NL8900481A - Nieuwe verbindingen en de toepassing ervan. - Google Patents

Description

ί 5 10

Nieuwe verbindingen en de toepassing ervan

Bacillus thurinqiensis (B.t.) is een sporenvormend 15 bacterie die een proteinekristal delta-endotoxine (i-endotoxine) aan het einde van het vegetatieve groeistadium produceert. Dit endotoxine produceert, bij opname door bepaalde insecten, toxische effecten, waaronder het beëindigen van het voeden, maag-darmstoornissen, dehydratatie en 20 uiteindelijk de dood vallen. Het 5-endotoxine wordt geproduceerd, in het algemeen uit een plasmidale bron, als een inactieve voorloper of protoxinevorm met een molecuulgewicht van 130.000-140.000 dalton [Calabrese, Canad, J. Microbiol.

26 (1980) 1006]. Proteolytische splitsing ter verwijdering 25 van de koolstof-eindstandige helft , bij benadering, en mogelijk vele aminozuren aan het stikstofuiteinde , vindt normaliter in de darm van de insecten als gevolg van de werking van darmproteasen plaats en is nodig opdat het actieve toxine met een molecuulgewicht van 65.000 tot 30 70.000d [Tyrell en med. J. Bacteriology 145 (1981) 1052] wordt gevormd. Er is een groot aantal ondervarieteiten van B.t.geïdentificeerd. Hoewel de meesten hiervan een specifiekere of grotere toxiciteit voor insecten van de Lepidoptera orde vertonen , bleek een beperkt aantal eveneens toxisch 35 ten opzichte van insecten van andere klassen te zijn. Zo is bijvoorbeeld B.t.israelensis toxisch voor Dipteran larven (muggen en zwarte vliegen) en er zijn onlangs twee andere 890 04 81 ·’ - 2 -

W

ondervarieteiten geindentificeerd , die giftig bleken te zijn ten opzichte van Coleopteran larven [Hofte en med, Nuc. Acid. Res 15(17) (1987) 7183).

Hoewel veel werk is verricht ter bereiding van 5 kortere toxinen en structurele gens die hiervoor coderen, schijnt er minder bekend te zijn over het vermogen van de B.t. fi-endotoxinen puntmutaties binnen het actieve of toxische gedeelte van de endotoxine volgorde te weerstaan en het effect van dergelijke mutaties op de activiteit van 10 de toxinemoleculen tegen te gaan.

Een doel van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van nieuwe mutanten van het actieve gedeelte van B.t. δ-endotoxinen.

Een ander doel van de onderhavige uitvinding is het 15 verschaffen van mutaties die doeltreffend zijn voor het produceren van een B.t. endotoxine-achtige werking bij zowel verkorte <S-endotoxinevörmen als die met een volledige lengte.

Weer een -andsr doel van de onderhavige uitvinding is 20 het verschaffen van mutaties die de insecticide werking van B.t. S-endotoxine structuren vergroten.

Volgens de onderhavige uitvinding werd , na het willekeurig aanbrengen van enkele en veelvoudige puntmutaties in vele honderden DNA strengen coderende voor een groot ge-25 bied van het actieve gedeelte van een representatief B.t. endotoxine dat insecticidaal actief is tegen Lepidoptera, volgens recombinanttechnieken vele mutant B.t. endotoxinen bereid en geïsoleerd die de kenmerkende insecticide werking tegen Lepidoptera vertonen, die het B.t. δ-endotoxine van 30 het wilde type heeft. Ook blijkt bij deze gevonden mutatie-punten , dat de codons die coderen voor elk ander natuurlijk aminozuur kunnen worden ingebracht ter verkrijging van actief endotoxine eiwit . Het bleek eveneens dat een aantal van de willekeurige mutaties een grotere mate van 35 insecticide werking produceerden. Een dergelijke werking kan bijvoorbeeld worden aangetoond met het "Tobacco Budworm" (Heliothis virescens. of met het Trichoplusia ni (koolrups) onderzoek, zoals hierna zal worden beschreven, en in vele 89 0 04 813 i· ψ> - 3 - gevallen was deze vergroting zeer opmerkelijk omdat een tenminste twee malen of meer grotere werking dan die van de endotoxine moederstructuur werd verkregen. Veelvuldige mutaties (gewoonlijk twee of drie aminozuren per gemuteerde 5 DNA spiraal ) werden eveneens individueel en in verschillende combinaties onderzocht teneinde bepaalde doeltreffender mutaties en combinaties daarvan te vinden. De mutaties volgens de onderhavige uitvinding bleken, met één uitzondering, eveneens voor te komen in gedeelten van de aminozuur-10 volgorde die onder een grote verscheidenheid van B.t. δ-endotoxinen van het wilde type goed bewaard waren gebleven, waaruit de algemeen toepasbaarheid van de mutaties verkregen volgens de uitvinding op een grote verscheidenheid van endo-toxinestructuren waarin dergelijke geconserveerde gebieden 15 insecticidale B.t. endotoxinen verschaffen blijkt.

Meer in het bijzonder werd onder verwijzing naar de aminozuurvolgorde en de nummering daarvan in de hierna volgende tabel A (te beginnen met het methionine (MET) ,dat plaats nummer 1 heeft en het normale N-eindstandige gedeelte 20 van het representatieve, tegen Lepidopteran actieve endotoxine, aangegeven in tabel A),gevonden dat B.t. endotoxine-eiwit dat anders insecticidaal actief is tegen Lepidoptera-insecten op de wijze van natieve B.t. endotoxinen indien het in het actieve gedeelte een aminozuurrest volgorde bevat die 25 dezelfde is of een grote homologie heeft met die weergegeven in tabel A voor de 116 aminozuurresten volgorde weergegeven op de plaatsen vanaf en met plaats 90 tot en met plaats 205 (dus de aminozuurplaatsen m-l-m-116) hebben, één of meer van de resten van de volgende aminozuren op de aan-30 gegeven of equivalente homologe plaatsen kunnen hebben (de nummers tussen haken op de m-plaats zijn ten opzichte van de genoemde volgorde van 116 aminozuurresten): a) op plaats 94 (plaats m-5) van de genoemde volgorde van 116 aminozuren) elk natuurlijk aminozuur waarvoor gecodeerd is door de gene-35 tische code behalve Asn; b) op plaats 95 (plaats m-6 van de genoemde volgorde van 116 aminozuren ) elk dergelijk natuurlijk aminozuur, afgezien van Gin? c) op plaats 101 (plaats m-12 van de genoemde volgorde van 116 aminozuren ) elk 8 9 0 0 4 a 1 —*—--·------ : 'i - 4 - dergelijk natuurlijk aminozuur, met uitzondering van Glu; d) op plaats 105 (plaats m-16 van de genoemde volgorde van 116 resten), elk dergelijk natuurlijk aminozuur, afgezien van Asn; e) op plaats 116 (plaats m-27 van de genoemde volgorde 5 van 116 resten) elk dergelijk natuurlijk aminozuur, behalve Glu,· f) op plaats 119 (plaats m-30 van de genoemde volgorde van 116 resten) elk dergelijk natuurlijk aminozuur,afgezien van Ala; g) op plaats 122 ( plaats m-33 van de genoemde volgor-de van 116 resten) elk dergelijk natuurlijk 10 aminozuur, met uitzondering van Thr ? h) op plaats 123 (plaats m-34 van de genoemde volgorde van 116 resten ) elk dergelijk natuurlijk aminozuur, behalve Asn; i) op plaats 125 (plaats m-36 van de genoemde volgorde van 116 resten) elk dergelijk natuurlijk aminozuur, behalve Ala; j) op 15 plaats 130 (plaats m-41 van de genoemde volgorde van 116 resten) elk dergelijk natuurlijk aminozuur, met uitzondering van Met; k) op plaats 184 (plaats m-95 van de genoemde volgorde van 116 resten) elk dergelijk natuurlijk aminozuur, behalve Phe; 1) op plaats 187 (plaats m-98 van de genoemde 20 volgorde van 116 resten) elk dergelijk natuurlijk aminozuur, behalve Ala; m) op plaats 188 (plaats m-99 van de genoemde volgorde van 116 resten) elk dergelijk natuurlijk aminozuur, behalve Thr; n) op plaats 194 (plaats m-105 van de genoemde volgorde van 116 resten) elk dergelijk natuurlijk aminozuur, 25 behalve Asn; en o) op plaats 201 (plaats m-112 van de genoemde volgorde van 116 resten) elk dergelijk natuurlijk aminozuur,behalve Gly.

Bovendien, en weer onder verwijzing naar de genummerde volgorde van aminozuurresten weergegeven in tabel A, 30 omvat de uitvinding de verandering van het aminozuur Asn op aminozuurplaats 4 in elk ander natuurlijk aminozuur waarvoor gecodeerd wordt door de genetische code.

Met betrekking tot de aminozuurresten verkregen volgens de uitvinding binnen de genoemde volgorde van 116 τεεί 5 -ten wordt opgemerkt, dat het volgens de uitvinding aanbeveling verdient dat een dergelijke volgorde wordt gekenmerkt, weer onder verwijzing naar de totale volledige volgorde weergegeven in tabel A (en eveneens naar een dergelijke 89 0 0481 ·< £ - 5 - volgorde van 116 resten), door één of een aantal van de volgende aminozuren op de aangeduide plaatsen: a) Lys op plaats 94 (plaats 5 van de 116 restvolgorde); b) Lys op plaats 95 (plaats 6 van de genoemde 116 rest- 5 volgorde); c) Lys op plaats 101 (plaats 12 van de genoemde 116 restvolgorde) ; d) Tyr op plaats 105 (plaats 16 van de genoemde 116 restvolgorde) ; 10 e) Lys of Arg, vooral Arg, op plaats 116 (plaats 27 van de genoemde 116 restvolgorde); f) Thr op plaats 119 (plaats 30 van de genoemde 116 restvolgorde) ; g) Ile op plaats 122 (plaats 33 van de genoemde 116 rest- 15 volgorde); h) Tyr op plaats 123 (plaats 34 van de genoemde 116 restvolgorde) ; i) Val op plaats 125 (plaats 36 van de genoemde 116 restvolgorde) ; 20 j) Ile op plaats 130 (plaats 41 van de genoemde 116 restvolgorde) ; k) Ile op plaats 184 (plaats 95 van de genoemde 116 restvolgorde) ; l) Thr op plaats 187 (plaats 98 van de genoemde 116 rest- 25 volgorde); m) Ser op plaats 188 (plaats 99 van de genoemde 116 restvolgorde) ; n) Lys op plaats 194 (plaats 105 van de genoemde 116 restvolgorde) en 30 o) Asp op plaats 201 (plaats 112 van de genoemde 116 restvolgorde) .

Indien het Asn op aminozuurplaats 4 wordt gewijzigd, is dit bij voorkeur in Tyr .

Tabel A bij het einde van deze beschrijving geeft een 35 nucleotide volgorde en de verkregen afgeleide aminozuur-volgorde die van belang is voor de B.t. 5-endotoxine produk-tie in de natuur. Met één uitzondering, de nucleotide volgorde werd verkregen uit een 6-endotoxine producerend plas- 89 014 81.' -------- i λ

F

- 6 - mide gevonden in B.t. wuhanensis.In het bijzonder is het volledige, structurele gen ( in werkelijkheid coderende voor het endotoxine zelf) van B.t. wuhanensis en de enige uitzondering is dat de volgorde vóór het menthionine (Met) 5 bij het begin van de structurele gen is van een endotoxine-producerend gen ge-vonden in B.t. kurstaki HD-1 (het zogenaamde 5.3Kb Hind III klasse plasmide van HD-1), een dergelijke bovenstrooms gele-gen volgorde bevattende de natieve Ribosomale bindings-plaats (RBS) van een dergelijk 10 B.t. kurstaki HD-1 endo-toxine-producerend plasmide. De bovenstroomse volgorde die de ribosomale bindingsplaats bevat , zoals gevonden in B.t. wuhanensis , verschilt weinig van die weergegeven in tabel A voor Kurstaki en de verschillen zijn hier in later aange-duid. Er wordt echter 15 op gewezen dat zowel de nucleotide als de aminozuurvolgorden in de betreffende B.t. wuhanensis en B.t. Kurstaki HD-1 structurele genen vanaf het begin van de endotoxine volgorde via het gehele actieve gedeelte daarvan tot tenminste de Κρη I plaats aangegeven in tabel A identiek zijn, waarbij de 20 genoemde Κρη I plaats zich in het protoxine gedeelte bevindt. Dus het actieve toxinegedeelte dat verkregen wordt door splitsing na opname door het.insect zal hetzelfde zijn voor zowel de betreffende B.t. wuhanensis als B.t. kurstaki Hd-1 endotoxinen. In tabel A zijn de aminozuren voor het 25 endotoxine-eiwit geproduceerd als gevolg van het tot expressie brengen van het structurele gen positief tussen haken 1-1181 onder het aminozuur genummerd. Die in het niet-getranslateerde gedeelte stroomopwaarts van het 1-Met zijn negatief genummerd in een tegengestelde of stroomopwaarts-30 richting (met stopsignalen gerekend als een aminozuur-plaats). Nucleotiden in het structurele gen zijn genummerd (niet tussen haken) boven de lijn waarin ze voorkomen en het laatste cijfer in het nummer staat boven het nucleotide waarop het nummer betrekking heeft. Nucleotiden in het 35 niet-getranslateerde gedeelte dat de ribosomale bindingsplaats bevat zijn negatief genummerd teruggaande van het initiërende ATG codon ( voor het 1-Met) . Binnen de genummerde volgorden aangeduid boven een gedeelte ervan is 6900481J .

* - 7 - afzonderlijk of ondergenummerd m-ι tot m-116 voor aminozuren en n-1 tot n-348 voor de nucleotiden voor dergelijke aminozuren , teneinde meer in het bijzonder een in hoge mate geconserveerd gebied aan te geven waarin de meeste mutaties 5 verkregen volgens de uitvinding zullen plaatsvinden. Bepaalde restrictieplaatsen die van belang zijn voor de nucleotide volgorde in tabel A zijn aangegeven met een lijn boven de betreffende nucleotiden in de restrictieplaatsen met een voetnoot van de betreffende plaats. Het toxische 10 gedeelte van het endotoxine weergegeven in tabel A volgens de stand der techniek betreft de aminozuurvolgorde te beginnen bij aminozuurplaats 1 Met en strekt zich uit tot aminozuurplaats 610 (Thr). Met het oog op de aard van de totale DNA-volgorde weergegeven in tabel A en teneinde de 15 volgende beschrijving gemakkelijker te kunnen begrijpen, wordt erop gewezen, dat de DNA- en amino-zuurvolgorden te beginnen met het niet-getranslateerde gedeelte op regel 1 van tabel A en voortgaande tot de Κρη I plaats bij ongeveer de aminozuurplaatsen 724-725 , en gedeelten daarvan, kunnen 20 en ook zijn aangeduid hierin op de wijze afgeleid van B.t. krustaki HD-1 (het 5.3Kb Hind III klasse plasmide).

Figuur 1 vertoont een beeld van de algemeen actieve plasmiden prAK en prAK-3 toegepast in verschillende stadia bij de uitvinding en omvat DNA coderende voor een verkort 25 B.t. endotoxine afgeleid van B.t. Kurstaki HD-1 met een insecticide werking tegen Lepidoptera.

Fig. 2 vertoont het plasmide pBSrII, welke omvat DNA coderende voor een bekort B.t. endotoxine eiwit met een wat grotere lengte dan dat waarvoor gecodeerd wordt door prAK 30 en eveneens afgeleid van B.t. kurstaki HD-1, met eveneens een insecticide werking tegen Lepidoptera.

In de figuren 3a en 3b zijn twee representatieve, dubbelstrengs DNA strengen afgebeeld, die kunnen worden gesynthetiseerd voor het uitvoeren van zogenaamde codon spin-35 proeven en die eveneens bruikbaar zijn voor het op geschikte wijze invoeren van gewenste mutaties in een B.t. endotoxine DNA coderende volgorde.

In fig. 4 is het plasmide pBT210 afgebeeld, dat omvat 89 00481.

f - 8 - s DNA coderende voor een natief endotoxine met volledige lengte uit B.t. wuhanensis, welk endotoxine de identieke aminozuurvolgorde in het actieve gedeelte ervan als het endotoxine uit B.t. krustaki HD-1 zoals gecodeerd voor in 5 prAK en pB8rII heeft.

In fig.5 is een bekorting van het plasmide prAK-9 tezamen met een vergroting van een gedeelte ervan afgebeeld, welk prAK-9 verder in bijzonderheden overeenkomt met het plasmide prAK-3 en welk gedeelte en ondergedeelten daarvan 10 in de moederplasmiden geschikt bruikbaar zijn voor het uitvoeren van codon spinproeven en het op een andere wijze aanbrengen van mutaties volgens de uitvinding.

Het plasmide prAK werd gedeponeerd in E. coli JM103 bij de Agricultural Research Culture Collection (NRRL), 15 Peoria, Illinois op 19 februari 1988 en ontving de-potnummer NRRL B-18329.

Het plasmide pBSrII werd gedeponeerd in E.coli JM103 bij de Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, op 19 februari 1988 en ontving depotnum-20 mer NRRL B-18331.

Het plasmide pBT210 werd op 19 februari 1988 in E.coli JM103 gedeponeerd bij de Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois en ontving depotnummer NRRL B-18330.

