ES2712773T3 - Evento Elite EE-GM3 y métodos y kits para identificar dicho evento en muestras biológicas - Google Patents

Abstract

Una planta de soja, o células, partes, semillas o progenie de la misma, comprendiendo, cada una, en su genoma un evento élite, en donde dicho evento élite, tal como se encuentra en la semilla de referencia depositada en el NCIMB bajo el número de depósito NCIMB 41659, es un locus genético que comprende un ADN extraño que comprende un gen que codifica HPPD Pf W336 quimérico y un gen que codifica 2mEPSPS quimérico.

Description

DESCRIPCION

Evento Elite EE-GM3 y metodos y kits para identificar dicho evento en muestras biologicas

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad respecto a la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos con N.° 61/367.227, presentada el 23 de julio de 2010; la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos n.° 61/263.690, presentada el 23 de noviembre de 2009; la Solicitud Europea N.° EP 09014564,0, presentada el 23 de noviembre de 2009.

Campo de la invencion

Esta invencion se refiere a plantas, material vegetal y semillas de soja transgenicas, caracterizadas por albergar un evento de transformacion especifico, particularmente por la presencia de genes que codifican proteinas que confieren tolerancia a herbicidas, en una ubicacion especifica en el genoma de la soja. Las plantas de soja de la invencion combinan el fenotipo de tolerancia a herbicidas con un rendimiento agronomico, estabilidad genetica y funcionalidad en diferentes origenes geneticos equivalentes a la linea de soja no transformada en ausencia de herbicida(s). Esta invencion proporciona ademas metodos y kits para identificar la presencia de material vegetal que comprende especificamente el evento de transformacion EE-GM3 en muestras biologicas.

Antecedentes de la invencion

La expresion fenotipica de un transgen en una planta esta determinada tanto por la estructura del gen o los genes en si mismos como por su ubicacion en el genoma de la planta. Al mismo tiempo, la presencia de los transgenes o "ADN extrano" en diferentes ubicaciones en el genoma influira en el fenotipo general de la planta de diferentes maneras. La introduccion exitosa desde el punto de vista agronomico o industrial de un rasgo comercialmente interesante en una planta mediante manipulacion genetica puede ser un procedimiento largo que depende de diferentes factores. La transformacion y regeneracion reales de las plantas transformadas geneticamente son solo las primeras de una serie de etapas de seleccion, que incluyen una extensa caracterizacion genetica, reproduccion y evaluacion en ensayos de campo, lo que finalmente lleva a la seleccion de un evento elite.

La identificacion inequivoca de un evento elite es cada vez mas importante en vista de las discusiones sobre nuevos alimentos/piensos, la segregacion de productos OGM y no OGM y la identificacion de material patentado. Idealmente, dicho metodo de identificacion es tanto rapido como simple, sin la necesidad de una extensa configuracion de laboratorio. Ademas, el metodo debe proporcionar resultados que permitan una determinacion inequivoca del evento elite sin la interpretacion de expertos, pero que se mantengan sometidos al escrutinio de expertos si es necesario. Se describen, en el presente documento, las herramientas especificas para su uso en la identificacion del evento elite EE-GM3 en muestras biologicas.

En esta invencion, EE-GM3 se ha identificado como un evento elite de una poblacion de plantas de soja transgenicas en el desarrollo de soja tolerante a herbicida (Glycine max) que comprende un gen que codifica la tolerancia al glifosato combinado con un gen que confiere tolerancia a inhibidores de la 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), cada uno bajo el control de un promotor expresable en plantas.

Green, J. (2009). Evolution of Glyphosate-Resistant Crop Technology. Weed Science, 57(1), 108-117 describe cultivos resistentes al glifosato, junto con montones con otras resistencias a herbicidas, en particular con la resistencia a los inhibidores de HPPD.

La publicacion de patente internacional WO 98/02562 describe plantas transgenicas resistentes a inhibidores de HPPD y a inhibidores de EPSPS.

Herouet-Guicheney, C., et al. Safety evaluation of the double mutant 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (2mEPSPS) from maize that confers tolerance to glyphosate herbicide in transgenic plants. Regulatory Toxicology and Pharmacology 54.2 (2009): 143-153., describe plantas transgenicas que comprenden el gen de resistencia al glifosato de 2mEPSPS. Las publicaciones de patente FR 2770854 A1 y EP 1186666 describen el uso del gen HPPD-Pf-W336 para la generacion de plantas transgenicas resistentes a inhibidores de HPPD.

Ademas, se han divulgado, en la tecnica, plantas de soja que comprenden un gen de tolerancia a herbicidas. Sin embargo, ninguna de las divulgaciones de la tecnica anterior ensena o sugiere la presente invencion.

Se conoce en la tecnica que obtener un evento de transformacion de elite tolerante a herbicida comercial en plantas de soja con un funcionamiento agronomico aceptable, sin arrastre de rendimiento, y que proporcione suficiente tolerancia a herbicida, ciertamente a 2 clases diferentes de herbicidas, no es en absoluto sencillo.

De hecho, se ha informado de que el primer evento de soja (evento 40-3-2) lanzado en el mercado con tolerancia a herbicidas, tuvo un arrastre significativo en el rendimiento en comparacion con las lineas (casi) isogenicas (Elmore et al. (2001) Agron. J. 93: 408-412).

Ademas, las semillas de soja Optimum GAT (TM) se hicieron para combinar la tolerancia al glifosato con la tolerancia a los herbicidas ALS, pero su desarrollador informo que estas semillas de soja no estaban cumpliendo con los estandares de tolerancia al glifosato por si mismos (sin la combinacion de otro tipo de evento de tolerancia al glifosato como el evento 40-3-2 (vease, por ejemplo, www.bloomberg.com/apps/news?pid=newsarchive&sid=ad4L0hH9MKWE)).

Resumen de las realizaciones preferidas de la invencion

La presente invencion se refiere a una planta de soja, o celulas, partes, semillas o progenie de la misma, comprendiendo, cada una, en su genoma un evento elite, en donde dicho evento elite, tal como se encuentra en la semilla de referencia depositada en el NCIMB bajo el numero de deposito NCIMB 41659, es un locus genetico que comprende un ADN extrano que comprende un gen que codifica HPPD Pf W336 quimerico y un gen que codifica 2mEPSPS quimerico. La invencion tambien se refiere a una planta de soja tolerante al glifosato y/o herbicidas inhibidores de HPPD, como el isoxaflutol, que se puede obtener introduciendo en el genoma dicho evento elite. Mas especificamente, la presente invencion se refiere a una planta de soja transgenica, o semilla, celulas o tejidos de la misma, que comprenden, integrado de manera estable en su genoma, un casete de expresion que comprende un gen de tolerancia a herbicida que comprende la secuencia codificante del gen 2mEPSPS y otro gen de tolerancia a herbicida que comprende la secuencia codificante de HPPD-Pf W336 (tanto como se describe en el Ejemplo 1.1 del presente documento como se representa en la SEQ ID NO:1), que es tolerante al glifosato y un herbicida inhibidor de HPPD como el isoxaflutol y, en ausencia de herbicida(s), tiene un rendimiento agronomico que es sustancialmente equivalente a la linea isogenica no transgenica. Despues de la aplicacion de uno o mas herbicidas a los que se proporciona tolerancia, la planta tendra un fenotipo agronomico superior en comparacion con una planta no transgenica.

Segun la presente invencion, la planta de soja o semillas, celulas o tejidos de la misma comprenden el evento elite EE-GM3.

Mas especificamente, la presente invencion se refiere a una planta de soja transgenica, semilla, celulas o tejidos de la misma, cuyo ADN genomico se caracteriza por el hecho de que, cuando se analiza en un Protocolo de Identificacion por PCR como se describe en el presente documento, usando dos cebadores dirigidos a la region flanqueante 5' o 3' de EE-GM3 y el ADN extrano que comprende genes de tolerancia a herbicidas, respectivamente, produce un fragmento que es especifico para EE-GM3. Los cebadores pueden dirigirse contra la region flanqueante 5' dentro de la SEQ ID NO: 2 y el ADN extrano que comprende genes de tolerancia a herbicidas, respectivamente. Los cebadores tambien pueden dirigirse contra la region flanqueante 3' dentro de la SEQ ID NO: 3 y el ADN extrano que comprende genes de tolerancia a herbicidas, respectivamente, tales como los cebadores que comprenden o consisten (esencialmente) en la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 7 respectivamente, y producen un fragmento de ADN de entre 100 y 800 pb, tal como un fragmento de aproximadamente 263 pb o 706 pb.

La semilla de referencia que comprende el evento elite de la invencion se ha depositado en el NCIMB con el numero de acceso NCIMB 41659. Una realizacion de la invencion es la semilla que comprende el evento elite EE-GM3 depositada como numero de acceso NCIMB 41659, que crecera en una planta de soja tolerante a herbicidas, particularmente tolerante al glifosato y/o inhibidores de HPPD, como el isoxaflutol. La semilla de numero de deposito de NCIMB, NCIMB 41659, es un lote de semillas que consta de al menos aproximadamente un 95% de semillas transgenicas homocigoticas para el ADN transferido, que comprende el evento elite de la invencion, que crecera en plantas tolerantes a herbicidas, por lo que las plantas son tolerantes al glifosato y/o isoxaflutol. La semilla o la semilla de la progenie que se puede obtener o se obtiene de la semilla depositada (p. Ej., despues del cruce con otras plantas de soja con un origen genetico diferente) puede sembrarse y las plantas en crecimiento pueden tratarse con glifosato o isoxaflutol como se describe en el presente documento para obtener un 100% de plantas tolerantes a glifosato o a isoxaflutol, que comprenden el evento elite de la invencion. La invencion se refiere adicionalmente a celulas, tejidos, progenie, y descendientes de una planta que comprende el evento elite de la invencion crecidos de la semilla depositada en el NCIMB que tiene el numero de acceso NCIMB 41659. La invencion se refiere ademas a plantas que se pueden obtener (como la propagacion de y/o la reproduccion con) de una planta de soja que comprende el evento elite de la invencion (como una planta que crece de la semilla depositada en el NCIMB que tiene el numero de acceso NCIMB 41659). La invencion tambien se refiere a plantas de soja que comprenden el evento elite EE-GM3.

La especificacion describe ademas un metodo para identificar una planta transgenica, o celulas o tejidos de la misma, que comprende el evento elite EE-GM3, cuyo metodo se basa en la identificacion de la presencia de secuencias de ADN o aminoacidos caracteristicos codificados por dichas secuencias de ADN en plantas, celulas o tejidos transgenicos. De acuerdo con una realizacion preferida de la invencion, tales secuencias de ADN de caracterizacion son secuencias de 15 pb o al menos 15 pb, preferentemente 20 pb o al menos 20 pb, lo mas preferentemente 30 pb o mas que comprenden el sitio de insercion del evento, es decir, tanto una parte del ADN extrano insertado que comprende genes de tolerancia a herbicidas como una parte del genoma de la soja (ya sea la region flanqueante 5 'o 3') contigua con el mismo, permitiendo la identificacion especifica del evento elite. La invencion tambien se refiere a plantas que comprenden el evento EE-GM3 tal como se identifica en el presente documento.

La presente invencion se refiere ademas a metodos para identificar el evento elite EE-GM3 en muestras biologicas, como se divulga en una cualquiera de las reivindicaciones 17-19, 23 y 26, cuyos metodos se basan en cebadores o sondas que reconocen especificamente la secuencia flanqueante 5 ' y/o 3' del ADN extrano que comprende los genes de tolerancia a herbicidas en EE-GM3.

La presente invencion tambien se refiere a un metodo para detectar la presencia del evento elite EE-GM3 en muestras biologicas como se divulga en la reivindicacion 27.

Mas especificamente, la invencion se refiere a un metodo que comprende amplificar una secuencia de un acido nucleico presente en muestras biologicas, utilizando una reaccion en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, uno de los cuales reconoce la region flanqueante 5 'o 3' del ADN extrano que comprende los genes de tolerancia a herbicidas en EE-GM3, el otro que reconoce una secuencia dentro del ADN extrano que comprende los genes de tolerancia a herbicidas, preferentemente para obtener un fragmento de ADN de entre 100 y 800 pb. Los cebadores pueden reconocer una secuencia dentro de la region flanqueante 5 ' de EE-GM3 (SEQ ID NO: 2, desde la posicion 1 a la posicion 1451) o dentro de la region flanqueante 3' de EE-GM3 (complemento de la SEQ ID NO: 3 desde la posicion 241 a la posicion 1408) y una secuencia dentro del ADN extrano que comprende genes de tolerancia a herbicidas (complemento de la SE^q ID NO: 2 desde la posicion 1452 a 1843 o la SEQ ID NO: 3 desde la posicion 1 a la posicion 240), respectivamente. El cebador que reconoce la region flanqueante 3' puede comprender la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 5 y el cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN extrano que comprende genes de tolerancia a herbicidas puede comprender la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 7 descritas en el presente documento. Esta invencion tambien se refiere a los cebadores especificos, como se describe en el presente documento.

La presente invencion se refiere mas especificamente a un metodo para identificar el evento elite EE-GM3 en muestras biologicas, metodo que comprende amplificar una secuencia de un acido nucleico presente en una muestra biologica, utilizando una reaccion en cadena de la polimerasa con dos cebadores que comprenden o consisten (esencialmente) en la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5 respectivamente, para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 263 pb o con dos cebadores que comprenden o consisten (esencialmente) en la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 7 respectivamente, para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 706 pb. Tambien se incluyen en esta invencion las plantas que comprenden el evento elite EE-GM3 identificado de este modo.

Tambien se describen en el presente documento las secuencias flanqueantes especificas de EE-GM3 descritas en el presente documento, que pueden usarse para desarrollar metodos de identificacion especificos para EE-GM3 en muestras biologicas. Dichas secuencias flanqueantes especificas tambien pueden usarse como material de control de referencia en ensayos de identificacion. Mas particularmente, la presente memoria descriptiva describe las regiones flanqueantes 5' y/o 3' de EE-GM3 que pueden usarse para el desarrollo de cebadores y sondas especificos como se describe adicionalmente en el presente documento. Tambien son adecuadas como material de referencia las moleculas de acido nucleico, preferentemente de aproximadamente 150-850 pb, que comprenden la secuencia que puede amplificarse mediante cebadores que comprenden o consisten (esencialmente) en la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 5 o la de SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5.

La invencion se refiere ademas a metodos de identificacion para la presencia de EE-GM3 en muestras biologicas basadas en el uso de dichos cebadores o sondas especificos. Los cebadores pueden comprender, consistir o consistir esencialmente en una secuencia de nucleotidos de 17 a aproximadamente 200 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO:2 del nucleotido 1 al nucleotido 1451 o el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 241 hasta nucleotido 1408, combinado con cebadores que comprenden, consisten, o consisten esencialmente en una secuencia de nucleotidos de 17 a aproximadamente 200 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2, tal como una secuencia de nucleotidos de 17 a aproximadamente 200 nucleotidos consecutivos seleccionados de la complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1452 al nucleotido 1843 o la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 1 al nucleotido 240. Los cebadores tambien pueden comprender estas secuencias de nucleotidos ubicadas en su extremo 3 ', y ademas comprenden secuencias no relacionadas o secuencias derivadas de las secuencias de nucleotidos mencionadas, pero que comprenden desapareamientos.

La invencion se refiere ademas a kits para identificar el evento elite EE-GM3 en muestras biologicas, como se divulga en la reivindicacion 25, comprendiendo, dichos kits, al menos un cebador o sonda que reconoce especificamente la region flanqueante 5 'o 3' del ADN extrano que comprende los genes de tolerancia a herbicidas en EE-GM3.

El kit de la invencion puede comprender, ademas de un cebador que reconoce especificamente la region flanqueante 5 'o 3' de EE-GM3, un segundo cebador que reconoce especificamente una secuencia dentro del ADN extrano que comprende genes de tolerancia a herbicidas de EE-GM3, para su uso en un protocolo de identificacion por PCR. Los kits de la invencion pueden comprender al menos dos cebadores especificos, uno de los cuales reconoce una secuencia dentro de la region flanqueante 5' de EE-GM3, y el otro reconoce una secuencia dentro del ADN extrano que comprende genes de tolerancia a herbicidas. El cebador que reconoce la region flanqueante 3 ' puede comprender la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 5 y el cebador que reconoce los transgenes o ADN extrano que comprende genes de tolerancia a herbicidas puede comprender la secuencia de nucleotidos de las SEQ ID NO: 4 o 7, o cualquier otro cebador o combinacion de cebadores como se describe en el presente documento.

La invencion se refiere ademas a un kit para identificar el evento elite EE-GM3 en muestras biologicas, comprendiendo dicho kit los cebadores de PCR que comprenden o consisten (esencialmente) en la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 4 para su uso en el Protocolo de Identificacion por PCR de EE-GM3 descrito en el presente documento.

La invencion se refiere ademas a un kit para identificar el evento elite EE-GM3 en muestras biologicas, cuyo kit comprende una sonda especifica como se divulga en la reivindicacion 24. Lo mas preferentemente, la sonda especifica comprende o consiste (esencialmente) en (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre el 80% y el 100% de identidad de secuencia con la secuencia entre el nucleotido 1431 a 1472 de la SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene entre el 80% y el 100% de identidad de secuencia a la secuencia entre el nucleotido 220 al 260 de la SEQ ID NO: 3.

De acuerdo con otro aspecto de la memoria descriptiva, se divulgan secuencias de ADN que comprenden el sitio de insercion del evento y la longitud suficiente de los polinucleotidos tanto del ADN genomico de la soja como del ADN extrano que comprende genes de tolerancia a los herbicidas (transgen), para que sean utiles como cebador o sonda para la deteccion de EE-GM3 y para caracterizar las plantas que comprenden el evento EE-GM3. Dichas secuencias pueden comprender al menos 9 nucleotidos del ADN genomico de la soja y un numero similar de nucleotidos del ADN extrano que comprende los genes de tolerancia a los herbicidas de EE-GM3, a cada lado del sitio de union, respectivamente. De la forma mas preferente, tales secuencias de ADN comprenden al menos 9 nucleotidos del ADN genomico de soja y un numero similar de nucleotidos del ADN extrano que comprenden genes de tolerancia a herbicidas contiguos con el sitio de insercion en la SEQID NO: 2 o la SEQID NO: 3. En un aspecto, se proporcionan plantas de soja que comprenden tales secuencias de ADN especificas.

La invencion se refiere ademas a una molecula de acido nucleico como se divulga en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6.

La invencion se refiere ademas a una molecula de ADN como se divulga en la reivindicacion 7, y a una planta de soja que comprende dicha molecula de ADN, como se divulga en la reivindicacion 9.

La invencion se refiere ademas a una molecula de ADN como se divulga en la reivindicacion 8, y a una planta, tejido celular o semilla de soja, comprendiendo cada uno dicha molecula de ADN, como se divulga en la reivindicacion 10. Los metodos y kits abarcados por la presente invencion se pueden usar para diferentes fines, tales como, pero sin limitacion, los siguientes: para identificar la presencia o determinar el umbral (inferior) de EE-GM3 en plantas, material vegetal o en productos tales como, pero sin limitacion, productos alimenticios o piensos (frescos o procesados) que comprenden o se derivan de material vegetal; adicionalmente o como alternativa, los metodos y kits de la presente invencion se pueden usar para identificar material vegetal transgenico para fines de segregacion entre materiales transgenicos y no transgenicos; adicionalmente o como alternativa, los metodos y kits de la presente invencion se pueden usar para determinar la calidad (es decir, el porcentaje de material puro) del material vegetal que comprende EE-GM3.

