BR122018000387B1

BR122018000387B1 - Molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira bacteriana, e método para proteção de uma planta contra uma praga

Info

Publication number: BR122018000387B1
Application number: BR122018000387-1A
Authority: BR
Inventors: Nadine Carozzi; Nalini Desai; Daniel J. Tomso
Original assignee: Athenix Corp.
Priority date: 2007-10-10
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2019-05-21
Also published as: EP2198030A2; CA2702231A1; CN101821395B; BRPI0817854B1; CN101821395A; AU2008310796B2; WO2009049126A2; BRPI0817854A2; CA2702231C; EP2198030B1; MX2010003891A; CN103540599A; AU2008310796A1; WO2009049126A3; EP2728006B1; US20090126044A1; ZA201002505B; EP2728006A2; EP2728006A3; AR068847A1

Abstract

a presente invenção se refere a composições e métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células de planta, tecidos e sementes. são fornecidas composições contendo uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica uma proteína cry1ac. as sequências codificadoras podem ser usadas em construtos de dna ou cassetes de expressão para transformação e expressão em plantas e bactérias. as composições também incluem bactérias, plantas, células de planta, tecidos e sementes transformadas. em particular, moléculas de ácido nucleico pesticida isolado são fornecidas, em que as sequências de nucleotídeos estão descritas nas seq id no:5, 1, 2, 3 ou 4, assim como suas variantes e fragmentos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA BACTERIANA, E MÉTODO PARA PROTEÇÃO DE UMA PLANTA CONTRA UMA PRAGA.

[0001] Dividido do PI0817854-2, depositado em 10.10.2008. CAMPO DA INVENÇÃO [0002] A presente invenção se refere ao campo da biologia molecular. São fornecidas novas sequências de nucleotídeos que codificam proteínas pesticidas. Essas proteínas e as sequências de ácido nucleico que as codificam são úteis na preparação de formulações pesticidas e na produção de plantas transgênicas resistentes a pragas. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0003] O Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva do solo que forma esporo caracterizada por sua habilidade de produzir inclusões cristalinas que são especificamente tóxicas para certas ordens e espécies de insetos, mas não são prejudiciais para plantas e outros organismos não intencionados. Por essa razão, as composições que incluem as cepas de Bacillus thuringiensis ou suas proteínas inseticidas podem ser usadas como inseticidas ambientalmente aceitáveis para controlar pragas de insetos agrícolas ou vetores de inseto para uma variedade de doenças humanas e de animais.

[0004] O uso de culturas comerciais, transgênicas que expressam toxinas de Bacillus thuringiensis (Bt) tem aumentado nos anos recentes por causa de suas vantagens sobre os inseticidas químicos tradicionais. Entretanto, genes cry nativos têm uma capacidade de codificação pobre em plantas (Murray et ai. (1991) Plant Mol. Biol. 16, 10351050). Várias estratégias têm sido desenvolvidas para aumentar a expressão de genes de Bt. Essas incluem o uso da líder da subunidade pequena de Arabidopsis thaliana e peptideo de trânsito para aumentar a transcrição e a eficiência de tradução (Wong et ai., (1992) Plant Mol

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Biol. 20, 81-93), a combinação do promotor 35S e do íntron da semente da mamona (Fujimoto et al. (1993) Bio/Technology 11:1151-1155) e a amplificação do gene da toxina em cloroplastos (McBride et al. (1995) Bio/Technology 13, 362-365), assim como modificações de utilização de códon para combinar a preferência de códon em plantas (Fujimoto et al. (1993); Wünn et al. (1996) Bio/Technology 14:171-176; Nayak et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sei USA 94:2111-2116; Sardana et al. (1996) Plant Cell Rep. 15, 677-681; Perlak et al. (1990) Bio/Technology 8, 939-943; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei USA 88, 3324-3328).

[0005] Desde a sua comercialização em 1996, plantas de algodão transgênicas contendo uma forma modificada do gene crylAc da bactéria do solo, Bacillus thuringiensis Berliner (Bt) (Bollgard®, Monsanto Co. St. Louis, MO) têm sido intensamente usadas para controlar pragas de lepidópteros. Entretanto, algumas heliotinas são adequadamente controladas com essa tecnologia (Bacheler e Mott (1997) Em: Dugger P. Richter D, Eds. Beltwide Cotton Conference Proceedings, pp 858-861. Memphis: National Cotton Council; Smith (1998) Em: Dugger P. Richter D, Eds. Beltwide Cotton Conference Proceedings, pp 965-966. Memphis: National Cotton Council) e a diferença tem sido atribuída a níveis variáveis de CrylAc.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0006] Composições e métodos para conferir atividade pesticida a bactérias, plantas, células de planta, tecidos e sementes são fornecidos. As composições incluem moléculas de ácido nucleico sintético que codificam polipeptídeos pesticidas e inseticidas de CrylAc, vetores que compreendem essas moléculas de ácido nucleico e as células hospedeiras que compreendem os vetores. As sequências de nucleotídeos podem ser usadas em construtos de DNA ou cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, incluindo

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3/50 micro-organismos e plantas. As sequências sintéticas de nucleotídeos são designadas para expressão em um organismo incluindo, mas não limitado a um micro-organismo ou uma planta. As composições também compreendem bactérias, plantas, células de planta, tecidos e sementes transformadas.

[0007] Em particular, as moléculas de ácido nucleico isolado sintético que são fornecidas codificam uma proteína pesticida CrylAc. Em particular, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolado compreendendo a sequência de nucleotídeos descrita nas SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 ou 5. As sequências de nucleotídeo que são complementares a uma sequência de nucleotídeos da invenção ou que hibridizam com uma sequência da invenção também são abrangidas.

[0008] São fornecidos métodos para a produção de polipeptídeos da invenção e para usar esses polipeptídeos para controlar ou matar uma praga de lepidóptero. Os métodos e kits para detectar os ácidos nucleicos e polipeptídeos da invenção em uma amostra também são incluídos.

[0009] As composições e métodos da invenção são úteis para a produção de organismos com uma resistência ou tolerância intensificada a uma praga pelo aperfeiçoamento do nível de expressão da proteína CrylAc no organismo. Esses organismos e composições que compreendem os organismos são desejáveis para propósitos agrícolas. As composições da invenção são úteis também para a geração de proteínas alteradas ou aperfeiçoadas que têm atividade pesticida ou para detectar a presença de proteínas ou ácidos nucleicos pesticidas em produtos ou organismos.

DESCRIÇÃO DETALHADA [00010] A presente invenção está direcionada para composições e métodos para regular a resistência ou tolerância a pragas em organismos, particularmente plantas ou células de planta. Por resistência

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4/50 é pretendido que a praga (por exemplo, inseto) seja morta depois da ingestão ou outro contato com os polipeptídeos da invenção. Por tolerância é pretendido uma deficiência ou redução no movimento, alimentação, reprodução ou outras funções da praga.

[00011] Os métodos envolvem a transformação de organismos com uma sequência de nucleotídeos sintética que codifica a proteína pesticida CrylAc da invenção. Vários relatos discutem problemas com a expressão e/ou a toxicidade de crylAc nativo, assim como várias versões modificadas que codificam CrylAc. Veja, por exemplo, Barton et al. (1987) Plant Physiol. 85:1103-1109, Publicação de Patente dos Estados Unidos N° 20010003849 e Patente dos Estados Unidos N° 6.121.014, cada uma das quais está incorporada aqui por referência em toda sua totalidade. São fornecidas aqui sequências de nucleotídeos úteis para a preparação de plantas e micro-organismos que possuem atividade pesticida. Portanto, as bactérias, plantas, células de planta, tecidos de planta e sementes transformadas são fornecidos. As sequências encontram uso na construção de vetores de expressão para a transformação subsequente em organismos de interesse, como sondas para o isolamento de outros genes homólogos (ou parcialmente homólogos) e para a geração de proteínas pesticidas alteradas por métodos conhecidos na técnica, tais como troca de domínio ou embaralhamento de DNA. As proteínas encontram uso no controle ou morte de populações de pragas de lepidópteros e para a produção de composições com atividade pesticida.

Moléculas de Ácido Nucleico Isolado [00012] Um aspecto da invenção se refere a moléculas de ácido nucleico sintético ou recombinante que compreendem sequências de nucleotídeo que codificam proteínas e polipeptídeos CrylAc, assim como moléculas de ácido nucleico suficientes para uso como sondas de hibridização para identificar moléculas de ácido nucleico que codifiPetição 870180001581, de 08/01/2018, pág. 30/79

5/50 cam proteínas com regiões de homologia de sequência. Como usada aqui, a expressão molécula de ácido nucleico pretende incluir moléculas de DNA (por exemplo, DNA recombinante, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos dos DNA ou RNA gerados usando análogos de nucleotideos. A molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples ou de fita dupla, mas preferivelmente é um DNA de fita dupla.

[00013] As sequências de nucleotideos que codificam as proteínas da presente invenção incluem a sequência descrita na SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 ou 5 e seus complementos. Por complemento é entendido uma sequência de nucleotideos que é suficientemente complementar a uma dada sequência de nucleotideos tal que pode hibridizar com a sequência de nucleotideos dada para, dessa maneira, formar um dúplice estável. A sequência de aminoácidos correspondente para a proteína pesticida codificada por essas sequências de nucleotideos está descrita na SEQ ID NO:6.

[00014] As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos dessas sequências de nucleotideos que codificam proteínas pesticidas CrylAc também são abrangidas pela presente invenção. Por fragmento é entendido uma porção da sequência de nucleotideos que codifica uma proteína pesticida. Um fragmento de uma sequência de nucleotideos pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida, ou pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador de PCR usando os métodos descritos abaixo. As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma sequência de nucleotideos que codificam uma proteína pesticida compreendem, pelo menos cerca de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 nucleotideos contíguos ou até o número de nucleotideos presentes na sequência de extensão completa que codifica a proteína CrylAc aqui descrita, dependendo do

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QI50 uso pretendido. Por nucleotideos contíguos são entendidos resíduos de nucleotideos que são imediatamente adjacentes um ao outro. Os fragmentos das sequências de nucleotideos da presente invenção codificarão fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica da proteína pesticida e, portanto, retêm a atividade pesticida. Por reter a atividade é pretendido que o fragmento codificará uma proteína que tenha pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade pesticida da proteína pesticida. Em uma modalidade, a atividade pesticida é atividade contra lepidópteros. Métodos para medir a atividade pesticida são bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; Patente U.S. N° 5.743.477, todos os quais estão incorporados aqui por referência em toda sua totalidade.

