CA2166124A1 - Fragment d'adn de clostridium bifermentans portant les genes codant pour des proteines associees a une activite insecticide - Google Patents
Fragment d'adn de clostridium bifermentans portant les genes codant pour des proteines associees a une activite insecticideInfo
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-
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Abstract
L'invention a pour objet une séquence nucléotidique caractérisée par les propriétés suivantes: elle comprend tout ou partie du fragment d'AND XbaI de 7 kb représente à la figure 4A, tel qu'obtenu à partir du plasmide pCBM1 déposé à la CNCM le 15 juin 1993 sous le No.
I-1317; elle hybride avec la sonde oligonucléotidique 8A (TGT GAA GTI AAT TGT GA) et/ou avec la sonde oligonucléotique 16A (TTT
CAT ATI GAA GCI GTI AAT GAA GG) et/ou avec au moins l'une des sondes 66A (ATG AAT ACI AAT ATI TTT TCI ACI AA) ou 66B (TC IGG TTC ICC ATA IAT CCA TTC ATC) dans des conditions stringentes; elle code pour une protéine, un polypeptide ou un peptide ayant la capacité de participer à l'activité toxique des produits d'expression du fragment XbaI de 7 kb vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier de larves de Moustiques ou de Simulies. Elle vise aussi les polypeptides codés par cette séquence et leur utilisation dans des compositions larvicides.
I-1317; elle hybride avec la sonde oligonucléotidique 8A (TGT GAA GTI AAT TGT GA) et/ou avec la sonde oligonucléotique 16A (TTT
CAT ATI GAA GCI GTI AAT GAA GG) et/ou avec au moins l'une des sondes 66A (ATG AAT ACI AAT ATI TTT TCI ACI AA) ou 66B (TC IGG TTC ICC ATA IAT CCA TTC ATC) dans des conditions stringentes; elle code pour une protéine, un polypeptide ou un peptide ayant la capacité de participer à l'activité toxique des produits d'expression du fragment XbaI de 7 kb vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier de larves de Moustiques ou de Simulies. Elle vise aussi les polypeptides codés par cette séquence et leur utilisation dans des compositions larvicides.
Description
21~12~
WO95/~W~g PCTtFR94/00768 F~M~NT D'ADN DE CLOSTRIDIUM BIFERMENTANS PORTANT ~E8 GENES CODANT POUR DE8 PRO,~:l~S ASSOCIEES A UNE
A~-.lvl.~ INSECTICIDE.
L'invention est relative à de nouvelles toxines isolees à partir d'une souche de bactérie anaérobie de l'espèce Clostridium bifermentans. La souche CH18 de Clostridium bifermentans serovar malaysia (Cbm), a été
décrite par H. de Barjac et M. Sebald, dans C.R. Acad.
Sci. Paris t. 310, Série III, p. 383-387, 1990.
Elle présente une activité toxique pendant la phase de sporulation par l'intermédiaire de toxines ayant un pouvoir larvicide vis-à-vis de larves d'arthropodes, en particulier d'insectes et notamment vis-à-vis de larves de Diptères, par exemple de larves de Moustiques ou de Simulies. Ces Diptères particuliers sont vecteurs de maladies ou provoquent des nlliCAnc~s.
Jusqu'à présent, on connaissait les toxines spécifiques de bactéries de l'espèce Bacillus thurinqiensis ou de l'espece Bacillus sphaericus pour leur activité entomopathogene et notamment leur activité toxique, vis-à-vis de larves de moustiques (Nicolas (1992). Pes. agropec. bras., Brasilia, abr.
1992, 27, 37-46). En dépit de l'intérêt manifeste de ces toxines de Bacillus pour lutter contre les insectes et notamment les larves d'insectes, la recherche de nouvelles toxines actives vis-à-vis de certains insectes, s'avérait importante notamment dans le but d'offrir des moyens pour lutter contre le risque de développement d'une résistance vis-à-vis de ces produits a activité larvicide. Dans ce contexte, les inventeurs ont mis en évidence chez une bactérie de l'espèce Clostridium bifermentans, l'existence d'une activité larvicide. A cet egard, l'invention propose pour la première fois des toxines presentes chez des bactéries anaérobies, susceptibles d'avoir une activité
WO95/~h~9 PCT~94/00768 216612'1 toxique et en particulier larvicide vis-à-vis d'arthropodes, et en particulier d'insectes de type Diptère. La souche de Clostridium bifermentans serovariété malaysia utilisée présente une inocuité
vis-à-vis des mammifères et des poissons testés ainsi que vis-à-vis de tous les organismes aquatiques en dehors de la cible naturelle de l'activité larvicide de Cbm (Thiery et al. (1992) J.econ.Entomol. 85(5), 1618-1623). L'existence de l'activité larvicide de Cbm a déjà été observée et associée dans l'art antérieur avec les cellules sporulantes (Charles et al. (199O) Res. Microbiol. 141, 721d-733). Il a également été noté
que cette activité diminue très fortement après la lyse cellulaire en raison de l'inactivation par des protéases cellulaires (Nicolas et al (1990). Appl.
Microbiol. Biotechnol. 34, 36-41).
L'invention a donc pour objet des séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides susceptibles de participer à l'activité toxique vis-à-vis de larves d'arthropodes et en particulier d'insectes, notamment de Diptères tels que les Moustiques ou les Simulies.
L'invention vise également ces polypeptides ainsi que des cellules recombinantes contenant les séquences nucléotidiques et les fragments de nucléotides de l'invention, dans des conditions permettant leur expression.
Entrent également dans le cadre de la présente demande, des anticorps reconnaissant les polypeptides de l'invention, ainsi que des compositions à activité
larvicide.
Une sequence nucléotidique de l'invention est caracterisée par les propriétés suivantes :
- elle comprend tout ou partie du fragment d'ADN
XbaI de 7 kb représente à la figure 4A, tel qu'obtenu à
FEUILLE DE REMPL~CEMENT (REGLE 26~
wo gs/oo~g ~ 12 ~ PCT~R94/00768 partir du plasmide pCBMl déposé à la CNCM le 15 Juin 1993 sous le n I-1317 ;
- elle hybride avec la sonde oligonucléotidique 18A (TGT GAA GTI AAT TGT GA) et/ou avec la sonde oligonucléotique 16A (TTT CAT ATI GAA GCI GTI AAT GAA
GG) et/ou avec au moins l'une des sondes 66A (ATG AAT
ACI AAT ATI TTT TCI ACI AA) ou 66B (TC IGG TTC ICC ATA
IAT CCA TTC ATC) dans- des conditions stringentes décrites dans la partie expérimentale :
- elle code pour une protéine, un polypeptide ou un peptide ayant la capacité de participer à l'activité
toxique des produits d'expression du fragment XbaI de 7 kb vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier de larves de Moustiques ou de Simulies.
On définit l'activité toxique dans le cadre de l'invention, par rapport à la "cible" sur laquelle on veut obtenir cette activité. Cette "cible" est de façon générale un arthropode et plus particulièrement un insecte, notamment de la famille des Diptères et par exemple, une larve de Moustique ou Simulie.
On considèrera dans le cadre de l'invention qu'une séquence de nucléotides code pour une protéine ou un polypeptide ayant la capacité de participer à
l'activité toxique des produits d'expression du fragment XbaI de 7 kb contenu dans le plasmide pCBMl déposé à la CNCM sous le n I-1317, des lors que la délétion ou l'altération de cette séquence au sein dudit plasmide entraine une diminution ou une suppression de l'activité toxique vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier de larves de Moustiques ou de Simulies, constatée lorsque ce plasmide est introduit dans une cellule recombinante n'ayant pas naturellement d'activité larvicide, par exemple une cellule de Clostridium bifermentans.
WO95/00~9 PCTIFR94/00768 216612~
D'autres cellules recombinantes, telles que celles décrites par Delécluse A. et al (1988) Mol. Gen. Genet.
214:42-47) peuvent être mises en oeuvre.
L'indication relative à l'activité toxique vis-à-vis des larves de Diptères ne doit en aucune façon être considérée comme restrictive s'agissant du spectre d'action, des moyens de l'invention. Elle constitue uniquement une référence pour l'évaluation de l'activité des produits de l'invention.
L'activité toxique peut être évaluée en mesurant la LC50 (dose léthale pour 50% des insectes ou plus généralement de la "cible" sur laquelle on veut évaluer l'activité toxique).
Différents tests ont déjà été proposés dans l'art antérieur pour détecter l'activité larvicide de souches de bactéries susceptibles de produire des toxines. A
cet égard, on pourra se reporter à la publication de Thiery, I. et al. (1992) Journal of American Mosquito Control Association, vol. 8, n 3, 272-276.
Dans le cadre de la définition donnée ci-dessus, une séquence nucléotidique selon l'invention peut coder pour une protéine, un polypeptide ou un peptide nécessaire à l'induction de l'activité larvicide ou/et peut coder pour une protéine, un polypeptide ou un peptide influençant le niveau de l'expression de la toxicité vis-à-vis d'une cible donnée. Comme on l'a dit précédemment, des tests effectués avec des cellules recombinantes naturellement dépourvues d'activité
larvicide, transformées par le plasmide pCBM1 dans des conditions permettant l'expression des gènes contenus dans le fragment d'ADN inséré, peuvent être utilisés comme base de comparaison pour tester l'activité
larvicide de proteines ou parties de protéines exprimées par une séquence nucléotidique selon l'invention.
wo gs/ow~g 216 S 12 '1 PCT/FR94/00768 Les termes "protéine", "polypeptide" et "peptide"
désignent dans le cadre de la demande, toute séquence d'acides aminés, cette séquence pouvant en outre être modifiée par des groupements de nature non protéique.
Pour faciliter la rédaction, ces protéines, polypeptides et peptides pourront être ~e~-oupés dans l'expression "polypeptides".
Selon un mode de réalisation avantageux de 1'invention, une séquence nucléotidique particulière est caractérisée en ce qu'elle hybride avec les quatre sondes 16A, 18A, 66A et 66B, dans des conditions stringentes. Les conditions stringentes dont il est question ici, sont décrites dans le détail dans la partie expérimentale de la présente demande.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, une séquence particulière est caractérisée en ce qu'elle hybride avec les quatre sondes 16A, 18A, 66A et 66B, dans des conditions non stringentes (moins stringentes par rapport aux conditions données plus loin au titre des conditions stringentes).
L'invention concerne en particulier la séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'il s'agit du fragment XbaI de 7 kb du plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le n I-1317.
Selon un mode de réalisation particulier, l'invention a pour objet une sequence de nucléotides choisie parmi les enchaînements désignés par les expressions Seql, Seq2.1, Seq2.2 ou Seq3, représentés à
la figure 6.
L'invention vise également une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle hybride avec l'une des séquences précedemment décrites, en ce qu'elle est présente dans l'ADN d'une bactérie de l'espèce Clostridium bifermentans, et en ce qu'elle code pour une protéine, un polypeptide ou un peptide ayant la capacité de participer à une activité toxique WO95/Oh~9 PCT~94100768
WO95/~W~g PCTtFR94/00768 F~M~NT D'ADN DE CLOSTRIDIUM BIFERMENTANS PORTANT ~E8 GENES CODANT POUR DE8 PRO,~:l~S ASSOCIEES A UNE
A~-.lvl.~ INSECTICIDE.
L'invention est relative à de nouvelles toxines isolees à partir d'une souche de bactérie anaérobie de l'espèce Clostridium bifermentans. La souche CH18 de Clostridium bifermentans serovar malaysia (Cbm), a été
décrite par H. de Barjac et M. Sebald, dans C.R. Acad.
Sci. Paris t. 310, Série III, p. 383-387, 1990.
Elle présente une activité toxique pendant la phase de sporulation par l'intermédiaire de toxines ayant un pouvoir larvicide vis-à-vis de larves d'arthropodes, en particulier d'insectes et notamment vis-à-vis de larves de Diptères, par exemple de larves de Moustiques ou de Simulies. Ces Diptères particuliers sont vecteurs de maladies ou provoquent des nlliCAnc~s.
Jusqu'à présent, on connaissait les toxines spécifiques de bactéries de l'espèce Bacillus thurinqiensis ou de l'espece Bacillus sphaericus pour leur activité entomopathogene et notamment leur activité toxique, vis-à-vis de larves de moustiques (Nicolas (1992). Pes. agropec. bras., Brasilia, abr.
1992, 27, 37-46). En dépit de l'intérêt manifeste de ces toxines de Bacillus pour lutter contre les insectes et notamment les larves d'insectes, la recherche de nouvelles toxines actives vis-à-vis de certains insectes, s'avérait importante notamment dans le but d'offrir des moyens pour lutter contre le risque de développement d'une résistance vis-à-vis de ces produits a activité larvicide. Dans ce contexte, les inventeurs ont mis en évidence chez une bactérie de l'espèce Clostridium bifermentans, l'existence d'une activité larvicide. A cet egard, l'invention propose pour la première fois des toxines presentes chez des bactéries anaérobies, susceptibles d'avoir une activité
WO95/~h~9 PCT~94/00768 216612'1 toxique et en particulier larvicide vis-à-vis d'arthropodes, et en particulier d'insectes de type Diptère. La souche de Clostridium bifermentans serovariété malaysia utilisée présente une inocuité
vis-à-vis des mammifères et des poissons testés ainsi que vis-à-vis de tous les organismes aquatiques en dehors de la cible naturelle de l'activité larvicide de Cbm (Thiery et al. (1992) J.econ.Entomol. 85(5), 1618-1623). L'existence de l'activité larvicide de Cbm a déjà été observée et associée dans l'art antérieur avec les cellules sporulantes (Charles et al. (199O) Res. Microbiol. 141, 721d-733). Il a également été noté
que cette activité diminue très fortement après la lyse cellulaire en raison de l'inactivation par des protéases cellulaires (Nicolas et al (1990). Appl.
Microbiol. Biotechnol. 34, 36-41).
L'invention a donc pour objet des séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides susceptibles de participer à l'activité toxique vis-à-vis de larves d'arthropodes et en particulier d'insectes, notamment de Diptères tels que les Moustiques ou les Simulies.
L'invention vise également ces polypeptides ainsi que des cellules recombinantes contenant les séquences nucléotidiques et les fragments de nucléotides de l'invention, dans des conditions permettant leur expression.
Entrent également dans le cadre de la présente demande, des anticorps reconnaissant les polypeptides de l'invention, ainsi que des compositions à activité
larvicide.
