BR9915969B1

BR9915969B1 - "hospedeiro recombinante e método para controlar uma peste lepidopterana".

Info

Publication number: BR9915969B1
Application number: BRPI9915969-4A
Authority: BR
Inventors: Jerald S Feitelson; H Ernest Schnepf; Kenneth E Narva; Brian A Stockhoff; James Schmeits; David Loewer; Charles Joseph Dullum; Judy Muller-Cohn; Lisa Stamp; George Morrill; Stacey Finstad-Lee
Original assignee: Mycogen Corp
Priority date: 1998-05-06
Filing date: 1999-05-06
Publication date: 2014-10-14
Also published as: HUP0101991A2; US20020100080A1; TR200003264T2; WO1999057282A3; AU759579B2; CA2327266A1; CN1296482C; CA2327266C; EP1944372A2; KR100763074B1; US6656908B2; AU3888399A; BR9915969A; HUP0101991A3; JP2002513574A; EP1944372B1; EP1075522A2; MXPA00010890A; AR016989A1; US6242669B1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "HOSPEDEI- RO RECOMBINANTE E MÉTODO PARA CONTROLAR UMA PESTE LÉ- PIDO PTERAN A".

Fundamentos da invenção Insetos e outras pestes custam aos agricultores bilhões de dóla- res anualmente em perdas de colheita e na despesa de se manter estas pestes sob controle. As perdas causadas por pestes de inseto nos ambien- tes de produção de agricultura incluem diminuição no rendimento de colhei- ta, qualidade de colheita reduzida e custos de colheita aumentados. Métodos de cultivação, tais como rotação de colheita e a aplica- ção de altos níveis de nitrogênio para estimular o crescimento de um sistema de raiz adventício, parcialmente leva em conta problemas causados por pes- tes de agricultura. Demandas econômicas na utilização de gleba de terra cultivada restrigem o uso de rotação de colheita. Além disso, trilhas de al- guns insetos que ultrapassam o inverno estão rompendo rotações de colhei- ta em algumas áreas. Assim, conta-se com a maior intensidde com insetici- das químicos para garantir o nível desejado de controle. Inseticidas são ou associados sobre ou incorporados no solo. O uso de inseticidas químicos tem várias desvantagens. O uso contínuo de inseticidas perimitiu que insetos resistentes se densenvolvam.

Situações tais como populações extremamente altas de larvas, chuvas pe- sadas e calibração imprópria de equipamento de aplicação de inseticida po- dem resultar em controle pobre. O uso de inseticidas freqü ente mente au- menta as preocupações ambientais tais como contaminação de solo e tanto de suprimentos de água de subsolo quanto de superfície. O público também se tomou preocupado com a quantidade de produtos químicos sintéticos, residuais que pode ser encontrado no alimento. O trabalho com inseticidas pode também apresentar riscos as pessoas que os aplicam. Portanto, pesti- cidas químicos sintéticos estão sendo crescente mente minuciosa mente e- xa minados e correta mente assim, quanto as suas consequências ambientais tóxicas potenciais. Exemplos de pesticidas químicos sintéticos amplamen- te usados incluem os organocloro, por exemplo, DDT, mirex, kepona, lindano, aldrina, clordano, aldicarb e dieldrin; os organofosfatos, por exem- plo, clorpirifos, paration, malation e diazinon; e carbamatos. Novas restri- ções rigorosas sobre o uso de pesticidas e da eliminação de alguns pestici- das eficazes oriundos do mercado podería limitar opções econômicas e efi- cazes para o controle de pestes prejudiciais e dispendiosas.

Por causa dos problemas associados ao uso de pesticidas quí- micos sintéticos orgânicos, existe uma clara necessidade de limitar o uso destes agentes e uma necessidade de indentificar agentes de controle al- ternativos. A substituição de pesticidas químicos sintéticos ou combinações destes agentes com pesticidas biológicos, poderíam reduzir os níveis de produtos químicos tóxicos no ambiente.

Um agente pesticida biológico que está desfrutando de popula- ridade crescente é o micróbio de solo Bacillus thuríngiensis (B.t.). O micróbio de solo Bacillus thuríngiensis (B.t.) é uma bactéria formadora de esporo, gram-positiva. A maior parte das cepas de B.t. não exibem atividade pestici- da. Algumas cepas de B.t. produzem, e podem ser caracterizadas por, in- clusões de proteína cristalina paraesporal. Estas inclusões freqüentemente aparecem microscopicamente como cristais de forma distinta. Algumas pro- teínas de B.t. são altamente tóxicas a pestes, tais como insetos, e são es- pecíficas em sua atividade tóxica. Certas proteínas de B.t. inseticidas são associadas às inclusões. Estas "δ-endotoxinas", são diferentes de exotoxi- nas, que têm uma faixa de hospedeiro não específica.

Certos genes de toxina Bacillus foram isolados e foram seqüen- ciados, e produtos à base de DNA recombinante foram produzidos e foram aprovados para o uso. Além disso, com o uso de técnicas de enge- nheiramento genético, novas abordagens para o fornecimento destas toxi- nas aos ambientes de agricultura estão sob desenvolvimento. Estas incluem o uso de plantas geneticamente engenheiradas com genes de toxina para resistência a inseto e o uso de células microbianas intactas estabilizadas como veículos de fornecimento de toxina. Assim, genes de toxina de Bacillus isolados estão se tornando comercialmente de alto valor.

Até os últimos quinze anos, o uso comercial de pesticidas de B.t. foi grandemente restrito ao direcionamento de uma faixa estreita de pestes de lepidopterano (Caterpillar). Preparações dos esporos e cristais de subespécie de B. thuringiensis kurstaki foram usadas por muitos anos como inseticidas comerciais para pestes de lepidopterano. Por exemplo, B. thurin- giensis var. kurstaki HD-1 produz uma δ-endotoxina cristalina que é tóxica às larvas de numerosos insetos de lepidopterano.

Em anos recentes, no entanto, investigadores revelaram pestici- das de B.t. com especificidades para uma faixa muito mais ampla de pestes.

Por exemplo, outras espécies de B.t., a saber israelensis e morrísoni (a.k.a. tenebrionis, a.k.a. B.t. M-7, a.k.a B.t. san diego), foram usadas comercial- mente para controlar insetos das ordens Diptera e Coleoptera, respectiva- mente, Bacillus thuringiensis var. tenebrionis foi relatado ser ativo contra dois besouros na ordem Coleoptera (besouros de batata Colorado, Lepti- notarsa decemlineata e Agelastica alni).

Mais recentemente novas subespécies de B.t. foram identifica- das, e genes responsáveis por proteínas de δ-endotoxina ativas foram iso- ladas. Hõfte e Whiteley classificaram genes de proteína de cristal de B.t. em quatro classes principais (Hõfte, H., H.R. Whiteley [1989] Microbiological Reviews 52(2): 242 - 255). As classes eram Cryl (específica de Lepidopte- ra), Cryll (específica de Lepidoptera e Diptera), Crylll (específica de Cole- optera), e CrylV (específica de Diptera). A revelação de cepas especifica- mente tóxicas a outras pestes foi relatada. Por exemplo, CryV e CryVI foram propostas designar uma classe de genes de toxina que são específica de nematóide. O esquema de classificação e nomeclatura de 1989 de Hõfte e Whiteley para proteínas de cristal foi à base da seqüência de aminoácidos e a faixa de hospedeiro da toxina. Aquele sistema foi adaptado para cobrir 14 diferentes tipos de genes de toxina que foram divididos em cinco classes principais. O número de genes de proteína de cristal de Bacillus thuringien- sis seqüenciados fica em mais do que 50. Um esquema de nomeclatura re- visada foi proposto que é baseado exclusivamente na identidade de amino- ácido (Crickmore e outros [1996] Society for Invertebrate Pathology, 29a An- nual Meeting, III rd International Colloquium on Bacillus thuringiensis, Uni- versity of Cordoba, Cordoba, Espanha, em 1 a 6 de setembro de 1996, re- sumo). A "cry" mnemônica foi conservada para todos os genes de toxina exceto cytA e cytB, que permanecem uma classe separada. Números roma- nos foram trocados para números arábicos na classe primária, e os parênte- ses na classe terciária foram removidos. Muitos dos nomes originais foram conservados, com as exceções observadas, embora um número tenha sido reclassificado.

Muitos outros genes de B.t. foram agora identificados. A WO 94/21795, WO 96/10083, WO 98/44137 e Estruch, J.J. e outros (1996) PNAS 93: 5389 - 5394 descrevem toxinas de Vip1A(a), de Vip1A(b), de Vip2A(a), de Vip2A(b), de Vip3A(a), e de Vip3A(b) obtidas a partir de micró- bios de Bacillus. Aquelas toxinas são relatadas serem produzidas durante o crescimento celular vegetativo e foram assim chamadas de proteínas inseti- cidas vegetativas (VIP). A atividade destas toxinas contra certas pestes de lepidopterano e certas pestes de coleopterano foi relatada. A WO 98/18932 revela novas classes de toxinas pesticidas.

Obstáculos ao uso em agricultura bem suscedida de toxinas de Bacillus incluem o desenvolvimento de resistência às toxinas de B.t. por in- setos. Além disso, certos insetos podem ser refratários aos efeitos de toxi- nas de Bacillus. O último inclui insetos tais como gorgulho de "boll" e grami- ola negra bem como insetos adultos da maioria das espécies que até agora demonstraram não aparentar sensibilidade significativa a δ-endotoxinas de B.t. Embora estratégias de gerenciamento em tecnologia de planta transge- ne de B.t. tenha se tornado de grande interesse, permanece uma grande necessidade de desenvolver genes adicionais que podem ser expressos em plantas a fim de eficazmente controlar vários insetos. O presente pedido provê novas classes de toxinas e genes, além daquelas descritas na WO 98/18932, e que são distintas daquelas re- veladas na WO 94/21795, na WO 96/10083, na WO 98/44137, e Estruch e outros.

Breve Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a materiais e a métodos úteis no controle de pestes de não mamífero e, particularmente, pestes de planta.

Em uma modalidade, a presente invenção provê novos isolados de Bacillus tendo atividade vantajosa contra pestes de não mamífero. Em uma modali- dade ulterior, a presente invenção provê novas toxinas úteis para o controle de pestes de não mamífero. Em uma modalidade preferida, estas pestes são lepidopteranos e/ou coleopteranos. As toxinas da presente invenção inclu- em, δ-endotoxinas bem como toxinas solúveis que podem ser obtidas a par- tir do sobrenadante das culturas de Bacillus. A presente invenção ulteriormente provê seqüências de nucleo- tídeos que codificam as toxinas da presente invenção. A presente invenção ulteriormente provê métodos e seqüências de nucleotídeos úteis na identifi- cação e na caracterização de genes que codificam toxinas pesticidas.

Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a seqüên- cias de nucleotídeos únicas que são úteis como sondas de hibridização e/ou iniciadores em técnicas de PCR. Os iniciadores produzem fragmentos de gene característicos que podem ser usados na identificação, caracterização, e/ou isolamento de genes de toxina específicos. As seqüências de nucleotí- deos da presente invenção codificam toxinas que são distintas das toxinas descritas anteriormente.

Em uma modalidade específica, a presente invenção provê no- vas classes de toxinas tendo atividades pesticidas vantajosas. Estas classes de toxinas podem ser codificadas por seqüências de polinucleotídeos que são caracterizados por sua capacidade de hibridizar com certas seqüências exemplificadas e/ou por sua capacidade de ser ampliada por PCR usando- se certos iniciadores exemplificados.

Um aspecto da presente invenção pertence à identificação e à caracterização de novas famílias inteiras de toxinas de Bacillus tendo pro- priedades pesticidas vantajosas. A presente invenção inclui novas classes de genes e toxinas chamadas aqui de MIS-7 e MIS-8. Genes e toxinas da novas classe WAR e SUP são também revelados. Certos genes e toxinas MIS-1 e MIS-2 são também ulteriormente caracterizados aqui.

Estas famílias de toxinas, e os genes que os codificam, podem ser caracterizados em termos, por exemplo, do tamanho do gene ou da toxi- na, da seqüência de aminoácidos ou de DNA, da atividade pesticida, e/ou da reatividade de anticorpo. Com relação aos genes que codificam as novas famílias de toxina da presente invenção, a revelação atual provê sondas de hibridização únicas e iniciadores de PCR que podem ser usados para iden- tificar e caracterizar DNA dentro das famílias exemplificadas.

Em uma modalidade da presente invenção, isolados de Bacillus podem ser cultivados sob condições que resultam em alta multiplicação do micróbio. Depois do tratamento do micróbio para prover ácido nucléico ge- nômico de fio único, o DNA pode ser posto em contato com os iniciadores da invenção e submetê-lo a ampliação por PCR. Fragmentos característicos de genes de codificação de toxina serão ampliados pelo procedimento, as- sim a identificação da presença do(s) gene(s) de codificação de toxina.

Um outro aspecto da presente invenção é o uso das seqüências de nucleotídeos reveladas como sondas para detectar genes que codificam toxinas de Bacillus que são ativos contra pestes.

Outros aspectos da presente invenção incluem os genes e iso- lados identificados usando-se os métodos e as seqüências de nucleotídeos revelados aqui. Os genes assim identificados codificam toxinas ativas contra pestes. Similarmente, os isolados terão atividade contra estas pestes. Em uma modalidade preferida, estas pestes são pestes de lepidopterano ou de coleopterano.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a células de plantas transformadas com pelo menos uma seqüência de poli- nucleotídeos da presente invenção de modo que as células de planta transformadas expressam toxinas pesticidas em tecidos consumidos por pestes alvo. Como descrito aqui, as toxinas úteis de acordo com a presente invenção podem ser toxinas quiméricas por combinação de porções de toxi- nas múltiplas. Além disso, misturas e/ou combinações de toxinas podem ser usadas de acordo com a presente invenção.

Transformação de plantas com os construtos genéticos revela- dos aqui pode ser realizada usando-se técnicas bem conhecidas por aquele versado na técnica e tipicamente envolveríam modificação do gene para otimizar expressão da toxina em plantas.

Alternativamente, os isolados de Bacillus da presente invenção, ou micróbios recombinantes que expressam toxinas descritas aqui, podem ser usados para controlar pestes. A este respeito, a invenção inclui o trata- mento de células de Bacillus substancialmente intactas, e/ou células recom- binantes contendo as toxinas expressas da invenção, tratadas para prolon- gar a atividade pesticida quando as células substancialmente intactas são aplicadas ao ambiente de uma peste alvo. A célula tratada age como um revestimento protetor para a toxina pesticida. A toxina se torna ativa após a ingestão por um inseto alvo.

Breve Descrição das Seqüèncias SEQ ID NO. 1 é uma seqüência de nucleotídeos que codificam um toxina oriunda de cepa B.t. Javelin 1990. SEQ ID NO. 2 é uma seqüência de aminoácidos para a toxina Javelin 1990. SEQ ID NO. 3 é um iniciador de avanço usado de acordo com a presente invenção. SEQ ID NO. 4 é um iniciador reverso usado de acordo com a presente invenção. SEQ ID NO. 5 é uma seqüência de nucleotídeos de um gene de toxina oriundo de cepa B.t. PS66D3 SEQ ID NO. 6 é uma seqüência de aminoácidos oriunda da to- xina 66D3. SEQ ID NO. 7 é uma seqüência de nucleotídeos de um gene de toxina MIS oriundo de cepa de B.t. PS177C8. SEQ ID NO. 8 é uma seqüência de aminoácidos oriunda de to- xina 177C8-MIS. SEQ ID NO. 9 é uma seqüência de nucleotídeos de um gene de toxina oriundo de cepa de B.t. PS177I8 SEQ ID NO. 10 é uma seqüência de aminoácidos oriunda da toxina 17718. SEQ ID NO. 11 é uma seqüência de nucleotídeos que codifica um gene de toxina 177C8-WAR oriunda de cepa de B.t. PS177C8. SEQ ID NO. 12 é uma seqüência de aminoácidos de uma toxina 177C8-WAR oriundo de cepa de B.t. PS177C8. SEQ ID NO. 13-21 são iniciadores usados de acordo com a in- venção.

SEQ ID NO. 22 é o complemento reverso do iniciador de SEQ ID NO. 14.

SEQ ID NO. 23 é o complemento reverso do iniciador de SEQ ID NO. 15.

SEQ ID NO. 24 é o complemento reverso do iniciador de SEQ ID NO. 17.

SEQ ID NO. 25 é o complemento reverso do iniciador de SEQ ID NO. 18.

SEQ ID NO. 26 é o complemento reverso do iniciador de SEQ ID NO. 19.

SEQ ID NO. 27 é o complemento reverso do iniciador de SEQ ID NO. 20.

SEQ ID NO. 28 é o complemento reverso do iniciador de SEQ ID NO. 21. SEQ ID NO. 29 é um iniciador de avanço MIS-7. SEQ ID NO. 30 é um iniciador de reverso MIS-7. SEQ ID NO. 31 é um iniciador de avanço MIS-8. SEQ ID NO. 32 é um iniciador de reverso MIS-8. SEQ ID NO. 33 é uma seqüência de nucleotídeos de um gene de toxina MIS-7 designado 157C1-A oriundo da cepa de B.t. PS157C1. SEQ ID NO. 34 é uma seqüência de aminoácidos de uma toxina MIS-7 designado 157C1-A oriunda da cepa de B.t. PS157C1. SEQ ID NO. 35 é uma seqüência de nucleotídeos de um gene de toxina MIS-7 oriundo da cepa de B.t. PS201Z. SEQ ID NO. 36 é uma seqüência de nucleotídeos de um gene de toxina MIS-8 oriundo da cepa de B.t. PS31F2. SEQ ID NO. 37 é uma seqüência de nucleotídeos de um gene de toxina MIS-8 oriundo da cepa de B.t. PS185Y2. SEQ ID NO. 38 é uma seqüência de nucleotídeos de um gene de toxina MIS-1 oriundo da cepa de B.t. PS33F1. SEQ ID NO. 39 é um iniciador MIS para o uso de acordo com a presente invenção. SEQ ID NO. 40 é um iniciador MIS para o uso de acordo com a presente invenção. SEQ ID NO. 41 é um iniciador WAR para o uso de acordo com a presente invenção. SEQ ID NO. 42 é um iniciador WAR para o uso de acordo com a presente invenção. SEQ ID NO. 43 é uma seqüência de nucleotídeos parcial para um gene MIS-7 oriundo de PS205C. SEQ ID NO. 44 é uma seqüência de aminoácidos parcial para uma toxina MIS-7 oriunda de PS205C. SEQ ID NO. 45 é uma seqüência de aminoácidos parcial para um gene WAR oriundo de PS205C. SEQ ID NO. 46 é uma seqüência de aminoácidos parcial para uma toxina WAR oriunda de PS205C. SEQ ID NO. 47 é uma seqüência de nucleotídeos para um gene MIS-8 oriundo de PS31F2. SEQ ID NO. 48 é uma seqüência de aminoácidos para uma to- xina MIS-8 oriunda de PS31F2.

SEQ ID NO. 49 é uma seqüência de nucleotídeos para um gene WAR oriundo de PS31F2. SEQ ID NO. 50 é uma seqüência de aminoácidos para uma to- xina WAR oriunda de PS31F2. SEQ ID NO. 51 é um iniciador SUP para o uso de acordo com a presente invenção. SEQ ID NO. 52 é um iniciador SUP para o uso de acordo com a presente invenção. SEQ ID NO. 53 é uma seqüência de nucleotídeos para um gene SUP oriundo de KB59A4-6. SEQ ID NO. 54 é uma seqüência de aminoácidos para uma to- xina SUP oriunda de KB59A4-6.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se a materiais e a métodos para o controle de pestes de não mamífero. Em modalidades específicas, a pre- sente invenção pertence a novos isolados de Bacillus thuringiensis e toxinas que têm atividade contra lepidopteranos e/ou coleopteranos. A presente invenção ulteriormente refere-se a novos genes que codificam toxinas pesti- cidas e a novos métodos para a identificação e caracterização de genes de Bacillus que codificam toxinas com propriedades úteis. A presente invenção refere-se não apenas às seqüências de polinucleotídeos que codificam es- tas toxinas, mas também ao uso destas seqüências de polinucleotídeos para produzir hospedeiros recombinantes que expressam as toxinas. As proteínas da presente invenção são distintas das toxinas de proteína que foram anteriormente isoladas de Bacillus thuringiensis.

Isolados de B.t. úteis de acordo com a presente invenção foram depositados na coleção permanente da Agricultural Research Service Pa- tent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA. Os números repositórios de cultura das cepas de B.t. são como se segue: Culturas que foram depositadas para as finalidades deste pedi- do de patente foram depositadas sob condições de que o acesso às culturas está disponível durante a pendência deste pedido de patente por alguém determinado pelo Comissionário de Patentes e Marcas Registradas a ser entitulado ao mesmo sob 37 CFR 1.14 e 35 U.S.C. 122. Os depósitos esta- rão disponíveis quando necessários pelas leis de Patente estrangeiras em países em que cópias da presente invenção, ou sua progênia, são arquiva- das. No entanto, deve ser entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a presente invenção em detrimento dos direitos de patente concedidos pela ação governamental.

Além disso, os presentes depósitos de cultura serão armazena- dos e tornados disponíveis ao público de acordo com as provisões do Tra- tado de Budapeste para o Depósito de Microorganismo, isto é, eles serão armazenados com todo o cuidado necessário para mantê-los viáveis e não contaminados por um período de pelo menos cinco anos depois da exigên- cia mais recente para o fornecimento de uma amostra do depósito, e em alguns casos, por um período de pelo menos trinta (30) anos depois da data do depósito ou pela vida obrigatória de qualquer patente que pode expedir a revelação da(s) cultura(s). O depositante reconhece a obrigação de substi- tuir o(s) depósito(s) caso o depositório seja incapaz de fornecer uma amos- tra quando exigido, devido a condição de um depósito. Todas as restrições sobre a disponibilidade ao público dos presentes depósitos de cultura serão irrevogavelmente removidos após a concessão de uma patente que as re- velem.

Muitas das cepas úteis de acordo com a presente invenção es- tão prontamente disponíveis em virtude da expedição de patentes que re- velam estas cepas ou por seu depósito em coleções públicas ou por sua inclusão em produtos comerciais. Por exemplo, a cepa de B.t. usada no produto comercial, Javelin, e os isolados de HD são todos disponíveis publi- camente.

Mutantes dos isolados mencionados aqui podem ser produzidos por procedimentos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um mutante asporogenoso pode ser obtido através de mutagênese de sulfonato de etil- metano (EMS) de um isolado. Os mutantes podem ser produzidos usando- se luz ultravioleta e guanidina nitrosa por procedimentos bem conhecidos na técnica.

Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a materiais e a métodos incluindo iniciadores de nucleotídeo e sondas para o isola- mento, caracterização e identificação de genes de Bacillus que codificam toxinas de proteína que são ativas contra pestes de não mamífero. As se- qüências de nucleotídeos descritos aqui podem também ser usadas para identificar novos isolados de Bacillus pesticidas. A invenção ulteriormente refere-se a genes, a isolados, a toxinas identificadas usando-se os métodos e os materiais revelados aqui.

As novas toxinas e as seqüências de nucleotídeos providas aqui são definidas de acordo com vários parâmetros. Uma característica das to- xinas descrita aqui é a atividade pesticida. Em uma modalidade específica, estas toxinas têm atividade contra as pestes de coleopterano e/ou lepidop- terano. As toxinas e os genes da presente invenção podem ser ulterior- mente definidos por suas seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos. As seqüências das moléculas podem ser definidas em termos de homologia a certas seqüências exemplificadas bem como em termos da capacidade de hibridizar com, ou ser ampliada por, certos iniciadores e sondas exemplifi- cados. As toxinas providas aqui podem também ser identificadas com base em sua imunoreatividade com certos anticorpos.