La memoria descriptiva describe ademas las regiones flanqueantes 5' y/o 3' de EE-GM3 y la invencion se refiere a los cebadores y sondas especificos desarrollados a partir de las secuencias flanqueantes 5' y/o 3' de EE-GM3, como se divulga en cualquiera de las reivindicaciones 20-22 y 24.

En el presente documento tambien se describe el ADN genomico obtenido de plantas que comprenden el evento elite EE-GM3. Dicho ADN genomico se puede usar como material de control de referencia en los ensayos de identificacion descritos en el presente documento.

Tambien se proporciona en el presente documento una planta de soja transgenica tolerante a herbicida, o celulas, partes, semillas o progenie de la misma, que comprende cada una al menos un evento elite, dicho evento elite comprende un ADN extrano que comprende:

i) un primer gen quimerico que comprende un gen epsps modificado de Zea mays que codifica una enzima EPSPS tolerante al glifosato bajo el control de un promotor expresable en plantas, y

ii) un segundo gen quimerico que comprende un gen hppd modificado de Pseudomonas fluorescens que codifica una enzima tolerante a herbicida inhibidor de HPPD bajo el control de un promotor expresable en plantas.

En una realizacion, dicho evento elite comprende los nucleotidos 1 a 1451 de la SEQ ID NO: 2 inmediatamente cadena arriba y contiguos con dicho ADN extrano y los nucleotidos 241 a 1408 de la SEQ ID NO: 3 inmediatamente cadena abajo y contiguos con dicho ADN extrano.

En una realizacion adicional, dicho evento elite puede obtenerse mediante la reproduccion con una planta de soja cultivada a partir de semilla de referencia que comprende dicho evento que se ha depositado en el NCIMB con el numero de deposito NCIMB 41659.

En otra realizacion, el ADN genomico de dicha planta de soja, o celulas, partes, semillas o progenie de la misma cuando se analiza utilizando el protocolo de identificacion de eventos elite para dicho evento elite con dos cebadores que comprenden la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5 respectivamente, produce un Fragmento de ADN de (aproximadamente) 263 pb.

En el presente documento, tambien se proporciona un metodo para identificar una planta transgenica de soja, o celulas, partes, semillas o progenie de las mismas tolerantes al glifosato y/o a un herbicida inhibidor de HPPD, como el isoxaflutol, en muestras biologicas, comprendiendo dicho metodo amplificar un fragmento de ADN de entre 100 y 500 pb de un acido nucleico presente en muestras biologicas utilizando una reaccion en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, uno de dichos cebadores reconoce la region flanqueante 5' del evento elite especificado anteriormente, comprendiendo dicha region flanqueante 5' la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1 al nucleotido 1451, o la region flanqueante 3 'de dicho evento elite, comprendiendo dicha region flanqueante 3' o la secuencia de nucleotidos del complemento de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 1408, el otro cebador de dichos cebadores que reconoce una secuencia dentro del ADN extrano que comprende la secuencia de nucleotidos del complemento de la SEQ ID NO:2 del nucleotido 1452 al nucleotido 1843 o la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 1 al nucleotido 240.

En el presente documento, tambien se proporciona un kit para identificar una planta transgenica de soja, o celulas, partes, semillas o progenie de las mismas tolerantes al glifosato y/o a un herbicida inhibidor de HPPD, como el isoxaflutol, en muestras biologicas, comprendiendo dicho kit un cebador que reconoce la region flanqueante 5' del evento elite especificado anteriormente, comprendiendo dicha region flanqueante 5' la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1 al nucleotido 1451, o un cebador que reconoce la region flanqueante 3 'de dicho evento elite, comprendiendo dicha region flanqueante 3' la secuencia de nucleotidos del complemento de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 1408, y un cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN extrano, comprendiendo dicho ADN extrano que comprende la secuencia de nucleotidos del complemento de la SEQ ID NO:2 del nucleotido 1452 al nucleotido 1843 o la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 1 al nucleotido 240.

En una realizacion de la invencion, el ADN extrano del evento elite EE-GM3, como se usa en el presente documento, comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 11 desde la posicion del nucleotido 1452 hasta la posicion del nucleotido 16638 o su complemento. En el presente documento tambien se divulga un ADN extrano de elite EE-GM3 que comprende una secuencia con al menos el 95, 98, 99 o 99,5% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 11 desde la posicion del nucleotido 1452 hasta la posicion del nucleotido 16638 o su complemento.

En el presente documento, tambien se describe una planta, celula vegetal, tejido o semilla de soja, que comprende en su genoma una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos con al menos el 97, 98 o al menos el 99% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 11 desde la posicion del nucleotido 1452 hasta la posicion del nucleotido 16638 o el complemento de la misma, o una secuencia de nucleotidos con al menos el 97, 98, o al menos el 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11 o el complemento de la misma.

En el presente documento, tambien se describe una planta, celula vegetal, tejido o semilla de soja, que comprende en su genoma una molecula de acido nucleico que hibrida con la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 1 o el complemento de la misma, o que hibrida con la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 11 desde la posicion del nucleotido 1452 hasta la posicion del nucleotido 16638 o el complemento de la misma, o hibrida a la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 11 o al complemento de la misma.

En el presente documento, tambien se describe una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos con al menos el 99% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 11 desde la posicion del nucleotido 1452 hasta la posicion del nucleotido 16638 o sel complemento de la misma, o una secuencia de nucleotidos con al menos el 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11 o el complemento de la misma, o una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que hibrida con la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 11 desde la posicion del nucleotido 1452 hasta la posicion del nucleotido 16638 o el complemento de la misma, o hibrida a la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 11 o al complemento de la misma.

La invencion tambien se refiere a un metodo para producir un producto de soja como se divulga en la reivindicacion 11.

La invencion se refiere ademas a un proceso para cultivar plantas de soja que contienen el evento elite EE-GM3, como se divulga en una cualquiera de las reivindicaciones 12-15.

Breve descripcion de los dibujos

Los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar la invencion a las realizaciones especificas descritas, pueden entenderse junto con las Figuras adjuntas, en las cuales:

Figura 1: Representacion esquematica de la relacion entre las secuencias de nucleotidos citadas y los cebadores. barra negra: ADN extrano; barra sombreada: ADN de origen vegetal; flecha a cuadros (a): gen quimerico que codifica HPPD Pf W366 (vease la Tabla 1 para conocer la composicion del gen quimerico); flecha sombreada (b): gen quimerico que codifica 2mEPSPS (vease la Tabla 1 para conocer la composicion del gen quimerico); flechas negras: cebadores de oligonucleotidos, las figuras debajo de las barras representan posiciones de nucleotidos; (c) se refiere al complemento de la secuencia de nucleotidos indicada; Nota: el esquema no esta dibujado a escala.

Figura 2: Resultados obtenidos por el Protocolo de Identificacion por PCR desarrollado para EE-GM3.

Secuencia de carga del gel: Carril l: Marcador de peso molecular (escalera de 100 pb); Carriles 2 y 3: Muestras de ADN de plantas de soja que comprenden el evento transgenico EE-GM3; carriles 4-7: Muestras de ADN de plantas de soja transgenicas que no comprenden el evento elite EE-GM3, pero que comprenden los mismos genes de tolerancia a herbicidas (otros eventos de transformacion); carril 8: Muestra de ADN de soja de tipo silvestre; carril 9: ADN control no plantilla; carril 10: marcador de peso molecular.

Figura 3: Resultados obtenidos por el protocolo de PCR de puntuacion de cigosidad desarrollado para EE-GM3. Secuencia de carga del gel: Carril l: Marcador de peso molecular (escalera de 100 pb); Carriles 2 y 5: Muestras de ADN de plantas de soja que comprenden el evento transgenico EE-GM3 en forma homocigotica; calles 3, 8 y 9: Muestras de ADN de plantas de soja que comprenden el evento transgenico EE-GM3 en forma heterocigotica; carriles 4, 6 y 7: Muestra de ADN control de planta de soja acigotica; carril 10: ADN control no plantilla; carril 11: marcador de peso molecular.

Descripcion detallada de las realizaciones preferidas de la invencion

La incorporacion de una molecula de ADN recombinante en el genoma de la planta generalmente da como resultado la transformacion de una celula o tejido. El sitio determinado de incorporacion se debe generalmente a la integracion aleatoria.

El ADN introducido en el genoma de la planta como resultado de la transformacion de una celula o tejido vegetal con un ADN recombinante o "ADN transformante", y que se origina a partir de dicho ADN transformante, se denomina en lo sucesivo en el presente documento "ADN extrano" que comprende uno o mas "transgenes". Los transgenes de EE-GM3 son los genes de tolerancia a glifosato y a herbicidas inhibidores de HPPD. "ADN de la planta" en el contexto de la presente invencion se referira al ADN que se origina a partir de la planta que se transforma. El ADN de la planta generalmente se encontrara en el mismo locus genetico en la planta de tipo silvestre correspondiente. El ADN extrano se puede caracterizar por la ubicacion y la configuracion en el sitio de incorporacion de la molecula de ADN recombinante en el genoma de la planta. El sitio en el genoma de la planta donde se ha insertado un ADN recombinante tambien se denomina "sitio de insercion" o "sitio diana". La insercion del ADN recombinante en la region del genoma de la planta denominado "ADN de la planta previo a la insercion" puede asociarse con una delecion del ADN de la planta, denominada "eliminacion del sitio diana". Una "region flanqueante" o "secuencia flanqueante" como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de al menos 20 pb, preferentemente al menos 50 pb, y hasta 5000 pb de ADN diferente del ADN introducido, preferentemente ADN del genoma de la planta que esta localizada inmediatamente cadena arriba y contiguo con o inmediatamente cadena abajo y contiguo con el ADN extrano. Los procedimientos de transformacion que dan lugar a la integracion aleatoria del ADN extrano daran como resultado transformantes con diferentes regiones flanqueantes, que son caracteristicas y unicas para cada transformante. Cuando el ADN recombinante se introduce en una planta a traves del cruce tradicional, su sitio de insercion en el genoma de la planta o sus regiones flanqueantes generalmente no se cambiaran.

Un "acido nucleico aislado (secuencia)" o "ADN aislado (secuencia)", como se usa en el presente documento, se refiere a un acido nucleico o ADN (secuencia) que ya no esta en el entorno natural del que se aislo, por ejemplo, la secuencia de acido nucleico en otro hospedador bacteriano o en un genoma de una planta, o un acido nucleico o ADN fusionado a ADN o nucleico acido de otro origen, como cuando esta contenido en un gen quimerico bajo el control de un promotor expresable en plantas.

Un evento se define como un locus genetico (artificial) que, como resultado de la ingenieria genetica, porta un ADN extrano o un transgen que comprende al menos una copia de un gen de interes o de los genes de interes. Los estados alelicos tipicos de un evento son la presencia o ausencia del ADN extrano. Un evento se caracteriza fenotipicamente por la expresion del transgen. A nivel genetico, un evento es parte de la composicion genetica de una planta. A nivel molecular, un evento se puede caracterizar por el mapa de restriccion (por ejemplo, como se determina por transferencia Southern), por las secuencias flanqueantes cadena arriba y/o cadena abajo del transgen, la ubicacion de los marcadores moleculares y/o la configuracion molecular del transgen. Normalmente, la transformacion de una planta con un ADN transformante que comprende al menos un gen de interes da lugar a una poblacion de transformantes que comprende una multitud de eventos separados, cada uno de los cuales es unico. Un evento se caracteriza por el ADN extrano y al menos una de las secuencias flanqueantes.

Un evento elite, como se usa en el presente documento, es un evento que se selecciona de un grupo de eventos, obtenido por transformacion con el mismo ADN transformante, en funcion de la expresion y la estabilidad del (de los) transgen(es) y su compatibilidad con las caracteristicas agronomicas optimas de la planta que lo comprende. Por lo tanto, los criterios para la seleccion de eventos elite son uno o mas, preferentemente dos o mas, ventajosamente todos los siguientes:

a) que la presencia del ADN extrano no comprometa otras caracteristicas deseadas de la planta, como las relacionadas con el rendimiento agronomico o el valor comercial;

b) que el evento se caracterice por una configuracion molecular bien definida que se herede de forma estable y para la cual se pueden desarrollar herramientas apropiadas para el control de identidad;

c) que (el)los gen(es) de interes muestre(n) una expresion fenotipica espacial y temporal correcta, apropiada y estable, tanto en condiciones heterocigoticas (o hemicigoticas) como homocigoticas del evento, a un nivel comercialmente aceptable en un intervalo de condiciones ambientales en las que las plantas que portan el evento probablemente esten expuestas a uso agronomico normal.

Se prefiere que el ADN extrano se asocie con una posicion en el genoma de la planta que permita la introgresion facil en los origenes geneticos comerciales deseados.

El estado de un evento como un evento elite se confirma mediante la introgresion del evento elite en diferentes origenes geneticos relevantes y observando el cumplimiento de uno, dos o todos los criterios, por ejemplo. a), b) y c) anteriores.

Por lo tanto, un "evento elite" se refiere a un locus genetico que comprende un ADN extrano, que cumple con los criterios descritos anteriormente. Una planta, material vegetal o progenie, tal como las semillas, pueden comprender uno o mas eventos elite en su genoma.

Las herramientas desarrolladas para identificar un evento elite o la planta o material vegetal que comprende un evento elite, o productos que comprenden material vegetal que comprende el evento elite, se basan en las caracteristicas genomicas especificas del evento elite, tal como, un mapa de restriccion especifico de la region genomica que comprende el ADN extrano, los marcadores moleculares o la secuencia de la region o regiones flanqueantes del ADN extrano.

Una vez que se han secuenciado una o las dos regiones flanqueantes del ADN extrano, se pueden desarrollar cebadores y sondas que reconocen especificamente esta(s) secuencia(s) en el acido nucleico (ADN o ARN) de una muestra por medio de una tecnica de biologia molecular. Por ejemplo, se puede desarrollar un metodo de PCR para identificar el evento elite en muestras biologicas (como muestras de plantas, material vegetal o productos que comprenden material vegetal). Dicha PCR se basa en al menos dos "cebadores" especificos, uno que reconoce una secuencia dentro de la region flanqueante 5 'o 3' del evento elite y el otro que reconoce una secuencia dentro del ADN extrano. Los cebadores tienen preferentemente una secuencia de entre 15 y 35 nucleotidos que en condiciones de PCR optimizadas "reconocen especificamente" una secuencia dentro de la region flanqueante 5 'o 3' del evento elite y el ADN extrano del evento elite respectivamente, de modo que el fragmento ("fragmento de integracion" o amplicon discriminante) se amplifica a partir de una muestra de acido nucleico que comprende el evento elite. Esto significa que solo el fragmento de integracion marcado, y ninguna otra secuencia en el genoma de la planta o del ADN extrano, se amplifica en condiciones de PCR optimizadas.

Los cebadores de PCR adecuados para la invencion pueden ser los siguientes:

- oligonucleotidos que varfan en longitud de 17 nt a aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleotidos de al menos 17 nucleotidos consecutivos, preferentemente 20 nucleotidos consecutivos, seleccionados del ADN de la planta en la secuencia flanqueante 5 '(SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1 al nucleotido 1451) en su extremo 3 '(cebadores que reconocen las secuencias flanqueantes 5'); o

- oligonucleotidos que varfan en longitud de 17 nt a aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleotidos de al menos 17 nucleotidos consecutivos, preferentemente 20 nucleotidos consecutivos, seleccionados del ADN de la planta en la secuencia flanqueante 3' (complemento de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 1408) en su extremo 3 '(cebadores que reconocen secuencias flanqueantes 3'); o

- oligonucleotidos que varfan en longitud de 17 nt a aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleotidos de al menos 17 nucleotidos consecutivos, preferentemente 20 nucleotidos consecutivos, seleccionados de las secuencias de ADN insertadas (complemento de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1452 al nucleotido 1843) en su extremo 3' (cebadores que reconocen el ADN extrano); o

- oligonucleotidos que varfan en longitud de 17 nt a aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleotidos de al menos 17 nucleotidos consecutivos, preferentemente 20 nucleotidos consecutivos, seleccionados de las secuencias de ADN insertadas (SEQ ID NO: 3 del nucleotido 1 al nucleotido 240); o

- oligonucleotidos adecuados que varfan en longitud de 17 nt a aproximadamente 200 nt, que comprenden una secuencia de nucleotidos de al menos 17 nucleotidos consecutivos, preferentemente 20 nucleotidos consecutivos, seleccionado de la secuencia de nucleotidos del fragmento de ADN insertado o su complemento (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 11 desde la posicion del nucleotido 1452 a 16638).

Los cebadores pueden, por supuesto, ser mas largos que los 17 nucleotidos consecutivos mencionados, y pueden, por ejemplo, tener 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nt de largo o incluso mas. Los cebadores pueden consistir completamente en una secuencia de nucleotidos seleccionada de las secuencias de nucleotidos mencionadas de secuencias flanqueantes y secuencias de ADN extrano. Sin embargo, la secuencia de nucleotidos de los cebadores en su extremo 5 '(es decir, fuera de los 17 nucleotidos consecutivos ubicados en 3') es menos crftica. Por lo tanto, la secuencia 5' de los cebadores puede comprender o consistir en una secuencia de nucleotidos seleccionada de las secuencias flanqueantes o ADN extrano, segun sea apropiado, pero puede contener varios (por ejemplo, 1, 2, 5, o 10) desapareamientos. La secuencia 5' de los cebadores puede ser incluso completamente una secuencia de nucleotidos no relacionada con las secuencias flanqueantes o ADN extrano, tal como, por ejemplo, una secuencia de nucleotidos que representa uno o mas sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion. Dichas secuencias no relacionadas o las secuencias de ADN flanqueantes con desapareamientos no deben ser preferentemente mayores de 100, mas preferentemente no mayores de 50 o incluso 25 nucleotidos.

Ademas, los cebadores adecuados pueden comprender o consistir (esencialmente) en una secuencia de nucleotidos en su extremo 3' que abarca la region de union entre las secuencias derivadas del ADN de la planta y las secuencias de ADN extrano (ubicadas en los nucleotidos 1451-1452 en la SEQ ID NO: 2 y los nucleotidos 240-241 en la SEQ ID NO: 3) siempre que los 17 nucleotidos consecutivos ubicados en 3' mencionados no deriven exclusivamente de ADN extrano o secuencias derivadas de plantas en las SEQ ID NO: 2 o 3.

Tambien quedara inmediatamente claro para el experto en la materia que los pares de cebadores de PCR seleccionados correctamente no deben comprender secuencias complementarias entre sf.

Para los fines de la invencion, el "complemento de una secuencia de nucleotidos representada en la SEQ ID NO: X" es la secuencia de nucleotidos que puede derivar de la secuencia de nucleotidos representada reemplazando los nucleotidos con su nucleotido complementario de acuerdo con las reglas de Chargaff (A^T; G ^C ) y leyendo la secuencia en direccion 5' a 3', es decir, en direccion opuesta a la secuencia de nucleotidos representada.

Ejemplos de cebadores adecuados son las secuencias de oligonucleotidos de la SEQ ID NO: 5 (cebador de reconocimiento de la secuencia flanqueante 3'), de la SEQ ID NO: 4 (cebador de reconocimiento de ADN extrano para su uso con los cebadores de reconocimiento de la secuencia flanqueante 3 '), o de la SEQ ID NO: 7 (cebador de reconocimiento de ADN extrano para su uso con los cebadores de reconocimiento de la secuencia flanqueante 3').

