BR112012012567A2 - plantas de soja tolerantes a herbicida e métodos para identificar as mesmas - Google Patents
plantas de soja tolerantes a herbicida e métodos para identificar as mesmas Download PDFInfo
- Publication number
- BR112012012567A2 BR112012012567A2 BR112012012567-2A BR112012012567A BR112012012567A2 BR 112012012567 A2 BR112012012567 A2 BR 112012012567A2 BR 112012012567 A BR112012012567 A BR 112012012567A BR 112012012567 A2 BR112012012567 A2 BR 112012012567A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- nucleotide
- seq
- sequence
- nucleotide sequence
- soy
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 78
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims abstract description 1089
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims abstract description 567
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 268
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims abstract description 144
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 claims abstract description 114
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 53
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 1455
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 1455
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 318
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 279
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 175
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 131
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 119
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 claims description 96
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 claims description 94
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 94
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 84
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 77
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 claims description 62
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 claims description 62
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 60
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 60
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 claims description 40
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 39
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 39
- 239000003999 initiator Substances 0.000 claims description 33
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 32
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 31
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 26
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 16
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 16
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 15
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 15
- OYIKARCXOQLFHF-UHFFFAOYSA-N isoxaflutole Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC(C(F)(F)F)=CC=C1C(=O)C1=C(C2CC2)ON=C1 OYIKARCXOQLFHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 11
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000005571 Isoxaflutole Substances 0.000 claims description 9
- 229940088649 isoxaflutole Drugs 0.000 claims description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 claims description 2
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 claims 40
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 15
- 238000004064 recycling Methods 0.000 claims 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 63
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 43
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 28
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 202
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 33
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 24
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 19
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 19
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 19
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 18
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 16
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 12
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- -1 5-hydroxy-1 -methyl-1 H-pyrazol-4-yl Chemical group 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 6
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 6
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 4
- 239000012297 crystallization seed Substances 0.000 description 4
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 101150113864 pat gene Proteins 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- 241000862632 Soja Species 0.000 description 3
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000013095 identification testing Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- CKJNUZNMWOVDFN-UHFFFAOYSA-N methanone Chemical compound O=[CH-] CKJNUZNMWOVDFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyphenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101000797323 Glycine max Actin-1 Proteins 0.000 description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- KXFJZKUFXHWWAJ-UHFFFAOYSA-N p-hydroxybenzoylformic acid Natural products OC(=O)C(=O)C1=CC=C(O)C=C1 KXFJZKUFXHWWAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- ZMYFCFLJBGAQRS-IRXDYDNUSA-N (2R,3S)-epoxiconazole Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1[C@@]1(CN2N=CN=C2)[C@H](C=2C(=CC=CC=2)Cl)O1 ZMYFCFLJBGAQRS-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCXDHFDTOYPNIE-RIYZIHGNSA-N (E)-acetamiprid Chemical compound N#C/N=C(\C)N(C)CC1=CC=C(Cl)N=C1 WCXDHFDTOYPNIE-RIYZIHGNSA-N 0.000 description 1
- XUHGTGGPZFJRMF-UHFFFAOYSA-N 1,3-dihydropyrazole-2-carboxylic acid Chemical class OC(=O)N1CC=CN1 XUHGTGGPZFJRMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JWUCHKBSVLQQCO-UHFFFAOYSA-N 1-(2-fluorophenyl)-1-(4-fluorophenyl)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)ethanol Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C(C=1C(=CC=CC=1)F)(O)CN1C=NC=N1 JWUCHKBSVLQQCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXMNMQRDXWABCY-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenyl)-4,4-dimethyl-3-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)pentan-3-ol Chemical compound C1=NC=NN1CC(O)(C(C)(C)C)CCC1=CC=C(Cl)C=C1 PXMNMQRDXWABCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQDARGUHUSPFNL-UHFFFAOYSA-N 1-[2-(2,4-dichlorophenyl)-3-(1,1,2,2-tetrafluoroethoxy)propyl]1,2,4-triazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1C(COC(F)(F)C(F)F)CN1C=NC=N1 LQDARGUHUSPFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YUVKUEAFAVKILW-UHFFFAOYSA-N 2-(4-{[5-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]oxy}phenoxy)propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=CC=C(C(F)(F)F)C=N1 YUVKUEAFAVKILW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPPOHAUSNPTFAJ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[(6-chloro-1,3-benzoxazol-2-yl)oxy]phenoxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=NC2=CC=C(Cl)C=C2O1 MPPOHAUSNPTFAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CABMTIJINOIHOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-methyl-5-oxo-4-(propan-2-yl)-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl]quinoline-3-carboxylic acid Chemical compound N1C(=O)C(C(C)C)(C)N=C1C1=NC2=CC=CC=C2C=C1C(O)=O CABMTIJINOIHOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTTKDUXKVPEXCG-UHFFFAOYSA-N 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-mesyl-4-trifluoromethylphenyl)propan-1,3-dione Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC(C(F)(F)F)=CC=C1C(=O)C(C#N)C(=O)C1CC1 ZTTKDUXKVPEXCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092742 A-DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000005875 Acetamiprid Substances 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 239000005476 Bentazone Substances 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JFLRKDZMHNBDQS-UCQUSYKYSA-N CC[C@H]1CCC[C@@H]([C@H](C(=O)C2=C[C@H]3[C@@H]4C[C@@H](C[C@H]4C(=C[C@H]3[C@@H]2CC(=O)O1)C)O[C@H]5[C@@H]([C@@H]([C@H]([C@@H](O5)C)OC)OC)OC)C)O[C@H]6CC[C@@H]([C@H](O6)C)N(C)C.CC[C@H]1CCC[C@@H]([C@H](C(=O)C2=C[C@H]3[C@@H]4C[C@@H](C[C@H]4C=C[C@H]3C2CC(=O)O1)O[C@H]5[C@@H]([C@@H]([C@H]([C@@H](O5)C)OC)OC)OC)C)O[C@H]6CC[C@@H]([C@H](O6)C)N(C)C Chemical compound CC[C@H]1CCC[C@@H]([C@H](C(=O)C2=C[C@H]3[C@@H]4C[C@@H](C[C@H]4C(=C[C@H]3[C@@H]2CC(=O)O1)C)O[C@H]5[C@@H]([C@@H]([C@H]([C@@H](O5)C)OC)OC)OC)C)O[C@H]6CC[C@@H]([C@H](O6)C)N(C)C.CC[C@H]1CCC[C@@H]([C@H](C(=O)C2=C[C@H]3[C@@H]4C[C@@H](C[C@H]4C=C[C@H]3C2CC(=O)O1)O[C@H]5[C@@H]([C@@H]([C@H]([C@@H](O5)C)OC)OC)OC)C)O[C@H]6CC[C@@H]([C@H](O6)C)N(C)C JFLRKDZMHNBDQS-UCQUSYKYSA-N 0.000 description 1
- 235000010520 Canavalia ensiformis Nutrition 0.000 description 1
- 244000045232 Canavalia ensiformis Species 0.000 description 1
- 102000016918 Complement C3 Human genes 0.000 description 1
- 108010028780 Complement C3 Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000005767 Epoxiconazole Substances 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 239000005900 Flonicamid Substances 0.000 description 1
- 239000005901 Flubendiamide Substances 0.000 description 1
- 239000005787 Flutriafol Substances 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000005981 Imazaquin Substances 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005583 Metribuzin Substances 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005591 Pendimethalin Substances 0.000 description 1
- 231100000674 Phytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 description 1
- 239000005930 Spinosad Substances 0.000 description 1
- 239000005931 Spirotetramat Substances 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 239000005839 Tebuconazole Substances 0.000 description 1
- 239000005840 Tetraconazole Substances 0.000 description 1
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 1
- 239000005857 Trifloxystrobin Substances 0.000 description 1
- 239000005942 Triflumuron Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- XCSGPAVHZFQHGE-UHFFFAOYSA-N alachlor Chemical compound CCC1=CC=CC(CC)=C1N(COC)C(=O)CCl XCSGPAVHZFQHGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- ZOMSMJKLGFBRBS-UHFFFAOYSA-N bentazone Chemical compound C1=CC=C2NS(=O)(=O)N(C(C)C)C(=O)C2=C1 ZOMSMJKLGFBRBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CNBGNNVCVSKAQZ-UHFFFAOYSA-N benzidamine Natural products C12=CC=CC=C2C(OCCCN(C)C)=NN1CC1=CC=CC=C1 CNBGNNVCVSKAQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- VIHAEDVKXSOUAT-UHFFFAOYSA-N but-2-en-4-olide Chemical compound O=C1OCC=C1 VIHAEDVKXSOUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 108010041758 cleavase Proteins 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 235000004879 dioscorea Nutrition 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- RLQJEEJISHYWON-UHFFFAOYSA-N flonicamid Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=NC=C1C(=O)NCC#N RLQJEEJISHYWON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N flubendiamide Chemical compound CC1=CC(C(F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CC(I)=C1C(=O)NC(C)(C)CS(C)(=O)=O ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGZZWXTVIYUUEY-UHFFFAOYSA-N fomesafen Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)NS(=O)(=O)C)=CC(OC=2C(=CC(=CC=2)C(F)(F)F)Cl)=C1 BGZZWXTVIYUUEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002545 isoxazoles Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- UHXUZOCRWCRNSJ-QPJJXVBHSA-N methomyl Chemical compound CNC(=O)O\N=C(/C)SC UHXUZOCRWCRNSJ-QPJJXVBHSA-N 0.000 description 1
- 125000004170 methylsulfonyl group Chemical group [H]C([H])([H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- FOXFZRUHNHCZPX-UHFFFAOYSA-N metribuzin Chemical compound CSC1=NN=C(C(C)(C)C)C(=O)N1N FOXFZRUHNHCZPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009526 moderate injury Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 231100000862 numbness Toxicity 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- CHIFOSRWCNZCFN-UHFFFAOYSA-N pendimethalin Chemical compound CCC(CC)NC1=C([N+]([O-])=O)C=C(C)C(C)=C1[N+]([O-])=O CHIFOSRWCNZCFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 229940014213 spinosad Drugs 0.000 description 1
- CLSVJBIHYWPGQY-GGYDESQDSA-N spirotetramat Chemical compound CCOC(=O)OC1=C(C=2C(=CC=C(C)C=2)C)C(=O)N[C@@]11CC[C@H](OC)CC1 CLSVJBIHYWPGQY-GGYDESQDSA-N 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000003971 tillage Methods 0.000 description 1
- IYMLUHWAJFXAQP-UHFFFAOYSA-N topramezone Chemical compound CC1=C(C(=O)C2=C(N(C)N=C2)O)C=CC(S(C)(=O)=O)=C1C1=NOCC1 IYMLUHWAJFXAQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- ONCZDRURRATYFI-TVJDWZFNSA-N trifloxystrobin Chemical compound CO\N=C(\C(=O)OC)C1=CC=CC=C1CO\N=C(/C)C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ONCZDRURRATYFI-TVJDWZFNSA-N 0.000 description 1
- XAIPTRIXGHTTNT-UHFFFAOYSA-N triflumuron Chemical compound C1=CC(OC(F)(F)F)=CC=C1NC(=O)NC(=O)C1=CC=CC=C1Cl XAIPTRIXGHTTNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
Abstract
"PLANTAS DE SOJA TOLERANTES À HERBICIDA E MÉTODOS PARA IDENTIFICÁ-LAS". A invenção provê plantas de soja transgênica, material de planta e sementes específicos, caracterizados pelo fato de que esses produtos englobam eventos de transformação específicos em locais específicos no genoma da soja. São também providas ferramentas que permitem identificação rápida e inequívoca desses eventos em amostras biológicas.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS DE CONTROLE DE ERVAS DANINHAS, DE PRODUÇÃO DE PRODUTO
DE SOJA E DE PLANTA DE SOJA TOLERANTE AOS HERBICIDAS GLIFOSATO, GLUFOSINATO E ISOXAFLUTOL, DE IDENTIFICAÇÃO DE 5 EVENTOS ELITES EE-GM1, EE-GM2 E EE-GM3, PARES DE SONDAS E INICIADORES, KIT, BEM COMO USO DE PLANTAS, CÉLULAS, PARTES, SEMENTES DE SOJA OU PROGÊNIE". Referência cruzada a pedidos relacionados Este pedido reivindica prioridade do pedido de patente provisório US 61/367.251, depositado em 23 de julho de 2010; pedido de patente pro- visório 61/263.707, depositado em 23 de novembro de 2009, e pedido de patente europeia EP 09014565.7, depositado dia 23 de novembro de 2009, as revelações de cada um estão aqui incorporadas como referência em suas totalidades. Campo da Invenção Esta invenção refere-se a plantas de soja transgênicas, material de planta e sementes, caracterizadas por abrigar pelo menos dois eventos de transformação específicos, nomeadamente através da presença de pelo menos dois conjuntos de genes que codificam proteínas que conferem tole- rância a herbicidas, cada um em um local específico no genoma de soja. As plantas de soja da invenção combinam o fenótipo de tolerância a herbicida com um desempenho agronômico, estabilidade genética e funcionalidade em diferentes origens genéticas equivalentes para a linhagem da soja não transformada na ausência de herbicida. Esta invenção fornece ainda méto- dos e kits para identificar a presença de material de planta compreendendo especificamente evento de transformação EE-GM3 e EE-GM2 ou EE-GM1 em amostras biológicas. Antecedentes da Invenção A expressão fenotípica de um transgene em uma planta é de- terminada tanto pela estrutura do gene ou pelos próprios genes quanto por suas localizações no genoma da planta. Ao mesmo tempo, a presença dos transgenes ou "DNA estrangeiro" em diferentes locais no genoma irá influ- Segue-se folha 1a/118
1a/118 enciar o fenótipo geral da planta de diferentes formas.
A introdução agrono- micamente ou industrialmente bem-sucedida de um traço comercialmente interessante em uma planta por manipulação genética pode ser um processo lento dependente de fatores diferentes.
A transformação real e regeneração
Segue-se folha 2/118 de plantas geneticamente transformadas são apenas a primeira de uma sé- rie de etapas de seleção que inclui caracterização genética extensa, criação e avaliação em ensaios de campo, ievando eventualmente à seleção de um evento elite. A identificação inequívoca de um evento elite está se tornando cada vez mais importante em vista das discussões sobre Novos Alimen- tos/AIimentação, segregação de produtos OGM e não-OGM e identificação de material proprietário. ldealmente, o método de identificação é rápido e simples, sem a necessidade de um extenso cenário de laboratório. Além dis- lO so, o método deve fornecer resultados que permitem a determinação inequi- voca do evento elite sem a interpretação de especialistas, mas que se reali- za sob análise de peritos, se necessário. Ferramentas especificas para utili- zação na identificação de evento eíite EE-GM3 e EE-GMI ou EE-GM2 em amostras biológicas são aqui descritos.
Nesta invenção, EE-GM3 foi identificado como um evento elite de uma população de plantas de soja transgênicas no desenvolvimento de soja tolerante a herbicida (Glycine n)ax) compreendendo um gene que codi- fica para a tolerância ao glifosato combinado com gene que confere tolerân- cia a inibidores de 4-hidróxi fenilpiruvato dioxigenase (HPPD), cada um sob de controle um promotor de planta expressável. EE-GMI e EE-GM2 foram anteriormente identificados como e- ventos elite de uma população de plantas de soja transgênicas no desenvol- vimento de soja tolerante a herbicida (Glycine max) compreendendo um ge- ne que codifica para tolerância a glufosinato sob controle de um promotor expressível de planta e são descritos em \NO2006/1 08674 e WO2006/108675 (ambas as publicações aqui incorporadas por referência). As plantas de soja compreendendo um gene de tolerância a herbicida foram divulgados na técnica. No entanto, nenhuma das divulga- ções técnicas anteriores ensina ou sugere a presente invenção.
É conhecido na técnica que a obtenção de um evento de trans- formação de elite comercial de tolerância a herbicida em plantas de soja com um desempenho aceitável agronômico, sem arraste do rendimento, e pro-
porcionando a tolerância a herbicida suficiente, certamente a 3 diferentes classes de herbicidas, não é de forma simples.
Na verdade, tem sido relatado que o primeiro evento de soja (e- vento 40-3-2) liberado no mercado com a tolerância a herbicida, tinha um
5 rendimento de arrasto significativo em comparação com as linhagens (qua- se) isogênicas (Elmore et al. (2001) Agron.
J. 93:408-412)- Além disso, sojas Optimum® GAT" (evento 356043) foram de- senvolvidas para combinar tolerância ao glifosato com tolerância a herbici- das ALS, mas tem sido relatado que estas soja não atingiram os padrões
10 para tolerância ao glifosato, por si só (sem combinação com outro soja tole- rância ao glifosato evento (como o evento 40-3-2) (vide, por exemplo, www.bloomberq.corri/apps/news?pid=newsarchive&sid=ad4LOhH9MKWE)). Sumário das Modalidades Preferenciais da Invenção A presente invenção se refere a uma planta de soja transgênica,
15 ou sementes, células ou tecidos da mesma que compreende, estavelmente " integrado no seu genoma, um cassete de expressão que compreende um gene de tolerância a herbicida que compreende a sequência de codificação do gene 2mEPSPS e um outro gene de tolerância a herbicida que compre- ende a sequência codificadora da HPPD-PF W336 (tanto como descrito no
20 Exemplo 1.1 aqui e conforme representado na SEQ ID No 1) bem como um segundo cassete de expressão compreendendo um gene de tolerància a herbicida compreendendo a sequência de codificação de um fosfinotricin acetil transferase, conforme descrito no Exemplo 1 aqui e conforme repre- sentado em SEQ ID No 11. A planta transgênica de soja, ou sementes, célu-
25 las ou tecidos do mesmo são tolerantes a herbicidas à base de glifosato, com base no glufosinato, e um herbicida inibidor de HPPD como isoxaflutol, e, na ausência de herbicida, tem um desempenho agronômico que é subs- tanciaímente equivalente à linhagem não transgênica isogênica.
Após a apli- cação de um ou mais herbicidas para o qual a tolerância é fornecida, a plan-
30 ta terá um fenótipo agronómico superior em comparação com uma planta não transgênica.
De acordo com a presente invenção, a planta de soja ou semen-
tes, células ou tecidos do mesmo evento elite cotnpreendem EE-GM3 e EE-
GMl ou EE-GM3 e EE-GM2. Mais especificamente, a presente invenção se refere a planta de soja transgênica, semente, células ou tecidos da mesma, cujo DNA genômi-
5 co é caracterizado pelo fato de que, quando analisado em um Protocolo de ldentificação de PCR conforme descrito aqui, usado dois iniciadores direcio- nados para a região flanqueadora 5' ou 3' de EE-GM3 e o DNA estrangeiro DNA compreendendo genes de tolerância a herbicida em EE-GM-3, respec- tivamente, rende um fragmento que é específico para EE-GM3 e ainda
10 quando analisado em um Protocolo de ldentificação de PCR conforme des- crito aqui, usando dois iniciadores direcionados para a região flanqueadora 5' ou 3' de EE-GMI ou EE-GM2 e o DNA estrangeiro compreendendo genes de tolerância a glufosinato, respectivamente, rende um fragmento que é es- pecífico para EE-GMI ou EE-GM2. Os iniciadores para a detecção de EE-
15 GM3 podem ser direcionados contra a região flanqueadora 5' dentro SEQ ID " NO: 2 e os genes de tolerância a herbicidas compreendendo DNA estrangei- ro, respectivamente.
Os iniciadores para a detecção de EE-GM3 podem ser direcionados contra a região flanqueadora 3' dentro SEQ ID NO: 3 e o DNA estrangeiro compreendendo genes de tolerância a herbicida, respectivamen-
20 te, como os iniciadores compreendendo ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotideo de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID No. 4 ou SEQ ID No.: 7 respectivamente, e rende um fragmento de DNA de entre 100 e 800 pb, como um fragmento de cerca de 263 pb ou cerca de 706 pb.
Os iniciadores para a detecção de EE-GMI podem ser direcionados contra a região flan-
25 queadora 5' dentro SEQ 1D NO: 12 e o DNA estrangeiro compreendendo os genes de tolerância a herblcidas, respectivamente.
Os iniciadores para a detecção de EE-GMI podem ser direcionados contra a região flanqueadora 3' dentro SEQ ID NO: 13 e o DNA estrangeiro compreendendo genes de tolerância a herbicida, respectivamente, como os iniciadores compreenden-
30 do ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 16 e SEQ ID No. 17 respectivamente, e rendem um fragmento de DNA de entre 100 e 500 pb, como um fragmento de cerca de 183 pb.
Os iniciado-
Ç 1 5/118 res para a detecção de EE-GM2 podem ser direcionados contra a região fianqueadora 5' dentro SEQ ID NO: 14 e o DNA estrangeiro compreendendo os genes de tolerância a herbicidas, respectivamente. Os iniciadores para a detecção de EE-GM2 podem ser direcionados contra a região flanqueadora 5 3' dentro SEQ ID NO: 15 e o DNA estrangeiro compreendendo genes de tolerância a herbicida, respectivamente, como os iniciadores compreenden- do ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 18 e SEQ ID No. 19 respectivamente, e rendem um fragmento de DNA de entre 100 e 500 pb, como um fragmento de cerca de 151 pb.
10 Semente de referência compreendendo o evento elite EE-GM3 da invenção foi depositada na NCIMB com o número de acessão NCÍMB
41659. Semente de Referência compreendendo o evento elite EE-GMI da invenção foi depositada na NCIMB com o número de acessão NCIMB
41.658. Semente de referência compreendendo o evento elite EE-GM2 da 15 invenção foi depositada na NCIMB com o número de acessão NCIMB " 41660. Semente de Referência compreendendo evento elite EE-GM3 e EE- GMl foi depositado na ATCC sob o número de acessão PTA-11041. Semen- te de Referência compreendendo evento elite EE-GM3 e EE-GM2 foi deposi- tado na ATCC sob o número de acessão PTA-11042.
20 Uma modalidade da invenção é a semente compreendendo e- vento elite EE-GM3 (semente de referência compreendendo o referido even- to sendo depositado como NCIMB número de acessão NCIMB 41659) e compreendendo ainda evento elite EE-·GM1 (semente de referência compre- endendo o referido evento sendo depositado como NCIMB número de aces- 25 são NCIMB 41658), ou semente compreendendo evento EE-GM3 e EE-GMI (semente de referência que compreende os referidos eventos sendo deposi- tada no ATCC sob o número de acessão PTA-11.041), que vai crescer em uma planta de soja tolerantes a pelo menos três herbicidas, particularmente tolerante ao glifosato e/ou inibidores de HPPD como isoxaflutol e/ou inibido- 30 res de glutamina sintetase, como glufosinato. Outra modalidade da invenção é a semente compreendendo e- vento elite EE-GM3 (semente de referência compreendendo o referido even-
t ?
6/118 to sendo depositada como NCIMB número de acessão NCIMB 41659) e compreendendo ainda evento elite EE-GM2 (semente de referência compre- endendo o referido evento sendo depositada como NCIMB número de aces- são NCIMB 41660), ou semente compreendendo evento EE-GM3 e EE-GM2
5 (semente de referência que compreende o referido evento sendo depositada no ATCC sob o número de acessão PTA-11042), que vai crescer em uma planta de soja tolerantes a pelo menos três herbicidas, particularmente tole- rante ao glifosato e/ou inibidores de HPPD como isoxaflutol e/ou inibidores de glutamina sinte'tase, como glufosinato. 10 A semente de NCÍMB número de depósito NCIMB 41659, é um lote de sementes que consiste em pelo menos cerca de 95% das sementes transgênicas, compreendendo evento elite EE-GM3, que vai crescer em plantas tolerantes a herbicidas, em que as plantas são plantas tolerantes a glifosato e/ou isoxaflutol.
A semente ou a descendência de sementes obtení-
15 vel ou obtido a partir da semente depositada (por exemplo, após cruzar com " outras plantas de soja com um fundo genético diferente) pode ser semeada e as plantas em crescimento podem ser tratadas com glifosato ou inibidores de HPPD como isoxaflutol conforme descrito aqui para obter plantas toleran- tes a glifosato ou isoxaflutol, compreendendo evento elite EE-GM3. A se-
20 mente de NCIMB número de depósito NCIMB 41658 e NCIMB 41660 são lotes de sementes consistindo de pelo menos cerca de 95% das sementes transgênicas, que compreende os eventos elite EE-GMI ou EE-GM2, res- pectivamente, as quais irão crescer em plantas tolerantes a herbicidas, em que as plantas são plantas tolerantes a glufosinato.
A semente pode ser se-
25 meada e as plantas em crescimento podem ser tratadas com glufosinato como aqui descrito para a obtenção plantas tolerantes a glufosinato, com- preendendo os eventos elite EE-GMI ou EE-GM2. A semente de ATCC número de depósito PTA-11041, é um lote de sementes que consiste em pelo menos cerca de 95% das sementes
30 transgênicas, compreendendo evento eíite EE-GM3 e evento elite EE-GMI em forma homozigótica, que vai crescer em plantas tolerantes a herbicidas, segundo o qual as plantas são plantas tolerantes a glifosato, glufosinato e/ou
» a 7/118 isoxaflutol. A semente ou a descendència de sementes obtidas ou obtidas a partir das sementes depositadas (por exemplo, após cruzamento com outras plantas de soja com um fundo genético diferente) pode ser semeada e as plantas em crescimento podem ser tratadas com glifosato, glufosinato e/ou 5 inibidores de HPPD como isoxaflutol, como aqui descrito para a obtenção plantas tolerantes a glifosato, glufosinato e/ou isoxaflutol, compreendendo evento elite EE-GM3 e EE-GMI. A semente de ATCC número de depósito PTA-11042, é um lote de sementes que consiste em peb menos cerca de 95% das sementes transgênicas, compreendendo evento elite EE-GM3 e 10 evento elite EE-GM2 em forma homozigótica, que vai crescer em plantas tolerantes a herbicidas, segundo o qual as plantas são plantas tolerantes a glifosato, glufosinato e/ou isoxaflutol. A semente ou a descendência de se- ' mentes obtidas ou obtidas a partir das sementes depositadas (por exemplo, após cruzamento com outras plantas de soja com um fundo genético diferen- 15 te) pode ser semeada e as plantas em crescimento podem ser tratadas com glifosato, glufosinato e/ou inibidores de HPPD como isoxaflutol, como aqui descrito para a obtenção plantas tolerantes a glifosato, glufosinato e/ou iso- xaflutol, compreendendo evento elite EE-GM3 e EE-GM2. A invenção ainda se refere a células, tecidos, descendência e 20 descendentes de uma planta que compreende o evento elite EE-GM3 e compreendendo ainda evento elite EE-GMI, e que podem ser obtidas por crescimento de uma planta que compreende o evento elite EE-GM3 e EE - GMl depositada na ATCC como PTA-11041, ou por crescimento de uma planta que compreende o evento elite EE-GM3 a partir da semente deposi- 25 tada na NCIMB com o número de acessão NCIMB 41659 e cruzando dita planta com uma planta compreendendo evento elite EE-GMI crescida a par- tir da semente depositada na NCIMB com o número de acessão NCIMB
41658. A invenção também se refere a células, tecidos, descendência, e descendentes de uma planta que compreende o evento elite EE-GM3 e 30 compreendendo ainda evento elite EE-GM2, e que podem ser obtidos por crescimento de uma planta que compreende o evento elite EE-GM3 e EE- GM2 depositado na ATCC como PTA-11,042, ou por crescimento de uma planta que compreende o evento elite EE-GM3 a partir da semente deposi- tada na NCIMB com o número de acessão NCÍMB 41659 e cruzamento de dita planta com uma planta compreendendo evento elite EE-GM2 crescida a partir da semente depositada na NCIMB com o número de acessão NCIMB
41660. A invenção ainda refere-se às plantas que podem ser obtidas a partir de (como, por propagação de e/ou de reprodução com) uma planta de soja ou semente, como descrito imediatamente acima. A invenção também refe- re-se a plantas de soja compreendendo evento elite EE-GM3 e EE-GMI ou EE-GM3 e EE-GM2. A invenção ainda se refere a um método para identificar uma planta transgênica, ou células ou tecidos da mesma que compreende evento elite EE-GM3 e EE-GMI ou EE-GM3 e EE-GM2, cujo método é baseado na identificação da presença de sequências de DNA caracterizantes ou amino- ácidos codificados por essas sequências de DNA na planta transgênica, cé- Iulas ou tecidos. De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, essas sequências de DNA caracterizantes são seqL1ências de pelo menos 15bp, 15bp, pelo menos 20bp, 20bp ou 30bp ou mais que compreendem o sÍtio de inserção do evento, isto é, tanto uma parte do DNA estrangeiro inse- rido compreendendo genes de tolerância a herbicidas quanto uma parte do genoma de soja (região de flanqueamento 5'ou 3') contíguas com o mesmo, permitindo a identificação específica do evento elite. A presente invenção diz ainda respeito a métodos para identifi- car eventos elite EE-GM3 e EE-GMI ou eventos elite EE-GM3 e EE-GM2 em amostras biológicas, cujos métodos são baseados em iniciadores ou sondas que reconhecem especificamente a sequência de flanqueamento 5' e/ou 3' do DNA estrangeiro compreendendo os genes de tolerância a herbi- cidas em EE-GM3 e EE-GMI ou EE-GM3 e EE-GM2. Mais especificamente, a invenção se refere a um método que compreende duas sequências amplificadoras de um ácido nucieico presen- tes em amostras biológicas, utilizando duas reações em cadeia da polimera- se cada um com pelo menos dois iniciadores ou uma reação em cadeia da polimerase com pelo menos quatro iniciadores, o primeiro iniciador reconhe-
cendo a região flanqueadora 5' ou 3' de DNA estrangeiro compreendendo genes de tolerârwia a herbicidas que compreendem os genes de tolerância a herbicidas em EE-GM3, o segundo iniciador que reconhece uma sequência dentro do DNA estrangeiros compreendendo genes de Éolerância a herbici-
5 das de EÉ-GM3, o terceiro iniciador reconhecendo a região flanqueadora 5 'ou 3' de DNA estrangeiro compreendendo os genes de tolerância a herbici- das em EE-GMI ou EE-GM2, e o quarto iniciador reconhecendo uma se- quência dentro do DNA estrangeiro compreendendo os genes de tolerância a herbicidas de EE-GMI ou EE-GM2, de preferência para obter dois frag-
lO mentos de DNA de entre 100 e 800 pb.
Os iniciadores para a identificação de EE-GM3 pode reconhecer uma sequência dentro da região de flanquea- mento 5' de EE-GM3 (SEQ ID No. 2, a partir da posição 1 à posição 1451) ou no interior da região de flanqueamento 3' de EE-GM3 (complemento da . SEQ ID No 3 a partir da posição 241 para a posição 1408) e uma sequência
15 dentro do DNA estrangeiro compreendendo os genes de tolerância a herbi- " cidas (complemento da SEQ ID No. 2 a partir da posição 1452-1843 ou SEQ ID No 3 da posição 1 à posição 240, ou SEQ ID No 20 a partirda posição de nucleotÍdeo 1452 a posição de nucleotídeo 16638 ou o seu complemento), respectlvamente.
O iniciador que reconhece a região de flanqueamento 3'
20 pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No, 5 e o inicia- dor que reconhece uma sequência dentro do DNA estrangeiro compreen- dendo genes de tolerância a herbicida pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No. 4 ou SEQ ID No.: 7 descrito aqui.
Os iniciadores para a identificaçào de EE-GMI pode reconhecer urna sequência dentro da
25 região de flanqueamento 5' de EE-GMI (SEQ ID No. 12, da posição 1 à po- sição 209) ou dentro da região de flanqueamento 3' de EE-GMI (comple- mento de SEQ ID No 13 da posição 569 à posição 1000) e uma sequência dentro do DNA estrangeiro compreendendo genes de tolerância a herbicida de EE-GMI (complemento de SEQ ID No 12 da posição 210 a 720, ou SEQ
30 ID No 13 da posição 1 à posição 568), respectivamente.
O iniciador de reco- nhecimento da região de flanqueamento 5' de EE-GMI pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No. 16 e o iniciador que reconhece íwnR uma sequência dentro do DNA estrangeiro de EE-'GMI pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No. 17 descrita aqui. Os iniciadores para identificar EE-GM2 podem reconhecer uma sequência dentro da região de flanqueamento 5' de EE-GM2 (SEQ ID No. 14, da posição 1 à posição 311) ou dentro da região de flanqueamento 3' de EE-GM2 (complemento de SEQ ID No 15 da posição 508 à posição 1880) e uma sequência dentro do DNA estrangeiro compreendendo genes de tolerância a herbicida de EE- GMl (complemento de SEQ ID No 14 da posição 312 a 810, ou SEQ ID No 15 da posição 1 à posição 507), respectivamente. O iniciador de reconheci- lO mento da região de flanqueamento 3' de EE-GM2 pode compreender a se- quência de nucleotídeo de SEQ ID No. 18 e o iniciador que reconhece uma sequência dentro do DNA estrangeiro de EE-GM2 pode compreender a se- quência de nucleotídeo de SEQ ID No. 19 descrita aqui. A amplificação de PCR pode ser realizada simultaneamente ou sequencialmente.
A presente invenção mais especificamente se refere a um méto- do para identificar evento elite EE-GM3 e EE-GMI em amostras biológicas, cujo método compreende amplificar pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos presentes em uma amostra biológica, usando uma reação de ca- deia da polimerase com dois iniciadores compreendendo ou consistindo (es- senciaimente) na sequência de nucleotídeo de SEQ ID No. 4 e SEQ ID No. 5, respectivamente, para obter um fragmento de DNA de cerca de 263 pb, ou com dois iniciadores compreendendo ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotídeo de SEQ ID No. 5 e SEQ ID No. 7 respectivamente, para obter um fragmento de DNA de cerca de 706 pb, e uma reação de ca- deia da poIimerase com dois iniciadores compreendendo ou consistindo (es- sencialmente) na sequência de nucleotídeo de SEQ ID No. 16 e SEQ ID No. 17 respectivamente, para obter um fragmento de DNA de cerca de 183 pb. As duas reações em cadeia da polimerase podem ser realizadas simultane- amente ou sequencialmente. A presente invenção mais especificamente refere-se a um méto- do para identificar evento elite EE-GM3 e EE-GM2 em amostras biológicas, cujo método compreende amplificar pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos presentes em uma amostra biológica, usando uma reação de ca- deia da polimerase com dois iniciadores conipreendendo ou consistindo (es- sencialmente) na sequência de nucleotídeo de SEQ ID No. 4 e SEQ ID No. 5 " respectivamente, para obter um fragmento de DNA de cerca de 263 pb, ou 5 com dois iniciadores compreendendo ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotídeo de SEQ ID No. 5 e SEQ ID No. 7 respectivamente, para obter um fragmento de DNA de cerca de 706 pb, e uma reação de ca- deia da polimerase com dois iniciadores compreendendo ou consistindo (es- sencialmente) na sequência de nucleotídeo de SEQ ID No. 18 e SEQ ID Nq.