25 Zoals werd aangegeven, kunnen de puntmutaties volgens de uitvinding worden aangebracht bij de endotoxine-eiwit-volgorden verkregen door Bacillus thurinaiensis variëteiten en ondertypen, welke volgorden insecticidaal actief zijn tegen Lepidopteran larven indien ze de hiervoor aangegeven 30 geconserveerde volgorde van 116 aminozuren of een volgorde die in hoge mate homoloog daarmede is of vrijwel een equivalent daarvan is , bevat waaronder eiwit-endotoxine volgorden die van het natuurlijke type met de gehele lengte of vrijwel volledige lengte en die welke bekort zijn door ver-35 wijdering van het gehele of een gedeelte van het beneden-stroomse protoxine of het inactieve deel ervan en zelfs die welke bekort kunnen zijn van het normale C-uiteinde boven-strooms en terug tot het actieve gedeelte van het endotoxine 89 0 04 8 1 .: * - 9 - zijn . Zoals reeds duidelijk zal zijn hebben endotoxinen uit B.t. kurstaki en B.t. wuhanensis beide het identieke geconserveerde gedeelte van 116 aminozuren en andere hebben of kunnen verwacht worden te hebben dezelfde volgorde van 116 5 aminozuren of een grotendeels homoloog equivalent daarvan.

Zo is bijvoorbeeld van endotoxinen uit B.t. sotto. B.t. kurstaki HD-73 (streng) en B.t. Galleriae reeds bekend dat ze endotoxinen met de identieke volgorde van 116 aminozuren produceren, zelfs hoewel enkele ervan tenminste in zekere 10 mate en in sommige gevallen significant verschillen in zowel het evenwicht van het toxische gedeelte van het endotoxine als in het protoxine gedeelte. Andere, zoals B.t. kurstaki HD-1 Dipel (een in de handel verkrijgbare onderstam) , hebben een verandering van één aminozuur in de aangeduide 15 volgorde van 116 aminozuren (m-59 is beu waarvoor wordt gecodeerd door TTG) en andere veranderingen-weglatingen-toevoegingen in andere volgordedelen. Deze en andere bleken een enkelvoudige verandering of meervoudige veranderingen te hebben, doch hebben de aminozuur-homologie van tenminste 20 ongeveer 70% van deze volgorde van 116 aminozuren kan één of een aantal mutantveranderingen volgens de uitvinding hebben van de aminozuren daarin welke identiek overeenkomen met het aminozuur in de genoemde volgorde van 116 niet-gemuteerde aminozuren , in het bijzonder indien het te veranderen 25 aminozuur aan elk van zijn zijden twee en bij voorkeur vier andere aminozuren heeft die identiek overeenkomen met die in de volgorde van 116 aminozuren. Er wordt eveneens op gewezen dat de mutaties volgens de uitvinding kunnen worden aangebracht op overeenkomstige aminozuren in homologe series 30 die essentieel weglatingen of toevoegingen bevatten, zodat de volgorde zelf korter of langer is dan de aangegeven volgorde van 116 aminozuren. In dergelijke gevallen zal de nummering zoals toegepast in de referentievolgorde van 116 aminozuren behouden blijven, zodat de weglatingen die 35 voorkomen in de te veranderen volgorde gerekend zullen worden als in werkelijkheid aanwezig zijnde en toevoegingen in de te veranderen volgorde eenvoudigweg niet zullen worden geteld. De aanduiding van de plaatsen van de aminozuren kan &9 0 0481 .' ·* - 10 - dus onafhankelijk worden geacht van de weglatingen of toevoegingen in een dergelijke homologe volgorde.

Bij voorkeur zijn de homologe aminozuurvolgorden waarin de mutantveranderingen volgens de uitvinding kunnen 5 worden gesubstitueerd die welke waarvoor door DNA is gecodeerd waaraan DNA van de van betekenis zijnde of niet van betekenis zijnde streng (of dubbele streng) van het DNA beginnende bij plaats n-1 en zich uitstrekkend t/m plaats n-348 in tabel A onder stringente hybridiserende 10 omstandigheden zal hybridiseren indien de te muteren homologe volgorde zijn aminozuren heeft, welke overeenkomen met die in de aangeduide volgorde van 116 aminozuren, waarvoor gecodeerd is door hetzelfde codon als het overeenkomstige aminozuur in de referentievolgorde. Methoden voor het 15 bereiden van een dergelijke gerangschikte hybridisatieprobe zijn bekend uit de stand der techniek. Stringente hybridiserende omstandigheden zijn die waarbij de hybridisatie wordt uitgevoerd bij 60°C in 2,5 x zoutcitraat (SSC) buffer, alleen gevolgd door spoelen bij 37°C bij een verlaagde 20 bufferconcentratie die niet de hybridisaties die plaatsvinden zal beïnvloeden.

Bij voorkeur worden de mutaties uitgevoerd in aminozuurvolgorden die niet meer dan 1,2 of 3 aminozuren verschillen van die in de referentievolgorde van 116 amino-25 zuren, in het bijzonder een volgorde die identiek is aan de referentievolgorde.

Het is reeds duidelijk in de stand der techniek aangegeven dat de referentievolgorde van 116 aminozuren een gedeelte van verder in aanzienlijke mate gemodificeerde of 30 verschillende endotoxine eiwitvolgorden kan vormen die een insecticide werking tegen Lepidopteranlarven bezitten en andere modificaties die buiten de referentievolgorde liggen zullen zeker buiten de kennis van de bekende stand der techniek vallen. De volgorden die dus aan het vereiste ge-35 muteerde volgordedeel grenzen dat analoog is aan het refe-rentiegedeelte van 116 aminozuren kunnen in aanzienlijke mate variëren en behoeven slechts voldoende te zijn om in-sectïcidaal actief endotoxine-eiwit te verschaffen, zoals 6900481.

* - 11 - bijvoorbeeld blijkt uit de insecticide werking tegen Heliothis virescens. De aminozuurvolgorde stroomopwaarts van het gemuteerde gedeelte kan dus worden bekort of verlengd of zelf zijn gemuteerd ten opzichte van de volgorde weergegeven 5 in tabel A, doch zal in het algemeen beginnen met methionine en het verdient vooral aanbeveling dat dit erg homoloog (70%) of identiek is aan die weergegeven in tabel A, hoewel het duidelijk zal zijn dat een dergelijke volgorde eveneens desgewenst de aanbevolen mutant op de 4-plaats , zoals ook 10 verschaft volgens de uitvinding, kan bevatten. Eveneens kan het gedeelte stroomafwaarts van het benodigde gemuteerde volgordegedeelte in sterke mate variëren en verkort of verlengd zijn t.o.v. de situatie daarvan weergegeven in tabel A tot het splitsingspunt ervan in de darm van het 15 insect en kan natuurlijk al of niet verder zijn uitgebreid onder vorming van een protoxine of inactief gedeelte dat wordt onderworpen aan splitsing in de darm van het insect ter verkrijging van een insecticidaal actief eiwittoxine.

DNA bevattende volgorden coderende voor mutantendo-20 toxinen zoals verschaft volgens de uitvinding zullen onder de controle van geschikte regelende volgorden worden opgenomen in plasmiden , ter vorming van expressievectoren die in cellen ter verkrijging van het endotoxine zullen worden getransformeerd of getransvecteerd. De produktie van endo-25 toxinen volgens dergelijke recombinant biotechnologische technieken, in tegenstelling met bijvoorbeeld het bereiden van geneesmiddelen volgens deze technieken, brengt weinig of geen opwerken ter zuivering van het endotoxine met zich mede. De cellen waarin het wordt geproduceerd kunnen wor-30 den gelyseerd, doch het was bij de commerciële bereiding van B.t. endotoxinen in het verleden kenmerkend eenvoudigweg de gehele inhoud van de cultuur of het fermentatiesysteem toegepast bij de bereiding van het eindprodukt te gebruiken , gewoonlijk na op een gebruikelijke wijze te hebben gedroogd, 35 zoals sproeidrogen bij een lage temperatuur, bekend uit de stand der techniek.Afhankelijk van het produkt ,kunnen,zoals eveneens bekend is , verschillende materialen worden toegevoegd ter verbetering van de stabiliteit van het produkt en 69 0 04 81 .· * - 12 - 'h eiwithoudende materialen, indien deze niet in geschikte hoeveelheden in het fermentatiesysteem aanwezig zijn, kunnen onafhankelijk met het produkt worden gemengd, ter verhoging van de stabiliteit ,zoals eveneens bekend is, bijvoorbeeld 5 poeder van sojabonen of poeder van ontvette sojabonen.

Hoewel de endotoxinen biotechnisch in vele getransformeerde of getransvecteerde celsystemen kunnen worden geproduceerd, verdient het in het algemeen aanbeveling bac-teriele cellen van zowel het gram-negatieve als gram-posi-10 tieve type te transformeren of transvecteren. Een aanbevolen type van gram-negatieve bacteriën is E.coli. waarmede reeds een aanzienlijke ervaring in de biotechnologie is verkregen en waarvoor een grote verscheidenheid van geschikte en operatief functionele plasmide en transferexpressie-15 vectorsystemen bekend zijn en in de handel verkrijgbaar zijn. Pseudomonas fluorescens is een ander type van gram-negatieve bacteriën waarin plasmiden met endotoxine volgorden zijn opgenomen . Zoals hierin zal worden aangetoond, kunnen endotoxine bevattende genen regulerende volg-20 orden bevatten zoals in het bijzonder ribosomale bindings-plaatsvolgorden die hun oorsprong vinden in B.t. indien opgenomen voor expressiedoeleinden in essentieel heterolo-ge bacteriëncellen, zoals E.coli. Aancrezien bacteriën van het Bacillus-type een milieu verschaffen dat meer natief is 25 voor de mutantendotoxinen volgens de uitvinding , ligt het vooral binnen het kader van deze uitvinding bacteriën van het Bacillus-type te transformeren of transvecteren met expressievectoren die het DNA-coderend voor de mutantendotoxinen volgens deze uitvinding bevatten. 30 Illustratief voor dergelijke Bacillus-cellen zijn van bijzonder belang B.t. cellen, B.-cereus cellen en B.subtilis cellen. Onlangs is een sterk verbeterde methode voor het transformeren van Bacillus cellen , in het bijzonder B.t. cellen, gevonden en deze is beschreven in de 35 hangende Britse octrooiaanvrage 8729726. Onder celtypen die geschikt zijn voor transformering volgens de werkwijze vallen cry minus typen , zoals de bekende B.t. kurstaki cry B cellen , die geen plasmiden en Bacillus-cellen van het 69OMSK .

- 13 - * wilde type bevatten, zoals de natieve B.t. cellen die endotoxine-producerende plasmiden hebben. Plasmiden die geschikt zijn voor opname in Bacillus-cellen, zoals B.t. cellen, zijn bekend, bijvoorbeeld het plasmide pBC16.1 5 (Kreft en med., Molec. Gen. Genet. [1978] 162 59) en de moederplasmiden ervan, die kunnen worden toegepast of gemodificeerd onder aanwending van gebruikelijke recombinanttechnieken ter verkrijging van de mutantendo-toxine coderingsvolgorden volgens de uitvinding . Zoals uit 10 de stand der techniek bekend is produceren Bacillus-cellen kenmerkend endotoxine slechts in gewenste hoeveelheden in hun sporen-vormend stadium en dus laat men ze tot een dergelijk stadium groeien, teneinde op de beste wijze de produkten die bruikbaar zijn als insecticide te verkrijgen.

15 Dus kunnen plasmiden of expressievectoren verkregen volgens de uitvinding en bevattende DNA voor de mutantendo-toxinen worden opgenomen in Bacillus-cellen , die hetzij geen endotoxine-producerende plasmiden bevatten of waarin reeds één of een aantal van dergelijke plasmiden aanwezig 20 zijn. Hoewel de mutantendotoxinen volgens de uitvinding kenmerkend een werking tegen Lepidoptera zullen hebben, kan endotoxinewerking tegen andere insectenklassen eveneens aanwezig zijn door het voorkomen in het moederendotoxine vóór de mutatie of als resultaat van andere toegestane 25 veranderingen in de volgorde en in elk geval ligt het binnen het kader van de uitvinding Bacillus-cellen te transformeren met Lepidopteran-toxische endotoxine producerende plasmiden volgens de uitvinding indien dergelijke cellen plasmiden voor endotoxinen bevatten die niet in sterke mate 30 doeltreffend zijn tegen Lepidoptera, teneinde bij de sporenvorming, combinerende endotoxinen ter verkrijging van ruimere trajecten wat insecticide werking betreft te verkrijgen. Zo kunnen bijvoorbeeld plasmiden met de gemuteerde endotoxine DNA coderende volgorden worden toegepast ter 35 transformatie van B.t. israeliensis of B.t. tenebrionis , die individueel niet voldoende doeltreffend zijn tegen Lepidoptera.

Hoewel de onderhavige uitvinding is toegelicht zowel 8900481 ·' .

9 - 14 - aan de hand van endotoxine-eiwitten van het natieve type met een bekorte of volledige lengte, verdient het in het algemeen aanbeveling, indien de mutant endotoxinen direkt als insecticiden, zoals hiervoor is beschreven, worden toe-5 gepast , volgorden met een volledige lengte toe te passen of te bereiden, welke dezelfde zijn als het natieve type of dit nabootsen, tenminste wat betreft de mogelijkheid een vouwvermogen van het endotoxine-eiwit te verkrijgen dat overeenkomt met dat van het natieve vermogen of van een 10 verbeterd vouw-effect over de gehele lengte.

Mutant DNA volgorden volgens de onderhavige uitvinding kunnen eveneens in het genoom van een plant worden opgenomen. Het verdient in dergelijke gevallen aanbeveling dat de gemuteerde volgorden van het bekorte type worden 15 toegepast, hoewel de volgorden met een volledige lengte eveneens geschikt zijn. Elke geschikte methode kan met goede resultaten worden toegepast voor een dergelijke opname van de endotoxine volgorden in een gastheerplantgenoom, zoals bijvoorbeeld via de Ti plasmide van Acrrobacterium 20 tumefaciens. elektroporatie. elektrotransformatie, micro-injectie, virale transvectie of het gebruik van chemicaliën die de opname van vrij DNA induceren of verhogen, enz. Dergelijke methoden en het gebruik hiervan bij de transformatie van planten zijn deskundigen bekend. Bij voorkeur zal 25 de DNA volgorde coderend voor het mutantendotoxine verbonden zijn met geschikte regulerende volgorden,zoals bijvoorbeeld operator en 3' regulerende volgorden die functioneel in planten zijn en het geheel zal in een vector van het expressietype worden opgenomen. Een dergelijke 30 transformatie van plantencellen, gevolgd door regeneratie van ontwikkeling van cellen tot volledige planten, maakt het mogelijk dat de mutant endotoxine DNA-volgorde een stabiel en permanent gedeelte van het plantgenoom wordt, zodat het overgaat van de ene generatie in de andere, via mitosis en 35 meiosis en bij expressie leidt tot een voor insecten toxisch eiwit , hetgeen de plant een erfelijke bestandheid tegen insecten verleent.

Bij dit onderzoek werden twee zeer overeenkomstige 8900481.

i - 15 - vectoren (prAK en prAK-3) toegepast als bron van de B.t. ί-endotoxine volgorde voor mutatie en eveneens ter verschaffing van dragers voor de produktie en het onderzoek van de B.t.endotoxinemutanten . De plasmiden prAK en prAK-3 zijn 5 weergegeven in fig. 1 waarbij de relevante bijzonderheden van prAK zijn weergegeven en de kleine variatie daarvan die in prAK-3 voorkomt is aangeduid. In principe zijn de plasmiden prAK en prAK-3 geheel competente expressie-vectoren voor E.coli en elk ervan bevat een voor ampicil-10 line resistent gen, een bron van replicatie en operatorvolg-orden, waaronder een E.coli promotor. Zoals in fig. 1 door de dikke , donkere lijnen en vierkanten is aangegeven, bevat de prAK vector in juist afgelezen framecoördinatie met de promotor een DNA-volgorde die aangetroffen wordt in 15 B.t. kurstaki stam HD-1 van het wilde type. De dikke , donkere lijn geeft de volledige volgorde weer die verkort is ter co-dering van een bekort natief B.t. 5-endotoxine dat zich uit-sterkt van aminozuurplaats 1 (Met) tot plaats 610 (Thr) in tabel A en verder in het protoxinegedeelte dat 20 eindigt met aminozuur 723 (Leu). Bij het stroomafwaartsgedeelte van de genoemde dikke , donkere lijn geeft een klein gedeelte, af-gebeeld als een open, dik vierkant in fig. 1 , een korte DNA volgorde van 54 baseparen weer , die het basepaar tri-plet coderend voor 25 723-Leu volgt en zelf onmiddellijk daar-na gevolgd wordt door een stopsignaal. Deze totale uitge-breide volgorde van 57 baseparen (waaronder het stopsig-naal) vindt zijn oorsprong in het bekende plasmide pBR322 dat werd toegepast voor de constructie van prAK. De expres-sievector prAK 30 codeert dus voor en produceert in E.coli es-sentieel een verkort B.t. 6-endotoxine fusie-eiwit met in totaal 741 aminozuren en is samengesteld uit de 610 amino-zuren van het natieve protoxinegedeelte en 18 aminozuren met als oorsprong pBR322 .Dit bekorte B.t endotoxine fusie-eiwit 35 heeft een grote mate van insecticide werking en werd toegepast ter beoordeling van de mutanten daarvan, die volgens de uitvinding werden verkregen. Deze werking kan vrijwel niet worden onderscheiden van een geheel bekort S- 8800481.

t h - 16 - endotoxine-eiwit met slechts de 610 aminozuren van het geactiveerde toxine (de aminozuren 1-610 in tabel A).