Otros ejemplos de cebadores de oligonucleotidos adecuados comprenden en su extremo 3' las siguientes secuencias o consisten (esencialmente) en tales secuencias:

a. cebadores de reconocimiento de la secuencia flanqueante 5':

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 264 al nucleotido 283

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 266 al nucleotido 285

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1240 al nucleotido 1259

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 265 al nucleotido 285

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 265 al nucleotido 283

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1239 al nucleotido 1259

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1241 al nucleotido 1259

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1244 al nucleotido 1263

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1248 al nucleotido 1267

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1250 al nucleotido 1269

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 262 al nucleotido 279

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 263 al nucleotido 279

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 264 al nucleotido 285

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 266 al nucleotido 283

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1238 al nucleotido 1259

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1242 al nucleotido 1259

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1243 al nucleotido 1263

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1245 al nucleotido 1263

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1247 al nucleotido 1267

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1249 al nucleotido 1269

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1249 al nucleotido 1267

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 263 al nucleotido 285

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 267 al nucleotido 283

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1242 al nucleotido 1263

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1243 al nucleotido 1259

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1246 al nucleotido 1267

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1246 al nucleotido 1263

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1248 al nucleotido 1269

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1250 al nucleotido 1271

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1250 al nucleotido 1267

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1241 al nucleotido 1263

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1245 al nucleotido 1267

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1247 al nucleotido 1269

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1247 al nucleotido 1263

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1249 al nucleotido 1271

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1242 al nucleotido 1261

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1241 al nucleotido 1261

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1243 al nucleotido 1261

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1240 al nucleotido 1261

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1244 al nucleotido 1261

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1239 al nucleotido 1261

la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1245 al nucleotido 1261

b. cebadores de reconocimiento de la secuencia de ADN extrano para su uso con los cebadores de reconocimiento de la secuencia flanqueante 5':

- el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1732 al nucleotido 1751 - el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1735 al nucleotido 1754 - el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1731 al nucleotido 1750 - el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1732 al nucleotido 1750 - el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1732 al nucleotido 1752 - el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1731 al nucleotido 1749 - el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1732 al nucleotido 1749 - el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1731 al nucleotido 1751 - el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1732 al nucleotido 1753 - el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1731 al nucleotido 1748 - el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1732 al nucleotido 1748 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1735 a nucleotido 1751 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1731 a nucleotido 1752 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1732 a nucleotido 1754 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1731 a nucleotido 1747 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1731 a nucleotido 1753 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1727 a nucleotido 1746 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1727 a nucleotido 1745 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1727 a nucleotido 1747 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1727 a nucleotido 1744 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1727 a nucleotido 1748 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1727 a nucleotido 1749 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1726 a nucleotido 1745 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1726 a nucleotido 1744 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1726 a nucleotido 1746 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1726 a nucleotido 1747 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1726 a nucleotido 1748 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1724 a nucleotido 1744 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1724 a nucleotido 1745 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1724 a nucleotido 1746 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1461 a nucleotido 1478 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1670 a nucleotido 1686 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1469 a nucleotido 1486 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1508 a nucleotido 1527 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1667 a nucleotido 1686 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1670 a nucleotido 1687 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1673 a nucleotido 1689 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1688 a nucleotido 1704 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1688 a nucleotido 1705 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1692 a nucleotido 1709 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1467 a nucleotido 1486 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1481 a nucleotido 1497 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1481 a nucleotido 1498 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1491 a nucleotido 1507 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1491 a nucleotido 1508 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1672 a nucleotido 1688 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1673 a nucleotido 1690 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1673 a nucleotido 1691 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1688 a nucleotido 1706 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1691 a nucleotido 1707 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1691 a nucleotido 1708 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1469 a nucleotido 1487 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1481 a nucleotido 1499 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1489 a nucleotido 1505 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1489 a nucleotido 1506 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1489 a nucleotido 1507 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1489 a nucleotido 1508 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1666 a nucleotido 1686 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1667 a nucleotido 1687 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1670 a nucleotido 1688 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1672 a nucleotido 1689 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1688 a nucleotido 1707 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1691 a nucleotido 1709 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1692 a nucleotido 1710 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1481 a nucleotido 1500 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1491 a nucleotido 1509 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1670 a nucleotido 1689 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1672 a nucleotido 1690 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1672 a nucleotido 1691 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1687 a nucleotido 1705 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1687 a nucleotido 1706 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1691 a nucleotido 1710 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1472 a nucleotido 1488 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1488 a nucleotido 1507 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1491 a nucleotido 1510 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1495 a nucleotido 1512 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1495 a nucleotido 1513 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1495 a nucleotido 1514 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1673 a nucleotido 1692 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1678 a nucleotido 1694 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1678 a nucleotido 1695 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1678 a nucleotido 1696 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1687 a nucleotido 1703 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1687 a nucleotido 1704 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1692 a nucleotido 1711 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1469 a nucleotido 1488 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1488 a nucleotido 1506 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1491 a nucleotido 1511 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1670 a nucleotido 1690 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1678 a nucleotido 1697 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1688 a nucleotido 1709 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1467 a nucleotido 1487 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1488 a nucleotido 1508 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1495 a nucleotido 1511 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1491 a nucleotido 1512 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1666 a nucleotido 1687 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1667 a nucleotido 1688 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1672 a nucleotido 1692 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1673 a nucleotido 1693 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1687 a nucleotido 1707 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1472 a nucleotido 1490 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1472 a nucleotido 1491 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1481 a nucleotido 1501 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1489 a nucleotido 1509 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1495 a nucleotido 1515 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1670 a nucleotido 1691 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1673 a nucleotido 1694 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1678 a nucleotido 1698 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1469 a nucleotido 1489 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1667 a nucleotido 1689 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1687 a nucleotido 1708 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1688 a nucleotido 1710 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1691 a nucleotido 1711 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1472 a nucleotido 1492 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1489 a nucleotido 1510 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1666 a nucleotido 1688 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1687 a nucleotido 1709 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1692 a nucleotido 1712 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1467 a nucleotido 1488 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1469 a nucleotido 1490 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1488 a nucleotido 1509 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1489 a nucleotido 1511 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1678 a nucleotido 1699 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1472 a nucleotido 1493 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1472 a nucleotido 1494 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1481 a nucleotido 1502 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1670 a nucleotido 1692 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1469 a nucleotido 1491 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1488 a nucleotido 1510 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1691 a nucleotido 1712 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1692 a nucleotido 1713 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1692 a nucleotido 1714 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1467 a nucleotido 1489 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1678 a nucleotido 1700 el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1481 a nucleotido 1503 - el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1691 al nucleotido 1713 c. cebadores de reconocimiento de la secuencia flanqueante 3':

complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 828 al nucleotido 847 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 830 al nucleotido 849 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 828 al nucleotido 846 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 828 al nucleotido 848 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 830 al nucleotido 848 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 830 al nucleotido 850 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 828 al nucleotido 845 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 830 al nucleotido 847 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 828 al nucleotido 849 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 830 al nucleotido 851 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 828 al nucleotido 844 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 830 al nucleotido 846 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 828 al nucleotido 850 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 830 al nucleotido 852 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 992 al nucleotido 1009 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 731 al nucleotido 752 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 776 al nucleotido 795 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 731 al nucleotido 753 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 776 al nucleotido 794 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 776 al nucleotido 796 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 776 al nucleotido 793 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 776 al nucleotido 797 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 776 al nucleotido 792 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 776 al nucleotido 798 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 733 al nucleotido 752 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 733 al nucleotido 753 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 733 al nucleotido 754 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 733 al nucleotido 755 complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 838 al nucleotido 854 - el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 246 al nucleotido 263

- el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 838 al nucleotido 855

- el complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 245 al nucleotido 264

d. cebadores de reconocimiento de la secuencia de ADN extrano para su uso con cebadores de reconocimiento de la secuencia flanqueante 3':

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 173 al nucleotido 192

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 22 al nucleotido 41

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 172 al nucleotido 192

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 174 al nucleotido 192

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 191 al nucleotido 210

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 171 al nucleotido 192

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 175 al nucleotido 192

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 190 al nucleotido 210

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 192 al nucleotido 210

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 176 al nucleotido 192

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 189 al nucleotido 210

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 193 al nucleotido 210

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 188 al nucleotido 210

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 194 al nucleotido 210

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 199 al nucleotido 218

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 200 al nucleotido 218

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 197 al nucleotido 218

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 201 al nucleotido 218

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 201 al nucleotido 220

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 200 al nucleotido 220

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 199 al nucleotido 220

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 200 al nucleotido 221

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 199 al nucleotido 221

- la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 150 al nucleotido 172

Como se usa en el presente documento, "la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: Z desde la posicion X a la posicion Y" indica la secuencia de nucleotidos que incluye ambos extremos de nucleotidos.

Preferentemente, el fragmento amplificado tiene una longitud de entre 50 y 500 nucleotidos, tal como una longitud de entre 100 y 350 nucleotidos. Los cebadores especificos pueden tener una secuencia que es entre el 80 y el 100% identica a una secuencia dentro de la region flanqueante 5 'o 3' del evento elite y el ADN extrano del evento elite, respectivamente, siempre que los desapareamientos todavia permitan la identificacion especifica del evento elite con estos cebadores en condiciones de PCR optimizadas. Sin embargo, el intervalo de desapareamientos permisibles, puede determinarse facilmente de manera experimental y es conocido por los expertos en la materia.

La deteccion de fragmentos de integracion puede producirse de varias maneras, por ejemplo, a traves de la estimacion del tamano despues del analisis en gel. Los fragmentos de integracion tambien secuenciarse directamente. Tambien se conocen en la tecnica, otros metodos especificos de secuencia para la deteccion de fragmentos de ADN amplificados.

Como la secuencia de los cebadores y su ubicacion relativa en el genoma son unicas para el evento elite, la amplificacion del fragmento de integracion ocurrira solo en muestras biologicas que comprenden (el acido nucleico de) el evento elite. Preferentemente, cuando se realiza una PCR para identificar la presencia de EE-GM3 en muestras desconocidas, se incluye un control de un conjunto de cebadores con los que se puede amplificar un fragmento dentro de un "gen constitutivo" de la especie de planta del evento. Los genes constitutivos son genes que se expresan en la mayoria de los tipos de celulas y que estan relacionados con las actividades metabolicas basicas comunes a todas las celulas. Preferentemente, el fragmento amplificado del gen constitutivo es un fragmento que es mas grande que el fragmento de integracion amplificado. Dependiendo de las muestras a analizar, se pueden incluir otros controles.

Los protocolos de PCR convencionales se describen en la tecnica, tal como en el "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2a edicion, 1999) y otras referencias. Las condiciones optimas para la PCR, incluida la secuencia de los cebadores especificos, se especifican en un "Protocolo de Identificacion por PCR (o Reaccion en Cadena de la Polimerasa)" para cada evento elite. Sin embargo, se entiende que una serie de parametros en el Protocolo de Identificacion por PCR deban ajustarse a condiciones especificas de laboratorio, y pueden modificarse ligeramente para obtener resultados similares. Por ejemplo, el uso de un metodo diferente para la preparacion de ADN puede requerir un ajuste de, por ejemplo, la cantidad de cebadores, la polimerasa y las condiciones de hibridacion utilizadas. De manera similar, la seleccion de otros cebadores puede dictar otras condiciones optimas para el Protocolo de Identificacion por PCR. Sin embargo, estos ajustes seran evidentes para una persona experta en la materia, y ademas se detallan en los manuales de aplicacion de PCR actuales, como el citado anteriormente.

Como alternativa, se pueden usar cebadores especificos para amplificar un fragmento de integracion que se puede usar como una "sonda especifica" para identificar EE-GM3 en muestras biologicas. Poner en contacto el acido nucleico de una muestra biologica, con la sonda, en condiciones que permitan la hibridacion de la sonda con su fragmento correspondiente en el acido nucleico, da como resultado la formacion de un acido nucleico/sonda hibrida. La formacion de este hibrido se puede detectar (por ejemplo, a traves del marcado del acido nucleico o la sonda), por lo que la formacion de este hibrido indica la presencia de EE-GM3. Se han descrito en la tecnica, tales metodos de identificacion basados en la hibridacion con una sonda especifica (ya sea en un soporte de fase solida o en solucion). La sonda especifica es preferentemente una secuencia que, en condiciones optimizadas, hibrida especificamente a una region dentro de la region flanqueante 5 'o 3' del evento elite y preferentemente tambien comprende parte del ADN extrano contiguo a ella (en lo sucesivo denominada "region especifica" "). Preferentemente, la sonda especifica comprende una secuencia de entre 50 y 500 pb, preferentemente de 100 a 350 pb, que es al menos un 80%, preferentemente entre 80 y 85%, mas preferentemente entre 85 y 90%, especialmente preferentemente entre 90 y 95%, de la forma mas preferente entre un 95% y un 100% identica (o complementaria) a la secuencia de nucleotidos de una region especifica. Preferentemente, la sonda especifica comprendera una secuencia de aproximadamente 15 a aproximadamente 100 nucleotidos contiguos identicos (o complementarios) a una region especifica del evento elite.

Los oligonucleotidos adecuados como cebadores de PCR para la deteccion del evento elite EE-GM3 tambien se pueden usar para desarrollar un protocolo basado en PCR para determinar el estado de cigosidad de las plantas que contienen el evento elite. Para este fin, dos cebadores que reconocen el locus de tipo silvestre antes de la integracion estan disenados de tal manera que se dirigen uno hacia el otro y tienen el sitio de insercion ubicado entre los cebadores. Estos cebadores pueden ser cebadores que reconocen especificamente las secuencias flanqueantes 5 'y 3' contenidas en las SEQ ID NO: 2 o 3, respectivamente. Estos cebadores tambien pueden ser cebadores que reconocen especificamente la secuencia flanqueante 5 'o 3'. Para la presente invencion, los cebadores particularmente adecuados que reconocen el locus de tipo silvestre antes de la integracion son cebadores que comprenden o consisten (esencialmente) en la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 6. Este conjunto de cebadores, junto con un tercer cebador complementario para transformar secuencias de ADN (como un cebador que comprende o consiste (esencialmente) en la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 7) permite la amplificacion simultanea por PCR de diagnostico del locus especifico de EE-GM3, asi como del locus de tipo silvestre. Si la planta es homocigotica para el locus transgenico o el locus de tipo silvestre correspondiente, la PCR de diagnostico dara lugar a un unico producto de PCR tipico, preferentemente de longitud tipica, ya sea para el locus transgenico o de tipo silvestre. Si la planta es hemicigotica para el locus transgenico, apareceran dos productos de PCR especificos del locus, lo que refleja tanto la amplificacion del locus transgenico como de tipo silvestre.

Ademas, los metodos de deteccion especificos para el evento elite EE-GM3 que difieren de los metodos de amplificacion basados en PCR tambien se pueden desarrollar utilizando la informacion de secuencia especifica del evento elite que se proporciona en el presente documento. Dichos metodos de deteccion alternativos incluyen metodos de deteccion de amplificacion de senal lineal basados en escision invasiva de estructuras de acido nucleico particulares, tambien conocida como tecnologia InvaderTM, (como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 5.985.557 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", 6,001,567 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage"). Para este fin, la secuencia diana hibrida con un primer oligonucleotido de acido nucleico marcado que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1452 al nucleotido 1469 o su complemento o dicha sonda de acido nucleico marcada que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 223 al nucleotido 240 o su complemento e hibrida adicionalmente con un segundo oligonucleotido de acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1434 al nucleotido 1451 o su complemento o dicha sonda de acido nucleico marcada que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 258 o su complemento, en donde el primer y segundo oligonucleotido se solapan con al menos un nucleotido. La estructura duplex o triple que se produce mediante esta hibridacion permite la escision selectiva de la sonda con una enzima (Cleavase®) dejando la secuencia diana intacta. La sonda marcada escindida se detecta posteriormente, potencialmente a traves de una etapa intermedia que da como resultado una amplificacion adicional de la senal.

Un "kit", como se usa en el presente documento, se refiere a un conjunto de reactivos con el proposito de realizar el metodo de la invencion, mas particularmente, la identificacion del evento elite EE-GM3 en muestras biologicas o la determinacion del estado de cigosidad de EE-GM3 que contiene material vegetal. Mas particularmente, una realizacion preferida del kit de la invencion comprende al menos dos cebadores especificos, como se describe anteriormente para la identificacion del evento elite, o tres cebadores especificos para la determinacion del estado de cigosidad. Opcionalmente, el kit puede comprender ademas cualquier otro reactivo descrito en el presente documento en el Protocolo de Identificacion por PCR. Como alternativa, segun otra realizacion de esta invencion, el kit puede comprender una sonda especffica, como se describe anteriormente, que hibrida especfficamente con acido nucleico de muestras biologicas para identificar la presencia de EE-GM3 en las mismas. Opcionalmente, el kit puede comprender ademas cualquier otro reactivo (tal como, pero sin limitacion, un tampon de hibridacion, marcador) para la identificacion de EE-GM3 en muestras biologicas, utilizando la sonda especffica.

El kit de la invencion se puede usar, y sus componentes se pueden ajustar especfficamente, para fines de control de calidad (por ejemplo, pureza de lotes de semillas), deteccion de la presencia o ausencia del evento elite en material vegetal o material que comprende o deriva de material vegetal, tal como, pero sin limitacion, productos alimenticios o piensos.

Como se usa en el presente documento, "identidad de secuencia" con respecto a las secuencias de nucleotidos (ADN o ARN), se refiere al numero de posiciones con nucleotidos identicos dividido por el numero de nucleotidos en la mas corta de las dos secuencias. La alineacion de las dos secuencias de nucleotidos se realiza mediante el algoritmo de Wilbur y Lipmann (Wilbur y Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad Sci. USA 80: 726) utilizando un tamano de ventana de 20 nucleotidos, una longitud de palabra de 4 nucleotidos y una penalizacion por huecos de 4. El analisis asistido por ordenador y la interpretacion de los datos de secuencia, incluida la alineacion de secuencia como se describe anteriormente, pueden, por ejemplo, realizarse convenientemente usando el paquete de software de analisis de secuencias del Genetics Computer Group (GCG, Centro de Biotecnologfa de la Universidad de Wisconsin). Las secuencias se indican como "esencialmente similares" cuando tales secuencias tienen una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 75%, particularmente al menos aproximadamente el 80%, mas particularmente al menos aproximadamente el 85%, bastante particularmente al menos alrededor del 90%, especialmente al menos aproximadamente el 95%, mas especialmente al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %. Esta claro que cuando se dice que las secuencias de ARN son esencialmente similares o tienen un cierto grado de identidad de secuencia con las secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN. Ademas, esta claro que pueden aparecer pequenas diferencias o mutaciones en secuencias de ADN a lo largo del tiempo y que se pueden permitir algunos desapareamientos para los cebadores o sondas especfficos de eventos de la invencion, por lo que cualquier secuencia de ADN indicada en el presente documento en cualquier realizacion de esta invencion para cualquier ADN flanqueante 3 ' o 5 ' o para cualquier inserto o ADN extrano o cualquier cebador o sonda de esta invencion, tambien incluye secuencias esencialmente similares a las secuencias proporcionadas en el presente documento, tales como secuencias que hibridan a o con al menos el 90%, 95 %, 96 %, 97 %, 98%, o al menos el 99% de identidad de secuencia con la secuencia dada para cualquier ADN flanqueante 3 'o 5', para cualquier cebador o sonda o para cualquier inserto o ADN extrano de esta invencion.

