HU209148B

HU209148B - Insecticidal preparative and method for producing active agent

Info

Publication number: HU209148B
Application number: HU89760A
Authority: HU
Inventors: Cyndy Lou Jellis; James Robert Rusche; Daniel Parker Witt
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1988-02-25
Filing date: 1989-02-15
Publication date: 1994-03-28
Also published as: BR8900881A; IT1230483B; CN1037538A; GB8904016D0; AU616945B2; IL89391A0; AT396940B; GB2216127B; ES2012283A6; FR2627778A1; BE1001877A4; PT89812B; GR1000457B; HUT50507A; JPH025872A; IT8947678A0; IL89391A; IE62118B1; GB2216127A; DK84589A

Description

A találmány tárgya inszekticid készítmény és eljárás a hatóanyag előállítására, közelebbről a hatóanyag - rovarokra nézve toxikus fehérje - géntechnológiai úton történő előállítására.

A Bacillus thuringiensis (B.t.) spórázó baktérium, amely egy kristályos delta-endotoxin (δ-endotoxin) fehérjét termel a növekedés vegetatív stádiumának a végén. Ez az endotoxin, amikor bizonyos rovarok elfogyasztják, toxikus hatásokat idéz elő, így pl. az illető rovar nem vesz fel táplálékot, emésztőszervei hibásan működnek, kiszárad és végül elpusztul. A δ-endotoxin, általában plazmidból, inaktív prekurzor vagy protoxin formából keletkezik, és molekulatömege 130000140000 dalton [Calabrese: Canad. J. Microbiol. 26, 1006 (1980)]. Normálisan a rovar bélrendszerében a bél proteázai hatásának eredményeképpen a C-terminális mintegy fele és esetleg az N-terminálisnál néhány aminosav proteolitikusan lehasad; így a 65 000-70 000 dalton (D) molekulatömegű toxin termelődik [Tyrell és munkatársai: J. Bacteriology, 145,1052 (1981)].

A B. t. számos alvariánsát azonosították. Bár ezek többsége fajlagosabb vagy megnövekedett toxicitást mutat a pikkelyesszárnyúak rendjébe (Lepidoptera) tartozó rovarok ellen, bizonyos alvariánsokról leírták, hogy más rendbe tartozó rovarok ellen is toxikusak. így pl. a B. t. israelensis toxikus a kétszárnyúak (Diptera) lárvái ellen (szúnyogok és tripsz) és két másik alvariánst nemrégen azonosítottak, amelyek toxicitást mutatnak fedelesszárnyúak (Coleoptera) lárvái ellen [Hofte és munkatársai: Nuc. Acid. Rés. 15 (17), 7183 (1987)].

Bár sok munkát fektettek megrövidített toxinok és ezeket kódoló struktúrgének termelésére, mégis úgy tűnik, keveset tudunk a B. t. képességeiről. A δ-endotoxinok az endotoxin szekvencia aktív vagy toxikus részén belül ellenállnak a pontmutációknak, és az ilyen mutációknak nincs hatása a toxin molekulák aktivitására.

A találmány tárgya eljárás a B. t. δ-endotoxinok aktív része új mutánsainak előállítására, továbbá olyan mutációk létrehozására, amelyek hatékonyak B. t. endotoxinszerű aktivitás termelésében mind megrövidített, mind teljes hosszúságú δ-endotoxin formában.

A találmány foglalkozik még olyan mutációk létrehozásával, amelyek fokozzák a δ-endotoxin szerkezetek inszekticid aktivitását.

A találmány értelmében véletlenszerű egyszeri vagy többszöri pontmutáció után pikkelyesszárnyúak ellen inszekticid aktivitású B. t. endotoxin aktív részének nagy részletét kódoló sok száz DNS szálban számos olyan mutáns B. t. endotoxint izolálunk és termelünk rekombináns DNS technikákkal, amelyek jellegzetesen olyan inszekticid aktivitást mutatnak pikkelyesszámyúak ellen, mint a vad típusú B. t. Ö-endotoxin. Felismertük, hogy a mutáció ezen felfedezett pontjainál bármely természetes aminosavat kódoló kodon behelyettesítésével aktív endotoxin fehérje kapható. Nagyszámú véletlen mutációról úgy találtuk, hogy fokozza az inszekticid aktivitást. Az ilyen aktivitás pl. a dohány bimbóféreg (Heliothis virescens) vizsgálatban vagy a Trichoplusia ni (káposzta araszoló lepke) vizsgálatban mutatható ki, amint később leírjuk, és sok esetben ez az aktivitásnövekedés egészen jelentékeny, legalább kétszerese, de inkább többszöröse a szülő endotoxinénak. Többszörös mutációkat is (általában 2-3 aminosav mutált DNS szálanként) kiértékeltünk önmagában és különböző kombinációkban, hogy valamivel hatásosabb mutációkat és kombinációkat azonosítsunk. A találmány szerinti mutációkról egy kivétellel azt találtuk, hogy olyan aminosavszekvencia részeken belül vannak, amelyek nagymértékben megőrződtek a számos vad típusú B. t. δ-endotoxinban, ami arra utal, hogy a találmány szerinti mutációk általánosan alkalmazhatók számos olyan endotoxin esetén, amelyekben az ilyen megőrzött területek szolgáltatják az inszekticid B. t. endotoxinokat.

Közelebbről úgy találtuk, hogy az egyébként pikkelyesszárnyúak ellen - a natív B. t. endotoxinokkal azonos módon inszekticid hatású B. t. endotoxin fehérje, ha aktív részében az A táblázatban bemutatott vagy azzal homológ 116 aminosavból álló szekvenciát tartalmazza a 90-től a 205. helyig, illetve m-1 aminosav helytől m-116 aminosavhelyig [ahol az A táblázatban (lásd később) levő aminosavszekvenciára és ennek számozására utalunk, amely metioninnal (Met) kezdődik, amely az 1. számú hely, és az A táblázatban bemutatott, pikkelyesszárnyúak ellen aktív endotoxin egy képviselőjének normális N-terminálisa), akkor a jelzett vagy azzal homológ helyen (a zárójelben levő m-helyzetek az említett 116 aminosav szekvenciára utalnak) egy vagy több következő aminosavat tartalmazhatja:

a) a 94. helynél (az említett 116 aminosavgyökös szekvencia m-5 helye) bármilyen, genetikai kód által kódolt aminosav Asn kivételével;

b) a 95. helynél (az említett 116 aminosavgyökös szekvencia m-6 helye) bármilyen, genetikai kód által kódolt aminosav Gin kivételével;

c) a 101. helynél (az említett 116 aminosavgyökös szekvencia m-12 helye) bármilyen, genetikai kód által kódolt aminosav Glu kivételével;

d) a 105. helynél (az említett 116 aminosavgyökös szekvencia m-16 helye) bármilyen, genetikai kód által kódolt aminosav Asn kivételével;

e) a 116. helynél (az említett 116 aminosavgyökös szekvencia m-27 helye) bármilyen, genetikai kód által kódolt aminosav Glu kivételével;

f) a 119. helynél (az említett 116 aminosavgyökös szekvencia m-30 helye) bármilyen, genetikai kód által kódolt aminosav Alá kivételével;

g) a 122. helynél (az említett 116 aminosavgyökös szekvencia m-33 helye) bármilyen, genetikai kód által kódolt aminosav Thr kivételével;

h) a 123. helynél (az említett 116 aminosavgyökös szekvencia m-34 helye) bármilyen, genetikai kód által kódolt aminosav Asn kivételével;

i) a 125. helynél (az említett 116 aminosavgyökös szekvencia m-36 helye) bármilyen, genetikai kód által kódolt aminosav Alá kivételével;

j) a 130. helynél (az említett 116 aminosavgyökös szekvencia m-41 helye) bármilyen, genetikai kód által kódolt aminosav Met kivételével;

HU 209 148 Β

k) a 184. helynél (az említett 116 aminosavgyökös szekvencia m-95 helye) bármilyen, genetikai kód által kódolt aminosav Phe kivételével;

l) a 187. helynél (az említett 116 aminosavgyökös szekvencia m-98 helye) bármilyen, genetikai kód által kódolt aminosav Ala kivételével;

m) a 188. helynél (az említett 116 aminosavgyökös szekvencia m-99 helye) bármilyen, genetikai kód által kódolt aminosav Thr kivételével;

n) a 194. helynél (az említett 116 aminosavgyökös szekvencia m-105 helye) bármilyen, genetikai kód által kódolt aminosav Asn kivételével;

o) a 201. helynél (az említett 116 aminosavgyökös szekvencia m-112 helye) bármilyen, genetikai kód által kódolt aminosav Gly kivételével.

Ezenkívül (ismét az A táblázatban levő aminosavgyök számozásra utalva) a találmány szerinti eljárás magában foglalja a 4. helynél levő Asn aminosav cseréjét bármilyen, genetikai kód által kódolt természetes aminosavra.

Az említett 116 gyökös szekvencián belül a találmány értelmében előnyösek azok a szekvenciák (ismét az A táblázatban bemutatott teljes érett szekvenciára, •valamint az említett 116 gyökös szekvenciára utalva), amelyeket az alábbi aminosavváltozások közül egy vagy több jellemez a megjelölt helyeknél:

a) Lys a 94. helynél (az említett 116 gyökös szekvencia 5. helye);

b) Lys a 95. helynél (az említett 116 gyökös szekvencia 6. helye);

c) Lys a 101. helynél (az említett 116 gyökös szekvencia 12. helye);

d) Tyr a 105. helynél (az említett 116 gyökös szekvencia 16. helye);

e) Lys vagy Arg, előnyösen Arg a 116. helynél (az említett 116 gyökös szekvencia 27. helye);

f) Thr a 119. helynél (az említett 116 gyökös szekvencia 30. helye);

g) Ile a 122. helynél (az említett 116 gyökös szekvencia 33. helye);

h) Tyr a 123. helynél (az említett 116 gyökös szekvencia 34. helye);

i) Val a 125. helynél (az említett 116 gyökös szekvencia 36. helye);

j) Ile a 130. helynél (az említett 116 gyökös szekvencia 41. helye);

k) Ile a 184. helynél (az említett 116 gyökös szekvencia 95. helye);

l) Thr a 187. helynél (az említett 116 gyökös szekvencia 98. helye);

m) Ser a 188. helynél (az említett 116 gyökös szekvencia 99. helye);

n) Lys a 194. helynél (az említett 116 gyökös szekvencia 105. helye);

o) Asp a 201. helynél (az említett 116 gyökös szekvencia 112. helye).

Előnyös, ha a 4. aminosavhelynél levő Asn Tyr-re változik.

Az,A táblázatban bemutatjuk a természetes B. t. δ-endotoxin nukleotidszekvenciáját és az ebből kikövetkeztetett aminosavszekvenciát. Egy kivétellel ezt a nukleotidszekvenciát kaptuk egy, a B. t. wuhanensisben található δ-endotoxin-termelő plazmidból. Pontosabban a teljes struktúrgén (amely ténylegesen magát az endotoxint kódolja) a B. t. wuhanensisből való, és az egyetlen kivétel az, hogy a metionint (Met) megelőző szekvencia a struktúrgén elejénél egy, a B. t. kurstaki HD-1-ben található endotoxintermelő génből (a HD-1 ún. 5,3 kb-s HindlII plazmidja) van, így a felfelé levő szekvencia az ilyen B. t. kurstaki HD-1 endotoxin-termelő plazmidból származó natív riboszóma kötőhelyet (RBS) tartalmazza. A riboszomális kötőhelyet tartalmazó felfelé levő szekvencia a B. t. wuhanensisben valamelyest különbözik az A táblázatban levő, a B. t. kurstaki-hoz tartozó szekvenciától; a különbségeket később majd jelezzük. Figyelembe kell vennünk azonban, hogy a szóban forgó B. t. wuhanensis és B. t. kurstaki HD-1 struktúrgéneknek mind nukleotid-, mind aminosavszekvenciái azonosak az endotoxin szekvencia kezdetétől a teljes aktív részen át egészen legalább az A táblázatban jelzett KpnI helyig, ahol az említett KpnI hely a protoxin területben van. így a rovarok által végzett emésztésnél a hasításból létrejövő aktív toxinrész azonos mindkét szóban forgó endotoxinnál, a B. t. wuhanensis endotoxinnál és a B. t. kurstaki HD-1 endotoxinnál. Az A táblázatban a struktúrgén kifejeződésének eredményeképpen termelt endotoxin fehérjéhez tartozó aminosavakat pozitív számokkal jelöltük zárójelben l-től 1181-ig az aminosavak alatt. A nemtranszlatált területben, az 1-Met-től fölfelé levő aminosavak negatív számozást kapnak hátrafelé, vagyis „fölfelé” irányban (ahol a stop szignált aminosav-helynek számoljuk). A struktúrgénben levő nukleotidokat zárójelbe nem tett számokkal számozzuk a fölött a vonal fölött, amelyben fel vannak tüntetve, és a szám utolsó számjegye a fölött a nukleotid fölött áll, amelyhez a szám tartozik. A nem-transzlatált területben levő nukleotidok, amelyek magukban foglalják a riboszomális kötőhelyet, negatív jelzéssel vannak számozva az induló ATG kodontól (amely az 1-Met-hez tartozik) visszafelé. A fentebb jelzett számozott szekvenciákon belül egy rész külön m-l-től m-116-ig terjedő számokkal is el van látva az aminosavaknál, és n-l-től η-348-ig az ilyen aminosavakhoz tartozó nukleotidoknál, hogy hangsúlyozottan jelöljük azt a nagymértékben megőrzött területet, amelynél úgy találtuk, hogy a találmányunk által végzett mutációk legtöbbje elhelyezkedik. Az A táblázatban bizonyos, a nukleotidszekvencia szempontjából fontos restrikciós helyeket is megjelöltünk egy vonallal az illető restrikciós helyhez tartozó nukleotidok fölött, és a lábjegyzetben utaltunk a megfelelő helyre. Az endotoxin toxikus része, ahogyan ezt a szakterületen már felismerték és ahogyan ezt az A táblázatban bemutatjuk, magában foglalja az 1. (Met) aminosavval kezdődő és a 610. aminosavig (Thr) terjedő aminosavszekvenciát. Az A táblázatban bemutatott teljes DNS természete miatt és abból a célból, hogy könnyebben megérthessük a leírást, meg kell jegyeznünk, hogy az A táblázat 1. sorában a nem transzlatált résszel kezdődő és a mintegy 724-725 ami3

HU 209 148 Β nosav-helyeknél levő KpnI helyig terjedő DNS és aminosavszekvenciák, valamint részeik a B. t. kurstaki HD-1-ből (az 5,3 kb-s Hindlll plazmid) származhatnak, és itt így is utalunk ezekre.

Az 1. ábra az általánosan felhasználható prAK és prAK-3 plazmidok térképét mutatja be, amelyeket különböző stádiumokban alkalmaztunk a találmánnyal kapcsolatban, és amelyek egy, a B. t. kurstaki HD-1ből származó és pikkelyesszámyúak ellen inszekticid aktivitással bíró megcsonkított B. t. endotoxint kódoló DNS-t tartalmaznak.

A 2. ábra a pB8rII plazmid térképét mutatja be, amely a prAK által kódoltnál valamivel hosszabb, csonkított B. t. endotoxin fehérjét kódoló DNS-t tartalmaz; a nevezett fehérje is B. t. kurstakiból származik és szintén van inszekticid aktivitása pikkelyesszámyúak ellen.

A 3a. és 3b. ábrák két reprenzatív kettősszálú DNS-t mutatnak be, amelyeket az ún. kodon kicserélési kísérletek elvégzésével szintetizálhatunk, és amelyek segítségével kívánt mutációk vezethetők be B. t. endotoxin DNS kódoló szekvenciába.

A 4. ábra a pBT210 plazmid térképét mutatja be, amely a B. t. wuhanensisből származó teljes hosszúságú natív endotoxint kódoló DNS-t tartalmazza, amely endotoxin aktív részének aminosavszekvenciája azonos a B. t. kurstaki HD-l-ből származó endotoxinéval, amint ez a prAK-ban és a pBBrII-ben kódolva van.

Az 5. ábra a prAK-9 plazmid rövidített térképét mutatja be egy kiemelt rész felnagyításával együtt, ahol az említett prAK-9 egyébként részleteiben hasonló a prAK-3-hoz és az említett részek és al-részei a szülő plazmidban könnyen alkalmazhatók a kodon kicserélési kísérletek végrehajtásához és általában mutációk bevezetéséhez, a találmány szerinti módon.

A prAK plazmidot E. coli JM103-ban deponáltuk az Agricultural Research Culture Collectionnál (NRRL; Peoria, Illinois) 1988. február 19-én, ahol ez az NRRL B-18329 számot kapta.

