FR2627778A1

FR2627778A1 - Gene de structure, proteine endotoxine correspondante et application insecticide

Info

Publication number: FR2627778A1
Application number: FR8902428A
Authority: FR
Inventors: Cindy Lou Jellis; James Robert Rusche; Daniel Parker Witt
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1988-02-25
Filing date: 1989-02-24
Publication date: 1989-09-01
Anticipated expiration: 2009-02-24
Also published as: GB8904016D0; TR26073A; PT89812A; HU209148B; GB2216127A; PL277925A1; IE62118B1; NZ228108A; DK84589A; HUT50507A; FR2627778B1; CN1037538A; GR1000457B; BE1001877A4; ATA41389A; BR8900881A; PT89812B; JPH025872A; AT396940B; PL161726B1

Abstract

L'invention concerne des protéines endotoxines de Bacillus thuringiensismutantes, présentant l'activité insecticide caractéristique qu'ont les delta-endotoxines de type sauvage. A chaque point de mutation individuel, il est indiqué que les codons codant pour n'importe quel acide aminé naturel peuvent être substitués pour produire une protéine endotoxine active. Sont également décrites des séquences d'ADN codant pour ces endotoxines et des techniques recombinantes pour la production d'endotoxine mutante à activité insecticide.

Description

Bacillus thuringiensis (B.t.) est une bactérie sporu-

lante qui produit une protéine cristalline, la delta-endo-

toxine (6-endotoxine) à la fin du stade végétatif de la croissance. Cette endotoxine, par ingestion par certains in-

sectes, produit des effets toxiques qui englobent la cessa-

tion de l'alimentation, le dérèglement gastro-intestinal, la déshydratation et aboutit à la mort. La 6-endotoxine est produite, généralement à partir d'une source de plasmide,

sous forme d'un précurseur inactif ou sous forme de pro-

toxine ayant une masse moléculaire de 130 000-140 000 dal-

tons [Calabrese, Canad, J. Microbiol. 26 (1980) 1006]. Le clivage protéolytique servant à éliminer environ la moitié C-terminale et probablement plusieurs acides aminés à l'extrémité N. se produit normalement dans l'intestin de l'insecte par suite de l'action des protéases de l'intestin, et il est nécessaire qu'il produise la toxine active d'une masse moléculaire de 65 000 à 70 000d [Tyrell et -coll., J.

Bacteriology 145 (1981) 10523.

Un grand nombre de sous-variétés de B.t. ont été iden-

tifiés. Bien que la plupart de celles-ci présentent une toxicité plus spécifique ou accrue aux insectes de l'ordre des lépidoptères, un nombre limité s'est également révélé

être toxique vis-à-vis des insectes d'autres classifica-

tions. Par exemple, B.t. israelensis est toxique vis-à-vis des larves de diptères (moustiques et mouches noires) et

deux autres sous-variétés qui révèlent une toxicité vis-à-

vis des larves de coléoptères ont été récemment identifiées

[Hofte et coll., Nuc. Acid. Res. 15(17) (1987) 7183].

Bien que de nombreux travaux aient été réalisés dans la production de toxines raccourcies et de gènes de structure codant pour celles-ci, il semble que l'on en sache moins à propos de la capacité des 6-endotoxines de B.t. à supporter des mutations ponctuelles dans la partie active ou toxique de la séquence d'endotoxine et sur l'effet de ces mutations

sur l'activité des molécules de toxine.

Un but de la présente invention est de fournir de nou-

veaux mutants de la portion active des 6-endotoxines de B.t.. Un autre but de la présente invention est de fournir des mutations qui sont efficaces pour produire une activité

analogue à l'endotoxine de B.t. à la fois sous forme de 6-

endotoxine tronquée et complète.

Un autre but de la présente invention est de fournir des mutations qui améliorent l'activité insecticide des

structures de 6-endotoxine de B.t..

Selon la présente invention, on a, après avoir créé de

façon aléatoire des mutations ponctuelles simples et mul-

tiples dans de nombreuses centaines de brins d'ADN codànt pour une large section de la portion active d'une endotoxine de B.t. représentative, active comme insecticide contre les

lépidoptères, isolé et produit par des techniques recombi-

nantes plusieurs endotoxines de B.t. mutantes qui présentent

l'activité insecticide caractéristique oontre les lépido-

ptères que possède la 6-endotoxine de B.t. de type sauvage.

De plus, à ces points de mutation découverts, il est indiqué que les codons codant pour n'importe quel autre acide aminé naturel peuvent être remplacés pour produire une protéine

d'endotoxine active. Un certain nombre des mutations aléa-

toires se sont également révélées produire un niveau supé-

rieur d'activité insecticide. Cette activité peut être dé-

montrée, par exemple, dans l'étude de la noctuelle du tabac (Heliothis virescens) ou dans l'étude de Trichoplusia ni (arpenteuse du chou), comme il est décrit ci-dessous, et dans de nombreux cas cette augmentation a été tout à fait remarquable en ce qu'elle réalisait une activité d'au moins

deux ou plus de deux fois plus grande que celle de la struc-

ture de l'endotoxine parente. Les mutations multiples (habi-

tuellement 2 ou 3 acides aminés par brin d'ADN muté) ont également été évaluées individuellement et en différentes

combinaisons pour identifier certaines mutations et combi-

naisons de celles-ci plus efficaces. Les mutations selon la présente invention, à une exception près, se sont également

avérées exister dans des sections de séquences d'acides ami-

nés qui sont hautement conservées parmi une grande variété de 6endotoxines de B.t. de type sauvage, ce qui indique donc la possibilité d'application générale des mutations fournies par l'invention à une grande variété de structures

d'endotoxine dans lesquelles ces zones conservées fournis-

sent des endotoxines de B.t. insecticides.

Plus particulièrement, si l'on se réfère à la séquence

d'acides aminés et à sa numérotation dans le tableau A ci-

dessous (en commençant par la méthionine (MET), qui est en

position numéro 1 et par l'extrémité N normale de l'endo-

toxine représentative active contre les lépidoptères indi-

quée sur le tableau A), on a découvert que la protéine d'en-

dotoxine B.t., qui a autrement une activité insecticide

contre les insectes lépidoptères à la manière des endotoxi-

nes de B.t. natives lorsqu'elle contient, dans la partie active, une séquence de résidu d'acides aminés, identique ou ayant une homologie substantielle avec celle indiquée sur le

tableau A pour la séquence de résidu d'acides aminés 116 in-

diquée aux positions à partir de la position 90 incluse et jusqu'à la position 205 incluse (également les positions d'acides aminés m-1 à m-116) , peut comporter un ou plusieurs

des résidus des acides aminés suivants aux positions homo-

logues indiquées ou équivalentes (les numéros des positions m entre parenthèses étant une référence à ladite séquence de

résidu d'acides aminés 116): a) en position 94 (position m-

5 de ladite séquence d'acides. aminés 116), n'importe quel acide aminé naturel pour laquelle code le code génétique, sauf Asn; b) en position 95 (position m-6 de ladite séquence d'acides aminés 116), n'importe quel acide aminé naturel de

ce type, sauf Gln; c) en position 101 (position m-12 de la-

dite séquence d'acides aminés 116), n'importe quel acide

aminé naturel de ce type, sauf Glu; d) en position 105 (po-

sition m-16 de ladite séquence de résidu 116), n'importe

quel acide aminé naturel de ce type, sauf Asn; e) en posi-

tion 116 (m-27 de ladite séquence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type sauf Glu; f) en position

119 (position m-30 de ladite séquence de résidu 116), n'im-

porte quel acide aminé naturel de ce type, sauf Ala; g) en position 122 (position m-33 de ladite séquence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type, sauf Thr; h) en position 123 (position m-34 de ladite séquence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type,

sauf Asn; i) en position 125 (position m-36 de ladite sé-

quence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de

ce type, sauf Ala; j) en position 130 (position m-41 de la-

dite séquence de résidu 116), n'importe quel acide aminé na-

turel de ce type, sauf Met; k) en position 184 (position m-

de ladite séquence de résidu 116), n'importe quel acide

aminé naturel de ce type, sauf Phe; 1) en position 187 (po-

sition m-98 de ladite séquence de résidu 116), n'importe

quel acide aminé naturel de ce type, sauf Ala; m) en posi-

tion 188 (position m-99 de ladite séquence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type, sauf Thr; n) en position.194 (position m105 de ladite séquence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de ce type, sauf

Asn; et o) en position 201 (position m-112 de ladite sé-

quence de résidu 116), n'importe quel acide aminé naturel de

ce type, sauf Gly.

De plus, et en se référant de nouveau à la séquence de résidu d'acides aminés numérotée indiquée sur le tableau A, l'invention inclut le changement dans l'acide aminé Asn à la position d'acide aminé 4 en tout autre acide aminé naturel

pour lequel code le code génétique.

En ce qui concerne les résidus d'acides aminés fournis par l'invention dans la séquence de résidu 116, on préfère, selon l'invention, que cette séquence soit caractérisée, en se référant de nouveau à la séquence mature totale indiquée sur le tableau A (et également à la séquence de résidu 116), par un ou plusieurs des acides aminés suivants aux positions indiquées: a) Lys en position 94 (position 5 de la séquence de résidu 116) ; b) Lys en position 95 (position 6 de ladite séquence de résidu 116); c) Lys en position 101 (position 12 de ladite séquence de résidu 116); d) Tyr en position 105 (position 16 de ladite séquence de résidu 116); e) Lys ou

Arg, de préférence Arg, en position 116 (position 27 de la-

dite séquence de résidu 116); f) Thr en position 119 (posi-

tion 30 de ladite séquence de résidu 116); g) Ile en posi-

tion 122 (position 33 de ladite séquence de résidu 116); h)

Tyr en position 123 (position 34 de ladite séquence de ré-

sidu 116); i) Val en position 125 (position 36 de ladite sé-

quence de résidu 116); j) Ile en position 130 (position 41 de ladite séquence de résidu 116); k) Ile en position 184 (position 95 de ladite séquence de résidu 116); 1) Thr en position 187 (position 98 de ladite séquence de résidu 116); m) Ser en position 188 (position 99 de ladite séquence de résidu 116); n) Lys en position 194 (position 105 de ladite séquence de résidu 116); et o) Asp en position 201 (position

112 de ladite séquence de résidu 116).

Lorsque le Asn en position d'acide aminé 4 est changé,

il est dé préférence changé en Tyr.

Le tableau A situé vers la fin de cette description

présente une séquence de nucléotides et la séquence d'acides

aminés déduite résultante relative à la production de 8-en-

dotoxine de B.t. dans la nature. A une exception près, la séquence de nucléotides a été obtenue à partir d'un plasmide

produisant de la 6-endotoxine trouvé dans B.t. wuhanensis.

En particulier, la totalité du gène de structure (codant en

fait pour l'endotoxine elle-même) provient de B.t. wuhanen-

sis et l'exception est que la séquence située avant la mé-

thionine (Met) au début du gène de structure provient d'un gène produisant de l'endotoxine découvert dans B.t. kurstaki HD-1 (que l'on appelle plasmide de la classe Hind III de ,3kb de HD-1), cette séquence amont contenant le site de

liaison ribosomique natif (RBS) issu de ce plasmide produi-

sant de l'endotoxine HD-1 de B.t. kurstaki. La séquence amont contenant le site de liaison ribosomique, telle qu'on

la trouve dans B.t. wuhanensis, diffère peu de celle indi-

quée sur le tableau A pour kurstaki et les différences sont indiquées dans la suite. Cependant, il faut garder présent à

l'esprit qu'à la fois la séquence de nucléotides et la sé-

quence d'acides aminés dans les gènes de structure HD-1 de

B.t. wuhanensis et dans B.t. kurstaki en question sont iden-

tiques à partir du début de la séquence d'endotoxine, en passant par toute sa partie active, au moins jusqu'au site

Kpn I indiqué au tableau A, ce site Kpn I étant dans la por-

tion protoxine. Par conséquent, la partie de la toxine ac-

tive résultant du clivage après l'ingestion par l'insecte

sera la même pour les deux endotoxines HD-1 de B.t. wuhanen-

sis et de B.t. kurstaki en question. Sur le tableau A, les acides aminés pour la protéine d'endotoxine produits par suite de l'expression du gène de structure, sont numérotés positivement entre parenthèses de 1 à 1181 au-dessous de

l'acide aminé. Ceux qui se trouvent dans la zone non tra-

duite en amont du 1-Met sont numérotés négativement à l'en-

vers ou vers l'amont (les signaux d'arrêt étant comptés comme étant une position d'acide aminé). Les nucleotides

dans le gène de structure sont numérotés (pas entre paren-

thèses) au-dessus de la ligne dans laquelle ils apparaissent

et le dernier chiffre du nombre se situe au-dessus du nu-

cléotide auquel le nombre s'applique. Les nucléotides dans

la région non traduite qui contient le site de liaison ribo-

somique sont numérotés négativement à l'envers à partir du codon ATG d'initiation (pour le 1-Met). Dans les séquences numérotées indiquées cidessus, une portion de celles-ci est numérotée séparément ou sousnumérotée m-1 à m-116 pour les acides aminés et n-1 à n-348 pour les nucléotides de ces

acides aminés, pour indiquer plus particulièrement une ré-

gion hautement conservée dans laquelle la plupart des muta-

tions fournies par l'invention se sont révélées être si-

tuées. Certains sites de restriction concernant la séquence de nucléotides, dans le tableau A, sont indiqués par une ligne située audessus des nucléotides mis en jeu dans les sites de restriction, avec une désignation en renvoi du site particulier. La portion toxique de l'endotoxine représentée

sur le tableau A, telle qu'elle est reconnue dans la tech-

nique, fait intervenir la séquence d'acides commençant à la position d'acide aminé 1 (Met) et allant jusqu'à la position d'acide aminé 610 (Thr). Du fait de la séquence d'ADN totale

représentée sur le tableau A, et afin de comprendre plus fa-

cilement la description suivante, on notera que l'ADN et les

séquences d'acides aminés commençant par la portion non tra-

duite par la ligne 1 du tableau A et s'étendant jusqu'au

site Kpn I aux environs des positions d'acides aminés 724-

725, et de leurs portions, peuvent être considérés ici comme dérivant de B.t. kurstakf HD-1 (le plasmide de classe Hind

III de 5,3kb), et on s'y réfère ici de cette façon.

La figure 1 représente une carte des plasmides de tra-

vail généraux prAK et prAK-3 utilisés à diyers stades ayant rapport avec l'invention et comprenant un ADN codant pour

une endotoxine de B.t. tronquée, dérivée de HD-1 de B.t.

kurstaki et ayant une activité insecticide contre les lépi-

doptères. La figure 2 représente une carte du plasmide pB8rII qui comprend un ADN codant pour une protéine d'endotoxine de B.t. tronquée de longueur légèrement plus grande que celle

pour laquelle code prAK et dérivée également de HD-1 de B.t.

kurstaki et ayant également une activité insecticide contre

les lépidoptères.

Les figures 3a et.3b représentent deux brins d'ADN bi-

caténaires représentatifs qui peuvent être synthétisés pour la mise en oeuvre de ce que l'on appelle des expériences de

rotation du codon et qui sont également utiles pour intro-

duire de façon commode les mutations souhaitées dans une sé-

quence d'ADN codant pour l'endotoxine de B.t..

La figure 4 représente une carte du plasmide pBT210 qui comprend un ADN codant pour une endotoxine native complète issue de B.t. wuhanensis, cette endotoxine comportant une séquence d'acides aminés, dans sa portion active, identique à celle de l'endotoxine issue de HD-1 de B.t. kurstaki pour

laquelle codent prAK et pB8rII.

La figure 5 montre une carte abrégée du plasmide prAK-9

ainsi qu'un agrandissement.d'une section éclatée de celui-

ci, ledit prAK-9 étant autrement analogue en détail au plas-

mide prAK-3 et ladite section et lesdites sous-sections de celui-ci dans les plasmides parents étant commodément utiles

pour mener des expériences de rotation du codon et introdui-

re autrement des mutations telles que celles fournies par l'invention.

Le plasmide prAK a été déposé dans JM103 de E. coli au-

près de l'Agricultural Research Culture Collection (NRRL),

Peoria, Illinois, le 19 février 1988, et a reçu le n de dé-

pôt NRRL B-18329.

Le plasmide pB8rII a été déposé dans JM103 de E. coli auprès de l'Agricultural Research Culture Collection (NRRL),

Peoria, Illinois, le 19 février 1988, et a reçu le n de dé-

pôt NRRL B-18331.