10 19 respectivamente, para obter um fragmento de DNA de cerca de 151 pb. As duas reações em cadeia da pohmerase podem ser realizadas simultane- amente ou sequencialmente. A presente invenção ainda refere-se às sequências específicas de flanqueamento de EE-GM3 descrito aqui em combinação com as se- 15 quências específicas de flanqueamento de EE-GMI, que podem ser usadas " para desenvolver métodos de identificação específicos para a presença si- multânea de EE-GM3 e EE-GMI em arnostras biológicas- Dias sequências específicas de flanqueamento combinadas podem ainda ser usadas como material de controle de referência em ensaios de identificação. Mais particu- 20 larmente, a invenção refere-se às regiões de flanqueamento 5' e/ou 3' de EE-GM3 em combinação com as regiões de flanqueamento 5' e/ou 3' de EE- GMl que podem ser usadas para o desenvolvimento de iniciadores e son- das específicos conforme ainda descrito aqui. Ainda apropriado como mate- rial de referência são moléculas de ácido nucleico, preferencialmente de cer- 25 ca de 150-850 pb, compreendendo a sequência que pode ser amplificada por iniciadores compreendendo ou consistindo (essencialmente) na sequên- ciadenucleotÍdeodeSEQlDNo.7eSEQ1DNo-5oudeSEQlDNo-4e SEQ ID No. 5 em combinação com moléculas de ácido nucleico compreen- dendo a sequência que pode ser amplificada por iniciadores compreendendo 30 ou consistindo (essenciaimente) na sequência de nucleotídeo de SEQ ID No. 16 e SEQ ID No. 17, particularmente ditas moléculas de ácido nucleico são obtidas usando ditos iniciadores em material compreendendo EE-GM3 e EE-
mn A presente invenção ainda se refere às sequências específicas de flanqueamento de EE-GM3 descritas aqui em combinação com a se- quência de flanqueamento especlfica de EE-GM2, que pode ser usada para 5 desenvolver métodos de identificação específicos para a presença simultâ- nea de EE-GM3 e EE-GM2 em amostras biológicas. Ditas sequências espe- cíficas de flanqueamento combinadas podem ainda ser usadas como mate- rial de controle de referência em ensaios de identificação. Mais particular- mente, a invenção refere-se às regiões de flanqueamento 5' e/ou 3' de EE- lO GM3 em combinação com as regiões de flanqueamento 5' e/ou 3' de EE- GM2 que podem ser usadas para o desenvolvimento de iniciadores e son- das especificas conforme ainda descrito aqui. Ainda apropriado como mate- rial de referência são as moléculas de ácido nucleico, prèferencialmente de cerca de 150-850 pb, compreendendo a sequência que pode ser amplificada 15 por iniciadores compreendendo ou consistindo (essencialmente) na sequên- " ciadenuc|eotídeodeSEQlDNo.7eSEQ|DNo.5oudeSEQ|DNo.4e SEQ ID No. 5 em combinação com moléculas de ácido nucleico compreen- dendo a sequência que pode ser amplificada por iniciadores compreendendo ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotídeo de SEQ ID No.
20 18 e SEQ ID No. 19, particularmente ditas moléculas de ácido nucleico são obtidas usando ditos iniciadores em material compreendendo EE-GM3 e EE- GM2. A invenção ainda se refere a métodos de identificação para a presença simultânea de EE-GM3 e EE-GMI em amostras biológicas com 25 base no uso desses iniciadores ou sondas específicas. lniciadores para de- tecção de EE-GM3 podem compreender, consistir ou consistir essencialmen- te emm uma sequência de nucleotídeo de 17 a cerca de 200 nucleotídeos consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 1451 ou o complemento da sequência de nu- 30 cleotídeo de SEQ ID 3 do nucleotídeo 241 ao nucleotideo 1408, combinado com iniciadores que compreendem, consistem ou consistem essencialmente em uma sequência de nucleotídeo de 17 a cerca de 200 nucleotídeos con-
secutivos selecionados da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 1, como uma sequência de nucleotideo de 17 a cerca de 200 nucleotideos consecuti- vos selecionados do complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1452 aD nucleotídeo 1843 ou a sequência de nucleotí-
5 deo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 240.. lniciadores para detecção de EE-GMI podem compreender, consistir ou consistir essencial- mente em uma sequência de nucleotideo de 17 a cerca de 200 nucleotídeos consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 12 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 209 ou o complemento da sequência de
10 nucleotídeo de SEQ ID 13 do nucleotídeo 569 ao nucleotídeo 1000, combi- nado com iniciadores que compreendem, consistem ou consistem essenci- almente em uma sequência de nucleotídeo de 17 a cerca de 200 nucleotí- , deos consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 11, como uma sequência de nucleotídeo de 17 a cerca de 200 nucleotídeos
15 consecutivos selecionados do complemento da sequência de nucleotídeo de " SEQ ID No 12 do nucleotídeo 219 ao nucleotídeo 720 ou a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 13 do nucleotideo 1 ao nucleotídeo 568. lniciado- . res podem ainda compreender aquelas sequências de nucleotídeos localiza- das na extremidade 3', e ainda compreender sequências não relacionadas
20 ou sequências derivadas de sequências de nucleotÍdeos mencionadas, mas compreendendo desemparelhamento.
A invenção ainda se refere a métodos de identificação para a presença simultânea de EE-GM3 e EE-GM2 em amostras biológicas com base no uso de ditas sondas ou iniciadores específicos. lniciadores para de-
25 tecção de EE-GM3 podem compreender, consistir ou consistir essencialmen- te em uma sequência de nucleotídeo de 17 a cerca de 200 nucleotídeos consecutivos conforme descrito no parágrafo anterior.
Iniciadores para de- tecção de EE-GM2 podem compreender, consistir ou consistir essencialmen- te em uma sequência de nucleotídeo de 17 a cerca de 200 nucleotídeos
30 consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 14 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 311 ou o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID 15 do nucleotídeo 508 ao nucleotídeo 1880, combi-
nado com iniciadores que compreendem, consistem ou consistem essenci- almente em uma sequência de nucleotídeo de 17 a cerca de 200 nucleotí- deos consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 11, como uma sequência de nucleotídeo de 17 a cerca de 200 nudeotídeos consecutivos selecionados do complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 14 do nucieotídeo 312 ao nucleotideo 810 ou a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 15 do nucleotideo 1 ao nucleotldeo 507. Iniciado- res podem ainda compreender aquelas sequências de nucleotídeos localiza- das na extremidade 3', e ainda compreender sequências não relacionadas ou sequências derivadas de sequências de nucleotideos mencionadas, mas compreendendo desemparelhamento.
A invenção ainda se refere a kits para identificar eventos elite EE-GM3 e EE-GMI em amostras biológicas, ditos kits compreendendo pelo menos um iniciador ou sonda que especificamente reconhece a região de flanqueamento 5' ou 3' do DNA estrangeiro compreendendo genes de tole- rância a herbicida em EE-GM3 e pelo menos um iniciador ou sonda que es- pecificamente reconhece a região de flanqueamento 5' ou 3' do DNA estran- geiro compreendendo genes de tolerância a herbicida em EE-GMI.
A invenção ainda se refere a kits para identificar eventos elite
EE-GM3 e EE-GM2 em amostras biológicas, ditos kits compreendendo pelo menos um iniciador ou sonda que especificamente reconhece a região de flanqueamento 5' ou 3' do DNA estrangeiro compreendendo genes de tole- rãncia a herbicida em EE-GM3 e pelo menos um iniciador ou sonda que es- pecificamente reconhece a região de flanqueamento 5' ou 3' do DNA estran-
geiro compreendendo um gene de tolerância a herbicida em EE-GM2. Os kits da invenção podem compreender, além do iniciador que especificamente reconhece a região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GM3 e a região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GMI, outro iniciador que especifi- camente reconhece uma sequência dentro do DNA estrangeiro compreen-
dendo genes de tolerância a herbicida de EE-GM3 e outro iniciador que es- pecificamente reconhece uma sequência dentro do DNA estrangeiro com- preendendo genes de tolerância a herbicida de EE-GMI, para uso em um
Protocolo de ldentificação de PCR- Os kits da invenção podem ainda compreender, além de um ini- ciador que especificamente reconhece a região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GM3 e a região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GM2, outro iniciador que especificamente reconhece uma sequência dentro do DNA estrangeiro compreendendo genes de tolerância a herbicida de EE-GM3 e outro inicia- dor que especificaniente reconhece uma sequência dentro do DNA estran- geiro compreendendo genes de tolerância a herbicida de EE-GM2, para uso em um Protocolo de ldentificação de PCR.
O iniciador de reconhecimento da região de flanqueamento 3' de EE-GM3 pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No- 5 e o iniciador que reconhece os transgenes ou DNA estrangeiro compreenden- do genes de tolerância a herbicida de EE-GM3 pode compreender a se- quência de nucleotídeo de SEQ ID No. 4 ou 7, ou qualquer outro iniciador ou combinação de iniciador para detecção de EE-GM3 conforme descrito aqui, em combinação com um iniciador que reconhece a região de flanqueamento 5' de EE-GMI que pode compreender a sequência de nucleotideo de SEQ ID No. 16 e um iniciador que reconhece transgenes de DNA estrangeiro compreendendo o gene de tolerância a herbicida de EE-GMI pode compre- ender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 17. O iniciador de reconhecimento da região de flanqueamento 3' de EE-GM3 pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No. 5 e o iniciador que reconhece os transgenes ou DNA estrangeiro compreenden- do genes de tolerância a herbicida de EE-GM3 pode compreender a se-
quência de nucleotídeo de SEQ ID No. 4 ou 7, ou qualquer outro iniciador ou combinação de iniciador para detecção de EE-GM3 conforme descrito aqui, em combinação com um iniciador que reconhece a região de flanqueamento 5' de EE-GM2 que pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No. 18 e um iniciador que reconhece transgenes de DNA estrangeiro compreendendo o gene de tolerância a herbicida de EE-GM2 pode compre- ender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 19. A invenção ainda se refere a um kit para identificar evento elite
EE-GM3 e EE-GMI em amostras biológicas, dito kit compreendendo Ínicia- dores de PCR compreendendo ou consistindo (essencialmente) na sequên- cia de nucleotídeo de SEQ ID No. 5 e SEQ ID No. 4 e iniciadores de PCR compreendendo ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotí-
5 deo de SEQ ID 16 e SEQ ID 17 para uso na identificação com base em PCR de EE-GM3/EE-GM1. A invenção ainda se refere a um kit para identificar evento elite EE-GM3 e EE-GM2 em amostras bioiógicas, dito kit compreendendo inicia- dores de PCR compreendendo ou consistindo (essenciaimente) na sequên-
lO cia de nucleotídeo de SEQ ID No. 5 e SEQ ID No. 4 e iniciadores de PCR compreendendo ou consistindo (essencialmente) na sequência de nucleotí- deo de SEQ ÍD 18 e SEQ ID 19 para uso na identificação com base em PCR de EE-GM3/EE-GM2. A invenção ainda se refere a um kit para identificar evento elite
15 EE-GM3 e EE-GMI em amostras biológicas, cujo kit compreende duas son- " das especificas, uma primeira sonda compreendendo ou consistindo (essen- cialmente) em uma sequência que corresponde (ou é complementar a) uma sequência contendo entre 80% e 100°/o de identidade de sequência com uma região específica de EE-GM3 e uma segunda sonda compreendendo
20 ou consistindo (essencialmente) em uma sequência que corresponde (ou é complementar a) uma sequência contendo entre 80% e 1OO°/o de identidade de sequência com uma região específica de EE-GMI.
Preferencialmente, a sequência da primeira sonda corresponde a uma região específica compre- endendo parte de uma região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GM3 e a se-
25 gunda sonda corresponde a uma região específica compreendendo parte de uma região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GMI.
Mais preferencialmente a sonda específica de EE-GM3 compreende ou consiste (essencialmente) de (ou é complementar a) uma sequência contendo entre 80% e 1OO°/o de iden- tidade de sequência à sequência entre o nucleotídeo 1441 a 1462 de SEQ
30 ID No 2 ou uma sequência contendo entre 80% e 100% de identidade de sequência à sequência entre o nucleotídeo 220 a 260 de ID No. 3 e a sonda especifica EE-GMI compreende, consiste (essencialmente) de (ou é com-
pIementar a) uma sequência contendo entre 8Ô°/o e 100% de identidade de sequência à sequência entre o nucleotídeo 199 a 220 de SEQ ID No 12 ou uma sequência contendo entre 8O°/j e 100% de identidade de sequência à sequência entre o nucleotídeo 558 a 579 de ID No. 13. 5 A invenção ainda se refere a um kit para identificar evento elite EE-GM3 e EE-GM2 em amostras biológicas, cujo kit compreende duas son- das específicas, uma primeira sonda compreendendo ou consistindo (essen- cialmente) em uma sequência que corresponde (ou é complementar a) uma sequência contendo entre 80% e 100% de identidade de sequência com
10 uma região específica de EE-GM3 e uma segunda sonda compreendendo ou consistindo (essencialmente) em uma sequência que corresponde (ou é complementar a) uma sequência contendo entre 80% e 100% de identidade " de sequência com uma região específica de EE-GM2, Preferencialmente, a sequência da primeira sonda corresponde a uma região específica compre-
15 endendo parte de uma região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GM3 e a se- " gunda sonda corresponde a uma região especlfica compreendendo parte de uma região de flanqueamento 5' ou 3' de EE-GM2. Mais preferencialmente a sonda específica de EE-GM3 compreende ou consiste (essencialmente) em (ou é complementar a) uma sequência contendo entre 8O°/j e 100% de iden-
20 tidade de sequência à sequência entre o nucleotídeo 1441 a 1462 de SEQ ID No 2 or uma sequência contendo entre 80% e 100% de identidade de se- quência à sequência entre o nucleotídeo 220 a 260 de ID No. 3 e a sonda especifica de EE-GM2 compreende ou consiste (essencialmente) de (ou é complementar a) uma sequência contendo entre 80% e 1OO°/o de identidade
25 de sequência à sequência entre o nucleotídeo 301 a 322 de SEQ ID No 14 or uma sequência contendo entre 80°6 e 100% de identidade de sequência à sequência entre o nucleotídeo 497 a 518 de ID No. 15. De acordo com outro aspecto da invenção, sequências de DNA são reveladas compreendendo um local de junção do evento e comprimento
30 suficiente de polinucleotideos de ambos DNA genômico da soja e o DNA estrangeiro compreendendo genes de tolerância a herbicida (transgene) de cada evento, de modo que seja útil como iniciador ou sonda para a detecção de EE-GM3 e EE-GMI.
Ditas sequências podem compreender pelo menos 9 nucleotideos do DNA genômico da soja e um número semelhante de nucleo- tídeos do DNA estrangeiro compreendendo genes de tolerância a herbicida (transgene) de EE-GM3 ou EE-GMI, em cada lado do local da junção res-
5 pectivamente.
Mais preferencialmente, ditas sequências de DNA compreen- de pelo menos 9 nucleotídeos do DNA genômico da soja e um número se- melhante de nucleotídeos do DNA estrangeiro compreendendo genes de tolerância a herbicida contíguos ao local da junção na SEQ id no: 2 ou SEQ ID NO: 3 e pelo menos 9 nucleotideos do DNA genômico da soja e um nú-
lO mero semelhante de nucleotídeos do DNA estrangeiro compreendendo ge- nes de tolerância a berbicida contíguos ao local da junção na SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13. De acordo ainda com outro aspecto da invenção, sequências de DNA são reveladas compreendendo um local de junção do evento e com-
15 primento suficiente de polinucleotkleos de ambos DNA genômico da soja e o " DNA estrangeiro compreendendo genes de tolerância a herbicida (transge- ne) de cada evento, de modo que seja útil como iniciador ou sonda para a detecção de EE-GM3 e EE-GM2. Ditas sequências podem compreender pe- lo menos 9 nucleotídeos do DNA genômico da soja e um número semelhan-
20 te de nucleotídeos do DNA estrangeiro compreendendo genes de tolerância a herbicida (transgene) de EE-GM3 ou EE-GM2, em cada lado do local da inserção respectivamente.
Mais preferencialmente, ditas sequências de DNA compreendem pelo menos 9 nucleotídeos do DNA genômico da soja e um número semelhante de nucleotideos do DNA estrangeiro compreendendo
25 genes de tolerância a herbicida contiguos ao local da junção na SEQ id NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 e pelo menos 9 nucleotídeos do DNA genômico da soja e um número semelhante de nucleotídeos do DNA estrangeiro compreen- dendo genes de tolerância a herbicida contíguos ao Iocal da junção na SEQ lDNO:14ou SEQID NO: 15. 30 Os métodos e kits incluidos pela presente invenção podem ser usados para diferentes finalidades como, entre outras, as seguintes: identifi- car a presença ou determinar o limite (inferior) de EE-GM3 e EE-GMI ou de
EE-GM3 e EE-GM2 em plantas, material da planta ou em produtos como, entre outros, a alimento ou produtos de alimentação (fresco ou pracessado) compreendendo ou derivado de material de planta; adicionalmente ou alter- nativamente, os métodos e kits da presente invenção podem ser usados pa- ra identificar material de planta transgênica para fins de segregação entre material transgênico e não transgênico; adicionalmente ou alternativamente, os métodos e kits da presente invenção podem ser usados para determinar a qualidade (ou seja, percentual de material puro) de material de planta compreendendo EE-GM3 e EE-GMI ou EE-GM3 e EE-GMI.
A invenção ainda se refere às regiões de flanqueamento 5' e/ou 3' de EE-GM3 GM3 em combinação com iniciadores e sondas especificas desenvolvidas a partir de sequências de Hanqueamento 5' e/ou 3' de EE- GMl ou EE-GM2, bem como a iniciadores e sondas específicas desenvolvi- das a partir de sequências de flanqueamento 5' e/ou 3' de EE-GM3 em com- binação com iniciadorês e sondas especificas desenvolvidas a partir de se- quências de flanqueamento 5' e/ou 3' de EE-GMI ou EE-GM2. A invenção ainda se refere a DNA genômico obtido de pIantas compreendendo eventos elite EE-GM3 e EE-GMI ou plantas compreenden- do eventos elite EE-GM3 e EE-GM2. Dito DNA genômico pode ser usado como material de controle de referência nos ensaios de identificação aqui descritos. Ainda é fomecida aqui uma planta de soja transgênica tolerante a herbicida, ou células, partes, sementes ou descendentes da mesma, cada uma compreendendo pelo menos dois eventos de elite, dito primeiro evento elite compreendendo um DNA estrangeiro compreendendo: i) um primeiro gene quimérico que compreende um gene epsps modificado de Z n7ays que codifica uma enzima EPSPS tolerante a glifosato sob o controle de um promotor expressível em planta, e ii) um segundo gene quimérico que compreende um gene hppd modificado de Pseudomonas nuorescens que codifica uma enzima tolerante ao herbicida inibidor de HPPD sob o controle de um promotor expressível em planta, e dito segundo evento elite compreende um (terceiro) gene qui-
mérico que compreende um gene de tolerância a glufosinato modificado de- rivado de Streptomyces viljdochron7ogenes que codifica uma enzima glufo- sinato (ou fosfnotricina) acetiltransferase sob o controle de um promotor ex pressível em planta. 5 Em uma modalidade, dito primeiro evento elite compreende nu- cleotídeos 1 a 1451 de SEQ ID No 2 imediatamente a montante de e conti- guo com dito DNA estrangeiro e os nucleotideos 241 a 1408 de SEQ ID No 3 imediatamente a jusante de e contíguo com dito DNA estrangeiro, dito se- - gundo evento compreende nucleotídeos 1 a 209 de SEQ ID No 12 imedia- lO tamente a montante de e contíguo com dito DNA estrangeiro e os nucieotí- deos 569 a 1000 de SEQ ÍD No 13 imediatamente a jusante de e contíguo com dito DNA estrangeiro, ou dito segundo evento compreende nucleotideos 1 a 311 de SEQ ID No 14 imediatamente a montante de e contíguo com dito DNA estrangeiro e os nucleotídeos 508 a 1880 de SEQ ID No 15 imediata- 15 mente a jusante de e contíguo com dito DNA estrangeiro. " Em outra modalidade, dito evento de elite é obtenível por cultivo com uma planta de soja crescida a partir da semente de referência compre- endendo ditos eventos foram depositados em ATCC sob c) número de depó- sito PTA-11041 ou PTA-11042, ou obtenível de semente de referência com-
2.0 preendendo dito primeiro evento foi depositado em NCIMB sob o número de acessão NCIMB 41659, e obtenivel de semente de referência compreen- dendo dito segundo evento foi depositado em NCIMB sob o número de a- cessào NCIMB 41658 ou NCIMB número de acessão NCIMB 41660. Em outra modalidade, o DNA genômico de dita planta de soja, 25 ou células, partes, sementes ou descendentes da mesma quando analisada usando o protocolo de identificação de evento elite para dito primeiro evento elite com dois iniciadores compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 4 e SEQ ID No 5 respectivamente, gera um fragmento de DNA de cerca de 263 pb ou 263 pb, e quanto analisada usando o protocolo de 30 identificação de evento elite para dito segundo evento elite com dois inicia- dores compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 16 e SEQ ID No 17 respectivamente, gera um fragmento de DNA de cerca de 183 pb ou 183 pb. ou com dois iniciadores compreendendo a sequência de nucleo- tídeo de SEQ ID No 18 e SEQ ID No 19 respectivamente, gera um fragmen- todeDNAdecercade151 pbou 151 pb.
Ainda é fornecido aqui um método para identificar uma planta de
5 soja transgênica, ou células, partes, sementes ou descendência da mesma compreendendo 2 eventos de elite, em que dita planta, células, semente ou descendência são tolerantes a glifosato, glufosinato em um herbicida inibidor de HPPD (como isoxaflutol), em amostras biológicas, dito método compre- endendo amplificar um fragmento de DNA de entre 100 e 500 pb de um áci-
lO do nucleico de dito primeiro evento presente em amostras biológicas usando uma reação de cadeia da polimerase com pelo menos dois iniciadores, um de ditos iniciadores reconhecendo a região de flanqueamento 5' do primeiro evento elite especificado acima, dita região de flanqueamento 5' compreen- dendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1 ao nu- 15 cleotídeo 1451, ou a região de flanqueamento 3' de dito primeiro evento eli- " te, dita região de flanqueamento 3' compreendendo a sequência de nucleo- tídeo do complemento de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 241 ao nucleotideo 1408, o outro iniciador de ditos iniciadores reconhecendo uma sequência dentro do DNA estrangeiro de dito primeiro evento compreendendo a se-
20 quência de nucleotídeo do complemento de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1452 ao nucleotídeo 1843 ou a seqLiência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotideo 1 ao nucleotídeo 240, e compreendendo amplificar um frag- mento de DNA de entre 50 e 1000 pb, ou entre 100 e 500 pb de um ácido nucleico de dito segundo evento presente em amostras biológicas usando
25 uma reação de cadeia da polimerase com pelo menos dois iniciadores, um de ditos iniciadores reconhecendo a região de flanqueamento 5' do segundo evento eiite especificado acima, dita região de flanqueamento 5' compreen- dendo a sequência de nucleotídeo de nucleotídeos 1 a 209 de SEQ ID No 12, ou a região de flanqueamento 3' de dito segundo evento elite, dita região 30 de flanqueamento 3' compreendendo a sequência de nucleotídeo do com- plemento de nucleotídeos 569 a 1000 de SEQ ID No 13, o outro iniciador de ditos iniciadores reconhecendo uma sequência dentro do DNA estrangeiro de dito segundo evento compreendendo a sequência de nucleotídeo do complemento de SEQ ÍD No 12 do nucleotideo 210 ao nucleotídeo 720 ou a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 13 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo
568. Ainda é fornecido aqui um método para identificar uma planta de soja transgênica, ou células, partes, sementes ou descendência da mesma compreendendo 2 eventos de elite, em que dita planta, células, semente ou descendência são tolerantes a herbicida glifosato, glufosinato e/ou inibidor de HPPD (como isoxaflutol), em amostras biológicas, dito método compre- lO endendo amplificar um fragmento de DNA de entre 50 e 1000 ou entre 100 e 500 pb de um ácido nucleico de dito primeiro evento presente em amostras biológicas usando uma reação de cadeia da polimerase com pelo menos dois iniciadores, um de ditos iniciadores reconhecendo a região de flanque- amento 5' do primeiro evento elite especificado acima, dita região de flan- queamento 5' compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 1451, ou a região de flanqueamento 3' de dito primeiro evento elite, dita região de flanqueamento 3' compreendendo a sequência de nucleotldeo do complemento de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 241 ao nucleotídeo 1408, o outro iniciador de ditos iniciadores reconhecendo uma sequência dentro do DNA estrangeiro de dito primeiro evento compre- endendo a sequência de nucleotídeo do complemento de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1452 ao nucleotideo 1843 ou a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 240, e compreendendo ampli- ficar um fragmento de DNA de entre 50 e 1000 pb ou entre 100 e 500 pb de um ácido nucleico de dito segundo evento presente em amostras biológicas usando uma reação de cadeia da polimerase com pelo menos dois iniciado- res, um de ditos iniciadores reconhecendo a região de flanqueamento 5' do segundo evento elite especificado acima, dita região de flanqueamento 5' compreendendo a sequência de nucleotídeo de nucleotídeos 1 a 311 de SEQ ID No 14, ou a região de flanqueamento 3' de dito segundo evento eli- te, dita região de flanqueamento 3' compreendendo a sequência de nucleo- tí'deo do compiemento de nucleotídeos 508 a 1880 de SEQ ID No 15, o outro iniciador de ditos iniciadores reconhecendo uma sequência dentro do DNA estrangeiro de dito segundo evento compreendendo a sequência de nucleo- tídeo do complemento de SEQ ID No 14 do nudeotídeo 312 ao nucleotídeo 810 ou a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 15 do nucleotídeo 1 ao 5 nucieotídeo 507. Ainda é fornecido aqui um kit para identificar uma planta de soja transgênica, ou células, partes, sementes ou descendência da mesma com- preendendo 2 eventos elite e sendo tolerante a glifosato, glufosinato em um herbicida inibidor de HPPD (como isoxafiutol), em amostras biológicas, dlto 10 kit compreendendo um iniciador reconhecendo a região de flanqueamento 5' do primeiro evento elite especificado acima, dita região de flanqueamento 5' compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID Nq 2 do nucleotídeo . 1 ao nucleotídeo 1451, ou um iniciador reconhecendo a região de flanquea- mento 3' de dito primeiro evento elite, dita região de fianqueamento 3' com- 15 preendendo a sequência de nucleotideo do complemento de SEQ ID No 3 " do nucleotídeo 241 ao nucleotideo 1408, e um iniciador reconhecendo uma sequência dentro do DNA estrangeiro de dito primeiro evento, dito DNA es- trangeiro compreendendo a sequência de nucleotídeo do cornplemento de SEQ ID No. 2 do nucleotídeo 1452 ao nucleotídeo 1843 ou a sequência de 20 nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 240, e dito kit compreendendo um iniciador reconhecendo a região de flanqueamento 5' do segundo evento elite especificado acima, dita região de flanqueamento 5' compreendendo a sequência de nucleotídeo de nucleotídeos 1 a 209 de SEQ ID No 12, ou um iniciador reconhecendo a região de 'flanqueamento 3' 25 de dito segundo evento elite, dita região de flanqueamento 3' compreenden- do a sequência de nucleotídeo do complemento de nucleotídeos 569 a 1000 de SEQ ÍD No 13, o outro iniciador de ditos iniciadores reconhecendo uma sequência dentro do DNA estrangeiro de dito segundo evento compreen- dendo a sequência de nucleotídeo do complemento de SEQ ID No 12 do 30 nucleotídeo 210 ao nucleotídeo 720 ou a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 13 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 568. Ainda é fornecido aqui um kit para identificar uma planta de soja transgênica, ou células, partes, sementes ou descendência da mesma com- preendendo 2 eventos elite e sendo tolerante a glifosato, glufosinato em um herbicida inibidor de HPPD (como isoxaflutol), em amostras biológicas, dito kit compreendendo um iniciador reconhecendo a região de flanqueamento 5'
5 do primeiro evento elite especificado acima, dita região de flanqueamento 5' compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 1451, ou um iniciador reconhecendo a região de fianquea- mento 3' de dito primeiro evento elite, dita região de flanqueamento 3' com- preendendo a sequência de nucleotídeo do complemento de SEQ ID No 3 10 do nucleotídeo 241 ao nucleotídeo 1408, e um iniciador reconhecendo uma sequência dentro do DNA estrangeiro de dito primeiro evento, dito DNA es- trangeiro compreendendo dita sequência de nucleotídeo do complemento de SEQ ID No. 2 do nucleotídeo 1452 ao nucleotídeo 1843 ou a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 240, e dito kit 15 compreendendo um iniciador reconhecendo a região de flanqueamento 5' do . segundo evento elite especificado acima, dita região de flanqueamento 5' compreendendo a sequência de nucleotídeo de nucleotídeos 1 a 311 de SEQ ID No 14, ou a região de flanqueamento 3' de dito segundo evento eli- te, dita região de flanqueamento 3' compreendendo a sequência de nucleo-
20 tídeo do complemento de nucleotideos 508 a 1880 de SEQ ID No 15, o outro iniciador de ditos iniciadores reconhecendo uma sequência dentro do DNA estrangeiro de dito segundo evento compreendendo a sequência de nucleo- tídeo do complemento de SEQ ID No 14 do nucleotídeo 312 ao nucleotídeo 810 ou a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 15 do nucieotídeo 1 ao
25 nucleotídeo 507. Ainda é fornecida aqui uma planta de soja, célula da planta, teci- do ou semente, compreendendo em seus genomas uma moíécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 97, 98, ou pelo menos 99% or 99,5% de identidade de sequência a uma se- 30 quência de nucleotideo de SEQ ID No. 20 do nucleotídeo da posição 1452 ao nucleotídeo da posição 16638, a sequência de nucieotídeo de SEQ ID No. 20 do nucleotídeo da posição 2257 ao nucleotideo da posição 16601 ou q
X 25/118 seus complementos, ou uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 97, 98, ou pelo menos 99 % ou 99,5 °/0 de identidade de sequência a SEQ ID No- 20 ou o complemento da mesma, e compreendendo em seus genomas uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleo- 5 tídeo com pelo menos 97, 98, ou pelo menos 99°6 ou 99,5% de identidade de sequência à sequência de nucleotideo de EE-GMI ou EE-GM2 ou o complemento da mesma, semente de referência compreendendo EE-GMI tendo sido depositada sob o número de depósito NCIMB 41658, e semente de referência compreendendo EE-GM2 tendo sido depositada sob o número 10 de depósito NCIMB 41660. Em uma modalidade desta invenção, a sequên- cia de nucleotldeo de EE-GMI ou EE-GM2 em dita planta, célula de planta, tecido ou semente, é a sequência de DNA (como a sequência de DNA es- trangeiro) na SEQ ID No 12 ou 13, ou a sequência de DNA (como a sequên- cia de DNA estrangeiro) na SEQ ID No 14 ou 15, ou a sequência de DNA no 15 genoma da planta (como nas sementes depositadas compreendendo EE- " GMI ou EE-GM2 da invenção) compreendendo SEQ ID No 12 e 13 entre o primeiro nucleotídeo da sequência de SEQ ID No 12 e o último nucleotÍdeo da sequência de SEQ ID No 13, ou a sequência de DNA no genoma da pIan- ta compreendendo SEQ ID No 14 e 15 entre o primeiro nucleotídeo da se- 20 quência de SEQ ID No 14 e o último nucleotídeo da sequência de SEQ ID Nq 15. Uma modalidade desta invenção fornece uma planta de soja, cé- lula da planta, tecido ou semente, compreendendo em seus genomas uma molécula de ácido nucleico que hibridiza a uma sequência de nucleotídeo de 25 SEQ ID No 1 ou o complemento da mesma, ou hibridiza a uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID No. 20 do nucleotídeo da posição 1452 ao nucleoti- deo da posição 16638 ou o complemento da mesma, ou hibridiza a uma se- quência de nucleotídeo de SEQ ID No. 20 ou o complemento da mesma, e compreendendo em seus genomas uma molécula de ácido nucleico que hi- 30 bridiza a uma sequência de nucleotídeo de EE-GMI ou EE-GM2 ou o com- pIemento da mesma, semente de referência compreendendo EE-GMI tendo sido depositada sob o número de depósito NCIMB 41658, e semente de re-
ferência compreendendo EE-GM2 tendo sido depositada sob o número de depósito NCIMB 41660. Em uma modalidade desta invenção, a sequência de nucleotídeo de EE-GMI ou EE-GM2 em dita planta, célula de planta, te- cido ou semente, é o DNA estrangeiro na SEQ ID No 12 ou 13, ou o DNA
5 estrangeiro na SEQ ID No 14 ou 15, ou a sequência de DNA estrangeiro no genoma da planta (como nas sementes depositadas compreendendo EE- GMl ou EE-GM2 da mvenção) compreendendo SEQ ID No 12 e 13 entre o primeiro nucleotídeo da sequência de SEQ ID No 12 e o último nucleotídeo da sequência de SEQ ÍD No 13, ou a sequência de DNA estrangeiro no ge- lO noma da planta compreendendo SEQ ID No 14 e 15 entre o primeiro nucleo- tídeo da sequência de SEQ ID No 14 e o último nucleotideo da sequência de SEQID No 15. Breve Descrição dos Desenhos Os seguintes exemplos, não destinados limitar a invenção a mo- 15 dalidades especificas descritas, podem ser entendidos em conjunto com as " figuras que acompanham, incorporadas por referência, em que: figura 1: Representação esquemática da relação entre as se- . quências de nucleotídeo citadas e iniciadores para evento elite EE-GM3. barra preta: DNA estrangeiro; barra hachurada: DNA de origem de planta;
20 seta xadrez (a): gene que codifica HPPD PF W366 quimérico (vide Tabela 1 para a composição do gene quimérico); seta tracejada (b): gene que codifica 2mEPSPS quimérico (vide Tabela 1 para a composição do gene quimérico); setas pretas: iniciadores de oligonucleotídeo, as figuras sob as barras repre- sentam posições de nucleotldeo; (c) refere-se ao complemento de sequência
25 de nucleotídeo indicado; Nota: o esquema não está desenhado em escala.
Figura 2: Resultados obtidos por Protocolo de identificação por PCR desenvolvido para EE-GM3. Sequência de carregamento do gel: Pista 1: Marcador de peso molecular (escada lOObp); pistas 2 e 3: Amostras de DNA a partir de plantas
30 de soja compreendendo o evento transgênico EE-GM3; pistas 4-7: Amostras de DNA a partir de plantas de soja transgênicas não compreendendo evento elite EE- GM3, nas compreendendo os mesmos genes de tolerância a herbi-
cida (outros eventos de transforrnação); pista 8: Amostra de DNA de soja Wt: pista 9: Sem controle de molde de DNA; pista 10: Marcador de peso molecu- lar.
Figura 3: Representação esquemática da relação entre as se- quências de nucleotídeo citadas e iniciadores para evento elite EE-GMI. barra preta: DNA estrangeiro; barra hachurada: DNA de origem de planta; seta com listra horizontal (d): gene que codifica fosfinotricina acetiltransfera- se quimérica (vide SEQ ID No. 11 para a composição do gene quimérico; setas pretas: iniciadores de oligonucleotídeo, as figuras sob as barras repre- lO sentam posições de nucieotídeo; (C) refere-se ao complemento de sequência de nucleotídeo indicado; Nota: o esquema não está desenhado em escala.
Figura 4: Representação esquemática da relação entre as se- quências de nucleotídeo citadas e iniciadores para evento elite EE-GM2- barra preta: DNA estrangeiro; barra hachurada: DNA de origem de planta; seta com listra horizontal (d): gene que codifica fosfinotricina acetiltransfera- se quimérica (vide SEQ (D No. 11 para a composição do gene quimérico; setas pretas: iniciadores de oligonucleotídeo, as figuras sob as barras repre- sentam posições de nucleotídeo; (C) refere-se ao complemento de sequência de nucleotídeo indicado; NA: Não aplicável.
Nota: o esquema não está de- senhado em escala.
Figura 5: Protocolo de identificação por PCR desenvolvido para EE-GMI.
Sequência de carregamento do gel: Pista 1: Amostra de DNA de plantas de soja compreendendo o evento transgènico EE-GMI ; pista 2: Amostra de DNA de uma planta de soja transgênica não compreendendo evento elite EE-GMI ; pista 3: Amostra de controle de DNA de plantas de soja tipo selvãgem; pista 4: sem controle de molde; pista 5: Marcador de pe- so molecular.
Figura 6, Protocolo de identificação por PCR desenvolvido para EE-GM2. Sequência de carregamento do gel: Pista 1: Amostra de DNA de plantas de soja compreendendo o evento transgênico EE-GM2 : pista 2 A- mostra de DNA de uma planta de soja transgênica não compreendendo e- vento elite EE-GM2 ; pista 3: Amostra de controle de DNA de plantas de soja tipo selvagem; pista 4: sem controle de molde; pista 5: Marcador de peso molecular. Descrição Detalhada das Modalidades Preferenciais da Invenção A incorporação de uma moíécula de DNA recombinante no ge- 5 noma da planta tipicamente resulta da transformação de uma célula ou teci- do. O local particular da incorporação é geraknente devido à integração alea- tória. O DNA introduzido no genoma da planta como resultado de transformação de uma célula de planta ou tecido com um DNA recombinante 10 ou "DNA de transformação", e originando de tal DNA de transformação é aqui referenciado como "DNA estrangeiro" compreendendo um ou mais "transgenes". Os transgenes de EE-GM3 são os genes de tolerância a glifo- sato e herbicida inibidor de HPPD. "DNA de planta" no contexto da presente invenção irá se referir ao DNA que se origina da planta que é transformado.