A pB8rII plazmidot E. coli JM103-ban deponáltuk az Agricultural Research Culture Collectionnál (NRRL; Peoria, Illinois) 1988. február 19-én, ahol ez az NRRLB-18331 számot kapta.

A pBT210 plazmidot E. coli JM103-ban deponáltuk az Agricultural Research Culture Collectionnál (NRRL; Peoria, Illinois) 1988. február 19-én, ahol ez az NRRLB-18330 számot kapta.

Amint említettük, a találmány szerinti pontmutációkat Bacillus thuringiensis variánsok és altípusok által termelt endotoxinok fehérjeszekvenciáihoz lehet alkalmazni, amelyek pikkelyesszárnyú lárvák ellen inszekticid hatásúak, ha tartalmazzák a fentebb jelzett 116 aminosavas megőrzött szekvenciát vagy egy olyan szekvenciát, amely nagymértékben homológ ezzel vagy lényegében ekvivalens ezzel, beleértve azokat a fehérje endotoxin szekvenciákat, amelyek természetes teljes hosszúságúak vagy lényegében teljes hosszúságúak, valamint azokat, amelyeknél a lefelé levő protoxin vagy annak inaktív része teljesen vagy részlegesen el van távolítva, de még azokat is, amelyeknél a normális C-terminális van fölfelé eltávolítva és a rövidítés belenyúlik az endotoxin aktív részébe. Amint már említettük, a B. t. kurstakiból és B. t. wuhanensisből származó endotoxinok azonos 116 aminosavas megőrzött területtel rendelkeznek, és más endotoxinok is rendelkezhetnek vagy feltételezhetően rendelkeznek ugyanezzel a 116 aminosavszekvenciával vagy ennek nagymértékben homológ ekvivalensével. így pl. a B. t. sotto, B. t. kurstaki HD-73, és B. t. galleriae törzsekről már ismeretes, hogy azonos 116 aminosavval rendelkező endotoxint termelnek, még ha egyébként ezek közül néhány valamilyen mértékben bizonyos esetekben jelentősen - el is tér az endotoxin toxikus részének arányában és a protoxin részben. Más törzsek, pl. a B. t. kurstaki HD-1 Dipel (kereskedelmi forgalomban levő altörzs) egy aminosavban különbözik a jelzett 116 aminosavas szekvenciától (az m-59 a TTG által kódolt Leu), és a szekvencia további részeiben további cserék (kiiktatások) betoldások fordulnak elő. Egyikben-másikban, amelynél úgy találtuk, hogy egy vagy több cserét tartalmaz, de aminosav homológiája legalább 95%-os a nevezett 116 aminosavas szekvenciához, egy vagy több találmány szerinti mutáns változtatást végezhetünk olyan aminosavaknál, amelyek azonosak az említett 116 aminosavas nem mutált szekvenciában levő aminosavakkal, elsősorban akkor, ha a megváltoztatandó aminosav mindkét oldalán két, előnyösen négy további olyan aminosav áll, amelyek szintén azonosak a 116 aminosavas szekvenciában levő aminosavakkal. A találmány szerinti mutációkat homológ sorozatokban levő megfelelő aminosavakon is végezhetjük, amelyek kiiktatásokat vagy betoldásokat tartalmaznak úgy, hogy a szekvencia maga hosszabb vagy rövidebb, mint a jelzett 116 aminosavas szekvencia. Ilyen esetekben is fenntartjuk a 116 aminosavra alkalmazott számozást úgy, hogy a megváltoztatott szekvenciában jelen levő kiiktatásokat úgy számozzuk, mintha aminosavak ténylegesen jelen lennének, és a betoldásokat a megváltoztatott szekvenciában egyszerűen nem számozzuk. így tehát az aminosavak helyét mutató jelzésekről elmondhatjuk, hogy egy ilyen homológ szekvenciában függetlenek a kiiktatásoktól és betoldásoktól.

A homológ aminosavszekvenciák, amelyeken a találmány szerinti mutáns változásokat végezzük, előnyösen azok, amelyeket olyan DNS-ek kódolnak, amely DNS-ekhez az A táblázatban n-1 hellyel kezdődő és az n-348 helyig terjedő DNS vagy értelmes (sense) vagy nem értelmes (antisense) szála (vagy kettős szála) szigorú hibridizálási körülmények között hibridizál, ha a mutálandó homológ szekvencia olyan aminosavakból áll, amelyek megfelelnek az idézett 116 aminosavas szekvenciában lévő aminosavaknak, amelyeket ugyanazok a kodonok kódolnak, mint a megfelelő aminosavakat a referenciaszekvenciában. Az ilyen összetoldott hibridizáló vizsgáló minta előállítására szolgáló eljárások a szakterületen jól ismertek. „Szigorú hibridizáló körülmények”-ről beszélünk, ha a hibridizálást 60 °C hőmérsékleten 2,5xfiziológiás sóoldatcitrát (SSC) pufferban végezzük, amelyet 37 °C hőmér4

HU 209 148 Β sékleten egyszerű öblítés követ csökkentett pufferkoncentrációnál, amely nem hat a végbemenő hibridizálásra.

A mutációkat előnyösen olyan aminosavszekvenciákon végezzük, amelyekben legfeljebb 1, 2 vagy 3 aminosav különbözik a 116 aminosavas referencia szekvenciához viszonyítva; legelőnyösebben ez olyan szekvencia, amely azonos a referencia szekvenciával.

A technika állása szerint ismeretes, hogy a 116 aminosavas referencia szekvencia egy olyan endotoxin protein szekvencia része lehet, amely egyébként jelentősen módosított vagy eltérő, és amely pikkelyesszárnyúak lárvái ellen inszekticid hatású, és a referencia szekvencián kívül levő további módosítások bizonyára jórészt nincsenek feltárva, mivel az ismeretek ezen a területen még fejlődőben vannak. így tehát a 116 aminosavas referencia résszel mutált szekvenciarészt határoló szekvenciák jelentős eltéréseket mutathatnak, csupán az szükséges, hogy inszekticid hatású endotoxin, pl. a dohány bimbóféreg elleni inszekticid hatású fehérje kialakítására megfelelőek legyenek. Tehát a mutált résztől felfelé levő aminosavszekvencia lehet rövidebb vagy hosszabb vagy önmagában mutált az A táblázatban bemutatotthoz képest, de általában metioninnal kezdődik és legelőnyösebben nagymértékben (95%) homológ vagy azonos azzal, bár nyilvánvaló, hogy az ilyen szekvencia kívánt esetben tartalmazhatja a 4. helyzetben a találmány értelmében végzett előnyös mutációt. Hasonlóképpen a találmány szerinti eljárásban érintett szekvencia-résztől lefelé levő rész az A táblázatban bemutatotthoz viszonyítva nagymértékben eltérhet és rövidebb vagy hosszabb, egészen a rovarok bélrendszerében végbemenő hasítás pontjáig, és természetesen egy meghosszabbított protoxint is alkothatnak, amely a rovarok bélrendszerében inszekticid szempontból aktív fehérje toxin felszabadulása közben hasad.

A találmány szerinti mutáns endotoxinokat kódoló szekvenciákat tartalmazó DNS-t megfelelő szabályozó szekvenciákat tartalmazó plazmidokba építjük be, így kifejező vektorokat képezünk, amelyeket sejtekbe transzformálunk vagy átfertőzünk, és így endotoxinokat termelünk. Az endotoxinok termelése ilyen rekombináns biotechnológiai technikákkal - ellentétben például a gyógyszerek termelésével - nem igényel jelentős vagy semmilyen az endotoxin tisztítására irányuló feldolgozási munkát. A termelő sejteket lizálhatjuk, de amint ez korábban a B. t. endotoxinok kereskedelmi célú termelésében jellemző volt, egyszerűen alkalmazható a teljes tenyészet vagy fermentlé, általában hagyományos módon, pl. alacsony hőmérsékleten végzett porlasztásos szárítás után, amely a szakterületen ismert. A terméktől függően különböző anyagok adagolhatók a termék stabilitásának javítására, amint ez szintén közismert, így például, ha a fermentlében nincs elég fehérjeszerű anyag jelen, a stabilitás fokozására szójalisztet vagy zsírtalanított szójalisztet keverhetünk hozzá.

Bár az endotoxinokat biotechnológiai úton sokféle transzformált vagy átfertőzött sejtrendszerben termelhetjük, általában előnyös Gram-negatív vagy Gram-pozitív típusú bakteriális sejteket transzformálni vagy átfertőzni. A Gram-negatív baktériumok egyik előnyös típusa az E. coli, amellyel kapcsolatban már jelentős tapasztalatok gyűltek össze a biotechnológiában, és amelyhez nagyon sokféle alkalmas és operatívan működő plazmid és átvivő kifejező vektor rendszer ismeretes és áll rendelkezésre. A Pseudomonas fluorescens a Gram-negatív baktériumok egy másik típusa, amelybe endotoxin szekvenciákat hordozó plazmidokat építettek be. Amint említettük, az endotoxin-termelő gének szabályozó szekvenciákat, pl. elsősorban B.t.-ből származó riboszomális kötőhely szekvenciákat is magukban foglalhatnak, amikor kifejeződéshez lényegében heterológ bakteriális sejtekbe, pl. E. coliba építjük be. Mivel a Bacillus típusú baktériumok természeteshez sokkal inkább hasonlító közeget nyújtanak a találmány szerinti mutáns endotoxinok kifejezésére, a találmány értelmében előnyösen Bacillus típusú baktériumokat transzformálunk vagy fertőzünk át olyan kifejező vektorokkal, amelyek a találmány szerinti mutáns endotoxinokat kódoló DNS-t tartalmazzák. Ilyen Bacillus sejtek különösen előnyösen a B. t. sejtek, B. cereus sejtek és B. subtilis sejtek. Bacillus sejtek, elsősorban B. t. sejtek transzformálására nagymértékben javított eljárást ismertet a 8 729 726 számon bejelentett brit szabadalmi bejelentés. Az eljárással történő transzformáláshoz alkalmas sejttípusok például a cry mínusz sejtek, amelyeknek nincs plazmidja, és a vad típusú Bacillus sejtek, pl. a natív B. t. sejtek, amelyek endotoxin-termelő plazmidokat hordoznak. A Bacillus sejtekbe, pl. B. t. sejtekbe való beépítéshez alkalmas plazmidok közül ismert pl. a pBC16.1 plazmid [Kreft és munkatársai: Molec. Gén. Génét. 162, 59 (1978)] és ennek szülő plazmidja, amelyek alkalmazhatók vagy hagyományos rekombináns DNS technikákkal módosíthatók, hogy a találmány szerinti mutáns endotoxin kódoló szekvenciákat hordozzák. Amint a szakterületen jól ismert, a Bacillus sejtek jellemző módon toxint kívánt mennyiségben csak spórázási stádiumukban termelnek, így eddig a stádiumig növesztjük abból a célból, hogy az inszekticidként alkalmas terméket a legjobb termeléssel kapjuk. így tehát a találmány szerinti eljárással előállított és a mutáns endotoxinokhoz tartozó DNS-t hordozó plazmidokat vagy kifejező vektorokat olyan Bacillus sejtekbe építhetjük be, amelyek vagy mentesek az endotoxin-termelő plazmidoktól, vagy már tartalmaznak egy vagy több ilyen plazmidot. Míg a találmány szerinti mutáns endotoxinok jellegzetesen rendelkeznek pikkelyesszárnyúak elleni aktivitással, más rovarok elleni endotoxin aktivitással is rendelkezhetnek vagy azért, mert ez a szülő endotoxinban jelen volt a mutáció előtt, vagy más megengedett szekvenciaváltozás eredményeképpen. A találmány oltalmi körébe tartozik az olyan Bacillus sejtek transzformálása is a találmány szerinti, pikkelyesszárnyúak ellen toxikus endotoxint termelő plazmidokkal, amelyek pikkelyesszárnyúak ellen lényegében nem hatásos endotoxinokhoz tartozó plazmidokat már tartalmaznak, abból a célból, hogy a spórázás során olyan endotoxi5

HU 209 148 Β nők keletkezzenek, amelyek aktivitásában az inszekticid hatás szélesebb tartománya kombinálódik. így pl. a mutált endotoxin DNS kódoló szekvenciát hordozó plazmidokat alkalmazhatjuk B. t. israeliensis vagy B. t. tenebrionis transzformálására, amelyek önmagukban lényegében nem hatásosak pikkelyesszámyúak ellen.

Bár a találmány szerinti megoldást mind rövidített, mind teljes hosszúságú natív típusú endotoxin fehérjék esetén bemutatjuk, általában előnyös, ha minél teljesebb hosszúságú szekvenciákat alkalmazunk vagy állítunk elő, amelyek azonosak a natív típusúval vagy utánozzák azt legalábbis annak a lehetőségnek a szempontjából, hogy az endotoxin fehérje összehajtódási képessége hasonló legyen a natív fehérje összehajtódási képességével, vagy megjavított összehajtódást érjünk el, amikor a mutáns endotoxint közvetlenül kívánjuk inszekticidként felhasználni.

A találmány szerinti mutáns DNS szekvenciákat valamely növény genomjába is beiktathatjuk. Ilyen esetekben előnyös, ha a rövidített típusú mutált szekvenciákat alkalmazzuk, bár a teljes hosszúságú szekvenciák szintén alkalmasak. Egy gazdanövény genomjába történő beépítéshez bármely alkalmas módszer előnyösen használható. Ilyen módszerek pl. a beépítés az Agrobacterium tumefaciens Ti plazmidja útján, elektroporáció, elektrotranszformáció, mikroinjektálás, vírusfertőzés vagy olyan vegyi anyagok alkalmazása, amelyek indukálják vagy növelik a szabad DNS felvételét stb. Az ilyen eljárások és ezek alkalmazása a növények transzformálásában a szakterületen jól ismert. A mutáns endotoxint kódoló DNS szekvenciát előnyösen megfelelő szabályozó szekvenciákkal, pl. a növényekben működőképes operátor és 3’ szabályozó szekvenciákkal kapcsoljuk, és ezt az egészet kifejező típusú vektorba építjük be. A növényi sejtekbe történő transzformálás, majd a sejtekből teljes növény kifejlesztése lehetővé teszi, hogy a mutáns endotoxin DNS szekvenciák a növényi genom stabil és állandó részévé váljanak, és az egyik generációból a következőbe mitózis és meiozis révén átjussanak és ezáltal a növénynek örökölhető rezisztenciát biztosítsanak. Kísérleteink során a mutációhoz két nagyon hasonló vektort (prAK és prAK-3) alkalmaztunk B. t. δ-endotoxin-szekvencia forrásaként és ezeket használtuk hordozóként a B. t. endotoxin mutánsok termeléséhez és értékeléséhez is. A prAK és prAK-3 plazmidokat az 1. ábrán mutatjuk be, ahol feltüntettük a prAK vonatkozó részleteit, és jeleztük a kisebb eltéréseket ettől, amelyek a prAK-3bán találhatók. A prAK és prAK-3 plazmidok alapjában véve teljesen kompetens kifejező vektorok E. colihoz, és mindegyik tartalmaz ampicillin rezisztencia gént, replikációs origót és operátor szekvenciákat, beleértve valamely E. coli promotort. Amint az 1. ábrán vastag, sötét vonalakkal és keretekkel jelezzük, a prAK vektor a promotorral összhangban levő megfelelő leolvasó keretben olyan DNS szekvenciát foglal magában, amely a vad típusú B. t. kurstaki HD-1 törzsben található. A vastag sötét vonal az érett szekvenciát képviseli, amely le van rövidítve, hogy olyan rövidített natív B. t. δ-endotoxint kódoljon, amely az A táblázat szerinti 1. aminosav helytől (Met) a 610-ig (Thr) terjed, majd tovább terjed a protoxin részre, ahol a 723. (Leu) aminosavval végződik. Az 1. ábrán az említett vastag, sötét vonal lefelé eső végénél egy kis üres téglalap egy 54 bázispáros rövid DNS szekvenciát képvisel, amely a 723-Leu-t kódoló bázispár triplettet követi és amelyet közvetlenül egy stop szignál követ. Ez az összesen 57 bázispámyi szekvencia (beleértve a stop szignált) a jól ismert pBR322-ből származik, amelyet a prAK megalkotásában alkalmaztunk. így a prAK kifejező vektor E. coliban rövidített B. t. δ-endotoxin fúziós fehérjét kódol és termel, amelynek a teljes hossza 741 aminosav a natív protoxin rész 610 aminosavából és 18 a pBR322 származó szekvencia által kódolt aminosavból áll. Ez a rövidített B. t. endotoxin fúziós fehérje magas szintű inszekticid aktivitással bír, és ezt alkalmaztuk a munkánkban kialakított mutánsok értékelésére. Ez az aktivitás lényegében megkülönböztethetetlen egy olyan rövidített B. t. δ-endotoxin fehérje aktivitásától, amely csak az aktivált toxin 610 aminosavát tartalmazza (az A táblázatban az 1-610. aminosavak).