Le plasmide pBT210 a été déposé dans JM103 de E. coli auprès de l'Agricultural Research Culture Collection (NRRL),

Peoria, Illinois, le 19 février 1988, et a reçu le n de dé-

pôt NRRL B-18330.

Comme il est essentiellement indiqué, les mutations

ponctuelles de l'invention peuvent être appliquées à des sé-

quences de protéine d'endotoxine produites par des variétés et des soustypes de Bacillus thuringiensis, ces séquences

ayant une activité insecticide contre les larves de lépido-

ptères lorsqu'elles contiennent la séquence d'acides aminés 116 conservée indiquée ci-dessus ou une séquence qui est hautement homologue à celle-ci ou qui est essentiellement un équivalent de celle-ci, notamment les séquences d'endotoxine

de protéine qui sont du type naturel complet ou essentielle-

ment complet et celles qui sont tronquées par élimination de

tout ou partie de la protoxine en aval ou d'une partie inac-

tive de celle-ci, et même celles qui peuvent être tronquées depuis l'extrémité C normale en amont en remontant jusqu'à

la portion active de l'endotoxine. Comme il est déjà évi-

dent, les endotoxines issues de B.t. kurstaki et de B.t.

wuhanensis ont toutes deux une région conservée d'acides aminés 116 identique et d'autres ont, ou on peut s'attendre à ce qu'elles aient, la même séquence d'acides aminés 116 ou

une séquence équivalente largement homogogue de celle-ci.

Par exemple, on sait déjà que les endotoxines issues de B.t.

sotto, de HD-73 de B.t. kurstaki (souche) et de B.t. galle-

riae produisent des endotoxines ayant la séquence d'acides

aminés 116 identique, même si certaines d'entre elles diffè-

rent au moins dans une certaine mesure, et dans certains cas de façon importante, à la fois dans le restant de la portion

toxique de l'endotoxine et dans la section de la protoxine.

D'autres, comme HD-1 de B.t. kurstaki Dipel (sous-souche du commerce) ont un changement d'acide aminé dans la séquence d'acides aminés 116 indiquée (m-59 est Leu pour lequel code

TTG) et d'autres changements/délétions/additions dans d'au-

tres portions de la séquence. Celle-ci et d'autres dont on a

trouvé qu'elles avaient un seul changement oudes change-

ments multiples, à l'exception d'une homologie en acides.

aminés d'au moins environ 70% par rapport à ladite séquence

d'acides aminés 116, peuvent.comporter un ou plusieurs chan-

gements mutants de l'invention apportés aux acides aminés de celle-ci, qui correspondent de façon identique à l'acide aminé dans ladite séquence non mutée d'acides aminés 116, en particulier lorsque l'acide aminé à changer possède, sur

chacun de ses côtés, 2 et de préférence 4 autres acides ami-

nés qui correspondent aussi de façon identique à ceux de la

séquence d'acides aminés 116. On envisage aussi que les mu-

tations de l'invention puissent être apportées aux acides aminés correspondants dans des séries homologues qui contiennent essentiellement des délétions ou des additions telles que la séquence elle-même soit plus courte ou plus longue que la séquence d'acides aminés 116 indiquée. Dans ces cas, la numérotation, telle qu'elle est employée dans la séquence d'acides aminés 116 de référence, sera conservée de telle manière que les délétions existant dans la séquence à changer soient comptées comme étant réellement présentes et

que les additions dans la séquences à. changer ne soient sim-

plement pas comptées. Par conséquent, on peut dire que l'attribution du positionnement des acides aminés est rendu indépendante des délétions ou des additions dans une telle

séquence homologue.

De préférence, les séquences d'acides aminés homologues

dans lesquelles les changements mutants de l'invention peu-

vent être substitués sont celles pour lesquelles code l'ADN, en lequel l'ADN issu ou bien du brin (ou du double brin) sens ou anti-sens de l'ADN commençant à la position n-1 et s'étendant jusqu'à la position n-348 dans le tableau A, s'hybridera dans des conditions d'hybridation rigoureuses lorsque la séquence homologue à muter a ses acides aminés, qui correspondent à ceux dans la séquence d'acides aminés 116 de référence, pour lesquels code le même codon que

l'acide aminé correspondant dans la séquence de référence.

Les modes opératoires pour préparer une telle sonde d'hy-

bridation marquée sont bien connus dans la technique. Les

conditions d'hybridation rigoureuses sont celles dans les-

quelles l'hybridation est effectuée à 60 C dans un tampon de citrate salin 2,5X (SSC), suivie simplement d'un rinçage à

37 C à une concentration réduite en tampon pour ne pas af-

fecter les hybridations qui ont lieu.

De préférence, les mutations sont faites dans des sé-

quences d'acides aminés qui ne possèdent pas plus de 1, 2 ou 3 différences d'acides aminés par rapport à ceux contenus

dans la séquence de référence d'acides aminés 116, mieux en-

core une séquence qui est identique à la séquence de réfé-

rence. Il a déjà été indiqué clairement dans la technique que la séquence de référence d'acides aminés 116 peut former une

portion de séquence de protéine endotoxine autrement es-

sentiellement modifiées ou différentes qui ont une activité insecticide contre les larves de lépidoptères et d'autres modifications en dehors de la séquence de référence seront très certainement découvertes à mesure que la connaissance dans la technique s'étend. Par conséquent, les séquences

bordant la portion de séquence mutée requise, qui est ana-

logue à la portion de référence d'acides aminés 116, peut varier dans une mesure considérable et n'a besoin que d'être suffisante pour fournir une protéine endotoxine à activité insecticide, par exemple comme celle mise en évidence par l'activité insecticide contre la noctuelle du tabac. Ainsi, la séquence d'acides aminés en amont de la portion mutée peut être raccourcie ou rallongée ou elle-même mutée par rapport à la séquence représentée sur le tableau A, mais

commencera généralement avec la méthionine et est de préfé-

rence hautement homologue (70%) ou identique à celle indi-

quée sur le tableau A, bien qu'il soit évident qu'une telle

séquence peut éventuellement aussi contenir le mutant pré-

féré en position 4, comme le fournit aussi l'invention. De

même, la portion en aval de la portion de séquence mutée re-

cherchée peut varier largement et être raccourcie ou ral-

longée par rapport au reste de celle-ci représentée sur le tableau A jusqu'à son point de clivage dans l'intestin de

l'insecte, et peut bien entendu ou non être davantage éten-

due pour former une portion protoxine ou une portion inac-

tive soumise à un clivage dans l'intestin de l'insecte pour

fournir une toxine de protéine à activité insecticide.

Un ADN comprenant des séquences codant pour des endo-

toxines mutantes, telles que celles fournies par l'inven-

tion, sera incorporé sous le contrôle de séquences régula-

trices appropriées dans des plasmides pour former des vec-

teurs d'expression qui seront transformés ou transfectés dans des cellules pour produire l'endotoxine. La production

d'endotoxines par de telles techniques biotechnologiques re-

combinantes, contrairement, par exemple, à la production de médicaments par ces techniques, fait intervenir peu ou pas

d'opérations conçues pour purifier l'endotoxine. Les cel-

lules dans lesquelles elle est produite peuvent être lysées, mais il est caractéristique, dans la production commerciale des endotoxines de B.t. dans le passé, d'employer simplement

la totalité du contenu du système de culture ou de fermenta-

tion utilisé dans la production de produit final, habituel-

lement après séchage par des moyens classiques, comme sé-

* chage par atomisation à basse température, tel qu'on le

connaît dans la technique. Suivant le produit, on peut ajou-

ter différentes matières pour améliorer la stabilité du pro-

duit, comme il est connu également, et on peut indépendam-

ment mélanger au produit des matières protéinées, si elles ne sont pas présentes en quantités adéquates dans le système de fermentation, pour améliorer la stabilité, comme il est connu également, par exemple de la poudre de soja ou de la

poudre de soja dégraissée.

Tandis que les endotoxines peuvent être produites par voie biotechnique dans une variété de systèmes cellulaires

transformés ou transfectés, on préfère généralement trans-

former ou transfecter des cellules bactériennes du type Gram-négatif ou Gram-positif. Un type préféré de bactérie

Gram-négative est E. coli, avec laquelle une quantité consi-

dérable d'expériences en biotechnologie ont été réalisées et pour laquelle une grande variété de systèmes de plasmides convenables et opérationnels et de vecteurs d'expression de

transfert sont connus et disponibles. Pseudomonas fluores-

cens représente un autre type de bactérie Gram-négative dans laquelle des plasmides portant des séquences d'endotoxine ont été incorporés. Comme il est démontré ici, les gènes

produisant l'endotoxine peuvent inclure des séquences régu-

latrices, comme particulièrement des séquences de sites de

liaison ribosomique qui ont leur origine dans B.t. lors-

qu'elles sont incorporées pour l'expression dans des cel-

lules bactériennes essentiellement hétérologues, comme E. coli. Comme les bactéries de type Bacillus fournissent un

environnement plus étroitement natif des endotoxines mu-

tantes de l'invention, il est particulièrement inclus dans le cadre de cette invention et envisagé par celle-ci de transformer ou de transfecter des bactéries de type Bacillus avec des vecteurs d'expression comprenant l'ADN codant pour les endotoxines mutantes-de cette invention. Des exemples

illustratifs de ces cellules de Bacillus présentant un inté-

rêt particulier sont les cellules de B.t., les cellules de B. cereus et les cellules de B. subtilis. Un mode opératoire

grandement amélioré pour transformer les cellules de Bacil-

lus, en particulier les cellules de B.t., a récemment été

découvert et est décrit dans la demande de brevet britan-

nique conjointe 8 729 726. Les types de cellule convenant pour la transformation par le procédé englobent les types

"cry minus", comme les cellules connues cry B de B.t. kurs-

taki qui ne possèdent pas de plasmides et les cellules de Bacillus de type sauvage comme les cellules de B.t. natives qui portent des plasmides produisant de l'endotoxine. Les plasmides convenant pour être incorporés dans les cellules de Bacillus, comme les cellules de B.t., sont connues, par

exemple le plasmide pBC16.1 (Kreft et coll., Molec. Gen. Ge-

net. [1978] 162 59) et ses plasmides parents qui peuvent

être utilisés ou modifiés au moyen des techniques recombi- nantes classiques servant à porter les séquences codant pour l'endotoxine

mutante de l'invention. Comme ii est bien connu dans la technique, les cellules de Bacillus produisent de

façon caractéristique de l'endotoxine en quantités sou-

haitées seulement à leur stade de la sporulation et sont donc cultivées jusqu'à ce stade afin de permettre d'obtenir

le mieux les produits utiles comme insecticides. Par consé-

quent, les plasmides ou les vecteurs d'expression fournis

par l'invention et portant l'ADN pour les endotoxines mu-

tantes peuvent être incorporés dans des cellules de Bacillus qui sont dénuées de plasmides produisant de l'endotoxine ou

bien qui contiennent déjà un ou plusieurs de ces plasmides.

Alors que les endotoxines mutantes de l'invention auront de façon caractéristique une activité contre les lépidoptères,

elles pourront également posséder une activité contre d'au-

tres classes d'insectes existant, dans l'endotoxine parente, avant la mutation ou par suite d'autres changements permis dans la séquence, et en tous cas il fait partie du cadre de l'invention de transformer des cellules de Bacillus avec les plasmides de l'invention produisant de l'endotoxine toxique pour les lépidoptères lorsque ces cellules portent des plasmides pour les endotoxines qui ne sont pratiquement pas efficaces contre les lépidoptères, afin de produire à la sporulation des endotoxines se combinant pour fournir des éventails plus larges d'activité insecticide. Par exemple, les plasmides portant les séquences d'ADN codant pour les endotoxines mutées peuvent être utilisés pour transformer

B.t. israeliensis ou B.t. tenebrionis, qui, individuelle-

ment, ne sont pratiquement pas efficaces contre les lépido-

ptères. Bien que la présente invention ait été démontrée à la

fois par référence à des protéines endotoxines de type tron-

qué et de type natif complet, on préfère généralement, lors-

qu'on utilise les endotoxines mutantes directement comme insecticides, comme il est décrit ci-dessus, employer ou produire des séquences complètes qui sont identiques ou qui imitent le type natif au moins en termes d'opportunité pour réaliser une aptitude de pliage de la protéine endotoxine analogue à celle de son aptitude native, ou un effet de

pliage complet amélioré.

Les séquences d'ADN mutantes selon la présente inven-

tion peuvent également être insérées dans le génome d'un vé-

gétal. Dans ces cas, on préfère employer les séquences'mu- tées du type tronqué, bien que les séquences complètes

conviennent aussi. Tout procédé convenable peut être avanta-

geusement employé pour cette incorporation des séquences d'endotoxine dans un génome de végétal hâteé-, comme, par exemple, par l'intermédiaire du plasmide Ti de Agrobacterium

tumefaciens, par électroporation, électrotransformation, mi-

croinjection, transfection virale ou au moyen de produits chimiques qui induisent ou qui augmentent l'absorption d'ADN libre, et analogue. Ces procédés et leur utilisation dans la

transformation des végétaux sont bien connus de l'homme de -

métier. De préférence, la séquence d'ADN codant pour l'endo-

toxine mutante sera associée aux séquences régulatrices appropriées, comme, par exemple, les séquences opérateur et régulatrice 3' qui sont fonctionnelles chez les végétaux, et

la totalité sera incorporée dans un vecteur de type expres-

sion. Une telle transformation de cellules végétales, suivie de la régénération du développement des cellules en végétaux entiers, permet à la séquence d'ADN d'en-dotoxine mutante de

devenir une partie stable et permanente du génome du végé-

tal, comme celle qui passe d'une génération à la suivante par mitose et méiose et qui, par expression, conduit à une protéine toxique pour les insectes, en procurant au végétal

une résistance aux insectes pouvant être héritée.

On a utilisé dans nos travaux deux vecteurs très sem-

blables (prAK et prAK-3) comme source de séquence de 8-endo-

toxine de B.t. pour la mutation et aussi pour fournir des véhicules pour la production et l'évaluation des mutants

d'endotoxine de B.t.. Les plasmides prAK et prAK-3 sont re-

présentés sur la figure 1 par l'illustration des détails pertinents de prAK et indication de la variation mineure qui existe entre prAK-3 et prAK. En fait, les plasmides prAK et prAK-3 sont des vecteurs d'expression entièrement compétents

pour E. coli et chacun inclut un gène de résistance à l'am-

picilline, une origine de réplication et des séquences opé-

rateurs, comprenant un promoteur de E. coli. Comme il est indiqué sur la figure 1, en traits noirs épais et en cases noires, le vecteur prAK inclut, dans la phase de lecture adéquate, une coordination avec le promoteur d'une séquence d'ADN que l'on trouve dans la souche HD-1 de B.t. kurstaki de type sauvage. Le trait noir épais représente la séquence mature qui a été raccourcie pour coder pour une 8-endotoxine de B.t. native tronquée s'étendant depuis l'acide aminé en

position 1 (Met) jusqu'à la position 610 (Thr) dans le ta-

bleau A et s'étendant ensuite dans la portion protoxine pour se terminer par l'acide aminé 723 (Leu). A l'extrémité aval de ce trait noir épais, une petite section représentée par

une case épaisse ouverte sur la figure 1, représente une sé-

quence d'ADN courte de 54 paires de bases qui suit le tri-

plet de paires de bases codant pour Leu-723 et qui est elle-

même immédiatement suivie d'un signal d'arrêt. Cette séquen-

ce s'étendant au total sur 57 paires de bases (y compris le signal d'arrêt) prend son origine dans le plasmide pBR322

bien connu qui a été utilisé dans la construction de prAK.

Par conséquent, le vecteur d'expression prAK code pour, et produit dans E. coli, essentiellement une protéine de fusion 8-endotoxine de B.t. tronquée ayant un total de 741 acides

aminés et composée des 610 acides aminés de la section pro-

toxine native et de 18 acides aminés ayant leur origine dans

pBR322. Cette protéine de fusion endotoxine de B.t. a un ni-

veau élevé d'activité insecticide et a été utilisée dans le

but d'évaluer les mutants de celle-ci produits dans nos tra-

vaux. Cette activité ne se distingue essentiellement pas de

celle d'une protéine 6-endotoxine de B.t. entièrement tron-

quée ne possédant que les 610 acides aminés de la toxine ac-

tivée (acides aminés 1 à 610 sur le tableau A).