Um aspecto importante da presente invenção é a identificação e caracterização de novas famílias de toxinas de Bacillus, e genes que codifi- cam estas toxinas. Estas famílias foram designadas MIS-7 e MIS-8. Novas famílias de toxina de tipo WAR E SUP são também reveladas aqui. Toxinas dentro destas famílias, bem como genes que codificam toxinas dentro des- tas famílias, podem prontamente ser identificados como descritos aqui por, por exemplo, tamanho, sequência de aminoácidos ou de DNA, e reatividade de anticorpo. Características de seqüência de aminoácidos e de DNA inclu- em homologia com seqüências exemplificadas, capacidade de hibridizar com sondas de DNA, e capacidade de ser ampliada com iniciadores especí- ficos.

Um gene e uma toxina (que são obteníveis a partir de PS33F1) da família de MIS-1 e um gene e uma toxina (que são obteníveis a partir de PS66D3) da família MIS-2 são também ulteriormente caracterizados aqui.

Uma nova família de toxinas identificadas aqui é a família de MIS-7. Esta família inclui toxinas que podem ser obtidas a partir de isolados de B.t. PS157C1, PS205C e PS201Z. A presente invenção ulteriormente provê sondas e iniciadores para a identificação das toxinas e genes MIS-7.

Uma outra nova família de toxinas identificadas aqui é a família de MIS-8. Esta família inclui toxinas que podem ser obtidas a partir de isola- dos de B.t. PS31F2 e PS185Y2. A presente invenção ulteriormente provê sondas e iniciadores para a identificação das toxinas e genes MIS-8.

Em uma modalidade preferida, os genes da família de MIS codi- ficam toxinas tendo um peso molecular de cerca de 70 a cerca de 100 kDA e, mais de preferência, as toxinas têm um tamanho de cerca de 80 kDa. Ti- picamente, estas toxinas são solúveis e podem ser obtidas a partir do so- brenadante de culturas de Bacillus como descritas aqui. Estas toxinas têm toxicidade contra pestes de não mamífero. Em uma modalidade preferida, estas toxinas têm atividade contra pestes de coleopterano. As proteínas MIS são ulteriormente úteis devido a sua capacidade de formar poros em célu- Ias. Estas proteínas podem ser usadas com segundas entidades incluindo, por exemplo, outras proteínas. Quando usada com uma segunda entidade, a proteína MIS facilitará entrada do segundo agente em uma célula alvo. Em uma modalidade preferida, a proteína MIS interage com receptores MIS em uma célula alvo e causa formação de poro na célula alvo. A segunda enti- dade pode ser uma toxina ou uma outra molécula cuja entrada na célula alvo é desejada. A presente invenção ulteriormente refere-se a uma família de toxinas designadas toxinas de tipo WAR. As toxinas WAR tipicamente têm um tamanho de cerca de 30 - 50 kDa e, mais tipicamente, têm um tamanho de cerca de 40 kDa. Tipicamente, estas toxinas são solúveis e podem ser obtidas a partir do sobrenadante de culturas de Bacillus como descritas aqui. As toxinas WAR podem ser identificadas com iniciadores descritos aqui bem como anticorpos.

Uma família adicional de toxinas provida de acordo com a pre- sente invenção são as toxinas designadas toxinas de tipo SUP. Tipicamen- te, estas toxinas são solúveis e podem ser obtidas a partir do sobrenadante de culturas de Bacillus como descritas aqui. Em uma modalidade preferida, as toxinas SUP são ativas contra pestes de lepidopterano. As toxinas SUP tipicamente têm um tamanho de cerca de 70-100 kDa e, de preferência cer- ca de 80 kDa. A família SUP é exemplificada aqui por toxinas oriundas de isolado KB59A4-6. A presente invenção provê sondas e iniciadores úteis para a identificação de toxinas e genes na família SUP. A presente invenção também provê genes e toxinas de Bacillus adicionais, incluindo genes e toxinas MIS, WAR e SUP adicionais.

Toxinas nas famílias MIS, WAR e SUP são todas solúveis e po- dem ser obtidas como descritas aqui a partir das culturas de Bacillus. Estas toxinas podem ser usadas sozinhas ou em combinação com outras toxinas para controlar pestes. Por exemplo, toxinas oriundas das famílias MIS po- dem ser usadas em combinação com toxinas de tipo WAR para conseguir o controle de pestes, particularmente pestes de coleopterano. Estas toxinas podem ser usadas, por exemplo, com δ-endotoxinas que são obtidas a partir de isolados de Bacillus. A tabela 2 provê um sumário das novas famílias de toxinas e genes da presente invenção. Certas famílias MIS são especificamente exemplificadas aqui por toxinas que podem ser obtidas a partir de isolados de B.t. como mostrado na tabela 2. Genes que codificam toxinas em cada uma destas famílias podem ser identificados por uma variedade de parâme- tros altamente específicos, incluindo a capacidade de hibridizar com as sondas particulares indicadas na tabela 2. A identidade de sequência em excesso de cerca de 80% com as sondas indicadas na tabela 2 pode tam- bém ser usada para identificar os genes das várias famílias. Também exem- plificados são pares de iniciador particulares que podem ser usados para ampliar os genes da presente invenção. Uma porção de um gene dentro das famílias indicadas tipicamente seria amplificável com pelo menos um dos pares de iniciador enumerados. Em uma modalidade, a porção ampliada seria de cerca do tamanho de fragmento indicado. Iniciadores motrados na tabela 2 consiste em seqüências de polinucleotídeos que codificam peptí- deos como mostrados na listagem de seqüência ligada até aqui. Sondas e iniciadores adicionais podem prontamente ser construídos por aqueles ver- sados na técnica de modo que alternam seqüências de polinucleotídeos que codificam as mesmas seqüências de aminoácidos que podem ser usadas para identificar e/ou caracterizar genes adicionais que codificam toxinas pesticidas.

Em uma modalidade preferida, estas toxinas adicionais, e seus genes, poderíam ser obtidos a partir de isolados de Bacillus.

Além do mais, toxinas quiméricas podem ser usadas de acordo com a presente invenção. Métodos foram desenvolvidos para a produção de toxinas quiméricas úteis por combinação de porções de proteínas de B.t. As porções que são combinadas não necessitam, elas próprias, serem pestici- das contanto que a combinação de porções cria uma proteína quimérica que seja pesticida. Isto pode ser feito usando-se enzimas de restrição, como descrito na, por exemplo, Patente Européia 0 228 838; Ge, A.Z., N.L. Shiva- rova, D. H. Dean (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 4037 -4041; Ge, A. Z., D. Rivers, R. Milne, D. H. Dean (1991) J. Biol. Chem. 266: 17954-17958;

Schnepf, Η. E., K. Tomczak, J. P. Ortega, H.R. Whiteley (1990) J. Biol.

Chem. 265: 20923-20930; Honee, G., D. Convents, J. Van Rie, S. Jansens, M. Peferoen, B. Visser (1991) Mol. Microbiol. 5:2799-2806. Altemativamen- te, recombinação usando-se mecanismos de recombinação celular pode ser usada para se conseguir resultados similares. Ver, por exemplo, Caramori, T., A. M. Albertini, A. Galizzi (1991) Gene 98:37 - 44; Widner, W. R., H.R.

Whiteley (1990) J. Bacteriol. 172:2826-2832; Bosch, D., B. Schipper, H. van. der Kliei, R.A. de Maagd, W. J. Stickema (1994) Biotechnology 12:915-918.

Numerosos outros métodos são conhecidos na técnica pelos quais tais DNAs quiméricos podem ser produzidos. A presente invenção destina-se a incluir proteínas quiméricas que utilizam novas seqüências identificadas no presente pedido.

Com os ensinamentos providos aqui, aquele versado na técnica poderia prontamente produzir e usar as várias toxinas e seqüências de poli- nucleotídeos descritas aqui.

Genes e Toxinas. Os genes e as toxinas úteis de acordo com a presente invenção não incluem apenas as seqüências de comprimento completo mas também fragmentos das seqüências, variantes, mutantes e proteínas de fusão que retêm a atividade pesticida característica das toxinas especificamente exemplificadas aqui. Toxinas e genes quiméricos, produzi- dos por combinação de porções oriundos de mais do que um gene ou toxina de Baciilus, podem também ser utilizados de acordo com os ensinamentos da presente invenção. Como usado aqui, os termos "variantes" ou "varia- ções" de genes referem-se a seqüência de nucleotídeos que codificam as mesmas toxinas ou que codificam toxinas equivalentes tendo atividade pes- ticida. Como usado aqui, o termo "toxinas equivalentes" refere-se a toxinas tendo a mesma ou essencialmente a mesma atividade biológica contra as pestes alvo que as toxinas exemplificadas. Por exemplo, a patente U.S. no. 5.605.793 descreve métodos para a geração de diversidade molecular adi- cional por uso de reagrupamento de DNA depois da fragmentação aleatória. É evidente para uma pessoa versada na técnica que genes que codificam toxinas ativas podem ser identificados e obtidos através de vários meios. Os genes específicos exemplificados aqui podem ser obtidos a partir de isolados depositados em um depositório de cultura como descrito acima.

Estes genes ou porções ou suas variantes, podem também ser contruídos sinteticamente, por exemplo, por uso de um sintetizador de gene.

Variações de genes podem ser prontamente construídas usando-se técnicas padrão para a produção de mutações de ponto. Também, fragmentos destes genes podem ser produzidos usando-se exonucleases disponíveis comerci- almente ou endonucleases de acordo com os procedimentos padrão. Por exemplo, enzimas tal como mutagênese de sítio-dirigida ou Bal31 podem ser usadas para sinteticamente cortar nucleotídeos oriundos das extremida- des destes genes. Também, genes que codificam fragmentos ativos podem ser obtidos usando-se uma variedade de enzimas de restrição. Proteases podem ser usadas para diretamente se obter fragmentos ativos destas toxi- nas.

Genes e/ou toxinas equivalentes que codificam estas toxinas equivalentes podem ser derivadas de isolados de Bacillus e/ou bibliotecas de DNA usando-se os ensinamentos providos aqui. Há numerosos métodos para a obtenção das toxinas pesticidas da presente invenção. Por exemplo, anticorpos para as toxinas pesticidas reveladas e reivindicadas aqui podem ser usados para identificar e isolar toxinas de uma mistura de proteínas. Es- pecificamente, anticorpos podem ser criados para as porções das toxinas que são mais constantes e mais distintas de outras toxinas de Bacillus. Es- tes anticorpos podem então ser usados para especificamente identificar to- xinas equivalentes com a atividade característica por imunoprecipitação, ensaio imunossorvente ligado por enzima (ELISA), ou Western blotting. An- ticorpos para as toxinas reveladas aqui, ou para as toxinas equivalentes, ou fragmentos destas toxinas, podem prontamente ser preparados usando-se procedimentos padrão nesta técnica. Os genes que codificam estas toxinas podem então ser obtidos a partir do microorganismo.

Fragmentos e equivalentes que retêm a atividade pesticida das toxinas exemplificadas estão dentro do escopo da presente invenção. Tam- bém, por causa da redundância do código genético, uma variedade de dife- rentes seqüências de DNA podem codificar as seqüência de aminoácidos reveladas aqui. Está bem dentro da habilidade de uma pessoa versada na técnica criar estas seqüências de DNA alternativas que codificam as mes- mas, ou essencialmente as mesmas toxinas. Estas seqüências de DNA va- riantes estão dentro do escopo da presente invenção. Como usado aqui, referência a seqüência "essencialmente a mesma" refere-se a seqüências que têm inserções, adições, deleções ou substituições de aminoácido que não materialmente afetam a atividade pesticida. Fragmentos que retêm ati- vidade pesticida estão também incluídos nesta definição.

Um outro método para a identificação das toxinas e genes da presente invenção é através do uso de sondas de oligonucleotídeos. Estas sondas são seqüências detectáveis. Sondas provêem um método rápido para a identificação de genes que codificam toxina da presente invenção.

Os segmentos de nucleotídeo que são usados como sonda de acordo com a invenção podem ser sintetizados usando-se um sintetizador de DNA e pro- cedimentos padrão.

Certas toxinas da presente invenção foram especificamente exemplificadas aqui. Uma vez que estas toxinas são meramente exemplares das toxinas da presente invenção, será prontamente evidente que a pre- sente invenção compreende toxinas variantes ou equivalentes (e seqüência de nucleotídeos que codificam toxinas equivalentes) tendo a mesma ativi- dade pesticida ou similar da toxinas exemplificada. Toxinas equivalentes terão homologia de aminoácido com uma toxina exemplificada. Esta identi- dade de aminoácido tipicamente será maior do que 60%, de preferência será maior do que 75%, mais de preferência maior do que 80%, de prefe- rência será maior do que 90%, e pode ser maior do que 95%. Estas identi- dades são como determinadas usando-se técnicas de alinhamento padrão. A homologia de aminoácido será mais alta em regiões críticas da toxina que levam em conta a atividade biológica ou estão envolvidas na determinação de configuração tridimensional que afinal de contas é responsável pela ati- vidade biológica. A este respeito, certas substituições de aminoácido são aceitáveis e podem ser esperadas se estas substituições são em regiões que não são críticas a atividade ou são substituições de aminoácido conser- vadores que não afetam a configuração tridimensional da molécula. Por exemplo, aminoácidos podem ser colocados nas seguintes classes: não polar, polar não carregado, básico e ácido. Substituições conservadoras pelo que um aminoácido de uma classe é substituído com um outro aminoá- cido do mesmo tipo cai dentro de escopo da presente invenção, contanto que a substituição não materialmente afeta a atividade biológica do com- posto. A tabela 3 provê uma listagem de exemplos de aminoácidos que pertencem a cada classe.

Em alguns casos, substituições não conservadoras podem tam- bém ser feitas. O fator crítico é que estas substituições não devem significa- tivamente depreciar a atividade biológica da toxina.

As δ-endotoxinas da presente invenção podem também ser ca- racterizadas em termos da forma e da localização de inclusões de toxina, que são descritas acima.

Como usado aqui, referência a polinucleotídeos "isolados" e/ou toxinas "purificadas" refere-se a estas moléculas quando elas não estão as- sociadas às outras moléculas com as quais elas seriam encontradas na na- tureza. Assim, referência a "isolado e purificado" significa o envolvimento da "mão do homem" como descrito aqui. Genes e toxinas quiméricos também envolvem a "mão do homem".

Hospedeiros Recombinantes. Os genes de codificação de toxina da presente invenção podem ser introduzidos para dentro de uma ampla variedade de hospedeiros de planta e microbianos. A expressão do gene de toxina resulta, diretamente ou indiretamente, na produção e na manutenção do pesticida. Com hospedeiros microbianos adequados, por exemplo, Pseu- domonas, os micróbios podem ser aplicados aos sítios da peste, onde eles proliferarão e serão ingeridos. O resultado é um controle da peste. Alternati- vamente, o micróbio que hospeda o gene de toxina pode ser morto ou trata- do sob condições que prolongam a atividade da toxina e estabilizam a cé- lula. A célula tratada, que retém a atividade tóxica, então pode ser aplicada ao ambiente da peste alvo.

Onde o gene de toxina de Bacillus via um vetor adequado para dentro de um hospedeiro microbiano, e o dito hospedeiro é aplicado ao am- biente em um estado vivo, é essencial que certos micróbios hospedeiros sejam usados. Hospedeiros de microorganismos selecionados que são co- nhecidos como ocupando a "fitoesfera" (filoplano, filoesfera, rizoesfera e/ou rizoplano) de uma ou mais colheitas de interesse. Estes microorganismos são selecionados de modo a ser capaz de competir com sucesso no ambi- ente particular (colheita ou outros habitats de insetos) com o microorganis- mo de tipo selvagem, provêem manutenção estável e expressão do gene que expressa o pesticida de polipeptídeo, e, desejavelmente, provêem pro- teção aperfeiçoada do pesticida contra a inativação e degradação ambien- tal.

Um grande número de microorganismos são conhecidos como habitando o filoplano (a superfície das folhas da planta) e/ou rizoesfera (o solo que envolve raízes de planta) de uma ampla variedade de colheitas importantes. Estes microorganismos incluem bactérias, algas e fungos. De particular interesse são microorganismos, tais como bactérias, por exemplo, gêneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacte- rium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, e Alcaligenes; fungos, particularmente levedura, por exemplo, gêneros Sac- charomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, e Aureobasidium. De particular interesse são tais espécies bacterianas da fitoesfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseu- domonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcalige- nes entrophus, e Azotobacter vinlandir, e espécies de levedura da fitoesfera tais como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marirta, R. aurantiaca, Crypto- coccus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretorien- sis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces vero- nae, e Aureobasidium pollulans. De particular interesse são os microorga- nismos pigmentados.

Uma ampla variedade de meios estão disponíveis para a intro- dução de um gene de Bacillus que codifica uma toxina para dentro um mi- croorganismo hospedeiro sob condições que permitem manutenção estável e expressão do gene. Estes métodos são bem conhecidos por aqueles ver- sados na técnica e são descritos, por exemplo, na patente U.S. no. 5.135.867, que é incorporada aqui por referência.

Genes sintéticos que são funcionalmente equivalentes às toxi- nas da presente invenção podem também ser usados para transformar hos- pedeiros. Métodos para a produção de genes sintéticos podem ser encon- trados na, por exemplo, patente U.S. no. 5.380.831.

Tratamento de Células. Como mencionado acima, células de Bacillus ou recombinantes que expressam uma toxina de Bacillus podem ser tratadas para prolongar a atividade de toxina e estabilizar a célula. A micro- cápsula pesticida que é formada compreende a toxina de Bacillus dentro de uma estrutura celular que foi estabilizada e protegerá a toxina quando a mi- crocápsula é aplicada ao ambiente da peste alvo. Células de hospedeiro adequadas podem incluir ou procariotas ou eucariotas. Como hospedeiros, de particular interesse serão as procariotas e as eucariotas inferiores, tais como fungos. A célula usualmente estará intacta e estará substancialmente na forma proliferativa quando tratada, ao invés de em uma forma de esporo.

Tratamento da célula microbiana, por exemplo, um micróbio contendo o gene de toxina de Bacillus, pode ser por meio químico ou físico, ou por uma combinação de meios químico e/ou físico, contanto que a técni- ca não nocivamente afete as propriedades da toxina, nem diminuam a capa- cidade celular de proteção da toxina. Métodos para o tratamento de células microbianas são revelados nas patentes U.S. nos. 4.695.455 e 4.695.462, que são incorporadas aqui por referência. Métodos e Formulações para o Controle de Pestes. Controle de pestes usando-se os isolados, toxinas e genes da presente invenção pode ser realizado por uma variedade de métodos conhecidos por aqueles versa- dos na técnica. Estes métodos incluem, por exemplo, a aplicação de isola- dos de Bacillus às pestes (ou sua localização), a aplicação de micróbios recombinantes às pestes (ou suas localizações), e a transformação de plantas com genes que codificam as toxinas pesticidas da presente inven- ção. Transformações podem ser feitas por aqueles versados na técnica usando-se técnicas padrão. Materiais necessários para estas transforma- ções são revelados aqui ou estão de outra maneira prontamente disponíveis pelo especializado versado.

Grânulos de isca formulados contendo um atrativo e as toxinas dos isolados de Bacillus, ou micróbios recombinantes compreendendo os genes obteníveis a partir de isolados de Bacillus revelados aqui, podem ser aplicados ao solo. Produtos formulados podem também ser aplicados como um revestimento de planta ou tratamento de raiz ou tratamento de planta total em estágios posteriores do ciclo de colheita. Tratamentos de planta e de solo de células de Bacillus podem ser empregados como poeiras, grânulos ou pós molháveis, por misturação com vários materiais inertes, tais como minerais inorgânicos (filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, e semelhantes) ou materiais botânicos (espigas de milho em pó, cascas de arroz, cascas de nozes, e semelhantes). As formulações podem incluir auxi- liares espalhadores-adesivos, agentes de estabilização, outros aditivos pesticidas ou tensoativos. Formulações líquidas podem ser de base aquosa ou não aquosa e empregadas como espumas, géis, suspensões, concentra- dos emulsificáveis, ou semelhantes. Os ingredientes podem incluir agentes reológicos, tensoativos, emulsificadores, dispersantes ou polímeros.

Como seria apreciado por uma pessoa versada na técnica, a concentração pesticida variará dependendo da natureza da formulação par- ticular, particularmente se ela é um concentrado ou será usada diretamente. 0 pesticida estará presente em pelo menos 1% em peso e pode ser de 100% em peso. As formulações secas terão de cerca de 1-95% em peso do pesticida enquanto as formulações líquidas em geral será de cerca de 1- 60% em peso dos sólidos na fase líquida. As formulações que contêm célu- las em geral terão de cerca de 102 a cerca de 104 células/mg. Estas formu- lações serão administradas a cerca de 50 mg (líquido ou seco) a 1 kg ou mais por hectare.

As formulações podem ser aplicadas ao ambiente da peste, por exemplo, sole e folhagem, por borrifamento, polvilhamento, regamento, ou semelhantes.

Sondas de Polinucleotídeos. É bem conhecido que DNA possui uma propriedade fundamental chamada complementaridade de base. Na natureza, DNA comumente existe na forma de pares de padrões antiparale- los, as bases sobre cada fio que se projeta daquele fio em relação ao fio oposto. A base adenina (A) sobre um fio sempre estará oposta à base timina (T) sobre outro fio, e a base guanina (G) estará oposta à base citosina (C).

As bases são mantidas em aposição por sua capacidade de ligar hidrogênio deste modo específico. Embora cada ligação individual seja relativamente fraca, o efeito global de muitas bases de ligação de hidrogênio adjacentes, juntamente com efeitos de empilhamento de base, é uma ligação estável dos dois fios complementares. Estas ligações podem ser rompidas por tra- tamento tal como pH alto ou alta temperatura, e estas condições resultam na dissociação, ou "desnaturação" dos dois fios. Se o DNA é então coloca- do em condições que produzem ligação de hidrogênio das bases termodi- namicamente favoráveis, os fios de DNA se anelarão ou "hibridizarão", e reformarão o DNA de fio duplo original. Se realizada sob condições apropri- adas, esta hibridização pode ser altamente específica. Isto é, apenas fios com um alto grau de complementaridade de base será capaz de formar es- truturas de fios duplos estáveis. A relação da especificidade de hibridização para dar condições de reação é bem conhecida. Assim, hibridização pode ser usada para testar se dois pedaços de DNA são complementares em su- as seqüências de base. É este mecanismo de hibridização que facilita o uso de sondas da presente invenção para prontamente detectar e caracterizar sequências de DNA de interesse.

As sondas podem ser RNA, DNA ou PNA (ácido nucléico de peptídeo). A sonda normalmente terá pelo menos cerca de 10 bases, mais usualmente pelo menos cerca de 17 bases, e pode ter até cerca de 100 ba- ses ou mais. Sondas mais longas podem prontamente ser utilizadas, e tais sondas podem ter, por exemplo, vários quilobases de comprimento. A se- qüência de sondas é projetada ser pelo menos substancialmente comple- mentar a uma porção de um gene que codifica uma toxina de interesse. A sonda não necessita ter complementaridade perfeita à seqüência a qual ela hibridiza. As sondas podem ser marcadas utilizando-se técnicas que são bem conhecidas por aqueles versados na técnica.

Uma abordagem para o uso da presente invenção como sondas vincula primeiramente a identificação por análise de Southern blot de um banco de gene do isolado de Bacillus todos os segmentos de DNA homólo- gos com as seqüências de nucleotídeos reveladas. Assim, é possível, sem o auxílio de análise biológica, conhecer antecipadamente a atividade provável de muitos novos isolados de Bacillus, e dos produtos de gene individuais expressos por um dado isolado de Bacillus. Uma tal análise de sonda provê um método rápido para a identificação de genes de toxina de alto valor po- tencialmente comerciais dentro das subespécies variadas de B.t.