Une sequence nucléotidique de l'invention est caracterisée par les propriétés suivantes :
- elle comprend tout ou partie du fragment d'ADN
XbaI de 7 kb représente à la figure 4A, tel qu'obtenu à
FEUILLE DE REMPL~CEMENT (REGLE 26~
wo gs/oo~g ~ 12 ~ PCT~R94/00768 partir du plasmide pCBMl déposé à la CNCM le 15 Juin 1993 sous le n I-1317 ;
- elle hybride avec la sonde oligonucléotidique 18A (TGT GAA GTI AAT TGT GA) et/ou avec la sonde oligonucléotique 16A (TTT CAT ATI GAA GCI GTI AAT GAA
GG) et/ou avec au moins l'une des sondes 66A (ATG AAT
ACI AAT ATI TTT TCI ACI AA) ou 66B (TC IGG TTC ICC ATA
IAT CCA TTC ATC) dans- des conditions stringentes décrites dans la partie expérimentale :
- elle code pour une protéine, un polypeptide ou un peptide ayant la capacité de participer à l'activité
toxique des produits d'expression du fragment XbaI de 7 kb vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier de larves de Moustiques ou de Simulies.
On définit l'activité toxique dans le cadre de l'invention, par rapport à la "cible" sur laquelle on veut obtenir cette activité. Cette "cible" est de façon générale un arthropode et plus particulièrement un insecte, notamment de la famille des Diptères et par exemple, une larve de Moustique ou Simulie.
On considèrera dans le cadre de l'invention qu'une séquence de nucléotides code pour une protéine ou un polypeptide ayant la capacité de participer à
l'activité toxique des produits d'expression du fragment XbaI de 7 kb contenu dans le plasmide pCBMl déposé à la CNCM sous le n I-1317, des lors que la délétion ou l'altération de cette séquence au sein dudit plasmide entraine une diminution ou une suppression de l'activité toxique vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier de larves de Moustiques ou de Simulies, constatée lorsque ce plasmide est introduit dans une cellule recombinante n'ayant pas naturellement d'activité larvicide, par exemple une cellule de Clostridium bifermentans.
WO95/00~9 PCTIFR94/00768 216612~
D'autres cellules recombinantes, telles que celles décrites par Delécluse A. et al (1988) Mol. Gen. Genet.
214:42-47) peuvent être mises en oeuvre.
L'indication relative à l'activité toxique vis-à-vis des larves de Diptères ne doit en aucune façon être considérée comme restrictive s'agissant du spectre d'action, des moyens de l'invention. Elle constitue uniquement une référence pour l'évaluation de l'activité des produits de l'invention.
L'activité toxique peut être évaluée en mesurant la LC50 (dose léthale pour 50% des insectes ou plus généralement de la "cible" sur laquelle on veut évaluer l'activité toxique).
Différents tests ont déjà été proposés dans l'art antérieur pour détecter l'activité larvicide de souches de bactéries susceptibles de produire des toxines. A
cet égard, on pourra se reporter à la publication de Thiery, I. et al. (1992) Journal of American Mosquito Control Association, vol. 8, n 3, 272-276.
Dans le cadre de la définition donnée ci-dessus, une séquence nucléotidique selon l'invention peut coder pour une protéine, un polypeptide ou un peptide nécessaire à l'induction de l'activité larvicide ou/et peut coder pour une protéine, un polypeptide ou un peptide influençant le niveau de l'expression de la toxicité vis-à-vis d'une cible donnée. Comme on l'a dit précédemment, des tests effectués avec des cellules recombinantes naturellement dépourvues d'activité
larvicide, transformées par le plasmide pCBM1 dans des conditions permettant l'expression des gènes contenus dans le fragment d'ADN inséré, peuvent être utilisés comme base de comparaison pour tester l'activité
larvicide de proteines ou parties de protéines exprimées par une séquence nucléotidique selon l'invention.
wo gs/ow~g 216 S 12 '1 PCT/FR94/00768 Les termes "protéine", "polypeptide" et "peptide"
désignent dans le cadre de la demande, toute séquence d'acides aminés, cette séquence pouvant en outre être modifiée par des groupements de nature non protéique.
Pour faciliter la rédaction, ces protéines, polypeptides et peptides pourront être ~e~-oupés dans l'expression "polypeptides".
Selon un mode de réalisation avantageux de 1'invention, une séquence nucléotidique particulière est caractérisée en ce qu'elle hybride avec les quatre sondes 16A, 18A, 66A et 66B, dans des conditions stringentes. Les conditions stringentes dont il est question ici, sont décrites dans le détail dans la partie expérimentale de la présente demande.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, une séquence particulière est caractérisée en ce qu'elle hybride avec les quatre sondes 16A, 18A, 66A et 66B, dans des conditions non stringentes (moins stringentes par rapport aux conditions données plus loin au titre des conditions stringentes).
L'invention concerne en particulier la séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'il s'agit du fragment XbaI de 7 kb du plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le n I-1317.
Selon un mode de réalisation particulier, l'invention a pour objet une sequence de nucléotides choisie parmi les enchaînements désignés par les expressions Seql, Seq2.1, Seq2.2 ou Seq3, représentés à
la figure 6.
L'invention vise également une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle hybride avec l'une des séquences précedemment décrites, en ce qu'elle est présente dans l'ADN d'une bactérie de l'espèce Clostridium bifermentans, et en ce qu'elle code pour une protéine, un polypeptide ou un peptide ayant la capacité de participer à une activité toxique WO95/Oh~9 PCT~94100768
2~661~ ~
vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier vis-à-vis de larves de Moustiques ou de Simulies.
Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être isolées par exemple à partir de bactéries anaérobies de l'espèce Clostridium bifermentans et en particulier à partir de la souche Clostridium bifermentans malaysia. Elles peuvent également être synthétisées par voie chimique selon les techniques classiques.
Par ailleurs, ces séquences nucléotidiques peuvent être constituées par de l'ADN simple ou double brin, par de l'ADNc ou encore par de l'ARN.
L'invention a également pour objet selon un mode de réalisation particulier, une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle contient des fragments codant pour les séquences d'acides aminés suivantes :
M N T N I F S T N L et/ou pour N N D E W I Y G E P D S S N I et/ou pour M N N (X) C E V N C E (X) T et/ou pour N A S L T W G K et/ou pour F E L et/ou pour Q W V K et/ou pour E N T A S G T E et/ou pour I E Y H N N L R et/ou pour A Y (R) Q W V K F H I E A V N E G L K I et/ou pour D I P I S P E D I S K.
L'identification des sequences d'acides aminés est effectuée en ayant recours au code à une lettre pour la désignation des acides aminés.
L'invention se rapporte aussi à un fragment de nucléotides contenu dans l'une des séquences ci-dessus définies, caractérisé par les propriétes suivantes :
- il comprend le fragment XbaI-EcoRV du fragment XbaI de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMB1 dépose à la CNCM sous le n I-1317, FEUILLE DE REMPLACEMENT ~REGLE 26) WO 95/OK~g ~16 612 ~1 PCT~94/00768 - il a une taille d'environ 1,8 kb et il code pour une protéine ayant un poids moléculaire de 66 kDa.
Un fragment de nucléotides préféré codant pour une protéine de 66 kDa est caractérisé en ce qu'il contient une séquence codant pour l'enchaînement d'acides aminés M N T N I F S T N L à son extrémité NH2-terminale, et une séquence codant pour l'enchaînement d'acides aminés N N D E W I Y G E P D S S N I comme fragment interne.
Un autre fragment de nucléotides selon l'invention, contenu dans l'une des séquences précédemment définies, est caractérisé par les propriétés suivantes :
- il hybride dans des conditions stringentes avec la sonde 16A ;
- il est présent dans le fragment XbaI de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le n I-1317 ;
- il a une taille d'environ 0,5 kb ;
- il code pour une protéine P16 ayant un poids moléculaire d'environ 16 kDa.
Un fragment préféré codant pour une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 16 kDa (protéine P16) est en outre caractérisé en ce qu'il contient une séquence codant pour l'enchainement d'acides aminés A Y
(R) Q W V K F H I E A V N E G L K I à son extrémité
NH2-terminale et une séquence codant pour l'enchainement d'acides aminés D I P I S P E D I S K en tant que fragment interne.
Un autre fragment de nucléotides selon l'invention contenu dans l'une des séquences precédentes, est caractérisé en ce qu'il code pour une protéine P20 ayant un poids moléculaire d'environ 20 kDa, précurseur de la protéine P16, P20 etant synthétisée pendant la phase de sporulation de bactéries de l'espece C.
bifermentans, en particulier de Cbm.
FE'~'ILLE DE REMPLACEMENT (~EG!E 26) W095/OK~9 PCT/FR94/00768 21 6~1~4 -L'invention a également pour objet un fragment de nucléotides contenu dans l'une des séquences precédentes, caractérisé par les propriétés suivantes :
- il hybride dans des conditions stringentes avec la sonde 18A ;
- il est présent dans le fragment XbaI de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le n I-1317 ;
- il a une taille d'environ 0,55 kb ;
- il code pour une protéine P18 ayant un poids moléculaire d'environ 18 kDa.
Un tel fragment peut de façon préférée être caractérisé en ce qu'il code pour une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 18 kDa et en ce qu'il contient une séquence codant pour l'enchainement d'acides aminés M N N (X) C E V N C E (X) T à son extrémité NH2-terminale et des séquences codant pour les enchaînements d'acides aminés N A S L T~W G K, F E
L, Q W V K, E N T A S G T E, et I E Y H N N L R en tant que fragments internes.
Font également partie de l'invention des vecteurs recombinants caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence nucléotidique ou un fragment de nucléotides répondant aux définitions précédentes, cette séquence ou ce fragment étant inséré en un site non essentiel pour la réplication du vecteur. Avantageusement ces vecteurs sont des plasmides.
Un vecteur particulier est caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pCBMl déposé a la CNCM sous le n I-1317.
Un autre vecteur recombinant selon l'invention, est le plasmide pHT316 résultant de l'introduction dans le plasmide pHT315 (Arantes et Lereclus, 1991, Gene, 108: 115-119), d'un fragment BamHI-EcoRI de 0,5 kb (Nicolas et al (1993) FEMS Microbiol. Letter 106, 275-280) contenant le promoteur de la cytolysine de B.
FEIJ'' LE DE RE~ilPLACEMENT (RE~LE 26) WO95/OK~9 ~ PCT~94/00768 thuringiensis (Ward et Ellar, 1986, J. Mol. Biol., l91:1-11). Ce vecteur peut être modifié par la séquence Cbm.
Le plasmide pHT316 permet avantageusement la surproduction chez Bt, des protéines de Cbm, toxiques vis-à-vis des insectes.
L'invention a également pour objet des cellules hôtes recombinantes procaryotes ou eucaryotes, caractérisées en ce qu'elles contiennent une séquence ou un fragment répondant à l'une des définitions données ci-dessus, ou encore un vecteur de l'invention dans des conditions permettant le clonage et/ou l'expression de ladite séquence ou dudit fragment.
Un hôte particulier peut être une cellule bactérienne, par exemple une souche de Clostridium bifermentans, une souche de Bacillus thurinqiensis ou une souche de Bacillus sphaericus.
S'agissant de B. thuringiensis, on fera référence à la publication de Lereclus D. et al (1989), FEMS
Microbiology Letters 60, 211-218, dans laquelle la technique de transformation (par introduction des gènes de toxines dans Bt) de B. thuringiensis est décrite.
S'agissant de B. sphaericus, on se reportera par exemple à la publication de Taylor L.D. et al (1990) FEMS Microbiology Letters 66, 125-128.
Une autre cellule selon l'invention peut être une cellule eucaryote par exemple une cellule végétale.
L'invention a également pour objet un polypeptide ou une composition de polypeptides, caractérisé en ce qu'il est code par une séquence nucléotidique ou un fragment de nucléotides défini(e) précédemment.
Un polypeptide particulier selon l'invention est impliqué dans une activité larvicide vis-à-vis de - larves de Dipteres, notamment de Moustiques ou de Simulies, et est caractérisé par les proprietés suivantes :
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO95/~h~9 PCT/FR94/00768 2~6124 - il est caractéristique d'une bactérie anaérobie de l'espèce Clostridium bifermentans ;
- il ne produit pas de réaction immunologique avec des sérums dirigés contre les protéines du cristal de B. thuringiensis israelensis ou de B. sphaericus.
Les polypeptides de l'invention comprennent notamment une première protéine caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 16 kDa et en ce qu'elle est le produit de l'expression dans une cellule recombinante d'un fragment de nucléotides hybridant avec l'oligonucléotide 16A dans des conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence NsiI-XbaI du fragment XbaI contenu dans le plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le numero I-1317.
Une autre protéine de l'invention est caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 18 kDa et en ce qu'elle est le produit de l'expression dans une cellule recombinante d'un fragment de .nucléotides hybridant avec l'oligonucléotide 18A dans des conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence EcoRI-XbaI du fragment XbaI contenu dans le plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le numéro I-1317 et décrit à la figure 4A.
Une troisième protéine selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 66 kDa et en ce qu'elle est le produit de l'expression dans une cellule recombinante d'un fragment de nucléotides hybridant avec l'oligonucleotide 66A et/ou 66B dans des conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence XbaI-EcoRI du fragment XbaI contenu dans le plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le numéro I-1317.
L'invention concerne aussi des fragments polypeptidiques des proteines P16, P18 ou P66, ou tout fragment tel qu'obtenu à partir des protéines précédemment définies dès lors qu'il est impliqué dans FE.JI' ~ E DE REMPLACEMENT (REGLE 26) W095/0063g ~ 12 ~ PCT~R94/00768 une activité larvicide vis-à-vis de larves de Diptères notamment de Moustiques ou de Simulies.
Entrent notamment dans le cadre de l'invention, les séquences polypeptidiques codées par les séquences de nucléotides Seql, Seq2.1, Seq2.2, Seq3 ou Seq4.
Une autre séquence d'intérêt est la séquence d'acides aminés correspondant au gène cbmll telle que représentée à la figure 6_ Selon un autre mode de réalisation de l'invention, un polypeptide de l'invention est caractérisé en ce qu'il est reconnu par des anticorps dirigés contre la protéine P16 et/ou par des anticorps dirigés contre la protéine P18 et/ou par des anticorps dirigés contre la protéine P66.
Des polypeptides particuliers de l'invention sont par exemple des polypeptides comprenant une séquence d'acides aminés codée par l'un des enchaînements Seql, Seq2.1, Seq2.2 ou Seq3 et reconnus respectivement par des anticorps anti-protéine P66 pour le polypeptide comprenant au moins l'une des séquences Seql, Seq2.1 ou seq2.2 et par des anticorps anti-protéine P16 ou anti-protéine P18 pour le polypeptide comprenant la séquence Seq3.
La demande concerne également un polypeptide caractérisé en ce qu'il est modifié par addition, délétion, substitution d'acides aminés des lors qu'il conserve la capacité du polypeptide correspondant non modifié à intervenir dans l'activité toxique vis-a-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies.
