MX2014004882A - Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas. - Google Patents

Abstract

Un método para controlar vegetación indeseable en un sitio de cultivo de plantas, que comprende las etapas de proporcionar, en dicho sitio, una planta que comprende al menos un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa de tipo silvestre o una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa mutada (mut-HPPD) que es resistente o tolerante a un herbicida derivado de cumarona y/o una secuencia de nucleótidos que codifica una homogentisato solanesiltransferasa de tipo silvestre o una homogentisato solanesiltransferasa mutada (mut-HST) que es resistente o tolerante a un herbicida derivado de cumarona y aplicar a dicho sitio una cantidad efectiva de dicho herbicida. También, plantas que comprenden mut-HPPD y métodos de obtención de tales plantas.

Description

PLANTAS QUE TIENEN UNA MAYOR TOLERANCIA A HERBICIDAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a métodos para conferir a plantas una tolerancia a herbicidas a nivel agrícola. La invención se refiere en particular a plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas "derivados de cumarona". Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos y plantas obtenidas por mutagénesis y cruzamiento y transformación que tienen una mayor tolerancia a herbicidas "derivados de cumarona".

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los herbicidas que inhiben la 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (4-HPPD; EC 1.13.11.27), una enzima clave en la biosíntesis de las prenilquinonas plastoquinona y tocoferoles, se han usado para el control selectivo de las malezas desde comienzos de 1990. Estos bloquean la conversión de 4-hidroxifenilpiruvato a homogentisato en la vía de la biosíntesis (Matringe et al., 2005, Pest Manag Sci., vol. 61 :269-276; Mitchell et al., 2001 , Pest Manag Sci. vol 57:120-128). Se cree que la plastoquinona es un cofactor necesario de la enzima fitoeno desaturasa en la biosíntesis de carotenoides (Boeger y Symann, 1998, Pestic Outlook, vol 9:29-35). Su inhibición da por resultado la depleción de los pools de plastoquinona y vitamina E de la planta, llevando a síntomas de lixiviación. La pérdida de carotenoides, en particular en su función como protectores de los fotosistemas contra fotooxidación, lleva a la degradación oxidativa de clorofila y las membranas de fotosíntesis en tejidos de brotes en crecimiento. En consecuencia, la síntesis y la función de los cloroplastos se ve perturbada (Boeger y Symann, 1998). La enzima homogentisato solanesiltransferasa (HST) cataliza el paso después de HPPD en la vía de biosíntesis de plastoquinona. HST es una prenil transferasa que descarboxila a la homogentisato y también transfiere a ésta el grupo solanesil del solanesil difosfato y así forma el 2-metil-6-solanesil-1 ,4-benzoquinol (MSBQ), un intermediario en la vía de biosíntesis de la plastoquinona. Las enzimas HST están ligadas a la membrana y los genes que las codifican incluyen una secuencia de direccionamiento de plástidos.

Las clases químicas más importantes de herbicidas comerciales que inhiben 4-HPPD incluyen las pirazolonas, las tricetonas y los isoxazoles. Los inhibidores simulan la unión del sustrato 4-hidroxifenilupiruvato a un ión ferroso ligado a la enzima en el sitio activo formando un complejo de transferencia estable ion-carga dipolar. Entre los herbicidas inhibidores de 4-HPPD, la tricetona sulcotriona fue el primer ejemplo de este grupo herbicida a ser usado en agricultura e identificado en su mecanismo de acción (Schulz et al., 1993, FEBS Lett. Vol 318:162-166). Se ha informado que las tricetonas son derivados de leptospermona, un componente herbicida de la planta cepillo de botella, Callistemon spp (Lee et al. 1997, Weed Sci. Vol 45, 162-166).

Algunas de estas moléculas se han usado como herbicidas ya que la inhibición de la reacción en plantas lleva al blanqueado de las hojas de las plantas tratadas y a la muerte de dichas plantas (Pallett, K. E. et al. 1997 Pestic. Sci. 50 83-84). Los herbicidas para los cuales el HPPD es el objetivo, y que se describen en el estado del arte, son, en particular, isoxazoles (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, U.S. Pat. No. 5.424.276), en particular isoxaflutola, que es un herbicida selectivo para el maíz, dicetonitrilos (EP496630, EP496631 ), en particular 2-ciano-3-c¡clopropil-1-(2-S02CH3-4-CF3 fenil)propano-1 ,3-diona y 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-S02CH3-4-2,3CI2fen¡l)propano-1 ,3-diona, tricetonas tales como se describen en EP625505, EP625508, patente U. S. N.° 5.506.195, en particular sulcotriona, o pirazolinatos. Además, el herbicida topramezona bien conocido provoca el mismo tipo de síntomas fitotóxicos, con pérdida de clorofila y necrosis en los tejidos de los brotes que crecen, que los herbicidas lixiviantes, que inhiben el 4-HPPD, descritos más arriba, en especies de plantas susceptibles. La topramezona pertenece a la clase química de las pirazolonas o benzoilpirazoles y fue introducida comercialmente en 2006. Cuando se aplica posemergencia, el compuesto controla selectivamente un amplio espectro de malezas de hoja ancha y pastos anuales en el maíz.

La tolerancia de las plantas a los "herbicidas derivados de cumarona" también ha sido informada en diversas patentes. La solicitud internacional N.° WO2010/029311 describe en general el uso de un ácido nucleico de HPPD y/o un ácido nucleico de HST para provocar la tolerancia a herbicidas en plantas. Los documentos WO 2009/090401 , WO 2009/090402, WO 2008/071918, WO 2008/009908, divulgan específicamente algunos "herbicidas derivados de cumarona" y líneas de plantas tolerantes a "herbicidas derivados de cumarona".

Se encuentran disponibles tres estrategias principales para preparar plantas tolerantes a herbicidas, es decir, (1 ) destoxificar el herbicida con una enzima que transforma el herbicida, o su metabolito activo, en productos no tóxicos, tales como, por ejemplo, las enzimas para la tolerancia a bromoxinilo o Basta (EP242236, EP337899); (2) mutar la enzima objetivo en una enzima funciona que es menos sensibles al herbicida, o a su metabolito activo, tal como, por ejemplo, las enzimas para la tolerancia al glifosato (EP293356, Padgette S. R. et al., J.Biol. Chem., 266, 33, 1991 ); o (3) sobreexpresar la enzima sensible de modo de producir cantidades de la enzima objetivo en la planta que son suficientes con relación al herbicida, en vista de las constantes cinéticas de esta enzima, de modo de tener suficiente enzima funcional disponible a pesar e la presencia de su inhibidor. La tercera estrategia se describió para obtener exitosamente plantas que eran tolerantes a los inhibidores de HPPD (documento WO 96/38567). El documento US 2009/0172831 divulga secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos que tienen actividad enzimática de tal modo que las secuencias de aminoácidos son resistentes a los productos químicos herbicidas inhibidores de HPPD, en particular los mutantes de HPPD específicos del inhibidor tricetona.

Hasta la fecha, el arte previo no describió plantas tolerantes a herbicidas derivados de cumarona que contienen por lo menos un ácido nucleico de HPPD mutada. El arte previo tampoco ha descrito plantas de cultivo tolerantes al herbicida derivado de cumarona que contienen mutaciones en genomas distintos del genoma del cual se deriva el gen de HPPD. Por lo tanto, lo que se necesita en el arte es la identificación de genes con tolerancia a herbicidas derivados de cumarona de genomas y especies adicionales. Lo que también se necesita en el arte son plantas de cultivo y plantas de cultivo que tengan mayor tolerancia a herbicidas tales como el herbicida derivado de cumarona y que contengan por lo menos un ácido nucleico de HPPD mutada. También se necesitan métodos para controlar el crecimiento de las malezas en la cercanía de tales plantas de cultivo o plantas de cultivo. Estas composiciones y métodos permitirían el uso de spray por sobre otras técnicas cuando se aplican herbicidas a áreas que contienen plantas de cultivo o a plantas de cultivo.

SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN El problema se resuelve por medio de la presente invención que se refiere a un método para controlar vegetación indeseable en un sitio de cultivo de plantas, que comprende las etapas de: a) proporcionar, en dicho sitio, una planta que comprende al menos un ácido nucleico que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa de tipo silvestre o una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa mutada (mut-HPPD) que es resistente o tolerante a un herbicida derivado de cumarona y/o (¡i) una secuencia de nucleótidos que codifica una homogentisato solanesiltransferasa de tipo silvestre o una homogentisato solanesiltransferasa mutada (mut-HST) que es resistente o tolerante a un herbicida derivado de cumarona b) aplicar a dicho sitio una cantidad efectiva de dicho herbicida.

Además, la presente invención se refiere a un método para identificar un herbicida derivado de cumarona usando una mut-HPPD codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 52, o una de sus variantes, y/o usando una mut-HST codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 47 ó 49 o una de sus variantes.

Dicho método comprende las etapas de: a) generación de una célula o planta transgénica que comprende un ácido nucleico que codifica una HPPD de tipo silvestre o mutada, en donde la HPPD de tipo silvestre o mutada se expresa; b) aplicación de un herbicida derivado de cumarona a la célula o planta transgénica de a) y a una célula o planta de control de la misma variedad; c) determinación del crecimiento o la viabilidad de la célula o planta transgénica y la célula o planta de control después de la aplicación de dicho compuesto de ensayo, y d) selección de los compuestos de ensayo que confieren crecimiento reducido a la célula o planta de control en comparación con el crecimiento de la célula o planta transgénica.

Otro objeto se refiere a un método de identificación de una secuencia de nucleótidos que codifica una mut-HPPD que es resistente o tolerante a un herbicida derivado de cumarona, que comprende: a) generación de una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican mut-HPPD, b) controlar una población de los ácidos nucleicos que codifican la mut-HPPD resultante por expresión de cada uno de dichos ácidos nucleicos en una célula o planta y tratamiento de dicha célula o planta con un herbicida derivado de cumarona, c) comparación de los niveles de tolerancia a herbicidas derivados de cumarona proporcionados por dicha población de mut-HPPD que codifica ácidos nucleicos con el nivel de tolerancia a herbicidas derivados de cumarona proporcionado por un ácido nucleico que codifica una HPPD de control, d) selección de al menos un ácido nucleico que codifica una mut-HPPD que proporciona un nivel de tolerancia significativamente mayor a un herbicida derivado de cumarona en comparación con el proporcionado por el ácido nucleico que codifica una HPPD de control.

En una forma de realización preferida, el ácido nucleico que codifica una mut-HPPD seleccionado en la etapa d) proporciona al menos 2 veces como mucho o tolerancia a un herbicida derivado de cumarona en comparación con el proporcionado por el ácido nucleico que codifica la HPPD de control.

La resistencia o tolerancia se puede determinar generando una planta transgénica que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la biblioteca de la etapa a) y comparación de dicha planta transgénica con una planta de control.

Otro objeto se refiere a un método de identificación de una planta o algas que contienen un ácido nucleico que codifica una mut-HPPD o mut-HST que es resistente o tolerante a un herbicida derivado de cumarona, que comprende: a) identificación de una cantidad efectiva de un herbicida derivado de cumarona en un cultivo de células vegetales o algas verdes. b) tratamiento de dichas células vegetales o algas verdes con un agente a mutagenizante, c) contacto de dicha población celular mutagenizada con una cantidad efectiva de herbicida derivado de cumarona, identificado en a), d) selección de al menos una célula que sobrevive a estas condiciones de ensayo, e) amplificación por PCR y secuenciación de genes de HPPD y/o HST de células seleccionadas en d) y comparación con tales secuencias con secuencias génicas de HPPD de tipo silvestre o HST, respectivamente.

En una forma de realización preferida, el agente mutagenizante es etilmetansulfonato.

Otro objeto se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica una mut-HPPD, siendo el ácido nucleico preferentemente identificable por un método definido con anterioridad.

En otra forma de realización, la invención se refiere a una célula de planta transformada por un ácido nucleico de HPPD mutada o de tipo silvestre o una planta que fue mutada para obtener una planta que expresa, con preferencia, que sobreexpresa un ácido nucleico de HPPD de tipo silvestre o mutada, en donde la expresión del ácido nucleico en la célula de planta da como resultado una mayor resistencia o tolerancia a un herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad del tipo silvestre de la célula de planta.

En una forma de realización preferida, la célula de planta de la presente está transformada por un ácido nucleico de HPPD mutada o de tipo silvestre que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1 , 51 , 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 52, o una de sus variantes o derivados.

En otra forma de realización, la invención se refiere a una planta transgénica que comprende una célula de planta de acuerdo con la presente invención, en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da por resultado la mayor resistencia de la planta al herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta.

Las plantas de la presente invención pueden ser transgénicas o no transgénicas. Con preferencia, la expresión del ácido nucleico en la planta da por resultado la mayor resistencia de la planta al herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta.

En otra forma de realización, la invención se refiere a una semilla producida por una planta transgénica que comprende una célula de planta de la presente invención, en donde la semilla es un verdadero cruzamiento para una mayor resistencia a un herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la semilla.

En otra forma de realización, la invención se refiere a un método para producir una célula de planta transgénica con mayor resistencia a un herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la célula de planta que comprende, transformar la célula de planta con un cásete de expresión que comprende un ácido nucleido de tipo silvestre o un ácido nucleico de HPPD mutada.

En otra forma de realización, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica que comprende (a) transformar una célula de planta con un cásete de expresión que comprende un ácido nucleico de tipo silvestre o un ácido nucleico de mut-HPPD, y (b) generar una planta con mayor resistencia a un herbicida derivado de cumarona de la célula de planta.

Con preferencia, el cásete de expresión comprende además una región reguladora de la iniciación de transcripción y una región reguladora de la iniciación de traducción que son funcionales en la planta.

En otra forma de realización, la invención se refiere al uso de la mut-HPPD de la invención como marcador seleccionable. La invención provee un método para identificar o seleccionar una célula de planta, tejido de planta, planta o parte de ésta transformados que comprende a) proveer una célula de planta, tejido de planta, planta o parte de ésta transformados, en donde dichos célula de planta, tejido de planta, planta o parte de ésta transformados comprenden un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de mut-HPPD de la invención como se describe más abajo, en donde el polipéptido se usa como un marcador de selección, y en donde dichos célula de planta, tejido de planta, planta o parte de ésta transformados pueden comprender opcionalmente otro ácido nucleico aislado de interés; b) poner en contacto la célula de planta, tejido de planta, planta o parte de ésta transformados con por lo menos un compuesto inhibidor de un derivado de cumarona; c) determinar si la célula de planta, tejido de planta, planta o parte de ésta es afectada por el inhibidor o compuesto de inhibición y d) identificar o seleccionar los célula de planta, tejido de planta, planta o parte de ésta transformados.

La invención también se pone en práctica en proteínas de mut-HPPD purificadas que contienen las mutaciones descriptas en la presente, que son útiles en estudios de modelación molecular para diseñar otras mejoras a la tolerancia a herbicidas. Los métodos de purificación de proteínas son bien conocidos y pueden ser realizados fácilmente usando productos disponibles comercialmente o métodos diseñados especialmente, como se presenta, por ejemplo, en Protein Biotechnology, Waish y Headon (Wiley, 1994).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 Alineamiento de secuencias de aminoácidos y regiones conservadas de enzimas HPPD de Chlamydomonas reinhardtii {Cr PP^a, Cr_HPPD1b), Physcomitrella patens (Pp_HPPD1 ), Oryza sativa (Osj_HPPD1 ), Triticum aestivum (Ta_HPPD1 ), Zea mays (Zm_HPPD1 ), Arabidopsis thaliana (AtJHPPD), Glycine max (GmJHPPD) y Vitis vinifera (VvJHPPD).

* Secuencia derivada del proyecto de secuenciación del genoma. Locus ID: GRMZM2G088396 ** Secuencia de aminoácidos basada en NCBI GenPept No. de acceso CAG25475 Figura 2 muestra un mapa de vector de un vector de transformación de plantas que se usa para la transformación de la soja con las secuencias HPPD / HST.

Figura 3 muestra un ensayo de germinación con plantines de Arabidopsis transgénicos que expresan HPPD de tipo silvestre de Hordeum (HvHPPD, Seq ID: 1/2). Las plantas se hicieron germinar en (A) 3-[2,4-dicloro-3-(3-metil-4,5-dihidroisoxazol-5-il)fenil]-1 -(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo-pirido[3,2-c]tiazin-4-ol y (B) 1 -(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo-3-(2,4,6-tricloro-3-piridil)pirido[3,2-c]tiazin-4-ol.

Figura 4 muestra tests de spray de herbicida contra esquejes de soja TO transgénicos que expresan HPPD tipo silvestre de Hordeum (Seq ID: 2, eventos LJ387 y AV4553); HPPD de Synechocystis (SeqID: 20, evento LG6156) y M335H mutante (evento HT1833) de HPPD de Arabidopsis (Seq ID:53). Las plantas de control no transformadas están marcadas como tipo silvestre. El herbicida derivado de cumarona usado es 3-[2,4-dicloro-3-(3-metil-4,5-dihidroisoxazol-5-il)fenil]-1-(2,2-difluoroetil)-2,2-d¡oxo-pir¡do[3,2-c]tiazin-4-ol.

LISTADO DE SECUENCIAS Tabla 1 DESCRIPCIÓN DETALLADA Los artículos "un" y "una" se usan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos a uno) de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" implica uno o varios elementos.

Tal como se usa en la presente, la expresión "que comprende" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" implica la inclusión de un elemento establecido, número entero o etapa o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Los inventores de la presente invención hallaron que la tolerancia o resistencia a herbicidas de una planta podían incrementarse marcadamente por sobreexpresión de enzimas de HPPD de tipo silvestre o mutadas que comprenden SEQ ID NO: 2, 5, 8, 1 1 , 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, o 53.

En consecuencia, la presente invención se refiere a un método para controlar vegetación indeseable en un sitio de cultivo de plantas, que comprende las etapas de: a) proporcionar, en dicho sitio, una planta que comprende al menos un ácido nucleico que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa de tipo silvestre (HPPD) o una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa mutada (mut-HPPD) que es resistente o tolerante a un "herbicida derivado de cumarona" y/o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una homogentisato solanesiltransferasa de tipo silvestre (HST) o una homogentisato solanesiltransferasa mutada (mut-HST) que es resistente o tolerante a un "herbicida derivado de cumarona" b) aplicar a dicho sitio una cantidad efectiva de dicho herbicida.

La expresión "control de vegetación indeseable" se ha de entender como muerte de malezas y/u otro retraso o inhibición del crecimiento normal de las malezas. Se entienden que las malezas, en el sentido más amplio, implican todas aquellas plantas que crecen en ubicaciones donde son indeseables. Las malezas de la presente invención incluyen, por ejemplo, malezas dicotiledóneas y monocotiledóneas. Las malezas dicotiledóneas incluyen, pero sin limitación, malezas de los géneros: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Verónica, Abutilón, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus y Taraxacum. Las malezas monocotiledóneas incluyen, pero sin limitación, malezas de los géneros: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus y Apera. Además, las malezas de la presente invención pueden incluir, por ejemplo, plantas de cultivo que crecen en una ubicación ¡ndeseada. Por ejemplo, una planta de maíz voluntaria que está en un campo que comprende predominantemente plantas de soja se pueden considerar una maleza, si la planta de maíz es indeseada en el campo de las plantas de soja.

El término "planta" se usa en su sentido más amplio ya que se refiere a material orgánico y pretende abarcar organismos eucarióticos que son miembros del Reino Vegetal, ejemplos de los cuales incluyen, pero no están limitados a, plantas vasculares, verduras, cereales, flores, árboles, hierbas, arbustos, pastos, enredaderas, heléchos, musgos, hongos y algas, etc., así como también clones, bulbillos, y partes de plantas usados para la propagación asexual (por ejemplo, esquejes, ribetes, brotes, rizomas, tallos subterráneos, mazorcas, coronas, bulbos, granos, tubérculos, rizomas, plantas/tejidos producidos en cultivo de tejidos, etc.). El término "planta" comprende además plantas enteras, ancestros y progenie de las plantas y partes de plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluyendo tubérculos), flores, floretes, frutas, pedículos, pedúnculos, estamen, antera, estigmas, estilos, ovario, pétalo, sépalo, carpelo, ápice de la raíz, cofia de la raíz, pelo de la raíz, pelo de la hoja, pelo de la semilla, grano de polen, microespora, cotiledón, hipocótilo, epicótilo, xilema, floema, parénquima, endosperma, una célula compañera, una célula guardiana, y cualesquiera otros órganos, tejidos y células de una planta, y tejidos y órganos, en donde cada uno de los antes mencionados comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término "planta" también comprende células de plantas, cultivos en suspensión, tejido de callos, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, nuevamente en donde cada uno de los antes mencionados comprende el gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son de particular utilidad en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiiedoneas y dicotiledóneas que incluyen forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos comestibles, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por ejemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [cañóla, colza oleaginosa, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucúrbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por ejemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleífera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japónica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo, Glycine max, Soja hispida o Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por ejemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Púnica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Sa// sp., Sambucus spp., Sécale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. fpor ejemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. fpor ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum o Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Wc/a spp., V/c/na spp., V7o/a odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., amaranto, alcaucil, espárrago, brócoli, repollitos de Bruselas, repollo, cañóla, zanahoria, coliflor, ápio, berza, maíz, lino, col rizada, lenteja, colza oleaginosa, ají turco, cebolla, papa, arroz, soja, frutilla, remolacha, caña de azúcar, girasol, tomate, calabacín, té y algas, entre otros. De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Los ejemplos de plantas de cultivo incluyen, inter alia, soja, girasol, cañóla, maíz, alfalfa, colza, algodón, tomate, papa o tabaco. También con preferencia, la planta es una planta monocotiledónea, como caña de azúcar. También con preferencia, la planta es un cereal, tales como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, sorgo o avena.

En una forma de realización preferida, la planta ha sido producida previamente por un proceso que comprende preparar en forma recombinante una planta introduciendo y sobre-expresando un HPPD de tipo silvestre o un mut-HPPD y/o un transgén de tipo silvestre o un transgén de mut-HST, como se describe con mayores detalles más abajo.