15 DNA de planta irá geralmente ser encontrado no mesmo local genético na correspondente planta tipo selvagem. O DNA estrangeiro pode ser caracteri- zado peia localização e configuração no local da incorporação da molécula - de DNA recombinante no genoma da planta. O local no genoma da planta onde um DNA recombinante foi inserido é ainda chamado de "local de inser- 20 ção" ou "local alvo". A inserção de DNA recombinante na região do genoma da planta referenciado como "pré-inserção de DNA de planta" pode ser as- sociado com uma deíeção de DNA de planta, referenciado como "deleção río local alvo". Uma "região de flanqueamento" ou "sequência de flanqueamen- to" conforme usado aqui se refere a uma sequência de pelo menos 20 pb, 25 preferencialmente pelo menos 50 pb, e até 5000 pb de DNA diferente do DNA introduzido , preferencialmente DNA do genoma da planta que está localizado imediatamente a montante de e contíguo com ou imed iatamente a jusante de e contíguo como o DNA estrangeiro. Os procedimentos de trans- formação que levam à integração aleatória do DNA estrangeiro resultarão 30 nas transformações com diferentes regiões de flanqueamento, que são ca- racterísticas únicas para cada transformação. Quando o DNA recombinante é introduzido em uma planta através de cruzamento tradicional, seu local de inserção no genoma da planta, ou suas regiões de flanqueamento irão ge- ralmente não ser alteradas.
Um "ácido nucleico isolado (sequência)" ou "DNA isolado (se- quência)", conforme usado aqui, se refere a um ácido nucleico ou DNA (se- 5 quência) que não é maior no ambiente natural que esÉe foi isolado, por e- xemplo, a sequência de ácido nucleico em outro hospedeiro bacteriano ou em um genoma de planta, ou um ácido nucleico ou DNA fundido ao DNA ou ácido nucleico de outra origem, como quando contido em um gene quimérico sob o controle de um promotor expressível em planta. 10 Um evento é definido como um locus genético (artificial) que, como resultado de engenharia genética, conduz um DNA estrangeiro ou transgene compreendendo pelo menos uma cópia de um gene de interesse ou dos genes de interesse.
Os estados alélicos tipicos de um evento são a presença ou ausência do DNA estrangeiro.
Um evento é caracterizado feno- 15 tipicamente pela expressão do transgene.
Em nível genético, um evento é parte do make-up genético de uma planta.
Em nível molecular, um evento pode ser caracterizado pelo mapa de restrição (por exemplo, conforme de- . terminado por Southern blotting), pela sequência de flanqueamentos a mon- tante e/ou a jusante do transgene, o local de marcadores moieculares e/ou a 20 configuração molecular do transgene.
Geralmente a transformação de uma planta com um DNA de transformação compreendendo pelo menos um gene de interesse leva a uma população de transformações compreendendo uma multitude de eventos separados, cada um dos quais é único.
Um evento é caracterizado por DNA estrangeiro e pelo menos um da sequência de flan- 25 queamentos.
Um evento elite, conforme usado aqui, é um evento que é sele- cionado do grupo de eventos, obtidos por transformação com o mesmo DNA de transformação, baseado na expressão e estabilidade dos transgenes e sua compatibilidade com caracterlsticas agronômicas ideais da planta com- 30 preendendo este.
Assim, o critério para seleção de evento elite é um ou mais, preferenciahiente dois ou mais, vantajosamente dos seguintes: a) que a presença de DNA estrangeiro não comprometa outras caracteristicas desejadas da planta, como aquelas relacionadas a desempe- nho agronômico ou valor comercial; b) que o evento seja caracterizado por uma bem definida confi- guração molecular que é estavelmente herdada e para a quai ferramentas 5 apropriadas para controle de identidade possam ser desenvolvidas; C) que os genes de interesse mostrem uma expressão correta, apropriada e espacial estável e fenotípica temporal, em condições heterozi- gotas (ou homozigotas) e homozigotas do evento, em um nível comercial- mente aceitável em uma faixa de condições ambientais em que as plantas 10 que conduzem o evento são provavelmente expostas em uso agronômico normal.
É preferencial que o DNA estrangeiro esteja associado com a posição no genoma da planta que permite a iritrodução fácil em fundos ge- néticos comerciais. 15 O estado de um evento como um evento elite é confirmado pela " introgressão do evento elite em diferentes relevantes fundos genéticos e ob- servando a conformidade com um, dois ou todos os critérios, por exemplo, m a), b) e C) acima.
Um "evento elite" assim refere-se a um locus genético compre- 20 endendo um DNA estrangeiro, que atinge os critérios acima descritos.
Uma planta, material de planta ou descendência como sementes pode compreen- der um ou mais eventos elite eni seu genoma.
As ferramentas desenvolvidas para identificar um evento elite ou a planta ou material de planta compreendendo um evento elite, ou produtos 25 que compreendem material de planta compreendendo o evento elite, são baseados em características genômicas específicas do evento elite, como, um mapa de restrição específico da região genômica compreendendo o DNA estrangeiro, marcadores moleculares ou a sequência da região de flanque- amento do DNA estrangeiro. 30 Uma vez que uma ou ambas as regiões de flanqueamento do DNA estrangeiro foram sequenciadas, iniciadores e sondas podem ser de- senvolvidos que especificamente reconhecem estas sequências no ácido nucleico (DNA ou RNA) de uma amostra por via de uma técnica de biologia molecular. Por exemplo, um método de PCR pode ser desenvolvido para identificar o evento elite em amostras biológicas (como amostras de plantas, material de planta ou produtos compreendendo material de planta). Dito 5 PCR é baseado em pelo menos dois "iniciadores" específicos, um reconhe- cendo uma sequência dentro da região de flanqueamento 5' ou 3' do evento elite e outra reconhecendo uma sequência dentro de DNA estrangeiro. Os iniciadores preferencialmente têm uma sequência dentre 15 e 35 nucleotí- deos que em condições otimizadas de PCR "especificamente reconhece" 10 uma sequência dentro da região de flanqueamento 5' ou 3' do evento elite e o DNA estrangeiro do evento elite respectivamente, de modo que um frag- mento específico ("fragmento de integração" ou amplicon discriminatório) é amplificado a partir de uma amostra de ácido nucleico compreendendo o evento elite. lsto signífica que somente o fragmento de integração marcado, 15 e nenhuma outra sequência no genoma da planta ou DNA estrangeiro, é " amplificado em condições otimizadas de PCR. lniciadores de PCR apropriados para identificação de EE-GM3
P podem ser os seguintes: - oligonucleotÍdeos variando em comprimento de 17 nt a cerca 20 de 200 nt, compreendendo uma sequência de nucleotídeo pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20 nucleotldeos consecutivos, selecionados do DNA de planta na sequência de flanqueamento 5' (SEQ ID No 2 do nucleotideo 1 ao nucleotideo 1451) em suas extremidades 3' (inici- adores reconhecendo 5' sequência de flanqueamentos); ou 25 - oligonucleotÍdeos variando em comprimento de 17 nt a cerca de 200 nt, compreendendo uma sequência de nucleotideo pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20 nucleotideos consecutivos, selecionados do DNA de pIanta na 3' sequência de flanqueamento (comple- mento de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 241 ao nucleotídeo 1408) em suas 30 extremidades 3' (iniciadôres reconhecendo 3' sequência de flanqueamen- tos); ou - digonucleotídeos variando em comprimento de 17 nt a cerca de 200 nt, compreendendo uma sequência de nucleotídeo pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20 nucleotídeos consecutivos, selecionado da sequências de DNA inseridas (complemento de SEQ ID No 2
' do nucleotídeo 1452 ao nucleotídeo 1843) em suas extremidades 3' (inicia- 5 dores reconhecendo DNA estrangeiro); ou - oligonucleotídeos variando em comprimento de 17 nt a cerca de 200 nt, compreendendo uma sequência de nucleotídeo pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20 nucleotídeos consecutivos, selecionados das sequências de DNA inseridas (SEQ ID No 3 do nucleotí-
lO deo 1 ao nucleotídeo 240); ou - o[jgonuc|eotÍdeos apropriados variando em comprimento de 17 nt a cerca de 200 nt, compreendendo uma sequência de nucleotídeo peio menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20 nucleotideos consecutivos, selecionados da sequência de nucleotídeo do fragmento de
15 DNA inserido ou seu complemento (SEQ ID No 1 ou SEQ ID No 20 do nu- cleotídeo da posição 1452 a 16638)- Os iniciadores podem, claro, ser maiores do que os menciona- v dos 17 nucleotídeos consecutivos, e podem, por exemplo, se 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nt em comprimento ou ainda mais longos.
Os iniciado-
20 res podem completamente consistir em sequência de nucleotídeo seleciona- do das sequências de nucleotídeos mencionadas da sequência de flanque- amentos e sequências de DNA estrangeiro.
No entanto, a sequência de nu- cleotídeo de iniciadores em suas extremidades 5' (ou seja, fora dos 17 nu- cleotídeos consecutivos localizados em 3') é menos crítico.
Assim, a se-
25 quência 5' dos iniciadores pode compreender ou consistir em uma sequência de nucleotídeo selecionada da sequência de flanqueamentos ou DNA es- trangeiro, conforme apropriado, mas pode conter vários (por exemplo, 1, 2, 5, ou 10) desemparelhamentos.
A sequência 5' dos iniciadores pode mesmo completamente ser uma sequência de nucleotídeo não relacionada à se-
30 quência de flanqueamentos ou DNA estrangeiro, como, por exemplo, uma sequência de nucleotídeo que representa um ou mais sÍtios de reconheci- mento de enzima de restrição.
Ditas sequências não relacionadas ou se-
quências de flanqueamento de DNA com desemparelhamentos deveria pre- ferencialmente ser não maior do que 100, mais preferencialmente não maior do que 50 ou mesmo 25 nucleotídeos.
Além disso, iniciadores apropriados podem compreender, con-
5 sistir ou consistir essencialmente em uma sequência de nucleotídeo em suas extremidades 3' abrangendo a região cIe junção entre as sequências deriva- das de DNA de planta e as sequências de DNA estrangeiro (localizadas em nucleotideos 1451-1452 na SEQ ID No 2 e os nucleotídeos 240-241 na SEQ ID No 3 para EE-GM3) desde que os mencionados 17 nucleotideos conse-
lO cutivos Iocalizados em 3' não sejam derivados exclusivamente do DNA es- trangeiro ou sequências derivadas de planta na SEQ ID No 2 ou 3. Será imediatamente claro ao especialista que os pares de inicia- dor de PCR apropriadamente selecionados devem ainda não compreender sequências complementares a cada outra. 15 Para as finalidades da invenção, o "complemento de uma se- quência de nucleotídeo representado na SEQ ID No: X" é a sequência de nucleotídeo que pode ser derivada de sequência de nucleotídeo representa- v da por substituição de nucleotídeos com seus nucleotídeos complementares de acordo com as regras de Chargaff (A T; G Q e lendo na sequência na
20 direção 5' a 3', ou seja, na direção oposta da sequência de nucleotídeo re- presentada.
Exemplos de iniciadores apropriados para EE-GM3 são as se- quências de oligonucleotídeo de SEQ ID No 5 (iniciador 3' sequência de 'flanqueamento reconhecendo), SEQ ID No 4 (DNA estrangeiro reconhecen-
25 do iniciador para uso com uma 3' sequência de flanqueamento reconhecen- do iniciadores), ou SEQ ID No 7 (DNA estrangeiro reconhecendo iniciador para uso com a 3' sequência de flanqueamento reconhecendo iniciadores). Outros exemplos de iniciadores apropriados de oligonucleotídeo para EE-GM3 compreendem em suas extremidades 3' as seguintes sequên-
30 cias ou consiste (essencialmente) nas ditas sequências: a. 5' sequência de flanqueamento reconhecendo iniciadores: - a sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo
%
264 ao nucleotídeo 283 - a sequência de nucíeotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 266 ao nucleotídeo 285 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 5 1240 ao nucleotídeo 1259 - a sequência de nucleotídeo de SEQ (D No 2 do nucleotídeo 265 ao nucleotídeo 285 - a sequência de nucleotídeo de SEQ (D No 2 do nucleotídeo 265 ao nucleotídeo 283 10 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1239 ao nucleotídeo 1259 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1241 ao nucleotídeo 1259 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucieotídeo
15 1244 ao nucleotídeo 1263 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1248 ao nucleotídeo 1267 y
- a sequência de nucieotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1250 ao nucleotídeo 1269 20 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 262 ao nucleotídeo 279 - a sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 263 ao nucleotídeo 279 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo
25 264 ao nucleotídeo 285 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 266 ao nucleotídeo 283 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1238 ao nucleotídeo 1259 30 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1242 ao nucleotídeo 1259 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo t P
35/118
1243 ao nucleotideo 1263 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1245 ao nucleotídeo 1263 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 5 1247 ao nucleotídeo 1267 - a sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1249 ao nucleotideo 1269 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1249 ao nucleotideo 1267 10 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 263 ao nucleotideo 285 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 267 ao nucleotídeo 283 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 15 1242 ao nucleotídeo 1263 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1243 ao nucleotídeo 1259 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1246 ao nucleotídeo 1267 20 - a sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1246 ao nucleotldeo 1263 - a sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1248 ao nucleotídeo 1269 - a sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 25 1250 ao nucleotídeo 1271 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1250 ao nucleotídeo 1267 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1241 ao nucleotídeo 1263 30 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1245 ao nucleotideo 1267 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotldeo a
T 36/118 1247 ao nucleotideo 1269 - a sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1247 ao nucleotídeo 1263 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 5 1249 ao nucleotideo 1271 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1242 ao nucleotideo 1261 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucieotídeo 1241 ao nucleotideo 1261 10 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1243 ao nucleotideo 1261 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1240 ao nucleotideo 1261 - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 15 1244 ao nucleotídeo 1261 - a sequência de nucleotldeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1239 ao nucleotídeo 1261 . - a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1245 ao nucleotídeo 1261 20 b. sequência de DNA estrangeiro reconhecendo iniciadores para uso com 5' sequência de flanqueamento reconhecendo iniciadores: - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1732 ao nucleotideo 1751 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 25 do nucleotídeo 1735 ao nucleotídeo 1754 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1731 ao nucleotídeo 1750 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1732 ao nucleotídeo 1750 30 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1732 ao nucleotídeo 1752 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 t »
37/118 do nucleotídeo 1731 ao nucleotídeo 1749 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1732 ao nucleotideo 1749 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 5 do nucleotideo 1731 ao nucleotídeo 1751 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1732 ao nucleotideo 1753 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1731 ao nucleotideo 1748 10 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1732 ao nucleotídeo 1748 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1735 âc) nucleotídeo 1751 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 15 do nucleotídeo 1731 ao nucieotídeo 1752 r' - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1732 ao nucleotídeo 1754 - o comp|emel1to da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1731 ao nucleotídeo 1747 20 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotkieo 1731 ao nucleotideo 1753 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1727 ao nucleotídeo 1746 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 25 do nucleotldeo 1727 ao nucleotideo 1745 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1727 ao nucleotídeo 1747 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1727 ao nucleotídeo 1744 30 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1727 ao nucleotídeo 1748 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2
I > 38/118 do nucleotídeo 1727 ao nucleotideo 1749 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotÍdeo 1726 ao nucleotídeo 1745 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 5 do nucleotídeo 1726 ao nucleotídeo 1744 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1726 ao nucleotídeo 1746 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1726 ao nucleotídeo 1747 10 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1726 ao nucleotídeo 1748 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1724 ao nucleotídeo 1744 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 15 do nucleotídeo 1724 ao nucleotídeo 1745
K - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1724 ao nucieotídeo 1746 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1461 ao nucleotídeo 1478 20 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1670 ao nucfeotideo 1686 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1469 ao nucleotídeo 1486 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 25 do nucleotídeo 1508 ao nucleotídeo 1527 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1667 ao nucleotídeo 1686 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1670 ao nucleotídeo 1687 30 - o complemento da sequência de nucieotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1673 ao nucleotídeo 1689 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1688 ao nucleotídeo 1704 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1688 ao nucleotídeo 1705 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2
5 do nucleotídeo 1692 ao nucleotídeo 1709 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1467 ao nucleotídeo 1486 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucieotideo 1481 ao nucleotídeo 1497 10 - o compiemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1481 ao nucleotldeo 1498 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1491 ao nucleotideo 1507 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 15 do nucleotídeo 1491 ao nucleotídeo 1508 - - o complemento da sequência de nucleotldeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1672 ao nucleotídeo 1688 N·
- o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1673 ao nucleotideo 1690 20 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1673 ao nucleotídeo 1691 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1688 ao nucleotideo 170(3 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2
25 do nucleotídeo 1691 ao nucleotldeo 1707 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1691 ao nucleotideo 1708 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1469 ao nucleotídeo 1487 30 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1481 ao nucleotídeo 1499 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 h
40/118 do nucleotídeo 1489 ao nucleotideo 1505 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1489 ao nucleotídeo 1506 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2
5 do nucleotídeo 1489 ao nucleotídeo 1507 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1489 ao nucleotídeo 1508 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotldeo 1666 ao nucleotídeo 1686 10 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1667 ao nucleotídeo 1687 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1670 ao nucleotídeo 1688 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2
15 do nucleotÍdeo 1672 ao nucleotídeo 1689 . - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1688 ao nucleotideo 1707 - c) complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1691 ao nucleotídeo 1709 20 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1692 ao nucleotídeo 1710 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1481 ao nucleotídeo 1500 - o complemento da sequência de nucleotideo de SLQ ID No 2
25 do nucleotídeo 1491 ao nucleotídeo 1509 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1670 ao nucleotídeo 1689 - o compiemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1672 ao nucleotideo 1690 30 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1672 ao nucleotídeo 1691 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1687 ao nucleotídeo 1705 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID Nq 2 do nucleotídeo 1687 ao nuckotídeo 1706 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 5 do nucleotídeo 1691 ao nucleotídeo 1710 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1472 ao nucleotídeo 1488 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1488 ao nucleotídeo 1507 10 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1491 ao nucleotídeo 1510 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1495 ao nucleotídeo 1512 - (j complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 15 do nucleotídeo 1495 ao nucleotídeo 1513 < - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1495 ao nucleotideo 1514 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotÍdeo 1673 ao nucleotídeo 1692 20 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1678 ao nucleotídeo 1694 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1678 ao nucleotídeo 1695 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 25 do nucleotideo 1678 ao nucleotídeo 1696 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1687 ao nucleotídeo 1703 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1687 ao nucleotídeo 1704 30 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1692 ao nucleotídeo 1711 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1469 ao nucleotídeo 1488 - o complemento da sequência de nucleotldeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1488 ao nucleotideo 1506 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ iO No 2 5 do nucleotídeo 1491 ao nucleotldeo 151 1 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1670 ao nucleotldeo 1690 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucieotideo 1678 ao nucleotídeo 1697 10 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1688 ao nucieotídeo 1709 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1467 ao nucleotideo 1487 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 15 do nucleotídeo 1488 ao nucieotídeo 1508
K - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1495 ao nucleotídeo 151 1 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1491 ao nucleotídeo 1512 20 - o complemento da sequência de nucieotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1666 ao nucleotídeo 1687 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1667 ao nucleotídeo 1688 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 25 do nucleotídeo 1672 ao nucleotídeo 1692 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1673 ao nucleotídeo 1693 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1687 ao nucleotídeo 1707 30 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1472 ao nucleotídeo 1490 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotldeo 1472 ao nucleotideo 1491 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1481 ao nucleotfdeo 1501 - o compfemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 5 do nucleotídeo 1489 ao nucleotídeo 1509 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1495 ao nucleotídeo 1515 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotldeo 1670 ao nucleotídeo 1691 10 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1673 ao nucleotideo 1694 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1678 ao nucleotídeo 1698 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 15 do nucleotídeo 1469 ao nucleotídeo 1489 .. - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1667 ao nucleotídeo 1689 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1687 ao nucleotídeo 1708 20 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1688 ao nucleotídeo 1710 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotldeo 1691 ao nucleotídeo 1711 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 25 do nucleotídeo 1472 ao nucleotídeo 1492 - o complemento da sequência de nucíeotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1489 ao nucleotideo 1510 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1666 ao nucleotídeo 1688 30 - o complemento da sequência de nucleotÍdeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1687 ao nucleotídeo 1709 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1692 ao nucleotídeo 1712 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1467 ao nucleotídeo 1488 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1469 ao nucleotídeo 1490 - o coniplemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1488 ao nucleotideo 1509 - o complernento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1489 ao nucleotídeo 1511 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1678 ao nucleotídeo 1699 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1472 ao nucleotídeo 1493 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1472 ao nucleotídeo 1494 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1481 ao nucleotídeo 1502 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1670 ao nucleotídeo 1692 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1469 ao nucleotídeo 1491 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1488 ao nucleotídeo 1510 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1691 ao nucleotídeo 1712 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1692 ao nucieotídeo 1713 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1692 ao nucleotídeo 1714 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1467 ao nucieotídeo 1489 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1678 ao nucleotldeo 1700 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1481 ao nucleotideo 1503 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 5 do nucleotídeo 1691 ao nucleotideo 1713 c. 3' sequência de flanqueamento reconhecendo iniciadores: - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 828 ao nucleotídeo 847 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 10 do nucleotídeo 830 ao nucleotídeo 849 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 3 do nucleotideo 828 ao nucleotídeo 846 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 828 ao nucleotídeo 848 15 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 " do nucleotídeo 830 ao nucleotídeo 848 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3
B do nucleotídeo 830 ao nucleotideo 850 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 20 do nucleotídeo 828 ao nucleotídeo 845 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotldeo 830 ao nucleotídeo 847 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 828 ao nucleotideo 849 25 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 830 ao nucleotídeo 851 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 828 ao nucleotideo 844 - o complernento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 3 30 do nucleotídeo 830 ao nucleotídeo 846 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 828 ao nucleotídeo 850
- o compiemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 830 ao nucleotideo 852 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 992 ao nucleotídeo 1009 5 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotideo 731 ao nucleotídeo 752 - o cornplemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 776 ao nucleotídeo 795 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 10 do nudeotídeo 731 ao nucleotídeo 753 -' o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 776 ao nucleotídeo 794 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 776 ao nucleotídeo 796 15 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 776 ao nucleotídeo 793 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 . do nucleotídeo 776 ao nucleotídeo 797 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 3 20 do nucleotldeo 776 ao nucleotídeo 792 - o compíemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ÍD No 3 do nucleotídeo 776 ao nucleotideo 798 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 733 ao nucleotldeo 752 25 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotideo 733 ao nucleotídeo 753 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 733 ao nucleotídeo 754 - o complemento da sequência de nucleotideo de SEQ ID No 3
30 do nucleotídeo 733 ao nucleotídeo 755 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 838 ao nucleotídeo 854
- o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 246 ao nucleotídeo 263 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotideo 838 ao nucleotídeo 855 5 - o complemento da sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 245 ao nucleotídeo 264 d. sequência de DNA estrangeiro reconhecendo iniciadores para uso com 3' sequência de flanqueamento reconhecendo iniciadores: 10 a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 173 ao nucleotídeo 192 a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 22 ao nucleotídeo 41 a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 172 15 ao nucleotídeo 192 . a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 174 ao nucleotídeo 192
W a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 191 ao nucleotideo 210 20 a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 171 ao nucleotídeo 192 a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 175 ao nucleotideo 192 a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 190 25 ao nucleotídeo 210 a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotldeo 192 ao nucleotídeo 210 a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 176 ao nucleotídeo 192 30 a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 189 ao nucleotídeo 210 a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotideo 193 ao nucleotideo 210 a sequência de nucleotideo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 188 ao nucleotideo 210 a sequência de nucleotideo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 194 5 ao nucleotídeo 210 a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 199 ao nucleotídeo 218 a sequência de nucleotldeo de SEQ ID No 3 do nucleotideo 200 ao nucleotídeo 218 10 a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 197 ao nucleotídeo 218 a sequência de nucleotideo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 201 ao nucleotídeo 218 a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotideo 201 15 ao nucleotídeo 220 . a sequència de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 200 ao nucleotídeo 220 q a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 199 ao nucleotídeo 220 20 a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 200 ao nucleotídeo 221 a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 199 ao nucleotídeo 221 a sequência de nucleotideo de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 150 25 ao nucleotídeo 172 lniciadores de PCR apropriados para a identificação de EE-GMI foram descritos em WO2006/ 108674, particularmente na página 8, pista 4 a página 26, pista 7 (aqui incorporado como referência)- lniciadores de PCR apropriados para a identificação de EE-GM2 30 foram descritos no WO2006/1 08675, particularmente nas páginas 8, pista 4 a página 33, pista 4 (aqui incorporado como referência). Conforme usado aqui, "a sequência de nucleotídeo de SEQ ID
No.
Z da posição X à posição Y" indica a sequência de nucleotideo incluindo ambos os pontos extremos dos nucleotídeos- Preferencialmente, o fragmento amplificado tem um comprimen- to de entre 50 e 500 nudeotídeos, como um comprimento entre 100 e 350 5 nucleotídeos.
Os iniciadores específicos podem ter uma sequência que é entre 80 e 100% idêntica a uma sequência dentro da região de flanquea- mento 5' ou 3' do evento elite e o DNA estrangeiro do evento elite, respecti- vamente, desde que os desemparelhamentos ainda permitam a identificação especifica do evento elite com estes iniciadores em condições otimizadas de 10 PCR.
A faixa do desemparelhamentos permissível, no entanto, pode facil- mente ser determinada experimentalmente e são conhecidos aos especialis- tas na técnica.
A detecção dos fragmentos de integração pode ocorrem de vá- rias formas, por exemplo, através de estimativa de tamanho após análise em 15 gel.
Os fragmentos de integração podem ainda ser sequenciados direcio- " nalmente.
Outros métodos específicos da sequência para detecção de frag- mentos de DNA amplificados são ainda conhecidos nã técnica.
Como a sequência dos iniciadores e seus locais relatívos no ge- noma são únicos para o evento elite, amplificação do fragmento de integra- 20 ção ocorrerá somente em amostras biológicas compreendendo (o ácido nu- cleico de) o evento elite.
Preferencialmente quando realizado um PCR para identificar a presença de eventos elite EE-GM3 e EE-GMI ou eventos elite EE-GM3 e EE-GM2 em amostras desconhecidas, um controle é incluido de um conjunto de iniciadores com os quais um fragmento dentro de um "gene 25 não destrutivo" da espécie de planta do evento pode ser amplificado.
Genes não destrutivo são genes que são expressos na maior parte dos tipos de células e que são referentes a atividades metabólicas básicas comuns as células- Preferencialmente, o fragmento ampíificado do gene não destrutivo é um fragmento que é maior do que o fragmento de integração amplificado. 30 Dependendo das amostras a serem analisadas, outros controles podem ser incluidos.
Os protocolos de PCR padrões são descritos na técnica, como em "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999) e outras referências.
As condições ideais para o PCR, incluindo a se- quência dos iniciadores específicos, são especificadas em um "Protocolo de ldentificação de PCR (ou Reação em Cadeia da Polimerase)" para cada e- 5 vento elite.
É, no entanto, entendido que um número de parâmetros no Pro- tocolo de ldentificação de PCR pode necessitar de ajuste para condições especificas de laboratório, e podem ser ligeiramente modificados para obter resultados semelhantes.
Por exemplo, o uso de um método diferente para a preparação de DNA pode requerer ajuste de, por exemplo, a quantidade de 10 iniciadores, polimerase e condições de anefamento usadas.
Da mesma for- ma, a seleção de outros iniciadores pode ditar outras condições ideais para o Protocolo de ldentificação de PCR.
Estes ajustes irão, no entanto, estar aparentes aos especialistas na técnica, e são ainda detalhados em manuais atuais de aplicação de PCR como aqueles citados acima. 15 Alternativamente, iniciadores específicos podem ser usados para ^ amplificar fragmentos de integração que podem ser usados como "sondas específicas" para identificar EE-GM3 e EE-GMI ou EE-GM3 e EE--GM2 em amostras biológicas.
Contatar ácido nucleico de uma amostra bioiógica, com as sondas, em condições que permitem hibridização das sondas com seus 20 fragmentos correspondentes no ácido nucleico da amostra, resulta ria for- mação de híbridos de ácido nucleico lsonda.
A formação destes híbridos pode ser detectada (por exemplo, via marcação do ácido riucleico ou sonda), por meio do qual a formação destes híbridos indica a presença de EE-GM3 e EE-GMI ou EE-GM3 e EE-GM2. Ditos métodos de identificação com bases 25 na hibridização com uma sonda específica (em veículo de fase sólida ou em solução) foram descritos na técnica.
A sonda específica é preferencialmente uma sequência que, em condições ideais, hibridiza especificamerite a uma região dentro da região de flanqueamento 5' ou 3' do evento elite e preferen- cialmente ainda compreendendo parte do DNA estrangeiro contiguo a este 30 (aqui referenciado como "região específica")- Preferencialmente, a sonda específica compreende uma sequência de entre 50 e 500 pb, preferencial- mente de 100 a 350 pb que é pelo menos 80%, preferencialmente entre 80 e
85%, mais preferencialmente entre 85 e 90%, especialmente preferencial- mente entre 90 e 95%, mais preferencialmente entre 95°6 e 100% idêntica (ou complementar) a uma sequência de nucleotídeo da região específica.
Preferencialmente, a sonda específica compreenderá uma sequência de 5 cerca de 15 a cerca de 100 nucleotídeos contíguos idênticos (ou comple- rnentares) a uma região específica do evento elite- Além disso, métodos de detecção específicos para eventos elite EE-GM3 e EE-GMI ou para eventos elite EE-GM3 e EE-GM2 que diferem de métodos de amplificação baseados em PCR podem ainda ser desenvol- lO vidos usando a informação da sequência específica do evento elite forneci- dos aqui.
Ditos métodos de detecção alternativos incluem métodos de de- tecção de amplificação de sinal linear baseados em clivagem invasiva de estruturas de ácido nucleico particular, ainda conhecido como tecnologia lnvaderTM, (conforme descrito, por exemplo, na patente US 5.985.557 "In- 15 vasive Cleavage of Nucleic Acids", 6.001.567 "Detection of Nucleic Acid se- quences by lnvader Directed Cleavage", incorporadas aqu como referência). Para detecção de EE-GM3 por este método, a sequência-alvo pode hibridi- . zar com um primeiro ohgonucleotídeo de ãcido nucleico marcado compreen- dendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotideo 1452 ao 20 nucleotídeo 1469 ou seu complemento ou dita sonda de ácido nucleico mar- cado compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 3 do nucle- otideo 223 ao nucleotídeo 240 ou seu complemento e ainda é hibridizado com um segundo oHgonudeotídeo de ácido nucleico compreendendo a se- quência de nucleotídeo de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1434 ao nucleotídeo 25 1451 ou seu complemento ou dita sonda de ácido nucleico marcado com- preendendo a sequência de nucleotideo de SEQ ID No 3 do nucleotideo 241 ao nucleotídeo 258 ou seu complemento, em que os primeiro e segundo oli- gonucleotídeos sobrepõem em pelo menos um nucleotídeo.
A estrutura du- pla ou tripla que é produzida por esta hibridização permite que a sonda sele- 30 tiva clive com uma enzima (C|eavase®) deixando a sequência-alvo intacta.
A sonda marcada cIivada é subsequentemente detectada, potencialmente a- través de uma etapa intermediária resultando em outra amplificação de sinal.
wuHE:!
Para a detecção de EE-GMI por este método, a sequência-alvo pode hibri- dizar com um primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico marcado compre- endendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 12 do nucleotídeo 210 ao nucleotídeo 227 ou seu complemento ou dita sonda de ácido nucleico 5 marcado compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 13 do nucleotideo 561 ao nucleotídeo 568 ou seu complemento e ainda é hibridi- zado com um segundo oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 12 do nucleotídeo 192 ao nucleotí- deo 209 ou seu complemento ou dita sonda de ácido nucleico marcado 10 compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 13 do nucleoti- deo 569 ao nucleotídeo 586 ou seu complemento, em que os primeiro e se- gundo oligonucleotídeos sobrepõem em pelo menos um nucleotídeo.
A es- trutura dupla ou tripla que é produzida por esta hibridização permite que a sonda seletiva clive com uma enzima (C[eavase®) deixando a sequência-
15 alvo intacta.
A sonda marcada cIivada é subsequentemente detectada, po- ' tencialmente através de uma etapa intermediária resultando em outra ampli- ficação de sinal.
Para detecção de EE-GM2 por este método, a sequência- alvo pode hibridizar com um primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico marcado compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 14 do 20 nucleotídeo 312 ao nucleotídeo 329 ou seu complemento ou dita sonda de ácido nucleico marcado compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 15 do nucleotídeo 490 a nucleotídeo 507 ou seu complemento e ainda é hibridizado com um segundo oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 14 do nucleotí- 25 deo 294 ao nucleotídeo 311 ou seu complemento ou dita sonda de ácido nucleico marcado compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 15 do nucleotídeo 508 ao nucleotldeo 525 ou seu complemento, em que o primeiro e segundo oligonucleotÍdeo sobrepõe em pelo menos um nucleo- tídeo.
A estrutura dupla ou tripla que é produzida por esta hibridização per- 30 mite que a sonda seletiva clive com uma enzima (Cleavase®) deixando a sequência-alvo intacta.
A sonda marcada clivada é subsequentemente de- tectada, potencialmente através de uma etapa intermediária resultando em mKE outra amplificação de sinal.
Um "kit" conforme usado aqui se refere a um conjunto de rea- gentes para a finalidade do método da invenção, mais particularmente, a identificação do evento elite EE-GM3 em amostras biológicas ou a determi- 5 nação do estado de zigosidade de EE-GM3 contido no material de planta.
Mais particularmente, uma modalidade preferencial do kit da invenção com- preende pelo menos um ou dois iniciadores especlficos, conforme descrito acima para identificação do evento elite, ou três iniciadores específicos para a determinação do estado de zigosidade.
Opcionalmente, o kit pode ainda 10 compreender qualquer outro reagente descrito aqui no Protocolo de ldentifi- caçâo de PGR.
Alternativamente, de acordo com outra modalidade desta invenção, o kit pode compreender uma sonda específica, conforme descrito acima, que especif'icamente hibridiza com ácido nucleico de amostras bioló- gicas para identificar a presença de EE-GM3 neste- Opcionalmente, o kit 15 pode ainda compreender qualquer outro reagente (tal como, sem limitação,
- tampão de hibridização, marcador) para a identificação de EE-GM3 em a- mostras biológicas, usando a sonda específica.
O kit da invenção pode ser usado, e seus componentes podem ser especificamente ajustados, para fins de controle de qualidade (por e- 20 xemplo, pureza dos lotes semente), detecção da presença ou ausência do evento elite em material de planta ou material compreendendo ou derivado de material de planta, como, entre outros, alimentos ou produtos alirnentí- cios.
Conforme usado aqui, "identidade de sequência" com relação às 25 sequências de nucleotídeo (DNA ou RNA), refere-se ao número de posições com nucleotídeos idênticos divididos pelo número de nucleotídeos na mais curta de duas sequências.
O alinhamento de duas sequências de nucleotí- deos é realizado por algoritmo de Wilbur e Lipmann (Wilbur and Lipmann, 1983, Proc.
Nat.
Acad.
Sci.
USA 80:726) usando um tamanho de janela de 30 20 nucleotídeos, um coniprimento de palavra de 4 nucleotídeos, e uma pe- nalidade de lacuna de 4. Análise assistida por computador e interpretação dos dados da sequência, incluindo alinhamento de sequência conforme des-
crito acima, pode, por exemplo, ser convenientemente realizado usando a análise de sequência do pacote de software do Genetics Computer Group (GCG, University of Wisconsin Biotechnology Center). As sequências são indicadas como "essencialmente semelhante" quando ditas sequências têm 5 uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 75%, particularmente pelo menos cerca de 80%, mais particularmente pelo menos cerca de 85%, particularmente pelo menos cerca de 90%, especialmente pelo menos cerca de 95°6, mais especialmente pelo menos cerca de 98 °/), ou pelo menos cer- ca de 99 °/0. É claro que, quando as sequências de RNA são ditas como es-
lO sencialmente semelhantes ou têm certo grau de identidade de sequência com sequências de DNA, timidina (T) na sequência de DNA é considerada igual a uracila (U) na sequência de RNA.