De dikke ,donkere lijn die het grootste gedeelte van de volgorde coderend voor het bekorte B.t. endotoxine 5 fusie-eiwit aangeeft is met het stroomopwaarts gelegen uiteinde ervan in fig. 1 verbonden met een dik , donker vierkant dat een volgorde weergeeft, die een B.t. riboso-male bindingsplaats (RBS) bevat. Dit gedeelte (eveneens weergegeven in tabel A, de regels 1 en 2), dat het RBS be-10 vat, heeft ongeveer 47 nucleotiden voor het begin van het stroomopwaarts gelegen gedeelte ervan met een BamHI plaats (in plasmiden uit de stand der techniek opgenomen ter verbinding van het gedeelte met het E.coli promotorgedeelte (aangeduid met een pijl in fig. 1). De promotor- en RBS-15 gedeelten zijn gerangschikt en met elkaar verbonden teneinde in de juiste afleesframecoördinatie met de coderende volgorde voor het endotoxine te zijn. Dus de dikke, donkere lijnen en vierkanten geven tezamen DNA weer dat zijn oorsprong vindt in B.t. kurstaki HD-1.

20 Vele andere restrictieplaatsen aangegeven in fig. 1 zijn relevant voor de strategie voor het op een gebruikelijke wijze verwijderen en weer invoegen van gedeelten van DNA voor mutatieonderzoekingen . Deze andere restrictieplaatsen zijn de Nsi 1 plaats ( te beginnen na ongeveer 25 slechts 26 nucleotiden vanaf het begin van de endotoxine coderende volgorde) , de twee Xba I plaatsen (zie hierna, echter betreffende prAK-3), de Sst I en de Hind III plaats.

Zoals hiervoor werd vermeld, verschilt prAK-3 30 slechts in één enkel klein opzicht van prAK. Het verschil is dat de Xba I plaats (TCT AGA) op de nucelotide plaatsen 292-297 van tabel A werden gewijzigd, onder toepassing van standaardmethoden, in TCG CGA, onder definiëring van een Nru I plaats. Geen verandering van de gecodeerde 35 aminozuurvolgor-de was hiervan het gevolg Het bereiden van prAK-3 is beschreven in de hierna volgende stap a) van voorbeeld l.Het eerste tussenprodukt bij het bereiden van andere plasmiden prAK-7 en prAK-9 is eveneens prAK-3.

8900481J

i - 17 -

De DNA-gedeelten, afgeleid van verschillende lengten van enkelstrengs DNA-gedeelten uit prAK en prAK-3 (zowel strengen die van belang zijn als die welke het niet zijn) die op een gebruikelijke wijze zijn gemuteerd, zoals 5 bijvoorbeeld is beschreven door Craick in Biotechniques jan/feb 1985, blz. 12-19, "Use of Oligonucleotides for Site-Specific Mutagenesis", zijn hierin terwille van het gemak aangeduid als M-l en M-2, waarbij M-l het gedeelte met 375 basenparen tussen de twee Xba I plaatsen in prAK en M-2 het 10 gedeelte tussen de Bam Hl en Xba I plaatsen in prAK-3 definieert (zoals afgebeeld in fig. 1).

De mutatie gevonden tussen de twee Xbal plaatsen volgens de uitvinding kan gemakkelijk worden verkregen onder toepassing van de hierin beschreven prAK-7, prAK-8 of prAK-9 15 plasmiden en synthetische dubbelstrengs oligonucleotiden geconstrueerd en toegepast op analoge wijze als de werkwijzen beschreven in voorbeeld 2.

Na de mutatie worden de gemuteerde enkelstrengs gedeelten volgens gebruikelijke methoden dubbelstrengs 20 gemaakt. In het geval van de M-l mutanten, onder toepassing van prAK als een mutatiedrager, werden de verkregen, dubbelstrengs, mutaatplasmiden getransformeerd in E.coli JM103, aangebracht op YT agar bevattende 50 jug/ml ampicil-line en een nacht geincubeerd, ter verkrijging van veel-25 vuldige koloniën met een variëteit van verschillende mutaties in plasmiden dezelfde als prAK behalve voor de mutaties.

In het geval van de M-2 mutanten , werd het gemuteerde , dubbelstrengs gedeelte tussen de Bam Hl en Xba I 30 plaatsen in de mutatiedragers weggenomen onder toepassing van respectievelijk Bam Hl en Xba I restrictie-endonucleasen en gebonden in prAK-3 vectoren behandeld met dezelfde twee enzymen. De verkregen M-2 gebied mutant-bevattende prAK-3 plasmiden werden 35 getransformeerd in E.coli JM103, aangebracht op YT agar met 50 ptg/ml ampicilline en een nacht geincubeerd ter verkrijging van andere veelvuldige ko-loniën waarbij verschillende andere mutaties zijn betrok- ken.

890 0481.

i - 18 -

Het onderzoek voor het aantonen van de werking van de gemutageneerde endotoxinevolgorden, tot expressie gebracht door DNA aanwezig in bijvoorbeeld E.coli JM103 of E.coli SG 4044 ( voor het publiek beschikbaar uit de Agricultural 5 Research Culture Collection (NRRL) , Peoria, Illinois, depotnummer B-15969) werd uitgevoerd volgens het "Tobacco Budworm" onderzoek (TBW) of T.ni onderzoek of beide, zoals beschreven in het hierna volgende voorbeeld A. Het DNA van mutanten die een grotere werking ten opzichte van standaard, 10 niet-mutant endotoxine vertoonde werd sequenced in de relevante mutatiegebieden ter bepaling van de mutatie in het DNA en dus in de eiwitvolgorde . Meer dan 6000 verschillende koloniën met plasmiden die M-l of M-2 gemutageniseerde delen bevatten werden aldus onderzocht en in het algemeen bleken 15 1-3 aminozuurveranderingen plaatsgevonden te hebben bij elk mutatieexperiment.

Tabel B hierna identificeert de up-mutanten die rechtstreeks zijn gewonnen als resultaat van de mutatie-proeven, de plaats van het aminozuur met betrekking tot de 20 plaatsnummers aangegeven in tabel A waarbij elke mutatie plaatsvindt, elk codon gemuteerd in elke mutant en de ami-nozuurverandering die op de aangeduide plaats optrad ten gevolge van de codonverandering.

In tabel B geven de min of negatieve aminozuur 25 plaatsgetallen de veranderingen aan tussen de Bam Hl plaats en het Met op de 1-plaats bij het begin van de endotoxine-volgorde, welke veranderingen dus niet de volgorde van het endotoxine waarvoor gecodeerd wordt door de mutantvolgorde beïnvloeden.

30 De in de hierna volgende tabel B geïdentificeerde mu tanten werden in alle drie fasen van het TBW onderzoek onderzocht , waarbij resultaten werden verkregen die in tabel B-l zijn opgenomen. Verschillende van deze mutanten zijn eveneens onderzocht met het T.ni-onderzoek. waarvan de 35 resultaten zijn opgenomen in de hierna volgende tabel B-2.

8500481.

- 19 -

Tabel B

Mutatie- Mutant Plaats van Verandering in het en- gedeelte het amino- dotoxinegebied zuur Nucleine- Amino- 5 zuur zuur M-l p26-3 119 GCA in ACA Ala in Thr 130 ATG in ATA Met in Ile 201 GGC in GAC Gly in Asp 10 M-l p48al4 101 GAA in AAA Glu in Lys 116 GAG in AAG Glu in Lys 217 CGT in CAT Arg in His 15 M-l p48c5 116 GAG in AAG Glu in Lys 187 GCG in ACG Ala in Thr M-l p36a65 122 ACT in ATT Thr in Ile 125 GCA in GTC Ala in Val 20 M-2 p95a76 123 Att in TAT Asn in Tyr M-2 p95a86 188 ACt in TCT Thr in Ser 25 M-2 p98cl 188 ACT in TCT Thr in Ser M-2 p99c62 204 ACA in ACT Thr in Thr 105 ATT in TAT Asn in Tyr 4 ATT in TAT Asn in Tyr 30 M-2 pl07c22 194 AAT in AAA Asn in Lys 94 AAC in AAA Asn in Lys M-2 pl07c25 184 TTT in ATT Phe in Ile 35 -11 TTG in TAG ---------- M-2 pll4a30 95 CAA in AAA Gin in Lys -15 TAT in TAA ---------- 8900481.

- 20 - i

In de hierna volgende tabel B-l geeft de lagere beoordeling in de toxiciteitskolom de grotere mate van activiteit aan (zie voorbeeld A voor een verklaring van de toxiciteitsbeoordelingen) en de controles hebben betrekking 5 op een equivalente hoeveelheid E.coli JM103 cellen en E.coli SG4044 cellen die niet zijn getransformeerd door een plas-mide. Er wordt op gewezen dat alle mutanten aanzienlijk actiever zijn dan het bekorte natieve endotoxine geproduceerd door een equivalente hoeveelheid van dergelijke cellen die 10 het plasmide prAK bevatten.

Tabel B-l

Mutant met betrekking Toxiciteitsbeoordeling 15 tot tabel B Gemiddelde toxiciteit p26-3 2/75 p48al4 2/25 p48c5 2/63 p36a65 1/50 20 p95a76 2/50 p95a86 1,30 p98cl 1,33 p99c62 1,83 pl07c22 1,42 25 pll4a30 2,00 controle (JM103 cellen) 4,68 prAK 3,35 controle (SG4044 cellen) 4,12 30 Tabel B-2

Mutant met betrekking Relatieve tot tabel B werking p26-3 217 p36A65 887 35 p95a76 291 pl07c22 357 pll4a30 239 controle (SAN415) 59 pBT301 100 8900481.

τ - 21 -

In de voorgaande tabel B-2 wordt aan de standaard pBT301 een relatieve potentie van 100 , volgens LD50 toegekend ( voor een volledigere beschrijving zie voorbeeld A) en elke relatieve waarde van de werking die hoger is duidt dus 5 op een toegenomen toxiciteit veroorzaakt door de mutatie.

Bij aanvullend werk ter bevordering van de uitvinding, werden bepaalde mutant DNA's weergegeven in tabel B betrokken bij veelvuldige mutaties, geanalyseerd ter bepaling van het effect van individuele en paren mutaties in 10 dergelijke veelvuldig gemuteerde gedeelten. Een dergelijk sub-kloneren van individuele mutaties of paren ervan werd uitgevoerd onder toepassing van een strategie die de isolatie van een veelvuldig gemuteerd doelwitfragment en vervolgens het knippen ervan bij een restrictieplaats in-15 wendig het fragment en geplaatst tussen twee van de gemuteerde codons inhoudt. De twee helften of fragmentseg-menten werden daarna via een gel geïsoleerd en elk werd gemengd met niet-mutant complementaire helften of fragment-segmenten die verkregen werden door op overeenkomstige wijze 20 dezelfde fragmenten uit prAK te knippen. De prAK vector die was afgeknipt ter isolering van het grotere complementaire fragment werd daarna gemengd met de twee gemengde complementaire helften en alle drie DNA-segmenten werden met elkaar verbonden ter vorming van een gemodificeerd prAK 25 plasmide dat de puntmutatie of mutaties bevat die in het fragment voorkomen en voor de helft afkomstig zijn van de veelvuldige mutantkloon. Meer in het bijzonder werd een plaats voor het restrictie endonuclease Xho II strategisch binnen bepaalde veelvuldige mutantsegmenten geplaatst , 30 teneinde de isolatie van fragmenten met minder dan het totale aantal mutaties in het totale mutantsegment mogelijk te maken. Zoals duidelijk zal zijn was het gebruik van het endonuclease Xho II toepasbaar op een aantal van de veelvuldige mutantsegmenten in tabel B ter verkrijging van 35 fragmenten met een enkelvoudige puntmutatie en anderen met twee mutaties. De veelvuldige mutantplasmiden werden dus eerst behandeld met de restrictie endonucleasen Nsi I en Sst I en de verkregen 1430 basenpaarfragmenten werden door dd004S1.‘ » >> - 22 - gelisolatie afgescheiden. Elk dergelijk 1430 bp fragment werd daarna behandeld met het restrictie endonuclease Xho II en de verkregen 330 bp (Nsi Ι/Xho II) en 1100 bp (Xho II/Sst

I) fragmenten werden via een gel geïsoleerd voor elke veel-5 vuldige mutant. Overeenkomstig werden de niet-mutantfrag-menten van 330 en 1100 bp en het grotere , ongeveer 4Kb Nsi I/Sst I fragment van prAK op overeenkomstige wijze verkregen. Meer in het bijzonder werden geringe hoeveelheden van het grotere segment gemengd met het gemuteerde 330 bp 10 fragment en het niet-gemuteerde prAK 100 bp fragment en het Verkregen mengsel werd gebonden onder vorming van een reeks hybride mutantplasmiden van prAK. Op overeenkomstige wijze werden hoeveelheden van dergelijke grotere prAK

segmenten gemengd met de niet-gemuteerde 300 bp prAK

15 fragmenten en de mutant 1100 bp fragmenten en deze DNA's gekoppeld onder vorming van een andere reeks hybride mutantplasmiden. De hybride mutantplasmiden of klonen die verkregen worden volgens de hiervoor beschreven methode zijn samengevat in de hierna volgende tabel C, waarin de drie 20 gecombineerde segmenten en de mutaties in het verkregen plasmide ten opzichte van het plasmide prAK zijn vergeleken.

Tabel C

25 Nieuwe Vectorsegment Bron van Bron van Mutatie amino- prAK en bron Nsil/ XhoII/ zuurplaats

aan- XhoII SstI

dui- segment segment ding 330 bp 100 bp_ 30 ----------------------------------------------------------------- A prAK Nsil/Sstl p48al4 prAK Glu in Lys @ 101 4 Kb Glu in Lys @ 116 B ,, p26-3 prAK Ala in Thr § 119 C ,, p48c5 prAK Glu in Lys & 116 35 D ,, prAK p48al4 Arg in Hls 6 217 E ,, prAK p26-3 Met in lie @ 130

Gly in Asp @ 201 F ,, prAK p48c5 Ala is Thr § 187 830048 1.

ί - 23 -

Volgens een tweede ronde van hybride mutant kloon-bereiding onder toepassing van dezelfde analoge methode die werd toegepast ter bereiding van de klonen van tabel C, werd 5 een reeks gemengde combinatiemutantplasmiden bereid door de combinatie van drie segmenten van het grote segment (ruwweg 4kb) van de digerering van prAK met Nsi I en SstI , een 330 bp Nsi I/Xho XI fragment van één van de klonen van tabel B en een 1100 bp Xho II/Sst I fragment van een andere kloon 10 van tabel b. De hybride mutantklonen die het resultaat zijn van deze tweede ronde zijn hierna opgenomen in tabel D, waarbij wordt opgemerkt dat de twee plasmiden afkomstig van dit tweede ronde protocol vier aminozuurveranderingen vergeleken met het prAK moederplasmide bevatten.

15 20 25 30 35 8000481.

- 24 -Tabel D

Nieuw ge- Vectorseg- Bron van Bron van „ , ,.

, Mutatie van de ammo- vormde ment en Nsil/Xholl XhoII/ prAK aan- segment SstI seg- zuurplaats 03Γ0Π _ . , 1 1 Λ <v , . 330 bp ment 1100 duiding , bp prAK-J prAK Nsi/Sst p48al4 p26-3 Glu 'in Lys @ 101 4 Kb Glu „ Lys @ 116

Me t ,, Ile @ 130 Gly , r Asp @ 201 prAK-K " p48al4 p48c5 Glu ,, Lys 101

Glu , f Lys @ 116 Ala ,, Thr @ 187 prAK-L " p48c5 p26-3 Glu ,, Lys @ 116

Met ,, Ile (3 130 Gly ,, Asp @ 201 prAK-Μ " p26-3 p48al4 Ala ,, Thr @ 119

Arg ,, His (3 217 prAK-N " p26-3 p48c5 Ala ,, Thr @ 119

Ala , r Thr <? 187 prAK-Ο " p48c5 p48al4 Glu fr Lys @ 116 ' Arg r r His (3 217 prAK-P " p26-3 p36a65 Ala Thr @ 119

Thr '' Ile (? 122 Ala ' Val <a 125 prAK-Q " p48c5 p36a65 Glu ,, Lys @ 116

Thr ,, Ile (3 122 Ala ,, Val @ 125 prAK-R " p48al4 p36a65 Glu ,, Lys @ 101

Glu ,, Lys @ 116 Thr rt Ile $ 122 Ala ,, Val @ 125 prAK-S " p26-3 p95a86 Ala ,, Thr @ 119

Thr ,f Ser (3 188 prAK-T " p48c5 p95a86 Glu ,, Lys @ 116

Thr ,, Ser @ 188 ! 89 00481.' i f - 25 -fVervolg tabel Dï prAK-U prAK Nsi/Sst p48al4 p95a86 Glu in Lys 8 101 4 Kb Glu ,, Lys 8 116

Thr ,, Ser 8 188 5 prAK-53 ,, p99c62 pl07c25 Asn ,, Tyr § 105

Phe ,, Ile § 184 prAK-68 ,, p99c62 p26-3 Asn ,, Tyr § 105 10 Met ,, Xle 8 130

Gly ,, Asp 8 201 prAK-70 ,, p26-3 pl07c25 Ala ,, Thr § 119

Phe ,, Ile 8 184 15 prAK-39 ,, p99c62 p98cl Asn ,, Tyr 8 105

Thr ,, Ser 8 188

De verschillende hybridemutanten weergege-20 ven in de tabellen C en D werden beoordeeld volgens de "Tobacco Budworm" proef van voorbeeld A en deze beoordeling omvatte de mutantklonen van tabel B ter vergelijking, onder andere, van het effect van het in hoofdzaak weglaten of verwijderen van één of twee mutaties uit de oorspronkelijke 25 mutanten van tabel B. De resultaten van deze beoordelingen van de toxiciteit of insecticide werking zijn hierna vermeld in tabel E, waarbij wordt opgemerkt dat : 1) de lagere beoordeling in de toxiciteitskolom de grotere mate van werking aangeeft (zie voorbeeld A voor een verkla- 30 ring van de beoordelingen ) , en 2) de controles betrekking hebben op een equivalente hoeveelheid van JM103 cellen en SG4044 cellen die niet door een plasmide zijn getransformeerd. Verder wordt opgemerkt dat de meeste mutanten , indien niet alle, die beoordeeld 35 zijn in beide dergelijke typen E.coli cellen en de mutant-resultaten in de tabellen hierin welke betrekking hebben op beide controles dienen te worden opgevat als een gemiddelde van de resultaten voor de mutanten tot expressie gebracht uit beide celtypen.