Az 1. ábrán a rövidített B. t. endotoxin fúziós fehérjét kódoló szekvencia legnagyobb részét ábrázoló vastag sötét vonal felső végénél egy fekete téglalapot tüntettünk fel, amely egy a B. t. riboszomális kötőhelyet (RBS) magában foglaló szekvenciát képvisel. Ez a rész (amelyet az A táblázatban is bemutatunk, lásd az 1. és 2. vonalakat), amely az RBS-t tartalmazza, mintegy 47 nukleotiddot tartalmaz, és a felső végénél egy BamHI hely van (ez a korábbi plazmidokba van beiktatva, hogy összekapcsolja ezt a részt az E. coli promotor résszel, amelyet nyíl jelöl az 1. ábrán). A promotor és RBS részeket (szekciókat) úgy rendezzük el és egyesítjük, hogy megfelelő leolvasó keretben legyenek az endotoxint kódoló szekvenciával. A vastag sötét vonalak és téglalapok együtt képviselik azt a DNS-t, amely B. t. kurstaki HD-1-ből származik.

Különböző más, az 1. ábrán jelzett restrikciós helyek is fontosak a DNS részek kényelmes eltávolításához és újra beiktatásához szolgáló stratégiához a mutációs kísérletekben. Ilyenek az Nsil hely (amely csak mintegy 26 nukleotiddal később kezdődik az endotoxin kódoló szekvencia rajtja után), a két Xbal hely (lásd alább a prAK-3-mal kapcsolatban), az SstI hely és a HindUI hely.

Amint említettük, a prAK-3 a prAK-tól csak egyetlen csekély, tekintetben különbözik. A különbség az, hogy az A táblázat 292-297. nukleotid helyénél levő Xbal helyet (TCT AGA) standard technikákat alkalmazva TCG CGA-vá változtatjuk, ezáltal Nrul helyet alakítunk ki. A kódolt aminosavszekvenciában ezáltal nem jön létre változás. A prAK-3 előállítását a későbbiekben az 1. példa a) lépésében írjuk le. A prAK-3 az első intermedier a prAK-7 és prAK-9 plazmidok előállításához.

A hagyományos módon [pl. Craick eljárása: Biotechniques, 1985. január/február, 12-19. oldal: „Use of Oligonucleotides fór Site-Specific Mutagenesis” (Oligonukleotidok alkalmazása helyspecifikus mutagenezishez)] mutált prAK-ból és prAK-3-ból való, külön6

HU 209 148 Β böző hosszúságú egyszálú DNS részekből (értelmes és nem értelmes szálakból egyaránt) eredő DNS fragmenseket a továbbiakban M-l-ként és Μ-2-ként említjük. Az M-l egy 375 bázispáros részt jelöl a prAK-ban levő két Xbal hely között, és az M-2 a prAK-3-ban a BamHI és Xbal helyek közti részt jelöli (amint ezt az 1. ábrán bemutatjuk).

A két Xbal hely közt található mutációt a találmány szerinti módon a következőkben ismertetett prAK-7, prAK-8 vagy prAK-9 plazmidok és szintetikus kettős szálú oligonukleotidok segítségével végezhetjük, amelyeket a 2. példában leírt eljárással analóg módon alkothatunk meg és alkalmazhatunk.

A mutációt követően a mutált egyszálú részeket hagyományos módon kettős szálúvá tesszük. Az M-l mutánsok esetében, mutációs hordozóként prAK-t alkalmazva, a létrejött kettős szálú, mutált plazmidot E. coli JM103-ba transzformáljuk, 50 gg/ml ampicillint is tartalmazó YT agarra szélesztjük, és egy éjszakán át inkubáljuk; ilyen módon olyan telepeket kapunk, amelyekben levő plazmidokban sokféle mutáció fordul elő, és amelyekben plazmidok a mutációk kivételével egyébként azonosak a prAK-val.

Az M-2 mutánsok esetében a mutációs hordozóban levő BamHI és Xba helyek között mutált kettős szálú területet BamHI, illetve Xbal restrikciós endonukleázokkal kivágjuk, és ugyanezzel a két enzimmel emésztett prAK-3 vektorba ligáljuk. Az így létrejött M-2 terület mutánst tartalmazó prAK-3 plazmidot E. coli JM103-ba transzformáljuk, 50 μg/ml ampicillint is tartalmazó YT agarra szélesztjük, és egy éjszakán át inkubáljuk, így egy másik telepsokaságot kapunk, amely sokféle különböző mutációt foglal magában.

A pl. E. coli JM103-ban vagy E. coli SG4044-ben [ez utóbbi törzs a köz rendelkezésére áll az Agricultural Research Culture Collection-nál (NRRL, Peoria, Illinois) B-15969 deponálási számon] levő DNS kifejezésével kapott mutagenizált endotoxin szekvenciák aktivitásának kimutatását dohány bimbóféreg (TBW) vizsgálattal vagy T. ni vizsgálattal vagy mindkettővel végeztünk, amint ezt a későbbi A példában leírjuk. Azoknak a mutánsoknak a DNS-eit, amelyek a standard, nem mutált endotoxinhoz viszonyítva megnövekedett aktivitást mutatnak, szekvenciaelemzésnek vetjük alá a mutáció fontosabb területeire nézve, hogy meghatározzuk a mutációt a DNS-ben és így a fehérjeszekvenciában is. Több mint 6000 különböző, M-l vagy M-2 mutagenizált részeket tartalmazó plazmidtelepet értékeltünk, és általában 1-3 aminosav változást találtunk, amelyek az egyes mutációs kísérletekben végbementek.

Az alábbi B táblázatban láthatók azok a mutánsok, amelyeket közvetlenül a mutációs kísérletek eredményeképpen nyertünk, megjelöltük az aminosav-helyeket, ahol az egyes mutációk végbementek (az A táblázat szerint jelölt helyszámozásra utalva), az egyes mutánsokban mutált egyes kodonokat, és azokat az aminosavváltozásokat, amelyek a jelzett helynél a kodonváltozás eredményeként jöttek létre.

A B táblázatban mínusz, vagyis negatív aminosav helyszámok a BamHI hely és az endotoxin szekvencia kezdeténél levő Met hely közti változásokat jelzik, ezek a változások tehát nem érintik a mutáns szekvencia által kódolt endotoxin szekvenciáját.

Az alábbi B táblázatban azonosított mutánsokat a TBW vizsgálat mindhárom fázisában értékeltük, ezek eredményeiről a B-l táblázatban számolunk be. Ezek közül a mutánsok közül többet T. ni vizsgálatban is értékeltünk, ennek eredményeit az alábbi B-2 táblázatban mutatjuk be.

B táblázat

Mutáci- ós szekció	Mutáns	Az aminosav helye	Változás az endotoxin területen
nukleinsav	aminosav
M-l	p26-3	119	GCAACA-ra	Alá Thr-re
130	ATGATA-ra	Met lle-re
201	GGC GAC-re	Gly Asp-ra
M-l	p48al4	101	GAAAAA-ra	Glu Lys-re
116	GAG AAG-re	Glu Lys-re
217	CGTCAT-re	Arg His-re
M-l	p48c5	116	GAG AAG-re	Glu Lys-re
187	GCG ACG-re	Alá Thr-re
M-l	p36a65	122	ACTATT-re	Thr lle-re
125	GCAGTA-ra	Alá Val-ra
M-2	p95a76	123	AATTAT-re	Asn Tyr-re
M-2	p95a86	188	ACTTCT-re	Thr Ser-re
M-2	p98cl	188	ACTTCT-re	Thr Ser-re
M-2	p99c62	204	ACAACT-re	Thr Thr-re
105	AATTAT-re	Asn Tyr-re
4	AATTAT-re	Asn Tyr-re
M-2	pl07c22	194	AATAAA-ra	Asn Lys-re
94	AAC AAA-ra	Asn Lys-re
M-2	pl07c25	184	TTTATT-re	Phe lle-re
-11	TTG TAG-re	-
M-2	pl!4a30	95	CAA AAA-ra	Gin Lys-re
-15	TATTAA-ra	-

Az alábbi B-l táblázatban a toxicitási oszlopban levő alacsonyabb pontszámok a nagyobb aktivitás szintet jelzik (lásd az A példát a toxicitási pontszámok magyarázatához). Kontrollként olyan E. coli JM103 és E. coli SG4044 sejteket alkalmaztunk, amelyek előzőleg semmiféle plazmiddal nem voltak transzformálva. Látható, hogy az összes mutáns lényegesen aktívabb, mint a prAK plazmidot tartalmazó ilyen sejtek ekvivalens mennyisége által termelt rövidített natív endotoxin.

HU 209 148 Β

B-l táblázat

Mutáns, a B táblázatra utalva	Toxicitási pontszám átlagos toxicitás
p26-3	2,75
p48al4	2,25
p48c5	2,63
p36a65	1,50
p95a76	2,50
p95a86	1,30
p98cl	1,33
p99c62	1,83
pl0c22	1,42
pll4a30	2,00
kontroll (JM103 sejtek)	4,68
prAK	3,35
kontroll (SG4044 sejtek)	4,12

B-2 táblázat

Mutáns, a B táblázatra utalva	Relatív potenciál
p26-3	217
p36a65	887
p95a76	291
pl07c22	357
pll4a30	239
kontroll (SAN415)	59
pBT301	100

A fenti B-2 táblázatban az LD₅₀ érték alapján a standard pBT301 plazmidhoz rendeljük 100 relatív potenciál értéket (a teljesebb leírással kapcsolatban lásd az A példát), és így bármely magasabb relatív potenciál érték a mutáció által okozott megnövekedett toxicitás szintet jelez.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során a fenti B táblázatban bemutatott bizonyos többszörös mutációt tartalmazó mutáns DNS-ek elemzésével meghatároztuk az egyes mutációk vagy mutáció-párok hatását a többszörösen mutált részekben. Az egyes mutációk vagy mutáció-párok szubklónozását olyan stratégia szerint hajtjuk végre, amelyben szerepel egy célzott többszörösen mutált fragmentum izolálása, majd ennek hasítása egy, a fragmentumon belül levő, két mutált kodon közt elhelyezkedő restrikciós helynél. A két fragmentum részt azután gélen izoláljuk, és egyenként összekeverjük prAK-ból való azonos fragmentumok hasonló hasításából kapott fragmentumrészek komplementer nem-mutáns felével. A prAK vektort, amelyet előzőleg hasítottunk abból a célból, hogy izoláljuk a nagyobb komplementer fragmentumot, ezután összekeverjük a két összekevert komplementer féllel, és a három DNS részt együtt ligáljuk, hogy olyan módosított prAK plazmidot kapjunk, amely tartalmazza a többszörösen mutáns klónból eredő fragmentum-félben jelen levő pontmutációt vagy mutációkat. Közelebbről egy XhoII restrikciós endonukleáz hasítási helyet helyezünk el stratégiai célból bizonyos többszörösen mutáns részeken belül, hogy lehetővé váljék olyan fragmentumok izolálása, amelyek a mutációk teljes számánál kevesebb mutációt tartalmaznak a teljes mutáns részben. Amint ez nyilvánvalóan látható, az XhoII endonukleáz a B táblázatban említett számos többszörös mutáns részre is alkalmazható abból a célból, hogy bizonyos fragmentumokat két mutációval kapjunk. így tehát a többszörösen mutáns plazmidokat először Nsil és Sstl restrikciós endonukelázokkal kezeltük, és az így létrejött 1430 bázispáros fragmentumokat gélen végzett izolálással elkülönítettük. Az ilyen 1430 bp-s fragmentumokat azután XhoII restrikciós endonukleázzal kezeltük, és az így létrejött 330 bp-s (Nsi Ι/XhoII)) és 1100 bp-s (XhoII/SstI) fragmentumokat minden többszörös mutánsnál gélen izoláltuk. Hasonlóképpen kaptuk meg a prAK-ból a megfelelő nem mutáns 330 bp-s és 1100 bp-s fragmentumokat és a nagyobb, mintegy 4 kb-s NsI/SstI fragmentumot. Pontosabban a nagyobb rész (szegmens) kis mennyiségeit összekevertük a mutált 330 bp-s fragmentummal és a nem-mutált 110 bp-s fragmentummal, és az így létrejött keveréket ligáivá a prAK-nak egy sorozat hibrid mutáns plazmidját alakítottuk ki. Hasonlóképpen ilyen nagyobb prAK részek bizonyos mennyiségeit összekevertük a nem-mutált 300 bp-s fragmentumokkal és a mutáns 1100 bp-s fragmentumokkal és ezeket a DNS-eket ligáivá hibrid mutáns plazmidoknak egy másik sorozatát alakítottuk ki. A fentebb jelzett stratégiával kialakított hibrid mutáns plazmidokat vagy kiónokat az alábbi C táblázatban foglaljuk össze, amely a három kombinált szegmenst, valamint az így létrejött plazmidban a mutációkat a prAK plazmiddal összehasonlítva mutatja be.

C táblázat

Újon- nan képzett prAK	Vektor szeg- mens és forrás	A 330 bps Nsil/ XhoII szegmens forrása	A 110 bps XhoIISstl szegmens forrása	Mutáció; az aminosav helye
A	prAK NSil/ Sstl	p48al4	prAK	Glu Lys-re 101-nél
	4kb			Glu Lys-re 116-nál
B	4kb	p26-3	prAK	AlaThr-re 119-nél
C	4kb	p48c5	prAK	Glu Lys-re 116-nál
D	4kb	prAK	p48al4	Arg His-re 217-nél
E	4kb	prAK	p26-3	Metlle-re 130-nál
				Gly Asp-ra 201-nél
F	4kb	prAK	p48c5	Alá Thr-re 187-nél

Hibrid mutáns klón készítmények egy második körében a C táblázat kiónjainak előállításánál alkalmazottal analóg eljárással kevert kombinációs mutáns plazmidok sorozatát állítottuk elő három szegmens: a prAK-nak Nsil-gyel és Sstl-gyel végzett emésztéséből

HU 209 148 Β származó nagy szegmens (durván 4 kb), a B táblázat kiónjainak egyikéből való 330 bp-s Nsil/XhoII fragmentum és B táblázat egy másik klónjából való 1100 bp-s XhoII/SstI fragmentum kombinációjával. Az ebből a második körből létrejött hibrid mutáns kiónokat 5 az alábbi D táblázatban mutatjuk be; megjegyezzük, hogy az ebből a második kör szerinti munkamenetből kikerülő két plazmid négy aminosav változást tartalmaz a szülő prAK plazmidhoz képest.

D táblázat

Újonnan képzett prAK	Vektor szegmens és forrás	A 330 bp-s Nsil/XhoII szegmens forrása	A 110 bp-s XholI-SstI szegmens forrása	Mutáció; az aminosav helye
prAK-J	prAK N Si/Sst; 4 kb	p48al4	p26-3	Glu Lys-re 101-nél
prAK N Si/Sst;
Met lle-re 130-nál
Gly Asp-ra 201-nél
prAK-K	prAK N Si/Sst; 4kb	p48al4	p48c5	Glu Lys-re 101-nél
Glu Lys-re 116-nál
AlaThr-re 187-nél
prAK-L	prAK N Si/Sst; 4 kb	p48c5	p26-3	Glu Lys-re 116-nál
Met Ile-re 130-nál
Gly Asp-ra 201-nél
prAK-M	prAK N Si/Sst; 4 kb	p26-3	p48al4	AlaThr-re 119-nél
Arg His-re 217-nél
prAK-N	prAK N Si/Sst; 4 kb	p26-3	p48c5	AlaThr-re 119-nél
AlaThr-re 187-nél
prAK-0	prAK N Si/Sst; 4 kb	p48c5	p48al4	Glu Lys-re 116-nál
Arg His-re 217-nél
prAK-P	prAK N Si/Sst; 4 kb	p26-3	p36a65	AlaThr-re 119-nél
Thr lle-re 122-nél
Alá Val-ra 125-nél
prAK-Q	prAK N Si/Sst; 4 kb	p48c5	p36a65	Glu Lys-re 116-nál
Thrlle-re 122-nél
Alá Val-ra 125-nél
prAK-R	prAK N Si/Sst; 4 kb	p48al4	p36a65	Glu Lys-re 101-nél
Glu Lys-re 116-nál
Thr lle-re 122-nél
Alá Val-ra 125-nél
prAK-S	prAK N Si/Sst; 4 kb	p26-3	p95a86	AlaThr-re 119-nél
Thr Ser-re 188-nál
prAK-T	prAK N Si/Sst; 4 kb	p48c5	p95a86	Glu Lys-re 116-nál
Thr Ser-re 188-nál
prAK-U	prAK N Si/Sst; 4 kb	p48al4	p95a86	Glu Lys-re 101-nél
Glu Lys-re 116-nál
Thr Ser-re 188-nál
prAK-53	prAK N Si/Sst; 4 kb	p99c62	pl07c25	Asn Tyr-re 105-nél
Phe lle-re 184-nél
prAK-68	prAK N Si/Sst; 4 kb	p99c62	p26-3	Asn Tyr-re 105-nél
Metlle-re 130-nál
Gly Asp-ra 201-nél
prAK-70	prAK N Si/Sst; 4 kb	p26-3	pl07c25	AlaThr-re 119-nél
Phe Ile-re 184-nél
prAK-39	prAK N Si/Sst; 4 kb	p99c62	p98cl	Asn Tyr-re 105-nél
Thr Ser-re 188-nál

HU 209 148 Β

A C és D táblázatban bemutatott különböző hibrid mutánsokat az A példában leírt dohány bimbóféreg vizsgálat szerint értékeltük. Az értékelésbe bevontuk a B táblázat mutáns kiónjait abból a célból, hogy többek között értékeljük egy vagy két mutáció kiiktatásának vagy eltávolításának hatását a B táblázat eredeti mutánsaival összehasonlítva. A toxicitási vagy inszekticid aktivitás vizsgálatoknak az eredményeit az alábbi E táblázatban adjuk meg. Ezzel kapcsolatban az alábbiakat jegyezzük meg: 1. a kisebb pontszám a toxicitási oszlopban az aktivitás magasabb szintjét jelzi (lásd az A példát a pontszámok magyarázatánál); és 2. a kontrollként olyan ekvivalens mennyiségű JM103 és SG4044 sejteket alkalmaztunk, amelyek előzőleg nem voltak transzformálva semmiféle plazmiddal. Megjegyezzük továbbá, hogy a legtöbb, ha nem éppen az összes, mindkét E. coli sejtben értékelt mutáns és az ebben a táblázatban mindkét kontrollra vonatkozó eredmények átlagérték formájában vannak megadva, amelyek a mutánsok mindkét sejttípusban történt kifejezéséből adódtak.