[00015] Um fragmento de uma sequência de nucleotideos que codifica uma proteína pesticida CrylAc que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína da invenção codificará, pelo menos, cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350,

400, 450 aminoácidos contíguos ou até o número total de aminoácidos presentes em uma proteína CrylAc de extensão completa.

[00016] Em várias modalidades, as sequências de nucleotídeo de crylAc sintético descritas aqui resultam na produção de um nível de

CrylAc em um organismo que é pelo menos cerca de 5% maior, pelo menos cerca de menos cerca de menos cerca de menos cerca de

10% maior, pelo 30% maior, pelo 50% maior, pelo 70% maior, pelo menos cerca de menos cerca de menos cerca de menos cerca de

20% maior, pelo

40% maior, pelo

60% maior, pelo

80% maior, pelo menos cerca de 90% maior, pelo menos cerca de 100% maior, pelo menos cerca de 150% maior, pelo menos cerca de 200% ou maior, ou

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7/50 pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes ou mais do que o nível da proteína CrylAc produzida em um organismo que expresse o gene crylAc nativo (N° de Acesso GENBANK BTU87793: SEQ ID NO:8).

[00017] As proteínas pesticidas preferidas da presente invenção são codificadas por uma sequência de nucleotideos suficientemente idêntica à sequência de nucleotideos de SEQ ID NO:1,2, 3 4 ou 5. Por suficientemente idêntica é pretendida uma sequência de aminoácidos ou nucleotideos que tem pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% ou mais de identidade de sequência comparada com uma sequência de referência usando um dos programas de alinhamento aqui descritos usando parâmetros padronizados. Aquele versado na técnica reconhecerá que esses valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar a identidade das proteínas correspondentes codificadas pelas duas sequências de nucleotideos , levando em consideração a degeneração de códon, a similaridade de aminoácido, o posicionamento da fase de leitura e semelhantes.

[00018] Para determinar o percentual de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para os propósitos de comparação ótima. O percentual de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (isto é, percentual de identidade = número de posições idênticas/número total de posições (por exemplo, posições superpostas) x 100). Em uma modalidade, as duas sequências têm a mesma extensão. O percentual de identidade

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8/50 entre duas sequências pode ser determinado usando técnicas similares àquelas descritas abaixo com ou sem a permissão de lacunas. No cálculo do percentual de identidade, combinações tipicamente exatas são contadas.

[00019] A determinação do percentual de identidade entre duas sequências pode ser obtida usando um algoritmo matemático. Um exemplo não-limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação das duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl, Acad. Sei. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo está incorporado nos programas BLASTN e BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. As pesquisas de nucleotideos com BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, escore=100, extensão da palavra = 12, para se obter sequências de nucleotideos homólogas a moléculas de ácido nucleico semelhantes à pesticida da invenção. As pesquisas de proteína com BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, escore=50, extensão da palavra = 3, para se obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína pesticida da invenção. Para se obter alinhamentos com lacunas para os propósitos de comparação, Gapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-Blast também pode ser usado para realizar uma pesquisa interativa que detecta relacionamentos distantes entre moléculas. Veja, Altschul et al. (1997) supra. Quando utilizar os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros predeterminados dos respectivos programas (por exemplo, BLASTX e BLASTN) podem ser usados. O alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.

[00020] Outro exemplo não-limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo ClustalW

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9/50 (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara sequências e alinha a totalidade da sequência de aminoácidos ou DNA e, portanto, pode fornecer dados a cerca da conservação da sequência da sequência de aminoácidos completa. O algoritmo ClustalW é usado em vários pacotes de programas de análise de aminoácidos/DNA, tais como o módulo ALIGNX do Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Depois do alinhamento das sequências com ClustalW, o percentual de identidade de aminoácidos pode ser avaliado. Um exemplo não-limitante de um programa útil para a análise de alinhamentos de ClustalW é GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite a avaliação de similaridade de aminoácidos (ou DNA) e identidade entre múltiplas proteínas. Outro exemplo não-limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Tal algoritmo está incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versão 10 (disponibilizado por Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USA). Quando utilizar o programa ALIGN para a comparação de sequências de aminoácidos, uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de extensão de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4 podem ser usadas.

[00021] A menos que estabelecido de outra maneira, GAP Versão 10, que usa o algoritmo de Needleham e Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48(3):443-453, será usado para determinar a identidade ou similaridade de sequência usando os seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeos usando GAP Weight de 50 e Length Weight de 3 e a matriz de escore nwsgapdna.cmp; % de identidade ou % de similaridade para uma sequência de aminoácidos usando GAP Weight de 8 e Length Weight de 3 e o programa de escore BLOSUM62. Programas equivalentes também poPetição 870180001581, de 08/01/2018, pág. 35/79

10/50 dem ser usados. Por programa equivalente é pretendido qualquer programa de comparação de sequência que, para quaisquer duas sequências em questão, gere um alinhamento que tem combinações idênticas de resíduo de nucleotideo e um percentual idêntico de identidade de sequência quando comparado ao alinhamento gerado por GAP Version 10.

[00022] A invenção também abrange moléculas de ácido nucleico variante. Variantes de sequências de nucleotídeos que codificam a proteína pesticida incluem aquelas sequências que codificam as proteínas pesticidas aqui descritas mas que diferem conservativamente por causa da degeneração do código genético, assim como aquelas que são suficientemente idênticas como discutidas acima. Variantes alélicas que ocorrem naturalmente podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem-conhecidas, tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização como descritas abaixo. Sequências de nucleotídeos variantes também incluem sequências de nucleotídeos derivadas sinteticamente que tenham sido geradas, por exemplo, pelo uso de mutagênese direcionada ao sítio, mas que ainda codificam as proteínas pesticidas descritas na presente invenção como discutido abaixo. Proteínas variantes abrangidas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é elas continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, ou seja, a atividade pesticida. Por retém a atividade é pretendido que a variante tenha pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80% da atividade pesticida da proteína CrylAc nativa. Os métodos para medição da atividade pesticida são bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et a!., (1998) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al., (1985), J. of Economic Entomology 78:290-293; e Patente U.S. N° 5.743.477, todos os quais estão

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11/50 incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[00023] O técnico experiente considerará que alterações podem ser introduzidas pela mutação das sequências de nucleotídeos da invenção, levando dessa maneira a alterações na sequência de aminoácidos das proteínas pesticidas codificadas, sem alterar a atividade biológica das proteínas. Portanto, moléculas de ácido nucleico isolado variante podem ser criadas pela introdução de uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeos na sequência de nucleotídeos correspondente aqui descrita, tal que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos sejam introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por técnicas padronizadas, tais como mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênese mediada por PCR. Tais sequências de nucleotídeos variantes também são abrangidas pela presente invenção.

[00024] Por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos podem ser feitas em ou mais resíduos de aminoácidos preditos, não essenciais. Um resíduo de aminoácido não essencial é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência de tipo selvagem de uma proteína pesticida sem alterar a atividade biológica, enquanto que um resíduo de aminoácido essencial é necessário para a atividade biológica. Uma substituição de aminoácido conservativa é aquela na qual o resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais similares estão bem-definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano),

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12/50 cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[00025] Delta-endotoxinas geralmente têm cinco domínios de sequência conservada e três domínios estruturais conservados (veja, por exemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). O primeiro domínio estrutural conservado consiste em sete hélices alfa e está envolvido na inserção de membrana e formação de poro. O domínio II consiste em três fitas beta arranjadas na configuração de mosaico grego e o domínio III consiste em duas fitas beta antiparalelas com a disposição de fitas de gelatina (de Maagd et al., 2001, supra). Os domínios II e III estão envolvidos no reconhecimento e ligação do receptor e são, portanto, considerados determinantes da especificidade da toxina.

[00026] As substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não conservadas que retenham a função. Em geral, tais substituições não devem ser feitas com resíduos de aminoácidos conservados ou com resíduos de aminoácidos que residam dentro de um motivo conservado, onde tais resíduos são essenciais para a atividade da proteína. Exemplos de resíduos que são conservados e que podem ser essenciais para a atividade da proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas similares ou relacionadas às sequências da invenção. Exemplos de resíduos que são conservados, mas que permitem substituições conservativas de aminoácidos e ainda retêm a atividade incluem, por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas em um alinhamento de toxinas similares ou relacionadas às sequências da invenção. Entretanto, aquele versado na técnica entenderá que as variantes funcionais podem ter alterações conservadas menores ou não conservadas nos re

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13/50 síduos conservados.

[00027] Alternativamente, sequências de nucleotídeos variantes podem ser feitas pela introdução de mutações aleatoriamente ao longo de toda ou de parte da sequência codificadora, tais como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser rastreados quanto à habilidade de conferir atividade pesticida para identificar os mutantes que retêm a atividade. Depois da mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa recombinantemente e a atividade da proteína pode ser determinada usando técnicas de ensaio padrão.

[00028] Usando métodos tais como PCR, hibridização e semelhantes, as sequências pesticidas correspondentes podem ser identificadas, tais sequências apresentando identidade substancial com as sequências sintéticas de crylAc da invenção. Veja, por exemplo, Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

[00029] Em um método de hibridização, toda ou parte da sequência de nucleotídeos sintética de crylAc pode ser usada para rastrear bibliotecas de cDNA ou genômicas. Métodos para a construção de tais bibliotecas de cDNA e genômica são geralmente conhecidos na técnica e estão descritos em Sambrook e Russell, 2001, supra. As assim chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser marcadas com um grupo detectável tal como ³²P ou qualquer outro marcador detectável, tais como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofator enzimático. As sondas para hibridização podem ser feitas pela marcação de oligonucleotídeos sintéticos com base nas sequências de nucleotídeos sintéticas de crylAc aqui descritas. Iniciadores degenerados designa

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14/50 dos com base em nucleotideos conservados ou resíduos de aminoácidos na sequência de nucleotideos ou na sequência de aminoácidos codificada podem ser adicionalmente usados. A sonda compreende, tipicamente, uma região da sequência de nucleotideos que hibridiza sob condições estringentes a pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotideos consecutivos das sequências de nucleotideos sintéticas de crylAc da invenção ou um fragmento ou a uma variante dessas. Os métodos para a preparação de sondas de hibridização são geralmente conhecidos na técnica e estão descritos em Sambrook e Russell, 2001, supra, incorporado aqui por referência.

