JP4413615B2 - 遺伝的に形質転換された細胞の選択方法 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝的に形質転換された細胞の選択方法に関する。

遺伝的な物質を形質転換の手段により細胞の集団に導入する場合、ある数の細胞のみが首尾よく形質転換されるであろうことは知られている。形質転換の後、形質転換された細胞を同定し、形質転換された細胞および形質転換されなかった細胞の集団から選択しなければならない。所望の導入遺伝子に加え、選択遺伝子もそれ故一般的には導入される。選択遺伝子は例えば遺伝的に形質転換された細胞を同定できる性質をコードする。そのような選択遺伝子の例は例えば抗生物質または殺草剤に対する耐性をコードする遺伝子である。形質転換後、形質転換された細胞および形質転換されなかった細胞の集団を形質転換されなかった（「野生型の」）細胞に毒性である抗生物質または殺草剤と接触させる。その結果、形質転換された細胞のみが導入された選択遺伝子の存在により生き残り、増殖できる。

抗生物質または殺草剤耐性をコードするそのような選択遺伝子を使用することは、しかしながら、大規模で環境に導入されるトランスジェニック収穫物、特に食糧収穫物については一般的に望ましくない。そのような選択機構の他の欠点は更に例えば、形質転換されなかった細胞は一般的に死亡し去り、更には細胞の集団が細胞の粘着性の組織または全体の器官である場合、形質転換された細胞も,例えば死滅する形質転換されなかった細胞により分泌される毒性の化合物により死滅しうる。

本発明の目的は、上記の欠点を有しない、形質転換された細胞および形質転換されなかった細胞の集団から形質転換された細胞を選択する方法を提供することである。

この目的は、
ａ）細胞中に少なくとも１つの所望のヌクレオチド配列および少なくとも１つの選択ヌクレオチド配列を導入し、遺伝的に形質転換された細胞を得（選択ヌクレオチド配列はトレハロースを代謝するのに関与するタンパク質をコードする領域を含む）；
ｂ）形質転換された細胞および形質転換されなかった細胞の集団をトレハロースおよび／または誘導体と接触させ；そして
ｃ）形質転換された細胞のトレハロースおよび／または誘導体を代謝する能力に基づいて集団から形質転換された細胞を選択する
ことを含む方法を提供することによる発明により達成される。

トレハロースは,細菌、酵母、真菌、そしてまたいくつかの植物を含む多くの生物により製造されるグルコースのｈｅｔα−１，１−二糖である。それは昆虫における最も重要な血液糖である。トレハロースは,タンパク質の変性および膜損傷に対する保護を提供するので特にワクチンの製造および器官移植プロトコールにますます用いられつつある。

細胞、特に特定の植物細胞は、他の代謝可能な炭素源存在することなしには高い濃度のトレハロースが存在する培地では正常に増殖しない。本発明の方法においては形質転換された細胞を選択するために使用する。この目的のために、所望の導入遺伝子に加えて、細胞を選択ヌクレオチド配列で形質転換し、選択ヌクレオチド配列はトレハロースの代謝に関与するタンパク質をコードする領域を含む。形質転換された細胞および形質転換されなかった細胞の集団を、例えばトレハロースおよび／またはその誘導体を培養培地に添加することによりトレハロースおよび／またはその誘導体に接触させる。形質転換された細胞は,従って,関係する導入遺伝子によるばかりでなく、トレハロースを代謝できるタンパク質をコードするそれらのゲノムのヌクレオチド配列の存在によっても形質転換されなかった細胞から区別される。形質転換された細胞は,トレハロースおよび／またはその誘導体を有する培地で生き残り、増殖することができるのに対し、形質転換されなかった細胞は更に増殖しないであろう。この方法では、形質転換された細胞は、トレハロースおよび／またはその誘導体を代謝する能力に基づいて全細胞集団から選択できる。

「トレハロースの代謝に関与するタンパク質」という語は、トレハロースおよび／またはその誘導体を分解し、それによってトレハロースおよび／またはその誘導体の濃度を減少させることができるタンパク質、例えば酵素に関する。

「トレハロースの誘導体」という語は、例えばトレハロースのメチル化またはハロゲン化形のような関連するタンパク質により代謝でき、細胞中でトレハロースと同じ応答を誘導するトレハロースの修飾された形に関する。

