BR112014010451B1 - Método para cultivo de plantas resistentes ou tolerantes a herbicida derivado de cumarona, ácido nucleico isolado e método de produção de uma célula vegetal transgênica - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA CONTROLAR VEGETAÇÃO INDESEJADA, MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA VEGETAL, PLAN TAS, SEMENTE E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA CÉLULA VEGETAL É fornecido um método para controlar a vegetação indesejada em um local de cultivo de plantas, o qual compreende as etapas de fornecer no referido local, uma planta compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica uma hidroxifenil piruvato dioxigenase do tipo selvagem ou uma hidroxifenil piruvato dioxigenase mutada (Mut-HPPD), que é resistente ou tolerante a um herbicida derivado de cumarona e/ou uma sequência de nucleotídeos que codifica uma homogentisato solanesil transferase do tipo selvagem ou uma homogentisato solanesil transferase mutada (mut-HST), que é resistente ou tolerante a um herbicida derivado de cumarona, e a aplicação de uma quantidade eficaz do referido herbicida ao referido local. Também são fornecidas plantas compreendendo mut-HPPD e métodos para a obtenção de tais plantas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se em geral a métodos para conferir tolerância a um herbicida em plantas ao nível agrícola. Particularmente, a invenção refere-se a plantas que possuem uma tolerância aumentada aos herbicidas “derivados de cumarona”. Mais especificamente, a presente invenção refere-se aos métodos e plantas obtidas pela mutagênese e cruzamento e transformação que possuem uma tolerância aumentada aos herbicidas “derivados de cumarona”.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os herbicidas que inibem a 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (4-HPPD; EC 1.13.11.27), uma importante enzima na biossíntese de prenilquinonas plastoquinona e tocoferóis, têm sido utilizados para o controle seletivo de ervas daninhas desde o início da década 1990. Eles bloqueiam a conversão de 4-hidroxifenilpiruvato em homogentisato na via biossintética (Matringe et al., 2005, Pest Manag Sci., vol. 61:269-276; Mitchell et al., 2001, Pest Manag Sci. vol 57:120-128). Acredita-se que a plastoquinona seja um cofator necessária para a enzima fitoeno dessaturase na biossíntese dos carotenoides (Boeger e Sandmann, 1998, Pestic Outlook, vol 9:29-35). Seus resultados de inibição na depleção de plastoquinona vegetal e pools de vitamina E, levou a sintomas de manchamento (bleaching). A perda de carotenoides, particularmente em sua função como protetores dos fotossistemas contra a oxidação fotoquímica, leva à degradação oxidativa da clorofila e das membranas fotossintéticas nos tecidos de brotos em crescimento. Consequentemente, a síntese e função dos cloroplastos são perturbadas (Boeger e Sandmann, 1998). A enzima homogentisato solanesil transferase (HST) catalisa a etapa após a HPPD na via biossintética da plastoquinona. A HST é uma prenil-transferase que descarboxila a homogentisato e também transfere a ela o grupo solanesil a partir do solanesil difosfato e forma assim 2-metil-6-solanesil-1,4-benzoquinol (MSBQ), um intermediário ao longo da via biossintética da plastoquinona. As enzimas HST estão ligadas à membrana e os genes que as codificam incluem uma sequência de direccionamento para o plastídio.

[003] As classes químicas mais importantes dos herbicidas comerciais inibidores de 4-HPPD incluem pirazolonas, tricetonas e isoxazóis. Os inibidores mimetizam a ligação do substrato 4-hidroxifenilpiruvato para um íon ferroso ligado a enzima no sítio ativo pela formação de um complexo de transferência de carga íon-dipolo estável. Entre os herbicidas inibidores de 4- HPPD, a sulcotriona tricetona foi o primeiro exemplo deste grupo de herbicidas a ser utilizada na agricultura e identificada em seu mecanismo de ação (Schulz et al., 1993, FEBS Lett. Vol. 318:162-166). As tricetonas têm sido referidas como sendo derivadas de leptospermona, um componente herbicida a partir de plantas calistemo (escova-de-garrafa), Callistemon spp (Lee et al.1997, Weed Sci. Vol. 45, 162-166).

[004] Algumas destas moléculas foram usadas como herbicidas uma vez que a inibição da reação em plantas leva ao branqueamento das folhas das plantas tratadas e morte das referidas plantas (Pallett, K.E. et al.1997 Pestic. Sci. 50 83-84). Os herbicidas para os quais o HPPD é o alvo, e que são descritas no estado da técnica, são, particularmente, os isoxazóis (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, Patente US 5.424.276), em particular isoxaflutol, que é um herbicida seletivo do milho, diquetonitrilas (EP496630, EP496631), em particular, 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-CF3 fenil)propano-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-2,3 Cl2-fenil)- propano-1,3-diona, tricetonas, como as descritas na EP 625505, EP 625508, Patente US 5.506.195, em particular a sulcotriona, ou então pirazolinatos. Além disso, o herbicida bem conhecido topramezona induz o mesmo tipo de sintomas de fitotoxicidade, com a perda de clorofila e necrose nos tecidos de brotos em crescimento, tal como os inibidores de 4-HPPD, herbicidas de branqueamento descrito acima em espécies de plantas susceptíveis. A topramezona pertence à classe química das pirazolonas ou benzoil pirazóis e foi comercialmente introduzida em 2006. Quando aplicada pós-emergência, o composto controla seletivamente um amplo espectro de gramíneas anuais e infestantes de folhas largas em milho.

[005] A tolerância vegetal aos “herbicidas derivados de cumarona” também tem sido relatada em várias patentes. O Pedido Internacional WO2010/029311 descreve de modo geral a utilização de um ácido nucleico HPPD e/ou um ácido nucleico HST para induzir a tolerância ao herbicida em plantas. Os pedidos WO2009/090401, WO2009/090402, WO2008/071918, WO2008/009908, divulgam especificamente certos “herbicidas derivados de cumarona” e linhagem de plantas tolerantes aos “herbicidas derivados de cumarona”.

[006] Três estratégias principais estão disponíveis para tornar as plantas tolerantes aos herbicidas, ou seja, (1) desintoxicar o herbicida com uma enzima que transforma o herbicida, ou o seu metabolito ativo, em produtos não tóxicos, como, por exemplo, enzimas para a tolerância ao bromoxinil ou Basta (EP242236, EP337899); (2) a mutação da enzima alvo em uma enzima funcional que é menos sensível ao herbicida, ou ao seu metabolito ativo, tal como, por exemplo, as enzimas para a tolerância ao glifosato (EP293356, Padgette S.R. et al., J. Biol.Chem, 266, 33, 1991); ou (3) superexpressando a enzima sensível de modo a produzir quantidades da enzima alvo na planta, que são suficientes em relação ao herbicida, levando em conta as constantes cinéticas desta enzima, de modo a ter enzima funcional suficientemente disponível apesar da presença de seu inibidor. A terceira estratégia foi descrita para a obtenção com sucesso de plantas que eram tolerantes aos inibidores HPPD (WO96/38567). A publicação US2009/0172831 divulga sequências nucleotídicas que codificam sequências de aminoácidos que possuem atividade enzimática de modo a que as sequências de aminoácidos são resistentes aos químicos herbicidas inibidores de HPPD, em particular, inibidores tricetona HPPD mutantes- específicos.

[007] Até a presente data, a arte anterior não descreveu plantas tolerantes ao herbicida derivado de cumarona contendo pelo menos um ácido nucleico HPPD mutado. A arte anterior também não descreveu plantas cultivadas tolerantes ao herbicida derivado de cumarona contendo mutações no genoma diferente do genoma a partir do qual o gene HPPD é derivado. Portanto, o que é necessário no estado da técnica, é a identificação de genes de tolerância ao herbicida derivado de cumarona a partir de genomas e espécies adicionais. O que também é necessário no estado da técnica são plantas cultivares e plantas cultivares possuindo tolerância aumentada aos herbicidas, tal como herbicida derivado de cumarona, e contendo pelo menos uma mutação no ácido nucleico HPPD. Também são necessários métodos para controlar o crescimento de ervas daninhas na vizinhança de tais plantas de cultivo ou cultivares. Estas composições e métodos permitem o uso de técnicas de pulverização, quando há aplicação de herbicidas nas áreas que contêm plantas de cultivo ou cultivares.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[008] O problema é resolvido pela presente invenção, que se refere a um método para controlar a vegetação indesejada em um local de cultivo de plantas, em que o método compreende as etapas de: a) fornecimento, no referido local, de uma planta que compreende pelo menos um ácido nucleico compreendendo: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma hidroxifenil piruvato dioxigenase do tipo selvagem ou uma hidroxifenil piruvato dioxigenase mutada (mut-HPPD), que é resistente ou tolerante a um herbicida derivado de cumarona e/ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma homogentisato solanesil transferase do tipo selvagem ou uma homogentisato solanesil transferase mutada (mut-HST), que é resistente ou tolerante a um herbicida derivado de cumarona; b) a aplicação de uma quantidade eficaz do dito herbicida ao referido local.

[009] Além disso, a presente invenção refere-se a um método para a identificação de um herbicida derivado de cumarona usando uma mut-HPPD codificada por um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 52 ou uma variante destas, e/ou uma mut-HST codificada por um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 47 ou 49 ou uma variante destas.

[010] O referido método compreende as etapas de: a) gerar uma planta ou célula transgênica que compreende um ácido nucleico que codifica uma mut-HPPD ou do tipo selvagem, em que a mut- HPPD ou do tipo selvagem é expressa; b) aplicação de um herbicida derivado de cumarona na planta ou célula transgênica de a) e em uma célula ou planta controle da mesma variedade; c) determinação do crescimento ou da viabilidade da planta ou célula transgênica e da célula ou planta controle após a aplicação do referido composto-teste, e d) seleção dos compostos-teste que conferem crescimento reduzido para a célula ou planta controle, em comparação com o crescimento da planta ou célula transgênica.

[011] Outro objeto refere-se a um método de identificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma mut-HPPD que é resistente ou tolerante a um herbicida derivado de cumarona, compreendendo o referido método: a) geração de uma biblioteca de ácidos nucleicos codificantes de mut-HPPD; b) a triagem de uma população de ácidos nucleicos codificante de mut-HPPD resultante pela expressão de cada um dos referidos ácidos nucleicos em uma célula ou planta e o tratamento da referida célula ou planta com um herbicida derivado de cumarona, c) a comparação dos níveis de tolerância ao herbicida derivado de cumarona fornecidos pela referida população de ácidos nucleicos codificante de mut-HPPD com o nível de tolerância ao herbicida derivado de cumarona fornecido por um ácido nucleico codificante de HPPD controle, d) a seleção de pelo menos um ácido nucleico codificante de mut- HPPD que proporciona um nível significativamente aumentado de tolerância a um herbicida derivado de cumarona, em comparação com os proporcionados pelo ácido nucleico codificante de HPPD controle.

[012] Em um exemplo de realização preferido, o ácido nucleico codificante de mut-HPPD selecionado na etapa d) proporciona, pelo menos, duas vezes mais tolerância a um herbicida derivado de cumarona, em comparação com aquela proporcionada pelo ácido nucleico codificante de HPPD controle.

[013] A resistência ou tolerância pode ser determinada pela geração de uma planta transgênica compreendendo uma sequência de ácido nucleico da biblioteca da etapa a) e comparando a referida planta transgênica com uma planta controle.

[014] Outro objeto refere-se a um método de identificação de uma planta ou alga contendo um ácido nucleico que codifica uma mut-HPPD ou mut- HST que é resistente ou tolerante a um herbicida derivado de cumarona, compreendendo o referido método: a) a identificação de uma quantidade eficaz de um herbicida derivado de cumarona de uma cultura de células vegetais ou algas verdes. b) o tratamento referidas células vegetais e algas verdes com um agente mutagênico, c) o contato da referida população de células mutagenizadas com uma quantidade eficaz de herbicida derivado de cumarona, identificado em (a), d) a seleção de pelo menos uma célula sobrevivente nestas condições de ensaio, e) a amplificação por PCR e sequenciamento de genes HPPD e/ou HST a partir de células selecionadas em d) e comparando tais sequências com as sequências de genes HPPD ou HST do tipo selvagem, respectivamente.

[015] Em um exemplo de realização preferido, o agente de mutagênese é etilmetanossulfonato.

[016] Outro objeto refere-se a um ácido nucleico isolado que codifica uma mut-HPPD, sendo o ácido nucleico preferencialmente identificável por um método conforme definido acima.

[017] Em outro exemplo de realização, a invenção refere-se a uma célula vegetal transformada por um ácido nucleico do tipo selvagem ou um mut- HPPD ou uma planta que foi mutada para a obtenção de uma planta que expressa, preferencialmente superexpressando, um ácido nucleico HPPD do tipo selvagem ou um mut-HPPD, em que a expressão do ácido nucleico nas células vegetais resulta na resistência ou tolerância aumentadas a um herbicida derivado de cumarona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da célula vegetal.

[018] Em um exemplo de realização preferido, a célula vegetal da presente invenção é transformada por um ácido nucleico do tipo selvagem ou mut-HPPD compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 52 ou uma variante ou derivado da mesma.

[019] Em outro exemplo de realização, a invenção refere-se a uma planta transgênica que compreende uma célula vegetal de acordo com a presente invenção, em que a expressão do ácido nucleico na planta resulta na resistência aumentada da planta aos herbicidas derivados de cumarona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da planta.

[020] As plantas da presente invenção podem ser transgênicas ou não transgênicas.

[021] Preferencialmente, a expressão do ácido nucleico em plantas resulta na resistência aumentada das plantas aos herbicidas derivado de cumarona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da planta.

[022] Em outro exemplo de realização, a invenção refere-se a uma semente produzida por uma planta transgênica compreendendo uma célula vegetal da presente invenção, em que a semente é geneticamente pura (true breeding) para uma resistência aumentada a um herbicida derivado de cumarona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da semente.

[023] Em outro exemplo de realização, a invenção refere-se a um método de produção de uma célula vegetal transgênica com uma resistência aumentada a um herbicida derivado de cumarona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da célula vegetal, compreendendo, a transformação da célula vegetal com um cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico do tipo selvagem ou mut-HPPD.

[024] Em outro exemplo de realização, a invenção refere-se a um método de produção de uma planta transgênica compreendendo, (a) a transformação de uma célula vegetal com um cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico do tipo selvagem ou mut-HPPD, e (b) a geração de uma planta com resistência aumentada ao herbicida derivado de cumarona a partir da célula vegetal.

[025] Preferencialmente, o cassete de expressão compreende ainda uma região reguladora da iniciação da transcrição e uma região reguladora da iniciação da tradução que são funcionais na planta.

[026] Em outro exemplo de realização, a invenção refere-se ao uso da mut-HPPD da invenção como um marcador selecionável. A invenção fornece um método de identificação ou seleção de uma célula vegetal, tecido vegetal, planta ou parte da mesma transformados, compreendendo: (a) o fornecimento de uma célula vegetal, tecido vegetal, planta ou parte da mesma transformados, em que a referida célula vegetal, tecido vegetal, planta ou parte da mesma transformados, compreende um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo mut-HPPD da invenção, conforme descrito a seguir, em que o polipeptídeo é utilizado como um marcador de seleção, e em que a referida célula vegetal, tecido vegetal, planta ou parte da mesma transformados podem compreender, opcionalmente, um outro ácido nucleico isolado de interesse; (b) o contato da célula vegetal, tecido vegetal, planta ou parte da mesma transformados com pelo menos um composto inibidor derivado de cumarona; (c) determinar se a célula vegetal, tecido vegetal, planta ou parte da mesma é afetada pelo inibidor ou composto inibidor; e (d) a identificação ou seleção da célula vegetal, tecido vegetal, planta ou parte da mesma transformados.

[027] A invenção também está incorporada em proteínas mut- HPPD purificadas que contêm as mutações aqui descritas, que são úteis em estudos de modelagem molecular para criar novas melhorias de tolerância aos herbicidas. Os métodos de purificação de proteínas são bem conhecidos, e podem ser prontamente realizados utilizando produtos disponíveis comercialmente ou métodos especialmente concebidos, conforme estabelecido, por exemplo, em Protein Biotechnology, Walsh e Headon (Wiley, 1994).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[028] Figura 1 - Alinhamento de sequências de aminoácidos de regiões conservadas de enzimas HPPD de Chlamydomonas reinhardtii (Cr_HPPD1a, Cr_HPPD1b), Physcomitrella patens (Pp_HPPD1), Oryza sativa (Osj_HPPD1), Triticum aestivum (Ta_HPPD1), Zea mays (Zm_HPPD1), de Arabidopsis thaliana (At_HPPD), Glycine max (Gm_HPPD) e Vitis vinifera (Vv_HPPD). * Sequência derivada de projeto de sequenciamento do genoma. Locus ID: GRMZM2G088396 ** Sequência de aminoácidos baseada no acesso NCBI GenPept CAG25475

[029] Figura 2 - Exibe um mapa de vetor de um vetor de transformação vegetal que é utilizado para a transformação da soja com as sequências HPPD / HST.

[030] Figura 3 exibe o ensaio de germinação de mudas transgênicas de Arabidopsis expressando HPPD do tipo selvagem de Hordeum (HvHPPD, Seq ID: 1/2). As plantas foram germinadas em (A) 3-[2,4-dicloro-3-(3- metil-4,5-dihidroisoxazol-5-il)fenil]-1-(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo-pirido[3,2- c]tiazin-4-ol e (B) 1-(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo-3-(2,4,6-tricloro-3-piridil)-pirido [3,2-c] tiazin-4-ol.

[031] Figura 4 exibe os testes de pulverização de herbicidas contra estacas caulinares transgênicas T0 de soja expressando HPPD do tipo selvagem de Hordeum (Seq ID: 2, eventos LJ387 e AV4553); HPPD de Synechocystis (SEQ ID: 20, evento LG6156) e HPPD de Arabidopsis (Seq ID: 53) M335H mutante (evento HT1833). As plantas-controle não transformadas são marcadas como tipo selvagem. O herbicida derivado de cumarona usado é o 3-[2,4-dicloro- 3-(3-metil-4,5-dihidroisoxazol-5-il)fenil]-1-(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo-pirido[3,2-c] tiazin-4-ol. LISTA DE SEQUÊNCIAS TABELA 1

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[032] Os artigos “um” e “uma” são utilizados na presente invenção para se referirem a um ou mais do que um (ou seja, pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Por exemplo, “um elemento” significa um ou mais elementos.

[033] Conforme utilizado no presente, a palavra “compreendendo”, ou variações como “compreende” ou “contendo”, será entendida como implicando a inclusão de um elemento declarado, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas.

[034] Os inventores da presente invenção descobriram que a tolerância ou resistência de uma planta aos herbicidas pode ser notavelmente aumentada com superexpressão de enzimas HPPD do tipo selvagem ou mutadas compreendendo as SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 ou 53.

[035] Consequentemente, a presente invenção se refere a um método para controlar a vegetação indesejada em um local de cultivo de plantas, em que o método compreende as etapas de: a) fornecimento, no referido local, de uma planta que compreende pelo menos um ácido nucleico compreendendo: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma hidroxifenil piruvato dioxigenase do tipo selvagem (HPPD) ou uma hidroxifenil piruvato dioxigenase mutada (mut-HPPD), que é resistente ou tolerante a um herbicida derivado de cumarona e/ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma homogentisato solanesil transferase do tipo selvagem (HST) ou uma homogentisato solanesil transferase mutada (mut-HST), que é resistente ou tolerante a um herbicida derivado de cumarona; b) a aplicação de uma quantidade eficaz do dito herbicida ao referido local.

[036] O termo “controle da vegetação indesejável” deve ser entendido como a morte de ervas daninhas e/ou o retardamento ou inibição de outro modo do crescimento normal das ervas daninhas. Ervas daninhas ou plantas daninhas, no sentido mais amplo, são entendidas como todas aquelas plantas que crescem em locais onde são indesejadas. As ervas daninhas da presente invenção incluem, por exemplo, ervas daninhas dicotiledôneas e monocotiledôneas. As ervas daninhas dicotiledôneas incluem, mas não estão limitadas às ervas daninhas do gênero: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, e Taraxacum. As ervas daninhas monocotiledôneas incluem, mas não estão limitadas às ervas daninhas do gênero: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, e Apera. Além disso, as ervas daninhas da presente invenção podem incluir, por exemplo, plantas de cultura que estão crescendo em uma localização indesejada. Por exemplo, uma planta de milho voluntária que está em um campo que compreende predominantemente de plantas de soja pode ser considerada uma erva daninha, se a planta de milho é indesejável no campo de plantas de soja.

[037] O termo “planta” é utilizado no seu sentido mais amplo, no que se refere ao material orgânico e destina-se a englobar organismos eucarióticos que são membros do reino Plantae, exemplos dos quais incluem, mas não se limitam às plantas vasculares, vegetais, grãos, flores, árvores, ervas, arbustos, gramíneas, trepadeiras, samambaias, musgos, fungos e algas, etc, bem como clones, deslocamentos, e partes de plantas utilizadas na propagação assexuada (por exemplo, estacas, tubulações, brotos, rizomas, caules subterrâneos, aglomerados, coroas, bulbos, cormos, tubérculos, rizomas, plantas/tecidos produzidos em cultura de tecidos, etc.). O termo “planta” abrange ainda as plantas inteiras, ancestrais e descendentes das plantas e partes de plantas, incluindo sementes, brotos, caules, folhas, raízes (incluindo tubérculos), flores, floretes, frutas, pedículos, pedúnculos, estame, anteras, estigma, estilo, ovário, pétala, sépala, carpelo, ponta da raiz, coifa, raiz fasciculada, folha fasciculada, sementes fasciculadas, grãos de pólen, microesporo, cotilédones, hipocótilo, epicótilo, xilema, floema, parênquima, endosperma, célula companheira, célula guarda, e quaisquer outros órgãos, tecidos e células vegetais conhecidos, e tecidos e órgãos, em que cada um dos acima mencionados compreende o gene/ácido nucleico de interesse. O termo “planta” também abrange células vegetais, culturas em suspensão, o tecido do calo, embriões, regiões meristemáticas, gametófitos esporófitos, pólen e micrósporos, novamente em que cada um dos acima mencionados compreende o gene/ácido nucleico de interesse.

[038] As plantas que são particularmente úteis nos métodos da presente invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular as plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, incluindo forragem ou leguminosas forrageiras, plantas ornamentais, cultivares alimentares, árvores ou arbustos selecionados a partir da lista que compreende: Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por exemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por exemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza, rabanete silvestre]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por exemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por exemplo, Glycine max, Soja hispida ou Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por exemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por exemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por exemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por exemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por exemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por exemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum ou Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., amaranto, alcachofra, aspargos, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, couve, milho, linhaça, couve crespa (kale), lentilha, colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, morango, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, tomate, abóbora (squash), chá e algas, dentre outros. De acordo com um exemplo de realização preferido da presente invenção, a planta é uma cultivar. Exemplos de cultivares incluem, entre outros, soja, girassol, canola, milho, alfafa, colza, algodão, tomate, batata ou tabaco. Ainda preferencialmente, a planta é uma planta monocotiledônea, tal como cana de açúcar. Ainda preferencialmente, a planta é um cereal, tal como arroz, milho, trigo, cevada, milho, centeio, sorgo ou aveia.