Ainda, é claro que pequenas dife- renças ou mutações podem aparecer nas sequências de DNA ao longo do tempo e que aíguns desemparelhamentos podem ser conseguidos para os 15 eventos iniciadores específicos ou sondas da invenção, de modo que qual- . quer sequência de DNA indicada aqui em qualquer modaiidade desta inven- ção para qualquer DNA de flanqueamento de 3' ou 5' ou para qualquer inser- - to ou DNA estrangeiro ou qualquer iniciador ou sonda desta invenção, ainda inclui sequências essencialmente semelhantes às sequências fornecidas
20 aqui, como sequences hibridizando a ou com pelo menos 90 °/), 95 °/0, 96 °/,, 97 '/), 98 °/), ou pelo menos 99 °/0 de identidade de sequência à sequência conferida por DNA de flanqueamento 3' ou 5', para qualquer iniciador ou sonda ou para qualquer inserto ou DNA estrangeiro desta invenção.
O termo "iniciador" conforme usado aqui inclui qualquer ácido
25 nucleico que é capaz de iniciar a sintese de um ácido nucleico nascente em um processo dependente de molde, como PCR.
Tipicamente, iniciadores são oligonucleotídeos de 10 a 30 nucleotídeos, mas sequências maiores podem ser empregadas.
Os iniciadores podem ser fornecidos ria forma de dupla fita, embora a forma de fita simples e seja preferencial.
As sondas po- 30 dem ser usadas como iniciadores, mas são desenhadas para se ligar a DNA ou RNA alvo e necessitam ser usadas em um processo de amplificação.
O termo "reconhecimento" conforme usado aqui quando se refe-
re aos iniciadores específicos, refere-se ao fato de que os iniciadores espe- cÍficos especialmente hibridizam a uma sequência de ácido nucleico nas condições estabelecidas no método (como as condições do Protocolo de ldentificação de PCR), em que a especificidade é determinada pela presen- 5 ça de controles positivos e negativos.
O termo "hibridizando" conforme usado aqui quando refere-se as sondas específicas, refere-se ao fato de que a sonda se liga a uma região específica na sequência de ácido nucleico do evento elite sob condições rí- gidas padrões.
Condições rigidas padrões conforme usado aqui refere-se às condições para hibridização descritas aqui ou as condições convencionais de hibridização conforme descrito por Sambrook et aL, 1989 (Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) que por exemplo pode compreender as seguintes etapas: 1) i- mobilizar fragmentos de DNA de planta genômico em um filtro, 2) pré- hibridizar o filtro por 1 a 2 horas a 42°C em 50% formamida, 5 X SSPE, 2 X de reagente de Denhardt e 0,1 °/) SDS, ou por 1 a 2 horas a 68°C em 6 X SSC, 2 X reagente de Denhardt e 0,1% SDS, 3) adicionado a sonda de hi- bridização que foi marcada, 4) incubar por 16 a 24 horas, 5) lavar o filtro por 20 rnin. em temperatura ambiente em lX SSC, 0,1 %SDS, 6) Iavando o filtro três vezes por 20 min- cada um a 68°C em 0,2 X SSC, 0,1 %SDS, e 7) ex- pondo o filtro por 24 a 48 horas a um filme de raio X a -70"C com uma tela de intensificação.
Conforme usado aqui, uma amostra biológica é uma amostra de uma planta, material de planta ou produtos compreendendo material de plan- ta.
O termo "planta" tem a intenção de incluir tecidos de planta de soja (G/y- cine max), em qualquer estágio de maturidade, bem como qualquer célula, tecido ou órgãos extraídos de ou derivados de qualquer dita planta, incluin- do, entre outros, qualquer semente, folha, caule, flores, raízes, células sim- ples, gametas, cultura de células, culturas de tecidos ou protoplastos. "Mate- rlal de planta", conforme usado aqui refere-se ao material que é obtido ou derivado de uma planta.
Os produtos compreendendo material de planta se
· referem a alimento, alimentação ou outros produtos que são produzidos u-
sando material de planta ou podem ser contaminados por material de planta.
É entendido que, no contexto da presente invenção, ditas amostras biológi- cas são restadas para a presença de ácidos nucleicos específicos para EE- GM3, EE-GMI e EE-GM2 implicando na presença de ácidos nucleicos nas amostras.
Assim, os métodos referenciados aqui para identificar evento elite EE-GM3 e EE-GM2 ou EE-GM3 e EE-GMI em amostras biológicas, refe- rem-se à identificação em amostras biológicas de ácidos nucleicos que com- preende o evento elite.
Conforme usado aqui "compreendendo" deve ser interpretado como especificando a presença de características declaradas, inteiros, eta- pas, reagentes ou componentes conforme referenciados, mas não exclui a presença ou adição de uma ou mais características, inteiros, etapas ou componentes ou grupos dos mesmos.
Assim, por exemplo, um ácido nuclei- co ou proteína compreendendo uma sequência de nucleotldeos ou aminoá- cidos, pode compreender mais nucleotídeos ou aminoácidos do que os já citados, ou seja, embutidas em um ácido nucleico ou protelna maior.
Um gene quimérico compreendendo uma sequência de DNA que é funcional- mente ou estruturalmente definido pode compreender sequências adicionais de DNA, como sequências promotoras e terminação de transcrição.
A presente invenção ainda se refere ao desenvolvimento de um grupo de eventos elite EE-GM3 e evento elite EE-GMI ou um conjunto de evento eiite EE-GM3 e evento elite EE-GM2 em soja, às plantas compreen- dendo um conjunto destes eventos, a descendência obtida a partir destas plantas e para as células de planta, ou material de pIanta derivado de plan- tas compreendendo estes conjuntos.
As plantas compreendendo evento elite EE-GM3 e EE-GMI ou EE-GM3 e EE-GM2 podem ser obtidas conforme descrito no exemplo 1. Os conjuntos são obtidos por plantas de cruzamento compreendendo eventos únicos usando métodos de reprodução convencio- nais e identificação de descendência das mesmas compreendendo dois e- ventos diferentes.
As plantas de soja ou material de pIanta compreendendo EE- GM3 e EE-GMI podem ser identificadas de acordo com o Protocolo de Iden-
tificação de PCR descrito para EE-GM3 e EE-GMI no Exemplo 2. Resumi- damente, o DNA genômico da soja presente na amostra biológica é amplifi- cado por PCR usando um iniciador que especificamente reconhece uma se- quência dentro de 5' ou 3' sequência de flanqueamento de EE-GM3 como o iniciador com a sequência de SEQ ID NO: 5, e um iniciador que reconhece uma sequência no DNA estrangeiro, como o iniciador com a sequência de SEQ ID NO: 4 e outro usando um iniciador que especificamente reconhece uma sequência dentro de 5' ou 3' sequência de flanqueamento de EE-GMI como o iniciador com a sequência de SEQ ID NO: 16 e um iniciador que re- lO conhece uma sequência no DNA estrangeiro, como o iniciador com a se- quência de SEQ ID NO: 17. As plantas de soja ou material de pIanta compreendendo EE- GM3 e EE-GM2 podem ser identificadas de acordo com o Protocolo de lden- tificação de PCR descrito para EE-GM3 e EE-GM2 no Exemplo 2. Resumi- damente, o DNA genômico da soja presente na amostra biológica é amplifi- cado por PCR usando um iniciador que especificamente reconhece uma se- quência dentro de 5' ou 3' sequência de flanqueamento de EE-GM3 como o iniciador com a sequência de SEQ ID NO: 5 e um iniciador que reconhece uma sequência no DNA estrangeiro, como o iniciador com a sequência de SEQ ID NO: 4 e outro usando um iniciador que especificamente reconhece uma sequência dentro de 5' ou 3' sequência de flanqueamento de EE-GM2 como o iniciador com a sequência de SEQ ID NO: 18 e um iniciador que re- conhece uma sequência no DNA estrangeiro, como o iniciador com a se- quência de SEQ ÍD NO: 19. Íniciadores de DNA que amplificam parte de uma sequência de soja endógena são usados como controle positivo para a amplificação de PCR.
Se na amplificação do PCR, o material rende os fragmentos dos tama- nhos esperados, o material contém de planta de uma planta de soja abri- gando evento elite EE-GM3 e EE-GMI ou de uma planta de soja abrigando evento elite EE-GM3 e EE-GM2. Plantas abrigando EE-GM3 e EE-GMI ou EE-GM3 e EE-GM2 são caracterizadas por sua tolerância a glifosato, bem como por sua tolerân-
cia a inibidores de HPPD como isoxaflutol e ainda por sua tolerância a glufo- sinato.
Plantas abrigando os conjuntos de eventos são ainda caracterizadas por conter características agronômicas que são comparáveis às variedades comercialmente disponíveis de soja, na ausência de aplicação de herbicida. 5 Foi observado que a presença de DNA estrangeiro nas regiões de inserção do genoma da planta de soja descrito aqui, confere particularmente interes-
. sante caracteristicas fenotípicas e moleculares às pIantas compreendendo este evento.
Uma modalidade desta invenção fornece uma combinação ou 10 eventos elite EE-GM3 e EE-GMI e/ou EE-GM2 em plantas de soja, obteni- vel por inserção de transgenes em locais específicos no genoma da soja, cujos eventos elite conferem tolerância a glifosato, glufosinato em um herbi- cida inibidor de HPPD como isoxaflutol em ditas plantas de soja, e em que ditos eventos elite não causam qualquer efeito no desempenho agronômico 15 de ditas sojas negativamente afeta ditas plantas de soja, comparadas as Iinhagens isogênicas (conforme usado aqui, "linhagens isogênicas" ou "li- nhagens quase isogênicas" são linhagens de soja do mesmo fundo genético, - mas faltando os transgenes, como plantas do mesmo fundo genético como a planta usada para transformação, ou linhagens irmãs de segregação tendo 20 perdido os transgenes). Particularmente, a invenção atual fornece uma com- binação de eventos elite EE-GM3 e EE-GMI e/ou EE-GM2 em plantas de soja, em que a inserção ou presença de dito evento de elite no genoma de ditas plantas de soja não causa uma suscetibilidade aumentada, não causa um arrasto de rendimento, ou não causa depósito aumentado, em ditas plan- 25 tas de soja, comparado às linhagens isogênicas.
Daí, a presente invenção fornece uma combinação de eventos elite em plantas de soja, designada como EE-GM3 e EE-GMI e/ou EE-GM2, que resulta em plantas de soja que podem toierar a aplicação e glifosato, glufosinato em um herbicida inibidor de HPPD (simultaneamente ou separadamente) sem negativamente afetar o 30 rendimento da dita pIanta de soja comparado às linhagens isogênicas, cujas plantas de soja não têm diferenças estatisticamente significativas em suas suscetibilidades a doença, ou alojamento, em comparação com plantas de soja isogênicas.
Estas características tornam a combinação atual de eventos eiite muito interessante para controlar as ervas daninhas resistentes a glifo- sato em campos de soja, e podem ainda ser usadas em abordagens para impedir ou retardar outro desenvolvimento de resistência a glifosato em 5 campos de soja (por exemplo, pela aplicação de glifosato e isoxaflutol e/ou giufosinato, ou pela aplicação de isoxaflutol e glifosato e/ou glufosinato, ou pela aplicação de glufosinato e glifosato e/ou isoxafulote, garantindo pelo menos 2 ou até mesmo 3 diferentes modos de ação de herbicidas aplicadas em um campo de soja)- 1O Aqui é fornecida uma planta de soja ou parte da mesma com- preendendo evento EE-GM3 e evento elite EE-GMI ou EE-GM2, em quê a semente de soja representativa compreendendo evento EE-GM3 que foi de- positado sob o número NCIMB número de acessão 41659, semente de soja representativa compreendendo evento elite EE-GMI foi depositado em 15 NCIMB sob o número de acessão NCIMB 41658, semente representativa " compreendendo evento elite EE-GM2 foi depositado em NCIMB sob o núme- ro de acessão NCIMB 41660, semente de soja representativa compreen- . dendo evento EE-GM3 e EE-GMI foi depositado em ATCC sob o número de acessão PTA-11041, e semente de soja representativa compreendendo e- 20 vento EE-GM3 e EE-GM2 foi depositado em ATCC sob o número de aces- são PTA-11042. Plantas de soja ou partes da mesma compreendendo EE-GM3 e EE-GMI ou EE-GM3 e EE-GM2 podem ser obtidas combinando os respecti- vos eventos elite conforme pode ser encontrado nas sementes respectivas 25 depositadas através de qualquer meio disponível na técnica, incluindo cru- zamento de plantas a partir de sementes depositadas, coleta de descendên- cia da mesma, e identificação destas plantas de descendência cornpreen- dendo a combinação apropriada de eventos de elite.
Ainda são fornecidas aqui sementes de ditas plantas, compreendendo ditos eventos, bem como 30 um produto de soja a partir de ditas sementes, em que dito produto de soja compreende evento EE-GM3 e EE-GMI ou EE-GM2. Dito produto de soja pode ser ou pode compreender refeição, sementes moídas, farinha, flocos,
etc.. Particularmente, dito produto de soja compreende um ácido nucleico que produz diagnóstico de amplicons para evento EE-GM3 e evento elite EE-GMI ou EE-GM2, ditos amplicons compreendendo SEQ ID No. 2 ou 3, SEQ ID No. 14 ou 15 e/ou SEQ ID No. 12 ou 13. Ainda é fornecido aqui um 5 método para produzir um produto de soja, compreendendo obter semente de soja compreendendo evento EE-GM3 e evento elite EE-GMI ou EE-GM2, e produzir dito produto de soja do mesmo.
Ainda é fornecida aqui uma planta de soja, que é a descendên- cia de qualquer uma das plantas de soja acima, e que compreende evento 10 EE-GM3 e EE-GMI ou EE-GM2. Ainda é fornecido aqui um método para produzir uma planta de soja tolerante a herbicidas glifosato e/ou glufosinato e/ou isoxaflutol, com- preendendo introduzir no genoma de dita planta evento EE-GM3 e evento EE-GMI ou EE-GM2, particularmente por cruzamento de uma primeira plan- 15 ta de soja contendo evento EE-GM3 com uma planta de soja compreenden- " do EE-GMI e/ou EE-GM2, e selecionando uma planta descendente tolerante a glifosato e/ou glufosinato e/ou isoxaflutol.
Ainda é fornecido aqui uma planta tolerante a glifosato e glufosi- nato e/ou isoxaflutol, particularmente sem arraste de rendimento, e com ca- 20 racterísticas agronômicas aceitáveis, compreendendo uma proteína 2mEPSPS, HPPD e PAT, e capaz de produzir um diagnóstico ampíicon para eventos EE-GM3 e EE- GMl ou EE-GM3 e EE-GM2. Ainda é fornecido aqui um método para controlar ervas daninhas em um campo de piantas de soja compreendendo eventos EE-GM3 e EE- 25 GMl ou EE-GM3 e EE-GM2, ou um campo a ser piantado com ditas plantas de soja, compreendendo tratar o campo com uma quantidade efetiva de um herbicida a base de isoxafiutol, a base de glifosato e/ou a base de glufosina- to, em que ditas plantas são tolerantes a ditos herbicidas.
Ainda é fornecido aqui uma planta de soja, célula, tecido ou se- 30 mente, compreendendo EE-GM3 e EE-GMI, caracterizada por compreender no genoma de suas células uma sequência de ácido nucleico com pelo me- nos 80%, 90%, 95 % ou 100 °/0 de identidade de sequência a SEQ ID No. 2 do nucleotídeo 1431 a 1472 and uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 8Ô°/o, 9Õ°/o, 95 % ou 100 °/, de identidade de sequência a SEQ ID No. 3 do nucleotídeo 220 a 261, ou o compiemento de ditas sequências, e ainda uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 8O°/q, 90%, 95 °/) ou 100 5 °/0 de identidade de sequência a SEQ ID No. 12 do nucleotídeo 199 a 220 and uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, 90%, 95 °/j ou 100 °/) de identidade de sequência a SEQ ID No. 13 do nucleotideo 558 a 579, ou o complemento de ditas sequências.
Ainda é fornecido aqui uma planta de soja, célula, tecido ou se- lO mente, compreendendo EE-GM3 e EE-GM2, caracterizada por compreender no genoma de suas células uma sequência de ácido nucleico com pelo me- nos 80%, 90%, 95 °/) ou 100 '/0 de identidade de sequência a SEQ ID No. 2 do nucleotídeo 1431 a 1472 and uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, 90%, 95 °/) ou 100 °/) de identidade de sequência a SEQ ID No. 15 3 do nucleotídeo 220 a 261, ou o complemento de ditas sequências, e ainda
" uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, 9O°/j, 95 °/0 ou 100 °/) de identidade de sequência a SEQ ID No. 14 do nucleotídeo 301 a 322 and uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80°€, 90%, 95 °/) ou 100 °'0 de identidade de sequência a SEQ ID No. 15 do nucleotídeo 497 a 20 518, ou o complemento de ditas sequências.
O termo "isoxaflutol", conforme usado aqui, refere-se ao herbici- da isoxaflutol [ou seja(5-ciclopropik4-isoxazolil) [2-(metilsulfonil)-4- (trifluorometil)fenil] metanona], o metabóhto ativo do mesmo, dicetonitrila, e qualquer mistura ou solução compreendendo ditos compostos, Herbicidas 25 que inibem HPPD úteis para aplicação nas plantas compreendendo os even- tos desta invenção são as d icetonitrilas, por exemplo 2-ciano-3-ciclopropil-1- (24neti|su|foni|-4-tnf|uometi1feni|)-propano-1 ,3-diona e 2-ciano-1-[4- (metikulfonil)-2-trif1uorometilfen j[]-3-(1-metilcic|opropi|)propano-1,3-diona: outros isoxazois; e as pirazolinatos, por exemplo topramezono [ou seja[3- 30 (4,5Aihidro-3-isoxazo|i|)-2-meti|-4-(meti|su|foni|)fenij] (5-hidróxi-1-metil-1 H- pirazol-4-il)metanona], e pirassulfotol [(5-hidróxi-|,3-dimetj|pirazo|-4-il(2-mesi|- 4-trifluarometilfenil)metanona]; ou pirazofen [2-[4-(2,4-diclorobenzoil)-1 ,3-
dimetilpirazol-5-iióxi]ace'tofenona]- Em uma modalidade desta invenção, um campo a ser plantado com plantas de soja contendo o evento EE-GM3, pode ser tratado com um herbicida inibidor de HPPD, como isoxaflutol ('IFT'), antes de as plantas de 5 soja serem plantadas ou as sementes são semeadas, que limpa o campo das sementes que são mortas pelo inibidor de HPPD, permitindo práticas de planto direto, seguido por plantio ou semeadura das sojas no mesmo campo pré-tratado posteriormente (aplicação burndown usando um herbicida inibi- dor de HPPD). A atividade residual de IFT ainda protege as plantas de soja 10 emergentes e crescentes da competição com ervas daninhas nos estágios iniciais do crescimento- Uma vez que as plantas de soja têm certo tamanho, e eNas daninhas tendem a reaparecer, glifosato, ou mistura de inibidor de HPPD-glifosato, pode ser aplicada como o herbicida pós-emergente sobre a parte superior das plantas. 15 Em outra modalidade desta invenção, um campo em que as se- " mentes contendo o evento EE-GM3 foram semeadas, podem ser tratadas com um herbicida inibidor de HPPD, como IFT, antes de as plantas de soja emergirem, mas após as sementes serem semeadas (o campo pode ser preparado livre de ervas antes de semeadura usando outros meios, tipica- 20 mente práticas de lavoura convencional como aragem, escarificação, ou preparo de leito de sementes), onde a atividade residual manterá o campo Iivre de eNas daninhas mortas pelo herbicida de modo que a emergência e crescimento das plantas de soja não têm competição por ervas daninhas (aplicação pré-emergência de um herbicida inibidor de HPPD). Uma vez que 25 as plantas de soja têm certo tamanho, e ervas daninhas tendem a reapare- cer, glifosato, ou mistura de inibidor de HPPO-glifosato, pode ser aplicada como o herbicida pós-emergente sobre a parte superior das plantas.
Em outra modalidade desta invenção, plantas contendo o evento EE-GM3 podem ser tratadas com um herbicida inibidor de HPPD, como IFT, 30 sobre a parte superior das plantas de soja (que foram emergidas a partir de sementes que foram semeadas), que limpa o campo de ervas daninhas mor- tas peb inibidor de HPPD, cuja apíicação pode ser junta com (por exempio,
t {
63/118 em um mistura de tanque de pulverização), seguido por um tratamento com glifosato herbicida pós-emergente sobre a parte superior das pIantas (aplica- ção pós-emergência de um herbicida inibidor de HPPD (com ou sem gíifosa- to)). 5 Ainda, de acordo com a invenção atual, plantas de soja abrigan- do EE-GM3 e EE-GMI ou EE-GM2 podem ser tratadas com os seguintes inseticidas, herbicidas ou fungicidas ou sementes de soja abrigando EE- GM3 e EE-GMI ou EE-GM2 podem ser revestidas com um revestimento de semente compreendendo os seguintes inseticidas, herbicidas ou fungicidas: 10 Herbicidas de soja: Alaclor, Bentazona, Trifluraiina, CIorimuron-Etil, Cloransulam- Metil, Fenoxaprop, Fomesafen, Fluazifop, Glifosato, lmazamox, Imazaquin, lmazethapir, (S-)Metolac!or, Metribuzin, Pendimetalina, Tepraloxidim, lsoxa- flutol, Glufosinato. 15 lnseticidas de soja: . Lambda-cihalotrin, Metomil, Paration, Tiocarb, lmidacloprid, Clo- tianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Flubendiamide, Rinaxipir, Ciazipir, Spinosad, Spinotoram, Emamectin-8enzoato, Fipronil, Etiprole, Deltametrin, f3-Ciflutrin, gamma e lambda Cihalotrin, 4-[[(6- 20 C|orpiridin-3-i|)meti|](2,2-dif|uoreti|)amino]furan-2(5H)-on, Spirotetramat, Spi- nodiclofen, Triflumuron, Flonicamid, Tiodicarb, beta-Ciflutrin.
Fungicidas de soja: Azoxistrobin, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostro- bin, Tebuconazol, Trifloxistrobin, Protioconazol, Tetraconazol. 25 Os seguintes exemplos descrevem a identificação de eventos e- Iite EE-GM3, EE-GMI e EE-GM2 e de plantas contendo um conjunto de e- vento EE-GM3 com EE-GMI ou EE-GM3 com EE-GM2 e o desenvolvimento de ferramentas para a identificação especifica do evento elite EE-GM3, EE- GMl ou EE-GM2 e conjuntos dos mesmos em amostras biológicas. 30 Salvo declarado de outra forma nos Exemplos, todas as técnicas recombinantes são conduzidas de acordo com protocolos padrões em "Sambrook J and Russell DW (eds-) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory
W e
T 64/118 .
Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York" e em "Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K (eds-) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York". 5 Os materiais padrões e referências são descritos em "Croy RDD (ed.) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BlOS Scientific Publishers Ltd., Oxford and Blackwell Scientific Publications, Oxford" e em "Brown TA, (1998) Molecular Biology LabFax, 2nd Edition, Academic Press, San Diego". Mate- riais padrões e métodos para reações em cadeia de polimerase (PCR) po- lO dem ser encontrados em "McPherson MJ and MOller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford" e em "PCR Applications Manual, 3rd Edition (2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim or www.roche-appíied-science.com". É entendido que um número de parâmetros em qualquer proto- 15 colo de laboratório como os Protocolos PCR nos Exemplos abaixo pode ne- ' cessitar de ajuste para condições especificas de laboratório, e podem ser ligeiramente modificados para obter resultados semelhantes. Por exemplo, o r uso de um método diferente para preparação de DNA ou a seleção de outros iniciadores em um método PCR pode ditar outras condições ideais para o 20 protocolo PCR. Estes ajustes, no entanto, serão aparentes a um especialista na técnica, e são, além disso, detalhados nos manuais de aplicação de PCR atuais. Na descrição e exemplos, a referência é feita às seguintes se- quências: 25 SEQ ID No. 1 : Sequência de nucleotídeo de fragmento Sall de vetor pSFlO. SEQ ID No. 2: Sequência de nucleotídeo compreendendo a re- gião de flanqueamento 5' de DNA estrangeiro compreendendo o gene de tolerância a herbicidas em EE-GM3- 30 SEQ ID No. 3: Sequência de nucleotídeo compreendendo a re- gião de flanqueamento 3' de DNA estrangeiro compreendendo o gene de tolerância a herbicidas em EE-GM3.
b q N 65/118
E SEQ ID No. 4: iniciador SOY028 SEQ ID No. 5: iniciador SOY029 SEQ ID No. 6: iniciador SMP187 SEQ ID No. 7: iniciador STVO19 5 SEQ ID No. 8: Sequência de nucleotídeo de amplicon SEQ ID No. 9: iniciador 1 para amplificação de fragmento contro- le (SOYOl) SEQ ID No. 10: iniciador 2 para amplificação de fragmento con- trole (SOY02) 10 SEQ ID No. 11: Sequência de nucleotídeo de pB2/P35SAcK SEQ ID No. 12: Sequência de nucieotídeo compreendendo a re- gião de flanqueamento 5' do DNA estrangeiro em EE-GMI SEQ ID No. 13: Sequência de nucleotideo compreendendo a re- gião de flanqueamento 3' do DNA estrangeiro em EE-GMI 15 SEQ ID No. 14: Sequência de nucleotídeo compreendendo a re- gião de flanqueamento 5' do DNA estrangeiro em EE-GM2 SEQ ID No. 15: Sequência de nucleotídeo compreendendo a re- gião de flancjueamento 3' dQ DNA estrangeiro em EE-GM2 SEQ ID No. 16: iniciador SOY06 20 SEQ ID No. 17: iniciador SOY07 SEQ ID No. 18: iniciador SOY09 SEQ ID No. 19 iniciador SOYOlO SEQ ID No. 20: sequência de nucleotídeo de um DNA estrangei- ro e sequência de flanqueamentos da planta em EE-GM3 25 SEQ ID No. 21: iniciador SHA 130 SEQ ID No. 22: iniciador SHA 178
1. Transformação de Glycine max com genes de tolerância a herbicida. 30 1.1. Descrição de DNA estrangeiro compreendendo os genes quiméricos 2mEPSPS e HPPD-PFW336 Plasmídeo pSFlO é um vetor de clonagem derivado pUC 19 que contém um gene quimérico lmepsps e um gene quimérico hppd-Pf-W336 localizado em um fragmento Sall de cerca de 7,3 kb.
Uma descrição total do DNA compreendida en'tre os sÍtios de restrição Sail é fornecido na Tabela 1 abaixo.
A sequência de nucleotideo é representada na SEQ ID No. 1. Tabela 1. Posições de nucleotídeo de DNA compreendido entre os sítios de restrição Sall de pSFlO (SEQ ID No 1) Posições de Orientação Descrição e referências nucleotídeos 188-479 complemento 3' nos: sequência incluindo a região 3' não traduzida do gene nopalina sintase de T- DNA de pT1T37 de Agrobacterium tumefaci- ens (Depicker et al., 1982, Joumai of Mole- cular and Applied Genetics, 1, 561-573) 480-1556 complemento hppdPf W336: a sequência de codificação de 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase de Pseudon7onas f/uorescens cepa A32 mod ifi- , cada pela substituição do aminoácido GIici- na 336 por um triptofano, conforme descrito por Boudec et al., (2001) Patente US 624596881 1557-1982 complemento TPotp Y: sequência de codificação de um derivado de peptídeo de transito otimizado (posição 55 alterada em Tirosina), contendo | sequência dos genes de subunidade pe- ) quena Ru8isCO de Zea mays (milho) e He- l (ianthus annuus (girassol), conforme descri- J to por Lebrum et al. (1996) US5510471
1929-2069 complemento I 5'tev: sequência incluindo a sequência líder I do vírus do tobacco etch conforme descrito I por Carrington and Freed (1990) Journal of ! Virology, 64, 1590-1597
2070-3359 complemento I Ph4a748 ABBC: sequência incluindo a regi-
% b 67/118
K Posições de Orientação Descrição e referências nucleotídeos í ão promotora do gene da Histona H4 de Arabidopsis thaliana, contendo uma dupli- cação intema (Chabouté et al., 1987), Plant í Molecular Biology, 8, 179-191.
3360-4374 Ph4a748:sequência incluindo a região pro- motora do gene da Histona H4 de Arabi- dopsis thaliana (Chabouté et al., 1987), Plant Molecular Biology, 8, 179-191. 4375-4855 intronl h3At: primeiro intron do gene ll da histona H3.1II variante de Arabidopsis thali- ana (Chabouté et al., 1992), Joumal od Mo- _ lecular Biology, 225, 569-574 4856-5227 TPotp C: sequência de codificação do pep- tideo de transito otimizado, contendo se- ~ quência de genes de subunidade pequena Ru8isCO de Zea mays (milho) e Helianthis : annuus (girassol) conforme descrito por Le- brun et al. (1996) US5510471 5228-6565 2rnepsps: a sequência de codificação do duplo mutante 5-enol-piruvilsikimate-3- fosfato gene sintase de Zea mays (milho) (Lebru et al., 1997) WO9704103-A1. 6566-7252 3'histonAt: sequência incluindo a região 3' não traduzida do gene histona H4 de Arabi- dopsis thaliana (Chabouté et al., 1987) Plant Molecular Biology, 8, 179-191.
1.2. Evento EE-GM3 O fragmento purificado em HPLC linearizado de Sall pSFlO de cerca de 7,3 kb (contendo o gene de tolerância a 2mEPSPS glifosato e o gene de tolerância inibidor de HPPD HPPD-Pf- \N336) foi usado para obter
PP , 68/118 as plantas de soja transformadas por meios de transferência de gene direto nas células de soja tipo jack (Nickell, C. D., G. R. Noel, D. J. Thomas, and R. Waller. Registro da soja 'jack'. Crop Sci 1365. 30.1990), seguido por re- generação de células de planta transformação em plantas de soja transgêni- 5 cas férteis.
1.2.1 ldentificação do evento elite EE-GM3 Evento elite EE-GM3 foi selecionado baseado em um procedi- mento de seleção extensivo em boa expressão e estabilidade dos genes de tolerância a herbicida, e sua compatibilidade com características agronômi- lO cas ideais como altura da planta, altura para o nó, suporte, vigor, rendimento de semente, foram avaliados. Plantas de soja contendo este evento foram selecionadas a partir de uma ampla faixa de diferentes eventos de transfor- mação obtidos usando os mesmos genes quiméricos. Os parâmetros usados na seleção deste evento foram: a) tolerância aceitáve! à isoxaflutol aplicação 15 de herbicida em campos, b) tolerância aceitável à glifosato aplicação de her- " bicida em campos de ensaio, C) tolerância aceitável à aplicação combinada de isoxaflutol e herbicidas glifosato em campos de ensaio, d) uma inserção 0 dos transgenes de tolerância a herbicida em um local único no genoma da planta de soja, com ausência de estrutura do vetor, e) agronomia geral se- 20 melhante às plantas parentais usadas para transcrição (maturidade, depósi- to, susceptibilidade de doença, etc.), e 'n sem arraste de rendimento signifi- cativo causada pela inserção de DNA de transformação (como comparado a uma linhagem isogênica sem o evento, como a linhagem de planta usada para transformação, crescida nas mesmas condições)- 25 Na geração T3, uma linhagem homozigota da transformação de soja evento EE-GM3 foi selecionado para a produção de semente. Estudos de campo agronômico replicados em vários locais foram conduzidos nas regiões de adaptação da variedade parental, Jack. As avaliações de campo inclulam desempenho agronômico e tolerância a herbicida. Desempenho 30 agronômico de plantas contendo EE-GM3 foi encontrado comparável ao jack (quando nenhum herbicida foi aplicado). As avaliações de campo também mostraram que plantas trans-
0 á
69/118 portando o evento EE-GM3 têm: - características de morfologia e sementes de vegetais seme- lhantes em relação a Jack, - nenhuma mudança em resposta às doenças de soja em com- 5 paração com jack, e - nenhuma alteração na germinação de sementes ou dormência em comparação com jack.
Semente (geração Tl ou Sl) colhida a partir de planta de trans- formante inicial (TO) (a planta transformada com o constructo de modo a 10 produzir evento EE-GM3) na estufa foi plantada no campo.
Três blocos fo- ram plantados e pulverizados com 0, 2 ou 4 kg por hectare de glifosato.
Se- mente foi colhida de plantas que demonstram o nivel desejado de tolerância ao herbicida glifosato.
Sementes (geração de T2) colhidas auto polinizaram planas Tl 15 cultivadas no campo foram semeadas "p/ant por fila". Análise de quiquadra-
- do de dados de segregação de linhas (total ou parcialmente tolerantes) e das plantas individuais dentro das filas (tolerantes ou sensíveis) demonstra a herança mendeliana esperada de uma inserção única para EE-GM3. Seleção e sementes aumentam continuado até que uma linha- 20 gem foi determinada ser homozigoto para evento de transformação EE-GM3 e selecionada para a produção de sernentes de núcleo na quarta geração- Em seguida, sementes de geração T5 serviram como candidatas para o de- senvolvimento de variedades diferentes.
Plantas na sexta geração (geração de T6) foram cruzadas com linhagens reprodutoras de soja convencional em 25 um programa de introgressão projetado para mover o evento em uma base mais ampla de germoplasma de soja comercial.
Centrais híbridas Fl (linha- gens EE-GM3 x linhagens convencionais) cresceram até a maturidade e a semente F2 foi plantada.
Amostras de folha de plantas 901 F2 foram anali- sadas por iniciadores de PCR projetados para identificar o homozigoto da 30 inserção EE-GM3, A proporção esperada de 1:2:1 para uma inserção segre- gação única pelas regras de Mendel foi observada.
O evento EE-GM3 selecionado foi introduzido em diferentes fun-
$ X
70/118 dos genéticos comerciais, e os resultados dos campos de estudo em diferen- tes locais foram comparados.
As plantas foram desafiadas com herbicida glifosato e/ou herbicida isoxaflutol usando diferentes tratamentos.
As plantas exibiram boa tolerância a herbicida.
Centenas de cultivares de soja diferen- 5 tes contendo evento EE-GM3 foram utilizadas em um estudo de herança, e herbicidas foram aplicados.
As linhagens selecionadas do presente ensaio mais tarde foram aumentadas em campo e ainda tratadas com herbicida.
A partir desse julgamento, 50 linhagens selecionadas foram aumentadas e es- tas também foram tratadas com herbicida.
Os escores de fitotoxicidade para
10 as últimas Iinhagens pulverizadas com isoxaflutol e glifosato mostrou alguma variabiiidade na resposta, mas a faixa de respostas entre as linhagens refle- tiu variabilidade semelhante conforme observado em 4 replicações do even- to EE-GM3 no backgroung original Jack, cultivado sob o mesmo tratamento e as condições ambientais.
Assim, à tolerância a herbicidas relevantes em 15 uma ampla variedade de germoplasma foi observada para plantas compre- " endendo EE-GM3. Além disso, plantas que contêm o evento EE-GM3 tinham folha normal, flor e morfologia de vagem, excelente fertilidade e não mostrou ne- nhuma doença ou suscetibilidade anormal a inseto em vários fundos genéti-
20 cos.
Durante a introgressão em vários fundos genéticos nenhum problema aberrante ou anormalidade foi observado.
Em uma temporada, um estudo de 10 localizações foi projetado para comparar o desempenho agronômico de tolerância dupla de soja a her- bicida compreendendo evento de transformação EE-GM3 para a transforma-
25 ção da variedade parental, Jack e algumas variedades de soja não- transgênicas.
Usando um design de bloco completo randomizado, plantas EE-GM3 foram cultivadas em parcelas replicadas com controle convencional de ervas ou com herbicidas destinados, glifosato e isoxaflutol.
Parcelas com plantas de soja que contêm evento de transformação EE-GM3 foram pulveri-
30 zadas com herbicida isoxaflutol em uma taxa-alvo de 70 gramas ai/Ha e her- bicida glifosato em uma taxa-alvo de 1060 gramas ai/Ha.