En otra forma de realización preferida, la planta ha sido producida previamente por un proceso que comprende la mutagenización in situ de células de plantas, para obtener células de plantas que expresan una mut-HPPD y/o mut-HST.

Como se divulga en la presente, los ácidos nucleicos de la invención se usan para aumentar la tolerancia a herbicidas de las plantas que comprenden en sus genomas un gen que codifica un HPPD de tipo silvestre o una mut-HPPD y/o una proteína de tipo silvestre o mut-HST. Un gen de este tipo puede ser un gen endógeno o un transgén, como se describe más abajo.

Por lo tanto, en otra forma de realización la presente invención se refiere a un método para aumentar o intensificar la tolerancia a herbicidas o la resistencia de una planta, comprendiendo el método la sobreexpresión de un ácido nucleico que codifica una enzima de tipo silvestre o mut-HPPD que comprende las SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 1 1 , 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53.

Adicionalmente, en algunas formas de realización, los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser apilados con cualquier combinación de secuencias de polinucleótidos de interés para crear plantas con un fenotipo deseado. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser apilados con cualquier otro polinucleótido que codifica polipéptidos que tienen actividad pesticida y/o insecticida, tal como, por ejemplo, las proteínas de la toxina Bacillus thuringiensis (descripta en las patentes U.S. Nos. 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881 ; y Geiser et al (1986) Gene 48: 109). Las combinaciones generadas también pueden incluir múltiples copias de uno cualquiera de los polinucleótidos de interés.

En una forma de realización particularmente preferida, la planta comprende por lo menos un ácido nucleico heterólogo adicional que comprende (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima con tolerancia a herbicidas seleccionada, por ejemplo, entre el grupo que consiste en 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), glifosato acetil transferasa (GAT), citocromo P450, fosfinotricina acetiltransferasa (PAT), acetohidroxiácido sintasa (AHAS; EC 4.1.3.18, también conocida como acetolactato sintasa o ALS), protoporfirinógeno oxidasa (PPGO), fitoeno desaturasa (PD) y enzimas degradantes de dicamba como se divulga en el documento WO 02/068607.

En general, el término "herbicida" se usa en la presente para indicar un ingrediente activo que mata, controla o modifica adversamente de otro modo el crecimiento de las plantas. La cantidad o concentración preferida del herbicida es una "cantidad efectiva" o "concentración efectiva". Por "cantidad efectiva" y "concentración efectiva" se entiende aquí una cantidad y una concentración, respectivamente, que es suficiente para matar o inhibir el crecimiento de una planta similar, planta de tipo silvestre, planta, tejido de planta, célula de planta, o célula huésped, pero que dicha cantidad no mata o inhibe tan severamente el crecimiento de las plantas, tejidos de plantas, células de plantas y células huésped resistentes a herbicidas de la presente invención. Típicamente, la cantidad efectiva de un herbicida es una cantidad que se usa rutinariamente en sistemas de producción agrícola para matar malezas de interés. Una cantidad como ésta es conocida por los expertos en el arte. La actividad herbicida es exhibida por el herbicida derivado de cumarona de la presente invención cuando se aplica directamente a la planta o al locus de la planta en cualquier etapa de crecimiento o antes de su plantación o emergencia. El efecto observado depende de la especie de planta a controlar, la etapa de crecimiento de la planta, los parámetros de aplicación de dilución y tamaño de gota del spray, el tamaño de partícula de los componentes sólidos, las condiciones ambientales en el momento de uso, el compuesto específico empleado, los adyuvantes y vehículos específicos empleados, el tipo de suelo, y similares, así como también la cantidad de producto químico aplicada. Estos y otros factores pueden ser ajustados como se conoce en el arte para promover una acción herbicida no selectiva o selectiva. En general, se prefiere aplicar el herbicida derivado de cumarona posemergencia a vegetación indeseable relativamente inmadura para lograr el máximo control de malezas.

Por una planta "tolerante a herbicidas" o "resistentes a herbicidas", se entiende una planta que es tolerante o resistente a por lo menos un herbicida a un nivel que normalmente mataría o inhibiría el crecimiento de una planta normal o de tipo silvestre. Por una "proteína mut-HPPD tolerante a herbicidas" o "proteína mut-HPPD resistente a herbicidas", se entiende que una proteína mut-HPPD como ésta presenta mayor actividad HPPD con relación a la actividad HPPD de una proteína mut-HPPD de tipo silvestre, cuando está en presencia de por lo menos un herbicida que se sabe que interfiere con la actividad HPPD y a una concentración o nivel del herbicida que se sabe que inhibe la actividad HPPD de la proteína mut-HPPD de tipo silvestre. Además, la actividad HPPD de una proteína mut-HPPD tolerante a herbicidas o resistente a herbicidas como ésta puede ser denominada en la presente como actividad HPPD "tolerante a herbicidas" o "resistente a herbicidas".

El "herbicida derivado de cumarona" de utilidad para la presente invención comprende los compuestos tal como se representa en la siguiente Tabla 2.

Tabla 2 Las solicitudes antes mencionadas, en particular las descripciones referidas a los compuestos de la Tabla 2, números 1-13 y sus posibles sustituyentes se incorporan en su totalidad por referencia.

En una forma de realización, el herbicida derivado de cumarona de utilidad para la presente invención se refiere al número 13 de la Tabla 2 anterior que tiene la fórmula: en donde las variables tienen el siguiente significado R es 0-RA, S(0)n-RA u 0-S(0)n-RA; es hidrógeno, alquilo C C4, Z-cicloalquilo C3-C6, haloalquilo CrC4> alquenilo C2-C6, Z-cicloalquenilo C3-C6, alquinilo C C6, Z-(tri-alquil C1-C4)sililo, Z-C(=0)-Ra, Z-NR'-CÍOJ-NRW1, Z-P(=0)(Ra)2l NR¡R¡i, un heterociclo saturado, insaturado o aromático monocíclico de 3 a 7 miembros o bicíclico de 9 ó 10 miembros que contiene 1 , 2, 3 ó 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S y que puede estar parcial o completamente sustituido por grupos Ra y/o Rb, Ra es hidrógeno, OH, alquilo C C8, haloalquilo C C4, Z-cicloalquilo C3- C6, alquenilo C2-C8, Z-cicloalquenilo C5-C6, alquinilo C2-C8, Z-alcox¡ C C6, Z-haloalcoxi Ci-C , Z-alqueniloxi C3-C8, Z-alquiniloxi C3-C8, NR'R", alquil C1-C6-sulfonilo, Z-(tri-alquil C1-C4)sililo, Z-fenilo, Z- fenoxi, Z-fenilamino o un heterociclo monocíclico de 5 ó 6 miembros o bicíclico de 9 ó 10 miembros que contiene 1 , 2, 3 ó 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, donde los grupos cíclicos no están sustituidos o están sustituidos con 1 , 2, 3 ó 4 grupos Rb; R', R" son, de modo independiente entre sí, hidrógeno, alquilo C C8, haloalquilo C1-C4, alquenilo C3-C8, alquinilo C3-C8, Z- cicloalquilo C3-C6, Z-alcoxi C C8, Z-haloalcoxi C Ce, Z- C(=0)-Ra, Z-fenilo, un heterociclo saturado, insaturado o aromático monocíclico de 3 a 7 miembros o bicíclico de 9 ó 10 miembros que contiene 1 , 2, 3 ó 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S y que está unido por medio de Z; R1 y R", junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, también pueden formar un heterociclo monocíclico de 5 ó 6 miembros o bicíclico de 9 ó 10 miembros que contiene 1 , 2, 3 ó 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S; R" son, de modo independiente entre sí, Z-CN, Z-OH, Z-N02, Z- halógeno, oxo (=0), =N-Ra, alquilo C1-C8, haloalquilo C^C4, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, Z-alcoxi C1-C8, Z-haloalcoxi C1-C8, Z-cicloalquilo C3-C10, O-Z-cicloalquilo C3-C10, Z-C(=0)-Ra, NR'R", Z-(tri-alquil C1-C4)sililo, Z-fenilo y S(0)nRbb; dos grupos Rb pueden formar juntos un anillo que tiene tres a seis miembros del anillo y, además de los átomos de carbono, también pueden contener heteroátomos del grupo que consiste en O, N y S y puede no estar sustituido o puede estar sustituido por otros grupos R ; Rbb es alquilo C C8> alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, haloalquenilo C2-C6, haloalquinilo C2-C6 o haloalquilo C C6; Z es un enlace covalente o alquileno Ci-C4; n es 0, 1 ó 2; es ciano, halógeno, nitro, alquilo CrC6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, haloalquilo Ci-Ce, Z-alcoxi C1-C6, Z-alcoxi C1-C4-alcox¡ C1-C4, Z-alquil C1-C4-tio, Z-alquil C1-C4-tio-alquil C1-C4-tio, alquenil C2-C6-oxi, alquinil C2-C6-oxi, haloalcoxi C1-C6, haloalcoxi alcoxi C1-C4-C1-C4, S(0)nRbb, Z-fenoxi, Z-heterocicliloxi, donde heterociclilo es un heterociclo saturado, parcialmente insaturado o aromático monocíclico de 5 ó 6 miembros o bicíclico de 9 ó 10 miembros que contiene 1 , 2, 3 ó 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, donde los grupos cíclicos no están sustituidos o están parcial o totalmente sustituidos con Rb; es N o C-R2; R2,R3,R4,R5 son, de modo independiente entre sí, hidrógeno, Z-halógeno, Z-CN, Z-OH, Z- N02, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C4, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, haloalquenilo C2-C8, haloalquinilo C2-C8, Z-alcox¡ C1-C8, Z-haloalcoxi C1-C8, Z- alcoxi C1-C4-alcoxi C1-C4, Z-alquil C1-C4-tio, Z-alquil C1-C4-tio-alquil C1-C4-tio, Z-C1-C6-haloalquil C1-C6-tio, alquenil C2-C6-oxi, alquinil C2-C6-oxi, haloalcoxi C1-C6, haloalcoxi alcoxi C1-C4-C1-C4, Z-cicloalquilo C3-C10, O-Z-cicloalquilo C3- C10, Z-C(=0)-Ra, R'R'', Z-(tri-alquil C1-C4)sililo, S(0)nRbb, Z-fenilo, Z1-fenilo, Z- heterociclilo, Z1-heterociclilo, donde el heterociclilo es un heterociclo saturado, parcialmente insaturado o aromático monocíclico de 5 ó 6 miembros o bicíclico de 9 ó 10 miembros que contiene 1 , 2, 3 ó 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, donde los grupos cíclicos no están sustituidos o están parcial o totalmente sustituidos con Rb; R2, junto con el grupo unido al átomo de carbono adyacente también puede formar un anillo saturado o parcial o totalmente insaturado mono- o bicíclico de cinco a diez miembros que, además de los átomos de carbono, pueden contener 1, 2 ó 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S y puede estar sustituido con otros grupos Rb; Z1 es un enlace covalente, alquilen C1-C4-oxi, oxialquileno C1-C4 o alquilen C1-C4-oxi-alquileno C1-C4; R6 es hidrógeno, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, alquil C1-C4-tio, haloalcoxi C1-C4, haloalquil C1-C4-tio; R7,R8 son, de modo independiente entre sí, hidrógeno, halógeno o alquilo C1-C4; R es alquilo Ci-C6, haloalquilo C1-C4, alcoxi d-C2-alqu¡lo Ci-C2, alquenilo C2-C6, haloalquenilo C2-C6, alquinilo C3-C6, haloalquinilo C3-C6 o Z-fenilo, que no está sustituido o está sustituido por 1 a 5 grupos Rb; donde en los grupos RA, y R1, R2, R3, R4 y R5 y sus subsustituyentes, las cadenas de carbono y/o los grupos cíclicos pueden estar parcial o totalmente sustituidos con grupos Rb o un N-óxido o una de sus sales agrícolamente apropiadas.

En otra forma de realización, el herbicida derivado de cumarona de utilidad para la presente invención se refiere al número 1 y 2 de la Tabla 2 anterior que tiene la fórmula anterior: en donde las variables son como se describen en WO2010/049270 y WO2010/049269.

En otra forma de realización preferida, el herbicida derivado de cumarona de utilidad para la presente invención tiene la siguiente fórmula (Tabla 2, N.° 8) en donde las variables tienen el siguiente significado: es 0-RA, S(0)n-RA u 0-S(0)n-RA; RA es hidrógeno, alquilo C1-C4, Z-cicloalquilo C3-C6, haloalquilo C1-C4, alquenilo C2-C6, Z-cicloalquenilo C3-C6, alquinilo C2-C6, Z-(tri-alquil C1- C4)sililo, Z-C(=0)-Ra, Z-NR'-CÍOJ-NR'R", Z-P(=0)(Ra)2, NR¡Ri¡, un heterociclo saturado, insaturado o aromático monocíclico de 3 a 7 miembros o bicíclico de 9 ó 10 miembros que contiene 1 , 2, 3 ó 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S y que puede estar parcial o completamente sustituido por grupos Ra y/o Rb, Ra es hidrógeno, OH, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C4, Z-cicloalquilo C3-C6, alquenilo C2-C8, Z-cicloalquenilo C5-C6, alquinilo C2-C8, Z- alcoxi C1-C6, Z-haloalcoxi C1-C4, Z-alqueniloxi C3-C8, Z-alquiniloxi C3-C8, NR'R", alquil C1-C6-sulfonilo, Z-(tri-alquil C1- C4)sililo, Z-fenilo, Z-fenoxi, Z-fenilamino o un heterociclo monocíclico de 5 ó 6 miembros o bicíclico de 9 ó 10 miembros que contiene 1, 2, 3 ó 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, donde los grupos cíclicos no están sustituidos o están sustituidos con 1 , 2, 3 ó 4 grupos Rb; R', R" son, de modo independiente entre sí, hidrógeno, alquilo C1- C8, haloalquilo C1-C4, alquenilo C3-C8, alquinilo C3-C8, Z- cicloalquilo C3-C6, Z-alcoxi C1-C8, Z-haloalcoxi C1-C8, Z- C(=0)-Ra, Z-fenilo, un heterociclo saturado, ¡nsaturado o aromático monocíclico de 3 a 7 miembros o bicíclico de 9 ó 10 miembros que contiene 1, 2, 3 ó 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S y que está unido por medio de Z; R' y R", junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, también pueden formar un heterociclo monocíclico de 5 ó 6 miembros o bicíclico de 9 ó 10 miembros que contiene 1 , 2, 3 ó 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S; Z es un enlace covalente o alquileno C1-C4; n es 0, 1 ó 2; es ciano, halógeno, nitro, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, haloalquilo C1-C6, Z-alcoxi C1-C6, Z-alcoxi C1-C4-alcoxi C1-C4, Z-alquil C1-C4-tio. Z-alquil C1-C4-tio-alquil C1-C4-tio, alquenil C2-C6-oxi, alquinil C2-C6-oxi, haloalcoxi C1-C6, haloalcoxi alcoxi C1-C4-C1-C4, S(0)nRbb, Z-fenoxi, Z-heterocicliloxi, donde heterociclilo es un heterociclo saturado, parcialmente insaturado o aromático monocíclico de 5 ó 6 miembros o bicíclico de 9 ó 10 miembros que contiene 1 , 2, 3 ó 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, donde los grupos cíclicos no están sustituidos o están parcial o totalmente sustituidos con Rb; Rbb es alquilo C1-C8, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, haloalquenilo C2-C6, haloalquinilo C2-C6 o haloalquilo C1-C6 y n es 0, 1 ó 2; es N o C-R2; es Z -fenilo, fenoxi o Z1 -heterociclilo, donde heterociclilo es un heterociclo saturado, parcialmente insaturado o aromático monocíclico de 5 ó 6 miembros o bicíclico de 9 ó 10 miembros que contiene 1 , 2, 3 ó 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, donde los grupos cíclicos no están sustituidos o están parcial o totalmente sustituidos con Rb; alquilo C1-C8, haloalquilo C2-C4, alcoxi C1-C4-alquilo C1-C4, alquil C1-C4-tio-alquilo C1-C4, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, haloalquenilo C2-C8, haloalquinilo C2-C8, alcoxi C2-C6, Z-alcox¡ C1-C4-alcox¡ C1-C4, Z-haloalcox¡ alcoxi C1-C4-C1- C4, haloalcoxi C2-C6, alquenil C3-C6-oxi, alquinil C3-C6-ox¡, alquil C2-C6-tio, haloalquil C2-C6-tio, Z-C(=0)-Ra, S(0)1-2Rbb; Z1 es un enlace covalente, alquilen C1-C4-oxi, oxialquileno C1-C4 o alquilen C1-C4-oxi-alquileno C1-C4; Rb son, de modo independiente entre sí, Z-CN, Z-OH, Z-N02l Z-halógeno, oxo (=0), =N-Ra, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C4, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, Z-alcoxi C1-C8, Z-haloalcoxi C1-C8, Z-cicloalquilo C3-C10, O-Z- cicloalquilo C3-C10, Z-C(=0)-Ra, NR¡Ri¡, Z-(tri-alquil C1-C4)sililo, Z-fenilo y S(0)nRb , dos grupos Rb pueden formar juntos un anillo que tiene tres a seis miembros del anillo y, además de los átomos de carbono, también pueden contener heteroátomos del grupo que consiste en O, N y S y puede no estar sustituido o puede estar sustituido por otros grupos Rb; R2 junto con el grupo unido al átomo de carbono adyacente también puede formar un anillo saturado o parcial o totalmente insaturado mono- o bicíclico de cinco a diez miembros que, además de los átomos de carbono, pueden contener 1, 2 ó 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S y pueden estar sustituidos con otros grupos Rb; es hidrógeno, halógeno, ciano, nitro, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1- C4, haloalcoxi C1-C4, alquenilo C2-C4, alquinilo C2-C4, alquenil C2-C4-oxi, alquinil C2-C4-oxi, S(0)nRbb; es hidrógeno, halógeno o haloalquilo C1-C4; es hidrógeno, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, alquil C1-C4-tio, haloalcoxi C1-C4, haloalquil C1-C4-tio; R7 son, de modo independiente entre sí, hidrógeno, halógeno o alquilo C1-C4; Y es O o S; X es O, S o N-Rx; R es hidrógeno, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C4, alquenilo C2-C6, alquinilo C3-C6, Z-cicloalquilo C3-C10, alcoxi C1-C6-alquilo C1-C6, cianoalquilo C1- C6, Z-fenilo, Z-C(=0)-Ra2 o tri-alquil C1-C4-sililo; Ra2 es alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C4, Z-alcoxi C1-C6, Z-haloalcoxi CI-CM o NR'R"; donde en los grupos RA y sus subsustituyentes, las cadenas de carbono y/o los grupos cíclicos pueden estar parcial o totalmente sustituidos con grupos Rb, o un N-óxido o una de sus sales agrícolamente apropiadas.

Los derivados de cumarona de utilidad para la presente invención se aplican a menudo de mejor forma junto con uno o varios otros herbicidas dirigidos a HPPD y/o HST para obtener control de una variedad más amplia de vegetación indeseada. Cuando se usa junto con otros herbicidas dirigidos a HPPD y/o HST, los compuestos revelados en la presente se pueden formular con el otro o los otros herbicidas, mezclar en tanque con el otro herbicida o los otros herbicidas o aplicar secuencialmente con el otro o los otros herbicidas.

Algunos de los herbicidas que son de utilidad junto con los derivados de cumarona de la presente invención incluyen benzobiciclona, mesotriona, sulcotriona, tefuriltriona, tembotriona, 4-hidroxi-3-[[2-(2-metoxietoxi)metil]-6-(trifluorometil)-3-piridinil]carbonil]-biciclo[3.2.1]-oct-3-en-2-ona (biciclopirona), cetospiradox o su ácido libre, benzofenap, pirasulfotol, pirazolinato, pirazoxifeno, topramezona, [2-cloro-3-(2-metoxietoxi)-4-(metilsulfonil)fenil](l-etil-5-hidroxi-1 H-pirazol-4-il)-metanona, (2,3-dihidro-3,3,4-trimetil-1,1-dioxidobenzo[b]tien-5-il)(5-hidroxi-1 -metil-1 H-pirazol-4-il)-metanona, isoxaclortol, isoxaflutol, a-(ciclopropilcarbonil)-2-(metilsulfonil)-p-oxo-4-cloro-bencenpropanonitrilo y a- (ciclopropilcarbonil)-2-(met¡lsulfonil)- -oxo-4-(trifluorometil)-bencenpropanonitr¡lo.

En una forma de realización preferida, el herbicida adicional es topramezona.

En una forma de realización de particular preferencia, el herbicida adicional es (1-etil-5-prop-2-iniloxi-1 H-pirazol-4-il)-[4-metansulfonil-2-metil-3-(3-metil-4,5-dihidro-isoxazol-5-il)-fenil]-metanona o (1-etil-5-hidroxi-1H-pirazol-4-il)-[4-metansulfonil-2-met¡l-3-(3-metil-4,5-dihidro-isoxazol-5-il)-fenil]-metanona Los compuestos antes descritos se describen con mayor detalle en el documento EP 09177628.6 que se incorpora por entero en la presente por referencia.

Los compuestos herbicidas de utilidad para la presente invención también se pueden usar junto con herbicidas adicionales a los que la planta de cultivo es naturalmente tolerante o a los que es resistente por expresión de uno o varios transgenes adicionales tal como mencionó supra. Algunos de los herbicidas que se pueden emplear junto con los compuestos de la presente invención incluyen sulfonamidas tales como metosulam, flumetsulam, cloransulam-metilo, diclosulam, penoxsulam y florasulam, sulfonilureas tales como clorimurona, tribenurona, sulfometurona, nicosulfurona, clorsulfurona, amidosulfurona, triasulfurona, prosulfurona, tritosulfurona, thifensulfurona, sulfosulfurona y metsulfurona, ¡midazolinonas tales como imazaquina, imazapic, ima-zetapir, imzapir, ¡mazametabenz e ¡mazamox, ácidos fenoxialcanoicos tales como 2,4-D, MCPA, diclorprop y mecoprop, ácidos piridiniloxiacéticos tales como triclopir y fluroxipir, ácidos carboxílicos tales como clopiralida, picloram, aminopiralida y dicamba, dinitroanilinas tales como trifluralina, benefina, benfluralina y pendimetalina, cloroacetanilidas tales como alaclor, acetoclor y metolaclor, semicarbazonas (inhibidores del transporte de auxina) tales como clorflurenol y diflufenzopir, ariloxifenoxipropionatos tales como fluazifop, haloxifop, diclofop, clodinafop y fenoxaprop y otros herbicidas comunes incluyendo glifosato, glufosinato, acifluorfeno, bentazona, clomazona, fumiclorac, fluometurona, fomesafeno, lactofeno, linurona, isoproturona, simazina, norflurazona, paraquat, diurona, diflufenicano, picolinafeno, cinidona, setoxidim, tralcoxidim, quinmerac, isoxabeno, bromoxinilo, metribuzina y mesotriona.