[039] Em um exemplo de realização preferido, a planta foi previamente produzida por um processo que compreende a preparação de uma planta de forma recombinante pela introdução e superexpressão de um transgene mut-HPPD ou do tipo selvagem e/ou mut-HST ou do tipo selvagem, como descrito a seguir em maiores detalhes.

[040] Em outro exemplo de realização preferido, a planta foi previamente produzida por um processo que compreende a mutagenização de células vegetais in situ, para a obtenção de células vegetais que expressam uma mut-HPPD e/ou mut-HST.

[041] Conforme divulgado na presente invenção, os ácidos nucleicos da invenção encontram uso no aumento da tolerância aos herbicidas de plantas que compreendem em seus genomas um gene que codifica uma proteína mut-HPPD ou do tipo selvagem e/ou mut-HST ou do tipo selvagem tolerantes ao herbicida. Tal gene pode ser um gene endógeno ou um transgene, conforme descrito a seguir.

[042] Portanto, em outro exemplo de realização a presente invenção refere-se a um método para aumentar ou melhorar a tolerância ou resistência aos herbicidas em uma planta, compreendendo o método a superexpressão de um ácido nucleico que codifica enzimas HPPD do tipo selvagem ou mut compreendendo a SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53.

[043] Adicionalmente, em certos exemplos de realização, os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser empilhados com qualquer combinação de sequências polinucleotídicas de interesse, a fim de criar plantas com um fenótipo desejado. Por exemplo, os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser empilhados com outros polinucleotídeos que codificam polipeptídeos com atividade pesticida e/ou inseticida, tais como, por exemplo, proteínas toxinas de Bacillus thuringiensis (descritos nas Patentes US 5.366.892; US 5.747.450; US 5.737.514; US 5.723.756; US 5.593.881 e Geiser et al (1986) Gene 48: 109). As combinações geradas podem também incluir múltiplas cópias de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse.

[044] Em um exemplo de realização particularmente preferido, a instalação compreende pelo menos um ácido nucleico heterólogo adicional compreendendo (iii) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima de tolerância a herbicida selecionado, por exemplo, a partir do grupo consistindo de 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS), Glifosato acetil transferase (GAT), citocromo P450, fosfinotricina acetiltransferase (PAT), acetohidroxiácido sintase (AHAS; EC 4.1.3.18, também conhecido como acetolactato sintase ou ALS), protoporfirinogênio oxidase (PPGO), fitoeno desaturase (PD) e enzimas que degradam dicamba conforme revelado na WO 02/068607.

[045] De modo geral, o termo “herbicida” é utilizado na presente invenção para designar um ingrediente ativo que mata, controla ou modifica adversamente de outra forma o crescimento de plantas. A quantidade ou concentração preferida de herbicida é uma “quantidade eficaz” ou “concentração eficaz”. Por “quantidade eficaz” e “concentração eficaz” pretende-se dizer a quantidade e concentração, respectivamente, que é suficiente para matar ou inibir o crescimento de uma planta semelhante, tipo selvagem, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira, mas que a referida quantidade ou concentração não mata ou inibe severamente o crescimento das plantas, tecidos vegetais, células vegetais, e células hospedeiras resistentes ao herbicida da presente invenção. Normalmente, a quantidade eficaz de um herbicida, é uma quantidade que é normalmente utilizada em sistemas de produção agrícola para matar as ervas daninhas de interesse. Tal quantidade é conhecida pelos técnicos hábeis no assunto. A atividade herbicida é exibida pelo herbicida derivado de cumarona da presente invenção quando aplicado diretamente na planta ou local da planta em qualquer estágio de desenvolvimento ou antes da plantação ou emergência da planta. O efeito observado depende da espécie de planta a ser controlada, do estágio de crescimento da planta, dos parâmetros de aplicação de diluição e tamanho de gota de pulverização, o tamanho de partícula de componentes sólidos, condições ambientais no momento de utilização, do composto específico utilizado, os adjuvantes e veículos específicos utilizados, tipo de solo, e similares, bem como a quantidade de produto químico aplicado. Estes e outros fatores podem ser ajustados tal como é conhecido no estado da técnica para promover a ação herbicida não seletiva ou seletiva. De modo geral, prefere-se aplicar o herbicida derivado de cumarona no estágio pós-emergência até a vegetação indesejável relativamente imatura para conseguir o controle máximo das ervas daninhas.

[046] Com o termo planta “tolerante ao herbicida” ou “resistente ao herbicida”, pretende-se dizer que uma planta é tolerante ou resistente a pelo menos um herbicida em níveis que normalmente matam ou inibem o crescimento de uma planta normal ou tipo selvagem. Por “proteína mut-HPPD tolerantes ao herbicida” ou “proteína mut-HPPD resistente ao herbicida”, pretende-se dizer que tal proteína mut-HPPD exibe atividade HPPD superior, em relação à atividade HPPD de uma proteína HPPD do tipo selvagem, quando na presença de pelo menos um herbicida que é conhecido por interferir com a atividade HPPD e na concentração ou nível de herbicida que é conhecida por inibir a atividade da proteína HPPD do tipo selvagem. Além disso, a atividade HPPD de tal proteína mut-HPPD tolerante ao herbicida ou resistente ao herbicida pode ser referida na presente invenção como atividade HPPD “herbicida-resistente” ou “herbicida-tolerante”.

[047] Os “herbicidas derivados de cumarona” úteis para a presente invenção abrangem os compostos conforme representado na Tabela 2 a seguir. TABELA 2

[048] Os pedidos mencionados acima, em especial as divulgações referentes aos compostos da Tabela 2, números 1-13, e seus possíveis substituintes são totalmente incorporadas ao presente pela referência.

[049] Em um exemplo de realização, o herbicida derivado de cumarona útil para a presente invenção refere-se ao Número 13 da Tabela 2 acima, possuindo a fórmula:

em que as variáveis têm os seguintes significados: R é O-RA, S(O)n-RA ou O-S(O)n-RA; RA é hidrogênio, alquila C1-C4, Z-C3-C6-cicloalquila, C1-C4- haloalquila, C2-C6-alquenila, Z-C3-C6-cicloalquenila, C2-C6-alquinila, Z-(tri-C1-C4-alquila)silil, Z-C(=O)-Ra, Z-NRi-C(O)-NRiRii, Z-P(=O)(Ra)2, NRiRii ou um monociclo com 3- a 7-membros ou um heterociclo biciclo com 9- ou 10- membros saturado, insaturado ou aromático que contém 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S e que podem ser parcialmente ou totalmente substituídos pelos grupos Ra e/ou Rb, Ra é independentemente hidrogênio, OH, C1-C8-alquila, C1-C4- haloalquila, Z-C3-C6-cicloalquila, C2-C8-alquenila, Z-C5-C6-cicloalquenila, C2-C8- alquinila, Z-C1-C6-alcóxi, Z-C1-C4-haloalcóxi, Z-C3-C8-alquiniloxi, Z-C3-C8- alquiniloxi, NRiRii, C1-C6-alquilsulfonila, Z-(tri-C1-C4-alquil)silila, Z-fenila, Z-fenoxi, Z-fenilamino ou um monocíclico com 5- ou 6- membros ou heterociclo bicíclico com 9- ou 10-membros que contém 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S, em que os grupos cíclicos são não substituídos ou substituídos por 1, 2, 3 ou 4 grupos Rb; Ri, Rii independentemente um do outro são hidrogênio, C1-C8- alquila, C1-C4-haloalquila, C3-C8-alquenila, C3-C8-alquinila, Z-C3-C6-cicloalquila, Z-C1-C8-alcóxi, Z-C1-C8-haloalcóxi, Z-C(=O)-Ra, Z-fenila, um monocíclico de 3- a 7- membros ou heterociclo bicíclico com 9- ou 10-membros saturado ou insaturado ou aromático que contém 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S e que é ativado via Z; Ri e Rii junto com o átomo nitrogênio ao qual eles estão acoplados podem também formar um monocíclico com 5- ou 6- membros ou heterociclo bicíclico com 9- ou 10-membros que contém 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S; Rb independentemente um do outro são Z-CN, Z-OH, Z-NO2, Z-halogênio, oxo (=O), =N-Ra, C1-C8-alquila, C1-C4-haloalquila, C2-C8-alquenila, C2-C8-alquinila, Z-C1-C8-alcóxi, Z-C1-C8-haloalcóxi, Z-C3-C10-cicloalquila, O-Z-C3-C10-cicloalquila, Z-C(=O)-Ra, NRiRii, Z-(tri-C1-C4-alquil)silila, Z-fenila ou S(O)nRbb; ou dois grupos Rb podem juntos formar um anel que tem três a seis membros de anel e, além dos átomos de carbono, podem conter heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S e podem ser não- substituídos ou substituídos por grupos Rb adicionais; Rbb é C1-C8-alquila, C2-C6-alquenila, C2-C6-alquinila, C2-C6- haloalquenila, C2-C6-haloalquinila ou C1-C6-haloalquila; Z é uma ligação covalente ou C1-C4-alquileno; n é 0, 1 ou 2; R1 é ciano, halogênio, nitro, C1-C6-alquila, C2-C6-alquenila, C2- C6-alquinila, C1-C6-haloalquila, Z-C1-C6-alcóxi, Z-C1-C4-alcoxi-C1-C4-alcóxi, Z-C1-C4-alquiltio, Z-C1-C4-alquiltio-C1-C4-alquiltio, C2-C6-alquiniloxi, C2-C6- alquiniloxi, C1-C6-haloalcóxi, C1-C4-haloalcoxi-C1-C4-alcóxi, S(O)nRbb, Z-fenoxi ou Z-heterocicliloxi, em que heterociclila é um monocíclico com 5- ou 6- membros ou heterociclo bicíclico com 9- ou 10-membros saturado, parcialmente insaturado ou aromático que contém 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S, em que os grupos cíclicos são não- substituídos ou parcialmente substituídos ou completamente substituídos por Rb; A é N ou C-R2; R2,R3,R4,R5 independentemente um do outro são hidrogênio, Z- halogênio, Z-CN, Z-OH, Z-NO2, C1-C8-alquila, C1-C4-haloalquila, C2-C8-alquenila, C2-C8-alquinila, C2-C8-haloalquenila, C2-C8-haloalquinila, Z-C1-C8-alcóxi, Z-C1-C8-haloalcóxi, Z-C1-C4-alcoxi-C1-C4-alcóxi, Z-C1-C4-alquitio, Z-C1-C4- alquiltio-C1-C4-alquiltio, Z-C1-C6-haloalquiltio, C2-C6-alquiniloxi, C2-C6-alquiniloxi, C1-C6-haloalcóxi, C1-C4-haloalcoxi-C1-C4-alcóxi, Z-C3-C10-cicloalquila, O-Z-C3- C10-cicloalquila, Z-C(=O)-Ra, NRiRii, Z-(tri-C1-C4-alquil)silila, S(O)nRbb, Z-fenila, Z1-fenila, Z-heterociclila ou Z1-heterociclila, em que heterociclila é um monocíclico com 5- ou 6- membros ou heterociclo bicíclico com 9- ou 10- membros saturado, parcialmente insaturado ou aromático que contém 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S, em que os grupos cíclicos são não-substituídos ou parcialmente substituídos ou completamente substituídos por Rb; R2 juntamente com o grupo acoplado ao átomo carbono adjacente pode também formam um anel mono- ou bicíclico saturado, parcialmente ou completamente insaturado com cinco ou dez membros que, além dos átomos de carbono, pode conter 1, 2 ou 3 heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S e pode ser substituído por grupos Rb adicionais; Z1 é uma ligação covalente, C1-C4-alquilenóxi, C1-C4- oxialquileno ou C1-C4-alquilenóxi-C1-C4-alquileno; R6 é hidrogênio, C1-C4-alquila, C1-C4-haloalquila, C1-C4-alcóxi, C1-C4-alquiltio, C1-C4-haloalcoxi, C1-C4-haloalquiltio; R7,R8 independentemente um do outro são hidrogênio, halogênio ou C1-C4-alquila; Rxé C1-C6-alquila, C1-C4-haloalquila, C1-C2-alcóxi-C1-C2-alquila, C2-C6-alquenila, C2-C6-halogenoalquenila, C3-C6-alquinila, C3-C6-haloalquinila ou Z-fenila, que é não substituído ou substituído por 1 a 5 grupos Rb; em que nos grupos RA, e R1, R2, R3, R4 e R5 e seus substituintes, as cadeias de carbono e/ou os grupos cíclicos podem ser parcialmente ou completamente substituídos pelos grupos Rb, ou um N-óxido ou sal agricolamente aceitável do mesmo.

[050] Em outro exemplo de realização, o herbicida derivado de cumarona útil para a presente invenção refere-se ao Número 1 e 2 da Tabela 2 acima, possuindo a fórmula acima:

em que as variáveis são conforme descrito nas publicações WO2010/049270 e WO2010/049269.

[051] Em outro exemplo de realização preferido, o herbicida derivado de cumarina útil para a presente invenção tem a seguinte fórmula (Tabela 2, N° 8);

em que as variáveis têm os seguintes significados: R é O-RA, S(O)n-RA ou O-S(O)n-RA; RA é hidrogênio, alquila C1-C4, Z-C3-C6-cicloalquila, C1-C4- haloalquila, C2-C6-alquenila, Z-C3-C6-cicloalquenila, C2-C6-alquinila, Z-(tri-C1-C4-alquila)silil, Z-C(=O)-Ra, Z-NRi-C(O)-NRiRii, Z-P(=O)(Ra)2, NRiRii ou um monociclo com 3- a 7-membros ou um heterociclo biciclo com 9- ou 10- membros saturado, insaturado ou aromático que contém 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S e que podem ser parcialmente ou totalmente substituídos pelos grupos Ra e/ou Rb, Ra é independentemente hidrogênio, OH, C1-C8-alquila, C1-C4- haloalquila, Z-C3-C6-cicloalquila, C2-C8-alquenila, Z-C5-C6-cicloalquenila, C2-C8- alquinila, Z-C1-C6-alcóxi, Z-C1-C4-haloalcóxi, Z-C3-C8-alquiniloxi, Z-C3-C8- alquiniloxi, NRiRii, C1-C6-alquilsulfonila, Z-(tri-C1-C4-alquil)silila, Z-fenila, Z-fenoxi, Z-fenilamino ou um monocíclico com 5- ou 6- membros ou heterociclo bicíclico com 9- ou 10-membros que contém 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S, em que os grupos cíclicos são não substituídos ou substituídos por 1, 2, 3 ou 4 grupos Rb; Ri, Rii independentemente um do outro são hidrogênio, C1-C8- alquila, C1-C4-haloalquila, C3-C8-alquenila, C3-C8-alquinila, Z-C3-C6-cicloalquila, Z-C1-C8-alcóxi, Z-C1-C8-haloalcóxi, Z-C(=O)-Ra, Z-fenila, um monocíclico de 3- a 7- membros ou heterociclo bicíclico com 9- ou 10-membros saturado ou insaturado ou aromático que contém 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S e que é ativado via Z; Ri e Rii junto com o átomo nitrogênio ao qual eles estão acoplados podem também formar um monocíclico com 5- ou 6- membros ou heterociclo bicíclico com 9- ou 10-membros que contém 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S; Z é uma ligação covalente ou C1-C4-alquileno; n é 0, 1 ou 2; R1 é ciano, halogênio, nitro, C1-C6-alquila, C2-C6-alquenila, C2- C6-alquinila, C1-C6-haloalquila, Z-C1-C6-alcóxi, Z-C1-C4-alcoxi-C1-C4-alcóxi, Z-C1-C4-alquiltio, Z-C1-C4-alquiltio-C1-C4-alquiltio, C2-C6-alquiniloxi, C2-C6- alquiniloxi, C1-C6-haloalcóxi, C1-C4-haloalcoxi-C1-C4-alcóxi, S(O)nRbb, Z-fenoxi ou Z-heterocicliloxi, em que heterociclila é um monocíclico com 5- ou 6- membros ou heterociclo bicíclico com 9- ou 10-membros saturado, parcialmente insaturado ou aromático que contém 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S, em que os grupos cíclicos são não- substituídos ou parcialmente substituídos ou completamente substituídos por Rb; Rbbé C1-C8-alquila, C2-C6-alquenila, C2-C6-alquinila, C2-C6- haloalquenila, C2-C6-haloalquinila ou C1-C6-haloalquila e n é 0, 1 ou 2; A é N ou C-R2; R2é Z1-fenila, fenóxi ou Z1-heterociclila, em que heterociclila é um monocíclico com 5- ou 6- membros ou bicíclico com 9- ou 10-membros heterociclo saturado, parcialmente insaturado ou aromático que contém 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S, em que os grupos cíclicos são não substituídos ou parcialmente substituídos ou completamente substituídos por Rb; C1-C8-alquila C2-C4-haloalquila C1-C4-alcóxi-C1-C4-alquila C1-C4- alquiltio-C1-C4-alquila C2-C8-alquenila, C2-C8-alquinila, C2-C8-haloalquenila, C2- C8-haloalquinila, C2-C6-alcóxi, Z-C1-C4-alcóxi-C1-C4-alcóxi, Z-C1-C4-haloalcóxi- C1-C4-alcóxi, C2-C6-haloalcóxi, C3-C6-alqueniloxi, C3-C6-alquiniloxi, C2-C6- alquiltio, C2-C6-haloalquiltio, Z-C(=O)-Ra, S(O)1-2Rbb; Z1 é uma ligação covalente, C1-C4-alquilenóxi, C1-C4- oxialquileno ou C1-C4-alquilenóxi-C1-C4-alquileno; Rb independentemente um do outro são Z-CN, Z-OH, Z-NO2, Z-halogênio, oxo (=O), =N-Ra, C1-C8-alquila, C1-C4-haloalquila, C2-C8-alquenila, C2-C8-alquinila, Z-C1-C8-alcóxi, Z-C1-C8-haloalcóxi, Z-C3-C10-cicloalquila, O-Z-C3-C10-cicloalquila, Z-C(=O)-Ra, NRiRii, Z-(tri-C1-C4-alquil)silila, Z-fenila ou S(O)nRbb; ou dois grupos Rb podem juntos formar um anel que tem três a seis membros de anel e, além dos átomos de carbono, podem conter heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S e podem ser não- substituídos ou substituídos por grupos Rb adicionais; R2 juntamente com o grupo acoplado ao átomo carbono adjacente pode também formam um anel mono- ou bicíclico saturado, parcialmente ou completamente insaturado com cinco ou dez membros que, além dos átomos de carbono, pode conter 1, 2 ou 3 heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de O, N e S e pode ser substituído por grupos Rb adicionais; R3 é hidrogênio, halogênio, ciano, nitro, C1-C4-alquila, C1-C4- haloalquila, C1-C4-alcóxi, C1-C4-haloalcóxi, C2-C4-alquenila, C2-C4-alquinila, C2-C4-alquiniloxi, C2-C4-alquiniloxi ou S(O)nRbb; R4 é hidrogênio, halogênio ou C1-C4-haloalquila; R5 é hidrogênio, C1-C4-alquila, C1-C4-haloalquila, C1-C4-alcóxi, C1-C4-alquiltio, C1-C4-haloalcoxi ou C1-C4-haloalquiltio; R6, R7 independentemente um do outro são hidrogênio, halogênio ou C1-C4-alquila; Y é O ou S; X é O, S ou N-Rx; Rxé hidrogênio, C1-C6-alquila, C1-C4-halogenoalquila, C2-C6- alquenila, C3-C6-alquinila, Z-C3-C10-cicloalquila, C1 - C6-alcoxi-C1-C6-alquila, C1- C6-cianoalquila, Z-fenila, Z-C(=O)-Ra2 ou tri-C1-C4-alquilsilila; Ra2 é C1-C6-alquila, C1-C4-haloalquila, Z-C1-C6-alcóxi, Z-C1-C4- haloalcóxi ou NRiRii; em que nos grupos RA, e seus substituintes, as cadeias de carbono e/ou os grupos cíclicos podem ser parcialmente ou completamente substituídos pelos grupos Rb, ou um N-óxido ou sal agricolamente aceitável do mesmo.

[052] Os derivados de cumarona úteis para a presente invenção são frequentemente melhor aplicados juntamente com um ou mais herbicidas direcionados a HPPD e/ou HST diferentes para obter o controle de uma variedade mais ampla de vegetação indesejável. Quando usado juntamente com outros herbicidas direcionados a HPPD e/ou HST, os compostos descritos na presente invenção podem ser formulados com o outro herbicida ou herbicidas, em mistura de tanque com o outro herbicida ou herbicidas, ou aplicado sequencialmente com o outro herbicida ou herbicidas.

[053] Alguns dos herbicidas que são úteis em conjunto com os herbicidas derivados de cumarona da presente invenção incluem: benzobiciclon, mesotriona, sulcotriona, tefuriltriona, tembotriona, 4-hidroxi-3-[[2-(2- metoxietoxi)metil]-6-(trifluorometil)-3-piridinil]carbonil]-biciclo[3.2.1]-oct-3-en-2- ona (biciclopirona), cetospiradox ou os ácidos livres do mesmo, benzofenap, pirasulfotol, pirazolinato, pirazoxifen, topramezona, [2-cloro-3-(2-metoxietoxi)-4- (metilsulfonil)fenil](l-etil-5-hidroxi-1H-pirazol-4-il)-metanona, (2,3-dihidro-3,3,4- trimetil-1,1-dioxidobenzo[b]tien-5-il)(5-hidroxi-1-metil-1H-pirazol-4-il)-metanona, isoxaclortol, isoxaflutol, α-(ciclopropilcarbonil)-2-(metilsulfonil)-β-oxo-4-cloro- benzenopropanonitrila, e α-(ciclopropilcarbonil)-2-(metilsulfonil)-β-oxo-4- (trifluorometil)-benzenopropanonitrila.

[054] E um exemplo de realização preferido, o herbicida adicional é topramezona.

[055] E um exemplo de realização particularmente preferido, o herbicida adicional é: (1-Etil-5-prop-2-iniloxi-1H-pirazol-4-il)-[4-metansulfonil-2-metil-3- (3-metil-4,5-dihidro-isoxazol-5-il)-fenil]-metanona

ou (1-Etil-5-hidroxi-1H-pirazol-4-il)-[4-metansulfonil-2-metil-3-(3-metil- 4,5-dihidro-isoxazol-5-il)-fenil]-metanona

[056] Os compostos descritos acima estão descritos em grandes detalhes na EP 09177628.6 que inteiramente incorporada ao presente pela referência.

