CN111471707B - 一种延缓森林草莓叶片衰老的载体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种延缓森林草莓叶片衰老的载体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体设计一种延缓森林草莓叶片衰老的载体及其应用。从森林草莓中筛选得到森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段，构建得到该基因的植物抑制表达载体GN2300‑FveHK4，转入二倍体森林草莓‘Hawaii 4’中，获得FveHK4基因的RNAi表达干扰株系，该株系的营养生长与野生型没有明显差异。在黑暗条件下，FveHK4‑RNAi离体叶片的衰老与野生型相比明显延缓，表明遗传转化FveHK4干扰载体的森林草莓转基因株系叶片衰老速度变缓，功能期延长。本发明对延缓草莓叶片衰老，提高叶片的光合生产量进而提高草莓产量具有重要的意义。

Description

一种延缓森林草莓叶片衰老的载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种延缓草莓叶片衰老的载体及其应用。
背景技术
作物叶片是植物进行光合作用的重要场所,也是植物衰老最敏感的器官之一。叶片衰老是导致叶片自然死亡的生命活动衰退的过程，在形态上表现为黄化。植物叶片颜色的变化能够反映出叶片的衰老状况和叶绿素的损失，叶绿素逐渐丧失而呈现黄色是叶片衰老最明显的特点。叶片衰老对作物的产量和质量有重要影响。有研究报道，在玉米、水稻等作物叶片上喷施适宜浓度的细胞分裂素类物质，可以延缓叶片衰老、改善作物品质，有明显的增产效果。
细胞分裂素是植物的生长调节因子，参与植物生长发育的各个过程，对植物形态建成和农作物产量有着重要意义。生产上常用的细胞分裂素主要有6-苄氨基嘌呤、激动素、玉米素等。细胞分裂素对植物生长发育最明显的生理作用是促进细胞分裂、调控器官分化、延缓蛋白质和叶绿素的降解、延迟衰老等。因此，通过调控细胞分裂素相关基因的表达，有可能延缓叶片衰老，为挖掘叶片的光合生产潜力提供可能的途径。
草莓(Fragaria×ananazsa Duch.)是蔷薇科草莓属多年生草本植物，其果实甜美可口，富含营养物质，具有较高的经济价值。延缓草莓叶片衰老、延长其叶片功能期对提高草莓叶片的光合生产量进而提高草莓产量具有重要的意义。
然而，目前对草莓叶片衰老机制的研究很少，尚没有其叶片衰老延缓基因的报道。栽培草莓是八倍体，遗传背景复杂。森林草莓(Fragaria vesca)是栽培草莓的直系祖先，与栽培草莓在营养生长和生殖生长方面的特性基本相同，但具有生长周期短、转化体系成熟、基因组小的优势，由此是研究栽培草莓的理想模式植物。调控森林草莓基因的表达实现其叶片衰老的延缓对延长栽培草莓叶片功能期，进而提高草莓产量具有重要的参考价值。
发明内容
针对现有技术中的亟需延缓草莓叶片衰老的问题，本发明的目的在于提供一个森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的植物抑制表达载体。
本发明所构建的植物抑制表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，对延缓草莓叶片衰老及延长叶片的功能期、充分挖掘叶片的光合生产潜力最终取得高产具有重要的意义。
本发明具体技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段在延缓草莓叶片衰老中的应用，所述RNA干扰片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
AGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAGTTGTGGTGATGGGTGGGAATTTGAAGATGCAGAGCCACCACTCTGTGGCTGTGAGGTTGAATGAGCAAATGGGGGCCAAAAAGGGCTTCACTTTTATTCAGGCTTACAGAGCTTGGTTCCCAAAGCTTTTGATGCTTTGGATTCTGGTGATGGCTTATTTGAGCTTCTCAATCTACAATTACATGGATGCTGATAACAAAGTG(SEQ ID NO.1)。
进一步的，所述RNA干扰片段核苷酸序列为位于NCBI登录号为XM_004297360的FveHK4序列675～899bp区域。
本发明从森林草莓中鉴定得到一个细胞分裂素受体基因FveHK4。本发明的FveHK4的RNA干扰片段是FveHK4基因序列中675～899bp区域长度为225bp的片段，同时也是与其他细胞分裂素受体基因以及其他草莓基因特异的一段序列。