Le trait noir épais représentant la plupart de la sé-

quence codant pour la protéine de fusion endotoxine de B.t.

tronquée est relié, à son extrémité amont sur la figure 1, à une case noire épaisse représentant une séquence qui inclut un site de liaison ribosomique (RBS) de B.t.. Cette section (représentée aussi sur le tableau A, lignes 1 et 2), qui contient le RBS, possède environ 47 nucléotides avant de commencer à son extrémité amont avec un site Bam HI (inséré dans les plasmides antérieurs pour lier la section avec la section promoteur de E. coli, indiquée par une flèche sur la

figure 1). La section promoteur et la section RBS sont dis-

posées et reliées pour être en bonne coordination de phase de lecture avec la séquence codant pour l'endotoxine. Par conséquent, les traits et les cases noirs épais représentent

ensemble un ADN ayant son origine dans HD-1 de B.t. kurs-

taki.

Divers autres sites de restriction indiqués sur la fi-

gure 1 concernaient la stratégie de l'élimination et de la

réinsertion classiques de sections d'ADN pour des expé-

riences de mutation. Ces autres sites de restriction sont le

site Nsi I (qui ne commence environ qu'au bout de 26 nucléo-

tides à partir du début de la séquence de codage de l'endo-

toxine), les deux sites Xba I (voir ci-dessous, toutefois, en ce qui concerne prAK-3), le site Sst I et le site Hind

III.

Comme on l'a indiqué ci-dessus, prAK-3 ne diffère de prAK que sous un seul aspect mineur. Cette différence est que le site Xpa I (TCT AGA) aux positions des nucléotides 292 à 297 du tableau A a été changé à l'aide de techniques standards en TCG CGA, définissant ainsi un site Nru I. Aucun changement de la séquence d'acides aminés codée n'a résulté de ce changement. La préparation de prAK-3 est décrite dans l'étape a) de l'exemple 1 ci-dessous. prAK-3 est également

le premier intermédiaire de la préparation des autres plas-

mides prAK-7 et prAK-9.

Des sections d'ADN, dérivées de différentes longueurs de sections d'ADN monocaténaires issues de prAK et de prAK-3 (à la fois les brins sens et anti-sens) mutées d'une manière

classique, comme décrite, par exemple, par Craick dans Bio-

techniques, janvier/février 1985, pages 12-19; "Use of Oli- gonucleotides for Site-Specific Mutagenesis" (Utilisation des oligonucléotides pour la mutagénèse spécifique aux sites), sont indiquées ici, pour des raisons de commodité, sous les noms de M-1 et M-2, M-1 définissant la section de 375 paires de bases entre les deux sites Xba I dans prAK et M-2 étant la section entre les sites Bam HI et Xba I dans

prAK-3 (comme l'indique la figure 1).

La mutation trouvée entre les deux sites Xba I selon

l'invention peut facilement être obtenue au moyen des plas-

mides prAK-7, prAK-8 ou prKA-9 décrits ici et des oligonu-

cléotides bicaténaires de synthèse construits et utilisés de façon analogue aux modes opératoires décrits dans l'exemple

2 ci-dessous.

Après la mutation, les parties monocaténaires mutées sont rendues bicaténaires par des moyens classiques. Dans le

cas des mutants M-1, utilisant prAK comme véhicule de la mu-

tation, les plasmides mutés bicaténaires résultants ont été transformés en JM103 de E. coli, déposés sur de la gélose YT contenant 50 gg/ml d'ampicilline et incubés pendant une nuit pour donner une pluralité de colonies avec une variété de mutations différentes dans les plasmides identiques à prKA,

à l'exception des mutations.

Dans le cas des mutants M-2, la région bicaténaire mu-

tée entre les sites Bam HI et Xba I dans les véhicules de la

mutation a été excisée respectivement à l'aide des endo-

nucléases de restriction Bam HI et Xba I et ligaturée dans des vecteurs prKA-3 digérés avec les deux mêmes enzymes. Les plasmides prAK-3 contenant la région mutante M-2 résultante ont été transformés dans JM103 de E. coli, placés sur de la gélose YT avec 50 gg/ml d'ampicilline et incubés pendant une

nuit pour donner une autre pluralité de colonies faisant in-

tervenir une variété de mutations différentes.

On a réalisé des essais pour démontrer l'activité des séquences d'endotoxine mutagènes, exprimées à partir d'un ADN contenu, par exemple, dans JM103 de E. coli ou dans

SG4044 de E. coli (disponible publiquement auprès de l'Agri-

cultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illi-

nois, sous le numéro de dépôt B-15969) ou bien dans l'étude de la noctuelle du tabac (-NT), ou bien dans l'étude de T.

ni, ou dans les deux, comme le décrit l'exemple A ci-des-

sous. L'ADN des mutants présentant une activité açcrue par rapport à l'endotoxine non mutante standard a été séquencé dans les zones de mutation applicables pour déterminer la mutation dans l'ADN et donc la séquence de la protéine. Plus de 6000 colonies différentes avec des plasmides contenant soit des sections mutagènes M-1 soit des sections mutagènes M-2 ont été ainsi évaluées et, d'une façon générale, on a constaté que de 1 à 3 changements-d'acides aminés avaient eu

lieu dans chaque expérience de mutation.

Le tableau B ci-dessous identifie les mutants ascen-

dants récupérés directement par suite des expériences de mru-

tation, la position de l'acide aminé par rapport aux numéros de position attribués dans le tableau A à laquelle a eu lieu chaque mutation, chaque codon muté dans chaque mutant et le changement d'acide aminé résultant à laposition indiquée

par suite du changement de codon.

Dans le tableau B, les numéros des positions des acides

aminés moins ou négatifs indiquent des changements entre le-

site Bam HI et la position Met numéro 1 au début de la sé-

quence d'endotoxine, ces changements n'affectant donc pas la

séquence de l'endotoxine pour laquelle code la séquence mu-

tante. Les mutants identifiés dans le tableau B ci-dessous ont été évalués dans les trois phases de l'étude de la NT en produisant les résultats indiqués ci-dessous dans le tableau B-1. Certains de ces mutants ont également été évalués dans

l'étude de T. ni, dont les résultats sont illustrés ci-des-

sous sur le tableau B-2.

TABLEAU B

SECTION POSITION CHANGEMENT DE LA ZONE

DE MUTA- DE L'ACIDE D'ENDOTOXINE

TION MUTANT AMINE ACIDE NUCLEIQUE ACIDE AMINE

M-1 p26-3 119 GCA à ACA Ala à Thr ATG à ATA Met à Ile 201 GGC à GAC Gly à Asp M-1 p48a14 101 GAA à AAA Glu à Lys 116 GAG à AAG Glu à,Lys 217 CGT à CAT Arg à gis M-1 p48c5 116 GAG à AAG Glu à Lys 187 GCG à ACG Ala à Thr M1 p36a65 122 ACT à ATT Thr à Ile GCA à GTA Ala à Val M-2 p95a76 123 AAT à, TAT Asn à Tyr M-2 p95a86 188 ACT à TCT Thr à Ser M-2 p98cl 188 ACT à TCT Thr à Ser M-2 p99c62 204 ACA à ACT Thr à Thr AAT à TAT Asn à Tyr 4 AAT à TAT Asn à Tyr M-2 p107c22 194 AAT à AAA Asn à Lys 94 AAC à AAA Asn à 'Lys M-2 plO7c25 184 TTT à ATT Phe à Ile

-11 TTG à TAG -------

M-2 pll4a30 95 CAA à AAA Gln à Lys

-15 TAT à TAA ----

Dans le tableau B-1 ci-dessous, le score le plus faible dans la colonne de toxicité indique le plus haut niveau d'activité (voir l'exemple A pour l'explication des scores

de toxicité) et les témoins ont impliqué une quantité équi-

valente de cellules JM103 de E. coli et de cellules SG4044 de E. coli n'ayant pas été transformées par un plasmide quelconque. On note que tous les mutants ont été indiqués comme étant substantiellement plus actifs que l'endotoxine native tronquée produite par une quantité équivalente de ces

cellules contenant le plasmide prAK.

TABLEAU B-1

MUTANT AVEC REFERENCE SCORE DE TOXICITE

AU TABLEAU B TOXICITE MOYENNE

p26-3 2t75 p48a14 2,25 p48c5 2,63 p36a65 1,50 p95a76 2150 p95a86 1,30 p98cl 1,33 - p99c62 1,83 plO7c22 1,42 pl1l4a30 - 2,00 témoin (cellules JM103) 4,68 prAK 3,35 témoin (cellules SG4044) 4,12

TABLEAU B-2

MUTANT AVEC REFERENCE PUISSANCE

AU TABLEAU B RELATIVE

p26-3 217 p36A65 887 p95a76 291 plO7c22 357 pl1l4a30 239 témoin (SAN415) 59 pBT301 100 Sur le tableau B-2 ci-dessus, on attribue à l'étalon pBT301 une puissance relative de 100, selon la DL50 (pour

une description plus détaillée, voir l'exemple A), et ainsi

toute valeur de puissance relative supérieure à celle-ci in-

dique un niveau accru de toxicité provoquée par la mutation.

Dans des travaux supplémentaires, destinés à étendre l'invention, on a analysé certains des ADN mutants indiqués sur le tableau B ci-dessus comme impliquant des mutations multiples pour déterminer l'effet de mutations individuelles et de paires de mutations dans ces sections mutées multiples. Ce sous-clonage de mutations individuelles ou de paires de mutation a été réalisé au moyen d'une stratégie mettant en jeu l'isolement d'un fragment muté multiple cible, puis sa coupure au site de restriction interne du

fragment et situé entre deux des codons mutés. Les deux moi-

tiés ou segments de fragment ont été ensuite isolés sur gel et chacun a été mélangé avec les moitiés ou segments de fragment complémentaires non mutants obtenus par coupure analogue des mêmes fragments à partir de prAK. Le vecteur prAK qui a été coupé pour isoler le fragment complémentaire

plus grand a été ensuite mélangé avec les deux moitiés com-

plémentaires mélangées et les trois segments d'ADN ligaturés ensemble pour former un plasmide prAK modifié contenant la ou les mutations ponctuelles existant dans la moitié de

fragment ayant son origine dans le clone mutant multiple.

Plus particulièrement, un site pour l'endonucléase de res-

triction Xho II a été situé de façon stratégique dans cer-

tains segments mutants multiples de manière à permettre

l'isolement de fragments comportant moins que le nombre to-

tal de mutations dans le segment mutant total. Comme il ap-

paraît à l'évidence, l'utilisation de l'endonucléase. Xho II a été applicable à un certain nombre des segments mutants

multiples du tableau B pour permettre d'obtenir des frag-

ments ayant une seule mutation ponctuelle et d'autres avec

deux mutations. Par conséquent, les plasmides mutants mul-

tiples ont été d'abord traités avec les endonucléases de restriction Nsi I et Sst I et les fragments de 1430 paires de bases résultants séparées par isolement sur gel. Chacun

de ces fragments de 1430 bp a ensuite été traité avec l'en-

donucléase de restriction Xho II et les fragments résultants de 330 bp (Nsi I/Xho II) et de 1100 bp (Xho II/Sst I) ont

été isolés sur gel pour chaque mutant multiple. Les frag-

ments non mutants de la contrepartie, de 330 et de 1100 bp,

et le fragment de prAK plus grand, Nsi I/Sst I de 4kb envi-

ron, ont été obtenus de manière analogue. Plus particu- lièrement, de petites quantités du segment plus grand ont été mélangées avec le fragment de 330 bp muté et le fragment de 1100 bp de prAK non muté et le mélange résultant a été ligaturé pour former une série de plasmides de prAK mutants

hybrides. D'une manière analogue, des quantités de ces seg-

ments de prAK plus grands ont été mélangées avec les frag-

ments de prAK de 300 bp non mutés et les fragments de 1100 bp mutants, et ces ADN ligaturés pour former une autre série

de plasmides mutants hybrides. Les plasmides mutants hy-

brides ou les clones résultant de la stratégie indiquée ci-

dessus sont résumés ci-dessous dans le tableau C qui donne

les trois segments combinés et les mutations dans le plas-

mide résultant comparé au plasmide prAK.

TABLEAU C

DESIGNATION SEGMENT SOURCE DU SOURCE DU POSITION

DU prAK NOU- DE SEGMENT SEGMENT DE L'ACIDE VELLEMENT VECTEUR NsiI/XhoII XhoII/SstI AMINE DE FORME ET SOURCE -DE 330 bp DE 1100 bp MUTATION A prAK NsiI/SstI p48a14 prAK Glu à Lys en 101o 4 Kb Glu à Lys enl16 B " p26-3 prAK Ala à Thr en ll9 C " p48c5 prAK Glu à Lys en 116 D " prAK p48a14 Arg à His en 217 E " prAK p26-3 Met à Ile en 130 Gly à Aspen201 F n prAK p48c5 Ala à Thr en187 Dans une seconde série de préparations du clone mutant hybride, utilisant le même mode opératoire analogue appliqué

à la préparation des clones du tableau C, une série de plas-

mides mutants de combinaison mélangées ont été préparés par la combinaison à trois segments du grand segment (environ 4 kb) issu de la digestion de prAK avec Nsi I et Sst I, d'un fragment Nsi I/Xho II de 330 bp issu de l'un des clones du tableau B et d'un fragment Xho II/Sst I de 100 bp issu d'un clone différent du tableau B. Les clones mutants hybrides résultants de cette seconde série sont indiqués ci-dessous au tableau D; on notera que deux plasmides produits par le

protocole de cette seconde série contenaient quatre change-

ments d'acides aminés en comparaison du plasmide parent prAK.

TABLEAU D

DESIGNATION SEGMENT SOURCE DU SOURCE DU POSITION

DU prAK NOU- DE SEGMENT SEGMENT DE L'ACIDE VELLEMENT VECTEUR NsiI/XhoII XhoII/SstI AMINE DE FORME ET SOURCE DE 330 bp DE 1100 bp MUTATION prAK-J prAK Nsi/Sst p48a14 p26-3 Glu à Lys en 101 4 Kb Glu à Lys en 116 Met à Ile en 130 Gly à Aspen201 prAK-K " p48al4 p48c5 Glu à Lys en 101 Glu à Lysenl6 Ala à Thren187 prAK-L " p48c5 p26-3 Glu à Lys en 116 Met à Ile en 130 Gly à Aspen201 prAK-M p26-3 p48a14 Ala à Thr en 119 Arg à Hisen217 prAK-N " p26-3 p48c5 Ala à Thr en 119 - Ala à Thren 187 prAK-0 p48c5 p48a14 Glu à Lys en 116 Arg à Hisen217 prAK-P " p26-3 p36a65 Ala à Thren 119 Thr à Ileen 122 Ala à Val en 125 prAK-Q. " p48c5 p36a65 Glu à Lys en 116 Thr à Ileen 122 Ala à Val en125 prAK-R. p48a14 p36a65 Glu à Lys en 101 Glu à Lys en 116 Thr à Ileen 122 Ala à Valen 125 prAK-S " p26-3 p95a86 Ala à Thr en 119 Thr à Seren188 prAK-T p48c5 p95a86 G1. à. Lys en 116 Thr à Seren 188

TABLEAU D (SUITE)

DESIGNATION SEGMENT SOURCE DU SOURCE DU POSITION

DU prAK NOU- DE SEGMENT SEGMENT DE L'ACIDE VELLEMENT VECTEUR NsiI/XhoII XhoII/SstI AMINE DE FORME ET SOURCE DE 330 bp DE 1100 bp MUTATION prAK-U " p48a14 p95a86 Glu a Lys en 101 Glu Lys en 116 Thr à Ser en 188 prAK-53 " p99c62 p107c25 Asn à Tyren 105 Phe à Ileen184 prAK-68 " p99c62 p26-3 Asn à Tyren 105 Met à Ile en 130 Gly à Asp en 201 prAK-70 " p26-3 p107c25 Ala à Thren 119 Phe à Ileen 184 prAK-39 " p99c62 p98cl Asn à Tyren 105 Thr à Seren 188 Les divers mutants hybrides indiqués sur les tableaux C et D ont été évalués en fonction de l'étude de la noctuelle du tabac de l'exemple A et l'évaluationa inclu les clones mutants du tableau B à titre de comparaison, entre autres,

de l'effet essentiellement d'une délétion ou d'une élimina-

tion d'une ou deux mutations des mutants d'origine du ta-

bleau B. Les résultats de ces évaluations de toxicité ou d'activité insecticide ont été regroupés ci-dessous dans le tableau E, dans lequel on note que: 1) le score le plus

faible dans la colonne de toxicité indique le niveau d'acti-

vité le plus élevé (voir l'exemple A pour l'explication des scores); et 2) les témoins font intervenir une quantité équivalente de cellules JM103 et de cellules SG4044 qui n'ont pas été transformées avec un plasmide quelconque, étant entendu que la plupart, voire la totalité, des mutants évalués dans ces deux types de cellules de E. coli et les résultats des mutants dans les tableaux de la présente

description qui se réfèrent aux deux témoins doivent être

pris comme étant une moyenne des résultats pour les mutants 2 7

exprimée à partir des deux types de cellules.