[057] Os compostos herbicidas úteis para a presente invenção podem ainda ser usados juntamente com herbicidas adicionais para os quais a cultivar é naturalmente tolerante, ou para os quais ela é resistente pela expressão de um ou mais transgenes adicionais conforme mencionado acima. Alguns dos herbicidas que podem ser utilizados juntamente com os compostos da presente invenção incluem sulfonamidas tais como metosulam, flumetsulam, cloransulam-metílico, diclosulam, penoxsulam e florasulam, sulfonilureias tais como clorimuron, tribenuron, sulfometuron, nicosulfuron, clorsulfuron, Amidosulfuron, triasulfuron, prosulfuron, tritosulfuron, tifensulfuron, sulfosulfuron e metsulfuron, imidazolinonas como imazaquina, imazapic, ima-zetapir, imzapir, imazametabenzo e imazamox, ácidos fenoxialcanóicos tais como 2,4-D, MCPA, Diclorprope e Mecoprope, ácidos piridiniloxiacéticos como triclopir e fluroxipir, ácidos carboxílicos, tais como clopiralide, picloram, aminopiralida e dicamba, dinitroanilinas tais como trifluralina, benefina, benfluralina e pendimetalina, cloroacetanilidas tais como alaclor, acetoclor e metolaclor, semicarbazonas (inibidores do transporte de auxina) tais como diflufenzopir e clorflurenol, como ariloxifenoxipropionatos fluazifop, haloxifop, diclofop, clodinafop e fenoxaprope e outros herbicidas comuns, incluindo o glifosato, glufosinato, acifluorfen, bentazon, clomazone, fumiclorac, fluometuron, fomesafen, lactofen, linuron, isoproturon, simazina, norflurazon, paraquat, diuron, diflufenicon, picolinafena, cinidon, setoxidim, tralcoxidim, quinmerac, isoxabena, bromoxinila, metribuzin e mesotrione.

[058] Os herbicidas derivados de cumarona úteis para a presente invenção podem, além disso, ser usados juntamente com glifosato e glufosinato em culturas tolerantes ao glifosato ou glufosinato.

[059] A menos que já incluídos na descrição acima, os herbicidas derivados de cumarona úteis para a presente invenção podem, ainda, ser utilizados juntamente com compostos: (a) a partir do grupo de inibidores da biossíntese lipídica: Aloxidim, aloxidim-sódio, butroxidim, Cletodim, Clodinafope, Clodinafope-propargil, cicloxidime, Cihalofope, cialofope-butílico, Diclofop, Diclofop-metílico, Fenoxaprop, Fenoxaprop-etílico, Fenoxaprop-P, Fenoxaprop- P-etílico, Fluazifop, Fluazifop- butílico, fluazifop-P, fluazifop-P-butílico, haloxifop, Haloxifop-metílico, Haloxifop-P, Haloxifop-P-metílico, Metamifop, Pinoxadene, profoxidim, propaquizafop, quizalofop Quizalofop-etílico, Quizalofop-tefuril, Quizalofop-P, Quizalofope-P-etílico, Quizalofope-P-tefuril, setoxidime, tepraloxidim, Tralcoxidim, Benfuresat, Butilat, Cicloat, dalapon, Dimepiperat, EPTC, esprocarb, Etofumesat, Flupropanat, Molinat, Orbencarb, Pebulat, prosulfocarbe, TCA, Tiobencarb, tiocarbazil, Triallat e Vernolat; (b) a partir do grupo de inibidores de ALS: Amidossulfuron, Azimsulfuron, Bensulfuron, Bensulfuron-metílico, Bispiribac, Bispiribac-sódico, Clorimuron, clorimuron-etílico, Clorsulfuron, cinosulfuron, cloransulam, cloransulam-metílico, ciclosulfamuron, diclosulam, etametsulfuron, etametsulfuron-metílico, etoxisulfuron, flazassulfuron, lorasulame, Flucarbazon, Flucarbazon-sódico, Flucetosulfuron, Flumetsulam, flupirsulfuron, flupirsulfuron-metil-sódico, Foramsulfuron, halosulfuron, halosulfuron-metílico, imazametabenzo, imazametabenzometilo, Imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, Imazossulfuron, Iodosulfuron, Iodosulfuron-metil-sódico, Mesossulfuron, metoxuron, Metsulfuron, Metsulfuron- metílico, Nicosulfuron, ortossulfamuron, oxasulfuron, penoxsulame, Primisulfuron, Primisulfuron-metílico, Propoxicarbazon, Propoxicarbazon-sódico, prosulfurao, pirazosulfuron, pirazosulfuron-etílico, Piribenzoxim, Pirimisulfan, Piriftalid, piriminobac, piriminobac-metílico, piritiobac, piritiobac-sódico, piroxsulam, rimsulfuron, Sulfometuron, Sulfometuron-metílico, sulfosulfuron Tiencarbazon, Tiencarbazon-metílico, Tifensulfuron, Tifensulfuron-metílico, Triasulfuron, Tribenuron, Tribenuron-metílico, Trifloxisulfuron, triflussulfuron, triflussulfuron-metil e tritosulfuron; (c) a partir do grupo de inibidores da fotosíntese: Ametrina, Amicarbazon, atrazina, Bentazon, Bentazon-sódica, Bromacil, bromofenoxim, Bromoxinil e seus sais e ésteres, Clorobromuron, cloridazon, clorotoluron, cloroxuron, Cyanazin, Desmedifame, desmetrina, dimefuron, dimetametrina, diquat, Diquat-dibromid, Diuron, fluometuron, Hexazinon, Ioxinil e seus sais e ésteres, Isoproturon, Isouron, Karbutilat, lenacil, Linuron, Metamitron, metabenztiazuron, metobenzuron, Metoxuron, Metribuzin, Monolinuron, Neburon, Paraquat, Paraquat-dicloreto, Paraquat-dimetilsulfato, Pentanoclor, Fenemedifame, Fenemedifame- etílico, prometon, Prometrina, Propanila, Propazina, piridafol, Piridat, Siduron, Simazin, simetrina, Tebutiuron, terbacil, Terbumeton, Terbutilazina, Terbutrina, Tidiazuron e Trietazina; d) a partir do grupo de Inibidores de Protoporfirinogênio-IX-oxidase: Acifluorfen, Acifluorfen-sódico, Azafenidin, Bencarbazon, Benzfendizon, Bifenox, Butafenacil, Carfentrazon, Carfentrazon-etílico, Clometoxifeno, Cinidon-etílico, Fluazolat, Flufenpir, Flufenpir-etílico, Flumiclorac, Flumiclorac-pentílico, Flumioxazin, Fluoroglycofen, Fluoroglicofen-etílico, Fluthiacet, Flutiacet-metílico, Fomesafen, Halosafen, Lactofen, Oxadiargil, Oxadiazon, Oxifluorfen, Pentoxazon, Profluazol, Piraclonil, Piraflufen, Piraflufen- etílico, Saflufenacil, Sulfentrazon, Tidiazimin, 2-Clor-5-[3,6-dihidro-3-metil-2,6- dioxo-4-(trifluormetil)-1(2H)-pirimidinil]-4-fluor-N- [(isopropil)metilsulfamoil]benzamida (H-1; CAS 372137-35-4), etil-éster de ácido [3-[2-clor-4-fluor-5-(1-metil-6-trifluormetil-2,4-dioxo-1,2,3,4,-tetrahidropirimidin-3- il)fenoxi]-2-piridiloxi]acético (H-2; CAS 353292-31-6), N-etílico-3-(2,6-diclor-4- trifluormetilfenoxi)-5-metil-1H-pirazol-1-carboxamida (H-3; CAS 452098-92-9), N-Tetrahidrofurfuril-3-(2,6-diclor-4-trifluormetilfenoxi)-5-metil-1H-pirazol-1- carboxamida (H-4; CAS 915396-43-9), N-etílico-3-(2-clor-6-fluor-4- trifluormetilfenoxi)-5-metil-1H-pirazol-1-carboxamida (H-5; CAS 452099-05-7) e N-Tetrahidrofurfuril-3-(2-clor-6-fluor-4-trifluormetilfenoxi)-5-metil-1H-pirazol-1- carboxamida (H-6; CAS 45100-03-7); e) a partir do grupo de Herbicidas Branqueadores (Bleacher): Aclonifen, amitrol, beflubutamida, Benzobiciclon, benzofenap, Clomazon, Diflufenicon, Fluridon, flurocloridona, Flurtamon, Isoxaflutol, Mesotrion, norflurazon, picolinafena, Pirasulfutol, Pirazolinat, pirazoxifen, Sulcotrion, Tefuriltrion, Tembotrion, Topramezon, 4-Hidroxi-3-[[2-[(2- metoxietoxi)metil]-6-(trifluormetil)-3-piridil]carbonil]biciclo[3.2.1]oct-3-en-2-ona (H-7; CAS 352010-68-5) e 4 - (3-Trifluormetilfenoxi) -2 - (4-trifluormetilfenil) pirimidina (H-8; CAS 180608-33-7); f) a partir do grupo de inibidores de EPSP sintase: Glifosato, glifosato-isopropilamônio e glifosato de trimésio (Sulfosat); g) a partir do grupo de inibidores da Glutamina sintase: Bilanafos (Bialafos), Bilanafos-sódico, Glufosinat e Glufosinat- amônio; h) a partir do grupo de inibidores da DHP sintase: Asulam; i) a partir do grupo de inibidores da mitose: Amiprofos, Amiprofos-metil, Benfluralin, Butamifos, Butralin, Carbetamid, Clorprofam, Clortal, Clortal-dimetílico, Dinitramin, Ditiopir, Etalfluralin, Flucloralin, Orizalin, Pendimetalin, Prodiamin, Profam, Propizamid, Tebutam, Tiazopir e Trifluralin; j) a partir do grupo de inibidores de VLCFA: Acetoclor, Alaclor, Anilofos, Butaclor, Cafenstrol, Dimetaclor, Dimetanamid, Dimetenamid-P, Difenamid, Fentrazamid, Flufenacet, Mefenacet, Metazaclor, Metolaclor, Metolaclor-S, Naproanilid, Napropamid, Petoxamid, Piperofos, Pretilaclor, Propaclor, Propisoclor, Piroxasulfona (KIH-485) e Tenilclor;

[060] Compostos de fórmula 2:

[061] Os compostos particularmente preferidos de fórmula 2 são os seguintes: 3-[5-(2,2-Diflúor-etoxi)-1-metil-3-trifluormetil-1H-pirazol-4- ilmetansulfonil]-4-flúor-5,5-dimetil-4,5-dihidro-isoxazol (2-1); 3-{[5-(2,2-Diflúor- etoxi)-1-metil-3-tri-fluormetil-1H-pirazol-4-il]-flúor-metasulfonil}-5,5-dimetil-4,5- dihidro-isoxazol (2-2); 4-(4-Flúor-5,5-dimetil-4,5-dihidro-isoxazol-3-sulfonilmetil)- 2-metil-5-triflúor-metil-2H-[1,2,3]triazol (2-3); 4-[(5,5-Dimetil-4,5-dihidro-isoxazol- 3-sulfonil)-flúor-metil]-2-metil-5-trifluormetil-2H-[1,2,3]triazol (2-4); 4-(5,5-Dimetil- 4,5-dihidro-isoxazol-3-sulfonilmetil)-2-metil-5-trifluormetil-2H-[1,2,3]triazol (2-5); 3-{[5-(2,2-Diflúor-etoxi)-1-metil-3-trifluormetil-1H-pirazol-4-il]-diflúor- metansulfonil}-5,5-dimetil-4,5-dihidro-isoxazol (2-6); 4-[(5,5-Dimetil-4,5-dihidro- isoxazol-3-sulfonil)-diflúor-metil]-2-metil-5-trifluormetil-2H-[1,2,3]triazol (2-7); 3- {[5-(2,2-Diflúor-etoxi)-1-metil-3-trifluormetil-1H-pirazol-4-il]-diflúor- metansulfonil}-4-flúor-5,5-dimetil-4,5-dihidro-isoxazol (2-8); 4-[Diflúor-(4-flúor- 5,5-dimetil-4,5-dihidro-isoxazol-3-sulfonil)-metil]-2-metil-5-trifluormetil-2H- [1,2,3]triazol (2-9); k) a partir do grupo de inibidores da biossíntese de celulose: Clortiamida, Diclobenil, Flupoxam e Isoxaben; l) a partir do grupo de Herbicidas de dissociação: Dinoseb, Dinoterb e DNOC e seus sais; m) a partir do grupo de Herbicidas Auxínicos: 2,4-D e seus sais e seus ésteres, 2,4-DB e seus sais e ésteres, aminopiralida e seus sais, aminopiralida-tris (2-hidroxipropil) amônio e os seus ésteres, benazolina, benazolina-etílica, clorambeno e seus sais e ésteres, clomeprop, clopiralid e os seus sais e ésteres, dicamba e os seus sais e ésteres, diclorprop e seus sais e ésteres, diclorprope-P e os seus sais e ésteres, Fluroxipir, Fluroxipir-butometílico, Fluroxipir-metílico, MCPA e seus sais e ésteres, MCPA-tioetila, MCPB, e seus sais e ésteres, Mecoprop e seus sais e ésteres, Mecoprop-P e os seus sais e ésteres, Picloram e seus sais e ésteres, quinclorac, quinmerac, TBA (2,3,6) e seus sais e ésteres, triclopir e seus sais e ésteres, e ácido 5,6-diclor-2-ciclopropil-4-pirimidincarbônico (H-9, CAS 85895608-8) e seus sais e ésteres; n) a partir do grupo de inibidores do transporte de auxína: Diflufenzopir, Diflufenzopir-sódico, Naptalam e Naptalam-sódico; o) a partir do grupo de outros Herbicidas: Bromobutid, Clorflurenol, Clorflurenol-metil, Cinmetilin, Cumiluron, Dalapon, Dazomet, Difenzoquat, Difenzoquatmetilsulfato, Dimetipin, DSMA, Dimron, Endotal e seus sais, Etobenzanid, Flamprop, Flamprop-isopropila, Flamprop-metílico, Flamprop-M- isopropílico, Flamprop-M-metílico, Flurenol, Flurenol-butílico, Flurprimidol, Fosamin, Fosamine-amônio, Indanofan, ácido Maleínico-hidrazida, Mefluidid, Metam, Metilazid, Metilbromid, Metil-dimron, Metiljodid. MSMA, ácido oléico, Oxaziclomefon, ácido pelargônico, Piributicarb, Quinoclamin, Triaziflam, Tridifan e 6-Clor-3-(2-ciclopropil-6-metilfenoxi)-4-piridazinol (H-10; CAS 499223-49-3) e seus sais e ésteres.

[062] Exemplos para protetores C preferidos são benoxacor, Cloquintocet, ciometrinil, Ciprosulfamid, diclormida, Diciclonon, dietolato, fenclorazol, fenclorim, Flurazol, fluxofenim, Furilazol, isoxadifen, mefenpir, Mefenat, ácido anidrido naftálico, oxabetrinil, 4-(Dicloracetil)-1-oxa-4-azaspiro [4,5] decano (H-11; MON4660, CAS 71526-07-3) e 2,2,5-trimetil-3-(dicloracetil)- 1,3-oxazolidin (H-12, R- 29148, CAS 52836-31-4).

[063] Os compostos de grupos a) a o) e os Protetores C são Herbicidas e Protetores conhecidos, vide, por exemplo, o Compêndio de Nomes comuns de pesticidas (http://www.alanwood.net/pesticides/); B. Hock, C. Fedtke, RR Schmidt, Herbicidas, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1995. Outros efetores herbicidas são conhecidos a partir do WO 96/26202, WO 97/41116, WO 97/41117, WO 97/41118, WO 01/83459 e WO 2008/074991, bem como a partir de W. Kramer et al. (ed.) “ Modern Crop Protection Compounds ”, Vol. 1, Wiley VCH, 2007 e a literatura ai citada.

[064] Geralmente é preferido utilizar os compostos acima descritos, em combinação com herbicidas que sejam seletivos para a cultura a ser tratada e que complementam o espectro de ervas daninhas controladas por estes compostos na taxa de aplicação utilizada. É ainda geralmente preferido aplicar os compostos da invenção e outros herbicidas complementares ao mesmo tempo, ou como uma formulação combinada ou como uma mistura de tanque.

[065] O termo “ácido nucleico mut-HPPD” refere-se a um ácido nucleico da HPPD possuindo uma sequência que está mutada a partir de um ácido nucleico da HPPD do tipo selvagem e que confere tolerância aumentada ao “herbicida derivado de cumarona” em uma planta na qual ele é expresso. Além disso, o termo “hidroxifenil piruvato dioxigenase mutada (HPPD-mut)” refere-se à substituição de um aminoácido das sequências primárias do tipo selvagem de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, ou 53, uma variante, derivado, homólogo, ortólogo ou parálogo das mesmas, com outro aminoácido. A expressão “aminoácido mutado” será usado a seguir para designar o aminoácido que é substituído por outro aminoácido, designando, assim, o local da mutação na sequência primária da proteína.

[066] Em um exemplo de realização preferido, o polipeptídeo mut- HPPD da presente invenção compreende uma sequência de aminoácidos mutada de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 53.

[067] O termo “ácido nucleico mut-HST” refere-se a um ácido nucleico da HST possuindo uma sequência que está mutada a partir de um ácido nucleico da HST do tipo selvagem e que confere tolerância aumentada ao “herbicida derivado de cumarona” em uma planta na qual ele é expresso. Além disso, o termo “homogentisato solanesil transferase mutada (mut-HST)” refere- se à substituição de um aminoácido nas sequências primárias do tipo selvagem de SEQ ID NO: 48 ou 50 por outro aminoácido. A expressão “aminoácido mutado” será usado a seguir para designar o aminoácido que é substituído por outro aminoácido, designando, assim, o local da mutação na sequência primária da proteína.

[068] Diversas HPPDs e as suas sequências primárias forma descritas no estado da técnica, em particular as HPPDs de bactérias tais como Pseudomonas (Ruetschi et al., Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, WO96/38567), de plantas, como a Arabidopsis (WO96/38567, Genebank AF047834), ou cenoura (WO96/38567, Genebank 87257), Coccicoides (Genebank COITR P), HPPDs de Arabidopsis, Brassica, algodão, Synechocystis e tomate (US 7.297.541), de mamíferos, como rato ou porco. Além disso, foram descritas sequências de HPPD artificiais, por exemplo, na US 6.768.044; US 6.268.549;

[069] Em um exemplo de realização preferido, a sequência de nucleotídeos de (i) compreende a sequência de SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, ou 52, ou uma variante ou derivado da mesma.

[070] Em um exemplo de realização particularmente preferido, o ácido nucleico mut-HPPD da presente invenção compreende uma sequência de ácido nucleico mutada de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 52, ou uma variante ou forma derivada da mesma.

[071] Em outro exemplo de realização preferido, a sequência de nucleotídeos de (ii) compreende a sequência de SEQ ID NO: 47 ou 49, ou uma variante ou derivado da mesma.

[072] Além disso, será compreendido pelo técnico no assunto que as sequências de nucleotídeos de (i) ou (ii) abrangem sequências homólogas, parálogas e ortólogas das SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, ou 52, e respectivamente, SEQ ID NO: 47 ou 49, conforme definido a seguir.

[073] O termo “variante” com relação a uma sequência (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico ou de polipeptídeos, como - por exemplo - uma sequência de nucleotídeos que regula a transcrição da invenção) é usado para se referir a sequências substancialmente similares. Para sequências de nucleotídeos que compreendem um quadro de leitura aberto, variantes incluem aquelas sequências que, por causa da degeneração do código genético, codificam sequências de aminoácidos idênticas às da proteína nativa. As variantes alélicas de ocorrência natural tal como estas podem ser identificadas com o uso de técnicas bem conhecidas da biologia molecular, como, por exemplo, a reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização. As sequências de nucleotídeos variantes incluem também as sequências de nucleotídeos sinteticamente derivadas, tal como aquelas geradas, por exemplo, usando a mutagênese sítio-dirigida, e por quadros de leitura aberto que codificam a proteína nativa, bem como aqueles que codificam um polipeptídeo possuindo substituições de aminoácidos em relação à proteína nativa. Geralmente, as sequências de nucleotídeos variantes da invenção terão pelo menos 30, 40, 50, 60 a 70%, por exemplo, preferencialmente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, até 79%, geralmente pelo menos 80%, por exemplo, 81% - 84%, pelo menos 85%, por exemplo, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, a 98% e 99% de “identidade na sequência” de nucleotídeos com as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO:1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 52, 47 ou 49. Por polipeptídeo “variante” pretende-se dizer um polipeptídeo derivado da proteína de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50 ou 53 pela deleção (chamado truncamento) ou adição de um ou mais aminoácidos na extremidade N-terminal e/ou C-terminal da proteína nativa; deleção ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais na proteína natural; ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais na proteína nativa. Tais variantes podem resultar, por exemplo, do polimorfismo genético ou da manipulação humana. Os métodos para tais manipulações são bem conhecidos no estado da técnica.

[074] Em um exemplo de realização preferido, as sequências de polinucleotídeos da invenção terão pelo menos 30, 40, 50, 60, a 70%, por exemplo, preferencialmente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, até 79%, geralmente pelo menos 80%, por exemplo, 81% - 84%, pelo menos 85%, por exemplo, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, a 98% e 99% de “identidade de sequência” com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 52.

[075] Reconhece-se que as moléculas de polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção abrangem moléculas de polinucleotídeos e polipeptídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos que é suficientemente idêntica às sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos expostas nas SEQ ID NOs: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 52, 47 ou 49 ou com as sequências de aminoácidos expostas nas SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, 48 ou 50. O termo “suficientemente idêntico” é utilizado na presente invenção para se referir a uma primeira sequência de aminoácidos ou nucleotídeos que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos ou equivalentes (por exemplo, com uma cadeia lateral semelhante) a uma segunda sequência de aminoácidos ou nucleotídeos, de tal modo que a primeira e segunda sequência de aminoácidos ou nucleotídeos têm um domínio estrutural comum e/ou atividade funcional comum.

[076] “Identidade de sequência” refere-se à extensão em que duas sequências de aminoácidos ou DNA otimamente alinhadas são invariantes ao longo de uma janela de alinhamento de componentes, por exemplo, nucleotídeos ou aminoácidos. Uma “fração de identidade” para segmentos alinhados de uma sequência teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos que são partilhados pelas duas sequências alinhadas, dividido pelo número total de componentes no segmento da sequência de referência, ou seja, toda a sequência de referência ou uma parte menor definida da sequência de referência. “Porcentagem de identidade” é a fração de identidade vezes 100. O alinhamento ótimo de sequências para alinhar uma janela de comparação é bem conhecido pelos técnicos hábeis no assunto e pode ser realizada por ferramentas, tais como o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, o método de busca de similaridade de Pearson e Lipman, e preferencialmente por implementações informatizadas destes algoritmos, tais como GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA disponível como parte do GCG. Wisconsin Package. (Accelrys Inc. Burlington, Mass.)

[077] Os termos “polinucleotídeo(s)”, “sequência(s) de ácidos nucleicos”, “sequência(s) de nucleotídeos”, “ácido(s) nucleico(s)”, “molécula(s) de ácido(s) nucleico(s)” são utilizados de maneira alternada e referem-se a nucleotídeos, quer seja ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma combinação de ambos, em uma forma polimérica não ramificada de qualquer comprimento.