El termino "cebador", como se usa en el presente documento, abarca cualquier acido nucleico que sea capaz de cebar la sfntesis de un acido nucleico naciente en un proceso dependiente de plantilla, tal como PCR. Tfpicamente, los cebadores son oligonucleotidos de 10 a 30 nucleotidos, pero se pueden emplear secuencias mas largas. Los cebadores pueden proporcionarse en forma de doble cadena, aunque se prefiere la forma de cadena sencilla.

Las sondas se pueden usar como cebadores, pero estan disenadas para unirse al ADN o ARN diana y no es necesario usarlas en un proceso de amplificacion.

El termino "reconocer" como se usa en el presente documento cuando se refiere a cebadores especfficos, se refiere al hecho de que los cebadores especfficos hibridan especfficamente con una secuencia de acido nucleico en el evento elite en las condiciones establecidas en el metodo (como las condiciones de la Identificacion de Identificacion por PCR), donde la especificidad se determina por la presencia de controles positivos y negativos.

El termino "hibridar" como se usa en el presente documento cuando se refiere a sondas especfficas, se refiere al hecho de que la sonda se une a una region especffica en la secuencia de acido nucleico del evento elite en condiciones de rigurosidad convencional. Las condiciones de rigurosidad convencional tal como se usan en el presente documento se refieren a las condiciones para la hibridacion descritas en el presente documento o a las condiciones de hibridacion convencionales descritas por Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) que por ejemplo puede comprender las siguientes etapas: 1) inmovilizar los fragmentos de ADN genomico de la planta en un filtro, 2) prehibridar del filtro durante 1 a 2 horas a 42 °C en formamida al 50%, 5 X SSPE, 2 X reactivo de Denhardt y SDS al 0,1%, o durante 1 a 2 horas 68 °C en 6 X SSC, 2 X reactivo de Denhardt y SDS al 0,1%, 3) anadir la sonda de hibridacion que se ha etiquetado, 4) incubar durante 16 a 24 horas, 5) lavar el filtro durante 20 min. a temperatura ambiente en IX SSC, SDS al 0,1%, 6) lavar el filtro tres veces durante 20 min. cada una a 68 °C en 0,2 X ^s S^c , SDS al 0,1%, y 7) exponer el filtro durante 24 a 48 horas a una pelfcula de rayos X a -70 °C con una pantalla intensificadora.

Como se usa en el presente documento, una muestra biologica es una muestra de una planta, material vegetal o productos que comprenden material vegetal. El termino "planta" esta destinado a abarcar tejidos de plantas de soja (Glycine max), en cualquier etapa de madurez, asf como cualquier celula, tejido u organo extrafdo de o derivado de cualquiera de dichas plantas, incluyendo sin limitacion, cualquier semilla, hoja, tallo, flor, rafz, celula individual, gameto, cultivo celular, cultivo de tejido o protoplasto. "Material vegetal", como se usa en el presente documento, se refiere al material obtenido o derivado de una planta. Los productos que comprenden material vegetal se refieren a alimentos, piensos u otros productos que se producen utilizando material vegetal o pueden estar contaminados por material vegetal. Se entiende que, en el contexto de la presente invencion, en dichas muestras biologicas se analiza la presencia de acidos nucleicos especificos para EE-GM3, lo que implica la presencia de acidos nucleicos en las muestras. Por lo tanto, los metodos a los que se hace referencia en el presente documento para identificar el evento elite EE-GM3 en muestras biologicas, se relacionan con la identificacion en muestras biologicas de acidos nucleicos que comprenden el evento elite.

Como se usa en el presente documento, "que comprende" se debe interpretar como que especifica la presencia de las caracteristicas, enteros, etapas, pasos, reactivos o componentes indicados a los que se hace referencia, pero no excluye la presencia o adicion de una o mas caracteristicas, enteros, etapas o componentes, o grupos de los mismos. Por lo tanto, por ejemplo, un acido nucleico o proteina que comprende una secuencia de nucleotidos o aminoacidos, puede comprender mas nucleotidos o aminoacidos que los realmente citados, es decir, estar incrustado en un acido nucleico o proteina mas grande. Un gen quimerico que comprende una secuencia de ADN que esta definida funcional o estructuralmente, puede comprender secuencias de ADN adicionales, tales como un promotor y secuencias de terminacion de la transcripcion.

La presente invencion tambien se refiere al desarrollo de un evento elite EE-GM3 en plantas de soja comprendiendo este evento, la plantas y semillas de progenie que comprenden el evento elite EE-GM3 obtenido de estas plantas y a las celulas vegetales, o material vegetal derivado de plantas que comprenden este evento. Las plantas que comprenden el evento elite EE-GM3 se pueden obtener como se describe en el Ejemplo 1. Esta invencion tambien se refiere a semillas que comprenden el evento elite EE-GM3 depositadas en el NCIMB con el numero de deposito NCIMB 41659 o derivados de las mismas que comprenden el evento elite EE-GM3. "Derivados (de semilla)", como se usa en el presente documento, se refiere a plantas que pueden crecer a partir de dicha semilla, la progenie que resulta del cruce o retrocruzamiento, asi como las celulas vegetales, organos, partes, tejido, cultivo celular, protoplastos y material vegetal de la misma.

Las plantas o el material vegetal de soja que comprenden EE-GM3 se pueden identificar de acuerdo con el Protocolo de Identificacion por PCR descrito para EE-GM3 en el Ejemplo 2. Brevemente, el ADN genomico de la soja presente en la muestra biologica se amplifica por PCR usando un cebador que reconoce especificamente una secuencia dentro de la secuencia flanqueante 5 'o 3' de EE-GM3, tal como el cebador con la secuencia de la SEQ ID NO: 5, y un cebador que reconoce una secuencia en el ADN extrano, tal como el cebador con la secuencia de la SEQ ID NO: 4. Los cebadores de ADN que amplifican parte de una secuencia endogena de soja se utilizan como control positivo para la amplificacion por PCR. Si tras la amplificacion por PCR, el material produce un fragmento del tamano esperado, el material contiene material vegetal de una planta de soja que alberga el evento elite EE-GM3.

Las plantas que albergan EE-GM3 se caracterizan por su tolerancia al glifosato, asi como por su tolerancia a los inhibidores de HPPD, tal como el isoxaflutol. Las plantas que albergan EE-GM3 tambien se caracterizan por tener caracteristicas agronomicas que son comparables a las variedades de soja disponibles comercialmente, en ausencia de la aplicacion de herbicida. Se ha observado que la presencia de un ADN extrano en la region de insercion del genoma de la planta de soja descrita en el presente documento, confiere caracteristicas fenotipicas y moleculares particularmente interesantes a las plantas que comprenden este evento.

Una realizacion de esta invencion proporciona un evento elite en plantas de soja, que se puede obtener mediante la insercion de 2 transgenes en una ubicacion especifica en el genoma de la soja, cuyo evento e elite confiere tolerancia al glifosato y a un herbicida inhibidor de HPPD como el isoxaflutol en tales plantas de soja, y en donde tal evento elite no causa ningun efecto sobre el rendimiento agronomico de tales semillas de soja que afecten negativamente el rendimiento de tales plantas de soja, en comparacion con las lineas isogenicas (como se usa en el presente documento, "lineas isogenicas" o "lineas casi isogenicas" son lineas de soja del mismo origen genetico pero que carecen de transgenes, tal como las plantas del mismo origen genetico que la planta utilizada para la transformacion, o la segregacion de lineas hermanas que han perdido los transgenes). En particular, la presente invencion proporciona un evento elite en plantas de soja, en donde la insercion o presencia de dicho evento elite en el genoma de tales plantas de soja no causa un aumento de la susceptibilidad a la enfermedad, no causa un arrastre en el rendimiento o no causa un aumento en el alojamiento, en tales plantas de soja, en comparacion con las lineas isogenicas. Por lo tanto, la presente invencion proporciona un evento elite en plantas de soja, denominado EE-GM3, que da como resultado plantas de soja que pueden tolerar la aplicacion de glifosato y un herbicida inhibidor de HPPD (ya sea de forma simultanea o por separado) sin afectar negativamente el rendimiento de dichas plantas de soja en comparacion con las lineas isogenicas, cuyas plantas de soja no tienen una diferencia estadisticamente significativa en su susceptibilidad a la enfermedad, o alojamiento, tal como las plantas de soja isogenicas. Estas caracteristicas hacen que el evento elite actual sea muy interesante para controlar las malezas resistentes al glifosato en los campos de soja, y tambien se puede usar en enfoques para prevenir o retrasar un mayor desarrollo de la resistencia al glifosato en los campos de soja (por ejemplo, mediante la aplicacion de glifosato e isoxaflutol, asegurando 2 modos de acciones aplicadas en un campo de soja).

En el presente documento tambien se proporciona una planta de soja o una parte de la misma que comprende el evento EE-GM3, en donde la semilla de soja representativa que comprende el evento EE-GM3 se ha depositado bajo el numero de acceso 41659 de NCIMB. En el presente documento, ademas se proporcionan las semillas de tales plantas, que comprenden dicho evento, y tambien se describe en el presente documento un producto de soja producido a partir de tales semillas, en el que dicho producto de soja comprende el evento EE-GM3. Dicho producto de soja puede ser o puede comprender semola, semillas molidas, harina, copos, etc. En particular, dicho producto de soja comprende un acido nucleico que produce un amplicon diagnostico o especifico para el evento EE-GM3, comprendiendo dicho amplicon las SEQ ID NO: 2 o 3. En el presente documento tambien se describe un metodo para producir un producto de soja, que comprende obtener semillas de soja que comprenden el evento EE-GM3, y producir dicho producto de soja a partir de ellas.

Tambien se proporciona en el presente documento una planta de soja, que es la progenie de cualquiera de las plantas de soja anteriores, y que comprende el evento EE-GM3.

En el presente documento se describe adicionalmente un metodo para producir una planta de soja tolerante al glifosato y/o a herbicidas de isoxaflutol, que comprende la introduccion en el genoma de dicho evento de planta EE-GM3, particularmente al cruzar una primera planta de soja que carece del evento EE-GM3 con una planta de soja que comprende EE-GM3, y la seleccion de una planta progenie tolerante al glifosato y/o al isoxaflutol.

Tambien se proporciona en el presente documento una planta tolerante al glifosato y/o isoxaflutol que comprende el evento elite EE-GM3, particularmente sin resistencia al rendimiento, y con caracteristicas agronomicas aceptables, que comprende una proteina 2mEPSPS y HPPD, y capaz de producir un amplicon diagnostico para el evento EE-GM3. Tambien se proporcionan en el presente documento, los amplicones aislados especificos (fragmentos de secuencia de ADN) como tales, que pueden obtenerse utilizando las herramientas de deteccion especificas descritas en el presente documento, particularmente los amplicones que incluyen en su secuencia un fragmento de ADN que se origina a partir de ADN de planta y un fragmento de ADN extrano o heterologo a dicha planta, como el ADN insertado en el genoma de la planta por transformacion, como se define en el presente documento.

En el presente documento, se describe adicionalmente un metodo para controlar malezas en un campo de plantas de soja que comprenden el evento EE-GM3, o un campo a plantar con tales plantas de soja, que comprende tratar el campo con una cantidad eficaz de un herbicida basado en isoxaflutol, en donde dichas plantas son tolerantes a dicho herbicida.

En el presente documento se describe adicionalmente un ADN que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia esencialmente similar a la misma, y cualquier planta, celula, tejido o semilla, particularmente de soja, que comprende dicha secuencia de ADN, como una planta, celula, tejido o semilla que comprende EE-GM3, particularmente un ADN que comprende 2 regiones adyacentes que comprenden o que consisten (esencialmente) en la SEQ ID NO: 1, o un ADN que comprende 2 regiones adyacentes que comprenden o que consisten en la SEQ ID NO: 1 con algunos nucleotidos cambiados, eliminados o agregados, tal como un ADN que comprende una duplicacion de la SEQ ID NO: 1 con 4, 6, 8 o 10 nucleotidos eliminados o reemplazados, ubicados cerca (tal como separados 200-500 nt, o menos de 2000 o 10.000 nt) entre si. Esto incluye el AdN de la SEQ ID NO: 11 desde la posicion del nucleotido 2257 hasta la posicion del nucleotido 16601 en donde se han reemplazado 2, 4, 6, 8 o 10 nucleotidos por otros nucleotidos, o en donde se han eliminado o agregado 2, 4, 6, 8 o 10 nucleotidos, o el ADN de la SEQ ID NO: 11 desde la posicion del nucleotido 2257 a la posicion del nucleotido 16601 de la SEQ ID NO: 11, asi como el ADN de la SEQ ID NO: 11, y cualquier planta, celula, tejido o semilla, particularmente de soja, que comprende cualquiera de tales secuencias de ADN. Tambien se incluye en el presente documento cualquier planta, celula, tejido o semilla de soja, que comprende la secuencia de ADN (heterologa o extrana a una planta, semilla, tejido o celula de soja convencional) de la SEQ ID NO: 11. En el presente documento tambien se describe cualquier planta, celula, tejido o semilla de soja que comprende la secuencia de ADN de la SEQ ID NO:11 desde la posicion del nucleotido 2257 hasta la posicion del nucleotido 16601, o que comprende una secuencia de ADN con al menos el 99% o 99,5% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 11, o que comprende una secuencia de ADN con al menos el 99% o 99,5% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 11 desde la posicion del nucleotido 2257 hasta la posicion del nucleotido 16601.

Tambien se proporciona, en el presente documento, una planta, celula vegetal, tejido o semilla de soja transgenica, que comprende en su genoma el evento EE-GM3 caracterizado por una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos esencialmente similar a la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1441 al nucleotido 1462 y una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos esencialmente similar a la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 230 al 251, o el complemento de dichas secuencias, asi como una planta, celula vegetal, tejido o semilla de soja, que comprende en su genoma el evento EE-GM3 caracterizado por una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos esencialmente similar a la SEQ ID NO: 2 y una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos esencialmente similar a la SEQ ID NO: 3, o el complemento de dichas secuencias.

Incluso se describe adicionalmente en el presente documento, una planta, celula, tejido o semilla de soja, que comprende EE-GM3, caracterizada por comprender en el genoma de sus celulas una secuencia de acido nucleico con al menos un 80%, 90%, 95% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1431 a 1472 y una secuencia de acido nucleico con al menos un 80%, 90%, 95% o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 220 a 261, o el complemento de dichas secuencias.

El termino "isoxaflutol", como se usa en el presente documento, se refiere al herbicida isoxaflutol [es decir, (5-ciclopropil-4-isoxazolil) [2-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil) fenil] metanona], el metabolito activo del mismo, dicetonitrilo, y cualquier mezcla o solucion que comprenda dichos compuestos. Los herbicidas inhibidores de HPPD utiles para la aplicacion en el evento de esta invencion son los diquetonitrilos, p. Ej. 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil) -propano-1,3-diona y 2-ciano-1-[4-(metilsulfonil)-2-trifluorometilfenil]-3-(1 -metilciclopropil) propano-1,3-fiona; otros isoxazoles; y los pirazolinatos, por ejemplo topramezona [es decir, [3-(4,5-dihidro-3-isoxazolil) -2-metil-4-(metilsulfonil) fenil] (5-hidroxi-1 -metil-1 H-pirazol-4-il) metanona], y pirasulfotol [(5-hidroxi-1,3-dimetilpirazol-4-il (2-mesil-4-trifluarometilfenil) metanona]; o pirazofeno [2-[4- (2,4-diclorobenzoil)-1,3-dimetilpirazol-5-iloxi] acetofenona].

En una realizacion de la presente invencion, un campo a ser plantado con plantas de soja que contienen el evento EE-GM3, se puede tratar con un herbicida inhibidor de HPPD, como el isoxaflutol ('IFT'), antes de plantar las plantas de soja o sembrar las semillas, lo que limpia el campo de malezas que son eliminadas por el inhibidor de HPPD, lo que permite realizar practicas de no labranza, seguidas del cultivo o siembra de las semillas de soja en el mismo campo pretratado mas adelante (aplicacion de quemado utilizando un herbicida inhibidor de HPPD). La actividad residual de IFT tambien protegera a las plantas de soja emergentes y en crecimiento de la competencia de las malezas en las primeras etapas de crecimiento. Una vez que las plantas de soja tengan un cierto tamano y las malas hierbas tiendan a reaparecer, se puede aplicar glifosato o una mezcla de inhibidor de HPPD-glifosato como herbicida postemergente sobre la parte superior de las plantas.

En otra realizacion de esta invencion, un campo en el que se sembraron semillas que contenian el evento EE-GM3, se puede tratar con un herbicida inhibidor de HPPD, tal como IFT, antes de que emerjan las plantas de soja, pero despues de sembrar las semillas (el campo se puede dejar libre de malezas antes de sembrar otros medios, tipicamente practicas de labranza convencionales como arado, arado de chissel o preparacion de lecho de siembra), donde la actividad residual mantendra el campo libre de malezas eliminadas por el herbicida, de modo que las plantas de soja emergentes y en crecimiento no tengan competencia por las malezas (aplicacion preemergente de un herbicida inhibidor de HPPD). Una vez que las plantas de soja tengan un cierto tamano y las malas hierbas tiendan a reaparecer, se puede aplicar glifosato - o una mezcla de inhibidor de HPPD-glifosato - como herbicida postemergente sobre la parte superior de las plantas.

En otra realizacion de esta invencion, las plantas que contienen el evento EE-GM3, se puede tratar con un herbicida inhibidor de HPPD, tal como IFT, sobre la parte superior de las plantas de soja que surgieron de las semillas que se sembraron, lo que limpia el campo de las malezas eliminadas por el inhibidor de HPPD, cuya aplicacion se puede hacer junto a (p. ej., en una mezcla de tanque de pulverizacion), seguida o ir precedida de un tratamiento con glifosato como herbicida postemergente en la parte superior de las plantas (aplicacion postemergente de un herbicida inhibidor de HPPD (con o sin glifosato)).

Ademas, de acuerdo con la presente invencion, las plantas de soja que albergan EE-GM3 pueden tratarse con los siguientes insecticidas, herbicidas o fungicidas o las semillas de soja que albergan EE-GM3 pueden recubrirse con una capa que comprende los siguientes insecticidas, herbicidas o fungicidas:

Herbicidas de Soja:

Alacloro, Bentazona, Trifluralin, Clorimuron-etilo, Cloransulam-metilo, Fenoxaprop, Fomesafen, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S-)Metolaclor, Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidim, Isoxaflutol.

Insecticidas de Soja:

Lambda-cihalotrina, Metomil, Paration, Tiocarb, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofurano, Flubendiamida, Rynaxypyr, Cyazypyr, Spinosad, Spinetoram, Emamectina - benzoato, Fipronilo, Etiprol, Deltametrina, p-ciflutrina, Cihalotrina, gamma y lambda, 4-[[(6-clorpiridin-3-il) metil] (2,2-difluoretil) amino] furan-2 (5H)-on, Espirotetramat, Espirodiclofeno, Triflumuron, Flonicamid, Tiodicarb, beta-Ciflutrina.

Fungicidas de Soja:

Azoxistrobina, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Pyraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Protioconazol, Tetraconazol.