Los herbicidas derivados de cumarona de utilidad para la presente invención también se pueden usar junto con glifosato y glufosinato en cultivos tolerantes a glufosato o tolerantes a glufosinato.

A menos que ya se incluya en la descripción anterior, los herbicidas derivados de cumarona de utilidad para la presente invención también se pueden usar junto con los ocmpuestos: (a) del grupo de los inhibidores de la biosíntesis de lípidos: Alloxidim, Alloxidim-sodio, Butroxidim, Clethodim, Clodinafop, Clodinafop-propargilo, Cycloxidim, Cyhalofop, Cyhalofop-butilo, Diclofop, Diclofop-metilo, Fenoxaprop, Fenoxaprop-etilo, Fenoxaprop-P, Fenoxaprop-P-etilo, Fluazifop, Fluazifop-butilo, Fluazifop-P, Fluazifop-P-butilo, Haloxifop, Haloxifop-metilo, Haloxifop-P, Haloxifop-P-metilo, Metamifop, Pinoxaden, Profoxidim, Propaquizafop, Quizalofop, Quizalofop-etilo, Quizalofop-tefurilo, Quizalofop-P, Quizalofop-P-etilo, Quizalofop-P-tefurilo, Setoxidim, Tepraloxidim, Tralcoxidim, Benfuresato, Butilato, Cicloato, Dalapon, Dimepiperato, EPTC, Esprocarb, Ethofumesato, Flupropanato, Molinato, Orbencarb, Pebulato, Prosulfocarb, TCA, Tiobencarb, Tiocarbazilo, Trialato y Vernolato; (b) del grupo de los inhibidores de ALS: Amidosulfurona, Azimsulfurona, Bensulfurona, Bensulfuron-metilo, Bispyribac, Bispyribac-sodio, cloroimuron, cloroimuron-etilo, clorosulfurona, Cinosulfurona, Cloransulam, Cloransulam-metilo, Cyclosulfamuron, Díclosulam, Ethametsulfuron, Ethametsulfuron-metilo, Ethoxisulfuron, Flazasulfuron, Florasulam, Flucarbazon, Flucarbazon-sodio, Flucetosulfuron, Flumetsulam, Flupyrsulfuron, Flupyrsulfuron-metil-sodio, Foramsulfuron, Halosulfuron, Halosulfuron-metilo, Imazamethabenz, Imazamethabenz-metilo, Imazamox, Imazapic, Imazapyr, Imazaquin, Imazethapyr, Imazosulfuron, lodosulfuron, lodosulfuron-metil-sodio, Mesosulfuron, Metosulam, Metsulfuron, Metsulfuron-metilo, Nicosulfuron, Orthosulfamuron, Oxasulfuron, Penoxsulam, Primisulfuron, Primisulfuron-metilo, Propoxicarbazon, Propoxicarbazon-sodio, Prosulfuron, Pyrazosulfuron, Pyrazosulfuron-etilo, Pyribenzoxim, Pyrimisulfan, Pyriftalid, Pyriminobac, Pyriminobac-metilo, Pyrithiobac, Pyrithiobac-sodio, Pyroxsulam, Rimsulfuron, Sulfometuron, Sulfometuron-metilo, Sulfosulfuron, Thiencarbazon, Thiencarbazon-metilo, Thifensulfuron, Thifensulfuron-metilo, Triasulfuron, Tribenuron, Tribenuron-metilo, Trifloxisulfurona, Triflusulfurona, Triflusulfuron-metilo y Tritosulfuron; (c) del grupo de los inhibidores de la fotosíntesis: Ametryn, Amicarbazon, Atrazin, Bentazon, Bentazon-sodio, Bromacil, Bromofenoxim, Bromoxinil y sus sales y ésteres, cloroobromuron, cloroidazon, clorootoluron, clorooxuron, Cyanazin, Desmedipham, Desmetryn, Dimefuron, Dimethametryn, Diquat, Diquat-dibromuro, Diuron, Fluometuron, Hexazinon, loxinil y sus sales y ésteres, Isoproturon, Isouron, Karbutilat, Lenacil, Linuron, Metamitron, Methabenzthiazuron, Metobenzuron, Metoxuron, Metribuzin, Monolinuron, Neburon, Paraquat, Paraquat-dicloruro, Paraquat-dimetilsulfato, Pentanochlor, Phenmedipham, Phenmedipham-etilo, Prometon, Prometryn, Propanil, Propazin, Pyridafol, Pyridat, Siduron, Simazin, Simetryn, Tebuthiuron, Terbacil, Terbumeton, Terbuthylazin, Terbutryn, Thidiazuron y Trietazin; d) del grupo de los inhibidores de la protoporfrinógeno-IX-oxidasa: Acifluorfen, Acifluorfen-sodio, Azafenidin, Bencarbazon, Benzfendizon, Bifenox, Butafenacil, Carfentrazon, Carfentrazon-etilo, Chlometoxifen, Cinidon-etilo, Fluazolat, Flufenpyr, Flufenpyr-etilo, Flumiclorac, Flumiclorac-pentilo, Flumioxazin, Fluoroglycofen, Fluoroglycofen-etilo, Fluthiacet, Fluthiacet-metilo, Fomesafen, Halosafen, Lactofen, Oxadiargyl, Oxadiazon, Oxyfluorfen, Pentoxazon, Profluazol, Pyraclonil, Pyraflufen, Pyraflufen-etilo, Saflufenacil, Sulfentrazon, Thidiazimin, 2-cloro-5-[3,6-dihidro-3-metil-2,6-dioxo-4-(trifluorometil)-1(2Ay)-pirimidinil]-4-fluoro-N-[(isopropil)metilsulfamoil]benzamida (H-1 ; CAS 372137-35-4), éster etílico de ácido [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1-metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1 ,2,3,4,-tetrahidropirimidin-3-il)fenoxi]-2-piridiloxi]ac§tico (H-2; CAS 353292-31-6), N-etil-3-(2,6-dicloro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-1H-pirazol-1-carboxamida (H-3; CAS 452098-92-9), N-tetrahidrofurfuril-3-(2,6-d¡cloro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-1H-pirazol-1-carboxamida (H-4; CAS 915396-43-9), N-etil-3-(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometilfenoxi)-5-met¡l-1H-pirazol-1-carboxamida (H-5; CAS 452099-05-7) y N-Tetrahidrofurfuril-3-(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-1/-/-pirazol-1-carboxamida (H-6; CAS 45100-03-7); e) del grupo de los inhibidores de herbicidas blanqueadores: Aclonifen, Amitrol, Beflubutamid, Benzobiciclon, Benzofenap, Clomazon, Diflufenican, Fluridon, Flurochloridon, Flurtamon, Isoxaflutol, Mesotrion, Norflurazon, Picolinafen, Pyrasulfutol, Pyrazolynat, Pyrazoxifen, Sulcotrion, Tefuryltrion, Tembotrion, Topramezon, 4-hidroxi-3-[[2-[(2-metoxietoxi)metil]-6-(trifluorometil)-3-piridil]carbonil]biciclo[3.2.1^ en-2-ona (H-7; CAS 352010-68-5) y 4-(3-Trifluormetilfenox¡)-2-(4-trifluorometilfenil)p¡rim¡d¡na (H-8; CAS 180608-33-7); f) del grupo de los inhibidores de la EPSP-sintasa: Glyphosat, Glyphosat-isopropilamonio y Glyphosat-trimesio (Sulfosat); g) del grupo de los inhibidores de glutamina-sintasa: Bilanaphos (Bialaphos), Bilanaphos-sodio, Glufosinat y Glufosinat-amonio; h) del grupo de los inhibidores de DHP-sintasa: Asulam; i) del grupo de los inhibidores de la mitosis: Amiprophos, Amiprophos-metilo, Benfluralin, Butamiphos, Butralin, Carbetamid, Chlorpropham, Chlorthal, Chlorthal-dimetilo, Dinitramin, Dithiopyr, Ethalfluralin, Flu-chloralin, Oryzalin, Pendimethalin, Prodiamin, Propham, Propyzamid, Tebutam, Thiazopyr y Trifluralin; j) del grupo de los inhibidores de VLCFA: Acetochlor, Alachlor, Anilofos, Butachlor, Cafenstrol, Dimethachlor, Dimetanamid, Dimethenamid-P, Diphenamid, Fentrazamid, Flufenacet, Mefenacet, Metazachlor, Metolachlor, Metolachlor-S, Naproanilid, Napropamid, Pethoxamid, Piperophos, Pretilachlor, Propachlor, Propisochlor, Pyroxasulfon (KIH-485) y Thenylchlor; Compuestos de la fórmula 2: Los compuestos de particular preferencia de la fórmula 2 son: 3-[5-(2,2-Difluoro-etoxi)-1-metil-3-trifluorometil-1 H-pirazol-4-ilmetansulfonil]-4-fluoro-5,5-dimetil-4,5-dihidro-isoxazol (2-1); 3-{[5-(2,2-Difluoro-etoxi)-1-metil-3-trifluorometil-1 H- pirazol-4-il]-fluoro-metansulfonil}-5,5-dimetil-4,5-dihidro-isoxazol (2-2); 4-(4-Fluoro-5,5-dimetil-4,5-dihidro-isoxazol-3-sulfonilmetil)-2-metil-5-trifluorometil-2H-[1,2,3]tnazol (2-3); 4-[(5,5-Dimetil-4,5-dihidro-isoxazol-3-sulfonil)-fluoro-metil]-2-metil-5-trifluorometil-2H [1 ,2,3]triazol (2-4); 4-(5,5-Dimetil-4>5-dihidro-isoxazol-3-sulfonilmetil)-2-metil-5-trifluorometil-2H-[1 ,2,3]triazol (2-5); 3-{[5-(2,2-Difluoro-etoxi)-1-metil-3-trifluorometil-1 H-pirazol-4-il]-difluoro-metansulfonil}-5,5-dimetil-4,5-dihidro-isoxazol (2-6); 4-[(5,5-Dimetil-4,5-dihidro-isoxazol-3-sulfonil)-difluoro-metil]-2-metil-5-trifluorometil-2H (2-7); 3-{[5-(2,2-Difluoro-etoxi)-1-metil-3-trifluorometil-1H-pirazol-4-il]-difluoro-metansulfo fluoro-5,5-dimetil-4,5-dihidro-isoxazol (2-8); 4-[Difluoro-(4-fluoro-5,5-dimetil-4,5-dihidro-isoxazol-3-sulfonil)-metil]-2-metil-5-trifluorometil-2H-[1 ,2,3]triazol (2-9); k) del grupo de los inhibidores de la biosíntesis de celulosa: Chlorthiamid, Dichlobenil, Flupoxam e Isoxaben; I) del grupo de los herbicidas de desacoplamiento: Dinoseb, Dinoterb y DNOC y sus sales; m) del grupo de los herbicidas de auxina: 2,4-D y sus sales y ésteres, 2,4-DB y sus sales y ésteres, Aminopiralid y sus sales tales como aminopiralid-tris(2-hidroxipropil)amonio y sus ésteres, Benazolin, Benazolin-etilo, cloroamben y sus sales y ésteres, Clomeprop, Clopiralid y sus sales y ésteres, Dicamba y sus sales y ésteres, Dichlorprop y sus sales y ésteres, Dichlorprop-P y sus sales y ésteres, Fluroxipyr, Fluroxipyr-butometilo, Fluroxipyr-meptilo, MCPA y sus sales y ésteres, MCPA-tioetilo, MCPB y sus sales y ésteres, Mecoprop y sus sales y ésteres, Mecoprop-P y sus sales y ésteres, Picloram y sus sales y ésteres, Quinclorac, Quinmerac, TBA (2,3,6) y sus sales y ésteres, Triclopyr y sus sales y ésteres y ácido 5,6-Diclor-2-ciclopropil-4-pirimidincarbónico (H-9; CAS 858956-08-8) y sus sales y ésteres; n) del grupo de los inhibidores de transporte de auxina: Diflufenzopyr, Diflufenzopyr- sodio, Naptalam y Naptalam-sodio; o) del grupo de otros herbicidas: Bromobutid, Chlorflurenol, Chlorflurenol-metilo, Cinmetilin, Cumyluron, Dalapon, Dazomet, Difenzoquat, Difenzoquat-metilsulfato, Dimethipin, DSMA, Dymron, Endothal y sus sales, Etobenzanid, Flamprop, Flamprop-¡sopropilo, Flamprop-metilo, Flamprop-M-isopropilo, Flamprop-M-metilo, Flurenol, Flurenol-butyl, Flurprimidol, Fosamin, Fosamine-amonio, Indanofan, hidrazina de ácido maleínico, Mefluiduro, Metam, Metilazida, Metilbromuro, Metil-dymron, Yoduro de metilo. MSMA, ácido oleico, Oxaziclomefon, Ácido pelargónico, Pyributicarb, Quinoclamin, Triaziflam, Tridiphan y 6-cloro-3-(2-ciclopropil-6-metilfenoxi)-4-piridazinol (H-10; CAS 499223-49-3) y sus sales y ésteres.

Los ejemplos de Safeners C preferidos son Benoxacor, Cloquintocet, Cyometrinil, Cyprosulfamid, Dichlormid, Diciclonon, Dietholate, Fenchlorazol, Fenclorim, Flurazol, Flu-xofenim, Furilazol, Isoxadifen, Mefenpyr, Mephenat, anhídrido de ácido naftálico, Oxabetrinil, 4-(Dicloroacet¡l)-1-oxa-4-azaespiro[4.5]decano (H-11 ; MON4660, CAS 71526-07-3) y 2,2,5-Trimetil-3-(dicloroacetil)-1 ,3-oxazolidina (H-12; R-29148, CAS 52836-31-4).

Los compuestos de los grupos a) a o) y los Safeners C son conocidos Herbicidas y Safeners, ver, por ejemplo, The Compendium of Pesticide Common ames (http://www.alanwood.net/pesticides/); B. Hock, C. Fedtke, R. R. Schmidt, Herbicides, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1995. Se conocen otros efectores herbicidas de los documentos WO 96/26202, WO 97/41116, WO 97/41117, WO 97/41118, WO 01/83459 y WO 2008/074991, así como de W. Krámer et al. (ed.) "Modern Crop Protection Compounds", Vol. 1 , Wiley VCH, 2007 y la literatura citada allí.

Se prefiere en general usar los compuestos antes descritos en combinación con herbicidas que son selectivos del cultivo en tratamiento y que complementan el espectro de malezas controladas por estos compuestos en la tasa de aplicación empleada.

También se prefiere en general la aplicación de los compuestos de la invención y otros herbicidas complementarios al mismo tiempo, ya sea como una formulación combinada o como mezcla en tanque.

La expresión "ácido nucleico de mut-HPPD" se refiere a un ácido nucleico de HPPD que tiene una secuencia que está mutada de un ácido nucleico de HPPD de tipo silvestre y que confiere mayor tolerancia a "herbicida derivado de cumarona" a una planta en la que se expresa. Por otra parte, la expresión "hidroxifenilpiruvato dioxigenasa mutada (mut-HPPD)" se refiere al reemplazo de un aminoácido de las secuencias primarias de tipo silvestre SEQ ID NO: 2, 5. 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 o 53, una variante, un derivado, un homólogo, un ortólogo o su parálogo, con otro aminoácido. La expresión "aminoácido mutado" se usará más abajo para designar el aminoácido que está reemplazado por otro aminoácido, designando así el sitio de mutación en ia secuencia primaria de la proteína.

En una forma de realización preferida, el polipéptido mut-HPPD de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos mutada de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 53.

La expresión "ácido nucleico de mut-HST" se refiere a un ácido nucleico de HST que tiene una secuencia que está mutada con respecto a un ácido nucleico de HST de tipo silvestre y que confiere mayor tolerancia a un "herbicida derivado de cumarona" a una planta en la cual se expresa. Además, el término "homogentisato solanesiltransferasa mutada (mut-HST)" se refiere al reemplazo de un aminoácido de las secuencias primarias de tipo silvestre SEQ ID NO: 48 o 50 con otro aminoácido. La expresión "aminoácido mutado" se usará más abajo para designar el aminoácido que es reemplazado por otro aminoácido, designando de este modo el sitio de la mutación en la secuencia primaria de la proteína.

Varias HPPDs y sus secuencias primarias han sido descriptas en el estado del arte, en particular las HPPDs de bacterias tales como Pseudomonas (Ruetschi et al., Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, W096/38567), de plantas tales como Arabidopsis (W096/38567, Genebank AF047834) o de zanahoria (W096/38567, Genebank 87257) de Coccicoides (Genebank COITRP), HPPDs de Arabidopsis, Brassica, algodón, Synechocystis y tomate (US 7.297.541 ), de mamíferos tales como el ratón o el cerdo. Además se han descrito secuencias de HPPD artificiales, por ejemplo, en la US 6.768.044; US 6.268.549.

En una forma de realización preferida, la secuencia de nucleótidos de (i) comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 , 51 , 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, o 52, o una variante o un derivado de ésta.

En una forma de realización particularmente preferida, el ácido nucleico de la mut-HPPD de la presente invención comprende una secuencia de ácidos nucleicos mutada de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 52, o una variante o derivado de ésta.

En otra forma de realización preferida, la secuencia de nucleótidos de (¡i) comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 47 ó 49, o una variante o derivado de ésta.

Además, el experto en el arte comprenderá que las secuencias de nucleótidos de (i) o (ii) comprenden homólogos, parálogos y ortólogos de las SEQ ID NOs: 1 , 51 , 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, o 52, y respectivamente SEQ ID NO: 47 ó 49, como se define más abajo.

El término "variante" con respecto a una secuencia (por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o ácidos nucleicos, tal como -por ejemplo- una secuencia de nucleótidos reguladora de la transcripción de la invención) se entiende que significa secuencias sustancialmente similares. Para secuencias de nucleótidos que comprenden un marco de lectura abierto, las variantes incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos idéntica de la proteína nativa. Las variantes alélicas que existen naturalmente, tales como las que pueden ser identificadas con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, con la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas en forma sintética, tales como aquellas generadas, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida a un sitio y para marcos de lectura abiertos, codifican la proteína nativa, así como también aquellas que codifican un polipéptido que tiene sustituciones de aminoácidos con relación a la proteína nativa. En general, las variantes de secuencias de nucleótidos de la invención tendrán por lo menos 30, 40, 50, 60 a 70%, por ejemplo, preferentemente 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% a 79%, en general por lo menos 80%, por ejemplo, 81%-84%, por lo menos 85%, por ejemplo, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% a 98% y 99% de "identidad de secuencia" de nucleótidos con respecto a la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOs:1 , 51 , 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 52, 47 ó 49. Por polipéptido "variante" se entiende un polipéptido derivado de la proteína de la SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11 , 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50 o 53, por deieción (así llamada truncado) o adición de uno o más aminoácidos al extremo N terminal y/o C terminal de la proteína nativa; la deieción o adición de uno o más aminoácidos a uno o más sitios en proteína nativa; o la sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Tales variantes pueden resultar de, por ejemplo, polimorfismo genético o de manipulación humana. Los métodos para tales manipulaciones son conocidos en general en el arte.

En una forma de realización preferida, las variantes de los polinucleótidos de la invención tendrán por lo menos 30, 40, 50, 60 a 70%, por ejemplo, preferentemente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% a 79%, en general por lo menos 80%, por ejemplo, 81%-84%, por lo menos 85%, por ejemplo, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% a 98% y 99% de "identidad de secuencias" de nucleótidos con respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO: 52.

Se reconoce que las moléculas de polinucleótidos y los polipéptidos de la invención comprenden moléculas de polinucleótidos y polipéptidos que comprenden una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos que es suficientemente idéntica a las secuencias de nucleótidos presentadas en las SEQ ID Nos: 1 , 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 52, 47 ó 49, o a las secuencias de aminoácidos presentadas en las SEQ ID Nos: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, 48 o 50. El término "suficientemente idéntica" se usa en la presente para referirse a una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos que contiene un núemro suficiente o mínimo de residuos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar) a una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos, de tal modo que la primera y la segunda secuencias de aminoácidos o nucleótidos tienen un dominio estructural común y/o una actividad funcional común.

"Identidad de secuencias" se refiere a la medida en la cual dos secuencias de ADN o aminoácidos óptimamente alineadas son invariantes en una ventana de alineamiento de componentes, por ejemplo, nucleótidos o aminoácidos. Una "fracción de identidad" para segmentos alineados de una secuencia de prueba y una secuencia de referencia es el número de componentes idénticos que son compartidos por las dos secuencias alineadas divididas por el número total de componentes en el segmento de secuencia de referencia, es decir, toda la secuencia de referencia o una parte definida más pequeña de la secuencia de referencia. "Identidad por ciento" es la fracción de identidad por 100. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación es bien conocido por los expertos en el arte y puede ser realizado con herramientas tales como el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, la búsqueda de un método de similitud de Pearson y Lipman, y preferentemente por ¡mplementaciones computarizadas de estos algoritmos tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA disponibles como parte de la GCG. Wisconsin Package. (Accelrys Inc. Burlington, Mass.) Los términos "polinucleótido(s)", "secuencia(s) de ácido nucleico(s)", "secuencia(s) de nucleótido(s)", "ácido(s) nucleico(s)", "molécula de ácido nucleico" se usan en la presente en forma intercambiable y se refieren a nucleótidos, o bien ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una combinación de ambos, en una forma no ramificada polimérica de cualquier longitud.