Um procedimento de hibridização útil de acordo com a presente invenção tipicamente inclui as etapas iniciais de isolamento da amostra de DNA de interesse e purificação dela quimicamente. Ou bactérias lisadas ou ácido nucléico fracionado total isolados de bactérias podem ser usados. Células podem ser tratadas usando-se técnicas conhecidas para liberar seu DNA (e/ou RNA). A amostra de DNA pode ser cortada em pedaços com uma enzima de restrição apropriada. Os pedaços podem ser separados pelo ta- manho através de eletroforese em um gel, usualmente agarose ou acrilami- da. Os pedaços de interesse podem ser transferidos para uma membrana de imobilização. A técnica de hibridização particular não é essencial a presente invenção. Quando aperfeiçoamentos são feitos nas técnicas de hibridiza- ção, eles podem ser prontamente aplicados. A sonda e a amostra podem então ser combinadas em uma so- lução de tampão de hibridização e mantidas em uma temperatura apropria- da até que o anelemanto ocorra. Depois disso, a membrana é lavada livre de materiais estranhos, deixando a amostra e as moléculas de sonda liga- das tipicamente detectadas e quantificadas por auto-radiografia e/ou conta- gem de cintilação líquida. Como é bem conhecido na técnica, se a molécula de sonda e a amostra de ácido nucléico se hibridizam por formação de uma ligação não covalente forte entre as duas moléculas, pode ser razoavel- mente admitido que a sonda e a amostra são essencialmente idênticas. O rótulo detectável da sonda provê um meio para a determinação de um modo conhecido se hibridização ocorreu.

No uso dos segmentos de nucleotídeo como sondas, a sonda particular é marcada com qualquer rótulo adequado conhecido por aqueles versados na técnica, incluindo rótulos radioativos ou não radioativos. Rótu- los radioativos típicos icluem 32P, 35S, ou semelhantes. Rótulos não radioati- vos incluem, por exemplo, ligando tal como biotina ou tiroxina, bem com en- zimas tais como hidrolases e peroxidases, ou os vários quimiluminescentes tais como luciferina ou compostos fluorescentes como fluoresceína e seus derivados. As sondas podem ser produzidas inerentemente como descritas no Pedido Internacional no. WO 93/16094. Vários graus de severidade de hibridização podem ser empre- gados. Quanto mais severa é a condição, maior é a complemantaridade que é necessária para formação duplex. Severidade pode ser controlada por temperatura, concentração de sonda, comprimento de sonda, concentração iônica, tempo, e semelhantes. De preferência, hibridização é conduzida sob condições de severidade moderada a alta por técnicas bem conhecidas na técnica, como descrito, por exemplo, em Keller, G. Η., M.M Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, Nova York, NY, págs. 169-170.

Como usado aqui, condições de "severidade de moderada a alta" para hibridização refere-se a condições que conseguem o mesmo, ou cerca do mesmo grau de especificidade de hibridização que as condições empregadas pelas requerentes atuais. São providos exemplos de condições de severidade de moderada e alta aqui. Especificamente, hibridização de DNA imobilizado sobre Southern blots com sondas específicas de gene marcadas por 32P foi realizada por métodos padrão (Maniatis e outros). Em geral, hibridização e lavagens subseqüentes são realizadas sob condições de severidade de moderada a alta que permitiram a detecção de seqüências alvo com homologia aos genes de toxina exemplificados. Para sondas de gene de DNA de fio duplo, hibridização foi realizada de uma dia para o outro a 20 - 25°C abaixo da temperatura de fusão (Tm) do híbrido de DNA em 6X SSPE, solução de 5X Denhardt, SDS a 0,1%, 0,1 mg/ml de DNA desnatura- do. A temperatura de fusão é descrita pela seguinte fórmula (Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, P.T. Cherbas e F.C. Kafatos [1983] Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman e K. Moldave [eds.] Academic Press, Nova York 100: 266-285).

Tm = 81,5°C + 16,6 Log[Na+]+0,41(%G+C)-0,61(% de formami- da)-600/comprimento de duplex em pares de base.

Lavagens são tipicamente realizadas como se segue: (1) duas vezes a temperatura ambiente por 15 minutos em 1X SSPE, SDS a 0,1% (lavagem de baixa severidade). (2) Uma vez a Tm-20°C por 15 minutos em 0,2X SSPE, SDS a 0,1% (lavagem de severidade moderada).

Para sondas de oligonucleotídeos, hibridização foi realizada de um dia para o outro a 10-20°C abaixo da temperatura de fusão (Tm) do hí- brido em 6X SSPE, solução de 5X Denhardt, SDS a 0,1%, 0,1 mg/ml de DNA desnaturado. Tm para sondas de oligonucleotídeos foi determinada pela seguinte fórmula: Tm (°C)=2 (número de pares de base T/A)+4(número de pares de base G/C) (Suggs, S.V., T. Miyake, E. H. Kawashime, M.J. Johnson, k.

Itakura, e R. B. Wallace [1981] ICN-UCLA Symp. Dev. Bio. Using Purified Genes, D.D. Brown [ed], Academic Press, Nova York, 23:683-693).

Lavagens foram tipicamente realizadas como se segue: (1) duas vezes a temperatura ambiente por 15 minutos em 1X SSPE, SDS a 0,1% (lavagem de baixa severidade). (2) Uma vez na temperatura de hibridização por 15 minutos em 1X SSPE, SDS a 0,1% (lavagem de severidade moderada).

Em geral, sal e/ou temperatura podem ser alterados para mudar severidade. Com o fragmento de DNA marcado > 70 bases mais ou menos de comprimento, as seguintes condições podem ser usadas: baixa: 1 ou 2X SSPE, temperatura ambiente baixa: 1 ou 2X SSPE, 42°C

moderada: 0,2X ou 1X SSPE, 65°C

alta: 0,1X SSPE, 65°C

Formação duplex e estabilidade dependem da complementari- dade substancial entre os dois fios de um híbrido, e, como observado acima, um certo grau de mal emparelhamento pode ser tolerado. Portanto, as se- qüências de sondas da presente invenção incluem mutações (tanto simples quanto múltiplas), deleções, inserções das seqüências descritas e suas combinações, em que as ditas mutações, inserções e deleções permitem a formação de híbridos estáveis com o polinucleotídeo alvo de interesse. Mu- tações, inserções e deleções podem ser produzidas em uma dada seqüên- cia de polinucleotídeos de muitos modos, e estes métodos são conhecidos por um artesão normalmente versado. Outros métodos podem se tornar co- nhecidos no futuro.

Assim, variantes mutacionais, insercionais e delecionais das seqüências de nucleotídeos reveladas podem ser prontamente preparadas que são bem cohecidas por aquele versado na técnica. Estas variantes po- dem ser usadas do mesmo modo que as seqüências de iniciadores exempli- ficadas contanto que as variantes têm homologia de seqüência substancial com a seqüência original. Como usado aqui, homologia de seqüência substancial refere-se a homologia que é suficiente para possibilitar a sonda de variante funcionar na mesma capacidade que a sonda original. De prefe- rência, esta homologia é maior do que 50%; mais de preferência, esta ho- mologia é maior do que 75%; e mais de preferência, esta homologia é maior do que 90%. O grau de homologia necessário para a variante funcionar em sua capacidade pretendida dependerá do uso pretendido da sequência.

Está bem dentro da habilidade de um pessoa treinada nesta técnica produ- zir mutações mutacionais, insercionais e delecionais que são projetadas para aperfeiçoar a função da seqüência ou de outra maneira prover uma vantagem metodológica.

Tecnologia por PCR. Reação de cadeia de polimerase (PCR) é uma síntese inicializada, enzimática, repetitiva de uma seqüência de ácidos nucléicos. Este procedimento é bem conhecido e é comumente usado por aqueles versados na técnica (ver Mullis, nas patentes U.S. nos. 4.683.195, 4.683.202 e 4.800.159; Saiki, Randall K., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Hom, Henry A. Erlich, Norman Amheim [1985] "En- zymatic Amplification of beta-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia" Science 230:1350-1354). PCR é a base da ampliação enzimática de um fragmento de DNA de inte- resse que é flanqueado por dois iniciadores de oligonucleotídeo que hibridi- zam para dar fios da seqüência alvo. Os iniciadores são orientados com as extremidades 3' apontando em direção a outra. Ciclos repetidos de desnatu- ração a quente do modelo, anelamento dos iniciadores com suas seqüên- cias complementares, e extensão dos iniciadores anelados com uma polime- rase de DNA resultam na ampliação do segmento definido pelas extremida- des 5' dos iniciadores de PCR. Uma vez que o produto de extensão de cada iniciador pode servir como um modelo para o outro iniciador, cada ciclo es- sencialmente dobra a quantidade de fragmento de DNA produzido no ciclo anterior. Isto resulta no acúmulo exponencial do fragmento alvo específico, até várias milhões de vezes em umas poucas horas. Por uso de uma poli- merase de DNA termoestável tal como Taq polimerase, que é isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus, o processo de ampliação pode ser totalmente automatizado. Outras enzimas que podem ser usadas são co- nhecidas por aqueles versados na técnica.

As seqüências de DNA da presente invenção podem ser usadas como iniciadores para ampliação de PCR. Na realização de ampliação de PCR, um certo grau de desparelhamento pode ser tolerado entre o iniciador e o modelo. Portanto, mutações, deleções e inserções (especialmente adi- ções de nucleotídeos a extremidade 5') dos iniciadores exemplificados caem dentro do escopo da presente invenção. Mutações, inserções e deleções podem ser produzidas em um dado iniciador por métodos conhecidos por um artesão normalmente versado.

Todas as referências citadas aqui são aqui incorporadas por referência. O que se segue são exemplos que ilustram os procedimentos para a prática da invenção. Estes exemplos não devem ser interpretados como limitantes. Todas as percentagens são em peso e todas as propor- ções de mistura de solvente são em volume a não ser que de outra maneira observado.

Exemplo 1 - Cultivo de Isolados de Bacillus Úteis de Acordo com a Presente Invenção O hospedeiro celular contendo o gene inseticida de Bacillus pode ser desenvolvido em qualquer meio nutriente conveniente. Estas cé- lulas podem então ser coletadas de acordo com os meios convencionais.

Alternativamente, as células podem ser tratadas antes da coleta.

As células de Bacillus da invenção podem ser cultivadas usan- do-se meios padrão e técnicas de fermentação. Durante o ciclo de fermen- tação, as bactérias podem ser coletadas por primeiramente separação dos fragmentos celulares lisados, cristais, esporos, e células vegetativas de Ba- cillus do caldo de fermentação por meio bem conhecido na técnica. Quais- quer δ-endotoxinas de cristal ou esporos de Bacillus formados podem ser recuperados empregando-se técnicas bem conhecidas e usadas como uma preparação de B.t. de δ-endotoxina convencional. O sobrenadante oriundo do processo de fermentação contém toxinas da presente invenção. As toxi- nas são isoladas e purificadas empregando-se técnicas bem conhecidas.

Uma subcultura de isolados de Bacillus, ou seus mutantes, po- dem ser usados para inocular o seguinte meio, conhecido como caldo de TB: Triptona 12 g/l Extrato de levedura 24 g/l Glicerol 4 g/l KH2P04 2,1 g/l K2HPO4 14,7 g/l PH 7,4 O fosfato de potássio foi adicionado ao caldo tratado em auto- clave depois do resfriamento. Frascos foram incubados a 30°C sobre um agitador rotativo a 250 rpm por 24-36 hroas. O procedimento acima pode ser prontamente aumentado de es- cala para fermentadores grandes por procedimentos conhecidos na técnica. O Bacillus obtidos na fermentação acima, pode ser isolado por procedimentos bem conhecidos na técnica. Um procedimento freqüente- mente usado é submeter o caldo de fermetação coletado a técnicas de se- paração, por exemplo, centrifugação. Em uma modalidade específica, pro- teínas de Bacillus úteis de acordo com a presente invenção podem ser obti- das a partir do sobrenadante. O sobrenadante de cultura contendo a(s) proteína(s) ativa(s) pode ser usado em bioensaios.

Alternativamente, uma subcultura de isolados de Bacillus, ou seus mutantes, pode ser usado para inocular a seguinte peptona, glicose, meio de sais: bacto peptona 7,5 g/l glicose 1,0 g/l KH2PO4 3,4 g/l K2HPO4 4,35 g/l solução de sal 5,0 ml/l solução de CaCI2 5,0 ml/l pH 7,2 Solução de sais (100 ml) MgS04 7H20 2,46 g MnS04H20 0,04 g ZnS04 7H20 0,28 g FeS047H20 0,40 g Solução de CaCI2 (100 ml) CaCI2.2H20 3,66 g A solução de sais e a solução de CaCI2 são esterilizadas por filtragem e são adicionadas ao caldo cozido e tratado em autoclave na hora de inoculação. Frascos são incubados a 30°C sobre um agitador rotativo a 200 rpm por 64 hs. O procedimento acima pode ser prontamente aumentado de es- cala para fermentadores grandes por procedimentos bem conhecidos na técnica.

Esporos e/ou cristais de Bacillus, obtidos na fermentação acima, podem ser isolados por procedimentos bem conhecidos na técnica. Um pro- cedimento freqüentemente usado é para submeter o caldo de fermentação coletado a técnicas de separação, por exemplo, centrifugação.

Exemplo 2 - Isolamento e Preparação de DNA Celular para PCR DNA pode ser preparado a partir de células desenvolvidas sobre ágar de Spizizen, ou outro ágar enriquecido ou mínimo conhecido por aqueles versados na técnica, por cerca de 16 horas. Ágar de ácido casami- no de Spizizen compreende 23,2 g/l de sais mínimos de Spizizen [(NH4)2S04, 120 g; K2HP04, 840 g; KH2P04, 360 g; citrato de sódio, 60 g;

MgS04.7H20, 12 g. Total: 1392 g], 1,0 g/l de ácidos casaminos livres de vi- tamina; 15,0 g/l de ágar Difco. Na preparação do ágar, a mistura foi tratada em autoclave por 30 minutos então uma solução de glicose a 50%, estéril pode ser adicionada para dar uma concentração final de 0,05% (1/100 vol).

Uma vez que as células são desenvolvidas por cerca de 16 horas, um em- plastro de cerca de 1 cm2 de células pode ser raspado a partir da ágar para dentro de 300 μΙ de Tris-HCI a 10 mM (pH 8,0)-EDTA a 1 mM. Proteinase K foi adicionada a 50 pg/ml e foi incubada a 55°C por 15 minutos. Outras pro- teases adequadas que carecem de atividade de nuclease podem ser usa- das. As amostras foram então colocadas em um banho de água fervente por 15 minutos para inativar a proteinase e desnaturam o DNA. Isto também precipita componentes indesejados. As amostras são então centrifugadas a 14.000 x g em uma micrófuga de Eppendorf a temperatura ambiente por 5 minutos para se remover fragmento celular. Os sobrenadantes contendo DNA bruto foram transferidos para tubos frescos e foram congelados a - 20°C até que fossem usados em reações de PCR.

Alternativamente, DNA celular total pode ser preparado a partir de células desenvolvidas em placas usando-se o kit de Tecido QIAmp da Qiagen (Santa Clarita, CA) seguindo as instruções do fabricante.

Exemplo 3 - Iniciadores Úteis para a Caracterização e/ou Identificação de Genes de Toxina O seguinte conjunto de iniciadores de PCR pode ser usado para identificar e/ou caracterizar genes da presente invenção, que codificam toxi- nas pesticidas: GGRTTAMTTGGRTAYTATTT (SEQ ID NO. 3) ATATCKWAYATTKGCATTTA (SEQ ID NO. 4) Códigos de nucleotídeo redundantes usados através de toda a presente revelação estão de acordo com a convenção de IUPAC e incluem: R = A ou G

M = A ou C

Y = C ou T

K = G ou T

W = A ou T

Exemplo 4 - Identificação e Seqüênciação de Genes que Codificam Novas Toxinas de Proteína Solúveis Oriundas de Cepas de Bacillus PCR usando-se iniciadores de SEQ ID NO. 3 e SEQ ID NO. 4 foi realizado sobre DNA genômico celular total isolado de uma ampla faixa de cepas de B.t. Aquelas amostras que fornecem uma tira de cerca de 1 kb para a caracterização por seqüênciação de DNA. Fragmentos de DNA am- pliados foram primeiramente clonados para dar vetor de plasmídio de clona- gem de TA de DNA por PCR, pCR2.1, como descrito pelo fornecedor (Invi- trogen, San Diego, CA). Plasmídios foram isolados dos clones recombinan- tes e foram testados quanto a presença de um inserto de cerca de 1 kpb por PCR usando-se os iniciadores de vetor de plasmídio, T3 e T7.

As seguintes cepas forneceram a tira esperada de cerca de 1000 pb, assim indicando a presença de um gene de toxina de tipo MIS: PS66D3, PS177C8, PS177I8, PS33F1, PS157C1 (157C1-A), PS201Z, PS31F2 e PS185Y2.

Plasmídios foram então isolados para o uso como a seqüênci- ação de modelos usando-se kits miniprep QIAGEN (Santa Clarita, CA) como descritos pelo fornecedor. Reações de seqüênciação foram realizadas usando-se um Kit de Reação Pronta de Seqüênciação de Ciclo Terminador de Corante da PE Applied Biosystems. As reações de seqüênciação foram realizadas sobre um Sequenciador Automatizado ABI PRISM 377. Dados de seqüência foram coletados, foram editados e foram montados usando-se a Coleção ABI PRISM 377, software Factura e AutoAssembler da PE ABI.

Seqüências de DNA foram determinadas para porções de novas toxinas de gene oriundas dos seguintes isolados: PS66D3, PS177C8, PS177I8, PS33F1, PS157C1 (157C1-A), PS201Z, PS31F2 e PS185Y2. Es- tas seqüências de nucleotídeos são mostradas nas SEQ ID NOs. 5, 7, 9, 38, 33, 35, 36 e 37, respectivamente. Seqüências de polipeptídeos foram dedu- zidas para porções das novas toxinas solúveis, codificadas oriundas dos seguintes isolados: PS66D3, PS177C8, PS177I8, PS157C1 (toxina 157C1- A). Estas seqüências de nucleotídeos são mostradas nas SEQ ID NOs. 6, 8, 10 e 34, respectivamente.

Exemplo 5 - Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição (RFLP) de Toxinas Oriundas de Cepas de Bacillus thuringiensis O DNA celular total foi preparado a partir de várias cepas de Bacillus thuringiensis (B.t.) foi desenvolvido para uma densidade ótica de 0,5 - 0,8 em luz visível de 600 nm. DNA foi extraído usando-se o kit Qiagen Genomic-tip 500/G e Conjunto de Tampão de DNA Genômico de acordo com o protocolo para bactérias gram-positivas (Qiagen Inc.; Valencia, CA).

Hibridizações Southern padrão usando-se sondas 32P-marcadas foram usadas para identificar e caracterizar novos genes de toxina das pre- parações de DNA genômico totais. DNA genômico total preparado foi dige- rido com várias enzimas de restrição, foi eletroforado sobre um gel de aga- rose a 1%, e foi imobilizado sobre uma membrana de náilon de suporte usando-se métodos padrão (Maniatis e outros).

Fragmentos DNA ampliados por PCR de 1,0-1,1 kb de compri- mento foram purificados por gel para o uso como sondas. Cerca de 25 ng de cada fragmento de DNA foram usados como um modelo para a inicialização de síntese de DNA nascente usando-se fragmento de Klenow de polimerase I de DNA (New England Biolabs), iniciadores de hexanucleotídeo aleatórios (Boehringer Mannheim) e 32PdCTP.

Cada fragmento 32P-marcado serviu como uma sonda específica a sua mancha de DNA genômico correspondente. Hibridizações de DNA imobilizado com sondas 32P-marcadas foram realizadas em tampão aquoso padrão que consiste em 5X SSPE, solução de 5X Denhardt, SDS a 0,5%, 0,1 mg/ml a 65°C de um dia para o outro. Manchas ("blots") foram lavadas sob severidade moderada em 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 65°C e foram ex- postas a película. Dados de RFLP que mostram tiras de hibridização espe- cíficas contendo todas as partes do novo gene de interesse foram obtidos para cada cepa.

Em experiências separadas, sondas alternativas de genes MIS e WAR foram usadas para detectar novos genes de toxina em Southern blots de DNA genômico por auto-radiografia de 32P ou por métodos não radioati- vos usando-se o sistema de detecção e marcação de ácido nucléico por DIG (Boehringer Mannheim; Indianapolis, IN). Fragmentos de DNA cerca de 2,6 kpb (gene de toxina PS177C8 MIS; SEQ ID NO.7) e 1,3 kpb (gene de toxina PS177C8 WAR); SEQ ID NO. 11) de comprimento foram apliados por PCR a partir de plasmídio pMYC2450 usando-se iniciadores homólogos às ex- tremidades 5'e 3' de cada gene respectivo. pMYC2450 é um plasmídio re- combinante contendo PS177C8 MIS e WAR sobre um fragmento de Clal de cerca de 14 kpb em pHTBluell (um vetor de transporte nos dois sentido de E. coli/B. thuringiensis constituído de pBluescript S/K (Stratagene, La Jolla, CA] e a origem de replicação de um plasmídio de B.t. residente [D. Lereclus e outros, 1989; FEMS Microbiology Letters 60:211-218]). Estes fragmentos de DNA foram usados como sondas para MIS RFLP classes de A até N e WAR RFLP classes de A até L. Dados de RFLP na tabela 4 para classe O foram gerados usando-se fragmentos MIS de cerca de 1636 pb ampliados com iniciadores S1-633F (CACTCAAAAATGAAAGGGAAA; SEQ ID NO. 39) e S1-2269R (CCGGTTTTATTGATGCTAC; SEQ ID NO. 40). Dados de RFLP na tabela 5 para classe M foram gerados usando-se fragmentos WAR

de cerca de 495 pb ampliados com iniciadores S2-501F (AGAACAAI I I I IA GATAGGG; SEQ ID NO 41) e S2-995R (TCCCTAAAGCATCAGAAATA; SEQ ID NO. 42).

Fragmentos foram purificados por gel e cerca de 25 ng de cada fragmento de DNA foram aleatoriamente marcados com 32P para detecção radioativa ou cerca de 30 ng de cada fragmento foram aleatoriamente mar- cados com kit de DIG High Prime para detecção não ratioativa. Hibridização de DNA imobilizado com sondas 32P marcadas aleatoriamente foi realizada em condições de formamida padrão: formamida a 50%, 5X SSPE, solução de 5X Denhardt, SDS a 2%, 0,1 mg/ml de DNA de esperma sonicado a 42°C

de um dia para o outro. Manchas foram lavadas sob baixa severidade em 2X SSC, SDS a 0,1% a 42°C e foram expostas a película. Dados de RFLP que mostram tiras de DNA contendo todo ou parte do novo gene de interesse foram obtidos para cada cepa.

Dados de RFLP usando-se sondas MIS como discutido acima eram como se segue: i !

Dados de RFLP usando-se sondas WAR como discutido acima eram como se segue: Exemplo 6 - Caracterização e/ou Identificação de Toxinas WAR

Em uma modalidade ulterior da presente invenção, toxinas pes- ticidas podem ser caracterizadsa e/ou identificadas por seu nível de reativi- dade com anticorpos para toxinas pesticidas exemplificadas aqui. Em uma modalidade específica, anticorpos podem ser criados para toxinas WAR tal como a toxina obtenível a partir de PS177C8a. Outras toxinas WAR podem então ser identificadas e/ou caracterizadas por sua reatividade com os anti- corpos. Em uma modalidade preferida, os anticorpos são anticorpos policlo- nais. Neste exemplo, toxinas com similaridade maior a toxina 177C8a-WAR teria a reatividade maior com os anticorpos policlonais. Toxinas WAR com diversidade maior reagem com os anticorpos policlonais 177C8a, mas em uma extensão menor. Toxinas que imunoreagem com anticorpos policlonais criados para a toxina 177C8a WAR podem ser obtidos a partir dos, por exemplo, isolados designados PS177C8a, PS177I8, PS66D3, KB68B55-2, PS185Y2, KB53A49-4, KB68B51-2, PS31F2, PS74H3, PS28M, PS71G6, PS71G7, PS71I1, PS71N1, PS201JJ7, KB73, KB68B46-2, KB71A35-4, KB71A116-1, PS70B2, PS71C2, PS86D1, HD573B, PS33F1, PS67B3, PS205C, PS40C1, PS130A3, PS143A2, PS157C1, PS201Z, PS71G4, KB42A33-8, KB71A72-1, KB71A133-11, KB71A134-2, KB69A125-3, KB69A127-7, KB69A136-2, e KB71A20-4. Isolados PS31F2 e KB68B46-2 mostram reatividade de anticorpo muito fraca, sugerindo diversidade vanta- josa.

