をその最３’末端に含む第３のプライマー；および、
    配列番号１９の配列をその最３’末端に含む第４のプライマー；
    を含む、前記プライマー対。
  33. ダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫由来の生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３およびＥＥ−ＧＭ２の同時存在を識別する方法であって、
    生物学的試料の核酸を、ＥＥ−ＧＭ３の５’または３’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性ＤＮＡの部分を含む領域に特異的にハイブリダイズするＥＥ−ＧＭ３に対する第１の特異的プローブとハイブリダイズさせること、および
    生物学的試料の核酸を、ＥＥ−ＧＭ２の５’または３’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性ＤＮＡの部分を含む領域に特異的にハイブリダイズするＥＥ−ＧＭ２に対する第２の特異的プローブとハイブリダイズさせることを含み、
    前記第１の特異的プローブの配列は、ＥＥ−ＧＭ３の５’フランキング領域または３’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性ＤＮＡの配列の部分を含む配列と少なくとも９０％配列同一性を有し、
    前記第２の特異的プローブの配列は、ＥＥ−ＧＭ２の５’フランキング領域または３’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性ＤＮＡの配列の部分を含む配列と少なくとも９０％配列同一性を有し、
    ＥＥ−ＧＭ３の前記５’フランキング領域は、配列番号２のヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までのヌクレオチド配列を含み、
    ＥＥ−ＧＭ３の前記３’フランキング領域は、配列番号３のヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記５’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ３の前記外来性ＤＮＡは、配列番号２のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ３の前記外来性ＤＮＡは、配列番号３のヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までのヌクレオチド配列を含むか、または前記５’もしくは３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ３の前記外来性ＤＮＡは、配列番号２０のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１６６３８までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含み、
    ＥＥ−ＧＭ２の前記５’フランキング領域は、配列番号１４のヌクレオチド１からヌクレオチド３１１までのヌクレオチド配列を含み、
    ＥＥ−ＧＭ２の前記３’フランキング領域は、配列番号１５のヌクレオチド５０８からヌクレオチド１８８０までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記５’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ２の前記外来性ＤＮＡは、配列番号１４のヌクレオチド３１２からヌクレオチド８１０までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ２の前記外来性ＤＮＡは、配列番号１５のヌクレオチド１からヌクレオチド５０７までのヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記５’または３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ２の前記外来性ＤＮＡは、配列番号１１のヌクレオチド３４５８からヌクレオチド３８４８までのヌクレオチド配列および配列番号１１のヌクレオチド４１３からヌクレオチド３４５７のヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を含み、
    ここで前記優良イベントＥＥ−ＧＭ３は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラＨＰＰＤ ＰｆＷ３３６コード遺伝子及びキメラ２ｍＥＰＳＰＳコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    前記優良イベントＥＥ−ＧＭ２は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６６０の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記方法。
  34. 請求項３３記載の方法であって、
    前記第１の特異的プローブの配列が、配列番号２のヌクレオチド１４３１から１４７２もしくは配列番号３のヌクレオチド２２０から２６１、またはその相補体と少なくとも９０％配列同一性を有し、
    前記第２の特異的プローブの配列が、配列番号１４のヌクレオチド３０１から３２２もしくは配列番号１５のヌクレオチド４９７から５１８、またはその相補体と少なくとも９０％配列同一性を有する、
    前記方法。
  35. 生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３および優良イベントＥＥ−ＧＭ２の同時存在を識別するための一対の特異的プローブであって、
    ＥＥ−ＧＭ３およびＥＥ−ＧＭ２のそれぞれは、５’フランキング領域、外来性ＤＮＡおよび３’フランキング領域を含み、５’フランキング領域は外来性ＤＮＡの直近上流にありそれに隣接しており、３’フランキング領域は外来性ＤＮＡの直近下流にありそれに隣接しており、
    ＥＥ−ＧＭ３中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’フランキング領域もしくは３’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性ＤＮＡの部分を含む配列と少なくとも９０％配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む第１のプローブ、ならびにＥＥ−ＧＭ２中の除草剤耐性遺伝子を含む外来性ＤＮＡの５’フランキング領域もしくは３’フランキング領域の部分およびそれに隣接する外来性ＤＮＡの部分を含む配列と少なくとも９０％配列同一性を有するヌクレオチド配列またはその相補体を含む第２のプローブを含み、例えば前記第１のプローブは、配列番号２のヌクレオチド１４４１から１４６２もしくは配列番号３のヌクレオチド２３０から２５１、またはその相補体と少なくとも９０％配列同一性を有し、前記第２の特異的プローブの配列は、配列番号１４のヌクレオチド３０１から３２２もしくは配列番号１５のヌクレオチド４９７から５１８、またはその相補体と少なくとも９０％配列同一性を有し、
    ＥＥ−ＧＭ３の前記５’フランキング領域は、配列番号２のヌクレオチド１からヌクレオチド１４５１までのヌクレオチド配列を含み、
    ＥＥ−ＧＭ３の前記３’フランキング領域は、配列番号３のヌクレオチド２４１からヌクレオチド１４０８までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記５’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ３の前記外来性ＤＮＡは、配列番号２のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１８４３までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ３の前記外来性ＤＮＡは、配列番号３のヌクレオチド１からヌクレオチド２４０までのヌクレオチド配列を含むか、または前記５’もしくは３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ３の前記外来性ＤＮＡは、配列番号２０のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１６６３８までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含み、