[078] Formas “derivadas” de uma proteína abrangem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas que têm substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos em relação à proteína não modificada em questão, e que possui atividade biológica e funcional semelhante à da proteína não modificada a partir do qual eles são derivados.

[079] “Homólogos” de uma proteína abrangem peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas que têm substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos em relação à proteína não modificada em questão, e que possui atividade biológica e funcional semelhante à da proteína não modificada a partir do qual eles são derivados.

[080] Uma deleção refere-se à remoção de um ou mais aminoácidos a partir de uma proteína.

[081] Uma inserção refere-se à introdução de um ou mais resíduos de aminoácidos em um local predeterminado de uma proteína. As inserções podem compreender fusões N-terminal e/ou C-terminal, bem como as inserções intra-sequências de um ou vários aminoácidos. Geralmente, as inserções dentro da sequência de aminoácidos serão menores do que as fusões N- ou C-terminais, na ordem de cerca de 1 a 10 resíduos. Exemplos de proteínas ou peptídeos de fusão N- ou C-terminal incluem o domínio de ligação ou o domínio de ativação de um ativador transcricional, como utilizado em sistemas híbridos de duas leveduras, proteínas de revestimento do fago, (histidina)-6-tag, glutationa S-transferase-tag, proteína A, proteína de ligação à maltose, diidrofolato-redutase, epítopo Tag^100, epítopo c - myc, epítopo-FLAG®, lacZ, CMP (calmodulina peptídeo de ligação), epítopo HA, epítopo da proteína C e epítopo VSV.

[082] Uma substituição refere-se à substituição de aminoácidos da proteína por outros aminoácidos que possuem propriedades semelhantes (tais como hidrofobicidade semelhante, hidrofilicidade semelhante, antigenicidade semelhante, ou com propensão para formar ou quebrar estruturas α - helicoidais ou estruturas em folhas-β). As substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos isolados, mas podem ser agrupadas dependendo das restrições funcionais colocadas sobre o polipeptídeo e podem variar de 1 a 10 aminoácidos; as inserções normalmente são de cerca de 1 a 10 resíduos de aminoácidos. As substituições de aminoácidos são preferencialmente substituições de aminoácidos conservadoras. As tabelas de substituições conservadoras são bem conhecidas no estado da técnica (vide, por exemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman & Company (Eds)). TABELA 3 EXEMPLOS DE SUBSTITUIÇÕES CONSERVADORAS DE AMINOÁCIDOS

[083] As substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos podem facilmente ser feitas utilizando técnicas de síntese de peptídeos bem conhecidas no estado da técnica, tais como a síntese peptídica em fase sólida e similares, ou por manipulação de DNA recombinante. Os métodos para a manipulação de sequências de DNA para produzir a substituição, inserção ou deleção variantes de uma proteína são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, as técnicas para produzir mutações de substituição em locais predeterminados no DNA são bem conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto e incluem a mutagênese M13, mutagênese in vitro T7-Gene (USB, Cleveland, OH), mutagênese sítio-dirigida QuickChange (Stratagene, San Diego , CA), mutagênese sítio-dirigida mediada por PCR ou outros protocolos de mutagênese sítio-dirigida.

[084] Em um exemplo de realização, a mutagênese sítio-dirigida para a geração de uma variante da HPPD de SEQ ID NO: 53 é realizada utilizando um ou mais dos primers selecionados dentre o grupo consistindo das SEQ ID NOs: 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 e 129.

[085] Consequentemente, em outro exemplo de realização preferido, a presente invenção refere-se a um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 e 129.

[086] “Derivados” incluem adicionalmente os peptídeos, oligopeptídeos e polipeptídeos que podem compreender, quando comparados com a sequência de aminoácidos da proteína na forma que ocorrem naturalmente, tal como a proteína de interesse, as substituições de aminoácidos por resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente, ou adições de resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente. “Derivados” de uma proteína incluem também os peptídeos, oligopeptídeos e polipeptídeos que compreendem resíduos de aminoácidos naturalmente alterados (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados, e etc) ou resíduos de aminoácidos não naturais em comparação com a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo na sua forma natural. Um derivado pode também compreender um ou mais substituintes não aminoácidos ou adições em relação à sequência de aminoácidos a partir da qual é derivada, por exemplo, uma molécula repórter ou outro ligante, ligado covalentemente ou não covalentemente à sequência de aminoácidos, tais como uma molécula repórter que está ligada para facilitar a sua detecção e resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural em relação à sequência de aminoácidos de uma proteína de ocorrência natural. Além disso, “derivados” também incluem fusões de ocorrência natural da proteína com peptídeos de marcação, tais como FLAG, His6 ou tioredoxina (para uma revisão de peptídeos de marcação, vide Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003).

[087] “Ortólogos” e “parálogos” abrangem conceitos evolucionistas usados para descrever as relações ancestrais de genes. Parálogos são genes dentro da mesma espécie que foram originados por meio da duplicação de um gene ancestral; ortólogos são genes a partir de organismos distintos que foram originados por meio da especiação, e também são derivados a partir de um gene ancestral comum. Uma lista não limitativa de exemplos de tais ortólogos é mostrada na Tabela 1.

[088] É bem conhecido no estado da técnica que parálogos e ortólogos podem partilhar domínios distintos que abrigam resíduos de aminoácidos adequados em determinados locais, tais como bolsas de ligação para substratos específicos ou motivos de ligação para a interação com outras proteínas.

[089] O termo “domínio” refere-se a um conjunto de aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de um alinhamento de sequência de proteínas evolutivamente relacionadas. Enquanto aminoácidos em outras posições podem variar entre homólogos, os aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam aminoácidos que provavelmente são essenciais para estrutura, estabilidade ou função de uma proteína. Identificado pelo seu elevado grau de conservação em sequências alinhadas de uma família de proteínas homólogas, eles podem ser usados como identificadores para determinar se qualquer polipeptídeo em questão pertence a uma família de polipeptídeo anteriormente identificada.

[090] Os termos “motivo” ou “sequência de consenso” referem-se a uma pequena região conservada na sequência de proteínas evolutivamente relacionadas. Os motivos são frequentemente partes de domínios altamente conservados, mas pode também incluir apenas uma parte do domínio, ou pode estar localizado fora do domínio conservado (se todos os aminoácidos do motivo estão fora de um domínio definido).

[091] Existem bases de dados especializadas para a identificação de domínios, por exemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher e Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (Em) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., págs 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)), ou Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002)) Um conjunto de ferramentas para análise de sequências de proteína in silicoestá disponível no servidor de proteômica ExPASy (Instituto Suíço de Bioinformática (Gasteiger et al, ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003)). Os domínios ou motivos também podem ser identificados utilizando técnicas de rotina, tal como por alinhamento de sequências.

[092] Os métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos no estado da técnica, tais métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar o alinhamento global (isto é, que abrange as sequências completas) de duas sequências, que maximiza o número de correspondências e minimiza o número de lacunas (gaps). O algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 40310) calcula a percentagem de identidade de sequência e executa uma análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O programa de computador para a realização da análise BLAST está disponível ao público através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (National Centre for Biotechnology Information - NCBI). Homólogos podem ser facilmente identificados utilizando, por exemplo, o algoritmo de alinhamento de múltiplas sequências ClustalW (versão 1,83), com os parâmetros de alinhamento em pares padrão, e um método de pontuação em percentagem. As percentagens globais de similaridade e identidade também pode ser determinadas utilizando um dos métodos disponíveis no pacote de software MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10; 4: 29. MatGAT: MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences). Uma edição manual em menor escala pode ser realizada para otimizar o alinhamento entre motivos conservados, tal como seria evidente para um técnico do assunto. Além disso, em vez de usar as sequências de comprimento total para a identificação de homólogos, domínios específicos também podem ser utilizados. Os valores de identidade de sequência podem ser determinados ao longo de toda a sequência de ácidos nucleicos ou aminoácidos ou ao longo de domínios selecionados ou motivo(s) conservado(s), utilizando os programas mencionados acima utilizando os parâmetros pré-definidos. Para alinhamentos locais, o algoritmo de Smith-Waterman é particularmente útil (Smith TF., Waterman M.S. (1981) J. Mol. Biol. Biol 147 (1); 195-7).

[093] Os inventores da presente invenção surpreendentemente descobriram que pela substituição de um ou mias resíduos de aminoácidos- chave a tolerância ou resistência de uma planta aos herbicidas pode ser notavelmente aumentada quando comparada com a atividade de enzimas HPPD do tipo selvagem com as SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53. As substituições preferidas da mut-HPPD são aquelas que aumentam a tolerância ao herbicida na planta, mas deixe a atividade biológica da dioxigenase substancialmente não afetada.

[094] Consequentemente, outro objeto da presente invenção refere-se à enzima HPPD, em que em uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, os resíduos de aminoácidos-chave das mesmas são substituídos por qualquer outro aminoácido.

[095] Em um exemplo de realização, os resíduos de aminoácidos- chave de uma enzima HPPD, uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga da mesma, são substituídos por um aminoácido conservado, tal como representado na Tabela 3 acima.

[096] Será compreendido pelo homem da técnica que os aminoácidos localizados em estreita proximidade com as posições de aminoácidos mencionadas abaixo também podem ser substituídos. Assim, em outro exemplo de realização a mut-HPPD da presente invenção compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, ou uma forma variante, derivada, ortóloga, paráloga ou homóloga destas, em que uma posição de aminoácidos de ± 3, ± 2 ou ± 1 aminoácidos a partir de um aminoácido-chave é substituída por qualquer outro aminoácido.

[097] Com base em técnicas bem conhecidas, um padrão de sequência altamente característica pode ser desenvolvida, por meio do qual candidatos mut-HPPD adicionais com a atividade desejada podem ser pesquisados.

[098] A procura de outras mut-HPPD candidatas pela aplicação de um padrão de sequência apropriada também é abrangida pela presente invenção. Será compreendido por um leitor perito na arte que o presente padrão de sequência não é limitado pelas distâncias exatas entre dois resíduos de aminoácidos adjacentes do referido padrão. Cada uma das distâncias entre dois vizinhos nos padrões acima pode, por exemplo, variar independentemente um do outro em até ± 10, ± 5, ± 3, ± 2 ou ± 1 posições de aminoácidos sem afetar substancialmente a atividade desejada.

[099] De acordo com a referida análise funcional e espacial dos resíduos de aminoácidos individuais acima, com base nos dados de cristalografia obtidos de acordo com a presente invenção, podem ser identificadas sequências de aminoácidos parciais únicas de características potencialmente úteis como mut-HPPD candidatas da invenção.

[0100] Em um exemplo de realização particularmente preferido, a forma variante ou derivada da mut-HPPD de SEQ ID NO: 2 é selecionada a partir da seguinte Tabela 4a e substituições de aminoácidos combinadas de mut- HPPD de SEQ ID NO: 2 são selecionadas a partir da Tabela 4b. TABELA 4A (SEQUÊNCIA ID NO: 2): SUBSTITUIÇÕES DE UM ÚNICO AMINOÁCIDO

TABELA 4B (SEQUÊNCIA ID NO: 2): SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDO COMBINADAS

[0101] Deve ser entendido que qualquer aminoácido além dos mencionados nas tabelas acima pode ser utilizado como um substituinte. Ensaios para testar a funcionalidade de tais mutantes estão disponíveis no estado da técnica, e, respectivamente, descritos na seção de exemplo da presente invenção.

[0102] Em um exemplo de realização preferido, a sequência de aminoácidos difere de uma sequência de aminoácidos de uma HPPD de SEQ ID NO: 2 em uma ou mais das seguintes posições: 236, 411, 320, 403, 334, 353, 321, 212, 407.

[0103]Exemplos de diferenças nestas posições de aminoácidos incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes procedimentos: o aminoácido na posição 236 é diferente de alanina; o aminoácido na posição 411 é diferente de ácido glutâmico; o aminoácido na posição 320 é diferente de leucina; o aminoácido na posição 403 é diferente de glicina; a aminoácido na posição 334 é diferente de leucina; a aminoácido na posição 353 é diferente de leucina; o aminoácido na posição 321 é diferente de prolina; o aminoácido na posição 212 é diferente de valina; o aminoácido na posição 407 é diferente de glicina.

[0104]Em alguns exemplos de realização, a enzima mut-HPPD de SEQ ID NO: 2 compreende uma ou mais das seguintes características: o aminoácido na posição 236 é leucina; o aminoácido na posição 411 é treonina; o aminoácido na posição 320 é asparagina, glutamina, histidina ou tirosina; o aminoácido na posição 403 é arginina; o aminoácido na posição 334 é ácido glutâmico; o aminoácido na posição 353 é metionina; o aminoácido na posição 321 é alanina ou arginina; o aminoácido na posição 212 é isoleucina ou leucina; o aminoácido na posição 407 é cisteína.

[0105]Em um exemplo de realização particularmente preferida, a enzima mut-HPPD da presente invenção de SEQ ID NO: 2 compreende uma ou mais das seguintes características: o aminoácido na posição 320 é asparagina; o aminoácido na posição 334 é ácido glutâmico; o aminoácido na posição 353 é metionina; o aminoácido na posição 321 arginina; o aminoácido na posição 212 é isoleucina.

[0106]Em um exemplo de realização adicional particularmente preferido, a forma variante ou derivada da mut-HPPD de SEQ ID NO: 53 é selecionada a partir da Tabela 4c a seguir, e substituições de aminoácidos combinadas de mut-HPPD de SEQ ID NO: 53 são selecionadas a partir da Tabela 4d. TABELA 4C (SEQUÊNCIA ID NO: 53): SUBSTITUIÇÕES DE UM ÚNICO AMINOÁCIDO

TABELA 4D (SEQUÊNCIA ID NO: 53): SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDOS COMBINADAS

[0107] Deve ser entendido que qualquer aminoácido além dos mencionados nas tabelas acima pode ser utilizado como um substituinte. Ensaios para testar a funcionalidade de tais mutantes estão disponíveis no estado da técnica, e, respectivamente, descritos na seção de exemplo da presente invenção.

[0108] Em outro exemplo de realização preferido, a sequência de aminoácidos difere de uma sequência de aminoácidos de uma HPPD de SEQ ID NO: 53 em uma ou mais das seguintes posições: 293, 335, 336, 337, 363, 422, 385, 393, 368, 421.

[0109] Exemplos de diferenças nestas posições de aminoácidos incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes procedimentos: o aminoácido na posição 293 é diferente de glutamina; o aminoácido na posição 335 é diferente de metionina; o aminoácido na posição 336 é diferente de prolina; o aminoácido na posição 337 é diferente de serina; o aminoácido na posição 363 é diferente de ácido glutâmico; o aminoácido na posição 422 é diferente da glicina; o aminoácido na posição 385 é diferente de leucina; o aminoácido na posição 393 é diferente de isoleucina; o aminoácido na posição 368 é diferente de leucina; o aminoácido na posição 421 é diferente de lisina.

[0110] Em alguns exemplos de realização, a enzima HPPD de SEQ ID NO: 53 compreende uma ou mais das seguintes características: o aminoácido na posição 293 é alanina, leucina, isoleucina, valina, histidina, asparagina ou serina; o aminoácido na posição 335 é alanina, triptofano, fenilalanina, leucina, isoleucina, valina, asparagina, glutamina, histidina, tirosina, serina, treonina ou cisteína; o aminoácido na posição 336 é alanina ou arginina; o aminoácido na posição 337 é alanina ou prolina; o aminoácido na posição 368 é metionina ou tirosina; a posição do aminoácido 363 é glutamina; o aminoácido na posição 421 é treonina; o aminoácido na posição 422 é a histidina, metionina, fenilalanina, ou cisteína; o aminoácido na posição 385 é valina ou alanina; a posição do aminoácido 393 é alanina ou leucina.

[0111] Em exemplos de realização particularmente preferidos, a enzima HPPD de SEQ ID NO: 53 compreende uma ou mais das seguintes características: o aminoácido na posição 335 é tirosina ou histidina; o aminoácido na posição 393 é leucina; o aminoácido na posição 385 é valina.

[0112] Em outro exemplo de realização, a enzima HPPD de SEQ ID NO: 53 compreende uma ou mais das seguintes características: o aminoácido na posição 335 é glutamina, asparagina, tirosina, histidina, e preferencialmente é histidina; o aminoácido na posição 336 é arginina ou alanina, e preferencialmente é alanina; e/ou o aminoácido na posição 363 é glutamina.

[0113] Será do conhecimento de um especialista no assunto identificar regiões conservadas e motivos compartilhados entre os homólogos, ortólogos, e parálogos das SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, e respectivamente SEQ ID NO : 48 ou 50, tal como aquelas representadas na Tabela 1. Tendo identificado tais regiões conservadas que podem representar motivos de ligação adequados, os aminoácidos correspondentes aos aminoácidos listados na Tabela 4a e 4b, 4c e 4d podem ser escolhidos para ser substituídos por qualquer outro aminoácido, de preferência por substituições de aminoácidos conservadas conforme mostrado na tabela 3, e mais preferivelmente pelos aminoácidos das tabelas 4a e 4b, 4c e 4d.

[0114] Além disso, a presente invenção refere-se a um método para a identificação de um herbicida derivado de cumarona usando uma mut-HPPD codificada por um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 ou 52, ou uma variante ou derivada destas, e/ou uma mut-HST codificada por um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 47 ou 49 ou uma variante ou derivada destas.

[0115] O referido método compreende as etapas de: a) gerar uma planta ou célula transgênica compreendendo um ácido nucleico que codifica uma mut-HPPD, em que a mut-HPPD é expressa; b) aplicação de um herbicida derivado de cumarona na planta ou célula transgênica de a) e em uma célula ou planta controle da mesma variedade; c) determinação do crescimento ou da viabilidade da planta ou célula transgênica e da célula ou planta controle após a aplicação do referido herbicida derivado de cumarona, e d) seleção dos “herbicida derivado de cumarona” que conferem crescimento reduzido para a célula ou planta controle em comparação com o crescimento da planta ou célula transgênica.

[0116] O termo “célula controle” ou “de planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira, similar tipo selvagem” designa uma planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira, respectivamente, que não tem as características de resistência ao herbicida e/ou polinucleotídeos específicos da invenção que estão aqui descritos. A utilização da expressão “tipo selvagem”, portanto, não pretende implicar que uma planta, tecido vegetal, célula vegetal, ou outra célula hospedeira não possui DNA recombinante no seu genoma, e/ou não possui características de resistência aos herbicidas que são diferentes daquelas divulgadas na presente invenção.

[0117] Outro objeto refere-se a um método de identificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma mut-HPPD que é resistente ou tolerante a um herbicida derivado de cumarona, compreendendo o referido método: e) a geração de uma biblioteca de ácidos nucleicos codificante de mut-HPPD; f) a triagem de uma população de ácidos nucleicos codificante de mut-HPPD resultante pela expressão de cada um dos referidos ácidos nucleicos em uma célula ou planta e o tratamento da referida célula ou planta com um herbicida derivado de cumarona, g) a comparação dos níveis de tolerância ao herbicida derivado de cumarona fornecidos pela referida população de ácidos nucleicos codificante de mut-HPPD com o nível de tolerância ao herbicida derivado de cumarona fornecido por um ácido nucleico codificante de HPPD controle, h) a seleção de pelo menos um ácido nucleico codificante de mut- HPPD que proporciona um nível significativamente aumentado de tolerância a um herbicida derivado de cumarona, em comparação com os proporcionados pelo ácido nucleico que codifica uma HPPD controle.

[0118] Em um exemplo de realização preferido, o ácido nucleico codificante da mut-HPPD selecionado na etapa (d) proporciona, pelo menos, duas vezes mais a resistência ou tolerância a um herbicida derivado de cumarona de uma célula o planta, em comparação com a resistência ou tolerância proporcionada pelo ácido nucleico codificante da HPPD controle.

[0119] Em um exemplo de realização preferido, o ácido nucleico codificante da mut-HPPD selecionado na etapa (d) proporciona, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 500 vezes mais a resistência ou tolerância de uma célula ou planta a um herbicida derivado de cumarona, em comparação com aquela proporcionada pelo ácido nucleico codificante da HPPD controle.

[0120] A resistência ou tolerância pode ser determinada pela geração de uma célula hospedeira ou planta transgênica, preferencialmente uma célula vegetal, compreendendo uma sequência de ácido nucleico da biblioteca da etapa a) e comparando a referida planta transgênica com uma planta ou célula hospedeira controle, preferencialmente uma célula vegetal.

[0121] Outro objeto refere-se a um método de identificação de uma planta ou alga contendo um ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos que codifica uma mut-HPPD ou mut-HST que é resistente ou tolerante a um herbicida derivado de cumarona, compreendendo o referido método: a) a identificação de uma quantidade eficaz de um herbicida derivado de cumarona de uma cultura de células vegetais ou algas verdes, que leva a morte das referidas células. b) o tratamento referidas células vegetais e algas verdes com um agente mutagênico, c) contatando da referida população de células mutagenizadas com uma quantidade eficaz de herbicida derivado de cumarona, identificado em (a), d) a seleção de pelo menos uma célula sobrevivente nestas condições de ensaio, e) a amplificação por PCR e sequenciamento de genes HPPD e/ou HST a partir de células selecionadas em d) e comparando tais sequências com as sequências de genes HPPD ou HST do tipo selvagem, respectivamente.

[0122] Em um exemplo de realização preferido, o agente de mutagênese é etilmetanossulfonato (EMS).

[0123] Muitos métodos conhecidos pelos especialistas na matéria estão disponíveis para obtenção de ácidos nucleicos candidatos adequados para a identificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma mut-HPPD a partir uma variedade de diferentes organismos fonte potenciais, incluindo micróbios, plantas, fungos, algas, etc. culturas mistas bem como fontes ambientais de DNA, tal como o solo. Estes métodos incluem, dentre outros, a preparação de bibliotecas de cDNA ou de ADN genômico, a utilização de primers de oligonucleotídicos adequadamente degenerados, o uso de sondas baseadas em sequências conhecidas ou ensaios de complementação (por exemplo, para o crescimento em tirosina), bem como a utilização da mutagênese e embaralhamento (shuffling) a fim de fornecer sequências codificantes de mut- HPPD recombinadas ou embaralhadas.