[00030] Por exemplo, uma sequência inteira de proteína pesticida aqui descrita, ou uma ou mais de suas porções, podem ser usadas como uma sonda capaz de hibridizar com as sequências semelhantes as da proteína pesticida correspondente e RNAs mensageiros. Para se obter a hibridização específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas e que preferivelmente têm pelo menos cerca de 10 nucleotideos de extensão ou pelo menos cerca de 20 nucleotideos de extensão. Tais sondas podem ser usadas para amplificar as sequências pesticidas correspondentes a partir de um organismo escolhido por PCR. Essa técnica pode ser usada para isolar sequências codificadoras adicionais de um organismo desejado ou como um ensaio diagnóstico para determinar a presença de sequências codificadoras em um organismo. As técnicas de hibridização incluem o rastreamento da hibridização de bibliotecas de DNA plaqueado (tanto placas quanto colônias; veja, por exemplo, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (2^a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

[00031] A hibridização de tais sequências pode ser realizada sob condições estringentes, Por condições estringentes ou condições

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15/50 estringentes de hibridização é entendido condições sob as quais uma sonda hibridizará com sua sequência-alvo em um grau detectavelmente maior do que de outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre o precedente). Condições estringentes são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Pelo controle da estringência de hibridização e/ou das condições de lavagem, as sequências-alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguns não pareamentos nas sequências tal que graus menores de similaridade são detectados (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda tem menos do que cerca de 1000 nucleotideos de extensão, preferivelmente menos do que 500 nucleotideos de extensão.

[00032] Tipicamente, as condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor do que cerca de 1,5 M de íon de Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon de Na (ou outro sal) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotideos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleotideos). As condições estringentes podem ser obtidas também com a adição de agentes desestabilizadores tal como a formamida. Condições de baixa estringência exemplares incluem hibridização com uma solução tampão de formamida 30 a 35%, NaCI 1M, SDS 1% (dodecil sulfato de sódio) a 37°C e uma lavagem com 1X a 2X SSC(20X SSC = NaCI 3,0 M/citrato trissódico 0,3 M) de 50 a 55°C. Condições moderadas de estringência exemplares incluem hibridização em formamida 40 a 45%, NaCI 1M, SDS 1% a 37°C e uma lavagem com 0,5X a 1X SSC de 55 a 60°C. Condições de alta estringência exemplares incluem hibridização em formamida 50%, NaCI 1M, SDS 1% a 37°C e uma lavagem com 0,1X SSC de 60 a 65°C. Opcionalmen

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16/50 te, os tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração da hibridização é geralmente menor do que 24 horas, geralmente cerca de 4 a cerca de 12 horas.

[00033] A especificidade é tipicamente a função das lavagens póshibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e a temperatura da solução final de lavagem. Para híbridos de DNA-DNA, a T_m pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: T_m = 81,5°C + 16,6(log M) + 0,41 (%GC) 0,61 (% form) - 500/L; onde M é a molaridade dos cátions monovalentes, %GC é o percentual de nucleotideos guanosina e citosina no DNA, % form é o percentual de formamida na solução de hibridização e L é a extensão do híbrido em pares de bases. A T_m é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma sequência-alvo complementar hibridiza a uma sonda perfeitamente pareada. A T_m é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de não pareamento; portanto, a T_m, hibridização e/ou as condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar sequências da identidade desejada. Por exemplo, se as sequências com >90% de identidade são procuradas, a T_m pode ser diminuída em 10°C. Geralmente, as condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5°C menores do que o ponto de fusão térmica (T_m) para a sequência específica e seu complemento em uma força iônica e pH definidos. Entretanto, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4°C abaixo do ponto de fusão térmica (T_m); condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°C abaixo do ponto de fusão térmica (T_m); condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20°C abaixo do ponto de fusão térmica (T_m). Usando a equação, as composições de hibridização e lavagem e a T_m desejada, aqueles versados na técnica compreenderão que variações na estrin

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17/50 gência da hibridização e/ou nas soluções de lavagem estão implicitamente descritas. Se o grau desejado de não pareamentos resulta em uma T_m menor do que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é preferido aumentar a concentração de SSC tal que uma temperatura maior possa ser usada. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hibridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elservier, New York); e Ausubekl et al., Eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York). Veja Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (2^a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Proteínas Isoladas e suas Variantes e Fragmentos [00034] Proteínas variantes de CrylAc também estão abrangidas dentro da presente invenção. Por proteína variante de CrylAc entende-se uma variante ou fragmento biologicamente ativo da sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO:6. Fragmentos ou porções biologicamente ativas incluem fragmentos de polipeptídeo que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO:6 e que exibem atividade pesticida. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína CrylAc pode ser um polipeptídeo, por exemplo, que tem 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 ou mais aminoácidos de extensão. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas quanto à atividade pesticida. Métodos para medição da atividade pesticida são bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; Patente U.S. N° 5.743.477, todos os quais estão incorporados aqui por referência em sua totalidade. Como usado

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18/50 aqui, um fragmento compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO:6. A invenção abrange outros fragmentos, entretanto, tal como qualquer fragmento na proteína maior do que cerca de 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 ou 300 aminoácidos.

[00035] Por variantes são designadas proteínas ou polipeptídeos que têm uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 60%. 65%, cerca de 70%, 75%, cerca de 80%, 85%, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a sequência de aminoácidos de NO:5. As variantes também incluem polipeptídeos codificados por uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com a molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO:1,2, 3, 4 ou 5 ou seu complemento, sob condições estringentes. Variantes incluem polipeptídeos que diferem na sequência de aminoácidos devido à mutagênese. Proteínas variantes abrangidas pela presente invenção são biologicamente ativas, ou seja, elas continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, ou seja, a retenção da atividade pesticida. Métodos para medição da atividade pesticida são bemconhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone etal. (1985) J. of Economic Entomology 78:290293; Patente U.S. N° 5.743.477, todos os quais estão incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[00036] Genes bacterianos, tais como os genes sintéticos crylAc dessa invenção, quase sempre possuem múltiplos códons de iniciação de metionina na proximidade do início da fase de leitura aberta. Geralmente, a iniciação da tradução em um ou mais desses códons de partida levará à geração de uma proteína funcional. Esses códons de partida podem incluir códons ATG. Entretanto, bactérias tais como Bacillus sp., também reconhecem o códon GTG como um códon de partida e as proteínas que iniciam a tradução em códons GTG contêm

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19/50 uma metionina no primeiro aminoácido. Além disso, não é frequentemente determinado, a priori, quais desses códons são usados naturalmente na bactéria. Portanto, é considerado que o uso de um dos códons de metionina alternativos nas sequências de nucleotídeos sintéticas aqui descritas também pode levar à geração de proteínas pesticidas.

[00037] Anticorpos para os polipeptídeos da presente invenção ou para variantes ou fragmentos desses também estão abrangidos. Métodos para a produção de anticorpos são bem-conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente U.S. N° 4.196.265).

Variantes Alteradas ou Aperfeiçoadas [00038] É reconhecido que as sequências de nucleotídeos sintéticas de crylAc aqui descritas podem ser alteradas por vários métodos e que essas alterações podem resultar em sequências de DNA que codificam proteínas com sequências de aminoácidos diferentes da proteína CrylAc nativa. Essa proteína pode ser alterada de várias maneiras incluindo substituições de aminoácidos, deleções, truncamentos e inserções de um ou mais aminoácidos de NO:5, incluindo até cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 105, cerca de 110, cerca de 115, cerca de 120, cerca de 125, cerca de 130, cerca de 135, cerca de 140, cerca de 145, cerca de 145, cerca de 150, cerca de 155 ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, variantes de sequências de aminoácidos de CrylAc po

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20/50 dem ser preparadas pelas mutações no DNA. Isso pode ser obtido também por uma das várias formas de mutagênese e/ou em evolução direta. Em alguns aspectos, as alterações codificadas na sequência de aminoácidos não afetarão substancialmente a função da proteína. Tais variantes possuirão a atividade pesticida desejada. Entretanto, é sabido que a habilidade de uma proteína pesticida em conferir atividade pesticida pode ser aperfeiçoada pelo uso de tais técnicas nas composições dessa invenção. Por exemplo, pode-se expressar uma proteína pesticida em células hospedeiras que exibem altas taxas de desincorporação de base durante a replicação do DNA, tal como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Depois da propagação de tais cepas, podese isolar o DNA (por exemplo, pela preparação de um plasmídeo de DNA ou pela amplificação por PCR e clonagem do fragmento resultante de PCR em um vetor), cultivar as mutações de proteína pesticida em uma cepa não mutagênica e identificar os genes mutados com atividade pesticida, por exemplo, pela realização de um ensaio para testar a atividade pesticida. Geralmente, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação. Veja, por exemplo, Marrone et al. (1985)

J. of Economic Entomology 78:290-293. Tais ensaios podem incluir contatar plantas com uma ou mais pragas e determinar a habilidade da planta para sobreviver e/ou causar a morte das pragas. Exemplos de mutações que resultam em toxicidade aumentada são encontrados em Schnepf etal. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

[00039] Alternativamente, podem ser feitas alterações na sequência da proteína de várias proteínas na terminação amino ou carbóxi sem afetar substancialmente a atividade. Isso pode incluir inserções, deleções ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, tais como PCR, incluindo amplificações por PCR que alteram ou estendem a sequência codificadora da proteína em virtude da inclusão de sequências que codificam aminoácidos nos oligonucleotídeos utili

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21/50 zados na amplificação por PCR. Alternativamente, as sequências de proteína adicionadas podem incluir as sequências codificadoras da proteína inteiras, tais como aquelas usadas comumente na técnica para a geração de proteínas de fusão. Tais proteínas de fusão são geralmente usadas para (1) aumentar a expressão de uma proteína de interesse, (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática ou epítopo para facilitar a purificação da proteína, a detecção da proteína ou outros usos experimentais conhecidos na técnica, (3) direcionar a secreção ou a tradução de uma proteína para uma organela subcelular, tal como o espaço periplasmático de bactérias Gram-negativas ou o retículo endoplasmático de células eucarióticas, o último dos quais resulta na glicosilação da proteína.