Exemplo 7 - Clonagem Molecular e Análise de Seqüência de DNA de Ge- nes de Proteína Inseticida Solúvel (MIS e WAR) Oridundos de Cepa de Ba- cillus thuringiensis PS205C DNA celular total foi preparado a partir de cepa de Bacillus thu- ringiensis PS205C densenvolvida para uma densidade ótica de 0,5-0,8 a 600 nm de luz visível em caldo de Luria Bertani (LB). DNA foi extraído usando-se o kit Qiagen Genomic-tip 500/G e Conjunto de Tampão de DNA

Genômico de acordo com o protocolo para bactérias gram-positivas (Qiagen Inc.; Valencia, CA). Uma biblioteca de cosmídio PS205C foi construída no vetor SuperCos (Stratagene) usando-se insertos de DNA celular total PS205C parcialmente digerido com Ndell. Células XL1-Blue (Stratagene) foram transfectadas com cosmídio embalados para se obter clones resis- tentes a carbenicilina e canamicina. 576 Colônias de cosmídios foram des- envolvidas em blocos de 96 cavidades em 1 ml de LB + carbenicilina (100 pg/ml) + canamicina (50 pg/ml) a 37°C por 18 horas e foram laminadas em réplica sobre filtros de náilon para a triagem por hibridização.

Um "amplicon" de PCR contendo cerca de 1000 pb do gene PS205 MIS foi ampliado a partir de DNA genômico PS205 usando-se inicia- dores SEQ ID NO. 3 e SEQ ID NO. 4 como descrito no exemplo 4. O frag- mento de DNA foi purificado por gel usando-se extração Qiaexll (Qiagen). A sonda foi radiomarcada com 32P-dCTP usando-se o kit Prime-lt II (Stratage- ne) e foi usada em solução de hibridização aquosa (6X SSPE, solução de 5X Denhardt, SDS a 0,1%, 0,1 mg/ml de DNA desnaturado) com os filtros de levantamento de colônia a 65°C por 16 horas. Os filtros de levantamento de colônia foram brevemente lavados 1X em 2X SSC/SDS a 0,1% a temperatu- ra ambiente seguido por duas lavagens adicionais por 10 minutos em 0,5X SSC/SDS a 0,1%. Os filtros foram então expostos a película de raios X por 5,5 horas. Um clone de cosmídio que hibridizou fortemente para dar a sonda foi selecionado para outra análise. Este clone de cosmídio foi confirmado conter o gene MIS por ampliação de PCR com iniciadores SEQ ID NO. 3 e SEQ ID NO. 4. Este clone de cosmídio foi designado como pMYC3105; cé- lulas XL-1 Blue MR de E. coli contendo pMYC3105 são designadas MR992.

Uma subcultura de MR992 foi depositada na coleção perma- nente da Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 USA em 4 de maio de 1999. O número de acesso é NRRL B-30124. Um clone de plasmídio trun- cado para PS205C foi também depositado em 4 de maio de 1999. O número de acesso é NRRL B-30122.

Para seqüenciar os genes PS205C MIS e WAR, inserções de transposon aleatórias em pMYC3105 foram geradas usando-se os protoco- los e Sistema de Inicialização de Genoma GPS-1 (New England Biolabs). O vetor de transposição de GPS2 que codifica resistência a clorofenicol foi escolhido para a seleção de cosmídios contendo inserções. Cosmídios pMYC3105 que adquiriram transposons foram identificados por transforma- ção e seleção de XL1-Blue MR de E. coli em meios contendo ampicilina, canamicina e cloranfenicol. Modelos de cosmídios foram preparados a partir de colônias individuais para o uso como modelos de seqüênciação usando- se plasmídio prep Multiscreen de 96 cavidades (Millipore). Os genes de to- xina MIS e WAR codificados por pMYC3105 foram seqüenciados com inici- adores GPS2 usando-se o sistema de seqüênciação automatizado ABI377 e o programa associado. Os genes MIS e WAR demonstraram estar localiza- dos perto um do outro em um óperon transcripcional aparente. As seqüên- cias de polipeptídeos deduzidas e nucleotídeos são designadas como novos SEQ ID NOs. 43-46.

Exemplo 8 - Clonagem Molecular e Análise de Seqüência de DNA de Ge- nes de Proteína Inseticida Solúvel (MIS e WAR) Oridundos de Cepa de Ba- cillus thuringiensis PS31F2 a. Preparação e Clonagem de DNA Genômico DNA celular foi preparado a partir da cepa de Bacillus thuringi- ensis PS31F2 desenvolvidas para uma densidade ótica de 0,5-0,8 a 600 nm de luz visível em caldo de Luria Bertani (LB). DNA foi extraído usando-se o kit Qiagen Genomic-tip 500/G ou Genomic-Tip 20/G e Conjunto de Tampão de DNA Genômico (Qiagen Inc.; Valencia, CA) de acordo com o protocolo para bactérias gram positivas.

Biblioteca lambda contendo DNA genômico total oriundo da cepa de Bacillus thuringensis PS31F2 foram preparadas a partir de DNA parcialmente digerido com Ndell. Digestos de restrição de Ndell parciais foram eletroforados sobre uma gel de agarose a 0,7% e a região do gel contendo fragmentos de DNA dentro da faixa de tamanho de 9-20 kpb foram extirpados do gel. DNA foi eletroeluído do fragmento de gel em tampão de 0,1X TAE a cerca de 30 V por uma hora e foi purificado usando-se colunas de Elutip-d (Schleichere Schuell; Keene, NH). DNA fracionado, purificado estava ligado em braços de Lambda- GEM-11 digerido por BamHI (Promega Corp., Madison, Wl). DNA ligado foi então embalado em fago lambda usando-se extrato de embalagem Giga- pack III Gold (Stratagene Corp., La Jolla, CA). Cepa de E. coli KW251 foi infectada com fago recombinante e foi laminada sobre placas de LB em aga- rose de topo de LB. Placas foram levantadas sobre filtros de nitrocelulose e foram preparadas por hibridização usando-se métodos padrão (Maniatis, e outros). Fragmentos de DNA de cerca de 1,1 kb (PS177C8 MIS) ou 700 pb (PS177C8 WAR) de comprimento foram ampliados por PCR a partir de plasmídio pMYC2450 e foram usados como as sondas. Fragmentos foram purificados por gel e cerca de 25 ng de cada fragmento de DNA foi aleatori- amente marcado com 32P-dCTP. Hibridização de DNA imobilizado com son- das PS177C8 32P-marcadas aleatoriamente foi realizada em condições de formamida padrão: formamida a 50%, 5X SSPE, solução de 5X Denhardt, SDS a 2%, 0,1 mg/ ml a 42°C de um dia para o outro. Manchas foram lava- das sob baixa severidade em 2X SSC, SDS a 0,1% a 42°C e foram expostas a película. Placas de hibridização foram isoladas das placas e foram sus- pensas em tampão de SM. Fago de DNA foi preparado usando-se fago de LambdaSorb adsorvente (Promega, Madison, Wl). PCR usando-se os inici- adores de oligonucleotídeo SEQ ID NO. 3 e SEQ ID NO. 4 foi realizado usando-se modelos de DNA de fago para verificar a presença do gene alvo.

As reações de PCR forneceram a tira de 1 kb esperada em ambas as amostras de DNA que confirmam que aqueles clones de fago contêm o ge- ne de interesse. Para a subclonagem, DNA de fago foi digerido com várias enzimas, foi fracionado sobre um gel de agarose a 1% e foi manchado para análise de Southern. Análise de Southern foi realizada como descrita acima.

Um fragmento de Hindlll de cerca de 8 kb de tamanho foi identificado que continha os genes de toxina PS31F2. Este fragmento foi purificado por gel e foi clonado para dar o sítio Hindlll de pBluescript (SK+); este clone de plas- mídio é designado pMYC2610. A cepa XL10 Gold [pMYC2610] de E. coli foi designada MR983.

Uma subcultura de MR983 foi depositada na coleção de sobre- nadante da Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 USA em 4 de maio de 1999. 0 número de acesso é NRRL B-30123.

b. Seqüènciacão de DNA O fragmento Hindlll pMYC2610 contendo os genes de toxina PS31F2 foi isolado por digestão de restrição, fracionação sobre um gel de agarose a 0,7% e purificação da matriz de gel usando-se um kit Qiaexll (Qi- agen Inc.; Valencia, CA). DNA de inserto purificado por gel foi então digeri- do separadamente com enzimas de restrição Alui, Msel ou Rsal e foi fracio- nado sobre um gel de agarose a 1%. Fragmentos de DNA entre 0,5 e 1,5 kb foram extirpados do gel e foram purificados usando-se o kit Qioexll. Frag- mentos recuperados estavam ligados em pBluescriptll digeridos por EcoRV e foram transformados em células XL10 Gold de E. coli. DNA de plasmídio foi preparado a partir de transformantes escolhidos aleatórios, foi digerido com Notl e Apal para verificar o tamanho do inserto e foi usado como mo- delos de seqüênciação com iniciadores homólogos às seqüências de vetor de plasmídio. Iniciador ambulante foi usado para completar a sequência.

Reações de seqüênciação foram realizadas usando-se kit de seqüênciação dRhodamine ou BigDye (ABI Prism/Perkin Elmer Applied Bi- osystems) e foram realizadas sobre seqüenciadores automatizados ABI 373 e 377. Dados foram analisados usando-se programas Factura, Autoassem- bler (ABI Prism) e Genetics Computer Group (Madison, Wl). Os genes MIS e WAR demonstraram estar localizados pertos um do outro em um óperon transcripcional aparente. O gene WAR é 5' em relação ao gene MIS, e os dois genes são separados por 4 bases de nucleotídeo.

As seqüências de nucleotídeos e seqüências de peptídeos de- duzidos para os novos genes MIS e WAR oriundos de PS31F2 são relata- das como novos SEQ ID NO. 47-50. c. Subclonaqem e Transformação de B. thurinaiensis Os genes de toxina PS31F2 foram subclonados sobre o frag- mento de HinDIlI de 8 kpb oriundos de pMYC2610 para dar o vetor de transporte de ida e vola E. co//7B.t., pHT370 (O. Arantes e D. Lereclus. 1991.

Gene 108: 115-119), para a expressão oriunda do promotor de Bacillus nati- vo. O construto de plasmídio resultante foi designado pMYC2615. DNA de plasmídio pMYC2415 foi preparado a partir de XLIOGold de E. coli recombi- nante para a transformação no hospedeiro de B.t. acristalífero, CryB (A.

Aronson, Purdue University, West Lafayette, IN), por eletroporação. A cepa CryB recombinante [pMYC2615] foi designada MR558.

Exemplo 9 - Clonagem Molecular e Análise de Seqüência de DNA de um Novo Gene de Toxina SUP Oriundo de Cepa de Bacillus thuriqiensis KB59A4-6 DNA celular total foi preparado a partir da cepa de Bacillus thu- rigiensis KB59A4-6 desenvolvido para uma densidade ótica de 0,5-0,8 a 600 nm de luz visível em caldo de Luria Bertani (LB). DNA foi extraído usando- se kit Qiagen Genomic-tip 500/G e Conjunto de Tampão de DNA Genômico de acordo com o protocolo para bactérias gram-positivas (Qiagen Inc.; Va- lencia, CA). DNA foi digerido com HinDIlI foi realizado sobre géis de agaro- se a 0,7% para análise de Southern blot por métodos padrão (Maniatis e outros). Um "amplicon" de PCR contendo o gene de tipo SUP (SEQ ID NO. 1) oriundo de DNA genômico Javelin-90 foi obtido por uso dos oligos "3A- atg (GCTCTAGAAGGAGGTAACTTATGAACAAGAATAATACTAAATTAAGC) (SEQ ID NO. 51) E "3A-Taa" (GGGGTACCTTACTTAATAGAGACATCG) (SEQ ID NO. 52). Este fragmento de DNA foi purificado por gel e foi marca- do com 32P-dCTP radioativo usando-se kit de Marcação de Iniciador Aleató- rio Prime-lt (Stratagene) para o uso como uma sonda. Hibridização de filtros de Southern blot foi realizada em uma solução de 6X SSPE, solução de 5X

Denhardt, SDS a 0,1%, 0,1 mg/ml de DNA desnaturado a 42°C de um dia para o outro em um banho de água de agitação. Os filtros foram subse- qüentemente lavados em 1X SSPE e SDS a 0,1% uma vez a 25°C seguido por duas lavagens adicionais a 37°C. Filtros hibridizados foram então ex- postos a película de raios X a -80°C. Um fragmento de HinDIlI de cerca de 1 kpb de DNA genômico KBS59A4-6 foi identificado que hibridizou para dar a sonda SUP Javelin 90.

Uma biblioteca lambda de DNA genômico KB59A4-6 foi cons- truída como se segue. DNA foi parcialmente digerido com Sau3A e foi fraci- onado pelo tamanho sobre géis de agarose. A região de gel contendo frag- mentos entre 9,0 e 23 kpb foi extirpada e DNA foi isolado por eletroeluição em tampão 0,1X TAE seguido por purificação sobre colunas Elutip-d (She- leicher e Schuell, Keene, NH). Insertos de DNA fracionados pelo tamanho estavam ligados em Lamda-Gem 11 digerido por BamHI (Promega) e fago recombinante foram embalados usando-se Extrato de Embalagem Giga- packlll (Stratagene). Fago foram laminados sobre células VCS257 de E. coli para a triagem por hibridização. Placas foram transferidas par filtros de nái- lon e foram secas sob vácuo a 80°C. Hibridização foi então realizada com a sonda de gene Sup Javelin 90 como descrita acima. Uma placa que deu um sinal positivo foi selecionada usando-se uma pipeta Pateur para se obter um tampãofplug"). O tampão foi encharcado durante a noite a temperatura am- biente em 1 ml de tampão de SM + 10 ul de CHI3. Preparações de DNA de fago de escala grande (Maniatis e outros) foram obtidas a partir de lisados líquidos de KW251 de E. coli foram infectadas com este fago. O gene de toxina KB59A4-6 foi subclonado para dar o vetor de transporte de ida e volta de B.thuringiensis de E. coli, pHT370 (O. Arantes e D. Lereclus. 1991. Gene 108: 115-119), sobre um fragmento de cerca de 5,5 kpb de Sacl/Xbal identificado por hibridização Southern. Este subclone de plasmídio foi designado pMYC2473. Células XL10-Gold de E. coli recombi- nante (Stratagene) contendo este constructo são desingadas MR993. O ge- ne de toxina inseticida foi seqüenciado por iniciador ambulante usando-se o plasmídio pMYC2473 e amplicons de PCR como modelos de DNA. Reações de seqüênciação foram realizadas usando-se Kit de Reação de Pronta de Seqüènciação de Ciclo Terminador de Corante da PE Applied Biosystems e foram realizadas sobre um Sequenciador Automatizado ABI PRISM 377.

Dados de seqüência foram analisados usando-se o programa PE ABI PRISM 377, Collection, Factura e Auto Assembler. A seqüência de DNA e seqüência de peptídeos deduzida da toxina KB59A4-6 são relatadas como novos SEQ ID NOs. 53 e 54, respectivaente.

Uma subcultura de MR993 foi depositada na coleção perma- nente da Patente Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 USA em 4 de maio de 1999. O número de acesso é NRRL B-30125.

Exemplo 10 - Bioensaios para Atividade Contra Lepidopteranos e Coleopte- ranos Atividade biológica das toxinas e dos isolados da presente in- venção pode ser confirmada usando-se procedimentos de bioensaio padrão.

Um tal ensaio é o ensaio de gorgulho de botão de flor-"bollworm" (Heliothis virescens [Fabricus] e Helivoverpa zea [Boddie]). Bioensaios de Lepidoptera foram conduzidos ou com aplicação de superfície a dieta de inseto artificial ou incorporação de dieta das amostras. Todos os insetos Lepidopterano foram testados a partir do estágio neonato até o segundo instar. Todos os ensaios foram conduzidos ou com dieta artificial de farinha de soja tostada ou dieta artificial de gramiola negra (BioServ, Frenchtown, NJ). A incorporação de dieta pode ser conduzida por misturação das amostras com dieta artificial em uma taxa de 6 ml de suspensão mais dieta de 45 ml. Depois do turbilhonamento, estas mistura é despejada para dentro de bandejas de plástico com cavidades de 3 ml compartimentalizadas (Nu- trend Container Corporation, Jacksonville, FL). Um material em branco aquoso não contendo nenhm B.t. serve como o controle. Larvas de primeiro instar (USDA-ARS, Stoneville, MS) são colocadas sobre a mistura de dieta.

Cavidades são então seladas com cobertura de Mylar (ClearLam Packaging, IL) usando-se um ferro de bordejamento, e vários furos foram feitos em cada cavidade para prover troca de gás. Larvas foram mantidas a 25°C por 6 dias em uma câmara de retenção 14:10 (claro:escuro). A mortalidade e retarda- mento de crescimento são registrados depois de 6 dias. O bioensaio pelo método de carregamento pelo topo utiliza a mesma amostra e preparações de dieta que listadas acima. As amostras são aplicadas à superfície da dieta de inseto. Em uma modalidade específi- ca, área de superfície variou de 0,3 a cerca de 0,8 cm2 dependendo do ta- manho de bandeja, placas de cultura de tecido de 96 cavidades foram usa- das além do formato listado acima. Após a aplicação, amostras são deixa- das secar ao ar antes da infestação de inseto. Um material em branco aquoso não contendo nenhum B.t. pode servir como o controle. Ovos são aplicados a cada cavidade tratada e foram então selados com cobertura de Mylar (ClearLam Packaging, IL) usando-se um ferro de bordejamento, e fu- ros foram feitos em cada cavidade para prover troca de gás. Bioensaios são mantidos a 25°C por 7 dias em um câmara de retenção de 14:10 (cla- ro:escuro) ou 28°C por 4 dias em uma câmara de retenção de 14:10 (cla- ro:escuro). A mortalidade e retardamento de crescimento são registrados no fim de cada bioensaio.

Um outro ensaio útil de acordo com a presente invenção é o ensaio de "rootworm de milho do oeste. Amostras podem ser bioanalisadas contra larvas de "rootworm" milho do oeste neonatas (Diabrotica virgifera virgifera) via carregamento pelo topo de amostra sobre uma dieta artificial à base de ágar em uma taxa de 160 ml/cm2. Dieta artificial pode ser distribuí- da em cavidades de 0,78 cm2 em cultura de tecido de 48 cavidades ou pla- cas similares e deixada endurecer. Depois que a dieta solidifica, amostras são distribuídas por pipeta sobre a superfície de dieta. Líquido em excesso é então evaporado a partir da superfície antes da transferência de aproxi- madamente três larvas neonatas por cavidade sobre a superfície de dieta por escova de cabelo de camelo. Para prevenir escape de inseto enquanto permitindo troca de gás, cavidades são seladas a quente com película de poliéster de punção de 2 mil (5,8 micra) com o adesivo 27HT (Oliver Pro- ducts Company, Grand Rapids, Michigan). Bioensaios são mantidos no es- curo a 25°C, e a mortalidade foi classificada depois de 4 dias.

Bioensaios análogos podem ser realizados por aqueles versa- dos na técnica para avaliar atividade contra outras pestes, tal como grami- ola negra (Agrotis ipsilon).

Resultados são mostrados na tabela 6.

Exemplo 11 - Resultados de Bioensaios de "Rootworm" de Milho do Oeste e Caracterização Ulterior das Toxinas Soluções líquidas concentradas, obtidas de acordo com a pre- sente invenção, foram testadas quanto a atividade contra "rootworm" de mi- lho do oeste (WCRW). Sobrenadantes oriundos dos seguintes isolados de- monstraram causar mortalidade contra WCRW: PS31F2, PS66D3, PS177I8, KB53A49-4, KB68B46-2, KB68B51-2, KB68B55-2, e PS177C8.

Sobrenadantes oriundos dos seguintes isolados foram demons- traram causar mortalidade contra WCRW: PS205A3, PS185V2, PS234E1, PS71G4, PS248N10, PS191A21, KB63B19-13, KB63B19-7, KB68B62-7, KB68B63-2, KB69A125-1, KB69A125-3, KB69A125-5, KB69A127-7, KB69A132-1, KB69B2-1, KB70B5-3, KB71A125-15, e KB71A35-6; foi con- firmado que esta atividade era instável quente. Além do mais, foi determina- do que os sobrenadantes dos seguintes isolados não reagiram (forneceu resultados de teste negativos) com o anticorpo WAR (ver, o exemplo 12), e não reagiram com as sondas MIS (SEQ ID NO. 31) e WAR (SEQ ID NO. 51): PS205A3, PS185V2, PS234E1, PS71G4, PS248N10, PS191A21, KB63B19-13, KB63B19-7, KB68B62-7, KB68B63-2, KB69A125-1, KB69A125-5, KB69A132-1, KB69B2-1, KB70B5-3, KB71A125-15, e KB71A35-6; os sobrenadantes de isolados KB69A125-3 e KB69A127-7 for- neceram resultados positivos.

Exemplo 12 - Cultivo de Clones 31F2 e Bioensaio de Toxinas 31F2 sobre "Rootworm"de Milho do Oeste (wCRW). MR983 de E. coli e a cepa de controle negativo MR948 (controle de vetor XL1-Blue de E. coli [pSupercros]); foram desenvolvidos em frascos providos de defletor fundo de 250 ml contendo 50 ml de meio de Caldo Ter- rific DIFCO. Culturas foram incubadas em agitador New Brunskwich que agitam a 250 RPM, 30°C por ~23 horas. Depois de 23 horas de amostras de incubação foram assepticamente tomadas para examinar as culturas sob o microscópio para checar quanto a presença de contaminantes. 30 ml de cultura foram distribuídas para dentro de um tubo de centrífuga de 50 ml e foram centrifugados em uma centrífuga Sorvall a 15.000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante 1Χ foi protegido e foi submetido para bioensaio contra wCRW. O pélete foi ressuspenso 5X com tampão de Tris a 10 mM, e foi so- nicada antes da submissão para bioensaio contra wCRW.

Cepa de B.t. MR558 e o controle negativo MR539 (controle de vetor cry de B.t. B[pHT Bluell]); foram desenvolvidos do mesmo modo ex- ceto quanto a omissão de glicerol do meio de Caldo Terrific. Péletes de cé- lula de B.t. foram resuspensos em água ao invés de tampão antes da soni- cação.

Ensaios para o clone de E. coli MR983 e clone de B. thuringien- sis MR558 contendo os genes de toxina 31F2 foram conduzidos usando-se o mesmo projeto experimental que no exemplo 10 para "rootworm" de milho do oeste com as seguintes exceções: Amostras de sobrenadantes foram carregadas pelo topo sobre a dieta em uma dose de ~ 160 ul/cm2. Amostras de péletes de B.t. celular a uma concentração de 5X foram carregadas pelo topo sobre a dieta a uma dose de -150 ul/cm2 para ambos os clones, e a -75, e em doses de -35 ul/cm2 para cada clone de B. thuringiensis MR558 (quantidade de toxina ativa desconhecida para qualquer clone). Cerca de 6- 8 larvas foram transferidas sobre a dieta imediatamente depois que a amos- tra evaporou. A placa de bioensaio foi selada com cobertura de Mylar usan- do-se um ferro de bordejamento e furos foram feitos acima de cada cavida- de para provê troca de gás. Tanto os clones MR983 quanto MR558 de- monstraram graus de bioatividade (mortalidade maior) contra "rootworm" de milho do oeste quando comparadas com os clones negativos à toxina MR948 e MR539. A tabela 7 apresenta os resultados que mostram a bioatividade de toxinas PS31F2 clonadas contra "rootworm" de milho do oeste.