[0124] Os ácidos nucleicos compreendendo as sequências codificantes de HPPD candidatas e de controle podem ser expressos em levedura, em uma cepa bactéria hospedeira, uma alga ou uma planta superior, tal como o tabaco ou Arabidopsis e os níveis relativos de tolerância inerente das sequências que codificam a HPPD triadas de acordo com um fenótipo indicador visível da cepa ou planta transformada na presença de diferentes concentrações de herbicida derivado de cumarona selecionado. A dose resposta e as alterações relativas nas doses respostas associadas com estes fenótipos indicadores (formação de cor castanha, inibição do crescimento, efeito herbicida, etc) são convenientemente expressas em termos de, por exemplo, GR50 (concentração para 50% de redução do crescimento) ou MIC (mínima concentração de inibição) em que os aumentos nos valores correspondem a aumentos na tolerância inerente da HPPD expressa. Por exemplo, em um sistema de ensaio relativamente rápido baseada na transformação de uma bactéria tal como a E. coli, cada sequência codificante de mut-HPPD pode ser expressa, por exemplo, como uma sequência de DNA sob o controle de um promotor controlável, tal como o promotor lacZ, e levando em conta, por exemplo, pela utilização de DNA sintético, questões tais como a utilização de códons preferencial de forma se a obter um nível de expressão comparável quanto possível de diferentes sequências HPPD. Tais cepas de expressão de ácidos nucleicos compreendendo as sequências de HPPD candidatas alternativas podem ser colocadas em placas com diferentes concentrações do herbicida derivado de cumarona selecionado em, opcionalmente, um meio suplementado com tirosina e os níveis relativos de tolerância inerente das enzimas HPPD expressas podem ser estimados com base a extensão e valores de MIC para a inibição da formação de pigmentos castanhos, ocronóticos.

[0125] Em outro exemplo de realização, os ácidos nucleicos candidatos, são transformados em material vegetal para gerar uma planta transgênica, regenerado em plantas férteis morfologicamente normais que são então medidas para a tolerância diferencial aos herbicidas derivados de cumarona selecionados. Muitos métodos adequados para a transformação por meio de marcadores de seleção adequados, tais como canamicina, vetores binários, como aqueles a partir de Agrobacterium, e regeneração de plantas, por exemplo, a partir de discos foliares de tabaco são bem conhecidos no estado da técnica. Opcionalmente, uma população de plantas controle também é transformada com um ácido nucleico expressando a HPPD controle. Alternativamente, uma planta dicotiledônea não transformada, tal como a Arabidopsis ou Tabaco, pode ser usada como controle uma vez que esta, em qualquer caso, manifesta a sua própria HPPD endógena. A média e a distribuição dos níveis de tolerância ao herbicida de uma variedade de eventos de transformação de plantas primárias ou seus descendentes para o herbicida derivado de cumarona selecionado a partir da Tabela 2 são avaliadas da maneira normal com base em danos nas plantas, sintomas de branqueamento meristemáticos etc, a uma gama de diferentes concentrações de herbicidas. Estes dados podem ser expressos em termos de, por exemplo, valores de GR50 derivados a partir das curvas dose/resposta com a “dose” representada no eixo x e “percentagem de mortes”, “efeito herbicida”, “números de plantas verdes emergentes” etc. representada no eixo y, onde valores elevados GR50 correspondem a níveis aumentados de tolerância inerente à HPPD expressa. Os herbicidas podem ser adequadamente aplicados pré-emergência ou pós- emergência.

[0126] Outro objeto refere-se a um ácido nucleico isolado que codifica uma mut-HPPD como definido em detalhe acima. Preferencialmente, o ácido nucleico é identificável pelos métodos definidos acima.

[0127] Em outro exemplo de realização, a invenção refere-se a uma célula vegetal transformada por um ácido nucleico mut-HPPD ou do tipo selvagem ou uma célula vegetal que foi mutada para a obtenção de uma planta que expressa um ácido nucleico mut-HPPD ou do tipo selvagem, em que a expressão do ácido nucleico na célula vegetal resulta na resistência ou tolerância aumentadas a um herbicida, preferencialmente um herbicida derivado de cumarona quando comparada com uma variedade do tipo selvagem da célula vegetal.

[0128] O termo “expressão/expressando” ou “expressão gênica” significa a transcrição de um gene específico ou genes específicos ou construção genética específica. O termo “expressão” “expressão gênica”, em particular, significa a transcrição de um gene ou genes ou construção genética em RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA, com ou sem a subsequente tradução deste último em proteína. O processo inclui a transcrição do DNA e processamento do produto mRNA resultante.

[0129] Para obter o efeito desejado, ou seja, plantas que são tolerantes ou resistentes ao herbicida derivado de cumarona da presente invenção, será entendido que o pelo menos um ácido nucleico é “superexpresso” por métodos e meios conhecidos para os técnicos hábeis no assunto.

[0130] O termo “expressão aumentada” ou “superexpressão”, conforme utilizado no presente, significa qualquer forma de expressão que é adicional ao nível de expressão original do tipo selvagem. Os métodos para a expressão crescente de genes ou produtos gênicos estão bem documentados na literatura prévia e incluem, por exemplo, a superexpressão conduzida por promotores apropriados, utilização de promotores de transcrição ou facilitadores (enhancers) da tradução. Os ácidos nucleicos isolados que servem como elementos promotores ou facilitadores podem ser introduzidos em uma posição apropriada (normalmente a montante) de uma forma não heteróloga de um polinucleotídeo, de modo a regular positivamente a expressão de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de interesse. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alterados in vivo por deleção, mutação, e/ou substituição (vide, Kmiec, US 5.565.350,. Zarling et al, WO9322443), ou promotores isoladas podem ser introduzidos em uma célula vegetal com a orientação e distância adequada a partir de um gene da presente invenção de modo a controlar a expressão do gene.

[0131] Se a expressão do polipeptídeo é desejada, geralmente é desejável incluir uma região de poliadenilação na extremidade 3' da região codificante do polinucleotídeo. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de outros genes vegetais, ou de T-DNA. A sequência da extremidade 3' a ser adicionada pode ser derivada, por exemplo, do gene da nopalina sintase ou octopina sintase ou, alternativamente, a partir de outro gene vegetal, ou menos preferencialmente, a partir de qualquer outro gene de eucariotos.

[0132] Uma sequência íntron pode ser acrescentada na região não traduzida 5' ou na sequência codificante da sequência de codificação parcial para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol. Foi demonstrado que a inclusão de um íntron que pode sofrer splicing na unidade de transcrição em construções de expressão em plantas e em animais aumenta em até 1000 vezes a expressão do gene em ambos os níveis: mRNA e proteína. (Buchman e Berg, (1988) Mol. Cell Biol. 8:4395-4405; Callis et al. (1987) Dev Genes. 1:1183-1200). Tal íntron de aprimoramento da expressão gênica é tipicamente maior quando colocado próximo da extremidade 5' da unidade de transcrição. O uso de íntrons do milho Adh1-S íntron 1, 2, e 6, intron Bronze-1 são conhecidos no estado da técnica. Para obter informações gerais, consulte: The Maize Handbook, capítulo 116, Freeling e Walbot, Eds, Springer, NY (1994).

[0133] O termo “introdução” termo ou “transformação” coforme referido no presente abrange a transferência de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independentemente do método utilizado para a transferência. O tecido vegetal capaz de submetido a propagação clonal subsequente, seja por organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com uma construção genética da presente invenção e uma planta inteira é regenerada do mesmo. O tecido específico escolhido irá variar dependendo dos sistemas de propagação clonal disponível para a, e melhor adaptada à espécie específica que está sendo transformada. Exemplos de tecidos alvo incluem discos de folhas, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, megagametófitos, tecido de calos, tecido meristemático existente (por exemplo, meristemas apicais, gemas axilares e meristemas de raiz), e tecido de meristema induzido (por exemplo, meristema cotilédone e meristema hipocótilo). O polinucleotídeo pode ser introduzido de maneira transitória ou estável em uma célula hospedeira e pode ser mantido não integrado, por exemplo, como um plasmídeo. Alternativamente, ele pode ser integrado ao genoma do hospedeiro. A célula vegetal transformada resultante pode então ser usada para regenerar uma planta transformada de uma forma conhecida para os técnicos do assunto.

[0134] A transferência de genes exógenos no genoma de uma planta é chamada de transformação. A transformação de espécies vegetais é atualmente uma técnica bastante rotineira. Vantajosamente, qualquer um dos diversos métodos de transformação pode ser usado para introduzir o gene de interesse em uma célula ancestral adequada. Os métodos descritos para a transformação e regeneração de plantas a partir de tecidos de plantas ou células vegetais podem ser utilizados para a transformação transitória ou estável. Os métodos de transformação incluem a utilização de lipossomas, eletroporação, produtos químicos que aumentem a captação de DNA livre, injeção de DNA diretamente na planta, bombardeamento com arma de partículas, transformação usando vírus ou pólen e microprojeção. Os métodos podem ser selecionados a partir do método de cálcio/polietileno-glicol por protoplastos (Krens, F.A. et al, (1982) Nature 296, 72-74;. Negrutiu I. et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); eletroporação de protoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 10991102); microinjeção em material vegetal (Crossway A. et al, (1986). Mol. Gen Genet 202: 179-185); partículas de bombardeamento revestidas com DNA ou RNA (Klein T.M. et al, (1987.) Nature 327: 70) infecção com vírus (não integrativo) e similares. As plantas transgênicas, incluindo plantas de cultivo transgênicas, são preferencialmente produzidas por meio da transformação mediada por Agrobacterium. Um método de transformação vantajoso é a transformação in planta. Para este fim, é possível, por exemplo, permitir que o Agrobacterium atue sobre as sementes de plantas, ou que o Agrobacterium seja inoculado no meristema de plantas. Provou ser particularmente vantajoso de acordo com a invenção permitir que uma suspensão de Agrobacterium transformados atue na planta intacta ou, pelo menos, sobre um primórdio floral. A planta é cultivada em seguida até que as sementes da planta tratada sejam obtidas (Clough e Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Os métodos para a transformação de arroz mediada por Agrobacterium incluem métodos bem conhecidos para a transformação do arroz, tais como aqueles descritos em qualquer um dos seguintes: pedido de patente EP 1198985 A1, Aldemita e Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al .(Plant Mol. Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), cujas descrições são incorporadas ao presente pela referência como se integralmente expostas. No caso da transformação de milho, o método preferido é tal como o descrito em Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14 (6): 745-50, 1996) ou Frame et al. (Plant Physiol 129 (1): 13-22, 2002), cujas descrições são incorporadas ao presente pela referência como se fossem integralmente expostas. Os referidos métodos são adicionalmente descritos a título de exemplo, em B. Jenes et al, Techniques for Gene Transfer, Em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 e em Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). O ácido nucleico ou construção a ser expressa é preferencialmente clonado em um vetor, que é adequado para a transformação do Agrobacterium tumefaciens, por exemplo, o pBIN19 (Bevan et al., Nucl.Acids Res. 12 (1984) 8711). A agrobactéria transformada por tal vetor pode então ser utilizada de maneira conhecida para a transformação de plantas, tal como as plantas utilizadas como modelo, como a Arabidopsis (a Arabidopsis thalianaestá dentro do escopo da presente invenção não sendo considerada como uma cultivar), ou cultivares como, a título de exemplo, plantas de tabaco, por exemplo, mergulhando as folhas machucadas ou folhas cortadas em uma solução com Agrobacterium e em seguida a cultivando-as em meios adequados. A transformação de plantas por meio do Agrobacterium tumefaciens é descrita, por exemplo, por Hofgen e Willmitzer em Nucl.Acid Res. (1988) 16, 9877 ou é conhecido, inter alia, a partir de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; Em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, págs. 15-38.

[0135] Além da transformação de células somáticas, que depois têm de ser regeneradas em plantas intactas, também é possível transformar células de meristemas de plantas e, em particular, aquelas células que se desenvolvem em gametas. Neste caso, os gametas transformados acompanham o desenvolvimento natural das plantas, dando origem a plantas transgênicas. Assim, por exemplo, as sementes de Arabidopsis são tratadas com o Agrobacterium e são obtidas sementes a partir de plantas em desenvolvimento nas quais certa porção está transformada e, desse modo, são transgênicas [Feldman, K.A. e Marks, M.D. (1987) Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann K. (1992). Em: C Koncz, N-H Chua & J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapura, págs. 274-289]. Os métodos alternativos são baseados na remoção repetida das inflorescências e incubação do sítio de excisão no centro da roseta com o Agrobacterium transformado, por de modo que as sementes transformadas podem igualmente ser obtidas em um momento posterior (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). No entanto, um método particularmente eficaz é o método de infiltração a vácuo com as suas modificações tal como o método de mergulho floral (floral dip). No caso de infiltração a vácuo da Arabidopsis, a planta inteira sob pressão reduzida é tratada com uma suspensão de Agrobacterium [Bechthold, N. (1993).CR Acad Sci Paris Life Sci., 316: 1194-1199], enquanto que no caso do método “floral dip” o tecido floral em desenvolvimento é brevemente incubado com uma suspensão de Agrobacterium tratada com surfactante [Clough, S.J. e Bent A.F. (1998) Plant J. 16, 735-743]. Certa proporção de sementes transgênicas é colhida em ambos os casos, e estas sementes podem ser distinguidas a partir de sementes não transgênicas por meio do crescimento sob as condições seletivas descritas acima. Além disso, a transformação estável de plastídios é vantajosa, pois os plastídios são herdados maternalmente na maioria das culturas, reduzindo ou eliminando o risco de fluxo de transgene através do pólen. A transformação do genoma do cloroplasto é geralmente conseguida através de um processo que foi mostrado esquematicamente em Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. Resumidamente as sequências a serem transformadas são clonadas juntamente com um gene marcador selecionável entre as sequências flanqueadoras homólogas ao genoma do cloroplasto. Estas sequências flanqueadoras homólogas direcionam a integração sítio-específica para o plastoma. A transformação plastidial foi descrita para diversas espécies diferentes de plantas e uma visão geral é dada em Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 21; 312 (3):425-38 ou Maliga, P. (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28. Um progresso biotecnológico adicional foi recentemente relatado na forma de marcador livre plastídios transformantes, os quais podem ser produzidos por um gene marcador cointegrado de maneira transitória (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22 (2), 225-229). As células vegetais geneticamente modificadas podem ser regeneradas por todos os métodos com os quais o trabalhador hábil está familiarizado. Métodos adequados podem ser encontrados nas publicações mencionadas acima por S.D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hofgen e Willmitzer.

[0136] Geralmente, após a transformação, as células vegetais ou agrupamentos de células são selecionados quanto à presença de um ou mais marcadores, que são codificados por genes que podem ser expressos em plantas cotransferidos com o gene de interesse, e em seguida o material transformado é regenerado em uma planta inteira. Para selecionar as plantas transformadas, o material vegetal obtido na transformação é, em geral, submetido a condições seletivas de modo que as plantas transformadas podem ser distinguidas a partir de plantas não transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas da maneira que foi descrita acima podem ser plantadas e, após um período inicial de crescimento, submetidas a uma seleção adequada por pulverização. Outra possibilidade consiste em cultivar as sementes, se for o caso, após a esterilização, em placas de ágar utilizando um agente de seleção adequado, de modo que apenas as sementes transformadas podem crescer em plantas. Alternativamente, as plantas transformadas são pesquisadas quanto à presença de um marcador selecionável, conforme descritos acima.

[0137] Após a transferência de DNA e regeneração, as plantas putativamente transformadas podem também ser avaliadas, por exemplo, usando a análise de Southern, para a avaliação da presença do gene de interesse, do número de cópias e/ou organização genômica. Alternativamente ou adicionalmente, os níveis de expressão do DNA recentemente introduzido podem ser monitorados por meio da análise de Northern e/ou Western, sendo ambas as técnicas bem conhecidas pelos técnicos especialistas no assunto.

[0138] As plantas transformadas geradas podem ser propagadas por uma variedade de meios, como por propagação clonal ou técnicas clássicas de reprodução. Por exemplo, uma primeira geração (ou T1) da planta transformada pode ser autofecundada e a segunda geração homozigótica (ou T2) transformante selecionada, e as plantas T2 podem ser adicionalmente propagadas através de técnicas de melhoramento clássico. Os organismos transformados gerados podem assumir uma variedade de formas. Por exemplo, eles podem ser quimeras de células transformadas e células não transformadas; transformantes clonais (por exemplo, todas as células transformadas contêm o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não transformados (por exemplo, nas plantas, um porta-enxerto (rootstock) transformado enxertado em um enxerto (garfo) não transformado).

[0139] Preferencialmente, o ácido nucleico da HPPD do tipo selvagem ou HPPD-mut (a) ou o ácido nucleico mut-HST ou do tipo selvagem (b) compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir grupo consistindo de: (a) um polinucleotídeo, conforme mostrado na SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 ou 52, ou uma variante ou derivado da mesma; (b) um polinucleotídeo, conforme mostrado na SEQ ID NO: 47 ou 49, ou um variante ou derivado da mesma; (c) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo conforme mostrado na SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, ou um polipeptídeo variante ou derivado da mesma; (d) um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um dentre (a) até (c); e (e) um polinucleotídeo complementar ao polinucleotídeo de qualquer uma de (a) até (d).

[0140] Preferencialmente, a expressão do ácido nucleico em plantas resulta na resistência aumentada das plantas aos herbicidas, preferencialmente herbicidas derivados de cumarona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da planta.

[0141] Em outro exemplo de realização, a invenção refere-se a uma planta, preferencialmente uma planta transgênica, compreendendo uma célula vegetal de acordo com a presente invenção, em que a expressão do ácido nucleico na planta resulta na resistência aumentada da planta aos herbicidas derivados de cumarona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da planta.

[0142] As plantas descritas na presente invenção podem ser tanto plantas de cultivo transgênicas como não transgênicas.

[0143] Para os propósitos da presente invenção, “transgênico”, “transgene” ou “recombinante” significam, em relação a uma sequência de ácido nucleico, cassete de expressão, construção gênica ou vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico ou um organismo transformados com as sequências de ácidos nucleicos, cassetes ou vetores de expressão de acordo com a invenção, todas as construções resultantes de métodos recombinantes, em que: (a) as sequências de ácidos nucleicos que codificam proteínas úteis nos métodos da presente invenção, ou (b) sequência(s) de controle genético que está(ão) operacionalmente ligada(s) à sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção, por exemplo, um promotor; ou (c) a) e b). não estão localizados no seu meio genético natural ou foram modificados por meio de métodos recombinantes, sendo possível que a modificação ocorra sob a forma de, por exemplo, uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeos. O ambiente genético natural é entendido como significando o locusgenômico natural ou locuscromossômico na planta original ou presença em uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da sequência de ácido nucleico é preferencialmente mantido, pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a sequência de ácido nucleico pelo menos em um lado e tem um comprimento de sequência de pelo menos 50 bp, preferivelmente pelo menos 500 bp, muito preferivelmente pelo menos 1000 bp, muito preferivelmente pelo menos 5000 bp. O cassete de expressão de ocorrência natural - por exemplo, a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácidos nucleicos com a sequência de ácido nucleico correspondente que codifica um polipeptídeo útil nos métodos da presente invenção, tal como definido acima - torna-se uma cassete de expressão transgênico quando este cassete de expressão é modificado por métodos não naturais, sintéticos (“artificiais”) tais como, por exemplo, o tratamento mutagênico. Os métodos adequados são descritos, por exemplo, na Patente EUA 5.565.350 ou pedido WO 00/15815.

[0144] Uma planta transgênica, para os propósitos da presente invenção é, portanto, entendida tal exemplificado acima, que os ácidos nucleicos utilizados no método da presente invenção não estão em seu locus natural no genoma da referida planta, sendo possível que os ácidos nucleicos sejam expressos de maneira heteróloga ou homóloga. Entretanto, conforme mencionado, transgênico também significa que, embora o ácido nucleico de acordo com a invenção ou que é utilizado no método inventivo possa estar em sua posição natural no genoma de uma planta, a sequência foi alterada em relação à sequência natural, e/ou as sequências reguladoras foram modificadas em relação as sequências naturais. Transgênico é preferencialmente entendido como a expressão dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção em um locus não natural no genoma, ou seja, ocorre a expressão homóloga ou, preferencialmente, a expressão heteróloga dos ácidos nucleicos. As plantas transgênicas preferidas são mencionadas no presente documento. Além disso, o termo “transgênico” refere-se a qualquer planta, célula vegetal, calos, tecidos vegetais, ou parte de planta, que contém a totalidade ou parte de pelo menos um polinucleotídeo recombinante. Em muitos casos, a totalidade ou parte do polinucleotídeo recombinante está integrado estavelmente em um cromossomo ou elemento extracromossômico estável, de modo que é transmitido para as gerações sucessivas. Para os propósitos da invenção, o termo “polinucleotídeo recombinante” refere-se a um polinucleotídeo que foi alterado, rearranjado ou modificado por engenharia genética. Exemplos incluem qualquer polinucleotídeo clonado, ou polinucleotídeos que estão ligados ou unidos às sequências heterólogas. O termo “recombinante” não se refere a alterações de polinucleotídeos que resultam de eventos que ocorrem naturalmente, tais como mutações espontâneas, ou mutagênese não espontânea seguida pela reprodução seletiva.

[0145] Plantas contendo mutações que surgem devido à mutagênese não espontânea e reprodução seletiva são referidas no presente como as plantas não transgênicas e estão incluídas na presente invenção. Em exemplos de realização em que a planta transgênica compreende diversos ácidos nucleicos mut-HPPD, os ácidos nucleicos podem ser derivados de diferentes genomas ou a partir do mesmo genoma. Alternativamente, em exemplos de realização em que a planta é não transgênica e compreendem múltiplos ácidos nucleicos mut-HPPD, os ácidos nucleicos estão localizados em diferentes genomas ou no mesmo genoma.

[0146] Em alguns exemplos de realização, a presente invenção envolve plantas resistentes ao herbicida que são produzidas pela mutação de reprodução (melhoramento). Tais plantas compreendem um polinucleotídeo que codifica uma mut-HPPD e/ou uma mut-HST e são tolerantes a um ou mais “herbicidas derivados de cumarona”. Tais métodos podem envolver, por exemplo, a exposição das plantas ou sementes a um agente mutagênico, particularmente um agente mutagênico químico tal como, por exemplo, metanossulfonato de etila (EMS), e selecionando as plantas que possuem tolerância melhorada a, pelo menos, um ou mais herbicidas derivados de cumarona.

[0147] No entanto, a presente invenção não está limitada a plantas tolerantes ao herbicida que são produzidas por um método de mutagênese que envolve o mutagênico químico EMS. Qualquer método de mutagênese conhecido no estado da técnica pode ser utilizado para produzir plantas resistentes ao herbicida da presente invenção. Tais métodos de mutagênese podem envolver, por exemplo, a utilização de qualquer um ou mais dos seguintes mutagênicos: radiação tal como raios-X, raios gama (por exemplo, cobalto 60 ou Césio 137), nêutrons, (por exemplo, produtos da cisão nuclear por urânio 235 em um reator atômico), radiação beta (por exemplo, emitida a partir de radioisótopos, tais como o fósforo 32 ou carbono 14), e radiação ultravioleta (de preferência de 250-290 nm), e mutagênicos químicos, tais como os análogos de bases (por exemplo, 5-bromo-uracila), compostos relacionados (por exemplo, 8- etoxi cafeína), antibióticos (por exemplo, estreptonigrina), agentes alquilantes (por exemplo, mostardas de enxofre, mostardas nitrogenadas, epóxidos, etilenaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azidas, hidroxilamina, ácido nitroso, ou acridinas. Plantas resistentes ao herbicida também podem ser produzidas por métodos de cultura de tecido para selecionar células vegetais que compreendam mutações que levam a resistência aos herbicidas e, em seguida, regenerando-as em plantas resistentes ao herbicida. Vide, por exemplo, as Patentes US 5.773.702 e US 5.859.348, ambas integralmente incorporadas ao presente pela referência. Detalhes adicionais de mutação podem ser encontrados em “Principals of Cultivar Development” Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company, cuja divulgação é incorporada ao presente pela referência.