"Derivados" de una proteína comprenden péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tienen una actividad biológica y funcional similar a la de la proteína no modificada de la cual se derivan.

"Homólogos" de una proteína comprenden péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tienen una actividad biológica y funcional similar a la de la proteína no modificada de la cual se derivan.

Una deleción se refiere a la remoción de uno o más aminoácidos de una proteína. Una inserción se refiere a uno o más residuos de aminoácidos que son introducidos en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones N terminales y/o C terminales así como también inserciones intrasecuencias de aminoácidos simples o múltiples. En general, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones N o C terminales, del orden de aprox. 1 a 10 residuos. Ejemplos de proteínas o péptidos de fusión N o C terminales incluyen el dominio de unión o el dominio de activación de un activador transcripcional como se usa en el sistema de dos híbridos de levaduras, las proteínas del recubrimiento del fago, (histidina)-6-tag, glutatión S-transferasa-tag, proteína A, proteína de unión de la maltosa, dihidrofolato reductasa, epitopo Tag»100, epitopo c-myc, epitopo FLAG®-, lacZ, CMP (péptido de unión de la calmodulina), epitopo HA, epitopo de la proteína C y epitopo VSV.

Una sustitución se refiere al reemplazo de aminoácidos de la proteína con otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión a formar o romper las estructuras a-helicoidales o las estructuras de hoja ß). Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos simples, pero pueden ser agrupados dependiendo de las restricciones funcionales relacionadas con el polipéptido y pueden oscilar entre 1 y 10 aminoácidos; las inserciones serán usualmente del orden de aprox. 1 a 10 residuos de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos son preferentemente sustituciones de aminoácidos conservadoras. Las tablas de sustitución conservadoras son bien conocidas en el arte (ver por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company (Eds).

Tabla 3: Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadas Las sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos pueden realizarse fácilmente usando las técnicas de síntesis de péptidos bien conocidas en el arte, tal como síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por manipulación de ADN recombinante. Los métodos para la manipulación de las secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o deleción de una proteína son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, las técnicas para preparar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en ADN son bien conocidas por los expertos en el arte e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagénesis dirigida a un sitio QuikChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida a un sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida a un sitio.

En una forma de realización particularmente preferida, la mutagénesis dirigida a un sitio para generar una variante de HPPD de la SEQ ID NO: 53 es llevada a cabo usando uno o más de los cebadores seleccionados entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 100, 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 1 14, 1 15, 1 16, 1 17, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, y 129.

En consecuencia, en otra forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 100, 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, y 129.

"Derivados" incluye además péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que pueden comprender, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la forma de la proteína que existe naturalmente, tal como la proteína de interés, sustituciones de aminoácidos con residuos de aminoácidos que no existen naturalmente, o adiciones de residuos de aminoácido que no existen naturalmente. "Derivados" de una proteína también comprenden péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que comprenden residuos de aminoácidos que existen naturalmente alterados (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados, etc.) o residuos de aminoácidos no alterados naturalmente en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma que existe naturalmente del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes o adiciones que no son aminoácidos en comparación con las secuencia de aminoácidos de la cual se derivan, por ejemplo, una molécula reportero u otro ligando, unido en forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula reportero que es unida para facilitar su detección, y residuos de de aminoácidos que no existen naturalmente con relación a la secuencia de aminoácidos de una proteína que existe naturalmente. Además, "derivados" también incluye fusiones de la forma que existe naturalmente de la proteína con péptidos marcadores tales como FLAG, HIS6 o tioredoxina (para una revisión de los péptidos marcadores, ver Terpe, Appl. Microbiol.

Biotechnol. 60, 523-533, 2003).

"Ortólogos" y "parálogos" comprenden conceptos evolutivos usados para describir las relaciones ancestrales de los genes. Los parálogos son genes dentro de la misma especie que se han originado a través de la duplicación de un gen ancestral; ortólogos son genes de diferentes organismos que se han originado a través de especiación, y también se derivan de un gen ancestral común. Una lista no limitativa de ejemplos de tales ortólogos se muestra en la Tabla 1.

Es bien conocido en el arte que los parálogos y ortólogos pueden compartir distintos dominios que alojan residuos de aminoácidos adecuados en sitios dados, tales como bolsillos de unión para sustratos particulares o motivos de unión para la interacción con otras proteínas.

El término "dominio" se refiere a un conjunto de aminoácidos conservado en posiciones específicas a lo largo de un alineamiento de secuencias de proteínas relacionadas evolutivamente. Si bien los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre homólogos, los aminoácidos que están altamente conservados en posiciones específicas indican los aminoácidos que son probablemente esenciales en la estructura, estabilidad o función de una proteína. Identificados por su alto grado de conservación en secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteínas, pueden ser usados como identificadores para determinar si cualquier polipéptido en cuestión pertenece a una familia de polipéptidos identificada previamente.

El término "motivo" o "secuencia de consenso" se refiere a una región conservada corta en la secuencia de proteínas relacionadas evolutivamente. Los motivos son frecuentemente partes altamente conservadas de dominios, pero también pueden incluir sólo parte del dominio, o pueden ser ubicadas fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo se encuentran fuera de un dominio definido).

Existen bases de datos especiales para la identificación de dominios, por ejemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucí. Acids. Res. 31 , 315-318), Prosite (Bucher y Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequence motifs and its function in automatic sequence interpretation. (En) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61 , AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucí. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)), o Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1 ): 276-280 (2002)). Un conjunto de herramientas para el análisis in silico de secuencias de proteínas se encuentra disponible en el servidor proteómico ExPASy (Swiss Institute de Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31 :3784-3788(2003)). Los dominios o motivos también pueden ser identificados usando técnicas de rutina, tales como por alineamiento de secuencias.

Los métodos para el alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en el arte, tales métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para hallar el alineamiento global (es decir, abarcando las secuencias completas) de dos secuencias que maximiza el número de apareamientos y minimiza el número de gaps. El algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula la identidad de secuencias en porcentaje y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar el análisis BLAST se encuentra disponible públicamente a través del National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Los homólogos pueden ser identificados fácilmente usando, por ejemplo, el algoritmo de alineamiento de secuencias múltiples ClustalW (versión 1.83), con los parámetros de alineamiento de a pares por defecto, y un método de evaluación en porcentaje. Los porcentajes globales de similitud e identidad también pueden ser determinados usando uno de los métodos disponibles en el paquete de software MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences). Se puede realizar una edición manual menor para optimizar el alineamiento entre motivos conservados, como resultaría evidente para un experto en el arte. Además, en lugar de usar secuencias de longitud completa para la identificación de homólogos, también se pueden usar dominios específicos. Los valores de identidad de secuencia pueden ser determinados sobre toda la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos o sobre dominios seleccionados o motivos conservados, usando los programas mencionados más arriba usando los parámetros por defecto. Para los alineamientos locales, es particularmente útil el algoritmo de Smith-Waterman (Smith TF, Waterman MS (1981 ) J. Mol. Biol 147(1); 195-7).

Los inventores de la presente invención han hallado sorprendentemente que sustituyendo uno o más de los residuos de aminoácidos claves se podía aumentar notablemente la tolerancia o resistencia a herbicidas en comparación con la actividad de las enzimas HPPD de tipo silvestre con las SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11 , 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53. Las sustituciones preferidas de mut-HPPD son aquellas que aumentan la tolerancia a herbicidas de la planta, pero dejan la actividad biológica de la dioxigenasa sustancialmente sin afectar.

Por consiguiente, otro objeto de la presente invención se refiere a la enzima HPPD, una variante, un derivado, un ortólogo, parálogo u homólogo de ésta, cuyos residuos de aminoácidos claves están sustituidos por cualquier otro aminoácido.

En una forma de realización, los residuos de aminoácidos claves de una enzima HPPD, una variante, un derivado, un ortólogo, un parálogo o un homólogo de ésta, es sustituido por un aminoácido conservado como se ilustra en la Tabla 3 más arriba.

El experto en el arte comprenderá que los aminoácidos ubicados en una estrecha proximidad a las posiciones de los aminoácidos mencionados más abajo también pueden ser sustituidos. Así, en otra forma de realización, la mut-HPPD de la presente invención comprende una secuencia de las SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11 , 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, o una variante, un derivado, un ortólogo, parálogo u homólogo de ésta, en donde un aminoácido ±3, ±2 o ±1 posiciones de aminoácido de un aminoácido clave es sustituido por cualquier otro aminoácido.

En base a las técnicas bien conocidas en el arte, se puede desarrollar un modelo de secuencias altamente característico, por medio del cual se pueden buscar otros candidatos de mut-HPPD con la actividad deseada.

La búsqueda de otros candidatos de mut-HPPD aplicando un modelo de secuencias adecuado también estaría comprendido por la presente invención. Un lector experto comprendería que el presente modelo de secuencias no está limitado por las distancias exactas entre dos residuos de aminoácidos adyacentes de dicho modelo. Cada una de las distancias entre dos vecinos en los modelos mencionados más arriba pueden variar, por ejemplo, independientemente uno de otro por hasta ± 10, ± 5, ± 3, ± 2 o ± 1 posiciones de aminoácidos sin afectar sustancialmente la actividad deseada.

En línea con dicho análisis funcional y espacial mencionado más arriba de residuos de aminoácidos individuales basado en los datos cristalográficos como se obtuvieron de acuerdo con la presente invención, se pueden identificar secuencias de aminoácidos parciales únicas características de candidatos de mut-HPPD potencialmente útiles de la invención.

En una forma de realización particularmente preferida, la variante o el derivado de la mut-HPPD de la SEQ ID NO: 2 es seleccionado de la siguiente Tabla 4a y las sustituciones de aminoácidos combinadas de mut-HPPD de la SEQ ID NO: 2 son seleccionadas de la Tabla 4b.

Tabla 4a: (Secuencia ID No: 2): sustituciones de aminoácidos simples Tabla 4b: (Secuencia ID No: 2): sustituciones de aminoácidos combinadas Se entiende que cualquier aminoácido además de los mencionados en las tablas anteriores se podría utilizar como un sustituyente. Los ensayos para evaluar la funcionalidad de estos mutantes son fácilmente asequibles en el arte y, respectivamente, se describen en la sección de ejemplos de la presente invención.

En una forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos difiere de una secuencia de aminoácidos de una HPPD de SEQ ID NO: 2 en una o varias de las siguientes posiciones: 236, 411 , 320, 403, 334, 353, 321 , 212, 407.

Los ejemplos de diferencias en estas posiciones de aminoácidos incluyen, pero sin limitación, uno o varios de los siguientes: el aminoácido en la posición 236 es distinto de alanina; el aminoácido en la posición 411 es distinta de ácido glutámico; el aminoácido en la posición 320 es distinta de leucina; el aminoácido en la posición 403 es distinta de glicina; la posición de aminoácido 334 es distinta de leucina; la posición de aminoácido 353 es distinta de leucina; el aminoácido en la posición 321 es distinta de prolina; el aminoácido en la posición 212 es distinta de valina; el aminoácido en la posición 407 es distinta de glicina.

En algunas formas de realización, la enzima mut-HPPD de la SEQ ID NO: 2 comprende uno o varios de los siguientes: el aminoácido en la posición 236 es leucina; el aminoácido en la posición 411 es treonina; el aminoácido en la posición 320 es asparagina, glutamina, histidina o tirosina; el aminoácido en la posición 403 es arginina; la posición de aminoácido 334 es ácido glutámico; la posición de aminoácido 353 es metionina; el aminoácido en la posición 321 es alanina o arginina; el aminoácido en la posición 212 es isoleucina o leucina; el aminoácido en la posición 407 es cisteína.

En una forma de realización de particular preferencia, la enzima mut-HPPD de la presente invención de SEQ ID NO: 2 comprende uno o varios de los siguientes: el aminoácido en la posición 320 es asparagina; la posición de aminoácido 334 es ácido glutámico; la posición de aminoácido 353 es metionina; el aminoácido en la posición 321 es arginina; el aminoácido en la posición 212 es isoleucina.

En otra forma de realización de particular preferencia, la variante o el derivado de la mut-HPPD de SEQ ID NO: 53 está seleccionado de la siguiente Tabla 4c y sustituciones de aminoácidos combinados de mut-HPPD de SEQ ID NO: 53 están seleccionadas de la Tabla 4d.

Tabla 4c: (Secuencia ID No: 53): sustituciones de aminoácidos simples Tabla 4d: (Secuencia ID No: 53): sustituciones de aminoácidos combinados Se entiende que cualquier aminoácido además de los mencionados en las tablas anteriores se podría utilizar como un sustituyente. Los ensayos para evaluar la funcionalidad de estos mutantes son fácilmente asequibles en el arte y, respectivamente, se describen en la sección de ejemplos de la presente invención.

En otra forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos difiere de una secuencia de aminoácidos de una HPPD de SEQ ID NO: 53 en una o varias de las siguientes posiciones: 293, 335, 336, 337, 363, 422, 385, 393, 368, 421.

Los ejemplos de diferencias en estas posiciones de aminoácidos incluyen, pero sin limitación, uno o varios de los siguientes: el aminoácido en la posición 293 es distinta de glutamina; el aminoácido en la posición 335 es distinta de metionina; el aminoácido en la posición 336 es distinta de prolina; el aminoácido en la posición 337 es distinta de serina; la posición de aminoácido 363 es distinta de ácido glutámico; el aminoácido en la posición 422 es distinta de glicina; el aminoácido en la posición 385 es distinta de leucina; la posición de aminoácido 393 es distinta de una isoleucina; la posición de aminoácido 368 es distinta de leucina; la posición de aminoácido 421 es distinta de lisina.

En algunas formas de realización, la enzima de HPPD de SEQ ID NO: 53 comprende uno o varios de los siguientes: el aminoácido en la posición 293 es alanina, leucina, isoleucina, valina, histidina, asparagina o serina; el aminoácido en la posición 335 es alanina, triptófano, fenilalanina, leucina, isoleucina, valina, asparagina, glutamina, histidina, tirosina, serina, treonina o cisteína; el aminoácido en la posición 336 es alanina o arginina; el aminoácido en la posición 337 es alanina o prolina; el aminoácido en la posición 368 es metionina o tirosina; la posición de aminoácido 363 es glutamina; el aminoácido en la posición 421 es treonina; el aminoácido en la posición 422 es histidina, metionina, fenilalanina o cisteína; el aminoácido en la posición 385 es valina o alanina; la posición de aminoácido 393 es alanina o leucina.

En formas de realización de particular preferencia, la enzima de HPPD de SEQ ID NO: 53 comprende uno o varios de los siguientes: el aminoácido en la posición 335 es tirosina o histidina; la posición de aminoácido 393 es leucina; el aminoácido en la posición 385 es valina.

En otra forma de realización de particular preferencia, la enzima de HPPD de SEQ ID NO: 53 comprende uno o varios de los siguientes: el aminoácido en la posición 335 es glutamina, asparagina, tirosina, histidina, con preferencia, histidina; el aminoácido en la posición 336 es arginina o alanina, con preferencia, alanina; y/o la posición de aminoácido 363 es glutamina.

Estará dentro del conocimiento del experto en el arte identificar las regiones conservadas y los motivos compartidos entre los homólogos, ortólogos y parálogos de la SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11 , 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, y respectivamente SEQ ID NO: 48 ó 50, tales como los representados en la Tabla 1. Habiendo identificado estas regiones conservadas que pueden representar motivos de unión apropiados, los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos enumerados en la Tabla 4a y 4b,4c y 4d se pueden seleccionar sustituidos por otro aminoácido, con preferencia, por aminoácidos conservados tal como se muestra en la tabla 3 y con mayor preferencia, por los aminoácidos de las tablas 4a y 4b, 4c y 4d.

Además, la presente invención se refiere a un método para identificar un herbicida derivado de cumarona usando una mut-HPPD codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, o 52, o una de sus variantes o derivados, y/o usando una mut-HST codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 47 ó 49 o una de sus variantes o derivados.

Dicho método comprende las etapas de: a) generación de una célula o planta transgénica que comprende un ácido nucleico que codifica una mut-HPPD, en donde la mut-HPPD se expresa; b) aplicación de un herbicida derivado de cumarona a la célula o planta transgénica de a) y a una célula o planta de control de la misma variedad; c) determinación del crecimiento o la viabilidad de la célula o planta transgénica y la célula o planta de control después de la aplicación de dicho herbicida derivado de cumarona, y d) selección de "herbicidas derivados de cumarona" que confieren crecimiento reducido a la célula o planta de control en comparación con el crecimiento de la célula o planta transgénica.

Por "célula de control" o "similar planta, tejido de planta, célula de planta o célula huésped de tipo silvestre" se entiende una planta, tejido de planta, célula de planta o célula huésped, respectivamente, que carecen de las características de resistencia a herbicidas y/o particulares polinucleótidos de la invención que se revelan en la presente. El uso de la expresión "de tipo silvestre", en consecuencia, no pretende implicar una planta, tejido de planta, célula de planta u otra célula huésped que carece de ADN recombinante en su genoma, y/o no posee características resistentes a herbicidas que son diferentes de aquellos revelados en la presente.

Otro objeto se refiere a un método de identificación de una secuencia de nucleótidos que codifica una mut-HPPD que es resistente o tolerante a un herbicida derivado de cumarona, que comprende: a) generación de una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican mut-HPPD, b) controlar una población de los ácidos nucleicos que codifican la mut-HPPD resultante por expresión de cada uno de dichos ácidos nucleicos en una célula o planta y tratamiento de dicha célula o planta con un herbicida derivado de cumarona, c) comparación de los niveles de tolerancia a herbicidas derivados de cumarona proporcionados por dicha población de mut-HPPD que codifica ácidos nucleicos con el nivel de tolerancia a herbicidas derivados de cumarona proporcionado por un ácido nucleico que codifica una HPPD de control, d) selección de al menos un ácido nucleico que codifica una mut-HPPD que proporciona un nivel de tolerancia significativamente mayor a un herbicida derivado de cumarona en comparación con el proporcionado por el ácido nucleico que codifica la HPPD de control.

En una forma de realización preferida, el ácido nucleico que codifica una mut-HPPD seleccionado en la etapa d) proporciona al menos 2 veces como mucho la resistencia o tolerancia de una célula o planta a un herbicida derivado de cumarona en comparación con el proporcionado por el ácido nucleico que codifica la HPPD de control.

En otra forma de realización preferida, el ácido nucleico que codifica una mut-HPPD seleccionado en la etapa d) proporciona al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces, como mucho de resistencia o tolerancia de una célula o planta a un herbicida derivado de cumarona en comparación con el proporcionado por el ácido nucleico que codifica la HPPD de control.

La resistencia o tolerancia se puede determinar generando una planta transgénica o célula huésped, con preferencia, una célula de planta, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la biblioteca de la etapa a) y comparación de dicha planta transgénica con una planta de control o célula huésped, con preferencia, una célula de planta.

Otro objeto se refiere a un método de identificación de una planta o algas que contienen un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una mut-HPPD o mut-HST que es resistente o tolerante a un herbicida derivado de cumarona, que comprende: a) identificación de una cantidad efectiva de un herbicida derivado de cumarona en un cultivo de células de planta o algas verdes que lleva a la muerte de dichas células. b) tratamiento de dichas células vegetales o algas verdes con un agente mutagen izante, c) contacto de dicha población celular mutagenizada con una cantidad efectiva de herbicida derivado de cumarona, identificado en a), d) selección de al menos una célula que sobrevive a estas condiciones de ensayo, e) amplificación por PCR y secuenciación de genes de HPPD y/o HST de células seleccionadas en d) y comparación con tales secuencias con secuencias génicas de HPPD de tipo silvestre o HST, respectivamente.

En una forma de realización preferida, dicho agente mutagenizante es etilmetansulfonato (EMS).

Muchos métodos bien conocidos por el experto en el arte se encuentra disponibles para obtener ácidos nucleicos candidatos adecuados para identificar una secuencia de nucleótidos que codifica una mut-HPPD de una variedad de diferentes organismos fuente potenciales incluyendo microbios, plantas, hongos, algas, cultivos mixtos, etc., así como también fuentes ambientales de ADN tal como el suelo. Estos métodos incluyen, entre otros, la preparación de bibliotecas de cADN o ADN genómico, el uso de cebadores oligonucleótidos degenerados adecuadamente, el uso de sondas basadas en secuencias o ensayos de complementación adecuados (por ejemplo, para cultivo sobre tirosina) así como también el uso de mutagénesis y transposición para proveer secuencias que codifican mut-HPPD recombinado o transpuesto.

Los ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican HPPD control y candidato pueden ser expresados en levadura, en una cepa huésped bacteriana, en un alga o en una planta superior al como tabaco o Arabidopsis y los niveles relativos de tolerancia inherente de las secuencias codificadoras de HPPD rastreadas de acuerdo con un fenotipo indicador visible de la cepa o planta transformada en presencia de diferentes concentraciones del herbicida derivado de cumarona seleccionado. Las respuestas a las dosis y las desviaciones relativas en las respuestas a las dosis asociadas con estos fenotipos indicadores (formación del color marrón, inhibición del crecimiento, efecto herbicida, etc.) son expresadas convenientemente en términos, por ejemplo, de valores GR50 (concentración para 50% de reducción de crecimiento) o MIC (concentración inhibidora mínima) en donde los aumentos de los valores corresponden a los aumentos de la tolerancia inherente de la HPPD expresada. Por ejemplo, en un sistema de ensayo relativamente rápido basado en la transformación de una bacteria tal como E. coli, cada secuencia que codifica la mut-HPPD puede ser expresada, por ejemplo, como una secuencia de ADN bajo el control de expresión de un promotor controlable tal como el promotor lacZ y teniendo en cuenta adecuadamente, por ejemplo por el uso de ADN sintético, temas tales como el uso del codón para obtener un nivel de expresión lo más comparable posible de diferentes secuencias de HPPD. Tales cepas que expresan ácidos nucleicos que comprenden secuencias de HPPD candidatos alternativas pueden ser colocadas en placas a diferentes concentraciones del herbicida derivado de cumarona seleccionado en, opcionalmente, un medio suplementado con tirosina y se calculan los niveles relativos de tolerancia inherente de las enzimas HPPD expresadas en base a la medida y la MIC para la inhibición de la formación del pigmento ocronótico marrón.