£900481.

i - 26 - t

Tabel E

Mutant met betrekking tot Toxiciteitbeoordeling de tabellen B,C of D „

Gemiddelde toxiciteit _controle___4,68__ _prAK__‘3,35_ ____A_;___2,05_ _B_______2,90___ _C____2^68__ _D__3^40___ |__E__2 ^ 50____

'i F 3.00 I

- 3--j

| E. coll SG 4044 (Contro-|fi _4,12__I

!_J___2,25 j I__K_____2,06_ ί L 2,08 .

!---r?-- !_M__3,10_! _N__2^73__ 0 2.70 ---j- _P__1 700_ _Q__V?___ j_R__2;85__ _S__2«. 16_ __T__1^20____ u 2,07 -- i- __53__3^0 8___ _68__2,00_ ___70__T ^ 50___ 39 2550 j 8900481.

« - 27 -

De uitvinding geeft verder een demonstatie van het vermogen voor de algemene aminozuursubstitutie op de amino-zuurplaatsen waarbij de willekeurige begin DNA-mutaties amino zuurver ander ingen geven , waarbij een grote 5 verscheidenheid van nieuwe , insecticidaal actieve B.t. endotoxine-eiwitten worden verschaft. Dit vermogen werd betrekkelijk gemakkelijk aangetoond met de zogenaamde "codon-spin" proeven, waarbij geselecteerde codons betrokken bij de aanvankelijke mutatieveranderingen werden veranderd in 10 de codons voor de andere natuurlijke aminozuren. Deze nieuwe mutanten brachten een endotoxine-eiwit met insecticide werking tegen de "Tobacco Budworm" tot expressie. Teneinde een dergelijk onderzoek efficiënter uit te voeren, werd een reeks van unieke plasmiden van het prAK type bereid voorna-15 melijk uitgaande van prAK en culminerende in het plasmide prAK-7 en andere tussengelegen plasmiden die achtereenvolgens in de volgorde van bereiding prAK-3, prAK-4, prAK-5 en prAK-6, zijn , zoals beschreven in voorbeeld 1. Het plasmide pB8rII zoals weergegeven in fig. 2 is in alle opzichten 20 identiek met het plasmide prAK, behalve dat het DNA coderende voor een verkort endotoxine bevat dat wat korter is dan dat waarvoor gecodeerd wordt door prAK en afgezien van niet ter zake doende modificaties van het moederplasmide uitgevoerd in het gebied van de verknoping ervan met het 25 stroomafwaarts gelegen uiteinde van DNA bekort endotoxine structurele gen, welk structurele gen, zoals afgebeeld in fig. 2, de Κρη I in het natieve gen af beeldt, terwijl in prAK de plaats is weggelaten en het prAK structurele gen eindigt bij ongeveer de voorafgaande positie van de genoemde 30 plaats. Het plasmide prAK-7 is bedoeld ter expressie van dezelfde endotoxine aminozuurvolgorde als plasmide prAK, doch zijn gemodificeerde DNA volgorde is gemodificeerd teneinde niet alleen de Nru I plaats van prAK-3 , doch eveneens een Hind III, Mst II en BssH II plaats te bevatten 35 en bovendien is de Hind III plaats oorspronkelijk aangetroffen in prAK bij voorkeur verwijderd. Zoals meer in het bijzonder is aangegeven in fig. 1 kunnen de achtereenvolgende volgorde van de berei-ding van prAK-7 uit ad o 04d 1 - 28 - prAK en de toevoeging of weglating van een plaats bij elke stap worden samengevat als volgt: prAK----------» prAK-3 (voeg toe Nru I) prAK-3---------» prAK-4 (voeg toe Hind III) 5 prAK-4---------» prAK-5 (voeg toe Mst II) prAK-5---------» prAK-6 (voeg toe BssH II) prAK-6 ---------» prAK-7 (schrap oorspronkelijk Hind III)

De hierboven aangeduide plaatsen werden ongeveer 40 basenparen apart ingevoerd , zodat een geautomatiseerde DNA-10 synthetiseerinrichting doeltreffend kon worden toegepast voor het bereiden van kleine , dubbelstrengs DNA fragmenten, die bij hun twee uiteinden eindigen met nucleotiden die het complementaire residu van de restrictieplaatsresten te vormen in prAK-7 zijn indien dit met de twee relevante res-15 trictie endonucleasen wordt geknipt. Dergelijke fragmenten kunnen derhalve gemakkelijk worden aangebracht in prAK-7 volgens standaard knip- en plakmethoden (zie het hierna volgende voorbeeld P) ter verkrijging van een plasmide dat in staat is een endotoxine-eiwit tot expressie te brengen dat 20 identiek is met dat van prAK, afgezien van de aminozuur-veranderingen waarvoor gecodeerd wordt door het gesynthetiseerde fragment gesubstitueerd in prAK-7 voor het overeenkomstige fragment in prAK-7 , als in voorbeeld 2 gegeven.

De figuren 3 A en 3B stellen twee kleine dubbel-25 strengs DNA fragmenten voor volgens de hiervoor beschreven codonspinstrategie te substitueren in het Hind III/Mst II gedeelte in prAK-7. Het dubbelstrengs fragment weergegeven in fig. 3A was ontworpen ter verkrijging van elk aminozuur op de aminozuurplaats 116 in de bekorte B.t. endotoxinen, 30 tot expressie gebracht door de prAK plasmiden door geschikte se-lectie van het XXX codon in overeenstemming met de genetische code. Op overeenkomstige wijze was het dubbelstrengs fragment weergegeven in fig. 3B ontworpen ter verkrijging van een aminozuur op de aminozuurplaats 119 in de 35 bekorte B.t. endotoxinen geproduceerd door de prAK plasmiden door geschikte selectie van het XXX codon in dit fragment. Zoals duidelijk zal zijn kunnen de andere dubbelstrengs fragmenten die nodig zijn voor substitutie in de Spe I/Nrü 89 0 0481.! « c - 29 - I plaats,( een fragmenttrajeet van ongeveer 115 basenparen dat eveneens met geautomatiseerde DNA synthetiseerinrich-tingen kan worden bereid), de Nru I/Hind III plaats en de Mst II/BssH II plaats in prAK-7 en ontworpen ter codering 5 van alle aminozuren op alle mutatiepunten aangetroffen in deze gedeelten, volgens analoge standaardmethoden worden bereid. Dus de overblijvende 18 van de 19 natuurlijke amino-zuurveranderingen of mutaties die op elk mutatiepunt tussen de Nru I en BssH II plaatsen in prAK-7 moeten worden uit-10 gevoerd, kunnen gemakkelijk met plasmide prAK-7 worden verricht.

Teneinde alle mutatiepunten binnen de betreffende volgorde van 116 aminozuren voor geschikt spinning van relevante codons te omvatten, kan het plasmide prAK-7 worden 15 toegepast ter bereiding van plasmide prAK-8, dat weer zelf uiteindelijk wordt toegepast ter bereiding van prAK-9, zoals beschreven in voorbeeld 1. In fig. 5 zijn alle relevante restrictieplaatsen zoals uiteindelijk verzameld in prAK-9 weergegeven in een vergroot , uitgesneden gedeelte 20 van prAK-9. De Spe I plaats weergegeven in fig. 5 is eveneens een unieke plaats die reeds in prAK, prAK-3 enz. aanwezig was. Zoals duidelijk zal zijn kunnen de plasmiden prAK-7, prAK-8 en prAK-9 worden toegepast ter invoering van veelvuldige mutatieveranderingen tussen elk paar restrictie-25 plaatsen en/of ter verkrijging van DNA coderende voor tenminste één verandering in twee of meer van dergelijke locaties, zodat een grote verscheidenheid van veelvuldige mutantcombinaties, waarbij oorspronkelijke mutatiepunten aangetroffen volgens de uitvinding zijn betrokken, kan wor-30 den geconstrueerd, ter verkrijging van een grote verscheidenheid van nieuwe, insecticidaal actieve, B.t. endotoxine-eiwitten.

Zoals ook duidelijk zal zijn, zijn plasmiden zoals prAK-7, prAK-8 en prAK-9 volledig capabele plasmiden voor 35 het wijzigen van één of een aantal codons binnen elk van de restrictieplaatspaarlocaties teweeg gebracht in deze plasmiden. Indien veranderingen binnen één of twee doch minder dan drie van dergelijke locaties zijn gewenst, kunnen plasmiden 89 0 04 81 « - 30 - zoals prAK-4 of prAK-5 worden toegepast indien ze de gewenste locatie van veranderingen omvatten , bij voorkeur na verwijdering van de oorspronkelijke Hind lil plaats in prAK en indien dergelijke plasmiden niet geschikt zijn, zal 5 duidelijk zijn dat een plasmide van het prAK type dat één of een aantal van dergelijke locaties bevat op een gebruikelijke wijze kan worden bereid door de keuze van het invoeren van de restrictieplaatsparen toegepast ter modificering van prAK ter bereiding van prAK-9 te variëren 10 of te beperken. De uitvinding verschaft dus eveneens éen verscheidenheid van nieuwe plasmiden die bruikbaar zijn voor het bereiden van mutanten en mutantcombinaties volgens de uitvinding en die één of een aantal van de restrictieplaatsparen uiteindelijk geproduceerd in prAK-9 15 bevatten.

Zoals eveneens duidelijk zal zijn kan DNA dat één of een aantal van dergelijke restrictieplaatsparen bevat worden uitgeknipt, vóór of na het modificeren teneinde één of een aantal mutaties volgens de uitvinding te hebben, uit de 20 plasmiden van het prAK type door te knippen op restrictie-plaatsen die buiten het gewenste mutatiegebied(en) liggen en die overeenkomstig worden gevonden in een ander plasmide voor een B.t. endotoxine en daarna (ligatie volgens standaardmethoden) het uitgeknipte DNA segment in te voegen 25 in een dergelijk ander B.t. endotoxineplasmide waarin op overeenkomstige wijze is geknipt, waardoor het mogelijk wordt, dergelijke andere plasmiden op een geschikte wijze te modificeren of direkt de mutaties volgens de uitvinding daarin op te nemen.

30 Ter opname van mutaties verschaft volgens de uitvin ding in een voor endotoxine coderende volgorde met volle lengte, werd een plasmide bevattende het DNA structurele gen voor het 5-endotoxine van B.t. wuhanensis toegepast terwille van het gemak en de toen gemakkelijke 35 beschikbaarheid. Dit plasmide, pBT210 is weergegeven in fig. 4. Het plasmide pBT210 bevat het endotoxine structurele gen met volledige lengte uit B.t. wuhanensis , zoals is aangegeven door de dikke, donkere lijn in fig, 4 en , in 8900481.

£ - 31 - analogie met figuur 1, eveneens een volgorde bevattende een B.t. ribosomale bindingsplaats, verkregen uit B.t. wuhanensis tezamen met het structurele gen aangegeven in fig. 4 door het donkere vierkantje. Het plasmide pBT210 is 5 een geheel competente E.coli expressievector bevattende hetzelfde E.coli promotorsysteem als de prAK plasmiden , een E.coli bron van replicatie (niet aangegeven) en een gen voor de resistentie tegen chlooramfenicol zoals aangegeven in fig. 4. De pijlen in fig. 4 wijzen op de afleesrichting 10 van het B.t. wuhansensis gen onder controle van de E.coli promotor en van het gen voor de bestandheid tegen chlooramfenicol. Op basis van de volgordeinformatie die in ons bezit is , is het volledige operon (structurele gen, ribosomaal bindingsvolgordegedeelte afgeleid van B.t. en 15 E. coli promotor-operatorvolgorde ) zeer gelijkend en slechts onbetekenend verschillend van het operon in het plasmide prAK. In het bijzonder is het DNA coderende voor de 610 aminozuren van het actieve gedeelte van het B.t. endotoxine (tabel A) en voortgaande in het protoxinegebied 20 tenminste ongeveer tot en met de Κρη I plaats weergegeven in fig. 4 voor pBT21Q, identiek aan de overeenkomstige DNA volgorde in het prAK plasmide. In het DNA gebied stroomafwaarts van de Κρη I plaats in het B.t. structurele gen in pBT210 tot het einde van een dergelijk structureel gen zijn 25 er onbekende , doch geringe verschillen vergeleken met het overeenkomstige gedeelte van het B.t. kurstaki HD-1 gen gericht op het maken van prAK. Deze verschillen zijn geïndiceerd door restrictie endonuclease mapping . Het plasmide pBT210 codeert voor een endotoxine met volledige lengte 30 zoals weergegeven in tabel A en is volledig homoloog in het actieve gedeelte ( en door tenminste de aminozuren geproduceerd tot de Κρη I plaats ervan tot het $-endotoxine uit B.t. kurstaki HD-l in de klonen prAK en pBSrII) en heeft een aanzienlijke homologie in de balans van het protoxine-35 gedeelte. Tenslotte is de ribosomale bindingsplaats in pBT210 identiek met die in prAK en het volledige DNA waaronder de ribosomale bindingsplaats (RBS) valt en zich uitstrekkende stroomopwaarts vanaf juist voor het begin Met 8900481. .

) - 32 - terug via de Bam Hl plaats komende bij het promotorgedeelte zijn dezelfde in pBT210 en in prAK , behalve dat er in pBT210 twee nucleotideveranderingen onmiddellijk na de Bam Hl plaats zijn (CC in plaats van GT zoals in prAK ) en 5 drie nucleotiden (TTT), zoals aangetroffen in prAK onmiddellijk na 2 van dergelijke nucleotiden zijn weggelaten in pBT210 , deze verschillen treden louter op als resultaat van verschillende bindingsstrategieën bij het verbinden van de RBS gedeelten uit B.t. met het E.coli 10 promotorgedeelte via een Bam Hl plaats. Het plasmide pBT210 kan worden toegepast ter bereiding van mu-tant B.t.

5-endotoxine-eiwit met volle lengte met één of meer van de veranderingen van aminozuur verschaft volgens de onderhavige uitvinding. De Nsi I plaats, de twee Xba I 15 plaatsen, de Sst I plaats en de eerst verschijnende stroomafwaartse Hind III plaats weergegeven in fig. 4 voor pBT210 komen overeen met dezelfde plaatsen weergegeven in fig. 1 voor prAK (het DNA voor beide plasmiden in dit gebied is identiek, zoals hiervoor reeds werd vermeld ).

20

Voorbeeld A

1. Trichonlusia ni (T. ni) onderzoek

Er werden proeven uitgevoerd op larven in het tweede 25 ontwikkelingsstadium. Alle insecten werden gehouden in klimaatkamers, onder standaardomstandigheden wat betreft temperatuur, vochtigheid, enz., gedurende de gehele onderzoek-periode en werden gevoed met een standaard kunstmatig dieet. De te onderzoeken verbindingen werden aan de insecten toe-30 gediend als onderdeel van het dieet , waarbij elke concentratie van het te onderzoeken materiaal werd toegediend aan een groep van 20 insecten. De insecten werden gedurende een periode van 7 dagen na de behandeling gevolgd, waarna de LD50 van de insecten werd bepaald. De LD50 waarde kan 35 worden gedefinieerd als een schatting van de dosis materiaal die nodig is om een mortaliteit van 50% bij de dieren te induceren . De eindresultaten zijn uitgedrukt als relatieve werking, waarin : 6900481.

- 33 - LD50 van standaard

Relatieve werking = "— - - - - — x 100 LD50 van experiment 5 Onder toepassing van de hiervoor beschreven methode kunnen de absolute waarden van LD50 worden verkregen , waarbij de interpretatie van de resultaten eenvoudig is, omdat alle waarden van de relatieve werking die hoger zijn dan van de standaard een werking groter dan die van de 10 standaard aangeven. Verder is een verbinding met een relatieve werking van bijvoorbeeld 400 vergeleken met een standaard van 100 vier malen actiever dan de standaard.

De standaard, met een relatieve werking van 100 bij de hiervoor beschreven proef, was het plasmide pBT301, welk 15 plasmide een 5-endotoxine volgorde van het wilde type met een volledige lengte is , welke identiek is aan pBT210, behalve dat het twee E.coli promotoren bevat, waarvan elk individueel dezelfde is als die in pBT210.

De bij de hiervoor beschreven proef toegepaste 20 controles waren: a) CAG 629 - een E.coli stam die geen i-endotoxine producerende plasmiden bevat en zelf geen insecticide werking heeft (verkregen van C A Gross, Department of Bacteriology, University of Wisconsin), 25 b) SAN 415 - een in de handel verkrijgbaar B.t. insecti cide, te verkrijgen onder de ingeschreven handelsnaam JAVELIN.

2. "Tobacco Budworm" onderzoek fTBW proef) 30

De toegepaste TBW proef was die welke in principe is beschreven door Dulmage en med. (1971) J, Invertebr. Path. 18 240-245, en werd uitgevoerd in drievoud met monsters in souffle caps van een heldere kunststof van één ounce met 35 één TBW-larve in de tweede fase van het ontwikkelingsstadium (4 tot 5 dagen oud, gemiddeld gewicht 1,6 g ) in elke cup.De monsters werden gecombineerd met 15 ml dieet ( bevattende het voedingsmiddelpoeder, vitaminepoeder, agar en andere be- 89 0 04 81.

