RS55883B1 - Biljke soje otporne na herbicide i postupci za njihovo identifikovanje - Google Patents

Description

Relevantne aplikacije

[0001]Ova predmetna prijava zahteva korist od Američke provizorne patentne prijave br. 61/367,251, podnete 23. jula 2010.; Američke provizorne patentne prijave br. 61/263,707, podnete 23. novembra 2009.; i Evropske patentne prijave br. EP 09014565.7, podnete 23. novembra 2009.

Tehnička oblast pronalaska

[0002]Ovaj pronalazak se odnosi na transgenične biljke soje, biljni materijal i semenski materijal, koji su karakterizovani sa najmanje dva specifična transformacijska događaja, posebno sa prisutnosti najmanje dva kompleta gena koji kodiraju belančevine koje omogućavaju otpornost (tolerantnost) na herbicid, pri čemu se svaki nalazi na specifičnoj lokaciji u genomu soje. Biljke soje iz ovoga pronalaska spajaju fenotip otpornosti na herbicide sa agronomskim prinosom, genetičku stabilnost sa funkcionalnosti u različitim genetičkim pozadinama koje su ekvivalentne ne-transformiranim linijama soje u odsutnosti herbicida. Ovaj pronalazak dodatno obezbeđuje postupke i komplete hemikalija za identifikovanje prisutnost biljnog materijala koji u biološkim primercima sadrži specifične transformacijske događaje, EE-GM3 i EE-GM2.

Pozadina pronalaska

[0003]Fenotipska ekspresija transgena u nekoj biljci je određena sa strukturom samog gena ili više njih i sa njihovom lokacijom u biljnom genomu. Istovremeno, prisutnost transgena ili "strane DNA" na različitim lokacijama u genomu utiče na celokupni fenotip biljke na različite načine. Agronomski ili industrijski korisno uvođenje komercijalno interesantnog svojstva u gemom biljke uz pomoć genetičke manipulacije može da bude duga procedura koja zavisi o različitim faktorima. Transformacija i regeneracija genetički transformiranih biljka su samo prvi koraci u serijama koraka za selekciju, koji uključuju ekstenzivno genetičko karakterizovanje, uzgoj, i evaluaciju na poljima, koje eventualno može da dovede do selektiranja elitnog događaja.

[0004]Nedvosmislena identifikacija elitnog događaja postaje izuzetno važna kada se govori o novoj hrani/stočnoj hrani, odvajanja GMO od ne-GMO produkata i identifikaciji rasplodnog materijal. Idealno, takav identifikacioni postupak treba da bude brz i jednostavan, bez potrebe za opsežnim laboratorijskim okruženjem. Nadalje, ovaj postupak treba da obezbedi rezultate koji omogućavaju nedvosmisleno potvrđivanje elitnog događaja bez interpretacije eksperata, ali koji će izdržati proveru eksperata ako je potrebno. Ovde su opisani specifični alati potrebni za identifikaciju elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM1 ili EE-GM2 u biološkim primercima.

[0005]U ovom pronalasku, događaj EE-GM3 je identifikovan kao elitni događaj u populaciji transgeničnih biljaka soje tokom razvoja soje koja je tolerantna na herbicid( Glycine max)koje sadrže gen koji omogućava toleranciju na glifosat zajedno sa genom koji donosi toleranciju na inhibitore 4-hidroksi fenilpiruvat dioksigenaze (HPPD), pri čemu su oba pod kontrolom promotora koji može da se eksprimira u biljci. Transgenične biljke koje sadrže gen koji omogućava toleranciju na glifosat zajedno sa genom koji omogućava toleranciju na inhibitore 4-hidroksi fenilpiruvat dioksigenaze (HPPD) su prvobitno opisane u Internacionalnoj patentnoj prijavi WO98/02562.

[0006]Događaji EE-GM1 i EE-GM2 su prethodno identifikovani kao elitni događaji iz populacije transgeničnih biljaka soje tokom razvoja soje( Glycine max)koja je tolerantna na herbicid i koja sadrži gen koji omogućava toleranciju na glufosinat pod kontrolom promotora koji može da se ekspresimira u biljci, a opisani su u dokumentima WO2006/108674 i WO2006/l 08675.

[0007]Biljke soje koje sadrže gen za toleranciju na herbicid su poznate stanju tehnike, na primer Green J. (2009), Evolution of Glvphosate-resistant Crop technologv, Weed Science, 57(1), str. 108-117. Međutim, niti jedan od opisa iz prethodnog stanja tehnike ne govori ili sugeriše ovaj pronalazak.

[0008]U stanju tehnike je poznato da ostvarivanje komercijalnog elitnog transformacijskog događaja tolerantnosti na herbicid u biljkama soje sa prihvatljivom agronomskom izvedbom, bez umanjenja prinosa, i koji obezbeđuje dovoljnu toleranciju na herbicid, obavezno na 3 različite klase herbicida, nikako nije jednostavno.

[0009]Uistinu, poznato je daje prvi događaj tolerancije soje na herbicid (događaj 40-3-2), koji je pušten u prodaju, imao značajno umanjenje prinosa u odnosu na (gotovo-)izogene linije (Elmore et al. (2001) Agron. J. 93:408-412).

[0010]Takođe, soje tipa Optimum™ GAT™ (događaj 356043) su razvijene sa ciljem da se spoji tolerancija na glifosat sa tolerancijom na ALS herbicide, ali je poznato da ove soje, same za sebe, nisu zadovoljavale standarde za toleranciju na glifosat (bez kombinovanja sa drugim događajem tolerancije soje na glifosat (poput događaja 40-3-2) (vidi, na primer,

w\w.bloombergxom/apps/news?pid^tiewsarchive&sid^ad4IJ)hH9MKWE)).

Rezime preferiranih izvedaba iz ovoga pronalaska

[0011]Ovaj pronalazak se odnosi na biljku soje, ili na njene ćelije, delove, semenski materijal, pri čemu svi pomenuti u svojem genomu sadrže elitni događaj EE-GM3 i elitni događaj EE-GM2, i pri čemu pomenuti elitni događaj EE-GM3, deponovan u referentnom semenskon materijalu koji se nalazi u NCIMB pod brojem NCIMB 41659, predstavlja genetički lokus koji sadrži stranu DNA koja obuhvata himerini gen koji kodira 2mEPSPS i himerni gen koji kodira HPPD PF W336, i pri čemu elitni događaj EE-GM2, deponovan u referentnom semenskom materijalu koji se nalazi u NCIMB pod brojem NCIMB 41660, predstavlja genetički lokus koji sadrži stranu DNA koja obuhvata himerni gen koji kodira fosfinotricin acetiltransferazu.

[0012]Još specifičnije, transgenična biljka soje, ili njen semenski materijal, njene ćelije ili tkiva u skladu sa ovim pronalaskom u svom genomu sadrže stabilno ugrađenu ekspresionu kasetu koja sadrži gen za toleranciju na herbicid koji obuhvata kodirajuću sekvencu gena2mEPSPSi drugi gen za toleranciju na herbicid koji obuhvata kodirajuću sekvencu HPPD-PF W336 (obe sekvence su opisane u Primeru 1.1 i predstavljene sa SEQ ID Br 1) kao i drugu ekspresionu kasetu koja sadrži gen za toleranciju na herbicid koji obuhvata kodirajuću sekvencu gena za fosfinotricin acetil transferazu, kao šta je opisano u Primeru 1 i predstavljeno u SEQ ID Br 11. Transgenična biljka soje, ili njen semenski materijal, njene ćelije ili tkiva su tolerantni na herbicide na bazi glifosata, koji je na bazi glufosinata, i na herbicid koji inhibira HPPD poput izoksaflutola, i, u odsutnosti herbicida, pokazuju agronomske rezultate koji su uglavnom podjednaki sa ne-transgeničnom izogenom linijom. Nakon nanošenja jednog ili više herbicida protiv kojih je obezbeđena tolerancija, pomenuta biljka će ispoljiti superioran agronomski fenotip u odnosu na ne-transgeničnu biljku.

[0013]U skladu sa ovim pronalaskom, pomenuta biljka soje ili njen semenski materijal, njene ćelije ili tkiva sadrže elitne događaje EE-GM3 i EE-GM2.

[0014]Još specifičnije, ovaj pronalazak se odnosi na transgeničnu biljku soje, na njen semenski materijal, njene ćelije ili tkiva, čija je genomska DNA karakterizovana sa time da, kada se analizira primenom protokola za PCR identifikaciju, kao šta je ovde opisano, i uz korišćenje dva prajmera komplementarna sa 5'- ili 3'-bočnim regionom iz EE-GM3 i sa stranom DNA, koja u EE-GM-3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, proizvodi fragment koji je specifičan za EE-GM3, i dodatno kada se analizira primenom protokola za PCR identifikaciju, kao šta je ovde opisano, uz korišćenje dva prajmera komplementarna sa 5'- ili 3'-bočnim regionom EE-GM2 i sa stranom DNA, koja sadrži gene za toleranciju na glufosinat, proizvodi fragment koji je specifičan za EE-GM2. Pomenuti prajmeri za detektovanje događaja EE-GM3 mogu da budu komplementarni sa 5'-bočnim regionom iz SEQ ID Br.: 2 i sa stranom DNA koja sadrži gene za toleranciju na herbicid. Pomenuti prajmeri za detektovanje događaja EE-GM3 mogu takođe da budu komplementarni sa 3'-bočnim regionom iz SEQ ID Br.: 3 i sa stranom DNA koja sadrži gene za toleranciju na herbicid, tako da prajmeri koji sadrže ili se sastoje (u suštini) od nukleotidne sekvence SEQ ID Br.: 5 i SEQ ID Br.: 4 ili SEQ ID Br.: 7 proizvede DNA fragment veličine između 100 i 800 bp, poput fragmenta od oko 263 bp ili oko 706 bp. Pomenuti prajmeri za detekovanje događaja EE-GM2 mogu da budu komplementarni sa 5'-bočnim regionom iz SEQ ID Br.: 14 i sa stranom DNA koja sadrži gene za toleranciju na herbicid. Pomenuti prajmeri za detektovanje događaja EE-GM2 mogu takođe da budu komplementarni sa 3'-bočnim regionom iz SEQ ID NO: 15 i sa stranom DNA koja sadrži gene za toleranciju na herbicid, tako da pomenuti prajmeri koji sadrže ili se sastoje (u suštini) od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br.: 18 i SEQ ID Br.: 19 proizvede DNA fragment veličine između 100 i 500 bp, poput fragmenta od oko 151 bp.

[0015]Referentni semenski materijal koji sadrži elitni događaj EE-GM3 iz ovoga pronalaska je deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 41659. Referentni semenski materijal koji sadrži elitni događaj EE-GM2 iz ovoga pronalazak je deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 41660. Referentni semenski materijal koji sadrži elitni događaj EE-GM3 i EE-GM2 je deponovan u ATCC pod pristupnim brojem PTA-11042.

[0016]Jedna izvedba iz ovoga pronalaska predstavlja semenski materijal koji sadrži elitni događaj EE-GM3 (referentni semenski materijal koji sadrži pomenuti događaj je deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 41659) i dodatno sadrži elitni događaj EE-GM2 (referentni semenski materijal koji sadrži pomenuti događaj je deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 41660), ili semenski materijal koji sadrži događaje EE-GM3 i EE-GM2 (referentni semenski materijal koji sadrži pomenute događaje je deponovan u ATCC pod pristupnim brojem PTA-11042), iz kojeg će izrasti biljka soje koja je tolerantna na najmanje tri herbicida, a posebno je tolerantna na glifosat i/ili inhibitore HPPD poput izoksaflutola i/ili inhibitora glutamin sintaze poput glufosinata.

[0017]Semenski materijal iz NCIMB pod brojem NCIMB 41659 predstavlja semenski materijal koji sadrži barem oko 95% transgeničnog semena koje sadrži elitni događaj EE-GM3 i iz kojeg će izrasti biljke koje su tolerantne na herbicid, pri čemu pomenute biljke su biljke koje su tolerantne na glifosat i/ili izoksaflutol. Semenski materijal ili rasplodni materijal koji se mogu dobiti ili su dobiveni iz deponovanog semenskog materijala (na primer, nakon ukrštanja sa drugim biljkama soje sa različitom genetičkom pozadinom) može da se seje i iz njega mogu da izrastu biljke koje mogu da budu tretirane sa glifosatom ili inhibitorima HPPD poput izoksaflutola, kao šta je ovde opisano, sa ciljem dobijanja biljaka koje su tolerantne na glifosat ili izoksaflutol, koje sadrže elitni događaj EE-GM3. Semenski materijal iz NCIMB depozita pod brojem NCIMB 41660 predstavlja semenski materijal koji se sastoji od najmanje 95% transgeničnog semena koje sadrži elitni događaj EE-GM2 i iz kojeg će izrasti biljke koje su tolerantne na herbicid, pri čemu pomenute biljke su biljke koje su tolerantne na glufosinat. Pomenuti semenski materijal može da se seje i iz njega mogu da izrastu biljke koje mogu da se tretiraju sa glufosinatom, kao šta je ovde opisano, sa ciljem da se dobiju biljke koje su tolerantne na glufosinat, koje sadrže elitni događaj EE-GM2.

[0018]Semenski materijal iz ATCC depozita pod brojem PTA-11042 predstavlja semenski materijal koji se sastoji od najmanje 95% transgeničnog semena koje sadrži elitni događaj EE-GM3 i elitni događaj EE-GM2 u homozigotnoj formi i iz koje će narasti biljke koje su tolerantne na herbicid, pri čemu pomenute biljke su biljke koje su tolerantne na glifosat, glufosinat i/ili izoksaflutol. Semenski materijal ili rasplodni materijal koji je dobiven iz deponovanog semenskog materijala (na primer, nakon ukrštanja sa drugim biljkama soje sa različitom genetičkom pozadinom) može da se seje i iz njega će izrasti biljke koje mogu da se tretiraju sa glifosatom, glufosinatom i/ili inhibitorima HPPD poput izoksaflutola, kao šta je ovde opisano, sa ciljem da se dobiju biljke koje su tolerantne na glifosat, glufosinat i/ili izoksaflutol, koje sadrže elitne događaje EE-GM3 i EE-GM2.

[0019]Ovaj pronalazak se odnosi na ćelije, tkiva, potomstvo, i potomke biljke koja sadrži elitni događaj EE-GM3 i dodatno sadrži elitni događaj EE-GM2, i koja može da se dobije uzgojem biljke koja sadrži elitne događaje EE-GM3 i EE-GM2 koja je deponovana u ATCC kao PTA-11042, ili uz pomoć uzgoja biljke koja sadrži elitni događaj EE-GM3 iz semenskog materijala koji je deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 41659 i ukrštanjem pomenute biljke sa biljkom koja sadrži elitni događaj EE-GM2 i koja je izrasla iz semenskog materijala koji je deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 41660. Ovaj pronalazak se dodatno odnosi na biljke koje mogu da se dobiju iz (na primer uz pomoć rasplođavanja i/ili uzgojem) biljke soje li semenskog materijala kao šta je malopre opisano. Ovaj pronalazak takođe se odnosi na biljke soje koje sadrže elitne događaje EE-GM3 i EE-GM2.

[0020]Takođe, ovde je opisan postupak za identifikovanje transgenične biljke, ili njenih ćelija ili tkiva, koji sadrže elitne događaje EE-GM3 i EE-GM2, pri čemu se pomenuti postupak bazira na otkrivanju prisutnosti sekvenci koje karakterizuju DNA ili amino-kiseline koje su kodirane sa tim DNA sekvencama u nekoj transgeničnoj biljci, njenim ćelijama ili tkivima. U skladu sa jednom preferiranom izvedbom ovoga pronalaska, takve sekvence koje karakterizuju DNA su sekvence od najmanje 15 bp, 15 bp, najmanje 20 bp, 20 bp, ili 30 bp ili više koje obuhvata mesto insercije samog događaja, tj., deo ugrađene strane DNA koja sadrži gene za toleranciju na herbicid i deo genoma soje (5'- ili 3'-bočni region) koji se nastavlja na to, koje omogućava specifičnu identifikaciju samog elitnog događaja.

[0021]Ovaj pronalazak se dodatno odnosi na postupke za identifikovanje elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM2 u biološkim primercima, pri čemu se pomenuti postupci baziraju na prajmerima ili probama koje specifično prepoznaju 5'- i/ili 3'-bočnu sekvencu strane DNA, koja u pomenutim događajima EE-GM3 i EE-GM2 sadrži gene za toleranciju na herbicid, kao šta je opisano u bilo kojem od zahteva od 7 do 9 i 14.

[0022]Još specifičnije, ovaj pronalazak se odnosi na postupak koji podrazumeva amplifikaciju dve sekvence nukleinske kiseline koja je prisutna u biološkim primercima uz pomoć dve lančane reakcije polimerazom od kojih se svaka provodi sa najmanje dva prajmera ili jedne lančane reakcije polimerazom koja se provodi sa najmanje četiri prajmera, pri čemu prvi prajmer prepoznaje 5'- ili 3'-bočni region strane DNA, koja u EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, drugi prajmer prepoznaje sekvencu u stranoj DNA, koja u EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, treći prajmer prepoznaje 5'- ili 3'-bočni region strane DNA, koja u EE-GM2 sadrži gene za toleranciju na herbicid, i četvrti prajmer prepoznaje neku sekvencu u stranoj DNA, koja u EE-GM2 sadrži gene za toleranciju na herbicid, i pri čemu se preferirano dobijaju dva DNA fragmenta veličine između 100 i 800 bp. U skladu sa ovim pronalaskom, prajmeri za identifikovanje događaja EE-GM3 prepoznaju neku sekvencu u 5'-bočnom regionu EE-GM3 (SEQ ID Br. 2, od pozicije 1 do pozicije 1451) ili u 3'-bočnom regionu EE-GM3 (komplement iz SEQ ID Br 3 od pozicije 241 do pozicije 1408) i neku sekvencu u stranoj DNA, koja sadrži gene za toleranciju na herbicid (komplement iz SEQ ID Br 2 od pozicije 1452 do 1843 ili SEQ ID Br 3 od pozicije 1 do pozicije 240, ili SEQ ID Br 20 od nukleotidne pozicije 1452 do nukleotidne pozicije 16638 ili njen komplement). Prajmer koji prepoznaje 3'-bočni region može da obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 5, a prajmer koji prepoznaje neku sekvencu u stranoj DNA, koja sadrži gene za toleranciju na herbicid, može da obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 4 ili SEQ ID Br.: 7 koje su ovde opisane. Prajmeri za identifikovanje događaja EE-GM2 prepoznaju neku sekvencu u 5'-bočnom regionu EE-GM2 (SEQ ID Br. 14, od pozicije 1 do pozicije 311) ili u 3'-bočnom regionu EE-GM2 (komplement od SEQ ID Br. 15 od pozicije 508 do pozicije 1880) i neku sekvencu u stranoj DNA, koja u EE-GM2 sadrži gen za toleranciju na herbicid (komplement od SEQ ID Br. 14 od pozicije 312 do 810, ili SEQ ID Br. 15 od pozicije 1 do pozicije 507). Prajmer koji prepoznaje 3'-bočni region EE-GM2 može da obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 18, a prajmer koji prepoznaje neku sekvencu u stranoj DNA (EE-GM2) može da obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 19 koje su ovde opisane. PCR amplifikacije može da se provede simultano ili redom.

[0023]Ovaj pronalazak još specifičnije se odnosi na postupak za identifikovanje elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM2 u biološkim primercima, pri čemu pomenuti postupak podrazumeva amplifikovanje najmanje dve sekvence nukleinskih kiselina koje su prisutne u nekom biološkom primerku uz primenu lančane reakcije polimerazom uz pomoć dva prajmera koji sadrže ili se sastoje (u suštini) od nukleotidnih sekvenca SEQ ID Br. 4 i SEQ ID Br. 5, pri čemu se dobiva DNA fragment od oko 263 bp, ili uz pomoć dva prajmera koji sadrže ili se sastoje (u suštini) od nukleotidnih sekvenca SEQ ID Br. 5 i SEQ ID Br. 7, pri čemu se dobiva DNA fragment od oko 706 bp, i lančanu reakciju polimerazom uz pomoć dva prajmera koji sadrže ili se sastoje (u suštini) od nukleotidnih sekvenca SEQ ID Br. 18 i SEQ ID Br. 19, pri čemu se dobija DNA fragment od oko 151 bp. Pomenute dve lančane reakcije polimerazom mogu da se provedu simultano ili uzastopno.

[0024]Specifične bočne sekvence događaja EE-GM3, koje su ovde opisane, zajedno sa specifičnom bočnom sekvencom događaja EE-GM2 mogu da se iskoriste za razvoj specifičnih identifikacionih postupaka za dokazivanje simultane prisutnosti događaja EE-GM3 i EE-GM2 u biološkim primercima. Takve združene specifične bočne sekvence mogu takođe da se koriste kao referentni kontrolni materijal u ogledima za identifikaciju. Još preciznije, 5'- i/ili 3'-bočni regioni EE-GM3 zajedno sa 5'- i/ili 3'-bočnim regionima EE-GM2 mogu da se iskoriste za razvoj specifičnih prajmera i proba kao šta je opisano u daljnjem tekstu. Takođe, prikladni referentni materijal su molekuli nukleinske kiseline, preferirano od oko 150-850 bp, koji sadrže sekvencu koja može da se amplifikuje uz pomoć prajmera koji sadrže ili se sastoje (u suštini) od nukleotidnih sekvenca SEQ ID Br. 7 i SEQ ID Br. 5 ili SEQ ID Br. 4 i SEQ ID Br. 5 zajedno sa molekulima nukleinske kiseline koji sadrže sekvencu koja se amplifikuje uz pomoć prajmera koji sadrže ili se sastoje (u suštini) od nukleotidnih sekvenca SEQ ID Br. 18 i SEQ ID Br. 19, a posebno se takvi molekuli nukleinske kiseline dobijaju uz pomoć pomenutih prajmera na materijalu koji sadrži događaje EE-GM3 i EE-GM2.

[0025]Ovaj pronalazak se odnosi na postupke za identifikovanje simultane prisutnosti događaja EE-GM3 i EE-GM2 u biološkim primercima na bazi upotrebe takvih specifičnih prajmera ili proba. Prajmeri za otkrivanje događaja EE-GM3 mogu da sadrže, da se sastoje ili da se u suštini sastoje od nukleotidne sekvence od 17 do oko 200 uzastopnih nukleotida izabranih iz nukleotidne sekvence SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1 do nukleotida 1451 ili od komplementa nukleotidne sekvence SEQ ID 3 od nukleotida 241 do nukleotida 1408, zajedno sa prajmerima koji sadrže, koji se sastoje, ili se u suštini sastoje od nukleotidne sekvence od 17 do oko 200 uzastopnih nukleotida izabranih iz nukleotidne sekvence SEQ ID No 1, poput nukleotidne sekvence od 17 do oko 200 uzastopnih nukleotida izabranih iz komplementa nukleotidne sekvence SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1452 do nukleotida 1843 ili nukleotidne sekvence SEQ ID Br. 3 od nukleotida 1 do nukleotida 240. Prajmeri za otkrivanje EE-GM2 mogu da sadrže, ili da se sastoje ili da se u suštini sastoje od nukleotidne sekvence od 17 do oko 200 uzastopnih nukleotida izabranih iz nukleotidne sekvence SEQ ID Br. 14 od nukleotida 1 do nukleotida 311 ili iz komplementa nukleotidne sekvence SEQ ID Br. 15 od nukleotida 508 do nukleotida 1880, zajedno sa prajmerima koji sadrže, koji se sastoje od ili se u suštini sastoje od nukleotidne sekvence od 17 do oko 200 uzastopnih nukleotida izabranih iz nukleotidne sekvence SEQ ID Br. 11, poput nukleotidne sekvence od 17 do oko 200 uzastopnih nukleotida izabranih iz komplementa nukleotidne sekvence SEQ ID Br. 14 od nukleotida 312 do nukleotida 810 ili iz nukleotidne sekvence SEQ ID Br. 15 od nukleotida 1 do nukleotida 507. Prajmeri mogu takođe da sadrže one nukleotidne sekvence koje su lokalizovane na krajnjem 3'-kraju, a dodatno sadrže nepovezane sekvence ili sekvence koje su izvedene iz pomenutih nukleotidnih sekvenca, ali koje dovode do pojave pogrešno sparenih baza tokom hibridizacije.

[0026]Ovaj pronalazak se dodatno odnosi na komplete hemikalija za identifikovanje elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM2 u biološkim primercima, kao šta je opisano u zahtevu 10 ili 15. Pomenuti kompleti hemikalija sadrže najmanje jedan prajmer ili probu koja specifično prepoznaje 5'- ili 3'-bočni region strane DNA, koja u EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, pri čemu pomenuti 5'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1 do nukleotida 1451, a pomenuti 3'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 241 do nukleotida 1408, i najmanje jedan prajmer ili probu koja specifično prepoznaje 5'- ili 3'-bočni region strane DNA, koja u EE-GM2 sadrži gen za toleranciju na herbicid, pri čemu pomenuti 5'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 14 od nukleotida 1 do nukleotida 311, a pomenuti 3'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 508 do nukleotida 1880.

[0027]Pomenuti kompleti hemikalija iz ovoga pronalaska takođe sadrže, osim prajmera koji specifično prepoznaje 5'- ili 3'-bočni region EE-GM3 i 5'- ili 3'-bočni region EE-GM2, dodatni prajmer koji specifično prepoznaje neku sekvencu u stranoj DNA, koja u EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, pri čemu pomenuta strana DNA sadrži nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1452 do nukleotida 1843 ili nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 3 od nukleotida 1 do nukleotida 240 ili nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 1 od nukleotida 188 do nukleotida 7252 ili njen komplement, ili nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 20 od nukleotidne pozicije 1452 do nukleotidne pozicije 16638 ili njen komplement, i dodatni prajmer koji specifično prepoznaje neku sekvencu u stranoj DNA, koja u EE-GM2 sadrži gene za toleranciju na herbicide, pri čemu pomenuta strana DNA sadrži nukleotidnu sekvenci komplementa iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 312 do nukleotida 810 ili nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 15 od nukleotida 1 do nukleotida 507 ili nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 11 ili njen komplement, za upotrebu u protokolu za PCR identifikaciju.

[0028]Prajmer koji prepoznaje 3'-bočni region EE-GM3 može da sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 5, a prajmer koji prepoznaje transgene ili stranu DNA, koja u EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, može da obuhvata sekvencu SEQ ID Br. 4 ili 7, ili bilo koji drugi prajmer ili kombinacija prajmera za otkrivanje EE-GM3, kao šta je ovde opisano, zajedno sa prajmerom koji prepoznaje 5'-bočni region EE-GM2 koji može da sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 18, i prajmer koji prepoznaje transgene iz strane DNA, koja u EE-GM2 sadrži gen za toleranciju na herbicid, može da obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 19.

[0029]U jednoj izvedbi kompleta hemikalija za identifikovanje elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM2 u biološkim primercima, pomenuti komplet sadrži PCR prajmere koji obuhvataju ili se sastoje (u suštini) od nukleotidnih sekvenca SEQ ID Br. 5 i SEQ ID Br. 4 i PCR prajmere koji obuhvataju ili se sastoje (u suštini) od nukleotidnih sekvenca SEQ ID Br. 18 i SEQ ID Br.

19 za upotrebu u identifikovanju događaja EE-GM3/EE-GM2 na bazi PCR-a.

[0030]Ovaj pronalazak takođe se odnosi na komplet hemikalija za identifikovanje elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM2 u biološkim primercima, pri čemu pomenuti komplet obuhvata dve specifične probe, od kojih prva proba sadrži ili se sastoji (u suštini) od neke sekvence koja odgovara (ili je komplementarna sa) sekvencom koja je između 80% i 100% identična sa nekim specifičnim regionom iz događaja EE-GM3 dok druga proba obuhvata ili se sastoji (u suštini) od sekvence koja odgovara (ili je komplementarna sa) sekvencom koja je između 80% i 100% identična sa nekim specifičnim regionom iz događaja EE-GM2. Sekvenca iz prve probe odgovara specifičnom regionu koji sadrži deo 5'- ili 3'-bočnog regiona EE-GM3, a druga proba odgovara specifičnom regionu koji sadrži deo 5'- ili 3'-bočnom regionu EE-GM2. Proba koja je specifična za događaj EE-GM3 sadrži ili se sastoji (u suštini) od (ili je komplementarna sa) sekvencom koja je između 80% i 100% identična sa sekvencom između nukleotida 1441 i 1462 iz SEQ ID Br. 2 ili od sekvence koja je između 80% i 100% identična sa sekvencom između nukleotida 230 i 251 iz SEQ ID Br. 3, dok proba koja je specifična za događaj EE-GM2 sadrži ili se sastoji (u suštini) od (ili je komplementarna sa) sekvencom koja je između 80% i 100% identična sa sekvencom između nukleotida 301 i 322 iz SEQ ID Br. 14 ili od sekvence koja je između 80% i 100% identična sa sekvencom između nukleotida 497 i 518 iz SEQ ID Br. 15.