本発明の方法の好ましい態様では、導入される選択ヌクレオチド配列はトレハラーゼ活性を有する細胞内タンパク質、即ち細胞内トレハロースおよび／またはその誘導体をグルコースに加水分解できる酵素をコードする領域を含む。形質転換された細胞中のこのタンパク質の存在、および形質転換されなかった細胞中のその非存在のために、形質転換された細胞のみが細胞に入るトレハロースおよび／またはその誘導体を分解できる。形質転換された細胞中のトレハロースの細胞内濃度はこれにより減少し、一方放出されたグルコースは余分の栄養源として形質転換された細胞によりさらに用いられ得る。

多くの細胞、特に、Glycine max および Arabidopsis thaliana 等の高級植物の特定の細胞においてはそのゲノムに内在のトレハラーゼについての遺伝子を有する（Aeschbacher R. A. et al., Plant Physiol. 119(2):489-496,1999; Mueller et al., Plant Physiol. 125(2):1086-1093, 2001）。しかしながら、これらの内在性トレハラーゼ遺伝子は一般に細胞外トレハラーゼをコードし、それは細胞内で不活性である。そのような内在の遺伝子を標準的な分子生物学的技術により修飾することは可能である。本発明の方法の好ましい態様では、従って、選択ヌクレオチド配列は細胞内活性のトレハラーゼをコードする修飾した内在トレハラーゼ遺伝子を含む。内在のトレハラーゼ遺伝子は発現したトレハラーゼが、例えば削除または突然変異によるタンパク質分泌信号を不活性化することにより、タンパク質を標的とする配列を変化させることにより、または酵素的に活性な部位のｐＨ感受性を変化させることにより細胞内活性であるように修飾する。

本発明の方法による特に適した態様では導入された選択ヌクレオチド配列はＥ．ｃｏｌｉからのＴｒｅＦ遺伝子を含む（Horlacher R. et al., J. Bacteriol. 178(1):6250-6257, 1996）。この遺伝子は、単離し、標準的な生物学的技術を用いて多様な細胞に導入するのに簡単である。

本発明の他の有利な態様では選択ヌクレオチド配列はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Locus At4G24040, AG1 no. 2134960）からのＡｔＴＲＥ１遺伝子を含む。

本発明の方法は、好ましくは、更に行程ｂ）の前または間に内在性の細胞外トレハラーゼの少なくとも１つの阻害剤と細胞集団を接触させることを含む。存在する可能性のある内在性の細胞外トレハロースの阻害は培地からのトレハロースが培地から部分的にまたは全体的に分解するのを防ぎ、それによって形質転換されなかった細胞もさらに増殖できるであろう。

本発明の方法に用いる適当な阻害剤の例はスイダテステリンおよびシュードオリゴサッカライド抗生物質バリダマイシンの修飾された形である（Asano N. et al., J. Antibiot. 40 (4):526-532, 1987; Goddijn O. J. et al., Plant Physiol. 113(1):181-190, 1997; Knuesel I. et al., Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 120(4):639-646, 1998）。バリダマイシンはそれが細胞に入らないよう修飾されねばならない。内在性の細胞外のトレハラーゼの活性を阻害し、細胞に吸収されない他の化合物も本発明に従い用い得る。

「細胞の集団」という語は、個々の細胞の集団、そしてまた組織、器官、またはその部分の細胞、または例えば植物のような全生物の細胞（全植物またはその部分は遺伝的に形質転換された細胞よりなる）を意味すると理解される。

本発明による方法は遺伝的に修飾された植物細胞を選択するのに好ましくは用いられる。例えばＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの種苗は高い濃度のトレハロースを含む培地ではさらに発育できない。種子は芽を出すであろうが広い根システムの形成と最初の葉の段階の発育はトレハロースの存在により阻害される。遺伝的に形質転換された植物は、選択ヌクレオチド配列の導入により、特に細胞の細胞質中で、トレハロースを発現することができるので、細胞に入ったトレハロースはグルコースに分解され得る。グルコースは植物の栄養源としてつぎに用いうる。遺伝的に形質転換された植物はそれ故さらに発育し、一方形質転換されなかった植物の発育は遅れる。本発明による方法を植物における遺伝的に形質転換された細胞の選択に用いる場合、形質転換された植物は視覚的に容易に同定できる。