Tabela 7 Exemplo 13 - Pestes Alvo As toxinas da presente invenção podem ser usadas, sozinhas ou em combinação com outras toxinas, para controlar uma ou mais pestes de não mamífero. Estas pestes podem ser, por exemplo, aquelas listadas na tabela 8. A atividade pode prontamente ser confirmada usando-se bioen- saios providos aqui, adaptações destes bioensaios, e/ou outros bioensaios bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

Exemplo 14 - Inserção de Genes de Toxina em Plantas Um aspecto da presente invenção é a transformação de plantas com genes que condificam a toxina inseticida da presente invenção. As plantas transformadas são resitentes ao ataque pela peste alvo.

Genes que codificam toxinas pesticidas, como revelados aqui, podem ser inseridos em células de planta usando-se uma variedade de téc- nicas que são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, um grande número de vetores de clonagem compreendendo um sisteam de replicação em E. coli e um marcador que permite que seleção para as células transformadas esteja disponível para a preparação para a inserção de genes estranhos em plantas superiores. Os vetores compreendem, por exemplo, pBR322, série pUC, espécie M13mp, pACYC184, etc. Correspondentemente, a seqüência que codifica a toxina de Bacillus pode ser inserida no vetor em um sítio de reação adequado. O plasmídio resultante é usado para a transformação em E. coli. As células de E. coli são cultivadas em um meio nutriente adequado, então são coletadas e são lisadas. O plasmídio é recuperado. Análise de seqüência, análise de restrição, eletroforese, e outros métodos bioquímicos- biológicos moleculares são em geral realizados como métodos de análise.

Depois de cada manipulação, a seqüência de DNA usada pode ser clivada e ligada à próxima seqüência de DNA. Cada seqüência de plasmídio pode ser clonada na mesma ou em outros plasmídios. Dependendo do método de inserção do genes desejados na planta, outras seqüências de DNA podem ser necessárias. Se, por exemplo, o plasmídio Ti ou Ri é usado para a transformação da célula de planta, então pelo menos a borda à direita, mas freqüentemente a borda à direita e à esquerda do T-DNA de plasmídio Ti ou Ri, tem de estar ligada como a região de flanqueamento dos genes a serem inseridos. O uso de T-DNA para a transformação de células de planta foi intensivamente pesquisado e suficientemente descrito na EP 120 516; Ho- ekema (1985) Em: The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B. V., Alblasserdam, capítulo 5, Fraley e outros, Crit. Ver. Plant Sei. 4:1-46; e An e outros (1985) EMBO J. 4:277-287.

Uma vez que o DNA inserido foi integrado no genoma, ele é re- lativamente estável lá e, por via regra, não sai novamente. Ele normalmente contém um marcador de seleção que confere sobre as células de planta transformadas resistência a um biocida ou a um antibiótico, tal como cana- micina, G 418, bleomicina, higromicina ou cloranfenicol, entre outros. Mar- cador individualmente empregado deve correspondentemente permitir a seleção de células transformadas ao invés de células que não contêm o DNA inserido.

Um grande número de técnica estão disponíveis para a inserção de DNA em uma célula de hospedeiro de planta. Aquelas técnicas incluem transformação com T-DNA usando-se Agrobacterium tumefaciens ou Agro- bacterium rhizogenes como agente de transformação, fusão, injeção, biolís- tico (bombardeamento de micropartículas) ou eletroporação bem como ou- tros métodos possíveis. Se Agrobacteria são usadas para a transformação, o DNA a ser inserido tem de ser clonado para dar plasmídios especiais, a saber ou para dar um vetor intermediário ou para dar um vetor binário. Os vetores intermediários podem ser integrados no plasmídio Ti ou Ri por re- combinação homóloga devido a seqüências que são homólogas a seqüên- cias no T-DNA. O plasmídio Ti ou Ri também compreende a região vir ne- cessária para a transferência do T-DNA. Vetores intermediários não podem replicar eles próprios nas Abrobacteria. O vetor intermediário pode ser transferido para dentro de Agrobacterium tumefaciens por meio de um plas- mídio auxiliar (conjugação). Vetores binários podem replicar eles próprios tanto em E. coli quanto em Agrobacteria. Eles compreendem um gene de marcador de seleção e um ligador ou poliligador que são modelados pelas regiões de borda de T-DNA a direita e a esquerda. Eles podem ser trans- formados diretamente para dentro de Agrobacteria (Holsters e outros [1978] Mol. Gen. Genet. 163: 181-187). A Agrobacterium usada como célula de hospedeiro é para compreender um plasmídio que porta uma região vir. A região vir é necessária para a transferência do T-DNA para dentro da célula de planta. T-DNA adicional pode ser contaminado. A bactéria assim transfo- rada é usada para a transformação de células de planta. Explantes de planta pode vantajosamente por cultivo com Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes para a transferência do DNA para dentro da cé- lula de platna. Plantas inteiras podem então ser regeneradas a partir de material de planta infectado (por exemplo, pedaços de folha, segmentos de talo, raízes, mas também protoplastos ou células de suspensão cultivadas) em um meio adequado, que pode conter antibióticos ou biocidas para sele- ção. As plantas assim obtidas podem então ser testadas quanto a presença do DNA inserido. Nenhuma das demandas especiais são feitas dos plasmí- dios no caso de injeção e eletroporação. É possível usar plasmídio comuns, tais como, por exemplo, derivados de pUC. Em transformação bioestática, DNA de plasmídio ou DNA linear pode ser empregado.

As células transformadas são regeneradas a partir de plantas morfologicamente normais do modo usual. Se um evento de transformação envolve uma célula de linha de germe, então o DNA inserido e característi- ca^ fenotípica(s) correspondente(s) serão transmitidas para plantas de pro- gênia. Tais plantas podem ser desenvolvidas no modo normal e cruzadas com plantas que têm os mesmos fatores hereditários transformados ou ou- tros fatores hereditários. Os híbridos resultantes individuais têm as proprie- dades fenotípicas correspondentes.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, plantas serão transformadas com genes em que o uso de códon foi otimizado para plantas. Ver, por exemplo, a patente U.S. no. 5.380.831. Também, vantajo- samente, plantas que codificam uma toxina truncada serão usadas. A toxina truncada tipicamente codificará cerca de 55% a cerca de 80% da toxina de comprimento total. Métodos para a criação de genes de Bacillus sintéticos para o uso em plantas são conhecidos na técnica.

Deve ser entendido que os exemplos e as concretizações des- critas aqui são para as finalidades ilustrativas apenas e que várias modifica- ções ou mudanças à luz das mesmas serão sugeridas para pessoas versa- das na técnica e devem estar incluídas dentro do espírito e campo de ação deste pedido e das reivindicações anexas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Nome(s) da Requerente: MYCOGEN CORPORATION

Rua: 5501 Oberlin Drive Cidade: San Diego Estado/Província: Califórnia País: Estados Unidos Código Postal/CEP: 92121 Número de telefone: (800) 745-7475 Número do fax: (619) 453-0142 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: NOVAS TOXINAS PESTICIDAS E SE- QUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICAM ESTAS TOXINAS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 54 (iv) ENDEREÇO DE CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: SALIWANCHIK, LLOYD 7 SALIWANCHIK (B) RUA: 2441 N.W. 41st STREET, SUITE A-1 (C) CIDADE: GAINESVILLE

(D) ESTADO: FL

(E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA (F) CEP: 32606-6669 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: DISQUETE (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível (C) SISTEMA DE OPERAÇÃO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Release #1.0, Versão# 1.30 (vi) DADOS DO PEDIDO ATUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DO ARQUIVAMENTO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US. 09/073.898 (B) DATA DO ARQUIVAMENTE: 5 de maio de 1998 (viii) INFORMAÇÃO DO PROCURADOR/AGENTE (A) NOME: SANDERS, JAY M. (B) NÚMERO DE REGISTRO: 39.355 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO DOCUMENTO: MA-708C2 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: 352-375-8100 (B) TELEFAX: 352-372-5800 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2375 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Jav90 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 1: ATGAACAAGA ATAATACTAA ATTAAGCACA AGAGCCTTAC CAAGTTTTAT TGATTATTTT 60 AATGGCATTT ATGGATTTGC CACTGGTATC AAAGACATTA TGAACATGAT TTTTAAAACG 120 GATACAGGTG GTGATCTAAC CCTAGACGAA ATTTTAAAGA ATCAGCAGTT ACTAAATGAT 180 ATTTCTGGTA AATTGGATGG GGTGAATGGA AGCTTAAATG ATCTTATCGC ACAGGGAAAC 240 TTAAATACAG AATTATCTAA GGAAATATTA AAAATTGCAA ATGAACAAAA TCAAGTTTTA 300 AATGATGTTA ATAACAAACT CGATGCGATA AATACGATGC TTCGGGTATA TCTACCTAAA 360 ATTACCTCTA TGTTGAGTGA TGTAATGAAA CAAAATTATG CGCTAAGTCT GCAAATAGAA 420 TACTTAAGTA AACAATTGCA AGAGATTTCT GATAAGTTGG ATATTATTAA TGTAAATGTA 480 CTTATTAACT CTACACTTAC TGAAATTACA CCTGCGTATC AAAGGATTAA ATATGTGAAC 540 GAAAAATTTG AGGAATTAAC TTTTGCTACA GAAACTAGTT CAAAAGTAAA AAAGGATGGC 600 TCTCCTGCAG ATATTCTTGA TGAGTTAACT GAGTTAACTG AACTAGCGAA AAGTGTAACA 660 AAAAATGATG TGGATGGTTT TGAATTTTAC CTTAATACAT TCCACGATGT AATGGTAGGA 720 AATAATTTAT TCGGGCGTTC AGCTTTAAAA ACTGCATCGG AATTAATTAC TAAAGAAAAT 780 GTGAAAACAA GTGGCAGTGA QGTCGGAAAT GTTTATAACT TCTTAATTGT ATTAACAGCT 840 CTGCAAGCAA AAGCTTTTCT TACTTTAACA ACATGCCGAA AATTATTAGG CTTAGCAGAT 900 ATTGATTATA CTTCTATTAT OAATGAACAT TTAAATAAOG AAAAAGAGGA ATTTAGAGTA 960 AACATCCTCC CTACACTTTC TAATACTTTT TCTAATCCTA ATTATGCAAA AGTTAAAGGA 1020 AGTGATGAAG ATGCAAAGAT GATTGTGGAA GCTAAACCAG GACATGCATT GATTGGGTTT 1080 GAAATTAGTA ATGATTCAAT TACAGTATTA AAAGTATATG AGGCTAAGCT AAAACAAAAT 1140 TATCAAGTCG ATAAGGATTC CTTATCGGAA GTTATTTATG GTGATATGGA TAAATTATTG 1200 TGCCCAGATC AATCTGAACA AATCTATTAT ACAAATAACA TAGTATTTCC AAATGAATAT 1260 GTAATTACTA AAATTGATTT CACTAAAAAA ATGAAAACTT TAAGATATGA GGTAACAGCG 1320 AATTTTTATG ATTCTTCTAC AGGAGAAATT GACTTAAATA AGAAAAAAGT AGAATCAAGT 1380 GAAGCGGAGT ATAGAACGTT AAGTGCTAAT GATGATGGGG TGTATATGCC GTTAGGTGTC 1440 ATCAGTGAAA CATTTTTGAC TCCGATTAAT GGGTTTGGCC TCCAAGCTGA TGAAAATTCA 1500 AGATTAATTA CTTTAACATG TAAATCATAT TTAAGAGAAC TACTGCTAGC AACAGACTTA 1560 AGCAATAAAG AAACTAAATT GATYGTCCCG CCAAGTGGTT TTATTAGCAA TATTGTAGAG 1620 AACGGGTCCA TAGAAGAGGA CAATTTAGAG CCGTGGAAAG CAAATAATAA GAATGCGTAT 1680 GTAGATCATA CAGGCGGAGT GAATGGAACT AAAGCTTTAT ATGTTCATAA GGACGGAGGA 1740 ATTTCACAAT TTATTGGAGA TAAGTTAAAA CCGAAAACTG AGTATGTAAT CCAATATACT 1800 GTTAAAGGAA AACCTTCTAT TCATTTAAAA GATGAAAATA CTGGATATAT TCATTATGAA 1B60 GATACAAATA ATAATTTAGA AGATTATCAA ACTATTAATA AACGTTTTAC TACAGGAACT 1920 GATTTAAAGG GAGTGTATTT AATTTTAAAA AGTCAAAATG GAGATGAAGC TTGGGGAGAT 1980 AACTTTATTA TTTTGGAAAT TAGTCCTTCT GAAAAGTTAT TAAGTCCAGA ATTAATTAAT 2 04 0 ACAAATAATT GGACGAGTAC GGGATCAACT AATATTAGCG GTAATACACT CACTCTTTAT 2100 CAGGGAGGAC GAGGGATTCT AAAACAAAAC CTTCAATTAG ATAGTTTTTC AACTTATAGA 2160 GTGTATTTTT CTGTGTCCGG AGATGCTAAT GTAAGGATTA GAAATTCTAG GGAAGTQTTA 2220 TTTGAAAAAA GATATATGAG CGGTGCTAAA GATGTTTCTG AAATGTTCAC TACAAAATTT 2280 GAGAAAGATA ACTTTTATAT AGAGCTTTCT CAAGGGAATA ATTTATATGG TGGTCCTATT 2340 GTACATTTTT ACGATGTCTC TATTAAGTAA CCCAA 2375 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 790 aminoácidos (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Jav90 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 2: Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe 1 5 10 15 Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp 20 25 30 Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu 35 40 45 Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys 50 55 60 Leu Asp Gly Vai Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gin Gly Aen 65 70 75 80 Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gin 85 90 95 Asn Gin Vai Leu Asn Asp Vai Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr 100 105 110 Met Leu Arg Vai Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Vai 115 120 125 Met Lys Gin Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gin Ile Glu Tyr Leu Ser Lys 130 135 140 Gin Leu Gin Glu Ile ser Aep Lys Leu Asp Ile Ile Asn Vai Asn Vai 145 150 155 160 Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gin Arg Ile 165 170 175 Lys Tyr Vai Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr 180 185 190 Ser Ser Lys Vai Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu 195 200 205 Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Vai Thr Lys Asn Asp Vai 210 215 220 Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Vai Met Vai Gly 225 230 235 240 Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile 245 250 255 Thr Lys Glu Asn Vai Lys Thr Ser Gly Ser Glu Vai Gly Asn Vai Tyr 260 265 270 Asn Phe Leu Ile Vai Leu Thr Ala Leu Gin Ala Lys Ala Phe Leu Thr 275 280 285 Leu Thr Thr Cys Arg Lye Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr 290 295 300 Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Vai 305 310 315 320 Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala 325 330 335 Lys Vai Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Vai Glu Ala Lys 340 345 350 Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr 355 360 365 Vai Leu Lys Vai Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gin Asn Tyr Gin Vai Asp 370 375 380 Lys Asp Ser Leu Ser Glu Vai Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu 3Θ5 390 395 400 Cys Pro Aep Gin Ser Glu Gin Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Vai Phe 405 410 415 Pro Asn Glu Tyr Vai Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys 420 425 430 Thr Leu Arg Tyr Glu Vai Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly 435 440 445 Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Vai Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr 450 455 460 Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Vai Tyr Met Pro Leu Gly Vai 465 470 475 480 Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gin Ala 485 490 495 Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lye Ser Tyr Leu Arg 500 505 510 Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile 515 520 525 Vai Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Vai Glu Asn Gly Ser Ile 530 535 540 Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Aen Lys Asn Ala Tyr 545 550 555 560 Vai Asp His Thr Gly Gly Vai Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Vai His 565 570 575 Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gin Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys 580 585 590 Thr Glu Tyr Vai Ile Gin Tyr Thr Vai Lys Gly Lys Pro Ser Ile His 595 600 605 Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn 610 615 620 Asn Leu Glu Asp Tyr Gin Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr 625 630 635 640 Asp Leu Lys Gly Vai Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gin Asn Gly Asp Glu 645 650 655 Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys 660 665 670 Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly 675 680 685 Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gin Gly Gly Arg 690 695 700 Gly Ile Leu Lys Gin Aen Leu Gin Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg 705 710 715 720 Vai Tyr Phe Ser Vai Ser Gly Aep Ala Aen Vai Arg Ile Arg Asn Ser 725 730 735 Arg Glu Vai Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Vai 740 745 750 Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu 755 760 765 Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Vai His Phe Tyr 770 775 780 Asp Vai Ser Ile Lys Pro 7B5 790 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: D NA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 3: GGRTTAMTTG GRTAYTATTT 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 4: ATATCKWAYA TTKGCATTTA 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1042 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: 66D3 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: TTAATTGGGT ACTATTTTAA AGQAAAAGAT TTTAATAATC TTACTATATT TGCTCCAACA 60 CGTGAGAATA CTCTTATTTA TGATTTAGAA ACAQCGAATT CTTTATTAGA TAAGCAACAA 120 CAAACCTATC AATCTATTCG TTGGATCGGT TTAATAAAAA GCAAAAAAGC TGGAGATTTT 180 ACCTTTCAAT TATCGGATGA TGAGCATGCT ATTATAGAAA TCGATGGGAA AGTTATTTCG 240 CAAAAAGGCC AAAAGAAACA AGTTGTTCAT TTAGAAAAAG ATAAATTAGT TCCCATCAAA 300 ATTGAATATC AATCTGATAA AGCGTTAAAC CCAGATAGTC AAATGTTTAA AGAATTGAAA 360 TTATTTAAAA TAAATAGTCA AAAACAATCT CAGCAAGTGC AACAAGACGA ATTGAGAAAT 420 CCTGAATTTG GTAAAGAAAA AACTCAAACA TATTTAAAGA AAGCATCGAA AAGCAGCCTG 480 TTTAGCAATA AAAGTAAACG AGATAXAGAT GAAGATATAG ATGAGGATAC AGATACAGAT 540 GGAGATGCCA TTCCTGATGT ATGGGAAGAA AATGGGTATA CCATCAAAGG AAGAGTAGCT 600 GTTAAATGGG ACGAAGGATI AGCTGATAAG GOATATAAAA AGTTTGTTTC CAATCCTTTT 660 AGACAGCACA CTGCTGGTGA CCCCTATAGT GACTATGAAA AGGCATCAAA AGATTTGGAT 720 TTATCTAATG CAAAAGAAAC ATTTAATCCA TTGGTGGCTG CTTTTCCAAG TGTCAATGTT 780 AGCTTGGAAA ATGTCACCAT ATCAAAAGAT GAAAATAAAA CTGCTGAAAT TGCGTCTACT 840 TCATCGAATA ATTGGTCCTA TACAAATACA GAGGGGGCAT CTATTGAAGC TGGAATTGGA 900 CCAGAAGGTT TGTTGTCTTT TGGAGTAAGT GCCAATTATC AACATTCTGA AACAGTGGCC 960 AAAGAGTGGG GTACAACTAA GGGAGACGCA ACACAATATA ATACAGCTTC AGCAGGATAT 1020 CTAAATGCCA ATGTACGATA TA 1Q42 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 347 AMINOÁCIDO

(B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: 66D3 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: Leu Ile Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lye Asp Phe Asn Asn Leu Thr Ile 15 10 15 Phe Ala Pro Thr Arg Glu Aen Thr Leu Ile Tyr Asp Leu Glu Thr Ala 20 25 30 Asn Ser Leu Leu Asp Lys Gin Gin Gin Thr Tyr Gin Ser Ile Arg Trp 35 40 45 Ile Gly Leu Ile Lys Ser Lys Lys Ala Gly Asp Phe Thr Phe Gin Leu 50 55 60 Ser Aep Asp Glu His Ala Ile Ile Glu Ile Asp Gly Lys Vai Ile Ser 65 70 75 80 Gin Lys Gly Gin Lys Lys Gin Vai Vai His Leu Glu Lys Asp Lys Leu 85 90 95 Vai Pro Ile Lys Ile Glu Tyr Gin Ser Asp Lys Ala Leu Asn Pro Asp 100 105 110 Ser Gin Met Phe Lys Glu Leu Lys Leu Phe Lys Ile Asn Ser Gin Lys 115 120 125 Gin Ser Gin Gin Vai Gin Gin Asp Glu Leu Arg Asn Pro Glu Phe Gly 130 135 140 Lys Glu Lys Thr Gin Thr Tyr Leu Lys Lys Ala Ser Lys Ser Ser Leu 145 150 155 160 Phe Ser Asn Lys Ser Lys Arg Asp Ile Asp Glu Asp Ile Asp Glu Asp 165 170 175 Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ala Ile Pro Asp Vai Trp Glu Glu Asn Gly 180 185 190 Tyr Thr Ile Lys Gly Arg Vai Ala Vai Lys Trp Aep Glu Gly Leu Ala 195 200 205 Asp Lye Gly Tyr Lys Lys Phe Vai Ser Asn Pro Phe Arg Gin His Thr 210 215 220 Ala Gly Asp Pro Tyr Ser Asp Tyr Glu Lys Ala Ser Lys Asp Leu Asp 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn Pro Leu Vai Ala Ala Phe Pro 245 250 255 Ser Vai Asn Vai Ser Leu Glu Aen Vai Thr Ile Ser Lys Asp Glu Asn 260 265 270 Lys Thr Ala Glu Ile Ala Ser Thr Ser Ser Asn Asn Trp Ser Tyr Thr 275 280 285 Asn Thr Glu Gly Ala Ser Ile Glu Ala Gly Ile Gly Pro Glu Gly Leu 290 295 300 Leu Ser Phe Gly Vai Ser Ala Asn Tyr Gin His Ser Glu Thr Vai Ala 305 310 315 320 Lys Glu Trp Gly Thr Thr Lys Gly Aap Ala Thr Gin Tyr Aen Thr Ala 325 330 335 Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Asn Vai Arg Tyr 340 345 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2645 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: PS177C8A (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 7: ATGAAGAAGA AGTTAGCAAG TGTTGTAACG TGTACGTTAT TAGCTCCTAT GTTTTTGAAT 60 GGAAATGTGA ATGCTGTTTA CGCAGACAGC AAAACAAATC AAATTTCTAC AACACAGAAA 120 AATCAACAGA AAGAGATGGA CCGAAAAGQA TTACTTGGGT ATTATTTCAA AGGAAAAGAT 180 TTTAGTAATC TTACTATGTT TGCACCGACA CGTGATAGTA CTCTTATTTA TGATCAACAA 240 ACAGCAAATA AACTATTAGA TAAAAAACAA CAAGAATATC AGTCTATTCG TTGGATTGGT 300 TTGATTCAGA GTAAAGAAAC GGGAGATTTC ACATTTAACT TATCTGAGGA TGAACAGGCA 3 60 ATTATAGAAA TCAATGGGAA AATTATTTCT AATAAAGGGA AAGAAAAGCA AGTTGTCCAT 420 TTAGAAAAAG GAAAATTAGT TCCAATCAAA ATAGAGTATC AATCAGATAC AAAATTTAAT 480 ATTGACAGTA AAACATTTAA AGAACTTAAA TTATTTAAAA TAGATAGTCA AAACCAACCC 540 CAGCAAGTCC AGCAAGATGA ACTGAGAAAT CCTGAATTTA ACAAGAAAGA ATCACAGGAA 600 TTCTTAGCGA AACCATCGAA AATAAATCTT TTCACTCAAA AAATGAAAAG GGAAATTGAT 660 GAAGACACGG ATACGGATGG GGACTCTATT CCTGACCTTT GGGAAGAAAA TGGGTATACG 720 ATTCAAAATA GAATCGCTGT AAAGTGGGAC GATTCTYTAG CAAGTAAAGG GTATACGAAA 780 TTTGTTTCAA ATCCGCTAGA AAGTCACACA GTTGGTGATC CTTATACAGA TTATGAAAAG 840 GCAGCAAGAG ACCTAGATTT GTCAAATGCA AAGGAAACGT TTAACCCATT GGTAGCTGCT SOO TTTCCAAGTG TGAATGTTAG TATGGAAAAG GTGATATTAT CACCAAATGA AAATTTATCC S60 AATAGTGTAG AGTCTCATTC ATCCACGAAT TGGTCTTATA CAAATACAGA AGGTGCTTCT 1020 GTTGAAGCGG GGATTGGACC AAAAGGTATT TCGTTCGGAG TTAGCGTAAA CTATCAACAC 1080 TCTGAAACAG TTGCACAAGA ATGGGGAACA TCTACAGGAA ATACTTCGCA ATTCAATACG 1140 GCTTCAGCGG GATATTTAAA TGCAAATGTT CGATATAACA ATGTAGGAAC TGGTGCCATG 1200 TACGATGTAA AACCTACAAC AAGTTTTGTA TTAAATAACG ATACTATCGC AACTATTACG 1260 GCGAAATCTA ATTCTACAQC CTTAAATATA TCTCCTGGAG AAAGTTACCC GAAAAAAGGA 1320 CAAAATGGAA TCGCAATAAC ATCAATGGAT GATTTTAATT CCCATCCGAT TACATTAAAT 1380 AAAAAACAAG TAGATAATCT GCTAAATAAT AAACCTATGA TGTTGGAAAC AAACCAAACA 1440 GATGGTGTTT ATAAGATAAA AGATACACAT GGAAATATAG TAACTGGCGG AGAATGGAAT 1500 GGTGTCATAC AACAAATCAA GGCTAAAACA GCGTCTATTA TTGTGGATGA TGGGGAACGT 1560 GTAGCAGAAA AACGTGTAGC GGCAAAAGAT TATGAAAATC CAGAAGATAA AACACCGTCT 1620 TTAACTTTAA AAGATGCCCT GAAGCTTTCA TATCCAGATG AAATAAAAGA AATAGAGGGA 1680 TTATTATATT ATAAAAACAA ACCGATATAC GAATCGAGCG TTATGACTTA CTTAGATGAA 1740 AATACAGCAA AAGAAGTGAC CAAACAATTA AATGATACCA CTGGGAAATT TAAAGATGTA 1800 AGT CATTXAT ATGATGTAAA ACTGACTCCA AAAATGAATG TTACAATCAA ATTGTCTATA 1860 CTTTATGATA ATGCTGAGTC TAATGATAAC TCAATTGGTA AATGGACAAA CACAAATATT 1920 GTTTCAGGTG GAAATAACGG AAAAAAACAA TATTCTTCTA ATAATCCGGA TGCTAATTTG 1980 ACATTAAATA CAGATGCTCA AGAAAAATTA AATAAAAATC GTACTATTAT ATAAGTTTAT 2040 ATATGAAGTC AGAAAAAAAC ACACAAIGTG AGATTACTAT AGATGGGGAG ATTTATCCGA 2100 TCACTACAAA AACAGTGAAT GTGAATAAAG ACAATTACAA AAGATTAGAT ATTATAGCTC 2160 ΑΤΑΑΓΑΤΑΑΑ AAGTAATCCA ATTTCTTCAA TTCATATTAA AACGAATGAT GAAATAACTT 2220 TATTTTGGGA TGATATTTCT ATAACAGATG TAGCATCAAT AAAACCGGAA AATTTAACAG 2280 ATTCAGAAAT TAAACAGATT TATAGTAGGT ATGGTATTAA GTTAGAAGAT GGAATCCTTA 2340 TTGATAAAAA AGGTGGGATT CATTATGGTG AATTTATTAA TGAAGCTAGT TTTAATATTG 2400 AACCATTGCA AAATTATGTG ACAAAATATA AAGTTACTTA TAGTAGTGAG TTAGGACAAA 2460 ACGTGAGTGA GACACTTGAA AGTGATAAAA TTTACAAGGA TGGGACAATT AAATTTGATT 2520 TTACAAAATA TAGTRAAAAT GAACAAGGAT TATTTTATGA CAGTGGATTA AATTGGGACT 2580 TTAAAATTAA TGCTATTACT TATGATGGTA AAGAGATGAA TGTTTTTCAT AGATATAATA 2640 AATAG 2645 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 881 AMINOÁCIDOS