[0031]Opisane DNA sekvence obuhvataju mesto spajanja događaja i dovoljno polinukleotida genomske DNA soje i strane DNA, koja sadrži gene za toleranciju na herbicid (transgene) svakog događaja, koji se koriste za prajmer ili probu za detektovanje događaja EE-GM3 i EE-GM2. Svaka sekvenca može da sadrži najmanje 9 nukleotida iz genomske DNA soje i sličan broj nukleotida iz strane DNA koja u EE-GM3 ili EE-GM2 sadrži gene za toleranciju na herbicid (transgene), na svakoj strani od mesta insercije. Još bolje, takve DNA sekvence sadrže najmanje 9 nukleotida genomske DNA soje i sličan broj nukleotida strane DNA, koja sadrži gene za toleranciju na herbicid, koja se nastavlja na mesto spajanja iz SEQ ID Br.: 2 ili SEQ ID Br.: 3 i najmanje 9 nukleotida genomske DNA iz soje i sličan broj nukleotida iz strane DNA, koja sadrži gene za toleranciju na herbicid, koja se nastavlja na mesto spajanja iz SEQ ID Br.: 14 ili SEQ ID Br.: 15.

[0032] Postupci i kompleti hemikalija koji su obuhvaćeni ovim pronalaskom mogu da se koriste za različite svrhe poput, ali bez ograničenja, sledećih: da se identifikuje prisutnost ili da se odredi (niži) nivo prisutnosti događaja EE-GM3 i EE-GM2 u biljkama, biljnom materijalu ili u produktima poput, ali bez ograničenja, hrane ili stočne hrane (sveže ili obrađene) koji sadrže ili potiču iz biljnog materijala; dodatno ili alternativno, postupci i kompleti hemikalija iz ovoga pronalaska mogu da se koriste za identifikovanje transgeničnog biljnog materijala sa ciljem odvajanja transgeničnog od ne-transgeničnog materijala; dodatno ili alternativno, postupci i kompleti hemikalija iz ovoga pronalaska mogu da se koriste za određivanje kvalitete (tj., procenta čistog materijala) biljnog materijala koji sadrži događaje EE-GM3 i EE-GM2.

[0033] Takođe, ovde su opisni 5'- i/ili 3'-bočni regioni EE-GM3 zajedno sa specifičnim prajmerima i probama koji su izvedeni iz 5'- i/ili 3'-bočnih sekvenca događaja EE-GM2, kao i sa specifičnim prajmerima i probama koji su izvedeni iz 5'- i/ili 3'-bočnih sekvenca događaja EE-GM3 zajedno specifičnim prajmerima i probama koji su razvijeni iz 5'- i/ili 3'-bočnih sekvenca događaja EE-GM2.

[0034] Takođe, ovde je opisana i genomska DNA koja je dobivena iz biljaka koje sadrže događaje EE-GM3 i EE-GM2. Takva genomska DNA može da se koristi kao referentni kontrolni materijal u ovde opisanim testovima za identifikaciju.

[0035] U skladu sa ovim pronalaskom, transgenična biljka soje koja je tolerantna na herbicid, njene ćelije, delovi, semenski materijal ili njeno potomstvo sadrže najmanje dva elitna događaja, EE-GM3 i EE-GM2, pri čemu prvi elitni događaj (EE-GM3) obuhvata stranu DNA koja sadrži: i) prvi himerni gen koji sadrži modifikovani epsps-gen izZea mayskoji kodira EPSPS-encim koji je tolerantan na glifosat i koji se nalazi pod kontrolom promotora koji se eksprimira u biljkama, i

ii) drugi himerni gen koji sadrži modifikovani hppd-gen izPseudomonas fluorescenskoji kodira inhibitor HPPD koji je tolerantan na herbicid i koji se nalazi pod kontrolom promotora koji se ekspresimira u biljkama, pri čemu pomenuti drugi elitni događaj obuhvata (treći) himerini gen koji sadrži modifikovani gen za toleranciju na glufosinat koji je izveden izStreptomyces viridochromogenesi koji kodira glufosinat (ili fosfinotricin) acetiltransferazu pod kontrolom promotora koji se eksprimira u biljkama.

[0036]U jednoj izvedbi, pomenuti prvi elitni događaj obuhvata nukleotide od 1 do 1451 iz SEQ ID Br. 2 tik uzvodno i susedno sa pomenutom stranom DNA i nukleotide od 241 do 1408 iz SEQ ID Br. 3 tik nizvodno i susedno sa pomenutom stranom DNA, a pomenuti drugi događaj sadrži nukleotide od 1 do 311 iz SEQ ID Br. 14 tik uzvodno i susedno sa pomenutom stranom DNA i nukleotide od 508 do 1880 iz SEQ ID Br. 15 tik nizvodno i susedno sa pomenutom stranom DNA.

[0037]U drugoj izvedbi, pomenuti elitni događaj može da se dobije uz pomoć uzgoja biljaka soje iz referentnog semenskog materijala, koji sadrži pomenute događaje, koji je deponovan u ATCC pod brojem PTA-11042, ili može da se dobije iz referentnog semenskog materijala, koji sadrži pomenuti prvi događaj, koji je deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 41659, a može da se dobije i iz referentnog semenskog materijala, koji sadrži pomenuti drugi događaj, koji je deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 41660.

[0038]U drugoj izvedbi, genomska DNA iz pomenute biljke soje, ili njenih ćelija, delova, semenskog materijala ili njenog potomstva je analizirana uz pomoć protokola za identifikovanje elitnog događaja, šta se tiče prvog elitni događaj, uz pomoć dva prajmera koji sadrže nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 4 i SEQ ID Br. 5, pri čemu se proizvodi DNA fragment od oko 263 bp ili 263 bp, a kada se analizira uz pomoć protokola za identifikovanje drugog elitnog događaja sa dva prajmera, koji sadrže nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 18 i SEQ ID Br. 19, tada se dobija DNA fragment od oko 151 bp ili 151 bp.

[0039]Takođe, ovde je obezbeđen postupak za identifikovanje transgenične biljke soje, ili njenih ćelija, delova, semenskog materijala ili potomstva koji sadrže 2 elitna događaja, pri čemu pomenuta biljka, njene ćelije, semenski materijal, ili potomstvo su tolerantni na glifosat, glufosinat i/ili na inhibitor HPPD (poput izoksaflutola), u biološkim primercima, pri čemu pomenuti postupak podrazumeva amplifikovanje DNA-fragmenta veličine između 50 i 1000 bp ili između 100 i 500 bp iz sekvence nukleinske kiseline od prvog događaja, koja je prisutna u biološkim primercima, uz korišćenje lančane reakcije polimerazom sa najmanje dva prajmera, od kojih prvi prepoznaje 5'-bočni region iz prvog elitnog događaja (specifikovan iznad), pri čemu pomenuti 5'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1 do nukleotida 1451, ili 3'-bočni region iz prvog elitnog događaja, pri čemu pomenuti 3'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu iz komplementa iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 241 do nukleotida 1408, dok drugi prajmer od malopre pomenutog kompleta prajmera prepoznaje neku sekvencu u stranoj DNA iz prvog događaja koja sadrži nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1452 do nukleotida 1843 ili nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 3 od nukleotida 1 do nukleotida 240, koje podrazumeva amplifikovanje DNA-fragmenta veličine između 50 i 1000 bp ili između 100 i 500 bp iz sekvence nukleinske kiseline pomenutog drugog događaja koji je prisutan u biološkim primercima uz korišćenje lančane reakcije polimerazom sa najmanje dva prajmera, do koji jedan prepoznaje 5'-bočni region drugog elitnog događaja (specifikovan iznad), pri čemu pomenuti 5'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu od nukleotida 1 do 311 iz SEQ ID Br. 14, ili 3'-bočni region pomenutog drugog elitnog događaja, pri čemu pomenuti 3'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu komplementa od nukleotida 508 do 1880 iz SEQ ID Br. 15, a drugi prajmer od pomenutog kompleta prajmera prepoznaje neku sekvencu u stranoj DNA iz pomenutog drugog događaja koja sadrži nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 312 do nukleotida 810 ili nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 15 od nukleotida 1 do nukleotida 507.

[0040]Takođe, ovde je obezbeđen komplet hemikalija za identifikovanje transgenične biljke soje, ili njenih ćelija, delova, semenskog materijala ili njenog potomstva koji sadrže 2 elitna događaja i koji su tolerantni na glifosat, glufosinat i na inhibitor HPPD (poput izoksaflutola), u biološkim primercima, pri čemu pomenuti komplet hemikalija sadrži jedan prajmer koji prepoznaje 5'-bočni region prvog elitnog događaja (specifikovan iznad), pri čemu pomenuti 5'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1 do nukleotida 1451, ili jedan prajmer koji prepoznaje 3'-bočni region iz pomenutog prvog elitnog događaja, pri čemu pomenuti 3'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 241 do nukleotida 1408, i jedan prajmer koji prepoznaje neku sekvencu u stranoj DNA iz pomenutog prvog događaja, pri čemu pomenuta strana DNA sadrži nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1452 do nukleotida 1843 ili nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 1 do nukleotida 240, a pomenuti komplet hemikalija još sadrži jedan prajmer koji prepoznaje 5'-bočni region iz drugog elitnog događaja (specifikovan iznad), pri čemu pomenuti 5'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu od nukleotida 1 do 311 iz SEQ ID Br. 14, ili 3'-bočni region iz pomenutog drugog elitnog događaja, pri čemu pomenuti 3'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu komplementa od nukleotida 508 do 1880 iz SEQ ID Br. 15, pri čemu drugi prajmer iz kompleta pomenutih prajmera prepoznaje neku sekvencu u stranoj DNA iz pomenutog drugog događaja koji sadrži nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 312 do nukleotida 810 ili nukleotidnu sekvencu SEQ ID Br. 15 od nukleotida 1 do nukleotida 507.

[0041]U jednoj izvedbi, ovaj pronalazak takođe se odnosi na par prajmera kao šta je opisano u zahtevu 11 ili 12.

[0042]U drugoj izvedbi, ovaj pronalazak se odnosi na komplet koji obuhvata četiri prajmera kao šta je opisano u zahtevu 13.

[0043]Druga izvedba ovoga pronalaska se odnosi na par specifičnih proba kao šta je opisano u zahtevu 16.

[0044]U skladu sa jednom drugom izvedbom, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za potvrđivanje čistoće semenskog materijala, ili za proveru da li semenski materijal sadrži događaje EE-GM3 i EE-GM2, pri čemu je pomenuti postupak opisan u zahtevu 17.

[0045]Takođe, ovde je opisana biljka soje, biljne ćelije, tkivo, ili semenski materijal koji u svojim genomima sadrže molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 97%, 98%, ili najmanje 99% ili 99.5% identična sa nukleotidnom sekvencom iz SEQ ID Br. 20 od nukleotidne pozicije 1452 do nukleotidne pozicije 16638, sa nukleotidnom sekvencom iz SEQ ID Br. 20 od nukleotidne pozicije 2257 do nukleotidne pozicije 16601 ili sa njihovim komplementima, ili nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 97%, 98%, ili najmanje 99% ili 99.5% identična sa sekvencom SEQ ID Br. 20 ili sa njenim komplementom, i koji još u svojim genomima sadrže molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 97%, 98%, ili najmanje 99% ili 99.5% identična sa nukleotidnom sekvencom iz događaja EE-GM2 ili sa njenim komplementom, pri čemu je referentni semenski materijal koji sadrži događaj EE-GM2 deponovan pod brojem NCIMB 41660. U jednoj izvedbi ovoga pronalaska, nukleotidna sekvenca događaja EE-GM2 u pomenutoj biljci, biljnim ćelijama, tkivu, ili semenskom materijalu je DNA sekvenca (poput strana DNA sekvenca) iz SEQ ID Br. 14 ili 15, ili pomenuta DNA sekvenca u biljnom genomu (na primer u deponovanom semenskom materijalu koji sadrži događaj EE-GM2 iz ovoga pronalaska) koja sadrži SEQ ID Br. 14 i 15 između prvog nukleotida od sekvence SEQ ID Br. 14 i zadnjeg nukleotida iz sekvence SEQ ID Br. 15.

[0046]Takođe, ovde je opisana biljka soje, biljna ćelija, tkivo, ili semenski materijal koji u svojim genomima sadrže molekul nukleinske kiseline koji hibridizuje sa nukleotidnom sekvencom iz SEQ ID Br. 1 ili sa njenim komplementom, ili hibridizuje sa nukleotidnom sekvencom iz SEQ ID Br. 20 od nukleotidne pozicije 1452 do nukleotidne pozicije 16638 ili sa njenim komplementom, ili hibridizuje sa nukleotidnom sekvencom iz SEQ ID Br. 20 ili sa njenim komplementom, i koji u svojim genomima sadrže molekul nukleinske kiseline koja hibridizuje sa nukleotidnom sekvencom iz događaja EE-GM2 ili sa njenim komplementom, pri čemu je referentni semenski materijal, koji sadrži događaj EE-GM2, deponovan pod brojem NCIMB 41660. Nukleotidna sekvenca EE-GM2 u pomenutoj biljci, biljnoj ćeliji, tkivu, ili semenskom materijalu je strana DNA iz SEQ ID Br. 14 ili 15, ili strana DNA sekvenca u biljnom genomu (na primer, deponirani semenski materijal koji sadrži događaj EE-GM2 iz ovoga pronalaska) koji sadrži SEQ ID Br. 14 i 15 između prvog nukleotida iz sekvence SEQ ID Br. 14 i zadnjeg nukleotida iz sekvence SEQ ID Br. 15.

Kratki opis slika

[0047]Sledeći Primeri, koji ne ograničavaju ovaj pronalazak samo na specifične i ovde opisne izvedbe, treba da se razmatraju zajedno sa pridruženim Slikama, koje su ovde uključene referencom:SI. 1: Shematski prikaz odnosa između opisanih nukleotidnih sekvenca i prajmera za elitni događaj EE-GM3.crno: strana DNA; prugasto: DNA biljnog porekla; kockasta strelica (a): himerni gen koji kodira HPPD PF W336 (sastav himernog gena vidi u Tabeli 1); prugasta strelica (b): himerni gen koji kodira 2mEPSPS (sastav himernog gena vidi u Tabeli 1); crne strelice: oligonukleotidni prajmeri, oznake ispod crteža predstavljaju nukleotidne pozicije; (c) odnosi se na komplement navedene nukleotidne sekvence; Beleška: shema nije nacrtana u razmeru.

SI. 2: Rezultati koji su dobiveni primenom protokola za identifikaciju događaja EE-GM3

uz pomoć PCR.Raspored sekvenca u gelu: Linija 1: marker za molekularnu masu (skala od 100 bp); linije 2 i 3: DNA primerci iz biljaka soje koje sadrže transgenični događaj EE-GM3; linije 4-7: DNA primerci iz transgeničnih biljaka soje koje ne sadrže elitni događaj EE-GM3, ali sadrže iste gene za toleranciju na herbicid (drugi transformacijski događaji); linija 8: DNA primerak iz soje divljeg-tipa; linija 9: kontrola bez DNA kalupa; linija 10: marker za molekularnu masu.

SI. 3: Shematski prikaz odnosa između navedenih nukleotidnih sekvenca i prajmera za

elitni događaj EE-GM1 (komparativno),crno: strana DNA; prugasto: DNA biljnog porekla; horizontalno-prugasta strelica (d): himerni gen koji kodira fosfinotricin acetiltransferazu (sastav himernog gena vidi u SEQ ID Br. 11; crne strelice: oligonukleotidni prajmeri, oznake ispod crteža predstavljaju nukleotidne pozicije; (c) odnosi se na komplement navedene nukleotidne sekvence; Beleška: shema nije nacrtana u omeru.

SI. 4: Shematski prikaz odnosa između navedenih nukleotidnih sekvenca i prajmera za

elitni događaj EE-GM2.crno: strana DNA; prugasto: DNA biljnog porekla; horizontalno-prugasta strelica (d): himerni gen koji kodira fosfinotricin acetiltransferazu (sastav himernog gena vidi u SEQ ID Br. 11; crne strelice: oligonukleotidni prajmeri, oznake ispod crteža predstavljaju nukleotidne pozicije; (c) odnosi se na komplement navedene nukleotidne sekvence; NA: nije primenjivo. Beleška: shema nije nacrtana u razmeru.

SI. 5: Protokol za identifikovanje događaja EE-GM1 uz pomoć PCR-a (komparativno).

Raspored sekvenca na gelu: Linijal: DNA primerak iz biljaka soje koji sadrže transgenični događaj EE-GM1; linija 2: DNA primerak iz transgenične biljke soje koja ne sadrži elitni događaj EE-GM1; linija 3: kontrolni DNA primerci iz biljaka soje divljeg-tipa; linija 4: kontrola bez kalupa; linija 5: marker za molekularnu masu.

SI. 6: Protokol za identifikovanje događaja EE-GM2 uz pomoć PCR-a.Raspored sekvenca na gelu: Linija 1: DNA primerak iz biljaka soje koje sadrže transgenični događaj EE-GM2; linija 2: DNA primerak iz transgenične biljke soje koja ne sadrži elitni događaj EE-GM2; linija 3: kontrolni DNA primerci iz biljke soje divljeg-tipa; linija 4: kontrola bez kalupa; linija 5: marker za molekularnu masu.

Detaljan opis preferiranih izvedaba ovoga pronalaska

[0048]Ugradnja rekombinantnog DNA molekula u gemom biljke tipično nastupa kao posledica transformacije ćelije ili tkiva. Specifično mesto ugradnje je najčešće posledica nasumičnog događaja.

[0049]DNA koja je uvedena u biljni genom kao rezultat transformacije biljne ćelije ili tkiva sa rekombinantnom DNA ili "transformirajućom DNA", i koja potiče od takve transformirajuće DNA ovde je označena kao "strana DNA" koja sadrži jedan ili više "transgena". Transgeni iz događaja EE-GM3 su geni za toleranciju na glifosat i inhibitor HPPD. "Biljna DNA" u kontekstu ovoga pronalaska se označava kao DNA koja potiče iz biljke koja je transformirana. Biljna DNA se obično nalazi u istom genetičkom lokusu u odgovarajućoj biljci divljeg-tipa. Strana DNA može da bude karakterizovana sa lokacijom i konfiguracijom na mestu ugradnje molekula rekombinantne DNA u biljnom genomu. Mesto u biljnom genomu gde se ugrađuje rekombinantna DNA se takođe naziva "mesto insercije" ili "mesto ciljanja". Insercija rekombinantne DNA u region biljnog genoma koji se naziva "pre-inserciona biljna DNA" može da bude povezana sa delecijom biljne DNA, koja je poznata kao "delecija ciljnog mesta". "Bočni region" ili "bočna sekvenca", kao šta se ovde koristi, se odnosi na sekvencu od najmanje 20 bp, preferirano najmanje 50 bp, pa do 5000 bp DNA koja je različita od ugrađene DNA, preferirano DNA iz biljnog genoma koja se nalazi tik uzvodno i susedno ili tik nizvodno i susedno stranoj DNA. Procedure za transformaciju koje omogućavaju nasumičnu ugradnju strane DNA rezultuju transformantima sa različitim bočnim regionima, koji su karakteristični i jedinstveni za svaki transformant. Kada se rekombinantna DNA ugradi u biljni genom uz pomoć tradicionalnog ukrštanja, mesto insercije u genomu, ili njegovi bočni regioni obično ne trpe promene.

[0050]"Izolovana nukleinska kiselina (sekvenca)" ili "izolovana DNA (sekvenca)", kao šta se ovde koristi, se odnosi na nukleinsku kiselinu ili DNA (sekvenca) koja se više ne nalazi u prirodnom okruženju iz kojeg je bila izolovana, na primer, sekvenca nukleinske kiseline u drugom bakterijskom domaćinu ili u biljnom genomu, ili nukleinska kiselina ili DNA fuzionisana na DNA ili nukleinska kiselina iz drugog izvora, na primer kada se nalazi unutar himernog gena pod kontrolom promotora koji se eksprimira u biljkama.

[0051]Događaj je definisan kao (veslački) genetički lokus koji, kao rezultat genetičkog inženjeringa, obuhvata stranu DNA ili transgen koji sadrži najmanje jednu kopiju nekog gena od interesa ili više gena od interesa. Tipična alelna stanja nekog događaja su prisutnost ili odsutnost strane DNA. Događaj je fenotipski karakterizovan sa ekspresijom transgena. Na genetičkom nivou, događaj je deo genetičkog sastava biljke. Na molekularnom nivou, događaj može da bude karakterizovan uz pomoć restrikcione mape (na primer, kao šta je određeno uz pomoć Southern-blotinga), koristeći uzvodne i/ili nizvodne bočne sekvence transgena, lokacije molekularnih markera i/ili molekularne konfiguracije transgena. Obično, transformacija biljke sa transformirajućom DNA, koja sadrži najmanje jedan gen od interesa, dovodi do pojave populacije transformanata koji sadrže mnoštvo odvojenih događaja, od kojih je svaki jedinstven. Događaj je karakterizovan sa stranom DNA i sa najmanje jednom bočnom sekvencom.

[0052] Elitni događaj, kao šta se ovde koristi, je događaj koji se selektira iz grupe događaja, koji su posledica transformacije sa istom transformirajućom DNA, na bazi ekspresije i stabilnosti transgena i njegove kompatibilnosti sa optimalnim agronomskim karakteristikama biljke koja ga sadrži. Tako, kriterijumi za selekciju elitnog događaja su jedan ili više, preferirano dva ili više, a najbolje svi od sledećih: a) da prisutnost strane DNA ne kompromitira druge željene karakteristike biljke, poput onih koji se donose na agronomske rezultate ili komercijalnu vrednost; b) daje događaj karakterizovani sa dobro definisanom molekularnom konfiguracijom koja se stabilno nasleđuje i za koju mogu da se razviju odgovarajući alati za identifikovanje; c) da gen(i) od interesa pokazuje(ju) korektnu, odgovarajuću i stabilnu prostornu i vremensku fenotipsku ekspresiju u heterozigotnom (ili hemizigotnom) i homozigotnom

stanju događaja, u komercijalno prihvatljivom nivou u rasponu okolišnih uslova u kojima se očekuje da biljke, koje nose pomenuti događaj, budu izložene tokom normalne agronomske upotrebe.

[0053] Preferirano je da je strana DNA povezana sa pozicijom u biljnom genomu koja dozvoljava jednostavnu introgresiju u željene komercijalne genetičke pozadine.

[0054]Status nekog događaj koji govori da se radi o elitnom događaju se potvrđuje uz pomoć introgresije elitnog događaja u različite genetički relevantne pozadine u skladu sa jednim, dva ili više od malopre pomenutih kriterijuma, na primer, a), b) i c).

[0055] "Elitni događaj" se tako odnosi na genetički lokus koji obuhvata stranu DNA, koja zadovoljava malopre opisani kriterijum. Biljka, biljni materijal ili potomstvo poput semenskog materijal može da sadrži jedan ili više elitnih događaja i svom genomu.

[0056] Alati koji su razvijeni za identifikovanje nekog elitnog događaja ili biljku ili biljni materijal koji sadrži taj elitni događaj, ili produkata koji sadrže biljni materijal koji sadrži pomenuti elitni događaj se baziraju na specifičnim genomskim karakteristikama samog elitnog događaja, poput, specifične restrikcione mape genomskog regiona koji sadrži pomenutu stranu DNA, molekularnih markera ili sekvenca bočnog(ih) regiona strane DNA.

[0057] Jednom kada su jedan ili oba bočna regiona strane DNA sekvencirana, mogu da se razviju prajmeri i probe koji specifično prepoznaju ovu (ove) sekvencu(e) u nukleinskoj kiselini (DNA ili RNA) iz primerka uz pomoć neke tehnike molekularne biologije. Na primer, može da se razvije PCR postupak koji identifikuje pomenuti elitni događaj u biološkim primercima (poput primeraka biljaka, biljnog materijala ili produkata koji sadrže biljni materijal). Takav PCR se bazira na najmanje dva specifična "prajmera", jedan koji prepoznaje sekvencu iz 5'- ili 3'-bočnog regiona elitnog događaja, a drugi koji prepoznaje sekvencu unutar strane DNA. Prajmeri preferirano imaju sekvencu veličine između 15 i 35 nukleotida koja u optimizovanim PCR-uslovima "specifično prepoznaje" neku sekvencu u 5'- ili 3'-bočnom regionu elitnog događaja i unutar strane DNA elitnog događaja, tako da se iz primerka nukleinske kiseline, koja sadrži elitni događaj, amplifikuje specifičan fragment ("integracioni fragment" ili amplikon za razlikovanje). Ovo znači da se samo ciljani integracioni fragment, a ne neka druga sekvenca u biljnom genomu ili stranoj DNA, amplifikuje u optimizovanim PCR-uslovima.

[0058] PCR-prajmeri koji su prikladni za identifikovanje događaja EE-GM3 mogu da budu sledeći: • oligonukleotidi sa rasponom veličine od 17 nt do oko 200 nt, koji sadrže nukleotidnu sekvencu sa najmanje 17 uzastopnih nukleotida, preferirano 20 uzastopnih nukleotida, koja je izabrana iz 5'-bočne sekvence biljne DNA (SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1 do nukleotida 1451) na njihovom 3'-kraju (prajmeri koji prepoznaju 5'-bočne sekvence);

ili

• oligonukleotidi sa rasponom veličine od 17 nt do oko 200 nt, koji sadrže nukleotidnu sekvenca od najmanje 17 uzastopnih nukleotida, preferirano 20 uzastopnih nukleotida, koja je izabrana iz 3'-bočne sekvence biljne DNA (komplement iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 241 do nukleotida 1408) na njihovom 3'-kraju (prajmer koji prepoznaju 3'-bočne sekvence); ili • oligonukleotidi sa rasponom veličine od 17 nt do oko 200 nt, koji sadrže nukleotidnu sekvencu od najmanje 17 uzastopnih nukleotida, preferirano 20 uzastopnih nukleotida, koja je izabrana iz insertiranih DNA sekvenca (komplement iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1452 do nukleotida 1843) na njihovom 3'-kraju (prajmeri koji prepoznaju stranu DNA); ili • oligonukleotidi sa rasponom veličine od 17 nt do oko 200 nt, koji sadrže nukleotidnu sekvencu od najmanje 17 uzastopnih nukleotida, preferirano 20 uzastopnih nukleotida, koja je insertiranih iz insertiranih DNA sekvenca (SEQ ID Br. 3 od nukleotida 1 do nukleotida 240); ili • prikladni oligonukleotidi sa rasponom veličine od 17 nt do oko 200 nt, koji sadrže nukleotidnu sekvencu od najmanje 17 uzastopnih nukleotida, preferirano 20 uzastopnih nukleotida, koja je izabrana iz nukleotidne sekvence insertiranog DNA fragmenta ili iz njegovog komplementa (SEQ ID Br. 1 ili SEQ ID Br. 20 od nukleotidne pozicije 1452 do 16638).

[0059] Prajmeri, naravno, mogu da budu duži od pomenutih 17 uzastopnih nukleotida, i mogu, na primer, da budu dugi 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nt ili čak i duži. Prajmeri mogu da se sastoje od nukleotidne sekvence koja je izabrana iz pomenutih nukleotidnih sekvenca bočnih regiona i sekvenca strane DNA. Međutim, nukleotidna sekvenca na 5'-krajevima prajmera (tj. izvan 3'-lociranih 17 uzastopnih nukleotida) je manje kritična. Tako, 5'-sekvenca prajmera može da sadrži ili da se sastoji od nukleotidne sekvence koja je izabrana iz bočnih sekvenca ili iz strane DNA, ako je prikladno, ali koja može da uzrokuje nekoliko (na primer, 1, 2, 5, ili 10) pogrešno sparenih baza. 5'-sekvenca prajmera može čak da bude nukleotidna sekvenca koja nema veze sa bočnim sekvencama ili sa stranom DNA, poput, na primer, nukleotidne sekvence koja sadrži jedno ili više mesta za cepanje sa restrikcionim encimima. Takve sekvence ili bočne DNA sekvence koje mogu da uzrokuju pogrešno sparenih baza preferirano ne treba da budu duže od 100, bolje od 50 ili čak 25 nukleotida.

[0060]Šlaviše, prikladni prajmeri na svojim 3'-krajevima mogu da sadrže, da se sastoje od ili da se u suštini sastoje od nukleotidne sekvence koja se proteže preko regiona spajanja i koja je izvedena iz biljne DNA i sekvence od strane DNA (lociranih kod nukleotida 1451-1452 u SEQ ID Br. 2 i nukleotida 240-241 u SEQ ID Br. 3 iz događaja EE-GM3) pod uslovom da pomenuti 3'-lociranih 17 uzastopnih nukleotida nije izvedeno isključivo iz strane DNA ili biljnih sekvenca iz SEQ ID Br. 2 ili 3.

[0061]Stručnjaku će, takođe, biti odmah jasno da pravilno izabrani parovi prajmera za PCR ne treba da sadrže međusobno komplementarne sekvence.