-

TABLEAU E

Mutant avec référence Score de toxicité aux tableaux B, C ou D Toxicité moyenne J Témoin 4,68 prAK 3,35

A 2, 05

B _____ 2,90

C _2,68

D 3 3,40

E 2,50

F 3,00

E. coli SG 4044 (témoin) 4,12

J 2,25

_K.2,06

L.2,08

M.3,10

N.2,73

_ D.-2,70

-p_. 1,00

Q 1,87

R.2t85

S _2-,16

T' 1,2.0

_ U 2,07

53 3,08

68 2,00

1,50

*39 2 50

_

L'invention inclut en outre une démonstration de la ca-

pacité de la substitution générale des acides aminés aux po-

sitions des acides aminés auxquelles les mutations d'ADN aléatoires initiales ont produit des changements d'acides aminés, ce qui fournit une grande variété de nouvelles pro-

téines endotoxines de B.t. à activité insecticide. Cette ca-

pacité a été démontrée avec une relative facilité par les expériences que l'on appelle "de rotation du codon" dans

lesquelles des codons sélectionnés mis en jeu dans les chan-

gements de la mutation initiale ont été changés en codons pour les autres acides aminés naturels. Ces nouveaux mutants

ont exprimé uné protéine endotoxine ayant une activité in-

secticide contre la noctuelle du tabac. Afin de conduire une telle étude plus efficacement, on a préparé une série de plasmides uniques du type prAK commençant essentiellement à prAK et culminant dans le plasmide prAK7, et les autres

plasmides intermédiaires étant séquentiellement, dans l'or-

dre de la préparation, prAK-3, prAK-4, prAK-5 et prAK-6, comme le décrit l'exemple 1. Le plasmide pB8rII représenté sur la figure 2 est identique, sous tous ses aspects, au plasmide prAK, sauf qu'il contient un ADN codant pour une

endotoxine tronquée plutôt plus longue que celle pour la-

quelle code le prAK et à l'exception de modifications sans conséquence dans le plasmide parent faites dans la zone de

sa ligature à l'extrémité aval du gène de structure d'endo-

toxine tronqué d'ADN, ce gène de structure, tel qu'il est représenté sur la figure 2, montrant le site Kpn I dans le

gène natif, tandis que, dans prAK, le site a subi une dé-

létion et le gène de structure prAK se termine environ à la position précédente dudit site. Le plasmide prAK-7 est conçu pour exprimer la même séquence d'acides aminés d'endotoxine que le plasmide prAK, mais sa séquence d'ADN a été modifiée pour inclure non seulement le site Nru I de prAK-3, mais également un site Hind III, Mst II et BssH II et, de plus, le site Hind III que l'on trouve à l'origine dans prAK est de préférence éliminé. Comme l'indique plus particulièrement l'exemple 1, l'ordre séquentiel de préparation de prAK-3 à partir de prAK et l'addition ou la délétion d'un site dans chaque étape peuvent être résumés de la manière suivante prAK -- prAK-3 (addition de Nru I) prAK-3 ------ prAK-4 (addition de Hind III) prAK-4 -..... prAK-5 (addi-tion de Mst II) prAK-5 - ----prAK-6 (addition de BssH II) prAK-6 -----4 prAK-7 (délétion de Hind III initiale) Les sites indiqués ci-dessus ont été introduits à une distance d'environ 40 paires de bases de sorte que l'on a pu utiliser efficacement un synthétiseur d'ADN automatisé pour

fabriquer de petits fragments d'ADN bicaténaires qui se ter-

minent à leurs deux extrémités par des nucléotides repré-

sentant le résidu complémentaire des résidus du site de res-

triction a créer dans prAK-7 lorsqu'il est coupé avec les deux endonucléases de restriction appropriées. Ces fragments ont donc pu être facilement substitués dans prAK-7 par des procédures standard de coupure et de ligature (voir exemple P, ci-dessous) pour fournir un plasmide capable d'exprimer

une protéine endotoxine identique à celle de prAK, à l'ex-

ception des changements d'acides aminés pour lesquels code le fragment synthétisé substitué dans prAK-7 au fragment

correspondant dans prAK-7, comme l'indique l'exemple 2 ci-

dessous.

Les figures 3A et 3B représentent deux petits fragments d'ADN bicaténaires préparés selon la stratégie de rotation du codon ci-dessus à substituer dans la section Hind III/Mst II dans prAK-7. Le fragment bicaténaire représenté sur la figure 3A a été conçu pour produire n'importe quel acide aminé à la position d'acide aminé 116 dans les endotoxines

de B.t. tronquées exprimées par les plasmides prAK, par sé-

lection appropriée du codon XXX en accord avec le code géné-

tique. De même, le fragment bicaténaire représenté sur la

figure 3B a été conçu pour produire un acide aminé à la po-

sition d'acide aminé 119 dans les endotoxines de B.t. tron-

quées produites par les plasmides prAK par sélection appro-

priée du codon XXX dans ce fragment. Comme on le voit, les

autres fragments bicaténaires nécessaires pour la substitu-

tion dans le lieu Spe I/Nru I (une tranche de fragment d'environ 115 paires de bases que l'on peut aussi préparer par des synthétiseurs d'ADN automatisés), le lieu Nru I/Hind

III et le lieu Mst II/BssH II dans prAK-7 et conçus pour co-

der pour tous les acides aminés en tous points de mutation trouvés dansces sections peuvent être préparés par des

modes opératoires standards analogues. Ainsi, les 18 change-

ments ou mutations d'acides aminés naturels sur les 19 à faire en chaque point de mutation entre les sites Nru I et BssH II dans prAK-7 peuvent être faits facilement au moyen

du plasmide prAK-7.

Pour couvrir tous les points de mutation de la séquence concernée des 116 acides aminés pour faire tourner de façon adéquate les codons adéquats, on peut utiliser le plasmide

prAK-7 pour préparer le plasmide prAK-8 que l'on utilise en-

fin à son tour pour préparer prAK-9, comme le décrit l'exem-

ple 1. Sur la figure 5, tous les sites de restriction appro-

priés tels qu'ils sont finalement accumulés dans prAK-9 sont indiqués dans une section éclatée agrandie de prKA-9. Le site Spe I représenté sur la figure 5 est également un site unique qui était déjà présent dans prAK, prAK-3, etc. Comme on l'appréciera également, les plasmides prAK-7, prAK8 et prAK-9 peuvent être utilisés pour introduire de multiples changements mutationnels entre n'importe quelle paire de sites de restriction et/ou pour produire un ADN codant pour au moins un changement dans deux ou plus de deux de ces

lieux, de telle manière qu'une grande variété de combinai-

sons de mutants multiples faisant intervenir des points de

mutation initiaux trouvés en accord avec l'invention puis-

sent être construites pour produire une grande variété de

nouvelles protéines endotoxines de B.t. à activité insecti-

cide. On appréciera également que les plasmides comme prAK-7, prAK-8 et prAK-9 sont des plasmides totalement capables de changer un ou plusieurs codons quelconques dans tout lieu de paires de sites de restriction fourni dans ces plasmides. Lorsque l'on souhaite des changements en un ou deux, mais moins de trois, de ces lieux, on peut utiliser des plasmides comme prAK-4 ou prAK-5 s'ils couvrent le lieu souhaité des changements, de préférence après élimination du site Hind III d'origine dans prAK, et, si ces plasmides ne conviennent pas, on appréciera que l'onr peut préparer un plasmide de type prAK contenant un ou plusieurs quelconques de ces lieux

de façon classique en faisant varier ou en limitant la sé-

lection pour l'introduction des paires de sites de restric-

tion utilisées pour modifier prAK lors de la production de prAK-9. Par conséquent, l'invention fournit également une variété de nouveaux plasmides utiles pour la production de

mutants et de combinaisons de mutants en accord avec l'in-

vention et contenant un ou plusieurs quelconques des paires

de sites de restriction finalement produits dans prAK-9.

Comme on l'appréciera également, un ADN comprenant une

ou plusieurs quelconques de ces paires de sites de restric-

tion peut être excisé, avant ou après la modification, pour

contenir une ou plusieurs mutations en accord avec l'inven-

tion, à partir des plasmides de type prAK, par coupure aux sites de restriction qui se trouvent en dehors de la ou des régions de mutation souhaitées et que l'on trouve de façon correspondante dans un autre plasmide pour une endotoxine de B.t., puis par insertion (ligature par des moyens standards) du segment d'ADN excisé dans cet autre plasmide d'endotoxine de B.t. qui a été coupé de façon analogue, ce qui permet ainsi à ces autres plasmides d'être modifiés commodément ou d'insérer directement les mutations de l'invention dans ceux-ci. Dans le but d'incorporer des mutations fournies par

l'invention dans une séquence de codage d'endotoxine com-

plète, on a utilisé un plasmide incorporant le gène de structure d'ADN pour la 8-endotoxine de B.t. wuhanensis pour des raisons de commodité et de disponibilité immédiate à l'époque. Ce plasmide, pBT210, est représenté sur la figure

4. Le plasmide pBT210 incorpore le gène de structure d'endo-

toxine complet de B.t. wuhanensis comme l'indique le trait noir épais de la figure 4 et, par analogie avec la figure 1,

incorpore également une séquence contenant un site de liai-

son ribosomique de B.t. qui a été obtenu à partir de B.t.

wuhanensis avec le gène de structure et qui est représenté sur la figure 4 par la case noire. Le plasmide pBT210 est un

vecteur d'expression de E. coli totalement compétent in-

cluant le -même système promoteur de E. coli que les plas-

mides prAK, une origine de réplication de E. coli (non re-

présentée) et un gène pour la résistance au chloramphénicol

comme l'indique la figure 4. Les flèches de la figure 4 re-

présentent le sens de lecture du gène de B.t. wuhanênsis

sous le contrôle du promoteur de E. coli et du gène de ré-

sistance au chloramphénicol. En se basant sur l'information sur les séquences en notre possession, on constate que la totalité de l'opéron (gène de structure, section de séquence

de liaison ribosomique dérivée de B.t. et séquence promo-

teur/opérateur de E. coli) est très analogue et ne diffère que de façon insignifiante de l'opéron dans le plasmide

prAK. En particulier, l'ADN codant pour les 610 acides ami-

nés de la partie active de l'endotoxine de B.t. (tableau A) et s'étendant dans la région de protoxine au moins jusqu'à environ le site Kpn I représenté sur la figure 4 pour pBT210, est identique à la séquence d'ADN correspondante dans le plasmide prAK. Dans la région d'ADN en aval du site Kpn I dans le gène de structure de B.t. dans pBT210 et

jusqu'à la fin de ce gène de structure, il existe des diffé-

rences inconnues mais mineures en comparaison de la section correspondante du gène HD-1 de B.t. kurstaki tronqué lors de la production de prAK. Ces différences ont été indiquées par

une cartographie de restriction à l'endonucléase. Le plas-

mide pBT210 code pour une endotoxine complète comme l'indi-

que le tableau A et est entièrement homologue dans la por-

tion active (et au moins sur les acides aminés produits jusqu'à son site Kpn I, jusqu'à la 6-endotoxine de HD-1 de B.t. kurstaki dans les clones prAK et pB8rII) et possède une

homologie importante dans le reste de la section de pro-

toxine. Finalement, le site de liaison ribosomique dans pBT210 est identique à ce site dans prAK et l'ADN dans son ensemble incluant le site de liaison ribosomique (RBS) et

s'étendant en amont depuis la position précédant immédiate-

ment le Met d'initiation en remontant par le site Bam HI re-

liant la section promoteur est le même dans pBT210 et dans

prAK, sauf que dans pBT210 il y a deux changements de nu-

cléotides suivant immédiatement Bam HI (CC au lieu deGT comme dans prAK) et que trois nucléotides (TTT), tels que ceux que l'on trouve dans prAK immédiatement après ces deux

nucléotides, on subit une délétion dans pBT210, ces diffé-

rences ne provenant que d'une différence de stratégies de ligature lors de la liaison des sections RBS de B.t. à la section promoteur de E. coli par l'intermédiaire d'un site Bam HI. Le plasmide pBT210 peut être utilisé pour produire

une protéine 6-endotoxine de B.t. mutante complète compor-

tant un ou plusieurs quelconques des changements d'acides aminés fournis par la présente invention. Le site Nsi I, et deux sites Xba I, le site Sst I et le premier site Hind III apparaissant en aval représenté sur la figure 4 pour pBT210 correspondent aux mêmes sites représentés sur la figure 1 pour prAK (les ADN pour les deux plasmides dans cette région

étant identiques comme on l'a indiqué ci-dessus).

EXEMPLE A

1. Etude de Trichoplusia ni (T. ni) On a réalisé des essais sur des larves au second stade

larvaire. Tous les insectes ont été maintenus dans des en-

ceintes climatisées dans des conditions standards de tempé-

rature, d'humidité, etc, au cours de la période d'essai et

ont été alimentés par un régime alimentaire artificiel stan-

dard. Les substances étudiées ont été données aux insectes dans l'alimentation, chaque concentration de substance étu- diée étant administrée à un lot de 20 insectes. Les insectes ont été surveillés pendant une période de 7 jours après le

traitement, après quoi on a enregistré la DL50 des insectes.

La DL50 peut être définie comme étant une estimation de la dose de substance nécessaire pour induire la mortalité chez

% des sujets. Les résultats finals sont indiqués en puis-

sance relative, o puissance relative = DL50 de l'étalon x 100 DL50 de l'expérience En utilisant la technique ci-dessus, on peut obtenir

les valeurs absolues des DL50, ce qui permet une interpréta-

tion simple des résultats, de sorte que toutes les valeurs

de puissance relative supérieures à celle de l'étalon indi-

quent une activité supérieure à celle de l'étalon. En outre, une substance ayant une puissance relative de, par exemple 400, en comparaison d'un étalon de 100, est quatre fois plus

active que l'étalon.

L'étalon, ayant une puissance relative de 100 dans l'essai ci-dessus, était le plasmide pBT301, ce plasmide

contenant une séquence de 8-endotoxine de type sauvage com-

plète et étant identique à pBT210, à l'exception du fait qu'il contient deux promoteurs de E. coli, chacun d'eux étant individuellement le même que celui contenu dans pBT210. Les témoins utilisés dans l'essai cidessus étaient:

a) CAG 629 - une souche de E. coli ne contenant pas de plas-

mides produisant de la 8-endotoxine et n'ayant pas d'activi-

té insecticide en soi (don de C A Gross, Department of Bacteriology, University of-Wisconsin); b) SAN 415 - insecticide de B.t. du commerce, disponible

sous la marque déposée JAVELIN.

2. Etude de la noctuelle du tabac (étude NT) L'étude NT employée était pratiquement celle décrite par Dulmage et coll., (1971) J. Invertebr. Path. 18 240-245, et a été réalisée avec des échantillons préparés en trois exemplaires dans des capsules soufflées en matière plastique transparente de 29,6 cm3, avec une larve de NT au second stade larvaire (âgée de 4 à 5 jours, poids moyen 1,6 g) dans chaque capsule. Les échantillons ont été combinés avec 15 ml

d'aliment (comprenant la poudre nutritive, la poudre de vi-

tamine, de la gélose et d'autres ingrédients), tel que dé-

crit par Dulmage et coll., USDA Technical Bulletin n 1528:1-5 (1976). L'alimentation a été divisée de façon égale entre les trois capsules qui ont été refroidies pendant 1/2 heure. On a ajouté une NT (en utilisant une brosse en poil de chameau de taille 00) à chaque capsule et on a fermé

fixement les couvercles. Ces échantillons ont alors été pla-

cés dans un incubateur à 27 C, de 50% d'humidité relative,

pendant 4 à 5 jours. Les numéros de dimension de groupe uti-.

lisés dans le score de l'essai de toxicité de NT correspon-

dent aux domaines de poids indiqués sur le tableau suivant.