La présente demande vise aussi des compositions de polypeptides caractérisées en ce qu'elles comprennent par exemple la protéine P16 et la protéine P18 ou en ce qu'elles comprennent les protéines P16, P18 et P66.
Ces protéines sont de préférence sous forme purifiée, le cas échéant co-purifiee, soit après W095/O~g - PCT/FR94/00768 l ?~ 'i isolement à partir d'une souche, soit après expression dans un hôte cellulaire recombinant.
L'invention concerne aussi un extrait protéique ayant une activité larvicide vis-à-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies tel qu'obtenu par :
- culture de Clostridium bifermentans à 34-C en anaérobiose en milieu TYG dans un courant gazeux contenant 5% H2, 5 CO2 et 90% N2, - récupération de la culture en fin de sporulation, environ après 16 h, - lavage de la culture avec NaCllM, - rinçage 2 fois avec un tampon TE, - récuperation du culot qui constitue l'extrait.
Une composition particulière de polypeptides selon l'invention peut aussi être caractérisée en ce qu'elle a l'activité larvicide d'un extrait brut tel que défini ci-dessus.
La présente demande a également pour objet des anticorps monoclonaux dirigés contre une protéine selon les définitions ci-dessus données.
Elle vise également un antisérum polyclonal caractérisé en ce qu'il est dirige contre une protéine de l'invention ou contre une composition de ces protéines ou encore contre un extrait tel que décrit ci-dessus.
Les séquences nucléotidiques ou fragments selon l'invention permettent également la préparation de sondes nucléotidiques, obtenues par marquage selon les techniques classiques des fragments ou sequences ci-dessus décrits.
Entrent également dans le cadre de l'invention, des compositions à activité larvicide comprenant à
titre de principe actif, un ou plusieurs polypeptides selon l'une quelconque des définitions données précédemment.
WO gS/OK~9 ~ 2 l1 PCTn~94/00768 D'autres compositions à activité larvicide selon l'invention peuvent également être caractérisées en ce qu'elles comprennent à titre de principe actif, des cellules recombinantes répondant aux définitions précédemment données.
De telles compositions peuvent en outre comporter des cellules recombinantes modifiées par des séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides à activité
larvicide de B. thurinqiensis et/ou de B. sphaericus.
On peut également envisager selon l'invention de préparer des cellules recombinantes contenant à la fois des gènes ou séquences nucléotidiques ou fragments codant pour une protéine répondant aux définitions ci-dessus et contenant en outre une séquence à activité
larvicide de B. thurinqiensis et/ou de B. sphaericus.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures qui suivent.
Fiqures 1 à 3: Relations immunoloqiques, distribution et cinétique de synthèse de P66, P18 et P16.
Fiqure 1 : SDS-PAGE de l'extrait toxique de Cbm. Les poids moléculaires de protéines standard sont indiqués dans la marge droite (en kDa).
Fiqure 2 : Détection des protéines P66, P18 et P16 dans C et dans des souches de C. bifermentans non toxiques. Des échantillons de 100 ~1 de cultures sporulées, ont été soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE), transférées sur une membrane de nitrocellulose et soumis à immunodétection avec des IgG purifiées par affinité dirigées contre P66 (A66), P18 (A18) ou P16 (A16). Puits a, Cbm; puits b, souche ATCC 638; puits c, souche 744-83; puits d, souche VPI 4407; puits e, souche VPI 4413A.
W095/0h~9 PCT~94/00768 2166:L2ll Fiqure 3 : Cinétique de synthèse de P66, P18 et P16 au cours de la sporulation de Cbm, à 34C (haut) ou à 42C
(bas), en conditions anaérobies. Des aliquots de 100 ~1 de culture ont été soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE), transférés sur une membrane de nitrocellulose et soumis à immunodétection avec des IgG purifiées par affinité, dirigées contre P66 (A66), P18 (A18) ou P16 (A16). Temps de culture en heures : a, 4.5; b, 6 (correspondant au to de sporulation); c, 7.5; d, 9; e, 10.5; f, 13; g, 30. Les poids moleculaires de protéines standard sont indiqués dans la marge (en kDa).
Fiqures 4A et 4B : Structure du plasmide pCBMl et carte de restriction du fragment XbaI.
Fragment XbaI : Bg : BqlII; N : NsiI; P : PvuII; R :
EcoRI; Rv : EcoRV; X : XbaI
Site de clonage :
H : HindIII; S : SphI; Ps : PstI; Sal :~SalI; Bm :
BamHI; Sm : SmaI; K : KpnI; Sst : SstI; R : EcoRI.
Les parties hachurées à droite et à gauche du fragment XbaI sont des fragments du plasmide vecteur pHT304 (Arantès 0. et al (1991), Gene, 108, p. 115-119).
Les fragments sur lesquels hybrident les sondes oligonucléotidiques sont représentés en traits hachurés, sous le fragment XbaI.
La flèche correspond à l'extrémité 5' du gène de P16 hybridant avec la sonde 16A.
Enzymes n'ayant pas de sites de restriction dans le fraqment XbaI :
BamHI, HindIII, PstI, SstI, SalI, SmaI.
Fiqure 5 : Localisation des oligonucléotides utilisés pour le séquençage des séquences lues.
Séquences des oligonucléotides utilisés :
16A': complémentaire 16 A: : acc cat tgt cta tat gc 16B : oligon 16 B non dégénéré: ggagat atc gga atg tc 16B': complémentaire 16 B' : ccg ata tct cct gaa ga FEUlLLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) W095/~h~9 2 16 6 12 ~ PCT~94/00768 18 B : oligo 18 B non dégénéré : tct gta ccg gaa gca gt 18 B': complémentaire 18 b : gct tcc ggt aca gaa gg 66 C-R: aac cct aca tct gtt aa 66 D-A: tac tac cat agt ttc ca 66 E-A: tgc aaa gcc aag ttg at Légende fragment Xba inséré, issu de l'ADN de Cbm Amorce "reverse" R-48 Amorce "universelle" - 40 Polylinker du pUC 19 Amorces nucléotidiques de synthèse () Vecteur navette pHT 304 Fiqure 6 : Séquences de nucléotides lues.
6A: Seq.l, lue à l'aide de l'amorce réverse R-48.
6B: Seq.2.1, lue à l'aide de l'amorce 66C-R.
6C et 6D: Seq.2.2, lue avec les amorces 66B, 66D-A et 66E-A.
6E à 6G: Gène Cbm, lu avec les diverses amorces "16 et 18".
6H et 6J:-SEq4, lue avec l'amorce universelle R-40.
Fiqure 7: Séquence d'acides aminés correspondant au gène Cbmll et localisation des séquences NH2-terminales et internes des protéines P18 et P16.
Figure 8 : Localisation des copies de cbm 11 sur le fragment XbaI.
Figure 9A et 9B : Localisation du fragment XbaI sur le plasmide résident.
Ligne 1: Marqueur de taille CCC de 16 a 2,06 Kb Ligne 2: Préparation des plasmides de Cbm CH 18, natifs Ligne 3: Préparation des plasmides de Cbm CH 18, hydrolysés par Xba Sonde utilisée : pCBMl Fiqure 10 : Expression des gènes introduits dans pCBMl, chez E.coli Ligne 1 : E.coli + pHT 304 (vecteur navette utilisé) Ligne 2 : E.coli + pCBM 1 FEUlLLE DE REMPLA~EMENT (REGLE 26) W095/OW~g PCT~94/00768 ~16~2 l ~
Sonde utilisée : anticorps anti Cbm total.
Fiqures llA, llB et llC : Homologies de séquence trouvées entre la protéine Cbm 11 et les protéines décrites dans la banque de données Swissprot.
MATERIELS ET METHODES
Préparation de l'extrait Un extrait a été préparé à partir d'une culture de Cbm réalisée à 34C en anaérobiose en milieu TYG (à
base de Biotrypcase 3%, extrait de levure 2%, glucose 0,5 a 1%, chlorydrate de cystéine 0,05%) dans un fermenteur ayant une capacité de 6 litres, en présence d'un courant gazeux contenant 5% H2, 5% CO2 et 90% N2.
La culture bactérienne sporulante a été récoltée après 16 h, en fin de phase de sporulation. La culture a ensuite été lavée avec lM NaCl, rincée 2 fois avec 20 mM Tris HCl, 5mM EDTA, pH8 (tampon TE) et {conservée à
-70C jusqu'à l'utilisation. Les culots congelés ont été décongelés resuspendus dans un tampon TE traité
dans un sonicateur pendant une durée totale de 1 minute comprenant un temps réel de sonication de 15 secondes sur la glace (Sonicateur Branson, grande sonde, échelle de sortie 40%, durée du cycle de sonication ("duty cycle": 25%) et centrifugés à 5000 g pendant 15 min. Le surnageant résultant (correspondant à l'extrait brut de protéines) a été recueilli.
Analyse des protéines La concentration en protéines de l'extrait a été
déterminée en utilisant le test Biorad de protéine avec l'albumine sérique bovine comme standard. Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide a été realisee selon la technique de Laemmli, U.K. (1970) (Nature 227, 680-685) sur des gels de polyacrylamide a 13%. Les marqueurs de poids moleculaires utilisés dans cette FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) W095/Oh39 PCT~V4/00768 21~12~
analyse des protéines par SDS-PAGE en conditions dénaturantes sont ceux du kit Pharmacia d'électrophorèse de protéines (LMW Ref. 17-0446-01), contenant les protéines suivantes : phosphorylase B (de masse moléculaire 94000 daltons), albumine (67000), ovalbumine (43000), anhydrase (30000) inhibiteur trypsique (20100) et alpha lactalbumine (14000).
Préparation des antisera contre les protéines de Cbm Des antisera polyclonaux contre l'extrait brut de protéine de Cbm ont été obtenus chez des lapins après deux séries de 10 à 15 microinjections intradermiques de 500 ~g de protéines émulsifiées dans l'adjuvant complet de Freund, à 3 semaines d'intervalle. Les lapins ont reçu des injections sous-cutanées d'une dose de rappel sans adjuvant de Freund, 3 semaines après.
Les IgG ont été purifiées à partir des sérums par précipitation au sulfate d'ammonium et chromatographie sur une colonne DEAE-52 (Whatmann) puis conservés à
4C.
Des antisera polyclonaux contre les polypeptides individualisés dénaturés P66, P18 et P16 ont été
produits chez les lapins selon la manière suivante :
les trois protéines ont été séparées par électrophorèse préparative SDS-PAGE et détectées avec du KCl lM. Les bandes ont été découpées sur les gels et les bandes d'acrylamide découpées ont été rincées avec de l'eau déionisée, puis plongées dans l'eau, émulsifiées avec de l'adjuvant complet de Freund et injectées aux lapins selon la technique décrite précédemment. Apr~es récupération des antisera, les IgG ont été purifiées par affinité sur des bandes de nitrocellulose contenant le polypeptide utilisé pour l'injection aux lapins, selon la technique de Burke et al (1982). EMB0 J. 1, 1621-1628.
FEUI! LE ~E R'-MPLACEM,-NT (REGLE 26) WO95/OW~9 PCT~94/00768 ~ . .
~6612il Hydrolyse enzymatique de l'extrait de Cbm Pour rechercher la toxicité de l'extrait, 500 ~1 d'aliquots de l'extrait (400 ~g) ont été chacun traités pendant deux heures à 37-C avec l'une des enzymes suivantes : protéinase K (EC 3.4.21.14, Boehringer, 40~g/ml), ribonucléase type I-A (EC 3.1.27.5, Sigma, 100 ~g/ml) et déoxyribonucléase I (EC 3.1.21.1, Boehringer, 100 ~g/ml).
L'activité larvicide a été testée sur des larves de Anopheles stephensi au troisième stade larvaire.
Fractionnement de l'extrait protéique Les extraits bruts de protéines ont éte filtrés sur un filtre HA-Millex contenant des pores de 0.45 ~m (Millipore) et soumis à une chromatographie liquide à
haute résolution (FPLC2, Pharmacia). Une chromatographie par échange d'ions a été réalisée sur une colonne Mono Q HR 10/10 équilibrée avec un tampon TE. Les protéines ont été éluées avec un gradient multi-étapes contenant de 0 à lM NaCl. Une filtration sur gel a été réalisée sur une colonne Superdex 200 HiLoad 16/60 dans un tampon TE contenant 150 mM NaCl (tampon TES). Les fractions ont été analysées par électrophorèse (SDS-PAGE) après précipitation des protéines avec 10% d'acide trichloracétique.
Test de neutralisation et immunoprécipitation La capacité des différents antisera d'inhiber l'activité larvicide de l'extrait a été testée selon la méthode suivante : des dilutions en série de l'extrait ont été incubées avec un volume fixe d'IgG anti-extrait dans un tampon TE à 20C pendant 1 heure. La toxicité
des échantillons et des échantillons de contrôle non-traités a été testée en utilisant des larves de A.
stephensi. Des tests de neutralisation ont été
W095/OW~9 21~ l PCT~94/00768 également réalisés dans les mêmes conditions avec les antisera ou les anticorps purifiés par affinité, dirigés contre les protéines dénaturées P66, P18 ou Pl6. Les protéines ont été immunoprécipitées à partir de l'extrait avec les antisera dirigés contre l'extrait ou contre les protéines individuelles P66, P18 ou P16 dénaturées par la technique de Howe et al, ((1982).
Mol. Gen. Genet. 186, 525-~30), en utilisant des billes de Protéine A Sepharose (Sigma) comme porteurs.
Cinétique de la synthèse de P66, P18 et P16 Cbm a poussé dans des flacons scellés de 1 litre, contenant 800 ml de milieu liquide TYG, avec une agitation magnétique douce, soit à 34C soit à 42C.
Des échantillons de 30 ml ont été récupérés à 9o minutes d'intervalles sans renouveler la teneur en gaz par ponction à travers un bouchon en caoutchouc. Les échantillons ont été centrifugés, rincés comme décrit précédemment et les culots de centrifugation ont été
gardés a -70C jusqu'à l'analyse de l'activité
larvicide et de la teneur en protéines par électrophorèse SDS-PAGE. Les expériences d'immunodétection ont été réalisées après électrotransfert sur une membrane Hybond-C Super~
(Amersham). P66, P18 et P16 ont été détectées avec les IgG purifiées par affinité dirigées contre chaque protéine (A66, A18 et A16) et visualisées avec un système de détection en Western blot ECL~ (Amersham).
Pour la comparaison, les cultures ont été réalisées à
34C et 42C dans des flacons dans lesquels un échange de gaz était possible.