それ故、本発明による方法は、形質転換された細胞、特に遺伝的に形質転換された植物に対して、簡単で、環境に優しい選択システムを提供する。トレハロースは製造するに比較的安価で、ヒトおよび動物に対して非毒性であることがわかっている簡単な化合物である。ヒトは、パンおよびビール等の酵母発酵の製品として長い間大量のトレハロースを消費してきており、ヒトおよび動物は腸叢中のトレハロースを製造する微生物の存在によりトレハロースに連続的に曝されている。

本発明によればトレハラーゼ活性を有するタンパク質をコードするいずれのヌクレオチド配列も遺伝的に形質転換された細胞で選択ヌクレオチド配列とし用いることができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌からきたような外来性トレハラーゼ遺伝子を使用できるが、例えば通常、細胞外でのみ活性なレハラーゼの細胞内形のために内在性のトレハラーゼの修飾された形をコードするよう遺伝子を修飾する。そのような内在性のトレハラーゼ遺伝子を用いることの利点は付加的な外来遺伝物質が細胞に導入されないことである。

望ましい導入遺伝子および選択ヌクレオチド配列は標準的な分子生物学的技術を用いて形質転換のために細胞中に導入される。これは必須ではないが、導入遺伝子および選択遺伝子を互いに連結し、選択遺伝子の存在は導入遺伝子も存在することを常に表す。導入遺伝子はおよび選択遺伝子は同じ遺伝的構築物の部分を場合により形成し得、同じベクターにより細胞中に導入しうる。選択ヌクレオチド配列が形質転換された細胞中で発現していることを確認するために、そのような遺伝的構築物は例えば構成的または調節可能なプロモーターのような調節配列も含むであろう。

本発明の方法は、トランスジェニック植物を選択するため特に適した方法で用いうる。本発明の方法を用いうる植物の例は、とうもろこし（Zea mays L.）、小麦（Triticum aestiym L.）、大麦（Hordeum vulgare L.）、コメ（Oryza sativa L.）、大豆（Phaseolus vulgaris L.）、サトウダイコン（Beta vulgaris L.）、チコリー（Cichorum intybus L.）、菜種（Brassica napus L.）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、サツマイモ（Dicorea esculenta L.）、カッサバ（Manihot esculenta L.）、ポテト（Solanum tuberosum L.）、トマト（Lycopersicon esculentum L．）、および牧草（例えば、Lolium spp., Poa spp. および Festuca spp.）である。

本発明は更に本発明の方法を用いて選択した形質転換した細胞、特に植物細胞、およびそれから再生した植物、およびその種子および子孫に関する。

本発明を実施例および図面を用いて更に説明する。

実施例
実施例１
Arabidopsis thaliana Col.OおよびLa-erの種苗のトレハロースに対する感受性
種子をCloughおよびBent（1998）（Clough S. J., Bent A. F., Plant J. 16（6）:735-743, 1998）の気相プロトコールを用いて、エッペンドルフ管中で滅菌した。滅菌した種子を滅菌水中に次に再懸濁し、マニトールまたはトレハロースを最終濃度１００ｍＭまでおぎなった半強度MurashigueおよびSkoog培地（MS培地；Murashigue T, Skoog F, Physiol. Plant. 15:473-497）ビタミンおよびMES緩衝液（ｐH５．７）を含む０．８％ｗ／ｖ寒天培地に配列させた。

１００ｍＭマニトールの存在下に培養した種子は広範な根システムを有する植物に発育したが、１００ｍＭトレハロースの存在下に培養した種子は図１に示すように小さい発育が観察された。図１Ａは１００ｍＭマニトール（対照）の存在下に培養した種子を示し、図１Ｂは１００ｍＭトレハロースの存在下に培養した種子を示す。植物の上の列はArabidopsis thaliana Landsberg erecta(La-er)を示し、植物の下の列はArabidopsis thaliana Colombia (col. O)を示す。