TAILLE DU GROUPE DOMAINE DE POIDS POIDS MOYEN

(mg) (mg) 1 0 1y3- 1,y9 1,6 1t5 2,7- 3t1 218

2,0 5,5- 6,3 5,8

2,5 11,7- 12,3 12,0

3,0 17,3- 22,2 19,6

3,5 3018- 34,2 32,8

4,0 50,1- 52,4 51,1

4,5 76,6- 94,3 84,8

,0 119,9-114,7. 113,5

6,0 119,8-134,3 >140,0

La "taille du groupe" indiquée ci-dessus correspond di-

rectement aux scores de toxicité rapportés ici. Par consé-

quent, le poids de la larve après chaque essai a été déter-

miné et il lui a été attribué le score de toxicité égal au groupe correspondant au domaine de poids dans lequel se trouve son poids. Sauf indication contraire, ci-dessous, on a attribué à toutes les larves mortes une taille de groupe et un score de toxicité de 0. On a pris la moyenne des scores de toxicité de toutes les répétions pour obtenir les résultats rapportés ici et, typiquement, tous les résultats

sont basés au moins sur 30 répétitions.

Les capsules ont été ouvertes jusqu'à ce que l'on loca-

lise des domaines de NT de différentes-tailles. Ces NT ont été pesées jusqu'à ce que l'on localise une NT tombant dans

chaque domaine de poids. Les capsules d'échantillon conte-

nant la NT d'un domaine de poids donné ont été marqués par le numéro de taille de groupe correspondant. Ces capsules ont été disposées en ordre croissant sur la paillasse du laboratoire. Les échantillons restants ont ensuite été notés par comparaison visuelle de leur taille avec les NT de l'échantillon pesé et se sont vu attribuer ce numéro de groupe sur une feuille de score. On a enregistré les larves

mortes avec un "+" et on leur a attribué un score de zéro.

On a suspecté-que les larves mortes qui étaient rose vif ou qui semblaient s'être liquéfiées d'être mortes de causes non liées à la 8- endotoxine. On a noté ces larves avec un "*" et

on ne les a pas comptées dans les résultats.

La taille d'échantillon étalon de 1 ml d'une culture de prAK répartie sur trois capsules a conduit à un retard de croissance dans le milieu du domaine des scores de toxicité; Par conséquent, l'étude a été utile pour distinguer les clones qui ont accru la toxicité de ceux ayant une toxicité réduite ou égale au parent non mutant. L'étude a produit un effet à la dose dépendant de la quantité de culture de prAK introduite dans l'étude. Par conséquent, plus la quantité des bactéries contenant prAK ajoutées aux échantillons était

grande, plus on a observé un degré de toxicité élevé vis-à-

vis de la NT. La courbe dose-effet de prAK a été utile pour évaluer le degré auquel les clones étaient plus toxiques que le parent non mutant. Le tableau suivant illustre l'effet à la dose des bactéries contenant prAK: Quantité de culture stationnaire de prAK ajoutée Scores de toxicité ml 1I5 1t5 2;0

2 2 2 5 2 5

1 3 3 3,5

015 3 3j5 4

0,25 3,5 4 4

En se basant sur l'évaluation ci-dessus, on a étudié toutes les cultures en utilisant 1 ml de culture afin, en rapport avec les tailles des groupes obtenues, d'avoir une large gamme pour déterminer quelles étaient celles ayant une

activité plus ou moins grande par rapport à prAK (et à d'au-

tres plasmides non mutants) comme étalon.

La poudre nutritive utilisée dans l'étude NT a été mé-

langée dans les proportions pondérales suivantes en gram-

mes: farine de soja, 1103,4 g; germe de blé, 429,4 g;

mélange de sel Wesson, 292,4 g; saccharose, 164.,2 g; para-

benzoate de méthyle, 24,6 g; et acide sorbique, 14,8 g.

La poudre de vitamine utilisée dans l'étude NT a été mélangée dans les proportions pondérales suivantes en grammes: peutothénate de calcium, 12, 0 g; nicotinamide, 6,0

g; riboflavine, 3,0 g; acide folique, 3,0 g; thiacine chlor-

hydrate, 1,5 g; pyridoxine chlorhydrate, 1,5 g; biotine,

0,12 g; et vitamine B12, 6,0 g.

On a employé les trois applications de criblage sui-

vantes de l'étude (primaire, secondaire et dilutions en sé-

rie) à divers stades de l'évaluation et on s'y réfère dans

cette description.

Etude primaire: on a combiné avec l'aliment des NT des parties aliquotes de 1 ml issues de cultures de 18 heures de 2 clones séparés, dans un tube de centrifugation conique de ml et on les a réparties uniformément dans trois capsules (avec 1 NT par capsule). Ces échantillons ont été évalués en même temps que des témoins de cellules transformées prAK ou

pBT210 de type sauvage et de cellules non transformées pré-

parées de la même manière. Etude secondaire: dans une seconde étude, on a criblé

les échantillons qui présentaient une toxicité accrue vis-à-

vis des NT dans l'étude primaire. Les colonies mutantes sé-

lectionnées ont été inoculées à partir des boîtes de biblio-

thèque dans un bouillon YT/Amp (une colonie par culture).

Dix échantillons de 1 ml ont été évalués en même temps que les témoins appropriés. Les clones présentant une toxicité accrue pour les NT ont été qualifiés de "mutants ascendants probables" et ont été évalués une troisième fois. Ceux qui ont répété une troisième fois leur phénotype "ascendant" ont été identifiés comme "mutants ascendants" et évalués dans un

dosage par dilutions en série pour déterminer plus précisé-

ment le niveau d'activité-améliorée en fonction du type sau-

vage parent.

Etude par dilutions en série les mutants qui ont

confirmé présenter un phénotype "ascendant" sur la construc-

tion non mutante ont été criblés dans l'étude NT dans une

série de dilutions basée sur le poids sec des cellules bac-

tériennes lyophilisées qui contenaient ou bien la toxine mu-

tante ou bien la toxine de type sauvage des clones prAK ou pBT210 ayant été cultivés pendant 18 heures (et les cellules en culot avant la lyophilisation). Les échantillons ont été

préparés en trois exemplaires à chacune des dilutions sui-

vantes dans un volume final de 15 ml: 167 lg/ml, 67 Lg/ml et 33 gg/ml. On a réalisé sur.la protéine de ces mutants une analyse SDS-PAGE et Western (immunoblot), typiquement à 75 pg de cellules en poids sec par ligne. Les résultats de l'étude par dilutions en série ont essentiellement confirmé

les résultats des études précédentes et ne sont pas présen-

tés autrement ici, ni ne figurent dans les présents tableaux qui consignent les résultats biologiques sous forme de moyennes.

EXEMPLE P - PROCEDURES REGULIERES

Dans les exemples numérotés suivants ou ailleurs dans

cette description, on a utilisé les procédures de labora-

toire régulières et standards suivantes, là o elles sont citées dans la suite ou là o elles sont requises, à moins

que le texte n'indique le contraire.

Exemple P-1:

Entretien et croissance de souches bactériennes et de phages Les souches SG4044 et JM103 de E. coli ont été les hôtes de toutes les constructions de plasmides. On a obtenu la souche JP103 de E. coli et le phage M18 et MP19 auprès des New England Biolabs. Ces souches bactériennes ont été cultivées dans un milieu YT (5 g/1 d'extrait de levure, 10

g/l de bactotryptone, 5 g/l de NaCl). Le milieu a été.com-

plémenté avec 50 mg/1 d'ampicilline pour la croissance des cellules contenant prAK ou des dérivés de ce plasmide et avec 20 mg/ml de chloramphénicol pour les cellules contenant

pBT210 ou des dérivés de ce plasmide.

Exemple P-2

Propagation et isolement de l'ADN du phage

On a effectué la préparation de stocks de phages recom-

binant dérivés de M13 et l'isolement de l'ADN du phage en employant les procédures décrites antérieurement (Messing,

J. (1983) Methods Enzymol. 101:20-78).

Exemple P-3

Préparation d'oligonucléotides synthétiques

On préparé les oligonucléotides synthétiques en utili-

sant une synthèse automatisée avec une machine de synthèse

d'ADN 380A de Applied Biosystems (Foster City, CA).

Les étapes de purification, une fois le cycle terminé, ont été les suivantes. L'oligonucléotide synthétique a été

débloqué par addition d'un volume égal d'hydroxyde d'ammo-

nium et incubation à 55 C pendant une nuit. Après élimina-

tion de l'hydroxyde d'ammonium par cycles successifs de cen-

trifugation sous vide à grande vitesse et remises en sus-

pension dans de l'eau distillée, on a encore purifié l'oli-

gonucléotide par électrophorèse sur gel d'urée-polyacryl-

amide (urée-PAGE). Pour visualiser la bande, on a placé le

gel sur une plaque de chromatographie à deux couches re-

couverte d'un emballage de SaranO et on a illuminé l'oli-

gonucléotide-avec une lumière ultraviolette à ondes courtes.

Après avoir découpé la portion du gel contenant l'oligonu-

cléotide avec une lame de rasoir, on a élué l'oligonucléoti-

de sur le gel dans de l'acétate d'ammonium 0,5M, de i'EDTA 1 mM, à pH 8,0, à 37 C, pendant une nuit sous agitation. Après une nuit d'élution, on a rassemblé les fragments de gel en un culot à 6000 t/min dans un rotor JA20 et on a transféré le surnageant combinant l'oligonucléotide élué dans un tube propre. On a utilisé une précipitation dans EtOH pour

concentrer l'oligonucléotide et on l'a quantifié par absor-

bance à une densité optique de 260. On a soumis 200 pmoles de l'oligonucléotide à de la kinase dans une réaction de 40 il avec 2 unités de polynucléotide-kinase T4 et 0,05 mM d'ATP.

Exemple P-4:

Transformation par l'ADN de cellules de E. coli A) On a préparé des cellules JP103 ou SG4044 de E. coli compétentes pour une transformation d'ADN par une procédure couramment utilisée (Cohen, S.N., Chang, A.C.P. et Hsu, L. [1972], Proc. Natl. Acad. Sci. USSA 69:2110-2114). Pour les expériences de mutagénèse des oligonucléotides dirigée vers

un site on a ajouté 60 ng d'ADN de phage recombinant hétéro-

duplex (M13) à 0,2 ml de cellules compétentes et on a main-

tenu la température à 0 C pendant 15 minutes. On a ensuite maintenu les cellules à 42 C pendant 2 minutes et on a ajouté 30 l de ce mélange à 3 ml de bouillon YT contenant

0,7% de bactogélose maintenue à 42 C pour empêcher la soli-

dification et 0,2 ml d'une culture fraîche préparée pendant

la nuit de JM 103 ou de SG4044. Le mélange a été immédia-

tement étalé sur une boîte de gélose YT (bouillon YT plus

1,5% de bactogélose) et les plaques (retournées) ont été in-

*cubées pendant une nuit à 37 C.

B) On ajouté 100 ng d'ADN plasmide issu des expériences de mutagénèse ou de tout autre ligature faisant intervenir des vecteurs prAK ou pBT210 tels que décrit ici à 0,2 ml de cellules compétentes (JP103 ou SG4044) et on a maintenu la température à 0 C pendant 30 minutes. On a ensuite maintenu les cellules à 42 C pendant 2 minutes et on les a retournées sur un bain de glace. On a étalé des quantités de 2 il à 200 l sur de la gélose YT contenant 50 ig/ml d'ampicilline pour les clones à base de prAK et 20 lg/ml de chloramphénicol pour les clones à base de pBT210 et on a incubé pendant une

nuit à 37"C.

Exemple P-5:

Digestion par les enzymes de restriction on a acheté toutes les enzymes de restriction ou bien

auprès de Bethesda Research Labs (Gaithersburg, MD) ou au-

près de New England Biolabs. Les conditions d'incubation ont

été celles recommandées par le fabricant.

Exemple P-6:

Ligature des fragments d'ADN A) Les réactions de ligature d'ADN (20 1l) contenaient

60 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de MgCl2, 1 mM de dithio-

thréitol, 50 gM d'ATP, 20 nM d'extrémités d'ADN et 20 unités d'ADN-ligase T4 (New England Biolabs). L'incubation s'est

faite à 14 C pendant 4 heures.

B) On a mis en place trois ligatures de fragments avec

des fragments en un rapport molaire de 1:1:1 en une concen-

tration de 0,04 pmole chacun dans un volume réactionnel de 1l. L'incubation s'est faite à 160C pendant 4 heures pour ne ligaturer qu'une extrémité cohésive (par exemple le site interne Xho II) ou pendant une nuit pour la ligature de n'importe quelle extrémité inactive (par exemple un site FnuD2). On a utilisé de la ligase T4 de New England Biolabs (NEB) à une concentration de 10 unités (définition de NEB}

par il de volume réactionnel.

Exemple P-7:

Séquençage d'ADN

On a effectué le séquençage d'ADN des gènes de 6-endo-

toxine et de leurs dérivés par la méthode de terminaison des chaînes de Heidecker et coll. (Heidecker, G., Messing, J.,

et Gronenborn, B. [1980], Gene (10:68-73).

EXEMPLE 1

Préparation des vecteurs prAK-3, prAK-4, prAK-5, prAK-6 et prAK-7 Etape a) Préparation de prAK-3 1 gg du plasmide pB8rII (représenté sur la figure 2 et décrit ci-dessus) et la forme réplicative d'ADN issue des vecteurs MP18 et MP19 de clonage du phage M13 bien connus

ont été digérés simultanément avec les endonucléases de res-

triction Bam HI (8 unités) et Kpn I (10 unités) pendant 60

minutes à 37 C dans une solution tampon de chlorure de so-

dium 100 mM contenant également 6 mM de Tris-HCl (pH 7,9), 6

mM de MgC12, 100 lg/ml de sérumalbumine de boeuf. Les frag-

ments souhaités de ces mélanges d'ADN résultants ont été pu-

rifiés par séparation du mélange entier selon les tailles

sur gel d'agarose préparatif à 1%. Les bandes ont été visua-

lisées par coloration avec du bromure d'éthidium et illumi-

nation avec de la lumière ultraviolette à ondes longues. Le fragment de gel contenant l'ADN recherché a été découpé et l'ADN élué par électrophorèse dans un tube de dialyse. Le

fragment Bam HI/Kpn I de pBSrII a été ligaturé dans les vec-

teurs coupés et purifiés par gel Bam HI/Kpn I de mpl8 et mpl9 par incubation pendant 4 heures à 14 C dans un volume total de 20 litres contenant 60 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de MgC12, 1 mM de dithiothréitol, 50 mM d'ATP, 20 nM

d'extrémités d'ADN. L'ADN résultant a été transformé en cel-

lules JM103 de E. coli compétentes comme dans l'exemple P-4,

sauf que les plaques de YT contenaient de l'isopropylthioga-

lactoside (IPTG) et du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galacto-

side (X gal), toutes deux obtenues auprès de Sigma Chemical Company. Comme le phage recombinant (contenant l'insertion d'ADN découpée de pB8rII) rendra les plaques incolores dans ces conditions, tandis que M18 et M19 rendent les plaques bleues, les plaques incolores ont été ajoutées à 2 ml de cellules JM 103 de E. coli dans du bouillon YT, incubées pendant une nuit à 37 C et un ADN monocaténaire a été préparé à partir du phage selon la procédure décrite par J. Messing, J. Methods Enzymol. (1983), 101:20-78. Ces clones recherchés contenant les séquences d'insertion d'ADN grandes mais monocaténaires issues de pB8rII ont été identifiés par électrophorèse sur gel d'agarose en vertu de leur mobilité plus lente en comparaison de mpl8 ou de mpl9. Le séquençage d'une portion de ces clones qui incluait l'ADN d'endotoxine, par la méthode de terminaison des chaînes didésoxy, a confirmé la présence de i'ADN d'endotoxine et indiqué que mpl8 avait acquis son brin anti-sens et que mp19 avait acquis son brin sens, tous deux ayant été récupérés. Un oligonucléotide anti-sens à 26 bases ayant la séquence

, GTC CTT CTA ATC GCG AAA TGG CTT GG3'

a été préparé par synthèse en phase solide dans le synthéti-

seur d'ADN automatisé et soumis à une kinase avec de la po-

lynucléotide-kinase T4 et de l'ATP comme le décrivent Ma-

niatis et coll., Molecular Cloning (1982): A Laboratory Ma-

nual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Un mélange, de volume total 60 41, contenant 0,4 gg du phage recombinant mpl9 contenant le brin sens d'endotoxine,

20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM de MgCl2, 1 mM de dithio-

thréitol,.50 mM de chlorure de sodium et 10 ng de l'oligonu-

cléotide anti-sens à 2, bases a été chauffé à 68 C pendant

minutes, puis à 37 C pendant 10 minutes, et placé à 0 C.