本发明的第二个目的是提供一种森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的植物抑制表达载体GN2300-FveHK4，所述植物抑制表达载体为在GN2300通用载体的XbaI/SalI双酶切位点中插入森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的ihpRNA发夹结构所得到，所述ihpRNA发夹结构由森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的正义链(SEQ ID NO.1所示)-内含子-森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的反义链构成。
进一步的，所述植物抑制表达载体GN2300-FveHK4中ihpRNA发夹结构的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
AGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAGTTGTGGTGATGGGTGGGAATTTGAAGATGCAGAGCCACCACTCTGTGGCTGTGAGGTTGAATGAGCAAATGGGGGCCAAAAAGGGCTTCACTTTTATTCAGGCTTACAGAGCTTGGTTCCCAAAGCTTTTGATGCTTTGGATTCTGGTGATGGCTTATTTGAGCTTCTCAATCTACAATTACATGGATGCTGATAACAAAGTGttcgaccatattattcaggtacattctgatttcattatcttcctacttggttaaatttcaacatgtaatactatttttggcttcaaacatttaaattaaggatgtgtactttaatgtgatgcagcttgcaaagcTctagtCACTTTGTTATCAGCATCCATGTAATTGTAGATTGAGAAGCTCAAATAAGCCATCACCAGAATCCAAAGCATCAAAAGCTTTGGGAACCAAGCTCTGTAAGCCTGAATAAAAGTGAAGCCCTTTTTGGCCCCCATTTGCTCATTCAACCTCACAGCCACAGAGTGGTGGCTCTGCATCTTCAAATTCCCACCCATCACCACAACTTCAACTACCTCTTTGCTTCT(SEQ IDNO.2)。
本发明的第三个目的是提供一种森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的植物抑制表达载体GN2300-FveHK4的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
S1：获得森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段：
S1-1：根据NCBI数据库登录号：XM_004297360公布的FveHK4序列为模板，设计特异性引物
FveHK4-RNAi-F1：5'-AGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAG-3'(SEQ ID No.4)和
FveHK4-RNAi-R1：5'-CACTTTGTTATCAGCATCCATG-3'(SEQ ID No.5)，扩增得到SEQID NO.1所示的森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的正义链；
S1-2：根据NCBI数据库登录号：XM_004297360公布的FveHK4序列为模板，设计特异性引物
FveHK4-RNAi-F2：5'-CACTTTGTTATCAGCATCCATG-3'(SEQ ID No.6)和
FveHK4-RNAi-R2：5'-AGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAG-3'(SEQ ID No.7)，扩增得到森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的反义链；
S2：获得内含子片段：以NCBI登录号：LOC101294385的序列为模板，设计特异性引物
Intron-F：5'-GGACTCTGCAGGTCGACCATATTATTCAGGTACATTC-3'(SEQ ID No.8)和Intron-R：5'-TGTGATGCAGCTTGCAAAGCTCTAGAGATCGTTCAAA-3'(SEQ ID No.9)，扩增得到SEQID NO.3所示的内含子片段：
CATATTATTCAGGTACATTCTGATTTCATTATCTTCCTACTTGGTTAAATTTCAACATGTAATACTATTTTTGGCTTCAAACATTTAAATTAAGGATGTGTACTTTAATGTGATGCAGCTTGCAAAGC(SEQ ID NO.3)
S3：构建含有内含子的Intron-GN2300载体：XbaI/SalI双酶切GN2300通用载体，将S2扩增得到的SEQ ID NO.3所示内含子片段连接到GN2300通用载体XbaI/SalI双酶切位点，得到含有内含子的Intron-GN2300载体；