[0062]Za potrebe ovoga pronalaska, "komplement nukleotidne sekvence predstavljene sa SEQ ID Br.: X" je nukleotidna sekvenca koja može da se izvede iz predstavljene nukleotidne sekvence uz pomoć zamene nekog nukleotida sa njegovim komplementarnim nukleotidom u skladu sa Chargaff-ovim pravilima (A«T; GoC) uz čitanje u smetu 5' prema 3', tj., suprotno od smera predstavljene nukleotidne sekvence.

[0063]Primeri za prikladne prajmere za događaj EE-GM3 su oligonukleotidne sekvence SEQ ID Br. 5 (prajmer koji prepoznaje 3'-bočnu sekvencu), SEQ ID Br. 4 (prajmer koji prepoznaje stranu DNA koji se koristi zajedno sa prajmerima koji prepoznaju 3'-bočnu sekvencu), ili SEQ ID Br. 7 (prajmer koji prepoznaje DNA koji se koristi sa prajmerima koji prepoznaju 3'-bočnu sekvencu).

[0064]Drugi primeri za prikladne oligonukleotidne prajmere za događaj EE-GM3 na svojem 3'-kraju sadrže sledeće sekvence ili se sastoje (u suštini) od takvih sekvenca:

a. prajmeri koji prepoznaju 5'-bočnu sekvencu:

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 264 do nukleotida 283

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 266 do nukleotida 285

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1240 do nukleotida 1259 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 265 do nukleotida 285

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 265 do nukleotida 283

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1239 do nukleotida 1259 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1241 do nukleotida 1259 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1244 do nukleotida 1263

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1248 do nukleotida 1267 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1250 do nukleotida 1269 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 262 do nukleotida 279

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 263 do nukleotida 279

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 264 do nukleotida 285

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 266 do nukleotida 283

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1238 do nukleotida 1259 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1242 do nukleotida 1259 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1243 do nukleotida 1263 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1245 do nukleotida 1263 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1247 do nukleotida 1267 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1249 do nukleotida 1269 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1249 do nukleotida 1267 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 263 do nukleotida 285

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 267 do nukleotida 283

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1242 do nukleotida 1263 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1243 do nukleotida 1259 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1246 do nukleotida 1267 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1246 do nukleotida 1263 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1248 do nukleotida 1269 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1250 do nukleotida 1271 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1250 do nukleotida 1267 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1241 do nukleotida 1263 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1245 do nukleotida 1267 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1247 do nukleotida 1269 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1247 do nukleotida 1263 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1249 do nukleotida 1271 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1242 do nukleotida 1261 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1241 do nukleotida 1261 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1243 do nukleotida 1261 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1240 do nukleotida 1261 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1244 do nukleotida 1261 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1239 do nukleotida 1261 o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1245 do nukleotida 1261

b. prajmeri koji prepoznaju stranu DNA koji se upotrebljavaju sa prajmerima koji prepoznaju 5'-bočnu sekvencu: o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1732 do

nukleotida 1751

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1735 do

nukleotida 1754

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1731 do

nukleotida 1750

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1732 do

nukleotida 1750

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1732 do

nukleotida 1752

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1731 do

nukleotida 1749

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1732 do

nukleotida 1749

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1731 do

nukleotida 1751

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1732 do

nukleotida 1753

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1731 do

nukleotida 1748

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1732 do

nukleotida 1748

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1735 do

nukleotida 1751

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1731 do

nukleotida 1752

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1732 do

nukleotida 1754

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1731 do nukleotida 1747

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1731 do

nukleotida 1753

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1727 do

nukleotida 1746

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1727 do

nukleotida 1745

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1727 do

nukleotida 1747

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1727 do

nukleotida 1744

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1727 do

nukleotida 1748

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1727 do

nukleotida 1749

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1726 do

nukleotida 1745

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1726 do

nukleotida 1744

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1726 do

nukleotida 1746

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1726 do

nukleotida 1747

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1726 do

nukleotida 1748

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1724 do

nukleotida 1744

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1724 do

nukleotida 1745

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1724 do

nukleotida 1746

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1461 do

nukleotida 1478

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1670 do nukleotida 1686

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1469 do

nukleotida 1486

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1508 do

nukleotida 1527

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1667 do

nukleotida 1686

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1670 do

nukleotida 1687

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1673 do

nukleotida 1689

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1688 do

nukleotida 1704

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1688 do

nukleotida 1705

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1692 do

nukleotida 1709

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1467 do

nukleotida 1486

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1481 do

nukleotida 1497

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1481 do

nukleotida 1498

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1491 do

nukleotida 1507

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1491 do

nukleotida 1508

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1672 do

nukleotida 1688

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1673 do

nukleotida 1690

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1673 do

nukleotida 1691

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1688 do nukleotida 1706

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1691 do

nukleotida 1707

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1691 do

nukleotida 1708

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1469 do

nukleotida 1487

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1481 do

nukleotida 1499

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1489 do

nukleotida 1505

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1489 do

nukleotida 1506

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1489 do

nukleotida 1507

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1489 do

nukleotida 1508

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1666 do

nukleotida 1686

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1667 do

nukleotida 1687

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1670 do

nukleotida 1688

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1672 do

nukleotida 1689

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1688 do

nukleotida 1707

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1691 do

nukleotida 1709

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1692 do

nukleotida 1710

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1481 do

nukleotida 1500

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1491 do nukleotida 1509

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1670 do

nukleotida 1689

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1672 do

nukleotida 1690

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1672 do

nukleotida 1691

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1687 do

nukleotida 1705

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1687 do

nukleotida 1706

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1691 do

nukleotida 1710

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1472 do

nukleotida 1488

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1488 do

nukleotida 1507

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1491 do

nukleotida 1510

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1495 do

nukleotida 1512

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1495 do

nukleotida 1513

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1495 do

nukleotida 1514

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1673 do

nukleotida 1692

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1678 do

nukleotida 1694

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1678 do

nukleotida 1695

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1678 do

nukleotida 1696

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1687 do nukleotida 1703

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1687 do

nukleotida 1704

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1692 do

nukleotida 1711

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1469 do

nukleotida 1488

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1488 do

nukleotida 1506

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1491 do

nukleotida 1511

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1670 do

nukleotida 1690

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1678 do

nukleotida 1697

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1688 do

nukleotida 1709

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1467 do

nukleotida 1487

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1488 do

nukleotida 1508

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1495 do

nukleotida 1511

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1491 do

nukleotida 1512

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1666 do

nukleotida 1687

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1667 do

nukleotida 1688

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1672 do

nukleotida 1692

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1673 do

nukleotida 1693

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1687 do nukleotida 1707

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1472 do

nukleotida 1490

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1472 do

nukleotida 1491

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1481 do

nukleotida 1501

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1489 do

nukleotida 1509

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1495 do

nukleotida 1515

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1670 do

nukleotida 1691

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1673 do

nukleotida 1694

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1678 do

nukleotida 1698

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1469 do

nukleotida 1489

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1667 do

nukleotida 1689

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1687 do

nukleotida 1708

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1688 do

nukleotida 1710

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1691 do

nukleotida 1711

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1472 do

nukleotida 1492

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1489 do

nukleotida 1510

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1666 do

nukleotida 1688

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1687 do nukleotida 1709

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1692 do

nukleotida 1712

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1467 do

nukleotida 1488

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1469 do

nukleotida 1490

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1488 do

nukleotida 1509

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1489 do

nukleotida 1511

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1678 do

nukleotida 1699

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1472 do

nukleotida 1493

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1472 do

nukleotida 1494

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1481 do

nukleotida 1502

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1670 do

nukleotida 1692

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1469 do

nukleotida 1491

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1488 do

nukleotida 1510

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1691 do

nukleotida 1712

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1692 do

nukleotida 1713

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1692 do

nukleotida 1714

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1467 do

nukleotida 1489

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1678 do nukleotida 1700

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1481 do

nukleotida 1503

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1691 do nukleotida 1713 c. prajmeri koji prepoznaju 3'-bočnu sekvencu;

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 828 do

nukleotida 847

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 830 do

nukleotida 849

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 828 do

nukleotida 846

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 828 do

nukleotida 848

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 830 do

nukleotida 848

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 830 do

nukleotida 850

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 828 do

nukleotida 845

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 830 do

nukleotida 847

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 828 do

nukleotida 849

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 830 do

nukleotida 851

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 828 do

nukleotida 844

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 830 do

nukleotida 846

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 828 do

nukleotida 850

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 830 do nukleotida 852

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 992 do

nukleotida 1009

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 731 do

nukleotida 752

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 776 do

nukleotida 795

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 731 do

nukleotida 753

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 776 do

nukleotida 794

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 776 do

nukleotida 796

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 776 do

nukleotida 793

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 776 do

nukleotida 797

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 776 do

nukleotida 792

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 776 do

nukleotida 798

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 733 do

nukleotida 752

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 733 do

nukleotida 753

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 733 do

nukleotida 754

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 733 do

nukleotida 755

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 838 do

nukleotida 854

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 246 do

nukleotida 263

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 838 do nukleotida 855

o komplement od nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 245 do nukleotida 264 d. prajmeri koji prepoznaju sekvencu strane DNA koji se koriste sa prajmerima koji prepoznaju 3'-bočnu sekvencu:

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 173 do nukleotida 192

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 22 do nukleotida 41

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 172 do nukleotida 192

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 174 do nukleotida 192

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 191 do nukleotida 210

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 171 do nukleotida 192

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 175 do nukleotida 192

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 190 do nukleotida 210

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 192 do nukleotida 210

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 176 do nukleotida 192

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 189 do nukleotida 210

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 193 do nukleotida 210

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 188 do nukleotida 210

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 194 do nukleotida 210

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 199 do nukleotida 218

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 200 do nukleotida 218

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 197 do nukleotida 218

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 201 do nukleotida 218

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 201 do nukleotida 220

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 200 do nukleotida 220

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 199 do nukleotida 220

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 200 do nukleotida 221

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 199 do nukleotida 221

o nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 150 do nukleotida 172.

[0065]PCR-prajmeri koji su prikladni za identifikovanje događaja EE-GM2 su opisani u dokumentu WO2006/108675, posebno od stranice 8, linija 4 do stranice 33, linija 4 (ovde uključen kao referenca).

[0066] Kao šta se ovde koristi, "nukleotidna sekvenca iz SEQ ID Br. Z od pozicije X do pozicije Y" ukazuje na nukleotidnu sekvencu koja obuhvata obe nukleotidne krajne tačke.

[0067] Preferirano, amplifikovani fragment je dugačak između 50 i 500 nukleotida, na primer između 100 i 350 nukleotida. Specifični prajmeri mogu da imaju sekvencu koja je između 80% i 100% identična sa sekvencom iz 5'- ili 3'-bočnog regiona elitnog događaja i strane DNA elitnog događaja, pod uslovom da pojava pogrešno sparenih baza još uvek dozvoljava specifičnu identifikaciju pomenutog elitnog događaja uz pomoć pomenutih prajmera u optimizovanim PCR uslovima. Stručnjaku je poznato da raspon dozvoljenih pogrešno sparenih baza, međutim, može da se odredi eksperimentalno.

[0068] Detektovanje integracionih fragmenata može da se provede na više načina, na primer, uz pomoć procene veličine nakon analize gela. Integracioni fragmenti mogu takođe da se direktno sekvenciraju. Drugi postupci za detektovanje specifične sekvence iz amplifikovanih DNA fragmenata su takođe poznati stanju tehnike.

[0069] Budući da su sekvence prajmera i njihove relativne lokacije u genomu jedinstvene za određeni elitni događaj, amplifikacija integracionog fragmenta će nastupiti samo u biološkim primercima koji sadrže (nukleinsku kiselinu) elitni događaj. Preferirano, kada se provodi PCR za identifikovanje prisutnosti elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM2 u nepoznatim primercima, koristi se kontrolni komplet prajmera uz pomoć kojih može da se amplifikuje fragment iz nekog" housekeeping- gena"biljne vrste kod koje je dobiven pomenuti događaj.Housekeeping- genisu geni koji su cksprimirani u najvećem broju ćelija i koji su uključeni u bazičnim metaboličkim aktivnostima koje su iste u svim ćelijama. Preferirano, amplifikovani fragment odhousekeeping- gena. jefragment koji je veći od amplifikovanog integracionog fragmenta. U zavisnosti o primercima koji se analizuju, mogu da se koriste i druge kontrole.

[0070] Standardni PCR protokoli su opisani u stanju tehnike, na primer u 'PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2. izdanje, 1999.) i druge reference. Optimalni uslovi za PCR za svaki elitni događaj, uključujući sekvence specifičnih prajmera, su specifikovani u "PCR (or Polvmerase Chain Reaction) Identification Protocol". Podrazumeva se, međutim, da broj parametara u identifikacionom protokolu uz pomoć PCR-a može da bude podešen prema specifičnim laboratorijskim uslovima, i može da se blago modifikuje kako bi se ostvario sličan rezultat. Na primer, upotreba različitih postupaka za pripremu DNA može da zahteva promene, na primer, količine prajmera, polimeraze i uslova za spajanje prajmara sa kalupom. Slično, izbor drugih prajmera može da diktira druge optimalne uslove za provedbu protokola za identifikovanje uz pomoć PCR-a. Ova podešavanja su, međutim, razumljiva i jasna stručnjaku, a dodatno su pojašnjena u postojećim priručnicima za primenu PCR-a (poput onih malopre citiranih).

[0071]Alternativno, specifični prajmeri mogu da se koriste sa ciljem da se amplifikuju integracioni fragmenti koji mogu da budu korišćeni kao "specifične probe" za identifikovanje događaja EE-GM3 i EE-GM2 u biološkim primercima. Kontaktiranje nukleinske kiseline iz nekog biološkog primerka sa probama u uslovima koji dozvoljavaju hibridizaciju proba sa njihovim odgovarajućim fragmentima u nukleinskoj kiselini iz primerka rezultuje formiranjem hibrida nukleinska kiselina/proba. Formiranje ovih hibrida može da se detektuje (na primer, preko označavanja nukleinske kiseline ili probe), pri čemu formiranje ovih hibrida ukazuje na prisutnosti događaja EE-GM3 i EE-GM2. Takvi identifikacioni postupci na bazi hibridizacije sa specifičnom probom (u čvrstoj fazi ili u rastvoru) su opisani u stanju tehnike. Specifična proba je preferirano neka sekvenca koja, u optimizovanim uslovima, hibridizuje specifično sa regionom iz 5'- ili 3'-bočnog regiona elitnog događaja, a preferirano takođe obuhvata deo susedne strane DNA (nadalje označen kao "specifičan region"). Preferirano, specifična proba obuhvata sekvencu veličine između 50 i 500 bp, preferirano od 100 do 350 bp koja je najmanje 80%, preferirano između 80% i 85%, bolje između 85% i 90%, posebno preferirano između 90% i 95%, a najbolje između 95% i 100% identična (ili komplementarna) sa nukleotidnom sekvencom iz specifičnog regiona. Preferirano, pomenuta specifična probe obuhvata sekvencu od oko 15 do oko 100 kontinuiranih nukleotida koji su identični (ili komplementarni) sa specifičnim regionom iz elitnog događaja.

[0072]Nadalje, specifični postupci za detektovanje elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM2, koji se razlikuju od postupaka amplifikacije na bazi PCR-a, takođe mogu da se razviju uz primenu specifične informacije iz sekvence elitnog događaja koja je ovde navedena. Takvi alternativni postupci za detektovanje uključuju postupke za detektovanje amplifikacije linearnog signala na bazi invazionog cepanja tačno određenih struktura nukleinske kiseline, takođe poznato kaoInvaderTM technology(kao šta je opisano u Američkim patentima 5,985,557 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", i 6,001,567 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage, koji su ovde uključeni preko reference). Za detektovanje događaja EE-GM3 uz pomoć ovoga postupka, ciljna sekvenca treba da hibridizuje sa označenim prvim oligonukleotidom nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1452 do nukleotida 1469 ili njen komplement ili sa pomenutom označenom probom nukleinske kiseline koja ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 223 do nukleotida 240 ili njen komplement i dodatno hibridizuje sa drugim oligonukleotidom nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1434 do nukleotida 1451 ili njen komplement ili sa pomenutom označenom probom nukleinske kiseline koja ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 241 do nukleotida 258 ili njen komplement, pri čemu se prvi i drugi oligonukleotid preklapaju za barem jedan nukleotid. Struktura dupleksa ili tripleksa koja nastaje uz pomoć ovakve hibridizacije dozvoljava selektivno cepanje probe uz pomoć encima (Klivaza<®>) koji ostavlja ciljnu sekvencu netaknutom. Pocepana označena probe se naknadno detektuje, moguće uz pomoć među-koraka koje rezultuje dodatnom amplifikacijom signala. Za detektovanje događaja EE-GM2 uz pomoć ovoga postupka, ciljana sekvenca može da hibridizuje sa označenim prvim oligonukleotidom nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 312 do nukleotida 329 ili njen komplement ili sa pomenutom označenom probom nukleinske kiseline koja ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 490 do nukleotida 507 ili njen komplement i dodatno hibridizuje sa drugom oligonukleotidom nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 294 do nukleotida 311 ili njen komplement ili sa pomenutom označenom probom nukleinske kiseline koja ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 508 do nukleotida 525 ili njen komplement, pri čemu se prvi i drugi oligonukleotid preklapaju za najmanje jedan nukleotid. Struktura dupleksa ili tripleksa koja nastaje ovom hibridizacijom dozvoljava selektivno cepanje probe sa encimom (Klivaza®) koji ostavlja ciljnu sekvencu netaknutom. Pocepana označena proba se naknadno detektuje, potencijalno preko među-koraka koji rezultuje dodatnom amplifikacijom signala.

[0073]U skladu sa ovim, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za detektovanje prisutnosti elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM2 u biološkim primercima uz pomoć hibridizacije sa probom sa označenom glavno komplementarnom nukleinskom kiselinom pri čemu se omer probe : ciljana nukleinska kiselina amplifikuje uz pomoć recikliranja sekvence ciljane nukleinske kiseline (ovaj postupak je opisan u zahtevu 18).

[0074]"Komplet hemikalija", kao šta se ovde koristi, se odnosi na komplet reagenasa za provođenje postupka iz ovoga pronalaska, ili malo specifičnije, za identifikaciju elitnog događaja EE-GM3 u biološkim primercima ili za određivanje statusa zigotnosti biljnog materijala koji sadrži događaj EE-GM3. Još preciznije, preferirana izvedba kompleta sa hemikalijama iz ovoga pronalaska sadrži najmanje jedan ili dva specifična prajmera, kao šta je opisano iznad, za identifikaciju elitnog događaja, ili tri specifična prajmera za određivanje statusa zigotnosti. Opciono, pomenuti komplet hemikalija dodatno sadrži i bilo koji drugi reagens koji je ovde opisan u vezi sa protokolom za PCR identifikaciju. Alternativno, u skladu sa drugom izvedbom ovoga pronalaska, pomenuti komplet hemikalija sadrži specifičnu probu, kao šta je opisano iznad, koja specifično hibridizuje sa nukleinskom kiselinom iz bioloških primeraka sa ciljem identifikovanja prisutnosti događaja EE-GM3 u njima. Opciono, ovaj komplet hemikalija dodatno sadrži bilo koji drugi reagens (poput, ali bez ograničenja, pufera za hibridizaciju, nalepnicu) za identifikovanje događaja EE-GM3 u biološkim primercima uz pomoć primene pomenute specifične probe.

[0075]Pomenuti komplet hemikalija iz ovoga pronalaska može da se koristi, a njegove komponente mogu da budu specifično podešene, za kontrolu kvaliteta (na primer, čistoća serija semenskog materijala), za detektovanje prisutnosti ili odsutnost elitnog događaja u biljnom materijalu ili u materijalu koji sadrži ili je dobiven iz biljnog materijala, poput, ali bez ograničenja, hrane ili stočne hrane.

[0076]Kao šta se ovde koristi, "identičnost sekvence" kada se govori o nukleotidnim sekvencama (DNA ili RNA), se odnosi na broj pozicija sa identičnim nukleotidima podeljen sa brojem nukleotida u kraćoj od dve sekvence. Alajniranje dve nukleotidne sekvence se provodi uz pomoć algoritma od Wilbura i Lipmanna (Wilbur & Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:726) uz korišćenje prozora veličine 20 nukleotida, dužinu reči od 4 nukleotida, i kazne od 4 boda za prazninu. Računarna analiza i interpretacija podataka sekvence, uključujući alajniranje sekvence kao šta je opisano iznad, može, na primer, da se prikladno provede uz pomoć softverskog paketa za analizu sekvence odGenetics Computer Group(GCG, University of Wisconsin Biotechnologv Center). Sekvence se označavaju "slične u suštini" kada dele identičnost od najmanje oko 75%, posebno najmanje oko 80%, još bolje najmanje oko 85%, mnogo bolje najmanje oko 90%, posebno dobro najmanje oko 95%, a najbolje najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99%. Jasno je da kada se kaže da su RNA sekvence slične u suštini ili imaju određeni stepen identičnosti sa DNA sekvencama, timidin (T) u DNA sekvenci se smatra jednakim sa uracilom (U) iz RNA sekvence. Takođe, jasno je da mogu da se pojave male razlike ili mutacije u DNA sekvencama tokom vremena i da nešto pogrešno sparenih baza mogu da budu dozvoljene u prajmerima koji su specifični za događaj ili u probama iz ovoga pronalaska, lako da svaka DNA sekvenca koja je ovde navedena u bilo kojoj izvedbi iz ovoga pronalaska za bilo koju 3'- ili 5'-bočnu DNA ili za bilo koji insert ili stranu DNA ili za bilo koji prajmer ili probu iz ovoga pronalaska, takođe obuhvata sekvence koje su slične u suštini sa sekvencama koje su ovde obezbeđene, poput sekvenca koje hibridizuju sa identičnosti od najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili najmanje 99% sa sekvencom iz bilo koje 3'- ili 5'-bočne DNA, iz bilo kojeg prajmera ili probu ili iz bilo kojeg inserta ili strane DNA iz ovoga pronalaska.

[0077] Termin "prajmer", kao šta se ovde koristi, obuhvata bilo koju nukleinsku kiselinu koja je sposobna da potakne sintezu nascentne nukleinske kiseline u procesu koji je zavisan o kalupu, poput PCR-a. Tipično, prajmeri su oligonukleotidi sa 10 do 30 nukleotida, ali mogu da se koriste i duže sekvence. Prajmeri mogu da dolaze u dvo-lančanoj formi, mada je jedno-lančana forma preferirana. Probe mogu da se koriste kao prajmeri, mada su dizajnirane da se vežu na ciljnu DNA ili RNA i ne moraju da se koriste u procesu za amplifikaciju.

[0078] Termin "prepoznaje", kao šta se ovde koristi, se odnosi na specifične prajmere, uzimajući u obzir da specifični prajmeri specifično hibridizuju sa sekvencom neke nukleinske kiseline iz elitnog događaja u opisanim uslovima za ovaj postupak (poput uslova iz protokola za PCR identifikaciju), pri čemu se specifičnost određuje uz pomoć pozitivne i negativne kontrole.

[0079] Termin "hibridizuje", kao šta se ovde koristi, se odnosi na specifične probe, uzimajući u obzir da se proba veže na specifičan region iz sekvence neke nukleinske kiseline iz elitnog događaja u uslovima standardne strogosti. Uslovi standardne strogosti, kao šta se ovde koriste, se odnose na uslove za ovde opisanu hibridizaciju ili na konvencionalne uslove za hibridizaciju kao šta je opisano u Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Drugo izdanje, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, NY) koji, na primer, obuhvataju sledeće korake: 1) imobiliziranje fragmenata biljne genomske DNA na filteru, 2) pre-hibridizovanje na filteru tokom 1 do 2 h na 42° C u 50% formamidu, 5x SSPE, 2x Denhardt-ovom reagensu i 0.1% SDS, ili tokom 1 do 2 h na 68° C u 6x SSC, 2x Denhardt-ovom reagensu i 0.1% SDS, 3) dodavanje probe za hibridizaciju koja je već obeležena, 4) inkubiranje tokom 16 h do 24 h, 5) ispiranje filtera tokom 20 min na sobnoj temperaturi u lx SSC, 0.1% SDS, 6) ispiranje filtera tri puta tokom 20 min na 68° C u 0.2x SSC, 0.1% SDS, i 7) izlaganje filtera tokom 24 h do 48 h filmu X-zraka na -70° C.

[0080] Kao šta se ovde koristi, biološki primerak je primerak biljke, biljnog materijala ili produkata koji sadrže biljni materijal. Termin "biljka" ima za namenu da obuhvati biljno tkivo soje( Glycine max),u bilo kojoj fazi zrelosti, kao i bilo koju ćeliju, tkivo, ili organe koji su uzeti iz ili dobiveni iz neke takve biljke, uključujući, ali bez ograničenja, bilo koji semenski materijal, listove, stabljike, svetove, korene, pojedinačne ćelije, gamete, ćelijske kulture, tkivne kulture ili protoplaste. "Biljni materijal", kao šta se ovde koristi, se odnosi na materijal koji se dobiva iz ili je izveden iz neke biljke. Produkti koji sadrže biljni materijal i koji su namenjeni za hranu, stočni hranu ili drugi produkti koji su proizvedeni uz korišćenje biljnog materijala ili mogu da se kontaminiraju sa biljnim materijalom. Podrazumeva se da se, u kontekstu ovoga pronalaska, takvi biološki primerci testiraju na prisutnost nukleinskih kiselina koje su specifične za događaje EE-GM3 i EE-GM2 koje implicira prisutnost nukleinskih kiselina u tim primercima. Tako, postupci koji se ovde navode za potrebe identifikovanja elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM2 u biološkim primercima, se odnose na identifikovanje nukleinskih kiselina, koje sadrže pomenuti elitni događaj, u pomenutim biološkim primercima.

[0081] Kao šta se ovde koristi, "koji sadrži" treba da se interpretira kao da specifikuje prisutnost navedenih karakteristika, celih brojeva, koraka, reagenasa ili komponenata, ali ne isključuje mogućnost prisutnosti ili dodavanja jedne ili više karakteristika, celih brojeva, koraka ili komponenata, ili njihovih grupa. Tako, na primer, nukleinska kiselina ili belančevina koja ima sekvencu nukleotida ili amino-kiselina, može da sadrži još nukleotida ili amino-kiselina od količine koja je navedena, tj., može da bude uklopljena u većoj nuklcinskoj kiselini ili belančevini. Himerni gen koji sadrži DNA sekvencu koja je funkcionalno ili strukturno definisana, može da sadrži dodatne DNA sekvence, poput promotora i sekvence za prekida nje transkripcije.

[0082] Ovaj pronalazak takođe se odnosi na formiranje uzastopne nakupine elitnog događaja EE-GM3 i elitnog događaja EE-GM2 u soji, na biljke koje sadrže takve nakupine pomenutih događaja, na potomstvo koje može da se dobije od ovih biljaka i na biljne ćelije, ili biljni materijal koji je izveden iz biljaka koje sadrže pomenute nakupine. Biljke koje sadrže elitne događaje EE-GM3 i EE-GM2 mogu da se dobiju kao šta je opisano u primeru 1. Nakupine se dobijaju uz pomoć ukrštanja biljaka, koje sadrže pojedinačne događaje, primenom konvencionalnih postupaka uzgoja i uz pomoć identifikacije njihovog potomstva koje sadrži dva različita događaja.

[0083] Biljke soje ili biljni materijal koji sadrži događaje EE-GM3 i EE-GM2 može da se identifikuje uz pomoć protokola za PCR identifikaciju događaja EE-GM3 i EE-GM2 koji je opisan u Primeru 2. Ukratko, genomska DNA soje koja je prisutna u biološkom primerku se amplifikuje uz pomoć PCR-a uz korišćenje prajmera koji specifično prepoznaje neku sekvenca u 5'- ili 3'-bočnoj sekvenci EE-GM3 poput prajmera sa sekvencom SEQ ID Br.: 5, i prajmera koji prepoznaje neku sekvencu u stranoj DNA, poput prajmera sa sekvencom SEQ ID Br.: 4 i uz dodatno korišćenje prajmera koji specifično prepoznaje neku sekvencu u 5'- ili 3'-bočnoj sekvenci EE-GM2 poput prajmera sa sekvencom SEQ ID Br.: 18, i prajmera koji prepoznaje neku sekvencu u stranoj DNA, poput prajmera sa sekvencom SEQ ID Br.: 19.

[0084] DNA-prajmeri koji amplifikuju deo endogene sekvence iz soje se koriste kao pozitivna kontrola za PCR amplifikaciju. Ako nakon PCR amplifikacije ispitivani materijal proizvede fragmente očekivanih veličina, pomenuti materijal sadrži biljni materijal iz soje koja sadrži elitne događaje EE-GM3 i EE-GM2.

[0085] Biljke koje sadrže događaje EE-GM3 i EE-GM2 tolerantne su na glifosat, kao i na inhibitore HPPD poput izoksaflutola i dodatno poseduju toleranciju na glufosinat. Biljke koje sadrže nakupine pomenutih događaja su takođe karakterizovane i sa time šta imaju agronomske karakteristike koje su uporedive sa komercijalno dostupnim varijetetima soje, kada se herbicid ne primenjuje. Primećeno je da prisutnost strane DNA u regionima insercije u genomu soje, koji su ovde opisani, donosi posebno interesantne fenotipske i molekularne karakteristike biljkama koje sadrže pomenuti događaj.