En otra forma de realización, los ácidos nucleicos candidatos son transformados en material de planta para generar una planta transgénica, regenerados en plantas fértiles morfológicamente normales que luego son medidas en cuanto a la tolerancia diferencial con relación a herbicidas derivados de cumarona seleccionados. Muchos métodos adecuados para la transformación usando marcadores de selección adecuados tales como kanamicina, vectores binarios tales como de Agrobacterium y regeneración de plantas como, por ejemplo, de discos de hojas de tabaco son bien conocidos en el arte. Opcionalmente, una población control de plantas también es transformada con un ácido nucleico que expresa la HPPD control. Alternativamente, se puede usar una planta dicotiledónea no transformada tal como Arabidopsis o tabaco como control ya que ésta, en todo caso, expresa su propia HPPD endógena. El promedio y la distribución de los niveles de tolerancia a herbicidas de un rango de eventos de transformación de plantas primarias o su progenie a derivados de cumarona seleccionados de la Tabla 2 son evaluados de la manera normal en base a daño de plantas, síntomas de blanqueo meristemático, etc., a un rango de diferentes concentraciones de herbicidas. Estos datos pueden ser expresados en términos de, por ejemplo, valores GR50 derivados de curvas de dosis/respuesta que tienen "dosis" representada gráficamente en el eje x y "eliminación en porcentaje", "efecto herbicida", "número de plantas verdes que emergen", etc., representado gráficamente en el eje y, en donde los valores de GR50 aumentados corresponden a niveles aumentados de tolerancia inherente de la HPPD expresada. Los herbicidas pueden ser aplicados adecuadamente preemergencia o posemergencia.

Otro objeto se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica una mut-HPPD como se definió en detalle más arriba. Con preferencia, el ácido nucleico se puede identificar por un método como se definió más arriba.

En otra forma de realización, la invención se refiere a una célula de planta transformada por un ácido nucleico de tipo silvestre o de mut-HPPD o una célula de planta que ha sido mutada para obtener una planta que exprese un ácido nucleico de tipo silvestre o de una mut-HPPD, en donde la expresión del ácido nucleico en la célula de planta da por resultado una mayor resistencia o tolerancia a un herbicida, preferentemente un herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la célula de planta.

El término "expresión/que expresa" o "expresión génica" significa la transcripción de un gen específico o genes específicos o un constructo genético específico. El término "expresión" o "expresión génica" en particular significa la transcripción de un gen o genes o un constructo genético en ARN estructural (rARN, tARN) o mARN con o sin traducción subsiguiente de este último en una proteína. El proceso incluye la transcripción de ADN y el procesamiento del producto de mARN resultante.

Para obtener el efecto deseado, es decir, plantas que son tolerantes o resistentes al herbicida derivado de cumarona de la presente invención, se comprenderá que el por lo menos un ácido nucleico es "sobre-expresado" por los métodos y medios conocidos por el experto en el arte.

La expresión "mayor expresión" o "sobreexpresion" como se usa en la presente significa cualquier forma de expresión que es adicional al nivel de expresión de tipo silvestre original. Los métodos para aumentar la expresión de genes o productos génicos están bien documentados en el arte e incluyen, por ejemplo, sobreexpresion dirigida por promotores apropiados, el uso de intensificadores de transcripción o intensificadores de traducción. Los ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o intensificadores pueden ser introducidos en una posición apropiada (típicamente corriente arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido de modo de regular hacia arriba la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos pueden ser alterados in vivo por mutación, deleción y/o sustitución (ver, Kmiec, US 5.565.350; Zarling et al., documento WO 9322443), o promotores aislados pueden ser introducidos en una célula de planta en la orientación y distancia apropiadas del gen de la presente invención de modo de controlar la expresión del gen.

Si se desea la expresión del polipéptido, en general es conveniente incluir una región de poliadeniladción en el extremo 3' de una región codificadora de polinucleótidos. La región de poliadenilación puede derivarse del gen natural, de una variedad de otros genes de plantas, o de T-ADN. La secuencia del extremo 3' a ser agregada puede derivarse, por ejemplo, de los genes de la nopalina sintasa o la octopina sintasa, o alternativamente de otro gen de planta, o menos preferentemente de cualquier otro gen eucariótico.

También se puede agregar una secuencia de un intrón a la región no traducida (UTR) 5' o la secuencia codificadora de la secuencia codificadora parcial para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón que se puede cortar y empalmar en la unidad de transcripción en constructos de expresión de plantas y animales ha demostrado aumentar la expresión génica tanto en los niveles de mARN como de proteínas hasta 1000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1 :1183-1200). Este aumento por el intrón de la expresión génica es típicamente mucho mayor cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de los intrones del maíz Adh1-S intrón 1 , 2, y 6, el intrón Bronze-1 con conocidos en el arte. Para información general ver: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994) El término "introducción" o "transformación" como se usan en la presente comprende la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del método usado para la transferencia. El tejido de planta capaz de propagación clonal subsiguiente, ya sea por organogénesis o embriogénesis, puede ser transformado con un constructo genético de la presente invención y una planta entera se puede regenerar de allí. El tejido particular elegido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles para, y más adecuados para, la especie particular que se está transformando. Objetivos de tejido ilustrativos incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, megagametofitos, tejido de callos, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, brotes axilares y meristemas radiculares), y tejido de meristema inducido (por ejemplo, meristema de cotiledón y meristema de hipocótilo). El polinucleótido puede ser introducido en forma transitoria o estable en una célula huésped y puede ser mantenido no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede ser integrado en el genoma del huésped. La célula de planta transformada resultante puede ser usada luego para regenerar una planta transformada de una manera conocida por los expertos en el arte.

La transferencia de genes extraños en el genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de especies de plantas es ahora una técnica bastante rutinaria. Ventajosamente se puede usar cualquiera de varios métodos de transformación para introducir el gen de interés en una célula de un ancestro adecuada. Los métodos descritos para la transformación y la regeneración de plantas a partir de tejidos de plantas o células de plantas pueden ser utilizados para la transformación transitoria o estable. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación usando virus o polen y microproyección. Los métodos pueden ser seleccionados entre el método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1 102); microinyección en material de plantas (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo con partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrativos) y similares. Las plantas transgénicas, incluyendo las plantas de cultivo transgénicas, se producen preferentemente a través de transformación mediada por Agrobacterium. Un método de transformación ventajoso es la transformación in planta. Para este fin es posible, por ejemplo, permitir que las agrobacterias actúen en semillas de plantas o inocular el meristema de planta con agrobacterias. Ha probado ser particularmente conveniente de acuerdo con la invención permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe sobre la planta intacta o por lo menos sobre los primordios de las flores. La planta se cultiva subsiguientemente hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los métodos para la transformación mediada por Agrobacterium de arroz incluyen métodos bien conocidos para la transformación del arroz, tales como los descritos en cualquiera de las siguientes: solicitud de patente europea EP 1198985 A1 , Aldemita y Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en la presente como si se presentaran en forma completa. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como se describe en Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o Frame et al. (Plant Physiol 129(1 ): 13-22, 2002), cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en la presente como si se presentaran en forma completa. Dichos métodos se describen además a modo de ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991 ) 205-225). Los ácidos nucleicos o el constructo a ser expresado son clonados preferentemente en un vector, que es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan et al., Nucí. Acids Res. 12 (1984) 8711 ). Las agrobacterias transformadas por un vector como éste pueden ser usadas luego de manera conocida para la transformación de plantas, tal como plantas usadas como un modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana que se encuentra dentro del alcance de la presente invención no es considerada una planta de cultivo), o plantas de cultivo tales como, a modo de ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo sumergiendo hojas dañadas u hojas cortadas en una solución de agrobacterias y cultivándolas luego en un medio adecuado. La transformación de plantas por medio de Agrobacterium tumefaciens se describe, por ejemplo, por Hófgen y Willmitzer en Nucí. Acid Res. (1988) 16, 9877 o es conocida, entre otros de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, págs. 15-38.

Además de la transformación de células somáticas, las que luego tienen que ser regeneradas a plantas intactas, también es posible transformar las células de meristemas de plantas y en particular aquellas células que se desarrollan a gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando lugar a plantas transgénicas. Así, por ejemplo, las semillas de Arabidopsis son tratadas con agrobacterias y se obtienen semillas de las plantas en desarrollo de las cuales una cierta proporción es transformada y por lo tanto transgénica [Feldman, KA y Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chua y J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274-289]. Los métodos alternativos se basan en la remoción repetida de las inflorescencias e incubación del sitio de excisión en el centro de la roseta con agrobacterias transformadas, por lo que se pueden obtener de igual modo semillas transformadas en un tiempo posterior (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Sin embargo, un método especialmente efectivo es el método de infiltración en vacío con sus modificaciones tales como el método de la "inmersión floral". En el caso de la infiltración en vacío de Arabidopsis, las planas intactas bajo presión reducida son tratadas con una suspensión de agrobacterias [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1 194-1 199], mientras que en el caso del método de "inmersión floral" tel tejido floral en desarrollo se incuba brevemente con una suspensión de agrobacterias tratada con tensioactivo [Clough, SJ y Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. Una cierta proporción de semillas transgénicas es cosechada en ambos casos, y estas semillas pueden ser distinguidas de las semillas no transgénicas cultivando bajo las condiciones selectivas arriba descriptas. Además, la transformación estable de plástidos es ventajosa porque los plástidos son heredados por vía materna en la mayoría de los cultivos reduciendo o eliminando el riesgo de flujo de transgenes a través del polen. La transformación del genoma del cloroplasto se logra en general por un proceso que ha sido presentado esquemáticamente en Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. En resumen, las secuencias a ser transformadas son clonadas juntas con un gen marcador seleccionable entre secuencias flanqueadoras homologas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias flanqueadoras homologas dirigen la integración específica del sitio en el plastoma. La transformación plastidal ha sido descrípta para muchas especies de plantas diferentes y se da un panorama en Bock (2001 ) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21 ; 312 (3):425-38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21 , 20-28. Se ha informado recientemente un progreso biotecnológíco adicional en forma de transformantes de plástidos libres de marcadores, que pueden ser producidos por un gen marcador co-integrado transitorio (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229). Las células de plantas modificadas genéticamente pueden ser regeneradas a través de todos los métodos con los cuales está familiarizado el experto. Los métodos adecuados se pueden hallar en las publicaciones arriba mencionadas de S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o Hófgen y Willmitzer.

En general después de la transformación, las células de plantas o agrupaciones de células son seleccionadas con respecto a la presencia de uno o más marcadores que son codificados por genes que se expresan en plantas co-transferidos con el gen de interés, después de lo cual el material transformado es regenerado a una planta completa. Para seleccionar plantas transformadas, el material de planta obtenido en la transformación es, en general, sometido a condiciones selectivas de modo que las plantas transformadas pueden ser distinguidas de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas de la manera arriba descripta pueden ser plantadas y, después de un período de crecimiento inicial, sometidas a una selección adecuada por rociado. Otra posibilidad consiste en cultivar las semillas, si fuera apropiado después de la esterilización, en placas de agar usando un agente de selección adecuado de modo de que sólo las semillas transformadas puedan crecer a plantas. Alternativamente, las plantas transformadas son rastreadas con respecto a la presencia de un marcador seleccionable tal como los descritos más arriba.

Después de la transferencia de ADN y la regeneración, las plantas transformadas putativamente también pueden ser evaluadas, por ejemplo, usando el análisis Southern, con respecto a la presencia del gen de interés, el número de copias y/o la organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN recién introducido pueden ser monitoreados usando análisis Northern y/o Western, siendo ambas técnicas bien conocidas por los expertos en el arte.

Las plantas transformadas generadas pueden ser propagadas por una variedad de medios, tal como por propagación clonal o técnicas de cultivo clásicas. Por ejemplo, una planta transformada de primera generación (o T1 ) puede ser autocruzada y se seleccionan transformantes de segunda generación homocigotas (o T2), y las plantas T2 pueden ser propagadas luego adicionalmente a través de técnicas de cultivo clásicas. Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clónales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el cásete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado en un vástago no transformado).

Con preferencia, el ácido nucleico de tipo silvestre o de mut-HPPD (a) o el ácido nucleico de tipo silvestre o de mut-HST (b) comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en: a) un polinucleótido como se muestra en la SEQ ID NO: 1 , 51 , 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, o 52, o una variante o derivado de ésta; b) un polinucleótido como se muestra en la SEQ ID NO: 47 ó 49, o una variante o un derivado de ésta; c) un polinucleótido que codifica un polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11 , 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, o una variante o derivado de ésta; d) un polinucleótido que comprende por lo menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de a) a c); y e) un polinucleótido complementario al polinucleótido de cualquiera de a) a d).

Con preferencia, la expresión del ácido nucleico en la planta da por resultado la resistencia aumentada de la planta a un herbicida, preferentemente un herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta.

En otra forma de realización, la invención se refiere a una planta, preferentemente una planta transgénica, que comprende una célula de planta de acuerdo con la presente invención, en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da por resultado la mayor resistencia de la planta a un herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta.

Las plantas descriptas en la presente pueden ser o bien plantas de cultivo transgénicas o plantas no transgénicas.

Para los propósitos de la invención, "transgénica", "transgén" o "recombinante" significa con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos, un cásete de expresión, constructo de gen o un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos o un organismo transformado con las secuencias de ácidos nucleicos, casetes de expresión o vectores de acuerdo con la invención, todas estas construcciones producidas por métodos recombinantes en los cuales o bien: (a) las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas útiles en los métodos de la invención, o (b) la o las secuencias de control genético que son unidas operativamente con la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, por ejemplo, un promotor, o (c) a) y b) no están ubicadas en su ambiente genético natural o han sido modificadas por métodos recombinantes, siendo posible que la modificación tome la forma de, por ejemplo, una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótidos. El ambiente genético natural se entiende como el locus genómico o cromosómico natural en la planta original o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácidos nucleicos es retenida preferentemente, por lo menos en parte. El medio circundante flanquea a la secuencia de ácidos nucleicos por lo menos en un lado y tiene una longitud de secuencias de por lo menos 50 bp, preferentemente por lo menos 500 bp, especialmente preferentemente por lo menos 1000 bp, más preferentemente aún por lo menos 5000 bp. Un cásete de expresión que existe naturalmente - por ejemplo, la combinación que existe naturalmente del promotor natural de las secuencias de ácidos nucleicos con la secuencia de ácidos nucleicos correspondiente que codifica un polipéptido útil en los métodos de la presente invención, como se define más arriba - se torna un cásete de expresión transgénico cuando este cásete de expresión es modificado por métodos no naturales, sintéticos ("artificiales") tales como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Métodos adecuados se describen, por ejemplo, en el documento US 5.565.350 o el documento WO 00/15815.

Una planta transgénica para los propósitos de la invención se entiende por lo tanto como significando, como se indicó más arriba, que los ácidos nucleicos usados en el método de la invención no se encuentran en su locus natural en el genoma de dicha planta, siendo posible que los ácidos nucleicos sean expresados en forma homologa o heteróloga. Sin embargo, como se mencionó, transgénico también significa que, si bien los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o usados en el método de la invención se encuentran en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia ha sido modificada con respecto a la secuencia natural, y/o que las secuencias reguladores de las secuencias naturales han sido modificadas. Transgénico se entiende preferentemente como significando la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en un locus no natural en el genoma, es decir, en donde tiene lugar la expresión homologa o, preferentemente, heteróloga de los ácidos nucleicos. Las plantas transgénicas preferidas se mencionan en la presente. Además, el término "transgénico" se refiere a cualquier planta, célula de planta, callo, tejido de planta, o parte de planta, que contiene todo o parte de por lo menos un polinucleótido recombinante. En muchos casos, todo o parte del polinucleótido recombinante es integrado en forma estable en un cromosoma o elemento extra-cromosómico estable, de modo que se pasa a generaciones sucesivas. Para los propósitos de la invención, el término "polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que ha sido alterado, reordenado o modificado por ingeniería genética. Ejemplos incluyen cualquier polinucleótido o polinucleótidos clonados, que son unidos o ligados a secuencias heterólogas. El término "recombinante" no se refiere a alteraciones de polinucleótidos que resultan de eventos que ocurren naturalmente, tales como mutaciones espontáneas, o de mutagénesis no espontánea seguido por cultivo selectivo.

Las plantas que contienen mutaciones que se producen debido a mutagénesis no espontánea y cultivo selectivo son indicadas en la presente como plantas no transgénicas y están incluidas en la presente invención. En formas de realización en donde la planta es transgénica y comprende múltiples ácidos nucleicos de mut-HPPD, los ácidos nucleicos pueden derivarse de diferentes genomas o del mismo genoma. Alternativamente, en formas de realización en donde la planta es no transgénica y comprende múltiples ácidos nucleicos de mut-HPPD, los ácidos nucleicos están ubicados en diferentes genomas o en el mismo genoma.

En algunas formas de realización, la presente invención comprende plantas resistentes a herbicidas que son producidas por cultivo por mutación. Tales plantas comprenden un polinucleótido que codifica un mut-HPPD y/o un mut-HST y son tolerantes a uno o más "herbicidas derivados de cumaronas". Tales métodos pueden comprender, por ejemplo, exponer las plantas o semillas a un mutágeno, particularmente un mutágeno químico tal como, por ejemplo, metansulfonato de etilo (EMS) y seleccionar plantas que tienen mayor tolerancia a por lo menos uno o más herbicidas derivados de cumarona.

Sin embargo, la presente invención no está limitada a plantas tolerantes a herbicidas que son producidas por un método de mutagénesis que comprende el mutágeno químico EMS. Se puede usar cualquier método de mutagénesis conocido en el arte para producir las plantas resistentes a herbicidas de la presente invención. Tales métodos de mutagénesis pueden comprender, por ejemplo, el uso de uno cualquiera de los siguientes mutágenos: radiación, tal como rayos X, rayos gamma (por ejemplo, cobalto 60 o cesio 137), neutrones, (por ejemplo, producto de fisión nuclear por uranio 235 en un reactor atómico), radiación beta (por ejemplo, emitida de radioisótopos tales como fósforo 32 o carbono 14), y radicación ultravioleta (preferentemente de 250 a 290 nm), y mutágenos químicos tales como análogos de bases (por ejemplo, 5-bromo-uracilo), compuestos relacionados (por ejemplo, 8-etoxi cafeína), antibióticos (por ejemplo, estreptonigrina), agentes alquilantes (por ejemplo, mostazas de azufre, mostrazas nitrogenadas, epóxidos, etilenaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso o acridinas. Las plantas resistentes a herbicidas también pueden ser producidas usando métodos de cultivo de tejidos para seleccionar células de plantas que comprenden mutaciones de la resistencia a herbicidas y luego regenerando plantas resistentes a herbicidas a partir de allí. Ver, por ejemplo, la patente U.S. Nos. 5.773.702 y 5.859.348, ambas incorporadas a la presente en su totalidad por referencia. Otros detalles del cultivo por mutación se pueden encontrar en "Principáis of Cultivar Development" Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company, cuya divulgación se incorpora a la presente por referencia.

Además de la definición dada más arriba, el término "planta" pretende abarcar plantas de cultivo en cualquier etapa de madurez o desarrollo, así como también cualesquiera tejidos u órganos (partes de plantas) tomadas o derivadas de cualquiera de tales plantas a menos que se indique claramente de otro modo por el contexto. Las partes de plantas incluyen, pero no están limitadas a, tallos, raíces, flores, óvulos, estámenes, hojas, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callos, cultivos de anteras, gametofitos, esporofitos, polen, microesporas, protoplastos, y similares.

La planta de la presente invención comprende por lo menos un ácido nucleico de mut-HPPD o un ácido nucleico de HPPD de tipo silvestre sobreexpresada, y tiene una mayor tolerancia a un herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. Es posible que las plantas de la presente invención tengan múltiples ácidos nucleicos de tipo silvestre o de mut-HPPD de diferentes genomas ya que estas plantas pueden contener más de un genoma. Por ejemplo, una planta contiene dos genomas, usualmente denominados genomas A y B. Como la HPPD es una enzima metabólica requerida, se supone que cada genoma tiene por lo menos un gen que codifica para la enzima HPPD (es decir, por lo menos un gen de HPPD). Como se usa en la presente, el término "locus del gen HPPD" se refiere a la posición de un gen de HPPD en un genoma, y los términos "gen de HPPD" y "ácido nucleico de HPPD" se refieren a un ácido nucleico que codifica la enzima HPPD. El ácido nucleico de HPPD en cada genoma difiere en su secuencia de nucleotidos de un ácido nucleico de HPPD en otro genoma. Un experto en el arte puede determinar el genoma de origen de cada ácido nucleico de HPPD a través de cruzamiento genético y/o métodos de secuenciación o métodos de digestión de exonucleasa conocidos por los expertos en el arte.

La presente invención incluye plantas que comprenden uno, dos, tres o más alelos de mut-HPPD, en donde la planta tiene mayor tolerancia a un herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. Los alelos de mut-HPPD pueden comprender una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo que consiste en un polinucleótido como se define en la SEQ ID NO: 1 , 51 , 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 52, o una variante o un derivado de estos, un polinucleótido que codifica un polipéptido como se definió en la SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, o una variante o un derivado, homólogo, ortólogo, parálogo de éste, un polinucleótido que comprende por lo menos 60 nucleotidos consecutivos de cualquiera de los polinucleótidos arriba mencionados; y un polinucleótido complementario a cualquiera de los polinucleótidos arriba mencionados.

"Alelos" o "variantes alélicas" son formas alternativas de un gen dado, ubicados en la misma posición cromosómica. Las variantes alélicas comprenden Polimorfismos de Nucleotidos Únicos (SNPs), así como también Polimorfismos de inserción/deleción pequeños (INDELs). El tamaño de los INDELs es usualmente menor de 100 bp. Los SNPs y INDELs forman el conjunto más grande de variantes de secuencias en cepas polimórficas que existen naturalmente de la mayoría de los organismos.