Los siguientes ejemplos describen el desarrollo e identificacion del evento elite EE-GM3, el desarrollo de diferentes lineas de soja que comprenden este evento y el desarrollo de herramientas para la identificacion especifica del evento elite EE-GM3 en muestras biologicas.

A menos que se indique lo contrario en los Ejemplos, todas las tecnicas recombinantes se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos estandar que se describen en "Sambrook J y Russell DW (eds.) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York" y en "Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith jA and Struhl K (eds.) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York".

Los materiales convencionales y las referencias se describen en "Croy RDD (ed.) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford y Blackwell Scientific Publications, Oxford" y in "Brown TA, (1998) Molecular Biology LabFax, 2.a edicion, Academic Press, San Diego". Los materiales y metodos convencionales para las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se pueden encontrar en "McPherson MJ y Moller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford" y en "PCR Applications Manual, 3a Edicion ( 2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim o www.roche-applied-science.com"

Debe entenderse que es posible que sea necesario ajustar una serie de parametros en cualquier protocolo de laboratorio, como los protocolos de PCR en los Ejemplos a continuacion, a las condiciones especificas del laboratorio y que se puedan modificar ligeramente para obtener resultados similares. Por ejemplo, el uso de un metodo diferente para la preparacion de ADN o la seleccion de otros cebadores en un metodo de PCR puede dictar otras condiciones optimas para el protocolo de PCR. Sin embargo, estos ajustes seran evidentes para un experto en la materia, y ademas se detallan en los manuales de aplicacion de PCR actuales.

En la descripcion y ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias:

SEQ ID NO: 1: Secuencia de nucleotidos de fragmento SalI del vector pSF10.

SEQ ID NO: 2: secuencia de nucleotidos que comprende la region 5' que flanquea el ADN extrano que comprende los genes de tolerancia a herbicidas en EE-GM3.

SEQ ID NO: 3: secuencia de nucleotidos que comprende la region 3' que flanquea el ADN extrano que comprende los genes de tolerancia a herbicidas en EE-GM3.

SEQ ID NO: 4: Cebador SOY028

SEQ ID NO: 5: Cebador SOY029

SEQ ID NO: 6: Cebador SMP187

SEQ ID NO: 7: Cebador STV019

SEQ ID NO: 8: secuencia de nucleotidos del amplicon

SEQ ID NO: 9: cebador 1 para la amplificacion del fragmento control (SOY01)

SEQ ID NO: 10 cebador 2 para la amplificacion del fragmento control (SOY02)

SEQ ID NO: 11 secuencia de nucleotidos de ADN extrano y secuencias flanqueantes de plantas en EE-GM3 SEQ ID NO: 12 Cebador SHA130

SEQ ID NO: 13 Cebador SHA178

Ejemplos

1. Transformacion de Glycine max con genes de tolerancia a herbicidas.

1.1. Descripcion del ADN extrano que comprende los genes quimericos 2mEPSPS y HPPD-Pf-W336

El plasmido pSF10 es un vector de clonacion derivado de pUC19 que contiene un gen quimerico 2mepsps y un gen quimerico hppd-Pf-W336 ubicados en un fragmento SalI de aproximadamente 7,3 kb. Se proporciona una descripcion completa del ADN comprendido entre los dos sitios de restriccion SalI en la Tabla 1 a continuacion. La secuencia de nucleotidos se representa en la SEQ ID NO: 1.

Tabla 1. Posiciones de nucleotidos del ADN comprendidas entre los sitios de restriccion SalI de pSF10 (SEQ

ID NO: 1

1.2. Evento EE-GM3

El fragmento pSF10 linealizado con Sail purificado por HPLC de aproximadamente 7,3 kb (que contiene el gen de tolerancia al glifosato 2mEPSPS y el gen de tolerancia al inhibidor de HPPD-Pf-W336) se uso para obtener plantas de soja transformadas mediante transferencia directa de genes a celulas de soja tipo Jack (Nickell, C. D., G. R. Noel, D. J. Thomas y R. Waller. Registration of 'Jack' soybean. Crop Sci 1365. 30.1990), seguido por la regeneracion de celulas vegetales transformadas en plantas de soja fertiles transgenicas.

1.2.1 Identificacion del evento elite EE-GM3

El evento elite EE-GM3 se selecciono basandose en un extenso procedimiento de seleccion basado en la buena expresion y estabilidad de los genes de tolerancia a herbicidas, y se evaluo su compatibilidad con caracteristicas agronomicas optimas como la altura de la planta, la altura al nodulo, el rodal, el vigor, el rendimiento de la siembra. Las plantas de soja que contienen este evento se seleccionaron de una amplia gama de diferentes eventos de transformacion obtenidos utilizando los mismos genes quimericos. Los parametros utilizados en la seleccion de este evento fueron: a) tolerancia aceptable a la aplicacion de herbicida isoxaflutol en ensayos de campo, b) tolerancia aceptable a la aplicacion de herbicida glifosato en ensayos de campo, c) tolerancia aceptable a la aplicacion combinada de herbicidas isoxaflutol y glifosato en ensayos de campo, d) una insercion de los transgenes de tolerancia a herbicidas en un solo locus en el genoma de la planta de soja, con ausencia de estructura del vector, e) agronomia general similar a las plantas parentales utilizadas para la transformacion (madurez, alojamiento, susceptibilidad a la enfermedad, etc.) y f) no hay un arrastre de rendimiento significativo causado por la insercion del ADN transformante (en comparacion con una linea isogenica sin el evento, como la linea de plantas utilizada para la transformacion, cultivada en las mismas condiciones).

En la generacion T3, se selecciono una linea homocigotica del evento de transformacion de soja EE-GM3 para la produccion de semillas. Se realizaron estudios de campo agronomico replicado en multiples ubicaciones en las regiones de adaptacion de la variedad parental, Jack. Las evaluaciones de campo incluyeron tolerancia a herbicidas y rendimiento agronomico. El rendimiento agronomico de las plantas que contienen EE-GM3 se encontro comparable a Jack (cuando no se aplicaron herbicidas).

Las evaluaciones de campo tambien mostraron que las plantas que portan el evento EE-GM3 tienen:

- morfologfa de plantas y caracterfsticas de semillas similares en comparacion con Jack,

- ningun cambio en la respuesta a las enfermedades de la soja en comparacion con Jack, y

- no hay cambios en la germinacion de semillas o latencia en comparacion con Jack.

Se plantaron en el campo las semillas (generacion T1 o S1) cosechadas de la planta transformante inicial (T0) (la planta transformada con el constructo para producir el evento EE-GM3) en el invernadero. Se plantaron tres bloques y se rociaron con 0, 2 o 4 kg/ha de glifosato. La semilla se cosecho de plantas que demostraron el nivel deseado de tolerancia al herbicida, glifosato.

Las semillas (generacion T2) cosechadas de plantas T1 autopolinizadas cultivadas en el campo se sembraron "planta por fila". El analisis de Chi cuadrado de los datos de segregacion para las filas (total o parcialmente tolerantes) y de plantas individuales dentro de las filas (tolerantes o sensibles) demuestra la herencia mendeliana esperada de una unica insercion para EE-GM3.

La seleccion y el aumento de semillas continuaron hasta que se determino que una lfnea era homocigotica para el evento de transformacion EE-GM3 y se selecciono para el nucleo de produccion de semillas en la cuarta generacion. A continuacion, la semilla de la generacion T5 sirvio como candidata para el desarrollo de diferentes variedades. Las plantas de la sexta generacion (generacion T6) se cruzaron con lfneas de reproduccion de soja convencionales en un programa de introgresion disenado para mover el evento a una base mas amplia del germoplasma de soja comercial. Las plantas hnbridas F1 (lfneas EE-GM3 x lfneas convencionales) se cultivaron hasta la madurez y se sembro la semilla F2. Las muestras de hojas de 901 plantas F2 se analizaron mediante cebadores de PCR disenados para identificar la cigosidad del inserto EE-GM3. Se observo la proporcion esperada de 1:2:1 para una segregacion de insercion unica segun las leyes de Mendel.

El evento seleccionado EE-GM3 se introdujo en diferentes orfgenes geneticos comerciales y se compararon los resultados de los ensayos de campo en diferentes ubicaciones. Las plantas se pusieron a prueba con herbicida glifosato y/o herbicida isoxaflutol utilizando diferentes tratamientos. Las plantas mostraron buena tolerancia a los herbicidas. Cientos de diferentes cultivares de soja que contienen el evento EE-GM3 se utilizaron en un estudio de herencia y se aplicaron herbicidas. Las lfneas seleccionadas de este ensayo se incrementaron posteriormente en el campo y tambien se trataron con herbicida. A partir de ese ensayo, se aumentaron 50 lfneas seleccionadas, y estas tambien se trataron con herbicida. Las puntuaciones de fitotoxicidad para las ultimas lfneas rociadas con isoxaflutol y glifosato mostraron cierta variabilidad en la respuesta, pero el intervalo de respuestas entre las lfneas reflejo una variabilidad similar a la observada a lo largo de 4 repeticiones del evento EE-GM3 en el origen Jack original, cultivado con el mismo tratamiento y condiciones ambientales. Por lo tanto, se observo tolerancia a los herbicidas relevantes a lo largo de una amplia gama de germoplasma para plantas que comprenden EE-GM3.

Ademas, las plantas que contienen el evento EE-GM3 tenfan una morfologfa normal de hojas, flores y vainas, excelente fertilidad, y no mostraron enfermedad o susceptibilidad anormal a los insectos en multiples orfgenes geneticos. Durante la introgresion en multiples orfgenes geneticos no se observaron problemas o anomalfas aberrantes.

En una temporada, se diseno un estudio de 10 ubicaciones para comparar el rendimiento agronomico de la soja con tolerancia doble a los herbicidas que comprendfa el evento de transformacion EE-GM3 con la variedad parental de la transformacion, Jack y algunas variedades de soja no transgenicas. Usando un diseno de bloques completos al azar, las plantas de EE-GM3 se cultivaron en parcelas replicadas con control de malezas convencional o con los herbicidas, glifosato e isoxaflutol previstos. Las parcelas con plantas de soja que contienen el evento de transformacion EE-GM3 se rociaron con herbicida isoxaflutol a una tasa diana de 70 gramos ai/Ha y con herbicida glifosato a una tasa diana de 1060 gramos ai/Ha. La aplicacion de herbicidas se realizo en estas plantas como un aerosol foliar en aproximadamente la etapa de crecimiento de las plantas V4-V5. Las observaciones agronomicas se realizaron en la temporada temprana, media y tardfa. La densidad de la planta (parametro; recuento de rodales) fue mayor para las parcelas de variedades Jack y no transgenicas que en el caso de las parcelas EE-GM3 en una desviacion estandar. La diferencia en el recuento de rodales inicial puede haber sido el resultado de la calidad del lote de semillas, ya que la semilla de siembra EE-GM3 se produjo en el vivero de contra temporada, mientras que la semilla de las variedades no transgenicas se produjo en la temporada de produccion normal de los estados contiguos. Sin embargo, el numero de dfas para alcanzar el 50% de emergencia y las tasas de vigor de la planta fueron las mismas, indicando que los lotes de semillas eran comparables para estos parametros de rendimiento. En los recuentos de rodales de la temporada tardfa, las variedades Jack y no transgenicas permanecieron diferentes por una desviacion estandar a las plantas EE-GM3. Los rendimientos de las parcelas de plantas de eventos EE-GM3 tambien fueron mas bajos que los de Jack en una desviacion estandar, tal vez como resultado de la menor densidad de plantas de las parcelas de eventos EE-GM3. El rendimiento de las variedades no transgenicas fue mayor que el de Jack como podrfa esperarse debido al avance en el potencial de rendimiento encontrado en las variedades mas recientes.

En un ensayo, las tasas de sanidad vegetal se realizaron en tres etapas de crecimiento: V4-5, R1 y madurez total. La primera evaluacion fue poco despues de la aplicacion del herbicida previsto. En el momento de la evaluacion final de la sanidad vegetal, las plantas que contenian EE-GM3 rociadas con ambos herbicidas tenian la misma puntuacion que las plantas Jack no pulverizadas, o las plantas no pulverizadas que comprendian EE-GM3. En las calificaciones del personal agronomico, las plantas rociadas con herbicida recibieron una calificacion de sanidad de 3-4 (lesion moderada) en las etapas de crecimiento de las plantas V4-5 y R1. Las plantas no pulverizadas (Jack no transformadas o plantas de soja que contienen EE-GM3) se calificaron como 4,6-4,8 (la calificacion de 5 indica que no hay lesion). En la calificacion final de sanidad vegetal, todas las parcelas recibieron la misma calificacion de 5 (sin lesiones).

Una temporada de ensayo fue una de lluvias excepcionales, y la lesion en los cultivos en las plantas EE-GM3 despues de la aplicacion del herbicida previsto fue mas obvia que la observada en otras temporadas. Las evaluaciones de campo tambien incluyeron el control de los caracteres de aptitud (reproduccion, resistencia a enfermedades, fecundidad, dispersion de semillas, latencia, persistencia). En cuanto a las caracteristicas reproductivas; dias a la emergencia, dias a 50% de floracion y dias a 90% de vainas en maduracion, las plantas EE-GM3 y Jack no fueron diferentes. No se observaron diferencias en la reaccion a las infestaciones naturales de enfermedades de las plantas y plagas de insectos. Aunque EE-GM3 produjo menos rendimiento final que Jack, no se encontraron diferencias en la fecundidad (peso de 100 semillas). La evaluacion de los parametros de dispersion de semillas (fragmentacion de la vaina y alojamiento de la planta) encontro que EE-GM3 y Jack tenian la misma puntuacion de fragmentacion de la vaina, pero encontraron que las plantas de la EE-GM3 eran menos propensas a ser alojadas. La evaluacion de las semillas cosechadas de los 10 lugares no encontro preocupaciones planteadas por las pruebas de germinacion o latencia.

En estos ensayos durante la temporada con lluvias excepcionales, el rendimiento final de las plantas EE-GM3, independientemente del tratamiento de control de malezas, fue menor que el rendimiento de Jack por una desviacion estandar (tal vez como resultado de la menor densidad de plantas de las parcelas de eventos EE-GM3). En la temporada excepcionalmente humeda, se notificaron lesiones en el cultivo (decoloracion en 10-30% del area de cultivo) para parcelas EE-GM3 hasta seis semanas despues de la aplicacion foliar de los herbicidas de glifosato e isoxaflutol. Sin embargo, por madurez, se asignaron las clasificaciones de sanidad vegetal "sin lesiones" a todas las parcelas. Se espera que los ensayos de campo de multiples ubicaciones replicados con EE-GM3 introgresado en el origen del cultivar de soja de elite, cuando se comparan con lineas hermanas casi isogenicas que no contienen el transgen, no muestren diferencias de rendimiento entre las plantas que contienen el evento EE-GM3 y las lineas casi isogenicas (en ausencia de tratamiento herbicida).

Ademas, en un ensayo de campo replicado, se encontro una tolerancia significativa al cultivo (decoloracion de menos del 10%) en plantas de soja que comprenden EE-GM3 cuando se trataron antes o despues de la emergencia con IFT (70 gr ai/ha con 0,5% de NIS, Agridex), pero tambien se encontro una tolerancia significativa al cultivo (decoloracion de menos del 10%) en las plantas de soja que contenian EE-GM3 cuando se trataron con una aplicacion despues de la emergencia de pirasulfotol (35 gr ai/ha con NIS al 0,5%, Agridex), otro herbicida inhibidor de HPPD.

1.2.2. Identificacion de las regiones flanqueantes y del ADN extrano del evento elite EE-GM3

Se determino que la secuencia de las regiones que flanquean el ADN extrano que comprende los genes de tolerancia a herbicidas en el evento elite EE-GM3 es la siguiente:

1.2.2.1. Region flanqueante derecha (5 ')

El fragmento identificado como que comprende la region flanqueante 5' se secuencio y su secuencia de nucleotidos se representa en la SEQ ID NO: 2. La secuencia entre el nucleotido 1 y 1451 corresponde al ADN de la planta, mientras que la secuencia entre el nucleotido 1452 y 1843 corresponde al ADN extrano.

1.2.2.2. Region flanqueante izquierda (3 ')

El fragmento identificado como que comprende la region flanqueante 3' se secuencio y su secuencia de nucleotidos se representa en la SEQ ID NO: 3. La secuencia entre el nucleotido 1 y 240 corresponde al ADN extrano, mientras que la secuencia entre el nucleotido 241 y 1408 corresponde al ADN de la planta.

1.2.2.3. ADN extrano que comprende los genes de tolerancia a herbicidas de EE-GM3

Usando diferentes tecnicas moleculares, se ha determinado que el ADN extrano del evento elite EE-GM3 que comprende los genes de tolerancia a herbicidas contiene dos secuencias parciales de histonat 3' en una orientacion cabeza a cabeza, seguidas de 2 copias casi completas del fragmento SalI del pSF10 dispuesto en orientacion de cabeza a cola (vease la Figura 1).

El ADN extrano que comprende los genes de tolerancia a herbicidas de EE-GM3 contiene, por lo tanto, en orden las siguientes secuencias:

- del nucleotido 1 al nucleotido 199: la secuencia de nucleotidos correspondiente al complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID 1 del nt 6760 al nt 6958;

- del nucleotido 200 al nucleotido 624: la secuencia de nucleotidos correspondiente a la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID 1 del nt 6874 al nt 7298;

- del nucleotido 625 al nucleotido 7909: la secuencia de nucleotidos correspondiente a la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID 1 del nt 7 al nt 7291;

- del nucleotido 7910 al nucleotido 15163: la secuencia de nucleotidos correspondiente a la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID 1 del nt 12 al nt 7265; y

- del nucleotido 15164 al nucleotido 15187: la secuencia de nucleotidos correspondiente a la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID 3 del nt 217 al nt 240 (esta secuencia no corresponde a ADN de plasmido pSF10 o ADN de planta de tipo silvestre y, por lo tanto, se denomina ADN de relleno).

Este ADN extrano esta precedido inmediatamente cadena arriba y contiguo al ADN extrano por la secuencia flanqueante 5' de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1 al 1451, y esta seguido inmediatamente cadena abajo y contiguo al ^a Dⁿ extrano por la secuencia flanqueante 3' de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 1408.

La secuenciacion completa confirmada de ADN de las secuencias de ADN extrano y flanqueantes en EE-GM3 dio como resultado la secuencia informada en la SEQ ID NO: 11. En esta secuencia, el ADN insertado es desde la posicion del nucleotido 1452 hasta la posicion del nucleotido 16638, y las 2 copias casi completas de pSF10 dispuestas en orientacion de cabeza a cola son desde la posicion del nucleotido 2257 hasta la posicion del nucleotido 16601. La secuencia de ADN flanqueante 5 ' en la SEQ ID NO: 11 es la secuencia desde la posicion del nucleotido 1 hasta la posicion del nucleotido 1451 en la SEQ ID NO: 11, y la secuencia del ADN flanqueante 3' en la SEQ ID NO: 11 es la secuencia desde la posicion del nucleotido 16639 hasta la posicion del nucleotido 17806 en la SEQ ID NO: 11.

2. Desarrollo de Protocolos de Identificacion de la Reaccion en Cadena de la Polimerasa para EE-GM3 2.1. Cebadores

Se desarrollaron cebadores especificos que reconocen secuencias dentro del evento elite.