[0086] Takođe, ovde je opisana kombinacija elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM2 u biljkama soje, koja može da se dobije insercijom transgena na specifičnim lokacijama u genomu soje, pri čemu pomenuti elitni događaji tim biljkama donose toleranciju na glifosat, glufosinat i inhibitor HPPD poput izoksaflutola, i pri čemu pomenuti elitni događaji ne utiču na agronomski rezultata takvih biljaka soje, poput negativnog uticaja na njihov prinos, ako se uporede sa izogenim linijama (kao šta se ovde koristi, "izogene linije" ili "gotovo-izogene linije" su linije soje iste genetičke pozadine, ali bez transgena, poput biljaka iste genetičke pozadine kao i biljke koje su korišćene za transformaciju, ili segregirajućih sestrinskih linija koje su izgubile pomenute transgene). Posebno, ovaj pronalazak obezbeđuje kombinaciju elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM2 u biljkama soje, pri čemu insercija ili prisutnost pomenutih elitnih događaja u genomu takvih biljaka soje ne uzrokuje povećanu osetljivost na bolest, ne uzrokuje umanjenje prinosa, ili ne uzrokuje povećano polijeganje biljaka u takvim kultivarima soje ako se uporede sa izogenima linijama. Tako, ovaj pronalazak obezbeđuje kombinaciju elitnih događaja (koji su označeni kao EE-GM3 i EE-GM2) u biljkama soje, koje rezultuje biljkama soje koje mogu da tolerišu primenu glifosata, glufosinata i inhibitora HPPD (simultano ili odvojeno) bez da to negativno utiče na prinos pomenutih biljaka soje ako se uporede sa izogenima linijama, pri čemu pomenute biljke soje ne pokazuju statistički značajnu razliku njihove osetljivosti na bolest, ili polijeganje biljaka ako se uporede sa izogenim biljkama soje. Ove karakteristike čine pomenutu kombinaciju elitnih događaja veoma interesantnom za kontrolu korova, koji su otporni na glifosat, na poljima soje, a takođe može da se koristi za preventiranje ili odgađanje pojave daljne rezistencije na glifosat na poljima soje (na primer, uz pomoć primene glifosata i izoksaflutola i/ili glufosinata, ili uz pomoć primene izoksaflutola i glifosata i/ili glufosinata, ili uz pomoć primene glufosinata i glifosata i/ili izoksaflutola, koje obezbeđuje barem 2 ili čak 3 različita modusa delovanja herbicida nanesenih na polje soje).

[0087] Ovde je takođe obezbeđena biljka soje ili njen deo koji sadrže elitni događaj EE-GM3 i elitni događaj EE-GM2, pri čemu je njen reprezentativni semenski materijal, koji sadrži događaj EE-GM3, deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem 41659, reprezentativni semenski materijal, koji sadrži elitni događaj EE-GM2, je deponovan u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 41660, a reprezentativni semenski materijal, koji sadrži događaje EE-GM3 i EE-GM2, je deponovan u ATCC pod pristupnim brojem PTA-11042.

[0088] Biljke ili njihovi delovi koji sadrže događaje EE-GM3 i EE-GM2 mogu da se dobiju kombinovanjem odgovarajućih elitnih događaja kao šta može da se pronađe u odgovarajućem deponovanom semenskom materijalu uz pomoć bilo kojih dostupnih načina poznatih stanju tehnike, uključujući ukrštanje biljaka dobivenih iz deponovanog semenskog materijala, sakupljanje njihovog potomstva, i identifikovanje pomenutog potomstva koje sadrži odgovarajuću kombinaciju elitnih događaja. Dalje, ovde je obezbeđen semenski materijal takvih biljaka, koje sadrže pomenute događaje, kao i sojin produkt koji je proizveden iz takvog semenskog materijala, pri čemu pomenuti sojin produkt sadrži događaj EE-GM3 i EE-GM2. Takav sojin produkt je ili sadrži obrok, smrvljeni semenski materijal, brašno ili pahuljice, i sadrži nukleinske kiseline koje su specifične za elitne događaje EE-GM2 i EE-GM3, koje mogu da se detektuju uz pomoć ovde opisanog postupka. Posebno, takav sojin produkt sadrži nukleinsku kiselinu koja producira amplikone koji mogu da se koriste za dijagnostiku događaja EE-GM3 i elitni događaj EE-GM2, pri čemu takvi amplikoni obuhvataju SEQ ID Br. 2 ili 3 i/ili SEQ ID Br. 14 ili 15. Takođe, ovde je obezbeđen postupak za proizvodnju sojinog produkta, koji podrazumeva nabavljanje semenskog materijala koji sadrži događaj EE-GM3 i elitni događaj EE-GM2, i proizvodnju sojinog proizvoda iz njega.

[0089] Takođe, ovde je obezbeđena biljka soje, koja je potomak bilo koje iznad opisane biljke soje, koja sadrži događaje EE-GM3 i EE-GM2.

[0090] Takođe, ovde je opisan postupak za proizvodnju biljke soje koja je tolerantna na glifosat i/ili glufosinat i/ili izoksaflutol, koji obuhvata uvođenje u genom pomenute biljke događaje EE-GM3 i EE-GM2 posebno uz pomoć ukrštanja prve biljke soje, koja sadrži događaj EE-GM3, sa drugom biljkom soje, koja sadrži događaj EE-GM2, i selektiranje biljke potomka koja je tolerantna na glifosat i/ili glufosinat i/ili izoksaflutol.

[0091] Takođe, ovde je obezbeđena biljka koja je tolerantna na glifosat i glufosinat i/ili izoksaflutol, koja sadrži EE-GM2 i EE-GM3, kod koje nema umanjenje prinosa, i koja ima prihvatljive agronomske karakteristike, koja sadrži 2mEPSPS, HPPD i PAT belančevinu, i koja je sposobna da producira amplikon za dijagnostiku događaja EE-GM3 i EE-GM2.

[0092] Dalje, ovde je obezbeđen postupak za kontrolu korova na polju biljaka soje, koje sadrže događaje EE-GM3 i EE-GM2, koji obuhvata tretiranje pomenutog polja sa efektivnom količinom herbicida na bazi izoksaflutola, glifosata i/ili glufosinata, pri čemu su takve biljke tolerantne na pomenuti herbicid(e).

[0093] Termin "izoksaflutol", kao šta se ovde koristi, se odnosi na herbicid izoksaflutol [tj. (5-ciklopropil-4-izoksazolil)[2-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)fenil]metanon], na neki njegov aktivan metabolit, diketonitril, i na bilo koju smešu ili rastvor koji sadrže pomenuta jedinjenja. Herbicidi koji inhibiraju HPPD i koji su korisni za primenu na biljkama koje sadrže događaje iz ovoga pronalaska su diketonitrili, na primer, 2-cijano-3-ciklopropil-l-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-dion i 2-cijano-1 -[4-(metilsulfonil)-2-trifluorometilfenil]-3-(1 - metilciklopropil)propan-l,3-fion; ostali izoksazoli; i pirazolinati, na primer, topramezon [tj. [3-(4,5-dihidro-3-izoksazolil)-2-metil-4-(metilsulfonil)fenil](5-hidroksi-l-metil-lH-pirazol-4-il)metanon], i pirasulfotol [(5-hidroksi-l,3-dimetilpirazol-4-il(2-mesil-4-lrifluaromelilfenil)metanon]; ili pirazofen [2-[4-(2,4-dihlorobenzoil)-l,3-dimelilpirazol-5-iloksijacetofenon].

[0094] Kao šta je ovde opisano, polje za sejanje sa biljkama soje koje sadrže događaj EE-GM3, može da se tretira sa inhibitorom HPPD, poput izoksaflutola ('IFT'), pre sađenja biljaka soje ili pre no je semenski materijal posejan, koje čisti polje od korova koji budu poubijani uz pomoć inhibitora HPPD, dozvoljavajući praksu sejanja na neoranom tlu, nakon čega sledi sađenje ili sejanje soje na istom pre-tretiranom polju( burndown- phmenauz pomoć inhibitora HPPD). Rezidualna aktivnost IFT takođe štiti mlade ili rastuće biljke soje od kompeticije sa korovima koji se nalaze u ranijim fazama rasta. Jednom kada biljke soje postignu određenu veličinu, a korovi se ponovo pojave, glifosat, ili smeša sa inhibitorom HPPD, mogu da se nanesu preko samih biljaka soje (herbicid koji se primenjuje nakon izbijanja biljaka).

[0095] U jednoj izvedbi ovoga pronalaska, polje u kojem je posejan semenski materijal koji sadrži EE-GM3 događaj može da bude tretirano sa inhibitorom HPPD, poput IFT, pre pojave biljaka soje, ali i nakon sejanja semenskog materijala (polje može da se očisti od korova pre sejanja uz pomoć drugih načina, tipično konvencionalne ratarske prakse poput oranja, obrade sachissel- plugom,ili prethodne pripreme semena), pri čemu rezidualna aktivnost održava polje bez korova, koji su poubijani sa herbicidom, tako da mlade ili rastuće biljke soje ne moraju da ulaze u kompeticiju sa korovima (tretman sa inhibitorom HPPD pre izbijanja biljaka). Jednom kada biljke soje dosegnu određenu veličinu, a korovi se ponovo pojave, glifosat - ili smeša inhibitor HPPD-glifosat - može da se nanese na ove biljke (herbicid koji se primenjuje nakon izbijanja biljaka).

[0096] U drugoj izvedbi ovoga pronalaska, biljke koje sadrže događaje EE-GM3 i EE-GM2 mogu da se tretiraju sa inhibitorom HPPD, poput IFT, koji se nanosi na same biljke soje (koje su izrasle iz posejanog semenskog materijala), koje čisti polje od korova poubijanih sa inhibitorom HPPD, a čija primena može da nastupi zajednički sa (na primer, mešavina u kontejneru za prskanje), nakon ili uz tretmana sa glifosatom kao herbicid koji se primenjuje nakon izbijanja biljaka tako da se nanosi na same biljke (primena inhibitora HPPD nakon izbijanja biljaka (sa ili bez glifosata)).

[0097]Takođe, u skladu sa ovim pronalaskom, biljke soje koje sadrže EE-GM3 i EE-GM2 mogu da se tretiraju sa sledećim insekticidima, herbicidima ili fungicidima ili sojin semenski materijal koji sadrži EE-GM3 i EE-GM2 može da bude prekriven sa premazom za semenski materijal koji obuhvata sledeće insekticide, herbicide ili fungicide:

Herbicidi za soju:

alahlor, bentazon, trifluralin, hlorimuron-etil, kloransulam-metil, fenoksaprop, fomesafen, fluazifop, glifosat, imazamoks, imazaquin, imazetapir, (S-) metolahlor, metribuzin, pendimetalin, tepraloksidim, izoksaflutol, glufosinat.

Insekticidi za soju:

lambda-cihalotrin, metomil, paration, tiokarb, imidakloprid, klotianidin, tiametoksam, tiakloprid, acetamiprid, dinetofuran, flubendiamid, rinaksipir, kiazipir, spinosad, spinotoram, emamektin-benzoat, fipronil, etiprol, deltametrin, fi-ciflutrin, gama i lambda cihalotrin, 4-[[(6-hlorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, spirotetramat, spinodiklofen, triflumuron, flonikamid, tiodikarb, beta-ciflutrin.

Fungicidi za soju:

azoksistrobin, ciprokonazol, epoksikonazol, flutriafol, piraklostrobin, tebukonazol, trifloksistrobin, protiokonazol, tetrakonazol.

[0098] Sledeći primeri opisuju postupak identifikacije elitnih događaja EE-GM3, EE-GM1 i EE-GM2 i biljke koje sadrže nakupine događaja EE-GM3 i EE-GM1 ili EE-GM3 zajedno sa EE-GM2 i razvoj alata za specifičnu identifikaciju elitnih događaja EE-GM3, EE-GM1 ili EE-GM2 i njihovih nakupina u biološkim primercima.

[0099] Osim ako je navedeno drugačije u Primerima, sve tehnike rekombinantne DNA su provođene u skladu sa standardnim protokolima kao šta je opisano u "Sambrook J & Russell DW (ur.) (2001) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 3. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, New York" i u "Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA & Struhl K (ur.) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York".

[0100]Standardni materijali i reference su opisani u "Croy RDD (ur.) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford & Blacksvell Scientific Publications, Oxford" i u "Brown TA, (1998) Molecular Biology LabFax, 2. izdanje, Academic Press, San Diego". Standardni materijali i postupci za lančanu reakciju polimerazom (PCR) mogu da se pronađu u "McPherson MJ & M0ller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford" i u "PCR Applications Manual, 3. izdanje (2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim ili na wvvw. roche- applied- science. com".

[0101] Podrazumeva se da se broj parametara u bilo kojem laboratorijskom protokolu, poput PCR-protokola iz Primera ispod, može podešavati prema specifičnim laboratorijskim uslovima, i može da se blago modifikuje kako bi se dobili slični rezultati. Na primer, upotreba različitog postupka za pripremu DNA ili izbor drugih prajmera za PCR-postupak može da zahteva druge optimalne uslovne za pomenuti PCR-protokol. Ova podešavanja su, međutim, poznata stručnjaku, a dodatno su opisana u postojećim priručnicima za primenu PCR-a.

[0102]U opisu i primerima su navedene sledeće sekvence:

Primeri

1. TransformacijaGlycine maxsa genima za toleranciju na herbicid.

1.1. Opis strane DNA koja sadrži himerne gene 2mEPSPS i HPPD-Pf-W336

[0103]Plazmid pSFlO je izveden iz vektora za kloniranje pUC19 koji sadrži himerni gen2mepspsi himerni genhppd- Pf- W336uSal Ifragmentu od oko 7.3 kb. Potpuni opis DNA koja se nalazi između dvaSalI restrikciona mesta je prikazan u Tabeli 1 ispod. Nukleotidna sekvenca je predstavljena u SEQ ID Br. 1.

1.2. Događaj EE-GM3

[0104]HPLC prečišćeniSalI-linearizovani pSFlO fragment od oko 7.3 kb (koji sadrži gen2mEPSPSza toleranciju na glifosat i genHPPD- Pf- W33za inhibiranje HPPD6)je korišćen za pripremu transformiranih biljka soje uz pomoć direktnog prenosa gena u ćelije soja tipa Jack (Nickell, C. D., G. R. Noel, D. J. Thomas, & R. Waller. Registration of'Jack' sovbean. Crop Sci 1365. 30.1990), nakon čega je usledila regeneracija transformiranih biljnih ćelija u transgenične fertilne biljke soje.

1.2.1 Identifikacija elitnog događaja EE-GM3

[0105]Elitni događaj EE-GM3 je selektiran uz pomoć ekstenzivne procedure selekcije na bazi dobre ekspresije i stabilnosti gena za toleranciju na herbicid, pri čemu je procenjena kompatibilnost sa optimalnim agronomskim rezultatima poput visine biljke, visine do čvora, uspravnog rasta, energije klijanja, prinosa semenskog materijala. Biljke soje koje su sadržavale ovaj događaj su selektirane iz širokog raspona različitih transformacijskih događaja uz pomoć istih himernih gena. Parametri koji su korišćeni za selekciju ovoga događaja su: a) prihvatljiva tolerancija na primenu herbicida izoksaflutola tokom terenskih proba, b) prihvatljiva tolerancija na primenu herbicida glifosata tokom terenskih proba, c) prihvatljiva tolerancija na kombinovanu primenu herbicida izoksaflutol i glifosat tokom terenskih proba, d) insercija transgena za toleranciju na herbicide u jednom lokusu u genomu soje, uz izostanak okosnice vektora, e) ukupna agronomija je slična sa parentnim biljkama koje su korišćene za transformaciju (zrelost, polijeganje biljaka, osetljivost na bolest, itd.), i f) bez značajnog umanjenje prinosa uzrokovanog insercijom transformirajuće DNA (upoređeno sa izogenom linijom koja ne sadrži događaj, poput biljne linije koja je korišćena za transformaciju, koja raste u istim uslovima).

[0106] U T3 generaciji, homozigotna linija soje sa transformacijskim događajem EE-GM3 je selektirana za proizvodnju semenskog materijala. Ponovljene agronomske studije na više terenskih mesta su provedene u regionima adaptacije parentnog varijeteta (Jack). Terenske evaluacije su uključivale toleranciju na herbicid i agronomski rezultat. Agronomski rezultat biljaka koje sadrže događaj EE-GM3 se pokazao uporedivim sa varijetetom Jack (kada herbicidi nisu bili primenjivani).

[0107] Terenske evaluacije su takođe pokazale da biljke koje nose događaj EE-GM3: • imaju sličnu biljnu morfologiju i karakteristike semenskog materijala upoređeno sa varijetetom Jack,

• ne pokazuju promenu u odgovoru na bolesti soje upoređeno sa varijetetom Jack, i

• ne pokazuju promene u klijavosti ili mirovanju semenskog materijala upoređeno sa varijetetom Jack.

[0108] Semenski materijal (TI ili SI generacija), koji je sakupljen od inicijalno transformirane (TO) biljke (biljka transformirana sa konstruktom tako da nastaje događaj EE-GM3) iz staklene bašte, je posejan u polju. Blokovi su posejani i poprskani sa 0, 2, ili 4 kg/ha glifosat. Iz biljaka je sakupljen semenski materijal koje upućuje na željeni nivo tolerancije na herbicid glifosat.

[0109] Semenski materijal (T2 generacija) koji je sakupljen iz samo-oplodnih TI biljaka koje su rasle u polju je posejan kao "biljke u redu". Hi-kvadrat analiza podataka segregacije iz pojedinih redova (potpuno i delomično tolerantno) i za pojedinačne biljke u redu (tolerantna ili osetljiva) pokazuje očekivano Mendel-ovo nasleđivanje pojedinačne insercije EE-GM3.

[0110]Selekcija i povećanje semenskog materijala su nastavljeni dok linija nije postala homozigotna za transformacijski događaj EE-GM3 pa je selektirana za proizvodnju osnovnog semenskog materijala u četvrtoj generaciji. Tada, semenski materijal iz T5 generacije je poslužio kao kandidat za razvoj različitih varijeteta. Biljke iz šeste generacije (T6 generacija) su ukrštene sa konvencionalnim linijama soje uz pomoć programa za introgresiju koji je osmišljen za premeštanje događaja u širu bazu komercijalne germplazme soje. Fl hibridne biljke (EE-GM3 linije x konvencionalne linije) su uzgajane do zrelosti, a F2 semenski materijal je posejan. Primerci listova iz 901 F2-biljke su analizirani uz pomoć PCR-prajmera koji su bili dizajnirani za identifikovanje zigotnosti inserta EE-GM3. Za segregaciju pojedinačne insercije je dobiven očekivani omer od 1:2:1, kao šta je očekivano po Mendel-ovim pravilima.

[0111]Selektirani događaj EE-GM3 je uveden u različite komercijalne genetičke pozadine, nakon čega su upoređeni rezultati terenskih istraživanja iz različitih lokacija. Biljke su izazvane sa glifosatom i/ili izoksaflutolom primenom različitih tretmana. Biljke su pokazale dobru toleranciju na herbicid. Stotine različitih kultivara soje, koji sadrže događaj EE-GM3, je korišćeno za potrebe studije naslednosti uz primenu herbicida. Selektirane linije iz ovog ispitivanja su kasnije uvedene u polje i takođe tretirane sa herbicidom. Iz te studije je izdvojeno 50 selektiranih linija koje su ispitivane u polju takođe uz tretman sa herbicidom. Rezultati fitotoksičnosti za kasne linije poprskane sa izoksaflutolom i glifosatom su pokazale određenu varijabilnost u odgovoru, ali raspon odgovora među linijama je ukazivao na sličnu varijabilnost koja je primećena u 4 replikacije događaja EE-GM3 u originalnoj pozadini Jack, koja je uzgajana uz isti tretman i iste uslove okoline. Tako, primećena je tolerancija na relevantne herbicide u širokom rasponu germplazme biljaka koje sadrže događaj EE-GM3.

[0112]Nadalje, biljke koje sadrže događaj EE-GM3 imaju normalnu morfologiju lišća, cveta i mahune, izvrsnu fertilnost, i ne pokazuju abnormalnu osetljivost na bolesti ili insekte u višestrukim genetičkim pozadinama. Tokom introgresije u višestruke genetičke pozadine nisu primećeni aberantni problemi ili abnormalnosti.

[0113]Tokom jedne sezone je bila provedena studija na 10 lokacija sa ciljem upoređivanja agronomski rezultata soje koja je tolerantna na dva herbicida i koja sadrži transformacijski događaj EE-GM3 u odnosu na parentni varijetet koji je bio transformiran (Jack) i na neke ne-transgenične varijetete soje. Uz primenu dizajna randomizovanog kompletnog bloka, biljke sa događajem EE-GM3 su uzgajane u reproduktivnim parcelama uz kontrolu od konvencionalnog korova ili uz primenjivane herbicide, glifosat i izoksaflutol. Parcele sa biljkama soje koje su sadržavale transformacijski događaj EE-GM3 su poprskane sa izoksaflutolom sa ciljanom stopom od 70 g ai/Ha i sa glifosatom sa ciljanom stopom od 1060 g ai/Ha. Nanošenje herbicida na pomenute biljke je provedeno uz pomoć folijarnog spreja u fazi biljnog rasta V4-V5. Agronomske opservacije su provođene u ranoj, srednjoj i kasnoj sezoni. Gustina biljaka (parametar; uspravne biljke) je veći u parceli sa varijetetima Jack i ne-transgeničnih biljaka u odnosu na parcelu sa biljkama koje sadrže događaj EE-GM3 (standardna devijacija). Takva razlika može da bude rezultat kvalitete pojedine serije semenskog materijala, jer je semenski materijal koji sadrži EE-GM3 je proizveden u klijalištu koje štiti van sezone, dok je semenski materijal ne-transgeničnih varijeteta proizveden tokom normalnih susednih sezona proizvodnje. Međutim, broj dana koji je potreban da se postigne 50% rasta i stope biljnog vigora (energija klijanja) su ostali isti, koje pokazuje da su serije semenskog materijala uporedive za pomenute parametre izvedbe. Šta se tiče rezultata iz kasne sezone, Jack i ne-transgenični varijeteti ostaju različiti za jednu standarnu devijaciju od biljaka sa događajem EE-GM3. Prinosi po parceli kod biljaka sa događajem EE-GM3 su takođe niži od onih kod Jack-a za jednu standardnu devijaciju, koje je rezultat niže gustine na parceli biljaka koje imaju događaj EE-GM3. Prinos ne-transgeničnih varijeteta je veći od Jack-a kao šta je očekivano zbog porasta prinosa kod novijih varijeteta.

[0114]U jednoj studiji, rangiranje biljnog zdravlja je provedeno u tri faze rasta: V4-5, Rl i puna zrelost. Prva evaluacija je usledila odmah nakon nameravane upotrebe herbicida. U tački konačne evaluacije biljnog zdravlja, biljke koje sadrže događaj EE-GM3 i koje su bile poprskane sa oba herbicida su pokazale isti rezultat kao i neprskane Jack-biljke, ili neprskane biljke koje sadrže događaj EE-GM3. Kod rangiranja od strane agronomskih stručnjaka, biljke koje su poprskane sa herbicidom su dobile zdravstveno rangiranje od 3-4 (blaga ozleda) u fazama biljnog rasta V4-5 i Rl. Neprskane biljke (netransformirane Jack-biljke ili biljke soje koje sadrže događaj EE-GM3) su rangirane kao 4.6-4.8 (ocena 5 ukazuje da nema ozlede). Kod konačnog rangiranja biljnog zdravlja, sve parcele su isto rangirane, tj. 5 (bez ozlede).

[0115]Jedna sezona je bila izuzetno kišovita pa je ozleda useva biljaka koje sadrže događaj EE-GM3, nakon tretiranja sa herbicidom, vidljivija u odnosu sa drugim sezonama. Terenske procene takođe uključuju monitoring karakteristika fitnesa (reprodukcija, otpornost na bolest, fekunditet, širenje semenskog materijala, mirovanje, perzistenciju). Za reproduktivne karakteristike; dani do pojave biljke, dani do 50% cvetanja i dani do 90% sazrevanja mahuna, EE-GM3-biljke i Jack-biljke nisu bili različite. Razlike nisu primećene ni kod reakcije na prirodne zaraze sa biljnim bolestima i insektima štetočinama. Mada su biljke sa događajem EE-GM3 proizvele manji konačni prinos od Jack-biljaka, razlika u fekunditetu (težina semenskog materijala: 100) nije primećena. Procena parametara širenja semenskog materijala (otvaranje mahune i polijeganje biljaka) je pokazala da EE-GM3-biljke i Jack-biljke imaju istu ocenu za otvaranje mahune, ali biljke sa događajem EE-GM3 su manje sklone polijeganju. Evaluacija semenskog materijala koji je sakupljen sa 10 lokacija ne ukazuje na povećanu zabrinutost od rezultata za klijanje ili mirovanje.

[0116]U studijama tokom izuzetno kišne sezone, finalan prinos EE-GM3-biljaka, bez obzira na tretman sa kontrolnim korovom, je manji od prinosa Jack-biljaka za jednu standardnu devijaciju (možda je to rezultat niže gustine u parceli sa biljkama sa događajem EE-GM3). U izuzetno vlažnoj sezoni, ozleda useva (beljenje na 10-30% površine useva) je prijavljena u parceli sa EE-GM3-biljkama do šest sedmica nakon folijarne primene glifosata i izoksaflutola. Međutim, za zrelost, ocena "bez ozleda" je pripisana svim parcelama. Ponovljeni terenski opiti na više lokacija sa događajima EE-GM3 uvedenih u pozadinu elitnog kultivara soje, kada se uporede sa gotovo-izogenim sestrinskim linijama koje ne sadrže transgen, očekivano ne pokazuju razliku u prinosu između biljka koji sadrže događaj EE-GM3 i gotovo-izogenih linija (bez tretmana sa herbicidom).

[0117]Dalje, u ponovljenom terenskom ispitivanju tolerancija useva (beljenje manje od 10%) je pronađena u biljkama soje koje sadrže EE-GM3 kada su tretirane sa IFT pre- ili nakon izbijanja biljaka (70 gr ai/ha sa 0.5% NIS, Agrideks), ali takođe značajna tolerancija useva (beljenje manje od 10%) je pronađena u biljkama soje koje sadrže događaj EE-GM3 kada su tretirane sa pirasulfotolom (drugi inhibitor HPPD) nakon izbijanja klijanaca (35 gr ai/ha sa 0.5% NIS, Agrideks).

1.2.2 Identifikacija bočnih regiona i strane DNA iz elitnog događaja EE-GM3

[0118]Sekvenca bočnih regiona iz strane DNA, koja u elitnom događaju EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, je određeno da predstavlja:

1.2.2.1. Desni(5')bočni region

[0119]Fragment identifikovan kao da sadrži 5'-bočni region je sekvenciran, a nukleotidna sekvenca je predstavljana u SEQ ID Br. 2. Sekvenca između nukleotida 1 i 1451 odgovara biljnoj DNA, dok sekvenca između nukleotida 1452 i 1843 odgovara stranoj DNA.

1.2.2.2. Levi (3') bočni region

[0120]Fragment identifikovan kao da sadrži 3'-bočni region je sekvenciran, a njegova nukleotidna sekvenca je predstavljena u SEQ ID Br. 3. Sekvenca između nukleotida 1 i 240 odgovara stranoj DNA, dok sekvenca između nukleotida 241 i 1408 odgovara biljnoj DNA.

1.2.2.3. Strana DNA koja sadrži gene za toleranciju na herbicide iz događaja EE-GM3

[0121]Uz pomoć različitih molekularnih tehnika je bilo određeno da strana DNA iz elitnog događaja EE-GM3, koji sadrži gene za toleranciju na herbicide, sadrži dve delomične 3'-histonAt sekvence u orijentaciji glava-na-glavu, nakon čega slede 2 gotovo kompletne kopijeSal Ifragmenta iz pSFlO u orijentaciji glava-na-rep (vidi Sliku 1).

[0122]Strana DNA, koja u EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, tako sadrži poredane sledeće sekvence: • od nukleotida 1 do nukleotida 199: nukleotidna sekvenca koja odgovara komplementu nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 1 od nt 6760 do nt 6958; • od nukleotida 200 do nukleotida 624: nukleotidna sekvenca koja odgovara nukleotidnoj sekvenci iz SEQ ID Br. 1 od nt 6874 do nt 7298; • od nukleotida 625 do nukleotida 7909: nukleotidna sekvenca koja odgovara nukleotidnoj sekvenci iz SEQ ID Br. 1 od nt 7 do nt 7291; • od nukleotida 7910 do nukleotida 15163: nukleotidna sekvenca koja odgovara nukleotidnoj sekvenci iz SEQ ID Br. 1 od nt 12 do nt 7265; i • od nukleotida 15164 do nukleotida 15187: nukleotidna sekvenca koja odgovara nukleotidnoj sekvenci iz SEQ ID Br. 3 od nt 217 do nt 240 (ova sekvenca ne odgovara ni DNA plazmida pSFlO niti DNA biljke divljeg-tipa pa prema tome je označena kao

filler- DNA).