- 34 - standdelen) zoals beschreven door Dulmage en med, USDA technical Bulletin No. 1528:1-5 (1979) . Het dieet werd gelijkmatig verdeeld over drie cups, die men 30 min liet afkoelen . Men voegde 1 TBW toe (onder gebruikmaking van een 5 borstel van kameelhaar, afmeting 00 ) aan elke cup en de deksels werden goed aangebracht.Deze monsters werden 4 tot 5 dagen geplaatst in een incubator met een temperatuur van 27 °C en een relatieve vochtigheid van 50%. De gewichten van de groep toegepast ter beoordeling van de TBW toxiciteits-10 proef komen overeen met de gewichtstrajecten vermeld in de volgende tabel .

Groepsgrootte Gewichtstrai eet (maV Gemiddeld gewicht (mg) 15 1,0 1,3 - 1,9 1,6 1.5 2,7- 3,1 2,8 2.0 5,5 - 6,3 5,8 2.5 11,7 - 12,3 12,0 3.0 17,3 - 22,2 19,6 20 3,5 30,8 - 34,2 32,8 4.0 50,1 - 52,4 51,1 4.5 76,6 - 94,3 84,8 5.0 119,9 -114,7 113,5 6.0 119,8 -134,3 >140,0 25

De hiervoor aangegeven "groepsgrootte" is gelijk aan de hierin vermelde toxiciteitswaarden. Dus werd na elke proef het gewicht van de larven bepaald en werd toegekend de toxiciteitscore gelijk aan de groep overeenkomende met 30 het gewichtstrajeet waarin het gewicht ervan viel. Behalve, zoals opgemerkt hiervoor, dat aan alle dode larven een groepsgrootte en toxiciteitsbeoordeling van 0 werden toegekend. De toxiciteitsbeoordelingen van alle replica's werden gemiddeld, ter verkrijging van de resultaten die 35 hierin zijn vermeld , waarbij typerend alle resultaten zijn gebaseerd op tenminste 30 replica's.

De cups werden geopend totdat trajecten van TBW's van andere grootten werden gelocaliseerd. Deze TBW's werden 8900481.

- 35 - gewogen tot één TBW werd gelocaliseerd die binnen elk gewichtstraject viel. De monstercups bevattende de TBW van een bepaald gewichtstraject werden daarna gemarkeerd met het overeenkomstige groepsgroottenummer. Deze cups werden 5 daarna in stijgende volgorde gerangschikt op de laborato-riumtafel. De overige monsters werden vervolgens beoordeeld door visuele vergelijking van de afmeting met het gewogen monster TBW's en dat groepsnummer werd vermeld op een beoor-delingsvel. De dode larven werden geregistreerd met een ,,+" 10 en verkregen een score van nul. De dode larven die helder roze waren of vervloeid leken te zijn werden geacht gestorven te zijn van oorzaken die geen verband hielden met het 5-endotoxine. Deze larven werden aangeduid met a en niet bij de resultaten geteld.

15 De standaard monsterafmeting van 1 ml van een prAK

cultuur verdeeld over drie cups resulteerde in een vertraging van de groei in het midden van het traject van toxiciteitsbeoordelingen. Daarom is de proef bruikbaar voor het onderscheiden van de klonen met toenemende toxiciteit 20 van die met een verminderde of gelijke toxiciteit als de niet gemuteerde ouder. De proef gaf een dosis-respons afhankelijk van de hoeveelheid prAK cultuur toegepast bij de proef. Hoe groter dus de hoeveelheid van de prAK-bevattende bacteriën die aan de monsters werd toegevoegd, des te groter 25 de mate van toxiciteit voor de TBW die werd waargenomen. De dosis-responskromme van prAK was bruikbaar ter beoordeling van de mate waarin de klonen toxischer zijn dan de niet gemuteerde ouder. De volgende tabel licht de dosis-respons van de prAK-bevattende bacteriën toe: 30 Hoeveelheid prAK Toxiciteitsbeoor-

Toeqevoeqde stationaire cultuur delingen 5 ml 1,5 1,5 2,0 2 2 2,5 2,5 1 3 3 3,5 35 0,5 3 3,5 4 0,25 3,5 4 4

Op basis van de hiervoor gegeven beoordeling, werden 8900481.

i - 36 - alle cultures onderzocht onder toepassing van 1 ml cultuur teneinde , in verband met de verkregen groepsgrootten, teneinde een groot traject mogelijk te maken ter bepaling van die met een grotere of kleinere werking ten opzichte van 5 prAK (en andere niet gemuteerde plasmiden) als standaard.

Het voedingsdmiddelpoeder dat bij de TBW-proef werd toegepast werd gemengd in de volgende hoeveelheden op basis van grammen: sojabonenmeel, 1103,4 g; tarwekiem, 429,4 g;

Wesson zoutmengsel, 292,4 g; sucrose, 164,2 g; methylpara-10 benzoaat, 24,6 g en sorbinezuur , 14,8 g.

Het bij het TBW onderzoek toegepaste vitaminepoeder werd gemengd in de volgende hoeveelheden op basis van grammen: calciumpentothenaat 12,0 g; nicotinezuuramide, 6,0 g; Ribo-flavine, 3,0 g; foliumzuur, 3,0 g; thiamine HC1, 1,5 g; 15 pyridoxine HCl, 1,5 g; Biotine, 0,12 g en vitamine B12# 6,0 g .

De volgende drie onderzoekmodellen van de TBW proef (primaire, secundaire en verdunnings-reeks) werden bij verschillende beoordelingsstadia toegepast en hiernaar wordt in 20 deze beschrijving verwezen.

Primair onderzoek: men combineerde fracties van 1 ml van cultures van twee gescheiden klonen van 18 uren met TBW dieet in een conische centrifugebuis van 50 ml en verdeelde deze gelijkmatig over drie cups (met 1 TBW per cup). Deze 25 monsters werden beoordeeld naast controles van met prAK of pBT210 van het wilde type getransformeerde cellen en niet-getransformeerde cellen die op een overeenkomstige wijze waren bereid.

Secundair onderzoek: monsters met een grotere toxici-30 teit ten opzichte van de TBW's bij het primaire onderzoek werden gekozen voor een tweede onderzoek. Geselecteerde mutantkoloniën werden geent uit de verzamelplaten in YT/Amp cultuurvloeistof (één kolonie per cultuur). Daarna werden 10 monsters van 1 ml beoordeeld tezamen met geschikte 35 controles. Klonen die een grotere toxiciteit ten opzichte van TBW's vertonen werden aangeduid als "mogelijke up-mutanten" en werden ten derde male onderzocht. Die welke hun "up " fenotype ten derde male herhaalden werden geidentifi- 8900481.

- 37 - ceerd als "up-mutanten" en werden met een reeks verdunnings-proeven onderzocht teneinde nauwkeuriger de mate van verhoogde werking ten opzichte van de ouder van het wilde type te bepalen.

5 Verdunninosreeksonderzoek: mutanten die een "up" feno-type ten opzichte van de niet-mutantconstructie vertoonden werden onderzocht met het TBW onderzoek bij een verdunningsreeksproef op basis van het drooggewicht van ge-lyofiliseerde bacteriëncellen die hetzij de mutant of het 10 toxine van het wilde type uit prAK of pBT210 klonen die 18 uren waren gegroeid ( en waarbij vóór het lyofiliseren van de cellen persstukjes waren gemaakt) bevatten. Er werden monsters in drievoud met elk van de volgende verdunningen in een eindvolume van 15 ml gemaakt: 167 jLtg/ml, 67 pg/jal en 15 33 jLtg/ml. SDS-PAGE en Western (immunoblotj analyse werd uitgevoerd op het eiwit uit deze mutanten , typerend met 75 μ<3 drooggewicht cellen per strook. De resultaten van de ver-dunningsreeks bevestigen op essentiele wijze de resultaten van de voorgaande onderzoekingen en zijn verder 20 niet hierin vermeld of gemiddeld in de tabellen hiervan die de biolo-gische resultaten vermelden .

Voorbeeld 2 - Regulaire methoden

In de volgende genummerde voorbeelden of verder in 25 deze beschrijving werden de volgende regulaire of standaard-laboratoriumonderzoekingen toegepast waarbij wordt verwezen naar het volgende, tenzij de beschrijving anders aangeeft.

Voorbeeld P-li Het houden en groeien van bacteriële 30 en fagenstammen.

E.coli stammen SG4044 en JM103 waren gastheer voor alle plasmideconstructies. De E.coli stam JM103 en de fagen Ml8 en MP19 werden verkregen van biolaboratoria uit New England . Deze bacteriële stammen liet men groeien in YT 35 medium ( 5 g per liter gistextract, 10 g epr liter bacto-trypton en 5 g per liter natriumchloride). Het medium werd aangevuld met 50 mg/1 ampicilline voor de groei van cellen die prAK of derivaten van dit plasmide bevatten en met 20 890 0481 .

- 38 - mg/ml chlooramfenicol voor cellen die pBT21Q of derivaten van dit plasmide bevatten .

Voorbeeld P-2: Voortplanting en isolatie van face DNA 5 Bereiding van M13 afgeleide recombinant fagenverzame- lingen en isolatie van fage DNA werd uitgevoerd onder toepassing van reeds eerder beschreven methoden (Messing, J.

(1983) Methods Enzymol. 101:20-78).

10 Voorbeeld P-3: Bereiding van synthetische oliqonucle- otiden

Synthetische oligonucleotiden werden bereid onder toepassing van automatische synthesen met een Applied Biosystems (Foster City, CA) 380A DNA synthese-machine.

15 Zuiveringsstappen, zodra eenmaal de cyclus was vol tooid, waren de volgende : het synthetische oligonucleotide werd gedeblokkeerd door toevoeging van een gelijk volume ammoniumhydroxyde en een nacht incuberen bij 55°C. Na verwijdering van ammoniumhydroxyde door achtereenvolgende 20 ronden van speed-vacuum centrifugatie en weer suspenderen in gedestilleerd water, werd het oligonucleotide verder gezuiverd door ureum-polyacrylamide gelelektroforese (Urea-PAGE) . Teneinde de band zichtbaar te maken werd de gel gebracht op een dubbellaag chromatografieplaat bedekt met 25 een SaranR omhulsel en het oligonucleotide werd bestraald met ultraviolet licht met korte golflengte. Na het uitsnijden van het oligonucleotide bevattende gedeelte van de gel met een scheermes , werd het oligonucleotide uit de gel ge-elueerd in 0,5 M ammoniumacetaat, 1 mM EDTA , bij pH 8,0 en 30 37 eC, gedurende de nacht onder beweging. Na een nacht elueren werden van de gelfragmenten persstukjes gemaakt bij 6000 omw/min in een JA20 rotor en de bovenstaande vloeistof die het geelueerde oligonucleotide bevatte werd in een nieuwe buis overgebracht. Precipitatie met ETOH werd toe-35 gepast teneinde het oligonucleotide te concentreren en het werd gekwantificeerd door absorptie bij O.D.260. 200 Pmol van het oligonucleotide werd gekinaseerd met een 40 μΐ reactie met twee eenheden T4 nucleotide kinase en 0,05 mM ATP.

8900481.

* * - 39 -

Voorbeeld P-4i DNA transformatie van E. coli cellen A) E.coli JM103 of SG4044 competent voor DNA transformatie werd bereid volgens een gewoonlijk toegepaste methode zoals beschreven in (Cohen , s.N., Chang, A.C.P. en 5 Hsu, L. [1972] Proc. Natl.Acad. Sci. USSA 69:2110-2114).

Voor plaats-gerichte oligonucleotide mutagenese proeven werd heteroduplex recombinantfage (M13) DNA (60 ng) toegevoegd aan 0,2 ml competente cellen en dit werd 15 min op 0eC gehouden. Vervolgens werden de cellen 2 min op 42eC gehouden 10 en 30 μΐ van dit mengsel werd toegevoegd aan 3 ml YT cultuurvloeistof bevattende 0,7% bactoagar gehouden op 42 eC ter verhindering van vastworden en 0,2 ml van een verse, s'nachts bewaarde culture van JM103 of SG4044. Het mengsel werd onmiddellijk verspreid op een YT agarplaat (YT cultuur-15 vloeistof plus 1,5 % bactoagar ) en de platen (omgekeerd) werden een nacht bij 37°C geincubeerd.

B) Plasmide DNA (100 ng) van mutagenese proeven of elke andere ligatie waarbij prAK of pBT210 vectoren zoals 20 hiervoor beschreven zijn betrokken , werd toegevoegd aan 0,2 ml competente cellen (JM103 of SG4044) en 30 min op 0°c gehouden. Daarna werden de cellen 2 min op 42°C gehouden en weer in een ijsbad gebracht. Hoeveelheden van 2μ1 tot 200 μΐ werden gebracht op YT agar bevattende 50 μΐ/ml ampi-25 cilline voor klonen gebaseerd op prAK en 20 μΐ/ml chlooram-fenicol voor klonen gebaseerd op pBT210 en een nacht geincubeerd bij 37eC.

Voorbeeld P-5: Restrictieenzvmdiqestie 30 Alle restrictieenzymen werden gekocht bij Bethesda

Research Labs (Gaithersburg, MD) of New England Biolabs. De incubatieomstandigheden waren die welke door de fabrikant werden aanbevolen .

35 Voorbeeld P-6: Liaatie van DNA fragmenten A) DNA ligatiereacties (20 μΐ) bevatten 60 mM Tris-HC1, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, 50 μΚ ATP, 20 nM DNA termini en 20 eenheden T4 DNA ligase (New England 8900481.

- 40 - biolabs). De incubatie duurde 4 uren en vond plaats bij 14 eC.

B) Drie fragmentligaties werden uitgevoerd met 5 fragmenten aanwezig in een molverhouding van 1:1:1 bij een concentratie van 0,04 p.mol elk in 20 μΐ reactievolume. De incubatie vond 4 uren plaats bij 16 °C bij ligatie van slechts een "sticky end" (bijv. XhoII inwendige plaats) of gedurende een nacht voor ligatie van een blunt end (bijv.

10 een FnuD2 plaats). Het New England biolabs (NEB ) T4 ligase werd toegepast in een concentratie van 10 eenheden (NEB definitie) per μΐ reactievolume.

Voorbeeld P-7: DNA sequencing 15 Het bepalen van de DNA volgorde van 5-endotoxine- genes en hun derivaten werd uitgevoerd volgens de keten terminatiemethode van Heidecker en med. (Heidecker, G., Messing, J., en Gronenborn, B. [1980] Gen 10:68-73).

20 Voorbeeld 1

Bereiding van de vectoren prAK-3, prAK-4, prAK-5, prAK-6 en prAK-7

Stap aV Bereiding van orAK-3 25 1 M9 Van het plasmide pB8rII (weergegeven in fig. 2 en hiervoor beschreven) en de replicatieve vorm van DNA uit de bekende M13 fage kloningfactoren MP18 en MP19 werden gelijktijdig gedigereerd met de restrictie endonucleasen Bam Hl (8 eenheden) en Κρη I ( 10 eenheden) gedurende 60 min bij 30 378C in 100 mM natriumchloridebuffer oplossing die eveneens 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2, 100 μg/ml runderserum albumine bevatte. De gewenste fragmenten van deze verkregen DNA mengsels werden gezuiverd door het gehele mengsel te laten lopen op een 1%-ige preparatieve agarosecel teneinde 35 een scheiding naar grootte tot stand te brengen. De banden werden zichtbaar gemaakt door kleuren met ethidiumbromide en te bestralen met ultraviolet licht met lange golflengte. Het gelfragment dat het gewenste DNA bevatte werd uitgesne- 8900481, - 41 - den en het DNA werd geelueerd door elektroforese in een dialysebuisinrichting . Het Bam ΗΙ/Κρη I frgment van pB8rII werd gebonden in de mpl8 en mpl9 Bam ΗΙ/Κρη I uitgeknipte en via de gel gezuiverde vectoren door 4 uren bij 14 °C te 5 incuberen in een totaalvolume van 20 1 bevattende 60 mM Tris-Hcl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, 50 mM ATP, 20 nM DNA termini. Het verkregen DNA werd getransformeerd in competente E.coli JM 103 cellen zoals beschreven in P-4, behalve dat de YT platen isopropylthiogalactoside 10 (IPTG) en 5-broom-4-chloor-3-indolyl-D-galactoside (X gal), beide be-trokken van Sigma Chemical Company, bevatten. Aangezien re-combinantfagen (bevattende het DNA invoegsel geknipt uit pB8rII ) onder deze omstandigheden heldere plaques zullen geven , terwijl M18 en M19 blauwe plaques 15 zullen geven, werden de heldere plaques toegevoegd aan 2 ml E.coli JM103 cellen in YT cultuurvloeistof, een nacht bij 37 eC geincu-beerd en werd enkelstrengs DNA bereid uit de fage volgens de methode zoals beschreven door J.Messing, J.Methods Enzymol. (1983), 101:20-78. Deze gewenste klonen 20 bevattende de grote doch enkelstrengs DNA inzetstukken uit pB8rII werden gei-dentificeerd onder toepassing van agarosegel elektroforese door middel van hun geringere mobiliteit vergeleken met mpl8 of mpl9. Bepaling van de volgorde van een gedeelte van deze klonen met daarin het 25 endotoxine DNA volgens de dideoxy-keten terminatiemethode bevestigde de aanwezigheid van het endotoxine DNA en gaf aan dat mpl8 de niet van belang zijnde streng daarvan en dat mp-19 de van belang zijnde strengvorm daarvan had opgenomen, waarbij beide werden gewonnen. Een niet van 30 belangzijnd oligonucleotide met 26 basen met de volgorde 5' GTC CTT CTA ATC GCG AAA TGG CTT GG3' werd bereid volgens in de vaste fase uitgevoerde synthese in de geautomatiseerde DNA synthetiseerinrichting en gekinaseerd met T4 polynucleotidekinase en ATP, zoals 35 beschreven door Maniatis en med., Molecular Cloning (1982):

A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Een mengsel met een totaalvolume van 60 μΐ bevattende 0,4 μg van de recombinantfage mpl9 bevattende het endotoxine met de van betekenis zijnde streng, 20 mM

8900481.