[0148] Além da definição acima, o termo “planta” pretende abranger as plantas de cultivo em qualquer fase da maturidade ou desenvolvimento, bem como quaisquer tecidos ou órgãos (partes da planta) retirados ou derivados de qualquer planta, a menos que seja claramente indicado de outra forma pelo contexto. Partes de plantas incluem, mas não estão limitadas a, caules, raízes, flores, óvulos, estames, folhas, embriões, as regiões meristemáticas, tecido de calos, culturas de antera, gametófitos e esporófitos, pólen, micrósporos, protoplastos e similares.

[0149] A planta da presente invenção compreende pelo menos um ácido nucleico mut-HPPD ou superexpressa o ácido nucleico da HPPD do tipo selvagem, e tem tolerância aumentada a um herbicida derivado de cumarona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da planta. É possível que as plantas da presente invenção tenham múltiplos ácidos nucleicos do tipo selvagem ou mut-HPPD a partir de diferentes genomas uma vez que estas plantas podem conter mais do que um genoma. Por exemplo, uma planta contem dois genomas, geralmente referidos como genomas A e B. Devido a HPPD ser uma enzima metabólica necessária, presume-se que cada genoma tenha pelo menos um gene que codifica a enzima HPPD (ou seja, pelo menos, um gene HPPD). Conforme utilizado no presente, o termo “locus do gene HPPD” refere- se a posição de um gene HPPD em um genoma, e os termos “gene HPPD” e “ácido nucleico HPPD” referem-se a um ácido nucleico que codifica a enzima HPPD. O ácido nucleico HPPD em cada genoma difere em sua sequência de nucleotídeos a partir de um ácido nucleico HPPD do outro genoma. Um técnico hábil no assunto pode determinar o genoma de origem de cada ácido nucleico HPPD pelo de cruzamento genético e/ou métodos de sequenciamento ou métodos de digestão com exonucleases conhecidos no estado da técnica.

[0150] A presente invenção inclui plantas compreendendo um, dois, três, ou mais alelos mut-HPPD, em que a planta possui uma tolerância aumentada a um herbicida derivado de cumarona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da planta. Os alelos mut-HPPD podem compreender uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo de um polinucleotídeo conforme definido na SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 52, ou uma variante ou derivado da mesma, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo conforme definido na SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53 ou uma variante ou derivado, homólogo, ortólogo, parálogo da mesma, um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um dos polinucleotídeos mencionados acima; e um polinucleotídeo complementar de qualquer um dos polinucleotídeos mencionados acima.

[0151] “Alelos” ou “variantes alélicos” são formas alternativas de um dado gene, localizadas na mesma posição cromossômica. Os variantes alélicos abrangem polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), bem como pequenos polimorfismos de inserção/deleção (INDELs). O tamanho dos INDELs é normalmente inferior a 100 pb. SNPs e INDELs formam o maior conjunto de sequências variantes em cepas polimórficas que ocorrem naturalmente na maioria dos organismos.

[0152] O termo “variedade” refere-se a um grupo de plantas dentro de uma espécie definida que partilha um conjunto comum de características ou traços aceitos pelos peritos na técnica como sendo suficientes para distinguir uma variedade de cultivares ou outra cultivar ou variedade. Não há nenhuma implicação em qualquer termo que todas as plantas de uma determinada cultivar ou variedade será geneticamente idêntica tanto em relação a todos os genes quanto no nível molecular, ou que qualquer planta será homozigótica em todos os loci. Uma cultivar ou variedade é considerada “geneticamente pura” para um traço particular se, quando a cultivar ou variedade geneticamente pura é autopolinizada, todos os descendentes contém o traço. Os termos “linhagem de cruzamento” ou “linhagem” refere-se a um grupo de plantas dentro de uma cultivar definida que partilha um conjunto de características ou traços comuns aceitos pelos peritos na técnica como sendo suficientes para distinguir uma linhagem de cruzamento ou linhagem de outra linhagem de cruzamento ou linhagem. Não há nenhuma implicação em qualquer termo que todas as plantas de uma linhagem de cruzamento ou linhagem serão geneticamente idênticas tanto em relação a todos os genes quanto no nível molecular, ou que qualquer planta será homozigótica em todos os loci. Uma linhagem de cruzamento ou apenas linhagem é considerada uma “geneticamente pura” para um traço ou característica particular se, quando a linhagem de cruzamento ou linhagem geneticamente pura é autopolinizada, todos os descendentes contém o traço ou característica. Na presente invenção, a característica resulta de uma mutação em um gene HPPD de uma planta ou semente.

[0153] As plantas resistentes ao herbicida da invenção que compreendem os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos mut-HPPD e/ou mut-HST também encontram uso em métodos para aumentar a resistência ao herbicida de uma planta através do melhoramento (cruzamento) de plantas convencional que envolve a reprodução sexuada. Os métodos compreendem o cruzamento de uma primeira planta que é uma planta resistente ao herbicida da presente invenção com uma segunda planta que pode ser ou não resistente ao mesmo herbicida ou herbicidas como a primeira planta; ou pode ser resistente a um herbicida ou herbicidas diferente daquele da primeira planta. A segunda planta pode ser qualquer planta que é capaz de produzir plantas descendentes viáveis (ou seja, sementes), quando cruzada com a primeira planta. Normalmente, mas não necessariamente, a primeira e segunda plantas são da mesma espécie. Os métodos podem opcionalmente envolver a seleção de progênies vegetais que compreendem os polipeptídeos mut-HPPD e/ou mut- HST da primeira planta e a resistência ao herbicida característica da segunda planta. As plantas descendentes (progênie) produzidas por este método da presente invenção têm resistência aumentada a um herbicida quando comparada com a primeira ou segunda planta ou ambas. Quando a primeira e a segunda planta são resistentes a diferentes herbicidas, as plantas descendentes terão as características de tolerância ao herbicida combinadas da primeira e segunda planta. Os métodos da invenção podem envolver ainda uma ou mais gerações de retrocruzamento das plantas descendentes do primeiro cruzamento com uma planta da mesma linhagem ou genótipo, tal como a primeira ou segunda planta. Alternativamente, a progênie do primeiro cruzamento ou qualquer cruzamento subsequente pode ser cruzada com uma terceira planta que é de uma linhagem ou genótipo diferente do que a primeira ou a segunda planta. A presente invenção também provê plantas, órgãos de plantas, tecidos vegetais, células vegetais, sementes, e células hospedeiras não humanas que são transformadas com a pelo menos uma molécula de polinucleotídeo, cassete de expressão ou vetor de transformação da invenção. Tais plantas, órgãos de plantas, tecidos vegetais, células vegetais, sementes, e células hospedeiras não humanas transformados têm tolerância ou resistência aumentada a pelo menos um herbicida, em níveis de herbicida que matam ou inibem o crescimento de uma planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira não humana não transformados, respectivamente. Preferencialmente, as plantas, tecidos vegetais, células vegetais e sementes transformados da presente invenção são da cultivar Arabidopsis thaliana.

[0154] Deve ser compreendido que a planta da presente invenção pode compreender um ácido nucleico HPPD do tipo selvagem, além de um ácido nucleico mut-HPPD. É contemplado que as linhagens tolerantes ao herbicida derivado de cumarona podem conter uma mutação em apenas uma das várias isoenzimas HPPD. Portanto, a presente invenção inclui uma planta que compreende um ou mais ácidos nucleicos mut-HPPD além de um ou mais ácidos nucleicos HPPD do tipo selvagem.

[0155] Em outro exemplo de realização, a invenção refere-se a uma semente produzida por uma planta transgênica compreendendo uma célula vegetal da presente invenção, em que a semente é geneticamente pura para uma resistência aumentada a um herbicida derivado de cumarona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da semente.

[0156] Em outro exemplo de realização, a invenção refere-se a um método de produção de uma célula vegetal transgênica com uma resistência aumentada a um herbicida derivado de cumarona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da célula vegetal, compreendendo, a transformação da célula vegetal com um cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica uma mut-HPPD ou do tipo selvagem conforme definido acima.

[0157] Em outro exemplo de realização, a invenção refere-se a um método de produção de uma planta transgênica compreendendo, (a) a transformação de uma célula vegetal com um cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica uma mut-HPPD ou do tipo selvagem, e (b) a geração de uma planta com resistência aumentada ao herbicida derivado de cumarona a partir da célula vegetal.

[0158] Consequentemente, ácidos nucleicos mut-HPPD da invenção são fornecidos em cassetes de expressão para expressão na planta de interesse. O cassete irá conter sequências reguladoras operacionalmente ligadas a uma sequência de ácido nucleico mut-HPPD da invenção. O termo “elemento regulador”, conforme utilizado no presente refere-se a um polinucleotídeo que é capaz de regular a transcrição de um polinucleotídeo operacionalmente ligado. Ele inclui, mas não se limita a, promotores, facilitadores “enhancers”, íntrons, 5 'UTRs e 3' UTRs. Com o termo “operacionalmente ligado” pretende-se dizer uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e medeia transcrição da sequência de DNA correspondendo a segunda sequência. Geralmente, operacionalmente ligado significa que as sequências de ácidos nucleicos ligadas são contíguas e, quando necessário para unir duas regiões codificantes de proteínas, contíguas e no mesmo quadro de leitura. O cassete pode adicionalmente conter pelo menos um gene adicional a ser cotransformado dentro do organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(ais) pode(m) ser fornecido(s) em múltiplos cassetes de expressão.

[0159] Tal cassete de expressão é preferencialmente provido de uma diversidade de sítios de restrição para a inserção da sequência de ácido nucleico mut-HPPD para estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O cassete de expressão pode adicionalmente conter genes marcadores de seleção.

[0160] O cassete de expressão incluirá na direção 5'-3' de transcrição, uma região de iniciação de transcrição e tradução (ou seja, o promotor), uma sequência do ácido nucleico mut-HPPD da invenção, e uma região de terminação da transcrição e tradução (ou seja, região de terminação) funcionais em plantas. O promotor pode ser nativo ou análogo, ou exógeno ou heterólogo, para a planta hospedeira e/ou para a sequência de ácido nucleico mut-HPPD da invenção. Além disso, o promotor pode ser de sequência natural ou, alternativamente, uma sequência sintética. Sempre que o promotor é “exógeno” ou “estrangeiro” ou “heterólogo” para a planta hospedeira, pretende- se que o promotor não seja encontrado na planta nativa na qual o promotor é introduzido. Sempre que o promotor é “exógeno” ou “estrangeiro” ou “heterólogo” com a sequência de ácido nucleico mut-HPPD da invenção, pretende-se que o promotor não seja nativo ou de ocorrência natural para a sequência de ácido nucleico mut-HPPD operacionalmente ligada da invenção. Tal como utilizado na presente invenção, um gene quimérico compreende uma sequência codificante operacionalmente ligada a uma região de iniciação da transcrição que é heteróloga para a sequência codificadora.

[0161] Embora possa ser preferível expressar os ácidos nucleicos mut-HPPD da invenção utilizando promotores heterólogos, podem ser utilizadas sequências promotoras nativas. Tais construções alterariam os níveis de expressão da proteína Mut-HPPD na planta ou célula vegetal. Assim, o fenótipo da célula vegetal ou planta é alterado.

[0162] A região terminadora pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, pode ser nativa com a sequência mut-HPPD operacionalmente ligada de interesse, pode ser nativa com a planta hospedeira, ou pode ser derivada de outra fonte (ou seja, exógena ou heteróloga para o promotor, para a sequência de ácido nucleico mut-HPPD de interesse, planta hospedeira, ou qualquer combinação dos mesmos). Regiões de terminação convenientes estão disponíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tal como regiões de terminação da octopina sintase de nopalina sintase. Vide também Guerineau et al. (1991) MoI. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639. Quando apropriado, o(s) gene(s) pode(m) ser otimizado(s) para expressão aumentada na planta transformada. Ou seja, os genes podem ser sintetizados utilizando códons preferenciais de plantas para expressão melhorada. Vide, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11 para uma discussão da utilização preferencial de códon (codon usage) pelo hospedeiro. Estão disponíveis métodos no estado da técnica para a síntese de genes preferidos de plantas. Vide, por exemplo, Patente US 5.380.831, e US 5.436.391, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporados ao presente pela referência.

[0163] Modificações de sequência adicionais são conhecidas para aumentar a expressão de genes em uma célula hospedeira. Dentre estas, incluem a eliminação de sequências codificantes de sinais de poliadenilação espúrios, sinais de locais de splicingéxon-íntron, repetições similares a transposons, e outras sequências bem caracterizadas que podem ser deletérias para a expressão gênica. O conteúdo de G-C da sequência pode ser ajustado para níveis médios para um determinado hospedeiro celular, calculado pela referência de genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de mRNA secundárias em grampo preditas. As sequências nucleotídicas para aumentar a expressão gênica podem também ser utilizadas em vetores de expressão para plantas. Estes incluem os íntrons do gene Adhl de milho, (Callis et al. Genes and Development 1: 1183-1200, 1987), e sequências líderes, (sequência W) a partir do vírus do Mosaico do Tabaco (TMV), Vírus do Mosqueado Clorótico do Milho (Maize Chlorotic Mottle Virus) e vírus do mosaico da alfalfa (Gallie et al. Nucleic Acid Res. 15:8693-8711, 1987 e Skuzeski et al. Plant MoI. Biol. 15:65-79, 1990). O primeiro íntron do locus shrunken-1 de milho foi demonstrado que aumenta a expressão de genes nas construções de genes quiméricos. As Patentes US 5.424.412 e US 5.593.874 divulgam a utilização de íntrons específicos em construções de expressão de genes, e Gallie et al. (Plant Physiol. 106:929-939, 1994) também demonstraram que os íntrons são úteis para a regulação da expressão gênica com base na especificidade do tecido. Para melhorar ainda mais ou para otimizar a expressão do gene mut-HPPD, os vetores de expressão para plantas da invenção também podem conter sequências de DNA que contêm região de interação com a matriz (MARs). As células vegetais transformadas com tais sistemas de expressão modificados, então, podem exibir a superexpressão ou a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos da invenção.

[0164] Os cassetes podem conter ainda sequências líderes 5' na construção do cassete de expressão. Tais sequências líderes podem atuar para aumentar (melhorar) a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos no estado da técnica e incluem: Líderes do picornavirus, por exemplo, líder EMCV (região não codificante 5’ da encefalomiocardite) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. ScL USA 86:6126-6130); líderes do potyvírus, por exemplo, líder TEV (vírus Etch do tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), líder MDMV (Maize Dwarf Mosaic Virus) (Virology 154:9-20), e proteína de ligação da cadeia pesada da imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:9094); líder não traduzido do mRNA da capa protéica do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) em Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nova Iorque), págs. 237-256); e Vírus do Mosqueado Clorótico do Milho (Maize Chlorotic Mottle Virus) (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Vide também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Outros métodos conhecidos para melhorar a tradução também podem ser utilizados, por exemplo, íntrons e semelhantes.

[0165] Na preparação do cassete de expressão, diversos fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a proporcionar as sequências de DNA na orientação correta e, conforme apropriado, no quadro de leitura correto. Para este fim, os adaptadores ou ligantes podem ser utilizados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para proporcionar sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição, ou outros similares. Para esta finalidade, a mutagênese in vitro, reparação de primers, restrição, hibridação, resubstituições, por exemplo, transições e trans versões, podem estar envolvidos.

[0166] Uma série de promotores pode ser usada na prática da invenção. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com outros promotores constitutivos, tecido-preferencial, para a expressão em plantas. Tais promotores constitutivos adequados incluem, por exemplo, o promotor core do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos divulgados no documento WO 99/43838 e Patente US 6.072.050; o promotor core CaMV 35S (Odell et al. Nature 313:810812 (1985)); actina do arroz (McElroy et al. Plant Cell 2:163-171 (1990)); ubiquitina (Christensen et al. Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989) e Christensen et al. Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)); pEMU (Last et al. Theor. Appl. Genet. 81:581-588 (1991)); MAS (Velten et al ., EMBO J. 3:2723-2730 (1984)); promotor ALS (Patente US 5.659.026), e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles citados nas Patentes US 5.608.149, US 5.608.144, US 5.604.121, US 5.569.597, US 5.466.785, US 5.399.680, US 5.268.463, US 5.608.142 e US 6.177.611.

[0167] Promotores tecido-preferenciais podem ser utilizados para melhorara a expressão da mut-HPPD direcionada dentro de um determinado tecido vegetal. Tais promotores tecido-preferenciais incluem, mas não estão limitados a, promotores folha-preferenciais, promotores raízes-preferenciais, promotores sementes-preferenciais, promotores caule-preferenciais. Promotores tecido-preferenciais incluem os divulgados por Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) MoI. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181196; Orozco et al. (1993) Plant MoI Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka . (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Tais promotores podem ser modificados, se necessário, para a expressão fraca. Em um exemplo de realização, os ácidos nucleicos de interesse são orientados para o cloroplasto para a expressão. Desta maneira, quando o ácido nucleico de interesse não é inserido diretamente no cloroplasto, o cassete de expressão irá conter, adicionalmente, uma sequência de direcionamento para o cloroplasto que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo de trânsito para o cloroplasto para direcionar o produto do gene de interesse para os cloroplastos. Tais peptídeos de transito são conhecidos no estado da técnica. Com relação às sequências de direcionamento para os cloroplastos, “operacionalmente ligado” significa que a sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de trânsito (ou seja, a sequência de direcionamento para o cloroplasto) está ligada ao ácido nucleico mut-HPPD da invenção de modo a que as duas sequências são contíguas e estão no mesmo quadro de leitura. Vide, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant MoI. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:1754417550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Qualquer peptídeo de trânsito para o cloroplasto conhecido na arte pode ser fundido com a sequência de aminoácidos de uma proteína mut-HPPD madura da invenção pela ligação operacional de uma sequência de direcionamento para o cloroplasto com a extremidade 5' de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína mut-HPPD madura da invenção. As sequências de direcionamento para o cloroplasto são conhecidas no estado da técnica e incluem a subunidade pequena do cloroplasto da ribulose-1,5-bifosfato- carboxilase (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant MoI. Biol. 30:769780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266 (5) :3335-3342); 5-(enolpiruvil) chiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22 (6) :789-810); triptofano-sintase (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 (11) :6081-6087); plastocianina (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 (33) :20357-20363); corismato sintase (Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268 (36) :27447-27457); e proteína de ligação a/b da clorofila de captura de luz (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996-14999). Vide também, Von Heijne et al. (1991) Plant MoI. Biol. Rep. 9: 104- 126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

[0168] Os métodos para a transformação de cloroplasto são conhecidos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. ScL USA 87:8526-8530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. O método baseia- se na entrega por arma de partículas de DNA contendo um marcador de seleção e direcionamento do DNA para o genoma do plastidial através da recombinação homóloga. Além disso, a transformação plastidial pode ser realizada pela transativação de um transgene de origem plastidial silencioso pela expressão tecido-preferencial de uma RNA polimerase codificada no núcleo e direcionada para o plastídio. Tal sistema foi divulgado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305. Os ácidos nucleicos de interesse a serem direcionados para o cloroplasto podem ser otimizados para a expressão no cloroplasto para explicar as diferenças na utilização preferencial de códon entre o núcleo da planta e esta organela. Desta maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados usando códons preferenciais para cloroplastos. Vide, por exemplo, a Patente US 5.380.831, incorporada ao presente pela referência.

[0169] Em um exemplo de realização preferido, o ácido nucleico da mut-HPPD (a) ou mut-HST (b) compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir grupo consistindo de: (a) um polinucleotídeo, conforme mostrado na SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 ou 52, ou uma variante ou derivado da mesma; (b) um polinucleotídeo, conforme mostrado na SEQ ID NO: 47 ou 49, ou um variante ou derivado da mesma; (c) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo conforme mostrado na SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, ou um variante ou derivado da mesma; (d) um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um dentre (a) até (c); e (e) um polinucleotídeo complementar ao polinucleotídeo de qualquer uma de (a) até (d).

[0170] Preferencialmente, o cassete de expressão compreende ainda uma região reguladora da iniciação da transcrição e uma região reguladora da iniciação da tradução que são funcionais na planta.

[0171] Embora os polinucleotídeos da invenção encontrem uso como genes marcadores selecionáveis para a transformação de plantas, os cassetes de expressão da presente invenção podem incluir outro gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Os genes marcadores selecionáveis, incluindo aqueles da presente invenção, são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem, mas não estão limitados a, genes que codificam a resistência aos antibióticos, tal como aqueles que codificam a neomicina-fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência a compostos herbicidas, tais como glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Vide, do modo geral, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3 :506-511 ; Christophers on et al (1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) MoI Microbiol 6:2419-2422; Barkley et al (1980) em The Operon, págs. 177-220; Hu et al (1987) Cell 48:555-566; Brown et al (1987) Cell 49:603-612; Figge et al (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al (1989) Proc. Natl Acad. AcL USA 86:5400-5404; Fuerst et al (1989) Proc. Natl Acad. ScL USA 86:2549-2553; Deuschle et al (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Tese de Doutorado, University of Heidelberg; Reines et al (1993) Proc. Natl Acad. ScL USA 90: 1917-1921; Labow et al (1990) MoI Cell Biol 10:3343-3356; Zambretti et al (1992) Proc. Natl Acad. ScL USA 89:3952-3956; Bairn et al (1991) Proc. Natl Acad. ScL USA 88:5072-5076; Wyborski et al (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics MoI Struc. Biol 10: 143- 162; Degenkolb et al (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591-1595; Kleinschnidt et al (1988) Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993) Tese de Doutorado, University of Heidelberg; Gossen et al (1992) Proc. Natl Acad. ScL USA 89:5547- 5551; Oliva et al (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913919; Hlavka et al (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al (1988) Nature 334:721-724. Estas divulgações são incorporadas ao presente pela referência. A lista acima de genes marcadores selecionáveis não tem a intenção de ser limitativa. Qualquer gene marcador selecionável pode ser utilizado na presente invenção.