E táblázat

Mutáns, utalva a B, C vagy D táblázatokra	Toxicitási pontszám átlagos toxicitás
Kontroll	4,68
prAK	3,35
A	2,05
B	2,90
C	2,68
D	3,40
E	2,50
F	3,00
E. coli SG4044 (kontroll)	4,12
J	2,25
K	2,06
L	2,08
M	3,10
N	2,73
O	2,70
P	1,00
Q	1,87
R	2,85
S	2,16
T	1,20
U	2,07
53	3,08
68	2,00
70	1,50
39	2,50

A találmány kiterjed továbbá az általános aminosavhelyettesítés módszerére, amelyet azoknál az aminosavhelyeknél végzünk, ahol a véletlenszerű DNS mutációk aminosavváltozásokat idéztek elő, ezáltal új, inszekticid hatású B. t. endotoxin fehérjéket állítunk elő. A módszer a viszonylag könnyen végrehajtható ún. „kodon-kicserélés”-en alapszik, amelynek során a kezdeti mutációs változásokban érintett kiválasztott kodonokat olyan kodonokká változtatunk, amelyek más természetes aminosavakat kódolnak. Ezek az új mutánsok olyan endotoxin fehérjéket kódolnak, amelyek inszekticid hatásúak dohány bimbóféreg ellen. Abból a célból, hogy a vizsgálatot hatékonyabbá tegyük, egyedi prAK típusú plazmidok sorozatát állítottuk elő, lényegében a prAK-val kezdve és a prAK-7 plazmiddal fejezve be, ezek közé tartoznak az előállítás sorrendjében a prAK-3, prAK-4, prAK-5 és prAK-6, amint ezt az 1. példában leírjuk. A 2. ábrán bemutatott pB8rII plazmid azonos a prAK plazmiddal, azzal az eltéréssel, hogy olyan DNS-t tartalmaz, amely valamivel hosszabb megrövidített endotoxint kódol, mint a prAK, továbbá jelentéktelen módosításokat tartalmaz a szülő plazmidhoz képest a szülő plazmidnak a megrövidített endotoxin struktúrgén lefelé lévő végéhez való ligálási területében, ahol az említett struktúrgén - amint a 2. ábrán bemutatjuk - egy KpnI helyet tartalmaz a natív génben, míg a prAK-ban ez a hely ki van iktatva, és a prAK struktúrgénje körülbelül az említett helyet megelőző helynél ér véget. A prAK-7 plazmidot úgy terveztük, hogy azonos endotoxin aminosav szekvenciát fejezzen ki, mint a prAK, de módosított DNS szekvenciával rendelkezzék, hogy ne csupán a prAK-3 Nrul helyét foglalja magában, hanem egy HindlII, MstlI és BssHI helyet is, és a prAK-3-ban eredetileg található HindlII hely előnyösen el legyen távolítva. Amint az 1. példában még pontosabban kifejtjük, a prAK-7 előállításának sorrendjét prAK-ból és egy hely hozzáadását vagy kiiktatását az egyes lépésekben, az alábbiakban összegezhetjük:

prAK---------prAK-3 (Nrul hozzáadása) prAK-3------prAK-4 (HindlII hozzáadása) prAK-4------prAK-5 (MstlI hozzáadása) prAK-5------prAK-6 (BssHII hozzáadása) prAK-6......prAK-7 (az eredeti HindlII kiiktatása)

A fentebb jelzett helyeket egymástól mintegy 40 bázispárra vezettük be úgy, hogy automatizált DNS szintetizáló berendezést alkalmazhatunk olyan kis kettős szálú DNS fragmentumok hatékony előállítására, amelyek két végükön a prAK-7-ben megalkotandó azon restrikciós helyek nukleotidjaival komplementer nukleotidokkal végződnek, amelyekkel a prAK-7-et hasítjuk. Az ilyen fragmentumokat ennek megfelelően könnyen be lehet építeni prAK-7-be standard hasítási és ligálási munkamenetekkel (lásd a későbbi P példát), hogy olyan plazmidot alakítsunk ki, amely egy, a prAK fehérjével lényegében azonos endotoxin fehérjét fejez ki, azzal a különbséggel, hogy a prAK-7-be beépített fragmentum szintetizált fragmentum által kódolt aminosavakat tartalmazza, amint ezt a 2. példában pontosabban bemutatjuk.

A 3A és 3B ábra két kis kettős szálú DNS fragmentumot ábrázol, amelyeket a fentebb említett kodon-ki10

HU 209 148 Β cserélés! stratégia szerint készítettünk, hogy beépíthetők legyenek a HindlII/MstlI részbe a prAK-7-ben. A 3A ábrán bemutatott kettős szálú fragmentumot úgy terveztük, hogy az XXX kodonnak a genetikai kód szerint megfelelő megválasztásával a prAK plazmidok által kifejezett megrövidített B. t. endotoxinok 116. aminosavhelyénél bármely aminosavat kódoljon. Hasonlóképpen a 3B ábrán bemutatott kettős szálú fragmentumot úgy terveztük, hogy az XXX kodon megfelelő megválasztásával a prAK plazmidok által kifejezett megrövidített B. t. endotoxinok 119. aminosav helyénél egy megfelelő aminosavat kódoljon. Amint nyilvánvalóan látható, a prAK-7-ben levő Spel/Nrul helybe (mintegy 115 bázispárra kiterjedő fragmentum, amely szintén elkészíthető automatizált DNS szintetizáló berendezéssel), az NruI/HindlII helybe és az MstH/BssHII helybe való beépítéshez szükséges és az ezekben a részekben található minden mutációs pontnál minden aminosav kódolására tervezett további kettős szálú fragmentumokat hasonló standard munkamenetekkel állíthatjuk elő. így tehát a prAK-7-ben az Nrul és BssII helyek közötti egyes mutációs helyeknél végzendő 19 természetes aminosav cseréből vagy mutációból a további 18 könnyen elvégezhető a prAK-7 alkalmazásával.

Abból a célból, hogy a 116 aminosavon belül az összes mutációs pontban a megfelelő kodonokat kicseréljük, a prAK-7 plazmidot alkalmazhatjuk a prAK-8 plazmid előállításához, amely viszont végül a prAK-9 előállításához alkalmazható, amint ezt az 1. példában leírjuk. Az 5. ábrán a prAK-9 egy kinagyított és kivetített részletével bemutatjuk az összes fontos restrikciós helyet, amely végül a prAK-9-ben található. Az 5. ábrán bemutatott Spel hely szintén egy olyan egyedi hely, amely már jelen volt a prAK-ban, prAK-3-ban stb.-ben is. Amint ez világosan látható, a prAK-7, prAK-8 és prAK-9 plazmidok alkalmazhatók többszörös mutációs változások bevezetésére a restrikciós hely-párok bármelyike közé, és/vagy legalább egy változást kódoló DNS előállítására két vagy több ilyen hely között, vagyis számos többszörös mutáns kombinációt lehet megalkotni, ideértve a találmány szerinti eredeti mutációs pontokat is, hogy nagyszámú, új, inszekticid hatású B. t. endotoxin fehérjét alakítsunk ki.

Az is világosan látható, hogy az olyan plazmidok, mint a prAK-7, prAK-8 és prAK-9 teljes mértékben alkalmasak arra, hogy segítségükkel egy vagy több, bármiféle kodont megváltoztassunk az ezen plazmidokban levő restrikciós hely-pár között. Ahol egy vagy két, de mindenképpen kevesebb, mint három ilyen elhelyezkedésen (lokáción) belül kívánatosak a változások, az olyan plazmidok, mint a prAK-4 vagy prAK-5 is alkalmazhatók, ha átfedik a változások kívánt elhelyezkedését, előnyösen a prAK-ban levő eredeti HindlII hely eltávolítása után. Ha a plazmidok nem megfelelőek, akkor egy vagy több, bármilyen ilyen elhelyezkedést (lokációt) tartalmazó plazmid könnyen előállítható úgy, hogy a szelekció variálásával vagy korlátozásával a restrikciós hely-párok bevezetésénél, amit a prAK módosítására használunk a prAK-9 előállításában. A találmány értelmében tehát egy sor különböző új plazmidot állítunk elő, amelyek a találmány szerinti mutánsok és mutáns kombinációk előállításához alkalmazhatók, és egy vagy több, a prAK9-ben végül kialakított restrikciós hely-pár bármelyikét tartalmazhatják.

Nyilvánvaló, hogy a prAK plazmidokból az egy vagy több, találmány szerinti mutációs módosítás előtt vagy után egy vagy több, bármilyen ilyen restrikciós hely-párt tartalmazó DNS-t kimetszhetünk olyan restrikciós helyeknél végzett hasításokkal, amelyek a kívánt mutációs területeken kívül esnek, és amelyek hasonlóan megtalálhatók egy B. t. endotoxinhoz való másik plazmidban, majd a kivágott DNS részt (szegmenst) beiktathatjuk egy másik ilyen B. t. endotoxin plazmidba, amelyet hasonlóképpen hasítunk el. Ezáltal lehetővé válik, hogy az ilyen más plazmidok könynyen módosíthatók legyenek, vagy az ilyen, találmány szerinti mutációk közvetlenül beiktathatok legyenek.

Abból a célból, hogy a találmány szerinti mutációkat egy teljes hosszúságú endotoxint kódoló szekvenciába bevezessük, olyan plazmidot alkalmazunk, amelybe a B. t. wuhanensis δ-en dotoxinjának DNS struktúrgénje épült be, mivel ez alkalmas erre a célra és jelenleg könnyen rendelkezésre áll. Ezt a plazmidot, a pBT210-et, a 4. ábrán mutatjuk be. A pBT210 plazmid tartalmazza a B. t. wuhanensisből a teljes hosszúságú struktúrgént (amint ezt a 4. ábrán a vastag, sötét vonal jelzi) és az 1. ábra analógiája szerint egy B. t. riboszomális kötőhelyet tartalmazó szekvenciát, amelyet a B. t. wuhanensisből kapunk a struktúrgénnel együtt, és amelyet a 4. ábrán a sötét téglalap jelöl. A pBT210 teljesen kompetens E. coli kifejező vektor, amely ugyanazt az E. coli promotort foglalja magában, mint a prAK plazmidok, és magában foglal egy E. coli replikációs origót (nem mutatjuk be) és egy kloramfenikol rezisztencia gént, amint ezt a 4. ábrán jelöljük. A 4. ábrán a nyilak a B. t. wuhanensis gén leolvasási irányát mutatják az E. coli promotor szabályozása alatt, valamint a kloramfenikol rezisztencia gén leolvasási irányát. A birtokunkban levő szekvencia-információk alapján a teljes operon (struktúrgén, B. t. eredetű riboszomális kötő szekvencia szekció és E. coli promotor/operátor szekvencia) nagyon hasonló és csupán jelentéktelenül tér el a prAK plazmidban levő operontól. Pontosabban a B. t. endotoxin (A táblázat) aktív részének 610 aminosavát kódoló és a protoxin területbe legalább a 4. ábrán a pBT210-re bemutatott módon a KpnI helyig kiterjedő DNS azonos a prAK plazmidban levő megfelelő DNS szekvenciával. A KpnI helytől lefelé levő DNS területben a pBT2lO-ben levő B. t. struktúrgénben az ilyen struktúrgén végéig vannak ismeretlen, de apróbb eltérések a prAK előállításához megrövidített B. t. kurstaki HD-1 gén megfelelő szekciójához hasonlítva. Ezeket a különbségeket a restrikciós endonukleázos térképezés jelezte. A pBT210 plazmid egy, az A táblázatban látható teljes hosszúságú endotoxint kódol, amelynek az aktív része (és még legalább a KpnI helyéig terjedő rész által kódolt aminosavak) teljesen homológ a prAK és pB8rII kiónok által kódolt, a B. t. kurstaki HD-1-bői származó δendotoxinnal és a protoxin szekcióban jelentős homoló11

HU 209 148 Β giát mutat. Végül a pBT210-ben levő riboszomális kötőhely azonos a prAK-ban levő kötőhellyel, és a teljes DNS, amelybe beleértjük a riboszomális kötőhelyet (RBS), és amely éppen az iniciációs Met előttől kezdődően felfelé vissza a promotor szekcióhoz csatlakozó BamHI helyig terjed, azonos a pBT210-ben és a prAKban, azzal az eltéréssel, hogy a pBT210-ben van két nukleotid változás közvetlenül a BamHI hely után (CC a prAK-ban levő GT helyett), és a prAK-ban ez után a két nukleotid után található három nukleotid (ΤΓΓ) a pBT210-ben hiányzik; ezek a különbségek csupán a különböző ligálási stratégiák eredményeiként jönnek létre, amikor a B. t.-ből származó RBS szekciókat kapcsoljuk az E. coli promotor szekcióval egy BamHI helyen keresztül. A pBT210 plazmid teljes hosszúságú mutáns B. t. δ-endotoxin fehérje előállítására alkalmazható, amely a találmány szerinti eljárással végzett egy vagy több aminosav változást tartalmaz. Az Nsil hely, a két Xbal hely, az SstI hely és a 4. ábrán lefelé levő első HindlII hely a pBT210-nél megfelel az 1. ábrán a prAK-hoz bemutatott azonos helyeknek (a DNS mindkét plazmidnál ezen a területen azonos, amint fentebb jeleztük).

A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük.

A) példa

1. Trichoplusia ni (T. ni) vizsgálat

Vizsgálatokat végeztünk második lárva-stádiumú lárvákon. A rovarokat klimatizált kamrában, a hőmérsékletet, nedvességet stb.-t illetően a vizsgálati időtartam folyamán standard körülmények között és standard mesterséges étrenden tartottuk. A vizsgálati anyagokat a rovaroknak az étrend részeként adtuk, a vizsgálati anyag minden koncentrációjánál 10 rovarból álló csoportot alkalmaztunk. A rovarokat a kezeléstől számított 7 napig tartó időtartamon át figyeltük meg, ezután meghatároztuk az LD₅₀ értéket. LD₅₀ az anyagnak az a mennyisége, amely a kísérleti lárvák 50%-ának a pusztulását okozza. A végső eredményeket relatív potenciálban adjuk meg, ahol:

, , a standard LD₅n értéke _inn relatív potenciál--x 100 ^r a kísérleti LD5Q érték

A fenti módon az LD₅₀ abszolút értékeit kapjuk, ahol az eredmények értelmezése egyszerű, és minden a standard értéknél magasabb relatív potenciálérték egy a standardnál magasabb aktivitásértéket jelöl. Ezen kívül egy pl. 400 relatív potenciálértékű anyag, összehasonlítva a standard 100 értékével négyszer aktívabb, mint a standard.