El término "variedad" se refiere a un grupo de plantas dentro de una especie definida porque comparten un conjunto común de características o rasgos aceptados por los expertos en el arte como suficientes para distinguir un cultivar o una variedad de otro cultivar o variedad. No hay una implicancia en cualquiera de los términos con respecto a que todas las plantas de cualquier cultivar o variedad dados será genéticamente idéntica a o bien el gen entero o el nivel molecular o que cualquier planta dada será homocigota en todos los loci. Un cultivar o variedad es considerado "cultivo verdadero" para un rasgo particular si, cuando el cultivar o variedad de cultivo verdadero es autopolinizado, toda la progenie contiene el rasgo. Los términos "línea de cultivo" o "línea" se refiere a un grupo de plantas dentro de un cultivar definido porque comparten un conjunto común de características o rasgos aceptados por los expertos en el arte como suficientes para distinguir una línea de cultivo o línea de otra línea de cultivo o línea. No hay una implicancia en cualquier término de que todas las plantas de cualquier línea de cultivo o línea será genéticamente idéntica en o bien el gen entero o el nivel molecular o que cualquier planta dada será homocigota en todos los loci. Una línea de cultivo o línea es considerada "cultivo verdadero" para un rasgo particular si, cuando la línea de cultivo verdadero o línea de cultivo es auto-polinizada, toda la progenie contiene el rasgo. En la presente invención, el rasgo proviene de una mutación en un gen de HPPD de la planta o semilla.

Las plantas resistentes a herbicidas de la invención que comprenden polinucleótidos que codifican polipéptidos de mut-HPPD y/o mut-HST también se pueden usar en métodos para aumentar la resistencia a herbicidas de una planta a través de cultivo de plantas convencional que comprende la reproducción sexual. Los métodos comprenden el cruzamiento de una primera planta que es una planta resistente a herbicidas de la invención con una segunda planta que puede o no ser resistente al mismo herbicida o herbicidas como la primera planta o puede ser resistente a un herbicida o a herbicidas diferentes que la primera planta. La segunda planta puede ser cualquier planta que es capaz de producir plantas de progenie viables (es decir, semillas) cuando se cruza con la primera planta. Típicamente, pero no necesariamente, la primera y la segunda plantas son de la misma especie. Los métodos pueden comprender opcionalmente seleccionar plantas de la progenie que comprenden los polipéptidos de mut-HPPD y/o mut-HST de la primera planta y las características de resistencia a herbicidas de la segunda planta. Las plantas de la progenie producidas por este método de la presente invención tienen mayor resistencia a un herbicida cuando se comparan con o bien la primera o la segunda planta o ambas. Cuando la primera y la segunda plantas son resistentes a diferentes herbicidas, las plantas de la progenie tendrán las características de tolerancia a herbicidas combinadas de la primera y la segunda plantas. Los métodos de la invención pueden comprender además una o más generaciones de retrocruzamiento de las plantas de la progenie del primer cruzamiento a una planta de la misma línea o genotipo que o bien la primera o la segunda planta. Alternativamente, la progenie del primer cruzamiento o cualquier cruzamiento subsiguiente puede ser cruzada con una tercera planta que es de una línea o genotipo diferente que la primera o la segunda planta. La presente invención también provee plantas, órganos de plantas, tejidos de plantas, células de plantas, semillas, y células huésped no humanas que son transformadas con la por lo menos una molécula de polinucleótido, cásete de expresión o vector de transformación de la invención. Tales plantas transformadas, órganos de plantas, tejidos de plantas, células de plantas, semillas y células huésped no humanas transformados tienen una mayor tolerancia o resistencia a por lo menos un herbicida, a niveles del herbicida que matan o inhiben el crecimiento de una planta no transformada, tejido de planta, célula de planta, o célula huésped no humana, no transformados, respectivamente. Con preferencia, las plantas transformadas, tejidos de plantas, células de plantas, y semillas de la invención son Arabidopsis thaliana y plantas de cultivo.

Debe entenderse que la planta de la presente invención puede comprender un ácido nucleico de HPPD de tipo silvestre además de un ácido nucleico de una -mut-HPPD. Se considera que las líneas tolerantes al herbicida derivado de cumarona pueden contener una mutación en sólo una de las múltiples isoenzimas HPPD. Por lo tanto, la presente invención incluye una planta que comprende uno o más ácidos nucleicos de mut-HPPD además de uno o más ácidos nucleicos de HPPD de tipo silvestre.

En otra forma de realización, la invención se refiere a una semilla producida por una planta transgénica que comprende una célula de planta de la presente invención, en donde la semilla es de cultivo verdadero para una mayor resistencia a un herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la semilla.

En otra forma de realización, la invención se refiere a un método para producir una célula de planta transgénica con mayor resistencia a un herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la célula de planta que comprende transformar la célula de planta con un cásete de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una de tipo silvestre o una mut-HPPD como se definió más arriba.

En otra forma de realización, la invención se refiere a un método para producir una planta transgénica que comprende, (a) transformar una célula de planta con un cásete de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una de tipo silvestre o una mut-HPPD, y (b) generar una planta con una mayor resistencia a un herbicida derivado de cumarona de la célula de planta.

En consecuencia, los ácidos nucleicos de mut-HPPD de la invención se proveen en casetes de expresión para la expresión en la planta de interés. El cásete incluirá secuencias reguladoras unidas operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos de una mut-HPPD de la invención. El término "elemento regulador" como se usa en la presente se refiere a un polinucleótido que es capaz de regular la transcripción de un polinucleótido unido operativamente. Incluye, pero no está limitado a, promotores, ¡ntensificadores, ¡ntrones, 5' UTRs y 3' UTRs. Por "unido operativamente" se entiende una unión funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia del promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. En general, unido operativamente significa que las secuencias de ácidos nucleicos que se están uniendo son contiguas y, en donde sea necesario para unir dos regiones codificadoras de proteínas, son contiguas y en el mismo marco de lectura. El cásete puede contener adicionalmente por lo menos un gen adicional para ser cotransformado en el organismo. Alternativamente, el o los genes adicionales pueden ser provistos en múltiples casetes de expresión.

Un cásete de expresión de este tipo se provee con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia de ácidos nucleicos de mut-HPPD sea bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El cásete de expresión puede contener adicionalmente genes marcadores seleccionables.

El cásete de expresión incluirá en la dirección 5'-3' de transcripción, una región de iniciación transcripcional y traduccional (es decir, un promotor), una secuencia de ácidos nucleicos de mut-HPPD de la invención, y una región de terminación transcripcional y traduccional (es decir, región de terminación) funcional en plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo, con respecto al huésped de planta y/o a la secuencia de ácidos nucleicos de la mut-HPPD de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. En donde el promotor es "extraño" o "heterólogo" con respecto al huésped de la planta, se entiende que el promotor no se encuentra en la planta nativa en la cual se introduce el promotor. En donde el promotor es "extraño" o "heterólogo" con respecto a la secuencia de ácidos nucleicos de la mut-HPPD de la invención, se entiende que el promotor no es el promotor nativo o que existe naturalmente para la secuencia de ácidos nucleicos de la mut-HPPD unida operativamente de la invención. Como se usa en la presnete, un gen quimérico comprende una secuencia codificadora unida operativamente a una región de iniciación de transcripción que es heteróloga con respecto a la secuencia codificadora.

Si bien puede ser preferible expresar los ácidos nucleicos de la mut-HPPD de la invención usando promotores heterólogo, se pueden usar secuencias de promotres nativos. Tales constructos cambiarán los niveles de expresión de la proteína de mut-HPPD en la planta o la célula de planta. Así, el fenotipo de la planta o la célula de planta es alterado.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la secuencia de mut-HPPD unida operativamente de interés, puede ser nativa con el huésped de la planta, o puede derivarse de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga con respecto al promotor, la secuencia de ácidos nucleicos de la mut-HPPD de interés, el huésped de la planta, o cualquier combinación de estos). Regiones de terminación convenientes se encuentran disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintasa y la nopalina sintasa. Ver también Guerineau et al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991 ) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991 ) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91 : 151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639. En donde sea apropiado, el o los genes pueden ser optimizados para mayor expresión en la planta transformada. Es decir, los genes pueden ser sintetizados usando codones preferidos de la planta para mejor expresión. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-1 1 para una discusión del uso del codón preferido del huésped. Se encuentran disponibles en el arte métodos para sintetizar genes preferidos de las plantas. Ver, por ejemplo, las patentes U.S. Nos. 5.380.831 y 5.436.391 , y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporadas a la presente por referencia.

Se sabe que las modificaciones de secuencias adicionales aumenta la expresión del gen en un huésped celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitio de corte y empalme exón-intrón, repeticiones tipo transposón y otras secuencias bien caracterizadas de este tipo que pueden ser deletéreas para la expresión del gen. el contenido de G-C de la secuencia puede ser ajustado a niveles promedio para un huésped celular dado, como se calcula por referencia a genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando es posible, la secuencia es modificada para evitar estructuras de mARN secundarias de horquilla predichas. Las secuencias de nucleótidos para aumentar la expresión del gen también se pueden usar en los vectores de expresión de plantas. Estos incluyen los intrones del maíz Adhl, gen intrónl (Callis et al. Genes and Development 1 : 1183-1200, 1987), y secuencias conductoras, (secuencia W) del virus del mosaico del tabaco (TMV), virus de la mancha clorótica del maíz y virus del mosaico de la alfalfa (Gallie et al. Nucleic Acids Res. 15:8693-8711 , 1987 y Skuzeski et al. Plant Mol. Biol. 15:65-79, 1990). Se ha demostrado que el primer intrón del locus 1 encogido del maíz aumenta la expresión de genes en constructos de genes quiméricos. Las patentes U.S. Nos. 5.424.412 y 5.593.874 divulgan el uso de intrones específicos en los constructos de expresión de genes, y Gallie et al. (Plant Physiol. 106:929-939, 1994) también han mostrado que los intrones son útiles para regular la expresión génica en una base específica del tejido. Para aumentar más o para optimizar la expresión del gen de la mut-HPPD, los vectores de expresión de plantas de la invención también pueden contener secuencias den ADN que contienen regiones de unión a la matriz (MARs). Las células de plantas transformadas con tales sistemas de expresión modificados pueden presentar entonces sobreexpresión o expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos de la invención.

Los casetes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias conductoras 5' en el cásete del constructo de expresión. Tales secuencias conductoras pueden actuar para aumentar la traducción. Los conductores de traducción son conocidos en el arte e incluyen: conductores picornavirus, por ejemplo, conductor EMCV (región no codificadora 5' de encefalomiocarditis) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nati. Acad. ScL USA 86:6126-6130); conductores potyvirus, por ejemplo, conductor TEV (virus grabado del tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), conductor MDMV (virus del mosaico enano del maíz) (Virology 154:9-20) y proteína ligadora del cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991 ) Nature 353:90-94); conductor no traducido del mARN de la proteína de recubrimiento del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); conductor del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nueva York), pp. 237-256); y conductor del virus de la mancha clorótica del maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81 :382-385). Ver también, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. También se pueden usar otros métodos conocidos para aumentar la traducción, por ejemplo, intrones, y similares.

En la preparación del cásete de expresión se pueden manipular los diversos fragmentos de ADN de modo de proveer las secuencias de ADN en la orientación adecuada y, según sea apropiado, en el marco de lectura adecuado. Para este fin, se pueden emplear los adaptadores o ligadores para unir los fragmentos de ADN o pueden usarse otras manipulaciones para proveer sitios de restricción convenientes, remoción de ADN superfluo, remoción de sitios de restricción, o similares. Para este propósito se pueden usar mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción, reasociación, resustituciones, por ejemplo, transiciones y trans versiones.

Se pueden usar una cantidad de promotores en la práctica de la invención. Los promotores pueden ser seleccionados en base al resultado deseado. Los ácidos nucleicos pueden ser combinados con promotores constitutivos, preferidos de tejidos, u otros promotores para la expresión en plantas. Tales promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor del núcleo del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos divulgados en la WO 99/43838 y la patente U. S. N.° 6.072.050; el promotor núcleo de CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina del arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991 ) Theor. Appl. Genet. 81:581- 588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (patente U. S. N.° 5.659.026), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, las patentes U.S. Nos. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121 ; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; y 6.177.611.

Los promotores preferidos de los tejidos pueden ser utilizados para ser direccionados a la expresión aumentada de la mut-HPPD dentro de un tejido de planta particular. Tales promotores preferidos de los tejidos incluyen, pero no están limitados a, promotores preferidos de las hojas, promotores preferidos de las raíces, promotores preferidos de las semillas, y promotores preferidos de los tallos. Los promotores preferidos de los tejidos incluyen Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341 ; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka. (1993) Proc Nati. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; y Guevara-García et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505.

Tales promotores pueden ser modificados, si es necesario, para una expresión débil. En una forma de realización, los ácidos nucleicos de interés son direccionados al cloroplasto para la expresión. De esta manera, en donde el ácido nucleico de interés no está insertado directamente en el cloroplasto, el cásete de expresión contendrá adicionalmente una secuencia direccionada al cloroplasto que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito de cloroplasto para dirigir el producto del gen de interés a los cloroplastos. Tales péptidos de tránsito son conocidos en el arte. Con respecto a las secuencias direccionadas a cloroplastos, "unidos operativamente" significa que la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido de tránsito (es decir, la secuencia direccionada al cloroplasto) está unida al ácido nucleico de la mut-HPPD de la invención de tal modo que las dos secuencias son contiguas y están en el mismo marco de lectura. Ver, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991 ) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421 ; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Cualquier péptido de tránsido de cloroplasto conocido en el arte puede ser fusionado a la secuencia de aminoácidos de una proteína mut-HPPD madura de la invención uniendo operativamente una secuencia direccionada al cloroplasto al extremo 5' de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína mut-HPPD madura de la invención. Las secuencias direccionadas a cloroplastos con conocidas en el arte e incluyen la subunidad pequeña del cloroplasto de la ribulosa-l,5-bisfosfato carboxilasa (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell et al. (1991 ) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); la 5-(enolpiruvil)shikimatp-3-fosfato sintasa (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); la triptófano sintasa (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11 ):6081 -6087); la plastocianina (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363); la corismato sintasa (Schmidt et al. (1993) J. Blol. Chem. 268(36):27447-27457); y la proteína ligadora a/b de la clorofila cosechadora de la luza (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14996-14999). Ver también Von Heljne et al. (1991 ) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104- 126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421 ; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

Los métodos para la transformación de cloroplastos son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Nati. Acad. ScL USA 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en el suministro por pistola de partículas de DNA que contiene un marcador seleccionare y direccionamiento del ADN al genoma del plástido a través de la recombinación homologa. Adicionalmente, la transformación de plástidos puede lograrse por transactivación de un transgén trasportado por plástido silente por la expresión preferida del tejido de una ARN polimerasa codificada nuclearmente y dirigida por plástidos. Un sistema como éste ha sido informado en McBride et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :7301-7305. Los ácidos nucleicos de interés a ser direccionados al cloroplasto pueden ser optimizados para la expresión en el cloroplasto para dar cuenta de las diferencias en el uso del codón entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De esta manera, los ácidos nucleicos de interés pueden ser sintetizados usando codores preferidos de los cloroplastos. Ver, por ejemplo, la patente U. S. N.° 5.380.831, incorporada a la presente por referencia.

En una forma de realización preferida, el ácido nucleico de la mut-HPPD (a) o el ácido nucleico de la mut-HST (b) comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en: a) un polinucleótido como se muestra en la SEQ ID NO: 1 , 51 , 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, o 52, o una variante o un derivado de éste; b) un polinucleótido como se muestra en la SEQ ID NO: 47 ó 49, o una variante o un derivado de éste; c) un polinucleótido que codifica un polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11 , 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, o una variante o un derivado de éste; d) un polinucleótido que comprende por lo menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de a) a c); y e) un polinucleótido complementario al polinucleótido de cualquiera de a) a d).

Con preferencia, el cásete de expresión comprende además una región reguladora de la iniciación de transcripción y una región reguladora de la iniciación de traducción que son funcionales en la planta.

Si bien los polinucleótidos de la invención se usan como genes marcadores seleccionabas para la transformación de plantas, los casetes de expresión de la invención pueden incluir otro gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Los genes marcadores seleccionares, incluyendo aquellos de la presente invención, se utilizan para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen, pero no están limitados a, genes que codifican la resistencia a antibióticos, tales como los que codifican la neomicina fosfotransferasa II (NEO) y la higromicina fosfotransferasa (HPT), así como también los genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato amonio, bromoxinilo, imidazolinonas, y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Ver en general, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3 :506-511 ; Christdeers on et al (1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71 :63-72; Reznikdef (1992) Mol Microbiol 6:2419-2422; Barkley et al (1980) en The Operan, pp. 177-220; Hu et al (1987) Cell 48:555-566; Brown et al (1987) Cell 49:603-612; Figge et al (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al (1989) Proc. Natl Acad. AcL USA 86:5400-5404; Fuerst et al (1989) Proc. Nati Acad. ScL USA 86:2549-2553; Deuschle et al (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Tesis, Universidad de Heidelberg; Reines et al (1993) Proc. Nati Acad. ScL USA 90: 1917-1921; Labow et al (1990) Mol Cell Biol 10:3343-3356; Zambretti et al (1992) Proc. Nati Acad. ScL USA 89:3952-3956; Baim et al (1991 ) Proc. Nati Acad. ScL USA 88:5072-5076; Wyborski et al (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hilleny-Wissman (1989) Topics Mol Struc. Biol 10: 143- 162; Degenkolb et al (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591-1595; Kleinschnidt et al (1988) Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Tesis, Universidad de Heidelberg; Gossen et al (1992) Proc. Nati Acad. ScL USA 89:5547- 5551 ; Oliva et al (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gilí et al (1988) Nature 334:721-724. Tales divulgaciones se incorporan a la presente por referencia. La lista indicada más arriba de genes marcadores seleccionares no pretende ser limitativa. Cualquier gen marcador seleccionable se puede usar en la presente invención.

La invención provee además un vector de expresión recombinante aislado que comprende el cásete de expresión que contiene un ácido nucleico de mut-HPPD como se describe más arriba, en donde la expresión del vector en una célula huésped da por resultad una mayor tolerancia a un herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped. Como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleicoe capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido" que se refiere a un lazo de ADN de doble hebra circular en el cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Algunos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) son integrados en el genoma de una célula huésped después de la introducción en la célula huésped, y de este modo son replicados junto con el genoma del huésped. Además, algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están unidos operativamente. Tales vectores son denominados en la presente "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinantes se encuentran frecuentemente en forma de plásmidos. En la presente memoria, "plásmido" y "vector" se pueden usar en forma intercambiable ya que el plásmido es la forma de vector que se usa más comúnmente. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, como los vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que sirven a funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células huésped a ser usadas para la expresión, que están unidas operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos a ser expresada. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en algunas células huésped o bajo ciertas condiciones. El experto en el arte apreciará que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a ser transformada, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden ser introducidos en células huésped para producir de este modo polipéptidos o péptidos, incluyendo polipéptidos o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en la presente (por ejemplo, polipéptidos de mut-HPPD, polipéptidos de fusión, etc.).

En una forma de realización preferida de la presente invención, los polipéptidos de mut-HPPD son expresados en plantas y células de plantas tales como células de plantas unicelulares (tales como las algas) (Ver Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251 y referencias allí mencionadas) y células de planta de plantas superiores (por ejemplo, los espermatofitos, tales como plantas de cultivo). Un polinucleótido de mut-HPPD puede ser "introducido" en una célula de planta por cualquier medio, incluyendo transfección, transformación o transducción, electroporación, bombardeo de partículas, agroinfección, biolística, y similares.

Métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped incluyendo células de plantas se pueden hallar en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2da. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartly y Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Como la mayor tolerancia a herbicidas derivados de cumarona es un rasgo general que se desea heredar en una amplia variedad de plantas tales como maíz, trigo, centeno, avena, trigo triticale, arroz, cebada, soja, maní, algodón, colza y cañóla, mandioca, pimienta, girasol y tagetes, plantas solanáceas como papa, tabaco, berenjena y tomate, Vicia species, arveja, alfalfa, plantas arbustivas (café, cacao, té), Salix species, árboles (palmera aceitera, coco), pastos perennes y cultivos para forraje, estas plantas de cultivo también son plantas objetivo preferidas para un tratamiento con ingeniería genética como otra forma de realización de la presente invención. En una forma de realización preferida, la planta es una planta de cultivo. Los cultivos para forraje incluyen, pero no están limitados a, Wheatgrass, Canarygrass, Bromegrass, Wildrye Grass, Bluegrass, Orchardgrass, Alfalfa, Salfoin, Birdsfoot Trefoil, Alsike Clover, Red Clover, y Sweet Clover.

En una forma de realización de la presente invención, la transfección de un polinucleótido de mut-HPPD en una planta se logra por transferencia de genes mediada por Agrobacterium. Un método de transformación conocido por los expertos en el arte es la inmersión de una planta que florece en una solución de Agrobacteria, en donde la Agrobacteria contiene el ácido nucleico de mut-HPPD, seguido por cultivo de los gametos transformados. La transformación de la planta mediada por Agrobacterium se puede realizar usando, por ejemplo la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101(pMP90) (Koncz y Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396) o LBA4404 (Clontech). La transformación se puede realizar por técnicas de transformación y regeneración estándar (Deblaere et al., 1994, Nucí. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. y Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2da. Ed. - Dordrecht : Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R. y Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Ratón: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por ejemplo, la colza puede ser transformada a través de transformación de cotiledones o hipocótilos (Moloney et al., 1989, Plant Cell Report 8:238-242; De Block et al., 1989, Plant Physiol. 91 :694-701 ). El uso de antibióticos para Agrobacterium y la selección de las plantas depende del vector binario y la cepa de Agrobacterium usada para la transformación. La selección de colza se realiza normalmente usando kanamicina como marcador de plantas seleccionare. La transferencia de genes mediada por Agrobacterium a lino se puede realizar usando, por ejemplo, una técnica descripta por Mlynarova et al., 1994, Plant Cell Report 13:282-285. Adicionalmente, la transformación de la soja se puede realizar usando por ejemplo una técnica descripta en la patente europea No. 0424 047, la patente U. S. N.° 5.322.783, la patente europea No. 0397 687, la patente U. S. N.° 5.376.543 o la patente U. S. N.° 5.169.770. La transformación de maíz se puede realizar por bombardeo de partículas, captación de ADN mediada por polietilenglicol o a través de la técnica de fibra de carburo de silicio. (Ver, por ejemplo, Freeling y Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: Nueva York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Un ejemplo específico de la transformación del maíz se encuentra en la patente U. S. N.° 5.990.387 y un ejemplo específico de la transformación del trigo se puede hallar en la publicación PCT N.° WO 93/07256.