[0172] A invenção provê ainda um vetor de expressão recombinante, isolado, compreendendo o cassete de expressão contendo um ácido nucleico mut-HPPD, conforme descrito acima, em que a expressão do vetor em uma célula hospedeira resulta em tolerância aumentada a um herbicida derivado de cumarona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da célula hospedeira. Conforme utilizado no presente, o termo “vetor” refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ela foi ligada. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça (loop) circular de DNA de fita dupla, ao qual, segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados dentro do genoma viral. Determinados vetores são capazes de realizar replicação autônoma na célula hospedeira a qual foram introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que possuem uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissomais) são integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante a introdução na célula hospedeira, sendo, desta forma, replicado junto com o genoma hospedeiro. Adicionalmente, determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos na presente invenção como “vetores de expressão”. Em geral, os vetores de expressão para uso em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente presentes na forma de plasmídeos. De acordo com o presente relatório descritivo, os termos “plasmídeo” e “vetor” podem ser utilizados de forma alternada, sendo que o termo “plasmídeo” é a forma de vetor mais comumente utilizada. No entanto, a invenção destina-se a incluir essas outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus de replicação defeituosa, adenovírus, e vírus adeno- associados), que desempenham funções equivalentes.

[0173] Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, o que significa que o vetor de expressão recombinante inclui uma ou mais sequências reguladoras selecionadas com base nas células hospedeiras a serem utilizadas para a expressão, a qual está operacionalmente ligada à sequência de ácido nucleico a ser expressa. As sequências reguladoras incluem aquelas que controlam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que controlam a expressão da sequência de nucleotídeos apenas em determinadas células hospedeiras ou apenas sob certas condições. Será reconhecido pelos técnicos hábeis no assunto que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão do polipeptídeo desejado, e etc. Os vetores de expressão da presente invenção podem ser introduzidos nas células hospedeiras para desse modo produzir polipeptídeos ou peptídeos, incluindo polipeptídeos de fusão ou peptídeos codificados por ácidos nucleicos como os descritos na presente invenção (por exemplo, polipeptídeos mut-HPPD, polipeptídeos de fusão, etc).

[0174] Em um exemplo de realização preferido da presente invenção, os polipeptídeos mut-HPPD são expressos em plantas e células vegetais, tais como células vegetais unicelulares (como algas) (vide Falciatore et al. De 1999, Marine Biotechnology 1 (3) :239-251 e suas referências) e células vegetais a partir de plantas superiores (por exemplo, espermatófitas, tais como cultivares). Um polinucleotídeo mut-HPPD pode ser “introduzido” em uma célula vegetal por quaisquer meios, incluindo a transfecção, transformação ou transdução, eletroporação, bombardeamento de partículas, agroinfecção, biolística, e técnicas similares.

[0175] Métodos adequados para a transformação ou transfecção de células hospedeiras, incluindo as células vegetais, podem ser encontrados em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2aEd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) e outros manuais de laboratório, como “Methods in Molecular Biology”, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, Ed.: Gartland & Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Como tolerância aumentada aos herbicidas derivados de cumarona é uma característica geral desejada a ser herdada em uma grande variedade de plantas como milho, trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada, soja, amendoim, algodão, colza e canola, mandioca, pimenta, girassol e tagetes, solanáceas como batata, tabaco, berinjela e tomate, espécies Vicia, ervilha, alfafa, plantas espessas (café, cacau, chá), espécies de Salix, árvores (óleo de palma, coco), gramíneas perenes e culturas forrageiras, estas plantas cultivadas também são plantas preferidas para uso da engenharia genética, como outro exemplo de realização da presente invenção. Em outro exemplo de realização, a planta é uma cultivar. As cultivares forrageiras incluem, mas não estão limitadas a, erva de trigo (wheatgrass), erva amarela (Canarygrass), bromo (bromegrass), plantas do gênero Elymus “wildrye”, Poa (Bluegrass), Dactylis (orchardgrass), alfafa, Salfoin, trevo cornichão (Birdsfoot), trevo híbrido (Alsike Clover), Trifolium (Red Clover) e melilotus (Sweet Clover).

[0176] Em um exemplo de realização da presente invenção, a transfecção de um polinucleotídeo mut-HPPD em uma planta é obtida pela transferência de genes mediada por Agrobacterium. Um método de transformação conhecido pelos especialistas na técnica é a imersão de uma planta em uma solução de Agrobacterium, em que o Agrobacteriumcontém o ácido nucleico mut-HPPD, seguido pelo melhoramento dos gâmetas transformados. A transformação de plantas mediada por Agrobacterium pode ser realizada utilizando, por exemplo, as cepas GV3101 (pMP90) (Koncz e Schell, 1986, Mol.Gen. Genet. 204:383-396) ou LBA4404 (Clontech) de Agrobacterium tumefaciens. A transformação pode ser realizada por técnicas de transformação e regeneração normais (Deblaere et al., 1994, Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. e Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual,2a Ed. - Dordrecht : Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R. & Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton : CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por exemplo, a semente de colza pode ser transformada pela transformação de cotilédones ou hipocótilo (Moloney et al, 1989, Plant Cell Report 8:238-242;. De Block et al, 1989, Plant Physiol. 91:694701). O uso de antibióticos para a seleção de Agrobacterium e plantas depende do vetor binário e da cepa de Agrobacterium utilizados para a transformação. A seleção da colza é normalmente realizada utilizando a canamicina como marcador de seleção da planta. A transferência de genes mediada pelo Agrobacterium para o linho pode ser realizada utilizando, por exemplo, uma técnica descrita por Mlynarova et al., 1994, Plant Cell Report 13:282-285. Adicionalmente, a transformação da soja pode ser realizada utilizando, por exemplo, uma técnica descrita na patente Europeia 0424 047, Patente US 5.322.783, Patente Europeia 0397 687, Patente US 5.376.543, ou Patente US 5.169.770. A transformação do milho pode ser obtida pelo bombardeamento de partículas, captação de DNA mediada pelo polietilenoglicol, ou através da técnica de fibras de carboneto de silício. (Vide, por exemplo, Freeling e Walbot “The maize handbook” Springer Verlag: Nova Iorque (1993) ISBN 3-540-978267). Um exemplo específico da transformação do milho é encontrada na Patente US 5.990.387, e um exemplo específico de transformação do trigo pode ser encontrada na Publicação PCT - WO 93/07256.

[0177] De acordo com a presente invenção, o polinucleotídeo mut- HDDP introduzido pode ser mantido na célula vegetal de maneira estável se ele for incorporado um repliconautônomo não cromossômico ou integrado dentro dos cromossomos vegetal. Alternativamente, o polinucleotídeo mut-HDDP introduzido pode estar presente em um vetor não replicante extracromossômico e ser expressa de maneira transitória ou ser transitoriamente ativo. Em um exemplo de realização, um micro-organismo recombinante homólogo pode ser criado em que o polinucleotídeo mut-HPPD é integrado em um cromossomo, é preparado um vetor que contém pelo menos uma porção de um gene HPPD em que uma deleção, adição ou substituição foi introduzida para desse modo alterar, por exemplo, interromper funcionalmente, o gene HPPD endógeno e criar um gene mut-HPPD. Para criar uma mutação pontual por meio da recombinação homóloga, híbridos DNA-RNA podem ser em uma técnica conhecida como quimeroplastia (Cole-Strauss et al., 1999, Nucleic Acids Research 27 (5) :1323- 1330 e Kmiec, 1999, Gene therapy American Scientist 87 (3) :240-247). Outros processos de recombinação homóloga na espécie Triticumtambém são bem conhecidos no estado da técnica e estão contempladas para a utilização na presente invenção.

[0178] No vetor de recombinação homóloga, o gene mut-HPPD pode ser flanqueado na sua extremidade 5' e 3' por uma molécula de ácido nucleico adicional do gene de HPPD para permitir que a recombinação homóloga ocorra entre o gene mut-HPPD exógeno carregado pelo vetor e um gene HPPD endógeno, em um micro-organismo ou planta. A molécula de ácido nucleico HPPD flanqueadora adicional tem comprimento suficiente para que ocorra a recombinação homóloga bem sucedida com o gene endógeno. Normalmente, várias centenas de pares de bases até quilobases de DNA de flanqueamento (na extremidade 5' e 3') estão incluídas no vetor (vide, por exemplo, Thomas, K.R., e Capecchi, M.R., 1987, Cell 51:503 para uma Descrição de vetores de recombinação homóloga ou Strepp et al., 1998, PNAS, 95 (8) :4368-4373 para cDNA baseado na recombinação em Physcomitrella patens). Entretanto, uma vez que o gene mut-HPPD normalmente difere do gene HPPD em poucos aminoácidos, uma sequência de flanqueamento nem sempre é necessária. O vetor de recombinação homóloga é introduzido em um micro-organismo ou célula vegetal (por exemplo, por meio de DNA mediado por polietilenoglicol), e as células em que o gene mut-HPPD introduzido foi homologamente recombinado com o gene de HPPD endógeno são selecionadas utilizando técnicas conhecidas na arte.

[0179] Em outro exemplo de realização, os micro-organismos recombinantes podem ser produzidos de modo que contenham sistemas selecionados que permitam a expressão regulada do gene introduzido. Por exemplo, a inclusão de um gene mut-HPPD em um vetor colocando-o sob o controle do operon lac permite a expressão do gene mut-HPPD apenas na presença de IPTG. Tais sistemas de regulação são bem conhecidos no estado da técnica.

[0180] Outro aspecto da invenção diz respeito a células hospedeiras em que um vetor de expressão recombinante da invenção foi introduzido. Os termos “célula hospedeira” e “célula hospedeira recombinante” são usados de maneira alternada na presente invenção. Deve-se compreender que tais termos se referem não só à célula em questão em particular, mas que também se aplicam às progênies ou potenciais progênies de tal célula. Pelo fato de que algumas alterações podem ocorrer em gerações sucessivas, tanto devido à mutação quanto por influências ambientais, tal descendente pode, de fato, não ser idêntica a célula-mãe, mas ainda sim está incluída no escopo do termo utilizado no presente. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula, procariótica ou eucariótica. Por exemplo, um polinucleotídeo mut-HPPD pode ser expresso em células bacterianas tais como de C. glutamicum, células de insetos, células de fungos, ou células de mamíferos (tais como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células COS), algas, ciliados, células vegetais, fungos ou outros micro-organismos, como C. glutamicum. Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas pelos hábeis no estado da técnica.

[0181] Uma célula hospedeira da invenção, tal como uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica em cultura, pode ser utilizada para produzir (ou seja, expressar) um polinucleotídeo mut-HPPD. Consequentemente, a invenção provê ainda métodos para a produção de polipeptídeos mut-HPPD usando as células hospedeiras da invenção. Em um exemplo de realização, o método compreende o cultivo da célula hospedeira da invenção (em que um vetor de expressão recombinante que codifica um polipeptídeo mut-HPPD foi introduzido, ou em que foi introduzido no genoma um gene que codifica um polipeptídeo mut-HPPD ou do tipo selvagem) em um meio adequado até o polipeptídeo mut-HPPD ser produzido. Em outro exemplo de realização, o método compreende ainda o isolamento dos polipeptídeos mut- HPPD a partir do meio de cultura ou da célula hospedeira. Outro aspecto da invenção refere-se a polipeptídeos mut-HPPD isolados, e porções biologicamente ativas dos mesmos. Um polipeptídeo “isolado” ou “purificado” ou uma parte biologicamente ativa do mesmo está livre de uma parte do material celular, quando produzido por técnicas de DNA recombinante, ou de precursores químicos ou outros químicos quando sintetizado quimicamente. A linguagem “substancialmente livre de material celular” inclui preparações de polipeptídeo mut-HPPD em que o polipeptídeo está separado de alguns dos componentes celulares das células nas quais ele é produzido naturalmente ou de forma recombinante. Em um exemplo de realização, a expressão “substancialmente livre de material celular” inclui preparações de um polipeptídeo mut-HPPD possuindo menos do que cerca de 30% (em peso seco) de material não mut- HPPD (também referido na presente invenção como um “polipeptídeo contaminante”), mais preferivelmente menos do que cerca de 20% de material não mut-HPPD, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10% de material não mut-HPPD, e mais preferivelmente menos do que cerca de 5% de material não mut-HPPD.

[0182] Quando o polipeptídeo mut-HPPD, ou parte biologicamente ativa do mesmo é produzido de forma recombinante, ele também é preferencialmente substancialmente livre de meio de cultura, ou seja, o meio de cultura representa menos do que cerca de 20%, mais preferivelmente menos do que cerca de 10%, e mais preferencialmente menos do que cerca de 5% do volume da preparação de polipeptídeo. A linguagem “substancialmente livre de precursores químicos ou outras substâncias químicas” inclui preparações de polipeptídeo mut-HPPD em que o polipeptídeo é separado a partir de precursores químicos ou outros produtos químicos que estão envolvidas na síntese do polipeptídeo. Em um exemplo de realização, a linguagem “substancialmente livre de precursores químicos ou outras substâncias químicas” inclui preparações de um polipeptídeo mut-HPPD possuindo menos do que cerca de 30% (em peso seco) de precursores químicos ou produtos químicos não mut-HPPD, mais preferencialmente menos do que cerca de 20% de precursores químicos ou produtos químicos não mut-HPPD, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10% de precursores químicos ou produtos químicos não mut-HPPD, e mais preferivelmente ainda menos do que cerca de 5% de precursores químicos ou produtos químicos não mut-HPPD. Em exemplos de realização preferidos, os polipeptídeos isolados, ou porções biologicamente ativas destes, não possuem polipeptídeos contaminantes a partir do organismo do qual o polipeptídeo mut-HPPD é derivado. Normalmente, tais polipeptídeos são produzidos pela expressão recombinante de, por exemplo, um polipeptídeo mut-HPPD em outras plantas, e micro-organismos, tais como C. glutamicum, ciliados, algas ou fungos.

[0183] Conforme descrito acima, a presente invenção ensina composições e métodos para aumentar a tolerância ao herbicida derivado de cumarona em uma cultivar ou semente, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da planta ou semente. Em um exemplo de realização preferido, a tolerância derivado de cumarona de uma cultivar ou semente é aumentada de modo a que a planta ou a semente pode resistir a uma aplicação do herbicida derivado de cumarona de preferência por cerca de 1-1000 g ha-1, mais preferivelmente 20-160 g ai ha-1, e mais preferivelmente 40-80 g ia ha-1. Conforme utilizado no presente, “resistir” ou “suportar” uma aplicação do herbicida derivado de cumarona significa que a planta não foi morta nem lesionada por tal aplicação.

[0184] Além disso, a presente invenção fornece métodos que envolvem o uso de pelo menos um herbicida derivado de cumarona, conforme ilustrado na Tabela 2.

[0185] Nestes métodos, o herbicida derivado de cumarona pode ser aplicado por qualquer método conhecido no estado da técnica, incluindo, mas não se limitado ao tratamento de sementes, tratamento do solo, e tratamento foliar. Antes da aplicação, o herbicida derivado de cumarona pode ser convertido nas formulações habituais, por exemplo, soluções, emulsões, suspensões, pó fino, pó, pastas e granulados. A forma de uso depende da finalidade específica; em cada caso, deve-se garantir uma distribuição fina e uniforme do composto de acordo com a invenção.

[0186] Ao fornecer plantas com tolerância aumentada ao herbicida derivado de cumarona, uma ampla variedade de formulações pode ser utilizada para proteger as plantas de ervas daninhas, de modo a aumentar o crescimento das plantas e reduzir a competição por nutrientes. Um herbicida derivado de cumarona pode ser usado sozinho para o controle de ervas daninhas na pré- emergência, pós-emergência, pré-plantio e plantio em áreas que rodeiam as cultivares descritas no presente, ou uma formulação de herbicida derivado de cumarona que contenha outros aditivos pode ser usada. O herbicida derivado de cumarona também pode ser utilizado como um tratamento de semente. Aditivos encontrados em uma formulação de herbicida derivado de cumarona incluem outros herbicidas, detergentes, adjuvantes, agentes de espalhamento, agentes de adesão, agentes estabilizantes, ou similares. A formulação de herbicida derivado de cumarona pode ser uma preparação seca ou úmida e pode incluir, mas não está limitado a, pó fluido, concentrados emulsionáveis e concentrados líquidos. As formulações de herbicidas e herbicidas derivados de cumarona podem ser aplicadas de acordo com métodos convencionais, por exemplo, pela pulverização, irrigação, polvilhamento, ou métodos similares.

[0187] As formulações adequadas estão descritas em detalhes nas publicações PCT/EP2009/063387 e PCT/EP2009/063386, que são incorporadas ao presente pela referência.

[0188] Deve ser compreendido que a descrição anterior refere-se a exemplos de realização preferidos da presente invenção e que numerosas alterações podem ser feitas sem nos afastarmos do escopo da invenção. A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos, que não devem ser interpretados de forma alguma como impondo limitações ao seu escopo. Pelo contrário, deve ser claramente entendido que pode-se recorrer a vários outros exemplos de realização, modificações e equivalentes destes, os quais, após a leitura da presente descrição, podem sugerir para os técnicos peritos no assunto sem se afastar do espírito do presente invenção e/ou do escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 SÍNTESE E SUBCLONAGEM DE GÊNICA

[0189] Outros genes codificantes da HPPD do tipo selvagem ou mutada foram sintetizados pela Geneart (Regensburg, Alemanha) ou Entelechon (Regensburg, Alemanha) e subclonados em um vetor de expressão pET24D modificado (Novagen) resultado em construções de expressão marcadas com uma cauda de seis histidinas na extremidade N-terminal (His-tagged).

CLONAGEM DA HPPD DE ARABIDOPSIS THALIANA

[0190] A sequência codificante parcial da AtHPPD de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 52) é amplificada por técnicas de PCR convencionais a partir do cDNA de Arabidopsis Thaliana utilizando os primers HuJ101 e HuJ102 (Tabela 5). TABELA 5 PRIMERSDE PCR PARA A AMPLIFICAÇÃO DE ATHPPD

[0191] O produto da PCR é clonado no vetor pEXP5-NT/TOPO®(Invitrogen, Carlsbad, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo resultante pEXP5-NT/TOPO®-AtHPPD é isolado a partir da E. coli TOP10 realizando uma minipreparação de plasmídeo. O cassete de expressão codificante da AtHPPD marcado com His (His6-tagged) na extremidade N- terminal é confirmado pelo sequenciamento de DNA.

EXEMPLO 2 EXPRESSÃO HETERÓLOGA E PURIFICAÇÃO DE ENZIMASHPPD RECOMBINANTES

[0192] As enzimas HPPD recombinantes são produzidas e expressas em E. coli. Células (DE3) BL21 quimicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, EUA) foram transformadas com o vetor pEXP5-NT/TOPO® (vide o Exemplo 1) ou com outros vetores de expressão de acordo com as instruções do fabricante.

[0193] As células transformadas são cultivadas em meio de autoindução (ZYM 5052 suplementado com 100 μg/mL de ampicilina), durante 6 horas a 37 °C, seguido de 24h a 25 °C.

[0194] Em uma OD600 (densidade ótica a 600 nm), 8 a 12, células são coletadas por centrifugação (8000 x g). O sedimento (pellet) de células foi resuspenso em tampão de lise (50 mM de tampão fosfato de sódio, 0,5 M de NaCl, 10 mM de imidazol, pH 7,0) suplementado com mistura de EDTA sem inibidor de protease completa (Roche Diagnostics) e homogeneizado usando um Avestin Press. O homogeneizado é clarificado pela centrifugação (40.000 x g). A HPPD His6-tagged ou variantes mutados são purificados por cromatografia de afinidade em uma coluna Ni-IDA 1000 (Macherey-Nagel) de acordo com as instruções do fabricante. A HPPD ou variantes mutados purificados são dialisados contra 100 mM de fosfato de sódio tampão pH 7,0, suplementado com 10% de glicerina e armazenadas a -86 °C. O teor de proteína é determinado de acordo com o método de Bradford, utilizando o ensaio de proteína Bio-Rad (Bio- Rad Laboratories, Hercules, EUA). A pureza da preparação de enzima é estimada por SDS-PAGE.

EXEMPLO 3 ENSAIO PARA A ATIVIDADE HPPD

[0195] A HPPD produz o ácido homogentísico e CO2 a partir de 4- hidroxifenilpiruvato (4-HPP) e O2. O ensaio de atividade da HPPD é baseado na análise de ácido homogentísico por HPLC de fase reversa.

[0196] Método (A):

[0197] A mistura de ensaio pode conter 150 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,0, 50 mM de ácido L-ascórbico, 1 μM FeSO4 e 7 μg de enzima purificada em um volume total de 1 mL.

[0198] Os inibidores são dissolvidos em DMSO (dimetil sulfóxido), em uma concentração de 20 mM ou 0,5 mM, respectivamente. A partir desta solução estoque, diluições seriadas de cinco vezes são preparadas em DMSO, que são usadas no ensaio. A respectiva solução de inibidor corresponde a 1% do volume do ensaio. Assim, as concentrações finais de inibidor variam de 200 μM a 2,5 nM ou de 5 μM a 63 pM, respectivamente.

[0199] Após uma pré-incubação de 30 min, a reação é iniciada pela adição de 4-HPP para uma concentração final de 0,1 mM. A reação é deixada prosseguir durante 120 min em temperatura ambiente. A reação é interrompida pela adição de 100 μL de ácido fosfórico 4,5 M.

[0200] A amostra é extraída em um cartucho Oasis® HLB 3cc/60mg (Waters), que foi pré-equilibrado com 63 mM de ácido fosfórico. Ácido L- ascórbico é lavado com 3 ml de ácido fosfórico a 63 mM. O homogeneizado é eluído com 1 mL de uma mistura 1:1 de 63 mM de ácido fosfórico e metanol (p/p).

[0201] 10 mL do eluato são analisados por HPLC de fase reversa em uma coluna Symmetry® C18 (tamanho de partícula 3,5 μm, dimensões de 4,6 x 100 mm; Waters) usando 5 mM de H3PO4/15% de etanol (p/p), como eluente.

[0202] O ácido homogentísico é detectado eletroquimicamente e quantificado pela medição das áreas de pico (Empower software; Waters).

[0203] As atividades são normalizadas definindo a atividade da enzima não inibida a 100%. Valores de IC50 são calculados por meio de regressão não linear.

[0204] Método (B):

[0205] A mistura de ensaio pode conter 150 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,0, 50 mM de ácido L-ascórbico, 100 μM de catalase (Sigma- Aldrich), 1 μM FeSO4 e 0,2 unidades de enzima HPPD purificada em um volume total de 505 μL. 1 unidade é definida como a quantidade de enzima que é necessária para produzir 1 nmol de HGA por minuto a 20 °C.

[0206] Após uma pré-incubação de 30 min, a reação é iniciada pela adição de 4-HPP para uma concentração final de 0,05 mM. A reação é deixada prosseguir durante 45 min em temperatura ambiente. A reação é interrompida pela adição de 50 μL de ácido fosfórico 4,5 M. A amostra é filtrada através de um filtro PVDF com tamanho de poro de 0,2 μM.

[0207] 5 μL da amostra limpa são analisados em uma coluna UPLC HSS T3 (tamanho de partícula 1,8 μm, dimensões 2,1 x 50 mm; Waters) por eluição isocrática utilizando 90% de NaH2PO4 20 mM pH 2,2, 10% de metanol (v/v).

[0208] O HGA é detectado eletroquimicamente a 750 mV (modo: DC; polaridade: positiva) e quantificado pela integração das áreas de pico (Enpower software, Waters).