Standardként, amelynek a fenti vizsgálatban relatív potenciálja 100, a pBT301 plazmidot alkalmaztunk, amely egy teljes hosszúságú vad típusú δ-endotoxin szekvenciát tartalmaz, amely azonos a pBT210-zel, azzal a különbséggel, hogy két E. coli promotort tartalmaz, amelyek mindegyike egyénileg azonos a pBT210-ben levő promotorral.

A vizsgálatban kontrollként az alábbiakat alkalmaztuk:

a) CAG 629: δ-endotoxin termelő plazmidot nem tartalmazó E. coli törzs, amely inszekticid aktivitást önmagában nem mutat, beszerezhető (Gross C. A.-tól, Department of Bacteriology, University of Wisconsin);

b) SAN-415: kereskedelmi forgalomban kapható

B. t. inszekticid, amely JAVELIN védjegyeztetett név 5 alatt kapható.

2. Dohány bimbóféreg vizsgálat (TBW vizsgálat)

Az alkalmazott TBW vizsgálatot Dulmage és munkatársai módszere szerint [J. Invertebr. Path. 18,240245 (1971)] három párhuzamosban végeztük 1 unciás (28,39 g) átlátszó műanyag edénykékben, az egyes edénykékben egy második lárva-stádiumú TBW lárvával (4-5 napos, átlagos tömeg 1,6 g). Dulmage és munkatársai szerint készített [USDA Technical Bulletin, 1528, 1-5 (1976)] 15 ml táplálékot [amely táp15 anyagporból (Nutrient Powder), vitamin porból (Vitamin Powder), agárból és egyéb alkotórészekből áll] egyenletesen három edénykébe szétosztottunk, és 1/2 órán át hagytunk lehűlni. Minden edénykébe egy TBW-t helyeztünk (egy 00 méretű teveszőr-kefe segít20 ségével), és a fedeleket biztonságosan rápattintottuk. A mintákat azután 4-5 napra 27 °C-os hőmérsékletű és 50% relatív nedvességtartalmú inkubátorba helyeztük. A TBW toxicitás vizsgálat pontozásában alkalmazott méretcsoport-számokat, amelyek tömegtartományok25 nak felelnek meg, az alábbi táblázatban adjuk meg:

Csoportméret	Tömeg-tartomány (mg)	Átlagos tömeg (mg)
1,0	1,3-1,9	1,6
1,5	2,7-3,1	2,8
2,0	5,5-6,3	5,8
2,5	11,7-12,3	12,0
3,0	17,3-22,2	19,6
3,5	30,8-34,2	32,8
4,0	50,1-34,2	32,8
4,5	76,6-94,3	84,8
5,0	119,9-114,7	113,5
6,0	119,8-134,3	>140,0

A fenti „csoportméret” adat közvetlenül a toxicitási pontszámot adja. Az egyes vizsgálatok után tehát meghatároztuk a lárva tömegét, és azon tömeg-tartománynak megfelelő csoporttal egyenlő toxicitási pontszám45 mai jelöltük, amelybe ennek tömege esett. Az elpusztult lárvákat a zéró csoportméretbe és toxicitási pontszámba számítottuk, kivéve ott, ahol másképp jelezzük (lásd alább). Az ismétlésekből származó toxicitási pontszámokat átlagolva kaptuk a megadott eredménye50 két, amelyek mindegyike legalább 30 ismétlésen alapul.

Az edénykéket addig tartottuk nyitva, amíg a különböző méretű TBW-ket behelyeztük. Ezeket a TB Wket úgy osztottuk el, hogy minden tömeg-tartományon belül egy TBW legyen elhelyezve. Az adott tömeg-tartományba tartozó TBW-t tartalmazó minta-edénykéket azután megjelöltük a megfelelő csoport-méretszámmal. Az edénykéket azután emelkedő sorrendben elhelyeztük a laboratóriumi asztalon. A megmaradó mintá60 kát azután pontozással értékeltük, a méretet vizuálisan

HU 209 148 Β összehasonlítva a lemért minta TBW-kel, és feljegyeztük a megfelelő csoportszámot egy értékelő ívre. Az elpusztult lárvákat „+” jellel jelöltük, és zéró pontszámmal számítottuk. Azok az elpusztult lárvák, amelyek világos rózsaszínűek voltak vagy elfolyósodtak, gyaníthatóan nem az endotoxin hatásából eredő okokból pusztultak el. Ezeket a lárvákat jellel értékeltük, és nem számítottuk be az eredmények közé.

ml prAK tenyészetet három edénykébe osztottunk szét, így a növekedés úgy szorult vissza, ami a toxicitási pontszám-tartomány közepén volt. A vizsgálat tehát alkalmas a megnövekedett toxicitású kiónok megkülönböztetésére azoktól a kiónoktól, amelyek a nem mutált szülőkkel azonos toxicitásúak vagy annál kisebb toxicitásúak. A vizsgálatban az alkalmazott prAK tenyészet mennyiségétől függő dózis-választ kaptunk. így tehát minél nagyobb mennyiségű prAKtartalmú baktériumot adtunk a mintákhoz, annál nagyobb mértékű TBW-elleni toxicitást figyeltünk meg. A prAK dózis-válasz görbéje alkalmas annak értékelésére, mely kiónok és menynyivel toxikusabbak, mint a nem mutált szülők. Az alábbi táblázat a prAK-tartalmú baktériumok dózis-válaszát mutatja.

prAK mennyisége Hozzáadott stacioner tenyészet	Toxicitási pontszámok
5 ml	1,5	1,5	2,0
2	2	2,5	2,5
1	3	3	3,5
0,5	3	3,5	4
0,25	3,5	4	4

A fenti értékelés alapján - 1 ml tenyészetet alkalmazva az összes tenyészetet átvizsgáltuk abból a célból, hogy nagyszámú adat alapján állapíthassuk meg, hogy a prAK-hoz (és más nem-mutánsokhoz) mint standardhoz viszonyítva mely minták rendelkeznek kisebb vagy nagyobb aktivitással.

A TBW vizsgálatban alkalmazott (és hivatkozott) „Nutrient Powder”-t az alábbi tömegarányok szerint kevertük össze:

1103,4 g szójaliszt; 429,4 g búzacsíra; 292,4 g Wesson sókeverék; 164,2 g szacharóz; 24,6 g metil-parabenzoát; 14,8 g szorbinsav.

A TBW vizsgálatokban alkalmazott (és hivatkozott) „Vitamin Powder”-t az alábbi tömegarányokban kevertük össze: 12,0 g kalcium-pantotenát; 6,0 g nikotinamid; 3,0 g riboflavin; 3,0 g fólsav; 1,5 g tiamin.HCl; 1,5 g piridioxin.HCl; 0,12 g biotin; 6,0 g B12 vitamin.

Az alábbi három TBW átvizsgálási módszert (primer vizsgálat, szekunder vizsgálat, sorozathígításos vizsgálat) alkalmaztuk az értékelés különböző stádiumaiban; ezekre utalunk majd a leírásban.

Primer vizsgálat

Két külön klón 18 órás tenyészeteinek 1 ml-es alikvotjait és TBW táplálékot bemérünk egy 50 ml-es kúpos centrifuga csőbe, és egyenletesen elosztjuk három edénykébe (egy TBW-vel edénykénként). Ezeket a mintákat vad típusú prAK-val vagy pBT210-zel transzformáit sejtek és nem transzformált sejtek hasonló módon készített kontrolijaival párhuzamosan értékeljük.

Szekunder vizsgálat

Azokat a mintákat, amelyek megnövekedett toxicitást mutatnak TBW irányában a primer vizsgálatban, egy második vizsgálatban is átvizsgáljuk. Szelektált mutáns telepeket inokulálunk a megőrzött („könyvtár”) lemezekről YT/Amp tápközegre (1 telep/tenyészet). 10 db 1 ml-es tenyészetet értékelünk megfelelő kontrollokkal együtt. Azokat a kiónokat, amelyek megnövekedett toxicitást mutatnak TBW ellen, „valószínűleg kiemelkedő mutáns”-nak nevezzük, és harmadszor is értékeljük. Azokat, amelyeket harmadszor is „kiemelkedő” fenotípusúaknak találunk, „kiemelkedő mutáns”-ként jelöljük, és értékeljük a sorozathígításos vizsgálatban, hogy pontosabban meghatározzuk a fokozott aktivitás szintjét a szülő vad típushoz viszonyítva.

Sorozathígításos vizsgálat

Azokat a mutánsokat, amelyek „kiemelkedő” fenotípust mutatnak a nem mutáns konstrukciókhoz viszonyítva, átvizsgáljuk sorozathígításban végzett TBW vizsgálatban; a sorozathígítás olyan liofilezett baktériumsejtek száraz tömegére vonatkoztatva készül, amelyek vagy a mutáns típusú, vagy a prAK vagy pBT210 kiónokból származó vad típusú toxint tartalmazzák, és amelyeket 18 órán át növesztettünk (és a sejteket liofilezés előtt üledékbe vittük). A mintákat három párhuzamosban vesszük fel 15 ml-es végső térfogatban az alábbi hígításokkal. 167 Bg/ml, 67 gg/ml és 33 gg/ml. SDS-PAGE és Western immunfolt elemzést végzünk az ezekből a mutánsokból kapott fehérjén, tipikusan csíkonként 75 gg száraz sejttömegnél. A hígítási sorozat eredményei lényegében igazolják a korábbi vizsgálatok eredményeit, így nem tüntetjük fel külön ezeket vagy ezek átlagait azokban a táblázatokban, amelyek biológiai eredményekről számolnak be.

P példa - szabályszerű eljárások

Az alábbi számozott példákban vagy a leírás egyéb helyein az alábbi szabályszerű avagy standard laboratóriumi eljárásokat alkalmazzuk; ezekre hivatkozunk a leírás későbbi részeiben, és ezektől csak akkor térünk el, ha ezt a szövegben külön jelezzük.

P-l példa

Baktérium és fág törzsek fenntartása és növesztése

Az összes plazmid-konstrukcióhoz az E. coli SG4044 és JM103 törzsek a gazdaszervezetek. Az E. coli JM103 törzset, valamint az M18 és M19 fágokat a New England Biolabs-tól szerezzük be. Ezeket a baktériumtörzseket YT tápközegekben növesztjük (5 g/1 élesztőkivonat, 10 g/1 Bacto-tripton, 5 g/1 NaCl). A tápközeget 50 mg/1 ampicillinnel egészítjük ki a prAK-t vagy ennek a plazmidnak a származékait tartalmazó sejtek növesztésénél, és 20 mg/ml klóramfenikollal egészítjük ki a pBT210-et vagy ennek a plazmidnak a származékait tartalmazó sejtek esetén.

HU 209 148 Β

P-2 példa

Fág DNS szaporítása és izolálása

Az M13 eredetű rekombináns fág készletek előállítását és a fág DNS izolálását úgy végezzük, amint ezt már korábban leírták [Messing J.. Methods Enzymol. 101,20-78 (1983)].

P-3 példa

Szintetikus oligonukleotidok előállítása

Szintetikus oligonukleotidokat automatizált szintézissel állítunk elő, Applied Biosystems 38OA típusú DNS szintetizáló berendezésen (Foster City, Kalifornia).

A ciklus befejezése után az alábbi tisztítási lépéseket végezzük. A szintetikus oligonukleotid blokkolását azonos térfogatú ammónium-hidroxid hozzáadásával és 55 °C hőmérsékleten egy éjszakán át végzett inkubálással megszüntetjük. Az ammónium-hidroxidot többszöri gyors vákuum centrifugálással és desztillált H₂Oban való újra szuszpendálással eltávolítjuk, majd az oligonukleotidot karbamid-poliakrilamid gélelektroforézissel (Karbamid-PAGE) tovább tisztítjuk. Abból a célból, hogy a csíkot láthatóvá tegyük, a gélt vékonyréteg-kromatográfiás lemezre visszük fel, amely Sárán zsugorfóliával van fedve, és az oligonukleotidot rövidhullámú ultraibolya fénnyel világítjuk meg. A gél oligonukleotidot tartalmazó részének borotvapengével végzett kihasítása után az oligonukleotidot 0,5 mól/1 ammónium-acetátot és 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldattal (pH=8,0) 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át rázatva eluáljuk a gélről. Egy éjszakán át végzett eluálás után a gél-fragmentumokat 6000 fordulat/perc sebességgel JA20 rotorban végzett centrifugálással üledékbe visszük, és az eluált oligonukleotidot tartalmazó felülúszót friss csőbe helyezzük át. Etil-alkohollal végzett kicsapással az oligonukleotidot koncentráljuk, és mennyiségét O.D.260 abszorbanciával meghatározzuk. 200 pmól oligonukleotidot 40 μΐ reakciótérfogatban 2 egység T4 polinukleotid kinázt és 0,05 mmól/1 ATP-t alkalmazva kinázos kezelésnek vetünk alá.

P-4. példa

E. coli sejtek DNS-transzformálása

A) DNS transzformáláshoz kompetens E. coli JM103 vagy SG4044 törzseket készítünk elő, amint ezt egy általánosan használt munkamenetben leírják [Cohen S. N., Chang A. C. P. és Hsu L.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110-2114 (1972)]. A helyre irányuló oligonukleotid mutagenezis kísérletekhez 60 ng heteroduplex rekombináns fág (M13) DNS-t adunk 0,2 ml kompetens sejthez, és 0 °C hőmérsékleten tartjuk 15 percen át. A sejteket ezt követően 2 percig 42 °C hőmérsékleten tartjuk, és ebből a keverékből 30 μΐ-t hozzáadunk 3 ml 42 °C hőmérsékleten tartott 0,7% Bacto-agart tartalmazó YT tápközeghez, és hozzáadunk még 0,2 ml friss, egy éjszakán át nőtt JM103 vagy SG4044 tenyészetet. A keveréket azonnal YT agar lemezen (YT folyékony tápközeg +1,5% Bactoagar) szélesztjük, és a lemezeket (lefordítva) egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk.

B) Mutagenezis kísérletekből vagy más Ugatásokból (ide értve a prAK vagy pBT210 vektorokat, amint ezeket korábban leírtuk) 100 ng plazmid DNS-t 0,2 ml kompetens sejthez (JM103 vagy SG4044) adunk, és 0 °C hőmérsékleten tartjuk, majd visszahelyezzük jégfürdőbe. 2 μΐ és 200 μΐ közti mennyiségeket YT agaron szélesztünk, amely a prAK-η alapuló kiónokhoz 50 pg/ml ampicillint, és a pBT210-en alapuló kiónokhoz 20 g/ml kloramfenikolt tartalmaz, és egy éjszakán át 73 °C hőmérsékleten inkubálunk.

P-5 példa

Restrikciós enzimes emésztés

A restrikciós enzimeket a Bethesda Research Laboratories-től (Gaithersburg, Maryland) vagy a New England Biolabs-tól szerzünk be. Az inkubációs körülményeket úgy választjuk meg, amint ezt a gyártó javasolja.

P-6 példa

DNS fragmentumok ligálása

A) DNS ligálási reakciókeveréket (20 μΐ) állítunk össze, amely 60 mmól/1 trisz.HCl-t (pH=7,5), 10 mmól/1 MgCl₂-t, 1 mmól/1 ditiotreitet, 50 mól/1 ATP-t, 20 mmól/1 DNS terminálist és 20 egység T4 DNS ligázt tartalmaz (New England Biolabs). Az inkubálást 14 °C hőmérsékleten 4 órán át végezzük.

B) Három fragmentumos ligálást 1:1:1 mólarányban, 0,04-0,04 pmól koncentrációban 20 μΐ reakciótérfogatban végzünk. Csak tapadós végek ligálása esetén (pl. XhoII belső hely) 16 °C-on 4 óra hosszat, bármilyen tompa vég esetén (pl. FnuD2 hely) pedig egy éjszakán át ligálunk. New England Biolabs (NEB) T4 ligázt alkalmazunk 10 egység (a NEB meghatározása szerint)/10 μΐ reakciótérfogat koncentrációban.

P-7 példa

DNS szekvenciaelemzés

A δ-endotoxin gének és származékaik DNS szekvenciaelemzését Heidecker és munkatársai láncterminációs módszerével végezzük [Heidecker G., Messing J. és Gronenbom B„ Gene 10,68-73 (1980)].