Aplicação de herbi- cida foi feita para estas plantas como uma pulverização foliar sobre o estágio de crescimento de planta V4-V5. Observações agronômicas foram feitas no início, meio e fica da temporada.
A densidade de plantas (parâmetro; conta- gem de suporte) foi maior para Jack e parcelas da variedade não Éransgêni- ca do que em partes do evento EE-GM3 por um desvio-padrão.
A diferença 5 de contagem de suporte inicial pode ter o resultado de qualidade de lote se- mente, conforme a semente de plantio EE-GM3 foi produzida em balcão de viveiro de temporada, enquanto a semente das variedades não transgênicas foi produzida na temporada de produção normal nos EUA.
No entanto, o número de dias para atingir 50% de emergência e as classificações de vigor 10 de pIanta foram os mesmos, indicando que os lotes de semente foram com- paráveis para esses parâmetros de desempenho.
Nas contagens de suporte ao fim da temporada, jack e as variedades não transgênicas permaneceram diferentes por um desvio-padrão de pIantas de EE-GM3. Rendimentos do lote de evento EE-GM3 de plantas foram também inferiores a Jack por um 15 desvio-padrão, talvez um resultado de densidade de planta inferior dos Iotes " de evento EE-GM3. O rendimento das variedades não transgênicas foi mais do que jack como se poderia esperar por causa do avanço no rendimento - potencial encontrado em variedades mais recentes.
Em um estudo, as taxas de saúde da planta foram feitas em três 20 fases de crescimento: V4-5, RÍ e maturidade cheia.
A primeira avaliação foi logo após a aplicação de herbicida destinado.
No momento da avaliação de saúde final da planta, as plantas contendo EE-GM3 pulverizadas com dois herbicidas tinham a mesma pontuação que as plantas Jack não pulverizadas ou plantas não pulverizadas compreendendo EE-GM3. Em classificações 25 pelo pessoal da agronomia, as plantas pulverizadas com herbicida recebe- ram uma classificação de saúde de 3-4. (lesão moderada) em V4-5 e fases de crescimento de pianta de Rl.
As plantas não pulverizadas (jack não transformada ou plantas de soja contendo EE-GM3) foram classificadas co- mo 4,6-4.8 (classificação 5 não indica nenhuma lesão). A classificação de 30 saúde final da planta, todas as parcelas receberam a mesma classificação de 5 (sem prejuízo). Uma temporada de estudo foi uma de chuvas excepcionais e Ie-
{ 0
72/118 são de cultura nas plantas EE-GM3 após o herbicida destinado foi mais evi- dente do que as observadas em outras estações.
As avaliações de campo também incluem monitoramento das características de aptidão (reprodução, resistência a doenças, fecundidade, dispersão de sementes, dormência, 5 persistência). Para as características reprodutivas; dias para emergência, dias para 50% de floração e dias para 90% amadurecimento de vagens, plantas EE-GM3 e jack não eram diferentes.
Nenhuma diferença foi obser- vada na reação a infestações naturais de doenças das plantas e pragas de insetos.
Embora EE-GM3 produziram menos rendimento final do que Jack, 10 nenhuma diferença na fecundidade (peso de 100 sementes) foi encontrada.
A avaliação dos parâmetros de dispersão de sementes (vagem quebrada e depósito da planta) demonstrou que EE-GM3 e Jack tiveram a mesma clas- sificação de vagem quebrada, mas demonstrou que as plantas EE-GM3 fo- ram menos propensas a depósito.
Avaliação de sementes colhidas dos 10 15 locais encontrados sem preocupações levantadas por teste de germinação
' ou dormência.
Nestes ensaios durante a temporada com chuvas excepcionais, o rendimento final de plantas EE-GM3, independentemente do tratamento de controle de ervas daninhas, foi menor do que o rendimento de Jack por um 20 desvio-padrão (talvez um resultado de menor densidade de plantas das par- celas de evento EE-GM3). Na estação excepcionalmente úmida, a lesão à cultura (branqueamento em 10-30% da área de cultura) foi relatada para lo- tes de EE-GM3 até seis semanas após a aplicação foliar dos herbicidas gli- fosato e isoxaflutol.
No entanto, por maturidade, as classificações de saúde 25 de planta "sem lesão" foram designadas para todos os lotes.
Estudos de campo replicados em vários locais com EE-GM3 introgrediram em fundo de cultivar de soja elite, quando comparado a linhagens irmãs quase isogênicas não contendo os transgene, são esperados demonstrar nenhuma diferença de rendimento entre plantas contendo evento EE-GM3 e as (inhagens quase 30 isogênicas (na ausência de tratamento herbicida)- Além disso, em um estudo de campo replicado, a tolerância sig- n ificativa da cuitura (branqueamento de menos de 10%) foi demonstrada em plantas de soja comprêendendo EE-GM3 quando tratadas com IFT pré- ou pós-emergência (70 gr ai/ha com 0,5% NlS, Agridex), mas ainda tolerância da cultura significativa (branqueamento de menos do que 10 °/0) foi encon- trado em plantas de soja compreendendo EE-GM3 quando tratadas com 5 aplicação pós emergência de pirasulfotol (35 gr ai/ha com 0,5 °/0 NIS, Agri- dex). outro herbicida inibidor de HPPD.
1.2.2 Identificação de regiões de flanqueamento e DNA estran- geiro do evento elite EE-GM3 A sequência de regiões de flanqueamento do DNA estrangeiro 10 compreendendo o gene de tolerância a herbicidas no evento elite EE-GM3 foi determinado como a seguir:
1.2.2.1. Região de flanquemanto direita (5') O fragmento identificado conforme compreendendo a região de flanqueamento 5' foi sequenciado e sua sequência de nucleotídeo é repre- 15 sentada na SEQ ID No. 2. A sequêr)cia entre nucleotÍdeo 1 e 1451 corres- " ponde ao DNA de planta, enquanto a sequência entre nucleotídeo 1452 e 1843 corresponde ao DNA estrangeiro.
1.2.2.2. Região de flanqueamento esquerda (3') O fragmento identificado conforme compreendendo a região de 20 flanqueamento 3' foi sequenciada e sua sequência de nucleotideo é repre- sentada na SEQ ID No. 3. A sequência entre nucleotídeo 1 e 240 correspon- de ao DNA estrangeiro, enquanto a sequência entre nucleotldeo 241 e 1408 corresponde ao DNA de planta-
1.2.2.3. DNA estrangeiro compreendendo o gene de tolerância a 25 herbicidas em EE-GM3. Usando diferentes técnicas moleculares, foi determinado que o DNA estrangeiro do evento elite EE-GM3 compreendendo o gene de tole- rância a herbicidas contém duas sequências parciais 3' histonAt em uma orientação cabeça a cabeça, seguido por 2 cópias quase completas de 30 fragmento Sall de pSFlO organizado na orientação cabeça a cauda (vide Figura 1). O DNA estrangeiro compreendendo o gene de tolerância a her-
74./118 bicidas de EE-GM3 assim con'tém em ordem as seguintes sequências: - do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 199: a sequência de nucleotí- deo correspondendo ao complemento da sequência de nucleotideo de SEQ 1D1apartirdent6760aont6958; 5 - do nucleotídeo 200 ao nucleotídeo 624: a sequência de nucleo- tídeo correspondendo à sequência de nucleotideo de SEQ ID 1 a partir de nt 6874 ao nt 7298; - do nucleotídeo 625 ao nucleotídeo 7909: a sequência de nu- cleotídeo correspondendo à sequência de nucleotideo de SEQ ID 1 a partir dent7aont7291; - do nucleotídeo 7910 ao nucleotideo 15163: a sequência de nu- cleotídeo correspondendo à sequência de nucleotídeo de SEQ ID 1 a partir de nt12 ao nt7265; e - do nucleotídeo 15164 ao nucleotídeo 15187: a sequência de nucleotídeo correspondendo à sequência de nucleotídeo de SEQ ID 3 a par- tir de nt 217 ao nt 240 (esta sequência não corresponde ao DNA de plasmí- deo pSFlO ou wt DNA de planta e portanto é designado DNA filler). Este DNA estrangeiro é precedido imediatamente a montante e contíguo com o DNA estrangeiro por 5' sequência de flanqueamento de SEQ ID No 2 do nucleotídeo 1 a 1451 e é seguido imediatamente a jusante e con- tíguo com o DNA estrangeiro por 3' sequência de flanqueamento de SEQ ID No 3 do nucleotídeo 241 ao nucleotídeo 1408. Confirmado sequenciamento de DNA completo do DNA estran- geiro e sequências de flanqueamento de DNA em EE-GM3 resultou em uma sequência reportada na SEQ ID No. 20. Nesta sequência, o DNA inserido é do nucleotideo da posição 1452 ao nucleotídeo da posição 16638, e as 2 cópias quase completas de pSFlO organizadas em uma orientação cabeça a cauda são do nucleotídeo da posição 2257 ao nucleotídeo da posição
16601. A sequência de DNA de flanqueamento 5' na SEQ ID No. 20 é a se- quência do nucleotídeo da posição 1 ao nucleotídeo da posição 1451 na SEQ ID No. 20, e a sequência de DNA de flanqueamento 3'na SEQ ID No. 20 é a sequência do nucleotídeo da posição 16639 ao nucleotideo da posi-
ção 17806 na SEQ ID No. 20.
1.3. Descrição de DNA estrangeiro compreendendo os genes quiméricos fosfinotriciaalcetiltransferase Plasmídeo pB2 P35SACK é um vetor de clonagem pUC19 deri- 5 vado que contém um gene pat quimérico. Uma descrição do vetor é dado na Tabela 2 abaixo. A sequência de nucleotideo da mesma é representada na SEQIDNo.11.
Tabela 2. Posições de nucleotídeo de constituintes de pB2/P35SAcK (SEQ , ID No 11) I Posições de nucleotídeo Descrição e referências I 461-1003 _ . Promotor 35S de vÍrus do mosaico da couve-flor k ) 1004-1011 Sequências derivadas de poliligante sintético I 1012-1563 Gene pat sintético (sequência de aminoácido de Streptomyces_vjrI"doch/"omogenes) ! 1564-1581 Sequências derivadas de poliligante s i,ntético 0 I 1582-1784 Terminador 35S do vírus do mosaico de couve- flor
K 10 1.4. Evento EE-GMI
1.4.1 ldentificação de EE-GMI soja resistente a herbicida foi desenvolvida por transformação de soja com vector pB 2/P35SACK usando transferência de gene direta.
Evento elite EE-GMI foi selecionado baseado em um procedi- 15 mento de seleção extensivo em boa expressão e estabilidade dos genes de tolerância a herbicida, e sua compatibilidade com características agronômi- cas ideais.
1.4.2 ldentificação de regiões de flanqueamento e DNA estran- geiro do evento elite EE-GMI 20 1.4.2.1- Região de flanqueamento direita (5') O fragmento identificado conforme compreendendo a região de flanqueamento 5' foi sequenciada e sua sequência de nucleotídeo é repre- sentada na SEQ ID No. 12. A sequência entre nucleotídeo 1 e 209 corres- ponde ao DNA de pfanta, enquanto a sequência entre nucleotídeo 210 e 720 corresponde ao DNA estrangeiro.
1.4.2.2. Região de flanqueamento esquerda (3') O fragmento identificado conforme compreendendo a região de flanqueamento 3' foi sequenciada e sua sequência de nucleotídeo é repre- 5 sentada na SEQ ID No. 13. A sequência entre nucleotideo 1 e 568 corres- ponde ao DNA estrangeiro, enquanto a sequência entre nucleotídeo 569 e 1000 corresponde ao DNA de pianta.
1.4.2.3. DNA estrangeiro compreendendo o gene de tolerância a herbicidas em EE-GMI. 10 Usando diferentes técnicas moleculares, foi determinado que o DNA estrangeiro de evento elite EE-GMI compreendendo o gene de tole- rância a herbicida compreende duas cópias de gene quimérico pat em uma estrutura de repetição direta (vide figura 3). O DNA estrangeiro compreendendo o gene de tolerância a her- 15 bicidas de EE-GMI assim contém em ordem as seguintes sequências: '" - do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 3122: a sequência de nucleo- tídeo correspondendo à sequência de nucleotídeo de SEQ ID 11 a partir de nt 340 ao nt 3461; - do nucleotÍdeo 3123 ao nucleotídeo 3458: a sequência de nu- 20 cleotideo correspondendo ao o complemento da sequência de nucleotídeo deSEQlD11apartirdent1ant336; - do nucleotideo 3459 ao nucleotídeo 4073: a sequência de nu- cleotideo correspondendo ao o complemento da sequência de nucleotídeo deSEQlD11apartirdent3462aont4076;e 25 - do nucleotídeo 4074 ao nucleotideo 6780: a sequência de nu- cleotideo correspondendo à sequência de nucleotídeo de SEQ ID 11 a partir de nt 337 ao nt 3043: e - do nucleotídeo 6781 ao nucleotídeo 6790: a sequência de nu- cleotídeo correspondendo à sequência de nucleotídeo de SEQ ID 13 a partir 30 de nt 559 ao nt 568 (esta sequência não corresponde plasmídeo de DNA ou wt DNA de planta e, portanto, é designado enchimento de DNA). Este DNA estrangeiro de EE-GMI é precedido imediatamente a b t 77/118
P montante e contiguo com o DNA estrangeiro na sequência de flanqueamen- to 5' de SEQ ID No 12 do nucleotídeo 1 a 209 e é seguido imediatamente a jusante e contíguo com o DNA estrangeiro na sequência de flanqueamento 3' de SEQ ID No 13 do nucleotídeo 569 ao nucleotídeo 1000- 5 1.5. Evento EE-GM2 soja resistente a herbicida foi desenvolvida por transformação de soja com vector pB pB2/P35SAcK usando transferência de gene direta. Evento elite EE-GM2 foi selecionado baseado em um procedi- mento de seleção extensivo em boa expressão e estabilidade dos genes de 10 tolerância a herbicida, e sua compatibilidade com características agronômi- cas ideais.
1.5.1. ldentificação de regiões de flanqueamento e DNA estran- geiro do evento elite EE-GM2
1.5.1.1. Região de flanqueamento direita (5') 15 O fragmento identificado conforme compreendendo a região de ." flanqueamento 5' foi sequenciada e sua sequência de nucleotídeo é repre- sentada na SEQ ID No. 14. A sequência entre nucleotídeo 1 e 311 corres- ponde ao DNA de planta, enquanto a sequência entre nucleotídeo 312 and 810 corresponde ao DNA estrangeiro. 20 1.5.1.2. Região de flanqueamento esquerda (3') O fragmento identificado conforme compreendendo a região de flanqueamento 3' foi sequenciada e sua sequência de nucleotideo é repre- sentada na SEQ ID No. 15. A sequência entre nucleotídeo 1 e 507 corres- ponde ao DNA estrangeiro, enquanto a sequência entre nucleotídeo 569 e 25 1880 corresponde ao DNA de planta.
1.5.1.3. DNA estrangeiro compreendendo o gene de tolerância a herbicidas em EE-GM2. Usando diferentes técnicas moleculares, foi determinado que o DNA estrangeiro de evento elite EE-GM2 compreendendo o gene de tole- 30 rância a herbicida compreende uma cópia de gene quimérico pat (vide Figu- ra 4). O DNA estrangeiro compreendendo o gene de tolerância a her-
bicidas de EE-GM2 assim contém em ordem as seguintes sequências: - do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 391: a sequência de nucleotí- deo correspondendo à sequência de nucleotídeo de SEQ ID 11 a partir de nt 3458 ao nt 3848; e 5 - do nucleotideo 392 ao nucleotídeo 3436: a sequência de nu- cleotídeo correspondendo à sequência de nucleotideo de SEQ ID 11 a partir dent413aont3457; Es'te DNA estrangeiro de EE-GM2 é precedido imediatamente a montante e contíguo com o DNA estrangeiro na 5' sequência de flanquea- lO mento de SEQ ID No 14 do nucleotídeo 1 a 311 e é seguido imediatamente a jusante e contíguo com o DNA estrangeiro na sequência de flanqueamento 3' de SEQ ID No 15 do nucleotideo 508 ao nucleotideo 1880.
2. Desenvolvimento de Protocolos de ldentificação de Reação em Cadeia da Polimerase para EE-GM3. 15 2.1. ln iciadores . lniciadores especificos foram desenvolvidos que reconhecem as sequências dentro do evento elite. . Um iniciador foi desenvolvido que reconhece uma sequência dentro de região de flanqueamento 3' de EE-GM3. Um segundo iniciador foi 20 então selecionado dentro da sequência do DNA estrangeiro de modo que os iniciadores tem o lapso dé uma sequência de cerca de 263 nucleotídeos. Os seguintes iniciadores demonstraram conferir resultados particularmente cla- ros e reproduzíveis em uma reação de PCR em EE-GM3' DNA: SOY028: 5'-ATC.gCT.TTA.ACg.TCC.CTC.Ag -3 (SEQ ID No.: 4) 25 (alvo: inserto DNA) SOY029: 5'-CAA.ggC.CTC.gAg.ATT.ATC -3' (SEQ ID No.: 5) (aívo: DNA de planta) Os iniciadores marcando uma sequência endógena são prefe- rencialmente incluídos no coquetel PCR. Estes iniciadores servem como um 30 controle intemo em amostras desconhecidas e no controle positivo de DNA. Um resultado positivo com o par endógeno de iniciadores (presença de um fragmento amplificado em PCR de 413 pb) demonstra que há um DNA am-
a : q 79/118
W plo de qualidade adequada na preparação de DNA genômico para um pro- duto de PCR a ser gerado. Os iniciadores endógenos foram selecionados para reconhecer o gene endógeno da soja actin, SOYOl 5'-gTC.AgC-CAC.ACA.gTg.CCT.AT -3' (SEQ ID No.: 9) 5 SOY02 5'-gTT. ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.ee -3' (SEQ ID No.: 10)
2.2, Fragmentos amplificados Os fragmentos amplificados esperados na reação de PCR são: Para par de iniciador SO YOl -SOY02 : 413bp (controle endóge- no) 10 Para o par de iniciador SOY028-SOY029: 263bp (EE-GM3 even- to elite)
2.3. Molde de DNA Molde de DNA foi preparado a partir de umas folhas de acordo com Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, pI349, 1991). Quando usan- 15 do DNA preparado com outros métodos, um teste realizado utilizando quan- -" tidades diferentes de molde deveriam ser feitos. Geralmente 50 ng de molde de DNA genômico rende os melhores resultados.
2.4. Controles positivo e negativo designados Para evitar falsos positivos ou negativos, foi determinado que os 20 seguintes controles positivos e negativos deveriam estar incluídos em uma corrida de PCR: - Controle Master Mix (DNA controle negativo). Isto é um PCR em que nenhum DNA é adicionado à reação. Quando o resultado esperado, nenhum produto de PCR é observado isto indica que o coquetel PCR não 25 estava contaminado com DNA alvo. - um controle positivo de DNA (amostra de DNA genômico co- nhecido por conter as sequências transgênicas). Amplificação bem-sucedida de deste controle positivo demonstra que o PCR correu em condições que permitem a amplificação de sequências-alvo. 30 - Controle de DNA de tipo selvagem. lsto é um PCR em que o molde de DNA fornecido é DNA genômico preparado a partir de uma planta não transgênica. Quando o resultado esperado, nenhuma amplificação de
R k 80/118 & um produto de PCR transgene, mas a amplificação do produto PCR endó- geno, é observado isto indica que não há amplificação de fundo de transge- ne detectável em uma amostra de DNA genômico.
2.5. Condições de PCR 5 Resultados ideais foram obtidos nas seguintes condições (ao descrever as várias condições para os resultados ideais, pretende-se forne- cer exemplos de ditas condições. Claramente um especialista na técnica poderia variar as condições, reagentes e parâmetros como usando outras Taq polimerases, e obter os resultados desejáveis): 10 - A mistura PCR para reações de 25µ1 contém: 20 ng molde de DNA 2,5 µ1 lOx Tampão de amplificação (fornecido pelo fabricante com a Taq polimerase) 0,5 µ110 mMdNTP's 15 0,4 µ1 SOYOl (1Opmoles/µl) -" 0,4 µ1 SOY02 (1Opmoles/µl) 0,7 µ1 SOY028 (1Opmoles/µl) . 0,7 µ1 SOY029 (1Opmoles/µl) 0,1 µ1 Taq DNA polimerase (5 unidades/µl) 20 Água até 25 µ1 O perfil de termociclagem a ser seguido para resultados ideais é o seguinte 4 min. a 95°C Seguido por: 1 min. a 95°C 25 1 min. a 57"C 2 min. a 72°C Para 5 ciclos Seguido por: 30 seg. a 92°C 30 seg. a 57°C 30 1 min. a 72°C Para 25 ciclos Seguido por: 10 minutos a 72°C
K $ r 81/118 b
2.6. Análise em gel de agarose Para idealmente visualizar os resultados do PCR foi determinado que entre 10 e 20µ1 das amostras de PCR deveriam ser aplicadas em um gel de agarose 1,5% (tampão Tris-borato) com um marcador de peso mole- 5 cular apropriado (por exemplo, escada lOObp Pharmacia). 2-7- Validação dos resultados Foi determinado que os dados de amostras transgênicas de DNA de planta dentro de uma única corrida de PCR e um único coquetel de PCR deveria não ser aceitável e menos que 1) o controle positivo de DNA 10 mostra os produtos de PCR esperados (fragmentos transgênicos e endóge- nos), 2) controle negativo de DNA é negativo para amplificação de PCR (sem fragmentos) e 3) o controle de DNA tipo selvagem mostra o resultado esperado (amplificação de fragmento endógeno). Quando seguindo o Protocolo de ldentificação de PCR para EE- 15 GM3 conforme descrito acima, pistas mostrando quantidades visíveis dos produtos de PCR transgênicos e endógenos dos tamanhos esperados, indi- cam a pIanta correspondente da qual o molde de DNA genômico foi prepa- rado, herdou o evento elite EE-GM3. As pistas nào mostrando quantidades visíveis de produtos de PCR transgênicos e mostraram quantidades visíveis 20 de produto de PCR endógeno, indicam que a planta correspondente do quai o molde genômico de DNA foi preparado, não compreende o evento elite. Pistas que não mostram quantidades visíveis de produtos de PCR endóge- nos e transgênicos indicam que a qualidade e/ou quantidade de DNA genô- mico não permite que um produto de pcr seja gerado. Estas plantas não 25 podem ser classificadas. A preparação de DNA genômico deveria ser repeti- da e uma nova corrida de PCR, com os controles apropriados, deve ser rea- lizada.
2.8, Uso de protocolo de PCR discriminador para identificar EE- GM3 30 Antes de tentar triar desconhecidos, uma corrida de teste, com todos os controles apropriados, é realizada. O protocolo desenvolvido pode requerer otimização para componentes que podem diferir entre laboratórios
V 0 82/118 .
(preparação do molde de DNA, Taq DNA polimerase, qualidade dos iniciado- res, dNTP's, termociclador, etc.). A amplificação das sequências endógenas desempenha um pa- pel chave no protocolo. Um deve reter condições de PCR e termociclagem 5 que amplificam quantidades equimolares de ambas as sequências endóge- nas e transgênicas em um molde de DNA genômico transgênico conhecido. Sempre que o fragmento endógeno marcado não é amplificado ou sempre que as sequências marcadas não são amplificadas com as mesmas intensi- dades de coloração de brometo de etídio, conforme julgado por eletroforese 10 em gel, a otimização das condições de PCR podem ser requeridas. Material em folha de um número de plantas de soja, alguns dos qual compreendendo EE-GM3 foram testados de acordo com o protocolo descrito acima. As amostras de evento elite EE-GM3 e de soja tipo selvagem foram tomadas como controles positivos e negativos, respectivamente. 15 A figura 2 ilustra o resultado obtido com o evento elite Protocolo de ldentificação de PCR para EE-GM3 em um número de amostras de plan- tas de soja. As amostras em linhas 2 e 3 demonstraram conter o evento elite © EE-GM3 como a banda de 263 pb é detectada, enquanto as amostras nas Iinhas 4 a 8 não compreendem EE-GM3. Linhas 6 e 7 incluem amostras de 20 outro evento de transformação de soja obtido usando os mesmos genes quiméricos de tolerância a herbicida; a pista 8 contém DNA de tipo selvagem de plantas de soja e pista 9 representa as amostras de controle negativo (água), linhas 1 e 10 representam o marcador de Peso Molecular (escada lOObp). 25 2.9. Ensaio dPCR para detecção de EE-GM3 em sementes vo- lumosas Um ensaio PCR (dPCR) discriminante é configurado para detec- tar a presença de baixo nivel de EE-GM3 sementes volumosas. Um nivel mínimo de 0, 4°/0 (p/p) de sementes transgênicas em um bulk de sementes 30 não transgênicas foi sucessivamente detectado em condições repetíveis. Por conseguinte, o Iimite de detecção é determinado a 0, 4% (p/p)- Os seguintes iniciadores são aplicados nesta reação de PCR al-
lniciador direto marcado para sequência de T-DNA: SHA130 5' - CTA.TAT.TCT.ggT.TCC.AAT.TTA-TC -3' (SEQ ID NO.12)
5 lniciador reverso marcado para sequência de flanqueamento 3': SMP178 5' - TgA.ggC-ACg-TAT.TgA-TgA.CC - 3' (SEQ ID No. 13) O fragmento amplificado esperado na reação de PCR destes ini- ciadoresé115pb. 10 A reação de PCR alvo é realizada em aproximadamente 20Ong do molde de DNA preparado a partir de sementes de terra volumosas de acordo com um kit de extração de purificação Gentra Puregene DNA pela (Qiagen). Quando usando DNA preparado com outros métodos, uma corrida de teste usando amostras com níveis conhecidos relativos de EE-GM3 deve 15 ser realizado.
Uma reação de PCR de sistema de referência validado, objeti- vando uma sequência endógena, deve idealmente ser realizada em uma -J corrida de PCR separada para verificar a adequabilidade da amostra de DNA para análise de PCR para evitar resultados falsos negativos. 20 Para amostras de teste desconhecidas o experimento de PCR deveria ideaimente incluir as amostras de controle positivo e negativo, ou seja: - Con'trole Master Mix (DNA controle negativo). lsto é um PCR em que nenhum DNA é adicionado à reação.
Quando o resultado esperado, 25 (nenhum produto de PCR) é observado para ambas a reação alvo e de sis- tema de referencia isto indica que o coquetel PCR não estava contaminado com DNA alvo. - um controle positivo de DNA (amostra de DNA genômico co- nhecido por conter as sequências transgênicas). Amplificação bem sucedida 30 deste controle positivo demonstra que o PCR correu em condições que per- mitem a amplificação de sequências-alvo. - Ainda um controle de DNA tipo selvagem pode ser adicionado neste PCR.
Isto é um PCR em que o molde de DNA fornecido é DNA genô- mico preparado a partir de uma planta não transgênica.
Quando o resultado esperado, nenhuma amplificação de um produto de PCR transgene mas a amplificação do produto PCR endógeno, é observado isto indica que não há 5 amplificação de fundo de transgene detectável em uma amostra de DNA genômico.
Resultados ótimos são obtidos nas seguintes condições: - A mistura PCR para reações de 25µ1 contém: 200 ng molde de DNA 5 µ1 5x Tampão de reação 0,25 µ1 20 mM dNTP's 0,7 µ1 SHA130 (10pmoles/l) 0,4 µ1 SMP178 (1Opmoles/l) 0,1 µ1 GO-Taq DNA polimerase (5 unidades/l) Adicionar água até 25 µ1 - O perfil de termociclagem a ser seguido para resultados ideais é o seguinte 4 min. a 95°C Seguido por: 1 min a 95°C 1 min. a 57°C 2 min. a 72°C Para 5 ciclos Seguido por: 30 s a 92°C 30 seg. a 57°C 1 min. a 72°C Para 30 ciclos Seguido por: 10 minutos a 72"C Para idealmente visualizar os resultados do PCR foi determinado que 25µ1 do produto de PCR deve ser aplicado em um gel de agarose 1,5°/o (tampão Tris-borato) com um marcador de peso molecular apropriado (por exemplo, escada 50bp). Quando após o método de PCR conforme descrito acima, as pis-
tas mostrando quantidades visíveis do alvo e produtos de PCR de referência do sistetna dos tamanhos esperados indicam que a amostra teste da qual o DNA molde genômico foi preparado, continha niveis de EE-GM3 evento elite acima do limite de detecção da reação alvo. 5 Pistas que não mostram quantidades visíveis de produtos PCR alvo mostrando quantidades vÍsíveis de produto PCR do sistema de referên- cia indicam que a amostra de ensaio da qual foi preparado o DNA genômico molde, continha niveis de EE-GM3 evento elite abaixo do lirnite de detecção da reação de destino. 10 Pistas que não mostram quantidades visíveis de produtos de PCR endógenos e transgênicos indicam que a qualidade e/ou quantidade de DNA genômico não permite que um produto de pcr seja gerado. Estas plantas não podem ser classificadas. A preparação de DNA genômico deveria ser repetida e uma nova corrida de PCR, com os 15 controles apropriados, deve ser realizada.
3. Uso de um fragmento de integração específico como sonda para detecção de material compreendendo EE-GM3. Um fragmento específico de integração de EE-GM3 é obtido por amplificação em PCR usando iniciadores específicos SOY028 (SEQ ID No. 20 4) e SOY029 (SEQ ID No.5 e SEQ ÍD No. 5) gerando um amplicon com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID No 8 ou por sintese química e é mar- cado. Este fragmento de integração é usado como uma sonda específica para a detecção de EE-GM3 em amostras biológicas. Ácido nucleico é extra- Ído das amostras de acordo com procedimentos-padrão. Este ácido nucleico 25 é então contatado com a sonda específica em condições de hibridização que são otimizados para permitir formação de um híbrido. A formação de hibri- dos é detectada, em seguida, para indicar a presença de ácido nucleico EE- GM3 da amostra. Opcionalmente, o ácido nucleico nas amostras é amplifi- cado usando os iniciadores específicos antes de contatar com a sonda es- 30 pecífica. Alternativamente, o ácido nucleico é marcado antes do contato com a sonda especifica ao invés de o fragmento de integração. Opcionalmente, a sonda especifica é Iigada a um veículo sólido (como, entre outros, a um fj]-
È;I0jnE:i tro, tira ou esferas), antes de contatar com as amostras.
4. Protocolo de identificação de Reação em Cadeia de Polimera- se para EE-GMI.
4.1. lniciadores 5 lniciadores específicos foram desenvolvidos que reconhecem as sequências dentro do evento elite. Mais particularmente, um in iciador foi de- senvotvido que reconhece uma sequência dentro da região de flanqueamen- to 5' de EE-GMI. Um segundo iniciador foi então selecionado dentro da se- quência do DNA estrangeiro de modo que os iniciadores tem o lapso de uma 10 sequência de cerca de 183 nucleotídeos. Os seguintes iniciadores demons- traram conferir resultados particularmente claros e reproduzíveis em uma reação de PCR em EE-GMI DNA: SOY06: 5'- ggC.gTT.CgT-AgT-gAC.TgA.gg -3' (SEQ ID No.: 16) (alvo: DNA de planta) 15 SOY07: 5"gTT.TTA.CAA.CgT.CgT.gAC.Tgg-3' (SEQ ID No.: 17) ,- (alvo: inserto DNA) Os iniciadores marcando uma sequência endógena são prefe- rencialmente incluídos no coquete) PCR. Estes iniciadores servem como um controle interno em amostras desconhecidas e no controle positivo de DNA. 20 Um resultado positivo com o par endógeno de iniciadores demonstra que há um DNA amplo de qualidade adequada na preparação de DNA genômico para um produto de PCR a ser gerado. Os iniciadores endógenos foram se- lecionados para reconhecer um gene não destrutivo em Glycine max: SOYOl : 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT-3' (SEQ ID No.: 9) 25 (localizado em gene actin 1 de Glycine max (Acesso JO 1298)) SOY02: 5'-gTT.ACC.gTACAg.gTCjTT.CC-3' (SEQ ID No.: 10) (localizado em gene actin 1 de Glycine max (Acesso JO 1298))
4.2. Fragmentos amplificados Os fragmentos amplificados esperados na reação de PCR são: 30 Para o par de iniciador SOYO1-SOY02: 413bp (controle endóge- m: Para o par de iniciador SOY06-SOY07: 183bp (EE-GMI evento elite)
4.3. Molde de DNA Molde de DNA foi preparado a partir de umas folhas de acordo com Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, pi 1349, 1991). Quando u- 5 sando DNA preparado com outros métodos, um teste realizado utilizando quantidades diferentes de molde deveria ser feito. Geralmente, 50 ng de moide de DNA genômico rendem os melhores resultados.
4.4. Controles positivo e negativo designados Para evitar falsos positivos ou negativos, foi determinado que os 10 seguintes controles positivos e negativos deveriam estar incluídos em uma corrida de PCR: - Con'trole Master Mix (DNA controle negativo). lsto é um PCR em que nenhum DNA é adicionado à reação. Quando o resultado esperado, nenhum produto de PCR é observado isto indica que o coquetel PCR não 15 estava contaminado com DNA alvo.
.* - um controle positivo de DNA (amostra de DNA genômico co- nhecido por conter as sequências transgênicas). Amplificação bem sucedida deste controle positivo demonstra que o PCR correu em condições que per- mitem a amplificação de sequências-alvo. 20 - Controle de DNA de tipo selvagem. lsto é um PCR em que o molde de DNA fomecido é DNA genômico preparado a partir de uma planta não transgênica. Quando o resultado esperado, nenhuma amplificação de um produto de PCR transgene, mas a amplificação do produto PCR endó- geno, é observado isto indica que não há arnplificação de fundo de transge- 25 ne detectável em uma amostra de DNA genômico.
4.5. Condições de PCR Resultados ótimos são obtidos nas seguintes condições: - A mistura PCR para reações de 25 contém:
2.5 µ1 molde DNA 30 2.5 µ1 lOx Tampão de amplificação (fornecido com Taq polime- rase) 0,5µ11OmMdNTP's
0,5 µ1 SOY06 (1Opmo1es/µl) 0,5 µ1 SOY07 (10pmo]es/µ[) 0,25 µ1 SOYOI (1Opmoles/µl) 0,25 µ1 SOY02 (1Opmoles/µl) 0,1 µ1 Taq DNA polimerase (5 unidades/µl) Água até 25 µ1 - O perfil de termociclagem a ser seguido para resultados ideais é o seguinte 4mina95°C Seguido por: 1 min a 95°C 1mina57°C 2mina72°C Para 5 ciclos Seguido por: 30 s a 92°C 30sa57°C 1 min a 72°C Para 25 ciclos Seguido por: 5 minutos a 72°C
4.6. Análise em gel de agarose Para idealmente visualizar os resultados do PCR foi determinado que entre 10 e 20µ1 das amostras de PCR deveriam ser aplicadas em um gel de agarose 1,5% (tampão Tris-borato) com um marcador de peso molecular apropriado (por exemplo escada lOObp Pharmacia).
4.7. Validação dos resultados Foi determinado que os dados de amostras transgênicas de DNA de planta dentro de uma única corrida de PCR e um único coquetel de PCR deveria não ser aceitável e menos que 1) o controle positivo de DNA mostra os produtos de PCR esperados (fragmentos transgênicos e endóge- nos), 2) controle negativo de DNA é negativo para amplificação de PCR (sem fragmentos) e 3) o controle de DNA tipo selvagem mostra que o resul- tado esperado (amplificação de fragmento endógeno). Quando seguindo o Protocolo de ldentificação de PCR para EE-
GMl conforme descrito acima, pistas mostrando quantidades visíveis dos produtos de PCR transgênicos e endógenos dos tamanhos esperados, indi- cam a planta correspondente da qual o molde de DNA genômico foi prepa- rado, herdou o evento elite EE-GMI. As pistas não mostraram quantidades 5 visíveis de produtos de PCR transgênicos e mostraram quantidades visíveis de produto de PCR endógeno, indicam que a planta correspondente do qual o molde genômico de DNA foi preparado, não compreende o evento elite. Pistas que não mostram quantidades visíveis de produtos de PCR end6ge- nos e transgênicos, indicam que a qualidade e/ou quantidade de DNA ge- lO nômico não permite que um produto de PCR seja gerado. Estas plantas não podem ser classificadas. A preparação de DNA genômico deveria ser repeti- da e uma nova corrida de PCR, com os controles apropriados, deve ser rea- lizada.