Se desarrollo un cebador que reconoce una secuencia dentro de la region flanqueante 3 ' de EE-GM3. A continuacion, se selecciono un segundo cebador dentro de la secuencia del ADN extrano, de modo que los cebadores abarcan una secuencia de aproximadamente 263 nucleotidos. Se encontro que los siguientes cebadores dan resultados particularmente claros y reproducibles en una reaccion de PCR en el ADN de EE-GM3:

SOY028: 5'-ATC.gCT.TTA.ACg.TCC.CTC.Ag-3 (diana: ADN inserto) (SEQ ID NO: 4) SOY029: 5'-CAA.ggC.CTC.gAg.ATT.ATC-3' (diana: ADN de la planta) (SEQ ID NO: 5) Se incluyen preferentemente en el coctel de PCR los cebadores que se dirigen a una secuencia endogena. Estos cebadores sirven como control interno en muestras desconocidas y en el control positivo de ADN. Un resultado positivo con el par de cebadores endogenos (presencia de un fragmento amplificado por PCR de 413 pb) demuestra que existe un ADN amplio de calidad adecuada en la preparacion de ADN genomico para que se genere un producto de PCR. Los cebadores endogenos se seleccionaron para reconocer el gen de soja endogeno de actina:

SOY01 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT-3' SEQ ID NO: 9)

SOY02 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC-3' SEQ ID NO: 10)

2.2. Fragmentos amplificados

Los fragmentos amplificados esperados en la reaccion de PCR son:

Para el par de cebadores SOY01- . , , . . ,, .

SOY02^ 413 pb (control endogeno)

Para el par de cebadores SOY028- r r

SOY029: 263 pb (evento elite EE-GM3)

2.3. ADN plantilla

La plantilla de ADN se preparo a partir de un punzon de hojas de acuerdo con Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991). Cuando se usa ADN preparado con otros metodos, se debe realizar una prueba utilizando diferentes cantidades de plantilla. Por lo general, 50 ng de ADN genomico plantilla producen los mejores resultados.

2.4. Controles positivos y negativos asignados

Para evitar falsos positivos o negativos, se determino que los siguientes controles positivos y negativos deberian incluirse en una ejecucion de PCR:

- Control Master Mix(control ADN negativo). Esta es una PCR en la que no se agrega ADN a la reaccion. Cuando se observa el resultado esperado, no hay productos de PCR, esto indica que el coctel de PCR no estaba contaminado con ADN diana.

- Un control positivo de ADN (muestra de ADN genomico que se sabe que contiene las secuencias transgenicas). La amplificacion exitosa de este control positivo demuestra que la PCR se ejecuto en condiciones que permiten la amplificacion de secuencias diana.

- Un control de ADN de tipo silvestre. Esta es una PCR en la que el ADN plantilla proporcionado es ADN genomico preparado a partir de una planta no transgenica. Cuando se observa el resultado esperado, no se observa una amplificacion de un producto de PCR del trasngen sino una amplificacion del producto de PCR endogeno, esto indica que no hay una amplificacion del origen del transgen detectable en una muestra de ADN genomico.

2.5. Condiciones de PCR

Los resultados optimos se obtuvieron en las siguientes condiciones (en la descripcion de las diversas condiciones para obtener resultados optimos se pretende proporcionar ejemplos de tales condiciones). Claramente, un experto en la materia podria variar las condiciones, los reactivos y los parametros, como el uso de otras polimerasas Taq, y lograr resultados deseables):

- la mezcla de PCR para reacciones de 25 pl contiene:

20 ng de ADN plantilla

2,5 pl de Tampon de Amplificacion 10x (suministrado por el fabricante con la polimerasa Taq)

0,5 pl de dNTP 10 mM

0,4 pl de SOY01 (10 pmoles/pl)

0,4 pl de SOY02 (10 pmoles/pl)

0,7 pl de SOY028 (10 pmoles/pl)

0,7 pl de SOY029 (10 pmoles/pl)

0,1 pl de polimerasa de ADN Taq (5 unidades/pl)

agua hasta 25 pl

el perfil de termociclado a seguir para obtener resultados optimos es el siguiente:

4 min. a 95°C

Seguido por: 1 min. a 95°C

1 min. a 57°C

2 min. a 72°C

Durante 5 ciclos

Seguido por: 30 seg. a 92°C

30 seg. a 57°C

1 min. a 72°C

Durante 25 ciclos

Seguido por: 10 minutos a 72°C

2.6. Analisis en gel de agarosa

Para visualizar optimamente los resultados de la PCR, se determino que entre 10 y 20 pl de las muestras de PCR deberian aplicarse en un gel de agarosa al 1,5% (tampon Tris-borato) con un marcador de peso molecular apropiado (por ejemplo, escalera Pharmacia de 100 pb).

2.7. Validacion de los resultados

Se determino que los datos de las muestras de ADN de plantas transgenicas dentro de una unica ejecucion de PCR y un solo coctel de PCR no deberian ser aceptables a menos que 1) el control positivo de ADN muestre los productos de PCR esperados (fragmentos transgenicos y endogenos), 2) el control negativo de ADN sea negativo para la amplificacion por PCR (sin fragmentos) y 3) el control de ADN de tipo silvestre muestre el resultado esperado (amplificacion de fragmentos endogenos).

Al seguir el Protocolo de Identificacion por PCR para EE-GM3 como se describe anteriormente, los carriles que muestran cantidades visibles de los productos de PCR transgenicos y endogenos de los tamanos esperados, indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparo el ADN genomico plantilla, ha heredado el evento elite EE-GM3. Los carriles que no muestran cantidades visibles de ninguno de los productos de PCR transgenicos y que muestran cantidades visibles del producto de PCR endogeno, indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparo el ADN genomico plantilla, no comprende el evento elite. Los carriles que no muestran cantidades visibles de los productos de PCR endogenos y transgenicos, indican que la calidad y/o cantidad del ADN genomico no permitio que se generara un producto de PCR. Estas plantas no se pueden puntuar. La preparacion del ADN genomico debe repetirse y se debe realizar una nueva ejecucion de PCR, con los controles apropiados.

2.8. Uso del protocolo de PCR discriminatorio para identificar EE-GM3

Antes de intentar analizar incognitas, se realiza una ejecucion de prueba, con todos los controles apropiados. El protocolo desarrollado puede requerir optimizacion para los componentes que pueden diferir entre laboratorios (preparacion de ADN de plantilla, ADN polimerasa Taq, calidad de los cebadores, dNTP, termociclador, etc.).

La amplificacion de la secuencia endogena juega un papel clave en el protocolo. Se tienen que lograr condiciones de PCR y de termociclado que amplifiquen cantidades equimolares tanto de la secuencia endogena como de la transgenica en una plantilla de ADN genomico transgenico conocido. Cuando el fragmento endogeno marcado no se amplifica o cuando las secuencias marcadas no se amplifican con las mismas intensidades de tincion con bromuro de etidio, como se determina por electroforesis en gel de agarosa, se puede requerir la optimizacion de las condiciones de la PCR.

El material de hojas de varias plantas de soja, algunas de las cuales comprendian EE-GM3 se probaron de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. Las muestras del evento elite EE-GM3 y de soja de tipo silvestre se tomaron como controles positivos y negativos, respectivamente.

La Figura 2 ilustra el resultado obtenido con el Protocolo de Identificacion por PCR de evento elite para EE-GM3 en varias muestras de plantas de soja. Se encontro que las muestras en los carriles 2 y 3 contenian el evento elite EE-GM3 cuando se detecto la banda de 263 pb, mientras que las muestras en los carriles 4 a 8 no comprenden EE-GM3. Los carriles 6 y 7 comprenden muestras de otros eventos de transformacion de soja obtenidos con los mismos genes quimericos con tolerancia a herbicidas; el carril 8 contiene ADN de plantas de soja de tipo silvestre y el carril 9 representa la muestra de control negativo (agua), los carriles 1 y 10 representan el Marcador de Peso Molecular (escalera de 100 pb).

2.9. Ensayo de dPCR para la deteccion de EE-GM3 en semillas a granel

Se establece un ensayo de PCR discriminante (dPCR) para detectar la presencia de niveles bajos de EE-GM3 en semillas a granel. Se detecto con exito un nivel minimo de 0,4% (p/p) de semillas transgenicas en un volumen de semillas no transgenicas en condiciones repetibles. Por lo tanto, se determina que el Limite de Deteccion es del 0,4% (p/p).

Los siguientes cebadores se aplican en esta reaccion de PCR de la diana:

Cebador directo dirigido a la secuencia de ADN-T:

SHA1305'-CTA.TAT.TCT.ggT.TCC.AAT.TTA.TC-3' (SEQ ID NO:12)

Cebador inverso dirigido a la secuencia flanqueante 3':

SMP1785'-TgA.ggC.ACg.TAT.TgA.TgA.CC-3' (SEQ ID NO: 13)

El fragmento amplificado esperado en la reaccion de PCR de estos cebadores es de 115 pb.

La reaccion de PCR de la diana se lleva a cabo en aproximadamente 200 ng de ADN plantilla preparado a partir de semillas a granel molidas de acuerdo con un kit de extraccion de purificacion de ADN Gentra Puregene modificado (Qiagen). Cuando se usa ADN preparado con otros metodos, debe realizarse una prueba utilizando muestras con niveles relativos conocidos de EE-GM3.

Una reaccion de PCR del sistema de referencia validada, dirigida a una secuencia endogena, deberia realizarse idealmente en una ejecucion de PCR separada para verificar la idoneidad de la muestra de ADN para el analisis de PCR para evitar resultados falsos negativos.

Para muestras de prueba desconocidas, el experimento de PCR deberia incluir idealmente las muestras de control positivo y negativo apropiadas, es decir:

- Control Master Mix(control ADN negativo). Esta es una PCR en la que no se agrega ADN a la reaccion. Cuando se observa el resultado esperado (sin producto de PCR) tanto para la reaccion del sistema objetivo como para el de referencia, esto indica que el coctel de PCR no estaba contaminado con el ADN diana.

- Un control positivo de ADN (muestra de ADN genomico que se sabe que contiene las secuencias transgenicas). La amplificacion exitosa de este control positivo demuestra que la PCR se ejecuto en condiciones que permiten la amplificacion de secuencias diana.

- Tambien se puede agregar un control de ADN de tipo silvestre en esta PCR. Esta es una PCR en la que el ADN plantilla proporcionado es ADN genomico preparado a partir de una planta no transgenica. Cuando se observa el resultado esperado, no se observa una amplificacion de un producto de PCR del trasngen sino una amplificacion del producto de PCR endogeno, esto indica que no hay una amplificacion del origen del transgen detectable en una muestra de ADN genomico.

Los resultados optimos se obtienen en las siguientes condiciones:

Obviamente, se pueden usar otras polimerasas Taq, y a continuacion, las condiciones pueden diferir para seguir las recomendaciones del proveedor.

- la mezcla de PCR para reacciones de 25 pl contiene:

200 ng de ADN plantilla

5 pl de 5xTampon de Reaccion

0,25 pl de dNTP 20 mM

0,7 pl de SHA130 (10 pmoles/pl)

0,4 pl de SMP178 (10 pmoles/pl)

0,1 pl de polimerasa de ADN GO-Taq (5 unidades/pl)

Anadir agua hasta 25 pl

el perfil de termociclado a seguir para obtener resultados optimos es el siguiente:

4 min. a 95°C

Seguido por: 1 min. a 95°C

1 min. a 57°C

2 min. a 72°C

Durante 5 ciclos

Seguido por: 30 seg. a 92°C

30 seg. a 57°C

1 min. a 72°C

Durante 30 ciclos

Seguido por: 10 minutos a 72°C

Para visualizar optimamente los resultados de la PCR, se determino que entre 25 pl del producto de PCR deberian aplicarse en un gel de agarosa al 1,5% (tampon Tris-borato) con un marcador de peso molecular apropiado (por ejemplo, escalera de 50 pb).

Al seguir el metodo de PCR como se describe anteriormente, los carriles que muestran cantidades visibles de los productos de la PCR diana y del sistema de referencia de los tamanos esperados, indican que la muestra de prueba a partir de la cual se preparo el ADN genomico plantilla, contenia niveles del evento elite EE-GM3 por encima del limite de deteccion de la reaccion objetivo.

Los carriles que no muestran cantidades visibles de ninguno de los productos de PCR diana y que muestran cantidades visibles del producto de PCR del sistema de referencia, indican que la muestra de prueba a partir de la cual se preparo el ADN genomico plantilla, contenia niveles del evento elite EE-GM3 por debajo del limite de deteccion de la reaccion objetivo.

Los carriles que no muestran cantidades visibles de los productos de PCR endogenos y transgenicos, indican que la calidad y/o cantidad del ADN genomico no permitio que se generara un producto de PCR. Estas plantas no se pueden puntuar. La preparacion del ADN genomico debe repetirse y se debe realizar una nueva ejecucion de PCR, con los controles apropiados.

3. Uso de un fragmento de integracion especifico como una sonda para la deteccion de material que comprende EE-GM3

Se obtiene un fragmento de integracion especifico de EE-GM3 mediante amplificacion por PCR utilizando los cebadores especificos SOY028 (SEQ ID NO: 4) y SOY029 (SEQ ID NO: 5) que producen un amplicon con la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 8 o por sintesis quimica y esta marcado. Este fragmento de integracion se utiliza como una sonda especifica para la deteccion de EE-GM3 en muestras biologicas. El acido nucleico se extrae de las muestras de acuerdo con los procedimientos convencionales. Este acido nucleico se pone en contacto, a continuacion, con la sonda especifica en condiciones de hibridacion que se optimizan para permitir la formacion de un hibrido. La formacion del hibrido se detecta, a continuacion, para indicar la presencia de acido nucleico EE-GM3 en la muestra. Opcionalmente, el acido nucleico en las muestras se amplifica utilizando los cebadores especificos antes de ponerlo en contacto con la sonda especifica. Como alternativa, el acido nucleico se marca antes de ponerlo en contacto con la sonda especifica en lugar del fragmento de integracion. Opcionalmente, la sonda especifica se une a un soporte solido (tal como, pero sin limitacion, un filtro, una tira o perlas), antes de ponerla en contacto con las muestras.

4. Protocolo para la determinacion basada en PCR del estado de cigosidad del material vegetal de soja EE-GM3

4.1. Cebadores

Dos cebadores que reconocen las secuencias de nucleotidos del locus de tipo silvestre antes de la insercion del evento elite, se disenaron de tal manera que se dirigen entre si y tienen el sitio de insercion del ADN extrano que comprende los genes de tolerancia al herbicida en el medio. Este conjunto de cebadores, junto con un tercer cebador complementario de secuencias de ADN extrano y dirigido hacia el ADN flanqueante, permite la amplificacion simultanea por PCR de la secuencia especifica de EE-GM3, asi como de la secuencia de tipo silvestre.

Se encontro que los siguientes cebadores dan resultados particularmente claros y reproducibles en una reaccion de PCR de puntuacion de cigosidad en el ADN de EE-GM3:

SMP187: 5'-ATA.TCA.ACC.CgT.AgC.TCg.AC-3' (SEQ ID NO: 6) (diana: ADN de plantas de tipo silvestre cadena arriba de la secuencia flanqueante 3'

SOY029 5'-CAA.ggC.CTC.gAg.ATT.ATC-3' (SEQ ID NO:5) (diana: ADN de plantas de la secuencia flanqueante 3')

STV019 5'-ggC.ATT.AAA.TTg.gTg.AAA.ATT.gC-3' (SEQ ID NO: 7) (diana: ADN inserto)

4.2. Fragmentos amplificados

Los fragmentos amplificados esperados en la reaccion de PCR son:

Para el par de cebadores SMP187 - SOY029: 319 pb (locus de tipo silvestre)

Para el par de cebadores STV019 - SOY029: 706 pb (locus de EE-GM3)

4.3. ADN plantilla

La plantilla de ADN se preparo a partir de un punzon de hojas de acuerdo con Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991). Cuando se usa ADN preparado con otros metodos, se debe realizar una prueba utilizando diferentes cantidades de plantilla. Por lo general, 25 o 50 ng de ADN genomico plantilla producen los mejores resultados.

4.4. Controles positivos y negativos asignados

Para evitar falsos positivos o negativos, es recomendable que los siguientes controles positivos y negativos se incluyan en una ejecucion de PCR:

- Control Master Mix(control ADN negativo). Esta es una PCR en la que no se agrega ADN a la reaccion. Cuando se observa el resultado esperado, no hay productos de PCR, esto indica que el coctel de PCR no estaba contaminado con ADN diana.

- Un control positivo de ADN (muestra de ADN genomico que se sabe que contiene las secuencias transgenicas). La amplificacion exitosa de este control positivo demuestra que la PCR se ejecuto en condiciones que permiten la amplificacion de secuencias diana.

- Un control de ADN de tipo silvestre. Esta es una PCR en la que el ADN plantilla proporcionado es ADN genomico preparado a partir de una planta no transgenica. Cuando se observa el resultado esperado, no se observa una amplificacion de un producto de PCR del trasngen sino una amplificacion del producto de PCR endogeno, esto indica que no hay una amplificacion del origen del transgen detectable en una muestra de ADN genomico.

4.5. Condiciones de PCR

Los resultados optimos se obtuvieron en las siguientes condiciones. Obviamente, se pueden usar otras polimerasas Taq, tal como GO-Taq y a continuacion, pueden diferir las condiciones para seguir las recomendaciones del proveedor.

- la mezcla de PCR para reacciones de 25 gl contiene:

x gl de ADN plantilla (25 ng)

2,5 gl de Tampon de Amplificacion 10x (suministrado por el fabricante con la polimerasa Taq)

0,5 gl de dNTP 10 mM

0,5 gl de SMP187 (10 pmoles/gl)

0,5 gl de STV019 (10 pmoles/gl)

1 gl de SOY029 (10 pmoles/gl)

0,1 gl de polimerasa de ADN Taq (5 unidades/gl)

agua hasta 25 gl

el perfil de termociclado a seguir para obtener resultados optimos es el siguiente:

4 min. a 95°C

Seguido por: 1 min. a 95°C

1 min. a 57°C

2 min. a 72°C

Durante 5 ciclos

Seguido por: 30 seg. a 92°C

30 seg. a 57°C

1 min. a 72°C

Durante 25 ciclos

Seguido por: 10 minutos a 72°C

4.6. Analisis en gel de agarosa

Para visualizar optimamente los resultados de la PCR, se determino que entre 10 y 20 gl de las muestras de PCR deberian aplicarse en un gel de agarosa al 1,5% (tampon Tris-borato) con un marcador de peso molecular apropiado (por ejemplo, escalera Pharmacia de 100 pb).

4.7. Validacion de los resultados

Los datos de muestras de ADN de plantas transgenicas dentro de una unica ejecucion de PCR y una unica PCR Master Mix no seran aceptables a menos que:

- el control positivo muestre los productos de PCR esperados (amplificacion de dianas transgenicas)

- el control de ADN positivo de tipo silvestre muestre el resultado esperado (amplificacion de la diana de tipo silvestre).

- el control negativo sea negativo para la amplificacion por PCR (sin fragmentos).

Los carriles que muestran cantidades visibles del producto de PCR transgenico del tamano esperado y que no muestran cantidades visibles del producto de PCR de tipo silvestre, indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparo la plantilla de ADN genomico, es homocigotica para el casete de genes transgenicos.