[00040] Sequências variantes de nucleotídeos e aminoácidos da presente invenção também abrangem as sequências derivadas de procedimentos mutagênicos ou de recombinação tais como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais regiões codificadoras de proteínas pesticidas diferentes podem ser usadas para criar uma nova proteína pesticida que possua as propriedades desejadas. Dessa maneira, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de sequências de polinucleotídeos relacionados que compreendem as regiões da sequência que têm identidade de sequência substancial e podem ser recombinadas homologamente in vitro ou in vivo. Por exemplo, usando essa abordagem, motivos de sequência que codificam um domínio de interesse podem ser embaralhados entre uma sequência sintética de crylAc da invenção e outros genes pesticidas conhecidos para se obter um novo gene que codifique uma proteína com a propriedade de interesse aperfeiçoada, tal como uma atividade inseticida aumentada. Estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-10751;

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Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; e Patentes U.S. N° 5.605.793 e 5.837.458. [00041] O intercâmbio ou o embaralhamento de domínio é outro mecanismo para a geração de proteínas pesticidas alteradas. Os domínios podem ser trocados entre proteínas pesticidas, resultando em toxinas híbridas ou quiméricas com atividade pesticida aperfeiçoada ou espectro direcionado. Métodos para a geração de proteínas recombinantes e para testá-las quanto à atividade pesticida são bem- conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:1795417958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

Vetores [00042] Uma sequência pesticida da invenção pode ser fornecida em um cassete de expressão para expressão em uma planta de interesse. Por cassete de expressão em planta é pretendido um construto de DNA que é capaz de resultar na expressão de uma proteína a partir de uma fase de leitura aberta em uma célula de planta. Tipicamente, esses contêm um promotor e uma sequência codificadora. Geralmente, tais construtos também conterão uma região 3' não traduzida, Tais construtos podem conter uma sequência de sinal ou sequência líder para facilitar o transporte cotraducional ou pós-traducional do peptideo para certas estruturas intracelulares tais como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático ou aparelho de Golgi.

[00043] Por sequência de sinal é pretendida uma sequência que é conhecida ou suspeita de resultar em transporte cotraducional ou póstraducional do peptideo através da membrana celular. Em eucariotos,

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23/50 isso envolve tipicamente a secreção no aparelho de Golgi, com alguma glicosilação resultante. Toxinas inseticidas de bactérias são geralmente sintetizadas como pró-toxinas, que são ativadas proteoliticamente no intestino da praga-alvo (Chang (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). Em algumas modalidades da presente invenção, a sequência de sinal está localizada na sequência nativa ou pode ser derivada de uma sequência da invenção. Por sequência líder é pretendido qualquer sequência que quando traduzida, resulte em uma sequência de aminoácidos suficiente para desencadear o transporte cotraducional da cadeia de peptídeo para uma organela subcelular. Portanto, isso inclui sequências líder que direcionam o transporte e/ou a glicosilação pela passagem no retículo endoplasmático, passagem para os vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastos, mitocôndrias e semelhantes.

[00044] Por vetor de transformação em planta é pretendido uma molécula de DNA que é necessária para a transformação eficiente de uma célula de planta. Tal molécula pode consistir em um ou mais cassetes de expressão em planta e pode ser organizada em mais do que um vetor de molécula de DNA. Por exemplo, vetores binários são vetores de transformação em planta que utilizam dois vetores de DNA não contíguos para codificar todas as funções que atuam em cis e trans necessárias para a transformação de células de planta (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Vetor se refere a um construto de ácido nucleico designado para transferência entre células hospedeiras diferentes. Vetor de expressão se refere a um vetor que tem a habilidade de incorporar, integrar e expressar sequências heterólogas de DNA ou fragmentos em uma célula estranha. O cassete incluirá sequências regulatórias 3' e 5' operativamente ligadas a uma sequência da invenção. Por operativamente ligada pretende-se uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda se

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24/50 quência, em que a sequência promotora inicia e media a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. Geralmente, operativamente ligada significa que as sequências de ácido nucleico a serem ligadas são contínuas e, quando necessário para ligar duas regiões que codificam proteína, contíguas e na mesma fase de leitura. O cassete pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional/adicionais pode/podem se fornecido(s) em múltiplos cassetes de expressão.

[00045] Promotor se refere a uma sequência de ácido nucleico que funciona para direcionar a transcrição de uma sequência codificadora a jusante. O promotor junto com outras sequências regulatórias transcricionais e traducionais de ácido nucleico (também denominadas (sequências de controle) são necessários para a expressão de uma sequência de DNA de interesse.

[00046] Tal cassete de expressão é fornecido com uma pluralidade de sítios de restrição para a inserção da sequência pesticida estar sob a regulação transcricional das regiões regulatórias.

[00047] O cassete de expressão incluirá na direção 5-3' da transcrição, uma região de iniciação transcricional e traducional (isto é, um promotor), uma sequência de DNA da invenção e uma região de terminação traducional e transcricional (isto é, região de terminação) funcionais em plantas. O promotor pode ser nativo ou análogo ou estranho ou heterólogo à planta hospedeira e/ou à sequência de DNA da invenção. Além disso, o promotor pode ser a sequência natural ou alternativamente uma sequência sintética. Onde o promotor é nativo ou homólogo à planta hospedeira, pretende-se que o promotor seja encontrado na planta nativa na qual o promotor é introduzido. Onde o promotor é estranho ou heterólogo à sequência de DNA da invenção, pretende-se que o promotor não seja nativo ou de ocorrência na

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25/50 tural para a sequência de DNA operativamente ligada da invenção. [00048] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação transcricional, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse operativamente ligada, pode ser nativa com a planta hospedeira ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, a sequência de DNA de interesse, a planta hospedeira ou qualquer combinação desses). Regiões de terminação convenientes estão disponíveis no plasmídeo Ti de A. tumefasciens, tais como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Veja também Guerineau et al (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acid Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

[00049] Em um aspecto da invenção, sequências sintéticas de DNA são designadas para um dado polipeptídeo, tais como as sequências sintéticas de DNA de crylAc aqui descritas. A expressão da fase de leitura aberta da sequência sintética de DNA em uma célula resulta na produção do polipeptídeo da invenção. Sequências sintéticas de DNA podem ser úteis para simplesmente remover sítios de restrição de endonucleases indesejáveis, para facilitar as estratégias de clonagem do DNA, para alterar ou remover qualquer desvio de códon potencial, para alterar ou melhorar o conteúdo de GC, para remover ou alterar fases de leitura alternativas e/ou para alterar ou remover sítios de reconhecimento de splice de intron/exon, sítios de poliadenilação, sequências de Shine-Delgarno, elementos promotores indesejados e semelhantes que podem estar presentes na sequência nativa de DNA. Também é possível que sequências sintéticas de DNA possam ser utilizadas para introduzir outros aperfeiçoamentos a uma sequência de DNA, tais como a introdução de uma sequência de intron, a criação de

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26/50 uma sequência de DNA que é expressa como uma proteína de fusão para sequências que visam a organela, tais como peptídeos de trânsito no cloroplasto, peptídeos que visam apoplasto/vacuolar ou sequências de peptídeo que resultam na retenção do peptídeo resultante no retículo endoplasmático. Genes sintéticos também podem ser sintetizados usando os códons preferidos da célula hospedeira para a expressão melhorada ou podem ser sintetizados usando códons com uma frequência de utilização preferida pelo hospedeiro. Veja, por exemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11; Patentes U.S. N° 6.320.100; 6.075.185; 5.380.831; e 5.436.391; Pedidos Publicados U.S. N° 20040005600 e 20010003849 e Murray et al (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporados aqui por referencia.

[00050] Em uma modalidade, a proteína pesticida é direcionada ao cloroplasto para expressão. Dessa maneira, onde a proteína pesticida não é diretamente inserida no cloroplasto, o cassete de expressão conterá adicionalmente um ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito para direcionar a proteína pesticida para os cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol Biol Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah et al (1986) Science 233:478-481. [00051] O gene pesticida a ser direcionado para o cloroplasto pode ser otimizado para a expressão no cloroplasto para ser responsável por diferenças na utilização de códon entre o núcleo da planta e essa organela. Dessa maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados usando os códons preferidos do cloroplasto. Veja, por exemplo, Patente U.S, N° 5.380.831, incorporada aqui por referência. Transformação de Planta [00052] Os métodos da invenção envolvem a introdução de um

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27/50 construto de nucleotídeo em uma planta. Por introdução pretende-se apresentar à planta o construto de nucleotídeo de tal maneira que o construto consiga acessar o interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não requerem que um método particular para a introdução de um construto de nucleotídeo em uma planta seja usado, apenas que o construto de nucleotídeo obtenha acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para a introdução de construtos de nucleotídeo em plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a métodos de transformação estáveis, métodos de transformação transitórios e métodos mediados por vírus.

[00053] Por planta é pretendido plantas completas, órgãos de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc), sementes, células de planta, propágulos, embriões e a progênie da mesma. Células de planta podem ser diferenciadas ou indiferenciadas (por exemplo, calo, suspensão de células em cultura, protoplastos, células de folha, células da raiz, células do floema, pólen).

[00054] Plantas transgênicas ou plantas transformadas ou plantas estavelmente transformadas ou células ou tecidos referem-se a plantas que incorporaram ou integraram sequências de ácido nucleico exógeno ou fragmentos de DNA na célula da planta. Essas sequências de ácidos nucleicos incluem aquelas que são exógenas ou não presentes na célula de planta não transformada, assim como aquelas que podem ser endógenas ou presentes na célula de planta não transformada. Heterólogo se refere geralmente a sequências de ácidos nucleicos que não são endógenas da células ou parte do genoma nativo no qual elas estão presentes e que tenham sido adicionadas à célula por infecção, transfecção, microinjeção, eletroporação, microprojéteis ou semelhantes.

[00055] A transformação de células de planta pode ser obtida por uma das várias técnicas conhecidas. O gene pesticida da invenção

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28/50 pode ser modificado para obter ou intensificar a expressão em plantas. Tipicamente um construto que expresse tal proteína conterá um promotor para direcionar a transcrição do gene, assim como uma região 3' não traduzida para permitir a terminação da transcrição e a poliadenilação. A organização de tais construtos é bem-conhecida na técnica. Em alguns exemplos, ela pode ser útil para manipular o gene tal que o peptídeo resultante é secretado ou direcionado de outra maneira dentro da célula da planta. Por exemplo, um gene pode ser manipulado para conter um peptídeo de sinal para facilitar a transferência do peptídeo para o retículo endoplasmático. Também pode ser preferível manipular o cassete de expressão em planta para conter um íntron, tal que o processamento do mRNA do intron seja necessário para a expressão.