Le mélange résultant, contenant l'ADN recombinant mp19 avec l'oligo mutagène traité a été ensuite additionné de 0,2 mM chacun de dATP, de dCTP, de dTTP et de dGTP, 1 mM d'ATP, 4 unités de fragment Klenow d'ADNpolymérase I (de

New England Biolabs), 0,5 gg de protéine de fixation monoca- ténaire de E. coli (de Pharmacia, Piscataway, N.J.) et 20 unités d'ADN-

ligase T4 (New England Biolabs). Le mélange ré- sultant a été incubé à 14 C pendant 4 heures pour permettre

la polymérisation et la ligature et l'ADN hêtéroduplex bica-

ténaire circulaire résultant a été transformé en JM103 de E. coli et cultivé comme le décrit l'exemple P-4. Vingt (20) plaques individuelles ont ensuite été sélectionnées et l'ADN

monocaténaire a été isolé du phage comme le décrivent Mania-

tis et coll., cités ci-dessus. L'ADN du phage des 20 pla-

ques, chacun en un volume total de 20 1 et contenant 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de KCl, 10 mM de MgC12, 10 ng de l'oligonucléotide anti- sens à 26 bases indiqué ci-dessus et 0,2 ig de molécules d'ADN de phage monocaténaire circulaire

différentes ont chacun été chauffés à 68 C pendant 15 mi-

nutes et placés à 37 C pendant 10 minutes. L'endonucléase de restriction Nru I (8 unités) a été ajoutée à chaque mélange résultant et on a poursuivi l'incubation à 371C pendant une heure. Le mélange a été soumis à une électrophorèse dans un gel d'agarose à 0,8%. Environ 10% des échantillons contenait de l'ADN migrant sous forme d'ADN linéaire pour permettre l'identification des clones positifs contenant le site Nru I recherché, et les clones positifs ont été transformés en JMI03 de E. coli pour assurer la purification. On a excisé

l'ADN entre le site Bam HI et le site Xba I dans les clones pEi-

tifs (après traitement avec l'oligo de séquençage m13 et 'po-

lymérisation pour le rendre bicaténaire, comme on l'a décrit ci-dessus pour l'oligo Nru I)'par coupure simultanée avec les endonucléases de ces sites et on l'a ligaturé (exemple P-6A) avec le grand fragment (environ 5004 paires de bases et ne comportant pas le fragment d'environ 749 bp entre le

site Bam HI et le second site Xba I dans prAK) ayant -été ob-

tenu et purifié sur gel après digestion complète de prAR si-

multanément avec les deux mêmes enzymes de restriction, le

tout d'une manière classique, pour former le plasmide prAK-

3. Etape b) Préparation de prAK-4 En suivant essentiellement l'ensemble de la procédure

qui est analogue à l'étape a) ci-dessus, l'ADN de phage mo-

nocaténaire obtenu dans l'étape a) a été traité en un oligo-

nucléotide anti-sens synthétisé de 25 bases ayant la sé-

quence

5, CCACTCTCTAAAGCTTTCTGCGTAA3,

conçue pour introduirele site Hind III entre les nucléo-

tides en positions n 327 et 351 dans la séquence de nucléo-

tides du tableau A. Des clones positifs ayant maintenant les deux sites recherchés Nru I et. Hind III ont été identifiés avec une fréquence d'environ 6,6% par évaluation par clivage avec la nucléase Hind III et ont été utilisés pour préparer

prAK-4 par ligature du fragment Bam HI/Xba I avec les nou-

veaux sites au grand fragment de 5004 bp issu de prAK, de la

même manière que dans l'étape a).

Etape c) Préparation de prAK-5 En suivant essentiellement l'ensemble de la procédure qui est analogue à l'étape a), l'ADN de phage monocaténaire

obtenu dans l'étape b) ci-dessus a été traité en un oligo-

nucléotide anti-sens synthétisé de 26 bases ayant la sé-

quence

' GCATCTCTTCCCTTAGGCTGGATTA3,

conçue pour introduire le site Mst II entre les nucléotides en positions n 366 et 391 dans la séquence de nucléotides du tableau A. Des clones positifs ayant maintenant les trois

sites recherchés Nru I, Hind III et Mst II ont été identi-

fiés à une fréquence d'environ 9,1% par évaluation par cli-

vage avec l'enzyme de restriction Mst II et ont été utilisés

pour préparer prAK-5.

Etape d) Préparation de prAK-6 En suivant essentiellement l'ensemble de la procédure qui est analogue à l'étape a) ci-dessus, les clones de phages bicaténaires positifs de l'étape c) ci-dessus ont été transformés en ADN de phage monocaténaires et traités en un oligonucléotide anti-sens synthétisé de 26 bases ayant la séquence

, GCGGTTGTAAGCGCGCTGTTCATGTC3,

conçue pour introduire le site Bss HII entre les nucléotides en positions n 406 et 431 dans la séquence des nucléotides du tableau A. Des clones positifs ayant maintenant les

quatre sites finalement recherchés dans prAK-7 ont été iden-

tifiés à une fréquence d'environ 12,5% par évaluation par

clivage avec l'enzyme Bss HII et ont été utilisés pour pré-

parer prAK-6.

Etape e) Préparation de prAK-7 En suivant essentiellement l'ensemble de la procédure

qui est analogue à l'étape a) ci-dessus, 1'ADN de phage mo-

nocaténaire obtenu dans l'étape d) ci-dessus a été traité en un oligonucléotide anti-sens synthétisé de 26 bases ayant la séquence

5' TACAGTCCTAAATCTTCCGGACTGTA3,

conçue pour éliminer le site Hind III entre les nucléotides

en positions n 1682 et 1707 dans la séquence des nucléo-

tides du tableau A. Des clones positifs représentant la sé-

quence totale recherchée pour prAK-7 ont été identifiés à une fréquence d'environ 2,8% par criblage par l'endonucléase de restriction de la forme réplicative (bicaténaire) de l'ADN de phage recombinant pour la perte du site Hind III entre les nucléotides 1682 et 1707. L'ADN bicaténaire isolé

du mutant a été utilisé pour préparer prAK-7.

Pour terminer la préparation d'un plasmide (prAK-9)

comportant des sites de restriction adéquats uniques et es-

pacés pour réaliser des expériences de rotation du codon à d'autres points de mutation entre les deux sites Xba I, on

peut poursuivre de façon analogue le développement de la sé-

rie de plasmides prAK selon les étapes suivantes pour prépa-

rer un plasmide prAK-8, et.à partir de celui-ci prAK-9,

comme l'indiquent ci-dessous les étapes f) et g).

Etape f) Préparation de prAK-8 En suivant essentiellement l'ensemble de la procédure qui est analogue à l'étape a) ci-dessus, l'ADN de phage monocaténaire obtenu dans l'étape e) ci-dessus a été traité en

un oligomère anti-sens synthétisé de 27 bases ayant la sé-

quence:

'TCCCCACCTTTGGCCAAACACTGAAAC 3'

conçue pour introduire un site de restriction Bal I approxi-

mativement à la position du nucléotide n 534 dans la sé-

quence des nucléotides du tableau A. Des clones positifs (prAK-8 comportant maintenant les cinq sites recherchés Nru I, Hind III, Mst II, Bss HII et Bal I et ne comportant le site Hind III éliminé lors de la préparation de prAK-7) sont

identifiés de la même manière que dans l'étape a) ci-dessus.

Etape g) Préparation de prAK-9

En suivant essentiellement la procédure qui est ana-

logue à l'étape a) ci-dessus, l'ADN de phage monocaténaire

obtenu dans l'étape f) ci-dessus a été traité en un oligo-

mère anti-sens synthétisé de 30 bases ayant la séquence:

' GTTGCCAATAAGACGCGTTAAATCATTATA 3'

conçue pour introduire un site de restriction Mlu I entre les nucléotides en positions n 588 et 595 dans la séquence des nucléotides du tableau A. Des clones positifs comportant maintenant les six sites de restriction recherchés Nru I, Hind III, Mst II, Bss HII, Bal I et Mlu I et ne comportant pas le site Hind III éliminé lors de la formation de prAK-7 sont identifiés de la même manière que dans l'étape a) et

sont nommés plasmide prAK-9.

Comme on le voit, la cassette d'ADN convenant pour une substitution entre les sites Bal I et Mlu I dans prAK-9 peut être codée de façon appropriée pour introduire toutes les

variations possibles des codons et des acides aminés aux po-

sitions d'acides aminés-mutées 184, 187, 188 et 194.

D'une manière analogue, la cassette d'ADN convenant pour une substitution entre le site Mlu I et le second site Xba I peut être codée de façon appropriée pour introduire toutes les variations possibles des codons et des acides aminés aux positions d'acides aminés mutés 201 et 204.

La figure 5 est une représentation schématique des -

sites de restriction uniques que l'on peut introduire entre les deux sites Xba I initiaux trouvés dans prAK (le premier de ces sites Xba I dans prAK-9 étant maintenant le site Nru I). Des oligonucléotides anti- sens indiqués ci-dessus dans les diverses étapes de l'exemple 2 ont été soulignés pour

indiquer le ou les changements à introduire.

EXEMPLE 2

Expériences de rotation du codon

A) Des oligonucléotides monocaténaires ayant les sé-

quences de chacun des deux brins représentés sur les figures 3A et 3B ont été préparés comme le décrit liexemple P-3 avec

le synthétiseur d'ADN programmé pour insérer de façon aléa-

toire tous les nucléotides A, T, C et G à chacune des posi-

tions X dans chacun des brins représentés sur la figure 3A.

Un total d'environ 200 pg (après purification) d'ADN de chaque essai sur la machine de ces monobrins (représentant une famille d'oligonucléotides identique, à l'exception des

positions X de chaque brin) ont été préparés par cette pro-

cédure. 10 pmoles de chaque brin, sens et anti-sens, pour chaque rotation de codon, ont été combinés en masse et traitéspar chauffage à 68 C pendant 10 minutes, puis à 37 C

pendant 10 minutes, refroidissement à la température am-

biante et placement sur de la glace. La masse résultante

d'oligomères bicaténaires épousant la forme de l'ADN repré-

senté sur la figure 3A a été jugée contenir, aux positions xxx (position d'acide aminé 116) chaque combinaison permise par le code génétique, notamment des signaux d'arrêt et des nombres de codons multiples mais variables pour chacun des acides aminés naturels plus les signaux d'arrêt. 1 pmole de ces oligomères ou cassettes bicaténaires ont été ensuite soumis à une kinase à l'aide de polynucléotide-kinase T4 de New England Biolabs et mélangés en masse avec le plus grand fragment (présent en concentration molaire 10 fois moins

grande) obtenu par isolement sur gel après le clivage simul-

tané du plasmide prAK-7 avec les endonucléases de res-

triction Hind III et Mst II dans 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 7, 5, 10 mM de MgC12, 10 mM de 2-mercaptoéthanol et 100 lg/ml de BSA, et le mélange résultant a été soumis à une ligature selon l'exemple P-6 (A). Une portion aliquote

de 5.l du mélange de ligature résultant a ensuite été uti-

lisée pour transformer JM103 de E. doli,. dans les conditions de l'exemple P-4 (B). On a soumis individuellement un nombre (200) des cellules transformées résultantes aux études sur

NT et T.ni (sans connaissance préalable de quel était le co-

don en XXX qui était dans un clone particulier) et on a trouvé qu'elles produisaient un niveau d'activité indiquant

bien que tous les divers mutants avaient conduit à un pro-

duit protéinique à activité insecticide ayant une activité

au moins environ égale à celle de l'endotoxine tronquée té-

moin, les mutants ascendants transparents (5 X témoin) étant également indiqués. Avant Cela, on a également sélectionné des cellules aléatoires de la transformation, on les a mises dans des boîtes de culture et on a cultivé les colonies comme dans l'exemple P-1 pour isoler l'ADN plasmide pour l'analyse séquentielle d'ADN par clonage du fragment Bam HI/Xba I dans les vecteurs de séquençage mpl8 et mpl9 coupés avec les mêmes enzymes. L'ADN dans la région de chacune des

11 mutations en position 116 et des mutants ascendants iden-

tifiés a ensuite été séquencé pour déterminer l'acide aminé pour lequel codait sa position 116. On a trouvé que l'un des deux mutants ascendants était le mutant ascendant initial (116-Lys, mais codé par AAA). On a trouvé que l'autre mutant ascendant était 116-Arg pour lequel codait CGT. On a trouvé que l'un des autres clones était le 116-Glu natif (mais codé par GAA). Sept des autres mutants légers était 116-Ile (ATT), 116-Cys (TGC), 116-Leu (CTC), 116-Asp (GAT), 116-Asn (AAC), 116-Ile (ATT) et 116Gly (GGA), tous uniques, sauf que le nouveau 116-Ile (ATT) était représenté par deux des

clones. Les clones finals codaient pour 116-STOP (TGA).

B) On a répété la procédure de la partie A) de cet exemple 2 pour l'acide aminé en position 119 en utilisant

l'ADN représenté sur la figure 3B. Une fois encore, l'éva-

luation aléatoire d'un grand nombre de clones résultants a produit un niveau d'activité dans les études sur NT et T.ni indiquant bien que tous les clones mutants-dans le groupe total étaient actifs. (Le pourcentage de molécules inactives

était environ égal à ce que l'on attendrait pour la fré-

quence des codons d'arrêt UAA, UAG et UGA d'après les don-

nées aléatoires des nucleotides en position XXX faites par

la machine.) Il a été indiqué que plusieurs clones indi-

viduels sélectionnés au hasard avaient chacun un niveau d'activité au moins environ égal à celle de l'endotoxine de la séquence native tronquée produite par prAK, mais qu'aucun

n'était un mutant ascendant selon notre étalon arbitraire.

Le séquençage des sept clones individuels a montré qu'ils étaient tous différents et uniques, comme suit: 119-Leu (CTA), 119-Tyr (TAC), 119-Asp (GAT), 119-His (CAT), 119-Pro

(CCA), 119-Ile (ATT) et 119-Ser (TCT).

EXEMPLE I

Endotoxine de B.t. mutante complète Le plasmide pBT210 (1 gg) a été simultanément coupé' avec les endonucléases de restriction Bam HI (8 unités) et Ssc I (8 unités) pendant 60 minutes dans une solution tampon

de chlorure de sodium 100 mM contenant aussi 6 mM de Tris-

HCl (pH 7,9), 6 mM de MgCl2 et 100 lg/ml de sérumalbumine de boeuf. Le plus grand fragment d'environ 7180 paires de bases

a été purifié sur gel pour être utilisé comme vecteur. En-

suite, 1.g de plasmide prAK-26-3 faisant intervenir les mu-

tations Ala--4Thr en 119, Met--3Ile en 130 et Gly--Asp en

201 a été également simultanément coupé avec les endonu-

cléases de restriction Bam HI (8 unités) et Sst I (8 unités)

dans une solution tampon de chlorure de sodium 100 mM conte-

nant également 6 mM de Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM de MgCl2 et gg/ml de sérumalbumine de boeuf. Le plus petit fragment d'environ 1428 paires de bases contenant les mutations ainsi

que la section RBS de B.t. a été purifié sur gel et ce frag-

ment, en une quantité d'environ 0,06 pmole, a été combiné pour une ligature avec 0,02 pmole du fragment du vecteur de 7180 paires de bases obtenu ci-dessus et relié ensemble dans 1 de milieu de ligature contenant 60 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de MgCl2, 1 mM de dithiothréitol, 50M d'ATP et 20 unités d'ADN-ligase T4, et le mélange résultant a été incubé pendant 4 heures à 14 C. Le plasmide résultant, désigné par pBt 26-3, a été transformé en JM103 de E. coli par addition de 5 jl dudit mélange de ligature à 0,2 ml de JM103 de E.

coli compétente, maintien initialement à 0 C pendant 30 mi-

nutes, puis impulsion à 42 C pendant 2 minutes et retour à la glace. Différentes quantités (2 gl, 20 li et 180 gl) du mélange résultant ont ensuite été immédiatement étalées sur des plaques de gélose YT avec 20 gg/ml de chloramphénicol (bouillon YT plus 1,5% de bacto-gélose) et les plaques ont été incubées pendant une nuit à 37 C retournées. Seule une cellule transformée avec résistance au chloramphénicol a pu

croître sur ces plaques. Les colonies résistantes au chlo-

ramphénicol ont été cultivées en culture liquide pendant une nuit à 37 C et un ADN plasmide a été préparé pour digestion de restriction avec des réactifs EcoRI et séquençage d'ADN

pour déterminer réellement la présence des mutations ponc-

tuelles. On a ensuite évalué, dans les études sur NT et T.ni, les transformants contenant le plasmide pBT 26-3 ayant réussi.