- 42 -

Tris-HCl, pH 7,5 , 7 mM MgCl2, 1 mM dithiothreital, 50 mM natriumchloride en 10 ng van het uit 26 base bestaande, niet van betekenis zijnde oligonucleotide werd 15 min verhit op 5 68°C, daarna 10 min verwarmd op 37°C en gebracht op 0°c.

Het verkregen mengsel bevattende het mpl9 recombinant DNA met het mutagene oligo gekoppeld werd daarna behandeld door toevoeging van 0,2 mM van zowel dATP , dCTP, dTTp en dGTP, 1 mM ATP, 4 eenheden DNA Polymerase I Klenow fragment (van New 10 England Biolabs) , 0,5 jug E.coli enkelstrengs bindings-eiwit (van Pharmacia, Piscataway, N.J.) en 20 eenheden T4 DNA ligase (New England Biolabs).Het verkregen mengsel werd 4 uren geincubeerd bij 14‘C voor polymerisatie en ligatie en het verkregen cirkelvormige dubbelstrengs heteroduplex DNA 15 werd gebracht in E.coli JM103 en op platen gebracht zoals beschreven in voorbeeld P-4. Daarna werden 20 individuele plaques geselecteerd en enkelstrengs DNA werd uit de fage geïsoleerd, zoals beschreven door Maniatis en med., supra. DNA uit fagen van de 20 plaques elk in een totaal volume van 20 20 1 en bevattende 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KC1, 10 mM

MgCl2, 10 ng van het hiervoor genoemde, niet van betekenis zijnde oligonucleotide met 26 basen en 0,2 μg verschillende cirkelvormige enkelstrengs fage DNA moleculen werd elk 15 min verhit op 68°C en daarna 10 min geplaatst bij 37°C. Het 25 restrictie-endonuclease Nru I ( 8 eenheden) werd aan elk verkregen mengsel toegevoegd en het incuberen werd nog 1 uur voortgezet bij 37"C. Het mengsel werd aan elektroforose onderworpen met een 0,8%-ige agarosegel. Ongeveer 10% van de monsters bevattende DNA migreerden als lineair DNA waardoor 30 de identificatie van de positieve klonen bevattende de gewenste Nru I plaats mogelijk werd en de positieve klonen werden gebracht in E.coli JM103 teneinde een zuivering te verzekeren. Het DNA tussen de Bam Hl en Xba I plaats in de positieve klonen werd daaruit geknipt(na koppeling met ml3 35 sequentie oligo en polymerisatie ter bereiding van dubbel-strengen zoals hiervoor beschreven voor het Nru I oligo) door simultaan te knippen met de endonucleasen voor deze plaatsen en geligateerd (voorbeeld P-6A) met het grote 8900481.! - 43 - fragment ( ongeveer 5004 baseparen en missende het ongeveer twee restrictieenzymen) hetgeen op een gebruikelijke wijze geschiedt,ter vorming van het plasmide prAK-3.

5 Stap b) Bereiding van prAK-4

Volgens de vrijwel volledige methode die analoog is aan de hiervoor beschreven stap a) , werd het enkelstrengs fage DNA verkregen bij stap a) gekoppeld aan een gesynthetiseerd, uit 25 basen bestaand, niet van belang zijnd oligo-10 nucleotide met de volgorde 5 * ccactctctaaagctttctgcgtaa3, bedoeld ter introductie van de Hind III plaats tussen nucleotide plaats nummer 327 en 351 in de nucleotide volgorde aangegeven in tabel A. Positieve klonen die nu zowel de 15 gewenste Nru I als Hind III plaatsen bevatten werden geiden-ticifeerd in een frequentie van ongeveer 6,6% door een beoordeling van de splitsing met het nuclease Hind III en werden toegepast ter bereiding van prAK-4 door ligatie van het Bam HI/Xba I fragment met de nieuwe plaatsen aan het 20 5004 bp grote fragment op de wijze van stap a).

Stap c) Bereiding van prAK-5

Volgens vrijwel de totale werkwijze als de totale werkwijze die analoog is aan stap a) werd het enkelstrengs 25 fage DNA verkregen bij stap b) hiervoor gekoppeld aan een uit 26 basen bestaand gesynthetiseerd, niet van belangzijnd oligonucleotide met de volgorde 5 * GCATCTCTTCSCTTAGGGCTGGATTA3, bestemd ter invoering van de Mst II plaats tussen de nu-30 cleotideplaatsen 366 en 391 in de in tabel A vermelde nucleotide volgorde. Positieve klonen die nu alle drie gewenste Nru I , Hind III en Mst II plaatsen bevatten werden geïdentificeerd in een frequentie van ongeveer 9,1% door beoordeling van de splitsing met het restrictieenzym 35 MstII en werden gebruikt ter bereiding van prAK-5.

8000481.

- 44 -

Stap ch Bereiding van prAK-6

In hoofdzaak volgens de totale werkwijze analoog aan de hiervoor weergegeven stap a) , werden de positieve , dubbelstrengs fageklonen van stap c) hiervoor omgezet in 5 enkelstrengs fase DNA en gekoppeld aan een gesynthetiseerd, niet van betekenis zijnd oligonucleotide van 26 basen met de volgorde 5' gcggttgtaagcgcgctgttcatgtc3, bestemd ter invoering van de Bss HII plaats tussen het 10 nucleotide plaatsnummer 406 en 431 in de nucleotide volgorde in tabel A . De positieve klonen die nu alle vier plaatsen die tenslotte gewenst zijn in prAK-7 bevatten werden geïdentificeerd in een frequentie van ongeveer 12,5% door splitsingsonderzoek met het enzym Bss Hii en werden 15 toegepast ter bereiding van prAK-6.

Stap e) Bereiding van PrAK-7

Vrijwel volgens de totale werkwijze analoog aan de hiervoorgaande stap a) , werd het enkelstrengs fage DNA 20 verkregen bij de hiervoorgaande stap d) gekoppeld aan een gesynthetiseerd, niet van belangzijnd , oligonucleotide met 26 basen met de volgorde 51 tacagtcctaaatcttccggactgta3, bestemd ter eliminering van de Hind III plaats tussen de 25 nucleotide plaatsen met nummers 1682 en 1707 in de nucleotide volgorde in tabel A. Positieve klonen die de totale volgorde gewenst voor prAK-7 weergeven werden in een frequentie van ongeveer 2,8% geïdentificeerd volgens restrictie endonucleaseonderzoek van de replicatieve vorm 30 (dubbelstrengs) van de recombinantfage DNA op het verlies van de Hind III plaats tussen de nucleotiden 1682 en 1707. Dubbelstrengs DNA geïsoleerd uit de mutant werd toegepast ter bereiding van prAK-7.

Ter completering van het verschaffen van een plas-35 mide (prAK-9) met geschikte unieke en ruimtelijke restric-tieplaatsen voor het uitvoeren van codon spinproeven op andere mutatiepunten tussen de twee Xba I plaatsen , kan de ontwikkeling van de plasmiden van de prAK reeks analoog aan 8300481 - 45 - de volgende stappen worden uitgevoerd ter bereiding van een plasmide prAK-8 en daaruit prAK-9 als hierna aangegeven bij de stappen f) en g).

5 Stap f) Bereiding van prAK-8

Vrijwel volgens de totale werkwij ze die analoog is aan de hiervoorgaande stap a) , werd het enkelstrengs fage DNA verkregen bij de hiervoorgaande stap e) gekoppeld aan een gesynthetiseerd, niet van belangzijnd oligomeer bestaan-10 de uit 27 basen met de volgende volgorde: 5' TCCCCACCTTTGGCCAAACACTGAAAC3, bestemd ter invoering van een Bal I restrictieplaats bij ongeveer het nucleotide plaatsnummer 534 in de in tabel A gegeven nucleotide volgorde . De positieve klonen (prAK-8 15 die nu alle 5 gewenste Nru I, Hind III, Mst II , BssHII en Bal I plaatsen bevatten en de Hind III plaats verwijderd bij de bereiding van prAK-7 mist, werden geïdentificeerd op de hiervoor beschreven wijze van stap a).

20 Stap cn Bereiding van prAK-9

Vrijwel volgens de werkwijze die analoog is aan de hiervoorgaande stap a), werd het enkelstrengs fage DNA verkregen bij de hiervoorgaande stap f) hiervoor gekoppeld aan een gesynthetiseerd, niet van belangzijnd oligomeer met 25 30 basen met de volgorde 5« GTTGCCAATAAGACGCGTTAAATCATTATA3', bestemd ter invoering van een Mlu I restrictieplaats tussen de nucleotide plaatsnummers 588 en 595 in de nucleotide volgorde van tabel A. Positieve klonen die nu alle zes 30 gewenste Nru I, Hind III, Mst II, BssHII, Bal I en Mlu I restrictieplaatsen bevatten en de Hind III plaats verwijderd bij de vorming van prAK-7 missen werden geïdentificeerd op de wijze van stap a) en aangeduid als plasmide prAK-9.

Zoals duidelijk zal zijn kan cassette DNA geschikt 35 voor substitutie tussen de Bal I en Mlu I plaasen in prAK-9 geschikt worden gecodeerd ter invoering van alle mogelijke codon- en aminozuurvariaties op de gemuteerde aminozuur-plaatsen 184, 187, 188 en 194.

8S00481 -46 -

Op overeenkomstige wijze kan cassette DNA geschikt voor substitutie tussen de Mlu I en tweede Xba I plaats geschikt worden gecodeerd ter invoering van alle mogelijke codon- en aminozuurvariaties op de gemuteerde aminozuur-5 plaatsen 201 en 204.

Fig. 5 is een schematische weergave van de unieke restrictieplaatsen die ingevoerd kunnen worden tussen de twee oorspronkelijke Xba I plaatsen gevonden in prAK (de eerste dergelijke Xba I plaatsen gevonden in prAK-9 is nu de 10 Nru I plaats).

De onderstreping in de niet van belangzijnde oli-gonucleotiden die hiervoor in de verschillende stappen van voorbeeld 2 is aangebracht, geeft de uit te voeren verandering of veranderingen aan.

15

Voorbeeld 2? Codon soinproeven a) Enkelstrengs oligonucleotiden met de volgorde van elk van de twee strengen weergegeven in de figuren 3A en 3B werden bereid op de wijze als beschreven in voorbeeld P-3 20 met de DNA synthetiseerinrichting die geprogrammeerd is teneinde willekeurig alle nucleotiden A, T, C en G op elk van de X-plaatsen in elke streng weergegeven in fig. 3A in te voeren. In totaal ongeveer 200 μg (na zuivering) DNA van elke gang met de machine werden dergelijke enkelvoudige 25 strengen (weergevende een familie van identieke oligonucleotiden, afgezien van de X-plaatsen van elke streng) volgens een dergelijke werkwijze bereid. Men combineerde 10 pmol van elke streng , al of niet van belangzijnde voor elke codonspin en masse en koppelde door 10 min te verhitten op 30 68 eC en daarna 10 min te verwarmen op 37 eC , waarna werd af gekoeld tot kamertemperatuur en op ijs werd geplaatst. De verkregen massa van dubbelstrengs oligomeren conformerend met het DNA weergegeven in fig. 3A bleek op de XXX-plaatsen (aminozuurplaats 116 ) elke combinatie toegestaan door de 35 genetische code waaronder stopsignalen en multiple, doch variërende aantallen codons voor elk van de 20 natuurlijke aminozuren plus stopsignalen te bevatten. Daarna behandelde men 1 pmol van deze dubbelstrengs oligomeren of cassettes 8900481.

- 47 - met T4 polynucleotide kinase uit New England biolabs en mengde en masse met het grotere fragment (aanwezig in een 10-voudig kleinere molaire concentratie ) verkregen door gelisolatie na de gelijktijdige splitsing van het plasmide 5 prAK-7 met de restrictie endonucleasen Hind Hi en Mst II in 100 mM NaCl 10 mM Tris-HCl pH 7,5 , 10 mM MgCl2, 10 mM 2-mercaptoethanol en 100 /ig/ml BSA en onderwierp het verkregen mengsel aan een koppeling volgens voorbeeld P-6 (A). Een fractie (5μ1) van het verkregen verknopings-10 mengsel werd daarna toegepast voor het transformeren van E. coli JM 103 onder de omstandigheden van voorbeeld P-4(B). Een aantal (200) van de verkregen , getransformeerde cellen werden individueel onderworpen aan de TBW en T.ni onderzoekingen ( zonder voorgaande kennis van welk codon op XXX 15 was in een speciale kloon) en bleek een activiteit te geven waaruit duidelijk bleek dat alle van de verschillende vele mutanten hadden geleid tot een insecticidaal actief eiwit-produkt met een activiteit die tenminste ongeveer die van het controle verkorte endotoxine is met duidelijke up-20 mutanten (5X controle). Hiervoor werden eveneens willekeurige cellen uit de transformatie geselecteerd, aangebracht op platen en men liet koloniën groeien zoals in voorbeeld P-l ter isolatie van plasmide DNA ter DNA volg-ordeanalyse door klonen van het Bam HI/Xba I fragment in 25 de volgordevectoren mpl8 en mpl9 geknipt met dezelfde enzymen. Het DNA in het gebied van elk van de 11 van dergelijke plaats-116 mutaties en de geïdentificeerde up-mutanten werd daarna onderzocht ter bepaling van het aminozuur waarvoor werd gecodeerd op de 116-plaats ervan. Gevon-30 den werd dat één van de twee up-mutanten het oorspronkelijke up-mutant (116-Lys, doch gecodeerd voor door AAA) was. Het andere up-mutant bleek 116-Arg waarvoor werd gecodeerd door CGT te zijn . Eén van de andere klonen bleek het natie-ve 116-Glu(doch gecodeerd door GAA) te zijn. Zeven van de 35 andere lichte mutanten waren 116-Ile (ATT), 116-Cys (TGC), 116-Leu (CTC), 116-Asp (GAT), 116-Asn (AAC), 116-Iel (ATT) en 116-Gly (GGA) , die alle uniek zijn, behalve dat het nieuwe 116-Ile (ATT) werd gerepresenteerd door twee van de 6900481.

- 48 - klonen . De eindklonen codeerden voor 116-STOP (TGA) .

B) De werkwijze van deel A) van dit voorbeeld 2 werd herhaald voor aminozuurplaats-119 onder toepassing van het 5 DNA weergegeven in fig. 3B . Ook nu weer gaf de willekeurige beoordeling van een groot aantal verkregen klonen een activiteitsgehalte bij de TBW en T.ni proeven waaruit duidelijk blijkt dat alle mutantklonen in de verzameling actief waren. (Het percentage inactieve moleculen was 10 ongeveer gelijk aan welke frequentie van stopcodons UAA, ÜAG en UGA te verwachten zou zijn van de willekeurige input in de machine van de nucleotiden op de XXX plaatsen). Zeven willekeurig geselecteerde, individuele klonen waren elk geïndiceerd voor een activiteit die minstens ongeveer die 15 van het bekorte natieve volgorde endotoxine geproduceerd door prAK was , doch geen was een up-mutant volgens onze arbitraire standaard. Uit de volgorden van de zeven individuele klonen bleek dat zij alle verschillend en uniek en wel als volgt waren: 20 119-Leu (CTA), 119-Tyr (TAC), 119-Asp (GAT) , 119-His (CAT), 119-Pro (CCA) , 119-Ile (ATT) en 119-Ser (TCT).

Voorbeeld 3

Mutant volledige lengte B.t. endotoxine 25 Het plasmide pBT210 ( Ipq) werd gelijktijdig geknipt met restrictie endonucleasen Bam Hl) (8 eenheden) en Sst I (8 eenheden) gedurende 60 min in een 100 mM natriumchloride-buffer oplossing die eveneens 6 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2, en 100 ^g/ml runderserumalbumine bevatte. De grotere 30 fractie van de ongeveer 7180 basenparen werden met een gel gezuiverd voor toepassing als een vector. Daarna werd één μg plasmide prAK-26-3 betreffende de mutaties Ala --->Thr@ 119, Met--->Ileê 130 en Gly--->Asp§ 201 eveneens gelijktijdig geknipt met de restrictie endonucleasen Bam Hl 35 (8 eenheden) en Sst 1(8 eenheden) in een 100 mM natrium-

chloridebuffer oplossing die eveneens 6 mM Tris-HCl (pH

7,9,), 6 mM MgCl2 en 100 μg/ml runderserumalbumine bevatte. Het kleinere fragment van ongeveer 1.428 basenparen dat de 8900481.