S4：构建抑制表达载体GN2300-FveHK4：将S1-1得到的SEQ ID NO.1所示正义链连接到含有内含子的Intron-GN2300载体的SalI酶切位点上，连接正义链的引物为：
F1：5'-ggactctgcaggtcgacAGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAG-3'(SEQ ID No.10)，
R1：5'-tgaataatatggtcgaaCACTTTGTTATCAGCATCCATG-3'(SEQ ID No.11)；
得到含有正义链和内含子的Intron-GN2300载体，再将S1-2得到的反义链连接到含有正义链和内含子的Intron-GN2300载体的XbaI酶切位点上，连接反义链的引物为：
F2：5'-gcttgcaaagcTctagtCACTTTGTTATCAGCATCCATG-3'(SEQ ID No.12)，
R2：5'-tttgaacgatctctagaAGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAG-3'(SEQ ID No.13)；
得到受体基因FveHK4的抑制表达载体GN2300-FveHK4；
S5：使用冻融法将S4得到的受体基因FveHK4的抑制表达载体转化至农杆菌GV3101感受态细胞中并提取阳性质粒，进行农杆菌菌落PCR及测序验证，得到含有森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的正义链-内含子-森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的反义链(即正义链位于内含子上游，反义链位于内含子下游的)的ihpRNA发夹结构的植物抑制表达载体GN2300-FveHK4。
本发明的第四个目的是提供转染了前述森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的植物抑制表达载体GN2300-FveHK4的转基因工程菌。
进一步的，所述转基因工程菌以GV3101农杆菌为宿主细胞。
本发明的第五个目的是提供前述森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的植物抑制表达载体GN2300-FveHK4在延缓叶片衰老中的应用。
本发明的第六个目的是提供前述的转染了前述森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的植物抑制表达载体GN2300-FveHK4的转基因工程菌在延缓叶片衰老中的应用。
本发明技术方案所实现的有益效果为：
(1)本发明筛选得到森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段，构建得到森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的植物抑制表达载体GN2300-FveHK4，进而转染转基因工程菌，转入二倍体森林草莓‘Hawaii 4’中，获得FveHK4基因的RNAi表达干扰株系，延缓了森林草莓叶片衰老，并证实FveHK4基因与草莓叶片衰老的延缓有关。
(2)FveHK4基因的RNAi表达干扰株系的生长情况不受影响，但是叶片的衰老速度较野生型(WT)更慢(WT为野生型草莓品种Hawaii4)。
(3)本发明通过抑制FveHK4基因表达可获得叶片延缓衰老的草莓植株，这对草莓叶片功能期的延长、叶片的光合生产潜力及产量的提高具有重要意义。
附图说明
图1：实施例2中构建的载体图谱。
图2：实施例3中WT和FveHK4抑制表达系植株生长情况。
其中：WT为野生型草莓品种Hawaii4，FveHK4-RNAi为FveHK4基因的RNAi表达干扰株系；
图3：实施例4中黑暗处理下的叶片衰老情况；
其中：WT为野生型草莓品种Hawaii4，FveHK4-RNAi为FveHK4基因的RNAi表达干扰株系；A，0d新鲜叶片；B，黑暗处理7d后的叶片；C，黑暗处理9d后的叶片；D黑暗处理13d的叶片。
图4：实施例4中黑暗处理下叶片的叶绿素浓度变化。
其中：WT为野生型草莓品种Hawaii4，FveHK4-RNAi为FveHK4基因的RNAi表达干扰株系；
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂和生物材料，如未特别说明，均已公开。
实施例1：获得森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段
细胞分裂素受体基因FveHK4核苷酸正义及反义链的克隆：
根据NCBI数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)登录号：XM_004297360公布的FveHK4序列为模板，设计特异性引物
FveHK4-RNAi-F：5'-AGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAG-3'(SEQ ID No.4)和