En procédant de manière analogue à l'exemple 3 ci-des-

sus, on a préparé les endotoxines mutantes complètes addi-

tionnelles suivantes et on-les a évaluées dans les études sur NT et T.ni. Le tableau F ci-dessous indique les systèmes

plasmide/cellule produisant l'endotoxine mutante addi-

tionnelle complète qui ont ainsi été prépares, tous avec les résultats approximatifs de leur évaluation dans l'étude sur NT et les résultats approximatifs obtenus dans cette étude

pour le produit de l'exemple 3 ci-dessus, l'endotoxine na-

tive de B.t. wuhanensis produite dans JM103 de E. coli et un

témoin faisant intervenir des cellules JM103 non transfor-

mées.

TABLEAU F

Identification Source de; du nouveau séquence Mutation(s) plasmide mutante réel2 lement Score de Exemple mutant Bam HI/ mise(s) en toxicité _n. rcPmpl-t Sst I jeu Essai-NT 3 pBT26-3 prAK-26-3 119-Thr 1 -Ile _ _ ___ 201-Asp _ 3-A pBT36a65 prAK-36a6 122-Ile 2 -Val

3-B pBT-C prAK-C 116-Lys.1.

3-C pBT-E prAK-E 130-Ile 2 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 2.1 -A sp 3-D pBT-O prAK-O 116-Lys 2 217-His 3-E pBT-R prAK-R 101-Lys 2 116-Lys 122-Ile ______ ___. _ 125-Val _ 3-F pBT98cl prAK-98cl 188-Ser 2 3-G pBT-B prAK-B 119-Thr 2 3-H pBT-D. prAK-D 217-His 3 3-I pBT-F, prAK-FP 187-Thr 2,5 3-J pBT-J prAK-J 101-Lys 3 116-Lys -Ile 201-Asp _ 3-K pBT-M prAK-M 119-Thr 2; 5 __ ___ 217-His __ 3-L pBT-N prAK-N 119-Thr 3 187-Thr 3-M pBT-S prAK-S 119-Thr 1 188-Ser TABLEAU F (suite) Identification Source de du nouveau séquence. Mutation(s) pl asmide mutante réellement Score de Exemple mutant Bam HI/ mise(s) en toxicité n _ _C__pl_ Sst I _eu ssai NT 3-N pBT-T prAK-T 116-Lys 1,5 _ _ _ _ _ _ __ _ _ 188-Ser ____ __ 3-0 pBT-U prAK-U 101-Lys 2 116-Lys 188-Ser 3-P pBT107c22 p107c22 94-Lys 3 194-Lys _ 3-Q pBT99c62 p99c26 4-Thr 3 -Tyr __ 204 -Tyr __ 3-R pBT107c25 p107c25 184- Ile 3 3-S pBT-A prAK-A 101-Lys 3

_______ ______ ______._ 116-Lys _.

3-T pBT-K prAK-K 101-Lys 3 116-Lys 187-Thr 3-U pBT-P prAK-P 119-Thr 2;5 122-Ile -Val 3-V pBT-Q prAK-Q 116-Lys 3 1 22-Ile -Val 3-W pBT39 prAK-39 105-Tyr 3 188-Ser 3-X pBT70 prAK-70 119-Thr 1 184-Ile 3-Y pBT68 prAK-68 105-Tyr 1 -Ile 201-Asp TABLEAU F (suite) Identification Source de du nouveau séquence Mutation(s) plasmide mutante réellement Score de Exemple mutant Bam HI/ mise(s) en toxicité n rnmPl f--st I je Esa N 3-Z pBT53 prAK-53 105-Tyr 3 ___ _ 184-IlE

B.T. - - 3

Wu-anensis

JM103 4.7

EXEMPLE 4*

Endotoxines de B.t. mutantes complètes additionnelles Le plasmide pBT210 (1 gg) a été digéré simultanément avec les endonucléases de restriction Bam HI (8 unités)*et ÀSst I (8 unités) et le grand fragment de 7180 bp résultant a été isolé sur gel. Dans une série d'expériences séparées on a également digéré simultanément chacun (l lg) des plasmides prAK, prAK-E, p26-3, p36a65 et p95a86 avec les endonucléases de restriction Bam HI (8 unités) et Sst I (8 unités), et on

a isolé sur gel chaque fragment de 1428 bp résultant compre-

nant une portion d'une séquence codante d'endotoxine tron-

quée. Chaque quantité de ces fragments de 1428 bp a ensuite été digérée séparément avec l'endonucléase de restriction Fnu D2 (4 unités dans 6 mM de NaCl, 6 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 6 mM de MgC12, 6 mM de 2mercaptoéthanol, 100 vlg/ml de sérumalbumine de boeuf). L'endonucléase de restriction Fnu D2 (connue également sous le nom de Acc 2) ne coupe qu'une fois chacun des divers fragments Bam HI/Sst I de 1428 bp et

coupe dans un fragment Bam HI/Fnu D2 de 640 bp et un frag-

ment Fnu D2/Sst I de 788 bp, les différents fragments de chaque expérience étant purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose. On a aussi obtenu une série de fragments différents Bam HI/Fnu D2 de 640 bp et une série de fragments différents Fnu

D2/Sst I de 788 bp. En sélectionnant un fragment dans cha-

cune de ces deux séries et en effectuant une ligature (exem-

ple P-6B) avec le fragment plus grand de 7180 bp obtenu de pBT210, on a obtenu un certain nombre de nouveaux plasmides abritant différents gènes d'endotoxine de B.t. mutants complets. Les nouveaux plasmides ainsi obtenus, identifiés ci-dessous dans le tableau G, ont ensuite été utilisés pour transformer JM103 de E. coli selon la procédure de l'exemple

P-4(A) et on a évalué les cellules résultantes pour la pro-

duction d'endotoxine de B.t. dans l'étude NT de l'exemple A, les résultats approximatifs obtenus dans cette étude étant également consignés ci-dessous dans le tableau G. Diverses

cellules parmi les cellules transformées contenant les plas-

mides décrits dans les tableaux F et G ont également.été évaluées dans l'étude sur T. ni, dont les résultats sont consignés dans le tableau H.

TABLEAU G

IDENTIFICATION

DU NOUVEAU SOURCE DE SOURCE DE

PLASMIDE FRAGMENT FRAGMENT MUTATIONCS) SCORE

EXEMPLE MUTANT BAM HI/ FNU D2/ REELLEMENT ESSAI

N COMPLET FNU D2 SST I MISE(S)ENJEU NT

4-A 66' p36a65 p26-3 122-Ile 3 -Val 201-Asp 4-B 67 p26-3 p95a86 119-Thr 1 130-Ile -. 188-Ser 4-C 74 p36a65 p95a86 122-Ile 3 -Val 188-Ser 4-D 106 p26-3 prAK 119-Thr 1 -Ile 4-E 107 prAK p26-3 201-Asp 2.5 4-F 108 prAK-E prAK 130-Ile 3

TABLEAV H

IDENTIFICATION TABLEAU ACTIVITE

DU PLASMIDE SOURCE RELATIVE

pBTA F 391 pBTC F 299 pBT66 F 169 pBT107c25 F 254 pBTP F 340 pBTS F 255 pBT67 G 304 pBT106 G 367 Etalon pBT301 100 Témoin SAN415 59 Témôin CAG629 0

EXEMPLE 5

Les cellules transformées avec un ADN codant pour une

séquence d'endotoxine mutante sont cultivées dans un fermen-

teur, dans des conditions connues et standards à cet effet.

L'ensemble du contenu du fermenteur est soumis, à la fin de la croissance cellulaire et immédiatement avant la récolte,

à une élévation de température jusqu'à environ 70-80 C.

Cette température est maintenue pendant 10 minutes avant re-

* froidissement et est suffisante pour inactiver les micro-or-

ganismes recombinants sans affecter l'activité biologique des protéines endotoxines. On évapore ensuite sous pression le contenu du fermenteur pour le concentrer au 1/3 du volume précédent et on soumet le concentré résultant à un séchage -par atomisation sous une pression d'insertion d'environ 13 790 kPa en utilisant une circulation d'air chauffé à contrecourant avec une température d'entrée de 140-160 C et une température de sortie de 20-50 C. On mélange la poudre résultante avec un véhicule, c. omme du soja dégraissé, pour former un concentré mouillable. Des rapports convenables de

celui-ci dépendront entre autres de la concentration souhai-

tée du produit final, mais peuvent, par exemple, être de

:40 parties en poids de la poudre au véhicule. Le concen-

tré résultant contient de préférence de 0,4 à 10%, et mieux encore de 0,8 à 8%, de substance active, en termes de spores

ou de protéine endotoxine. La poudre mouillable est avanta-

geusement diluée avec de l'eau, comme il est connu dans la

technique, pour être appliquée par pulvérisation.

TABLE A

(a) -46

GG ATC CGT TTT AAA TTG TAG TAA TGA AAA ACA GTA TTA

Ile Arg Phe Lys Leu *** *** *** Lys Thr Val Leu

TAT CAT AAT GAA TTG 'GTA TCT TAA TAA AAG AGA TGG AGG TAA CTT

Tyr His Asn Glu Leu Val Ser *** *** Lys Arg Trp Arg *** Leu (-15)

ATG GAT AAC AAT CCG AAC ATC AAT GAA TGC ATT CCT TAT AAT TGT

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys.

(1) (4) (15)

TTA AGT AAC CCT GAA GTA GAA GTA TTA GGT GGA GAA AGA. ATA GAA

Leu Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu

ACT GGT TAC ACC CCA ATC GAT ATT TCC TTG TCG CTA ACG CAA TTT

Thr Gly Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe (b)

CTT TTG AGT GAA TTT GTT CCC GGT GCT GGA TTT GTG TTA GGA CTA-

Leu Leu Ser Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu (60)

UTT GAT ATA ATA TGG GGA ATT TTT GGT CCC TCT CAA TGG GAC GCA

Val Asp Ile Ile Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala n-1

TTT CTT GTA CAA ATT GAA CAG TTA ATT AAC CAA AGA ATA GAA GAA

Phe Leu Val Gln Ile Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu (m-1) (c) 300

TTC GCT AGG AAC CAA GCC ATT TCT AGA TTA GAA GGA CTA AGC AAT

Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn

(100) (105)

CTT TAT CAA ATT TAC GCA GAA TCT TTT AGA GAG TGG GAA GCA GAT

Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp

CCT ACT AAT CCA GCA TTA AGA GAA GAG ATG CGT ATT CAA TTC AAT

Pro Thr An Pro Ala Leu Arg Glu Glu Met Arg Ile.Gln Phe Asn (135) Notes: (a) est le site Bam HI (b) est le site Spe-I (c) est le site Xba I

GAC ATG AAC AGT GCC CTT ACA ACC GCT ATT CCT CTT TTT GCA GTT

Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val (140)

CAA AAT TAT CAA GTT CCT CTT TTA TCA GTA TAT GTT CAA GCT GCA

Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val Gln Ala Ala (165)

AAT TTA CAT TTA TCA GTT TTG AGA GAT GTT TCA GTG TTT GGA CAA

Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser Val Phe Gly Gln (180)

549 577

AGG TGG GGA TTT GAT GCC GCG ACT ATC AAT AGT CGT TAT AAT'GAT

Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg Tyr Asn'Asp (195) 606 n348 624

TTA ACT AGG CTT ATT GGC AAC TAT ACA GAT CAT GCT GTA CGC TGG

Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val Arg Trp (m-116) (210) (d) 675

TAC AAT ACG GGA TTA GAG CGT GTA TGG GGA CCG GAT TCT AGA GAT

Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg Asp (225)

TGG ATA AGA TAT AAT CAA TTT AGA AGA GAA TTA ACA CTA ACT GTA

Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val

TTA GAT ATC GTT TCT CTA TTT CCG AAC TAT GAT AGT AGA ACG TAT

Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr (255)

CCA ATT CGA ACA GTT.TCC CAA TTA ACA AGA GAA ATT TAT ACA AAC

Pro Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn

CCA GTA TTA GAA AAT TTT GAT GGT AGT TTT CGA GGC TCG GCT CAG

Pro Val Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gin

GGC ATA GAA GGA AGT ATT AGG AGT CCA CAT TTG ATG GAT ATA CTT

Gly Ile Glu Gly Ser Ile Arg Ser Pro His.Leu Met Asp Ile Leu

AAC AGT ATA ACC ATC TAT ACG GAT GCT CAT AGA GGA GAA TAT TAT

Asn Ser Ile Thr Ile Tyr Thr Asp Ala Ris Arg Gly Glu Tyr Tyr

TGG TCA GGG CAT CAA ATA ATG GCT TCT CCT GTA GGG TTT TCG GGG

Trp Ser Gly His Gin Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Note: (d) est le site Xba I

CCA GAA TTC ACT TTT CCG CTA TAT GGA ACT ATG GGA AAT GCA GCT

Pro Glu Phe Thr Phe Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala

CCA CAA CAA CGT ATT GTT GCT CAA CTA GGT CAG GGC GTG TAT AGA

Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg

ACA TTA TCG TCC ACT TTA TAT AGA AGA CCT TTT AAT ATA GGG ATA

Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile

AAT AAT CAA CAA CTA TCT GTT CTT GAC GGG ACA GAA TTT GCT TAT

Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp Gly Thr Glu Phe Ala Tyr

GGA ACC TCC TCA AAT TTG CCA TCC GCT GTA TAC AGA AAA AGC GGA

Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val Tyr Arg Lys Ser Gly

ACG GTA GAT TCG CTG GAT GAA ATA CCG CCA CAG AAT AAC AGC GTG

Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asn Asn Asn Val

CCA CCT AGG CAA GGA TTT AGT CAT CGA TTA AGC CAT GTT TCA ATG

Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His Val Ser Met

TTG CGT TCA GGC TTT AGT AAT AGT AGT GTA AGT ATA ATA AGA GCT

Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile Arg Ala (450)

CCT ATG TTC TCT TGG ATA CAT CGT AGT GCT GAA TTT AAT AAT ATA

Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn Il ATT CCT TCA TCA CAA ATT ACA CAA ATA CCT TTA ACA AAA TCT ACT

Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr

AAT CTT GGC TCT GGA ACT TCT GTC GTT AAA GGA CCA GGA TTT ACA

Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr

GGA GGA GAT ATT CTT CGA AGA ACT TCA CCT GGC CAG ATT TCA ACC

Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr

TTA AGA GTA AAT ATT ACT GCA CCA TTA TCA CAA AGA TAT CGG GTA

Leu Arg Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val

AGA ATT CGC TAC GCT TCT ACC ACA AAT TTA CAA TTC CAT ACA TCA

Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gin Phe His Thr Ser

ATT GAC GGA AGA CCT ATT AAT CAG GGG AAT TTT TCA GCA ACT ATG

Ile Asp Gly Arg Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met

AGT AGT GGG AGT AAT TTA CAG TCC GGA AGC TTT AGG ACT GTA GGT

Ser Ser Gly Ser Asn Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly

TTT ACT ACT CCG TTT AAC TTT TCA AAT GGA TCA AGT GTA TTT ACG

Phe Thr Thr Pro Phe Asn Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr

TTA AGT GCT CAT GTC TTC AAT TCA GGC AAT GAA GTT TAT ATA GAT

Leu Ser Ala His Val Phe Asn Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp

CGA ATT GAA TTT GTT CCG GCA GAA GTA ACC TTT GAG GCA GAA TAT

Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr (610>

GAT TTA GAA AGA GCA CAA AAG GCG GTG AAT GAG CTG TTT ACT TCT

Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Glu Leu Phe Thr Ser

TCC AAT CAA ATC GGG TTA AAA ACA GAT GTG ACG GAT TAT CAT ATT

Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile

GAT CAA GTA TCC AAT TTA GTT GAG TGT TTA TCT GAT GAA TTT TGT

Asp'Gln Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys

CTG GAT GAA AAA AAA GAA TTG TCC GAG AAA GTC AAA CAT GCG AAG

Leu Asp. Glu Lys Lys Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys

CGA CTT AGT GAT GAG CGG AAT TTA CTT CAA GAT CCA AAC TTT AGA

Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asn Phe Arg

GGG ATC AAT AGA CAA CTA GAC CGT GGC.TGG AGA GGA AGT ACG.GAT

Gly Ile Asn Arg Gln Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp

ATT ACC ATC CAA GGA GGC GAT GAC GTA TTC AAA GAG AAT TAC GTT

Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val (e)

ACG CTA TTG GGT ACC TTT GAT GAG TGC TAT CCA ACG TAT TTA TAT

Thr Leu Leu Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr (723)

CAA AAA ATA GAT GAG TCG AAA TTA AAA GCC TAT ACC CGT TAC CAA

Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln (750)

TTA AGA GGG TAT ATC GAA GAT AGT CAA GAC TTA GAA ATC TAT TTA

Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gin Asp Leu Glu Ile-Tyr Leu

ATT CGC TAC AAT GCC AAA CAC GAA ACA GTA AAT GTG CCA GGT ACG

Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr

GGT TCC TTA TGG CCG CTT TCA GCC CCA AGT CCA ATC GGA AAA TGT

Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Ala Pro Ser Pro Ile Gly Lys Cys Note: (e) est le site Kpn I

GGA GAA CCG AAT CGA TGC GCA CCA CAA CTT GAA TGG AAT CCA GAT

Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro Gln Leu Glu Trp Asn Pro Asp

CTA GAT TGT TCC TGC AGA GAC GGA GAA AAA TGT GCC CAT CAT TCC

Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser

CAT CAT TTC TCC TTG GAC ATT GAT GTT GGA TGT ACA GAC TTA AAT

His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn (840)

GAG GAC TTA GGT GTA TGG GTG ATA TTC AAG ATT AAG ACG CAA GAT

Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gin Asp

GGC CAT GCA AGA CTA GGA AAT CTA GAA TTT CTC GAA GAG AAA CCA

Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro

TTA GTA GGA GAA GCA CTA GCT CGT GTG AAA AGA GCG GAG AAA AAA-

Leu'Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys

TGG AGA GAC AAA CGT GAA AAA TTG GAA TGG GAA ACA AAT ATT GTT

Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr Asn Ile Val (900)

TAT AAA GAG GCA AAA GAA TCT GTA GAT GCT TTA TTT GTA AAC TCT

Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser

CAA TAT GAT AGA TTA CAA GCG GAT ACC AAC ATC GCG ATG ATT CAT

Gln Tyr Asp Arg Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His.