- 49 -

mutaties evenals het B.t. RBS gedeelte bevatte werd met een gel gezuiverd en een dergelijk fragment werd in een hoeveelheid van 0,06 pmol gecombineerd voor koppelingsdoeleinden met 0,02 pmol van het hiervoor verkregen 7180 basenpaar 5 vectorfragment en samen verenigd in 20 1 koppelingsmedium dat 60 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM

dithiothreitol, 50 MATP, en 20 eenheden T4 DNA ligase bevatte en het verkregen mengsel werd 4 uren geincubeerd bij 14 “C. Het verkregen plasmide, aangeduid met pBt 26-3, werd 10 getransformeerd in E.coli JM103 door toevoeging van 5 μΐ van het genoemde koppelingsmengsel aan 0,2 ml competente E.coli JM103, waarbij het mengsel eerst 30 min op 0°C werd gehouden , daarna 2 min pulsing bij 42'C en tenslotte op ijs werd gebracht. Verschillende hoeveelheden ( 2μ1, 20 μΐ, en 15 180 μΐ) van het verkregen mengsel werden daarna onmiddellijk verspreid op YT agarplaten met 20 μg/ml chlooramfenicol (YT cultuurvloeistof plus 1,5% bactoagar) en de platen werden een nacht bij 37‘C geincubeerd, omgekeerd. Slechts getransformeerde cellen met bestandheid tegen chlooram-20 fenicil kunnen op deze platen groeien. De tegen chlooramfenicol bestandzijnde koloniën werden een nacht bij 37°C gegroeid in een vloeistofcultuur en plasmide DNA werd bereid voor restrictiedigerering met EcoRI reagentia en DNA volgordebepaling teneinde de aanwezigheid van puntmutaties 25 te kunnen bepalen. Succesvolle transformanten die het plasmide pBT 26-3 bevatten werden daarna onderzocht met de TBW en T.ni proeven .

Vrijwel analoog te werk gaande aan het hiervoor beschreven voorbeeld 3 werden de volgende andere mutant-30 endotoxinen met volledige lengte bereid en onderzocht met de TBW en T.ni onderzoeken . De hierna volgende tabel F geeft aan de andere mutant endoxotine producerende plasmiden met volledige lengte/celcystemen die aldus werden bereid, alle met de benaderde resultaten van hun beoordeling met de TBW 35 proef en de benaderde resultaten die met een dergelijk onderzoek werden verkregen voor het produkt van het hiervoor beschreven voorbeeld 3 , het B.t. wuhanensis natieve endotoxine geproduceerd in E.coli JM103 en een controle waarbij niet-getransformeerde JM103 cellen zijn betrokken.

8900481.

- 50 -Tabel F

Voor- Identificatie Bron van de Effectieve , TBW onder- van het nieuwe mutant betreffende zoek beeld mutantplasmide Bam Hl/ mutatie(s) Toxiciteits-

No. met volledige Sst I volg- beoordeling lengte j orde •_ 3 pBT26-3 prAK-26-3 119-Thr 1 130-1le _____20 1 -Asp__ 3-A pBT36a65 prAK-36a6 122-Ile 2 ___;__125-Val__ 3-B pBT-C__prAK-C 11 6-Lys__1 3-C pBT-E prAK-E 130-Ile 2 _ , _ 2Q1 -Asp ___ 3-D pBT-0 prAK-0 116-Lys 2 __;___217-His__ 3-E pBT-R prAK-R 101-Lys 2 116-Lys 122-Ile _____125-Val___ 3-F pBT98cl__prAK-98cl 1 88-Ser__2 3-G pBT-B__prAK-B 11 9-Thr__2 3-H pBT-D.__prAK-D 217-His____3 3-1 pBT-F prAK-F 187-Thr 2,5 3-J pBT-J prAK-J 101-Lys 3 116-Lys 130-Ile _ ___________________ ___ 201 -Asp _ 3-K pBT-M prAK-M 119-Thr 2,5 ______ 217-His__' 3-L pBT-N prAK-N 119-Thr 3 _ ____187-Thr __ 3-M pBT-S prAK-S 119-Thr 1 188-Ser 8900481.

( - 51 - (vervolg tabel F) ! 3-N pBT-T prAK-T 116-Lys 1.5 __;____1 88-Ser___ 3-0 pBT-U prAK-U 101-Lys 2 116-Lys ______1 88-Ser__ 3-P pBT107c22 p107c22 94-Lys 3 _______1 94-Lys__ 3-Q pBT99c62 p99c26 4-Thr 3 105-Tyr |_____204-Tyr___ ï 3-R pBTI 07c25__p107c25 1 84-Ile 3 3-S pBT-A prAK-A 101-Lys 3 j_____116-Lys____ j 3-T pBT-K prAK-K 101-Lys 3 116-Lys i _ 187-Thr i 3-U pBT-P prAK-P 119-Thr 2.5 I 122-Ile 125-Val * I 3-V pBT-Q prAK-Q 116-Lys 3 j 122-Ile j___;__125-Val__ j 3-W pBT39 prAK-39 105-Tyr 3 ! 188-Ser

| — ....... .11 ......... I II II— lil·· . I —I

3-X pBT70 prAK-70 119-Thr 1 ___.___184-Ile___ 3-Y pBT68 prAK-68 105-Tyr 1 [ 130-Ile ! 201-Asp i 'I I I — ..... ‘ 3-Z pBT53 prAK-53 105-Tyr 3 _ 184-I1E__ ! ! Control B.T. - - 3 | Wuhanensis

Control? JM103 - ~ 4^7 8900481 .

- 52 - 5 Voorbeeld 4

Meer mutant B.T. endotoxinen met volledige lengte

Het plasmide pBT210 ( 1 μg) werd gelijktijdig gedigereerd met de restrictie endonucleasen Bam Hl (8 eenheden) en Sst I ( 8 eenheden) en het verkregen 7180 bp grote 10 fragment werd met een gel geïsoleerd. Volgens een reeks afzonderlijke proeven werd elk (1 μg) van de plasmiden prAK, prAK-E, p26-3, p36a65 en p95a86 eveneens gelijktijdig

gedigereerd met de restrictie endonucleasen Bam Hl ( 8 eenheden) en Sst I ( 8 eenheden) en elk verkregen 1428 bp frag-15 ment bevattende een gedeelte van een bekorte endotoxine coderende volgorde werd met een gel geïsoleerd. Elke hoeveelheid van deze 1428 bp fragmenten werd daarna afzonderlijk gedigereerd met het restrictie endonuclease Fnu D2 ( 4 eenheden in 6 mM NaCl, 6 mM Tris HC1 (ph 7,4) 6 mM

20 MgCl2, 6 mM 2-mercaptoethanol, 100 ^g/ml runderserumalbumi-ne). Het restrictie endonuclease Fnu D2 (eveneens bekend als Acc 2) knipt elk van de verschillende 1428 bp Bam HI/Sst I fragmenten slechts éénmaal en in een 640 bp Bam HI/Fnu D2 fragment en een 788 bp Fnu D2/Sst I fragment, waarbij de 25 verschillende fragmenten van elke proef werden gezuiverd door agarosecel elektroforese.

Aldus werden een reeks van verschillende 640 bp Bam HI/Fnu D2 fragmenten en een reeks verschillende 788 bp Fnu D2/Sst I fragmenten verkregen. Door selecteren van één 30 fragment van elk van deze twee series en koppelen (voorbeeld P-6B) met het 7180 bp grotere fragment verkregen uit pBT210, werd een aantal nieuwe plasmiden die verschillende mutant B.t. endotoxine genen met volle lengte bevatten verkregen. De aldus verkregen nieuwe plasmiden 35 geïdentificeerd in de hierna volgende tabel G, werden daarna toegepast voor het transformeren van E.coli JM103 volgens de werkwij ze van voorbeeld P-4(A) en de verkregen cellen werden onderzocht op de produktie van B.t. endotoxine met het TBW onderzoek 89 00481.

- 53 - van voorbeeld A , waarbij de benaderde , verkregen resultaten bij dit onderzoek eveneens zijn opgenomen in de hierna volgende tabel G. Vele van de getransformeerde cellen die plasmiden zoals beschreven in de tabellen F en G 5 bevatten, werden eveneens onderzocht volgens de T.ni proef, waarvan de resultaten zijn toegelicht in de hierna volgende tabel H .

Tabel G

10 Vb. Identifi- Bron van het Bron van het Feitelij- TBW

no. catie van Bam HI/Fnu Fnu D2/ Sst ke muta- onnieuwe mu- D2 fragment I fragment tie(s)die der tantplas- erbij zoek miden met is be- sco- 15 volledige trokken re lengte 4-A 66 p36a65 p26-3 122-Ile 3 125-Val 20 201-Asp 4—B 67 p26-3 p95a86 119-Thr 1 130-Ile 188-Ser 25 4-C 74 p36a65 p95a86 122-Ile 3 125-Val 188-Ser 30 4—D 106 p26-3 prAK 119-Thr 1 130-Ile 4-E 107 prAK p26—3 201-Asp 2,5 35 4-F 108 prAK-E prAK 130-Ile 3 8900481.

- 54 -

Tabel Η

Plasmide iden- Tabelbron Relatieve wer- tificatie king 5 pBTA F 391 pBTC F 299 pBT66 F 169 pBT107c25 F 254 10 pBTP F 340 pBTS F 255 pBT67 G 304 pBT106 G 367 standaard pBT301 100 15 controle SAN415 59 controle CAG629 0

Voorbeeld 5

Cellen getransformeerd met DNA coderend voor een 20 mutant endotoxinevolgorde liet men groeien in een fermentator, onder bekende en standaardomstandigheden hiervoor. De gehele inhoud van de fermentator werd , aan het einde van de celgroei en onmiddellijk voor het winnen , onderworpen aan een verhoging van de temperatuur tot ongeveer 70-80°C. 25 Deze temperatuur handhaafde men 10 min voor het koelen en is voldoende de recombinant microorganismen te inactiveren zonder de biologische werking van de endotoxine-eiwitten te beïnvloeden. De inhoud van de fermentator werd daarna onder verminderde druk ingedampt ter concentrering tot 1/3 van het 30 vorige volume en het verkregen, geconentreerde produkt werd gesproeidroogd bij een invoerdruk van ongeveer 2000 psi onder toepassing van een verhitte luchttegenstroom met een inlaattemperatuur van 140-160eC en een uitlaattemperatuur van 20-50°C. Het verkregen poeder werd met drager gemengd, 35 zoals ontvette sojabonen, onder vorming van een bevochtigbaar, geconcentreerd produkt. Geschikte verhoudingen hiervan zullen o.a. afhangen van de gewenste werking van het eindprodukt, doch kunnen bijvoorbeeld 60:40 8900481.

\ - 55 - gew.delen poeder tot drager zijn. Het verkregen, geconcentreerde produkt bevat bij voorkeur 0,4-10%, vooral 0,8-8 % , actief bestandeel, uitgedrukt in sporen of endotoxine-eiwit.

Het bevochtigbare poeder wordt geschikt verdund met water 5 voor sproeitoepassingen zoals bekend is uit de stand der techniek.

10 15 20 25 30 35 8100481 .

- 56 -

Tabel A

(a) -46 GG ATC CGT TTT AAA TTG TAG TAA TGA AAA ACA GTA TTA lie Arg Phe Lys Leu *** *** *** Lys Thr Val Leu

TAT CAT AAT GAA TTG GTA TCT TAA TAA AAG AGA TGG AGG TAA CTT

Tyr His Asn Glu Leu Val Ser *** *** Lys Arg Trp Arg *** Leu (-15) 45

ATG GAT AAC AAT CCG AAC ATC AAT GAA TGC ATT CCT TAT AAT TGT

Met Asp Asn Asn Pro Asn lie Asn Glu Cys lie Pro Tyr Asn Cys (1) (4) (15)

TTA AGT AAC CCT GAA GTA GAA GTA TTA GGT GGA GAA AGA ATA GAA

Leu Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg lie Glu

ACT GGT TAC ACC CCA ATC GAT ATT TCC TTG TCG CTA ACG CAA TTT

Thr Gly Tyr Thr Pro lie Asp lie Ser Leu Ser Leu Thr Gin Phe (b)

CTT TTG AGT GAA TTT GTT CCC GGT GCT GGA TTT GTG TTA GGA CTA

Leu Leu Ser Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu (60)

ÏÏTT GAT ATA ATA TGG GGA ATT TTT GGT CCC TCT CAA TGG GAC GCA

Val Asp lie lie Trp Gly lie Phe Gly Pro Ser Gin Trp Asp Ala n-1

TTT CTT GTA CAA ATT GAA CAG TTA ATT AAC CAA AGA ATA GAA GAA

Phe Leu Val Gin lie Glu Gin Leu lie Asn Gin Arg He Glu Glu (m-1) (c) , 300

TTC GCT AGG AAC CAA GCC ATT TCT AGA TTA GAA GGA CTA AGC AAT

Phe Ala Arg Asn Gin Ala lie Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn (100) (105)

CTT TAT CAA ATT TAC GCA GAA TCT TTT AGA GAG TGG GAA GCA GAT

Leu Tyr Gin He Tyr Ala Glu Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp

CCT ACT AAT CCA GCA TTA AGA GAA GAG ATG CGT ATT CAA TTC AAT

Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu Met Arg He Gin Phe Asn (135)

Opmerkingen: (a) is Bam HI plaats (b) is Spe I plaats (c) is xba I -plaats 8900481.

- 57 -

GAC ATG AAC AGT GCC CTT ACA ACC GCT ATT CCT CTT TTT GCA GTT

Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala lie Pro Leu Phe Ala Val (140) 495 CAA AAT TAT CAA GTT CCT CTT TTA TCA GTA TAT GTT CAA GCT GCA Gin Asn Tyr Gin Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val Gin Ala Ala (165) 523

AAT TTA CAT TTA TCA GTT TTG AGA GAT GTT TCA GTG TTT GGA CAA

Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser Val Phe Gly Gin (180) 549 577

AGG TGG GGA TTT GAT GCC GCG ACT ATC AAT AGT CGT TAT AAT GAT

Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr He Asn Ser Arg Tyr Asn Asp (195) 606 n-348 624

TTA ACT AGG CTT ATT GGC AAC TAT ACA GAT CAT GCT GTA CGC TGG

Leu Thr Arg Leu lie Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val Arg Trp (m—116) (210) (d) 675

TAC AAT ACG GGA TTA GAG CGT GTA TGG GGA CCG GAT TCT AGA GAT

Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg Asp (225)

TGG ATA AGA TAT AAT CAA TTT AGA AGA GAA TTA ACA CTA ACT GTA

Trp He Arg Tyr Asn Gin Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val

TTA GAT ATC GTT TCT CTA TTT CCG AAC TAT GAT AGT AGA ACG TAT

Leu Asp lie Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr (255 )

CCA AIT CGA ACA GTT TCC CAA TTA ACA AGA GAA ATT TAT ACA AAC

Pro lie Arg Thr Val Ser Gin Leu Thr Arg Glu He Tyr Thr Asn

CCA GTA TTA GAA AAT TTT GAT GGT AGT TTT CGA GGC TCG GCT CAG

Pro Val Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gin

GGC ATA GAA GGA AGT ATT AGG AGT CCA CAT TTG ATG GAT ATA CTT

Gly lie Glu Gly Ser lie Arg Ser Pro His Leu Met Asp He Leu

AAC AGT ATA ACC ATC TAT ACG GAT GCT CAT AGA GGA GAA TAT TAT

Asn Ser He Thr He Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr

TGG TCA GGG CAT CAA ATA ATG GCT TCT CCT GTA GGG TTT TCG GGG

Trp Ser Gly His Gin He Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly »

Opmerking:(d ) is Xba I plaats 8900481.

- 58 -

CCA GAA TTC ACT TTT CCG CTA TAT GGA ACT ATG GGA AAT GCA GCT

Pro Glu Phe Thr Phe Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala

CCA CAA CAA CGT ATT GTT GCT CAA CTA GGT CAG GGC GTG TAT AGA

Pro Gin Gin Arg lie Val Ala Gin Leu Gly Gin Gly Val Tyr Arg

ACA TTA TCG TCC ACT TTA TAT AGA AGA CCT TTT AAT ATA GGG ATA

Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg Arg Pro Phe Asn lie Gly lie

AAT AAT CAA CAA CTA TCT GTT CTT GAC GGG ACA GAA TTT GCT TAT

Asn Asn Gin Gin Leu Ser Val Leu Asp Gly Thr Glu Phe Ala Tyr

GGA ACC TCC TCA AAT TTG CCA TCC GCT GTA TAC AGA AAA AGC GGA

Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val Tyr Arg Lys Ser Gly

ACG GTA GAT TCG CTG GAT GAA ATA CCG CCA CAG AAT AAC AGC GTG

Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu lie Pro Pro Gin Asn Asn Asn Val

CCA CCT AGG CAA GGA TTT AGT CAT CGA TTA AGC CAT GTT TCA ATG

Pro Pro Arg Gin Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His Val Ser Met 1350

TTG CGT TCA GGC TTT AGT AAT AGT AGT GTA AGT ATA ATA AGA GCT

Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser lie lie Arg Ala (450)

CCT ATG TTC TCT TGG ATA CAT CGT AGT GCT GAA TTT AAT AAT ATA

Pro Met Phe Ser Trp lie His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn lie

ATT CCT TCA TCA CAA ATT ACA CAA ATA CCT TTA ACA AAA TCT ACT

lie Pro Ser Ser Gin lie Thr Gin lie Pro Leu Thr Lys Ser Thr

AAT CTT GGC TCT GGA ACT TCT GTC GTT AAA GGA CCA GGA TTT ACA

Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr

GGA GGA GAT ATT CTT CGA AGA ACT TCA CCT GGC CAG ATT TCA ACC

Gly Gly Asp lie Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gin lie Ser Thr

TTA AGA GTA AAT ATT ACT GCA CCA TTA TCA CAA AGA TAT CGG GTA

Leu Arg Val Asn lie Thr Ala Pro Leu Ser Gin Arg Tyr Arg Val

AGA ATT CGC TAC GCT TCT ACC ACA AAT TTA CAA TTC CAT ACA TCA

Arg lie Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gin Phe His Thr Ser

ATT GAC GGA AGA CCT ATT AAT CAG GGG AAT TTT TCA GCA ACT ATG

lie Asp Gly Arg Pro lie Asn Gin Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met

AGT AGT GGG AGT AAT TTA CAG TCC GGA AGC TTT AGG ACT GTA GGT

Ser Ser Gly Ser Asn Leu Gin Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly

TTT ACT ACT CCG TTT AAC TTT TCA AAT GGA TCA AGT GTA TTT ACG

Phe Thr Thr Pro Phe Asn Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr 8900481.