De acuerdo con la presente invención, el polinucleótido de mut-HPPD introducido puede ser mantenido en la célula de planta en forma estable si está incorporado en un replicón autónomo no cromosómico o integrado en los cromosomas de la planta. Alternativamente, el polinucleótido de mut-HPPD introducido puede estar presente en un vector no replicante extra-cromosómico y ser expresado transitoriamente o ser activo transitoriamente. En una forma de realización, se puede crear un microorganismo recombinante homólogo en donde el polinucleótido de mut-HPPD es integrado en un cromosoma, se prepara un vector que contiene por lo menos una porción de un gen de HPPD en el cual se ha introducido una deleción, adición o sustitución para alterar de este modo, por ejemplo, romper funcionalmente, el gen de HPPD endógeno y para crear un gen de mut-HPPD. Para crear una mutación puntual a través de recombinación homologa, se pueden usar híbridos de ADN-ARN en una técnica conocida como quimeraplastia (Cole-Strauss et al., 1999, Nucleic Acids Research 27(5):1323-1330 y Kmiec, 1999, Gene therapy American Scientist 87(3):240-247). Otros procedimientos de recombinación homologa en la especie Triticum también son bien conocidos en el arte y se contemplan para su uso en la presente.

En el vector de recombinación homologa, el gen de mut-HPPD puede estar flanqueado en sus extremos 5' y 3' por una molécula de ácido nucleico adicional del gen de HPPD para permitir que ocurra la recombinación homologa entre el gen de mut-HPPD exógeno llevado por el vector y un gen de HPPD endógeno, en un microorganismo o planta. La molécula de ácido nucleico de HPPD flanqueadora adicional tiene una longitud suficiente para la recombinación homologa exitosa con el gen endógeno. Típicamente, varios cientos de pares de bases hasta kilobases de ADN flanqueador (en ambos extremos 5' y 3') se incluyen en el vector (ver por ejemplo, Thomas, K. R., y Capecchi, M. R., 1987, Cell 51:503 para una descripción de vectores de recombinación homologa o Strepp et al., 1998, PNAS, 95(8):4368-4373 ara recombinación basada en cADN en Physcomitrella patens). Sin embargo, como el gen de mut-HPPD normalmente difiere del gen de HPPD en muy pocos aminoácidos, una secuencia flanqueadora no siempre es necesaria. El vector de recombinación homologa es introducido en un microorganismo o célula de planta (por ejemplo, a través de ADN mediado por polietilenglicol), y se seleccionan células en las cuales el gen de mut-HPPD introducido se ha recombinado en forma homologa con el gen de HPPD endógeno usando técnicas conocidas en el arte.

En otra forma de realización, se pueden producir microorganismos recombinantes que contienen sistemas seleccionados que permiten la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen de mut-HPPD en un vector colocándolo bajo el control del operón lac permite la expresión del gen de mut-HPPD sólo en presencia de IPTG. Tales sistemas reguladores son bien conocidos en el arte.

Otro aspecto de la invención se refiere a células huésped en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan en forma intercambiable en la presente. Se entiende que tales términos se refieren no solamente a la célula objeto particular sino que se aplican también a la progenie o potencial progenie de esta célula.

Como pueden ocurrir algunas modificaciones en generaciones posteriores debido a mutación o influencias ambientales, tal progenie puede de hecho no ser idéntica a la célula parental, pero aún está incluida dentro del alcance del término como se usa en la presente. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un polinucleótido de mut-HPPD puede ser expresado en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insectos, células fúngicas o células de mamíferos (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas, ciliados, células de plantas, hongos u otros microorganismos como C. glutamicum. Otras células huésped adecuadas son conocidas por los expertos en el arte.

Una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariótica o eucariótica en cultivo se puede usar para producir (es decir, expresar) un polinucleótido de mut-HPPD. Por consiguiente, la invención provee además métodos para producir polipéptidos de mut-HPPD usando las células huésped de la invención. En una forma de realización, el método comprende cultivar la célula huésped de la invención (en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido de mut-HPPD o en cuyo genoma se ha introducido un gen que codifica un polipéptido de tipo silvestre o de mut-HPPD) en un medio adecuado hasta que se produce el polipéptido de mut-HPPD. En otra forma de realización, el método comprende además aislar polipéptidos de mut-HPPD del medio o la célula huésped. Otro aspecto de la invención se refiere a polipéptidos de mut-HPPD aislados y a porciones biológicamente activas de estos. Un polipéptido "aislado" o "purificado" o porción biológicamente activa de éste está libre de algún material celular cuando es producido por técnicas de ADN recombinantes, o precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparados de polipéptido de mut-HPPD en donde el polipéptido es separado de algunos de los componentes celulares de las células en las cuales es producido en forma natural o recombinante. En una forma de realización, la expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparados de un polipéptido de mut-HPPD que tiene menos de aprox. 30% (en peso seco) de material que no es de mut-HPPD (también denominado en la presente "polipéptido contaminante"), más preferentemente menos de aprox. 20% de material no mut-HPPD, aún más preferentemente menos de aprox. 10% de material no mut-HPPD y más preferentemente todavía menos de aprox. 5% de material no mut-HPPD.

Cuando el polipéptido de mut-HPPD, o la porción biológicamente activa de éste es producido en forma recombinante también está preferentemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aprox. 20%, más preferentemente menos de aprox. 10%, y más preferentemente aún menos de aprox. 5% del volumen del preparado del polipéptido. La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas" incluye preparados de polipéptido de mut-HPPD en los cuales el polipéptido es separado de los precursores químicos u otras sustancias químicas que están involucradas en la síntesis del polipéptido. En una forma de realización, la expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas" incluye preparados de un polipéptido de mut-HPPD que tienen menos de aprox. 30% (en peso seco) de precursores químicos o sustancias químicas no mut-HPPD, más preferentemente menos de aprox. 20% de precursores químicos o sustancias químicas no mut-HPPD, aún más preferentemente menos de aprox. 10% de precursores químicos o sustancias químicas no mut-HPPD y más preferentemente todavía menos de aprox. 5% de precursores químicos o sustancias químicas no mut-HPPD. En formas de realización preferidas, los polipéptidos aislados, o las porciones biológicamente activas de estos, no tienen polipéptidos contaminantes del mismo organismo del cual se deriva el polipéptido de mut-HPPD. Típicamente, tales polipéptidos son producidos por expresión recombinante de, por ejemplo, un polipéptido de mut-HPPD en plantas distintos de, o en microorganismos tales como, C. glutamicum, ciliados, algas u hongos.

Como se describió más arriba, la presente invención enseña composiciones y métodos para aumentar la tolerancia a derivados de cumarona de una planta de cultivo o semilla en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta o semilla. En una forma de realización preferida, la tolerancia al derivado de cumarona de una planta de cultivo o semilla está aumentada de tal modo que la planta o la semilla puede resistir la aplicación de un herbicida derivado de cumarona de preferentemente aproximadamente 1-1000 g ai ha"1, más preferentemente 20-160 g ai ha"1, y más preferentemente aún 40-80 g ai ha'1. Como se usa en la presente, "resistir" la aplicación de un herbicida derivado de cumarona significa que la planta no se muere ni es dañada por tal aplicación.

Además, la presente invención provee métodos que comprenden el uso de por lo menos un herbicida derivado de cumarona como se ilustra en la Tabla 2.

En estos métodos, el herbicida derivado de cumarona puede ser aplicado por cualquier método conocido en el arte incluyendo, pero no limitado a, tratamiento de semillas, tratamiento del suelo y tratamiento foliar. Antes de la aplicación, el herbicida derivado de cumarona puede ser convertido en las formulaciones acostumbradas, por ejemplo soluciones, emulsiones, suspensiones, pulverizaciones, polvos, pastas y granulos. La forma de uso depende del propósito particular previsto; en cada caso, debería asegurar una distribución fina y uniforme del compuesto de acuerdo con la invención.

Al proveer plantas que tienen mayor tolerancia a un herbicida derivado de cumarona, se pueden emplear una amplia variedad de formulaciones para proteger a las plantas de las malezas, de modo de aumentar el crecimiento de la planta y reducir la competencia por nutrientes. Se puede usar un herbicida derivado de cumarona sólo para el control de malezas preemergencia, posemergencia, preplantado y durante el plantado en áreas que rodean a las plantas de cultivo descriptas en la presente, o se puede usar una formulación de un herbicida derivado de cumarona que contiene otros aditivos. El herbicida derivado de cumarona también se puede usar como un tratamiento de semillas. Los aditivos que se encuentran en una formulación de un herbicida derivado de cumarona incluyen otros herbicidas, detergentes, adyuvantes, agentes dispersantes, agentes adhesivos, agentes estabilizantes, o similares. La formulación del herbicida derivado de cumarona puede ser un preparado húmedo o seco y puede incluir, pero no está limitada a, polvos que fluyen, concentrados emulsionables y concentrados líquidos. Las formulaciones de herbicidas derivados de cumarona y herbicidas se pueden aplicar de acuerdo con métodos convencionales, por ejemplo, por rociado, irrigación, pulverización, o similares.

Formulaciones adecuadas se describen en detalle en el documento PCT/EP2009/063387 y el documento PCT/EP2009/063386, que se incorporan a la presente por referencia.

Debería entenderse también que lo que antecede se refiere a formas de realización preferidas de la presente invención y que se podrán realizar numerosos cambios sin apartarse del alcance de la invención. La invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse de ninguna manera como imponiendo limitaciones al alcance de ésta. Por el contrario, debe entenderse claramente que se podrá recurrir a varias otras formas de realización, modificaciones, y equivalentes de estas, las cuales, después de leer la descripción en la presente, podrán sugerirse a los expertos en el arte sin apartarse del espíritu de la presente invención y/o del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: Síntesis de genes y subclonación Los genes que codifican HPPD mutada o de tipo silvestre fueron sintetizados por Geneart (Regensburg, Alemania) o Entelechon (Regensburg, Alemania) y subclonados en un vector de expresión modificado pET24D (Novagen) dando por resultado constructos de expresión N-terminalmente marcados con His.

Clonación de HPPD de Arabidopsis thaliana La secuencia de codificación parcial de AtHPPD de Arabidopsis thaliana (SEQ ID No: 52) es amplificada por técnicas de PCR estándar de cADN de Arabidopsis thaliana usando los cebadores HuJ101 y HuJ102 (Tabla 5).

Tabla 5: Cebadores de PCR para amplificación de AíHPPD El producto de PCR se clona en el vector pEXP5-NT/TOPO® (Invitrogen, Carisbad, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El plásmido resultante pEXP5-NT/TOPO®-AtHPPD es aislado de E. coli TOP10 realizando una minipreparación de plásmido. El cásete de expresión que codifica AtHPPD N-terminalmente marcado con His6 es confirmado por secuenciación de ADN.

EJEMPLO 2: Expresión heteróloga y purificación de enzimas HPPD recombinantes Las enzimas HPPD recombinantes son producidas y sobreexpresadas en E. coli.

Células químicamente competentes BL21 (DE3) (Invitrogen, Carisbad, Estados Unidos) son transformadas con pEXP5-NT TOPO® (ver EJEMPLO 1 ) o con otros vectores de expresión de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las células transformadas son cultivadas en medio de autoinducción (ZYM 5052 suplementado con 100 pg/ml de ampicilina) durante 6 hs a 37°C seguido por 24 hs a 25 °C.

A una OD600 (densidad óptica a 600 nm) de 8 a 12, las células son cosechadas por centrifugación (8000 x g). El pellet de células es resuspendido en tampón de lisis (50 m de tampón de fosfato de sodio, 0,5 M de NaCI, 10 mM de imidazol, pH 7,0) suplementadp con una mezcla de inhibidor de proteasa completamente libre de EDTA (Roche-Diagnostics) y homogeneizado usando una Avestin Press. El homogenado es clarificado por centrifugación (40.000 x g). HPPD marcada con His6 o variantes mutantes son purificadas por cromatografía de afinidad en una columna empaquetada Protino Ni-IDA 1000 Packed Column (Macherey-Nagel) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. HPPD purificada o variantes mutantes son dializadas contra 100 mM de tampón de fosfato de sodio pH 7,0, suplementado con 10% de glicerina y almacenado a -86°C. Se determina el contenido de proteína de acuerdo con Bradford usando el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA). Se estima la pureza del preparado enzimático por SDS-PAGE.

EJEMPLO 3: Ensayo para determinar la actividad de HPPD La HPPD produce ácido homogentísico y C02 de 4-hidroxifenilpiruvato (4-HPP) y 02. El ensayo de actividad para HPPD se basa en el análisis del ácido homogentísico por HPLC de fase inversa.

Método (A) La mezcla del ensayo puede contener 150 mM de tampón de fosfato de potasio pH 7,0, 50 mM de ácido L-ascórbico, 1 µ? de FeS04 y 7 pg de enzima purificada en un volumen total de 1 mi.

Los inhibidores se disuelven en DMSO (dimetilsulfóxido) a una concentración de 20 mM o 0.5 mM, respectivamente. De esta solución madre se preparan diluciones en serie cinco veces en DMSO, que se usan en el ensayo. La solución inhibidora respectiva representa 1 % del volumen del ensayo. Así, las concentraciones de inhibidores finales oscilan entre 200 µ? y 2,5 nM o de 5 µ? a 63 M, respectivamente.

Después de una preincubación de 30 min se inicia la reacción agregando 4-HPP a una concentración final de 0,1 mM. Se deja proceder la reacción durante 120 min a temperatura ambiente. La reacción se detiene por adición de 100 µ? de ácido fosfórico 4,5 M.

La muestra se extrae en un cartucho Oasis® HLB de 3cc/60mg (Waters) que fue pre-equilibrado con 63 mM de ácido fosfórico. El ácido L-ascórbico se retira por lavado con 3 mi de 63 mM de ácido fosfórico. El homogentisato es eluido con 1 mi de una mezcla 1 :1 de 63mM de ácido fosfórico y metanol (p/p).

Se analizan 10 µ? del eluado por HPLC de fase inversa en una columna Symmetry® C18 (tamaño de partícula 3,5 pm, dimensiones 4,6 x 100 mm; Waters) usando 5 mM de H3PO4/I5 % etanol (p/p) como un eluyente.

El ácido homogentísico es detectado electroquímicamente y cuantificado midiendo las áreas pico (Empower software; Waters).

Las actividades son normalizadas ajustando la actividad de la enzima no inhibida en 100%. Los valores ICso son calculados usando regresión no lineal.

Método (B) La mezcla del ensayo puede contener 150 mM de tampón de fosfato de potasio pH 7,0, 50 mM de ácido L-ascórbico, 100 µ? de Catalase (Sigma-Aldrich), 1 µ? de FeS04 y 0,2 unidades de enzima HPPD purificada en un volumen total de 505 µ?. 1 unidad se define como la cantidad de enzima que se requiere para producir 1 nmol de HGA por minuto a 20 °C.

Después de una preincubación de 30 min se inicia la reacción agregando 4-HPP a una concentración final de 0,05 mM. Se deja proceder la reacción durante 45 min a temperatura ambiente. La reacción se detiene por la adición de 50 µ? de 4.5 M de ácido fosfórico. La muestra es filtrada usando un dispositivo de filtración PVDF de tamaño de poros 0,2 µ?.

Se analizan 5 µ? de la muestra clarificada en una columna UPLC HSS T3 (tamaño de partícula 1 ,8 µ??, dimensiones 2,1 x 50 mm; Waters) por elución ¡socrática usando 90% de 20 mM de NaH2P04 pH 2,2, 10% metanol (v/v).

Se detecta HGA electroquímicamente a 750 mV (modo: DC; polaridad: positiva) y se cuantifica integrando áreas de picos (Empower software; Waters).

Los inhibidores se disuelven en DMSO (dimetilsulfóxido) a una concentración de 0,5 mM. De esta solución madre se preparan diluciones en serie cinco veces en DMSO, que se usan en el ensayo. La solución de inhibidor respectiva representa 1 % del volumen del ensayo. Así, las concentraciones de inhibidor finales oscilan entre 5 µ? y 320 pM, respectivamente. Las actividades son normalizadas ajusfando la actividad enzimática no inhibida a 100%. Los valores IC50 se calculan usando regresión no lineal.

EJEMPLO 4: Caracterización in vitro de enzimas HPPD de tipo silvestre Usando métodos que se describen en los ejemplos más arriba o que son bien conocidos en el arte, se caracterizan las enzimas HPPD de tipo silvestre, recombinantes, purificadas con respecto a sus propiedades cinéticas y su sensibilidad con respecto a los herbicidas que inhiben la HPPD. Se calculan las constantes de michaelis aparentes (Km) y las velocidades de reacción máximas (Vmax) por regresión no lineal con el software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, USA) usando un modelo de inhibición de sustrato. Los valores kcat aparentes se calculan de Vmax asumiendo una pureza de 100% del preparado enzimático. Se calculan las medias ponderadas (por error estándar) de los valores Km y IC50 de al menos tres experimentos independientes. Se usa la ecuación de Cheng-Prusoff para la inhibición competitiva (Cheng, Y. C; Prusoff, W. H. Biochem Pharmacol 1973, 22, 3099-3108) para calcular las constantes de disociación (K¡).

El rendimiento en campo de la enzima HPPD, que se usa como un rasgo de tolerancia a herbicidas puede depender no sólo de su falta de sensibilidad con respecto a herbicidas que inhiben la HPPD sino también de su actividad. Para evaluar el rendimiento potencial de un rasgo de tolerancia a herbicidas se calcula un índice de tolerancia (TI) usando la siguiente fórmula: Se permite una fácil comparación y clasificación de cada rasgo normalizando cada índice de tolerancia en HPPD de Hordeum.

Los ejemplos de los datos obtenidos en un ensayo in vitro se ¡lustran en la Tabla 6 y en la Tabla 7.

Tabla 6 Determinación de la constante de michaelis (Km) para 4-HPP, número de recambio (kcat), eficiencia catalítica (kcat/Km), constante de disociación (K¡) e índice de tolerancia (TI) para las enzimas HPPD de Arabidopsis y Hordeum. metil-4,5-dihidroisoxazol-5-il)fenil]-1-(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo-pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inhibidor 1 ) y 1-(2,2-difluoroet¡l)-2,2-dioxo-3-(2,4,6-tr¡^ (Inhibidor 2).

Tabla 7 índices de tolerancia normalizados de varias enzimas HPPD Enzima HPPD Inhibidor 1* Inhibidor 2* Hordeum 1 1 Avena 7,4 5,2 Blepharisma 6,3 4,9 Kordia 7,5 12 Lolium 6,5 5,6 Picrophilus 289,9 222,8 Rhodococcus HPPD1 40,1 17,1 Rhodococcus HPPD2 73,9 20,5 Synechococcus 2,2 n.d.

* Los herbicidas derivados de cumarona usados en este ejemplo son 3-[2,4-dicloro-3-(3-metil-4,5-dihidroisoxazol-5-il)fenil]-1-(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo-pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inhibidor 1 ) y 1-(2,2-difluoroet¡l)-2,2-d¡oxo-3-(2,4,6-tr¡cloro-3-pir¡dN^ (Inhibidor 2).

Se puede ver de los ejemplos arriba indicados que una enzima HPPD puede ser seleccionada como una que es resistente a herbicidas derivados de cumarona. Se puede observar que el índice de tolerancia de esta enzima es mayor que el índice de tolerancia de la enzima de referencia. Por ejemplo la HPPD de Picrophilus es particularmente útil como un gen que confiere tolerancia a herbicidas en la presente invención porque su índice de tolerancia es mucho mayor que el correspondiente a HPPD de Hordeum.

Además, estos ejemplos indican que una enzima HPPD puede ser seleccionada como una que proporciona tolerancia al inhibidor 1 o inhibidor 2 de derivados de cumarona porque se halló que el índice de tolerancia del Inhibidor 1 o Inhibidor 2 con, por ejemplo, la enzima HPPD de Picrophilus es mucho mayor que los índices de tolerancia de otras enzimas HPPD.

Es evidente que cualquier enzima HPPD que es resistente a herbicidas derivados de cumarona, aún si esta proteína no está ilustrada en este texto, es parte del objeto de esta invención.

EJEMPLO 5: Mutagénesis racional Por medio de biología estructural y alineamiento de secuencias es posible elegir un cierto número de aminoácidos que pueden estar involucrados en forma directa o indirecta en la ligadura de "herbicidas derivados de cumarona" y luego mutagenizarlos y obtener enzimas HPPD tolerantes.

(A) Mutagénesis dirigida a un sitio La mutagénesis dirigida a un sitio basada en PCR se realiza con el kit QuikChange II Site-Directed Mutagénesis Kit (Stratagene, Santa Clara, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esta técnica requiere dos cebadores de ADN sintetizados químicamente (cebador directo e inverso) para cada mutación. Los cebadores ilustrados que se pueden usar para la mutagénesis dirigida a un sitio de íHPPD (SEQ ID NO:52/53) se indican en la Tabla 7.

Tabla 8: Cebadores de PCR para la mutagénesis dirigida a un sitio de At PPD (SEQ ID NOs: 56 a 121 ) Los cebadores ilustrados que se pueden usar para la mutagénesis dirigida a un sitio de HvHPPD (SEQ ID NO:1/2) se indican en la Tabla 8.

Tabla 9: Cebadores de PCR para la mutagénesis dirigida a un sitio de HvHPPD (SEQ ID NOs: 122 a 129) Los plásmidos mutantes son aislados de E. coli TOP10 realizando una minipreparación de plásmido y confirmados por secuenciación de ADN.

La combinación de sustituciones individuales de aminoácidos se logra por una propuesta de mutagénesis escalonada.