実施例２
選択遺伝子としてのE.coli細胞質トレハラーゼ遺伝子(TreF）を有する発現ベクター
ＴｒｅＦを、ＰＣＲプライマートレルド（CTC TGC AGA TGC TCA ATC AGA AAA TTC AAA ACC)およびトレル（TGC ACT GCA GTT ATG GTT CGC CGT ACA AAC CAA)を用いてE.coliのゲノムＤＮＡから増幅した。増幅したＴｒｅＦ遺伝子をｐＧＥＭＴベクター（Promega、US)に次にクローニングした。ＴｒｅＦ遺伝子をＰＣＲプライマーＴＲｅ２ｄ（AGC ACT GCA GCC ATG GCT TTG GTT ACC CTC AAT CAG AAA ATT CAA AAC CCT）およびＴｒｅｍｙｃ(TTA CAG ATC TTC TTC AGA AAT AAG TTT TTG TTC TGG TTC GCC GTA CAA ACC AAT TAA)を用いてタンパク質のＣ末端でｍｙｃ−ｔａｇの導入のため更に修飾し、配列確認のためｐＧＥＭＴ中に再びクローニングした。生じた修飾ＴｒｅＦ配列はＰｓｔ１制限酵素で切断し、つぎのものに導入した。
Ａ．pCAMBIA2201(CAMBIA、Australia)。ＴｒｅＦ断片の外側末端をブラントし、消化したｐCAMBIA220プラスミドに断片をライゲートし、Ｎｃｏ１およびＢｓｔＥＩＩでブラントした。
Ｂ．pCambiaのＰｓｔ１部位；この目的のためにArabidopsis thalianaのユビキチン１０プロモーターをpCambia2380−TreFの平滑にしたHindIII部位に平滑にしたXhol-Spe １断片として加えた。
Ｃ．ｐACNプラスミドのＰｓｔ１部位（Zeneca, Caddick M.X. et al., Nat. Biotechnol. 16(2):177-180, 1998）。生じた構築物を次にHindIIIで消化し、断片はハイブリッドＡｌｃＡ／ミニマル ３５Ｓ プロモーター、その後のＴｒｅＦ配列およびＮｏｓ ＰｏｌｙＡターミネターを有する断がリリースされる。この断片はＳＲＮバイナリーベクター（Zeneca）のHindIII部位に導入され（Zeneca, Caddick M.X. et al., Nat. Biotechnol. 16（2）177-180, 1998）、それによって示した構築物が得られる。

図２は得られた構築物を示す。ＬＢ：左のＴ−ＤＮＡ境界；ＲＢ：右のＴ−ＤＮＡ境界；ｔｒｅＦ：細胞質トレハラーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉ遺伝子；ＮｐｔＩＩ：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子ＩＩ；ＡｌｃＲ；アルコール誘導可能なシステムのレギュレーターをコードする遺伝子；CaMV35S:カウリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター；Ｕｂｉ１０：Arabidopsis thalianaのユビキチン１０遺伝子のプロモーター；ＡｌｃＡ／３５Ｓ：ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと融合したエタノール誘導に反応性のＡｌｃＡプロモーター因子。

実施例３
トランスジェニックArabidopsis種子の選択
Arabidopsis thaliana Co1.O植物を「floral dip」プロトコール（Clough and Bent,上記）による実施例２Ｃに記載のバイナリープラスミドを有するAgrobacteriumで形質転換した。得られた乾燥した種子を滅菌し、トレハロースを最終濃度１００ｍＭで補充した半強度ＭＳ塩（１／２ＭＳ塩）、ビタミン、およびＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．７を有する０．８％ｗ／ｖ固体の寒天培地に蒔いた。その皿を３日間４℃でインキュベートし（stratification）、その後１滴のエタノールをカバーの内側に適用し、皿を２２℃に移した。
図３は１２日後に得られた種苗を示す。形質転換された耐性の種苗は緑色で、長い根および一次葉を有する。一方形質転換されなかった、感受性の種苗はアントシアニンを蓄積し、１次葉を発育せず、根は３ｍｍより長くならなかった。湿気の大きい条件では子
葉は色が薄くなった。

約４０００の蒔いた植物について２４の耐性の種苗を同定した。これは形質転換頻度が他
の選択システムで得られるそれと匹敵することを示す。１２の種苗を黒土に移し植物に発育させたが、形質転換されなかった野生タイプの植物と区別できなかった。

実施例４
Arabidopsisトランスジェニックラインエッジにおけるトレハラーゼをコードする選択遺伝子の安定な発現
トレハラーゼをコードする選択遺伝子の発現の安定性を、本発明の選択遺伝子にリンクする従来のカナマイシン選択遺伝子を用いる独立のArabidopsisトランスジェニックラインエイジで試験した。