[0123]Ova strana DNA se nastavlja tik uzvodno i susedno stranoj DNA iz 5'-bočne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1 do 1451, a nakon nje tik nizvodno i susedno sledi strana DNA iz 3'-bočne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 241 do nukleotida 1408.

[0124]Potvrđeno potpuno sekvenciranje strane DNA i bočnih DNA sekvenca EE-GM3 daje sekvencu koja je prijavljena kao SEQ ID Br. 20. U toj sekvenci, insertirana DNA se proteže od nukleotidne pozicije 1452 do nukleotidne pozicije 16638, a 2 gotovo kompletne kopije iz pSFlO, aranžirane u orijentaciji glava-na-rep, se protežu od nukleotidne poziciji 2257 do nukleotidne pozicije 16601. Sekvenca 5'-bočne DNA iz SEQ ID Br. 20 je sekvenca koja se proteže od nukleotidne pozicije 1 do nukleotidne pozicije 1451 iz SEQ ID Br. 20, a sekvenca 3'-bočne DNA iz SEQ ID Br. 20 je sekvenca koja se proteže od nukleotidne pozicije 16639 do nukleotidne pozicije 17806 iz SEQ ID Br. 20.

1.3. Opis strane DNA koja sadrži himerne gene za fosfinotricinacetiltransferazu

[0125]Plazmid pB2/P35SAcK je vektor za kloniranje izveden iz pUC19 koji sadrži himernigen pat.Opis vektora se nalazi u Tabeli 2 ispod. Njegova nukleotidna sekvenca je predstavljana u SEQ ID Br. 11.

1.4. Događaj EE-GM1 (komparativni primer)

1.4.1 Identifikacija događaja EE-GM1

[0126]Soja rezistentna na herbicid je razvijena uz pomoć transformacije soje sa vektorom pB2/P35SAcK primenom direktnog prenosa gena.

[0127]Elitni događaj EE-GM1 je selektiran uz pomoć procedure ekstenzivne selekcije na bazi dobre ekspresije i stabilnosti gena za rezistenciju na herbicid i na bazi kompatibilnosti sa optimalnim agronomskim rezultatima.

1.4.2 Identifikacija bočnih regiona i strane DNA iz elitnog događaja EE-GM1

1.4.2.1. Desni (5') bočni region

[0128]Fragment identifikovan da sadrži 5'-bočni region je sekvenciran, a njegova nukleotidna sekvenca je predstavljena u SEQ ID Br. 12. Sekvenca između nukleotida 1 i 209 odgovara biljnoj DNA, dok sekvenca između nukleotida 210 i 720 odgovara stranoj DNA.

1.4.2.2. Levi (3') bočni region

[0129]Fragment identifikovan da sadrži 3'-bočni region je sekvenciran, a njegova nukleotidna sekvenca je predstavljena u SEQ ID Br. 13. Sekvenca između nukleotida 1 i 568 odgovara stranoj DNA, dok sekvenca između nukleotida 569 i 1000 odgovara biljnoj DNA.

1.4.2.3. Strana DNA koja sadrži gene za toleranciju na herbicid iz događaja EE-GM1

[0130]Uz pomoć različitih molekularnih tehnika je bilo određeno da strana DNA iz elitnog događaja EE-GM1, koja sadrži gen za toleranciju na herbicid, sadrži dve kopije himernog genapat uformi direktno ponovljene strukture (vidi Sliku 3).

[0131]Strana DNA koja sadrži gene za toleranciju na herbicid iz događaja EE-GM1 tako poredane sadrži sledeće sekvence: • od nukleotida 1 do nukleotida 3122: nukleotidna sekvenca koja odgovara nukleotidnoj sekvenci iz SEQ ID Br. 11 od nt 340 do nt 3461; • od nukleotida 3123 do nukleotida 3458: nukleotidna sekvenca koja odgovara komplementu nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 11 od nt 1 do nt 336; • od nukleotida 3459 do nukleotida 4073: nukleotidna sekvenca koja odgovara komplementu nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 11 od nt 3462 do nt 4076; i • od nukleotida 4074 do nukleotida 6780: nukleotidna sekvenca koja odgovara nukleotidnoj sekvenci iz SEQ ID Br. 11 od nt 337 do nt 3043; i • od nukleotida 6781 do nukleotida 6790: nukleotidna sekvenca koja odgovara nukleotidnoj sekvenci iz SEQ ID Br. 13 od nt 559 do nt 568 (ova sekvenca ne odgovara ni plazmidnoj DNA niti biljnoj DNA divljeg-tipa pa je prema označena kaofiller-DNA).

[0132]Ova strana DNA iz događaja EE-GM1 se proteže tik uzvodno i susedno sa stranom DNA na 5'-bočnoj sekvenci iz SEQ ID Br. 12 od nukleotida 1 do 209, a prati ju tik nizvodno i susedno stranoj DNA na 3'-bočnoj sekvenci iz SEQ ID Br. 13 od nukleotida 569 do nukleotida 1000.

1.5. Događaj EE-GM2

[0133]Soja koja je rezistentna na herbicid je razvijena uz pomoć transformacije soje sa vektorom pB2/P35SAcK primenom direktnog prenosa gena.

[0134]Elitni događaj EE-GM2 je selektiran uz pomoć procedure ekstenzivne selekcije na bazi dobre ekspresije i stabilnosti gena za rezistenciju na herbicid i kompatibilnosti sa optimalnim agronomskim razultatima.

1.5.1. Identifikacija bočnih regiona i strane DNA iz elitnog događaja EE-GM2

1.5.1.1. Desni(5')bočni region

[0135]Fragment identifikovan da sadrži 5'-bočni region je sekvenciran, a njegova nukleotidna sekvenca je predstavljena u SEQ ID Br. 14. Sekvenca između nukleotida 1 i 311 odgovara biljnoj DNA, dok sekvenca između nukleotida 312 i 810 odgovara stranoj DNA.

1.5.1.2. Levi(3')bočni region

[0136]Fragment identifikovan da sadrži 3'-bočni region je sekvenciran, a njegova nukleotidna sekvenca je predstavljena u SEQ ID Br. 15. Sekvenca između nukleotida 1 i 507 odgovara stranoj DNA, dok sekvenca između nukleotida 569 i 1880 odgovara biljnoj DNA.

1.5.1.3. Strana DNA koja sadrži gene za toleranciju na herbicid iz događaja EE-GM2

[0137]Uz pomoć raznih molekularnih tehnika je bilo određeno da strana DNA iz elitnog događaja EE-GM2, koja sadrži gen za toleranciju na herbicid, sadrži jednu kopiju himernoggena pat(vidi Sliku 4).

[0138]Strana DNA koja sadrži gene za toleranciju na herbicid iz događaja EE-GM2 tako poredane sadrži sledeće sekvence: • od nukleotida 1 do nukleotida 391: nukleotidna sekvenca koja odgovara nukleotidnoj sekvenci iz SEQ ID Br. 11 od nt 3458 do nt 3848; i • od nukleotida 392 do nukleotida 3436: nukleotidna sekvenca koja odgovara nukleotidnoj sekvenci iz SEQ ID Br. 11 od nt 413 do nt 3457.

[0139]Ova sirana DNA iz događaja EE-GM2 se proleže lik uzvodno i susedno od sirane DNA na 5'-bočnoj sekvenci iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 1 do 311, a praćena je tik nizvodno i susedno sa stranom DNA na 3'-bočnoj sekvenci iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 508 do nukleotida 1880.

2. Razvoj protokola za identifikaciju događaja EE-GM3 uz pomoć lančane reakcije

polimerazom.

2.1. Prajmeri

[0140]Razvijeni su specifični prajmeri koji prepoznaju sekvence unutar elitnog događaja.

[0141]Razvijen je prajmer koji prepoznaje neku sekvencu unutar 3'-bočnog regiona događaja EE-GM3. Tada je izabran drugi prajmer koji prepoznaje sekvencu unutar strane DNA tako da oba prajmera obujme sekvencu oko 263 nukleotida. Sledeći prajmer su proizveli posebno jasan i reproducibilan rezultat PCR reakcije na DNA kapulu sa događajem EE-GM3:

[0142]Prajmeri koji ciljaju endogenu sekvencu su preferirano uključeni u PCR-koktelu. Ovi prajmeri služe kao interna kontrola kod nepoznatih primeraka, ali i kao pozitivna DNA kontrola. Pozitivan rezultat sa endogenim parom prajmera (prisutnost amplifikovanog fragmenta od 413 bp) ukazuje da u preparatu genomske DNA postoji obimna DNA adekvatne kvalitete koji omogućava da se generiše PCR-produkt. Endogeni prajmeri su izabrani tako da prepoznaju endogeni gen za aktin iz soje:

2.2. Amplifikovani fragmenti

[0143]Očekivani fragmenti koji se amplifikuju tokom PCR reakcije su:

2.3. DNA kalup

[0144]DNA kalup je pripremljen iz isečka lista u skladu sa instrukcijama autora Edvvards et al. (Nucleic Acid Research, 19, str. 1349, 1991). Kada se koristi DNA pripremljena uz pomoć drugih postupaka, potrebno je da se podesi količina kalupa uz pomoć provere na različitim količinama. Obično, 50 ng genomske DNA (kalup) daje najbolje rezultate.

2.4. Dodeljene kontrole, pozitivna i negativa

[0145]Sa ciljem da se izbegne pojava lažno pozitivnih ili negativnih primeraka, bilo je zaključeno da se moraju uvesti sledeće kontrole, pozitivna i negativa koje se provode u istom PCR pokušaju:• Master Mixkontrola (negativna DNA kontrola). Ovo je PCR-reakcija u koju se ne dodaje DNA. Postizanje očekivanog rezultata, nema PCR-produkata, ukazuje da PCR-koktel nije bio kontaminiran sa ciljanom DNA. • Pozitivna DNA kontrola (primerak genomske DNA za kojeg se zna da sadrži transgenične sekvence). Uspešna amplifikacija ove pozitivne kontrole ukazuje daje PCR-reakcija provedena u uslovima koji dozvoljavaju amplifikaciju ciljanih sekvenca. • Kontrola sa divljim-tipom DNA. To je PCR-reakcija u kojoj DNA kalup obezbeđuje genomsku DNA koja je pripremljena iz ne-transgenične biljke. Postizanje očekivanog rezultat, nema amplifikacije transgenog PCR-produkta, ali ima amplifikacije endogenog PCR-produkta, ukazuje na ne postoji detektabilna pozadinska amplifikacija transgena u primerku genomske DNA.

2.5. PCRuslovi

[0146] Optimalni rezultati su dobiveni u sledećim uslovima (opisivanje raznih uslova za optimalne rezultate je namenjeno obezbeđivanju prajmera za pomenute uslove. Jasno je da stručnjak može da menja uslove, reagense i parametre poput upotrebne drugih Taq-polimeraza, sa ciljem da se postignu željeni rezultati):

PCR smeša za reakciju od 25 ul sadrži:

profil ciklusa za postizanje optimalnih rezultata je sledeći:

2.6. Analiza na agaroznom gelu

[0147]Sa ciljem optimalne vizualizacije rezultata PCR-a je zaključeno da se u 1.5% agarozni gel (Tris-boratni pufer) treba naneti između 10 i 20 ul PCR-primeraka zajedno sa odgovarajućim markerom molekularne mase (na primer, skala od 100 bp, Pharmacia).

2.7. Potvrđivanje rezultata

[0148]Bilo je zaključeno da podaci iz primeraka sa transgeničnom biljnom DNA iz pojedinačnog PCR testa i pojedinačnog PCR-koktela ne trebaju se uzimati u obzir osim ako 1) pozitivna DNA kontrola proizvede očekivane PCR produkte (transgenične i endogene fragmente), 2) negativna DNA kontrola ne proizvede amplifikovane produkte (nema fragmenata) i 3) kontrola sa divljim-tipom DNA proizvede očekivane rezultate (amplifikacija endogenog fragmenta).

[0149]Kada se provodi protokol za PCR identifikaciju događaja EE-GM3, kao šta je opisano iznad, linije koje sadrže vidljive količine transgeničnih i endogenih PCR-produkata očekivanih veličina, ukazuju na to daje odgovarajuća biljka, iz koje je pripremljen kalup sa genomskom DNA, nasledila elitni događaj EE-GM3. Linije koje ne sadrže vidljive količine transgeničnih PCR-produkata, a sadrže vidljive količine endogenog PCR-produkta, ukazuju na to da odgovarajuća biljka, iz koje je pripremljen kalup sa genomskom DNA, ne sadrži pomenuti elitni događaj. Linije koje ne sadrže vidljive količine ni endogenih niti transgeničnih PCR-produkata, ukazuju na to da kvalitet i/ili količina genomske DNA ne dozvoljava generisanje PCR-produkta. Ove biljke ne mogu da se ocene. Preparat genomske DNA treba da se ponovo pripremi, a iz njega treba da se provede novi PCR test, uz odgovarajuće kontrole.

2.8. Upotreba diskriminiraj ućeg PCR-protokola sa ciljem identifikovan ja događaja ££-GM3

[0150]Pre pokušaja ispitivanja nepoznatih primeraka treba da se pripremi test sa svim odgovarajućim kontrolama. Već razvijeni protokol može da zahteva optimizaciju za komponente koje mogu da se razlikuju između laboratorija (priprema DNA kalupa, Taq DNA polimeraza, kvalitet prajmera, dNTP, aparat za PCR, itd.).

[0151]Amplifikacija endogene sekvence ima ključnu ulogu u ovom protokolu. Potrebno je da se postignu uslovi PCR-reakcije i ciklusa koji dozvoljavaju amplifikovanje ekvimolarnih količina endogene i transgenične sekvence iz poznatog kalupa sa transgeničnom genomskom DNA. Kada god ciljani endogeni fragment nije ampliflkovan ili kada god ciljane sekvence nisu amplifikovane tako da pokazuju podjednake intenzitete bojanja sa etidijum bromidom, na osnovi procene uz pomoć elektroforeze na agaroznom gelu, potrebno je optimizovanje PCR-uslova.

[0152]Lisni materijal iz više biljaka soje, od kojih neke mogu da sadrže EE-GM3, je bio testiran u skladu sa malopre opisanim protokolom. Primerci sa elitnim događajem EE-GM3 i iz biljaka divljeg-tipa su uzeti kao pozitivna i negativna kontrola.

[0153]Slika 2 ilustruje rezultate koji su dobiveni uz pomoć protokola za PCR identifikaciju događaja EE-GM3 u brojnim primercima biljaka soje. Primerci iz linija 2 i 3 su sadržavali elitni događaj EE-GM3 jer je kod njih detektovana vrpca od 263 bp, dok primerci u linijama 4 do 8 nisu sadržavali događaj EE-GM3. Linije 6 i 7 sadrže primerke sa drugim transformacijskim događajima u soji koji su dobiveni uz pomoć istih himernih gena za toleranciju na herbicid; linija 8 sadrži DNA iz biljke soje divljeg-tipa, a linija 9 predstavlja negativnu kontrolu (voda), linije 1 i 10 predstavljaju marker za molekularnu masu (skala od 100 bp).

2.9. dPCR ogled za detektovanje događaja EE-GM3 u hrpi semenskog materijala

[0154]Diskriminirajući PCR (dPCR) ogled je uspostavljen sa ciljem da detektuje niski nivo prisutnosti događaja EE-GM3 u hrpi semenskog materijala. Minimalni nivo od 0.4% (w/w) transgeničnog semenskog materijala u hrpi ne-transgeničnog semenskog materijala je uspešno detektovan pod repoducibilnim uslovima. Prema tome, limit za detektovanje je dogovorno određen na 0.4% (w/w).

[0155]Slcdcći prajmeri su primenjivani za ovu ciljanu PCR-rcakciju:

Fonvard- prajmerkoji cilja T-DNA sekvencu:

SHA130 5' - CTA.TAT.TCT.ggT.TCC.AAT.TTA.TC - 3' (SED ID Br. 12)Revers e- prajmerkoji cilja 3'-bočnu sekvencu:

SMP178 5' - TgA.ggC.ACg.TAT.TgA.TgA.CC - 3' (SEQ ID Br. 13)

Očekivani fragment koji se amplifikuje u PCR-reakciji uz pomoć ovih prajmera je dugačak 115 bp.

[0156]Ciljana PCR-reakcija se provodi na DNA kalupu od približno 200 ng pri čemu je DNA pripremljena iz hrpe smrvljenog semenskog materijala u skladu sa modifikovanim protokolom iz kompleta hemikalijaGentra Puregene DNA purification extraction kit(Qiagen). Kada se koristi DNA koja je pripremljena uz pomoć drugih postupaka, potreban je probni test uz pomoć primeraka sa poznatim relativnim nivoima događaja EE-GM3.

[0157] Provereni referentni sistem za PCR-reakciju, koji cilja neku endogenu sekvencu, idealno bi se trebao izvoditi u odvojenom PCR-pokušaju sa ciljem da se verifikuje prikladnost DNA primerka za PCR analizu kako bi se izbegli lažni negativni rezultati.

[0158] Za testiranje nepoznatih primeraka u PCR eksperiment idealno treba da se uključe odgovarajući primerci sa pozitivnom i negativom kontrolom, tj.:• Master Mixkontrola (negativna DNA kontrola). Ovo je PCR-reakcija u kojoj se ne dodaje DNA. Postizanje očekivanog rezultata (nema PCR-produkta) za ciljani i referentni sistem ukazuje da PCR-koktel nije bio kontaminiran sa ciljanom DNA. • Pozitivna DNA kontrola (primerak sa genomskom DNA za kojeg se zna da sadrži transgenične sekvence). Uspešna amplifikacija ove pozitivne kontrole pokazuje daje PCR-reakcija provedena u uslovima koji dozvoljavaju amplifikaciju ciljanih sekvenca. • Takođe, u ovaj PCR pokušaj može da se uvede kontrola sa divljim-tipom DNA. To je PCR-reakcija u kojoj DNA kalup sadrži genomsku DNA koja je pripremljena iz neke ne-transgenične biljke. Ostvarivanje očekivanog rezultata, nema amplifikacije ciljanog PCR-produkta, ali ima amplifikacije endogenog PCR-produkta, ukazuje na to da ne postoji detektabilna pozadinska transgena amplifikacija u primerku sa genomskom

DNA.

[0159] Optimalni rezultati mogu da se dobiju uz pomoć sledećih uslova:

PCR-smcša za reakciju od 25 ul sadrži:

profil ciklusa za postizanje optimalnih rezultata je kako sledi:

[0160] Za optimalnu vizualizaciju rezultata PCR-reakcije je određeno da 25ul PCR-produkta treba da se nanese u 1.5% agarozni gel (Tris-boratni pufer) zajedno sa odgovarajućim markerom za molekularnu masu (na primer, skala od 50 bp).

[0161] Kada se provodi PCR-postupak kao šta je opisano iznad, linije koje sadrže vidljive količine ciljanih i referentnih PCR-produkata očekivanih veličina, ukazuju da testirani primerak, iz kojeg je pripremljena genomska DNA za kalup, sadrži nivoe elitnog događaja EE-GM3 (u ciljanoj reakciji) koji su veći od limita za detektovanje.

[0162] Linije koje ne sadrže vidljive količine ciljanih PCR-produkata, ali sadrže vidljive količine referentnog PCR-produkta, pokazuju da testirani primerak, iz kojeg je pripremljena genomska DNA za kalup, sadrži nivoe elitnog događaja EE-GM3 (u ciljanoj reakciji) koji su manji od limita za detektovanje.

[0163] Linije koje ne sadrže vidljive količine endogenog i transgeničnog PCR-produkta, pokazuju da kvalitet i/ili količina genomske DNA ne dozvoljava generisanje PCR-produkta.

[0164]Ove biljke ne mogu da se ocene. Priprema genomske DNA treba da se ponovo provede, a tada treba da se izvede novi PCR pokušaj uz odgovarajuće kontrole.

3. Upotreba specifičnog integracionog fragment kao proba za detektovanje materijala

koji sadrži događaj EE-GM3.

[0165]Upotrebom specifičnih prajmera SOY028 (SEQ ID Br. 4) i SOY029 (SEQ ID Br. 5) dobij a se specifični integracioni fragment sa događajem EE-GM3 uz pomoć PCR-amplifikacije koja proizvodi amplikon sa nukleotidnom sekvencom iz SEQ ID Br. 8, ili uz pomoć hemijske sinteze, nakon čega se fragment označava. Ovaj integracioni fragment se koristi kao specifična proba za detektovanje događaja EE-GM3 u biološkim primercima. Nukleinska kiselina je izoluje iz primeraka primenom standardnih procedura. Ova nukleinska kiselina se tada kontaktira sa specifičnom probom u uslovima hibridizacije koji su optimizovani i omogućavaju formiranje hibrida. Tada se detektuje pojava hibrida koje ukazuje na prisutnost nukleinske kiseline događaja EE-GM3 u primerku. Opciono, nukleinska kiselina u primercima se amplifikuje uz pomoć specifičnih prajmera pre kontaktiranja sa specifičnom probom. Alternativno, nukleinska kiselina se označava pre kontaktiranja sa specifičnom probom (umesto integracioni fragment). Opciono, specifična proba se spaja na čvrsti nosilac (poput, ali bez ograničenja, filtera, trake ili kuglica) pre kontaktiranja primeraka.

4. Protokol za PCR identifikaciju događaja EE-GM1 (komparativni primer).

4.1. Prajmeri

[0166]Razvijeni su specifični prajmeri koji prepoznaju sekvence unutar pomenutog elitnog događaja. Još preciznije, razvijen je prajmer koji prepoznaje neku sekvencu unutar 5'-bočnog regiona događaja EE-GM1. Tada je pronađen drugi prajmer, koji prepoznaje sekvencu strane DNA, tako da pomenuti prajmeri obujmljuju sekvencu od oko 183 nukleotida. Sledeći prajmeri omogućavaju dobijanje posebno jasnog i reproducibilnog rezultata u PCR-reakciji koja koristi DNA događaja EE-GM1 kao kalup:

[0167]Prajmeri koji ciljaju neku endogenu sekvencu preferirano se dodaju u PCR-koktel. Ovi prajmeri služe kao interna kontrola kod nepoznatih primeraka i kao pozitivna DNA kontrola. Pozitivan rezultat sa endogenim parom prajmera pokazuje da u preparatu genomske DNA postoji obimna količina DNA sa adekvatnim kvalitetom koje dozvoljava da se generiše PCR-produkt. Endogeni prajmeri su izabrani tako da prepoznaju nekihousekeeping- genuGlycine

max:

4.2. Amplifikovani fragmenti

[0168]U ovoj PCR-reakciji očekivana reakcija je amplifikacija sledećih fragmenata:

4.3. DNA za kalup

[0169]DNA za kalup je pripremljena iz isečka lista u skladu sa instrukcijama autora Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, str. 1349, 1991). Kada se koristi DNA koja je pripremljena uz pomoć drugih postupaka, potrebno je provođenje probnog testa sa različitim količinama kalupa. Obično, najbolji rezultati se postižu sa 50 ng genomske DNA za kalup.

4.4. Dodeljene kontrole, pozitivna i negativa

[0170]Sa ciljem da se izbegnu lažni pozitivni ili negativni rezultati u PCR-pokušaj je potrebno da se uključe pozitivne i negativne kontrole:• Master Mixkontrola (negativna DNA kontrola). To je PCR-reakcija u koju nije dodana DNA. Ostvarivanje očekivanog rezultata, nema PCR-produkata, pokazuje da PCR-koktel nije bio kontaminiran sa ciljnom DNA. • Pozitivna DNA kontrola (primerak sa genomskom DNA za kojeg se zna da ne sadrži transgenične sekvence). Uspešna amplifikacija ove pozitivne kontrole pokazuje daje PCR-reakcija provedena u uslovima koji dozvoljavaju amplifikaciju ciljanih sekvenca. • Kontrola sa divljim-tipom DNA. To je PCR-reakcija u kojoj DNA za kalup je genomska DNA koja je pripremljena iz ne-transgenične biljke. Ostvarivanje očekivanog rezultata, nema amplifikacije ciljanog PCR-produkta, ali ima amplifikacije endogenog PCR-produkta, pokazuje da u genomskoj DNA primerka ne postoji detektabilna transgena pozadina za amplifikaciju.

4.5. PCR uslovi

[0171]Optimalni rezultati su ostvareni u sledećim uslovima:

PCR-smeša za reakciju od 25 ul sadrži:

profil ciklusa koji je potreban za optimalni rezultat je sledeći:

4.6. Analiza na agaroznom gelu

[0172]Sa ciljem optimalnog vizualiziranja rezultata PCR-reakcije potrebno je da se u 1.5% agarozni gel (Tris-boratni pufer) nanese između 10 i 20 ul PCR-primeraka uz odgovarajući marker za molekularnu masu (na primer, skala od 100 bp, Pharmacia).

4.7. Potvrđivanje rezultata

[0173]Dogovoreno je da podaci za primerke DNA od transgenične biljke iz pojedinačnog PCR-pokušaja i pojedinačnog PCR-koktela nisu prihvatljivi osim ako 1) pozitivna DNA kontrola proizvede očekivane PCR-produkte (transgenični i endogeni fragmenti), 2) negativna DNA kontrola ostane negativna amplifikacija (nema fragmenata) i 3) kontrola sa divljim-tipom DNA proizvede očekivani rezultat (amplifikacija endogenog fragmenta).

[0174]Kada se primenjuje protokol za PCR identifikaciju događaja EE-GM1 kao šta je opisano iznad, linije koje sadrže vidljive količine transgeničnog i endogenog PCR-produkta očekivanih veličina ukazuju daje odgovarajuća biljka, iz koje je pripremljena genomska DNA koja služi kao kalup, nasledila elitni događaj EE-GM1. Linije koje ne sadrže vidljive količine transgeničnih PCR-produkata, a pokazuju vidljive količine endogenog PCR-produkta, pokazuju da odgovarajuća biljka, iz koje je pripremljena genomska DNA koja služi kao kalup, ne sadrži pomenuti elitni događaj. Linije koje ne sadrže vidljive količine endogenog i transgeničnih PCR-produkata, pokazuju da kvalitet i/ili količina genomske DNA ne dozvoljava generisanje PCR-produkta. Ove biljke ne mogu da budu ocenjene. Preparat sa genomskom DNA treba da se ponovo pripremi, a nakon toga treba da se provede novi PCR-pokušaj zajedno sa odgovarajućim kontrolama.

4.8. Upotreba diskriminirajućeg PCR-protokola za identifikovanje događaja EE-GM1

(komparativni primer)

[0175]Pre ispitivanja nepoznatih primeraka potrebno je da se provede probni test sa svim odgovarajućim kontrolama. Razvijeni protokol može da zahteva optimizovanje šta se tiče komponenata koji se razlikuju između laboratorija (priprema DNA kalupa, Taq DNA polimeraza, kvalitet prajmera, dNTP, aparat za PCR, itd.).

[0176]Amplifikacija endogene sekvence ima ključnu ulogu u ovom protokolu. Potrebno je da se postignu uslovi PCR-reakcije i profil ciklusa koji omogućavaju amplifikaciju ekvimolarnih količina endogene i transgenične sekvence na poznatom kalupu transgenične genomske DNA. Kada god se ciljani endogeni fragment ne amplifikuje ili kada god se ciljane sekvence ne amplifikuju sa podjednakim intenzitetima bojanja sa etidijum bromidom, na osnovu procene elektroforeze na agaroznom gelu, potrebno je optimizovanje PCR-uslova.

[0177]Lisni materijal vrsteGlycine max(soja) iz većeg broja biljaka, od kojih neke sadrže događaj EE-GM1, je bio testiran u skladu sa malopre opisanim protokolom. Primerci sa elitnim događajem EE-GM1 i divljeg-tipaGlycine maxsu korišćeni kao pozitivna i negativa kontrola.

[0178]Slika 5 ilustruje rezultate koji su dobiveni uz pomoć protokola za PCR identifikaciju elitnog događaja EE-GM1 na brojnim primercima soje (linije 1 do 14). Primerci iz linije 1 su sadržavali elitni događaj u formi vrpce od 185, dok primerci u linijama 2, 3 i 4 nisu sadržavali događaj EE-GM1. Linija 2 je sadržavala drugi elitni događaj u soju, linija 3 predstavlja kontrolu sa ne-transgeničnomGlycine max\linija 4 predstavlja negativnu kontrolu (voda), a linija 5 predstavlja marker za molekularnu masu (100 bp).

5. Upotreba specifičnog integracionog fragmenta kao proba za detektovanje materijala

koji sadrži događaj EE-GM1 (komparativni primer).

[0179]Specifični integracioni fragment za događaj EE-GM1 je dobiven uz pomoć PCR-amplifrkacije primenom specifičnih prajmera SOY06 (SEQ ID Br. 16) i SOY07 (SEQ ID Br.