FveHK4-RNAi-R：5'-CACTTTGTTATCAGCATCCATG-3'(SEQ ID No.5)，通过PCR反应扩增得到SEQ ID NO.1所示的森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的正义链，长度为225bp；
同样以上述模板，设计特异性引物
FveHK4-RNAi-F2：5'-CACTTTGTTATCAGCATCCATG-3'(SEQ ID No.6)和
FveHK4-RNAi-R2：5'-AGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAG-3'(SEQ ID No.7)，通过PCR反应扩增得到森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的反义链，长度为225bp。
扩增目的片段的PCR反应体系如表1：
表1 50μl普通PCR扩增反应体系
Figure BDA0002421851220000051
/>
Figure BDA0002421851220000061
PCR反应条件：98℃预变性5min，98℃变性10s、55℃退火15s、68℃延伸40s，32个循环，68℃延伸10min。
实施例2：植物表达载体GN2300-FveHK4的构建
具体步骤如下：
1.将内含子连接到GN2300载体，得到含有内含子的Intron-GN2300载体：
①获得内含子(Intron)片段：以NCBI登录号：LOC101294385的序列为模板，设计特异性引物Intron-F：5'-GGACTCTGCAGGTCGACCATATTATTCAGGTACATTC-3'(SEQ ID No.8)和Intron-R：5'-TGTGATGCAGCTTGCAAAGCTCTAGAGATCGTTCAAA-3'(SEQ ID No.9)，PCR扩增内含子Intron片段。获得的Intron内含子片段序列如SEQ ID NO.3所示。
PCR反应体系如表1。
反应条件：98℃预变性5min，98℃变性10s、55℃退火15s、68℃延伸10s，32个循环，68℃延伸10min。
②用XbaI/SalI双酶切GN2300通用载体。
双酶切体系如下：50μl的反应液中，1μg DNA，37℃的温度条件，反应1小时。
③将扩增的内含子片段连接到GN2300通用载体XbaI/SalI双酶切位点，得到含有内含子的Intron-GN2300载体。
2.构建抑制表达载体GN2300-FveHK4：
将SEQ ID NO.1所示的正义链连接到含有内含子的Intron-GN2300载体的SalI酶切位点上，连接正义链的引物为：
F1：5'-ggactctgcaggtcgacAGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAG-3'(SEQ ID No.10)，
R1：5'-tgaataatatggtcgaaCACTTTGTTATCAGCATCCATG-3'(SEQ ID No.11)；
反应体系如表2所示：
表2连接反应体系
Figure BDA0002421851220000062
Figure BDA0002421851220000071
反应步骤为：16℃过夜连接反应，提取5μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取含有正义链和内含子的Intron-GN2300载体的质粒。
再将反义链连接到含有正义链和内含子的Intron-GN2300载体的XbaI酶切位点上，连接反义链的引物为：
F2：5'-gcttgcaaagcTctagtCACTTTGTTATCAGCATCCATG-3'(SEQ ID No.12)，
R2：5'-tttgaacgatctctagaAGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAG-3'(SEQ ID No.13)；
反应体系为如表3所示：
表3连接反应体系
10×T4 ligase Buffer 1μL
含有正义链和内含子的Intron-GN2300载体 2μL
实施例1中得到的反义链 6μL
T4DNA连接酶 1μL
反应程序为：16℃过夜连接反应，提取5μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。37℃培养箱过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取抑制表达载体GN2300-FveHK4的质粒。
使用冻融法将抑制表达载体GN2300-FveHK4的质粒转化农杆菌GV3101感受态细胞并提取阳性质粒，进行农杆菌菌落PCR及测序验证，得到含有森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的正义链-内含子-森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的反义链(即正义链位于内含子上游，反义链位于内含子下游的)的ihpRNA发夹结构的植物抑制表达载体GN2300-FveHK4。