[00056] Tipicamente, esse cassete de expressão em planta será inserido em um vetor de transformação em planta. Esse vetor de transformação em planta pode ser compreendido por um ou mais vetores de DNA necessários para obter a transformação da planta. Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar vetores de transformação em planta que são constituídos por mais do que um segmento contíguo de DNA. Esses vetores são geralmente referidos na técnica como vetores binários. Vetores binários, assim como vetores com plasmídeos auxiliares, são mais frequentemente usados para a transformação mediada por Agrobacterium, onde o tamanho e a complexidade dos segmentos de DNA necessários para se obter a transformação eficiente é bastante grande e é vantajoso separar as funções sobre moléculas de DNA separadas. Os vetores binários contêm tipicamente um vetor de plasmídeo que contém as sequências que atuam em cis necessárias para a transferência de T-DNA (tal como a borda esquerda e a borda direita), um marcador selecionável que é manipulado para ser capaz de expressão em uma célula de planta e um gene

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29/50 de interesse (um gene manipulado para ser capaz de expressão em uma célula de planta para a qual a geração de plantas transgênicas é desejada). Também estão presentes nesse vetor de plasmídeo as sequências necessárias para a replicação bacteriana. As sequências que atuam em cis são arranjadas em uma configuração para permitir a transferência eficiente em células de planta e a expressão nesse local. Por exemplo, o gene marcador selecionável e o gene pesticida estão localizados entre as bordas esquerda e direita. Frequentemente, um segundo vetor de plasmídeo contém fatores que atuam em trans que mediam a transferência de T-DNA de Agrobacterium para células de planta. Esse plasmídeo contém, geralmente, as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção de células de planta por Agrobacterium e a transferência de DNA pela divagem das sequências da borda e transferência de DNA mediada por vir, como é conhecido na técnica (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446451). Vários tipos de cepas de Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser usados na transformação de planta. O segundo vetor de plasmídeo não é necessário para transformar a planta pelos outros métodos tais como micro-projéteis, microinjeção, eletroporação, polietileno glicol, etc.

[00057] Em geral, os métodos para transformação de planta envolvem a transferência de DNA heterólogo para as células da planta-alvo (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, calo indiferenciado, protoplasto, etc.), seguida pela aplicação de um nível limiar máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador selecionável) para recuperar as células da planta transformada a partir de uma massa de células não transformadas. Os explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em brotos depois da colocação em meio de re

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30/50 generação suplementado com um nível máximo de agente de seleção. Os brotos são transferidos depois para um meio de enraizamento seletivo para recuperar um broto enraizado ou plântula. A plântula transgênica é cultivada até uma planta madura e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Os explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Uma descrição geral das técnicas e métodos para a geração de plantas transgênicas é encontrada em Ayres and Park (1994) Criticai Reviews in Plant Science 13:219-239 e Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Como o material transformado contém várias células, ambas, as células transformadas e não transformadas, estão presentes em qualquer pedaço do calo ou tecido ou grupo de células. A habilidade para matar células não transformadas e permitir que as células transformadas proliferem resulta em culturas de plantas transformadas. Geralmente, a habilidade para remover as células não transformadas é uma limitação à rápida recuperação de células de planta transformadas e a geração bem-sucedida de plantas transgênicas.

[00058] Os protocolos de transformação assim como os protocolos para a introdução de sequências de nucleotídeos em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou de célula de planta, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, marcada para a transformação. A geração de plantas transgênicas pode ser realizada por um de vários métodos, incluindo mas não limitado a microinjeção, eletroporação, transferência direta de gene, introdução de DNA heterólogo por Agrobacterium em células de planta (transformação mediada por Agrobacterium), bombardeio de células de planta com DNA heterólogo estranho aderido a partículas, aceleração de partícula balística, transformação com jato de aerossol (Pedido Publicado U.S. N° 20010026941; Patente

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U.S. N° 4.945.050; Publicação Internacional N° WO 91/00915; Pedido Publicado U.S. N° 2002015066), transformação com Lec1 e vários outros métodos diretos não mediados por partícula para transferir DNA. [00059] Os métodos para a transformação de cloroplastos são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Svab et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sei USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J 12:601606. O método conta com a liberação por uma arma de partícula de DNA contendo um marcador selecionável e com o direcionamento do DNA para o genoma do plastídeo através de recombinação homóloga. Além disso, a transformação do plastídeo pode ser obtida pela transativação de um transgene silencioso gerado no plastídeo pela expressão no tecido preferido de uma RNA polimerase nuclear codificada e direcionada ao plastídeo. Tal sistema foi descrito em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei USA 91:7301-7305.

[00060] Depois da integração do DNA estranho heterólogo nas células de planta, pode-se aplicar depois um nível de limite máximo de seleção apropriada no meio para matar as células não transformadas e separar e proliferar as células transformadas putativamente que sobrevivem a esse tratamento de seleção pela transferência regular para um meio fresco. Pela passagem contínua e inoculação com a seleção apropriada, as células que estão transformadas com o vetor de plasmídeo são identificadas e proliferadas. Métodos moleculares e bioquímicos podem então ser usados para confirmar a presença do gene heterólogo de interesse integrado no genoma de uma planta transgênica.

[00061] As células que foram transformadas podem ser desenvolvidas em plantas de acordo com meios convencionais. Veja, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Essas plantas podem, portanto, ser cultivadas e polinizadas tanto com a mesma li

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32/50 nhagem transformada ou com linhagens diferentes e o híbrido resultante que tem a expressão constitutiva da característica fenotípica desejada é identificado. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida e herdada estavelmente e depois que as sementes coletadas para assegurar a expressão da característica fenotípica desejada tenham sido obtidas. Dessa maneira, a presente invenção fornece uma semente transformada (também referida como semente transgênica) que tem um construto de nucleotideos da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporado estavelmente ao seu genoma.

Avaliação da Transformação de Planta [00062] Depois da introdução do DNA estranho heterólogo nas células de plantas, a transformação ou integração do gene heterólogo no genoma da planta é confirmada por vários métodos tais como a análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabolitos associados com o gene integrado.

[00063] A análise com PCR é um método rápido para rastrear as células, tecidos ou brotos transformados quanto à presença do gene incorporado no estágio precoce antes do transplante para o solo. (Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). PCR é realizada usando iniciadores de oligonucleotídeos específicos para o gene de interesse ou vetor de Agrobacterium, etc.

[00064] A transformação da planta pode ser confirmada pela análise Southern blot de DNA genômico ((Sambrook and Russell, 2001, supra). Em geral, o DNA total é extraído do transformante, digerido com as enzimas de restrição apropriadas, fracionado em um gel de agarose e transferido para uma membrana de nitrocelulose ou nylon. A membrana ou blot é sondado depois, por exemplo, com um fragmen

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33/50 to de DNA marcado com ³²P para confirmar a integração do gene introduzido no genoma da planta de acordo com técnicas padrão (Sambrook and Russell, 2001, supra).

[00065] Na análise Northern blot, o RNA é isolado de tecidos específicos do transformante, fracionado em um gel de agarose e formaldeído e transferido para um filtro de nylon de acordo com procedimentos padrão que são rotineiramente usados na técnica (Sambrook and Russell, 2001, supra). A expressão do RNA codificado pelo gene pesticida é testada depois pela hibridização do filtro com uma sonda radioativa derivada de um gene pesticida, por métodos conhecidos na técnica (Sambrook and Russell, 2001, supra).

[00066] Western blot, ensaios bioquímicos e semelhantes podem ser realizados em plantas transgênicas para confirmar a presença da proteína codificada pelo gene pesticida por procedimentos padrão (Sambrook and Russell, 2001, supra) usando anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos presentes na proteína pesticida.

Atividade Pesticida em Plantas [00067] Em outro aspecto da invenção, pode-se gerar plantas transgênicas que expressam uma proteína pesticida que tem atividade pesticida, Os métodos descritos acima como meio de exemplo podem ser utilizados para gerar as plantas transgênicas, mas a maneira pela qual as células da planta transgênica são geradas não é crítica nessa invenção. Os métodos conhecidos ou descritos na técnica, tais como transformação mediada por Agrobacterium, transformação biolística e métodos não mediados por partícula podem ser usados a critério do experimentador. As plantas que expressam uma proteína pesticida podem ser isoladas por métodos comuns descritos na técnica, por exemplo, pela transformação de calo, seleção de calo transformado e regeneração de plantas férteis a partir de tais calos transgênicos. Em tal processo pode-se utilizar qualquer gene como um marcador seleci

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34/50 onável, desde que sua expressão em células de planta confira a habilidade de identificar ou selecionar as células transformadas.

[00068] Vários marcadores têm sido desenvolvidos para uso com células de planta, tais como resistência ao cloranfenicol, aminoglicosídeo G418, higromicina e semelhantes. Outros genes que codificam um produto envolvido no metabolismo do cloroplasto também podem ser usados como marcadores selecionáveis. Por exemplo, os genes que conferem resistência a herbicidas de planta tais como glifosato, bromoxinil ou imidazolinona podem encontrar um uso particular. Tais genes foram descritos (Stalker etal. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gene nitrilase de resistência a bromoxinil); e Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (AHAS gene de resistência à imidazolinona). Além disso, os genes aqui descritos são úteis como marcadores para avaliar a transformação de bactérias ou células de planta. Métodos para detectar a presença de um transgene em uma planta, órgão de planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), semente, célula de planta, propágulos, embriões ou a progênie da mesma são bemconhecidos na técnica. Em uma modalidade, a presença do transgene é detectada pelo teste da atividade pesticida.