Criblaqe de P66, P18 et P16 dans des souches C.
bifermentans non larvicides WO95/OK~9 ` PCTn~94/00768 1 2 '~ `
Les souches non larvicides de C. bifermentans (souche type ATCC 638, 744-83, VPI 4407 et VPI 4413A
ont été criblées par immunodétection pour rechercher la présence de P66, P18 et P16. Ces souches ainsi que la souche Cbm ont été cultivées dans des flacons scellés contenant 50 ml de milieu TYG, à 34C et récupérées après 15h lorsque la sporulation était complètement terminée mais avant la lyse cellulaire.
Bioessais sur des larves de moustiques Des échantillons de culture bactérienne ou des extraits de protéine ont été testés sur 20 larves de Culex pipiens au quatrième stade larvaire et/ou de A.
stephensi au troisieme stade larvaire dans des boites en plastique de Petri d'une capacité de 6 ml. Les mortalités ont été enregistrées après 24 h et 48 h d'exposition.
Relations immunologiques avec les toxines de Bacillus Un extrait brut de Cbm a été testé avec des antisera dirigés contre les cristaux de B.
thurinqiensis serovar israelensis 1884, B.
thurinqiensis serovar aizawai 7.29, B. thuringiensis serovar thurinqiensis 1715 et B. thurinqiensis serovar entomocidus HD9, ainsi que des antisera contre les protéines de cristaux de 42 et 51 kDa de B. sphaericus 2362.
RES~LTATS ET DISC~SSION
L'extrait de Cbm contenait trois protéines majeures de poids moléculaires apparents 66, 18 et 16 kDa, désignées par les abréviations P66, P18 et P16, ainsi que différents composants mineurs de nature protéique (Figs. 1 a 3).
W095/~W~9 ~ 6 ~1 2 ~ PCT~94/00768 1. Caractérisation des protéines P66, P18 et P16 L'extrait obtenu est toxique envers les larves des moustiques Culex pipiens, Anopheles stephensi et Aedes aegypti.
Sa LC50 après 48h contre A. stephensi au troisième stade larvaire était de 5 ~g/ml. L'activité larvicide de l'extrait a été perdue après incubation pendant 2h à
37C avec de la protéinase K. Au contraire, aucune inactivation n'a été obtenue avec la DNase ou la RNase.
De plus, l'activité larvicide était totalement inhibée par les IgG dirigées contre l'extrait total. Ainsi l'activité larvicide est bien due à des toxines de nature protéique au moins en partie.
Des antisera dirigés contre les protéines du cristal entomopathogène de B. thurinqiensis ou B.
sphaericus n'ont pas donné lieu à une réaction croisée avec les protéines de l'extrait de Cbm, indiquant que les toxines de Cbm appartiennent à une nouvelle classe de toxines insecticides.
P66, P18 et P16 sont les composants majoritaires des extraits toxiques de Cbm.
P66, P18 ou P16 ne sont pas immunologiquement apparentées (Figure 2, lignes a). P18 et P16 étaient seulement présentes dans Cbm alors qu'une protéine de 66 kDa immunologiquement apparentée à P66 de Cbm a été
détectée dans 4 souches de C. bifermentans non-entomopathogènes testées (Figure 2, lignes b à e).
La synthèse de P18 et de P16 dans une culture effectuée à 34C, était concommitante avec la sporulation de Cbm (figure 3) et l'apparition de l'activité larvicide. P16 etait synthétisée sous forme d'un precurseur de 20 kDa (P20), progressivement converti en un polypeptide de 16 kDa lors de la lyse cellulaire (Fig. 3).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO95/OK~9 PCTA~94/00768 216612ll P18 et P20/P16 ne sont pas détectées immunologiquement dans les souches de C. bifermentans dépourvues d'activité larvicide (Fig 2).
P18 et P20/P16 sont très faiblement détectées dans Cbm cultivée à 42C, dans les conditions où la bactérie n'est pas toxique (Fig 3).
P66 était détectée dans des cellules de Cbm pendant le stade végétatif et durant la sporulation.
Dans les cellules sporulantes, d'autres polypeptides immunologiquement apparentés à P66 étaient détectés, allant de 25 à 66 kDa (figure 3); ces polypeptides pourraient être des produits de dégradation de P66.
La culture de Cbm a poussé à 42C sans échange gazeux ; elle n'était pas toxique et contenait seulement des traces de P18 et P16. Dans cette culture, P66 était également synthétisée pendant la phase végétative mais aucune protéine de poids moléculaire inférieur n'a été détectée (Figure 3). Dans les cultures avec échange gazeux, on ne relevait pas de différence dans l'activité larvicide, la synthèse de P66, P18 et P16 et la lyse du sporange, entre les cultures effectuées à 34C ou à 42C.
Des essais de purification de chaque protéine ont permis les constatations suivantes : la plus grande partie de la toxicité était perdue après filtration, avant la réalisation d'une chromatographie FPLC~, bien que les extraits filtrés et non filtrés aient eu les mêmes profils protéiques. Ceci suggère que l'activité
larvicide pourrait être liée à la présence d'aggrégats proteiques ou de particules. Ceci a également été
observé pour les toxines de Bti ou de B. sphaericus qui sont beaucoup plus actives sous forme d'aggrégats qu'en solution (Schnell et al (1984). Science 223, 1191-1193 et Nicolas et al (1993). FEMS Lett. 106, 275-280). En outre, avec la chromatographie FPLC~, soit sur colonne d'echange d'ions, soit par filtration sur gel, les FEUlLLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) wo gsto~g ~16 612 I PCTtFR94/00768 trois polypeptides P66, P18 et P16 coéluaient en différents points. Des tests d'immunoprécipitation ont montre que chacun des antisera individuels dirigés contre P66, P18 ou P16 étaient capables de précipiter les trois produits ensemble comme le faisaient des anticorps préparés contre l'extrait brut. Des tests de chromatographie et d'immunoprécipitation ont suggéré
que P66, P18 et P16 sont a-ssemblés en un complexe.
Des IgG dirigées contre les protéines P66, P18 et/ou P16 denaturées ne neutralisaient pas la toxicité;
en revanche des anticorps contre la fraction brute de l'extrait neutralisaient la toxicité. Il est concevable que des IgG dirigées contre les protéines dénaturées étaient capables de reconnaitre le complexe P66-P18-P16, mais ne reconnaissaient pas des épitopes ou des domaines impliqués dans l'activité larvicide.
Ces expériences ont montré l'implication de P18 et P16 dans l'activité larvicide. En effet, dans des cultures de Cbm effectuées à 34-C, les deux protéines sont synthétisées concommitamment avec l'apparition de l'activité larvicide. Elles sont absentes des souches non toxiques de C. bifermentans et présentes à un niveau très bas dans des cellules non toxiques de Cbm cultivées à 42-C. L'activité larvicide de Cbm a 42 C
est modulée par les conditions d'échange de gaz entre la culture et le mélange de gaz anaérobique. L'absence d'activité larvicide dans des flacons scellés, sans échange gazeux est corrélée avec la faible synthèse et/ou une rapide dégradation de P18 et P20/P16.
2. Clonaqe des qènes codant pour P66, P18 et P16 Des séquences partielles en acides aminés de P66, P18 et P16 ont été déterminées par microséquençage.
Séquences en acides aminés des protéines P66, P18 et P16 WO95/Oh~9 PCT~94/00768 2~6612~ 24 Ces séquences ont été obtenues par microsequençage, selon des techniques couramment pratiquées par les laboratoires de microséquençage.
Pour chaque protéine ont été réalisées i) la séquences NH2-terminale et ii) une ou plusieurs séquences de fragments internes obtenus par hydrolyse trypsique de la protéine. Les séquences ont été déterminées avec un séquenceur Applied Biosystems 470, a partir des protéines séparées sur SDS-PAGE et transférées sur membrane de PVDF Immobilon (Millipore).
- séquence NH2-terminale M N T N I F S T N L
- interne 1 N N D E W I Y G E P D S S N I
- NHz-terminale M N N (X) C E V N C E (X) T
- interne 1 N A S L T W G K
- interne 2 F E L
- interne 3 Q W V K
- interne 4 E N T A S G T E
- interne 25 I E Y H N N L R
- NH2-terminale A Y (R) Q W V K F H I E A V N E G L K I
- interne 1 D I P I S P E D I S K
(X) : indéterminé
Les sondes oligonucléotidiques ont été faites à partir des séquences soulignées Protéine Acides aminés Sonde oligonucléotidique 5'-3' P66, NH2-term. N N T N I F S T N 66A=ATG AAT ACI AAT ATI
TTT TCI ACI AA (26mer) P66, interne D E W I Y G E P D 66B =TC IGG TTC ICC ATA
WO95/O~g PCT~4/00768 1 2 ~
IAT CCA TTC ATC (26mer) P18, NH2-term. C E V N C E18A=TGT GAA GTI AAT TGT
GA (17 mer) P16, NH2-term. F H I E A V N E G 16A= TTT CAT ATI GAA GCI
GTI AAT GAA GG (26mer) I=DMT dInosine cyan~ethyl phosphoramidite ~=séquence complémentaire A partir de ces informations des sondes oligonucléotidiques ont été synthétisées et utilisées pour cribler une banque d'ADN total de Cbm hydrolysé
par l'enzyme XbaI, construite dans le plasmide navette pHT304 (Arantès ~ Lereclus, Gene. 1991. 108 : 115-119).
Sélection du plasmide pCBMl Une banque d'ADN a été construite dans un vecteur navette- pHT304, construit par O. Arantès et D.
Lereclus, à parti~ d'un plasmide résident de B.
thurinqiensis pHT 1030 et de pUCl9, capable de se répliquer dans E. coli et dans les bactéries à gram positif. L'ADN total de Cbm a été hydrolysé par XbaI, transféré sur membrane Hybond N+ (Amersham) après électrophorèse sur gel d'agarose, et hybridé avec chacune des sondes synthétisées, marquées à l'extrémité
vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier vis-à-vis de larves de Moustiques ou de Simulies.
Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être isolées par exemple à partir de bactéries anaérobies de l'espèce Clostridium bifermentans et en particulier à partir de la souche Clostridium bifermentans malaysia. Elles peuvent également être synthétisées par voie chimique selon les techniques classiques.
Par ailleurs, ces séquences nucléotidiques peuvent être constituées par de l'ADN simple ou double brin, par de l'ADNc ou encore par de l'ARN.
L'invention a également pour objet selon un mode de réalisation particulier, une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle contient des fragments codant pour les séquences d'acides aminés suivantes :
M N T N I F S T N L et/ou pour N N D E W I Y G E P D S S N I et/ou pour M N N (X) C E V N C E (X) T et/ou pour N A S L T W G K et/ou pour F E L et/ou pour Q W V K et/ou pour E N T A S G T E et/ou pour I E Y H N N L R et/ou pour A Y (R) Q W V K F H I E A V N E G L K I et/ou pour D I P I S P E D I S K.
L'identification des sequences d'acides aminés est effectuée en ayant recours au code à une lettre pour la désignation des acides aminés.
L'invention se rapporte aussi à un fragment de nucléotides contenu dans l'une des séquences ci-dessus définies, caractérisé par les propriétes suivantes :
- il comprend le fragment XbaI-EcoRV du fragment XbaI de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMB1 dépose à la CNCM sous le n I-1317, FEUILLE DE REMPLACEMENT ~REGLE 26) WO 95/OK~g ~16 612 ~1 PCT~94/00768 - il a une taille d'environ 1,8 kb et il code pour une protéine ayant un poids moléculaire de 66 kDa.
Un fragment de nucléotides préféré codant pour une protéine de 66 kDa est caractérisé en ce qu'il contient une séquence codant pour l'enchaînement d'acides aminés M N T N I F S T N L à son extrémité NH2-terminale, et une séquence codant pour l'enchaînement d'acides aminés N N D E W I Y G E P D S S N I comme fragment interne.
Un autre fragment de nucléotides selon l'invention, contenu dans l'une des séquences précédemment définies, est caractérisé par les propriétés suivantes :
- il hybride dans des conditions stringentes avec la sonde 16A ;
- il est présent dans le fragment XbaI de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le n I-1317 ;
- il a une taille d'environ 0,5 kb ;
- il code pour une protéine P16 ayant un poids moléculaire d'environ 16 kDa.
Un fragment préféré codant pour une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 16 kDa (protéine P16) est en outre caractérisé en ce qu'il contient une séquence codant pour l'enchainement d'acides aminés A Y
(R) Q W V K F H I E A V N E G L K I à son extrémité
NH2-terminale et une séquence codant pour l'enchainement d'acides aminés D I P I S P E D I S K en tant que fragment interne.
Un autre fragment de nucléotides selon l'invention contenu dans l'une des séquences precédentes, est caractérisé en ce qu'il code pour une protéine P20 ayant un poids moléculaire d'environ 20 kDa, précurseur de la protéine P16, P20 etant synthétisée pendant la phase de sporulation de bactéries de l'espece C.
bifermentans, en particulier de Cbm.
FE'~'ILLE DE REMPLACEMENT (~EG!E 26) W095/OK~9 PCT/FR94/00768 21 6~1~4 -L'invention a également pour objet un fragment de nucléotides contenu dans l'une des séquences precédentes, caractérisé par les propriétés suivantes :
- il hybride dans des conditions stringentes avec la sonde 18A ;
- il est présent dans le fragment XbaI de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMBl déposé à la CNCM sous le n I-1317 ;
- il a une taille d'environ 0,55 kb ;
- il code pour une protéine P18 ayant un poids moléculaire d'environ 18 kDa.
Un tel fragment peut de façon préférée être caractérisé en ce qu'il code pour une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 18 kDa et en ce qu'il contient une séquence codant pour l'enchainement d'acides aminés M N N (X) C E V N C E (X) T à son extrémité NH2-terminale et des séquences codant pour les enchaînements d'acides aminés N A S L T~W G K, F E
L, Q W V K, E N T A S G T E, et I E Y H N N L R en tant que fragments internes.
Font également partie de l'invention des vecteurs recombinants caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence nucléotidique ou un fragment de nucléotides répondant aux définitions précédentes, cette séquence ou ce fragment étant inséré en un site non essentiel pour la réplication du vecteur. Avantageusement ces vecteurs sont des plasmides.
Un vecteur particulier est caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pCBMl déposé a la CNCM sous le n I-1317.
Un autre vecteur recombinant selon l'invention, est le plasmide pHT316 résultant de l'introduction dans le plasmide pHT315 (Arantes et Lereclus, 1991, Gene, 108: 115-119), d'un fragment BamHI-EcoRI de 0,5 kb (Nicolas et al (1993) FEMS Microbiol. Letter 106, 275-280) contenant le promoteur de la cytolysine de B.