(B) Caracterización in vitro de mutantes de HPPD de Hordeum Se obtienen enzimas HPPD mutantes purificadas por los métodos descritos más arriba. Las mediciones de respuesta a la dosis y cinéticas se llevan a cabo usando el ensayo de actividad de HPPD descrito. Las constantes de michaelis aparentes (Km) y las velocidades de reacción máximas (Vmax) se calculan or regresión no lineal con el software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, USA) usando un modelo de inhibición de sustrato. Los valores kcat aparentes se calculan de Vmax asumiendo una pureza de 100% del preparado enzimático. Se calculan las medias ponderadas (por error estándar) de los valores Km e IC50 de al menos tres experimentos independientes. Se usa la ecuación de Cheng-Prusoff para la inhibición competitiva (Cheng, Y. C; Prusoff, W. H. Biochem Pharmacol 1973, 22, 3099-3108) para calcular las constantes de disociación (K¡).

El rendimiento en campo de la enzima HPPD optimizada, que se usa como un rasgo de tolerancia a herbicidas puede depender no sólo de su falta de sensibilidad con respecto a herbicidas que inhiben la HPPD sino también de su actividad. Para evaluar el rendimiento potencial de un rasgo de tolerancia a herbicidas se calcula un índice de tolerancia (TI) usando la siguiente fórmula: &m Se permite una fácil comparación y clasificación de cada rasgo normalizando el índice de tolerancia en el respectivo HPPD de tipo silvestre.

Los ejemplos de los datos obtenidos se ilustran en la Tabla 10 y en la Tabla 11.

Tabla 10. índices de tolerancia normalizados de varias mutantes de HPPD generadas en la HPPD de Hordeum (SEQ ID: 1/2) Variante de HPPD de Ti TÍ Hordeum Inhibidor 1* Inhibidor 2* Tipo silvestre 1 1 G407C 1 ,6 3,2 L320N 3,3 1 ,7 L334E 3,8 2,2 L353M, P321 R, L320N 2,5 3 L353M, P321 R, V212I 2,3 3 L353M, P321 R, V212I, 2,4 3,8 L334E V212L 2,6 0,5 L320Q 3,4 1 ,8 L320H 6,1 5,7 L320H, P321A 6,5 3,7 * Herbicidas derivados de cumarona usados en este ejemplo son 3-[2,4-dicloro-3-(3-metil-4,5-dihidroisoxazol-5-il)fenil]-1-(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo-pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inhibidor 1 ) y 1-(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo-3-(2,4,6-tricloro-3-piridil)pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inhibidor 2) · Tabla 11 índices de tolerancia normalizados de varias mutantes de HPPD generadas en la HPPD de Arabidopsis (SEQ ID: 53).

Variante de HPPD de TÍ ~ TÍ Arabidopsis Inhibidor 1* Inhibidor 2* Tipo silvestre 1 1 M335H, P336A, E363Q 3 1 ,2 M335H 2,9 0,2 * Herbicidas derivados de cumarona usados en este ejemplo son 3-[2,4-dicloro-3-(3-metil-4,5-dihidroisoxazol-5-il)fenil]-1-(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo-pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inhibidor 1 ) y 1-(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo-3-(2,4,6-tricloro-3-p¡^ (Inhibidor 2)· De los ejemplos presentados más arriba se puede ver que una enzima HPPD muíante se puede seleccionar como una que es resistente a herbicidas derivados de cumarona porque se halló que el índice de tolerancia de esta muíante es mayor que el índice de tolerancia para la enzima de tipo silvestre no modificada. Por ejemplo, el cambio de Leu en la posición 320 (Seq ID: 2) a His lleva a un aumento en el índice de tolerancia para el Inhibidor 1 y 2. Otro ejemplo es el cambio de Met en la posición 335 (Seq ID: 53) a His que lleva a un aumento del índice de tolerancia para el inhibidor 1.

También se puede observar que la combinación seleccionada de varias mutaciones de sitios individuales juntas lleva a un aumento del índice de tolerancia.

Es evidente que cualquier mutación o combinación de mutaciones que harían posible obtener una enzima HPPD que es resistente a herbicidas derivados de cumarona, aún si esta proteína no se encuentra ilustrada en este texto, es parte del objeto de esta invención.

EJEMPLO 6 Preparación de plantas que expresan enzimas HPPD y / o HST heterólogas y que son tolerantes a "herbicidas derivados de cumarona" Varios métodos para la producción de plantas transformadas en forma estable son bien conocidos en el arte.

Plantas de soja (Glycine max) o maíz (Zea mays) tolerantes a herbicidas derivados de cumarona pueden ser producidas por un método descrito por Olhoft et al. (patente US 2009/0049567). En resumen, polinucleótidos que codifican HPPD o HST son clonados en un vector binario usando técnicas de clonación estándar como describen Sambrook et al. (Molecular cloning (2001 ) Coid Spring Harbor Laboratory Press). El constructo del vector final contiene una secuencia que codifica HPPD o HST flanqueada por una secuencia de promotor (por ejemplo, la secuencia del promotor de ubiquitina (PcUbi)) y una secuencia terminadora (por ejemplo, la secuencia terminadora de la nopalina sintasa (NOS)) y un cásete del gen marcador de la resistencia (por ejemplo, AHAS) (Figura 3). Opcionalmente, el gen de HPPD o HST puede proveer los medios de selección. La transformación mediada por Agrobacterium se usa para introducir el ADN en las células del meristema axilar de la soja en el nodo primario de los explantes de los plantines. Después de la inoculación y el co-cultivo con Agrobacteria, los explantes son transferidos a medio de inducción de brotes sin selección durante una semana. Los explantes son transferidos subsiguientemente a medio de inducción de brotes con 1-3 µ? de imazapir (Arsenal) durante 3 semanas para seleccionar células transformadas. Los explantes con almohadillas de callos/brotes sanos en el nodo primario se transfieren luego a medio de alargamiento de brotes que contenía 1-3 µ? de imazapir hasta que un brote se alarga o el explante muere. Después de la regeneración, los transformantes son transplantados al suelo en pequeñas macetas, colocados en cámaras de cultivo (16 hs día/ 8 hs noche; 25 °C día/ 23°C noche; 65% de humedad relativa; 130-150 mE m-2 s-1 ) y se testearon subsiguientemente con respecto a la presencia de T-ADN por análisis de Taqman. Después de algunas semanas, eventos de copia simple, transgénicamente positivos, sanos son transplantados a macetas más grandes y se dejan crecer en la cámara de cultivo.

La transformación de plantas de maíz se realiza por un método descrito por McElver y Singh (documento WO 2008/124495). Los constructos del vector de transformación de plantas que contienen las secuencias de HPPD o HST son introducidos en embriones inmaduros de maíz a través de transformación mediada por Agrobacterium. Las células transformadas son seleccionadas en medio de selección suplementado con 0,5-1 ,5 µ? de imazetapir durante 3-4 semanas. Las plántulas transgénicas son regeneradas en medio de regeneración de plantas y luego enraizadas. Las plántulas transgénicas son sometidas a análisis TaqMan para determinar la presencia del transgén antes de ser transplantadas a una mezcla para macetas y cultivadas hasta la madurez en el invernadero.

Arabidopsis thaliana es transformada con secuencias de HPPD o HST por el método de inmersión flora como decriben McElver y Singh (WO 2008/124495). Las plantas de Arabidopsis transgénicas son sometidas a análisis de TaqMan para analizar el número de loci de integración.

La transformación de Oryza sativa (arroz) se realiza por transformación de protoplastos como describen Peng et al. (US 6653529) Plantas transgénicas T0 o T1 de soja, maíz, arroz y Arabidopsis thaliana conteniendo secuencias de HPPD o HST son testeadas con respecto a una mejora de la tolerancia a "herbicidas derivados de cumarona" en estudios en invernadero.

EJEMPLO 7: Experimentos en invernadero Plantas transgénicas que expresan enzimas HPPD o HST heterólogas son testeadas para determinar la tolerancia contra herbicidas derivados de cumarona en experimentos en invernadero.

Para el tratamiento preemergencia se aplican los herbicidas directamente después de sembrar por medio de toberas de distribución fina. Los contenedores son irrigados suavemente para promover la germinación y el crecimiento y son cubiertos subsiguientemente con cubiertas de plástico transparentes hasta que las plantas se enraizaron. Esta cubierta provoca la germinación uniforme de las plantas de prueba, a menos que esto hubiera sido perjudicado por los herbicidas.

Para el tratamiento post emergencia, las plantas de prueba se cultivan primero hasta una altura de 3 a 15 cm, dependiendo del hábito de la planta y sólo entonces se tratan con los herbicidas. Para este propósito las plantas de prueba se siembran directamente y se cultivan en los mismos contenedores o se cultivan primero separadamente y se transplantan en los contenedores de prueba algunos días antes del tratamiento.

Para testear plantas TO, se pueden usar esquejes. En el caso de plantas de soja, un brote óptimo para el esqueje es de aprox. 7,5 a 10 cm de altura, con al menos dos nodos presentes. Cada esqueje se toma del transformante original (planta madre) y se sumerge en polvo de hormona enraizante (ácido indol-3-butírico, IBA). El esqueje se coloca luego en cuñas oasis dentro de un bio-domo. Los esquejas de tipo silvestre también se toman simultáneamente para servir como controles. Los esquejes se mantienen en el biodomo durante 5-7 días y luego son transplantados a macetas y luego aclimatados en la cámara de cultivo durante dos días más. Subsiguientemente, los esquejes son transferidos al invernadero, aclimatados durante aproximadamente 4 días y luego sometidos a tests de rociado como se indica.

Dependiendo de la especie, las plantas se mantienen a 10-25 °C o 20-35 °C. El período de prueba se extiende durante 3 semanas. Durante este tiempo las plantas son cuidadas y se evalúa su respuesta a los tratamientos individuales. Se realizan evaluaciones de daños por el herbicida a las 2 y 3 semanas después del tratamiento. El daño de la planta se clasifica en una escala de 0 a 9, siendo 0 sin lesiones y siendo 9 la planta muerta.

La tolerancia a herbicidas derivados de cumarona también puede ser evaluada en Arabidopsis. En este caso las plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana son ensayadas para determinar la tolerancia mejorada a herbicidas derivados de cumarona en placas de 48 cavidades. Las semillas son esterilizadas en superficie agitando durante 5 min en etanol + agua (70+30 en volumen), enjuagando una vez con etanol + agua (70+30 en volumen) y dos veces con un agua desionizada estéril. Las semillas son resuspendidas en 0,1% agar disuelto en agua (p/v). Se colocan en placas cuatro a cinco semillas por cavidad en medio de nutrientes sólido que consistía en una solución de nutrientes de media concentración de Murashige Skoog, pH 5,8 (Murashige y Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15: 473-497). Los compuestos se disuelven en dimetilsulfóxido (DMSO) y se agregan al medio antes de la solidificación (concentración final de DMSO 0,1 %). Placas de múltiples cavidades son incubadas en una cámara de cultivo a 22°C, 75% de humedad relativa y 1 10 prnol de Phot * m-2 * s-1 con un fotoperíodo de 14 : 10 hs luz : oscuridad. Siete a diez días después de sembrar se evalúa la inhibición del crecimiento por comparación con plantas de tipo silvestre. El factor de tolerancia se calcula dividiendo el valor IC50 de crecimiento de la planta de las plantas transgénicas que contenía una secuencia de HPPD y / o HST por el de las plantas de tipo silvestre.

Adicionalmente, las plantas transgénicas T1 y T2 de Arabidopsis pueden ser testeadas con respecto a una mejor tolerancia a herbicidas derivados de cumarona en un estudio de invernadero. La clasificación de los daños por el herbicida se realiza 2 - 3 semanas después del tratamiento y es clasificada en una escala de 0 a 100 %, siendo 0% la falta de lesiones y 100% la planta muerta.

Los ejemplos de los datos obtenidos se ilustran en las Tablas 12-13 y en las Figuras 3 y 4.

Tabla 12 Factor de tolerancia observado para plantas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresan la HPPD de tipo silvestre.

*Los herbicidas derivados de cumarona usados en este ejemplo son 3-[2,4-dicloro-3-(3- metil-4,5-dihidroisoxazol-5-il)fenil]-1-(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo-pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inhibidor 1 ) y 1-(2I2-difluoroetil)-2,2-dioxo-3-(2,4>6-tricloro-3-piridil)pirido[3,2-c]tiazin-4-ol (Inhibidor 2).

Tabla 13 Pruebas de invernadero de plantas de soja transgénicas (esquejes TO). Las evaluaciones de las lesiones se tomaron dos semanas después del tratamiento con el herbicida.

*EI herbicida derivado de cumarona usado en este ejemplo es 3-[2,4-dicloro-3-(3-metil-4,5-dihidroisoxazol-5-¡l)fen¡l]-1 -(2,2-difluoroetil)-2,2-dioxo-pirido[3,2-c]tiazin-4-ol.

** Se prueban eventos marcados a media velocidad.

Se puede ver de los ejemplos presentados más arriba que un polinucleótido que codifica una HPPD que es transformada en plantas puede ser seleccionado como uno que confiere resistencia a herbicidas derivados de cumarona porque se halló que las plantas que son transformadas con un polinucleótido como éste son menos dañadas por herbicidas derivados de cumarona que las plantas control no transformadas.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un método para controlar la vegetación indeseable en un sitio de cultivo de plantas, caracterizado porque comprende las etapas de: a) proporcionar, en dicho sitio, una planta que comprende al menos un ácido nucleico que comprende (i) una secuencia de nucleotidos que codifica una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa de tipo silvestre o una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa mutada (mut-HPPD) que es resistente o tolerante a un herbicida derivado de cumarona y/o (ii) una secuencia de nucleotidos que codifica una homogentisato solanesiltransferasa de tipo silvestre o una homogentisato solanesiltransferasa mutada (mut-HST) que es resistente o tolerante a un herbicida derivado de cumarona b) aplicar a dicho sitio una cantidad efectiva de dicho herbicida. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia de nucleotidos de (i) comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 , 51 , 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 52, o una de sus variantes o derivados. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia de nucleotidos de (ii) comprende la secuencia de SEQ ID NO: 47 ó 49 o una de sus variantes o derivados. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la planta comprende al menos un ácido nucleico heterólogo adicional que comprende (iii) una secuencia de nucleotidos que codifica una enzima con tolerancia a herbicidas. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el herbicida derivado de cumarona se aplica junto con uno o varios otros herbicidas dirigidos a HPPD y/o HST. Un método para identificar un herbicida derivado de cumarona caracterizado porque se utiliza una mut-HPPD codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 , 51 , 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 52, o una de sus variantes o derivados, y/o se utiliza una mut-HST codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 47 ó 49 o una de sus variantes o derivados. El método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende las etapas de: a) generación de una célula o planta transgénica que comprende un ácido nucleico que codifica una mut-HPPD, en donde la mut-HPPD se expresa; b) aplicación de un derivado de cumarona a la célula o planta transgénica de a) y a una célula o planta de control de la misma variedad; c) determinación del crecimiento o la viabilidad de la célula o planta transgénica y la célula o planta de control después de la aplicación de dicho compuesto de ensayo, y d) selección de los compuestos de ensayo que confieren crecimiento reducido a la célula o planta de control en comparación con el crecimiento de la célula o planta transgénica. Un método de identificación de una secuencia de nucleótidos que codifica una mut-HPPD que es resistente o tolerante a un herbicida derivado de cumarona, caracterizado porque comprende: a) generación de una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican mut-HPPD, b) controlar una población de los ácidos nucleicos que codifican la mut-HPPD resultante por expresión de cada uno de dichos ácidos nucleicos en una célula o planta y tratamiento de dicha célula o planta con un derivado de cumarona c) comparación de los niveles de tolerancia del "derivado de cumarona" proporcionados por dicha población de mut-HPPD que codifica ácidos nucleicos con el nivel de tolerancia del "derivado de cumarona" proporcionado por un ácido nucleico que codifica una HPPD de control, d) selección de al menos un ácido nucleico que codifica una mut-HPPD que proporciona un nivel de tolerancia significativamente mayor a un "derivado de cumarona" en comparación con el proporcionado por el ácido nucleico que codifica la HPPD de control. El método de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica una mut-HPPD seleccionado en la etapa d) proporciona al menos 2 veces como mucho tolerancia a un herbicida derivado de cumarona en comparación con el proporcionado por el ácido nucleico que codifica la HPPD de control. El método de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque la resistencia o tolerancia se determina generando una planta transgénica que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la biblioteca de la etapa a) y comparación de dicha planta transgénica con una planta de control. Un ácido nucleico aislado que codifica una mut-HPPD, caracterizado porque comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11 , 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, o una de sus variantes o derivados. El ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 11 , caracterizado porque el ácido nucleico es identificable por un método tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10. Una célula de planta transgénica transformada por un ácido nucleico de HPPD de tipo silvestre o mutada, caracterizada porque el ácido nucleico de HPPD de tipo silvestre o mutada comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en: a) un polinucleótido tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1 , 51 , 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 52, o una de sus variantes o derivados; b) un polinucleótido tal como se muestra en la SEQ ID NO: 47 ó 49 o una de sus variantes o derivados; c) un polinucleótido que codifica un polipéptido tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11 , 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, o 48, 50 o una de sus variantes o derivados; d) un polinucleótido que comprende al menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de a) a c); y e) un polinucleótido complementario al polinucleótido de cualquiera de a) a d). Una planta transgénica que comprende una célula de planta tal como se define en la reivindicación 13, caracterizada porque la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado una mayor resistencia de la planta a un herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad del tipo silvestre de la planta. Una planta que expresa una mut-HPPD mutagenizada o recombinante que comprende la SEQ ID NO: 2, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos difiere de una secuencia de aminoácidos de HPPD de una correspondiente planta de tipo silvestre en una o varias posiciones de aminoácido, en donde el aminoácido en la posición 236 es distinto de alanina; el aminoácido en la posición 41 es distinto de ácido glutámico; el aminoácido en la posición 320 es distinto de leucina; el aminoácido en la posición 403 es distinto de glicina; la posición de aminoácido 334 es distinto de leucina; la posición de aminoácido 353 es distinto de leucina; el aminoácido en la posición 321 es distinto de prolina; el aminoácido en la posición 212 es distinto de valina; y/o el aminoácido en la posición 407 es distinto de glicina y en donde dicha HPPD confiere en la planta mayor tolerancia a herbicidas en comparación con la correspondiente variedad de tipo silvestre de la planta cuando se expresa allí. Una semilla producida por una planta transgénica que comprende una célula de planta tal como se define en la reivindicación 13, o por la planta de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15, caracterizada porque la semilla es una real reproducción para una mayor resistencia a un herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad del tipo silvestre de la semilla. Un método de producción de una célula de planta transgénica que tiene mayor resistencia a un herbicida derivado de cumarona en comparación con una variedad del tipo silvestre de la célula de planta, caracterizado porque comprende (a) transformar la célula de planta con un cásete de expresión que comprende un ácido nucleico de HPPD mutada o de tipo silvestre, y (b) generar una planta con una mayor resistencia a un herbicida derivado de cumarona desde la célula de planta, en donde el ácido nucleico de HPPD mutada o de tipo silvestre comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1 , 51 , 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 52, o una de sus variantes o derivados; b) un polinucleótido tal como se muestra en la SEQ ID NO: 47 ó 49 o una de sus variantes o derivados; c) un polinucleótido que codifica un polipéptido tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11 , 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, 48, 50 o una de sus variantes o derivados; d) un polinucleótido que comprende al menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de a) a c); y e) un polinucleótido complementario al polinucleótido de cualquiera de a) a d). El método de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque el cásete de expresión también comprende una región reguladora del inicio de la transcripción y una región reguladora del inicio de la traducción que son funcionales en la planta. Un método de identificación o selección de una célula de planta transformada, tejido de planta, planta o parte de planta, caracterizado porque comprende: i) proporcionar una célula de planta transformada, tejido de planta, planta o parte de ella, en donde dicha célula de planta transformada, tejido de planta, planta o parte de ella comprende un polinucleótido tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1 , 51 , 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 52, o una de sus variantes o derivados, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido de mut-HPPD que se usa como un marcador de selección y en donde dicha célula de planta transformada, tejido de planta, planta o parte de ella puede comprender otro polinucleótido aislado; ii) puesta en contacto de la célula de planta transformda, tejido de planta, planta o parte de ella con al menos un compuesto derivado de cumarona; iii) determinar si la célula de planta, tejido de planta, planta o parte de ella está afectada por el compuesto inhibidor; y iv) identificación o selección de la célula de planta transformada, tejido de planta, planta o parte de ella, Una planta que expresa una mut-HPPD mutagenizada o recombinante caracterizada porque comprende la SEQ ID NO: 53, en donde la secuencia de aminoácidos difiere de una secuencia de aminoácidos de HPPD de una correspondiente planta de tipo silvestre en una o varias posiciones de aminoácido, en donde el aminoácido en la posición 293 es distinto de glutamina; el aminoácido en la posición 335 es distinto de metionina; el aminoácido en la posición 336 es distinto de prolina; el aminoácido en la posición 337 es distinto de serina; la posición de aminoácido 363 es distinta de ácido glutámico; el aminoácido en la posición 422 es distinto de glicina; el aminoácido en la posición 385 es distinto de leucina; la posición de aminoácido 393 es distinta de una isoleucina, la posición del aminoácido 368 es distinta a leucina; y/o la posición de aminoácido 421 es distinta de una lisina, y en donde dicha HPPD confiere a la planta mayor tolerancia a herbicidas en comparación con la correspondiente variedad de tipo silvestre de la planta cuando se expresa allí. RESUMEN Un método para controlar vegetación indeseable en un sitio de cultivo de plantas, que comprende las etapas de proporcionar, en dicho sitio, una planta que comprende al menos un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa de tipo silvestre o una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa mutada (mut-HPPD) que es resistente o tolerante a un herbicida derivado de cumarona y/o una secuencia de nucleótidos que codifica una homogentisato solanesiltransferasa de tipo silvestre o una homogentisato solanesiltransferasa mutada (mut-HST) que es resistente o tolerante a un herbicida derivado de cumarona y aplicar a dicho sitio una cantidad efectiva de dicho herbicida. También, plantas que comprenden mut-HPPD y métodos de obtención de tales plantas. Figura 1 A 1/6