実施例３からの１０の自己受粉したＴ１植物から得たＴ２種子を滅菌し、１％ｗ／ｖ蔗糖および２５ｍｇ／ｌカナマイシンを補った１／２ＭＳ−塩を有する０．８％の固体の寒天培地に蒔き、４℃で３日間インキュベートし、２２℃に移し、１６時間光／８時間暗のサイクルで１２日間生長させた。発芽頻度は１００％であった。

カナマイシン感受性の種苗は発芽したが青白い子葉を有し、根の発達がなく、１次葉段階がなかった。カナマイシン耐性の種苗は緑色で、１次葉および根を発育した。

表１に示すようにＴ１植物のトランスジェニック構築物はＴ２世代に常に出て行った。表１は各試験したラインエイジにおけるカンマイシンに対して耐性の種苗の数を示す。

Arabidopsisは自己受精により種子を作り、ディプロイド植物である。Ｔ１世代植物はそのゲノム中に少なくとも１つの安定な導入遺伝子を有する場合、Ｔ２世代は少なくとも３／４の耐性植物および最大で１／４の感受性植物よりなる。導入遺伝子がＴ１植物のゲノムに安定な方法で挿入されなかった場合、導入遺伝子はＴ２世代には見出されないであろう。表１はＴ２でのカナマイシン選択を使用することにより導入遺伝子を有するＴ２種苗が各Ｔ１ラインエイジに見出し得ることを示す。

表１

トレハロースへのArabidopsis thalianaの２つの異なるアクセッションの感受性を示す。Ａ：１００ｍＭマニトールの存在下に培養した種子（対照）；Ｂ：１００ｍＭトレハロースの存在下に培養した種子

Ｅ．ｃｏｌｉトレハラーゼ遺伝子の細胞質発現のための異なる構築物を示す。

１００ｍＭトレハロースの存在下の形質転換された、および形質転換されなかったArabidopsis thaliana Col.O種苗の培養を示す。

Ｅ．ｃｏｌｉからのＴｒｅＦ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。

Arabidopsis thaliana AtTrelのｍＲＮＡ配列を示す。

Glycine max からの GMTrelのｍＲＮＡ配列を示す。

Claims (13)

1. ａ）細胞中に所望のヌクレオチドおよび選択ヌクレオチドを導入し、遺伝的に形質転換された植物細胞を得（選択ヌクレオチドはトレハロースを代謝するのに関与するタンパク質をコードする領域を含む）；
   ｂ）形質転換された植物細胞および形質転換されなかった植物細胞の集団をトレハロースおよび／または誘導体と接触させ；そして
   ｃ）形質転換された植物細胞のトレハロースおよび／または誘導体を代謝する能力に基づいて集団から形質転換された細胞を選択する
   ことを含む細胞の集団から遺伝的に形質転換された植物細胞を選択する方法。
2. 選択ヌクレオチドが、トレハラーゼ活性を有する細胞内タンパク質をコードする領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 選択ヌクレオチドが、細胞内活性なトレハラーゼをコードする修飾された内在性トレハラーゼ遺伝子を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. 選択ヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＴｒｅＦ遺伝子を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
5. 選択ヌクレオチドが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のＡｔＴＲＥ１遺伝子を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
6. その方法が更に、行程ｂ）の前または間に、細胞の集団を内在性細胞外トレハラーゼの阻害剤と接触させることを含むことを特徴とする請求項１−５のいずれかに記載の方法。
7. 細胞が植物細胞であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. 形質転換された植物細胞および形質転換されなかった植物細胞の集団からの形質転換された細胞の選択のためのトレハロースおよび／またはその誘導体の使用であって、形質転換された植物細胞のゲノムはトレハロースの代謝に関与するタンパク質をコードする領域を含有する選択ヌクレオチドを含む使用。
9. 選択ヌクレオチドが、トレハラーゼ活性を有する細胞内タンパク質をコードする領域を含むことを特徴とする請求項８に記載の使用。
10. 選択ヌクレオチドが、細胞内で活性なトレハラーゼをコードする修飾された内在性のトレハラーゼ遺伝子を含むことを特徴とする請求項８又は９に記載の使用。
11. 選択ヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＴｒｅＦ遺伝子を含むことを特徴とする請求項８又は９に記載の使用。
12. 選択ヌクレオチドが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のＡｔＴＲＥ１遺伝子を含むことを特徴とする請求項８又は９に記載の使用。
13. 細胞が植物細胞であることを特徴とする請求項８−１２のいずれかに記載の使用。

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