FEIJ'' LE DE RE~ilPLACEMENT (RE~LE 26) WO95/OK~9 ~ PCT~94/00768 thuringiensis (Ward et Ellar, 1986, J. Mol. Biol., l91:1-11). Ce vecteur peut être modifié par la séquence Cbm.
Le plasmide pHT316 permet avantageusement la surproduction chez Bt, des protéines de Cbm, toxiques vis-à-vis des insectes.
L'invention a également pour objet des cellules hôtes recombinantes procaryotes ou eucaryotes, caractérisées en ce qu'elles contiennent une séquence ou un fragment répondant à l'une des définitions données ci-dessus, ou encore un vecteur de l'invention dans des conditions permettant le clonage et/ou l'expression de ladite séquence ou dudit fragment.
Un hôte particulier peut être une cellule bactérienne, par exemple une souche de Clostridium bifermentans, une souche de Bacillus thurinqiensis ou une souche de Bacillus sphaericus.
S'agissant de B. thuringiensis, on fera référence à la publication de Lereclus D. et al (1989), FEMS
Microbiology Letters 60, 211-218, dans laquelle la technique de transformation (par introduction des gènes de toxines dans Bt) de B. thuringiensis est décrite.
S'agissant de B. sphaericus, on se reportera par exemple à la publication de Taylor L.D. et al (1990) FEMS Microbiology Letters 66, 125-128.
Une autre cellule selon l'invention peut être une cellule eucaryote par exemple une cellule végétale.
L'invention a également pour objet un polypeptide ou une composition de polypeptides, caractérisé en ce qu'il est code par une séquence nucléotidique ou un fragment de nucléotides défini(e) précédemment.
Un polypeptide particulier selon l'invention est impliqué dans une activité larvicide vis-à-vis de - larves de Dipteres, notamment de Moustiques ou de Simulies, et est caractérisé par les proprietés suivantes :
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO95/~h~9 PCT/FR94/00768 2~6124 - il est caractéristique d'une bactérie anaérobie de l'espèce Clostridium bifermentans ;
- il ne produit pas de réaction immunologique avec des sérums dirigés contre les protéines du cristal de B. thuringiensis israelensis ou de B. sphaericus.
Les polypeptides de l'invention comprennent notamment une première protéine caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 16 kDa et en ce qu'elle est le produit de l'expression dans une cellule recombinante d'un fragment de nucléotides hybridant avec l'oligonucléotide 16A dans des conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence NsiI-XbaI du fragment XbaI contenu dans le plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le numero I-1317.
Une autre protéine de l'invention est caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 18 kDa et en ce qu'elle est le produit de l'expression dans une cellule recombinante d'un fragment de .nucléotides hybridant avec l'oligonucléotide 18A dans des conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence EcoRI-XbaI du fragment XbaI contenu dans le plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le numéro I-1317 et décrit à la figure 4A.
Une troisième protéine selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 66 kDa et en ce qu'elle est le produit de l'expression dans une cellule recombinante d'un fragment de nucléotides hybridant avec l'oligonucleotide 66A et/ou 66B dans des conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence XbaI-EcoRI du fragment XbaI contenu dans le plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le numéro I-1317.
L'invention concerne aussi des fragments polypeptidiques des proteines P16, P18 ou P66, ou tout fragment tel qu'obtenu à partir des protéines précédemment définies dès lors qu'il est impliqué dans FE.JI' ~ E DE REMPLACEMENT (REGLE 26) W095/0063g ~ 12 ~ PCT~R94/00768 une activité larvicide vis-à-vis de larves de Diptères notamment de Moustiques ou de Simulies.
Entrent notamment dans le cadre de l'invention, les séquences polypeptidiques codées par les séquences de nucléotides Seql, Seq2.1, Seq2.2, Seq3 ou Seq4.
Une autre séquence d'intérêt est la séquence d'acides aminés correspondant au gène cbmll telle que représentée à la figure 6_ Selon un autre mode de réalisation de l'invention, un polypeptide de l'invention est caractérisé en ce qu'il est reconnu par des anticorps dirigés contre la protéine P16 et/ou par des anticorps dirigés contre la protéine P18 et/ou par des anticorps dirigés contre la protéine P66.
Des polypeptides particuliers de l'invention sont par exemple des polypeptides comprenant une séquence d'acides aminés codée par l'un des enchaînements Seql, Seq2.1, Seq2.2 ou Seq3 et reconnus respectivement par des anticorps anti-protéine P66 pour le polypeptide comprenant au moins l'une des séquences Seql, Seq2.1 ou seq2.2 et par des anticorps anti-protéine P16 ou anti-protéine P18 pour le polypeptide comprenant la séquence Seq3.
La demande concerne également un polypeptide caractérisé en ce qu'il est modifié par addition, délétion, substitution d'acides aminés des lors qu'il conserve la capacité du polypeptide correspondant non modifié à intervenir dans l'activité toxique vis-a-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies.
La présente demande vise aussi des compositions de polypeptides caractérisées en ce qu'elles comprennent par exemple la protéine P16 et la protéine P18 ou en ce qu'elles comprennent les protéines P16, P18 et P66.
Ces protéines sont de préférence sous forme purifiée, le cas échéant co-purifiee, soit après W095/O~g - PCT/FR94/00768 l ?~ 'i isolement à partir d'une souche, soit après expression dans un hôte cellulaire recombinant.
L'invention concerne aussi un extrait protéique ayant une activité larvicide vis-à-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies tel qu'obtenu par :
- culture de Clostridium bifermentans à 34-C en anaérobiose en milieu TYG dans un courant gazeux contenant 5% H2, 5 CO2 et 90% N2, - récupération de la culture en fin de sporulation, environ après 16 h, - lavage de la culture avec NaCllM, - rinçage 2 fois avec un tampon TE, - récuperation du culot qui constitue l'extrait.
Une composition particulière de polypeptides selon l'invention peut aussi être caractérisée en ce qu'elle a l'activité larvicide d'un extrait brut tel que défini ci-dessus.
La présente demande a également pour objet des anticorps monoclonaux dirigés contre une protéine selon les définitions ci-dessus données.
Elle vise également un antisérum polyclonal caractérisé en ce qu'il est dirige contre une protéine de l'invention ou contre une composition de ces protéines ou encore contre un extrait tel que décrit ci-dessus.
Les séquences nucléotidiques ou fragments selon l'invention permettent également la préparation de sondes nucléotidiques, obtenues par marquage selon les techniques classiques des fragments ou sequences ci-dessus décrits.
Entrent également dans le cadre de l'invention, des compositions à activité larvicide comprenant à
titre de principe actif, un ou plusieurs polypeptides selon l'une quelconque des définitions données précédemment.
WO gS/OK~9 ~ 2 l1 PCTn~94/00768 D'autres compositions à activité larvicide selon l'invention peuvent également être caractérisées en ce qu'elles comprennent à titre de principe actif, des cellules recombinantes répondant aux définitions précédemment données.
De telles compositions peuvent en outre comporter des cellules recombinantes modifiées par des séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides à activité
larvicide de B. thurinqiensis et/ou de B. sphaericus.
On peut également envisager selon l'invention de préparer des cellules recombinantes contenant à la fois des gènes ou séquences nucléotidiques ou fragments codant pour une protéine répondant aux définitions ci-dessus et contenant en outre une séquence à activité
larvicide de B. thurinqiensis et/ou de B. sphaericus.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures qui suivent.
Fiqures 1 à 3: Relations immunoloqiques, distribution et cinétique de synthèse de P66, P18 et P16.
Fiqure 1 : SDS-PAGE de l'extrait toxique de Cbm. Les poids moléculaires de protéines standard sont indiqués dans la marge droite (en kDa).
Fiqure 2 : Détection des protéines P66, P18 et P16 dans C et dans des souches de C. bifermentans non toxiques. Des échantillons de 100 ~1 de cultures sporulées, ont été soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE), transférées sur une membrane de nitrocellulose et soumis à immunodétection avec des IgG purifiées par affinité dirigées contre P66 (A66), P18 (A18) ou P16 (A16). Puits a, Cbm; puits b, souche ATCC 638; puits c, souche 744-83; puits d, souche VPI 4407; puits e, souche VPI 4413A.
W095/0h~9 PCT~94/00768 2166:L2ll Fiqure 3 : Cinétique de synthèse de P66, P18 et P16 au cours de la sporulation de Cbm, à 34C (haut) ou à 42C
(bas), en conditions anaérobies. Des aliquots de 100 ~1 de culture ont été soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE), transférés sur une membrane de nitrocellulose et soumis à immunodétection avec des IgG purifiées par affinité, dirigées contre P66 (A66), P18 (A18) ou P16 (A16). Temps de culture en heures : a, 4.5; b, 6 (correspondant au to de sporulation); c, 7.5; d, 9; e, 10.5; f, 13; g, 30. Les poids moleculaires de protéines standard sont indiqués dans la marge (en kDa).
Fiqures 4A et 4B : Structure du plasmide pCBMl et carte de restriction du fragment XbaI.
Fragment XbaI : Bg : BqlII; N : NsiI; P : PvuII; R :
EcoRI; Rv : EcoRV; X : XbaI
Site de clonage :
H : HindIII; S : SphI; Ps : PstI; Sal :~SalI; Bm :
BamHI; Sm : SmaI; K : KpnI; Sst : SstI; R : EcoRI.
Les parties hachurées à droite et à gauche du fragment XbaI sont des fragments du plasmide vecteur pHT304 (Arantès 0. et al (1991), Gene, 108, p. 115-119).
Les fragments sur lesquels hybrident les sondes oligonucléotidiques sont représentés en traits hachurés, sous le fragment XbaI.
La flèche correspond à l'extrémité 5' du gène de P16 hybridant avec la sonde 16A.
Enzymes n'ayant pas de sites de restriction dans le fraqment XbaI :
BamHI, HindIII, PstI, SstI, SalI, SmaI.
Fiqure 5 : Localisation des oligonucléotides utilisés pour le séquençage des séquences lues.
Séquences des oligonucléotides utilisés :
16A': complémentaire 16 A: : acc cat tgt cta tat gc 16B : oligon 16 B non dégénéré: ggagat atc gga atg tc 16B': complémentaire 16 B' : ccg ata tct cct gaa ga FEUlLLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) W095/~h~9 2 16 6 12 ~ PCT~94/00768 18 B : oligo 18 B non dégénéré : tct gta ccg gaa gca gt 18 B': complémentaire 18 b : gct tcc ggt aca gaa gg 66 C-R: aac cct aca tct gtt aa 66 D-A: tac tac cat agt ttc ca 66 E-A: tgc aaa gcc aag ttg at Légende fragment Xba inséré, issu de l'ADN de Cbm Amorce "reverse" R-48 Amorce "universelle" - 40 Polylinker du pUC 19 Amorces nucléotidiques de synthèse () Vecteur navette pHT 304 Fiqure 6 : Séquences de nucléotides lues.
6A: Seq.l, lue à l'aide de l'amorce réverse R-48.
6B: Seq.2.1, lue à l'aide de l'amorce 66C-R.
6C et 6D: Seq.2.2, lue avec les amorces 66B, 66D-A et 66E-A.
6E à 6G: Gène Cbm, lu avec les diverses amorces "16 et 18".
6H et 6J:-SEq4, lue avec l'amorce universelle R-40.
Fiqure 7: Séquence d'acides aminés correspondant au gène Cbmll et localisation des séquences NH2-terminales et internes des protéines P18 et P16.
Figure 8 : Localisation des copies de cbm 11 sur le fragment XbaI.
Figure 9A et 9B : Localisation du fragment XbaI sur le plasmide résident.
Ligne 1: Marqueur de taille CCC de 16 a 2,06 Kb Ligne 2: Préparation des plasmides de Cbm CH 18, natifs Ligne 3: Préparation des plasmides de Cbm CH 18, hydrolysés par Xba Sonde utilisée : pCBMl Fiqure 10 : Expression des gènes introduits dans pCBMl, chez E.coli Ligne 1 : E.coli + pHT 304 (vecteur navette utilisé) Ligne 2 : E.coli + pCBM 1 FEUlLLE DE REMPLA~EMENT (REGLE 26) W095/OW~g PCT~94/00768 ~16~2 l ~
Sonde utilisée : anticorps anti Cbm total.
Fiqures llA, llB et llC : Homologies de séquence trouvées entre la protéine Cbm 11 et les protéines décrites dans la banque de données Swissprot.
MATERIELS ET METHODES
Préparation de l'extrait Un extrait a été préparé à partir d'une culture de Cbm réalisée à 34C en anaérobiose en milieu TYG (à
base de Biotrypcase 3%, extrait de levure 2%, glucose 0,5 a 1%, chlorydrate de cystéine 0,05%) dans un fermenteur ayant une capacité de 6 litres, en présence d'un courant gazeux contenant 5% H2, 5% CO2 et 90% N2.
La culture bactérienne sporulante a été récoltée après 16 h, en fin de phase de sporulation. La culture a ensuite été lavée avec lM NaCl, rincée 2 fois avec 20 mM Tris HCl, 5mM EDTA, pH8 (tampon TE) et {conservée à
-70C jusqu'à l'utilisation. Les culots congelés ont été décongelés resuspendus dans un tampon TE traité
dans un sonicateur pendant une durée totale de 1 minute comprenant un temps réel de sonication de 15 secondes sur la glace (Sonicateur Branson, grande sonde, échelle de sortie 40%, durée du cycle de sonication ("duty cycle": 25%) et centrifugés à 5000 g pendant 15 min. Le surnageant résultant (correspondant à l'extrait brut de protéines) a été recueilli.
Analyse des protéines La concentration en protéines de l'extrait a été
déterminée en utilisant le test Biorad de protéine avec l'albumine sérique bovine comme standard. Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide a été realisee selon la technique de Laemmli, U.K. (1970) (Nature 227, 680-685) sur des gels de polyacrylamide a 13%. Les marqueurs de poids moleculaires utilisés dans cette FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) W095/Oh39 PCT~V4/00768 21~12~
analyse des protéines par SDS-PAGE en conditions dénaturantes sont ceux du kit Pharmacia d'électrophorèse de protéines (LMW Ref. 17-0446-01), contenant les protéines suivantes : phosphorylase B (de masse moléculaire 94000 daltons), albumine (67000), ovalbumine (43000), anhydrase (30000) inhibiteur trypsique (20100) et alpha lactalbumine (14000).
Préparation des antisera contre les protéines de Cbm Des antisera polyclonaux contre l'extrait brut de protéine de Cbm ont été obtenus chez des lapins après deux séries de 10 à 15 microinjections intradermiques de 500 ~g de protéines émulsifiées dans l'adjuvant complet de Freund, à 3 semaines d'intervalle. Les lapins ont reçu des injections sous-cutanées d'une dose de rappel sans adjuvant de Freund, 3 semaines après.