1. példa prAK-3, prAK-4, prAK-5, prAK-6 és prAK-7 előállítása

a) lépés: prAK-3 előállítása pg pB8rII plazmidot (amelyet a 2. ábrán mutatunk be és fentebb leírtunk) és a jól ismert mpl8 és mpl9 M13 fág klónozó vektorokból kapott DNS replikatív formáját szimultán emésztettük BamHI (8 egység) és KpnI (10 egység) restrikciós endonukleázzal 60 percen át 37 °C hőmérsékleten 100 mmól/1 nátriumklorid pufferoldatban, amely még 6 mmól/1 trisz.HCl-t (pH = 7,9), 6 mmól/1 MgCl₂-t és 100 pg/ml szarvasmarha szérum albumint tartalmazott. Az így létrejött DNS-ekből a kívánt fragmentumokat úgy tisztítottuk, hogy az egész keveréket 1%-os preparatív agaróz gélen futtatva méret szerint szeparáltuk. A csíkokat etídiumbromiddal végzett festéssel és hosszúhullámú ultra14

HU 209 148 Β ibolya fénnyel megvilágítva tettük láthatóvá. Egy 4,2 kb és egy 2,5 kb méretű fragmenst kaptunk. A 2,5 kb méretű DNS fragmenst tartalmazó gél fragmentumot kivágtuk, és a DNS-t dializáló csőben végzett elektroforézissel eluáltuk, majd a fragmentumot a BamHI-gyel és KpnI-gyel hasított és gélen tisztított M18 és M19 vektorokba ligáltuk 4 órán át 14 ’C hőmérsékleten 4 órán át 20 μΐ teljes térfogatban végzett inkubálással. Az elegy 60 mmól/1 trisz.HCl-t (pH = 7,5), 10 mmól/1 MgCl₂-t, 1 mmól/1 ditiotreitolt, 50 mmól/1 ATP-t és 20 mmól/1 DNS terminálist tartalmazott. Az így létrejött DNS-t kompetens E. coli JM103 sejtekbe transzformáltuk, amint ezt a P-4 példában leírtuk, azzal az eltéréssel, hogy az YT lemezek izopropil-tio-galaktozidot (IPTG) és 5-bróm-4-klór-3indolil-D-galaktozidot (X gal) tartalmaztak (mindkettő a Sigma Chemical Company-tól szerezhető be). Ilyen körülmények között a rekombináns fág (amely a pBRII-ből kihasított DNS beiktatást tartalmazta) világos tarfoltokat alakított ki, míg az M18 és M19 kék tarfoltokat alakított ki. A világos tarfoltokat 2 ml, YT folyékony táptalajban levő E. coli JM103 sejtekhez adtuk, egy éjszakán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáltuk, és a fágból egyszálú DNS-t állítottunk elő a Messing J. által leírt munkamenet szerint [Methods Enzymol. 101, 20-78 (1983)). A kívánt kiónokat, amelyek tartalmazták a pB8rII-ből származó nagy, de egyszálú DNS beiktatást, agaróz gél elektroforézissel azonosítottuk, az mpl8-cal vagy mpl9-cel összehasonlítva lassabb mozgékonyságuk alapján. Az endotoxin DNS-t tartalmazó kiónok egy részének szekvenciaelemzése, amelyet didezoxi lánc-terminációs módszerrel végeztünk, igazolta az endotoxin DNS jelenlétét, és jelezte azt, hogy az ml 8 ennek értelmetlen (antisense) szálát, míg az ml9 ennek értelmes (sense) szálát vette fel, amelyek mindegyikét kinyerjük. Automatizált DNS-szintetizáló berendezéssel, szilárd fázisú szintézissel egy 26 bázisos antisense oligonukleotidot készítettünk, amelynek szekvenciája

5’-GTC CCT CTA ATC GCG AAA TGG CTT GG 3’, és T4 polinukleotid-kinázzal és ATP-vel kinázos kezelésnek vetettük alá amint ezt Maniatis és munkatársai leírják [Molecular Cloning; A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)]. 60 pl térfogatú keveréket, amely 0,4 pg, az endotoxin sense szálát magában foglaló mpl9 rekombináns fágot, 20 mmól/1 trisz.HCl-t, 1 mmól/1 ditiotreitolt, 50 mmól/1 nátrium-kloridot és 10 ng 26 bázisos antisense oligonukleotidot tartalmazott, 15 percig 68 ’C-on 10 percig, majd 37 ’C-on melegítettünk, ezután 0 °C hőmérsékletre hűtöttük. Az így létrejött keverékhez, amely az mpl9 rekombináns DNS-t és az összeforrasztott mutagén oligonukleotidot tartalmazta, hozzáadtuk a következő anyagokat: 0,2-0,2 mmól/1 dATP, dCTP, dTTP és dGTP, 1 mmól/1 ATP, 4 egység DNS polimeráz I Klenow-fragmentum (a New England Biolabs-tól), 0,5 g E. coli egyszálú kötőfehérje [a Pharmacia-tól (Piscataway, New Jersey)] és 20 egység T4 DNS ligáz (New England Biolabs). A kapott elegyet 14 ’C-on 4 óra hoszszat inkubálva polimerizáltuk és ligáltuk. A kapott cirkuláris kettősszálú heteroduplex DNS-t E. coli JM103 sejtekbe transzformáltuk, és a P-4. példa szerinti módon szélesztettük. 20 plakkot kiválasztottunk, és Maniatis és munkatársai fenti művében ismertetett módon egyszálú DNS-t izoláltunk a plakkokból. A 20 plakk fágjainak DNS-ét külön-külön 20 pl 50 mmól/1 trisz.HCl-t (pH = 8,0), 50 mmól/1 KCl-t, 10 mmól/1 MgCl₂-t, 10 ng fenti 26 bázis hosszúságú antisense oligonukleotidot és 0,2 pg különböző cirkuláris egyszálú fág DNS molekulákat tartalmazó oldatban 15 percig 68 ’C-on, majd 10 percig 37 ’C-on tartottuk. Az egyes így létrejött keverékekhez Nrul endonukleázt (8 egység) adtunk, és az inkubálást 37 ’C hőmérsékleten 1 órán át folytattuk. A keveréket 0,8%-os agaróz gélen elektroforézisnek vetettük alá. A minták mintegy 10%-a tartalmazta a lineáris DNSként vándorló DNS-t, így lehetővé vált a kívánt Nrul helyet tartalmazó pozitív kiónok azonosítása. A pozitív kiónokat E. coli JM103-ba transzformálva tisztítottuk. A pozitív kiónokban levő BamHI és Xbal helyek közti DNS-t - ezekkel az endonukleázokkal szimultán hasítva - kimetszettük (miután összeforrasztottuk ml 3 szekvenáló oligonukleotiddal és polimerizáltuk, hogy kettősszálúvá tegyük, amint ezt fentebb az Nrul oligonukleotidnál leírtuk), és azzal a nagy fragmentummal (mintegy 5004 bázispáros, és hiányzik belőle a BamHI és a prAK-ban levő második Xbal hely közti mintegy 749 bp-s fragmentum) ligáltuk (P-6A példa szerinti módon), amelyet a prAK teljes emésztése után kaptunk és gélen tisztítottunk, ahol az emésztést szimultán végeztük ugyanazzal a két restrikciós enzimmel, minden műveletet hagyományos módon végezve; így alakítottuk ki a prAK-3 plazmidot.

b) lépés: prAK-4 előállítása

Lényegében a fenti a) lépéssel analóg eljárást követve az a) lépésben kapott egyszálú fág DNS-t egy 25 bázisos szintetizált antisense oligonukleotiddal forrasztottuk össze, amelynek szekvenciája:

’-CCACTCTCTAAAGC7TTCTGCGTAA-3 ’ és amelyet úgy terveztünk, hogy a HindlII helyet az A táblázat nukleotid-szekvenciájában levő 327. és 351. számú nukleotid helyek közé vezessük be. A pozitív kiónokat, amelyek mind a kívánt Nrul helyet, mind a HindlII helyet tartalmazták, 6,6% gyakorisággal azonosítottuk HindlII nukleázzal végzett hasításos értékeléssel, és ezeket alkalmaztuk prAK-4 előállítására, a kapott újabb BamHEXbal fragmentumot ligáltuk a prAK-ból származó 5004 bp-s nagy fragmentumba az a) lépésben leírt módon.

c) lépés: prAK-5 előállítása

Lényegében a fenti a) lépéssel analóg eljárást követve a b) lépésben kapott egyszálú fág DNS-t egy 26 bázisos szintetizált antisense oligonukleotiddal forrasztottuk össze, amelynek szekvenciája:

’ -GC ATCTCTTCCCTTAGGGCTGGATTA-3 ’ és amelyet úgy terveztünk, hogy a MstlI helyet az A táblázat nukleotid-szekvenciájában levő 366. és 391. számú nukleotidok közé vezessük be. A pozitív klóno15

HU 209 148 Β kát, amelyek, mindhárom kívánt helyet, vagyis az Nrul, HindlII és MstlI helyeket tartalmazták, mintegy 9,1%os gyakorisággal azonosítottuk MstlI restrikciós enzimmel végzett hasításos értékeléssel, és ezeket alkalmaztuk prAK-4 előállítására.

d) lépés: prAK-6 előállítása

Lényegében a fenti a) lépéssel analóg eljárást követve a c) lépésben kapott pozitív kettős szálú fág kiónokat egyszálú fázisban levő DNS-sé alakítottuk át, és egy 26 bázisos szintetizált antisense oligonukleotiddal forrasztottuk össze, amelynek szekvenciája:

’-GCGGTTGTAAGCGCGCTGTTCATGTC-3 ’ és amelyet úgy terveztünk, hogy a BssHII helyet az A táblázat nukleotid-szekvenciájában levő 406. és 431. számú nukleotidok közé vezessük be. A pozitív kiónokat, amelyek mind a négy, a prAK-7-ben kívánt helyet tartalmazták, 12,5% gyakorisággal azonosítottuk a BssHII enzimmel végzett hasításos értékeléssel, és prAK-6 előállítására alkalmaztuk.

e) lépés: prAK-7 előállítása

Lényegében a fenti a) lépéssel analóg eljárást követve a d) lépésben kapott egyszálú fág DNS-t egy 26 bázisos szintetizált antisense oligonukleotiddal forrasztottuk össze, amelynek szekvenciája:

’ -TAC AGTCCTA A ATCTTCCGG ACTGTA-3 ’ és amelyet úgy terveztünk, hogy eltüntesse a HindlII helyet az A táblázat nukleotid-szekvenciájában levő 1682. és 1707. számú nukleotidok között. A prAK-7 hez szükséges teljes szekvenciát képviselő pozitív kiónokat mintegy 2,8% gyakorisággal azonosítottuk úgy, hogy a rekombináns fág DNS replikatív (kettős szálú) formáját az 1682. és 1707. nukleotidok közötti HindlII hely elvesztésére nézve átvizsgáltuk. A mutánsból izolált kettős szálú DNS-t prAK-7 előállítására alkalmaztuk.

Abból a célból, hogy a két Xbal hely között végzendő kodon-kicserélési kísérletekhez egy egymástól megfelelő térközre elhelyezkedő, egyedi restrikciós helyeket tartalmazó plazmidot (prAK-9) alakítsunk ki, a prAK sorozatba tartozó prAK-8 és prAK-9 plazmidokat az alábbi lépésekkel állítottuk elő.

f) lépés: prAK-8 előállítása

Lényegében a fenti a) lépéssel analóg eljárást követve az e) lépésben kapott egyszálú fág DNS-t egy 27 bázisos szintetizált antisense oligomerrel forrasztottuk össze, amelynek szekvenciája:

’-TCCCCACCTTTGGCCA AACACTGAAAC-3 ’ és amelyet úgy terveztünk, hogy a Ball restrikciós helyet az A táblázat nukleotid-szekvenciájában levő 534. helyszámú nukleotidnál vezessük be. A pozitív kiónokat (prAK-8), amely mind az öt kívánt helyet, vagyis az Nrul, HindlII, MstlI, BssHII és Ball helyeket tartalmazták, és hiányzott belőlük a prAK-7 előállításánál eltávolított HindlII, úgy azonosítottuk, mint a fenti a) lépésben.

g) lépés: prAK-9 előállítása

Lényegében a fenti a) lépéssel analóg eljárást követve az f) lépésben kapott egyszálú fág DNS-t egy 30 bázisos szintetizált antisense oligomerrel fomasztottuk össze, amelynek szekvenciája:

5’-GTTGCCAATAAGACGCGTTAAATCATTATA-3’ és amelyet úgy terveztünk, hogy egy Miül restrikciós helyet az A táblázat nukleotid-szekvenciájában levő 588. és 595. helyszámú nukleotid közé vezessünk be. A pozitív kiónokat, amelyek mind a hat kívánt helyet, mégpedig az Nrul, HindlII, MstlI, BssHII, Ball és Miül restrikciós helyeket tartalmazták, és hiányzott belőlük a prAK-7 képzésénél eltávolított HindlII hely, olyan módon azonosítottuk, mint az a) lépésben, és ezt prAK-9 plazmidnak neveztük.

Látható, hogy a prAK-9-ben a Ball és Miül helyek közti helyettesítésre alkalmas DNS kazettát megfelelően lehet kódolni ahhoz, hogy a 184., 187., 188. és 194. mutált aminosav helyeknél minden lehetséges kodon- és aminosav-variációt bevezessünk.

Hasonló módon az Miül és második Xbal hely közötti helyettesítésre alkalmas DNS kazettákat megfelelően kódolhatjuk, hogy a 201. és 204. mutált aminosav helyeknél minden lehetséges kodon- és aminosav-variációt bevezessünk.

Az 5. ábra a prAK-ban található két eredeti Xbal hely közé bevezethető egyedi restrikciós helyek vázlatos ábrázolása (az első ilyen Xbal hely a prAK-9-ben most az Nrul hely).

A fentebb bemutatott antisense oligonukleotidban az aláhúzások az 1. példa különböző lépéseiben a bevezetendő változást vagy változásokat jelzik.

2. példa

Kodon kicserélési (spin) kísérletek

A) A 3A és 3B ábrákon bemutatott szekvenciájú két szál mindegyikének megfelelő egyszálú oligonukleotidokat állítottunk elő a P-3 példában leírtak szerint DNS szintetizáló berendezéssel, amely úgy volt programozva, hogy az A, T, C és G nukleotidok véletlenszerűen épüljenek be a 3A ábrán bemutatott szálak X-szel jelölt helyeire.

Az eljárással az egyes menetekben a gépen összesen mintegy 200 μg (tisztítás után) ilyen egyszálú DNS-t kaptunk (amelyek oligonukleotidok azonos családját képviselték, az eltérés köztük csak az egyes szálak X helyeinél volt). Az egyes szálakból (sense és antisense) a kodon kicseréléséhez 10 pikomólt egyesítettünk, 68 °C hőmérsékleten végzett 10 perces, majd 37 °C hőmérsékleten végzett 10 perces melegítéssel összeforrasztottuk, majd szobahőmérsékletre lehűtöttük, és jégre helyeztük. A 3A ábrán bemutatott DNS-sel összhangban levő kettős szálú oligomerek így létrejött tömegéről úgy találtuk, hogy az XXX helyeknél (116. aminosavhely) tartalmazta a genetikai kód által engedélyezett összes kombinációt, beleértve a stop szignálokat és a 20 természetes aminosav + stop szignál bármelyikéhez tartozó kodonok többszörös, de változó számát. A kettős szálú oligomerekből vagy kazettákból azután 1 pmólt T4 polinukleotid kinázzal (New England Biolabs) végzett kinázos kezelésnek vetettünk alá, és összekevertük a prAK-7 plazmid HindlII és MstI restrikciós endonukleázokkal végzett szimultán hasítás után gélen való izolálással kapott nagyobb fragmentummal (amely tízszer

HU 209 148 Β kisebb moláris koncentrációban van jelen), 100 mmól/1 NaCl-t, 10 mmól/1 trisz.HCl-t (pH = 7,5), 10 mmól/1 MgCl₂-t, 10 mmól/1 2-merkaptoetanolt és 100 g/ml BSA-t tartalmazó oldatban, és az így létrejött keveréket ligálásnak vetettük alá a P-6 (A) példa szerint. A létrejött ligálási keverék egy alikvotját (5 pl) alkalmaztuk azután E. coli JM103 transzformálására a P-4 (B) példában leírt körülmények között. Az így létrejött transzformált sejtek közül többet, (200) egyenként TBW és T. ni vizsgálatnak vetettünk alá (anélkül, hogy előzőleg tudtuk volna, hogy az XXX-nél milyen kodon volt az adott kiónban), és olyan aktivitási szint előállítását figyeltük meg, amely világosan jelezte, hogy a különböző változó mutánsok mindegyike inszekticid szempontból olyan aktív fehérje-terméket eredményezett, amelyeknek aktivitása legalább annyi, mint a kontroll megrövidített endotoxiné, és kiemelkedő mutánsok (a kontroll ötszöröse) is jelentkeztek. Még ez előtt a transzformációból véletlenszerűen kiválasztott sejteket is szelektáltunk, szélesztettünk, és ezekből telepeket növesztettünk, amint a P-l példában leírtuk, hogy plazmid DNS-t izoláljunk DNS szekvenciaelemzéshez, amit a BamHI/Xbal fragmentumnak az azonos enzimekkel hasított mpl8 és mpl9 szekvenáló vektorokba történő klónozásával végeztünk. A DNS szekvenciát a tizenegy ilyen 116. helyzetű mutáció mindegyikének területében elemeztük, hogy meghatározzuk a 116. helynél kódolt aminosavat. Úgy találtuk, hogy a két kiemelkedő mutáns egyike az eredeti kiemelkedő mutáns (116-Lys, amelyet azonban AAA kódol). A másik kiemelkedő mutáns pedig CGT által kódolt 116-Arg volt. A további kiónok egyikéről úgy találtuk, hogy ez a natív 116-Glu (ezt azonban GAA kódolja). A további gyenge mutánsok közül hét [116Ile (ATT), 116-Cys (TGC), 116-Leu (CTC), 116-Asp (GAT), 116-Asn (AAC), 116-Ile (ATT) és 116-Gly (GGA)) egyedi volt, kivéve az új 116-Ile (ATT)-t, ezt két klón képviselte. Az utolsó kiónok 116-STOP (TGA)-t kódoltak.