实施例3：森林草莓的遗传转化
(1)使用农杆菌介导的遗传转化法将实施例2获得的载体转化森林草莓，具体步骤如下：
①菌种的活化：将含抑制表达载体GN2300-FveHK4的GV3101农杆菌在含50mg/LKan和50mg/L Rif的LB固体培养基上划线，并倒置放于28℃恒温培养箱中，黑暗培养2d。待长出单菌落后，挑取大小适中、饱满圆润的单菌落接种于含有相同浓度抗生素的800μl LB液体培养基于2ml离心管中，200rpm 28℃振荡培养16h。取100μl菌液加入新的100ml LB培养基中，200rpm 28℃再振荡培养15h左右使OD600值为0.6-0.8。4℃条件下5000rpm离心5min，将沉淀的菌体用重悬液(MS+100uM AS)使OD600值为0.47-0.5，继续放入摇床100rpm28℃悬浮振荡1h后待用。
②材料准备：取野生二倍体森林草莓‘Hawaii 4’无菌苗的健壮叶片(培养45-60d左右，选取长势一致、叶脉清晰、叶片饱满的幼嫩叶片)，用刀片沿垂直于叶脉方向轻轻地划出3-4条伤口。将切好的叶片放置于不加任何激素的MS液体悬浮液中以防止叶片失水萎蔫。
③农杆菌侵染：待所有草莓叶片切好后将其浸入待用的农杆菌重悬液中，100rpm28℃振荡侵染20min，结束后用滤纸(经过高温高压灭菌的)吸去多余的重悬液。
④共培养：侵染后的叶片接种在草莓共培养培养基上(近轴面接触培养基)，置于25±2℃培养箱中黑暗培养3d。
⑤脱菌培养：将共培养3d后的草莓叶片转入脱菌培养基，25±2℃培养室中弱光培养15d左右。脱菌培养结束时，草莓叶片伤口处会长出淡黄色愈伤组织。
⑥筛选培养：将经过脱菌培养的草莓外植体转入筛选培养基，25±2℃培养室中弱光培养20-25d，培养光周期为16h(光)/8h(暗)，每15d更换一次新的培养基。筛选培养结束时，在愈伤组织上会有少量绿色芽点露出。
⑦生芽培养：继续将草莓叶片转入生芽培养基，25±2℃培养室中弱光培养30d左右，培养光周期为16h(光)/8h(暗)，每15d更换一次新的培养基，外植体一直放置在生芽培养基直到绿色芽点分化成芽。
⑧生根培养：待抗性植株长3-4片叶时，将其从愈伤上剥离，并转移到生根培养基上进行生根培养，待其生根出苗。
遗传转化中所用到的培养基配方如下：
①共培养培养基：MS-B5培养基+2.2mg/L TDZ+0.3mg/L IBA
②脱菌培养基：MS-B5培养基+2.2mg/L TDZ+0.3mg/L IBA+300mg/L Ti
③筛选培养基：MS-B5培养基+3mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+25mg/L Kan+300mg/L Ti
④生芽培养基：MS-B5培养基+2mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+25mg/L Kan+300mg/L Ti
⑤生根培养基：1/2MS培养基+0.2mg/L IBA+300mg/L Ti
⑥LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+NaCl粉末10g/L用蒸馏水定容，分装到所需规格的三角瓶，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25min，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。
⑦MS-B5固体培养基：蔗糖20g/L+MS培养基粉末(不含维生素)4302.09mg/L+B5有机溶液5mL/L+琼脂7g/L用1N氢氧化钠调节培养基的PH至5.80，用蒸馏水定容，分装到所需规格的三角瓶，封口，按上述方法灭菌。
⑧1/2MS固体培养基：蔗糖20g/L+1/2MS培养基粉末4302.09mg/L+琼脂7g/L用1N氢氧化钠调节培养基的PH至5.80，用蒸馏水定容，分装到所需规格的三角瓶，封口，按上述方法灭菌。
⑨MS固体培养基：蔗糖30g/L+MS大培养基粉末(包含维生素)4.406g/L+琼脂7g/L用1N氢氧化钠调节培养基的PH至5.80，用蒸馏水定容，分装到所需规格的三角瓶，封口，按上述方法灭菌。
⑩MS液体培养基：蔗糖30g/L+MS大培养基粉末(包含维生素)4.406g/L用1N氢氧化钠调节培养基的PH至5.80，用蒸馏水定容，分装到所需规格的三角瓶，封口，按上述方法灭菌。
主要溶液配方如下：
①6-BA(4mg/mL)激素的配置：称取6-BA 24mg，用150μL的1N氢氧化钠溶解5min，加1mL酒精(起到杀菌作用)，待溶解完全后蒸馏水定容至6mL，-20℃保存备用。
②TDZ(2mg/mL)激素的配置：称取TDZ 12mg，用150μL的1N氢氧化钠溶解5min，加1mL酒精(起到杀菌作用)，待溶解完全后蒸馏水定容至6mL，-20℃保存备用。
③IBA(1mg/mL)激素的配置：称取IBA 6mg，用蒸馏水定容至6mL，-20℃保存备用。
④Ti(300mg/mL)激素的配置：称取Ti 1.8g，用蒸馏水定容至6mL，-20℃保存备用。