4.8. Uso de protocolo de PCR discriminador para identificar EE- 15 GMl -' Antes de tentar triar desconhecidos, uma corrida de teste, com todos os controles apropriados, deve ser realizada O protocolo desenvolvido 9 pode requerer otimizaçào para componêntês que podem diferir entre labora- tórios (preparação do molde de DNA, Taq DNA polimerase, qualidade dos 20 iniciadores, dNTP's, termociclador, etc.). A amplificação das sequências endógenas desempenha um pa- pel chave no protocolo. Um deve reter condições de PCR e termociclagem que amplificam quantidades equimolares de ambas as sequências endóge- nas e transgênicas em um molde de DNA genômico transgênico conhecido. 25 Sempre que o fragmento endógeno marcado não é amplificado ou sempre que as sequências marcadas não são amplificadas com as mesmas intensi- dades de coloração de brometo de etídio, conforme julgado por eletroforese em gel, a otimização das condições de PCR podem ser requeridas. Material em folha de Glycine max de um número de plantas de 30 soja, alguns dos qual compreendendo EE-GMI foram testados de acordo com o protocolo descrito acima. As amostras de evento elite EE-GMI e de Glycine max tipo selvagem foram tomadas como controles positivos e nega-
tivos, respectivamente. A figura 5 ilustra o resultado obtido com o evento elite Protocolo de ldentificação de PCR para EE-GMI em um número de amostras de pfan- tas de soja (pistas 1 a 14). As amostras na pista 1 foram encontradas para 5 conter evento elite que a banda 185 pb é detectada, enquanto as amostras em pistas 2, 3 e 4 não compreendem EE-GMI. Pista 2 compreende outro evento eiite de soja, pista 3 representa um controle não transgênico de GIy- cine max; pista 4 representa a amostra de controle negativo (água), e a pista 5 representa o Marcador de peso Molecular ( 100 pb) -
5. Uso de um fragmento de integração específico como sonda para detecção de material compreendendo EE-GMI. Um fragmento específico de integração de EE-GMI é obtido por amplificação em PCR usando iniciadores específicos SOY06 (SEQ ID No. 16) e SOY07 (SEQ ID No. 17) ou por síntese química e é rotulado. Este fragmento de integração é usado como uma sonda específica para a detec- ção de EE-GMI em amostras biológicas. Ácido nucleico é extraído das a- mostras de acordo com procedimentos-padrão. Este ácido nucleico é eritão contatado com a sonda específica em condições de hibridização que são otimizados para permitir formação de um híbrido. A formação de hibridos é detectada, em seguida, para indicar a presença de ácido nucleico EE-GMI da amostra. Opcionalmente, o ácido nucleico nas amostras é amplificado usando os iniciadores especificos antes de contatar com a sonda específica. Alternativamente, o ácido nucleico é marcado antes do contato com a sonda específica ao invés de o fragmento de integração. Opcionalmente, a sonda específica é ligada a um veículo sólido (como, entre outros, a um filtro, tira ou esferas), antes de contatar com as amostras.
6. Protocolo de identificação de Reação em Cadeia de Polimera- se para EE-GM2.
6.1. lniciadores lniciadores específicos foram desenvolvidos que reconhecem as sequências dentro do evento elite. Mais particularmente, um iniciador foi de- senvolvido que reconhece uma sequência dentro da região de flanqueamen-
m r. 4 911118 a to 3' de EE-GM2. Um segundo iniciador foi então selecionado dentro da se- quência do DNA estrangeiro de modo que os iniciadores tem o lapso de uma sequência de cerca de 150 nucleotídeos. Os seguintes iniciadores demons- traram conferir resultados particularmente claros e reproduzíveis em uma 5 reação de PCR em EE-GM2 DNA: SOY09: 5'- TgT.ggT.TAT.ggC.ggT.gCC.ATC -3' (SEQ ID No.: 18) (alvo: DNA de planta) SOYOIO: 5'-TgC.TAC.Agg.CAT.CgT.ggT,gTC-3' (SEQ ID No.: 10 19) (alvo: inserto DNA) Os iniciadores marcando uma sequência endógena são prefe- rencialmente incluídos no coquetel PCR. Estes iniciadores seNem como um controle interno em amostras desconhecidas e no controle positivo de DNA. 15 Um resultado positivo com o par endógeno de iniciadores demonstra que há um DNA amplo de qualidade adequada na preparação de DNA genômico para um produto de PCR a ser gerado. Os iniciadores endógenos foram se- . lecionados para reconhecer um gene não destrutivo em Glycine max: SOYOl: 5'-gTC,AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT-3' (SEQ ID No.: 9) 20 Qocalizado em gene actin 1 de Glycine max (Acesso JO 1298)) SOY02: 5'-gTT.ACC,gTA.CAg.gTC. I I l.CC-3' (SEQ ID No.: 10) (localizado em gene actin 1 de Glycine max (Acesso JO 1298))
6.2. Fragmentos amplificados Os fragmentos amplificados esperados na reação de PCR são: 25 Para o par de iniciador SOYO1-SOY02: 413bp (controle endóge- no) Para o par de iniciador SOY09-SOYO1O: 151bp (EE-GM2 evento elite)
6.3. Molde de DNA 30 Molde de DNA foi preparado a partir de umas folhas de acordo com Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p 1349, 1991). Quando u- sando DNA preparado com outros métodos, um teste realizado utilizando quantidades diferentes de molde deveria ser feito. Geralmente, 50 ng de molde de DNA genômico rendem os melhores resultados.
6.4. Controles positivo e negativo designados Para evitar falsos positivos ou negativos, foi determinado que os 5 seguintes controles positivos e negativos deveriam estar incluídos em uma corrida de PCR: - Controle Master Mix (DNA controle negativo). Isto é um PCR em que nenhum DNA é adicionado à reação. Quando o resultado esperado, nenhum produto de PCR é observado isto indica que o coquetel PCR não estava contaminado com DNA alvo. - um controle positivo de DNA (amostra de DNA genômico co- nhecido por conter as sequências transgênicas). Amplificação bem-sucedida deste contrde positivo demonstra que o PCR correu em condições que per- mitem a amplificação de sequências-alvo- - Controle de DNA de tipo selvagem. lsto é um PCR em que o molde de DNA fornecido é DNA genômico preparado a partir de uma planta não transgênica. Quando o resultado esperado, nenhuma amplificação de um produto PCR transgene, mas a amplificação do produto de PCR endó- geno, é observado isto indica que não há nenhuma amplificação de fundo transgene detectável em um amostra de DNA genômico.
6.5. Condições de PCR Resultados ótimos são obtidos nas seguintes condições: - A mistura PCR para reações de 25µ1 contém:
2.5 µ1 molde DNA 2,5 µ1 lOx Tampão de amplificação (fornecido com Taq polime- rase) 0,5 µl1OmMdNTP's 0,5 µ1 SOY09 (1Opmoles/µl) 0,5 µ1 SOYOlO (1Opmoles/µl) 0,25 µ1 SOYOl (1Opmoles/µl) 0,25 µ1 SOY02 (1Opmoles/µl) 0,1 µ1 Taq DNA polimerase (5 unidades/µl)
¢' » E 93/118 Água até 25 µ1 - O perfil de termociclagem a ser seguido para resultados ideais é o seguinte 4 min. a 95°C 5 Seguido por: 1 min a 95°C 1 min. a 57°C 2 min. a 72°C Para 5 ciclos Seguido por: 30 s a 92°C 10 30 seg, a 57°C 1 min. a 72°C Para 25 ciclos Seguido por: 5 minutos a 72"C
6.6. Análise em gel de agarose 15 Para idealmente visualizar os resultados do PCR foi determinado que entre 10 e 20µ1 das amostras de PCR deveriam ser aplicadas em um get de agarose 1,5% (tampão Tris-borato) com um marcador de peso mole- . cular apropriado (por exemplo, escada lOObp Pharmacia).
6.7. Validação dos resultados 20 Foi determinado que os dados de amostras transgênicas de DNA de pIanta dentro de uma única corrida de PCR e um único coquetel de PCR deveria não ser aceitável e menos que 1) o controle positivo de DNA mostra os produtos de PCR esperados (fragmentos transgênicos e endóge- nos), 2) controle negativo de DNA é negativo para amphficação de PCR 25 (sem fragmentos) e 3) o controle de DNA tipo selvagem mostra que o resul- tado esperado (amplificação de fragmento endógeno). Quando seguindo o Protocolo de ldentificação de PCR para EE- GM2 conforme descrito acima, pistas mostrando quantidades visíveis dos produtos de PCR transgênicos e endógenos dos tamanhos esperados, indi- 30 cam a planta correspondente da qual o molde de DNA genômico foi prepa- rado, herdou o evento elite EE-GM2. As pistas não mostraram quantidades visiveis de produtos de PCR transgênicos e mostraram quantidades visíveis de produto de PCR endógeno, indicam que a planta correspondente do qual o molde genômico de DNA foi preparado, não compreende o evento elite. Pistas que não mostram quantidades visíveis de produtos de PCR endóge- nos e transgênicos indicam que a qualidade e/ou quantidade de DNA genô- 5 mico não permite que um produto de PCR seja gerado. Estas pIantas não podem ser classificadas. A preparação de DNA genômico deveria ser repeti- da e uma nova corrida de PCR, com os controles apropriados, deve ser rea- lizada.
6.8. Uso de protocolo de PCR discriminador para identificar EE- 10 GM2 Antes de tentar triar desconhecidos, uma corrida de teste, com todos os controles apropriados, deve ser realizada. O protocolo desenvolvi- do pode requerer otimização para componentes que podem diferir entre la- boratórios (preparação do molde de DNA, Taq DNA polimerase, qualidade 15 dos iniciadores, dNTP's, termociclador, etc.)- A amplificação das sequências endógenas desempenha um pa- . pel chave no protocolo. Um deve reter condições de PCR e termociclagem que amplificam quantidades equimolares de ambas sequências endógenas e transgênicas em um molde de DNA genômico transgênico conhecido. Sem- 20 pre que o fragmento endógeno marcado não é amplificado ou sempre que as sequências marcadas não são amplificadas com as mesmas intensidades de coloração de brometo de etidio, conforme julgado por eletroforese em gel, a otimização das condições de PCR podem ser requeridas. Material em folha de Glycine max de um número de plantas de 25 soja, alguns dos qual compreendendo EE-GM2 foram testados de acordo com o protocolo descrito acima. As amostras de evento elite EE-GM2 e de Glycine max tipo selvagem foram tomadas como controles positivos e nega- tivos, respectivamente, A figura 6 ilustra o resultado obtido com o evento elite Protocolo 30 de ldentificação de PCR para EE-GM2 em um número de amostras de pIan- tas de soja (pistas 1 a 14). As amostras na pista 1 foram encontradas para conter evento elite que a banda 185 pb é detectada, enquanto as amostras em pistas 2, 3 e 4 não compreendem EE-GM2. Pista 2 compreende outro evento elite de soja, pista 3 representa um controle não transgênico de Gly- cine max; pista 4 representa a amostra de controle negativo (água), e a pista 5 representa o Marcador de peso Molecular ( 100 pb) . 5 7. Uso de um fragmento de integração especifico como sonda para detecção de material compreendendo EE-GM2. Um fragmento específico de integração de EE-GM2 é obtido por amplificação em PCR usando iniciadores específicos SOY09 (SEQ ID No. 18) e SOYOlO (SEQ ID No. 19) ou por sÍntese química e é rotulado. Este 10 fragmento de integração é usado como uma sonda específica para a detec- ção de EE-GM2 em amostras biológicas. Ácido nucleico é extraído das a- mostras de acordo com procedimentos-padrão. Este ácido nucleico é então contatado com a sonda especifica em condições de hibridização que são otimizados para permitir formação de 15 um híbrido. A formação de híbridos é detectada, en) seguida, para indicar a % presença de ácido nucleico EE-GM2 da amostra. Opcionalmente, o ácido nucleico nas amostras é amplificado usando os iniciadores especificos antes de contatar com a sonda específica. Alternativamente, o ácido nucleico é marcado antes do contato com a sonda especifica ao invés de o fragmento 20 de integração. Opcionalmente, a sonda específica é ligada a um veículo só- lido (como, entre outros, a um filtro, tira ou esferas), antes de contatar com as amostras.
8. Geração de plantas de soja compreendendo EE-GM3 e EE- GMl ou EE-GM3 e EE-GM2 e avaliação de desempenho agronômico de 25 ditas plantas- Uma planta de soja contendo uma combinação de eventos elite EE-GM3 e EE-GMI foi obtido por cruzamento convencional entre uma planta de soja parente compreendendo EE-GM3 e uma planta de soja parente compreendendo EE-GMI. As plantas descendentes compreendendo ambos 30 eventos são identificadas usando Protocolo de ldentificaçào de PCRS para EE-GMI e EE-GM3 conforme descrito aqui. Especificamente, os cruzamen- tos foram feitos com plantas contendo EE-GM3 e várias linhagens EE-GMI.
te ? 96/118 As plantas Fl resultantes foram crescidas e pulverizadas com glifosato e glu- fiosinato. Sementes F2 foram colhidas de plantas Fl e plantadas (plantas F2 não foram pulverizadas). Plantas únicas F2 foram então puxadas. Pistas Plantas F2:F3 foram crescídas e pulverizadas com glifosato e glufosinato. 5 Pistas de homozigotos para ambos EE-GM3 e EE-GMI foram identificados e posteriormente coIhidos. Os dados de segregaçáo deste estudo mostraram uma segregação mendeliana esperada dos eventos. Uma pIanta de soja contendo uma combinação de eventos elite EE-GM3 e EE-GM2 foi obtida por cruzamento convencional entre uma planta 10 de soja parental compreendendo EE-GM3 e uma planta de soja de origem compreendendo EE-GM2- As plantas descendentes compreendendo ambos os eventos são identificadas usando Protocolo de ídentificação de PCRs pa- ra EE-GM2 e EE-GM3 conforme descrito aqui. Especificamente, os cruza- mentos foram feitos com plantas contendo EE-GM3 e plantas contendo EE- 15 GM2. As plantas Fl resultantes foram cruzadas para 4 pistas convencionais.
. As Fls destes cruzamentos foram crescidas no campo e pulverizadas com glifosato e glufosinato. Semente F2 coIhida de plantas Fl resistentes a am- . bos herbicidas foi então plantada. As plantas F2 foram pulverizadas com glifosato e glufosinato. Novecentas plantas tolerantes a ambos herbicidas 20 foram colhidos e plantados em um estudo de campo- Os dados de segrega- ção mendeliana esperados foram obtidos neste estudo. Aproximadamente 40 pistas de homozigotos para tolerância a ambos herbicidas foram selecio- nados para un iformidade agronômica para outros estudos, Estas linhagens tiveram boa tolerância a ambos herbicidas com boas características agro- 25 nômicas. Estudos de campo com ditas plantas de soja compreendendo os eventos combinados em diferentes tipos de germoplasma comercial estão sendo conduzidos em vários locais e vários parâmetros agronômicos das plantas estão sendo avaliados, incluindo altura da planta, altura do nó, su- 30 porte, vigor, rendimento de semente, e níveis de tolerância de glifosato, iso- xaflutol e glufosinato.
9. lntrogressão de EE-GM3 e EE-GMI ou EE-GM2 em cultivares
C " y preferenciais.
Evento elite EE-GM3 e evento elite EE-GMI ou EE-GM2 são in- troduzidos por cruzamento reverso repetido em cultivares de soja comerci- ais, entre outros, Cultivar de soja 7631014 (US2009252860): Cultivar de So- 5 ja 7431014 (US2009252859); Cultivar de soja 7925084 (US2009252858); Cultivar de soja 7311153 (US2009252857); Cultivar de soja S070159 (US2009252856); Cultivar de soja 7535357 (US2009246353): Cultivar de soja S070160 (US2009246352); Cultivar de Soja 26074414 ( US2009249508): Cultlvar de soja 7509171 (US2009249507); Cultivar de 10 soja S070158 (US2009246351); Cultivar de soja 7511119 (US2009249506); Cultivar de Soja 7113111 (US2009238945): Cultivar de soja S06- 02RMO18047 (US7592518); Cultivar de soja 7013345 (US2009232957): Cultivar de Soja 7041461 (US2009235376); Cultivar de soja 7549450 (US2009232956); Cultivar de soja 7317090 (US2009232955); Cultivar de 15 soja 2N2V58015 (US2009226597): Cultivar de soja 7243182
- (US2009226596): Cultivar de soja 7143182 (US2009226595); Cultivar de soja 7043182 (US2009220673); Cultivar de soja S070157 (US2009222950); Cultivar de soja 306924721 (US2009220672); Cultivar de soja 7614385 (US2009220671); Cultivar de soja 7925118 (US2009214750); Cultivar de 20 Soja 7821295 (US2009214749); Cultivar de soja 7811336 (US2009214748): Cultivar de soja S070150 (US2009214747); Cultivar de soja 6214260 (US2009214746); Cultivar de soja S070152 (US2009214745); Cultivar de soja 7429331 (US2009214751); Cultivar de soja 26034631 (US2009208634); Cultivar de soja S07-03JR108674 (US7560621); Cultivar 25 de soja S07-03KLO16279 (US7560620); Cultivar de soja S06-CL95941 1 (US7554017); CULTIVAR DE SOJA SG3870NRR (US2009158453); CULTI- VAR DE SOJA HFPR-G (CA2645702); Cultivar de soja S06-02JR423016 (US7521606); Cultivar de soja S06-01JR1 19814 (US7518039); Cultivar de soja S06-01JR119448 (US7518038); Cultivar de soja 6540220 30 (US2009055960); Cultivar de soja S060292 (US2009055959); Cultivar de soja S050228 (US2009055958); Cultivar de soja S06-02JR423003 (US7491873); Cultivar de soja S06-02JR423005 (US7491872); Cultivar de
C W 0 mH:'
soja S06-02JR409114 (US7485782); Cultivar de soja S06-SJ144056
(US7473823); Cultivar de soja (US7470835); Cultivar de soja 6910450
(US2008282369); CULTIVAR DE SOJA 6223012 (US7446246); CULTNAR
DE SOJA 6549250 (US7446245); Cultivar de soja 17731225
5 (US2008271204); Cultivar de soja 6928285 (US2008271203); Cultivar de Soja 6736054 (US2008271169): Cultivar de soja S060299 (US2008271199);
Cultivar de soja S060294 (US2008271202); Cultivar de Soja 6943322
(US2008271201); Cultivar de soja 5343260 (US2008263719); Cultivar de soja 6439359 (US2008263704); Cultivar de soja 6238359 (US2008263703);
10 Cultivar de soja 6547272 (US2008263702): Cultivar de soja 6929431 (US2008263701); Cultivar de soja 6703392 (US2008263700); Cultivar de soja 6044483 (US2008263699); Cultivar de soja S050224 (US2008263698);
Cultivar de soja 6719022 (US2008263697); Cultivar de soja 5826056
(US2008263696); Cultivar de soja 6265047 (US2008263724): Cultivar de
15 Soja 6928331 (US2008263695); Cultivar de soja 6719331
. (LjS2008263694): Cultivar de soja 6636454 (US2008263693); Cultivar de soja 6226454 (US2008263718); Cultivar de soja QO073801
" (US2008256657): CULTIVAR DE SOJA 6326393 (US2008256652): CULTI- VAR DE SOJA 6408448 (US2008256651): Cultivar de soja 6449315
20 (US2008250524); Cultivar de soja S060296 (US2008250523); Cultivar de soja 6012078 (US2008250522); Cultivar de soja 6342078 (US2008250521):
Cultivar de soja 6419156 (US2008250520); Cultivar de soja 5723264
(US2008250519); Cultivar de soja S050225 (US2008250518); Cultivar de soja S060298 (US2008244783): Cultivar de soja 6935331 (US2008244782):
25 Cultivar de Soja 6819456 (US2008244787); Cultivar de soja S060297 (US2008244781): Cultivar de soja 6135319 (US2008244786): Cultivar de soja 6819331 (US2008244780); Cultivar de soja 6137445 (US2008244779);
Cultivar de soja 6917445 (US2008244778); Cultivar de soja 6111333
(US2008244777); Cultivar de soja S050229 (US2008244776); Cultivar de
30 soja 6114011 (US2008244775); Cultivar de soja 6900358 (US2008244784); Cultivar de soja 6345184 (US2008244774); Cultivar de soja 6836085
(US2008244773); Cultivar de soja 6635047 (US2008244772); Cultivar de
C " t
99/118 soja 6139105 (US2008244771): CULTIVAR DE SOJA 6434385 (US2008244770); CULTIVAR DE SOJA S060295 (US2008244769); Cultivar de So ja 6035184 (US2008244768); Cultivar de soja S060293 (US2008209590); Cultivar de soja 6733322 (US2008209594): CULTIVAR 5 DE SOJA 6421326 (US2008209593); Cultivar de soja S060077 (US2008209589): CULTIVAR DE SOJA 6600375 (US2008209592); Cultivar de soja S06-CL821457 (US7420104); Cultivar de soja S07-02KG294306 (US7414178); Cultivar de soja S06-BA0461 19 (US7414175); Cultivar de soja S07-02KG294307 (US7411114); Cultivar de soja SG3865N 10 (US2008189802); Cultivar de soja 6701475 (US7408097); Cultivar de soja 1335025 (US2008178316); Cultivar de soja 1686017 (US2008178315); Cul- tivar de soja 2388028 (US2008178314); Cultivar de soja 2387029 (US2008178313); Cultivar de soja S06-V\NV152330 (US7388129); Cultivar de soja 6424090 (US7385118); Cultivar de soja 6723322 (US7385115); Cul- 15 tivar de soja SG4377NRR (US73851 14); Cultivar de Soja S06-02JR111334
. (US7381864); Cultivar de soja 6141287 (US7378577): Cultivar de soja MT110501 (US7378576); Cultivar de soja (US7378575); Cultivar de soja S06-V\NV169267 (US7375261); Cultivar de soja 6223392 (US7371939); Cul- tivar de soja S06-CL968413 (US7371937): Cultivar de soja S06-CL9 1 107 20 (US7368636); Cultivar de soja S06-MT9152077 (US7361810); Cultivar de soja 421 1676 (US2008092253); Cultivar de soja S06- 059029 (US73551Oi); Cultivar de soja 6548193 (US7345228); Cultivar de soja 6440261 (US7345227); Cultivar de soja S060291 (US7342151); Cultivar de soja S06-MT9206166 (US7339094): Cultivar de soja S06-V\NVO13107 25 (US7339093): Cultivar de soja S06-M03256 (US7335820); Cultivar de soja 6134466 (US7332656); Cultivar de soja S06-01JR123373 (US7329800); Cultivar de soja S06-MT9211059 (US7326831): Cultivar de soja 26170838 (US2008016590); Cultivar de soja 306612412 (US2008016588); Cultivar de soja 26660135 (US2008016587); Cultivar de soja 306734323 30 (US2008016586); Cultivar de soja S06-01JR122235 (US7317144); CULTI- VAR DE SOJA 5900450 (US7314986): Cultivar de soja S06-MT116260 (US7314984); Cultivar de soja S06-SJ143606 (US7312381); Cultivar de So-
100/118 ja S06-98181-GO1-35167 (US7309819); CULTIVAR DE SOJA 26082635 (US7304219); Cultivar de soja BA922834 (US7304217); Cultivar de soja O1JR123480 (US7304216); Cultivar de soja M061422 (US7304215); Cultivar de soja 17082821 (US2007277262); Cultivar de soja 17621620 5 (US2007277261); Cultivar de Soja 00977706 (US2007277260); Cultivar de soja S060182 (US2007277259); Cultivar de soja 26312034 (US7301078): Cultivar de soja 26143837 (US7301077); Cultivar de soja 435.TCS (US2007271626); Cultivar de soja 495.RC (US2007271625); Cultivar de So- ja 5306230 (US7297845): Cultivar de soja S06-WW167686 (US7291772);
10 Cultivar de soja 6141 145 (US2007245426); Cultivar de soja S050232 (US2007226829); Cultivar de soja 5333301 (US2007226828); CULTIVAR DE SOJA S050215 (US2007226827); CULTIVAR DE SOJA 3235020 (US2007226826); Cultivar de soja 5720482 (US2007226825); Cultivar de soja S050216 (US2007226824); Cultivar de soja 5512112 (US2007226823); 15 Cultivar de soja- 3233021 (US2007226822): CULTIVAR DE SOJA 1336024
- (US2007226821); Cultivar de soja 5348287 (US2007226820); Cultivar de Soja 5204220 (US2007226819); Cultivar de soja 6188027 (US2007226818); r·
Cultivar de soja 4183026 (US2007226817); Cultivar de soja S06- \N\N157958 (US7271325); Cultivar de soja 5733056 (US2007209091); Culti-
20 var de soja 90501911 (US2007209090); Cultivar de Soja S050221 (US2007204361); CULTÍVAR DE SOJA 5802205 (US2007204360); Cultivar de soja 1000642 (US2007204359); Cultivar de soja 5420128 (US2007204358); Cultivar de soja S050222 (US2007199094); Cultivar de
Soja S050217 (US2007199093); CULTIVAR DE SOJA S050223 25 (US2007199092); Cultivar de soja S050218 (US2007199091); Cultivar de soja 5419227 (US2007199089); Cultivar de soja 5319227 (US2007199088); Cultivar de soja 5723045 (US2007199087): CULTIVAR DE SOJA 5051007 (US2007199086); Cultivar de soja 5826175 (US2007192893); Cultivar de soja S050231 (US2007192892); CULTIVAR DE SOJA 5826376 30 (US2007192891); CULTIVAR DE SOJA 5628386 (US2007192890); Cultivar de soja 5138236 (US2007186307): Cultivar de soja 5608398 (US2007186306): CULTIVAR DE SOJA S050230 (US2007186305); CULTI-
8 " 0
101/118
VAR DE SOJA 5624126 (US2007180561); CULTIVAR DE SOJA 5019225 (US2007180560); CULTIVAR DE SOJA 5549483 (US2007180559); CULTI- VAR DE SOJA 4189010 (US2007180551); CULTIVAR DE SOJA 1486018 (US2007180550); CULTIVAR DE SOJA S050235 (US2007180549); CULTI- 5 VAR DE SOJA 5023230 (US2007180548); CULTIVAR DE SOJA S050238 (US2007174930): CULTIVAR DE SOJA 5830261 (US2007174928); CULTI- VAR DE SOJA S050226 (US7247772); CULTIVAR DE SOJA 5806063 (US7247771); CULTIVAR DE SOJA S050233 (US7244881): CULTIVAR DE SOJA 5726085 (US7241939); Cuítivar de soja MTO00792 (US7238867); 10 Cultivar de soja 5521161 (US7235718): Cultivar de soja W\N109447 (US7235717); Cultivar de soja BA947474 (US7220898): Cultivar de soja 5939002 (US7217870): Cultivar de soja 5726175 (US7217869): Cultivar de soja 5432082 (US7217868): Cultivar de soja SG0850RR (US7211715): Cul- tivar de soja SG1750NRR (US7208658); Cultivar de soja MTO17827 15 (US7208657); Cultivar de Soja 4N2V74028 (US7205458); Cultivar de soja CL431203 (US7202400); Cultivar de soja 4NOS63222 (US7199288); Cultivar de soja 5520279 (US7196253); Cultivar de soja 5834401 (US7196252); Cul- " tivar de soja 5621 161 (US7196251); Cultivar de soja CL722114 (US7196250); Cultivar de soja 5741081 (US7193140); Cultivar de soja 20 CL727422 (US7186895); Cultivar de soja 4N2V55022 (US7183468); Cultivar de soja 5083011 (US7173169); Cultivar de soja 5626085 (US7169976); CULTIVAR DE SOJA S050051 (US7169974); CULTIVAR DE SOJA 4506816 (US2006294626); Cultivar de soja \NW152201 (US7132594): Cultivar de soja CL727636 (US7132593): Cultivar de soja M08851 (US7126047); Culti- 25 var de soja 4324401 (US7105728); Cultivar de soja S050164 (US7105727); Cultivar de soja 4136015 (US2006195931); Cultivar de soja 3133014 (US2006195930): Cultivar de soja S040132 (US2006195929); Cultivar de soja 4328386 (US2006195928); Cultivar de soja 1339013 (US2006195927); CULTIVAR DE SOJA 4423183 (US2006195925); Cultivar de Soja S040131 30 (US2006195924); Cultivar de soja 4929388 (US2006195923); Cultivar de soja 4817034 (US2006195922): Cultivar de soja 4916816 (US7098385); Cultivar de soja 4713487 (US2006191032): Cultivar de soja 4348019
1 h b
102/118
(US2006191031); Cultivar de soja S040122 (US2006191030): Cultivar de soja S040133 (US2006185031); Cultivar de soja CL821418 (US7091404); CULTIVAR DE SOJA 4441080 (US7091403); Cultivar de soja 4805442 (US2006179509); Cultivar de Soja 4921237 (US2006179508); Cultivar de 5 soja 4417380 (US2006174369); Cultivar de soja 4405070 (US2006174368); Cultivar de soja 4417779 (US7084328): Cultivar de soja S040125 (US2006168678); Cultivar de soja 4909380 (US7081572); Cultivar de soja S050162 (US7081571); Cultivar de soja 6084016 (US7081570); Cultivar de soja S050163 (US7078600): Cultivar de soja S040135 (US7078598): Culti- lO var de soja S040117 (US7078597); Cultivar de Soja M03393 (US7071391); Cultivar de soja 4145306 (US7064253); Cultivar de soja 900213 (US2006117405): Cultivar de soja 1000126 (US2006117404); Cultivar de soja 901023 (US2006117403); Cultivar de soja S040130 (US7053280); Cul- tivar de soja 4706198 (US7053279); Cultivar de soja S040118 15 (US7053278): Cultivar de soja S040119 (US7053277); Cultivar de soja
. S040123 (US7053276); Cultivar de soja 4442112 (US7049497); CULTIVAR DE SOJA 917013 (US7045689); Cultivar de soja S040124 (US7045691): Cultivar de soja 4238491 (US7045690): Cultivar de soja SO 10136 (US7041882); Cultivar de soja 900613 (US7030297); Cultivar de soja 20 4337175 (US7030301); Cultivar de soja S040121 (US7030300): Cultivar de soja 4216033 (US7030299); Cultivar de soja S040128 (US7022901); Culti- var de soja S040120 (US7022900); Cultivar de soja S040127 (US7019199); Cultivar de soja S040134 (US7015378); Cultivar de soja S040129 (US7015377); Cultivar de soja 4513420 (US7005564); Cultivar de soja 25 943013 (US2006031958); Cultivar de soja S030136 (US2006021081); Culti- var de Soja 927013 (US2006021080); Cultivar de soja 1000109 (US2006015962); Cultivar de soja 90046112 (US2006010530); Cultivar de soja 90897327 (US2006010529); Cultivar de soja 90362421 (US2006010528); Cultivar de soja 03022253 (US2006010527): Cultivar de 30 Soja 02022433 (US2006010526); Cultivar de soja 02022323 (US2006010525); Cultivar de soja 02912951 (US2006010524): Cultivar de soja 0102115 (US2006010523); Cultivar de soja 915034 (US2006010522);
t * u
1031118
Cultivar de soja 0509255 (US2006010521); Cultivar de soja 4803070 (US6982368); Cultivar de soja 4704310 (US6979762); Cultivar de soja SJ919784 (US2005268362); Cultivar de soja CL615261 (US2005268361); Nova soja (US2004199964); Cultivar de soja 0509214 (US2005210542): 5 Cultivar de soja 70826751 (US2005193442); Cultivar de soja 0509243 (US2005193441); Cultivar de soja 0509246 (US2005193440); Cuitivar de Soja 0509253 (US2005193439): Cultivar de soja 0509247 (US2005193438); Cultivar de soja 0509252 (US2005193437); Cultivar de soja 0509241 (US200519343l3); Cultivar de soja 0509249 (US6884927); Cultivar de soja 10 0509244 (US2005183158); Cultivar de soja 0509240 (US2005183157); Cul- tivar de soja 0509239 (US2005183156); Cultivar de soja 0509254 (US2005183155); Cultivar de soja 0509245 (US2005183154); Cultivar de soja 0509251 (US2005183153): Cultivar de soja 4283008 (US6888050): Cultivar de soja 2386009 (US2005183152): Cultivar de soja 3282002 15 (US6870080); Cultivar de soja 0509248 (US2005183151); Cultivar de soja 5091007 (US6906249 0: Cultivar de soja 0509236 (US2005166281); Culti- var de soja 0509235 (US2005166280); Cultivar de soja 0509237 (US2005166279); Cultivar de soja SG5322NRR (US2005164390); Cultivar de soja SG5030NRR (US2005166278); Cultivar de soja SG4911NRR 20 (US2005166277): Cultivar de soja S030153 (US2005160504); Cultivar de soja S030158 (US2005144680); CULTÍVAR DE SOJA S030160 (US2005144679); Cultivar de soja S030161 (US2005144678); Cultivar de soja S030157 (US2005144677); Cultivar de soja S030155 (US2005144676); Cultivar de soja S030156 (US2005144675); CULTIVAR DE SOJA S030159 25 (US2005144674); Cultivar de soja S030154 (US6900376): Cultivar de soja S020030 (US2005114929); Cultivar de soja S030010 (US20051 14928); Cultivar de soja SG1431RR (US2005097629); CULTIVAR DE SOJA SG1330NRR (US2005097642): Cultivar de soja S030150 (US2005071900); CULTIVAR DE SOJA S022209 (US2005050601); Cultivar de soja S022217 30 (US2005050600); Cultivar de soja S022219 (US2005050599): Cuitivar de soja S030151 (US2005050598); Cultivar de soja 0491735 (US2005022272); Cultivar de soja S022218 (US2005022271); Cultivãr de soja 6190006 t q J
104/118