(B) TIPO: AMINOÁCIDO

j (C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: PS177C8A (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: Met Lye Lys Lys Leu Ala Ser Vai Vai Thr Cys Thr Leu Leu Ala Pro 15 10 15 Met Phe Leu Asn Gly Asn Vai Aan Ala Vai Tyr Ala Asp Ser Lys Thr 20 25 30 Asn Gin Ile Ser Thr Thr Gin Lys Asn Gin Gin Lys Glu Met Asp Arg 35 40 45 Lys Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys Asp Phe Ser Asn Leu 50 55 60 Thr Met Phe Ala Pro Thr Arg Asp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Gin Gin 65 70 75 80 Thr Ala Asn Lys Leu Leu Asp Lys Lys Gin Gin Glu Tyr Gin Ser Ile 85 90 95 Arg Trp Ile Gly Leu Ile Gin Ser Lys Glu Thr Gly Asp Phe Thr Phe 100 105 110 Asn Leu Ser Glu Asp Glu Gin Ala Ile Ile Glu Ile Asn Gly Lys Ile 115 120 125 Ile Ser Asn Lys Gly Lys Glu Lys Gin Vai Vai His Leu Glu Lye Gly 130 135 140 Lys Leu Vai Pro Ile Lys Ile Glu Tyr Gin Ser Asp Thr Lys Phe Asn 145 150 155 160 Ile Asp Ser Lys Thr Phe Lys Glu Leu Lys Leu Phe Lys Ile Asp Ser 165 170 175 Gin Asn Gin Pro Gin Gin Vai Gin Gin Asp Glu Leu Arg Asn Pro Glu 180 185 190 Phe Asn Lys Lys Glu Ser Gin Glu Phe Leu Ala Lys Pro Ser Lys Ile 195 200 205 Asn Leu Phe Thr Gin Lys Met Lys Arg Glu Ile Asp Glu Asp Thr Asp 210 215 220 Thr Asp Gly Asp Ser Ile Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gly Tyr Thr 225 230 235 240 Ile Gin Asn Arg Ile Ala Vai Lys Trp Asp Asp Ser Leu Ala Ser Lys 245 250 255 Gly Tyr Thr Lys Phe Vai Ser Asn Pro Leu Glu Ser His Thr Vai Gly 260 265 270 Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Arg Asp Leu Asp Leu Ser 275 280 285 Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn Pro Leu Vai Ala Ala Phe Pro Ser Vai 290 295 300 Asn Vai Ser Met Glu Lys Vai Ile Leu Ser Pro Asn Glu Asn Leu Ser 305 310 315 320 Asn Ser Vai Glu Ser His Ser Ser Thr Asn Trp Ser Tyr Thr Asn Thr 325 330 335 Glu Gly Ala Ser Vai Glu Ala Gly Ile Gly Pro Lys Gly Ile Ser Phe 340 345 350 Gly Vai Ser Vai Asn Tyr Gin His Ser Glu Thr Vai Ala Gin Glu Trp 355 360 365 Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr Ser Gin Phe Asn Thr Ala Ser Ala Gly 370 375 380 Tyr Leu Asn Ala Asn Vai Arg Tyr Asn Asn Vai Gly Thr Gly Ala Ile 385 390 395 400 Tyr Asp Vai Lys Pro Thr Thr Ser Phe Vai Leu Asn Asn Asp Thr Ile 405 410 415 Ala Thr Ile Thr Ala Lys Ser Asn Ser Thr Ala Leu Asn lie Ser Pro 420 425 430 Gly Glu Ser Tyr Pro Lys Lys Gly Gin Asn Gly Ile Ala Ile Thr Ser 435 440 445 Met Asp Asp Phe Asn Ser His Pro Ile Thr Leu Asn Lys Lys Gin Vai 450 455 460 Asp Asn Leu Leu Asn Asn Lys Pro Met Met Leu Glu Thr Asn Gin Thr 465 470 475 480 Asp Gly Vai Tyr Lys Ile Lys Asp Thr His Gly Asn Ile Vai Thr Gly 485 490 495 Gly Glu Trp Asn Gly Vai Ile Gin Gin Ile Lys Ala Lys Thr Ala Ser 500 505 510 Ile Ile Vai Asp Asp Gly Glu Arg Vai Ala Glu Lys Arg Vai Ala Ala 515 520 525 Lys Asp Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Lys Thr Pro Ser Leu Thr Leu Lys 530 535 540 Asp Ala Leu Lys Leu Ser Tyr Pro Asp Glu Ile Lys Glu Ile Glu Gly 545 550 555 560 Leu Leu Tyr Tyr Lys Asn Lys Pro Ile Tyr Glu Ser Ser Vai Met Thr 565 570 575 Tyr Leu Asp Glu Asn Thr Ala Lys Glu Vai Thr Lys Gin Leu Asn Asp 580 585 590 Thr Thr Gly Lys Phe Lys Asp Vai Ser His Leu Tyr Asp Vai Lys Leu 595 600 605 Thr Pro Lys Met Asn Vai Thr Ile Lys Leu Ser Ile Leu Tyr Asp Asn 610 615 620 Ala Glu Ser Asn Asp Aen Ser Ile Gly Lys Trp Thr Asn Thr Asn Ile 625 630 635 640 Vai Ser Gly Gly Asn Asn Gly Lys Lys Gin Tyr Ser Ser Asn Asn Pro 645 650 655 Asp Ala Asn Leu Thr Leu Asn Thr Asp Ala Gin Glu Lye Leu Asn Lys 660 665 670 Asn Arg Asp Tyr Tyr Ile Ser Leu Tyr Met Lys Ser Glu Lys Asn Thr 675 680 685 Gin Cys Glu Ile Thr Ile Asp Gly Glu Ile Tyr Pro Ile Thr Thr Lys 690 695 700 Thr Vai Asn Vai Asn Lye Asp Asn Tyr Lys Arg Leu Aep Ile Ile Ala 705 710 715 720 His Asn Ile Lys Ser Asn Pro Ile Ser Ser Ile His Ile Lys Thr Asn 725 730 735 Asp Glu Ile Thr Leu Phe Trp Asp Asp Ile Ser Ile Thr Asp Vai Ala 740 745 750 Ser Ile Lys Pro Glu Asn Leu Thr Asp Ser Glu lie Lys Gin Ile Tyr 755 760 765 Ser Arg Tyr Gly Ile Lys Leu Glu Asp Gly Ile Leu Ile Asp Lys Lys 770 775 780 Gly Gly Ile His Tyr Gly Glu Phe Ile Asn Glu Ala Ser Phe Asn Ile 785 790 795 800 Glu Pro Leu Gin Asn Tyr Vai Thr Lys Tyr Lys Vai Thr Tyr Ser Ser 805 810 815 Glu Leu Gly Gin Asn Vai Ser Asp Thr Leu Glu Ser Asp Lys Ile Tyr 820 B25 830 Lys Asp Gly Thr Ile Lys Phe Asp Phe Thr Lys Tyr Ser Xaa Asn Glu 835 840 845 Gin Gly Leu Phe Tyr Asp Ser Gly Leu Asn Trp Aep Phe Lys Ile Asn 850 855 860 Ala Ile Thr Tyr Asp Gly Lye Glu Met Asn Vai Phe His Arg Tyr Asn 865 870 875 880 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1022 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: 17718 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 9: TGGATTAATT GGGTATTATT TCAAAGGAAA AGATTTTAAT AATCTTACTA TGTTTGCACC 60 GACACGTGAT AATACCCTTA TGTATGACCA ACAAACAGCG AATGCATTAT TAGATAAAAA 120 ACAACAAGAA TATCAGTCCA TTCGTTGGAT TGGTTTGATT CAGAGTAAAG AAACGGGCGA 180 TTTCACATTT AACTTATCAA AGGATGAACA GGCAATTATA GAAATCGATG GGAAAATCAT 240 TTCTAATAAA GQGAAAGAAA AGCAAGTTGT CCATTTAGAA AAAGAAAAAT TAGTTCCAAT 300 CAAAATAGAG TATCAATCAG ATACGAAATT TAATATTGAT AGTAAAACAT TTAAAGAACT 360 TAAATTATTT AAAATAGATA GTCAAAACCA ATCTCAACAA GTTCAACTGA GAAACCCTGA 420 ATTTAACAAA AAAGAATCAC AGGAATTTTT AGCAAAAGCA TCAAAAACAA ACCTTTTTAA 480 GCAAAAAATG AAAAGAGATA TTGATGAAGA TACGGATACA GATGGAGACT CCATTCCTGA 540 TCTTTGGGAA GAAAATGGGT ACACGATTCA AAATAAAGTT GCTGTCAAAT GGGATGATTC 600 GCTAGCAAGT AAGGGATATA CAAAATTTGT TTCGAATCCA TTAGACAGCC ACACAGTTGG 660 CGATCCCTAT ACTGATTATG AAAAGGCCGC AAGGGATTTA GATTTATCAA ATGCAAAGGA 720 AACGTTCAAC CCATTGGTAG CTGCTTTYCC AAGTGTGAAT GTTAGTATGG AAAAGGTGAT 780 ATTATCACCA AATGAAAATT TATCCAATAG TGTAGAGTCT CATTCATCCA CGAATTGGTC 840 TTATACGAAT ACAGAAGGAG CTTCCATTGA AGCTGGTGGC GGTCCATTAG GCCTTTCTTT 900 TGGAGTGAGT GTTAATTATC AACACTCTGA AACAGTTGCA CAAGAATGGG GAACATCTAC 960 AGGAAATACT TCACAATTCA ATACGGCTTC AGCGGGATAT TTAAATGCCA ATATACGATA 1020 TA 1022 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 340 aminoácidos (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: 17718 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: Gly Leu Ile Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys Asp Phe Asn Asn Leu Thr 15 10 15 Met Phe Ala Pro Thr Arg Asp Asn Thr Leu Met Tyr Asp Gin Gin Thr 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Asp Lys Lys Gin Gin Glu Tyr Gin Ser Ile Arg 35 40 45 Trp Ile Gly Leu Ile Gin Ser Lys Glu Thr Gly Asp Phe Thr Phe Asn 50 55 60 Leu Ser Lys Asp Glu Gin Ala Ile Ile Glu Ile Asp Gly Lys Ile Ile 65 70 75 80 Ser Asn Lys Gly Lys Glu Lys Gin Vai Vai Hls Leu Glu Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Vai Pro Ile Lys Ile Glu Tyr Gin Ser Asp Thr Lys Phe Asn Ile 100 105 110 Asp Ser Lys Thr Phe Lys Glu Leu Lys Leu Phe Lys Ile Asp Ser Gin 115 120 125 Asn Gin Ser Gin Gin Vai Gin Leu Arg Asn Pro Glu Phe Asn Lys Lye 130 135 140 Glu Ser Gin Glu Phe Leu Ala Lys Ala Ser Lye Thr Asn Leu Phe Lys 145 150 155 160 Gin Lys Met Lys Arg Asp Ile Asp Glu Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp 165 170 175 Ser Ile Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gly Tyr Thr Ile Gin Asn Lye 180 185 190 Vai Ala Vai Lys Trp Asp Asp Ser Leu Ala Ser Lys Gly Tyr Thr Lys 155 200 205 Phe Vai Ser Asn Pro Leu Asp Ser His Thr Vai Gly Asp Pro Tyr Thr 210 215 220 Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Arg Asp Leu Asp Leu Ser Asn Ala Lys Glu 225 230 235 240 Thr Phe Asn Pro Leu Vai Ala Ala Xaa Pro Ser Vai Asn Vai Ser Met 245 250 255 Glu Lys Vai Ile Leu Ser Pro Asn Glu Asn Leu Ser Asn Ser Vai Glu 250 265 270 Ser His Ser Ser Thr Asn Trp Ser Tyr Thr Asn Thr Glu Gly Ala Ser 275 280 285 Ile Glu Ala Gly Gly Gly Pro Leu Gly Leu Ser Phe Gly Vai Ser Vai 290 295 300 Asn Tyr Gin Híb Ser Glu Thr Vai Ala Gin Glu Trp Gly Thr Ser Thr 305 310 315 320 Gly Asn Thr Ser Gin Phe Asn Thr Ala Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala 325 330 335 Asn Ile Arg Tyr 340 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1341 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: PS177C8a (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 11: ATGTTTATGG TTTCTAAAAA ATTACAAGTA GTTACTAAAA CTGTATTGCT TAGTACAGTT 60 TTCTCTATAT CTTTATTAAA TAATGAAGTG ATAAAAOCTG AACAATTAAA TATAAATTCT 120 CAAAGTAAAT ATACTAACTT GCAAAATCTA AAAATCACTG ACAAGGTAGA GGATTTTAAA 180 GAAGATAAGG AAAAAGCGAA AGAATGGGGG AAAGAAAAAG AAAAAGAGTG GAAACTAACT 240 GCTACTQAAA AAGGAAAAAT GAATAATTTT TTAGATAATA AAAATGATAT AAAGACAAAT 300 TATAAAGAAA TTACTTTTTC TATGGCAGGC TCATTTGAAG ATGAAATAAA AGATTTAAAA 360 GAAATTGATA AGATGTTTGA TAAAACCAAT CTATCAAATT CTATTATCAC CTATAAAAAT 420 GTSGAACCGA CAACAATTGG ATTTAATAAA TCTTTAACAG AAGGTAATAC GATTAATTCT 480 GATGCAATGG CACAGTTTAA AGAACAATTT TTAGATAGGG ATATTAAGTT TGATAGTTAT 540 CTAGATACGC ATTTAACTGC TCAACAAGTT TCCAGTAAAG AAAGAGTTAT TTTGAAGGTT 600 ACGGTTCCGA GTGGGAAAGG TTCTACTACT CCAACAAAAG CAGGTGTCAT TTTAAATAAT 660 AGTGAATACA AAATGCTCAT TGATAATGGG TATATGGTCC ATGTAGATAA GGTATCAAAA 720 GTGGTGAAAA AAGGGGTGGA GTGCTTACAA ATTGAAGGGA CTTTAAAAAA GAGTCTTGAC 780 TTTAAAAATG ATATAAATGC TGAAGCGCAT AGCTGGGGTA TGAAGAATTA TGAAGAGTGG 840 GCTAAAGATT TAACCGATTC GCAAAGGGAA GCTTTAGATG GGTATGCTAG GCAAGATTAT 900 AAAGAAATCA ATAATTATTT AA3AAATCAA GGCGGAAGTG GAAATGAAAA ACTAGATGCT 980 CAAATAAAAA ATATTTCTGA TGCTTTAGGG AAGAAACCAA TACCGGAAAA TATTACTGTG 1020 TATAGATGGT GTGGCATGCC GGAATTTGGT TATCAAATTA GTGATCCGTT ACCTTCTTTA 1080 AAAGATTTTG AAGAACAATT TTTAAATACA ATCAAAGAAG ACAAAGGATA TATGAGTACA 1140 AGCTTATCGA GTGAACGTCT TGCAGCTTTT GGATCTAGAA AAATTATATT ACGATTACAA 1200 GTTCCGAAAG GAAGTACGGG TGCGTATTTA AGTGCCATTG GTGGATTTGC AAGTGAAAAA 1260 GAGATCCTAC TTGATAAAGA TAGTAAATAT CATATTGATA AAGTAACAGA GGTAATTATT 1320 AAGGTGTTAA GCGATATGTA G 1341 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 446 aminoácidos (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: PS177C8a (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12: Met Phe Met Vai Ser Lye Lye Leu Gin Vai Vai Thr Lye Thr Vai Leu 15 10 15 Leu Ser Thr Vai Phe Ser Ile Ser Leu Leu Asn Asn Glu Vai Xle Lye 20 25 30 Ala Glu Gin Leu Aen Ile Asn Ser Gin Ser Lys Tyr Thr Asn Leu Gin 35 40 45 Asn Leu Lys Ile Thr Asp Lys Vai Glu Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu 50 55 60 Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys Glu Lys Glu Lys Glu Trp Lys Leu Thr 65 70 75 80 Ala Thr Glu Lys Gly Lys Met Asn Asn Phe Leu Asp Asn Lys Asn Asp 85 90 95 Ile Lys Thr Asn Tyr Lys Glu Ile Thr Phe Ser Met Ala Gly Ser Phe 100 105 110 Glu Aep Glu Ile Lys Asp Leu Lys Glu Ile Asp Lys Met Phe Asp Lys 115 120 125 Thr Aen Leu Ser Asn Ser Ile Ile Thr Tyr Lys Asn Vai Glu Pro Thr 130 135 140 Thr Ile Gly Phe Asn Lys Ser Leu Thr Glu Gly Asn Thr Ile Aen Ser 145 150 155 ISO