B) Az A) részben leírt eljárást ismételtük meg a 119. aminosavhely kodon kicseréléséhez a 3B ábrán bemutatott DNS-t alkalmazva. Az így létrejött kiónok nagy számának véletlenszerű értékelése szerint az aktivitási szint a TBW és T. ni vizsgálatokban határozottan jelezte, hogy a gyűjteményben minden mutáns klón aktív. (Az inaktív molekulák %-a mintegy azonos volt azzal, ami várható volt a nukleotidok gépi előállításánál az XXX helyeknél véletlenszerűen beépülő UAA, UAG és UGA STOP-kodonok gyakorisága alapján.) Hét véletlenszerűen kiválasztott egyedi kiónnak legalább olyan aktivitási szintje volt, mint a prAK által termelt megrövidített, natív szekvenciájú endotoxinnak, de egyik sem volt kiemelkedő mutáns az általunk megszabott önkényes standard szerint. A hét egyedi klón szekvenciaelemzése azt mutatta, hogy ezek különbözőek és egyediek, éspedig: 119-Leu (CTA), 119-Tyr (TAC), 119-Asp (GAT), 119-His (CAT), 119-Pro (CCA), 119-Ile (ATT) és 119-Ser (TGT).

3. példa

Teljes hosszúságú mutáns B. t. endotoxin pg pBT210 plazmidot szimultán hasítottunk BamHl (8 egység) és SstI (8 egység) restrikciós endonukleázokkal 60 percig 100 mmól/1 nátriumklorid pufferoldatban, amely tartalmazott még 6 mmól/1 trisz.HCl-t (pH = 7,9), 6 mmól/1 MgCl₂-t és 100 pg/ml szarvasmarha szérum albumint. A mintegy 7180 bázispáros nagyobb fragmentumot gélen tisztítottuk vektorként való felhasználáshoz. A prAK-26-3 plazmid, amely magában foglalta az Alá -> Thr 119, Met -> Ile 130 és Gly -> Asp 201 mutációkat, 1 pg-ját szimultán hasítottuk BamHl (8 egység) és SstI (8 egység) restrikciós endonukleázokkal 100 mmól/1 nátrium-klorid pufferoldatban, amely tartalmazott még 6 mmól/1 trisz.HCl-t (pH = 7,9), 6 mmól/1 MgCl₂-t, és 100 pg/ml szarvasmarha szérum albumint, A mintegy 1428 bázispáros kisebb fragmentumot, amely tartalmazta a mutációkat, valamint a B. t. RBS szekciót, gélen tisztítottuk, és ebből mintegy 0,06 pmólt ligáláshoz egyesítettünk, 0,02 pmól 7180 bázispáros, fentebb kapott vektor fragmentummal, és 20 pl ligáló közegben kapcsoltuk, amely 60 mmól/1 trisz.HCl-t (pH = 7,5) 10 mmól/1 MgCl₂-t, 1 mmól/1 ditiotreitolt, 50 pmól/1 ATP-t, és 20 egység T4 DNS ligázt tartalmazott, és az így létrejött reakciókeveréket 4 órán át 14 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az így létrejött plazmidot, amelyet pBT26-3-nak neveztünk, E. coli JM 103-ba transzformáltuk 5 pl említett ligálási keveréket adva 0,2 ml kompetens E. coli JM103-hoz, kezdetben 0 °C hőmérsékleten tartva 30 percen át, majd 42 °C hőmérsékleten 2 percig, végül jégre visszahelyezve. Különböző mennyiségű (2 pl, 20 pl és 180 pl) így létrejött keveréket azután azonnal YT agar lemezekre szélesztettünk, amely lemezek 20 pg/ml kloramfenikolt is tartalmaztak (YT tápközeg +1,5% Bactoagar), és a lemezeket egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten lefelé fordítva inkubáltuk. Csupán a kloramfenikol rezisztenciával bíró transzformált sejtek tudtak növekedni ezeken a lemezeken. A kloramfenikol rezisztens telepeket folyékony tenyészetben egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten növesztettük, és plazmid DNS-t állítottunk elő EcoRI restrikciós emésztéshez és DNS szekvenciaelemzéshez, hogy ténylegesen meghatározzuk a pontmutációk jelenlétét. A pBT 26-3 plazmidot tartalmazó sikeres transzformánsokat azután TBW és T. ni vizsgálatokban értékeltük.

A fenti módon további teljes hosszúságú mutáns endotoxinokat állítottuk elő és értékeltük a TBW és T. ni vizsgálatokban. Az alábbi F táblázat jelzi a további így készített teljes hosszúságú mutáns endotoxin termelő plazmid/sejt rendszereket, mindegyiket a TBW vizsgálatban kapott értékelésük eredményeivel, és itt megtalálhatók a fenti 3. példa termékeire vonatkozó ilyen vizsgálatokban kapott eredmények, valamint az E. coli JM 103-bán termelt B. t. wuhanensis natív endotoxin és a nem-transzformált JM103-ból kapott kontroll eredményei.

HU 209 148 Β

F táblázat

Példa száma (Plazmid jele)	Új mutáns teljes hoszszúságú plazmid azonosítás	A mutáns BamHI/Sstl szekvencia forrása	Az érintett tényleges mutációk	TBW vizsgálat; toxicitási pontszám
3	pBT26-3	prAK-26-3	119-Thr	1
130-lle
210-Asp
3-A	pBT36a65	prAK-36a6	122-lle	2
125-Val
3-B	pBT-C	prAK-C	116-Lys	1
3-C	pBT-E	prAK-E	130-lle	2
201-Asp
3-D	pBT-0	prAK-0	116-Lys	2
3-E	pBT-R	prAK-R	101-Lys	2
116-Lys
122-lle
125-Val
3-F	pBT98cl	prAK-98cl	188-Ser	2
3-G	pBT-B	prAK-B	119-Thr	2
3-H	pBT-D	prAK-D	217-His	3
3-1	pBT-F	prAK-F	187-Thr	2,5
3-J	pBT-J	prAK-J	101-Lys	3
116-Lys
130-lle
201-Asp
3-K	pBT-M	prAK-M	119-Thr	2,5
217-His
3-L	pBT-N	prAK-N	119-Thr	3
187-Thr
3-M	pBT-S	prAK-s	119-Thr	1
188-Ser
3-N	pBT-T	prAK-T	116-Lys	1,5
188-Ser
3-0	pBT-U	prAK-U	101-Lys	2
116-Lys
188-Ser
3-P	pBT107c22	pl07c22	94-Lys	3
194-Lys
3-Q	pBT99c62	p99c26	4-Thr	3
105-Thr
204-Thr
3-R	pBT107c25	p!07c25	184-Ile	3

Példa száma (Plazmid jele)	Új mutáns teljes hoszszúságú plazmid azonosítás	A mutáns BamHI/Sstl szekvencia forrása	Az érintett tényleges mutációk	TBW vizsgálat; toxicitási pont- szám
3-S	pBT-A	prAK-A	101-Lys	3
116-Lys
3-T	pBT-K	prAK-K	101-Lys	3
116-Lys
187-Thr
3-U	pBT-P	prAK-P	119-Thr	2,5
122-lle
125-Val
3-V	pBT-Q	prAK-Q	116-Lys	3
122-lle
125-Val
3-W	pBT39	prAK-39	105-Tyr	3
188-Ser
3-X	pBT7O	prAK-70	119-Thr	1
184-Ile
3-Y	pBT68	prAK-68	105-Tyr
130-lle
201-Asp
3-Z	pBT53	prAK-53	105-Tyr	3
184-Ile
Kontroll	B. t. wuhanensis	-	-	3
Kontroll	JM103	-	-	4,7

4. példa

Teljes hosszúságú mutáns B. t. endotoxinok 1 μg pBT210 plazmidot együtt emésztettünk

BamHI (8 egység) és SstI (8 egység) restrikciós endonukleázokkal, és az így létrejött 7180 bp-s nagy fragmentumot gélen izoláltuk. Külön-külön kísérletek sorozatában 1-1 μg prAK, prAK-E és a p26-3, p36a65 és p95a86 mutánst kódoló plazmidot (lásd B táblázat) együtt emésztettünk BamHI (8 egység) és SstI (8 egység) restrikciós endonukleázokkal, és az így egyenként létrejött 1428 bps-fragmentumot, amely egy megrövidített endotoxint kódoló szekvencia egy részét tartalmazta, gélen tisztítottuk. Az 1428 bp-s fragmentumok adott mennyiségét külön-külön emésztettük FnuD2 restrikciós endonukleázzal [4 egység 6 mmól/1 NaCl-t, 6 mmól/1 trisz.HCl-t (pH = 7,4), 6 mmól/1 MgCl₂-t, 6 mmól/12-merkapto-etanolt és 100 g/ml szarvasmarha szérum albumint tartalmazó oldatban)]. Az FnuD2 restrikciós endonukleáz (amely Acc2-ként is ismeretes) a különböző 1428 bp-s BamHI/Sstl fragmentumokat csak egyszer hasítja, egy 640 bp-s BamHI/FnuD2 fragmentummá és egy 788 bp-s FnuD2/SstI fragmentummá; a különböző fragmentumokat az egyes kísérletekből agaróz gélen elektroforézissel tisztítottuk.

HU 209 148 Β így ^egy sorozat különböző 640 bp-s BamHI/FnuD2 fragmentumot és egy sorozat különböző 788 bp-s FnuD2/SstI fragmentumot kaptunk. Ebből a két sorozatból egy-egy fragmentumot kiválasztva és a pBT210-ből kapott 7180 bp-s nagyobb fragmentumhoz ligáivá (P-6B példa), egy sor új plazmidot kaptunk, amelyek különböző teljes hosszúságú mutáns B. t. endotoxin gént tartalmaztak. Az így kapott új plazmidokat, amelyeket az alábbi G táblázatban foglaltunk öszsze, használtuk azután E. coli JM103 transzformálására a P-4(A) példa eljárása szerint, és az így létrejött sejteket értékeltük B. t. endotoxin termelésére az A példa TBW vizsgálatában; az említett vizsgálatban kapott eredményeket szintén megadtuk a G táblázatban. Az F és G táblázatban leírt plazmidokat tartalmazó különböző transzformált sejteket értékeltük T. ni vizsgálatban is, ennek eredményeit a H táblázatban mutatjuk be.

G táblázat

Példa száma (Plazmid jele)	Új teljes hosszúságú mutáns plazmid azonosítás	ABam- HI/FnuD2 fragmentum fonása	Az FnuD2/SstJ fragmentum forrása	Az érintett tényleges mutációk	TBW vizs- gálat pont- szám
4-A	66	p36a65	p26-3	122-Ile	3
125-Val
201-Asp
4-B	67	p26-3	p95a86	119-Thr	1
130-Ile
188-Ser
4-C	74	p36a65	p95a86	122-Ile	3
125-Val
188-Ser
4-D	106	p26-3	prAK	119-Thr	1
130-lle
4-E	107	prAK	p26-3	201-Asp	2,5
4-F	108	prAK-E	prAK	130-Ile	3

H táblázat

Plazmid azonosítás	Táblázat forrás	Relatív képesség
pBTA	F	391
pBTC	F	299
pBT66	F	169
pBT107c25	F	254
pBTP	F	340
pBTs	F	255
pBT67	G	304
pBT106	G	367
standard pBT301		100
kontroll SAN415		59
kontroll CAG629		0

5. példa

Egy mutáns endotoxin szekvenciát kódoló DNS20 szelektív transzformált sejteket fermentorban növesztettünk ismert körülmények között. A sejtnövekedés végén és közvetlenül a kinyerés előtt a fermentor teljes tartalmát 70-80 °C hőmérsékletre melegítettük. Ezt a hőmérsékletet 10 percen át tartottuk, majd lehűtöttük, így a rekombináns mikroorganizmust inaktiváltuk anélkül, hogy az endotoxin fehérje biológiai aktivitását befolyásoltuk volna. A fermentor tartalmát azután nyomás alatt az eredeti egyharmadára bepároltuk, és az így létrejött koncentrátumot mintegy 14 MPa nyomás30 nál, 140-160 °C bemenő és 20-50 °C kimenő hőmérsékletű melegített ellenáramú légáramlatot alkalmazva porlasztva szárítottuk. Az így kapott port valamilyen hordozóval, pl. zsírtalanított szójababbal összekeverve nedvesíthető koncentrátumot képeztünk. Az alkalmas arányok többek között a végtermék kívánt erősségétől függnek, előnyös pl. 60:4 tömegrész por/hordozó. A kapott koncentrátum előnyösen 0,4-10% és még előnyösebben 0,8-8% aktív alkotórészt tartalmazott, a spórákra vagy endotoxinra vonatkoztatva. A nedvesít40 hető port permetezéshez alkalmas módon vízzel hígíthatjuk, amint ez a szakterületen ismert.

A) TÁBLÁZAT (a) -46

GG ATC CGT TTT AAA TTG TAG TAA TGA AAA ACA GTA TTA

Ile Arg Phe Lys Leu *** *** *** Lys Thr Val Leu

TAT C AT AAT GAA TTG GTA TCT TAA TAA AAG AGA TGG AGG TAA CTT TyrH is Asn Glu Leu Val Ser *** *** Lys Arg Trp Arg *** Leu (-15)

ATG GAT AAC AATCCG AAC ATC AAT GAA TGC ATT CCT TAT AAT 4 5 Met Asp Asn AsnPro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn TGT (1) (4) Cys (15)

TTA AGT AAC CCT GAA GTA GAA GTA TTA GGT GGA GAA AGA ATA GAA Leu Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu

ACT GGT TAC ACC CCA ATC GAT ATT TCC TTG TCG CTA ACG CAA TTT Thr Gly Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gin Phe

HU 209 148 Β (b)

CTT TTG AGT GAA ITT GTT CCC GGT GCT GGA TTT GTG TTA GGA CTA Leu Leu Ser Glu Phe Val Pro Gly Alá Gly Phe Val Leu GlyLeu (60)

GTT GAT ΑΤΑ ATA TGG GGA ATT TTT GGT CCC TCT CAA TGG GAC GC A Val Asp Ile Ile Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gin Trp Asp Alá n-1

TTT CTT GTA CAA ATT GAA CAG TTA ATT AAC CAA AGA ATA GAA GAA Phe Leu Val Gin Ile Glu Gin Leu Ile Asn Gin Arg Ile Glu Glu (m-1) (c) 300

TTC GCT AGG AAC CAA GCC ATITCT AGA TTA GAA CGA CTA AGC A AT Phe Alá Arg Asn Gin Alá Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn (100) (105)

CTT TAT CAA ATT TAC GCA GAA TCT TTT AGA GAG TGG GAA GCA GAT Leu Tyr Gin Ile Tyr Alá Glu Ser Phe Arg Glu Trp Glu Alá Asp

CCT ACT AAT CCA GCA TTA AGA GAA GAG ATG CGT ATT CAA TTC A AT Pro Thr Asn Pro Alá Leu Arg Glu Glu Met Arg Ile Gin Phe Asn (135)

GAC ATG AAC AGT GCC CTT ACA ACC GCT ATT CCT CTT TTT GCA GTT Asp Met Asn Ser Alá Leu Thr Thr Alá Ile Pro Leu Phe Alá Val (140)

495

CAA AAT TAT CAA GTT CCT CTT TTA TCA GTA TAT GTT CAA GCT GCA Gin Asn Tyr Gin Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val Gin Alá A 1 a (165)

523

AAT TTA CAT TTA TCA GTT TTG AGA GAT GTT TCA GTG TTT GGA CAA Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser Val Phe Gly Gin (180)

549 577

AGG TGGGGA TTT GAT GCC GCG ACT ATC AAT AGT CGT TAT AAT GAT Arg TrpGly Phe Asp Alá Alá Thr Ile Asn Ser ArgTyrAsn Asp (195)