Les IgG ont été purifiées à partir des sérums par précipitation au sulfate d'ammonium et chromatographie sur une colonne DEAE-52 (Whatmann) puis conservés à
4C.
Des antisera polyclonaux contre les polypeptides individualisés dénaturés P66, P18 et P16 ont été
produits chez les lapins selon la manière suivante :
les trois protéines ont été séparées par électrophorèse préparative SDS-PAGE et détectées avec du KCl lM. Les bandes ont été découpées sur les gels et les bandes d'acrylamide découpées ont été rincées avec de l'eau déionisée, puis plongées dans l'eau, émulsifiées avec de l'adjuvant complet de Freund et injectées aux lapins selon la technique décrite précédemment. Apr~es récupération des antisera, les IgG ont été purifiées par affinité sur des bandes de nitrocellulose contenant le polypeptide utilisé pour l'injection aux lapins, selon la technique de Burke et al (1982). EMB0 J. 1, 1621-1628.
FEUI! LE ~E R'-MPLACEM,-NT (REGLE 26) WO95/OW~9 PCT~94/00768 ~ . .
~6612il Hydrolyse enzymatique de l'extrait de Cbm Pour rechercher la toxicité de l'extrait, 500 ~1 d'aliquots de l'extrait (400 ~g) ont été chacun traités pendant deux heures à 37-C avec l'une des enzymes suivantes : protéinase K (EC 3.4.21.14, Boehringer, 40~g/ml), ribonucléase type I-A (EC 3.1.27.5, Sigma, 100 ~g/ml) et déoxyribonucléase I (EC 3.1.21.1, Boehringer, 100 ~g/ml).
L'activité larvicide a été testée sur des larves de Anopheles stephensi au troisième stade larvaire.
Fractionnement de l'extrait protéique Les extraits bruts de protéines ont éte filtrés sur un filtre HA-Millex contenant des pores de 0.45 ~m (Millipore) et soumis à une chromatographie liquide à
haute résolution (FPLC2, Pharmacia). Une chromatographie par échange d'ions a été réalisée sur une colonne Mono Q HR 10/10 équilibrée avec un tampon TE. Les protéines ont été éluées avec un gradient multi-étapes contenant de 0 à lM NaCl. Une filtration sur gel a été réalisée sur une colonne Superdex 200 HiLoad 16/60 dans un tampon TE contenant 150 mM NaCl (tampon TES). Les fractions ont été analysées par électrophorèse (SDS-PAGE) après précipitation des protéines avec 10% d'acide trichloracétique.
Test de neutralisation et immunoprécipitation La capacité des différents antisera d'inhiber l'activité larvicide de l'extrait a été testée selon la méthode suivante : des dilutions en série de l'extrait ont été incubées avec un volume fixe d'IgG anti-extrait dans un tampon TE à 20C pendant 1 heure. La toxicité
des échantillons et des échantillons de contrôle non-traités a été testée en utilisant des larves de A.
stephensi. Des tests de neutralisation ont été
W095/OW~9 21~ l PCT~94/00768 également réalisés dans les mêmes conditions avec les antisera ou les anticorps purifiés par affinité, dirigés contre les protéines dénaturées P66, P18 ou Pl6. Les protéines ont été immunoprécipitées à partir de l'extrait avec les antisera dirigés contre l'extrait ou contre les protéines individuelles P66, P18 ou P16 dénaturées par la technique de Howe et al, ((1982).
Mol. Gen. Genet. 186, 525-~30), en utilisant des billes de Protéine A Sepharose (Sigma) comme porteurs.
Cinétique de la synthèse de P66, P18 et P16 Cbm a poussé dans des flacons scellés de 1 litre, contenant 800 ml de milieu liquide TYG, avec une agitation magnétique douce, soit à 34C soit à 42C.
Des échantillons de 30 ml ont été récupérés à 9o minutes d'intervalles sans renouveler la teneur en gaz par ponction à travers un bouchon en caoutchouc. Les échantillons ont été centrifugés, rincés comme décrit précédemment et les culots de centrifugation ont été
gardés a -70C jusqu'à l'analyse de l'activité
larvicide et de la teneur en protéines par électrophorèse SDS-PAGE. Les expériences d'immunodétection ont été réalisées après électrotransfert sur une membrane Hybond-C Super~
(Amersham). P66, P18 et P16 ont été détectées avec les IgG purifiées par affinité dirigées contre chaque protéine (A66, A18 et A16) et visualisées avec un système de détection en Western blot ECL~ (Amersham).
Pour la comparaison, les cultures ont été réalisées à
34C et 42C dans des flacons dans lesquels un échange de gaz était possible.
Criblaqe de P66, P18 et P16 dans des souches C.
bifermentans non larvicides WO95/OK~9 ` PCTn~94/00768 1 2 '~ `
Les souches non larvicides de C. bifermentans (souche type ATCC 638, 744-83, VPI 4407 et VPI 4413A
ont été criblées par immunodétection pour rechercher la présence de P66, P18 et P16. Ces souches ainsi que la souche Cbm ont été cultivées dans des flacons scellés contenant 50 ml de milieu TYG, à 34C et récupérées après 15h lorsque la sporulation était complètement terminée mais avant la lyse cellulaire.
Bioessais sur des larves de moustiques Des échantillons de culture bactérienne ou des extraits de protéine ont été testés sur 20 larves de Culex pipiens au quatrième stade larvaire et/ou de A.
stephensi au troisieme stade larvaire dans des boites en plastique de Petri d'une capacité de 6 ml. Les mortalités ont été enregistrées après 24 h et 48 h d'exposition.
Relations immunologiques avec les toxines de Bacillus Un extrait brut de Cbm a été testé avec des antisera dirigés contre les cristaux de B.
thurinqiensis serovar israelensis 1884, B.
thurinqiensis serovar aizawai 7.29, B. thuringiensis serovar thurinqiensis 1715 et B. thurinqiensis serovar entomocidus HD9, ainsi que des antisera contre les protéines de cristaux de 42 et 51 kDa de B. sphaericus 2362.
RES~LTATS ET DISC~SSION
L'extrait de Cbm contenait trois protéines majeures de poids moléculaires apparents 66, 18 et 16 kDa, désignées par les abréviations P66, P18 et P16, ainsi que différents composants mineurs de nature protéique (Figs. 1 a 3).
W095/~W~9 ~ 6 ~1 2 ~ PCT~94/00768 1. Caractérisation des protéines P66, P18 et P16 L'extrait obtenu est toxique envers les larves des moustiques Culex pipiens, Anopheles stephensi et Aedes aegypti.
Sa LC50 après 48h contre A. stephensi au troisième stade larvaire était de 5 ~g/ml. L'activité larvicide de l'extrait a été perdue après incubation pendant 2h à
37C avec de la protéinase K. Au contraire, aucune inactivation n'a été obtenue avec la DNase ou la RNase.
De plus, l'activité larvicide était totalement inhibée par les IgG dirigées contre l'extrait total. Ainsi l'activité larvicide est bien due à des toxines de nature protéique au moins en partie.
Des antisera dirigés contre les protéines du cristal entomopathogène de B. thurinqiensis ou B.
sphaericus n'ont pas donné lieu à une réaction croisée avec les protéines de l'extrait de Cbm, indiquant que les toxines de Cbm appartiennent à une nouvelle classe de toxines insecticides.
P66, P18 et P16 sont les composants majoritaires des extraits toxiques de Cbm.
P66, P18 ou P16 ne sont pas immunologiquement apparentées (Figure 2, lignes a). P18 et P16 étaient seulement présentes dans Cbm alors qu'une protéine de 66 kDa immunologiquement apparentée à P66 de Cbm a été
détectée dans 4 souches de C. bifermentans non-entomopathogènes testées (Figure 2, lignes b à e).
La synthèse de P18 et de P16 dans une culture effectuée à 34C, était concommitante avec la sporulation de Cbm (figure 3) et l'apparition de l'activité larvicide. P16 etait synthétisée sous forme d'un precurseur de 20 kDa (P20), progressivement converti en un polypeptide de 16 kDa lors de la lyse cellulaire (Fig. 3).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO95/OK~9 PCTA~94/00768 216612ll P18 et P20/P16 ne sont pas détectées immunologiquement dans les souches de C. bifermentans dépourvues d'activité larvicide (Fig 2).
P18 et P20/P16 sont très faiblement détectées dans Cbm cultivée à 42C, dans les conditions où la bactérie n'est pas toxique (Fig 3).
P66 était détectée dans des cellules de Cbm pendant le stade végétatif et durant la sporulation.
Dans les cellules sporulantes, d'autres polypeptides immunologiquement apparentés à P66 étaient détectés, allant de 25 à 66 kDa (figure 3); ces polypeptides pourraient être des produits de dégradation de P66.
La culture de Cbm a poussé à 42C sans échange gazeux ; elle n'était pas toxique et contenait seulement des traces de P18 et P16. Dans cette culture, P66 était également synthétisée pendant la phase végétative mais aucune protéine de poids moléculaire inférieur n'a été détectée (Figure 3). Dans les cultures avec échange gazeux, on ne relevait pas de différence dans l'activité larvicide, la synthèse de P66, P18 et P16 et la lyse du sporange, entre les cultures effectuées à 34C ou à 42C.
Des essais de purification de chaque protéine ont permis les constatations suivantes : la plus grande partie de la toxicité était perdue après filtration, avant la réalisation d'une chromatographie FPLC~, bien que les extraits filtrés et non filtrés aient eu les mêmes profils protéiques. Ceci suggère que l'activité
larvicide pourrait être liée à la présence d'aggrégats proteiques ou de particules. Ceci a également été
observé pour les toxines de Bti ou de B. sphaericus qui sont beaucoup plus actives sous forme d'aggrégats qu'en solution (Schnell et al (1984). Science 223, 1191-1193 et Nicolas et al (1993). FEMS Lett. 106, 275-280). En outre, avec la chromatographie FPLC~, soit sur colonne d'echange d'ions, soit par filtration sur gel, les FEUlLLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) wo gsto~g ~16 612 I PCTtFR94/00768 trois polypeptides P66, P18 et P16 coéluaient en différents points. Des tests d'immunoprécipitation ont montre que chacun des antisera individuels dirigés contre P66, P18 ou P16 étaient capables de précipiter les trois produits ensemble comme le faisaient des anticorps préparés contre l'extrait brut. Des tests de chromatographie et d'immunoprécipitation ont suggéré
que P66, P18 et P16 sont a-ssemblés en un complexe.
Des IgG dirigées contre les protéines P66, P18 et/ou P16 denaturées ne neutralisaient pas la toxicité;
en revanche des anticorps contre la fraction brute de l'extrait neutralisaient la toxicité. Il est concevable que des IgG dirigées contre les protéines dénaturées étaient capables de reconnaitre le complexe P66-P18-P16, mais ne reconnaissaient pas des épitopes ou des domaines impliqués dans l'activité larvicide.
Ces expériences ont montré l'implication de P18 et P16 dans l'activité larvicide. En effet, dans des cultures de Cbm effectuées à 34-C, les deux protéines sont synthétisées concommitamment avec l'apparition de l'activité larvicide. Elles sont absentes des souches non toxiques de C. bifermentans et présentes à un niveau très bas dans des cellules non toxiques de Cbm cultivées à 42-C. L'activité larvicide de Cbm a 42 C
est modulée par les conditions d'échange de gaz entre la culture et le mélange de gaz anaérobique. L'absence d'activité larvicide dans des flacons scellés, sans échange gazeux est corrélée avec la faible synthèse et/ou une rapide dégradation de P18 et P20/P16.
2. Clonaqe des qènes codant pour P66, P18 et P16 Des séquences partielles en acides aminés de P66, P18 et P16 ont été déterminées par microséquençage.
Séquences en acides aminés des protéines P66, P18 et P16 WO95/Oh~9 PCT~94/00768 2~6612~ 24 Ces séquences ont été obtenues par microsequençage, selon des techniques couramment pratiquées par les laboratoires de microséquençage.
Pour chaque protéine ont été réalisées i) la séquences NH2-terminale et ii) une ou plusieurs séquences de fragments internes obtenus par hydrolyse trypsique de la protéine. Les séquences ont été déterminées avec un séquenceur Applied Biosystems 470, a partir des protéines séparées sur SDS-PAGE et transférées sur membrane de PVDF Immobilon (Millipore).
- séquence NH2-terminale M N T N I F S T N L
- interne 1 N N D E W I Y G E P D S S N I
- NHz-terminale M N N (X) C E V N C E (X) T
- interne 1 N A S L T W G K
- interne 2 F E L
- interne 3 Q W V K
- interne 4 E N T A S G T E
- interne 25 I E Y H N N L R
- NH2-terminale A Y (R) Q W V K F H I E A V N E G L K I
- interne 1 D I P I S P E D I S K
(X) : indéterminé
Les sondes oligonucléotidiques ont été faites à partir des séquences soulignées Protéine Acides aminés Sonde oligonucléotidique 5'-3' P66, NH2-term. N N T N I F S T N 66A=ATG AAT ACI AAT ATI
TTT TCI ACI AA (26mer) P66, interne D E W I Y G E P D 66B =TC IGG TTC ICC ATA
WO95/O~g PCT~4/00768 1 2 ~
IAT CCA TTC ATC (26mer) P18, NH2-term. C E V N C E18A=TGT GAA GTI AAT TGT
GA (17 mer) P16, NH2-term. F H I E A V N E G 16A= TTT CAT ATI GAA GCI
GTI AAT GAA GG (26mer) I=DMT dInosine cyan~ethyl phosphoramidite ~=séquence complémentaire A partir de ces informations des sondes oligonucléotidiques ont été synthétisées et utilisées pour cribler une banque d'ADN total de Cbm hydrolysé
par l'enzyme XbaI, construite dans le plasmide navette pHT304 (Arantès ~ Lereclus, Gene. 1991. 108 : 115-119).
Sélection du plasmide pCBMl Une banque d'ADN a été construite dans un vecteur navette- pHT304, construit par O. Arantès et D.
Lereclus, à parti~ d'un plasmide résident de B.
thurinqiensis pHT 1030 et de pUCl9, capable de se répliquer dans E. coli et dans les bactéries à gram positif. L'ADN total de Cbm a été hydrolysé par XbaI, transféré sur membrane Hybond N+ (Amersham) après électrophorèse sur gel d'agarose, et hybridé avec chacune des sondes synthétisées, marquées à l'extrémité
3' par la fluorescéine ("kit ECLTM 3' oligolabeling and detection systems", Amersham) selon le protocole recommandé par le fournisseur dans les conditions d'hybridation et de stringence suivantes :
Temperature d'hybri~ation : 42C, 15h, en four à
hybridation HYBAID (Cera-Labo) avec 5-10 ng de sondes/ml.