GCG GCA GAT AAA CGC GTT CAT AGC ATT CGA GAA GCT TAT CTG CCT

Ala Ala Asp Lys Arg Val His Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro

GAG CTG TCT GTG ATT CCG GGT GTC AAT GCG GCT ATT TTT GAA GAA

Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu

TTA GAA GGG CGT ATT TTC ACT GCA TTC TCC CTA TAT GAT GCG AGA

Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg

AAT GTC ATT AAA AAT GGT GAT TTT AAT AAT GGC TTA TCC TGC TGG

Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp

AAC GTG AAA GGG CAT GTA GAT GTA GAA GAA CAA AAC AAC CAC CGT

Asn Val Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn His Arg

TCG GTC CTT GTT GTT CCG GAA TGG GAA GCA GAA GTG TCA CAA GAA

Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu

GTT CGT GTC TGT CCG GGT CGT GGC TAT ATC CTT CGT GTC ACA GCG

Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala

TAC AAG GAG GGA TAT GGA GAA GGT TGC GTA ACC ATT CAT GAG ATC

Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile

(1050)

GAG AAC AAT ACA GAC GAA CTG AAG TTT AGC AAC TGT GTA GAA GAG

Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu

3240

GAA GTA TAT CCA AAC AAC ACG GTA ACG TGT AAT GAT TAT ACT GCG

Glu Val Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Ala

(1080)

ACT CAA GAA GAA TAT GAG GGT ACG TAC ACT TCT.CGT AAT CGA GGA

Thr Gln Glu Glu Tyr Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly

TAT GAC GGA GCT TAT GAA AGC AAT TCT TCT GTA CCA GCT GAT TAT

Tyr Asp Gly Ala Tyr Glu Ser Asn Ser Ser Val Pro Ala Asp Tyr

GCA TCA GCC TAT GAA GAA AAA GCA TAT ACA GAT GGA CGA AGA GAC

Ala Ser Ala Tyr Glu Glu Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Asp

AAT CCT TGT GAA TCT AAC AGA GGA TAT GGG GAT TAC ACA CCA CTA

Asn Pro Cys Glu Ser Asn Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Thr Pro Leu

CCA GCT GGC TAT GTG ACA AAA GAA TTA GAG TAC TTC CCA GAA-ACC

Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr

GAT AAG GTA TGG ATT GAG ATC GGA GAA ACG GAA GGA ACA TTC ATT

Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile

(1170)

GTG GAT AGC GTG GAA TTA CTC CTT ATG GAG GAA TAG

Val Asp Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu ***

(1181)

Les mutations particulièrement préférées de l'invention englobent celles aux positions 116 (Lys ou Arg), 119 (Thr), 130 (Ile) et 188 (Ser) et les combinaisons incluant une ou plusieurs de celles-ci, comme celles que l'on trouve dans pBT26-3, pBT-106, pBT-68, pBT-C, pBT-67 et pBT-70 (certaines d'entre elles se trouvant sur le tableau G). Les mutations individuelles et combinées dans p36a65, en particulier pour les endotoxines tronquées, présentent également un intérêt particulier. Les mutations trouvées et permises selon l'invention en position d'acide aminé 4 présentent un intérêt car elles tombent dans une section de 25 acides aminés (positions 1 à 25 comprise, dans le tableau A), pour laquelle on a émis l'hypothèse qu'elle formait aussi une portion pré- toxine ou pro-toxine de l'endotoxine et qu'elle était soumise à un

clivage par la protéase dans l'intestin pour former l'endo-

toxine active ou une endotoxine plus active. Par conséquent, les mutations permises en position 4 sont indiquées comme étant appropriées aux séquences d'endotoxine comprenant lesdits 25 acides aminés ou ayant avec ceux-ci une homologie importante (d'au moins 70%), et étant plus particulièrement appropriées aux endotoxines codées dans cette région par un ADN qui s'hybriderait avant la mutation en position 4 et dans des conditions rigoureuses pour former un ADN ayant la

séquence trouvée au tableau A pour les positions des nucléo-

tides s'étendant du nucléotide en position 1 jusqu'au nu-

cléotide en position 75 inclus, indépendamment des délétions et des additions et avec un codage équivalent des acides aminés correspondants, comme on l'a discuté ci-dessus pour

la zone de la séquence d'acides aminés 116 conservée.

La mutation non couverte par nos travaux à la position

d'acide aminé 217 et consignée au tableau B ci-dessus, et.

évaluée comme on le voit ailleurs ici, est jugée indiquer que tous les acides aminés codés naturellement peuvent être

présents en cette position dans des endotoxines actives com-

portant la séquence appropriée, représentée sur le tableau A, qui s'étend depuis la fin de la séquence de référence d'acides aminés 116 jusqu'à la position d'acide aminé 217 comprise. Par conséquent, la situation dans laquelle l'acide

aminé en position 217 dans une telle séquence ou un équiva-

lent de celle-ci est n'importe quel acide aminé codé natu-

rellement, sauf Arg, est incluse dans le cadre de cette in-

vention. Cependant, comme la mutation indiquée en position

217 a produit des résultats moins intéressants, elle pré-

sente principalement un intérêt en combinaison avec les autres mutations décrites ici et indiquant que la position 217 peut changer dans des endotoxines dans lesquelles Arg se

trouve naturellement à cette position.

R E V E N D I CATIONS

1.- Gène de structure comprenant un ADN codant pour une protéine endotoxine ayant une activité toxique contre les

insectes, cet ADN renfermant une portion codant pour une sé-

quence d'acides aminés présentant une homologie substan- tielle avec la séquence d'acides aminés 116 commençant en

position m-1 et s'étendant jusqu'à la position m-116 du ta-

bleau A indiqué ici, lesdits numéros de position s'appli-

quant à une séquence homologue indépendante des délétions ou additions éventuelles, caractérisé en ce que ledit ADN est

modifié de telle manière qu'un ou plusieurs des acides ami-

nés suivants soient codés à la position de référence d'acide aminé indiquée: a) en position m-5, n'importe quel acide aminé naturel sauf Asn; b) en position m-6, n'importe quel acide aminé naturel sauf Gln;

c) en position m-12, n'importe quel acide aminé naturel sauf-

Glu d) en position m-16, n'importe quel acide aminé naturel sauf Asn; e) en position m-27, n'importe quel acide aminé naturel sauf Glu; f) en position m-30, n'importe quel acide aminé naturel sauf -Ala; g) en position m-33, n'importe quel acide aminé naturel sauf Thr; h) en position m-34, n'importe quel acide aminé naturel sauf Asn; i) en position m-36, n'importe quel acide aminé naturel sauf Ala; j) en position m-41, n'importe quel acide aminé naturel sauf Met; k) en position m-95, n'importe quel acide aminé naturel sauf Phe; 1) en position m-98, n'importe quel acide aminé naturel sauf Ala; m) en position m-99, n'importe quel acide aminé naturel sauf Thr; n) en position m-105, n'importe quel acide aminé naturel sauf Asn; et o) en position m-112, n'importe quel acide aminé naturel

sauf Gly.

2.- Gène de structure selon la revendication 1, dans lequel l'homologie entre la séquence d'acides aminés codée par une portion de l'ADN dudit gène de structure et la séquence d'acides aminés 116 commençant en position m-l et s'étendant jusqu'à la position m-116 du tableau A indiqué ici, est d'au

moins 70%.

3.- Gène de structure selon la revendication 1 ou 2, carac-

térisé en ce que l'ADN a été modifié de telle manière qu'un ou plusieurs des acides aminés suivants soient codés à la position de référence d'acide aminé indiquée: a) en position m-5, Lys b) en position m-6, Lys c) en position m-12, Lys d) en position m-16, Tyr e) en position m-27, Lys ou Arg f) en position m-30, Thr g) en position m-33, Ile h) en position m34, Tyr i) en position m-36, Val j) en position m-41, Ile k) en position m-95, Ile 1) en position m-98, Thr m) en position m-99, Ser n) en position m-105, Lys; et

o) en position m-112, Asp.

4.- Gène de structure selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'ADN a été modifié pour incorporer le changement au niveau de l'une des deux positions de référence d'acides

aminés m-37 et m-30 ou des deux.

5.- Gène de structure selon le7s revendications 1 à 4, ca-

ractérisé en ce que la portion d'ADN, sans aucune des

modifications spécifiées dans les revendications 1 à 4,

s'hybride dans des conditions d'hybridation rigoureuses pour donner un oligomère à 348 nucleotides ayant la séquence de

nucléotides décrite sur le tableau A, commençant à la posi-

tion n-1 et s'étendant jusqu'à la position du nucléotide n-

348. 6.- Gène de structure selon la revendication 5, caractérisé

en ce que la portion d'ADN, avant toute modification spéci-

fiée dans les revendications 1 à 4, code pour la séquence

d'acides aminés 116 du tableau A commençant à la position m-

1 et s'étendant jusqu'à la position m-116.

7.- Gène de structure selon la revendication 6, dans lequel l'ADN codant pour l'endotoxine comprend un ADN codant pour

la séquence d'acides aminés du tableau A commençant-à la'po-

sition d'acide aminé 1 et s'étendant jusqu'à la position

d'acide aminé 205.

8.- Gène de structure comprenant un ADN codant pour une protéine endotoxine ayant une activité toxique contre les insectes, ledit ADN comportant une portion codant pour une séquence d'acides aminés présentant une homologie d'acides aminés substantielle pour la séquence d'acides aminés 205 commençant à la position d'acide aminé 1 et s'étendant

jusqu'à la position d'acide aminé 205 dans le tableau A in-

diqué ici, caractérisé en ce que l'acide aminé en position 4

est n'importe quel acide aminé, à l'exception de Asn.

9.- Gène de structure selon la revendication 8, caractérisé

en ce que l'acide aminé en position U est Tyr. -

10.- Vecteur d'expression comprenant le gène de structure

selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 sous le

contrôle d'un ADN opérant pour provoquer l'expression dudit

gène de structure dans un hôte bactérien.

11.- Vecteur d'expression selon la revendication 10, carac-

térisé en ce que ledit gène est sous le contrôle d'un ADN

opérant pour provoquer l'expression dudit gène dans E. coli.

* 12.- Vecteur d'expression selon la revendication 10, carac-

térisé en ce que ledit gène est sous le contrôle d'un ADN

opérant pour provoquer l'expression dudit gène dans B.t..

13.- Protéine d'endotoxine ayant une activité toxique contre

les insectes, cette protéine comprenant une portion de sé-

quence d'acides aminés ayant une homologie substantielle avec la séquence d'acides aminés 116 commençant en position m-1 et s'étendant jusqu'à la position m-16 dans le tableau A indiqué ici, lesdits numéros de position s'appliquant à une séquence homologue indépendante de toute délétion ou de toute addition, caractérisée en ce que un ou plusieurs des

acides aminés suivants sont présents aux positions de réfé-

rence d'acide aminé indiquées: a) en position m-5, n'importe quel acide aminé naturel sauf Asn; b) en position m-6, n'importe quel acide aminé naturel sauf Gln; c) en position m-12, n'importe quel acide aminé naturel sauf Glu d) en position m-16, n'importe quel acide aminé naturel sauf Asn; e) en position m-27, n'importe quel acide aminé naturel sauf Glu; f) en position m-30, n'importe quel acide aminé naturel sauf Ala; g) en position m-33, n'importe quel acide aminé naturel sauf Thr; h) en position m-34, n'importe quel acide aminé naturel sauf Asn; i) en position m-36, n'importe quel acide aminé naturel sauf Ala; j) en position m-41, n'importe quel acide aminé naturel sauf Met; k) en position m-95r n'importe quel acide aminé naturel sauf Phe; 1) en position m-98, n'importe quel acide aminé naturel sauf Ala; m) en position m-99, n'importe quel acide aminé naturel sauf Thr; n) en position m-105, n'importe quel acide aminé naturel sauf Asn; et o) en position m-112, n'importe quel acide aminé naturel

sauf Gly.

14.- Protéine endotoxine selon la revendication 13, caracté-

risée en ce que l'homologie entre ladite portion de séquence

d'acides aminés et la séquence d'acides aminés 116 commen-

çant en position m-1 et s'étendant jusqu'à la position m-116

du tableau A indiqué ici, est d'au moins 70%.

15.- Protéine endotoxine selon la revendication 13 ou 14,

caractérisée en ce qu'un ou plusieurs des acides aminés sui-

vants est codé à la position de référence d'acide aminé in-

diquée: a) en position m-5, Lys b) en position m-6, Lys c) en position m12, Lys d) en position m-16, Tyr e) en position m-27, Lys ou Arg f) en position m-30, Thr g) en position m-33, Ile h) en position m-34, Tyr i) en position m-36, Val j) en position m-41, Ile k) en position m-95, Ile 1) en position m-98, Thr m) en position m-99, Ser n) en position m-105, Lys; et

o) en position m-112, Asp.

16.- Protéine endotoxine selon la revendication 15, caracté-

risée en ce que l'un ou les deux acides aminés aux positions

de référence m-27 et m-30 ont été changés.

17.- Protéine endotoxine produite à partir d'un gène selon la revendication 8 ou 9. 18.- Procédé de production d'une protéine endotoxine qui comprend la transformation ou la transfection d'une cellule

avec un vecteur d'expression selon l'une quelconque des re-

vendications 8 à 11 et la culture des cellules résultantes

pour produire ladite endotoxine.

19.- Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la cellule transformée ou transfectée est une cellule végétale. 20.- Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la cellule transformée ou transfectée est une cellule bactérienne. 21.- Végétal comprenant des cellules contenant un gène de

structure selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.

22.- Cellules bactériennes comprenant un vecteur d'expres-

sion selon l'une quelconque des revendications 10 à 12.

23.- Séquence d'ADN comprenant un ADN comportant la séquence depuis la position du nucléotide n-1 s'étendant jusqu'à la

position du nucléotide n-348 dans le tableau A, ou des va-

riations mutantes de celle-ci, et comportant un ou plusieurs

sites de restriction espacés choisis dans le groupe consti-

tué par Hind III, Mst II, BssH II, Bal I et Mlu I, ces sites ne changeant pas la séquence d'acides aminés pour laquelle

code l'ADN.

24.- Composition insecticide comprenant une quantité à effi-

cacité insecticide d'une protéine produite à partir d'un ADN

selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 en associa-

tion avec un véhicule acceptable en agriculture.

25.- Composition insecticide comprenant une quantité à effi-

cacité insecticide d'une protéine selon l'une quelconque des

revendications 13 à 17 en association avec un véhicule ac-

ceptable en agriculture.