[0209] Os inibidores são dissolvidos em DMSO (dimetil sulfóxido), em uma concentração de 0,5 mM. A partir desta solução estoque, diluições seriadas de cinco vezes são preparadas em DMSO, que são usadas no ensaio. A respectiva solução de inibidor corresponde a 1% do volume do ensaio. Assim, as concentrações finais de inibidor variam de 5 μM a 320 pM, respectivamente. As atividades são normalizadas definindo a atividade da enzima não inibida a 100%. Valores de IC50 são calculados por meio de regressão não linear.

EXEMPLO 4 CARACTERIZAÇÃO IN VITRODE ENZIMASHPPD DO TIPO SELVAGEM

[0210] Utilizando métodos que estão descritos nos exemplos acima ou conhecidos no estado da técnica, as enzimas HPPD do tipo selvagem recombinantes, purificadas, são caracterizadas com relação às suas propriedades cinéticas e sensibilidade à inibição pelos herbicidas. As Constantes aparentes de Michaelis (Km) e as velocidades de reação máximas (Vmax) são calculadas por regressão não linear com o software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, EUA), utilizando um modelo de inibição pelo substrato. Os valores kcat aparentes são calculados a partir da Vmax assumindo 100% de pureza da preparação de enzima. A média ponderada (por erro padrão) da Km e os valores de IC50 são calculados a partir de pelo menos três experimentos independentes. A equação de Cheng-Prusoff para a inibição competitiva (Cheng, Y.C., Prusoff, W.H. Biochem Pharmacol 1973, 22, 30993108) é usada para calcular as constantes de dissociação (Ki).

[0211] O desempenho de campo da enzima HPPD, que é utilizado como uma característica de tolerância ao herbicida pode depender não apenas na sua falta de sensibilidade em relação aos herbicidas inibidores de HPPD, como também sobre a sua atividade. Para avaliar o desempenho potencial de uma característica de tolerância ao herbicida um índice de tolerância (TI) é calculado usando a seguinte fórmula:

[0212] A fácil comparação e classificação de cada característica são permitidas pela normalização de cada índice de tolerância na HPPD de Hordeum.

[0213] Exemplos dos dados obtidos em um ensaio in vitroestão apresentados na Tabela 6 e na Tabela 7. TABELA6 DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE MICHAELIS (KM) PARA 4-HPP, NÚMEROS DE RENOVAÇÃO( TURNOVER NUMBER) (KCAT), EFICIÊNCIA CATALÍTICA (KCAT/KM), CONSTANTE DE DISSOCIAÇÃO (KI) E ÍNDICE DE TOLERÂNCIA (TI) DAS ENZIMAS HPPD DE ARABIDOPSIS E HORDEUM.

Os herbicidas derivados de cumarona utilizados neste exemplo são 3-[2,4- dicloro-3-(3-metil-4,5-dihidroisoxazol-5-il)phenil]-1-(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo- pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inibidor 1) e 1-(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo-3-(2,4,6-tricloro- 3-piridil)pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inibidor 2). TABELA7 ÍNDICES DE TOLERÂNCIA NORMALIZADOS DE DIVERSAS ENZIMASHPPD

[0214] Os herbicidas derivados de cumarona utilizados neste exemplo são 3-[2,4-dicloro-3-(3-metil-4,5-dihidroisoxazol-5-il)phenil]-1-(2,2- difluoroetil)-2,2-dioxo-pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inibidor 1) e 1-(2,2-difluoroetil)-2,2- dioxo-3-(2,4,6-tricloro-3-piridil)pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inibidor 2).

[0215] Pode ser observado a partir dos exemplos precedentes que uma enzima HPPD pode ser selecionada como uma que é resistente aos herbicidas derivados de cumarona. Pode ser observado que o índice de tolerância desta enzima é mais elevado do que o índice de tolerância da enzima de referência. Por exemplo, a HPPD de Picrophilusé particularmente útil como um gene que confere tolerância ao herbicida na presente invenção, pois seu índice de tolerância é muito maior do que para a HPPD de Hordeum.

[0216] Além disso, estes exemplos mostram que uma enzima HPPD pode ser selecionada como uma que fornece tolerância ao Inibidor 1 e Inibidor 2 derivado de cumarona, pois verificou-se que o índice de tolerância ao Inibidor 1 e Inibidor 2 com, por exemplo, a enzima HPPD de Picrophilusé muito maior do que os índices de tolerância de outras enzimas HPPD.

[0217] É evidente que qualquer enzima HPPD que seja resistente aos herbicidas derivados de cumarona, mesmo que esta proteína não esteja exemplificada neste texto, faça parte do objeto da presente invenção.

EXEMPLO 5 MUTAGÊNESE RACIONAL

[0218] Por meio da biologia estrutural e alinhamento de sequências, é possível escolher um certo número de aminoácidos que podem estar envolvidos, diretamente ou indiretamente, na ligação de “herbicidas derivados de cumarona” e, em seguida, mutagenizá-los para se obter enzimas HPPD tolerantes.

(A) MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA

[0219] Mutagênese sítio-dirigida baseada em PCR é feita com o kit de mutagênese sítio-dirigida QuikChange II Site-Direted Mutagenesis Kit (Stratagene, Santa Clara, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Esta técnica requer dois primers de DNA sintetizados quimicamente (primer direto e reverso) para cada mutação. Os primers exemplificados que podem ser utilizados para a mutagênese sítio-dirigida da AtHPPD (SEQ ID NO: 52/53) estão listados na Tabela 7. TABELA 8 PRIMERSDE PCR PARA A MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA DA ^THPPD (SEQ ID NOs: 56 A 121)

[0220] Os primers exemplificados que podem ser utilizados para a mutagênese sítio-dirigida da HvHPPD (SEQ ID NO: 1/2) estão listados na Tabela 8. TABELA 9 PRIMERS DE PCR PARAA MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA DA HVHPPD (SEQ ID NOS: 122-129)

[0221] Os plasmídeos mutantes são isolados a partir da E. coli TOP10 realizando uma minipreparação de plasmídeos e confirmando por sequenciamento de DNA.

[0222] A combinação das substituições de um único aminoácido é obtida por uma abordagem de mutagênese por etapas.

(B) CARACTERIZAÇÃO IN VITRO DAS HPPD MUTANTES DE HORDEUM

[0223] As enzimas HPPD mutantes purificadas são obtidas pelos métodos descritos acima. As medições dose-resposta e medições cinéticas são realizadas utilizando o ensaio de atividade da HPPD descrito. As Constantes aparentes de Michaelis (Km) e as velocidades de reação máximas (Vmax) são calculadas por regressão não linear com o software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, EUA), utilizando um modelo de inibição pelo substrato. Os valores kcat aparentes são calculados a partir da Vmax assumindo 100% de pureza da preparação de enzima. A média ponderada (por erro padrão) da Km e os valores de IC50 são calculados a partir de pelo menos três experimentos independentes. A equação de Cheng-Prusoff para a inibição competitiva (Cheng, Y.C., Prusoff, W.H. Biochem Pharmacol 1973, 22, 30993108) é usada para calcular as constantes de dissociação (Ki).

[0224] O desempenho de campo da enzima HPPD otimizado, que é utilizado como uma característica de tolerância ao herbicida pode depender não apenas na sua falta de sensibilidade em relação aos herbicidas inibidores de HPPD, como também sobre a sua atividade. Para avaliar o desempenho potencial de uma característica de tolerância ao herbicida um índice de tolerância (TI) é calculado usando a seguinte fórmula:

[0225] A fácil comparação e classificação de cada característica são permitidas pela normalização do índice de tolerância no respectivo tipo selvagem.

[0226] Exemplos dos dados obtidos estão representados na Tabela 10 e Tabela 11. TABELA 10 ÍNDICES DE TOLERÂNCIA NORMALIZADOS DE DIVERSAS HPPD MUTANTES GERADAS NA HPPD DE HORDEUM (SEQ ID: 1/2)

[0227] Os herbicidas derivados de cumarona utilizados neste exemplo são 3-[2,4-dicloro-3-(3-metil-4,5-dihidroisoxazol-5-il)phenil]-1-(2,2- difluoroetil)-2,2-dioxo-pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inibidor 1) e 1-(2,2-difluoroetil)-2,2- dioxo-3-(2,4,6-tricloro-3-piridil)pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inibidor 2). TABELA 11 ÍNDICES DE TOLERÂNCIA NORMALIZADOS DE DIVERSAS HPPD MUTANTES GERADAS NA HPPD DE ARABIDOPSIS (SEQ ID: 53)

[0228] Os herbicidas derivados de cumarona utilizados neste exemplo são 3-[2,4-dicloro-3-(3-metil-4,5-dihidroisoxazol-5-il)phenil]-1-(2,2- difluoroetil)-2,2-dioxo-pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inibidor 1) e 1-(2,2-difluoroetil)-2,2- dioxo-3-(2,4,6-tricloro-3-piridil)pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inibidor 2).

[0229] Pode ser observado a partir dos exemplos precedentes que uma enzima HPPD mutada pode ser selecionada como aquela que é resistente aos herbicidas derivados de cumarona, pois se verificou que o índice de tolerância desta mutante é maior do que o índice de tolerância da enzima do tipo selvagem não modificada. Por exemplo, a troca de Leu na posição 320 (SEQ ID: 2) por His leva a um aumento no índice de tolerância para o Inibidor 1 e 2. Outro exemplo é a troca de Met na posição 335 (SEQ ID: 53) por His que leva a um aumento no índice de tolerância para o Inibidor 1.

[0230] Também pode ser observado que a combinação selecionada de várias mutações pontuais juntas leva a um aumento no índice de tolerância.

[0231] É evidente que qualquer mutação ou combinação de mutações que tornam possível a obtenção de uma enzima HPPD que é resistente aos herbicidas derivados de cumarona, mesmo que esta proteína não esteja exemplificada neste texto, é parte do objeto da presente invenção.

EXEMPLO 6 PREPARAÇÃO DE PLANTAS QUE EXPRESSAM ENZIMASHPPD E/OU HST HETERÓLOGAS E QUE SÃO TOLERANTES AOS “HERBICIDAS DERIVADOS DE CUMARONA”

[0232] Vários métodos para a produção de plantas transformadas de forma estável são bem conhecidos no estado da técnica.

[0233] As plantas de soja (Glycine max) e milho (Zea mays) tolerantes ao herbicida derivado de cumarona podem ser produzidas pelo método descrito por Olhoft et al.(Patente US 2009/0049567). Resumidamente, os polinucleotídeos codificantes da HPPD ou HST são clonados em um vetor binário, utilizando técnicas de clonagem convencionais, conforme descrito por Sambrook et al. (Molecular Cloning (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press). A construção final contém um vetor ou sequência codificante de HPPD ou HST flanqueada por uma sequência promotora (por exemplo, o promotor da ubiquitina (PcUbi)) e uma sequência terminadora (por exemplo, o terminador da nopalina sintase (NOS)) e um cassete com gene marcador de resistência (por exemplo, AHAS) (Figura 3). Opcionalmente, o gene da HST ou HPPD pode proporcionar os meios de seleção.

[0234] A transformação mediada pelo Agrobacteriumé usada para introduzir o DNA em células de meristemas axilares de soja no nó principal de explantes de plântulas. Após a inoculação e cucultivo com Agrobacterium, os explantes são transferidos para meio de indução de brotos sem seleção durante uma semana. Os explantes são posteriormente transferidos para o meio de indução de brotos com 1-3 μM de imazapir (Arsenal) por 3 semanas para selecionar as células transformadas. Os explantes com pads de calos/brotos saudáveis no nó primário são então transferidos para o meio de alongamento de brotos contendo 1-3 μM imazapir até que o broto cresça (alongue) ou até que o explante morra. Após a regeneração, os transformantes são transplantados para o solo em pequenos vasos, colocados em câmaras de crescimento (16 hr dia / 8 horas noite; a 25 °C dia/23 °C noite, 65% de umidade relativa; 130-150 mE m-2 s-1) e subsequentemente testado para a presença de T-DNA por meio de análise Taqman. Após algumas semanas, eventos transgênicos positivos de cópia única, saudáveis, são transplantados para vasos maiores e deixados crescer na câmara de crescimento.

[0235] A transformação de plantas de milho é feita através de um método descrito por McElver e Singh (WO 2008/124495). As construções de vetores de transformação de plantas contendo as sequências HPPD ou HST são introduzidas em embriões imaturos de milho através de transformação mediada pelo Agrobacterium. As células transformadas são selecionadas nos meios de seleção suplementados com 0,5-1,5 imazetapir 0,5-1,5 μM por 3-4 semanas. As plântulas transgênicas são regeneradas em meio de regeneração de plantas e em seguida enraizadas. As plântulas transgênicas são submetidas a análise de TaqMan para a presença do transgene antes de serem transplantadas para mistura de envasamento e cultivadas até a maturidade em estufa.

[0236] A Arabidopsis thalianaé transformada com sequências HPPD ou HST pelo método de mergulho floral (floral dip) conforme descrito por McElver e Singh (WO 2008/124495). As plantas de Arabidopsistransgênicas são submetidas à análise TaqMan para análise do número de loci de integração.

[0237] A transformação da Oryza sativa (arroz) é realizada pela transformação de protoplastos conforme descrito por Peng et al. (US 6.653.529).

[0238] A planta transgênica T0 ou T1 de soja, milho, arroz e Arabidopsis thaliana contendo sequências HPPD ou HST são testadas quanto à tolerância melhorada aos “herbicidas derivados de cumarona” em estudos de estufa.

EXEMPLO 7 EXPERIMENTOS EM ESTUFA

[0239] Plantas transgênicas expressando enzimas HPPD ou HST heterólogas são avaliadas quanto à tolerância aos herbicidas derivados de cumarona em experimentos em estufa.

[0240] Para o tratamento de pré-emergência, os herbicidas são aplicados diretamente após a semeadura por meio de bocais de distribuição fina. Os recipientes são irrigados com cuidado para promover a germinação e crescimento e, posteriormente cobertos com capuzes de plástico transparente até que as plantas estejam enraizadas. Esta cobertura causa a germinação uniforme das plantas de teste, a menos que esta tenha sido prejudicada pelos herbicidas.

[0241] Para o tratamento pós-emergência, as plantas teste são primeiramente cultivadas até uma altura de 3 a 15 cm, dependendo do hábito de planta, e só depois tratadas com os herbicidas. Para esta finalidade, as plantas-teste são semeadas diretamente e cultivadas nos mesmos recipientes, ou elas são primeiramente cultivadas separadamente e transplantadas para os recipientes de ensaio alguns dias antes do tratamento.

[0242] Para avaliação das plantas T0, podem ser usadas estacas caulinares. No caso das plantas de soja, um broto ótimo para a estaca caulinar é de cerca de 7,5 a 10 cm de altura, com pelo menos dois nós presentes. Cada estaca é feita a partir do transformante inicial (planta- mãe) e mergulhado no hormônio de enraizamento em pó (ácido indol-3- butírico, IBA). A estaca caulinar é então colocada em bandejas tipo “oasis wedges” dentro de uma bio-cúpula. As estacas do tipo selvagem também são coletadas simultaneamente para servir como controles. As estacas caulinares são mantidas na bio-cúpula durante 5-7 dias e, em seguida, transplantadas para vasos e, em seguida, aclimatadas na câmara de crescimento durante mais dois dias. Subsequentemente, as estacas são transferidas para a estufa, aclimatadas durante aproximadamente 4 dias, e, em seguida, submetidas aos testes de pulverização, tal como indicado.

[0243] Dependendo das espécies, as plantas são mantidas a 10- 25 °C ou 20-35 °C. O período de teste se estende ao longo de 3 semanas. Durante este tempo, as plantas são cuidadas e suas respostas aos tratamentos individuais são avaliadas. As avaliações de lesões causadas pelo herbicida são tomadas 2 e 3 semanas após o tratamento. A lesão da planta é classificada e uma escala de 0 a 9, sendo 0 nenhuma lesão e 9 a morte completa.

[0244]A tolerância aos herbicidas derivados de cumarona também pode ser avaliada na Arabidopsis. Neste caso, as plantas de Arabidopsis thaliana transgênicas são avaliadas para uma melhor tolerância aos herbicidas derivados de cumarona em placas de 48 poços. As sementes têm as superfícies esterilizadas por meio da agitação, durante 5 minutos em etanol + água (70+30 em volume), lavagem uma vez com etanol + água (70+30 em volume) e duas vezes com uma solução estéril de água deionizada. As sementes são resuspensas em 0,1% de ágar dissolvido em água (p/v). Quatro a cinco sementes por poço foram semeadas em meio nutritivo sólido constituído de solução nutriente Murashige Skoog de força média, pH 5,8 (meio de Murashige e Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15: 473-497). Os compostos são dissolvidos em dimetil sulfóxido (DMSO) e adicionados ao meio antes da solidificação (concentração final de DMSO - 0,1%). As placas multi poços são incubadas em uma câmara de crescimento a 22 °C, 75% de umidade relativa e 110 μmol Phot * m -2 * s-1 com foto- período 14:10 hrs de luz:escuro. Sete a dez dias após a semeadura a inibição do crescimento é avaliada por comparação com plantas do tipo selvagem. O fator de tolerância é calculado dividindo o valor IC50 do crescimento de plantas de plantas transgênicas contendo uma sequência HPPD e/ou HST pelo de plantas do tipo selvagem.

[0245]Além disso, as plantas transgênicas de Arabidopsis T1 e T2 podem ser avaliadas quanto à tolerância melhorada aos herbicidas derivados de cumarona em estudos em estufa. A pontuação da lesão pelo herbicida é feita 2-3 semanas após o tratamento e é classificada em uma escala de 0 a 100%, sendo 0% a ausência de lesão e 100% a morte completa.

[0246] Exemplos dos dados obtidos estão representados nas Tabelas 12-13 e nas Figuras 3 e 4. TABELA 12 FATOR DE TOLERÂNCIA OBSERVADO PARA PLANTAS DE ARABIDOPSIS TRANSGÊNICAS SUPEREXPRESSANDO HPPD DO TIPO SELVAGEM

Os herbicidas derivados de cumarona utilizados neste exemplo são 3-[2,4- dicloro-3-(3-metil-4,5-dihidroisoxazol-5-il)phenil]-1-(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo- pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inibidor 1) e 1-(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo-3-(2,4,6-tricloro- 3-piridil)pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inibidor 2). TABELA 13 TESTES EM ESTUFA DE PLANTAS DE SOJA TRANSGÊNICAS (ESTACAS CAULINARES T0). As AVALIAÇÕES DAS LESÕES FORAM FEITAS APÓS O TRATAMENTO COM O HERBICIDA

O herbicida derivado de cumarona usado neste exemplo é o 3- [2,4-dicloro-3-(3-metil-4,5-dihidroisoxazol-5-il)fenil]-1-(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo- pirido[3,2-c]tiazin-4-ol. ** Eventos marcados são testados a uma taxa de 50%.

[0247] Pode ser observado a partir dos exemplos anteriores que um polinucleotídeo que codifica HPPD que é transformado em plantas pode ser selecionado como aquele que confere resistência aos herbicidas derivados de cumarona, pois verificou-se que as plantas que são transformadas com tal polinucleotídeo são menos lesionadas pelo uso de um herbicida derivado de cumarona do que as plantas controle não transformadas.

Claims (6)

1. MÉTODO PARA CULTIVO DE PLANTAS RESISTENTES OU TOLERANTES A HERBICIDA DERIVADO DE CUMARONA, caracterizado por compreender as etapas de: - a) cultivo de uma planta que compreende pelo menos um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma hidroxifenil piruvato dioxigenase mutada (mut-HPPD), que é resistente ou tolerante a um herbicida derivado de cumarona; e - b) aplicação de uma quantidade eficaz do dito herbicida a tais plantas e sua vizinhança; em que a sequência de nucleotídeos compreende a sequência da SEQ ID NO: 1 ou 51, em que - os nucleotídeos 958-960 da SEQ ID NO:1 ou 51 que codifica Leu na posição 320 da SEQ ID NO: 2 são modificados para qualquer códon que codifica His, Gln ou Asn; - os nucleotídeos 961-963 da SEQ ID NO:1 ou 51 que codifica Pro na posição 321 da SEQ ID NO: 2 são modificados para qualquer códon que codifica Ala ou Arg; e em que a mut-HPPD codificada é uma variante da SEQ ID NO: 2, na qual: - o aminoácido correspondente à posição L320 é substituído por His, Gln ou Asnou - o aminoácido correspondente à posição L320 é substituído por His, Gln ou Asn e o aminoácido correspondente à posição P321 é substituído por Ala ou Arg.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela planta compreender pelo menos um ácido nucleico heterólogo adicional compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima de tolerância a herbicida.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo herbicida derivado de cumarona ser aplicado juntamente com um ou mais outros herbicidas.

4. ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, caracterizado por compreender a sequência da SEQ ID NO: 1 ou 51, em que: - os nucleotídeos 958-960 da SEQ ID NO:1 ou 51 que codifica Leu na posição 320 da SEQ ID NO: 2 são modificados para qualquer códon que codifica His, Gln ou Asn; - os nucleotídeos 961-963 da SEQ ID NO:1 ou 51 que codifica Pro na posição 321 da SEQ ID NO: 2 são modificados para qualquer códon que codifica Ala ou Arg; em que o referido ácido nucleico isolado codifica uma mut-HPPD, que compreende uma variante da SEQ ID NO: 2, em que: - o aminoácido correspondente à posição L320 é substituído por His, Gln ou Asn, ou - o aminoácido correspondente à posição L320 é substituído por His, Gln ou Asn e o aminoácido correspondente à posição P321 é substituído por Ala ou Arg.

5. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA CÉLULA VEGETAL TRANSGÊNICA, possuindo uma resistência aumentada a um herbicida derivado de cumarona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da célula vegetal, caracterizado por compreender: (a) a transformação da célula vegetal com um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico mut-HPPD; e (b) a geração de uma planta com resistência aumentada aos herbicidas derivados de cumarona a partir da célula vegetal; em que o ácido nucleico mut-HPPD compreende a sequência da SEQ ID NO: 1 ou 51, em que: - os nucleotídeos 958-960 da SEQ ID NO:1 ou 51 que codifica Leu na posição 320 da SEQ ID NO: 2 são modificados para qualquer códon que codifica His, Gln ou Asn; - os nucleotídeos 961-963 da SEQ ID NO:1 ou 51 que codifica Pro na posição 321 da SEQ ID NO: 2 são modificados para qualquer códon que codifica Ala ou Arg; - m que o referido ácido nucleico isolado codifica um variante de um polipeptídeo conforme mostrado na SEQ ID NO: 2; em que o aminoácido correspondente à posição L320 é substituído por His, Gln ou Asn ou o aminoácido correspondente à posição L320 é substituído por His, Gln ou Asn e o aminoácido correspondente à posição P321 é substituído por Ala ou Arg.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo cassete de expressão compreender ainda uma região reguladora da iniciação da transcrição e uma região reguladora da iniciação da tradução que são funcionais na planta.

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