17), ili uz pomoć hemijske sinteze, pa je označen. Ovaj integracioni fragment se koristi kao specifična proba za detektovanje događaja EE-GM1 u biološkim primercima. Nukleinska kiselina je izolovana iz primeraka primenom standardnih procedura. Ova nukleinska kiselina je tada kontaktirana sa specifičnom probom u uslovima hibridizacije koji su bili optimizovani da omoguće formiranje hibrida. Tada je detektovano formiranje hibrida koje ukazuje na prisutnost nukleinske kiseline događaja EE-GM1 u primerku. Opciono, nukleinska kiselina u primercima je amplifikovana uz pomoć specifičnih prajmera pre kontakta sa specifičnom probom. Alternativno, nukleinska kiselina je označena pre kontakta sa specifičnom probom (umesto integracioni fragment). Opciono, specifična proba je spojena na čvrsti nosilac (poput, ali bez ograničenja, filtera, trake ili kuglica) pre kontakta sa primercima.

6. Protokol za PCR identifikaciju događaja EE-GM2.

6.1. Prajmeri

[0180]Razvijeni su specifični prajmeri koji prepoznaju sekvence unutar pomenutog elitnog događaja. Još specifičnije, razvijen je prajmer koji prepoznaje sekvencu unutar 3'-bočnog regiona događaja EE-GM2. Tada je odabran drugi prajmer koji prepoznaje sekvencu unutar strane DNA tako da pomenuti prajmeri obujmljuju sekvencu od oko 150 nukleotida. Sledeći prajmeri daju posebno jasan i reproducibilan rezultat na DNA-kalupu događaja EE-GM2 u PCR-reakciji:

[0181]Prajmeri koji ciljaju neku endogenu sekvencu su preferirano uključeni u PCR-koktelu. Ovi prajmeri služe kao interna kontrola kod nepoznatih primeraka i kao pozitivna DNA kontrola. Pozitivni rezultat sa endogenim parom prajmera pokazuje da u preparatu genomske DNA postoji obimna DNA adekvatnog kvaliteta koje dozvoljava generisanje PCR-produkta. Endogeni prajmeri su izabrani tako da prepoznaju nekihousekeeping- genizGlycine max:

6.2. Amplifikovani fragmenti

[0182]Očekivani fragmenti koji su amplifikovani u ovoj PCR-reakciji su:

6.3. DNA kalup

[0183]DNA kalup je pripremljen iz isečka lista prema instrukcijama autora Eđvvards et al.

(Nucleic Acid Research, 19, pl349, 1991). Kada se koristi DNA koja je pripremljena uz pomoć drugih postupaka, potrebno je provođenje probnog testa sa različitim količinama kalupa. Obično najbolji rezultati se dobijaju sa 50 ng genomske DNA za kalup.

6.4. Dodeljene kontrole, pozitivna i negativa

[0184]Sa ciljem da se izbegnu lažni pozitivni ili negativni rezultati, u PCR-pokušaju je potrebno da se uključe i sledeće pozitivne i negativne kontrole:• Master Mixkontrola (negativna DNA kontrola). Ovo je PCR-reakcija u kojoj se ne dodaje DNA. Ostvarivanje očekivanog rezultata, nema PCR-produkata, označava da PCR-koktel nije bio kontaminiran sa ciljnom DNA. • Pozitivna DNA kontrola (primerak sa genomskom DNA za kojeg se zna da sadrži transgenične sekvence). Uspešna amplifikacija ove pozitivne kontrole ukazuje da je PCR-reakcija provedena u uslovima koji dozvoljavaju amplifikaciju ciljanih sekvenca. • Kontrola divljeg-tipa DNA. Ovo je PCR-reakcija u kojoj DNA kalup je preparat sa genomskom DNA iz ne-transgenične biljke. Ostvarivanje očekivanog rezultata, nema amplifikacije transgenog PCR-produkta, ali ima amplifikacije endogenog PCR-produkta, ukazuje na to da ne postoji detektabilna transgena pozadinska amplifikacija u primerku genomske DNA.

6.5. PCR uslovi

[0185]Optimalni rezultati su dobiveni u sledećim uslovima:

PCR-smeša za reakcije od 25 ul sadrži:

profil ciklusa koji dovode do optimalnih rezultata je sledeći:

6.6. Analiza na agaroznom gelu

[0186]Za optimalnu vizualizaciju rezultata PCR-reakcije potrebno je da se u 1.5% agarozni gel nanese između 10 i 20 ul PCR-primeraka (Tris-boratni pufer) zajedno sa odgovarajućim markerom za molekularnu masu (na primer, skala od 100 bp, Pharmacia).

6.7. Potvrđivanje rezultata

[0187]Bilo je određeno da su podaci iz primeraka sa transgeničnom biljnom DNA iz pojedinačnog PCR-pokušaja i pojedinačnog PCR-koktela prihvatljivi ako 1) pozitivna DNA kontrola proizvede očekivane PCR produkte (transgenični i endogeni fragment), 2) negativna DNA negative ostaje negativna za PCR-amplifikaciju (nema fragmenata) i 3) kontrola divljeg-tipa DNA proizvede očekivane rezultate (amplifikacija endogenog fragmenta).

[0188]Kada se provodi protokol za PCR identifikaciju događaja EE-GM2 kao šta je opisano iznad, linije koje sadrže vidljive količine transgeničnih i endogenih PCR-produkata očekivanih veličina ukazuju daje odgovarajuća biljka, iz koje je pripremljena genomska DNA za kalup, nasledila elitni događaj EE-GM2. Linije koje ne sadrže vidljive količine transgeničnih PCR-produkata, a sadrže vidljive količine endogenog PCR-produkta, pokazuju da odgovarajuća biljka, iz koje je pripremljena genomska DNA za kalup, ne sadrži pomenuti elitni događaj. Linije koje ne sadrže vidljive količine endogenog i transgeničnih PCR-produkata, pokazuju da kvalitet i/ili količina genomske DNA ne dozvoljava generisanje PCR-produkta. Ove biljke ne mogu da budu ocenjene. Preparat sa genomskom DNA treba da se ponovo pripremi, a PCR-pokušaj treba da se ponovi zajedno sa odgovarajućim kontrolama.

6.8. Upotreba diskriminirajućeg PCR-protokola za identifikovanje događaja EE-GM2

[0189]Pre ispitivanja nepoznatih primeraka potrebno je da se provede probni test uz sve odgovarajuće kontrole. Razvijen protokol može da zahteva optimizovanje šta se tiče komponenata koje se razlikuju između laboratorija (priprema DNA kalupa, Taq DNA polimeraza, kvalitet prajmera, dNTP, aparat za PCR, itd.).

[0190]Amplifikacija endogene sekvence ima ključnu ulogu u ovom protokolu. Potrebno je da se ostvare uslovi za PCR-reakciju i profil ciklusa koji amplifikuju ekvimolarne količine endogene i transgenične sekvence na poznatom kalupu transgenične genomske DNA. Kada god ciljani endogeni fragment nije amplifikovan ili kada god ciljane sekvence nisu amplifikovane u količinama koje pokazuju iste intenzitete bojanja u etidijum bromidu, na osnovu elektroforeze u agaroznom gelu, potrebno je optimizovanje PCR-uslova.

[0191]Materijal iz lista više biljakaGlycine max,od kojih neke sadrži događaj EE-GM2, je bio testiran u skladu sa malopre opisanim protokolom. Primerci sa elitnim događajem EE-GM2 i sa divljim-tipomGlycine maxsu korišćeni kao pozitivna i negativna kontrola.

[0192]Slika 6 ilustruje rezultate koji su dobiveni uz pomoć protokola za PCR identifikaciju elitnog događaja EE-GM2 iz više biljnih primeraka soje (linije 1 do 14). Primerci u liniji 1 su sadržavali elitni događaj jer je detektovana vrpca od 185 bp, dok primerci u linijama 2, 3 i 4 nisu sadržavali događaj EE-GM2. Linija 2 sadrži drugi elitni događaj u soji, a linija 3 predstavlja kontrolu sa ne-transgeničnomGlycine max;linija 4 predstavlja negativnu kontrolu (primerak sa vodom), a linija 5 sadrži marker za molekularnu masu (100 bp).

7. Upotreba specifičnog integracionog fragmenta kao proba za detektovanje materijala

koji sadrži događaj EE-GM2.

[0193]Specifični integracioni fragment sa događajem EE-GM2 je dobiven uz pomoć PCR-amplifikacije uz korišćenje specifičnih prajmera SOY09 (SEQ ID Br. 18) SOY010 (SEQ ID Br. 19), ili uz pomoć hemijske sinteze, a tada je označen. Ovaj integracioni fragment je korišćen kao specifična proba za detektovanje događaja EE-GM2 u biološkim primercima. Nukleinska kiselina je izolovana iz primeraka primenom standardnih procedura.

[0194]Ova nukleinska kiselina je tada kontaktirana sa specifičnom probom u uslovima hibridizacije koji su optimizovani da se omogući formiranje hibrida. Tada je detektovano formiranje hibrida koje ukazuje na prisutnost nukleinske kiseline (u primerku) koja sadrži događaj EE-GM2. Opciono, nukleinska kiselina iz primeraka je amplifikovana uz pomoć specifičnih prajmera pre kontakta sa specifičnom probom. Alternativno, nukleinska kiselina je označena pre kontakta sa specifičnom probom (umesto integracioni fragment). Opciono, specifična proba je spojena na čvrsti nosilac (poput, ali bez ograničenja, filtera, trake ili kuglica), pre kontakta sa pomenutim primercima.

8. Proizvodnja biljaka soje koje sadrže događaje EE-GM3 i EE-GM1 (komparativni

primer) ili događaje EE-GM3 i EE-GM2 i procena agronomskih rezultata takvih

biljaka soje.

[0195]Biljka soje koja sadrži kombinaciju elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM1 je dobivena uz pomoć konvencionalnog ukrštanja između parentne biljke soje, koja sadrži EE-GM3, i parentne biljke soje, koja sadrži EE-GM1. Potomstvo biljaka koje sadrže oba događaja je identifikovano uz pomoć protokola za PCR identifikaciju događaja EE-GM1 i EE-GM3, kao šta je ovde već objašnjeno. Specifično, ukrštanja su provedena sa biljkama koje sadrže događaj EE-GM3 i sa nekoliko linija koje sadrže događaj EE-GM1. Dobivene Fl-biljke su uzgajane i poprskane sa glifosatom i glufosinatom. F2-semenski materijal je sakupljen iz Fl-biljaka pa je posejan (F2-biljke nisu poprskane). Sakupljene su pojedinačne F2-biljke. Uzgajane su F2:F3-biljke u redovima pa su poprskane sa glifosatom i glufosinatom. Identifikovani su redovi homozigota za oba događaja, EE-GM3 i EE-GM1, pa su biljke sakupljene. Podaci segregacije iz ovoga terenskog ispitivanja su pokazali očekivanu Mendel-ovu segregaciju pomenutih događaja.

[0196] Biljke soje koje su sadržavale kombinaciju elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM2 su dobiveni uz pomoć konvencionalnog ukrštanja između parentne biljke soje, koja sadrži EE-GM3, i parentne biljke soje, koja sadrži EE-GM2. Potomstvo biljaka koje sadrže oba događaja je identifikovanu uz pomoć protokola za PCR identifikaciju događaja EE-GM2 i EE-GM3 kao šta je već objašnjeno. Specifično, ukrštanja su provedena sa biljkama koje sadrže događaj EE-GM3 i biljkama koje sadrže događaj EE-GM2. Nastale Fl-biljke su ukrštene sa 4 konvencionalne linije. Fl-biljke iz ovih ukrštanja su uzgojene u polju, pa su poprskane sa glifosatom i glufosinatom. F2 semenski materijal je sakupljen sa Fl-biljaka koje su bile rezistentne na oba herbicida pa je posejan. F2-biljke su poprskane sa glifosatom i glufosinatom. Devetsto biljaka koje je bilo tolerantno na oba herbicida je sakupljeno i uzgojeno u polju. Uz pomoć ovog ispitivanja je pokazano da oba događaja segregiraju Mendel-ovski. Približno 40 linija homozigotnih za gene za toleranciju na oba herbicida je selektirano na agronomsku uniformnost za daljnje ispitivanje. Ove linije su pokazivale dobru toleranciju na oba herbicida uz dobre agronomske rezultate.

[0197] Ispitivanja na oglednim poljima sa biljkama soje koje sadrže kombinovane događaje u različitim tipovima komercijalne germplazme su provedena na više lokacija, pri čemu su procenjeni brojni agronomski parametri biljaka, uključujući biljka visinu, visinu do čvora, uspravan rast, energiju klijanja, prinos semenskog materijala, i nivoe tolerancije na glifosat, izoksaflutol i glufosinat.9. Introgresija događaja EE-GM3 i EE-GM1 (komparativni primer) ili događaja EE-GM2 u preferirane kultivare.

[0198]Elitni događaj EE-GM3 i elitni događaj EE-GM1 ili EE-GM2 su uvedeni, uz pomoć ponovljenog povratnog ukrštanja, u komercijalne kultivare soje kao što je, ali bez ograničenja, Kultivar soje 7631014 (US2009252860); Kultivar soje 7431014 (US2009252859); Kultivar soje 7925084 (US2009252858); Kultivar soje 7311153 (US2009252857); Kultivar soje S070159 (US2009252856); Kultivar soje 7535357 (US2009246353); Kultivar soje S070160 (US2009246352); Kultivar soje 26074414 (US2009249508); Kultivar soje 7509171 (US2009249507); Kultivar soje S070158 (US2009246351); Kultivar soje 7511119 (US2009249506); Kultivar soje 7113111 (US2009238945); Kultivar soje S06-02RM018047

(US7592518); Kultivar soje 7013345 (US2009232957); Kultivar soje 7041461 (US2009235376); Kultivar soje 7549450 (US2009232956); Kultivar soje 7317090 (US2009232955); Kultivar soje 2N2V58015 (US2009226597); Kultivar soje 7243182 (US2009226596); Kultivar soje 7143182 (US2009226595); Kultivar soje 7043182 (US2009220673); Kultivar soje S070157 (US2009222950); Kultivar soje 306924721 (US2009220672); Kultivar soje 7614385 (US2009220671); Kultivar soje 7925118 (US2009214750); Kultivar soje 7821295 (US2009214749); Kultivar soje 7811336 (US2009214748); Kultivar soje S070150 (US2009214747); Kultivar soje 6214260 (US2009214746); Kultivar soje S070152 (US2009214745); Kultivar soje 7429331 (US2009214751); Kultivar soje 26034631 (US2009208634); Kultivar soje S07-03JR108674 (US7560621); Kultivar soje S07-03KL016279 (US7560620); Kultivar soje S06-CL959411 (US7554017); KULTIVAR SOJE SG3870NRR (US2009158453); KULTIVAR SOJE HFPR-G (CA2645702); Kultivar soje S06-02JR423016 (US7521606); Kultivar soje S06-01JR119814 (US7518039); Kultivar soje S06-01JR119448 (US7518038); Kultivar soje 6540220 (US2009055960); Kultivar soje S060292 (US2009055959); Kultivar soje S050228 (US2009055958); Kultivar soje S06-02JR423003 (US7491873); Kultivar soje S06-02JR423005 (US7491872); Kultivar soje S06-02JR409114 (US7485782); Kultivar soje S06-SJ144056 (US7473823); Kultivar soje (US7470835); Kultivar soje 6910450 (US2008282369); KULTIVAR SOJE 6223012 (US7446246); KULTIVAR SOJE 6549250 (US7446245); Kultivar soje 17731225 (US2008271204); Kultivar soje 6928285 (US2008271203); Kultivar soje 6736054 (US2008271169); Kultivar soje S060299 (US2008271199); Kultivar soje S060294 (US2008271202); Kultivar soje 6943322 (US2008271201); Kultivar soje 5343260 (US2008263719); Kultivar soje 6439359 (US2008263704); Kultivar soje 6238359 (US2008263703); Kultivar soje 6547272 (US2008263702); Kultivar soje 6929431 (US2008263701); Kultivar soje 6703392 (US2008263700); Kultivar soje 6044483 (US2008263699); Kultivar soje S050224 (US2008263698); Kultivar soje 6719022 (US2008263697); Kultivar soje 5826056 (US2008263696); Kultivar soje 6265047 (US2008263724); Kultivar soje 6928331 (US2008263695); Kultivar soje 6719331 (US2008263694); Kultivar soje 6636454 (US2008263693); Kultivar soje 6226454 (US2008263718); Kultivar soje Q0073801 (US2008256657); KULTIVAR SOJE 6326393 (US2008256652); KULTIVAR SOJE 6408448 (US2008256651); Kultivar soje 6449315 (US2008250524); Kultivar soje S060296 (US2008250523); Kultivar soje 6012078 (US2008250522); Kultivar soje 6342078 (US2008250521); Kultivar soje 6419156 (US2008250520); Kultivar soje 5723264 (US2008250519); Kultivar soje S050225

(US2008250518); Kultivar soje S060298 (US2008244783); Kultivar soje 6935331 (US2008244782); Kultivar soje 6819456 (US2008244787); Kultivar soje S060297 (US2008244781); Kultivar soje 6135319 (US2008244786); Kultivar soje 6819331 (US2008244780); Kultivar soje 6137445 (US2008244779); Kultivar soje 6917445 (US2008244778); Kultivar soje 6111333 (US2008244777); Kultivar soje S050229 (US2008244776); Kultivar soje 6114011 (US2008244775); Kultivar soje 6900358 (US2008244784); Kultivar soje 6345184 (US2008244774); Kultivar soje 6836085 (US2008244773); Kultivar soje 6635047 (US2008244772); Kultivar soje 6139105 (US2008244771); KULTIVAR SOJE 6434385 (US2008244770); KULTIVAR SOJE S060295 (US2008244769); Kultivar soje 6035184 (US2008244768); Kultivar soje S060293 (US2008209590); Kultivar soje 6733322 (US2008209594); KULTIVAR SOJE 6421326 (US2008209593); Kultivar soje S060077 (US2008209589); KULTIVAR SOJE 6600375 (US2008209592); Kultivar soje S06-CL821457 (US7420104); Kultivar soje S07-02KG294306 (US7414178); Kultivar soje S06-BA046119 (US7414175); Kultivar soje S07-02KG294307 (US7411114); Kultivar soje SG3865N (US2008189802); Kultivar soje 6701475 (US7408097); Kultivar soje 1335025 (US2008178316); Kultivar soje 1686017 (US2008178315); Kultivar soje 2388028 (US2008178314); Kultivar soje 2387029 (US2008178313); Kultivar soje S06-WW152330 (US7388129); Kultivar soje 6424090 (US7385118); Kultivar soje 6723322 (US7385115); Kultivar soje SG4377NRR (US7385114); Kultivar soje S06-02JR111334 (US7381864); Kultivar soje 6141287 (US7378577); Kultivar soje MT110501 (US7378576); Kultivar soje (US7378575); Kultivar soje S06-WW169267 (US7375261); Kultivar soje 6223392 (US7371939); Kultivar soje S06-CL968413 (US7371937); Kultivar soje S06-CL951107 (US7368636); Kultivar soje S06-MT9152077 (US7361810); Kultivar soje 4211676 (US2008092253); Kultivar soje S06-M059029 (US7355101); Kultivar soje 6548193 (US7345228); Kultivar soje 6440261 (US7345227); Kultivar soje S060291 (US7342151); Kultivar soje S06-MT9206166 (US7339094); Kultivar soje S06-WW013107 (US7339093); Kultivar soje S06-M03256 (US7335820); Kultivar soje 6134466 (US7332656); Kultivar soje S06-01JR123373 (US7329800); Kultivar soje S06-MT9211059 (US7326831); Kultivar soje 26170838 (US2008016590); Kultivar soje 306612412 (US2008016588); Kultivar soje 26660135 (US2008016587); Kultivar soje 306734323 (US2008016586); Kultivar soje S06-01JR122235 (US7317144); KULTIVAR SOJE 5900450 (US7314986); Kultivar soje S06-MT116260 (US7314984); Kultivar soje S06-SJ143606 (US7312381); Kultivar soje S06-98181-G01-35167 (US7309819); KULTIVAR SOJE 26082635 (US7304219); Kultivar soje BA922834 (US7304217); Kultivar soje 01JR123480 (US7304216); Kultivar soje M061422 (US7304215); Kultivar soje 17082821 (US2007277262); Kultivar soje 17621620 (US2007277261); Kultivar soje 00977706 (US2007277260); Kultivar soje S060182 (US2007277259); Kultivar soje 26312034 (US7301078); Kultivar soje 26143837 (US7301077); Kultivar soje 435.TCS (US2007271626); Kultivar soje 495.RC (US2007271625); Kultivar soje 5306230 (US7297845); Kultivar soje S06-WW167686 (US7291772); Kultivar soje 6141145 (US2007245426); Kultivar soje S050232 (US2007226829); Kultivar soje 5333301 (US2007226828); KULTIVAR SOJE S050215 (US2007226827); KULTIVAR SOJE 3235020 (US2007226826); Kultivar soje 5720482 (US2007226825); Kultivar soje S050216 (US2007226824); Kultivar soje 5512112 (US2007226823); Kultivar soje 3233021 (US2007226822); KULTIVAR SOJE 1336024 (US2007226821); Kultivar soje 5348287 (US2007226820); Kultivar soje 5204220 (US2007226819); Kultivar soje 6188027 (US2007226818); Kultivar soje 4183026 (US2007226817); Kultivar soje S06-WW157958 (US7271325); Kultivar soje 5733056 (US2007209091); Kultivar soje 90501911 (US2007209090); Kultivar soje S050221 (US2007204361); KULTIVAR SOJE 5802205 (US2007204360); Kultivar soje 1000642 (US2007204359); Kultivar soje 5420128 (US2007204358); Kultivar soje S050222 (US2007199094); Kultivar soje S050217 (US2007199093); KULTIVAR SOJE S050223 (US2007199092); Kultivar soje S050218 (US2007199091); Kultivar soje 5419227 (US2007199089); Kultivar soje 5319227 (US2007199088); Kultivar soje 5723045 (US2007199087); KULTIVAR SOJE 5051007 (US2007199086); Kultivar soje 5826175 (US2007192893); Kultivar soje S050231 (US2007192892); KULTIVAR SOJE 5826376 (US2007192891); KULTIVAR SOJE 5628386 (US2007192890); Kultivar soje 5138236 (US2007186307); Kultivar soje 5608398 (US2007186306); KULTIVAR SOJE S050230 (US2007186305); KULTIVAR SOJE 5624126 (US2007180561); KULTIVAR SOJE 5019225 (US2007180560); KULTIVAR SOJE 5549483 (US2007180559); KULTIVAR SOJE 4189010 (US2007180551); KULTIVAR SOJE 1486018 (US2007180550); KULTIVAR SOJE S050235 (US2007180549); KULTIVAR SOJE 5023230 (US2007180548); KULTIVAR SOJE S050238 (US2007174930); KULTIVAR SOJE 5830261 (US2007174928); KULTIVAR SOJE S050226 (US7247772); KULTIVAR SOJE 5806063 (US7247771); KULTIVAR SOJE S050233 (US7244881); KULTIVAR SOJE 5726085 (US7241939); Kultivar soje MT000792 (US7238867); Kultivar soje 5521161 (US7235718); Kultivar soje WW109447 (US7235717); Kultivar soje BA947474 (US7220898); Kultivar soje 5939002 (US7217870); Kultivar soje 5726175 (US7217869); Kultivar soje 5432082 (US7217868); Kultivar soje SG0850RR (US7211715); Kultivar soje SG1750NRR

(US7208658); Kultivar soje MT017827 (US7208657); Kultivar soje 4N2V74028 (US7205458); Kultivar soje CL431203 (US7202400); Kultivar soje 4N0S63222 (US7199288); Kultivar soje 5520279 (US7196253); Kultivar soje 5834401 (US7196252); Kultivar soje 5621161 (US7196251); Kultivar soje CL722114 (US7196250); Kultivar soje 5741081 (US7193140); Kultivar soje CL727422 (US7186895); Kultivar soje 4N2V55022 (US7183468); Kultivar soje 5083011 (US7173169); Kultivar soje 5626085 (US7169976); KULTIVAR SOJE S050051 (US7169974); KULTIVAR SOJE 4506816 (US2006294626); Kultivar soje WW152201 (US7132594); Kultivar soje CL727636 (US7132593); Kultivar soje M08851 (US7126047); Kultivar soje 4324401 (US7105728); Kultivar soje S050164 (US7105727); Kultivar soje 4136015 (US2006195931); Kultivar soje 3133014 (US2006195930); Kultivar soje S040132 (US2006195929); Kultivar soje 4328386 (US2006195928); Kultivar soje 1339013 (US2006195927); KULTIVAR SOJE 4423183 (US2006195925); Kultivar soje S040131 (US2006195924); Kultivar soje 4929388 (US2006195923); Kultivar soje 4817034 (US2006195922); Kultivar soje 4916816 (US7098385); Kultivar soje 4713487 (US2006191032); Kultivar soje 4348019 (US2006191031); Kultivar soje S040122 (US2006191030); Kultivar soje S040133 (US2006185031); Kultivar soje CL821418 (US7091404); KULTIVAR SOJE 4441080 (US7091403); Kultivar soje 4805442 (US2006179509); Kultivar soje 4921237 (US2006179508); Kultivar soje 4417380 (US2006174369); Kultivar soje 4405070 (US2006174368); Kultivar soje 4417779 (US7084328); Kultivar soje S040125 (US2006168678); Kultivar soje 4909380 (US7081572); Kultivar soje S050162 (US7081571); Kultivar soje 6084016 (US7081570); Kultivar soje S050163 (US7078600); Kultivar soje S040135 (US7078598); Kultivar soje S040117 (US7078597); Kultivar soje M03393 (US7071391); Kultivar soje 4145306 (US7064253); Kultivar soje 900213 (US2006117405); Kultivar soje 1000126 (US2006117404); Kultivar soje 901023 (US2006117403); Kultivar soje S040130 (US7053280); Kultivar soje 4706198 (US7053279); Kultivar soje S040118 (US7053278); Kultivar soje S040119 (US7053277); Kultivar soje S040123 (US7053276); Kultivar soje 4442112 (US7049497); KULTIVAR SOJE 917013 (US7045689); Kultivar soje S040124 (US7045691); Kultivar soje 4238491 (US7045690); Kultivar soje S010136 (US7041882); Kultivar soje 900613 (US7030297); Kultivar soje 4337175 (US7030301); Kultivar soje S040121 (US7030300); Kultivar soje 4216033 (US7030299); Kultivar soje S040128 (US7022901); Kultivar soje S040120 (US7022900); Kultivar soje S040127 (US7019199); Kultivar soje S040134 (US7015378); Kultivar soje S040129 (US7015377); Kultivar soje 4513420 (US7005564); Kultivar soje 943013 (US2006031958); Kultivar soje

S030136 (US2006021081); Kultivar soje 927013 (US2006021080); Kultivar soje 1000109 (US2006015962); Kultivar soje 90046112 (US2006010530); Kultivar soje 90897327 (US2006010529); Kultivar soje 90362421 (US2006010528); Kultivar soje 03022253 (US2006010527); Kultivar soje 02022433 (US2006010526); Kultivar soje 02022323 (US2006010525); Kultivar soje 02912951 (US2006010524); Kultivar soje 0102115 (US2006010523); Kultivar soje 915034 (US2006010522); Kultivar soje 0509255 (US2006010521); Kultivar soje 4803070 (US6982368); Kultivar soje 4704310 (US6979762); Kultivar soje SJ919784 (US2005268362); Kultivar soje CL615261 (US2005268361); Novel sovbean (US2004199964); Kultivar soje 0509214 (US2005210542); Kultivar soje 70826751 (US2005193442); Kultivar soje 0509243 (US2005193441); Kultivar soje 0509246 (US2005193440); Kultivar soje 0509253 (US2005193439); Kultivar soje 0509247 (US2005193438); Kultivar soje 0509252 (US2005193437); Kultivar soje 0509241 (US2005193436); Kultivar soje 0509249 (US6884927); Kultivar soje 0509244 (US2005183158); Kultivar soje 0509240 (US2005183157); Kultivar soje 0509239 (US2005183156); Kultivar soje 0509254 (US2005183155); Kultivar soje 0509245 (US2005183154); Kultivar soje 0509251 (US2005183153); Kultivar soje 4283008 (US6888050); Kultivar soje 2386009 (US2005183152); Kultivar soje 3282002 (US6870080); Kultivar soje 0509248 (US2005183151); Kultivar soje 5091007 (US6906249 (); Kultivar soje 0509236 (US2005166281); Kultivar soje 0509235 (US2005166280); Kultivar soje 0509237 (US2005166279); Kultivar soje SG5322NRR (US2005164390); Kultivar soje SG5030NRR (US2005166278); Kultivar soje SG4911NRR (US2005166277); Kultivar soje S030153 (US2005160504); Kultivar soje S030158 (US2005144680); KULTIVAR SOJE S030160 (US2005144679); Kultivar soje S030161 (US2005144678); Kultivar soje S030157 (US2005144677); Kultivar soje S030155 (US2005144676); Kultivar soje S030156 (US2005144675); KULTIVAR SOJE S030159 (US2005144674); Kultivar soje S030154 (US6900376); Kultivar soje S020030 (US2005114929); Kultivar soje S030010 (US2005114928); Kultivar soje SG1431RR (US2005097629); KULTIVAR SOJE SG1330NRR (US2005097642); Kultivar soje S030150 (US2005071900); KULTIVAR SOJE S022209 (US2005050601); Kultivar soje S022217 (US2005050600); Kultivar soje S022219 (US2005050599); Kultivar soje S030151 (US2005050598); Kultivar soje 0491735 (US2005022272); Kultivar soje S022218 (US2005022271); Kultivar soje 6190006 (US2004268447); Kultivar soje SG1120RR (US2004250316); Kultivar soje 0487681 (US2004237153); Kultivar soje 0491717 (US2004237152); Kultivar soje SO22220 (US2004237151); Kultivar soje 0491715 (US2004237150); Kultivar soje 0491712