⑤Kan(100mg/mL)激素的配置：称取Kan 600mg，用蒸馏水定容至6mL，-20℃保存备用。
⑥1N氢氧化钠贮存液:称取氢氧化钠4.0g，用蒸馏水溶解定容至100mL，室温保存备用。
⑦MS-B5有机溶液：称取维生素B1 2g，称取维生素B6 0.2g，称取烟酸0.2g，称取肌醇20g，用蒸馏水溶解定容至1000mL，4℃保存备用。
(2)GUS染色验证、移栽
对转基因植株GUS染色检测：将GUS染液分装入PCR排管中置于-20℃冰箱保存待用。剪取生根的转基因T0代植株叶片(确保叶片存在伤口)和WT草莓叶片(阴性对照)，将其置于盛有GUS染液的PCR排管中，置于37℃恒温培养箱中进行染色，20h后将GUS染液吸出，用浓度为100％的酒精对叶片进行脱色处理，脱色三次直到所取对照叶片的表面呈无色状。显微镜或肉眼观察叶片组织若有明显蓝色，表明GUS报告基因已整合到草莓基因组中，并且发生了表达，可初步鉴定为转基因成功。
将GUS染色成功的FveHK4基因的RNAi表达干扰株系移栽至含营养基质(营养土：蛭石：珍珠岩＝2：1：1)的花盆中并放置于本校植物生长室中种植，生长室条件为60％的湿度，16h的光照(22℃)/8h的黑暗(20℃)循环。
对植株的表型观察结果表明，与WT相比，除了FveHK4基因的RNAi表达干扰株系其本身(即T0代)在叶片衰老速度上变慢，其他形态生长在营养生长阶段都与WT相同。
实施例4：森林草莓离体叶片黑暗处理
分别剪取WT和实施例3获得的FveHK4-RNAi株系完全展开，且叶龄相似的叶片，分别放在只含琼脂(7.5mg/L)的固体培养基上，用封口膜将培养皿封住后置于22±2℃黑暗环境条件下处理。叶片衰老是一个极其复杂的生理生化过程,叶片衰老最明显的特点是叶绿素的降解，表现为叶片黄化、叶绿素浓度降低。因此通过叶片颜色观察和叶绿素浓度检测评估叶片衰老的程度。观察黑暗处理第1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d和15d WT和FveHK4-RNAi株系叶片的状态，并分别测定其叶绿素浓度。本实验共进行3次生物学重复，每次各处理WT和抑制表达系叶片30片(包括叶片颜色观察和叶绿素浓度检测)。
采用丙酮－乙醇混合液浸提法(丙酮:乙醇＝1:1，v/v)提取草莓叶片叶绿素。具体方法如下：将草莓叶片切碎后，浸泡于含丙酮－乙醇混合液的离心管中，并用锡箔纸包裹离心管后置于4℃冰箱黑暗放置48h以上，待叶片绿色完全脱去后取出。然后利用紫外分光光度计，分别测定在波长663nm和645nm下浸提液的吸光值。最后通过以下方式计算叶片中的叶绿素含量：叶绿素的含量(mg/g)＝(20.21×OD645+8.02×OD663)×V/(1000×W)；其中OD表示测定波长下的光密度值，V代表提取液体积(ml)，W为叶片鲜重(g)。
在黑暗培养条件下，FveHK4基因抑制表达系的离体叶片衰老明显晚于WT：如说明书附图3所示，黑暗处理9d后，WT离体叶片已开始变黄，而FveHK4-RNAi株系的所有叶片依然保持绿色；FveHK4-RNAi株系的离体叶片在黑暗处理13d后才开始黄化，此时WT叶片的黄化已十分明显。叶绿素浓度测定的结果与表型观察一致：黑暗处理的前一周，WT和FveHK4-RNAi株系叶片的叶绿素浓度基本无差异；一周之后，FveHK4-RNAi株系离体叶片的叶绿素含量显著高于WT(附图4)。这些结果表明，与WT相比，FveHK4-RNAi的离体叶片在黑暗条件下的衰老显著延缓。
本发明利用筛选得到的森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段，构建森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的植物抑制表达载体GN2300-FveHK4，能够有效延缓森林草莓叶片的衰老，延长草莓叶片功能期。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种延缓森林草莓叶片衰老的载体及其制备方法和应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 225
<212> DNA
<213> 森林草莓(Fragaria vesca)
<400> 1
agaagcaaag aggtagttga agttgtggtg atgggtggga atttgaagat gcagagccac 60
cactctgtgg ctgtgaggtt gaatgagcaa atgggggcca aaaagggctt cacttttatt 120
caggcttaca gagcttggtt cccaaagctt ttgatgcttt ggattctggt gatggcttat 180
ttgagcttct caatctacaa ttacatggat gctgataaca aagtg 225
<210> 2
<211> 590
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agaagcaaag aggtagttga agttgtggtg atgggtggga atttgaagat gcagagccac 60