Asp Ala Met Ala Gin Phe Lys Glu Gin Phe Leu Asp Arg Asp Ile Lys 165 170 175 Phe Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His Leu Thr Ala Gin Gin Vai Ser Ser 180 185 190 Lys Glu Arg Vai Ile Leu Lys Vai Thr Vai Pro Ser Gly Lys Gly Ser 195 200 205 Thr Thr Pro Thr Lys Ala Gly Vai Ile Leu Asn Asn Ser Glu Tyr Lys 210 215 220 Met Leu Ile Asp Asn Gly Tyr Met Vai His Vai Asp Lys Vai Ser Lys 225 230 235 240 Vai Vai Lys Lys Gly Vai Glu Cys Leu Gin Ile Glu Gly Thr Leu Lys 245 250 255 Lys Ser Leu Asp Phe Lys Asn Asp Ile Asn Ala Glu Ala His Ser Trp 260 265 270 Gly Met Lys Asn Tyr Glu Glu Trp Ala Lys Asp Leu Thr Asp Ser Qln 275 280 2Θ5 Arg Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala Arg Gin Asp Tyr Lys Glu Ile Asn 290 295 300 Asn Tyr Leu Arg Asn Gin Gly Gly Ser Gly Asn Glu Lys Leu Asp Ala 305 310 315 320 Gin Ile Lys Asn Ile Ser Asp Ala Leu Gly Lys Lys Pro Ile Pro Glu 325 330 335 Asn Ile Thr Vai Tyr Arg Trp Cys Gly Met Pro Glu Phe Gly Tyr Gin 340 345 350 Ile Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys Asp Phe Glu Glu Gin Phe Leu 355 360 365 Aen Thr Ile Lys Glu Asp Lys Gly Tyr Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser 370 375 380 Glu Arg Leu Ala Ala Phe Gly Ser Arg Lys Ile Ile Leu Arg Leu Gin 385 390 395 400 val Pro Lys Gly Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Ser Ala Ile Gly Gly Phe 405 410 415 Ala Ser Glu Lys Glu Ile Leu Leu Asp Lys Asp Ser Lys Tyr His Ile 420 425 430 Asp Lys Vai Thr Glu Vai Ile Ile Lys Vai Leu Ser Asp Met 435 440 445 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: D NA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: GCTGATGAAC CATTTAATGC C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: CTCTTTAAAG TAGATACTAA GC 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15: GATGAGAACT TATCAAATAG TATC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: CGAATTCTTT ATTAGATAAG CAACAACAAA CCT 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 17: GTTATTTCGC AAAAAGGCCA AAAG 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18: GAATATCAAT CTGATAAAGC GTTAAACCCA G 31 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 19: GCAGCYTGTT TAGCAATAAA AGT 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: D NA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 20: CAAAGGAAGA GTAGCTGTTA 2 0 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 21: CAATGTTAGC TTGGAAAATG TCACC 25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 22: GCTTAGTATC TACTTTAAAG AG 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 23: GATACTATTT GATAAGTTCT CATC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 24: CTTTTGGCCT TTTTGCGAAA TAAC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 25: CTGGGTTTAA CGCTTTATCA GATTGATATTC 31 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 26: ACTTTTATTG CTAAACARGC TGC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 27: TAACAGCTAC TCTTCCTTTG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 28: GGTGACATTT TCCAAGCTAA CATTG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 29: CCAGTCCAAT GAACCTCTTA C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 30: AGGGAACAAA CCTTCCCAAC C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 31: CARMTAKTAA MTAGGGATAG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 32: AGYTTCTATC GAAGCTGGGR ST 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1035 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 33: gggttaattg ggtattattt taaagggaaa gattttaata atctgactat gtttgcacca 60 ACCATAAATA ATACGCTTAT TTATGATCGG CAAACAGCAG ATACACTATT AAATAAGCAG 120 CAACAAGAGT TCAATTCTAT TCGATGGATT GGTTTAATAC AAAGTAAAGA AACAGGTGAC 180 TTTACATTCC AATTATCAGA TGATAAAAAT GCCATCATTG AAATAGATGG AAAAGTTGTT 240 TCTCGTAGAG GAGAAGATAA ACAAACTATC CATTTAGAAA AAGGAAAGAT GGTTCCAATC 300 AAAATTGAGT ACCAGTCCAA TGAACCTCTT ACTGTAGATA GTAAAGTATT TAACGATCTT 360 AAACTATTTA AAATAGATGG TCATAATCAA TCGCATCAAA TACAGCAAGA TGATTTGAAA 420 ATCCTGAATT TAATAAAAAG GAAACGAAAG AGCTTTTATC AAAAACAGCA AAAAGAACCT 480 TTTCTCTTCA AAACGGGQTT GAGAAGCGAT GAGGATGATG ATCTAGGATA CAGATGGTGA 540 TAGCATTCCT GGATAATTGG GAAATGAATG GATATACCAT TCAAACGAAA AATGGCAGTC 600 AAATGGGATG ATTCATTTGC AGAAAAAGGA TATACAAAAT TTGTTTCGAA TCCATATGAA 660 GCCCATACAG CAGGAGATCC TTATACCGAT TATGAAAAAG CAGCAAAAGA TATTCCTTTA 720 TCGAACGCAA AAGAAGCCTT TAATCCTCTT GTAGCTGCTT TTCCATCTGT CAATGTAGGA 780 TTAGAAAAAG TAGTAATTTC TAAAAATGAG GATATGAGTC AGGGTGTATC ATCCAGCACT 840 TCGAATAGTG CCTCTAATAC AAATTCAATT GGTGTTACCG TAGATGCTGG TTGGGAAGGT 900 TTGTTCCCTA AATTTGGTAT TTCAACTAAT TATCAAAACA CATGGACCAC TGCACAAGAA 960 TGGGGCTCTT CTAAAGAAGA TTCTACCCAT ATAAATGGAG CACAATCAGC CTTTTTAAAT 1020 GCAAATGTAC GATAT 1035 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 345 aminoácidos (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 34: Gly Leu Ile Gly Tyr Tyr Phe Lya Gly Lys Asp Phe Asn Asn Leu Thr 15 10 15 Met Phe Ala Pro Thr Ile Asn Asn Thr Leu Ile Tyr Asp Arg Gin Thr 20 25 30 Ala Asp Thr Leu Leu Asn Lys Gin Gin Gin Glu Phe Asn Ser Ile Arg 35 40 45 Trp Ile Gly Leu Ile Gin Ser Lys Glu Thr Gly Asp Phe Thr Phe Gin 50 55 60 Leu Ser Asp Aep Lys Asn Ala Ile Ile Glu Ile Asp Gly Lys Vai Vai 65 70 75 80 Ser Arg Arg Gly Glu Asp Lys Gin Thr Ile His Leu Glu Lys Gly Lys 85 90 95 Met Vai Pro Ile Lys Ile Glu Tyr Gin Ser Asn Glu Pro Leu Thr Vai 100 105 110 Asp Ser Lys Vai Phe Asn Aep Leu Lys Leu Phe Lys Ile Asp Gly His 115 120 125 Asn Gin Ser His Gin Ile Gin Gin Asp Asp Leu Lys Ile Leu Asn Leu 130 13S 140 Ile Lys Arg Lys Arg Lys Ser Phe Tyr Gin Lys Gin Gin Lys Glu Pro 145 150 155 160 Phe Leu Phe Lys Thr Gly Leu Arg Ser Asp Glu Asp Asp Asp Leu Gly 165 170 175 Tyr Arg Trp Xaa Xaa His Ser Trp Ile Ile Gly Lys Xaa Met Asp Ile 180 185 190 Pro Phe Lys Arg Lys Met Ala Vai Lys Trp Asp Asp Ser Phe Ala Glu 195 200 205 Lys Gly Tyr Thr Lys Phe Vai Ser Asn Pro Tyr Glu Ala His Thr Ala 210 215 220 Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Lys Asp Ile Pro Leu 225 230 235 240 Ser Asn Ala Lys Glu Ala Phe Asn Pro Leu Vai Ala Ala Phe Pro Ser 245 250 255 Vai Asn Vai Gly Leu Glu Lys Vai Vai Ile Ser Lys Asn Glu Asp Met 260 265 270 Ser Gin Gly Vai Ser Ser Ser Thr Ser Aen Ser Ala Ser Asn Tbr Aen 275 280 285 Ser Ile Gly Vai Thr Vai Asp Ala Gly Trp Glu Gly Leu Phe Pro Lye 290 295 300 Phe Gly Ile Ser Thr Asn Tyr Gin Asn Thr Trp Thr Thr Ala Gin Glu 305 310 315 320 Trp Gly Ser Ser Lys Glu Aep Ser Thr His Ile Asn Gly Ala Gin Ser 325 330 335 Ala Phe Leu Asn Ala Asn Vai Arg Tyr 340 345 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 35: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1037 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO. ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 35: GGGTTAATTG GGTATTATTT TAAAGGGAAA GATTTTAATA ATCTGACTAT GTTTGCACCA 60 ACCATAAATA ATACGCTTAT TTATGATCGG CAAACAGCAG ATACACTATT AAATAAGCAG 120 CAACAAGAGT TCAATTCTAT TCGATGGATT GGTTTAATAC AAAGTAAAGA AACAGGTOAC 180 TTTACATTCC AATTATCAGA TGATAAAAAT GCCATCATTG AAATAGATGG AAAAGTTGTT 240 TCTCGTAGAG GAGAAGATAA ACAAACTATC CATTTAGAAA AAGGAAAGAT GGTTCCAATC 300 AAAATTGAGT ACCAGTCCAA TGAACCTCTT ACTGTAGATA GTAAAGTATT TAACGATCTT 360 AAACTATTTA AAATAGATGG TCATAATCAA TCGCATCAAA TACAGCAAGA TGATTTGAAA 420 AATCCTGAAT TTAATAAAAA AGAAACGAAA GAGCTTTTAT CAAAAACAGC AAAAAGRAAC 480 CTTTTCTCTT CAAACGRRGT KGAGAAGCGA TGAGGATGAT RATCYTAGAT ACAGGTGGKG 540 ATAGCATTCC YKGATAATTG GGGAAATGAA WGGRTATACC ATTCAACSGA AAAATGGSAG 600 TCAAATGGGA TGATTCATTT GCGGAAAAAG GATATACAAA ATTTGTTTCG AATCCATATG 660 AAGCCCATAC AGCAGGAGAT CCTTATACCG ATTATGAAAA AGCAGCAAAA GATATTCCTT 720 TATCGAACGC AAAAGAAGCC TTTAATCCTC TTGTAGCTGC TTTTCCATCT GTCAATGTAG 780 GATTAGAAAA AGTAGTAATT TCTAAAAATG AGGATATGAG TCAGGGTGTA TCATCCAGCA 840 CTTCGAATAG TGCCTCTAAT ACAAATTCAA TTGGTGTTAC CGTAGATGCT GGTTGGGAAG 900 GTTTGTTCCC TAAATTTGGT ATTTCAACTA ATTATCAAAA CACATGGACC ACTGCACAAG 960 AATGGGGCTC TTCTAAAGAA GATTCTACCC ATATAAATGG AGCACAATCA GCCTTTTTAA 1020 ATGCAAATGT ACGATAT 1037 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 36: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1048 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 36: TGGGTTAATT GGGTATTATT TTAAAGGGCA AGAGUTAAT CATCTTACTT TGTTCGCACC 60 AACACGTGAT AATACCCTTA TTTATGATCA ACAAACAGCG AATTCCTTAT TAGATACCAA 120 GCAACAAGAA TATCAATCTA TTCGCTGGAT TGGTTTAATT CAAAGTAAAG AAACGGGTGA 180 TTTCACATTT AACTTATCAG ATGATCAACA TGCAATTATA GAAATC3AT3 GCAAAATCAT 240 TTCGCATAAA GGACAGAATA AACAAGTTGT TCACTTAGAA AAAGGAAAGT TAOTCCCGAT 300 AAAAATTGAG TATCAATCAG ATCAACTATT AAATAGGGAT AGTAACATCT TTAAAGAGTT 360 TAAATTATTC AAAGTAGATA GTCAGCAACA CGCTCACCAA GTTCAACTAG ACGAATTAAG 420 AAACCCTGCG TTTAATAAAA AGGAAACACA ACAATCTTAA GAAAAAGCAT CCAAAAACAA 480 TCTTTTTACA CCAGGGACAT TAAAAGGAAG ATACTGATGA TGATGATAAG GATAACAGGA 540 TGGGAGATTC TATTCCTGGA CCTTTTGGGG GAAOAAAATG GGTATACCAA TCCCAAAATA 600 AAATAGCTGG TCCAAGTGGG ATGTTCATTC GCCGCGAAAG GGTATACAAA TTTGTTTCTT 660 AATCCACTTG ATAGTCATAC AGTTGGAGAT CCCTATACGG ATTATGAAAA AGCAGCAAGA 720 GATTTAGACT TGGCCCAATG CAAAAGAAAC ATTTAACCCA TTAGTAGCTG CTTTTCCAAG 780 TGTGAATGTG AATTTGGAAA AAGTCATTTT ATCTAAAGAT GAAAATCTAT CCAATAGTGT 840 AGAGTCACAT TCCTCCACCA ACTGGTCTTA TACGAATACA GAAGGAGCTT CTATCGAAGC 900 TGGGGCTAAA CCAGAGGGTC CTACTTTTGG AGTGAGTGCT ACTTATCAAC ACTCTGAAAC 960 AGTTGCAAAA GAATGGGGAA CATCTACAGG AAATACCTCG CAATTTAATA CAGCTTCAGC 1020 AGGATATTTA AATGCAAATG TACGATAT 1048 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1175 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: D NA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 37: ACCTCTAGAT GCANGCICGA GCOGCCGCCA GTGTGATGGA TATCTGCAGA ATTCGGATTA 60 CTTGGGTATT ATTTTAAAGG GAAAGAGTTT AATCATCTTA CTTTGTTCGC ACCAACACGT 120 GATAATACCC TTATTTATGA TCAACAAACA GCGAATTCCT TATTAGATAC CAAACAACAA 180 GAATATCAAT CTATTCGCTG GATTGGTTTG ATTCAAAGTA AAGAAACAGG TGATTTCACG 240 TTTAACTTAT CTGATGATCA AAATGCAATT ATAGAAATAG ATGGCAAAAT CATTTCGCAT 300 AAAGGACAGA ATAAACAAGT TGTTCACTTA GAAAAAGGAA AGTTAGTCCC GATAAAAATT 360 GAGTATCAAT CAGATCAGAT ATTAACTAGG GATAGTAACA TCTTTAAAGA GTTCAATTAT 420 TCAAAGTAGA TAGTCAAGCA ACACTCTCAC CAAAGTTCAA CTTAGGNCNG AATTAAGNAA 480 CCCTNGGATT ΤΤΑΑΝΤΓΝΑΑ AAAAAGGAAC CCNCANCATT CTTTAGGAAA AAGCAGCAAN 540 AACCAAATCC TTTTTTACCA CAGGATATTG AAAAGGAGAT ACGGGNTNGA TGATGGATTG 600 ATACCGGGAT ACCAGTTGGG GNTTCTANTC CCTGACCTTT GGGGAAAGAA AATNGGTATA 660 CCNATCCCAA AANTTAAGCC AGCTGTCCAG GTGGGATGAT TCAATTCGCC CGCGAAAGGG 720 TATACCAAAA TTTGTTTCTT AATCCACTTG AGAGTCATAC AGTTGGAGAT CCCTATACGG 780 ATTATGAAAA AGCAGCAAGA GATTTAGACT TGGCCAATGC AAAAGAAACA TTTAACCCAT 84 0 TAGTAGCTGC TTTTCCAAGT GTGAATGTGA ATTTGGAAAA AGTAATATTA TCCCCAGATG 900 AGAATTTATC TAACAGTGTA GAATCTCATT CGTCTACAAA TTGGTCTTAT ACGAATACTG 960 AAGGAGCTTC TATCGAAGCT GGGGGTGGTC CATTAGGTAT TTCATTTGGA GTGAGTGCTA 1020 ATTATCAACA CTCTGAAACA GTTGCAAAAG AATGGGGAAC ATCTACAGGA AATACCTCGC 1080 AATTTAATAC AGCTTCAGCA GGATATTTAA ATGCCAATGG TCGATKTAAG CCGAATNCCA 1140 NCACACTGNC GGCCGTTAGT AGTGGCACCG AGCCC 1175 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1030 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 38: GGRTTAMTTG GGTATTATTT TAAAGGGAAA GATTTTAATG ATCTTACTGT ATTTGCACCA 60 ACGCGTGGGA ATACTCTTGT ATATGATCAA CAAACAGCAA ATACATTACT AAATCAAAAA 120 CAACAAGACT TTCAGTCTAT TCGTTGGGTT GGTTTAATTC AAAGTAAAGA AGCAGGCGAT 180 TTTACATTTA ACTTATCAGA TGATGAACAT ACGATGATAG AAATCGATGG GAAAGTTATT 240 TCTAATAAAG GGAAAGAAAA ACAAGTTGTC CATTTAGAAA AAGGACAGTT CGTTTCTATC 300 AAAATAGAAT ATCAAGCTGA TGAACCATTT AATGCGGATA GTCAAACCTT TAAAAATTTG 360 AAACTCYTTA AAGTAGATAC TAAGCAACAG TCCCAGCAAA TTCAACTAGA TGAATTAAGA 420 AACCCTGRAA TTTAATAAAA AAGAAACACA AGAATTTCTA ACAAAAGCAA CAAAAACAAA 480 CCTTATTACT CAAAAAGTGA AGAGTACTAG GGATGAAGAC ACGGATACAG ATGGAGATTC 540 TATTCCAGAC ATTTGGGAAG AAAATGGGTA TACCATCCAA AATAAGATTG CCGTCAAATG 600 GGATGATTCA TTAGCAAGTA AAGGATATAC GAAATTTQTT TCAAACCCAC TAGATACTCA 660 CACGGTTGGA GATCCTTATA CAGATTATGA AAAAGCAGCA AGGGATTIAG ATTTGTCAAA 720 TGCAAAAGAA ACATTTAACC CATTAGTTGC GGCTTTTCCA AGTGT3AATG TGAGTATGGA 780 AAAAGTGATA TTGTCTCCAG ATGAGAACTT ATCAAATAGT ATCGAGTCTC ATTCATCTAC 840 GAATTGGTCG TATACGAATA CAGAAGGGGC TTCTATTGAA GCTGGTGGGG GAGCATTAGG 900 CCTATCTTTT GGTGTAAGTG CAAACTATCA ACATTCTGAA ACAGTTGGGT ATGAATGGGG 960 AACATCTACG GGAAATACTT CGCAATTTAA TACAGCTTCA GCGGGGTATT TAAATGCCAA 1020 TRTAMGATAT 1030 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 39: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 39: CACTCAAAAA ATGAAAAGGG AAA 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: D NA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 40: CCGGTTTTAT TGATGCTAC 19 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 41: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 41: AGAACAATTT TTAGATAGGG 2 0 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 42: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 42: TCCCTAAAGC ATCAGAAATA 2 0 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 43: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1170 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 43: ATGAAGAAAC AAATAGCAAG CGTTGTAACT TGTACGCTAT TAGCCCCTAT GCTTTTTAAT 60 GGAGATATGA ACGCTGCTTA CGCAGCTAGT CAAACAAAAC AAACACCTGC AGCTCAGGTA 120 AACCAAGAGA AAGAAGTAGA TCGAAAAGGA TTACTTGGCT ATTACTTTAA AGGGAAAGAT 180 TTTAATGATC TTACTGTATT TGCACCAACG CGTGGGAATA CTCTTGTATA TGATCAACAA 240 ACAGCAAATA CATTACTAAA TCAAAAACAA CAAGACTTTC AGTCTATTCG TTGGGTTGGT 300 TTAATTCAAA GTAAAGAAGC AGGCGATTTT ACATTTAACT TATCAGATGA TGAACATACG 360 ATGATAGAAA TCGATGGGAA AGTTATTTCT AATAAAGGGA AAGAAAAACA AGTTGTCCAT 420 TTAGAAAAAG GACAGTTCGT TTCTATAAAA TGATTCAGCT GATGAACCAT TTAATGCGGT 480 AGTAAACCTT TAAAAATTTG AAACTCTTTA AAGTAGATAC TAAGCAACAG TCCCAGCAAA 540 TTCAACTAGA TGAATTAAGA AACCCTGAAT TTAATAAAAA AGAAACACAA GAATTTCTAA 600 CAAAAGCAAC AAAAACAAAC CTTATTACTC AAAAAGTGAA GAGTACTAGG GATGAAGACA 660 CGGATACAGA TGGAGATTCT ATTCCAGACA TTTGGGAAGA AAATGGGTAT ACCATCCAAA 720 ATAAATTGCC GTCAAATGGG ATGATTCATT AGCAAGTAAA GGATATACGA AATTTGTTTC 780 AAACCCACTA GATACTCACA CGGTTGGAGA TCCTTATACA GATTATGAAA AAGCAGCAAG 840 GGATTTAGAT TTGTCAAATG CAAAAGAAAC ATTTAACCCA TTAGTTGCGG CTTTTCCAAG 900 TGTAATTGAG TATGGAAAAA GOATTTGTTC CAGATGAGAA CTTATCAAAT AGTATCGAGT 960 TCATTCATTC CTACAATTGG TCGATACGAA TACAGAAGGG GCTTCTATTG AAGCTGGTGG 1020 GGGAGCATTA GGCCTATCTT TTGGTGTAAG TGCAAACTAT CAACATTCTG AAACAGTTGG 1080 GTATGAATGG GGAACATCTA CGGGAAATAC TTCGCAATTT AATACAGCTT CAGCGGGGTA 1140 TTTAAATGCG AATGTTGCTA CAATAACGTG 1170 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 44: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 348 aminoácidos (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 44: Met Lys Lys Gin Ile Ala Ser Vai Vai Thr Cye Thr Leu Leu Ala Pro 15 10 15 Met Leu Phe Asn Gly Asp Met Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Ser Gin Thr 20 25 30 Lys Gin Thr Pro Ala Ala Gin Vai Asn Gin Glu Lys Glu Vai Asp Arg 35 40 45 Lys Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys Asp Phe Asn Asp Leu 50 55 60 Thr Vai Phe Ala Pro Thr Arg Gly Asn Thr Leu Vai Tyr Asp Gin Gin 65 70 75 80 Thr Ala Asn Thr Leu Leu Asn Gin Lys Gin Gin Asp Phe Gin Ser Ile 85 90 95 Arg Trp Vai Gly Leu Ile Gin Ser Lys Glu Ala Gly Asp Phe Thr Phe 100 105 110 Αβπ Leu Ser Asp Asp Glu His Thr Met Ile Glu Ile Asp Gly Lys Vai 115 120 125 Ile Ser Asn Lys Gly Lys Glu Lys Gin Vai Vai Hie Leu Glu Lys Gly 130 135 140 Gin Phe Vai Ser Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Asp Glu Pro Phe Asn 145 150 155 160 Ala Xaa Ser Xaa Thr Phe Lys Asn Leu Lys Leu Phe Lys Vai Asp Thr 165 170 175 Lys Gin Gin Ser Gin Gin Ile Gin Leu Asp Glu Leu Arg Asn Pro Glu 180 185 190 Phe Asn Lys Lys Glu Thr Gin Glu Phe Leu Thr Lys Ala Thr Lys Thr 195 200 205 Asn Leu Ile Thr Gin Lys vai Lys Ser Thr Arg Asp Glu Asp Thr Asp 210 215 220 Thr Asp Gly Asp Ser Ile Pro Asp Ile Trp Glu Glu Asn Gly Tyr Thr 225 230 235 240 Ile Gin Asn Xaa Ile Ala Vai Lys Trp Asp Asp Ser Leu Ala Ser Lys 245 250 255 Gly Tyr Thr Lys Phe Vai Ser Asn Pro Leu Aep Thr His Thr Vai Gly 260 265 270 Aep Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Arg Aap Leu Aap Leu Ser 275 280 285 Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn Pro Leu Vai Ala Ala Phe Pro Ser Vai 290 295 300 Asn Xaa Ser Met Glu Lys Xaa Ile Leu Xaa Pro Asp Glu Asn Leu Ser 305 310 315 320 Asn Ser Ile Glu Xaa His Ser Phe Leu Xaa Ile Gly Arg Ile Arg Ile 325 330 335 Gin Lys Gly Leu Leu Leu Lys Leu Vai Gly Glu His 340 345 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 45: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 45: ATG 3 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 46: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1 aminoácido (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 46: Met 1 