216 6 12 1 PCT~94/00768 Lavages après hybridation : 2 fois 5 minutes à
température ambiante dans 5 x SSC, 0,1% SDS, puis 2 fois 15 minutes en 1 x SSC, 0,1% SDS.
La banque d'ADN génomique de Cbm construite dans E. coli souche TGl a été criblée par hybridation sur colonies avec l'oligonucléotide 16A marqué en extrémité
3' par la fluorescéine (système ECL 3' oligolabeling Amersham). Le criblage a permis d'isoler un plasmide recombinant pCBM1 hybridant avec l'oligonucléotide 16A
mais aussi avec les oligonucléotides 66A, 66B et 18A.
Une seule bande de 7 kb a été détectée sur l'ADN
hydrolysé par XbaI par la sonde correspondant à
l'extrémité NH2 terminale de P16 (sonde 16A). Une faible réaction a été également été détectée sur ce fragment avec les sondes 18A et 66A. La banque a donc été construite dans E. coli TGl avec les fragments XbaI
d'ADN de taille voisine de 7,5 kb élués sur Prep-A-Gene (Biorad). Le criblage de la banque (400 clones) par hybridation des colonies sur filtre Hybond N+ avec l'oligonucléotide 16A a révélé 10 clones positifs (mêmes conditions de stringence que décrites ci-dessus). L'analyse des 10 plasmides recombinants, par plusieurs enzymes de restriction, a montré qu'ils étaient tous similaires. Un des plasmides (pCBMl, 13,5 kb) a été selectionné.
Le plasmide pCBMl a une taille de 13,5kb et résulte donc de l'insertion d'un fragment XbaI d'ADN de Cbm de 7kb au site de clonage XbaI de pHT304 (6,5kb).
La carte de restriction de pCBMl a été déterminée (Fig 4A et 4B).
Les régions avec lesquelles hybrident les sondes mentionnées ci-dessus ont été déterminees par Southern-blot sur le plasmide pCBMl hydrolysé par différentes enzymes de restriction pour les 4 sondes.
De plus la technique de PCR en utilisant comme amorces FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO95/~9 PCT~4/00768 ~16~12~
l'amorce universelle et l'oligonucléotide 16A a permis de localiser la région d'hybridation de 16A à 2kb de l'extrémité 3' du fragment XbaI (Fig 4A). Ces résultats permettent de conclure que les 3 gènes codant pour P66, P20/16 et P18 sont contenus dans le fragment XbaI de 7kb.
Localisation par PCR de l'extrémité 5' du qene codant pour P16 sur le fraqment XbaI
La PCR a éte réalisée en utilisant la Taq polymérase et comme amorces, l'oligonucléotide 16A et l'amorce universelle (M13 universal sequencing primer Pharmacia) et comme matrice le plasmide pCBMl, avec le cycle suivant :
1 cycle Dénaturation : 95C 10 min.
25 cycles Hybridation: 42C 1 min.
Elongation: 72C 2 min.
Dénaturation: 95C 1 min.
1 cycle Hybridation: 42C 3 min.
Elongation: 72C 4 min.
3. Détermination de la séquence nucléotidique La stratégie de séquençage utilisée était celle de "marche sur le fragment". La séquence a été réalisée selon la technique de Sanger (Sanger, et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) sur le plasmide pCBMl rendu simple brin par dénaturation a la soude. L'extension a été effectuée à partir des amorces universelle, réverse, ou des oligonucléotides correspondant aux séquences déduites des séquences en acides aminés des protéines P66, Pl8 et P16 ou des séquences nucléotidiques lues. L'ensemble des FEUiLLE C'E ~Rr~ P~CE~ENT (REGLE 26) W095/00639 PCT~R94/00768 2l66l2ll oligonucléotides utilisés et leur localisation sur le fragment d'ADN sont représentés dans la figure 5.
Un total de 1800 pb a été lu et est présenté sur la figure 6. Les séquences nucléotidiques (Seql, Seq2, Seq3 et Seq4) déterminées, ainsi que la séquence en acides aminés déduite de la séquence Seq3 sont données dans la figure 6.
La détermination des sites de restriction contenus dans la séquence du gène codant pour la protéine de 66 kDa a permis de localiser avec précision la position du début du gène 66kDa sur le fragment XbaI ; environ 95%
du gene est présent sur le fragment clone.
L'analyse de la séquence Seq3 et la comparaison avec les séquences amino terminales et internes des protéines 16kDa et 18 kDa (mentionnées dans la figure 6) a montré que les gènes 16 kDa et 18 kDa ne sont pas distincts et représentent en fait le même gène. Un seul cadre de lecture capable de coder pour une protéine de 11 kDa (masse moléculaire calculée) a été trouvé ; le gène correspondant a été désigné gène CBMll. La masse moléculaire calculée de 11 kDa correspondrait à celui de la protéine de 18 kDa. D'apres la séquence, la protéine de 16 kDa serait en fait une protéine ayant une masse moléculaire calculée de 8,9 kDa ; elle pourrait résulter de la protéine 11 kDa par clivage des 17 acides aminés NH2-terminaux.
La recherche d'homologies au niveau acides aminés entre la séquence Seq3 et d'autres protéines a été
réalisée. Seule trois protéines (dont une produite par une autre espèce de Clostridium) présentant des homologies très restreintes ont été trouvées dans les banques de données.
L'existence d'un gène unique codant pour les deux protéines est en contradiction apparente avec un résultat précédemment trouvé concernant l'absence de parenté immunologique entre ces protéines. On a donc WO95/~K~9 PCT~94/00768 2 ~ 2 ~
recherché la présence de plusieurs copies du gène CBM
11 codant pour des protéines différentes.
Temperature d'hybri~ation : 42C, 15h, en four à
hybridation HYBAID (Cera-Labo) avec 5-10 ng de sondes/ml.
216 6 12 1 PCT~94/00768 Lavages après hybridation : 2 fois 5 minutes à
température ambiante dans 5 x SSC, 0,1% SDS, puis 2 fois 15 minutes en 1 x SSC, 0,1% SDS.
La banque d'ADN génomique de Cbm construite dans E. coli souche TGl a été criblée par hybridation sur colonies avec l'oligonucléotide 16A marqué en extrémité
3' par la fluorescéine (système ECL 3' oligolabeling Amersham). Le criblage a permis d'isoler un plasmide recombinant pCBM1 hybridant avec l'oligonucléotide 16A
mais aussi avec les oligonucléotides 66A, 66B et 18A.
Une seule bande de 7 kb a été détectée sur l'ADN
hydrolysé par XbaI par la sonde correspondant à
l'extrémité NH2 terminale de P16 (sonde 16A). Une faible réaction a été également été détectée sur ce fragment avec les sondes 18A et 66A. La banque a donc été construite dans E. coli TGl avec les fragments XbaI
d'ADN de taille voisine de 7,5 kb élués sur Prep-A-Gene (Biorad). Le criblage de la banque (400 clones) par hybridation des colonies sur filtre Hybond N+ avec l'oligonucléotide 16A a révélé 10 clones positifs (mêmes conditions de stringence que décrites ci-dessus). L'analyse des 10 plasmides recombinants, par plusieurs enzymes de restriction, a montré qu'ils étaient tous similaires. Un des plasmides (pCBMl, 13,5 kb) a été selectionné.
Le plasmide pCBMl a une taille de 13,5kb et résulte donc de l'insertion d'un fragment XbaI d'ADN de Cbm de 7kb au site de clonage XbaI de pHT304 (6,5kb).
La carte de restriction de pCBMl a été déterminée (Fig 4A et 4B).
Les régions avec lesquelles hybrident les sondes mentionnées ci-dessus ont été déterminees par Southern-blot sur le plasmide pCBMl hydrolysé par différentes enzymes de restriction pour les 4 sondes.
De plus la technique de PCR en utilisant comme amorces FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO95/~9 PCT~4/00768 ~16~12~
l'amorce universelle et l'oligonucléotide 16A a permis de localiser la région d'hybridation de 16A à 2kb de l'extrémité 3' du fragment XbaI (Fig 4A). Ces résultats permettent de conclure que les 3 gènes codant pour P66, P20/16 et P18 sont contenus dans le fragment XbaI de 7kb.
Localisation par PCR de l'extrémité 5' du qene codant pour P16 sur le fraqment XbaI
La PCR a éte réalisée en utilisant la Taq polymérase et comme amorces, l'oligonucléotide 16A et l'amorce universelle (M13 universal sequencing primer Pharmacia) et comme matrice le plasmide pCBMl, avec le cycle suivant :
1 cycle Dénaturation : 95C 10 min.
25 cycles Hybridation: 42C 1 min.
Elongation: 72C 2 min.
Dénaturation: 95C 1 min.
1 cycle Hybridation: 42C 3 min.
Elongation: 72C 4 min.
3. Détermination de la séquence nucléotidique La stratégie de séquençage utilisée était celle de "marche sur le fragment". La séquence a été réalisée selon la technique de Sanger (Sanger, et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) sur le plasmide pCBMl rendu simple brin par dénaturation a la soude. L'extension a été effectuée à partir des amorces universelle, réverse, ou des oligonucléotides correspondant aux séquences déduites des séquences en acides aminés des protéines P66, Pl8 et P16 ou des séquences nucléotidiques lues. L'ensemble des FEUiLLE C'E ~Rr~ P~CE~ENT (REGLE 26) W095/00639 PCT~R94/00768 2l66l2ll oligonucléotides utilisés et leur localisation sur le fragment d'ADN sont représentés dans la figure 5.
Un total de 1800 pb a été lu et est présenté sur la figure 6. Les séquences nucléotidiques (Seql, Seq2, Seq3 et Seq4) déterminées, ainsi que la séquence en acides aminés déduite de la séquence Seq3 sont données dans la figure 6.
La détermination des sites de restriction contenus dans la séquence du gène codant pour la protéine de 66 kDa a permis de localiser avec précision la position du début du gène 66kDa sur le fragment XbaI ; environ 95%
du gene est présent sur le fragment clone.
L'analyse de la séquence Seq3 et la comparaison avec les séquences amino terminales et internes des protéines 16kDa et 18 kDa (mentionnées dans la figure 6) a montré que les gènes 16 kDa et 18 kDa ne sont pas distincts et représentent en fait le même gène. Un seul cadre de lecture capable de coder pour une protéine de 11 kDa (masse moléculaire calculée) a été trouvé ; le gène correspondant a été désigné gène CBMll. La masse moléculaire calculée de 11 kDa correspondrait à celui de la protéine de 18 kDa. D'apres la séquence, la protéine de 16 kDa serait en fait une protéine ayant une masse moléculaire calculée de 8,9 kDa ; elle pourrait résulter de la protéine 11 kDa par clivage des 17 acides aminés NH2-terminaux.
La recherche d'homologies au niveau acides aminés entre la séquence Seq3 et d'autres protéines a été
réalisée. Seule trois protéines (dont une produite par une autre espèce de Clostridium) présentant des homologies très restreintes ont été trouvées dans les banques de données.
L'existence d'un gène unique codant pour les deux protéines est en contradiction apparente avec un résultat précédemment trouvé concernant l'absence de parenté immunologique entre ces protéines. On a donc WO95/~K~9 PCT~94/00768 2 ~ 2 ~
recherché la présence de plusieurs copies du gène CBM
11 codant pour des protéines différentes.
4. Nombre de copies du qène CBM 11 Des expériences de PCR réalisées sur la plasmide pCBM1 avec les différentes combinaisons d'amorces décrites dans la figure 5 ont montré la présence de deux copies du gène Cbm 11 sur le fragment XbaI de 7 kb cloné. Ces deux copies ont des tailles similaires, sont en orientation directe et distantes d'environ 200 pb (Figure 8).
Des expériences similaires effectuées sur l'ADN
total de Cbm ont permis de montrer l'existence d'au moins une copie supplémentaire sur cet ADN en orientation inverse.
Des expériences similaires effectuées sur l'ADN
total de Cbm ont permis de montrer l'existence d'au moins une copie supplémentaire sur cet ADN en orientation inverse.
5. Localisation des gènes codant pour les protéines de 66 kDa, 18 kDa et 16 kDa Des expériences d'hybridation ont été réalisées en parallèle sur l'ADN plasmidique et l'ADN total de Cbm en utilisant comme sonde le fragment XbaI de 7 kb ; ces expériences ont eté réalisées en utilisant la technique "Direct nucleic acid labelling system" ECL (Amersham) de sondes froides, selon les indications du fournisseur. Les résultats obtenus ont permis de localiser ce fragment sur un plasmide résident d'environ 13 kb (Figure 9A et 9B).
6. Expression des qènes des protéines de 66 kDa, 18 kDa et 16 kDa chez E.coli L'étude de l'expression des gènes clonés dans le plasmide pCBM1 a été réalisee chez E.coli par immunodétection a l'aide de sondes froides. Les extraits de E.coli ont été préparés de la façon suivante : les clones TG1 (pHT304) et TGl (pCBM1) ont eté cultivés en milieu LB. Cette expérience a mis en F~U'LEE DE REMPLACEMENT (r~EGLE 26) W095/00639 PCT~R94/00768 216612 l évidence la synthèse chez ce recombinant d'une protéine unique de 20 kDa réagissant spécifiquement avec l'anticorps anti protéine 18 kDa (Figure 10). Aucun produit correspondant à l'expression du gène 66 kDa n'a pu être visualisé.
Des essais biologiques menés sur Anopheles stephensi Liston montrent que ce clone recombinant, bien que synthétisant une protéine immunologiquement apparentée aux protéines de Cbm, ne présente aucune toxicité même à forte concentration. Ceci suggère que la protéine de 20 kDa exprimée chez E.coli n'est pas le seul élément responsable de la toxicité de Cbm et confirme les résultats obtenus concernant un phénomène de synergisme entre les différentes protéines produites par Cbm.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
Des essais biologiques menés sur Anopheles stephensi Liston montrent que ce clone recombinant, bien que synthétisant une protéine immunologiquement apparentée aux protéines de Cbm, ne présente aucune toxicité même à forte concentration. Ceci suggère que la protéine de 20 kDa exprimée chez E.coli n'est pas le seul élément responsable de la toxicité de Cbm et confirme les résultats obtenus concernant un phénomène de synergisme entre les différentes protéines produites par Cbm.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
Claims (40)
1. Séquence nucléotidique caractérisée par les propriétés suivantes :
- elle comprend tout ou partie du fragment d'ADN
XbaI de 7 kb représenté à la figure 4A, tel qu'obtenu à
partir du plasmide pCBM1 déposé à la CNCM le 15 Juin 1993 sous le n° I-1317 ;
- elle hybride avec la sonde oligonucléotidique 18A (TGT GAA GTI AAT TGT GA) et/ou avec la sonde oligonucléotique 16A (TTT CAT ATI GAA GCI GTI AAT GAA
GG) et/ou avec au moins l'une des sondes 66A (ATG AAT
ACI AAT ATI TTT TCI ACI AA) ou 66B (TC IGG TTC ICC ATA
IAT CCA TTC ATC) dans des conditions stringentes ;
- elle code pour une protéine, un polypeptide ou un peptide ayant la capacité de participer à l'activité
toxique des produits d'expression du fragment XbaI de 7 kb vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier de larves de Moustiques ou de Simulies.