(US2004268447); Cultivar de soja SG1120RR (US2004250316): Cultivar de soja 0487681 (US2004237153); Cultivar de Soja 0491717 (US2004237152); Cultivar de soja SO22220 (US2004237151): Cultivar de soja 0491715 (US2004237150); Cultivar de soja 0491712 (US2004237149): Cultivar de 5 soja 0491718 (US2004237148); Cultivar de Soja 99271316 (US2004221344): Cultivar de soja S022212 (US2004221343): Cultivar de soja 0491737 (US2004221342); Cultivar de soja S022211 (US2004221341); Cultivar de soja SO22210 (US2004221340); Cultivar de soja S022213 (US2004221339); Cultivar de soja 0491725 (US2004221346); Cultivar de 10 soja 03129016 (US2004221329); Cultivar de soja SO22208 (US2004221328): Cultivar de soja SO22207 (US2004221345); Cultivar de soja 02932 (US2004210968): Cultivar de soja 94137321 (US2004205862); Cultivar de soja 94106224 (US2004205861); Cultivar de soja 94143901 (US2004205859); CULTIVAR DE SOJA 0487685 (US2004205858); CULTI- 15 VAR DE SOJA 92440927 (US2004205857); Cultivar de soja 0487686
. (US2004205856): Cuitivar de soja S022215 (US2004205855); Cultivar de soja S022214 (US2004205854); CULTNAR DE SOJA 0491726 (US2004205849); CULTIVAR DE SOJA 92478609 (US2004205853); Cultivar de soja 922013 (US6781040); CULTIVAR DE SOJA 0491727 20 (US2004205852); CULTIVAR DE SOJA 0491728 (US2004205851): Cuitivar de soja 1465003 (US2004098766); Cultivar de soja 3186004 (US2004019936): Cultivar de soja 7085005 (US2004205850); Cultivar de soja SO22204 (US2004199958): Cultivar de soja SO22206 (US2004199957); Cultivar de soja 0491731 (US2004199956); Cultivar de
25 soja 0491733 (US2004199955); Cultivar de soja 0491738 (US2004199954): Cultivar de soja 0491732 (US2004199953); Cultivar de soja 0491729 (US2004199952); Cultivar de soja SO20011 (US2004199951); Cultivar de soja 0491739 (US2004199950); Cultivar de soja 0491730 (US2004199949); Cultivar de soja 13873 (US2004199948); Cultivar de soja 954011
30 (US2004181822); Cultivar de soja 010022 (US2004181831); Cultivar de So- ja 4181001 (US2003229926): Cultivar de soja 0491721 (US2004168228); Cultivar de soja 0491723 (US6911581 (); Cultivar de soja 0491716
1051118
(US2004168226); Cultivar de soja 0491713 (US2004168225); Cultivar de soja 0491711 (US2004168224); Cultivar de soja 0491722 (US2004168223); Cultivar de soja 0491724 (US2004168222); Cultivar de soja 0491720 (US2004168221): Cultivar de soja- 0487682 (US2004168220); Cultivar de 5 soja 0491714 (US20041682'19): Cultivar de soja 0491719 (US2004168218); Cultivar de soja DP 5634 RR (US2003177540); Cultivar de soja S56-D7 (US2004098765); Cultivar de soja 926877 (US2004064859); Cultivar de So- ja - SE73753 (US2004055059); Cultivar de soja SN83594 (US2004055058); Cultivar de soja SE71112 (US2004055056); Cultivar de soja SE73090 10 (US2004055054); Cultivar de soja SN79526 (US2004055053); Cultivar de soja sw90702 (US2004055052); Cultivar de soja SN79525 (US2004055051); Cultivar de soja SE90345 (US2004055050): Cultivar de soja 0149928 (US2004055049); Cultivar de soja- SN83780 (US2004055048): Cultivar de soja 0053840 (US2004055047): Cultivar de 15 Soja 924001 (US2004055046); Cultivar de soja 0004747 (US2004055057); Cultivar de soja 0037357 (US2004055045); Cultivar de soja SN83366
(US2004055044); Cultivar de soja SN76208 (US2004055043); Cultivar de
" soja 0037370 (US2004055042); Cultivar de soja SX95512 (US2004049821); Cultivar de soja 0096008 (US 2004049820): Cultivar de soja SN83544
20 (US2004049819); Cultivar de soja 0088401 (US2004049818); Cultivar de soja SN64195 (US2004049817); Cultivar de soja 0034754 (US2004049816): Cultivar de soja SN71173 (US2004049815); Cultivar de soja SN83211 (US2004049814); Cultivar de soja 92422749 (US2004045058); Cultivar de soja 012031 1 (US2004045057); Cultivar de
25 soja SO10344 (US2004003438); Cultivar de soja 70876922 (US2004003437): Cultivar de soja 924496 (US2004003436): Cultivar de So-
ja 19705120 (US2003237116); Cultivar de soja 19704220 (US2003235914);
Cultivar de soja- 19704280 (US2003237115); Cultivar de soja 19704210
(US2003237114): Cultivar de soja S37-N4 (US2003237113); Cultivar de So-
30 ja 19602310 (US2003233685); Cultivar de soja 19704120 (US2003233684); Cultivar de soja 19704230 (US2003233683); Cultivar de soja 1000126
(US2003233682); Cultivar de soja 93831526 (US2003221226); Cultivar de
Ç K 0 1061118 soja 0322581 (US2003221225); Cultivar de soja 0332149 (US2003213028); Cultivar de soja 0332144 (US2003213027): Cultivar de Soja 924788 (US2003213026); Cultivar de soja 924861 (US2003213025); Cultivar de So- ja 928070 (US2003213024); Cultivar de soja SO10354 (US2003213023); 5 Cultivar de soja SO10360 (US2003213022): Cultivar de soja SO10361 (ÚS2003213021); Cultivar de soja SO10363 (US2003213020); Cultivar de soja SO10364 (US2003213019); Cultivar de soja 0332148 (US2003208805); Cultivar de soja 0332147 (US2003208804); Cdtivar de soja 0332146 (US2003208803): Cultivar de soja 0332135 (US2003208802); Cultivar de 10 soja 1000144 (US2003208801); Cultivar de soja 0332143 (US2003208800); Cultivar de soja 0332145 (US2003208799); Cultivar de soja SO10345 (US2003204884): Cultivar de soja 0332131 (US2003204883); Cultivar de soja 0332130 (US2003204882); Cultivar de soja 0332129 (US2003204881); Cultivar de soja 0332122 (US2003204880); Cultivar de soja SO10350 15 (US2003204879); Cultivar de soja SO10355 (US2003204878); Cultivar de
K soja 031766 (US2003204877): Cultivar de soja SO10353 (US2003204876); Cultivar de soja 0322580 (US2003200579): Cultivar de soja 0322579 (US2003200578); Cultivar de soja SO10347 (US2003200577); Cuitivar de Soja SO10349 (US2003200576); Cultivar de soja 0332141 (US2003200575); 20 Cultivar de soja 0332142 (US2003200574); Cultivar de soja 0332133 (US2003200573); Cultivar de soja 0332134 (US2003200572); Cultivar de soja 0332139 (US2003200571); Cultivar de soja 0332137 (US2003200570); Variedade de soja XB33U08 (US7598435): Variedade de soja XB27D08 (US7592519); Variedade de soja XB41 M08 (US7589261); Variedade de 25 Soja XB05J08 (US7589260); Variedade de soja XB33T08 (US7589259): Variedade de soja XB30Y08 (US7586025); Variedade de soja XB40U08 (US7582813); Variedade de soja XB29M08 (US7582811); VARIEDADE DE SOJA 93Y1O (US2009144843); VARIEDADE DE SOJA D4325666 (US2009055957); VARIEDADE DE SOJA D4125897 (US2009055956): VA- 30 RIEDADE DE SOJA D4698573 (US2009055955); VARIEDADE DE SOJA D4356652 (US2009019592); VARIEDADE DE SOJA D4456885 (US2009019591); VARIEDADE DE SOJA D4698013 (US2009019590); VA-
µ " t 107/118
RIEDADE DE SOJA D4637114 (US2009019589); VARIEDADE DE SOJA D4102367 (US2009019595); VARIEDADE DE SOJA D4266582 (US2009019594): VARIEDADE DE SOJA D4422801 (US2009019593); VA- RIEDADE DE SOJA D4520980 (US2009019588); VARIEDADE DE SOJA
5 D4521369 (US2009019587): VARIEDADE DE SOJA D4223057 (US2009019586); VARIEDADE DE SOJA D4682156 (US2009019585); VA- RIEDADE DE SOJA D4233569 (US 2009019584); VARIEDADE DE SOJA
D4925614 (US2009019583); VARIEDADE DE SOJA D4203144 (US2009019604): VARIEDADE DE SOJA D4102536 (US2009019582); VA-
lO RIEDADE DE SOJA D4865324 (US2009019581); VARIEDADE DE SOJA D4825495 (US2009019580); VARIEDADE DE SOJA D4659251 (US2009019579); VARIEDADE DE SOJA D4258962 (US2009019578); VA- RIEDADE DE SOJA D4253969 (US2009019577); VARIEDADE DE SOJA
D4696658 (US2009019603); VARIEDADE DE SOJA D4256925 15 (US2009019576); VARIEDADE DE SOJA D4253681 (US2009019575); VA-
. RIEDADE DE SOJA D4789254 (US2009019574): VARIEDADE DE SOJA D4713125 (US2009019573); VARIEDADE DE SOJA D4526223 " (US2009019572); VARIEDADE DE SOJA D4556201 (US2009019571): VA- RIEDADE DE SOJA D4012368 (US2009019570): VARIEDADE DE SOJA
20 D4452019 (US2009019569); VARIEDADE DE SOJA D4201483 (US2009019568); VARIEDADE DE SOJA D4463892 (US2009019567): VA- RIEDADE DE SOJA D4159630 (US2009019566); VARIEDADE DE SOJA
D4470236 (US2009019565); VARIEDADE DE SOJA D4063284 (US2009019564); VARIEDADE DE SOJA D4021792 (US2009013429); VA-
25 RIEDADE DE SOJA D4902530 (US2009013428); VARIEDADE DE SOJA D4367012 (US2009013427); VARIEDADE DE SOJA D4923560 (US2009013426); VARIEDADE DE SOJA D4253854 (US2009013425); VA- RIEDADE DE SOJA D4210110 (US2009007290); VARIEDADE DE SOJA D4523081 (US2009007289); VARIEDADE DE SOJA D4328762 30 (US2009007288); VARIEDADE DE SOJA D4483789 (US2009007287): VA- RIEDADE DE SOJA D431 1702 (US2009007286); VARIEDADE DE SOJA
D4127789 (US2008313765); VARIEDADE DE SOJA D4361423 q b j
108/118
(US2008313764); VARIEDADE DE SOJA D4208814 (US2008313763); VA-
RIEDADE DE SOJA D4201139 (US2008313762): VARIEDADE DE SOJA
D4120384 (US2008313761); VARIEDADE DE SOJA D4572906 (US2008313760); VARIEDADE DE SOJA D4301279 (US2008313759); VA-
5 RIEDADE DE SOJA D4422957 (US2008313758); VARIEDADE DE SOJA
D4256958 (US2008313757); VARIEDADE DE SOJA 4074328 (US2008282366); VARIEDADE DE SOJA XB47Q06 (US2008244767); VA-
RIEDADE DE SOJA XB26R06 (US2008244766); VARIEDADE DE SOJA
4991629 (US2008216190); VARIEDADE DE SOJA 4158090
10 (US2008216189); Variedade de soja XB40K07 (US2008209582); VARIE- DADE DE SOJA DO069201 (US2008178345); VARIEDADE DE SOJA
DO064801 (US2008178320): VARIFDADE DE SOJA DO063801 (US2008178344); VARIEDADE DE SOJA DO061501 (US2008178343); VA-
RIEDADE DE SOJA 4938051 (US2008178319); VARIEDADE DE SOJA
15 4880500 (US2008178318); VARIEDADE DE SOJA 4835953
. (US2008178317); VARIEDADE DE SOJA 4684181 (US2008178342); VARI- EDADE DE SOJA 4427363 (US2008178340); VARIEDADE DE SOJA
4676311 (US2008178339); VARIEDADE DE SOJA 4953710 (US2008178337); VARIEDADE DE SOJA 4857548 (US2008178336); VAR1-
20 EDADE DE SOJA 4551757 (US2008178335); VARÍÉDADE DE SOJA
4027271 (US2008178334); VARIEDADE DE SOJA 4274171 (US2008178333); VARIEDADE DE SOJA 0341931 (US2008178332): VARI-
EDADE DE SOJA 4282159 (US2008178331); VARIEDADE DE SOJA
4852004 (US2008178330): VARIEDADE DE SOJA 4688589
25 (1JS2008178329); VARIEDADE DE SOJA 4614131 (US2008178327); VARI- EDADE DE SOJA 4201823 (US2008178326); VARIEDADE DE SOJA
92M22 (US2008178350); VARIEDADE DE SOJA 4174206 (US2008178322);
VARIEDADE DE SOJA 4305498 (US2008178321); VARIEDADE DE SOJA
4423586 (US2008172761): VARIEDADE DE SOJA 4568207
30 (US2008172756); VARIEDADE DE SOJA 4840308 (US2008172755); VARI- EDADE DE SOJA 4256323 (US2008172754); VARIEDADE DE SOJA
4789516 (US7399907); VARIEDADE DE SOJA 90Y40 (US2008168581);
K « q
109/118
VARIEDADE DE SOJA 4959932 (US7396983): VARIEDADE DE SOJA 4062885 (US7394000); Variedade de soja 4858197 (US7390940); Varieda-
de de soja 4092390 (US7390939); Variedade de soja 4735486 (US7390938): Variedade de soja 4219527 (US7388132); Variedade de soja
5 4599695 (US7388131); Variedade de soja 4554257 (US7388130); Varieda- de de soja 4896902 (US7385113): Variedade de soja 4367308 (US7385112); Variedade de soja 4589609 (US7385111); Variedade de Soja 4640250 (US7385110); Variedade de soja 4540394 (US7385109); Varieda-
de de soja 4297661 (US7385108): Variedade de soja 4958786
10 (US7381866); Variedade de soja 4440685 (US7375262); Variedade de soja 4008211 (US7371938); Variedade de soja 4778469 (US7368637); Varieda-
de de soja 4766295 (US7355103); Variedade de soja 4436909 (US7355102): Variedade de soja 4812469 (US7351886); Variedade de soja 4761767 (US7351885); Variedade de soja 4142393 (US7329801): Varieda-
15 de de soja 4502135 (US7326832); Variedade de soja 4353363 (US7321082); Variedade de Soja 91B42 (US7317143); VARIEDADE DE SOJA 0330739 (US2007271622); Variedade de soja 0384279 (US7294768);
" VARIEDADE DE SOJA 4175567 (US2007256187); VARIEDADE DE SOJA 4336643 (US2007256186); VARIEDADE DE SOJA 4671685 20 (US2007256185); VARIEDADE DE SOJA 4309194 (US2007256190): VARI- EDADE DE SOJA 0330738 (US2007256184): VARIEDADE DE SOJA
0045477 (US2007256183); VARIEDADE DE SOJA 0437973 (US2007256182); VARIEDADE DE SOJA 0457028 (US2007256181); VARI- EDADE DE SOJA 0367478 (US2007256180); VARJEDADE DE SOJA
25 0358232 (US2007256179); VARIEDADE DE SOJA 0417158 (US2007256178): VARIEDADE DE SOJA 4559809 (US2007256177); VARI- EDADE DE SOJA 0196172 (US2007256176); VARIEDADE DE SOJA
4785923 (US2007256175); VARIEDADE DE SOJA 4587513 (US2007256174); VARIEDADE DE SOJA 0409670 (US2007256173): VARI-
30 EDADE DE SOJA 4010165 (US2007256172); VARIEDADE DE SOJA 0421133 (US2007256171); VARIEDADE DE SOJA 0240187 (US2007256170): VARIEDADE DE SOJA 0387907 (US2007256169); VARI-
EDADE DE SOJA 0232405 (US2007256168); VARIEDADE DE SOJA
0146529 (US2007256167); VARIEDADE DE SOJA 4788561 (US2007256166); VARIEDADE DE SOJA 457114 (US2007256165); VARI- EDADE DE SOJA 0149217 (US2007256164); VARIEDADE DE SOJA
5 4247825 (US2007254366); VARIEDADE DE SOJA 0212938 (US2007256163): VARIEDADE DE SOJA 0146565 (US2007256162); VARI- EDADE DE SOJA 4647672 (US2007256161); VARIEDADE DE SOJA
0215818 (US2007256160); VARIEDADE DE SOJA 0384531 (US2007256159); VARIEDADE DE SOJA 4878185 (US2007254365); VARI-
IO EDADE DE SOJA 4498438 (US2007256158); VARIEDADE DE SOJA 0436052 (US2007256157); VARIEDADE DE SOJA 4782157 (US2007256156); VARIEDADE DE SOJA 0385457 (US2007256155); VARI- EDADE DE SOJA 0385240 (US2007256154); VARIEDADE DE SOJA
4735316 (US2007256153); VARIEDADE DE SOJA 0277524 15 (US2007256152); VARIEDADE DE SOJA 0276951 (US2007256151); Varie- dade de soja XB37L07 (US2007245429); Variedade de soja XB35X07 (US2007226837); Variedade de soja XB35S07 (US2007226836); Variedade
' de soja XB35F07 (US2007226835); Variedade de soja XB34R07 (US2007226834); Variedade de soja XB34L07 (US2007226833); Variedade
20 de soja XB34D07 (US2007226832): Variedade de soja XB33G07 (US2007226831); Variedade de soja 98Y11 (US2007169220); Variedade de soja 0137335 (US7241941); Variedade de soja XB 15E07 (US2007150980): Variedade de Soja 92M52 (US2007150979); Variedade de soja XB47R07 (US2007136888); Variedade de soja XB46V07 (US2007136887): Variedade
25 de soja XB57E07 (US2007136886); Variedade de soja XB54X07 (US2007136885): Variedade de soja XB54V07 (US2007136884); Variedade de soja XB52Q07 (US2007136883); Variedade de soja XB37M07 (US2007136882); Variedade de soja XB37J07 (US2007136881); Variedade de soja XB34Q07 (US2007136880); Variedade de soja XB32S07
30 (US2007136879): Variedade de soja XB32J07 (US2007136878): Variedade de soja XB31R07 (US2007136877); Variedade de soja XB31J07 (US2007136876); Variedade de soja XB29K07 (US2007136875); Variedade
! h A 111/118 de soja XB31H07 (US2007136874); Varledade de soja XB30G07 (US2007136873); Variedade de soja XB30E07 (US2007136872); Variedade de soja XB25E07 (US2007136871); Variedade de soja XB26X07 (US2007136870); Variedade de soja XB23L07 (US2007136869); Variedade
5 de soja XB 19Z07 (US2007136868); Variedade de soja XB 19E07 (US2007136867); Variedade de soja XB 18M07 (US2007136866); Varieda- de de soja XB18K07 (US2007136865): Variedade de soja XB 18J07 (US2007136864); Variedade de soja XB 17W07 (US2007136863): Varieda- de de soja XB 17U07 (US2007136862); Variedade de soja XB15B07
10 (US2007136861): Variedade de soja XB 12R07 (US2007136860); Variedade de Soja XB 11J07 (US2007136859); Variedade de soja XB04E07 (US2007136858): Variedade de soja XB02K07 (US2007136857); Variedade de soja XB49V07 (US2007136856); Variedade de soja XB48X07 (US2007136855); Variedade de soja 92M75 (US2007136854); Variedade de
15 soja XB48\N07 (US20071 36853); Variedade de soja XB44G07 (US2007136852); Variedade de soja XB42K07 (US2007136851 ): Variedade de soja XB42H07 (US2007136850); Variedade de soja XB41J07
" (US2007136849); Variedade de Soja XB40Y07 (US2007136848): Variedade de soja XB40X07 (US2007136847); Variedade de soja XB39E07
20 (US2007136846): Variedade de soja XB38W07 (US2007136845); Variedade de soja XB38S07 (US2007136844); Variedade de Soja XB23V07 (US2007136843); Variedade de soja XB31M07 (US2007130652); Variedade de soja XB28E07 (US2007130651); Variedade de soja XB25S07 (US2007130650): Variedade de soja XB21N07 (US2007130649); Variedade
25 de soja XB03Q07 (US2007130648); Variedade de soja XB49Q07 (US2007130647): Variedade de soja XB06M07 (US2007130646); Variedade de soja S04-97130-15-02 (US7196249); Variedade de soja S04-97026-N99-
42648-01 (US7189896); Variedade de soja S05-97016-G99-21212 (US7186894); Variedade de soja S05-99048-19 (US7164064); Variedade de
30 soja 92B14 (US7161065); Variedade de soja 98R31 (US2007006350); Vari- edade de soja S05-97177-NO0-22972 (US7132592); Variedade de soja XB25G06 (US2006225160); Variedade de soja 91M70 (US2006174381);
µ x 1
112/118
Variedade de soja XB24R06 (US2006162029): Variedade de soja S03- 95368-N98-52902 (US7078594): Variedade de soja S05-97130-51 (US7078599); Variedade de soja XB11L06 (US2006130187); Variedade de soja 94B 13 (US7064251); Variedade de soja 94B74 (US7064250); Varie-
5 dade de soja XB27J06 (US2006112462); Variedade de soja XB29N06 (US2006112460); Variedade de soja XB28T06 (US2006112459); Variedade de Soja XB 16W06 (US2006112458); Variedade de soja XB18C06 (US2006112456); Variedade de soja XB 1OM06 (US2006107391); Varieda- de de soja XB06K06 (US2006107390); Variedade de soja XB28V06
10 (US2006107389); Variedade de soja XBO04A06 (US2006107388): Varieda- de de soja XB 12L06 (US2006107387); Variedade de soja XBO05A06 (US2006107386); Variedade de soja XB25H06 (US2006107385); Variedade de soja XB39W06 (US2006107384); Variedade de soja XB27K06 (US2006107383); Variedade de soja XB29R06 (US2006107382); Variedade
15 de soja XB 16S06 (US2006107381); Variedade de soja XB36V06 (US2006107380); Variedade de Soja XB07N06 (US2006107379): Variedade de soja XB23H06 (US2006107378); Variedade de soja XB35C06
" (US2006107377); Variedade de soja XB32L06 (US2006107376); Variedade de soja XB58P06 (US2006107375); Variedade de soja XB36M06
20 (US2006107374); Variedade de soja XB22G06 (US2006107373): Variedade de soja XB36Q06 (US20061 07372); Variedade de soja 91M61 (US2006107371 ); Variedade de soja XB32A06 (US2006107370); Variedade de soja XB 19V06 (US2006107369); Variedade de soja XB43C06 (US2006107368); Variedade de soja XB22N06 (US2006107367); Variedade
25 de soja XB38E06 (US2006107366); Variedade de soja XB37U06 (US2006107365); Variedade de soja XB37Q06 (US2006107364); Variedade de soja XBOOD06 (US2006107363); Variedade de soja XB14N06 (US2006107362); Variedade de soja XB31H06 (US2006107361); Variedade de soja XB21Z06 (US2006107360): Variedade de soja XBO05B06
30 (US2006107359); Variedade de soja XB 15W06 (US2006107358); Varieda- de de soja XB33N06 (US2006107357): Variedade de soja XB 18W06 (US2006107356): Variedade de soja XB32M06 (US2006107355); Variedade
Ç " d
113/118 de soja XB 19F06 (US2006107354): Variedade de soja S03-95021 -55-138-
AB (US7026531): Variedade de Soja 94M41 (US7002061 ): Variedade de soja 91M50 (US6998518): Variedade de soja 92B 13 (US6989475); Varie-
dade de soja 93B68 (US6989474): Variedade de soja 93B09 (US6979759);
5 Variedade de soja 92MOO (US6972352); Variedade de soja XB08P05 (US2005120433); Variedade de Soja XB26V05 (US2005150023): Variedade de soja XB21 R05 (US2005108795); Variedade de soja XB28E05 (US2005114942); Variedade de soja XB58K05 (US2005114941); Variedade de soja XB27B05 (US2005114940); Variedade de soja XB21S05
10 (US2005150022); Variedade de soja XB26U05 (US2005138695); Variedade de soja XB35K05 (US2005150021); Variedade de soja XB 18S05 (US2005120436); Variedade de soja XB25C05 (US2005120435): Variedade de soja 90MO1 (US2005120434); Variedade de soja XB22H05 (US2005150020); Variedade de soja XB22K05 (US2005114939); Variedade
15 de Soja XB58G05 (US2005114938); Variedade de soja XB57U05
. (US2005120432); Variedade de Soja XB49MO5 (US2005120431): Variedade de soja XB20D05 (US2005144683); Variedade de soja XB41B05
' (US2005150019); Variedade de soja XB38T05 (US2005120430); Variedade de soja XB 13T05 (US2005120429); Variedade de soja XB 19Y05
20 (US2005120428); Variedade de soja XB43D05 (US2005120427); Variedade de So ja XB40E05 (US2005120426); Variedade de soja XB39N05 (US2005120425); Variedade de soja 93MO1 (US2005120424); VARIEDADE
DE SOJA XB31\N05 (US2005223439); Variedade de soja XB32C05 (US20051i4937): Variedade de soja XB40D05 (US2005120423); Variedade
25 de soja 92M61 (US20051204.22): Variedade de soja 91M91 (US2005114936): Variedade de soja XB33Y05 (US2005120421); Variedade de soja XB34A05 (US2005120420); Variedade de soja XB 13U05 (US2005114935); Variedade de soja XB 12K05 (US2005114934); Variedade de soja XB30P05 (US2005120419); Variedade de soja XB57T05
30 (US2005114933): Variedade de soja XB 17S05 (US2005114932): Variedade de soja XB25Y05 (US2005114930); Variedade de soja XB25S05 (US20051 50017); Variedade de soja XB43W04 (US2004177420); Variedade de soja XB44W04 (US2004177419); Variedade de soja XB53J04 (US2004199960); Variedade de soja XB43V04 (US2004216192); Variedade de soja XB49K04 (US2004172668); Variedade de soja XB27P04 (US 2004205864); Variedade de soja XB29L04 (US2004177418); Variedade de 5 soja XB29K04 (US2004177417); Variedade de soja XB41U04 (US2004231017): Variedade de soja XB34D04 (US2004177416); Variedade de soja XB09J04 (US2004172711); Variedade de soja XB32Y04 (US2004194169); Variedade de soja XB44D04 (US2004172710); Variedade de soja XB44C04 (US2004172709); Variedade de soja XB 1OL04 10 (US2004172708); Variedade de soja XB 19U04 (US2004172707); Variedade de soja XB02F04 (US2004172706): Variedade de soja XB 25X04 (US2004172705); Variedade de soja XB26L04 (US2004172704); Variedade de soja XB 1 1F04 (US2004172703); Variedade de soja XB40Z04 (US2004177415); Variedade de soja XB40Y04 (US2004181833): Variedade 15 de soja XBO07C04 (US2004181832); Variedade de soja 96M20
. (US2004172702): de soja XB29A04 Variedade de soja XB39J04 (US2004172700): (US2004172701); Variedade Variedade de soja XB35P04 (US2004172699): Variedade de soja XB58Z04 (US2004177414); Variedade de soja XB43R04 (US2004172698); Variedade de soja XB35L04 20 (US2004172697); Variedade de soja XB06H04 (US2004172696); Variedade de soja XB59U04 (US2004172695); Variedade de soja XB64C04 (US2004172694); Variedade de soja 95M80 (US2004172693); Variedade de Soja XB35Q04 (US2004177413); Variedade de soja XB04D04 (US2004177412): Variedade de soja XB08L04 (US2004177411); Variedade 25 de soja XB18Q04 (US2004177410); Variedade de soja XB16Q04 (US2004177409): Variedade de soja XB55K04 (US2004172692); Variedade de soja XB57M04 (US2004172691); Variedade de soja XB25L04 (US2004205863); Variedade de soja XB48T04 (US2004194168); Variedade de soja XB42X04 (US2004199959); Variedade de soja XB31T04 30 (US2004177408); Variedade de soja XB31 U04 (US2004194167); Variedade de soja XB30E04 (US2004177407); Variedade de soja XB31R04 (US2004177406); Variedade de soja S03-95341-A98-60618 (US6909033);
Variedade de soja SN97-6946 (US2004168227); Variedade de soja 94M70 (US6864408): Variedade de soja 92M70 (US6797866); Variedade de soja 92M71 (US6858782); Variedade de soja 91M40 (US6828490); Variedade de soja 93M80 (US6849789); Variedade de soja XB39N03 (US6864407); Vari- 5 edade de soja 93M90 (US6846975); Variedade de soja 90M90 (US6852913): Variedade de soja 92M72 (US6960708); Variedade de soja 91M90 (US6849788); Variedade de soja 92M50 (US6855876); Variedade de soja 92M30 (US6951974); Variedade de soja 93M60 (US6797865); Varie- dade de soja 93M40 (US6791016); Variedade cie soja 93M41 (US6835875); 10 Variedade de Soja XB 15P03 (US6797864): Variedade de soja XB24H03 (US6936752): Variedade de soja XB05A03 (US6815585); Variedade de soja 92M80 (US6849787); Variedade de soja XB33S03 (US6855875); Variedade de soja XB48P03 (US6797863); Variedade de soja XB29X03 (US6806406); Variedade de soja XB02C03 (US6800795); Variedade de soja XB29W03 15 (US6858781); Variedade de soja 91M1O (US6958437): Variedade de soja 92M1O (US6916975); Variedade de soja XB 1OG03 (US6806405); Varieda- . de de soja 92M31 (US6846974); Variedade de soja XB38D03 (US6806404); Variedade de soja XB34N03 (US68035O8); Variedade de soja XB30W03 (US6809236): Variedade de soja XB37J03 (US6844488); Variedade de soja 20 SE72581 (US2004148665); Variedade de soja SE90076 (US2004148664); Variedade de soja SD82997 (US2004148663); Variedade de soja 0037393 (US2004148662); Variedade de soja 0088414 (US2004148661); Variedade de soja 0149926 (US2004148660); Variedade de soja 0037209 (US2004148659); Variedade de soja 93B36 (US6833498); Variedade de 25 soja 90B74 (US6812384); Variedade de soja 90B51 (US6818809); Varieda- de de soja 91B03 (US6815584); Variedade de soja 95B43 (US6818808); Variedade de soja 95B42 (US6815583); Variedade de soja 92B47 (US6812383): Variedade de soja SE90346 (US2004055055); Variedade de Soja 0007583 (US2004010824); Variedade de soja 0008079 30 (US2004010823); Variedade de soja S02-AP98041-2-333-01 (US2003121076); Variedade de soja S02-98041-2-251-01 (US2003182694); Variedade de soja S02-AP98041-2-262-02 (US2003196220); Variedade de soja S02-95021-55-240-BA (US2003188348); Variedade de soja APA94- 31572 (US2003061641): Variedade de Soja AP98041-1-203 (US2003056251): Variedade de soja APA95-15294 (US2003061640); Varie- dade de soja AP98041-4-117 (US2003056250); Variedade de soja 91B33
5 (US6580018); Variedade de soja 93B85 (US6605762): Variedade de soja 92B76 (US661091 1); Variedade de soja 92B38 (US6605761); Variedade de soja 94B24 (US6613967); Variedade de soja 94B73 (US6605760); Varieda- de de soja 93B86 (US6610910); Variedade de soja 91B12 (US6583343); Variedade de soja 95B34 (US6605759); Variedade de soja 94B23
10 (US6605758); Variedade de soja 90811 (US6583342); Variedade de soja 91B92 (US6586659); Variedade de soja 95B96 (US6605757); Variedade de soja 93B72 (US6566589); Variedade de soja 95B97 (US6613966); Varieda- de de soja 92B95 (US6608243): Variedade de soja 93B47 (US6583341); Variedade de soja 97B52 (US6605756); Variedade de soja 93B 15
15 (US6617499); Variedade de soja 94B54 (US6613965); Variedade de soja 93B67 (US6573433); Variedade de soja 93B87 (US6727410); Variedade de ¶
Soja 96B51 (US6613964): Variedade de soja 92B84 (US6730829); Varieda-
" de de soja 92B 12 (US6605755); Variedade de soja 90A07 (US6320105); Variedade de soja 93B26 (US6342659); Variedade de soja 96B21
20 (US6369301): Variedade de soja 92B63 (US6326529): Variedade de soja 93B46 (US6323402); Variedade de soja 92B75 (US6362400): Variedade de soja 93B08 (US6323401); Variedade de soja 97B62 (US6323400); Varieda- de de soja 92B37 (US6323399); Variedade de soja 92B56 (US6339186): Variedade de soja 93B66 (US6307131); Variedade de soja 92B62
25 (US6346657): Variedade de soja 92B36 (US6369300); Variedade de soja 90B73 (US6316700); Variedade de soja 95B95 (US6323398); Variedade de Soja 93B65 (US6229074): Variedade de soja 92B24 (US6284950); Varieda- de de soja 94B53 (US6235976); Variedade de soja 94B22 (US6140557); Variedade de soja 93B84 (US6143956); Variedade de soja 95B32
30 (US6229073); Variedade de soja 95B53 (US6147283); Variedade de soja 93B35 (US6153816); Variedade de soja 93B07 (US6143955); Variedade de soja 92B74 (US6124526): Variedade de soja 92B35 (US6166296); Varieda-
ç µ j
117/118 de de Soja 94B45 (US6162968); Variedade de soja 96801 (US6143954); Variedade de soja 93B53 (US6335197). É observado que a introgressão dos eventos elite nestes cultiva- res não influencia significativamente qualquer uma das características feno- 5 típicas ou agronômicas destes cultivares (sem arraste de rendimento) en- quanto a expressão do transgene, conforme determinado por tolerância a glifosato e/ou isoxaflutol ou glufosinato, atinge os níveis comercialmente a- ceitáveis.
Os conjuntos podem ser vantajosamente ainda combinados com 10 um ou mais outros eventos de soja disponíveis no mercado, incluindo entre outros eventos de toíerância a herbicida, como eventos descritos em peti- ções USDA-APHIS: 09-349-01p, 09-201-O1p, 09-183-01p, 09-082-01p, 09- 015-01P, 06-354-01p, 06-271-O1p, 06-178-01p, 98-238-01p, 98-014-01p, 97- 008-01p, 96-068-01p, 95-335-01p, 93-258-01p, (vide, por exemplo, 15 www.aphis.usda.gov/brs/not_ reg.html) ou evento MON89788 (tolerância a Glifosato) descrito em US 2006-282915, evento DP-305423-1 (tolerância a ácido oleico / inibidor de ALS) descrito em WO 2008/054747, MON87701 descrito em US2009130071, evento 3560,4.3.5 descrito em US2009036308, ou evento DP-305423-1 descrito em US2008312082, ou evento BPS-CV127- 20 9 (Evento 127) de WO 2010/080829. Conforme usado nas reivindicações abaixo, salvo se claramente indicado de outra forma, o termo "planta" tem a intenção de incluir tecidos de planta, em qualquer estágio de maturidade, bem como qualquer célula, teci- do ou órgãos extraídos de ou derivados de qualquer dita planta, incluindo, 25 entre outros, qualquer semente, folha, caule, flores, raizes, células simples, gametas, cultura de células, culturas de tecidos ou protoplastos.
Semente de referência compreendendo evento elite EE-GM3 foi depositada conforme 32-RRMM-0531 em NCIMB (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Scotland) em 12 de outu- 30 bro de 2009, com NCIMB número de acessão NCIMB 41659, e a viabilidade da mesma foi confirmada.
Um nome alternativo para EE-GM3 é evento FG- 072, ou MST-FG072-3.
Semente de referência compreendendo evento elite EE-GMI foi depositada conforme 32RRMM0368 em NCIMB (Ferguson Building.
Craibs- tone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA.
Scotland) em 12 de outubro de 2009, com NCIMB número de acessão NCIMB 41658. Um nome alternativo para EE-GMI é LL,27, A2704-12, ou ACS-GM005-3. Semente de referência compreendendo evento elite EE-GM2 foi depositada conforme 32CON0688 em NCIMB (Ferguson Building, Craibsto- ne Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Scotland) em 12 de outubro de 2009, com NCIMB número de acessão NCIMB 41660. Um nome alternativo para EE-GM2 é LL55, A5547-127, ou ACS-GM006-4. Semente de referência compreendendo evento elite EE-GM3 e EE-GMI foi depositado como soja 111606 em ATCC (American Type Cultu- re Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209, USA) em 11 de junho de 2010, em ATCC número de acessão PTA-11041. Semente de referência compreendendo evento elite EE-GM3 e EE-GM2 foi depositado como soja 05SHX2XEB em ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209, USA) em 11 de junho de 2010, em ATCC número de acessão PTA-11042. A descrição acima da invenção pretende ser ilustrativa como i-
lustrativa e não limitante.
Várias alterações ou rnodificações nas modalidades descritas podem ocorrer aos especialistas na técnica.
Estas podem ser feitas sem se afastar do espírito ou escopo da invenção.