Los carriles que muestran cantidades visibles de los productos de PCR transgenicos y de tipo silvestre de los tamanos esperados, indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparo el ADN genomico plantilla, es hemicigotica para el casete de genes transgenicos. Los carriles que no muestran cantidades visibles del producto de PCR transgenico y que muestran cantidades visibles del producto de PCR de tipo silvestre, indican que la planta correspondiente a partir de la cual se preparo el ADN genomico plantilla, no ha heredado la secuencia transgenica analizada y, por lo tanto, es homocigotica para el locus de tipo silvestre.

Los carriles que no muestran cantidades visibles de los productos de PCR transgenicos y de tipo silvestre, indican que la calidad y/o cantidad del ADN genomico no permitio que se generara un producto de PCR. Estas plantas no se pueden puntuar. La preparacion del ADN genomico debe repetirse y se debe realizar una nueva ejecucion de PCR, con los controles apropiados.

4.8. Uso del protocolo de puntuacion de la cigosidad para la identificacion del estado de cigosidad en plantas que contienen EE-GM3

La Figura 3 ilustra el resultado obtenido con la PCR de puntuacion de cigosidad para EE-GM3 en varias muestras de plantas de soja. Se encontro que las muestras en los carriles 2 y 5 contenian solo el fragmento de PCR (706 pb) caracteristico del evento elite EE-GM3, mientras que las muestras en los carriles 4, 6 y 7 contenian solo el fragmento caracteristico de la presencia del locus de ts. Los carriles 3, 8 y 9 contenian ambos fragmentos. Los carriles 2 y 5, por lo tanto, contienen EE-GM3 en forma homocigotica, los carriles 3, 8 y 9 contienen EE-GM3 en forma hemicigotica y los carriles 4, 6 y 7 contienen el locus de ts en forma homocigotica (acigoto para EE-GM3). El carril 10 representa la muestra de control negativo (agua) y los carriles 1 y 11 representan el Marcador de Peso Molecular (escalera de 100 pb).

5. Introgresion de EE-GM3 en cultivares preferidos

El evento elite EE-GM3 se introduce mediante retrocruzamiento repetido en cultivares de soja comerciales tal como, pero sin limitacion, Cultivar de soja 7631014 (US2009252860); Cultivar de soja 7431014 (US2009252859); Cultivar de soja 7925084 (US2009252858); Cultivar de soja 7311153 (US2009252857); Cultivar de soja S070159 (US2009252856); Cultivar de soja 7535357 (US2009246353); Cultivar de soja S070160 (US2009246352); Cultivar de soja 26074414 (US2009249508); Cultivar de soja 7509171 (US2009249507); Cultivar de soja S070158 (US2009246351); Cultivar de soja 7511119 (US2009249506); Cultivar de soja 7113111 (US2009238945); Cultivar de soja S06-02RM018047 (US7592518); Cultivar de soja 7013345 (US2009232957); Cultivar de soja 7041461 (US2009235376); Cultivar de soja 7549450 (US2009232956); Cultivar de soja 7317090 (US2009232955); Cultivar de soja 2N2V58015 (US2009226597); Cultivar de soja 7243182 (US2009226596); Cultivar de soja 7143182 (US2009226595); Cultivar de soja 7043182 (US2009220673); Cultivar de soja S070157 (US2009222950); Cultivar de soja 306924721 (US2009220672); Cultivar de soja 7614385 (US2009220671); Cultivar de soja 7925118 (US2009214750); Cultivar de soja 7821295 (US2009214749); Cultivar de soja 7811336 (US2009214748); Cultivar de soja S070150 (US2009214747); Cultivar de soja 6214260 (US2009214746); Cultivar de soja S070152 (US2009214745); Cultivar de soja 7429331 (US2009214751); Cultivar de soja 26034631 (US2009208634); Cultivar de soja S07-03JR108674 (US7560621); Cultivar de soja S07-03KL016279 (US7560620); Cultivar de soja S06-CL959411 (US7554017); CULTIVAR DE SOJA SG3870NRR (US2009158453); CULTIVAR DE SOJA HFPR-G (CA2645702); Cultivar de soja S06-02JR423016 (US7521606); Cultivar de soja S06-01JR119814 (US7518039); Cultivar de soja S06-01JR119448 (US7518038); Cultivar de soja 6540220 (US2009055960); Cultivar de soja S060292 (US2009055959); Cultivar de soja S050228 (US2009055958); Cultivar de soja S06-02JR423003 (US7491873); Cultivar de soja S06-02JR423005 (US7491872); Cultivar de soja S06-02JR409114 (US7485782); Cultivar de soja S06-SJ144056 (US7473823); Cultivar de soja (US7470835); Cultivar de soja 6910450 (US2008282369); Cultivar de soja 6223012 (US7446246); Cultivar de soja 6549250 (US7446245); Cultivar de soja 17731225 (US2008271204); Cultivar de soja 6928285 (US2008271203); Cultivar de soja 6736054 (US2008271169); Cultivar de soja S060299 (US2008271199); Cultivar de soja S060294 (US2008271202); Cultivar de soja 6943322 (US2008271201); Cultivar de soja 5343260 (US2008263719); Cultivar de soja 6439359 (US2008263704); Cultivar de soja 6238359 (US2008263703); Cultivar de soja 6547272 (US2008263702); Cultivar de soja 6929431 (US2008263701); Cultivar de soja 6703392 (US2008263700); Cultivar de soja 6044483 (US2008263699); Cultivar de soja S050224 (US2008263698); Cultivar de soja 6719022 (US2008263697); Cultivar de soja 5826056 (US2008263696); Cultivar de soja 6265047 (US2008263724); Cultivar de soja 6928331 (US2008263695); Cultivar de soja 6719331 (US2008263694); Cultivar de soja 6636454 (US2008263693); Cultivar de soja 6226454 (US2008263718); Cultivar de soja Q0073801 (US2008256657); Cultivar de soja 6326393 (US2008256652); Cultivar de soja 6408448 (US2008256651); Cultivar de soja 6449315 (US2008250524); Cultivar de soja S060296 (US2008250523); Cultivar de soja 6012078 (US2008250522); Cultivar de soja 6342078 (US2008250521); Cultivar de soja 6419156 (US2008250520); Cultivar de soja 5723264 (US2008250519); Cultivar de soja S050225 (US2008250518); Cultivar de soja S060298 (US2008244783); Cultivar de soja 6935331 (US2008244782); Cultivar de soja 6819456 (US2008244787); Cultivar de soja S060297 (US2008244781); Cultivar de soja 6135319 (US2008244786); Cultivar de soja 6819331 (US2008244780); Cultivar de soja 6137445 (US2008244779); Cultivar de soja 6917445 (US2008244778); Cultivar de soja 6111333 (US2008244777); Cultivar de soja S050229 (US2008244776); Cultivar de soja 6114011 (US2008244775); Cultivar de soja 6900358 (US2008244784); Cultivar de soja 6345184 (US2008244774); Cultivar de soja 6836085 (US2008244773); Cultivar de soja 6635047 (US2008244772); Cultivar de soja 6139105 (US2008244771); Cultivar de soja 6434385 (US2008244770); CULTIVAR DE SOJA S060295 (US2008244769); Cultivar de soja 6035184 (US2008244768); Cultivar de soja S060293 (US2008209590); Cultivar de soja 6733322 (US2008209594); Cultivar de soja 6421326 (US2008209593); Cultivar de soja S060077 (US2008209589); Cultivar de soja 6600375 (US2008209592); Cultivar de soja S06-CL821457 (US7420104); Cultivar de soja S07-02KG294306 (US7414178); Cultivar de soja S06-BA046119 (US7414175); Cultivar de soja S07-02KG294307 (US7411114); Cultivar de soja SG3865N (US2008189802); Cultivar de soja 6701475 (US7408097); Cultivar de soja 1335025 (US2008178316); Cultivar de soja 1686017 (US2008178315); Cultivar de soja 2388028 (US2008178314); Cultivar de soja 2387029 (US2008178313); Cultivar de soja S06-WW152330 (US7388129); Cultivar de soja 6424090 (US7385118); Cultivar de soja 6723322 (US7385115); Cultivar de soja SG4377NRR (US7385114); Cultivar de soja S06-02JR111334 (US7381864); Cultivar de soja 6141287 (US7378577); Cultivar de soja MT110501 (US7378576); Cultivar de soja (US7378575); Cultivar de soja S06-WW169267 (US7375261); Cultivar de soja 6223392 (US7371939); Cultivar de soja S06-CL968413 (US7371937); Cultivar de soja S06-CL951107 (US7368636); Cultivar de soja S06-MT9152077 (US7361810); Cultivar de soja 4211676 (US2008092253); Cultivar de soja S06-M059029 (US7355101); Cultivar de soja 6548193 (US7345228); Cultivar de soja 6440261 (US7345227); Cultivar de soja S060291 (US7342151); Cultivar de soja S06-MT9206166 (US7339094); Cultivar de soja S06-WW013107 (US7339093); Cultivar de soja S06-M03256 (US7335820); Cultivar de soja 6134466 (US7332656); Cultivar de soja S06-01JR123373 (US7329800); Cultivar de soja S06-MT9211059 (US7326831); Cultivar de soja 26170838 (US2008016590); Cultivar de soja 306612412 (US2008016588); Cultivar de soja 26660135 (US2008016587); Cultivar de soja 306734323 (US2008016586); Cultivar de soja S06-01JR122235 (US7317144); Cultivar de soja 5900450 (US7314986); Cultivar de soja S06-MT116260 (US7314984); Cultivar de soja S06-SJ143606 (US7312381); Cultivar de soja S06-98181-G01-35167 (US7309819); Cultivar de soja 26082635 (US7304219); Cultivar de soja BA922834 (US7304217); Cultivar de soja 01JR123480 (US7304216); Cultivar de soja M061422 (US7304215); Cultivar de soja 17082821 (US2007277262); Cultivar de soja 17621620 (US2007277261); Cultivar de soja 00977706 (US2007277260); Cultivar de soja S060182 (US2007277259); Cultivar de soja 26312034 (US7301078); Cultivar de soja 26143837 (US7301077); Cultivar de soja 435.TCS (US2007271626); Cultivar de soja 495.RC (US2007271625); Cultivar de soja 5306230 (US7297845); Cultivar de soja S06-WW167686 (US7291772); Cultivar de soja 6141145 (US2007245426); Cultivar de soja S050232 (US2007226829); Cultivar de soja 5333301 (US2007226828); CULTIVAR DE SOJA S050215 (US2007226827); Cultivar de soja 3235020 (US2007226826); Cultivar de soja 5720482 (US2007226825); Cultivar de soja S050216 (US2007226824); Cultivar de soja 5512112 (US2007226823); Cultivar de soja 3233021 (US2007226822); Cultivar de soja 1336024 (US2007226821); Cultivar de soja 5348287 (US2007226820); Cultivar de soja 5204220 (US2007226819); Cultivar de soja 6188027 (US2007226818); Cultivar de soja 4183026 (US2007226817); Cultivar de soja S06-WW157958 (US7271325); Cultivar de soja 5733056 (US2007209091); Cultivar de soja 90501911 (US2007209090); Cultivar de soja S050221 (US2007204361); Cultivar de soja 5802205 (US2007204360); Cultivar de soja 1000642 (US2007204359); Cultivar de soja 5420128 (US2007204358); Cultivar de soja S050222 (US2007199094); Cultivar de soja S050217 (US2007199093); CULTIVAR DE SOJA S050223 (US2007199092); Cultivar de soja S050218 (US2007199091); Cultivar de soja 5419227 (US2007199089); Cultivar de soja 5319227 (US2007199088); Cultivar de soja 5723045 (US2007199087); Cultivar de soja 5051007 (US2007199086); Cultivar de soja 5826175 (US2007192893); Cultivar de soja S050231 (US2007192892); Cultivar de soja 5826376 (US2007192891); Cultivar de soja 5628386 (US2007192890); Cultivar de soja 5138236 (US2007186307); Cultivar de soja 5608398 (US2007186306); CULTIVAR DE SOJA S050230 (US2007186305); Cultivar de soja 5624126 (US2007180561); Cultivar de soja 5019225 (US2007180560); Cultivar de soja 5549483 (US2007180559); Cultivar de soja 4189010 (US2007180551); Cultivar de soja 1486018 (US2007180550); CULTIVAR DE SOJA S050235 (US2007180549); Cultivar de soja 5023230 (US2007180548); CULTIVAR DE SOJA S050238 (US2007174930); Cultivar de soja 5830261 (US2007174928); CULTIVAR DE SOJA S050226 (US7247772); Cultivar de soja 5806063 (US7247771); CULTIVAR DE SOJA S050233 (US7244881); Cultivar de soja 5726085 (US7241939); Cultivar de soja MT000792 (US7238867); Cultivar de soja 5521161 (US7235718); Cultivar de soja WW109447 (US7235717); Cultivar de soja BA947474 (US7220898); Cultivar de soja 5939002 (US7217870); Cultivar de soja 5726175 (US7217869); Cultivar de soja 5432082 (US7217868); Cultivar de soja SG0850RR (US7211715); Cultivar de soja SG1750NRR (US7208658); Cultivar de soja MT017827 (US7208657); Cultivar de soja 4N2V74028 (US7205458); Cultivar de soja CL431203 (US7202400); Cultivar de soja 4N0S63222 (US7199288); Cultivar de soja 5520279 (US7196253); Cultivar de soja 5834401 (US7196252); Cultivar de soja 5621161 (US7196251); Cultivar de soja CL722114 (US7196250); Cultivar de soja 5741081 (US7193140); Cultivar de soja CL727422 (US7186895); Cultivar de soja 4N2V55022 (US7183468); Cultivar de soja 5083011 (US7173169); Cultivar de soja 5626085 (US7169976); CULTIVAR DE SOJA S050051 (US7169974); Cultivar de soja 4506816 (US2006294626); Cultivar de soja WW152201 (US7132594); Cultivar de soja CL727636 (US7132593); Cultivar de soja M08851 (US7126047); Cultivar de soja 4324401 (US7105728); Cultivar de soja S050164 (US7105727); Cultivar de soja 4136015 (US2006195931); Cultivar de soja 3133014 (US2006195930); Cultivar de soja S040132 (US2006195929); Cultivar de soja 4328386 (US2006195928); Cultivar de soja 1339013 (US2006195927); Cultivar de soja 4423183 (US2006195925); Cultivar de soja S040131 (US2006195924); Cultivar de soja 4929388 (US2006195923); Cultivar de soja 4817034 (US2006195922); Cultivar de soja 4916816 (US7098385); Cultivar de soja 4713487 (US2006191032); Cultivar de soja 4348019 (US2006191031); Cultivar de soja S040122 (US2006191030); Cultivar de soja S040133 (US2006185031); Cultivar de soja CL821418 (US7091404); Cultivar de soja 4441080 (US7091403); Cultivar de soja 4805442 (US2006179509); Cultivar de soja 4921237 (US2006179508); Cultivar de soja 4417380 (US2006174369); Cultivar de soja 4405070 (US2006174368); Cultivar de soja 4417779 (US7084328); Cultivar de soja S040125 (US2006168678); Cultivar de soja 4909380 (US7081572); Cultivar de soja S050162 (US7081571); Cultivar de soja 6084016 (US7081570); Cultivar de soja S050163 (US7078600); Cultivar de soja S040135 (US7078598); Cultivar de soja S040117 (US7078597); Cultivar de soja M03393 (US7071391); Cultivar de soja 4145306 (US7064253); Cultivar de soja 900213 (US2006117405); Cultivar de soja 1000126 (US2006117404); Cultivar de soja 901023 (US2006117403); Cultivar de soja S040130 (US7053280); Cultivar de soja 4706198 (US7053279); Cultivar de soja S040118 (US7053278); Cultivar de soja S040119 (US7053277); Cultivar de soja S040123 (US7053276); Cultivar de soja 4442112 (US7049497); Cultivar de soja 917013 (US7045689); Cultivar de soja S040124 (US7045691); Cultivar de soja 4238491 (US7045690); Cultivar de soja S010136 (US7041882); Cultivar de soja 900613 (US7030297); Cultivar de soja 4337175 (US7030301); Cultivar de soja S040121 (US7030300); Cultivar de soja 4216033 (US7030299); Cultivar de soja S040128 (US7022901); Cultivar de soja S040120 (US7022900); Cultivar de soja S040127 (US7019199); Cultivar de soja S040134 (US7015378); Cultivar de soja S040129 (US7015377); Cultivar de soja 4513420 (US7005564); Cultivar de soja 943013 (US2006031958); Cultivar de soja S030136 (US2006021081); Cultivar de soja 927013 (US2006021080); Cultivar de soja 1000109 (US2006015962); Cultivar de soja 90046112 (US2006010530); Cultivar de soja 90897327 (US2006010529); Cultivar de soja 90362421 (US2006010528); Cultivar de soja 03022253 (US2006010527); Cultivar de soja 02022433 (US2006010526); Cultivar de soja 02022323 (US2006010525); Cultivar de soja 02912951 (US2006010524); Cultivar de soja 0102115 (US2006010523); Cultivar de soja 915034 (US2006010522); Cultivar de soja 0509255 (US2006010521); Cultivar de soja 4803070 (US6982368); Cultivar de soja 4704310 (US6979762); Cultivar de soja SJ919784 (US2005268362); Cultivar de soja CL615261 (US2005268361); Nueva soja (US2004199964); Cultivar de soja 0509214 (US2005210542); Cultivar de soja 70826751 (US2005193442); Cultivar de soja 0509243 (US2005193441); Cultivar de soja 0509246 (US2005193440); Cultivar de soja 0509253 (US2005193439); Cultivar de soja 0509247 (US2005193438); Cultivar de soja 0509252 (US2005193437); Cultivar de soja 0509241 (US2005193436); Cultivar de soja 0509249 (US6884927); Cultivar de soja 0509244 (US2005183158); Cultivar de soja 0509240 (US2005183157); 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Variedad de soja XB32C05 (US2005114937); Variedad de soja XB40D05 (US2005120423); Variedad de soja 92M61 (US2005120422); Variedad de soja 91M91 (US2005114936); Variedad de soja XB33Y05 (US2005120421); Variedad de soja XB34A05 (US2005120420); Variedad de soja XB13U05 (US2005114935); Variedad de soja XB12K05 (US2005114934); Variedad de soja XB30P05 (US2005120419); Variedad de soja XB57T05 (US2005114933); Variedad de soja XB17S05 (US2005114932); Variedad de soja XB25Y05 (US2005114930); Variedad de soja XB25S05 (US2005150017); Variedad de soja XB43W04 (US2004177420); Variedad de soja XB44W04 (US2004177419); Variedad de soja XB53J04 (US2004199960); Variedad de soja XB43V04 (US2004216192); Variedad de soja XB49K04 (US2004172668); Variedad de soja XB27P04 (US2004205864); Variedad de soja XB29L04 (US2004177418); Variedad de soja XB29K04 (US2004177417); Variedad de soja XB41U04 (US2004231017); Variedad de soja XB34D04 (US2004177416); Variedad de soja XB09J04 (US2004172711); Variedad de soja XB32Y04 (US2004194169); 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Variedad de soja XB18Q04 (US2004177410); Variedad de soja XB16Q04 (US2004177409); Variedad de soja XB55K04 (US2004172692); Variedad de soja XB57M04 (US2004172691); Variedad de soja XB25L04 (US2004205863); Variedad de soja XB48T04 (US2004194168); Variedad de soja XB42X04 (US2004199959); Variedad de soja XB31T04 (US2004177408); Variedad de soja XB31U04 (US2004194167); Variedad de soja XB30E04 (US2004177407); Variedad de soja XB31R04 (US2004177406); Variedad de soja S03-95341-A98-60618 (US6909033); Variedad de soja SN97-6946 (US2004168227); Variedad de soja 94M70 (US6864408); Variedad de soja 92M70 (US6797866); Variedad de soja 92M71 (US6858782); Variedad de soja 91M40 (US6828490); Variedad de soja 93M80 (US6849789); Variedad de soja XB39N03 (US6864407); Variedad de soja 93M90 (US6846975); Variedad de soja 90M90 (US6852913); Variedad de soja 92M72 (US6960708); Variedad de soja 91M90 (US6849788); Variedad de soja 92M50 (US6855876); Variedad de soja 92M30 (US6951974); Variedad de soja 93M60 (US6797865); Variedad de soja 93M40 (US6791016); Variedad de soja 93M41 (US6835875); Variedad de soja XB15P03 (US6797864); Variedad de soja XB24H03 (US6936752); Variedad de soja XB05A03 (US6815585); Variedad de soja 92M80 (US6849787); Variedad de soja XB33S03 (US6855875); Variedad de soja XB48P03 (US6797863); Variedad de soja XB29X03 (US6806406); Variedad de soja XB02C03 (US6800795); Variedad de soja XB29W03 (US6858781); Variedad de soja 91M10 (US6958437); Variedad de soja 92M10 (US6916975); Variedad de soja XB10G03 (US6806405); Variedad de soja 92M31 (US6846974); Variedad de soja XB38D03 (US6806404); Variedad de soja XB34N03 (US6803508); Variedad de soja XB30W03 (US6809236); Variedad de soja XB37J03 (US6844488); Variedad de soja SE72581 (US2004148665); Variedad de soja SE90076 (US2004148664); Variedad de soja SD82997 (US2004148663); Variedad de soja 0037393 (US2004148662); Variedad de soja 0088414 (US2004148661); Variedad de soja 0149926 (US2004148660); Variedad de soja 0037209 (US2004148659); Variedad de soja 93B36 (US6833498); Variedad de soja 90B74 (US6812384); Variedad de soja 90B51 (US6818809); Variedad de soja 91B03 (US6815584); Variedad de soja 95B43 (US6818808); Variedad de soja 95B42 (US6815583); Variedad de soja 92B47 (US6812383); Variedad de soja SE90346 (US2004055055); Variedad de soja 0007583 (US2004010824); Variedad de soja 0008079 (US2004010823); Variedad de soja S02-AP98041-2-333-01 (US2003121076); Variedad de soja S02-98041-2-251-01 (US2003182694); Variedad de soja S02-AP98041-2-262-02 (US2003196220); Variedad de soja S02-95021 -55-240-BA (US2003188348); Variedad de soja APA94-31572 (US2003061641); Variedad de soja AP98041 -1 -203 (US2003056251); Variedad de soja APA95-15294 (US2003061640); Variedad de soja AP98041-4-117 (US2003056250); Variedad de soja 91B33 (US6580018); Variedad de soja 93B85 (US6605762); Variedad de soja 92B76 (US6610911); Variedad de soja 92B38 (US6605761); Variedad de soja 94B24 (US6613967); Variedad de soja 94B73 (US6605760); Variedad de soja 93B86 (US6610910); Variedad de soja 91B12 (US6583343); Variedad de soja 95B34 (US6605759); Variedad de soja 94B23 (US6605758); Variedad de soja 90B11 (US6583342); Variedad de soja 91B92 (US6586659); Variedad de soja 95B96 (US6605757); Variedad de soja 93B72 (US6566589); Variedad de soja 95B97 (US6613966); Variedad de soja 92B95 (US6608243); Variedad de soja 93B47 (US6583341); Variedad de soja 97B52 (US6605756); Variedad de soja 93B15 (US6617499); Variedad de soja 94B54 (US6613965); Variedad de soja 93B67 (US6573433); Variedad de soja 93B87 (US6727410); Variedad de soja 96B51 (US6613964); Variedad de soja 92B84 (US6730829); Variedad de soja 92B12 (US6605755); Variedad de soja 90A07 (US6320105); Variedad de soja 93B26 (US6342659); Variedad de soja 96B21 (US6369301); Variedad de soja 92B63 (US6326529); Variedad de soja 93B46 (US6323402); Variedad de soja 92B75 (US6362400); Variedad de soja 93B08 (US6323401); Variedad de soja 97B62 (US6323400); Variedad de soja 92B37 (US6323399); Variedad de soja 92B56 (US6339186); Variedad de soja 93B66 (US6307131); Variedad de soja 92B62 (US6346657); Variedad de soja 92B36 (US6369300); Variedad de soja 90B73 (US6316700); Variedad de soja 95B95 (US6323398); Variedad de soja 93B65 (US6229074); Variedad de soja 92B24 (US6284950); Variedad de soja 94B53 (US6235976); Variedad de soja 94B22 (US6140557); Variedad de soja 93B84 (US6143956); Variedad de soja 95B32 (US6229073); Variedad de soja 95B53 (US6147283); Variedad de soja 93B35 (US6153816); Variedad de soja 93B07 (US6143955); Variedad de soja 92B74 (US6124526); Variedad de soja 92B35 (US6166296); Variedad de soja 94B45 (US6162968); Variedad de soja 96B01 (US6143954); Variedad de soja 93B53 (US6335197).