[00069] Plantas férteis que expressam a proteína pesticida podem ser testadas quanto à atividade pesticida e as plantas que mostram atividade ótima são selecionadas para reprodução posterior. Os métodos estão disponíveis na técnica para ensaiar a atividade pesticida. Geralmente, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação. Veja, por exemplo, Marrone et al (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

[00070] A presente invenção pode ser usada para a transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas não limitado a monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não são limitados a milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucífePetição 870180001581, de 08/01/2018, pág. 60/79

35/50 ras, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba açucareira, tabaco, cevada, canola, Brassica sp., alfafa, centeio, painço, açafrão, amendoim, batata-doce, mandioca, café, cacau, abacaxi, cítricos, coco, chá, banana, abacate, fido, goiaba, manga, azeitona, papaia, caju, macadamia, amêndoa, aveia, vegetais, ornamentais e coníferas.

[00071] Os vegetais incluem, mas não são limitados a tomates, alface, ervilha, feijão de lima, e membros do gênero Curcumis tais como pepino, melão cantalupo e meloa. As plantas ornamentais incluem, mas não são limitadas a azaléia, hidrângea, hibisco, rosa, tulipa, narciso, petúnia, cravo, copo-de-leite e crisântemo. Preferivelmente, as plantas da presente invenção são plantas cultivadas (por exemplo, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, arroz, soja, beterraba açucareira, cana-de-açúcar, tabaco, cevada, canola, etc.).

[00072] Praga inclui, mas não está limitada a insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros, carrapatos e semelhantes. Pragas de insetos incluem insetos selecionados a partir das ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera, Lepidoptera e Diptera.

[00073] A ordem Coleoptera inclui as subordens Adephaga e Polyphaga. A subordem Adephaga inclui as superfamílias Caraboidea e Gyrinoidea, enquanto que a subordem Polyphaga inclui as superfamílias Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea e Curculionoidea. A superfamília Caraboidea inclui as famílias Cicindelidae, Carabidae e Dytiscidae. A superfamília Gyrinoidea inclui a família Gyrinidae. A superfamília Hydrophiloidea inclui a família Hydrophilidae. A superfamília Staphylinoidea inclui as famílias Silphidae e Staphylinidae. A superfamília Cantharoidea in

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36/50 clui as famílias Cantharidae e Lampyridae. A superfamília Cleroidea inclui as famílias Cleridae e Dermestidae. A superfamília Elateroidea inclui as famílias Elaterídae e Buprestidae. A superfamília Cucujoidea inclui a família Coccinellidae. A superfamília Meloidea inclui a família Meloidae. A superfamília Tenebrionoidea inclui a família Tenebrionidae. A superfamília Scarabaeoidea inclui as famílias Passalidae e Scarabaeidae. A superfamília Cerambycoidea inclui a família Cerambycidae. A superfamília Chrysomeloidea inclui a família Chrysomelidae. A superfamília Curculionoidea inclui as famílias Curculionidae e Scolytidae. [00074] A ordem Diptera inclui as Subordens Nematocera, Brachycera, e Cyclorrhapha. Subordem Nematocera inclui as famílias Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae, e Cecidomyiidae. A Subordem Brachycera inclui as famílias Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae, e Dolichopodidae. A Subordem Cyclorrhapha inclui as Divisões Aschiza e Aschiza. A Divisão Aschiza inclui as famílias Phoridae, Syrphidae, e Conopidae. A Divisão Aschiza inclui as Seções Acalyptratae e Calyptratae. A Seção Acalyptratae inclui as famílias Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae, e Drosophilidae. A Seção Calyptratae inclui as famílias Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphorídae, e Sarcophagidae.

[00075] A ordem Lepidoptera inclui as famílias Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae, e Tineidae.

[00076] As pragas de insetos da invenção para as principais culturas incluem Milho: Ostrinia nubilalis, broca do milho europeu; Agrotis ipsilon, lagarta-rosca preta; Helicoverpa zea, lagarta da espiga do milho; Spodoptera frugiperda, lagarta do cartucho; Diatraea grandiosella, broca do milho do sudoeste; Elasmopalpus lignosellus, lagarta do cau

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37/50 le do milho; Diatraea saccharalis, broca da cana-de-açúcar; Diabrotica virgifera, larva da raiz do milho do oeste; Diabrotica longicornis barberi, larva da raiz do milho do nordeste; Diabrotica undecimpunctata howardi, larva da raiz do milho do sudeste; Melanotus spp., larvas; Cyclocephala borealis, joaninha do nordeste (larvas brancas); Cyclocephala immaculata, joaninha do sudeste (larvas brancas); Popillia japonica, besouro japonês; Chaetocnema pulicaria, besouro do milho; Sphenophorus maidis, caruncho do milho; Rhopalosiphum maidis, afídeo da folha do milho; Anuraphis maidiradicis, afídeo da raiz do milho; Bí/ssus leucopterus leucopterus, pulgão; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de pernas vermelhas; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Hylemya platura, larvas da semente do milho; Agromyza parvicornis, bicho mineiro do milho; Anaphothrips obscrurus, tripés da grama; Solenopsis milesta, formiga; Tetranychus urticae, ácaro rajado com duas manchas; Sorqo: Chilo partellus, broca do sorgo; Spodoptera frugiperda, lagarta de cartucho; Helicoverpa zea, lagarta do milho; Elasmopalpus lignosellus, broca do caule do milho; Feltia subterrânea, larva de traça granulada; Phyllophaga crinita, larva branca; Eleodes, Conoderus, e Aeolus spp., larvas; Oulema melanopus, besouro da folha de cereal; Chaetocnema pulicaria, besouro do milho; Sphenophorus maidis, caruncho do milho; Rhopalosiphum maidis', afídeo da folha do milho; Siphaflava, afídeo amarelo da cana-de-açúcar; Bí/ssus leucopterus leucopterus, pulgão; Contarinia sorghicola, mosca do sorgo; Tetranychus cinnabarinus, ácaro vermelho; Tetranychus urticae, ácaro de duas manchas; Trigo: Pseudaletia unipunctata, lagarta de cartucho; Spodoptera frugiperda, lagarta de cartucho do outono; Elasmopalpus lignosellus, broca do caule do milho; Agrotis orthogonia, larva de traça do oeste; Elasmopalpus lignosellus, broca do caule do milho; Oulema melanopus, besouro da folha de cereal; Hyp era punctata, caruncho da folha de trevo; Diabrotica undecimpunctata howardi, verme da raiz do

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38/50 milho do sudeste; afídeo do trigo russo; Schizaphis graminum, besouro verde; Macrosiphum avenae, afídeo do grão inglês; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migratório; Mayetiola destructor, mosca hessiana; Sitodiplosis mosellana, mosca do trigo; Meromyza americana, verme do caule do trigo; Hylemya coarctata, mosca do bulbo do trigo; Frankliniella fusca, tripés do tabaco; Cephus cinctus, vespa do caule do trigo; Aceria tulipae, caracol do trigo; Girassol: Suleima helianthana, traça do girassol; Homoeosoma electellum, traça do girassol; zygogramma exclamationis, besouro do girassol; Bothyrus gibbosus, besouro da cenoura; Neolasioptera murtfeldtiana, mosca da semente do girassol; Algodão: Heliothis virescens, larva de raça do algodão; Helicoverpa zea, lagarta da maça do algodão; Spodoptera exígua, besouro de cartucho; Pectinophora gossypiella, lagarta rosada da maçã do algodão; Anthonomus grandis, caruncho da maçã do algodão; Aphis gossypii, afídeo do algodão; Pseudatomoscelis seriatus, gafanhoto do algodão; Trialeurodes abutilonea, mosca branca de asa listrada; Lygus lineolaris, percevejo da mancha da planta; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Thrips tabaci, tripés da cebola; Franklinkiella fusca, tripés do tabaco; Tetranychus cinnabarinus, ácaro vermelho; Tetranychus urticae, ácaro de duas manchas; Arroz: Diatraea saccharalis, broca da cana-de-açúcar; Spodoptera frugiperda, lagarta de cartucho do outono; Helicoverpa zea, larva do grão de milho; Colaspis brunnea, besouro da uva; Lissorhoptrus oryzophilus, caruncho da água do arroz; Sitophilus oryzae, caruncho do arroz; Nephotettix nigropictus, cicadelídeo do arroz; B/Issus leucopterus leucopterus, pulgão; Acrosternum hilare, besouro do arroz; Soja: Pseudoplusia includens, larva geométrica da soja; Anticarsia gemmatalis, lagarta aveludadda; Plathypena scabra, verme do trevo verde; Ostrinia

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39/50 nubilalis, broca do milho europeu; Agrotis ipsilon, larva de mosca preta; Spodoptera exigua, lagarta de cartucho da beterraba; Heliothis virescens, lagarta do algodão; Helicoverpa zea, lagarta da maçã do algodão; Epilachna varivestis, besouro do feijão mexicano; Myzus persicae, afídeo do pêssego verde; Empoascafabae, cicadelídeo da batata; Acrosternum hilare, besouro verde; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto de perna vermelha; Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial; Hylemya platura, larvas da semente do milho; Sericothrips variabilis, tripés da soja; Thrips tabaci, tripés da cebola; Tetranychus turkestani, ácaro do morango; Tetranychus urticae, ácaro de duas manchas; Cevada: Ostrinia nubilalis, broca do milho europeu; Agrotis ipsilon, larva de mosca preta; Schizaphis graminum, besouro verde; B/issus leucopterus leucopterus, pulgão; Acrosternum hilare, besouro verde fétido; Euschistus servus, besouro marrom fétido; Delia platura, larva da semente do milho; Mayetiola destructor, mosca hessiana; Petrobia latens, ácaro marrom do trigo; Canola: Brevicoryne brassicae, afídeo do repolho; Phyllotreta cruciferae, besouro; Mamestra configurata, lagarta de cartucho de Bertha; Plutella xylostella, traça das crucíferas; Delia ssp., vermes da raiz.

[00077] Os nematódeos incluem nematódeos parasitas tais como nematódeos de galha, cistos e nematódeos lesivos, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp., e Globodera spp.; particularmente, membros de cistos de nematódeos incluindo, mas não limitados a Heterodera glycines (cisto nematoide da soja); Heterodera schachtii (cisto nematoide da beterraba); Heterodera avenae (cisto nematoide do cereal); e Globodera rostochiensis e Globodera pailida (cisto nematoide da batata). Nematódeos lesivos incluem Pratylenchus spp.