(US2004237149); Kultivar soje 0491718 (US2004237148); Kultivar soje 99271316 (US2004221344); Kultivar soje S022212 (US2004221343); Kultivar soje 0491737 (US2004221342); Kultivar soje S022211 (US2004221341); Kultivar soje SO22210 (US2004221340); Kultivar soje S022213 (US2004221339); Kultivar soje 0491725 (US2004221346); Kultivar soje 03129016 (US2004221329); Kultivar soje SO22208 (US2004221328); Kultivar soje SO22207 (US2004221345); Kultivar soje 02932 (US2004210968); Kultivar soje 94137321 (US2004205862); Kultivar soje 94106224 (US2004205861); Kultivar soje 94143901 (US2004205859); KULTIVAR SOJE 0487685 (US2004205858); KULTIVAR SOJE 92440927 (US2004205857); Kultivar soje 0487686 (US2004205856); Kultivar soje S022215 (US2004205855); Kultivar soje S022214 (US2004205854); KULTIVAR SOJE 0491726 (US2004205849); KULTIVAR SOJE 92478609 (US2004205853); Kultivar soje 922013 (US6781040); KULTIVAR SOJE 0491727 (US2004205852); KULTIVAR SOJE 0491728 (US2004205851); Kultivar soje 1465003 (US2004098766); Kultivar soje 3186004 (US2004019936); Kultivar soje 7085005 (US2004205850); Kultivar soje SO22204 (US2004199958); Kultivar soje SO22206 (US2004199957); Kultivar soje 0491731 (US2004199956); Kultivar soje 0491733 (US2004199955); Kultivar soje 0491738 (US2004199954); Kultivar soje 0491732 (US2004199953); Kultivar soje 0491729 (US2004199952); Kultivar soje SO20011 (US2004199951); Kultivar soje 0491739 (US2004199950); Kultivar soje 0491730 (US2004199949); Kultivar soje 13873 (US2004199948); Kultivar soje 954011 (US2004181822); Kultivar soje 010022 (US2004181831); Kultivar soje 4181001 (US2003229926); Kultivar soje 0491721 (US2004168228); Kultivar soje 0491723 (US6911581 (); Kultivar soje 0491716 (US2004168226); Kultivar soje 0491713 (US2004168225); Kultivar soje 0491711 (US2004168224); Kultivar soje 0491722 (US2004168223); Kultivar soje 0491724 (US2004168222); Kultivar soje 0491720 (US2004168221); Kultivar soje 0487682 (US2004168220); Kultivar soje 0491714 (US2004168219); Kultivar soje 0491719 (US2004168218); Kultivar soje DP 5634 RR (US2003177540); Kultivar soje S56-D7 (US2004098765); Kultivar soje 926877 (US2004064859); Kultivar soje SE73753 (US2004055059); Kultivar soje SN83594 (US2004055058); Kultivar soje SE71112 (US2004055056); Kultivar soje SE73090 (US2004055054); Kultivar soje SN79526 (US2004055053); Kultivar soje SW90702 (US2004055052); Kultivar soje SN79525 (US2004055051); Kultivar soje SE90345 (US2004055050); Kultivar soje 0149928 (US2004055049); Kultivar soje SN83780 (US2004055048); Kultivar soje 0053840 (US2004055047); Kultivar soje 924001

(US2004055046); Kultivar soje 0004747 (US2004055057); Kultivar soje 0037357 (US2004055045); Kultivar soje SN83366 (US2004055044); Kultivar soje SN76208 (US2004055043); Kultivar soje 0037370 (US2004055042); Kultivar soje SX95512 (US2004049821); Kultivar soje 0096008 (US2004049820); Kultivar soje SN83544 (US2004049819); Kultivar soje 0088401 (US2004049818); Kultivar soje SN64195 (US2004049817); Kultivar soje 0034754 (US2004049816); Kultivar soje SN71173 (US2004049815); Kultivar soje SN83211 (US2004049814); Kultivar soje 92422749 (US2004045058); Kultivar soje 0120311 (US2004045057); Kultivar soje S010344 (US2004003438); Kultivar soje 70876922 (US2004003437); Kultivar soje 924496 (US2004003436); Kultivar soje 19705120 (US2003237116); Kultivar soje 19704220 (US2003235914); Kultivar soje 19704280 (US2003237115); Kultivar soje 19704210 (US2003237114); Kultivar soje S37-N4 (US2003237113); Kultivar soje 19602310 (US2003233685); Kultivar soje 19704120 (US2003233684); Kultivar soje 19704230 (US2003233683); Kultivar soje 1000126 (US2003233682); Kultivar soje 93831526 (US2003221226); Kultivar soje 0322581 (US2003221225); Kultivar soje 0332149 (US2003213028); Kultivar soje 0332144 (US2003213027); Kultivar soje 924788 (US2003213026); Kultivar soje 924861 (US2003213025); Kultivar soje 928070 (US2003213024); Kultivar soje S010354 (US2003213023); Kultivar soje S010360 (US2003213022); Kultivar soje S010361 (US2003213021); Kultivar soje S010363 (US2003213020); Kultivar soje S010364 (US2003213019); Kultivar soje 0332148 (US2003208805); Kultivar soje 0332147 (US2003208804); Kultivar soje 0332146 (US2003208803); Kultivar soje 0332135 (US2003208802); Kultivar soje 1000144 (US2003208801); Kultivar soje 0332143 (US2003208800); Kultivar soje 0332145 (US2003208799); Kultivar soje S010345 (US2003204884); Kultivar soje 0332131 (US2003204883); Kultivar soje 0332130 (US2003204882); Kultivar soje 0332129 (US2003204881); Kultivar soje 0332122 (US2003204880); Kultivar soje S010350 (US2003204879); Kultivar soje S010355 (US2003204878); Kultivar soje 031766 (US2003204877); Kultivar soje S010353 (US2003204876); Kultivar soje 0322580 (US2003200579); Kultivar soje 0322579 (US2003200578); Kultivar soje S010347 (US2003200577); Kultivar soje S010349 (US2003200576); Kultivar soje 0332141 (US2003200575); Kultivar soje 0332142 (US2003200574); Kultivar soje 0332133 (US2003200573); Kultivar soje 0332134 (US2003200572); Kultivar soje 0332139 (US2003200571); Kultivar soje 0332137 (US2003200570); Sorta soje XB33U08 (US7598435); Sorta soje XB27D08 (US7592519); Sorta soje XB41M08 (US7589261); Sorta soje XB05J08 (US7589260); Sorta soje XB33T08 (US7589259); Sorta soje XB30Y08 (US7586025); Sorta soje XB40U08 (US7582813); Sorta soje XB29M08 (US7582811); SORTA SOJE 93Y10 (US2009144843); SORTA SOJE D4325666 (US2009055957); SORTA SOJE D4125897 (US2009055956); SORTA SOJE D4698573 (US2009055955); SORTA SOJE D4356652 (US2009019592); SORTA SOJE D4456885 (US2009019591); SORTA SOJE D4698013 (US2009019590); SORTA SOJE D4637114 (US2009019589); SORTA SOJE D4102367 (US2009019595); SORTA SOJE D4266582 (US2009019594); SORTA SOJE D4422801 (US2009019593); SORTA SOJE D4520980 (US2009019588); SORTA SOJE D4521369 (US2009019587); SORTA SOJE D4223057 (US2009019586); SORTA SOJE D4682156 (US2009019585); SORTA SOJE D4233569 (US2009019584); SORTA SOJE D4925614 (US2009019583); SORTA SOJE D4203144 (US2009019604); SORTA SOJE D4102536 (US2009019582); SORTA SOJE D4865324 (US2009019581); SORTA SOJE D4825495 (US2009019580); SORTA SOJE D4659251 (US2009019579); SORTA SOJE D4258962 (US2009019578); SORTA SOJE D4253969 (US2009019577); SORTA SOJE D4696658 (US2009019603); SORTA SOJE D4256925 (US2009019576); SORTA SOJE D4253681 (US2009019575); SORTA SOJE D4789254 (US2009019574); SORTA SOJE D4713125 (US2009019573); SORTA SOJE D4526223 (US2009019572); SORTA SOJE D4556201 (US2009019571); SORTA SOJE D4012368 (US2009019570); SORTA SOJE D4452019 (US2009019569); SORTA SOJE D4201483 (US2009019568); SORTA SOJE D4463892 (US2009019567); SORTA SOJE D4159630 (US2009019566); SORTA SOJE D4470236 (US2009019565); SORTA SOJE D4063284 (US2009019564); SORTA SOJE D4021792 (US2009013429); SORTA SOJE D4902530 (US2009013428); SORTA SOJE D4367012 (US2009013427); SORTA SOJE D4923560 (US2009013426); SORTA SOJE D4253854 (US2009013425); SORTA SOJE D4210110 (US2009007290); SORTA SOJE D4523081 (US2009007289); SORTA SOJE D4328762 (US2009007288); SORTA SOJE D4483789 (US2009007287); SORTA SOJE D4311702 (US2009007286); SORTA SOJE D4127789 (US2008313765); SORTA SOJE D4361423 (US2008313764); SORTA SOJE D4208814 (US2008313763); SORTA SOJE D4201139 (US2008313762); SORTA SOJE D4120384 (US2008313761); SORTA SOJE D4572906 (US2008313760); SORTA SOJE D4301279 (US2008313759); SORTA SOJE D4422957 (US2008313758); SORTA SOJE D4256958 (US2008313757); SORTA SOJE 4074328 (US2008282366); SORTA SOJE XB47Q06 (US2008244767); SORTA SOJE XB26R06 (US2008244766); SORTA SOJE 4991629 (US2008216190); SORTA SOJE 4158090 (US2008216189); Sorta soje XB40K07 (US2008209582); SORTA SOJE D0069201 (US2008178345); SORTA SOJE

D0064801 (US2008178320); SORTA SOJE D0063801 (US2008178344); SORTA SOJE D0061501 (US2008178343); SORTA SOJE 4938051 (US2008178319); SORTA SOJE 4880500 (US2008178318); SORTA SOJE 4835953 (US2008178317); SORTA SOJE 4684181 (US2008178342); SORTA SOJE 4427363 (US2008178340); SORTA SOJE 4676311 (US2008178339); SORTA SOJE 4953710 (US2008178337); SORTA SOJE 4857548 (US2008178336); SORTA SOJE 4551757 (US2008178335); SORTA SOJE 4027271 (US2008178334); SORTA SOJE 4274171 (US2008178333); SORTA SOJE 0341931 (US2008178332); SORTA SOJE 4282159 (US2008178331); SORTA SOJE 4852004 (US2008178330); SORTA SOJE 4688589 (US2008178329); SORTA SOJE 4614131 (US2008178327); SORTA SOJE 4201823 (US2008178326); SORTA SOJE 92M22 (US2008178350); SORTA SOJE 4174206 (US2008178322); SORTA SOJE 4305498 (US2008178321); SORTA SOJE 4423586 (US2008172761); SORTA SOJE 4568207 (US2008172756); SORTA SOJE 4840308 (US2008172755); SORTA SOJE 4256323 (US2008172754); SORTA SOJE 4789516 (US7399907); SORTA SOJE 90Y40 (US2008168581); SORTA SOJE 4959932 (US7396983); SORTA SOJE 4062885 (US7394000); Sorta soje 4858197 (US7390940); Sorta soje 4092390 (US7390939); Sorta soje 4735486 (US7390938); Sorta soje 4219527 (US7388132); Sorta soje 4599695 (US7388131); Sorta soje 4554257 (US7388130); Sorta soje 4896902 (US7385113); Sorta soje 4367308 (US7385112); Sorta soje 4589609 (US7385111); Sorta soje 4640250 (US7385110); Sorta soje 4540394 (US7385109); Sorta soje 4297661 (US7385108); Sorta soje 4958786 (US7381866); Sorta soje 4440685 (US7375262); Sorta soje 4008211 (US7371938); Sorta soje 4778469 (US7368637); Sorta soje 4766295 (US7355103); Sorta soje 4436909 (US7355102); Sorta soje 4812469 (US7351886); Sorta soje 4761767 (US7351885); Sorta soje 4142393 (US7329801); Sorta soje 4502135 (US7326832); Sorta soje 4353363 (US7321082); Sorta soje 91B42 (US7317143); SORTA SOJE 0330739 (US2007271622); Sorta soje 0384279 (US7294768); SORTA SOJE 4175567 (US2007256187); SORTA SOJE 4336643 (US2007256186); SORTA SOJE 4671685 (US2007256185); SORTA SOJE 4309194 (US2007256190); SORTA SOJE 0330738 (US2007256184); SORTA SOJE 0045477 (US2007256183); SORTA SOJE 0437973 (US2007256182); SORTA SOJE 0457028 (US2007256181); SORTA SOJE 0367478 (US2007256180); SORTA SOJE 0358232 (US2007256179); SORTA SOJE 0417158 (US2007256178); SORTA SOJE 4559809 (US2007256177); SORTA SOJE 0196172 (US2007256176); SORTA SOJE 4785923 (US2007256175); SORTA SOJE 4587513 (US2007256174); SORTA SOJE 0409670 (US2007256173); SORTA SOJE 4010165

(US2007256172); SORTA SOJE 0421133 (US2007256171); SORTA SOJE 0240187 (US2007256170); SORTA SOJE 0387907 (US2007256169); SORTA SOJE 0232405 (US2007256168); SORTA SOJE 0146529 (US2007256167); SORTA SOJE 4788561 (US2007256166); SORTA SOJE 457114 (US2007256165); SORTA SOJE 0149217 (US2007256164); SORTA SOJE 4247825 (US2007254366); SORTA SOJE 0212938 (US2007256163); SORTA SOJE 0146565 (US2007256162); SORTA SOJE 4647672 (US2007256161); SORTA SOJE 0215818 (US2007256160); SORTA SOJE 0384531 (US2007256159); SORTA SOJE 4878185 (US2007254365); SORTA SOJE 4498438 (US2007256158); SORTA SOJE 0436052 (US2007256157); SORTA SOJE 4782157 (US2007256156); SORTA SOJE 0385457 (US2007256155); SORTA SOJE 0385240 (US2007256154); SORTA SOJE 4735316 (US2007256153); SORTA SOJE 0277524 (US2007256152); SORTA SOJE 0276951 (US2007256151); Sorta soje XB37L07 (US2007245429); Sorta soje XB35X07 (US2007226837); Sorta soje XB35S07 (US2007226836); Sorta soje XB35F07 (US2007226835); Sorta soje XB34R07 (US2007226834); Sorta soje XB34L07 (US2007226833); Sorta soje XB34D07 (US2007226832); Sorta soje XB33G07 (US2007226831); Sorta soje 98Y11 (US2007169220); Sorta soje 0137335 (US7241941); Sorta soje XB15E07 (US2007150980); Sorta soje 92M52 (US2007150979); Sorta soje XB47R07 (US2007136888); Sorta soje XB46V07 (US2007136887); Sorta soje XB57E07 (US2007136886); Sorta soje XB54X07 (US2007136885); Sorta soje XB54V07 (US2007136884); Sorta soje XB52Q07 (US2007136883); Sorta soje XB37M07 (US2007136882); Sorta soje XB37J07 (US2007136881); Sorta soje XB34Q07 (US2007136880); Sorta soje XB32S07 (US2007136879); Sorta soje XB32J07 (US2007136878); Sorta soje XB31R07 (US2007136877); Sorta soje XB31J07 (US2007136876); Sorta soje XB29K07 (US2007136875); Sorta soje XB31H07 (US2007136874); Sorta soje XB30G07 (US2007136873); Sorta soje XB30E07 (US2007136872); Sorta soje XB25E07 (US2007136871); Sorta soje XB26X07 (US2007136870); Sorta soje XB23L07 (US2007136869); Sorta soje XB19Z07 (US2007136868); Sorta soje XB19E07 (US2007136867); Sorta soje XB18M07 (US2007136866); Sorta soje XB18K07 (US2007136865); Sorta soje XB18J07 (US2007136864); Sorta soje XB17W07 (US2007136863); Sorta soje XB17U07 (US2007136862); Sorta soje XB15B07 (US2007136861); Sorta soje XB12R07 (US2007136860); Sorta soje XB11J07 (US2007136859); Sorta soje XB04E07 (US2007136858); Sorta soje XB02K07 (US2007136857); Sorta soje XB49V07 (US2007136856); Sorta soje XB48X07

(US2007136855); Sorta soje 92M75 (US2007136854); Sorta soje XB48W07 (US2007136853); Sorta soje XB44G07 (US2007136852); Sorta soje XB42K07 (US2007136851); Sorta soje XB42H07 (US2007136850); Sorta soje XB41J07 (US2007136849); Sorta soje XB40Y07 (US2007136848); Sorta soje XB40X07 (US2007136847); Sorta soje XB39E07 (US2007136846); Sorta soje XB38W07 (US2007136845); Sorta soje XB38S07 (US2007136844); Sorta soje XB23V07 (US2007136843); Sorta soje XB31M07 (US2007130652); Sorta soje XB28E07 (US2007130651); Sorta soje XB25S07 (US2007130650); Sorta soje XB21N07 (US2007130649); Sorta soje XB03Q07 (US2007130648); Sorta soje XB49Q07 (US2007130647); Sorta soje XB06M07 (US2007130646); Sorta soje S04-97130-15-02 (US7196249); Sorta soje S04-97026-N99-42648-01 (US7189896); Sorta soje S05-97016-G99-21212 (US7186894); Sorta soje S05-99048-19 (US7164064); Sorta soje 92B14 (US7161065); Sorta soje 98R31 (US2007006350); Sorta soje S05-97177-N00-22972 (US7132592); Sorta soje XB25G06 (US2006225160); Sorta soje 91M70 (US2006174381); Sorta soje XB24R06 (US2006162029); Sorta soje S03-95368-N98-52902 (US7078594); Sorta soje S05-97130-51 (US7078599); Sorta soje XB11L06 (US2006130187); Sorta soje 94B13 (US7064251); Sorta soje 94B74 (US7064250); Sorta soje XB27J06 (US2006112462); Sorta soje XB29N06 (US2006112460); Sorta soje XB28T06 (US2006112459); Sorta soje XB16W06 (US2006112458); Sorta soje XB18C06 (US2006112456); Sorta soje XB 10M06 (US2006107391); Sorta soje XB06K06 (US2006107390); Sorta soje XB28V06 (US2006107389); Sorta soje XB004A06 (US2006107388); Sorta soje XB12L06 (US2006107387); Sorta soje XB005A06 (US2006107386); Sorta soje XB25H06 (US2006107385); Sorta soje XB39W06 (US2006107384); Sorta soje XB27K06 (US2006107383); Sorta soje XB29R06 (US2006107382); Sorta soje XB16S06 (US2006107381); Sorta soje XB36V06 (US2006107380); Sorta soje XB07N06 (US2006107379); Sorta soje XB23H06 (US2006107378); Sorta soje XB35C06 (US2006107377); Sorta soje XB32L06 (US2006107376); Sorta soje XB58P06 (US2006107375); Sorta soje XB36M06 (US2006107374); Sorta soje XB22G06 (US2006107373); Sorta soje XB36Q06 (US2006107372); Sorta soje 91M61 (US2006107371); Sorta soje XB32A06 (US2006107370); Sorta soje XB19V06 (US2006107369); Sorta soje XB43C06 (US2006107368); Sorta soje XB22N06 (US2006107367); Sorta soje XB38E06 (US2006107366); Sorta soje XB37U06 (US2006107365); Sorta soje XB37Q06 (US2006107364); Sorta soje XB00D06 (US2006107363); Sorta soje XB14N06 (US2006107362); Sorta soje XB31H06

(US2006107361); Sorta soje XB21Z06 (US2006107360); Sorta soje XB005B06 (US2006107359); Sorta soje XB15W06 (US2006107358); Sorta soje XB33N06 (US2006107357); Sorta soje XB18W06 (US2006107356); Sorta soje XB32M06 (US2006107355); Sorta soje XB19F06 (US2006107354); Sorta soje S03-95021-55-138-AB (US7026531); Sorta soje 94M41 (US7002061); Sorta soje 91M50 (US6998518); Sorta soje 92B13 (US6989475); Sorta soje 93B68 (US6989474); Sorta soje 93B09 (US6979759); Sorta soje 92M00 (US6972352); Sorta soje XB08P05 (US2005120433); Sorta soje XB26V05 (US2005150023); Sorta soje XB21R05 (US2005108795); Sorta soje XB28E05 (US2005114942); Sorta soje XB58K05 (US2005114941); Sorta soje XB27B05 (US2005114940); Sorta soje XB21S05 (US2005150022); Sorta soje XB26U05 (US2005138695); Sorta soje XB35K05 (US2005150021); Sorta soje XB18S05 (US2005120436); Sorta soje XB25C05 (US2005120435); Sorta soje 90M01 (US2005120434); Sorta soje XB22H05 (US2005150020); Sorta soje XB22K05 (US2005114939); Sorta soje XB58G05 (US2005114938); Sorta soje XB57U05 (US2005120432); Sorta soje XB49M05 (US2005120431); Sorta soje XB20D05 (US2005144683); Sorta soje XB41B05 (US2005150019); Sorta soje XB38T05 (US2005120430); Sorta soje XB13T05 (US2005120429); Sorta soje XB19Y05 (US2005120428); Sorta soje XB43D05 (US2005120427); Sorta soje XB40E05 (US2005120426); Sorta soje XB39N05 (US2005120425); Sorta soje 93M01 (US2005120424); SORTA SOJE XB31W05 (US2005223439); Sorta soje XB32C05 (US2005114937); Sorta soje XB40D05 (US2005120423); Sorta soje 92M61 (US2005120422); Sorta soje 91M91 (US2005114936); Sorta soje XB33Y05 (US2005120421); Sorta soje XB34A05 (US2005120420); Sorta soje XB13U05 (US2005114935); Sorta soje XB12K05 (US2005114934); Sorta soje XB30P05 (US2005120419); Sorta soje XB57T05 (US2005114933); Sorta soje XB17S05 (US2005114932); Sorta soje XB25Y05 (US2005114930); Sorta soje XB25S05 (US2005150017); Sorta soje XB43W04 (US2004177420); Sorta soje XB44W04 (US2004177419); Sorta soje XB53J04 (US2004199960); Sorta soje XB43V04 (US2004216192); Sorta soje XB49K04 (US2004172668); Sorta soje XB27P04 (US2004205864); Sorta soje XB29L04 (US2004177418); Sorta soje XB29K04 (US2004177417); Sorta soje XB41U04 (US2004231017); Sorta soje XB34D04 (US2004177416); Sorta soje XB09J04 (US2004172711); Sorta soje XB32Y04 (US2004194169); Sorta soje XB44D04 (US2004172710); Sorta soje XB44C04 (US2004172709); Sorta soje XB10L04 (US2004172708); Sorta soje XB19U04

(US2004172707); Sorta soje XB02F04 (US2004172706); Sorta soje XB25X04 (US2004172705); Sorta soje XB26L04 (US2004172704); Sorta soje XB11F04 (US2004172703); Sorta soje XB40Z04 (US2004177415); Sorta soje XB40Y04 (US2004181833); Sorta soje XB007C04 (US2004181832); Sorta soje 96M20 (US2004172702); Sorta soje XB39J04 (US2004172701); Sorta soje XB29A04 (US2004172700); Sorta soje XB35P04 (US2004172699); Sorta soje XB58Z04 (US2004177414); Sorta soje XB43R04 (US2004172698); Sorta soje XB35L04 (US2004172697); Sorta soje XB06H04 (US2004172696); Sorta soje XB59U04 (US2004172695); Sorta soje XB64C04 (US2004172694); Sorta soje 95M80 (US2004172693); Sorta soje XB35Q04 (US2004177413); Sorta soje XB04D04 (US2004177412); Sorta soje XB08L04 (US2004177411); Sorta soje XB18Q04 (US2004177410); Sorta soje XB16Q04 (US2004177409); Sorta soje XB55K04 (US2004172692); Sorta soje XB57M04 (US2004172691); Sorta soje XB25L04 (US2004205863); Sorta soje XB48T04 (US2004194168); Sorta soje XB42X04 (US2004199959); Sorta soje XB31T04 (US2004177408); Sorta soje XB31U04 (US2004194167); Sorta soje XB30E04 (US2004177407); Sorta soje XB31R04 (US2004177406); Sorta soje S03-95341-A98-60618 (US6909033); Sorta soje SN97-6946 (US2004168227); Sorta soje 94M70 (US6864408); Sorta soje 92M70 (US6797866); Sorta soje 92M71 (US6858782); Sorta soje 91M40 (US6828490); Sorta soje 93M80 (US6849789); Sorta soje XB39N03 (US6864407); Sorta soje 93M90 (US6846975); Sorta soje 90M90 (US6852913); Sorta soje 92M72 (US6960708); Sorta soje 91M90 (US6849788); Sorta soje 92M50 (US6855876); Sorta soje 92M30 (US6951974); Sorta soje 93M60 (US6797865); Sorta soje 93M40 (US6791016); Sorta soje 93M41 (US6835875); Sorta soje XB15P03 (US6797864); Sorta soje XB24H03 (US6936752); Sorta soje XB05A03 (US6815585); Sorta soje 92M80 (US6849787); Sorta soje XB33S03 (US6855875); Sorta soje XB48P03 (US6797863); Sorta soje XB29X03 (US6806406); Sorta soje XB02C03 (US6800795); Sorta soje XB29W03 (US6858781); Sorta soje 91M10 (US6958437); Sorta soje 92M10 (US6916975); Sorta soje XB10G03 (US6806405); Sorta soje 92M31 (US6846974); Sorta soje XB38D03 (US6806404); Sorta soje XB34N03 (US6803508); Sorta soje XB30W03 (US6809236); Sorta soje XB37J03 (US6844488); Sorta soje SE72581 (US2004148665); Sorta soje SE90076 (US2004148664); Sorta soje SD82997 (US2004148663); Sorta soje 0037393 (US2004148662); Sorta soje 0088414 (US2004148661); Sorta soje 0149926 (US2004148660); Sorta soje 0037209 (US2004148659); Sorta soje 93B36 (US6833498); Sorta soje 90B74 (US6812384); Sorta soje 90B51 (US6818809); Sorta soje 91B03

(US6815584); Sorta soje 95B43 (US6818808); Sorta soje 95B42 (US6815583); Sorta soje 92B47 (US6812383); Sorta soje SE90346 (US2004055055); Sorta soje 0007583 (US2004010824); Sorta soje 0008079 (US2004010823); Sorta soje S02-AP98041-2-333-01 (US2003121076); Sorta soje S02-98041-2-251-01 (US2003182694); Sorta soje S02-AP98041-2-262-02 (US2003196220); Sorta soje S02-95021-55-240-BA (US2003188348); Sorta soje APA94-31572 (US2003061641); Sorta soje AP98041-1-203 (US2003056251); Sorta soje APA95-15294 (US2003061640); Sorta soje AP98041-4-117 (US2003056250); Sorta soje 91B33 (US6580018); Sorta soje 93B85 (US6605762); Sorta soje 92B76 (US6610911); Sorta soje 92B38 (US6605761); Sorta soje 94B24 (US6613967); Sorta soje 94B73 (US6605760); Sorta soje 93B86 (US6610910); Sorta soje 91B12 (US6583343); Sorta soje 95B34 (US6605759); Sorta soje 94B23 (US6605758); Sorta soje 90B11 (US6583342); Sorta soje 91B92 (US6586659); Sorta soje 95B96 (US6605757); Sorta soje 93B72 (US6566589); Sorta soje 95B97 (US6613966); Sorta soje 92B95 (US6608243); Sorta soje 93B47 (US6583341); Sorta soje 97B52 (US6605756); Sorta soje 93B15 (US6617499); Sorta soje 94B54 (US6613965); Sorta soje 93B67 (US6573433); Sorta soje 93B87 (US6727410); Sorta soje 96B51 (US6613964); Sorta soje 92B84 (US6730829); Sorta soje 92B12 (US6605755); Sorta soje 90A07 (US6320105); Sorta soje 93B26 (US6342659); Sorta soje 96B21 (US6369301); Sorta soje 92B63 (US6326529); Sorta soje 93B46 (US6323402); Sorta soje 92B75 (US6362400); Sorta soje 93B08 (US6323401); Sorta soje 97B62 (US6323400); Sorta soje 92B37 (US6323399); Sorta soje 92B56 (US6339186); Sorta soje 93B66 (US6307131); Sorta soje 92B62 (US6346657); Sorta soje 92B36 (US6369300); Sorta soje 90B73 (US6316700); Sorta soje 95B95 (US6323398); Sorta soje 93B65 (US6229074); Sorta soje 92B24 (US6284950); Sorta soje 94B53 (US6235976); Sorta soje 94B22 (US6140557); Sorta soje 93B84 (US6143956); Sorta soje 95B32 (US6229073); Sorta soje 95B53 (US6147283); Sorta soje 93B35 (US6153816); Sorta soje 93B07 (US6143955); Sorta soje 92B74 (US6124526); Sorta soje 92B35 (US6166296); Sorta soje 94B45 (US6162968); Sorta soje 96B01 (US6143954); Sorta soje 93B53 (US6335197).