- elle comprend tout ou partie du fragment d'ADN
XbaI de 7 kb représenté à la figure 4A, tel qu'obtenu à
partir du plasmide pCBM1 déposé à la CNCM le 15 Juin 1993 sous le n° I-1317 ;
- elle hybride avec la sonde oligonucléotidique 18A (TGT GAA GTI AAT TGT GA) et/ou avec la sonde oligonucléotique 16A (TTT CAT ATI GAA GCI GTI AAT GAA
GG) et/ou avec au moins l'une des sondes 66A (ATG AAT
ACI AAT ATI TTT TCI ACI AA) ou 66B (TC IGG TTC ICC ATA
IAT CCA TTC ATC) dans des conditions stringentes ;
- elle code pour une protéine, un polypeptide ou un peptide ayant la capacité de participer à l'activité
toxique des produits d'expression du fragment XbaI de 7 kb vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier de larves de Moustiques ou de Simulies.
2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle hybride avec les quatre sondes 16A, 18A, 66A et 66B soit dans des conditions stringentes, soit dans des conditions non stringentes.
3. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'il s'agit du fragment XbaI de 7 kb du plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le n° I-1317.
4. Séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle hybride avec une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, en ce qu'elle est présente dans l'ADN d'une bactérie de l'espèce Clostridium bifermentans, et en ce qu'elle code pour une protéine, un polypeptide ou un peptide ayant la capacité de participer à une activité toxique vis-à-vis de larves de Diptères et en particulier de larves de Moustiques ou de Simulies.
5. Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle contient des fragments codant pour les séquences d'acides aminés suivantes :
M N T N I F S T N L et/ou pour N N D E W I Y G E P D S S N I et/ou pour M N N (X) C E V N C E (X) T et/ou pour N A S L T W G K et/ou pour F E L et/ou pour Q W V K et/ou pour E N T A S G T E et/ou pour I E Y H N N L R et/ou pour A Y ( R ) Q W V K F H I E A V N E G L K I et/ou pour D I P I S P E D I S K.
M N T N I F S T N L et/ou pour N N D E W I Y G E P D S S N I et/ou pour M N N (X) C E V N C E (X) T et/ou pour N A S L T W G K et/ou pour F E L et/ou pour Q W V K et/ou pour E N T A S G T E et/ou pour I E Y H N N L R et/ou pour A Y ( R ) Q W V K F H I E A V N E G L K I et/ou pour D I P I S P E D I S K.
6. Fragment de nucléotides contenu dans une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à
5, caractérisé par les propriétés suivantes :
- il comprend le fragment XbaI - EcoRV du fragment XbaI de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le n° I-1317 ;
- il a une taille d'environ 1,8 kb et il code pour une protéine ayant un poids moléculaire de 66 kDa.
5, caractérisé par les propriétés suivantes :
- il comprend le fragment XbaI - EcoRV du fragment XbaI de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le n° I-1317 ;
- il a une taille d'environ 1,8 kb et il code pour une protéine ayant un poids moléculaire de 66 kDa.
7. Fragment de nucléotides selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine P66 ayant un poids moléculaire d'environ 66 kDa et en ce qu'il contient une séquence codant pour l'enchaînement d'acides aminés M N T N I F S T N L a son extrémité
NH2-terminale, et une séquence codant pour l'enchaînement d'acides aminés N N D E W I Y G E P D S
S N I comme fragment interne.
NH2-terminale, et une séquence codant pour l'enchaînement d'acides aminés N N D E W I Y G E P D S
S N I comme fragment interne.
8. Fragment de nucléotides contenu dans une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à
7, caractérisé en ce qu'il répond à l'un des enchaînements Seq1, Seq2.1 ou Seq2.2 représentés à la figure 6, ou en ce qu'il comprend l'un au moins de ces enchaînements.
7, caractérisé en ce qu'il répond à l'un des enchaînements Seq1, Seq2.1 ou Seq2.2 représentés à la figure 6, ou en ce qu'il comprend l'un au moins de ces enchaînements.
9. Fragment de nucléotides contenu dans une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à
5, caractérisé par les propriétés suivantes :
- il hybride dans des conditions stringentes avec la sonde 16A ;
- il est présent dans le fragment XbaI de 7 kb représenté a la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le n° I-1317 ;
- il a une taille d'environ 0,5 kb ;
- il code pour une protéine P16 ayant un poids moléculaire d'environ 16 kDa.
5, caractérisé par les propriétés suivantes :
- il hybride dans des conditions stringentes avec la sonde 16A ;
- il est présent dans le fragment XbaI de 7 kb représenté a la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le n° I-1317 ;
- il a une taille d'environ 0,5 kb ;
- il code pour une protéine P16 ayant un poids moléculaire d'environ 16 kDa.
10. Fragment de nucléotides selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine P16 ayant un poids moléculaire d'environ 16 kDa et en ce qu'il contient une séquence codant pour l'enchainement d'acides aminés A Y (R) Q W V K F H I E A V N E G L K I
à son extrémité NH2-terminale et une séquence codant pour l'enchainement d'acides aminés D I P I S P E D I S
K en tant que fragment interne.
à son extrémité NH2-terminale et une séquence codant pour l'enchainement d'acides aminés D I P I S P E D I S
K en tant que fragment interne.
11. Fragment de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 9 et 10, caractérisé en ce qu'il répond à l'enchaînement Seq3 représenté à la figure 6 ou comprenant l'enchaînement Seq3.
12. Fragment de nucléotides contenu dans une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à
5 caractérisé en ce qu'il code pour une protéine P20 ayant un poids moléculaire d'environ 20 kDa, précurseur de la protéine P16, P20 étant synthétisée pendant la phase de sporulation de bactéries de l'espèce C.
bifermentans.
5 caractérisé en ce qu'il code pour une protéine P20 ayant un poids moléculaire d'environ 20 kDa, précurseur de la protéine P16, P20 étant synthétisée pendant la phase de sporulation de bactéries de l'espèce C.
bifermentans.
13. Fragment de nucléotides contenu dans une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à
5, caractérisé par les propriétés suivantes :
- il hybride dans des conditions stringentes avec la sonde 18A ;
- il est présent dans le fragment XbaI de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le n°I-1317 ;
- il a une taille d'environ 0,55 kb ;
- il code pour une protéine P18 ayant un poids moléculaire d'environ 18 kDa.
5, caractérisé par les propriétés suivantes :
- il hybride dans des conditions stringentes avec la sonde 18A ;
- il est présent dans le fragment XbaI de 7 kb représenté à la figure 4A et contenu dans le plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le n°I-1317 ;
- il a une taille d'environ 0,55 kb ;
- il code pour une protéine P18 ayant un poids moléculaire d'environ 18 kDa.
14. Fragment de nucléotides selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 18 kDa et en ce qu'il contient une séquence codant pour l'enchainement d'acides aminés M N N (X) C E V N C E (X) T à son extrémité NH2-terminale et des séquences codant pour les enchaînements d'acides aminés N A S L T W G K, F E
L, Q W V K, E N T A S G T E, et I E Y H N N L R en tant que fragments internes.
L, Q W V K, E N T A S G T E, et I E Y H N N L R en tant que fragments internes.
15. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il contient une séquence ou un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, en un site non essentiel pour sa réplication.
16. Vecteur selon la revendication 15, caractérisé
en ce qu'il s'agit du plasmide pCBM1 déposé à la CNCM
sous le numéro I-1317.
en ce qu'il s'agit du plasmide pCBM1 déposé à la CNCM
sous le numéro I-1317.
17. Vecteur selon la revendication 15, caractérisé
en ce qu'il s'agit du plasmide pHT816 modifié par une séquence nucléotidique ou un fragment de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
en ce qu'il s'agit du plasmide pHT816 modifié par une séquence nucléotidique ou un fragment de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
18. Hôte cellulaire recombinant procaryote ou eucaryote, caractérisé en ce qu'il contient une séquence ou un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 a 14 ou un vecteur selon l'une quelconque des revendications 15 ou 17, dans des conditions permettant son clonage et/ou son expression.
19. Hôte cellulaire selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie, par exemple d'une souche C. bifermentans d'une souche B.
thuringiensis ou d'une souche B. sphaericus.
thuringiensis ou d'une souche B. sphaericus.
20. Hôte cellulaire selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une cellule eucaryote par exemple une cellule végétale.
21. Polypeptide ou composition de polypeptides, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique ou un fragment de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
22. Polypeptide impliqué dans une activité
larvicide vis-à-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies, caractérisé par les propriétés suivantes:
- il est caractéristique d'une bactérie anaérobie de l'espèce Clostridium bifermentans - il ne produit pas de réaction immunologique avec des sérums dirigés contre les protéines du cristal de B. thuringiensis israelensis ou de B. sphaericus.
larvicide vis-à-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies, caractérisé par les propriétés suivantes:
- il est caractéristique d'une bactérie anaérobie de l'espèce Clostridium bifermentans - il ne produit pas de réaction immunologique avec des sérums dirigés contre les protéines du cristal de B. thuringiensis israelensis ou de B. sphaericus.
23. Polypeptide selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il a un poids moléculaire d'environ 16 kDa et en ce qu'il est le produit de l'expression dans une cellule recombinante d'un fragment de nucléotides hybridant avec l'oligonucléotide 16A dans des conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence NsiI-XbaI du fragment XbaI contenu dans le plasmide pCMB1 déposé à
la CNCM sous le numéro I-1317.
la CNCM sous le numéro I-1317.
24. Polypeptide selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il a un poids moléculaire d'environ 18 kDa et en ce qu'il est le produit de l'expression dans une cellule recombinante, d'un fragment de nucléotides hybridant avec l'oligonucléotide 18A dans des conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence EcoRI-XbaI
du fragment XbaI contenu dans le plasmide pCMB1 déposé
à la CNCM sous le numéro I-1317.
du fragment XbaI contenu dans le plasmide pCMB1 déposé
à la CNCM sous le numéro I-1317.
25. Polypeptide selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il a un poids moléculaire d'environ 66 kDa et en ce qu'il est le produit de l'expression dans une cellule recombinante d'un fragment de nucléotides hybridant avec l'oligonucléotide 66A et/ou 66B dans des conditions stringentes, ce fragment étant contenu dans la séquence XbaI-EcoRI du fragment XbaI contenu dans le plasmide pCMB1 déposé à la CNCM sous le numéro I-1317.
26. Fragment polypeptidique d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 22 à 25, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans une activité
larvicide vis-à-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies.
larvicide vis-à-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies.
27. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 22 ou 26, caractérisé en ce qu'il est reconnu par des anticorps dirigés contre la protéine P16 selon la revendication 23, et/ou par des anticorps dirigés contre la protéine P18 selon la revendication 24, et/ou par des anticorps dirigés contre la protéine P66 selon la revendication 25.
28. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 21 à 27, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés codée par l'une au moins des enchaînements Seq1, Seq2.1, Seq2.2 et reconnue par des anticorps anti-protéine P66 ou codée par l'enchaînement Seq3 et reconnue par des anticorps anti-protéine P16 ou des anticorps anti-protéine P18.
29. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 22 à 27 caractérisé en ce qu'il est modifié par addition, délétion, substitution d'acides aminés dès lors qu'il conserve la capacité du polypeptide correspondant non modifié à intervenir dans l'activité toxique vis-à-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies.
30. Composition de polypeptides caractérisée en ce qu'elle comprend la protéine P16 selon la revendication 23 et la protéine P18 selon la revendication 24.
31. Composition de polypeptides selon la revendication 30 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la protéine P66 selon la revendication 25.
32. Extrait protéique ayant une activité larvicide vis-à-vis de larves de Diptères, notamment de Moustiques ou de Simulies tel qu'obtenu par :
- culture de Clostridium bifermentans à 34°C en anaérobiose en milieu TYG dans un courant gazeux contenant 5% H2, 5° CO2 et 90% N2, - récupération de la culture en fin de sporulation, environ après 16 h, - lavage de la culture avec NaCl1M, - rinçage 2 fois avec un tampon TE, - récupération du culot qui constitue l'extrait.
- culture de Clostridium bifermentans à 34°C en anaérobiose en milieu TYG dans un courant gazeux contenant 5% H2, 5° CO2 et 90% N2, - récupération de la culture en fin de sporulation, environ après 16 h, - lavage de la culture avec NaCl1M, - rinçage 2 fois avec un tampon TE, - récupération du culot qui constitue l'extrait.
33. Composition de polypeptides selon l'une quelconque des revendications 30 ou 31, caractérisée en ce qu'elle a l'activité larvicide d'un extrait brut selon la revendication 32.
34. Anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 21 à 29.
35. Antiserum polyclonal caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 21 à 29 ou une composition selon l'une quelconque des revendications 30, 31 ou 33 ou un extrait selon la revendication 32.
36. Sonde nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou un fragment de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 7 à 14.
37. Composition à activité larvicide, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, un ou plusieurs polypeptides selon l'une quelconque des revendications 31 à 33.
38. Composition à activité larvicide, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif des cellules recombinantes selon l'une quelconque des revendications 18 à 20.
39. Composition à activité larvicide selon la revendication 38, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des cellules recombinantes contenant une séquence codant pour un polypeptide à activité
larvicide de B. thuringiensis et/ou de B. sphaericus.
larvicide de B. thuringiensis et/ou de B. sphaericus.
40. Composition à activité larvicide, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif des cellules recombinantes modifiées par une séquence ou un fragment selon l'une quelconque des revendications 1 à
14 ou par un vecteur selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16 lesdites cellules étant en outre modifiées par une séquence à activité larvicide de B. thuringiensis et/ou de B. sphaericus.
14 ou par un vecteur selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16 lesdites cellules étant en outre modifiées par une séquence à activité larvicide de B. thuringiensis et/ou de B. sphaericus.
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| FR93/07795 | 1993-06-25 | ||
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| PCT/FR1994/000768 WO1995000639A1 (fr) | 1993-06-25 | 1994-06-24 | Fragment d'adn de clostridium bifermentans portant les genes codant pour des proteines associees a une activite insecticide |
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