Métodos para aumentar a produtividade da planta [00078] São fornecidos métodos para aumentar a produtividade da planta. Os métodos compreendem introduzir em uma planta ou uma

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40/50 célula de planta um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotideos sintética de crylAc aqui descrita. Como definido aqui, produtividade da planta se refere à qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. Por biomassa entende-se qualquer produto medido da planta. Um aumento na produção de biomassa é qualquer aperfeiçoamento na produtividade do produto de planta medido. O aumento da produtividade da planta tem várias aplicações comerciais. Por exemplo, o aumento da biomassa de folha da planta pode aumentar a produtividade de vegetais folhosos para consumo humano ou animal. Além disso, o aumento da biomassa de folhas pode ser usado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados de planta. Um aumento na produtividade pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo incluindo, mas não limitado a pelo menos um aumento de 1%, pelo menos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um aumento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, pelo menos um aumento de 30%, pelo menos um aumento de 50%, pelo menos um aumento de 70%, pelo menos um aumento de 100% ou um aumento maior na produtividade comparada com uma planta que não expressa a sequência de nucleotideos sintética de crylAc.

[00079] Os exemplos a seguir são oferecidos como meio de ilustração e não como meio de limitação.

EXPERIMENTAÇÃO

Exemplo 1. Sequências de nucleotideos sintéticas que codificam CrylAc [00080] Foram designadas sequências de nucleotideos sintéticas que codificam CrylAc (SEQ ID NO:6). Essas sequências estão representadas aqui pela SEQ ID NO:1 (synFLCrylAc), SEQ ID NO:2 (synCrylAc-variante 1), SEQ ID NO:3 (synCrylAcB), SEQ ID NO:4 (synCrylAcC) e SEQ ID NO:5 (optCry1Acv02).

Exemplo 2. Expressão de sequências sintéticas de crylAc em Bacillus

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41/50 [00081] A sequência sintética de crylAc é amplificada por PCR e clonada no vetor de expressão em Bacillus pAX916 por métodos bemconhecidos na técnica. O clone resultante é ensaiado quanto à expressão da proteína CrylAc depois da transformação em células de uma cepa de Bacillus thuringiensis cry(-). Uma cepa de Bacillus contendo o clone synCrylAc e expressando a proteína inseticida CrylAc é cultivada, por exemplo, em meio CYS (Bacto-casitone 10 g/l); 3 g/l de extrato de levedura; 6 g/l de KH₂PO₄; 14 g/l de K₂PO₄; 0,5 mM de MgSO₄; 0,05 mM de MnCI₂; 0,05 mM de FeSO₄), até que a esporulação fique evidente pelo exame por microscópio. As amostras são preparadas e analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE).

Exemplo 3. Ensaios para Atividade Pesticida [00082] As sequências de nucleotídeos sintéticas de crylAc da invenção podem ser testadas quanto a sua habilidade de produzir proteínas pesticidas. A habilidade de uma proteína pesticida para atuar como um pesticida é geralmente avaliada por vários meios. Um meio bem-conhecido na técnica é realizar um ensaio de alimentação. Em tal ensaio de alimentação, expõe-se a praga a uma amostra que contenha os compostos a serem testados ou a amostras de controle. Geralmente isso é realizado pela colocação do material a ser testado, ou de uma diluição adequada de tal material, sobre um material que a praga ingerirá, tal como uma dieta artificial. O material a ser testado pode ser composto de um líquido, sólido ou uma pasta. O material a ser testado pode ser colocado sobre a superfície e depois deixado secar. Alternativamente, o material a ser testado pode ser misturado com uma dieta artificial pastosa e depois depositado na câmara de ensaio. A câmara de ensaio pode ser, por exemplo, um copo, um prato ou um poço de uma placa de microtitulação.

[00083] Ensaios para pragas sugadoras (por exemplo afídeos) po

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42/50 dem envolver a separação do material de teste do inseto por uma divisória, idealmente uma porção que possa ser picada pelas partes sugadoras da boca do inseto sugador, para permitir a ingestão do material de teste. Geralmente o material de teste é misturado com um estimulante da alimentação, tal como sacarose, para promover a ingestão do composto de teste.

[00084] Outros tipos de ensaios podem incluir a microinjeção do material de teste na boca ou no intestino da praga, assim como o desenvolvimento de plantas transgênicas, seguido pelo teste da habilidade da praga em se alimentar sobre a planta transgênica. Testar uma planta pode envolver o isolamento de partes da planta normalmente consumidas, por exemplo, em pequenas caixas acopladas a folha ou o isolamento de plantas inteiras em caixas que contêm os insetos.

[00085] Outros métodos e abordagens para ensaiar pragas são bem- conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Robertson and Preisler, Eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL. Alternativamente, os ensaios são comumente descritos nos jornais Arthropod Management Tests e Jounal ofEconomic Entomology ou pela discussão com membros da Entomological Society of América (ESA).

Exemplo 4. Vetorização de Genes synCrylAc para Expressão em Planta [00086] As regiões codificadoras da invenção são conectadas com um promotor apropriado e as sequências terminadoras para expressão em plantas. Tais sequências são bem-conhecidas na técnica e podem incluir o promotor de actina do arroz ou o promotor de ubiquitina do milho para expressão em monocotiledôneas, o promotor UBQ3 de Arabidopsis ou o promotor CaMV 35S para expressão em dicotiledôneas e os terminadores nos ou Pinll. As técnicas para a produção e confirmação de construtos de promotor-gene-terminador também são

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43/50 bem-conhecidas na técnica. Em um aspecto da invenção, as sequências sintéticas de DNA são planejadas e geradas. Essas sequências sintéticas têm uma sequência de nucleotideos alterada em relação à sequência parental, mas codificam proteínas que são essencialmente idênticas à proteína CrylAc parental (por exemplo, SEQ ID NO:1,2, 3, 4 ou 5).

[00087] Em outro aspecto da invenção, versões modificadas dos genes sintéticos são planejadas tal que o peptídeo resultante é direcionado para uma organela da planta, tal como o retículo endoplasmático ou o apoplasto. Sequências de peptídeo conhecidas para resultar no direcionamento de proteínas de fusão para organelas de planta são conhecidas na técnica. Por exemplo, a região do gene da fosfatase ácida do tremoço branco Lupinus albus (GENEBANK® ID Gl:14276838, Miller et al (2001) Plant Physiology 127:594-606) é conhecida na técnica por resultar no direcionamento para retículo endoplasmático de proteínas heterólogas. Se a proteína de fusão resultante também contém uma sequência de retenção no retículo endoplasmático compreendendo o peptídeo N terminal lisina-ácido aspártico-ácido glutâmico-leucina (isto é, o motivo KDEL (SEQ ID NO:7)) na terminação C, a proteína de fusão será direcionada para o retículo endoplasmático. Se a proteína de fusão carece da sequência de direcionamento para o retículo endoplasmático na terminação C, a proteína será direcionada para o retículo endoplasmático, mas no final será sequestrada no apoplasto.

[00088] Portanto, esse gene codifica uma proteína de fusão que contém na terminação N trinta e um aminoácidos do gene da fosfatase ácida do tremoço branco Lupinus albus (GENEBANK® ID Gl:14276838, Miller et al,2001, supra) fundidos com a terminação N da sequência de CrylAc, assim como a sequência KDEL na terminação C. Portanto, a proteína resultante é predita estar direcionada para o retículo endoplasmático da planta depois da expressão em uma célula de planta.

[00089] Os cassetes de expressão em planta descritos acima são

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44/50 combinados com um marcador selecionável apropriado para a planta para auxiliar na seleção de células e tecidos transformados e ligados nos vetores de transformação em planta. Esses podem incluir vetores binários de transformação mediada por Agrobacterium ou vetores de plasmídeo simples para transformação por aerossol ou biolística.

Exemplo 5. Vetorização de Genes synCrylAc para Expressão em Planta [00090] As regiões codificadoras do DNA de syncrylAc da invenção são operativamente conectadas com um promotor apropriado e as sequências terminadoras para expressão em plantas. Tais sequências são bem- conhecidas na técnica e podem incluir o promotor de actina do arroz ou o promotor de ubiquitina do milho para expressão em monocotiledôneas, o promotor UBQ3 de Arabidopsis ou o promotor CaMV 35S para expressão em dicotiledôneas e os terminadores nos ou Pinll. As técnicas para a produção e confirmação de construtos de promotorgene-terminador também são bem- conhecidas.

[00091] Os cassetes de expressão em planta descritos acima são combinados com um marcador selecionável apropriado para a planta para auxiliar na seleção de células e tecidos transformados e ligados nos vetores de transformação em planta. Esses podem incluir vetores binários de transformação mediada por Agrobacterium ou vetores de plasmídeo simples para transformação por aerossol ou biolística. Exemplo 6. Transformação de células de milho com os genes de proteína pesticida aqui descritos [00092] Grãos de milho são melhor coletados 8 a 12 dias depois da polinização. Os embriões são isolados dos grãos e aqueles embriões com 0,8 a 1,5 mm de comprimento são preferidos para uso na transformação. Os embriões são plaqueados com o escutelo para cima em um meio de incubação adequado, tal como o meio DN62A5S (3,6 g/l de Sais N6; 1 ml/l de Vitaminas N6 (de uma Solução estoque de

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1000x); 800 mg/l de L-asparagina; 100 mg/l de Mio-inositol; 1,4 g/l de L-prolina; 100 mg/l de Casaminoácidos; 50 g/l de sacarose; 1 ml/l de

2,4-D (de uma solução estoque de 1 mg/ml)). Entretanto, meios e sais diferentes de DN6A5S são adequados e são conhecidos na técnica. Os embriões são incubados durante a noite a 25°C no escuro. Entretanto, não é necessário per se incubar os embriões durante a noite.

[00093] Os explantes resultantes são transferidos para telas quadradas (30 a 40 por placa), transferidas para um meio osmótico por cerca de 30 a 45 minutos e depois transferidas para uma placa de irradiação (veja, por exemplo, Publicação PCT N° WO/0138514 e Patente U.S. N° 5.240.842).