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 47: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2583 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 47: ATQACATATA TGAAAAAAAA GTTAGTTAGT GTTGTAACTT GCACGTTATT GGCTCCGATA 60 TTTTTGACTG GAAATGTACA TCCTGTTAAT GCAGACAGTA AAAAAAGTCA GCCTTCTACA 120 GCGCAGGAAA AACAAGAAAA GCCGGTTGAT CGAAAAGGGT TACTCGGCTA TTTTTTTAAA 180 GGGAAAGAGT TTAATCATCT TACTTTGTTC GCACCAACAC GTGATAATAC CCTTATTTAT 240 GATCAACAAA CAGCGAATTC CTTATTAQAT ACCAAACAAC AAGAATATCA ATCTATTCGC 300 TGGATTGC-TT TGATTCAAAG TAAAGAAACA GGTGATTTCA CGTTTAACTT ATCTGATGAT 360 CAAAATGCAA TTATAGAAAT AGATGGCAAA ATCATTTCGC ATAAAGGACA GAATAAACAA 420 GTTGTTCACT TAGAAAAAGG AAAGTTAGTC CCGATAAAAA TTGAGTATCA ATCAGATCAG 480 ATATTAACTA GGGATAGTAA CATCTTTAAA GAGTTTCAAT TATTCAAAGT AGATAGTCAG 540 CAACACTCTC ACCAAGTTCA ACTAGACGAA TTAAGAAACC CTGATTTTAA TAAAAAAGAA 600 ACACAACAAT TCTTAGAAAA AGCAGCAAAA ACAAATCTTT TTACACAGAA TATGAAAAGA 660 GATACGGATG ATGATGATGA TACGGATACA GATGGAGATT CTATTCCTGA CCTTTGGGAA 720 GAAAATGGGT ATACCATCCA AAATAAAGTA GCTGTCAAGT GGGATGATTC ATTCGCCGCG 780 AAAGGGTATA CAAAATTTGT TTCTAATCCA CTTGAGAGTC ATACAGTTGG AGATCCCTAT 840 ACGGATTATG AAAAAGCAGC AAGAGATTTA GACTTGGCCA ATGCAAAAGA AACATTTAAC 900 CCATTAGTAG CTGCTTTTCC AAGTGTGAAT GTGAATTTGG AAAAAGTAAT ATTATCCCCA 960 GATGAGAATT TATCTAACAG TGTAGAATCT CATTCGTCTA CAAATTGGTC TTATACGAAT 1020 ACTGAAGGAG CTTCTATCGA AGCTGGGGGT GGTCCATTAG GTATTTCATT TGGAGTGAGT 1080 GCTAATTATC AACACTCTGA AACAGTTGCA AAAGAATGGG GAACATCTAC AGGAAATACC 1140 TCGCAATTTA ATACAGCTTC AGCAGGATAT TTGAATGCGA ATGTTCGATA CAATAATGTG 1200 GGAACAGGTG CGATTTATGA GGTGAAACCT ACAACAAGTT TTGTATTAGA TAAAGATACT 1260 GTAGCAACAA TTACCGCAAA ATCGAATTCG ACAGCTTTAA GTATATCTCC AGGAGAAAGT 1320 TATCCCAAAA AAGGACAAAA TGGAATTGCA ATTAATACAA TGGATGATTT TAATTCCCAT 1380 CCGATTACAT TAAATAAACA ACAATTAGAT CAACTATTAA ATAATAAACC TCTTATGTTA 1440 GAAACAAATC AGGCAGATGG TGTTTATAAA ATAAAGGATA CAAGCGGTAA TATTGTGACT 1500 GGTGGAGAAT GGAACGGTGT TATCCAACAA ATTCAAGCAA AAACAGCCTC TATTATCGTT 1560 GATACGGGAG AAAGTGTTTC AGAAAAGCGT GTCGCAGCAA AAGATTATGA TAATCCTGAG 1620 GATAAAACAC CTTCTTTATC TTTAAAAGAG GCACTTAAAC TTGGATATCC AGAAGAAATT 1680 AAAGAAAAAG ATGGATTGTT GTACTATAAG GACAAGCCAA TTTACGAATC TAGTGTTATG 1740 ACTTATCTAG ATGAGAATAC AGCCAAGGAA GTGGAAAAAC AATTACAGGA TACAACCGGA 1800 ATATATAAAG ATATCAATCA TTTATATGAT GTGAAATTAA CACCTACAAT GAATTTTACG 1860 ATTAAATTAG CTTCCTTATA TGATGGAGCT GAAAATAATG ATGTGAAGAA TGGTCCTATA 1920 GGACATTGGT ATTATACCTA TAATACAGGG GGAGGAAATA CTGGAAAACA CCAATATAGG 1980 TCTQCTAATC CCAGTGCAAA TGTAGTTTTA TCTTCTGAAG CGAAAAGTAA GTTAGATAAA 2040 AATACAAATT ACTACCTTAG TATGTATATG AAAGCTGAGT CTGATACAGA GCCTACAATA 2100 OAAGTAAGTG GTGAGAATTC TACGATAACG AGTAAAAAGG TAAAACTAAA CAGTGAGGGC 2160 TATCAAAGAG TAGATATTTT AGTGCCGAAT TCTGAAAGAA ATCCAATAAA TCAAATATAT 2220 GTAAGAGGAA ATAATACAAC AAATGTATAC TGGGATGATG TTTCAATTAC AAATATTTCA 2280 GCTATAAACC CAAAAACTTT AACAGATGAA GAAATTAAAG AAATATATAA AGATTTTAGT 2340 3AGTCTAAAG ACTGGCCTTG GTTCAATGAT GTTACGTTTA AAAATATTAA ACCATTAGAG 2400 AATTATGTAA AACAATATAG AGTTGATTTC TGGAATACTA ATAGTGATAG ATCATTTAAT 2460 AGGATTAAGG ACAGTTACCC AGTTAATGAA GATGGAAGTG TTAAAGTCAA CATGACAGAA 2S20 TATAATGAAG GATATCCACT TAGAATTGAA TCCGCCTACC ΑΤΤΓΑΑΑΤΑΤ TTCAGATCTA 2580 TAA 2583 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 48: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 860 aminoácidos (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 48: Met Thr Tyr Met Lys Lys Lys Leu Vai Ser Vai Vai Thr Cys Thr Leu 15 10 15 Leu Ala Pro Ile Phe Leu Thr Gly Asn Vai His Pro Vai Aen Ala Asp 20 25 30 Ser Lys Lye Ser Gin Pro Ser Thr Ala Gin Glu Lys Gin Glu Lye Pro 35 40 45 Vai Asp Arg liye Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Phe Lys Gly Lys Glu Phe 50 55 60 Asn His Leu Thr Leu Phe Ala Pro Thr Arg Asp Asn Thr Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Asp Gin Gin Thr Ala Asn Ser Leu Leu Asp Thr Lys Gin Gin Glu Tyr 85 90 95 Gin Ser Ile Arg Trp Ile Gly Leu Ile Gin Ser Lys Glu Thr Gly Asp 100 105 110 Phe Thr Phe Asn Leu Ser Asp Asp Gin Asn Ala Ile Ile Glu Ile Asp 115 120 125 Gly Lys Ile Ile Ser His Lys Gly Gin Asn Lys Gin Vai Vai His Leu 130 135 140 Glu Lys Gly Lys Leu Vai Pro ile Lys Ile Glu Tyr Gin Ser Asp Gin 145 150 155 160 Ile Leu Thr Arg Asp Ser Asn Ile Phe Lys Glu Phe Gin Leu Phe Lys 165 170 175 Vai Asp Ser Gin Gin His Ser Híb Gin Vai Gin Leu Asp Glu Leu Arg 180 185 190 Asn Pro Aep Phe Asn Lys Lys Glu Thr Gin Gin Phe Leu Glu Lys Ala 195 200 205 Ala Lys Thr Asn Leu Phe Thr Gin Asn Met Lys Arg Asp Thr Asp Asp 210 215 220 Asp Asp Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ser Ile Pro Asp Leu Trp Glu 225 230 235 240 Glu Asn Gly Tyr Thr Ile Gin Asn Lys Vai Ala Vai Lys Trp Asp Asp 245 250 255 Ser Phe Ala Ala Lys Gly Tyr Thr Lys Phe vai Ser Asn Pro Leu Glu 260 265 270 Ser His Thr Vai Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lye Ala Ala Arg 275 280 285 Asp Leu Asp Leu Ala Asn Ala Lye Glu Thr Phe Asn Pro Leu Vai Ala 290 295 300 Ala Phe Pro Ser Vai Asn Vai Asn Leu Glu Lys Vai Ile Leu Ser Pro 305 310 315 320 Asp Glu Asn Leu Ser Asn Ser Vai Glu Ser His Ser Ser Thr Asn Trp 325 330 335 Ser Tyr Thr Asn Thr Glu Gly Ala Ser Ile Glu Ala Gly Gly Gly Pro 340 345 350 Leu Gly Ile Ser Phe Gly Vai Ser Ala Asn Tyr Gin His Ser Glu Thr 355 360 365 Vai Ala Lys Glu Trp Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr Ser Gin Phe Asn 370 375 380 Thr Ala Ser Ala Gly Tyr Leu Aan Ala Asn Vai Arg Tyr Asn Asn Vai 3B5 390 395 400 Gly Thr Gly Ala Ile Tyr Glu Vai Lys Pro Thr Thr Ser Phe Vai Leu 405 410 415 Asp Lys Asp Thr Vai Ala Thr Ile Thr Ala Lys Ser Asn Ser Thr Ala 420 425 430 Leu Ser Ile Ser Pro Gly Glu ser Tyr Pro Lys Lys Gly Gin Asn Gly 435 440 445 Ile Ala Ile Asn Thr Met Asp Asp Phe Asn Ser His Pro Ile Thr Leu 450 455 460 Asn Lys Gin Gin Leu Asp Gin Leu Leu Asn Asn Lys Pro Leu Met Leu 465 470 475 480 Glu Thr Asn Gin Ala Asp Gly vai Tyr Lys Ile Lys Asp Thr Ser Gly 485 490 495 Asn Ile Vai Thr Gly Gly Glu Trp Asn Gly Vai Ile Gin Gin Ile Gin 500 505 510 Ala Lys Thr Ala Ser Ile Ile Vai Asp Thr Gly Glu Ser Vai Ser Glu 515 520 525 Lys Arg Vai Ala Ala Lys Asp Tyr Aep Asn Pro Glu Asp Lys Thr Pro 530 535 540 Ser Leu Ser Leu Lys Glu Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Pro Glu Glu Ile 545 550 555 560 Lys Glu Lys Asp Gly Leu Leu Tyr Tyr Lys Asp Lys Pro Ile Tyr Glu 565 570 575 Ser Ser Vai Met Thr Tyr Leu Asp Glu Asn Thr Ala Lys Glu Vai Glu 580 585 590 Lys Gin Leu Gin Asp Thr Thr Gly Ile Tyr Lys Asp Ile Asn His Leu 595 600 605 Tyr Asp Vai Lys Leu Thr Pro Thr Met Asn Phe Thr Ile Lys Leu Ala 610 6X5 620 Ser Leu Tyr Asp Gly Ala Glu Aen Asn Asp Vai Lya Asn Gly Pro Ile 625 630 635 640 Gly His Trp Tyr Tyr Thr Tyr Asn Thr Gly Gly Gly Asn Thr Gly Lys 645 650 655 Hi9 Gin Tyr Arg Ser Ala Aan Pro Ser Ala Asn Vai Vai Leu Ser Ser 660 665 670 Glu Ala Lye Ser Lye Leu Asp Lys Asn Thr Asn Tyr Tyr Leu Ser Met 675 680 685 Tyr Met Lys Ala Glu Ser Asp Thr Glu Pro Thr Ile Glu Vai Ser Gly 690 695 700 Glu Asn Ser Thr Ile Thr Ser Lys Lys Vai Lys Leu Aen Ser Glu Gly 705 710 715 720 Tyr Gin Arg vai Asp Ile Leu Vai Pro Asn Ser Glu Arg Asn Pro Ile 725 730 735 Asn Gin Ile Tyr Vai Arg Gly Asn Asn Thr Thr Asn Vai Tyr Trp Asp 740 745 750 Asp Vai Ser Ile Thr Asn Ile Ser Ala Ile Asn Pro Lys Thr Leu Thr 755 760 765 Asp Glu Glu Ile Lys Glu Ile Tyr Lys Asp Phe Ser Glu Ser Lys Asp 770 775 780 Trp Pro Trp Phe Asn Asp Vai Thr Phe Lys Asn Ile Lys Pro Leu Glu 785 790 795 800 Asn Tyr Vai Lys Gin Tyr Arg Vai Asp Phe Trp Asn Thr Asn Ser Asp 805 810 815 Arg Ser Phe Asn Arg Ile Lys Asp Ser Tyr Pro Vai Asn Glu Asp Gly 820 825 830 Ser Vai Lys Vai Asn Met Thr Glu Tyr Asn Glu Gly Tyr Pro Leu Arg 835 840 845 Ile Glu Ser Ala Tyr His Leu Asn Ile Ser Asp Leu 850 855 860 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 49: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1356 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 49: ATGGTATCCA AAAAGTTACA ATTAGTCACA AAAACTTTAG TGTTTAGTAC AGTTTTGTCA 60 ATACCGTTAT TAAATAATAG TGAGATAAAA GCGGAACAAT TAAATATGAA TTCTCAAATT 120 AAATATCCTA ACTTCCAAAA TATAAATATC GCTGATAAGC CAGTAGATTT TAAAGAGGAT 180 AAAGAAAAAG CACGAGAATG GGGAAAAGAA AAAGAAAAAG AGTGGAAACT AACTGCTACT 240 GAAAAAGGGA AAATTAATGA TTTTTTAGAT GATAAAGATG GATTAAAAAC AAAATACAAA 300 GAAATTAATT TTTCTAAGAA TTTTGAATAT GAAACAGAGT TAAAACAGCT TGAAAAAATT 360 AATAGCATGC TAGATAAAGC AAATCTAACA AATTCAATTG TCACGTATAA AAACGTTGAG 420 CCTACAACAA TAGGATTCAA TCACTCTTTG ACTGATGGGA ATCAAATTAA TTCCGAAGCT 480 CAACAGAAGT TCAAGGAACA GTTTTTAGGA AATGATATTA AATTTGATAG TTATTTGGAT 540 ATGCACTTAA CTGAACAAAA TGTTTCCGGT AAAGAAAGGG TTATTTTAAA AGTTACAGTA 600 CTTAGTGGGA AAGGTTCTAC TCCAACAAAA GCAGGTGTTG TTTTAAATAA TAAAGAATAC 660 AAAATGTTGA TTGATAATGG ATATATACTA CATGTAGAAA ACATAACGAA AGTTGTAAAA 720 AAAGGACAGG AATGTTTACA AGTTGAAGGA ACGTTAAAAA AGAGCTTGGA CTTTAAAAAT 780 GATA3TGACG GTAAGGGAGA TTCCTGGGGA AAGAAAAATT ACAAGGAATG GTCTGATTCT B40 TTAACAAATG ATCAGAGAAA AGACTTAAAT GATTATGGTG CGCGAGGTTA TACCGAAATA 900 AATAAATATT TACGTGAAGG GGGTACCGGA AATACAGAGT TGGAGGAAAA AATTAAAAAT 960 ATTTCTGACG CACTAGAAAA GAATCCTATC CCTGAAAACA TTACTGTTTA TAGATATTGC 1020 GGAATGGCGG AATTTGGTTA TCCAATTCAA CCCGAGGCTC CCTCCGTACA AGATTTTGAA 1080 GAGAAATTTT TGGATAAAAT TAAGGAAGAA AAAGQATATA TGAGTACGAG CTTATCAAGX 1140 GATGCGACTT CTTTTGGCGC AAGAAAAATT ATCTTAAGAT TGCAGATACC AAAAGGAAGT 1200 TCAGGAGCAT ATGTAGCTGG TTTAGATGGA TTTAAACCAG CAGAGAAGGA GATTCTTATT 1260 GATAAGGGAA GCAAGTATCA TATTGATAAA GTAACAGAAG TAGTTGTGAA AGGTATTAGA 1320 AAACTCGTAG TAGATQCGAC ATTATTATTA AAATAA 1356 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 50: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 451 aminoácidos (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 50: Met Vai Ser Lye Lye Leu Gin Leu Vai Thr Lye Thr Leu Vai Phe Ser 15 10 15 Thr Vai Leu Ser Ile Pro Leu Leu Asn Aen Ser Olu Ile Lys Ala Glu 20 25 30 Gin Leu Asn Met Asn Ser Gin Ile Lys Tyr Pro Asn Phe Gin Asn Ile 35 40 45 Asn Ile Ala Asp Lys Pro Vai Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ala 50 55 60 Arg Glu Trp Gly Lys Glu Lys Glu Lye Glu Trp Lys Leu Thr Ala Thr 65 70 75 60 Glu Lys Gly Lys Ile Asn Asp Phe Leu Asp Asp Lys Asp Gly Leu Lys 85 90 95 Thr Lys Tyr Lys Glu Ile Asn Phe Ser Lys Asn Phe Glu Tyr Glu Thr 100 105 110 Glu Leu Lys Gin Leu Glu Lys Ile Asn ser Met Leu Asp Lys Ala Asn 115 120 125 Leu Thr Asn Ser Ile Vai Thr Tyr Lys Asn Vai Glu Pro Thr Thr Ile 130 135 140 Gly Phe Asn Hls ser Leu Thr Asp Gly Asn Gin Ile Asn Ser Glu Ala 145 150 155 160 Gin Gin Lys Phe Lys Glu Gin Phe Leu Gly Asn Asp Ile Lys Phe Asp 165 170 175 Ser Tyr Leu Asp Met His Leu Thr Glu Gin Asn Vai Ser Gly Lys Glu 180 185 190 Arg Vai Ile Leu Lye Vai Thr Vai Leu Ser Gly Lys Gly Ser Thr Pro 195 200 205 Thr Lys Ala Gly Vai Vai Leu Asn Asn Lys Glu Tyr Lys Met Leu Ile 210 215 220 Asp Asn Gly Tyr Ile Leu His Vai Glu Asn Ile Thr Lys Vai Vai Lys 225 230 235 240 Lys Gly Gin Glu Cys Leu Gin Vai Glu Gly Thr Leu Lys Lys Ser Leu 245 250 255 Asp Phe Lys Asn Asp Ser Asp Gly Lys Gly Asp Ser Trp Gly Lys Lys 260 265 270 Asn Tyr Lys Glu Trp Ser Asp Ser Leu Thr Asn Asp Gin Arg Lys Asp 275 280 285 Leu Asn Asp Tyr Gly Ala Arg Gly Tyr Thr Glu Ile Asn Lys Tyr Leu 290 295 300 Arg Glu Gly Gly Thr Gly Aen Thr Glu Leu Glu Glu Lys Ile Lys Asn 305 310 315 320 Ile Ser Aep Ala Leu Olu Lys Aen Pro Ile Pro Glu Asn Ile Thr Vai 325 330 335 Tyr Arg Tyr Cys Gly Met Ala Glu Phe Gly Tyr Pro Ile Gin Pro Glu 340 345 350 Ala Pro Ser Vai Gin Asp Phe Glu Glu Lys Phe Leu Asp Lys Ile Lys 355 360 365 Glu Glu Lys Gly Tyr Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser Asp Ala Thr Ser 370 375 380 Phe Gly Ala Arg Lys Ile Ile Leu Arg Leu Gin Ile Pro Lys Gly Ser 385 390 395 400 Ser Gly Ala Tyr Vai Ala Gly Leu Asp Gly Phe Lys Pro Ala Glu Lys 405 410 415 Glu Ile Leu Ile Asp Lys Gly Ser Lys Tyr His Ile Asp Lys Vai Thr 420 425 430 Glu Vai Vai Vai Lys Gly Ile Arg Lys Leu Vai Vai Asp Ala Thr Leu 435 440 445 Leu Leu Lys 450 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 51: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 47 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: D NA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 51: GCTCTAGAAG GAGGTAACTT ATGAACAAGA ATAATACTAA ATTAAGC 47 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 52: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 52: OOGGTACCTT ACTTAATAGA GACATCG 27 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 53: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2364 pares de base (B) TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (GENÔMICO) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 53: ATGAATATGA ATAATACTAA ATTAAACGCA AGGGCCCTAC CGAGTTTTAT TGATTATTTT 60 AATQGCATTT ATGGATTTGC CACTQGTATC AAAGACATTA TGAATATGAT TTTTAAAACG 120 GATACAGGTG GTAATCTAAC CTTAGACGAA ATCCTAAAGA ATCAGCAGTT ACTAAATGAG 1Θ0 ATTTCTGGTA AATTGGATGG GGTAAATGGG AGCTTAAATG ATCTTATCGC ACAGGGAAAC 240 TTAAATACAG AATTATCTAA GGAAATCTTA AAAATTGCAA ATOAACAOAA TCAAGTCTTA 300 AATGATGTTA ATAACAAACT CGATGCGATA AATACGATGC TTCATATATA TCTACCTAAA 360 ATCACATCTA TGTTAAGTGA TGTAATGAAG CAAAATTATG CGCTAAGTCT GCAAGTAGAA 420 TACTTAAGTA AACAATTGAA AGAAATTTCT GATAAATTAG ATGTTATTAA CGTAAATGTT 480 CTTATTAACT CTACACTTAC TGAAATTACA CCTGCATATC AACGGATTAA ATATGTAAAT 540 GAAAAATTTG AAGAATTAAC TTTTGCTACA GAAACCACTT TAAAAGTAAA AAAGGATAGC 600 TCGCCTGCTG ATATTCTTGA CGAGTTAACT OAATTAACTG AACTAGCGAA AAGTGTTACA 660 AAAAATGACG TGGATGGTTT TGAATTTTAC CTTAATACAT TCCACGATGT AATGGTAGGA 720 AATAATTTAT TCGGGCGTTC AGCTTTAAAA ACTGCTTCAG AATTAATTGC TAAAGAAAAT 780 GTGAAAACAA GTGGCAGTGA AGTAGGAAAT GTTTATAATT TCTTAATTGT ATTAACAGCT 840 CTACAAGCAA AAGCTTTTCT TACTTTAACA ACATGCCGAA AATTATTAGG CTTAGCAGAT 900 ATTGATTATA CATCTATTAT GAATGAACAT TTAAATAAGG AAAAAGAGGA ATTTAGAGTA 960 AACATCCTTC CTACACTTTC TAATACTTTT TCTAATCCTA ATTATGCAAA AGTTAAAGGA 1020 AGTGATGAAG ATGCAAAGAT GATTGTGGAA GCTAAACCAG GACATGCATT GGTTGGGTTT 1080 GAAATTAGTA ATGATTCAAT GACAGTATTA AAAGTATATG AAGCTAAGCT AAAACAAAAT 1140 TACCAAGTTG ATAAGGATTC CTTATCGGAA GTCATTTATA GTGATATGGA TAAATTATTG 1200 TGCCCAGATC AATCTGAACA AATTTATTAT ACAAATAATA TAGTATTICC AAATGAATAT 1260 GTAATTACTA AAATTGATTT TACTAAGAAA ATGAAAACTT TAAGATATOA GGTAACAGCT 1320 AATTCTTACG ATTCTTCTAC AGGAGAAATT GACTTAAATA AGAAGAAAGT AGAATCAAGT 1380 GAAGCGGAGT AXAGGACGTT AAGTGCTAAT AATGATGGAG TATATATGCC GTTAGGTGTC 1440 ATCAGTGAAA CATTTTTGAC TCCAATTAAT GGATTTGGCC TCCAAGCTGA TGAAAATTCA 1500 AGATTAATTA CTTTAACATG TAAATCATAT TTAAGGGAAC TACTACTAGC GACAGACTTA 1560 AGCAATAAAG AAACTAAATT GATTGTCCCG CCTATTAGTT TTATTAGTAA TATTGTAGAA 1620 AATGGGAACT TAGAGGGAGA AAACTTAGAG CCGTGGATAG CAAATAACAA AAATGCGTAT 1680 GTAGATCATA CAGGTGGTAT AAATGGAACT AAAGTTTTAT ATGTTCATAA GGATGGTGAG 1740 TTTTCACAAT TTGTTGGAGG TAAGTTAAAA TCGAAAACAG AATATGTAAT TCAATATATT 1800 GTAAAGGGAA AAGCTTCTAT TTATTTAAAA GATAAAAAAA ATGAGAATTC CATTTATGAA 1860 GAAATAAATA ATGATTTAGA AGGTTTTCAA ACTGTTACTA AACGTTTTAT TACAGGAACG 1920 GATTCTTCAG GGATTCATTT AATTTTTACC AGTCAAAATG GCGAGGGAGC ATTTGGAGGA 1980 AACTTTATTA TCTCAGAAAT TAGGACATCC GAAGAGTTAT TAAGTCCAGA ATTGATTATG 2040 TCOGATGCXT GGGTTGGATC CCAGGGAACT TGGATCTCAG GAAATTCTCT CACTATTAAT 2100 AGTAATGTAA ATGGAACCTT XCGACAAAAT CTTCCGTTAG AAAGTTATTC AACCTATAGT 2160 ATOAACTTTA CTGTGAATGG ATTTGGCAAG GTGACAGTAA GAAATTCTCG TGAAGTATTA 2220 TTTGAAAAAA GTTATCCGCA GCTTTCACCT AAAGATATTT CTGAAAAATT TACAACTGCA 2280 GCCAATAATA CCGGATTATA TGTAGAGCTT TCTCGCTCAA CGTCGGGTGG TGCAATAAAT 2340 TTCCGAGATT TTTCAATTAA GTAA 2364 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 54: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 787 aminoácidos (B) TIPO: AMINOÁCIDO

(C) TIPO DE FIO: ÚNICO

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

Claims

1. Hospedeiro recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 53 e codificando uma proteína pesticidamente ativa, em que a referida proteína compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54, em que o referido polinucleotídeo está em um constructo genético para a transformação de plantas e não está associado com uma molécula natural ou não é natural ou encontrado na natureza ou ainda que dela isolado, em que o referido hospedeiro consiste de uma célula microbiana.

2. Hospedeiro de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula microbiana é uma célula bacteriana.

3. Método para controlar uma peste lepidopterana, caracterizado pelo fato de que compreende por em contato a referida peste com uma pro- teína, em que a referida proteína compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida proteína é produzida por e está presente em uma plan- ta, a referida peste lepidopterana ingere uma porção da referida planta, des- sa forma entrando em contato com a referida proteína.