    ＥＥ−ＧＭ２の前記５’フランキング領域は、配列番号１４のヌクレオチド１からヌクレオチド３１１までのヌクレオチド配列を含み、
    ＥＥ−ＧＭ２の前記３’フランキング領域は、配列番号１５のヌクレオチド５０８からヌクレオチド１８８０までの相補体のヌクレオチド配列を含み、
    前記５’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ２の前記外来性ＤＮＡは、配列番号１４のヌクレオチド３１２からヌクレオチド８１０までの相補体のヌクレオチド配列を含み、かつ前記３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ２の前記外来性ＤＮＡは、配列番号１５のヌクレオチド１からヌクレオチド５０７までのヌクレオチド配列を含むか、あるいは前記５’または３’フランキング領域に隣接するＥＥ−ＧＭ２の前記外来性ＤＮＡは、配列番号１１のヌクレオチド３４５８からヌクレオチド３８４８までのヌクレオチド配列および配列番号１１のヌクレオチド４１３からヌクレオチド３４５７のヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を含み、
    ここで前記優良イベントＥＥ−ＧＭ３は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラＨＰＰＤ ＰｆＷ３３６コード遺伝子及びキメラ２ｍＥＰＳＰＳコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    前記優良イベントＥＥ−ＧＭ２は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６６０の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記一対の特異的プローブ。
  36. ＥＥ−ＧＭ３およびＥＥ−ＧＭ２を特異的に認識するプライマー対またはプローブを含むキットであって、
    前記プライマー対は、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載のプライマー対であり、
    前記プローブは、請求項３５に記載のプローブである、
    前記キット。
  37. 請求項２５または３３記載の方法であって、
    前記生物学的試料が種子試料であり、
    種子の純度を確認するか、または優良イベントＥＥ−ＧＭ３およびＥＥ−ＧＭ２の存在または非存在に関して種子をスクリーニングするためであり、
    前記種子試料における、特異的プライマー対またはプローブ対によるＥＥ−ＧＭ３およびＥＥ−ＧＭ２特異的領域の検出を含む、
    前記方法。
  38. 実質的に相補な標識された核酸プローブとのハイブリダイゼーションを介してダイズ植物、又はその細胞、部分、種子若しくは子孫由来の生物学的試料中の優良イベントＥＥ−ＧＭ３およびＥＥ−ＧＭ２の存在を検出する方法であって、
    標的核酸配列の再利用を介して該標的核酸配列の検出シグナルが増幅され、
    下記工程：
    ａ）前記標的核酸配列を、配列番号２のヌクレオチド１４５２からヌクレオチド１４６９までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第１の核酸オリゴヌクレオチド、または配列番号３のヌクレオチド２２３からヌクレオチド２４０までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第１の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること；
    ｂ）前記標的核酸配列を、配列番号２のヌクレオチド１４３４からヌクレオチド１４５１までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第２の核酸オリゴヌクレオチド、または配列番号３のヌクレオチド２４１からヌクレオチド２５８までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第２の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること、ここで前記第１および第２のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチドで重複しており、そしてここで前記第１または該第２のオリゴヌクレオチドのいずれかが標識されて前記標識された核酸プローブとなる；
    ｃ）デュプレックス解離をもたらす選択的プローブ切断を起こす酵素により、プローブ:標的核酸配列デュプレックス内の標識されたプローブのみを切断し、標的配列は未損傷のままとすること；
    ｄ）工程（ａ）から（ｃ）を反復することにより標的核酸配列を再利用すること；および
    ｅ)切断された標識されたプローブを検出することにより、標的核酸配列の存在を決定すること；ならびに
    ｆ）前記標的核酸配列を、配列番号１４のヌクレオチド３１２からヌクレオチド３２９までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第３の核酸オリゴヌクレオチド、または配列番号１５のヌクレオチド４９０からヌクレオチド５０７までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第３の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること；
    ｇ）前記標的核酸配列を、配列番号１４のヌクレオチド２９４からヌクレオチド３１１までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第４の核酸オリゴヌクレオチド、または配列番号１５のヌクレオチド５０８からヌクレオチド５２５までのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む第４の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること、ここで前記第３および第４のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチドで重複しており、そしてここで前記第３または該第４のオリゴヌクレオチドのいずれかが標識されて前記標識された核酸プローブとなる；
    ｈ）デュプレックス解離をもたらす選択的プローブ切断を起こす酵素により、プローブ:標的核酸配列デュプレックス内の標識されたプローブのみを切断し、標的配列は未損傷のままとすること；
    ｉ）工程（ｆ）から（ｈ）を反復することにより標的核酸配列を再利用すること；および
    ｅ)切断された標識されたプローブを検出することにより、標的核酸配列の存在を決定すること；
    を含み、
    ここで前記優良イベントＥＥ−ＧＭ３は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６５９の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラＨＰＰＤ ＰｆＷ３３６コード遺伝子及びキメラ２ｍＥＰＳＰＳコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座であり、
    前記優良イベントＥＥ−ＧＭ２は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６６０の下にＮＣＩＭＢに寄託されているレファレンス種子中に見出される、キメラホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子を含む外来性ＤＮＡ並びに前記外来性ＤＮＡに直接隣接する５’及び３’フランキング配列を含む遺伝子座である、
    前記方法。
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