[00094] Os construtos de DNA planejados para os genes da invenção em células de planta são acelerados no tecido de planta usando um acelerador de jato de aerossol, usando condições essencialmente como descritas na Publicação PCT N° WO/0138514. Depois de irradiados, os embriões são incubados por cerca de 30 min em meio osmótico e colocados em meio de incubação durante a noite a 25°C no escuro. Para evitar o dano desnecessário aos explantes irradiados, eles são incubados por pelo menos 24 horas antes da transferência para o meio de recuperação. Os embriões são espalhados depois sobre o meio do período de recuperação, por cerca de 5 dias, 25°C no escuro, transferidos depois para um meio de seleção. Os explantes são incubados no meio de seleção por até oito semanas, dependendo da natureza e das características da seleção utilizada em particular. Depois do período de seleção, o calo resultante é transferido para um meio de maturação de embrião até que a formação de embriões somáticos maduros seja observada. Os embriões somáticos maduros são colocados sob pouca luz e o processo de regeneração é iniciado pelos métodos conhecidos na técnica. As mudas resultantes são deixadas enraizar em meio de enraizamento e as plantas resultantes são transferi

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46/50 das para potes e propagadas como plantas transgênicas. Materiais

Meio DN62A5S

Componentes	Por litro	Fonte
Mistura de Sal Chu's N6 Basal (N° prod. C416)	3,98 g/l	Phytotechnology Labs
Solução de Vitamina Chu's N6 (N° prod. C149)	1 ml/l (Solução estoque 1000x)	Phytotechnology Labs
L-asparagina	800 mg/l	Phytotechnology Labs
Mio-inositol	100 mg/l	Sigma
L-prolina	1,4 g/l	Phytotechnology Labs
Casaminoácidos	100 mg/l	Fisher Scientific
sacarose	50 g/l	Phytotechnology Labs
2,4-D (N° prod. D-7299)	1 ml/l (de sol. estoque de 1 mg/ml)	Sigma

[00095] O pH da solução é ajustado para pH 5,8 com KOH 1N/KCI 1N, Gelrite (Sigma) é adicionado até uma concentração de 3g/l e o meio é autoclavado. Depois de resfriar para 50°C, 2 ml/l de uma solução estoque de 5 mg/ml de nitrato de prata (Phytotechnology Labs) são adicionados.

Exemplo 7. Transformação de genes syncrylAc da invenção em células de planta por transformação mediada por Agrobacterium [00096] Grãos de milho são melhor coletados 8 a 12 dias depois da polinização. Os embriões são isolados dos grãos e aqueles embriões com 0,8 a 1,5 mm de comprimento são preferidos para uso na transformação. Os embriões são plaqueados com o escutelo para cima em um meio de incubação adequado e incubados a 25°C no escuro. Entretanto, não é necessário per se incubar os embriões durante a noite. Os embriões são contatados com uma cepa de Agrobacterium contendo os vetores apropriados para o transferência mediada pelo plasmídeo Ti por cerca de 5-10 min e depois plaqueados em meio de cocultura por cerca de 3 dias (a 25° no escuro). Depois da cocultura, os explantes são transferidos para um meio de período de recuperação por

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47/50 cerca de cinco dias (a 25° no escuro). Os explantes são incubados no meio de seleção por até oito semanas, dependendo da natureza e das características da seleção utilizadas em particular. Depois do período de seleção, o calo resultante é transferido para um meio de maturação de embrião até que a formação de embriões somáticos maduros seja observada. Os embriões somáticos maduros são colocados sob pouca luz e o processo de regeneração é iniciado como conhecido na técnica. Exemplo 8. Atividade pesticida contra pragas de Lepidópteros [00097] Eventos de milho transgênico contendo construtos desenvolvidos para reduzir o dano causado por pragas de insetos lepidópteros foram avaliados em uma série de testes de campo para determinar seu nível de resistência à broca do milho europeu (Ostrinia nubilalis Hübner) e a larva do grão de milho (Helicoverpa zea Bodie). As medidas dos índices de danos à folha e tunelização do caule foram usadas para avaliar os eventos de resistência a ECB. Um índice de dano do grão foi usado para quantificar a quantidade de dano alimentar do grão pela larva do grão de milho.

[00098] Eventos T2 gerados a partir de dois construtos foram avaliados em testes de campo. O construto A continha o gene synCrylAcvariantel (SEQ ID NO:2) dirigido pelo promotor TripProõ (Publicação de Patente U.S. N° 20060218662). O construto B continha o gene synFLCrylAc (SEQ ID NO:1) dirigido pelo promotor TripProõB (Publicação de Patente U.S. N° 20060218662). Ambos, Hi-ll e um híbrido suscetível foram usados como controles negativos. A semente foi embalada e arranjada em experimentos em bloco com desenho aleatório em um local em um campo isolado em lowa. Os experimentos foram plantados no solo que foi desocupado no ano anterior.

[00099] As práticas agronômicas usadas foram representativas daquelas usadas na produção de milho no U.S. Corn Belt, exceto que não foram usados inseticidas. A área do lote foi enquadrada e arada

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48/50 antes do plantio para estabelecer um leito para a semente. Fertilizante líquido foi aplicado antes do plantio. As ervas daninhas foram controladas pelo uso de uma aplicação pré-emergência e uma aplicação pós-emergência de herbicidas comerciais, assim como pelo tratamento local para controlar ervas daninhas que emergem tardiamente.

Teste para a Broca do Milho Europeu (ECB).

[000100] Para as avaliações da primeira geração, todas as plantas nos testes de ECB foram infestadas com larvas de ECB em duas datas separadas. As plantas foram infestadas em uma espiral em torno de cada planta usando um contaminador de campo que foi calibrado para liberar 25 larvas por dose. Cada planta foi infestada com 2 doses em cada data de infestação para uma infestação total de 100 larvas por planta. As plantas foram avaliadas quanto aos danos da 1^a geração usando a Escala de Dano Foliar de Guthrie (Guthrie et al. (1960) Leaf and sheath feeding resistance to the European corn borer in eight inbred lines of dent corn. Ohio Agric. Res. Dev. Cent. Res. Bull. 860). Os segregantes negativos foram removidos antes da classificação dos lotes. Todas as plantas remanescentes foram infestadas com larvas de ECB para avaliação da segunda geração. As larvas foram preparadas como descrito para as avaliações da 1^a geração. No total, 150 larvas foram aplicadas a cada planta durante três datas. As plantas foram avaliadas quanto ao dano à segunda geração pela divisão da planta longitudinalmente a partir de 3 nós acima do grão primário para o solo. A quantidade de tunelização em centímetros(polegadas) foi medida para cada caule. A parte inferior do grão primário também foi dividida e todos os túneis foram medidos e adicionados ao total. Quaisquer túneis que se estendiam para a espiga também foram medidos.

Teste para a Larva do Grão do Milho.

[000101] As plantas foram infestadas com 50 larvas de ECB durante o estágio na espiral para identificar plantas positivas e negativas em

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49/50 cada fila. Os surtos das larvas do grão de milho foram monitorizados com uma armadilha de feromônio. Um surto significativo de larva do grão de milho ocorreu na área desse teste do meio para o final de Agosto quando as plantas eram atrativas para lepidópteros fêmeas. Através de avaliações de grãos individuais no teste, foi determinado que a infestação natural era suficiente para as avaliações da larva do grão de milho. O dano ao grão foi classificado no período apropriado usando uma escala visual de 1 a 9 (descrita na Tabela 1). Primeiro, plantas positivas a negativas fora identificadas pelo dano foliar por ECB na primeira geração. Os índices foram calculados para ambas as plantas positivas e negativas dentro de cada fileira. Um índice médio para as plantas positivas dentro da fileira foi então calculado. Resultados e Discussão.

[000102] As infestações de larvas de ECB produziram níveis suficientes de dano durante ambas as 1^a e 2^a gerações. Os controles negativos tiveram dano foliar severo. Para a larva do grão de milho, o dano foi mais variável devido à infestação natural, mas a maioria dos grãos negativos tiveram um dano central pelo menos menor.

[000103] Em resumo, os eventos testados exibiram níveis comercialmente viáveis de resistência a lepidópteros; e vários não mostraram dano ou tunelização visíveis. Além disso, está claro que a atividade contra a larva do grão de milho está presente, conferida pelos construtos sintéticos de crylAc expressos nas linhagens transgênicas.

Tabela 1. Dados dos testes de campo para a broca do milho europeu e larva do grão de milho

Construto	Linhagem	índice Foliar (1-9)	Cent.(Pol) de Tunelização por planta	índice de dano por larva de grão de milho (1-9)²
A	1	1	0(0)	1,1
A	2	1	0(0)
A	3	1	0,23 (0,09)
A	4	1,5	0(0)	1,1
B	1	1	0(0)	1,3

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Construto	Linhagem	índice Foliar (1-9)	Cent.(Pol) de Tunelização por planta	índice de dano por larva de grão de milho (1-9)²
B	2	1,5	0(0)	1,0
B	3	1	0(0)	1,0
B	4	1	0,18(0,07)
Hi-ll		7	13,16(5,18)	2,8
Híbrido Susc.		5	10,16(4,0)	2,6

¹ Linhagens em vermelho são selecionadas para desenvolvimento ²Escala de Classificação CEW: 1 = sem danos; 2 = danos leves a fibras, cascas e ponta do grão, mas sem dano ao núcleo, 3 = 1 a 2 núcleos danificados; 4 = 0,1 a 1,0 cm de núcleos danificados; 5 = 1,1 a 2 cm de núcleos danificados; 6 = 2,1 a 3,0 cm danificados; 7 = 3,1 a 4,0 cm danificados; 8 = 4,1 a 5 cm danificados; 9 = > 5 cm danificados.

[000104] Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados no pedido são indicativos do nível de experiência daqueles versados na técnica a qual essa invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente estão aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente estivesse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

[000105] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo com o propósito de facilitar a compreensão, é óbvio que certas alterações e modificações poderão ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5.
2. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita sequência de nucleotídeos está operacionalmente ligada a um promotor capaz de direcionar a expressão da sequência de nucleotídeos em uma célula de planta e uma região de terminação funcional em plantas.
3. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 1 ou 2.
4. Vetor, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo.
5. Célula hospedeira bacteriana, caracterizada pelo fato de que contêm uma das moléculas de ácido nucleico, como definidas na reivindicação 1 ou 2.
6. Método para proteção de uma planta contra uma praga, caracterizado pelo fato de que compreende:

introduzir na dita planta ou em uma célula da mesma pelo menos um vetor de expressão, que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo pesticida, em que a dita sequência de nucleotídeos compreende SEQ ID NO: 5, e cultivar a dita planta ou célula da mesma em um campo contendo a dita praga.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita planta produz um polipeptídeo pesticida que apresenta atividade contra uma praga lepidóptera.