[0199]Primećeno je da introgresija elitnih događaja u ove kultivare ne utiče značajno na bilo koju poželjnu fenotipsku ili agronomsku karakteristiku pomenutih kultivara (nema umanjenje prinosa) dok istovremeno ekspresija pomenutog transgena, kao šta je određeno uz pomoć tolerancije na glifosat i/ili izoksaflutol ili glufosinat, zadovoljava komercijalno dopuštene nivoe.

[0200] Nakupine pomenutih događaja mogu da se dodatno kombinuju sa jednim ili više drugih događaja u soji koji su dostupni na tržištu, uključujući, ali bez ograničenja, druge događaje za toleranciju na herbicid, poput događaja opisanih u USDA-APHIS peticijama: 09-349-0lp, 09-201-Olp,09-183-01p,09-082-01p, 09-015-01p, 06-354-01p, 06-271-01p, 06-178-01p, 98-238-Olp, 98-014-01p, 97-008-01p, 96-068-01p, 95-335-01p, 93-258-01p, (vidi, na primer, ww\ v. aphis. usda. gov/ brs/ not reg. htr. nl) ili događaj MON89788 (tolerancija na glifosat) koji je opisan u dokumentu US 2006-282915, događaj DP-305423-1 (visoki nivo oleinske kiseline/tolerancija na inhibitor ALS) koji je opisan u dokumentu WO 2008/054747, događaj MON87701 koji je opisan u dokumentu US2009130071, događaj 3560.4.3.5 koji je opisan u dokumentu US2009036308, ili događaj DP-305423-1 koji je opisan u dokumentu US2008312082, ili događaj BPS-CV127-9 (Događaj 127) iz dokumenta WO 2010/080829.

[0201] Kao šta se koristi u zahtevima ispod, osim ako je drugačije navedeno, termin "biljka" ima za namenu da obuhvata biljna tkiva, u bilo kojoj fazi zrelosti, kao i bilo koje ćelije, tkiva, ili organe uzete iz ili izvedene iz bilo koje takve biljke, uključujući, ali bez ograničenja, bilo koji semenski materijal, listove, stabljike, cvetove, korenje, pojedinačne ćelije, gamete, ćelijske kulture, tkivne kulture ili protoplaste.

[0202] Referentni semenski materijal koji sadrži elitni događaj EE-GM3 je deponovan kao 32-RRMM-0531 u NCIMB (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Škotska) 12. oktobra 2009., pod pristupnim brojem NCIMB 41659, a njegova vijabilnost je potvrđena. Alternativna oznaka za događaj EE-GM3 je FG-072, ili MST-FG072-3.

[0203] Referentni semenski materijal koji sadrži elitni događaj EE-GM1 je deponovan kao 32RRMM0368 u NCIMB (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Škotska) 12. oktobra 2009., pod pristupnim brojem NCIMB 41658. Alternativa oznaka za događaj EE-GM1 je LL27, A2704-12, ili ACS-GM005-3.

[0204] Referentni semenski materijal koji sadrži elitni događaj EE-GM2 je deponovan kao 32CON0688 u NCIMB (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Škotska) 12. oktobra 2009., pod pristupnim brojem NCIMB 41660. Alternativna oznaka za događaj EE-GM2 je LL55, A5547-127, ili ACS-GM006-4.

[0205]Referentni semenski materijal koji sadrži elitne događaje EE-GM3 i EE-GM1 je deponovan kao 111606 soja u ATCC (American Type Culture Collection, 10801 Universitv Blvd., Manassas, Va. 20110-2209, SAD) 11. juna 2010., pod ATCC pristupnim brojem PTA-11041.

[0206]Referentni semenski materijal koji sadrži elitne događaje EE-GM3 i EE-GM2 je deponovan kao 05SHX2XEB soja u ATCC (American Type Culture Collection, 10801 Universitv Blvd., Manassas, Va. 20110-2209, SAD) 11. juna 2010., pod ATCC pristupnim brojem PTA-11042.

[0207]

Claims (18)

1. Biljka soje, ili njene ćelije, delovi, semenski materijal ili potomstvo,naznačeni time,što svaki od pomenutih u svojem genomu sadrži elitni događaj EE-GM3 i elitni događaj EE-GM2, pri čemu je elitni događaj EE-GM3, iz referentnog semenskog materijala, koji je deponovan u NCIMB pod depozitnim brojem NCIMB 41659, genetički lokus koji sadrži stranu DNA koja sadrži himerni gen koji kodira 2mEPSPS i himerni gen koji kodira HPPD PF W336, i pri čemu je elitni događaj EE-GM2, iz referentnog semenskog materijala, koji je deponovan u NCIMB pod depozitnim brojem NCIMB 41660, genetički lokus koja sadrži stranu DNA koja sadrži himerni gen koji kodira fosfinotricin acetiltransferazu.

2.Produkt soje,naznačen time,što je proizveden iz semenskog materijala koji sadrži događaje EE-GM3 i EE-GM2 iz zahteva 1, pri čemu pomenuti produkt soje je ili sadrži sojin obrok, smrvljeni semenski materijal, brašno, ili pahuljice, i sadrži nukleinske kiseline koje su specifične za elitne događaje EE-GM2 i EE-GM3, koji mogu da se detektuju uz pomoć postupka iz bilo kojeg od zahteva 7 do 9 ili 14.

3.Postupak za proizvodnju sojinog proizvoda,naznačen time,što podrazumeva nabavljanje semenskog materijala soje koja sadrži događaj EE-GM3 i događaj EE-GM2 iz zahteva 1, iz kojeg se proizvodi pomenuti sojin produkt.

4.Postupak za tretman biljaka soje sa ciljem kontrole korova u polju soje,naznačen time,što podrazumeva tretiranje biljaka soje koje sadrže događaje EE-GM3 i EE-GM2 iz zahteva 1, sa efektivnom količinom herbicida na bazi izoksaflutola i/ili glifosata i/ili glufosinata, pri čemu su takve biljke tolerantne na pomenuti(e) herbicid(e).

5.Proces za tretman semenskog materijala, koji sadrži događaje EE-GM3 i EE-GM2 iz zahteva 1, kada se poseje na polje,naznačen time,što obuhvata primenu herbicida koji je inhibitor HPPD, poput izoksaflutola, koje je opciono praćeno sa primenom glifosata i/ili glufosinata ili smešom inhibitora HPPD sa glifosatom i/ili glufosinatom, kao herbicid koji se koristi nakon izbijanja biljke, pri čemu pomenuta primena podrazumeva tretiranje samih biljaka sa ciljem kontrole rasta korova.

6.Proces za kontrolu korova,naznačen time,što podrazumeva tretiranje biljaka soje, koje sadrže događaje EE-GM3 i EE-GM2 iz zahteva 1, sa herbicidom koji je inhibitor HPPD, poput izoksaflutola, pri čemu pomenuto tretiranje podrazumeva tretman samih biljaka, koji se primenjuje zajedno sa, nakon ili pre tretmana sa glifosatom i/ili glufosinatom kao herbicidi koji se koriste nakon šta biljke izbiju i nanošenje na same biljke (tj. preko biljaka).

7. Postupak za identifikovanje simultane prisutnosti elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM2 u biološkim primercima,naznačen time,šta obuhvata detektovanje specifičnog regiona EE-GM3 uz pomoć specifičnog prvog para prajmera ili uz pomoć probe koja specifično prepoznaje 5'- ili 3'-bočni region i stranu DNA koja se na to nastavlja i ulazi u EE-GM3, pri čemu jedan od pomenutih prajmera iz prvog para prajmera prepoznaje 5'- ili 3'-bočni region strane DNA, koja u EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, i pri čemu pomenuti 5'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1 do nukleotida 1451, a pomenuti 3'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 241 do nukleotida 1408, dok drugi prajmer iz prvog para prajmera prepoznaje neku sekvencu unutar strane DNA iz EE-GM3 i sadrži nukleotidnu sekvenca komplementa iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1452 do nukleotida 1843 ili nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 1 do nukleotida 240 ili drugi prajmer iz prvog para prajmera prepoznaje neku sekvenca unutar strane DNA iz EE-GM3 i sadrži nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 1 od nukleotida 188 do nukleotida 7252 ili njezin komplement, ili sadrži nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 20 od nukleotidne pozicije 1452 do nukleotidne pozicije 16638 ili njezin komplement, i pri čemu pomenuta prva proba sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa sekvencom koja sadrži deo iz 5'-bočne sekvence ili iz 3'-bočne sekvence strane DNA, koja u EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, i sa sekvencom iz strane DNA koja se tu nastavlja, ili sa njenim komplementom, tako da pomenuta prva proba ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1441 do 1462 ili sa SEQ ID Br. 3 od nukleotida 230 do 251, ili sa komplementima pomenutih sekvenca i detektovanje specifičnog regiona EE-GM2 sa specifičnim drugim parim prajmera ili sa probom koji specifično prepoznaju 5'- ili 3'-bočni region i stranu DNA koja se proteže u EE-GM2, pri čemu jedan od prajmera iz pomenutog drugog para prajmera prepoznaje 5'- ili 3'-bočni region strane DNA, koja u EE-GM2 sadrži gene za toleranciju na herbicid, i pri čemu pomenuti 5'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 1 do nukleotida 311, a pomenuti 3'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 508 do nukleotida 1880, a drugi prajmer iz pomenutog drugog para prajmera prepoznaje sekvencu unutar strane DNA za događaj EE-GM2 koja ima nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 312 do nukleotida 810 ili ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 1 do nukleotida 507 ili drugi prajmer iz drugog para prajmera prepoznaje neku sekvencu unutar strane DNA iz EE-GM2 koja ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 11 ili njen komplement, i pri čemu pomenuta druga specifična proba ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa sekvencom koja sadrži deo 5'-bočne sekvence ili 3'-bočne sekvence iz strane DNA, koja u EE-GM2 sadrži gene za toleranciju na herbicid, i sa sekvencom iz strane DNA koja se tu nastavlja, ili sa njenim komplementom, tak da pomenuta druga proba ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID Br. 14 od nukleotida 301 do 322 ili sa SEQ ID Br. 15 od nukleotida 497 do 518, ili sa komplementima pomenutih sekvenca, pri čemu pomenuti događaji EE-GM3 i EE-GM2 su definisani u zahtevu 1.

8. Postupak iz zahteva 7,naznačen time,što pomenuti postupak obuhvata amplifikovanje dva DNA fragmenta veličine između 50 i 1000 bp iz nukleinske kiseline koja je prisutna u pomenutim biološkim primercima uz pomoć primene prve lančane reakcije polimerazom uz korišćenje pomenutog prvog para prajmera, i uz pomoć primene druge lančane reakcije polimerazom uz korišćenje pomenutog drugog para prajmera, pri čemu pomenuta prva i druga lančana reakcija polimerazom mogu da se provode odvojeno ili simultano.

9. Postupak iz zahteva 7,naznačen time,što pomenuti prajmer koji prepoznaje 5'-bočni region EE-GM3 na svojem krajnjem 3'-kraju sadrži sekvencu od najmanje 17 uzastopnih nukleotida izabranih iz nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1 do nukleotida 1451 ili pomenuti prajmer koji prepoznaje 3'-bočni region EE-GM3 na svojem krajnjem 3'-kraju sadrži nukleotidnu sekvencu od najmanje 17 uzastopnih nukleotida izabranih iz nukleotidne sekvence komplementa iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 241 do nukleotida 1408, pomenuti prajmer koji prepoznaje neku sekvencu unutar strane DNA iz EE-GM3 na svojem krajnjem 3'-kraju sadrži najmanje 17 uzastopnih nukleotida izabranih iz nukleotidne sekvence komplementa iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1452 do nukleotida 1843 ili iz nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 1 do nukleotida 240 ili iz nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 1 od nukleotida 188 do nukleotida 7252 ili iz njenog komplementa, pomenuti prajmer koji prepoznaje 5'-bočni region iz EE-GM2 na svojem krajnjem 3'-kraju sadrži nukleotidnu sekvencu od najmanje 17 uzastopnih nukleotida izabranih iz nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 1 do nukleotida 311 ili pomenuti prajmer koji prepoznaje 3'-bočni region iz EE-GM2 na svojem krajnjem 3'-kraju sadrži nukleotidnu sekvencu od najmanje 17 uzastopnih nukleotida izabranih iz nukleotidne sekvence komplementa iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 508 do nukleotida 1880, pomenuti prajmer koji prepoznaje neku sekvencu unutar strane DNA iz EE-GM2 na svojem krajnjem 3'-kraju ima najmanje 17 uzastopnih nukleotida izabranih iz nukleotidne sekvence komplementa iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 312 do nukleotida 810 ili iz nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 1 do nukleotida 507 ili iz nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 11 ili iz njenog komplementa, tako da pomenuti prajmeri, koji su specifični za EE-GM3, sadrže sekvencu iz SEQ ID Br. 5 i iz SEQ ID Br. 4, ili sekvencu iz SEQ ID Br. 7 i iz SEQ ID Br. 5, a pomenuti prajmeri, koji su specifični za EE-GM2, sadrže sekvencu iz SEQ ID Br. 18 i iz SEQ ID Br. 19.

10. Komplet hemikalija za identifikovanje simultane prisutnosti elitnog događaja EE-GM3 i elitnog događaja EE-GM2 u biološkim primercima,naznačen time,što pomenuti komplet hemikalija sadrži prvi prajmer koji prepoznaje 5'- ili 3'-bočni region strane DNA, koja u EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, pri čemu pomenuti 5'-bočni region ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1 do nukleotida 1451, a pomenuti 3'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 241 do nukleotida 1408, i drugi prajmer koji prepoznaje sekvencu unutar strane DNA, koja u EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, pri čemu pomenuta strana DNA ima nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1452 do nukleotida 1843 ili nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 1 do nukleotida 240 ili nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 1 od nukleotida 188 do nukleotida 7252 ili njen komplement, ili nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 20 od nukleotidne pozicije 1452 do nukleotidne pozicije 16638 ili njen komplement, i pri čemu pomenuti komplet hemikalija dodatno sadrži i treći prajmer koji prepoznaje 5'- ili 3'-bočni region strane DNA, koja u EE-GM2 sadrži gene za toleranciju na herbicid, pri čemu pomenuti 5'-bočni region ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 1 do nukleotida 311, a pomenuti 3'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 508 do nukleotida 1880, i sadrži četvrti prajmer koji prepoznaje sekvenca unutar strane DNA, koja u EE-GM2 sadrži gene za toleranciju na herbicid, pri čemu pomenuta strana DNA ima nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 312 do nukleotida 810 ili nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 1 do nukleotida 507 ili nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 11 ili njen komplement.

11. Dva para prajmera prikladna za specifično detektovanje događaja EE-GM3 i EE-GM2,naznačeni time,što prvi par prajmera sadrži prvi prajmer sa sekvencom koja prepoznaje sekvencu unutar 5'- ili 3'-bočnog regiona strane DNA koja u EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, pri čemu pomenuti 5'-bočni region ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1 do nukleotida 1451, a pomenuti 3'-bočni region ima nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 241 do nukleotida 1408, i drugi prajmer sa sekvencom koja prepoznaje neku sekvencu unutar sekvenca od strane DNA koje se nastavljaju na pomenute 5'- ili 3'-bočne regione iz EE-GM3, a pomenuta strana DNA koja se nastavlja na pomenuti 5'-bočni region ima nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1452 do nukleotida 1843 dok pomenuta strana DNA koja se nastavlja na pomenuti 3'-bočni region ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 1 do nukleotida 240; dok drugi par prajmera sadrži treći prajmer sa sekvencom koja prepoznaje neku sekvencu unutar 5'- ili 3'-bočnog regiona strane DNA, koja u EE-GM2 sadrži gene za toleranciju na herbicid, pri čemu pomenuti 5'-bočni region ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 1 do nukleotida 311, a pomenuti 3'-bočni region ima nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 508 do nukleotida 1880, i četvrti prajmer sa sekvencom koja prepoznaje neku sekvencu unutar sekvenca strane DNA koje se nastavljaju na pomenute 5'- ili 3'-bočne regione iz EE-GM2, pri čemu pomenuta strana DNA koja se nastavlja na pomenuti 5'-bočni region sadrži komplement nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 312 do nukleotida 810, a pomenuta strana DNA koja se nastavlja na pomenuti 3'-bočni region ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 1 do nukleotida 507.

12.Parovi prajmera iz zahteva 11,naznačeni time,što pomenuti prvi prajmer na svojem krajnjem 3'-kraju sadrži nukleotidnu sekvencu od najmanje 17 uzastopnih nukleotida izabranih iz nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1 do nukleotida 1451 ili nukleotidnu sekvencu od najmanje 17 uzastopnih nukleotida izabranih iz nukleotidne sekvence komplementa iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 241 do nukleotida 1408, pomenuti drugi prajmer na svojem krajnjem 3'-kraju sadrži nukleotidnu sekvencu od najmanje 17 uzastopnih nukleotida izabranih iz komplementa nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1452 do nukleotida 1843 ili nukleotidnu sekvencu od najmanje 17 uzastopnih nukleotida izabranih iz nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 1 do nukleotida 240, pomenuti treći prajmer na svom krajnjem 3'-kraju sadrži nukleotidnu sekvencu od najmanje 17 uzastopnih nukleotida izabranih iz nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 1 do nukleotida 311 ili nukleotidnu sekvencu od najmanje 17 uzastopnih nukleotida izabranih iz nukleotidne sekvence komplementa iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 508 do nukleotida 1880, pomenuti četvrti prajmer na svom krajnjem 3'-kraju sadrži nukleotidnu sekvencu od najmanje 17 uzastopnih nukleotida izabranih iz komplementa nukleotidne sekvence iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 312 do nukleotida 810 ili nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 1 do nukleotida 507.

13. Komplet,naznačen time,što sadrži četiri prajmera, prvi prajmer koja na svojem krajnjem 3'-kraju sadrži sekvencu iz SEQ ID Br. 5; drugi prajmer koja na svom krajnjem 3'-kraju sadrži sekvencu iz SEQ ID Br. 4; treći prajmer koja na svom krajnjem 3'-kraju sadrži sekvencu iz SEQ ID Br. 18; i četvrti prajmer koja na svom krajnjem 3'-kraju sadrži sekvencu iz SEQ ID Br. 19.

14. Postupak iz zahteva 7,naznačentime, što podrazumeva hibridizaciju nukleinske kiseline iz bioloških primeraka sa prvom probom koja je specifična za događaj EE-GM3 i sa drugom probom koja je specifična za događaj EE-GM2, pri čemu sekvenca pomenute prve specifične probe je najmanje 80% identična sa sekvencom koja sadrži deo 5'-bočne sekvence ili 3'-bočne sekvence događaja EE-GM3 i sa sekvencom iz strane DNA koja se tu nastavlja i pri čemu je sekvenca iz pomenute druge specifične probe najmanje 80% identična sa sekvencom koja sadrži deo 5'-bočne sekvence ili 3'-bočne sekvence događaja EE-GM2 i sa sekvencom iz strane DNA koja se tu nastavlja, tako da sekvenca prve specifične probe ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1431 do 1472 ili sa SEQ ID Br. 3 od nukleotida 220 do 261, ili sadrži komplemente pomenutih sekvenca i pri čemu sekvenca pomenute druge specifične probe ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID Br. 14 od nukleotida 301 do 322 ili sa SEQ ID Br. 15 od nukleotida 497 do 518, ili sadrži komplemente pomenutih sekvenca.

15.Komplet hemikalija za identifikovanje simultane prisutnosti elitnog događaja EE-GM3 i elitnog događaja EE-GM2 u biološkim primercima,naznačen time,što pomenuti komplet hemikalija sadrži prvu specifičnu probu, koja može da specifično hibridizuje sa specifičnim regionom iz događaja EE-GM3 i drugu specifičnu probu koja može da specifično hibridizuje sa specifičnim regionom iz događaja EE-GM2, pri čemu je sekvenca pomenute prve specifične probe najmanje 80% identična sa nekom sekvencom koja sadrži deo 5'-bočne sekvence ili 3'-bočne sekvence strane DNA, koja u EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, i sa sekvencom strane DNA koja se tu nastavlja i pri čemu je sekvenca pomenute druge specifične probe najmanje 80% identična sa sekvencom koja sadrži deo 5'-bočne sekvence ili 3'-bočne sekvence strane DNA, koja u EE-GM2 sadrži gene za toleranciju na herbicid, i sa sekvencom iz strane DNA koja se tu nastavlja, tako da sekvenca prve specifične probe sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1441 do 1462 ili sa SEQ ID Br. 3 od nukleotida 230 do 251, ili sa komplementima pomenutih sekvenca i tako da sekvenca pomenute druge specifične probe sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID Br. 14 od nukleotida 301 do 322 ili sa SEQ ID Br. 15 od nukleotida 497 do 518, ili sa komplementima pomenutih sekvenca.

16. Par specifičnih proba za identifikaciju simultane prisutnosti elitnog događaja EE-GM3 i elitnog događaja EE-GM2 u biološkim primercima pri čemu su pomenuti događaji EE-GM3 i EE-GM2 definisani u zahtevu 1,naznačen time,što pomenuti par specifičnih proba obuhvata prvu probu koja ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa nekom sekvencom koja sadrži deo 5'-bočne sekvence ili 3'-bočne sekvence strane DNA, koja u EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, i sa sekvencom iz strane DNA koja se tu nastavlja, ili sa njenim komplementom, i drugu probu koja ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa sekvencom koja sadrži deo 5'-bočne sekvence ili 3'-bočne sekvence strane DNA, koja u EE-GM2 sadrži gene za toleranciju na herbicid, i sa sekvencom iz strane DNA koja se tu nastavlja, ili sa njenim komplementom, tako da pomenuta prva proba ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1441 do 1462 ili sa SEQ ID Br. 3 od nukleotida 230 do 251, ili sa komplementima pomenutih sekvenca, dok pomenuta druga proba ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID Br. 14 od nukleotida 301 do 322 ili sa SEQ ID Br. 15 od nukleotida 497 do 518, ili sa komplementima pomenutih sekvenca.

17.Postupak za potvrđivanje čistoće semenskog materijala, ili za proveru semenskog materijala na prisutnost elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM2,naznačen time,što pomenuti postupak podrazumeva detektovanje specifičnog regiona iz događaja EE-GM3 uz pomoć specifičnog prvog para prajmera ili uz pomoć probe koji specifično prepoznaju 5'- ili 3'-bočni region i stranu DNA događaja EE-GM3 koja se tu nastavlja, pri čemu jedan od prajmera iz prvog para prajmera prepoznaje 5'- ili 3'-bočni region strane DNA, koja u EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, pri čemu pomenuti 5'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1 do nukleotida 1451, a pomenuti 3'-bočni region sadrži nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 241 do nukleotida 1408, dok drugi prajmer iz prvog para prajmera prepoznaje neku sekvencu unutar strane DNA događaja EE-GM3 koja ima nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1452 do nukleotida 1843 ili nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 1 do nukleotida 240 ili drugi prajmer iz prvog para prajmera prepoznaje neku sekvencu unutar strane DNA događaja EE-GM3 koja ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 1 od nukleotida 188 do nukleotida 7252 ili njen komplement, ili koja ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 20 od nukleotidne pozicije 1452 do nukleotidne pozicije 16638 ili njen komplement, pri čemu pomenuta prva proba ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa nekom sekvencom koja sadrži deo 5'-bočne sekvence ili 3'-bočne sekvence strane DNA, koja u EE-GM3 sadrži gene za toleranciju na herbicid, i sa sekvencom iz strane DNA koja se tu nastavlja, ili sa njenim komplementom, tako da pomenuta prva proba ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1441 do 1462 ili sa SEQ ID Br. 3 od nukleotida 230 do 251, ili sa komplementima pomenutih sekvenca, i još podrazumeva detektovanje specifičnog regiona iz događaja EE-GM2 uz pomoć specifičnog drugog para prajmera ili uz pomoć probe koji specifično prepoznaju 5'- ili 3'-bočni region i stranu DNA događaja EE-GM2 koja se tu nastavlja, pri čemu jedan od prajmera iz pomenutog drugog para prajmera prepoznaje 5'- ili 3'-bočni region strane DNA, koja u EE-GM2 sadrži gene za toleranciju na herbicid, pri čemu 5'-bočni region ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 1 do nukleotida 311, a pomenuti 3'-bočni region ima nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 508 do nukleotida 1880, dok drugi prajmer iz pomenutog drugog para prajmera prepoznaje neku sekvencu unutar strane DNA događaja EE-GM2 koja ima nukleotidnu sekvencu komplementa iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 312 do nukleotida 810 ili nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 1 do nukleotida 507 ili drugi prajmer iz drugog para prajmera prepoznaje neku sekvencu unutar strane DNA događaja EE-GM2 koja ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 11 ili njen komplement, dok pomenuta druga specifična probe ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa nekom sekvencom koja sadrži deo 5'-bočne sekvenca ili 3'-bočne sekvenca strane DNA, koja u EE-GM2 sadrži gene za toleranciju na herbicid, i sa sekvencom iz strane DNA koja se tu nastavlja, ili sa njenim komplementom, tako da pomenuta druga proba ima nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID Br. 14 od nukleotida 301 do 322 ili sa SEQ ID Br. 15 od nukleotida 497 do 518, ili sa komplementima pomenutih sekvenca, u primercima semenskog materijala, pri čemu su događaji EE-GM3 i EE-GM2 definisani u zahtevu 1.

18.Postupak za detektovanje prisutnost elitnih događaja EE-GM3 i EE-GM2 u biološkim primercima uz pomoć hibridizacije sa uglavnom komplementarnom, označenom probom od nukleinske kiseline pri čemu omer proba : ciljana nukleinska kiselina se amplifikuje uz pomoć recikliranja sekvence ciljane nukleinske kiseline,naznačen time,što obuhvata: a) hibridizovanje pomenute sekvence ciljane nukleinske kiseline sa prvim oligonukleotidom nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1452 do nukleotida 1469 ili njen komplement ili pomenuti prvi oligonukleotid nukleinske kiseline ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 223 do nukleotida 240 ili njen komplement; b) hibridizovanje pomenute sekvence ciljane nukleinske kiseline sa drugim oligonukleotidom nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 2 od nukleotida 1434 do nukleotida 1451 ili njen komplement ili pomenuti drugi oligonukleotid nukleinske kiseline ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 3 od nukleotida 241 do nukleotida 258 ili njen komplement, pri čemu pomenuti prvi i drugi oligonukleotid se preklapaju za najmanje jedan nukleotid i pri čemu pomenuti prvi i drugi oligonukleotid su označeni kako bi se dobila označena proba nukleinske kiseline; c) cepanje (samo) označene probe iz dupleksa kojeg čine proba i ciljana nukleinska kiselina sa encimom koji uzrokuje selektivno cepanje probe koje dovodi do raspada dupleksa, koje ostavlja ciljanu sekvencu intaktnom; d) recikliranje sekvence ciljane nukleinske kiseline uz pomoć ponavljanja koraka (a) do (c); i e) detektovanje pocepane označene probe, koje omogućava utvrđivanje prisutnosti pomenute ciljane sekvence nukleinske kiseline, i f) hibridizovanje pomenute sekvence ciljane nukleinske kiseline sa trećim oligonukleotidom nukleinske kiseline koji ima sekvencu iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 312 do nukleotida 329 li njen komplement ili pomenuti treći oligonukleotid nukleinske kiseline ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ TD Br. 15 od nukleotida 490 do nukleotida 507 ili njen komplement; g) hibridizovanje pomenute sekvence ciljane nukleinske kiseline sa četvrtim oligonukleotidom nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 14 od nukleotida 294 do nukleotida 311 ili njen komplement ili pomenuti četvrti oligonukleotid nukleinske kiseline ima nukleotidnu sekvencu iz SEQ ID Br. 15 od nukleotida 508 do nukleotida 525 ili njen komplement, pri čemu se treći i četvrti oligonukleotid preklapaju za najmanje jedan nukleotid i pri čemu pomenuti treći i četvrti oligonukleotid su označeni kako bi se dobila označena proba nukleinske kiseline; h) cepanje (samo) označene probe iz dupleksa koji se sastoji od probe i ciljane sekvence nukleinske kiseline sa encimom koji uzrokuje cepanje selektivne probe i dovodi do raspada dupleksa, koje ostavlja ciljanu sekvencu intaktnom; i) recikliranje sekvence ciljane nukleinske kiseline uz pomoć ponavljanja koraka (f) do(h);i j) detektovanje pocepane označene probe, koje omogućava utvrđivanje prisutnosti pomenute sekvence ciljane nukleinske kiseline.