606 n-348 624

TTA ACT AGG CTT ATT GGC AAC TAT ACA GAT C AT GCIGTA CGC TGG Leu Thr Arg Leu He Gly Asn Tyr Thr Asp His Alá Val Arg Trp (m-116) (210) (d) 675

TAC AAT ACG GGA TTA GAG CGT GTA TGG GGA CCG GAT TCT AGA GAT Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg Asp (225)

TGG ATA AGA TAT AAT CAA TTT AGA AGA GAA TTA ACA CTA ACT GTA Trp Ile Arg Tyr Asn Gin Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val

TTA GAT ATC GTT TCT CTA TTT CCG AAC TAT GAT AGT AGA ACG TAT Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr (255)

CCA ATT CGA ACA GTT TCC CAA TTA ACA AGA GAA ATT TAT ACA AAC Pro Ile Arg Thr Val Ser Gin Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn

CCA GTA TTA GAA AAT TTT GAT GGT AGT TTT CGA GGC TCG GCT CAG Pro Val Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Alá Gin

HU 209 148 Β

GGC ATA GAA GGA AGT ATT AGG AGT CCA CAT TTG ATG GAT ATA CTT Gly Ile Glu Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu

AAC AGT ATA ACC ATC TAT ACG GAT GCT CAT AGA GGA GAA TAT TAT Asn Ser Ile Thr Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr

TGG TCA GGG CAT CAA ATA ATG GCT TCT CCT GTA GGG TTT TCG GGG Trp Ser Gly His Gin He Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly

CCA GAA TTC ACT TTT CCG CTA TAT GGA ACT ATG GGA AAT GCA GCT Pro Glu Phe Thr Phe Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala

CCA CAA CAA CGT ATT GTT GCT CAA CTA GGT CAG GGC GTG TAT AGA Pro Gin Gin Arg He Val Ala Gin Leu Gly Gin Gly Val Tyr Arg

ACA TTA TCG TCC ACT TTA TAT AGA AGA CCT TTT AAT ATA GGG ATA Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile

AAT AAT CAA CAA CTA TCT GTT CTT GAC GGG ACA GAA TTT GCT TAT Asn Asn Gin Gin Leu Ser Val Leu Asp Gly Thr Glu Phe Ala Tyr

GGA ACC TCC TCA AAT TTG CCA TCC GCT GTA TAC AGA AAA AGC GGA Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val Tyr Arg Lys Ser Gly

ACG GTA GAT TCG CTG GAT GAA ATA CCG CCA CAG AAT AAC AGC GTG Thr Val Asp Ser Leu As Glu Ile Pro Pro Gin Asn Asn Asn Val

CCA CCT AGG CAA GGA TTT AGT CAT CGA TTA AGC CAT GTT TCA ATG Pro Pro Arg Gin Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His Val Ser Met

1350

TTG CGT TCA GGC TTT AGT AAT AGT AGT GTA AGT ATA ATA AGA GCT Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile Arg Ala (450)

CCT ATG TTC TCT TGG ATA CAT CGT AGT GCT GAA TTT AAT AAT ATA Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile

ATT CCT TCA TCA CAA ATT ACA CAA ATA CCT TTA ACA AAA TCT ACT Ile Pro Ser Ser Gin Ile Thr Gin Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr

AAT CTT GGC TCT GGA ACT TCT GTC.GTT AAA GGA CCA GGA TTA ACA Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr

GGA GGA GAT ATT CTT CGA AGA ACT TCA CCT GGC CAG ATT TCA ACC Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gin Ile Ser Thr

TTA AGA GTA AAT ATT ACT GCA CCA TTA TCA CAA AGA TAT CGG GTA Leu Arg Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gin Arg Tyr Arg Val

AGA ATT CGC TAC GCT TCT ACC ACA AAT TTA CAA TTC CAT ACA TCA Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gin Phe His Thr Ser

ATT GAC GGA AGA CCT ATT AAT CAG GGG AAT TTT TCA GCA ACT ATG Ile Asp Gly Arg Pro Ile Asn Gin Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met

AGT AGT GGG AGT AAT TTA CAG TCC GGA AGC TTT AGG ACT GTA GGT Ser Ser Gly Ser Asn Leu Gin Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly

TIT ACT ACT CCG TTT AAC TTT TCA AAT GGA TCA AGT GTA TTT ACG Phe Thr Thr Pro Phe Asn Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr

TTA AGT GCT CAT GTC TTC AAT TCA GGC AAT GAA GTT TAT ATA GAT Leu Ser Ala His Val Phe Asn Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp

CGA ATT GAA TTT GTT CCG GCA GAA GTA ACCTTT GAG GCA GAA TAT Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr (610)

HU 209 148 Β

GAT TTA GAA AGA GCA CAA AAG GCG GTG AAT GAG CTG TTT ACT TCT Asp Leu Glu Arg Alá Gin Lys Alá Val Asn Glu Leu Phe Thr Ser

TCC AAT CAA ATC GGG TTA AAA ACA GAT GTG ACG GAT TAT CAT ATT Ser Asn Gin lle Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His lle

GAT CAA GTA TCC AAT TTA GTT GAG TGT TTA TCT GAT GAA TTT TGT Asp Gin Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys

CTG GAT GAA AAA AAA GAA TTG TCC GAG AAA GTC AAA CAT GCG AAG Leu Asp Glu Lys Lys Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Alá Lys

CGA CTT AGT GAT GAG CGG AAT TTA CTT CAA GAT CCA AAC TTT AGA Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gin Asp Pro Asn Phe Arg

GGG ATC AAT AGA CAA CTA GAC CGT GGC TGG AGA GGA AGT ACG GAT Gly lle Asn Arg Gin Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp

ATT ACC ATC CAA GGA GGC GAT GAC GTA TTC AAA GAG AAT TAC GTT He Thr lle Gin Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val (e)

ACG CTA TTG GGT ACCTTT GAT GAG TGC TAT CCA ACG TAT TTA TAT Thr Leu Leu Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr (723)

2250

CAA AAA ATA GAT GAG TCG AAA TTA AAA GCC TAT ACC CGT TAC CAA Gin Lys lle Asp Glu Ser Lys Leu Lys Alá Tyr Thr Arg Tyr Gin (750)

TTA AGA GGG TAT ATC GAA GAT AGT CAA GAC TTA GAA ATC TAT TTA Leu Arg Gly Tyr lle Glu Asp Ser Gin Asp Leu Glu lle Tyr Leu

ATT CGC TAC AAT GCC AAA CAC GAA ACA GTA AAT GTG CCA GGT ACG lle Arg Tyr Asn Alá Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr

GGT TCC TTA TGG CCG CTT TCA GCC CCA AGT CCA ATC GGA AAA TGT Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Alá Pro Ser Pro lle Gly Lys Cys

GGA GAA CCG AAT CGA TGC GCA CCA CAA CTT GAA TGG AAT CCA GAT Gly Glu Pro Asn Arg Cys Alá Pro Gin Leu Glu Trp Asn Pro Asp

CTA GAT TGT TCC TGC AGA GAC GGA GAA AAA TGT GCC CAT CAT TCC Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys Cys Alá His His Ser

CAT CAT TTC TCC TTG GAC ATT GAT GTT GGA TGT ACA GAC TTA AAT His His Phe Ser Leu Asp lle Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn (840)

GAG GAC TTA GGT GTA TGG GTG ATA TTC AAG ATT AAG ACG CAA GAT Glu Asp Leu Gly Val Trp Val lle Phe Lys lle Lys Thr Gin Asp

GGC CAT GCA AGA CTA GGA AAT CTA GAA TTT CTC GAA GAG AAA CCA Gly His Alá Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro

TTA GTA GGA GAA GCA CTA GCT CGT GTG AAA AGA GCG GAG AAA AAA Leu Val Gly Glu Alá Leu Alá Arg Val Lys Arg Alá Glu Lys Lys

2700

TGG AGA GAC AAA CGT GAA AAA TTG GAA TGG GAA ACA AAT ATT GTT Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr Asn lle Val (900)

TAT AAA GAG GCA AAA GAA TCT GTA GAT GCT TTA TTT GTA AAC TCT Tyr Lys Glu Alá Lys Glu Ser Val Asp Alá Leu Phe Val Asn Ser

CAA TAT GAT AGA TTA CAA GCG GAT ACC AAC ATC GCG ATG ATT CAT Gin Tyr Asp Arg Leu Gin Alá Asp Thr Asn lle Alá Met lle His

HU 209 148 Β

GCG GCA GAT AAA CGC GTT CAT AGC ATT CGA GAA GCT TAT CTG CCT Alá Alá Asp Lys Arg Val His Ser Ile Arg Glu Alá Tyr Leu Pro

GAG CTG TCT GTG ATT CCG GGT GTC AAT GCG GCT ATT TTT GAA GAA Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Alá Alá Ile Phe Glu Glu

TTA GAA GGG CGT ATT TTC ACT GCA TTC TCC CTA TAT GAT GCG AGA Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr Alá Phe Ser Leu Tyr Asp Alá Arg

AAT GTC ATT AAA AAT GGT GAT TTT AAT AAT GGC TTA TCC TGC TGG Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp

AAC GTG AAA GGG CAT GTA GAT GTA GAA GAA CAA AAC AAC CAC CGT Asn Val Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gin Asn Asn His Arg

TCG GTC CTT GTT GTT CCG GAA TGG GAA GCA GAA GTG TCA CAA GAA Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Alá Glu Val Ser Gin Glu

GTT CGT GTC TGT CCG GGT CGT GGC TAT ATC CTT CGT GTC ACA GCG Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr He Leu Arg Val Thr Alá

TAC AAG GAG GGA TAT GGA GAA GGT TGC GTA ACC ATT CAT GA G ATC Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile (1050)

GAG AAC AAT ACA GAC GAA CTG AAG TTT AGC AAC TGT GTA GAA GAG Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu

3240

GAA GTA TAT CCA AAC AAC ACG GTA ACG TGT AAT GAT TAT AC T GCG Glu Val Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Alá (1080)

ACT CAA GAA GAA TAT GAG GGT ACG TAC ACT TCT CGT AAT CGA GGA Thr Gin Glu Glu Tyr Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly

TAT GAC GGA GCT TAT GAA AGC AAT TCT TCT GTA CCA GCT GAT TAT Tyr Asp Gly Alá Tyr Glu Ser Asn Ser Ser Val Pro Alá Asp Tyr

GCA TCA GCC TAT GAA GAA AAA GCA TAT ACA GAT GGA CGA AGA GAC Alá Ser Alá Tyr Glu Glu Lys Alá Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Asp

AAT CCT TGT GAA TCT AAC AGA GGA TAT GGG GAT TAC ACA CCA CTA Asn Pro Cys Glu Ser Asn Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Thr Pro Leu

CCA GCT GGC TAT GTG ACA AAA GAA TTA GAG TAC TTC CCA GAA ACC Pro Alá Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr

GAT AAG GTA TGG ATT GAG ATC GGA GAA ACG GAA GGA ACA TT C ATT Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly,Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile (1170)

GTG GAT AGC GTG GAA TTA CTC CTT ATG GAG GAA TAG

Val Asp Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu

Jegyzetek: (a) BamHI hely (b) Spel hely 50 (c) és (d) Xbal hely (e) KpnI hely

A találmány szerinti legelőnyösebb mutációk a 116 (Lys vagy Arg), 119 (Thr), 130 (Ile) és 188 (Ser) helyeknél levő mutációk és ezek kombinációi, beleértve egy vagy több azonos kombinációt, mint amelyet a pBT26-3-ban, pBT-106-ban, ρΒΤ-68-ban, pBT-C-ben, ρΒΤ-67-ben és ρΒΤ-70-ben találunk (ezek közül néhányat felsoroltunk a G táblázatban). Különösen érdekesek az egyedi és kombinált mutáciGiu *** (1181) ók a p36a65-ben, elsősorban a megrövidített endotoxinokban.

A találmány szerint talált és lehetővé tett mutációk a 4. aminosav-helyzetnél különösen érdekesek, mivel ezek egy olyan 25 aminosavas szekción belül vannak (1-25., beleértve a határértékeket, az A táblázatban), amelyről le55 hetségesnek tartjuk, hogy az endotoxin pre-toxin vagy protoxin részét is képezik, és ezekből a bélrendszerben proteázos hasítással aktív vagy aktívabb endotoxin képződik, így tehát a 4. helyzetben lehetségessé vált mutációk az olyan endotoxin szekvenciákra vonatkozónak lát60 szanak,-amelyek tartalmazzák az említett 25 aminosavat

HU 209 148 Β vagy lényeges homológiával (legalább 95%) bírnak ezzel, és még inkább azokra az endotoxinokra vonatkoznak, amelyeket olyan DNS kódol, amely a 4. hely mutációja előtt szigorú körülmények között olyan DNSsel hibridizált, amely az A táblázatban található szekvenciával bír az 1. nukleotid helytől kezdődően, magában foglalva a 75. nukleotid helyet, függetlenül a beiktatástól és kiiktatásoktól.

Úgy találtuk, hogy a 217. aminosavhelynél talált mutációnál, amelyről a fenti B táblázatban számoltunk be, és amelyet értékeltünk, minden természetes kódolt aminosav jelen lehet az aktív endotoxinokban, amelyek az A táblázatban bemutatott idevonatkozó szekvenciával bírnak, amely szekvenciák a 116 aminosavas referencia szekvencia végétől a 217. aminosav helyig terjednek, beleértve ezt az aminosavat is. Következésképpen minden toxin, amelyben a 217. helynél levő aminosav bármely természetes kódolt aminosav, Argót kivéve, benne foglaltatik a találmány oltalmi körében. Mivel a 217. helynél jelzett mutáció kevésbé értékes eredményeket alakít ki, ez főleg más itt ismertetett mutációkkal kombinálva érdekes, és azt mutatja, hogy a 217. hely változhat azokban az endotoxinokban, amelyekben természetes módon Arg fordul elő ennél a helynél.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás rovarokra nézve toxikus Bacillus thuringiensis δ-endotoxin fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy baktériumsejteket olyan a B táblázatban felsorolt p26-3, p48al4, p48c5, p36a65, p95a76, p95a86, p98cl, p99c62, pl07c22, pl07c25 vagy pll4a30 mutáns DNS-szekvenciát tartalmazó kifejező vektorral vagy valamely az F táblázatban felsorolt 3-3Z jelű vagy a G táblázatban felsorolt 4-A-4-F jelű plazmiddal transzformálunk vagy fertőzünk át, amely egy, az A táblázatban az m-1 helynél kezdődő és az m-116 helyig terjedő aminosav-szekvenciával legalább 95% homológiát mutató aminosav-szekvenciát kódol, ahol a vektorban alkalmazott DNS-szekvencia az alábbi egy vagy több aminosav-helynél az alább megadott aminosavakat kódolja:

a) az m-5 helynél Lys,

b) az m-6 helynél Lys,

c) az m-12 helynél Lys,

d) az m-16 helynél Tyr,

e) az m-27 helynél Lys vagy Arg,

f) az m-30 helynél Thr,

g) az m-33 helynél Ile,

h) az m-34 helynél Tyr,

i) az m-36 helynél Val,

j) az m-41 helynél Ile,

k) az m-95 helynél Ile,

l) az m-98 helynél Thr,

m) az m-99 helynél Ser,

n) az m-105 helynél Lys,

o) az m-112 helynél Asp, és a kapott sejteket tenyésztjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t alkalmazunk, amely az m-27 és m-30 aminosav-helynél az 1. igénypontban megadott aminosavat kódolja.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t alkalmazunk, amely az 1. vagy 2. igénypont szerinti módosítások előtt szigorú hibridizáló körülmények között olyan 348 nukleotidos oligomerhez hibridizál, amelynek nuklotid-szekvenciája az A táblázatban megadott n-1 helytől n-348 helyig terjed.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t alkalmazunk, amely az 1. vagy 2. igénypont szerinti módosítás előtt az A táblázatban megadott m-1 helynél kezdődő és m-116 helyig terjedő aminosav-szekvenciát kódolja.
5. Eljárás rovarokra nézve toxikus endotoxin fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy baktériumsejteket olyan kifejező vektorral transzformálunk vagy fertőzünk át, amely egy, az A táblázatban megadott 1. aminosav-helytől a 205. aminosav-helyig terjedő aminosav-szekvenciával legalább 95% homológiát mutató aminosav-szekvenciát kódoló DNSszekvenciát tartalmaz, ahol a DNS szekvencia a 4. aminosav-helyen az Asn-től eltérő bármilyen aminosavat kódol, és a kapott sejteket tenyésztjük.
6. Az 5. igénypont.szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t alkalmazunk, amely az A táblázatban megadott 1. aminosav-helytől a 205. aminosav-helyig terjedő aminosav-szekvenciát kódolja.
7. Inszekticid készítmény, azzal jellemezve, hogy valamely az 1. vagy 5. igénypont szerinti eljárással előállított fehérjét tartalmaz mezőgazdasági szempontból elfogadható hordozó mellett.