cactctgtgg ctgtgaggtt gaatgagcaa atgggggcca aaaagggctt cacttttatt 120
caggcttaca gagcttggtt cccaaagctt ttgatgcttt ggattctggt gatggcttat 180
ttgagcttct caatctacaa ttacatggat gctgataaca aagtgttcga ccatattatt 240
caggtacatt ctgatttcat tatcttccta cttggttaaa tttcaacatg taatactatt 300
tttggcttca aacatttaaa ttaaggatgt gtactttaat gtgatgcagc ttgcaaagct 360
ctagtcactt tgttatcagc atccatgtaa ttgtagattg agaagctcaa ataagccatc 420
accagaatcc aaagcatcaa aagctttggg aaccaagctc tgtaagcctg aataaaagtg 480
aagccctttt tggcccccat ttgctcattc aacctcacag ccacagagtg gtggctctgc 540
atcttcaaat tcccacccat caccacaact tcaactacct ctttgcttct 590
<210> 3
<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catattattc aggtacattc tgatttcatt atcttcctac ttggttaaat ttcaacatgt 60
aatactattt ttggcttcaa acatttaaat taaggatgtg tactttaatg tgatgcagct 120
tgcaaagc 128
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agaagcaaag aggtagttga ag 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cactttgtta tcagcatcca tg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cactttgtta tcagcatcca tg 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agaagcaaag aggtagttga ag 22
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggactctgca ggtcgaccat attattcagg tacattc 37
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgtgatgcag cttgcaaagc tctagagatc gttcaaa 37
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggactctgca ggtcgacaga agcaaagagg tagttgaag 39
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgaataatat ggtcgaacac tttgttatca gcatccatg 39
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcttgcaaag ctctagtcac tttgttatca gcatccatg 39
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tttgaacgat ctctagaaga agcaaagagg tagttgaag 39

Claims (4)

1. 森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段在延缓草莓叶片衰老中的应用，其特征在于，所述RNA干扰片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RNA干扰片段核苷酸序列位于NCBI登录号为XM_004297360的FveHK4序列675~899bp区域。
3.包括权利要求1所述森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的植物抑制表达载体GN2300-FveHK4在延缓草莓叶片衰老中的应用。
4.包括权利要求1所述森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的转基因工程菌在延缓草莓叶片衰老中的应用。
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