W _ r . 1/118 Relatório Descritivo da Patente de lnvenção para "'PLANTAS DE
SOJA TOLERANTES A HERBICIDA E MÉTODOS PARA IDENTIFICAR AS MESMAS". Referência cruzada a pedidos relacionados 5 Este pedido reivindica prioridade do pedido de patente provisório US 61/367.251, depositado em 23 de julho de 2010; pedido de patente pro- visório 61/263.707, depositado em 23 de novembro de 2009, e pedido de patente europeia EP 09014565.7, depositado dia 23 de novembro de 2009, as revelações de cada um estão aqui incorporadas como referência em suas 10 totalidades. Campo da lnvenção Esta invençáo refere-se a plantas de soja transgênicas, material de planta e sementes, caracterizadas por abrigar pelo menos dois eventos de transformação específicos, nomeadamente através da presença de pelo 15 menos dois conjuntos de genes que codificam proteínas que conferem tole- " rância a herbicidas, cada um em um local especifico no genoma de soja. As plantas de soja da invenção combinam o fenótipo de tolerância a herbicida com um desempenho agronômico, estabilidade genética e funcionalidade em diferentes origens genéticas equivalentes para a linhagem da soja não 20 transformada na ausência de herbicida. Esta invenção fornece ainda méto- dos e kits para identificar a presença de material de planta compreendendo especificamente evento de transformação EE-GM3 e EE-GM2 ou EE-GMI em amostras biológicas- Antecedentes da lnvenção 25 A expressão fenotípica de um transgene em uma planta é de- terminada tanto pela estrutura do gene ou pelos próprios genes quanto por suas localizações no genoma da planta- Ao mesmo tempo, a presença dos transgenes ou "DNA estrangeiro" em diferentes locais no genoma irá influ- enciar o fenótipo geral da plarita de diferentes formas. A introdução agrono- 30 micamente ou industrialmente bem-sucedida de um traço comercialmente interessante em uma planta por manipulação genética pode ser um processo lento dependente de fatores diferentes. A transformação real e regeneração
Claims (26)
1. Método para o controle de ervas daninhas, caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação dos herbicidas glifosato, glufosinato ou isoxaflutol em plantas, células, partes, sementes de soja ou progênie das 5 mesmas, em que as referidas plantas, células, partes, sementes ou progênie compreendem evento elite EE-GM3 e evento elite EE-GM1 ou evento elite EE-GM3 e evento elite EE-GM2 em seu genoma, em que a semente de refe- rência compreendendo o referido evento elite EE-GM3 é depositada sob o número NCIMB de depósito, NCIMB 41659, a semente de referência com- preendendo o referido evento elite EE-GM2 é depositada sob o número NCIMB de depósito, NCIMB 41660, e a semente de referência compreen- dendo o referido evento elite EE-GM1 é depositada sob o número NCIMB de depósito, NCIMB 41658.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas plantas, células, partes, sementes ou progênie com- preendem evento elite EE-GM3 e evento elite EE-GM1 ou evento elite EE- GM3 e evento elite EE-GM2 em seu genoma, em que o referido evento elite EE-GM3 compreende um DNA exógeno compreendendo um gene quimérico que codifica HPPD Pf W336 e um gene quimérico que codifica 2mEPSPS, o referido evento elite EE-GM3 compreende a sequência de nucleotídeos 1 a 1451 de SEQ ID NO: 2 imediatamente à montante do, e contígua com, o re- ferido DNA exógeno e a sequência de nucleotídeos 241 a 1408 de SEQ ID NO: 3 imediatamente à jusante do, e contígua com, o referido DNA exógeno e em que o referido evento elite EE-GM2 ou EE-GM1 compreende um DNA exógeno compreendendo um gene quimérico que codifica fosfinotricina ace- tiltransferase, o referido evento elite EE-GM2 compreende a sequência de nucleotídeos 1 a 311 de SEQ ID NO: 14 imediatamente à montante do, e contígua com, o referido DNA exógeno e a sequência de nucleotídeos 508 a 1880 de SEQ ID NO: 15 imediatamente à jusante do, e contígua com, o refe- rido DNA exógeno, e o referido evento elite EE-GM1 compreende a sequên- cia de nucleotídeos 1 a 209 de SEQ ID NO: 12 imediatamente à montante do, e contígua com, o referido DNA exógeno e a sequência de nucleotídeos
569 a 1000 de SEQ ID NO: 13 imediatamente à jusante do, e contígua com, o referido DNA exógeno e, em que a semente de referência compreendendo o referido evento elite EE-GM3 é depositada sob o número NCIMB de depó- sito, NCIMB 41659, a semente de referência compreendendo o referido e- 5 vento elite EE-GM2 é depositada sob o número NCIMB de depósito, NCIMB 41660, e a semente de referência compreendendo o referido evento elite EE-GM1 é depositada sob o número NCIMB de depósito, NCIMB 41658.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o DNA exógeno inserido no EE-GM3 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 20, da posição de nucleotídeo 1452 à posi- ção de nucleotídeo 16638, e em que o DNA exógeno inserido no EE-GM2 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 14, do nucleotídeo 312 ao nucleotídeo 810 e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 507, e em que o DNA exógeno inserido no EE-GM1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12, do nucleotídeo 210 ao nucleotídeo 720 e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 13, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 568.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas plantas, células, partes, sementes ou progênie com- preendem em seu genoma, em ordem, as seguintes sequências de nucleotí- deos: a) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, do nucleotí- deo 1 ao 1451; b) a sequência de nucleotídeos do complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, do nucleotídeo 6760 ao nucleotídeo 6958; c) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, do nucleotídeo 6874 ao nucleotídeo 7298; d) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, do nucleotí- deo 7 ao nucleotídeo 7291; e) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, do nucleotí- deo 12 ao nucleotídeo 7265; f) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, do nucleotídeo
217 ao nucleotídeo 240; e g) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, do nucleotí- deo 241 ao nucleotídeo 1408; e compreendendo ainda em ordem, as seguintes sequências de 5 nucleotídeos: h) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 14, do nucleotí- deo 1 ao nucleotídeo 311; i) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 11, do nucleotí- deo 3458 ao nucleotídeo 3848; j) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 11, do nucleotí- deo 413 ao nucleotídeo 3457; e k) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, do nucleotí- deo 508 ao nucleotídeo 1880; ou compreendendo, em ordem, as seguintes sequências de nucleotídeos: l) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12, do nucleotí- deo 1 ao nucleotídeo 209; m) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 11, do nucleotí- deo 340 ao nucleotídeo 3461; n) a sequência de nucleotídeos do complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 11, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 336; o) a sequência de nucleotídeos do complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 11, do nucleotídeo 3462 ao nucleotídeo 4076; p) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 11, do nucleotí- deo 337 ao nucleotídeo 3043; q) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 13, do nucleotí- deo 559 ao nucleotídeo 568; e r) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 13, do nucleotí- deo 569 ao nucleotídeo 1000.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido evento elite EE-GM3 compreende uma molécula de ácido nucleico com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 20.
6. Uso de plantas, células, partes, sementes de soja ou progênie das mesmas, caracterizado pelo fato de que as referidas plantas, células, partes, sementes de soja ou progênie da mesma são usadas em um método de controle de ervas daninhas, em que as referidas plantas, células, partes, 5 sementes ou progênie compreendem em seu genoma o evento elite EE- GM3, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e o evento elite EE-GM1 ou EE-GM2, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5.
7. Produto de soja, caracterizado pelo fato de que é produzido a partir da semente compreendendo eventos elites EE-GM3 e EE-GM2 ou e- ventos elites EE-GM3 e EE-GM1, em que o referido produto de soja é, ou compreende, flocos, farinha, sementes moídas, ou refeição de soja, e em que os referidos eventos elites EE-GM3, EE-GM2 e EE-GM1 são como defi- nidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
8. Método para produzir o produto de soja, como definido na rei- vindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende a obtenção de se- mente de soja compreendendo evento elite EE-GM3 e evento elite EE-GM2 ou EE-GM1, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e a produção de tal produto de soja a partir desta.
9. Método para o controle de ervas daninhas em um campo de plantas de soja compreendendo eventos elites EE-GM3 e EE-GM2 ou even- tos elites EE-GM3 e EE-GM1, como definidos em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende o tratamento do campo com uma quantidade eficaz de um herbicida com base em glufosina- to e/ou com base em glifosato e/ou com base em isoxaflutol, em que tais plantas são tolerantes a tais herbicidas.
10. Método para o controle de ervas daninhas, caracterizado pe- lo fato de que compreende o tratamento de um campo em que sementes contendo eventos elites EE-GM3 e EE-GM2 ou eventos elites EE-GM3 e EE- GM1 foram semeadas com um herbicida inibidor HPPD, tal como isoxaflutol, opcionalmente seguido de aplicação de glifosato e/ou glufosinato como her- bicida pós-emergência no topo das plantas, em que os referidos EE-GM3,
EE-GM2 e EE-GM1 são como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
11. Método para o controle de ervas daninhas, caracterizado pe- lo fato de que compreende o tratamento plantas de soja contendo eventos 5 elites EE-GM3 e EE-GM2 ou eventos elites EE-GM3 e EE-GM1 foram se- meadas com um herbicida inibidor HPPD, tal como isoxaflutol, no topo das plantas, aplicado juntamente com, seguido de, ou precedido pelo tratamento com glifosato e/ou glufosinato como herbicida pós-emergência no topo das plantas, em que os referidos EE-GM3, EE-GM2 e EE-GM1 são como defini- dos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
12. Método para produzir uma planta de soja tolerante aos her- bicidas glifosato e/ou glufosinato e/ou isoxaflutol, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução no genoma de tal planta dos eventos elites EE-GM3 e EE-GM2 ou eventos elites EE-GM3 e EE-GM1, em que EE-GM3, EE-GM2 e EE-GM1 são como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pe- lo fato de que a referida planta é obtida através do cruzamento de uma pri- meira planta compreendendo evento elite EE-GM3 com uma planta de soja compreendendo evento elite EE-GM1 ou EE-GM2, e seleção da progênie de planta tolerante ao glufosinato e glifosato ou glufosinato e isoxaflutol.
14. Método para a identificação da presença simultânea de e- ventos elites EE-GM3 e EE-GM2 ou eventos elites EE-GM3 e EE-GM1 em amostras biológicas, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção de uma região específica EE-GM3 com um par de iniciador específico que reconhece especificamente a região flanqueadora 5' ou 3' e o DNA exógeno contíguo a esse no EE-GM3 e detecção de uma região específica EE-GM2 ou EE-GM1 com um par de iniciador específico que reconhece especifica- mente a região flanqueadora 5' ou 3' e o DNA exógeno contíguo a esse no EE-GM2 ou EE-GM1, o referido método compreendendo a amplificação de dois fragmentos de DNA de entre 50 e 1000 pb de um ácido nucleico pre- sente nas referidas amostras biológicas usando i) uma primeira reação em cadeia da polimerase com pelo menos dois iniciadores, um dos referidos iniciadores reconhecendo a região flanqueadora 5' de EE-GM3, cuja região flanqueadora 5' compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 1451, o outro iniciador dos referidos inicia- 5 dores reconhecendo uma sequência na região do DNA exógeno de EE-GM3 que compreende a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID NO: 2, do nucleotídeo 1452 ao nucleotídeo 1843, ou um dos referidos inicia- dores reconhecendo a região flanqueadora 3' de EE-GM3, cuja região flan- queadora 3' compreende a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID NO: 3, do nucleotídeo 241 ao nucleotídeo 1408, o outro iniciador dos referidos iniciadores reconhecendo a sequência no DNA exógeno de EE- GM3 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 240, e usando ii) uma segunda reação em ca- deia da polimerase com pelo menos dois iniciadores, um dos referidos inici- adores reconhecendo a região flanqueadora 5' de EE-GM2, a referida região flanqueadora 5' compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 14, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 311, o outro iniciador dos referidos iniciadores reconhecendo o DNA exógeno contíguo com a região flanquea- dora 5' de EE-GM2, o referido DNA exógeno compreendendo a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID NO: 14, do nucleotídeo 312 ao nucleotídeo 810, ou um dos referidos iniciadores reconhecendo a região flanqueadora 3' de EE-GM2, cuja região flanqueadora 3' compreende a se- quência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID NO: 15, do nucleotídeo 508 ao nucleotídeo 1880, o outro iniciador dos referidos iniciadores reconhe- cendo uma sequencia no DNA exógeno de EE-GM2 contígua com a região flanqueadora 3' de EE-GM2, o referido DNA exógeno compreendendo a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 507, ou usando iii) uma segunda reação em cadeia da polimerase com pelo menos dois iniciadores, um dos referidos iniciadores reconhecendo a região flanqueadora 5' de EE-GM1, a referida região flanqueadora 5' compreen- dendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 209, o outro iniciador dos referidos iniciadores reconhecendo o
DNA exógeno contíguo com a região flanqueadora 5' de EE-GM1, o referido DNA exógeno compreendendo a sequência de nucleotídeos do complemen- to de SEQ ID NO: 12, do nucleotídeo 210 ao nucleotídeo 720, ou um dos referidos iniciadores reconhecendo a região flanqueadora 3' de EE-GM1, 5 cuja região flanqueadora 3' compreende a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID NO: 13, do nucleotídeo 569 ao nucleotídeo 1000, o outro iniciador dos referidos iniciadores reconhecendo uma sequencia no DNA exógeno de EE-GM1 contígua com a região flanqueadora 3' de EE- GM2, o referido DNA exógeno compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 13, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 568, em que as referi- das primeira e segunda reação em cadeia da polimerase podem ser se- quenciais ou simultâneas.
15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pe- lo fato de que os referidos iniciadores específicos EE-GM3 compreendem a sequência de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 4, ou a sequência de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7 e, em que os referidos iniciadores específicos EE- GM2 compreendem a sequência de SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19, e os referidos iniciadores específicos EE-GM1 compreendem a sequência de SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17, respectivamente.
16. Pares de iniciadores adequado para uso na detecção especí- fica de eventos elites EE-GM3 e EE-GM2 ou eventos elites EE-GM3 e EE- GM1, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro iniciador compreen- dendo uma sequencia que reconhece uma sequência na região flanqueado- ra 5' ou 3' de EE-GM3, a referida região flanqueadora 5' compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, do nucleotídeo 1 ao nucleotí- deo 1451, e a referida região flanqueadora 3' compreendendo a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID NO: 3, do nucleotídeo 241 ao nucleotídeo 1408, e o referido segundo iniciador compreendendo uma se- quencia que reconhece uma sequência na sequência de DNA exógeno con- tígua com a região flanqueadora 5' ou 3' no EE-GM3, o referido DNA exóge- no contíguo com a região flanqueadora 5' compreendendo a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID NO: 2, do nucleotídeo 1452 ao nucleotídeo 1843, e o referido DNA exógeno contíguo com a região flanque- adora 3' compreendendo a sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 3, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 240, o terceiro iniciador compreendendo uma sequencia que reconhece uma sequência na região flanqueadora 5' ou 3' de 5 EE-GM2, a região flanqueadora 5' compreendendo a sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 14, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 311, e a referida região flanqueadora 3' compreendendo a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID NO: 15, do nucleotídeo 508 ao nucleotídeo 1880, e o referido quarto iniciador compreendendo uma sequencia que reconhece uma sequência nas sequências de DNA exógeno contíguas com a referida região flanqueadora 5' ou 3' de EE-GM2, o referido DNA exógeno contíguo com a referida região flanqueadora 5' compreendendo o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 14, do nucleotídeo 312 ao nucle- otídeo 810, e o DNA exógeno contíguo com a referida região flanqueadora 3' compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, do nucleo- tídeo 1 ao nucleotídeo 507, ou o referido terceiro iniciador compreendendo uma sequencia que reconhece uma sequência na região flanqueadora 5' ou 3' EE-GM1, a região flanqueadora 5' compreendendo a sequência de nu- cleotídeos de SEQ ID NO: 12, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 209, e a refe- rida região flanqueadora 3' compreendendo a sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID NO: 13, do nucleotídeo 569 ao nucleotídeo 1000, e o referido quarto iniciador compreendendo uma sequencia que reconhece uma sequência nas sequências de DNA exógeno contíguas com a referida região flanqueadora 5' ou 3' de EE-GM1, o referido DNA exógeno contíguo com a referida região flanqueadora 5' compreendendo o complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12, do nucleotídeo 210 ao nucle- otídeo 720, e e o DNA exógeno contíguo com a referida região flanqueadora 3' compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 13, do nu- cleotídeo 1 ao nucleotídeo 568.
17. Pares de iniciadores de acordo com a reivindicação 15, ca- racterizado pelo fato de que o primeiro iniciador compreende em sua extre- midade 3', uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, selecionados da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 1451, ou uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, selecionados da sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID NO: 3, do nucleotídeo 241 ao nu- 5 cleotídeo 1408, em que o referido segundo iniciador compreende em sua extremidade 3', uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotí- deos consecutivos, selecionados do complemento da sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 2, do nucleotídeo 1452 ao nucleotídeo 1843, ou uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, selecionados da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, do nucleotí- deo 1 ao nucleotídeo 240, em que o referido terceiro iniciador compreende em sua extremidade 3', uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, selecionados da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 14, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 311, ou uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, selecionados da sequência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID NO: 15, do nucleotí- deo 508 ao nucleotídeo 1880, e em que o referido quarto iniciador compre- ende em sua extremidade 3', uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, selecionados do complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 14, do nucleotídeo 312 ao nucleotídeo 810, ou uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 507, ou em que o referido terceiro iniciador compreende em sua extremidade 3', uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nucleotí- deos consecutivos, selecionados da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 209, ou uma sequência de nucleo- tídeos de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, selecionados da se- quência de nucleotídeos do complemento de SEQ ID NO: 13, do nucleotídeo 569 ao nucleotídeo 1000, e em o referido quarto iniciador compreende em sua extremidade 3', uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 17 nu- cleotídeos consecutivos, selecionados do complemento da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12, do nucleotídeo 210 ao nucleotídeo 720, ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 13, do nucleotídeo 1 ao nucleo-
tídeo 568.
18. Conjunto, caracterizado pelo fato de que compreende quatro iniciadores, em que: um primeiro iniciador compreende em sua extremidade 3’ termi- 5 nal a sequência de SEQ ID NO: 5; um segundo iniciador compreende em sua extremidade 3’ termi- nal a sequência de SEQ ID NO: 4; um terceiro iniciador compreende em sua extremidade 3’ termi- nal a sequência da SEQ ID NO: 18, e um quarto iniciador compreende em sua extremidade 3’ terminal a sequência da SEQ ID NO: 19, ou em que: um primeiro iniciador compreende em sua extremidade 3’ termi- nal a sequência de SEQ ID NO: 5; um segundo iniciador compreende em sua extremidade 3’ termi- nal a sequência de SEQ ID NO: 4; um terceiro iniciador compreende em sua extremidade 3’ termi- nal a sequência da SEQ ID NO: 16, e um quarto iniciador compreende em sua extremidade 3’ terminal a sequência da SEQ ID NO: 17.
19. Método para a identificação da presença simultânea de e- ventos elites EE-GM3 e EE-GM2 ou eventos elites EE-GM3 e EE-GM1 em amostras biológicas, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção de uma região específica EE-GM3 com uma sonda que reconhece especifi- camente a região flanqueadora 5' ou 3' e o DNA exógeno contíguo a esse no EE-GM3 e detecção de uma região específica EE-GM2 ou EE-GM1 com uma sonda que reconhece especificamente a região flanqueadora 5' ou 3' e o DNA exógeno contíguo a esse no EE-GM2 ou EE-GM1, o referido método compreendendo a hibridização de um ácido nucleico de amostras biológicas com uma primeira sonda específica para EE-GM3 e com uma segunda son- da específica para EE-GM2 ou EE-GM1, em que a sequência da referida primeira sonda específica tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência compreendendo parte da sequência flanqueadora 5' ou da sequência flanqueadora 3' de EE-GM3 e da sequência do DNA exógeno contíguo a essa, e em que a referida segunda sonda específica tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência compreendendo parte da sequência flanqueadora 5' ou da sequência flanqueadora 3' de EE- 5 GM2 ou EE-GM1 e da sequência do DNA exógeno contíguo a essa, em que a sequência da referida primeira sonda específica reconhecendo EE-GM3 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, do nucleotídeo 1431 ao nucleotídeo 1472, ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, do nucleotídeo 220 ao nucleotídeo 261, ou o complemento das referidas sequências e, em que a referida segunda sonda específica reconhecendo EE-GM2 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 14, do nucleotídeo 301 ao nucleotídeo 322, ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, do nucleotídeo 497 ao nucleotídeo 518, ou o complemento das referidas sequências e, em que a sequência da referida segunda sonda específica reconhecendo EE-GM1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12, do nucleotídeo 199 ao nucleotídeo 220, ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 13, do nucleotídeo 558 ao nucleotídeo 579, em que a referida região flanqueadora 5' de EE-GM3 compreende a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 1451, o DNA exógeno contíguo com a região flanqueadora 5' compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, do nucleotídeo 1452 ao nucle- otídeo 1843, e em que a região flanqueadora 3' de EE-GM3 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, do nucleotídeo 241 ao nucleo- tídeo 1408, e o DNA exógeno de EE-GM3 contíguo com a referida região flanqueadora 3' compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 240, ou o complemento das referidas se- quências, e em que a referida região flanqueadora 5' de EE-GM2 compreen- de a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 14, do nucleotídeo 1 ao nu- cleotídeo 311, o DNA exógeno contíguo com a região flanqueadora 5' de EE-GM2 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 14, do nucleotídeo 312 ao nucleotídeo 810, e em que a região flanqueadora 3' de EE-GM2 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, do nucleotídeo 508 ao nucleotídeo 1880, e o DNA exógeno de EE-GM2 contí- guo com a referida região flanqueadora 3' de EE-GM2 compreende a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 507, ou o complemento das referidas sequências, e em que a referida região 5 flanqueadora 5' de EE-GM1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 209, o DNA exógeno contí- guo com a região flanqueadora 5' de EE-GM1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12, do nucleotídeo 210 ao nucleotídeo 720, e em que a região flanqueadora 3' de EE-GM1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 13, do nucleotídeo 569 ao nucleotídeo 1000, e o DNA exógeno de EE-GM1 contíguo com a referida região flanqueadora 3' de EE-GM2 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 13, do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 568, ou o complemento das referidas sequên- cias.
20. Par de sondas específicas para a identificação da presença simultânea de eventos elites EE-GM3 e EE-GM2 ou eventos elites EE-GM3 e EE-GM1 em amostras biológicas, caracterizado pelo fato de que as son- das são como definidas na reivindicação 19.
21. Par de sondas de acordo com a reivindicação 20, caracteri- zado pelo fato de que compreende uma primeira sonda compreendendo a sequência de nucleotídeos obtida por amplificação PCR usando os iniciado- res de SEQ ID NOs: 4 e 5 em material biológico compreendendo evento elite EE-GM3, e uma segunda sonda obtida por amplificação PCR usando os ini- ciadores de SEQ ID NOs: 18 e 19 em material biológico compreendendo evento elite EE-GM2, ou uma segunda sonda obtida por amplificação PCR usando os iniciadores de SEQ ID NOs: 16 e 17 em material biológico com- preendendo evento elite EE-GM1, em que a semente de referência compre- endendo o referido evento elite EE-GM3 é depositada sob o número NCIMB de depósito, NCIMB 41659, a semente de referência compreendendo o refe- rido evento elite EE-GM2 é depositada sob o número NCIMB de depósito, NCIMB 41660, e a semente de referência compreendendo o referido evento elite EE-GM1 é depositada sob o número NCIMB de depósito, NCIMB
41658.
22. Kit para a identificação da presença simultânea de eventos elites EE-GM3 e EE-GM2 ou eventos elites EE-GM3 e EE-GM1 em amos- tras biológicas, caracterizado pelo fato de que compreende os iniciadores, 5 como definidos na reivindicação 14 ou 15 ou as sondas, como definidas na reivindicação 20 ou 21.
23. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 19, para con- firmar a pureza de sementes ou para rastrear sementes para a presença de evento elite EE-GM3, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção de uma região específica EE-GM3 com os referidos iniciadores ou sondas específicos que reconhecem especificamente a região flanqueadora 5 'ou 3' de EE-GM3 e o DNA exógeno contíguo a essa, e a detecção de uma região específica EE-GM2 ou EE-GM1 com iniciadores ou sondas específicos que reconhecem especificamente a região flanqueadora 5 'ou 3' de EE-GM2 ou EE-GM1 e o DNA exógeno contíguo a essa em amostras de sementes.
24. Método para detectar a presença de eventos elites EE-GM3 e EE-GM2, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 em amostras biológicas através de hibridização com uma sonda de ácido nuclei- co substancialmente complementar marcada, na qual a proporção son- da:ácido nucleico alvo é amplificada por meio da reciclagem da sequência de ácido nucleico alvo, caracterizado pelo fato de que compreende: a) hibridizar a referida sequência-alvo de ácido nucleico para um primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, do nucleotídeo 1452 ao nucleotídeo 1469 ou o seu complemento ou o referido primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, do nucleotí- deo 223 ao nucleotídeo 240 ou o seu complemento; b) hibridizar a referida sequência-alvo de ácido nucleico para um segundo oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, do nucleotídeo 1434 ao nucleotídeo 1451, ou o seu complemento, ou a referida sonda de ácido nucleico marcada compre- endendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, do nucleotídeo 241 ao nucleotídeo 258 ou o seu complemento, em que os referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos sobrepõem-se por pelo menos um nucleotídeo e, em que tanto o referido primeiro ou segundo oligonucleotídeo é marcado para ser a referida sonda de ácido nucleico marcada; 5 c) clivar apenas a sonda marcada dentro da sonda: sequência de ácido nucleico alvo duplex com uma enzima que causa a clivagem da sonda seletiva resultando em dissociação duplex, deixando a sequência-alvo intacta; d) reciclar a sequência de ácido nucleico alvo através da repeti- ção das etapas (a) a (c), e e) detectar a sonda marcada clivada, determinando assim a pre- sença da referida sequência de ácido nucleico alvo; e f) hibridizar a referida sequência-alvo de ácido nucleico para um terceiro oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 14, do nucleotídeo 312 ao nucleotídeo 329 ou o seu complemento ou o referido terceiro oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, do nucleo- tídeo 490 ao nucleotídeo 507 ou o seu complemento; g) hibridizar a referida sequência-alvo de ácido nucleico para um quarto oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 14, do nucleotídeo 294 ao nucleotídeo 311, ou o seu complemento, ou a referida sonda de ácido nucleico marcada compre- endendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, do nucleotídeo 508 ao nucleotídeo 525 ou o seu complemento, em que os referidos terceiro e quarto oligonucleotídeos sobrepõem-se por pelo menos um nucleotídeo e, em que tanto o referido terceiro ou quarto oligonucleotídeo é marcado para ser a referida sonda de ácido nucleico marcada; h) clivar apenas a sonda marcada dentro da sonda: sequência de ácido nucleico alvo duplex com uma enzima que causa a clivagem da sonda seletiva resultando em dissociação duplex, deixando a sequência-alvo intacta; i) reciclar a sequência de ácido nucleico alvo através da repeti-
ção das etapas (f) a (h), e j) detectar a sonda marcada clivada, determinando assim a pre- sença da referida sequência de ácido nucleico alvo.
25. Método para detectar a presença de eventos elites EE-GM3 5 e EE-GM1, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 em amostras biológicas através de hibridização com uma sonda de ácido nuclei- co substancialmente complementar marcada, na qual a proporção son- da:ácido nucleico alvo é amplificada por meio da reciclagem da sequência de ácido nucleico alvo, caracterizado pelo fato de que compreende: a) hibridizar a referida sequência-alvo de ácido nucleico para um primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, do nucleotídeo 1452 ao nucleotídeo 1469 ou o seu complemento ou o referido primeiro oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, do nucleotí- deo 223 ao nucleotídeo 240 ou o seu complemento; b) hibridizar a referida sequência-alvo de ácido nucleico para um segundo oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, do nucleotídeo 1434 ao nucleotídeo 1451, ou o seu complemento, ou a referida sonda de ácido nucleico marcada compre- endendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, do nucleotídeo 241 ao nucleotídeo 258 ou o seu complemento, em que os referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos sobrepõem-se por pelo menos um nucleotídeo e, em que tanto o referido primeiro ou segundo oligonucleotídeo é marcado para ser a referida sonda de ácido nucleico marcada; c) clivar apenas a sonda marcada dentro da sonda: sequência de ácido nucleico alvo duplex com uma enzima que causa a clivagem da sonda seletiva resultando em dissociação duplex, deixando a sequência-alvo intacta; d) reciclar a sequência de ácido nucleico alvo através da repeti- ção das etapas (a) a (c), e e) detectar a sonda marcada clivada, determinando assim a pre- sença da referida sequência de ácido nucleico alvo; e f) hibridizar a referida sequência-alvo de ácido nucleico para um terceiro oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12, do nucleotídeo 210 ao nucleotídeo 227 ou o seu complemento ou o referido terceiro oligonucleotídeo de ácido nucleico 5 compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 13, do nucleo- tídeo 561 ao nucleotídeo 568 ou o seu complemento; g) hibridizar a referida sequência-alvo de ácido nucleico para um quarto oligonucleotídeo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 12, do nucleotídeo 192 ao nucleotídeo 209, ou o seu complemento, ou a referida sonda de ácido nucleico marcada compre- endendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 13, do nucleotídeo 569 ao nucleotídeo 586 ou o seu complemento, em que os referidos terceiro e quarto oligonucleotídeos sobrepõem-se por pelo menos um nucleotídeo e, em que tanto o referido terceiro ou quarto oligonucleotídeo é marcado para ser a referida sonda de ácido nucleico marcada; h) clivar apenas a sonda marcada dentro da sonda: sequência de ácido nucleico alvo duplex com uma enzima que causa a clivagem da sonda seletiva resultando em dissociação duplex, deixando a sequência-alvo intacta; i) reciclar a sequência de ácido nucleico alvo através da repeti- ção das etapas (f) a (h), e j) detectar a sonda marcada clivada, determinando assim a pre- sença da referida sequência de ácido nucleico alvo.
26. Invenção, caracterizada pelo fato de ser de quaisquer produ- tos, processos, usos ou reivindicações descritos no, ou derivados do, pedido de patente PCT equivalente, conforme originalmente depositado, por um técnico no assunto, incluindo os seus exemplos, listagem de sequências e figuras.
b çn
O ,j,})')' §)'Í ")'\u)i)r
E tzo
CU W b— '4—
ÚJ ·LL
V B 2/6 cl a .o -q cj ¢> cj Cj co a j j '4> o « , m ® k ? f-,±. <·'1:& E!,?à5 : aL¥' ·· }¥:¥7'±":; r:,[';'·¢ ,. '"*:" . cd ' u?:s'"° " ;µ ,â" : à? ." ç:|f " "" /,.'{4' e' Ç- · 'Z' "'· ,, ·a .$!) m '# kj Lt) ' i :¶, -· ' . $ ... .q,. 3 .. . " g - "' 'tj'" - '.' % ,, ';t," ' ¶y,7 :±"' . r"' " !":')i)"i)'!',è't!Z'd - ;.çí'j' ji4fx \:gjj':""'í ' '])'":"ii!)Ê m ' f n { .
' g ' :ͱ - " xQ h I
P tt q- a úQ m çg c) f cd < n
N
Ô e
LL ín Cj ,,,,,i)L- "' ')')")
C QJ C'J
E &0
CU Ò 5~ - ií
± rn c> E k* S
O e (U ' Q) 3 rj'j k e â ,-_ J)jsq ! )§) Ê,j,
P C) L- 'à) i ' '))))"'i 6 < e uo CU õ k ií q í 5/6 Q. Q- -D .D O C3 Ç;J O © <
I I f . I LD ' 7. , h ) " , -¢ , 1 ,'1 ,[I :$ '1) · m Y, C) I "lr """" 'K/'.'" .. 4' - ' ^' -, 'í' ,L ' zèj $ , r"à" ' ' 3 . *" 'y ' K < .'r '!é: ÕJ" ,5" ". » ·a . " " sií 4', " · - ..'È," 'ȱ .%, Y $'i, ;j,¥"' C\J '!S "' ·,5£tr 'jY' . , ""'94 lf. i? " ?; -., £. Í 4 -b éj ?e Z·.&' átM, K·' ·», . ' ,j' :,,.. -C r r jj; " m f I y,' ,, ""Y "¥'L' "· " 4 ' T :'1 jC7' ' 'l '! , Q- -Q t O. .Q cn Q'J m CJO m" m új
ÜJ ií í 6/6
Ó e m + g0 · b '"r %.1 ' ""' " ·.í q . . ,.
+. ·z t' ' u 'A .... .> . :".' ' ' % ,â, + 'íé·:,.,-.K-l·"""" "' i'fÈ -' )tt':::?)'!·'j:'R4,0i"..,Ê":!:)-'""-Y)"?§È",:. 'ii' ç ,' ! l '. f ,.J i "'V ' . . .. '"·"íf, ' ^ " ¥' ., V .·.." 'b'íiq - M:q. £.·.., ,-g.;. ' ' 7 l':í l. " á$ú $tj "4 L ' b· .- ,b, ' ' ,. .'-7 Ü t j ' j' "¶ k k "L W ' '""%: "":'""" · (· ..,,. g .
T -<'i" 'k '· '"'4'j;k' "Aj "' " l r ' w" ,> ' q . % . ,\ " ,· 'g N ' ·: -, · µ µ · . ) J r. 7 . ..
,,n . . ":j)k-:!"¢3yc)!!'-'"'l¢ij1¢"")".i")!:"' "f'¢2Yi'""!-!'íbq']':f7'I?-""-'í%y"'""" '"i :),'")I:4'z")|)"))f||)Ê1"""i'"").'j|f||'"j7""'"é||':'y·' -'íj'"q'·'.-'.'} ))'f):!'j!)'")À'!j:""i.íÍ'")""g'^|)y'|."t'"'s't&¢'<:-'"ttt'91:'À')íl'í" e 4µ 'i' ·.i. i' - . < , /: ÊÊi· b . .. .Wk'4· ' ' : ·":m· ' P "m;r t - '" al 'jg'.t ' - :1. . -F-, W" J < '' ' " .' -51" " · ' m4-.'-Á ' .."""'""-"' K ".-' T2S$Zi' " ' ' =""' *,t.' "' ' ' '" f '-'" k ..,.. · F ·'e · · r, .. .. -i;- , -e 3 A· :j>,
F m· q " . · '4A ' """<1: k é¶' : -. · rp.- Y,Eb ' 4ÀG.?¥<" *1··'m"t d+ ' [ 'n · r W. . b.. .. .
O e a O
N
CD à ií
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US26370709P | 2009-11-23 | 2009-11-23 | |
| EP09014565 | 2009-11-23 | ||
| EP09014565.7 | 2009-11-23 | ||
| US61/263,707 | 2009-11-23 | ||
| US36725110P | 2010-07-23 | 2010-07-23 | |
| US61/367,251 | 2010-07-23 | ||
| PCT/US2010/057886 WO2011063413A2 (en) | 2009-11-23 | 2010-11-23 | Herbicide tolerant soybean plants and methods for identifying same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112012012567A2 true BR112012012567A2 (pt) | 2020-08-11 |
Family
ID=69650473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR112012012567-2A BR112012012567A2 (pt) | 2009-11-23 | 2010-11-23 | plantas de soja tolerantes a herbicida e métodos para identificar as mesmas |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| BR (1) | BR112012012567A2 (pt) |
| CL (1) | CL2012001333A1 (pt) |
| UA (1) | UA114171C2 (pt) |
-
2010
- 2010-11-23 BR BR112012012567-2A patent/BR112012012567A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2010-11-23 UA UAA201207696A patent/UA114171C2/uk unknown
-
2012
- 2012-05-23 CL CL2012001333A patent/CL2012001333A1/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CL2012001333A1 (es) | 2013-01-04 |
| UA114171C2 (uk) | 2017-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10494681B2 (en) | Elite event EE-GM3 and methods and kits for identifying such event in biological samples | |
| AU2010321586C1 (en) | Herbicide tolerant soybean plants and methods for identifying same | |
| ES2654294T3 (es) | Plantas de algodón tolerantes a herbicidas y métodos para identificar las mismas | |
| BRPI0417592B1 (pt) | Molécula de dna, segmento de ácido nucleico, polinucleotídeo, sonda e métodos para detecção de evento de milho e determinação de zigosidade do mesmo | |
| CA3162199A1 (en) | Enhanced disease resistance of maize to northern corn leaf blight by a qtl on chromosome 4 | |
| BR112019012947A2 (pt) | moléculas de ácido nucleico, dna, plantas, produto de soja, métodos para produção de um produto de soja, para proteção de plantas, para produção de uma planta, para identificação, pares de iniciadores, para confirmação da pureza de sementes, para determinação do estado de zigosidade, para redução da perda de rendimento e para aumento do rendimento de plantas, processo para controle de ervas daninhas, uso, sondas, estojo e método de detecção da presença do evento de elite | |
| BR112012012567A2 (pt) | plantas de soja tolerantes a herbicida e métodos para identificar as mesmas | |
| ES2712773T3 (es) | Evento Elite EE-GM3 y métodos y kits para identificar dicho evento en muestras biológicas | |
| BR122023026028A2 (pt) | Método para produção de um produto de soja, processos para controle de ervas daninhas, para proteção de plantas, usos de uma planta e de uma semente de soja e métodos para produção de uma planta, para redução da perda de rendimento e para aumento do rendimento | |
| BR122023026037A2 (pt) | Par de iniciadores, kit e métodos para detecção da presença do evento de elite ee-gm5 e para determinação do estado de zigosidade |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B09B | Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette] | ||
| B12B | Appeal against refusal [chapter 12.2 patent gazette] | ||
| B350 | Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette] | ||
| B25A | Requested transfer of rights approved |
Owner name: MS TECHNOLOGIES, LLC (US) ; BASF AGRICULTURAL SOLUTIONS SEED US LLC (US) |