Se observa que la introgresion del evento elite en estos cultivares no influye significativamente en ninguna de las caracteristicas fenotipicas o agronomicas deseables de estos cultivares (sin arrastre de rendimiento), mientras que la expresion del transgen, segun lo determinado por la tolerancia al glifosato y/o isoxaflutol, cumple niveles comercialmente aceptables. Esto confirma el estado del evento EE-GM3 como un evento elite.

El evento elite EE-GM3 se puede combinar ventajosamente con uno o mas de los otros eventos de soja disponibles en el mercado, incluidos,pero sin limitacion,otros eventos de tolerancia a herbicidas, tal como los eventos descritos en las peticiones del USDA-APHIS: 09-349-01p, 09-201 -01 p, 09-183-01 p, 09-082-01p, 09-015-01p, 06-354-01p, 06­ 271-01 p, 06-178-01p, 98-238-01 p, 98-014-01 p, 97-008-01p, 96-068-01p, 95-335-01p, 93-258-01p (vease, por ejemplo, www.aphis.usda.gov/brs/not_reg.html),o el evento MON89788 (tolerancia al Glifosato) descrito en el documento US 2006-282915, evento DP-305423-1 (Alta tolerancia al acido oleico/inhibidor de ALS) descrito en el documento WO 2008/054747, eventos A2704-12 y A5547-127 (tolerancia al Glufosinato) descritos respectivamente en los documentos WO 2006/108674 o WO 2006/108675, MON87701 descrito en el documento US2009130071, evento 3560.4.3.5 descrito en el documento US2009036308, evento DP-305423-1 descrito en el documento US2008312082, o evento BPS-CV127-9 (Evento 127) del documento WO 2010/080829.

Tal como se utiliza en las reivindicaciones a continuacion, a menos que se indique claramente lo contrario, el termino "planta" pretende abarcar tejidos vegetales, en cualquier etapa de madurez, asi como cualquier celula, tejido u organo extraido de o derivado de cualquiera de dichas plantas, incluyendo sin limitacion, cualquier semilla, hoja,

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Una planta de soja, o celulas, partes, semillas o progenie de la misma, comprendiendo, cada una, en su genoma un evento elite, en donde dicho evento elite, tal como se encuentra en la semilla de referencia depositada en el NCIMB bajo el numero de deposito NCIMB 41659, es un locus genetico que comprende un ADN extrano que comprende un gen que codifica HPPD Pf W336 quimerico y un gen que codifica 2mEPSPS quimerico.

2. Una molecula de acido nucleico que se puede obtener de una planta de soja de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicha molecula de acido nucleico comprende el ADN extrano del evento elite de la reivindicacion 1, y las secuencias flanqueantes 5' y 3' de dicho evento elite, en donde dicha molecula de acido nucleico comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1441 al nucleotido 1462 que comprende parte de la secuencia flanqueante 5' y el ADN extrano contiguo a ella, y la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 230 al 251 que comprende parte de la secuencia flanqueante 3' y el ADN extrano contiguo a ella.

3. Una molecula de acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1431 al nucleotido 1462, o el complemento de la misma.

4. La molecula de acido nucleico de la reivindicacion 3, que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2, o el complemento de la misma.

5. Una molecula de acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 220 al 261, o el complemento de la misma.

6. La molecula de acido nucleico de la reivindicacion 5, que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3, o el complemento de la misma.

7. Una molecula de ADN, que comprende,en orden, las siguientes secuencias de nucleotidos:

a) la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1 al nucleotido 1451;

b) la secuencia de nucleotidos del complemento de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleotido 6760 al nucleotido 6958;

c) la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleotido 6874 al nucleotido 7298;

d) la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleotido 7 al nucleotido 7291;

e) la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleotido 12 al nucleotido 7265;

f) la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 217 al nucleotido 240; y

g) la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 1408.

8. Una molecula de ADN que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 11.

9. Una planta de soja que comprende la molecula de ADN de la reivindicacion 7.

10. Una planta, celula, tejido o semilla de soja, que comprende cada uno la molecula de ADN de la reivindicacion 8.

11. Un metodo para producir un producto de soja, en el que dicho producto de soja es o comprende semola, semillas molidas, harina o copos de soja, que comprende obtener semillas de soja que comprenden el evento elite de la reivindicacion 1, y producir dicho producto de soja a partir de ellas.

12. Un proceso para cultivar plantas de soja que contienen el evento elite de la reivindicacion 1, que comprende sembrar un campo con semillas que contienen el evento elite de la reivindicacion 1, tratar dicho campo con un herbicida inhibidor de HPPD, como el isoxaflutol, antes de que emerjan las plantas de soja pero despues de sembrar las semillas, seguido opcionalmente por la aplicacion de glifosato o una mezcla de inhibidor de HPPD-glifosato como herbicida postemergente sobre la parte superior de las plantas.

13. Un metodo para cultivar plantas de soja que contienen el evento elite de la reivindicacion 1, que comprende tratar un campo a plantar con plantas de soja que comprenden el evento elite de la reivindicacion 1 o a sembrar con semillas de soja que comprenden el evento elite de la reivindicacion 1, con un herbicida inhibidor de HPPD, antes de plantar las plantas de soja o sembrar las semillas, seguido de la plantacion o siembra de dichas plantas o semillas de soja en dicho campo pretratado, opcionalmente en donde se aplica glifosato, o una mezcla de inhibidor de HPPD-glifosato, como herbicida postemergente sobre la parte superior de las plantas.

14. Un metodo para cultivar plantas de soja que comprenden el evento elite de la reivindicacion 1, que comprende sembrar semillas que contienen el evento elite de la reivindicacion 1 y tratar las plantas de soja que han emergido de las semillas que se sembraron con un herbicida inhibidor de HPPD, como el isoxaflutol, sobre la parte superior de las plantas de soja.

15. El metodo de la reivindicacion 14, en donde el tratamiento con un herbicida inhibidor de HPPD se puede aplicar junto con, seguido por o precedido por un tratamiento con glifosato como herbicida postemergente en la parte superior de las plantas.

16. Una planta de soja tolerante a los herbicidas glifosato y/o isoxaflutol, que se puede obtener al introducir en el genoma el evento elite de la reivindicacion 1.

17. Un metodo para identificar el evento elite de la reivindicacion 1 en muestras biologicas, comprendiendo el metodo, la deteccion de una region especifica de dicho evento elite con dos cebadores especificos, uno de los cuales reconoce especificamente una secuencia dentro de la region flanqueante 5 'o 3' del ADN extrano que comprende genes de tolerancia a herbicidas en dicho evento elite, comprendiendo dicha region flanqueante 5', la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1 al nucleotido 1451, y comprendiendo dicha region flanqueante 3', la secuencia de nucleotidos del complemento de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 1408, y el otro cebador que reconoce especificamente una secuencia dentro del ADN extrano contiguo a dicha region flanqueante 5' o 3', comprendiendo dicho ADN extrano, la secuencia de nucleotidos del complemento de la SEQ ID nO: 2 del nucleotido 1452 al nucleotido 1843 o la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 1 al nucleotido 240, o comprendiendo la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 11 desde la posicion del nucleotido 1452 hasta la posicion del nucleotido 16638 o su complemento, o con una sonda especifica que reconoce especificamente la region flanqueante 5 'o 3' de dicho evento elite, y parte del ADN extrano contiguo a ella.

18. El metodo de la reivindicacion 17, comprendiendo dicho metodo amplificar un fragmento de ADN de entre 50 y 1000 pb de un acido nucleico presente en dichas muestras biologicas utilizando una reaccion en cadena de la polimerasa con al menos dichos dos cebadores especificos.

19. El metodo de la reivindicacion 18, en donde dicho cebador que reconoce la region flanqueante 5 ' comprende en su extremo 3' final una secuencia de nucleotidos de al menos 17 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1 al nucleotido 1451 o dicho cebador, que reconoce la region flanqueante 3' de dicho evento elite, comprende en su extremo 3 ' final una secuencia de nucleotidos de al menos 17 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleotidos del complemento de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 1408, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN extrano comprende en su extremo 3' final al menos 17 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleotidos del complemento de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1452 al nucleotido 1843 o la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 1 al nucleotido 240 o la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleotido 188 al nucleotido 7252 o su complemento, o la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 11 desde la posicion del nucleotido 1452 hasta la posicion del nucleotido 16638 o su complemento, o en donde dichos cebadores comprenden la secuencia de la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente, o la secuencia de la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 5, respectivamente.

20. Un par de cebadores adecuado para su uso en una deteccion especifica para el evento elite de la reivindicacion 1, que comprende un primer cebador que reconoce una secuencia dentro de la region flanqueante 5' de un ADN extrano que comprende genes de tolerancia a herbicidas en dicho evento elite, comprendiendo dicha region flanqueante 5' la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1 al nucleotido 1451 y un segundo cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN extrano insertado contiguo a dicha region flanqueante 5', comprendiendo dicho ADN extrano insertado contiguo a dicha region flanqueante 5 ', la secuencia de nucleotidos del complemento de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1452 al nucleotido 1843; o que comprende un primer cebador que reconoce una secuencia dentro de la region flanqueante 3 ' del ADN extrano que comprende genes de tolerancia a herbicidas de dicho evento elite, y un segundo cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN extrano insertado contiguo a dicha region flanqueante 3', en donde dicha region flanqueante 3 'comprende la secuencia de nucleotidos del complemento de la s Eq ID NO: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 1408, y comprendiendo dicho ADN extrano insertado contiguo a dicha region flanqueante 3', la secuencia de la SEQ ID NO:3 del nucleotido 1 hasta nucleotido 240.

21. El par de cebadores de la reivindicacion 20, en donde uno de dichos cebadores comprende, preferentemente en su extremo 3 ', una secuencia de nucleotidos de 17 a 200 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1 al nucleotido 1451 o una secuencia de nucleotidos de 17 a 200 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleotidos del complemento de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 1408.

22. El par de cebadores de la reivindicacion 21, que comprende un primer cebador que comprende en su extremo 3 ' final la secuencia de la SEQ ID NO: 5 y un segundo cebador que comprende en su extremo 3' final la secuencia de la SEQ ID NO: 4.

23. El metodo de la reivindicacion 17, cuyo metodo comprende hibridar un acido nucleico de muestras biologicas con una sonda especffica para dicho evento elite, en donde la secuencia de dicha sonda especffica tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende parte de la secuencia flanqueante 5 ' o de la secuencia flanqueante 3' en dicho evento elite y la secuencia del ADN extrano contiguo a la misma, o el complemento de la misma, en donde dicha secuencia flanqueante 5 ' comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1 al nucleotido 1451, y el ADN extrano contiguo a ella comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1452 al nucleotido 1843, y en donde dicha secuencia flanqueante 3' comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 1408, y el ADN extrano contiguo a ella comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 1 al nucleotido 240, como en donde la secuencia de dicha sonda especffica tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1431 al 1472 o la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 220 al 261, o el complemento de dichas secuencias.

24. Una sonda especffica para la identificacion del evento elite de la reivindicacion 1 en muestras biologicas, que comprende una secuencia de nucleotidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende parte de la secuencia flanqueante 5 ' o la secuencia flanqueante 3' del ADN extrano que comprende genes de tolerancia a herbicidas en dicho evento elite y la secuencia del ADN extrano contiguo a ella, o el complemento de la misma, en donde dicha secuencia flanqueante 5 ' comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1 al nucleotido 1451, y el ADN extrano contiguo a ella comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1452 al nucleotido 1843, y en donde dicha secuencia flanqueante 3' comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 1408, y el ADN extrano contiguo a ella comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 1 al nucleotido 240, tal como una sonda que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1441 al 1462 o la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 230 al 251, o el complemento de dichas secuencias.

25. Un kit que comprende un par de cebadores o una sonda que reconocen especfficamente el evento elite de la reivindicacion 1, en donde dicho par de cebadores es el par de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, y en donde dicha sonda es la sonda de la reivindicacion 24.

26. El metodo de la reivindicacion 17 para confirmar la pureza de la semilla, o para seleccionar semillas para detectar la presencia del evento elite de la reivindicacion 1, cuyo metodo comprende la deteccion, en muestras de semillas, de una region especffica para dicho evento elite con dos cebadores especfficos, uno de los cuales reconoce especfficamente la region flanqueante 5 'o 3' del ADN extrano que comprende genes de tolerancia a herbicidas en dicho evento elite, y el otro reconoce especfficamente una secuencia dentro de dicho ADN extrano, o con una sonda especffica que reconoce especfficamente la region flanqueante 5 'o 3 ' de dicho evento elite, y parte del ADN extrano contiguo a ella, en donde dicha region flanqueante 5 ' comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1 al nucleotido 1451, y el ^a Dⁿ extrano contiguo a ella comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1452 al nucleotido 1843, y en donde dicha region flanqueante 3' comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 1408, y el ADN extrano contiguo a ella comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 1 al nucleotido 240.

27. Un metodo para detectar la presencia del evento elite de la reivindicacion 1 en muestras biologicas mediante hibridacion con una sonda de acido nucleico marcada sustancialmente complementaria en el que la relacion sonda: acido nucleico diana se amplifica mediante el reciclaje de la secuencia del acido nucleico diana, comprendiendo dicho metodo:

a) hibridar dicha secuencia de acido nucleico diana a un primer oligonucleotido de acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1452 al nucleotido 1469 o su complemento o dicho primer oligonucleotido de acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleotido 223 al nucleotido 240 o su complemento;

b) hibridar dicha secuencia de acido nucleico diana con un segundo oligonucleotido de acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 2 del nucleotido 1434 al nucleotido 1451 o su complemento o dicho segundo oligonucleotido de acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 desde nucleotido 241 al nucleotido 258 o su complemento, en donde dichos primer y segundo oligonucleotido se solapan con al menos un nucleotido y en donde dichos primer o dicho segundo oligonucleotido se marcan para ser dicha sonda de acido nucleico marcada;

c) escindir solamente la sonda marcada dentro del duplex sonda:secuencia de acido nucleico diana con una enzima que causa la escision selectiva de la sonda que da como resultado la disociacion del duplex, dejando la secuencia diana intacta;

d) reciclar la secuencia de acido nucleico diana repitiendo las etapas (a) a (c); y

e) detectar la sonda marcada escindida, determinando, de este modo, la presencia de dicha secuencia de acido nucleico diana.