- 59 - TTA AGT GCT CAT GTC TTC AAT TCA GGC AAT GAA GTT TAT ATA GAT Leu Ser Ala His Val Phe Asn Ser Gly Asn Glu Val Tyr lie Asp CGA ATT GAA TTT GTT CCG GCA GAA GTA ACC TTT GAG GCA GAA TAT Arg lie Glu Phe Val Pro Ala Glu Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr (610) GAT TTA GAA AGA GCA CAA AAG GCG GTG AAT GAG CTG TTT ACT TCT Asp Leu Glu Arg Ala Gin Lys Ala Val Asn Glu Leu Phe Thr Ser TCC AAT CAA ATC GGG TTA AAA ACA GAT GTG ACG GAT TAT CAT ATT Ser Asn Gin Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile GAT CAA GTA TCC AAT TTA GTT GAG TGT TTA TCT GAT GAA TTT TGT Asp Gin Val Ser Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys CTG GAT GAA AAA AAA GAA TTG TCC GAG AAA GTC AAA CAT GCG AAG Leu Asp Glu Lys Lys Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys CGA CTT AGT GAT GAG CGG AAT TTA CTT CAA GAT CCA AAC TTT AGA Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gin Asp Pro Asn Phe Arg GGG ATC AAT AGA CAA CTA GAC CGT GGC TGG AGA GGA AGT ACG GAT Gly Ile Asn Arg Gin Leu Asp Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp ATT ACC ATC CAA GGA GGC GAT GAC GTA TTC AAA GAG AAT TAC GTT Ile Thr Ile Gin Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val (e) ACG CTA TTG GGT ACC TTT GAT GAG TGC TAT CCA ACG TAT TTA TAT Thr Leu Leu Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr (723) 2250 CAA AAA ATA GAT GAG TCG AAA TTA AAA GCC TAT ACC CGT TAC CAA Gin Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Gin (750) TTA AGA GGG TAT ATC GAA GAT AGT CAA GAC TTA GAA ATC TAT TTA Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gin Asp Leu Glu Ile Tyr Leu ATT CGC TAC AAT GCC AAA CAC GAA ACA GTA AAT GTG CCA GGT ACG Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr GGT TCC TTA TGG CCG CTT TCA GCC CCA AGT CCA ATC GGA AAA TGT Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Ala Pro Ser Pro Ile Gly Lys Cys

Opmerkingi e) is Kpn I plaats ----- _ t 8900481.

- 60 -

GGA GAA CCG AAT CGA TGC GCA CCA CAA CTT GAA TGG AAT CCA GAT

Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro Gin Leu Glu Trp Asn Pro Asp

CTA GAT TGT TCC TGC AGA GAC GGA GAA AAA TGT GCC CAT CAT TCC

Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys Cys Ala His-His Ser

CAT CAT TTC TCC TTG GAC ATT GAT GTT GGA TGT ACA GAC TTA AAT

His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn (840)

GAG GAC TTA GGT GTA TGG GTG ATA TTC AAG ATT AAG ACG CAA GAT

Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gin Asp

GGC CAT GCA AGA CTA GGA AAT CTA GAA TTT CTC GAA GAG AAA CCA

Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro

TTA GTA GGA GAA GCA CTA GCT CGT GTG AAA AGA GCG GAG AAA AAA

Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys 270 0

TGG AGA GAC AAA CGT GAA AAA TTG GAA TGG GAA ACA AAT ATT GTT

Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr Asn Ile Val (900)

TAT AAA GAG GCA AAA GAA TCT GTA GAT GCT TTA TTT GTA AAC TCT

Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser

CAA TAT GAT AGA TTA CAA GCG GAT ACC AAC ATC GCG ATG ATT CAT

Gin Tyr Asp Arg Leu Gin Ala Asp Thr Asn lie Ala Met Ile His

GCG GCA GAT AAA CGC GTT CAT AGC ATT CGA GAA GCT TAT CTG CCT

Ala Ala Asp Lys Arg Val His Ser lie Arg Glu Ala Tyr Leu Pro *

'gag CTG TCT GTG ATT CCG GGT GTC AAT GCG GCT ATT TTT GAA GAA

Glu Leu Ser Val lie Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu

TTA GAA GGG CGT ATT TTC ACT GCA TTC TCC CTA TAT GAT GCG AGA

Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg

AAT GTC ATT AAA AAT GGT GAT TTT AAT AAT GGC TTA TCC TGC TGG

Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp

AAC GTG AAA GGG CAT GTA GAT GTA GAA GAA CAA AAC AAC CAC CGT

Asn Val Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gin Asn Asn His Arg

TCG GTC CTT GTT GTT CCG GAA TGG GAA GCA GAA GTG TCA CAA GAA

Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gin Glu

GTT CGT GTC TGT CCG GGT CGT GGC TAT ATC CTT CGT GTC ACA GCG

Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala 8900481.

- 61 - *

TAC AAG GAG GGA TAT GGA GAA GGT TGC GTA ACC ATT CAT GAG ATC

Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr lie His Glu Ile (1050)

GAG AAC AAT ACA GAC GAA CTG AAG TTT AGC AAC TGT GTA GAA GAG

Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu 3240

GAA GTA TAT CCA AAC AAC ACG GTA ACG TGT AAT GAT TAT ACT GCG

Glu Val Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Ala (1080)

ACT CAA GAA GAA TAT GAG GGT ACG TAC ACT TCT CGT AAT CGA GGA

Thr Gin Glu Glu Tyr Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly

TAT GAC GGA GCT TAT GAA AGC AAT TCT TCT GTA CCA GCT GAT TAT

Tyr Asp Gly Ala Tyr Glu Ser Asn Ser Ser Val Pro Ala Asp Tyr

GCA TCA GCC TAT GAA GAA AAA GCA TAT ACA GAT GGA CGA AGA GAC

Ala Ser Ala Tyr Glu Glu Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Asp

AAT CCT TGT GAA TCT AAC AGA GGA TAT GGG GAT TAC ACA CCA CTA

Asn Pro Cys Glu Ser Asn Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Thr Pro Leu

CCA GCT GGC TAT GTG ACA AAA GAA TTA GAG TAC TTC CCA GAA ACC

Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr

GAT AAG GTA TGG ATT GAG ATC GGA GAA ACG GAA GGA ACA TTC ATT

Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile O 170)

GTG GAT AGC GTG GAA TTA CTC CTT ATG GAG GAA TAG

Val Asp Ser Val Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu *** (1181) 8900481.

- 62 -

Onder de meer aanbevolen mutaties volgens de uitvinding vallen die op de plaatsen 116 (Lys of Arg) , 119 (Thr), 130 (Ile) en 188 (Ser) en combinaties, waaronder één of een aantal van dezelfde , zoals die aangetroffen in 5 pBT26-3, pBT-106, pBT-68, pBT-C, pBT-67 en pBT-70 ( enkele hiervan zijn te vinden in tabel G). Eveneens worden aanbevolen de afzonderlijke en gecombineerde mutaties in p36a65, in het bijzonder voor bekorte endotoxinen.

De mutaties aangetroffen en toegestaan volgens de 10 uitvinding op aminozuurplaats-4 zijn belangrijk, aangezien ze vallen binnen het gebied van 25 aminozuren ( de plaatsen 1 tot en met 25 in tabel A) , waarvan werd gepostuleerd dat ze eveneens een pre-toxine of protoxinegedeelte van het actieve endotoxine vormen en proteasesplitsing in de darm 15 ondergaan onder vorming van het endotoxine of actievere endotoxine. De mutaties die mogelijk zijn op de 4-plaats zijn geïndiceerd van belang te zijn voor endotoxine-volgorden bevattende genoemde 25 aminozuren of met een aanzienlijke (tenminste 70%) homologie daarmede en meer in 20 het bijzonder van belang te zijn voor die endotoxinen waarvoor in een dergelijk gebied wordt gecodeerd door DNA dat voor de 4-plaats mutatie onder stringente omstandigheden zal hybridiseren tot DNA met de volgorde aangetroffen in tabel A voor de nucleotide plaatsen die zich uitstrekken van de 25 nucleotide plaats 1 tot en met nucleotideplaats 75, onafhankelijk van weglatingen en toevoegingen en met equivalente codering van overeenkomstige aminozuren, zoals hiervoor is besproken in verband met het behouden gebied van de 116 aminozuur volgorde.

30 De mutatie die niet onder de uitvinding valt bij de aminozuurplaats 217 en vermeld in de voorgaande tabel B en beoordeeld elders hierin , werd onderzocht teneinde duidelijk te maken dat alle natuurlijk gecodeerde aminozuren op deze plaats aanwezig kunnen zijn in actieve endotoxinen met 35 de relevante volgorde weergegeven in tabel A die zich uitstrekt van het uiteinde van de referentievolgorde van 116 aminozuren tot en met aminozuurplaats 217. Dus valt de mogelijkheid dat het aminozuur op de 217-plaats in een derge- 8900481.

♦ - 63 - lijke volgorde of equivalent daarvan elk natuurlijk gecodeerd aminozuur, behalve Arg is , binnen het kader van de uitvinding. Aangezien echter de geindiceerde mutatie op de 217-plaats minder interessante eigenschappen oplevert, is 5 het voornamelijk van belang in combinatie met andere mutaties die hierin zijn beschreven en aan te geven dat de 217-plaats kan veranderen in endotoxinen waarin Arg natuurlijk op deze plaats voorkomt.

10 15 20 25 30 35 &90M81.

----— - ___*

Claims (26)

1. Een structureel gen dat DNA coderend voor een 5 endotoxine-eiwit met een toxische werking tegen insecten bevat, welk DNA een gedeelte bevat dat codeert voor een aminozuurvolgorde dat een aanzienlijke homologie voor de volgorde van 116 aminozuren te beginnen op plaats m-l en zich uitstrekkende t/m plaats m-116 in tabel A heeft, welke 10 plaatsnummers gelden voor een dergelijke homologe volgorde ongeacht eventueel weglatingen of toevoegingen daarin, waarin genoemd DNA zodanig is gemodificeerd dat voor elk of een aantal van de volgende aminozuren is gecodeerd op de aangegeven aminozuurreferentieplaats: 15 a) op plaats m-5 elk natuurlijk aminozuur behalve Asn; b) ,, ,, m-6 ,, ,, ,, ,, Gin? c) ,, ff m-12 ,,,,, ,, ft Glu? d) ft tf m-16 ,, ,, it ii Asn? e) ft ft m-27 ,, ,, ii it Glu? 20 f) ,, ft m-30 ,, ,, it it Ala? 9j it it m-33 it it it it Thr? h) ii ii m-34 iiii it it Asn? ï) ft ii m-36 iiii tl ii Ala? j) ii it m—41,, it it it Met? 25 k) ,, ft m-95 ,, ,, ,, ,, Phe? l) ,, ,, m-98 I, I, ,, I, Ala? m) ,, ft m-99 tiii ii it Thr? n) f/ ff ro—105,, ,, ,, ii Asn en o) ,, ,, m-112,, ,, ,, ,, Gly? 30

2. Een structureel gen volgens conclusie 1 waarin de homologie tussen de aminozuurvolgorde waarvoor gecodeerd is door een gedeelte van het DNA van het genoemde structurele gen en de volgorde van 116 aminozuren te beginnen op plaats 35 m-l en zich uitstrekkende tot en met plaats m-116 in tabel A daarvan tenminste 70% is,

3. Een structureel gen volgens conclusie 1 of 2 waarin het DNA zodanig is gemodificeerd dat voor elk of 89 0 0 4 8 1. - 65 - meer van de volgende aminozuren is gecodeerd op de vermelde aminozuurreferentieplaats: a) op plaats m-5, Lys b) ,, ,, m-6, Lys 5 c) r, fl m-12,Lys d) ,, ,, m-16, Tyr e) ,, ,, m-27, Lys or Arg f) ,, ,, m-30, Thr g) ft ff m—33, Ile 10 h) ,, ,, m-34, Tyr i) /, // m-36, Val j) ,, ,, m-41, Ile k) ,, f, m-95, Ile l) f# ff m-98, Thr 15 m) ,, ,, m-99, Ser n) ,, ,, m-105, Lys en o) ,, ,, m-112, Asp.

4. Een structureel gen volgens conclusie 3 waarin het DNA is gemodificeerd ter opname van de verandering bij één 20 of beide aminozuurreferentieplaatsen m-27 en m-30.

5. Het structurele gen volgens conclusies 1-4 waarin het DNA gedeelte buiten elk van de modificaties beschreven in conclusies 1-4 onder stringente hybridiseringsomstandig-heden hybridiseert tot een 348 nucleotide oligomeer met de 25 in tabel A beschreven nucleotide volgorde te beginnen op plaats n-1 en zich uitstrekkende tot en met nucleotide plaats n-348.

6. Het structurele gen volgens conclusie 5 waarin het DNA gedeelte voor elke modificatie beschreven in de 30 conclusies 1-4 codeert voor de volgorde van 116 aminozuren van tabel A te beginnen op plaats m-l en zich uitstrekkende tot en met plaats m-116.

7. Het structurele gen volgens conclusie 6 waarin het DNA coderende voor het endotoxine DNA bevat coderende voor 35 de aminozuurvolgorde van tabel A te beginnen bij aminozuur-plaats l en zich uitstrekkende tot en met aminozuurplaats 205 .

8. Een structureel gen omvattende DNA coderende voor 89 0 0481. - 66 - een endotoxine-eiwit met een toxische werking tegen insecten, welk DNA een gedeelte coderende voor een aminozuurvol gor de met een aanzienlijke aminozuurhomologie voor de 5 volgorde van 205 aminozuren te beginnen bij aminozuurplaats 1 en zich uitstrekkende tot en met de aminozuurplaats 205 in tabel A bevat , waarin het aminozuur op de 4-plaats elk aminozuur met uitzondering van Asn is .

9. Een structureel gen volgens conclusie 8, waarin 10 het aminozuur op de 4-plaats Tyr is.

10. Een expressievector die de structurele gen volgens één der conclusies 1-9 onder controle van DNA werkzaam bij het tot expressie brengen van dit structurele gen in een bacteriële gastheer omvat.

11. Een expressievector volgens conclusie 10 waarin dit gen onder controle is van DNA dat werkzaam is in het tot expressie brengen van dit gen in E.coli.

12. Een expressievector volgens conclusie 10 waarin dit gen onder controle is van DNA dat werkzaam is in het 20 tot expressie brengen van dit gen in B.t..

13. Een endotoxine-eiwit met een toxische werking tegen insecten, welk eiwit een aminozuurvolgordegedeelte met vrijwel homologie met de volgorde van 116 aminozuren te beginnen op plaats m-1 en verdergaande tot en met plaats m-116 25 in tabel A bevat, welke plaatsnummers betrekking hebben op een dergelijke homologe volgorde, onafhankelijk van eventuele weglatingen of toevoegingen daaraan , waarbij elk of meerdere van de volgende aminozuren op de aangeduide amino-zuurreferentieplaatsen aanwezig zijn: 30 a) op plaats m-5 elk natuurlijk aminozuur behalve Asn, b) ,, ti m—6 it ,, ,1 ,, Gin, c) ii ii m-12 ii ,1 ,, ,, Glu, d) ii ii m—16 it it ii ii Asn, e) ii ii m—27 ,, ,, ,, ,, Glu, 35 f) ii ii m—30 ii ii ii if Ala, g) ,1 /f m—33 ,, ,, ,, ,, Thr, h) ii tl ro—34 if ,1 ii ii Asn, l) ,, it m—36 ii ,, ,1 ii Ala, 5900481· - 67 - 3) ,, tt m-41 tt rr tr rt Met, Jc) ,, f r m-95 ,, ,, ,, ,, Pile, 1. tt tt in-98 ,, ,, ,, ,, Ala, in) ,, ,, ®“99 ,, ,, ,, ,, Thr, 5 n) ,, ,, in-105 ,, ,, ,, ,, Asn, en 0) ,, ,, nt“112 ,, ,, ,, ,, Gly.

14. Een endotoxine-eiwit volgens conclusie 13, waarin de homologie tussen genoemd aminozuurvolgordegedeelte en de volgorde van 116 aminozuren te beginnen op plaats m-1 en 10 verdergaande tot en met plaats m-116 in tabel A tenminste 70% is.

15. Een endotoxine-eiwit volgens conclusie 13 of 14, waarin voor elk of meerdere van de volgende aminozuren is gecodeerd op de aangegeven aminozuurreferentieplaats: 15 a) op plaats m-5, Lys b) ,, ,, m-6, Lys c) ,, ,, m-12, Lys d) ,, ,, m-16, Tyr e) ,, ,, m-27, Lys of Arg 20 f) ,, ,, m-30, Thr g) ,, ,, m-33, Ile h) ,, ,, m-34, Tyr 1) ,, ,, m-36, Val j) ,, ,, m—41, Ile 25 k) ,, ,, m-95, Ile l) ,, ,, m-98, Thr m) ,, ,, m-99, Ser n) ,, ,, m-105, Lys en o) ,, ,, m-112, Asp.

16. Een endotoxine-eiwit volgens conclusie 15, waarin één of beide aminozuren op de referentieplaatsen m-27 en m-30 gewijzigd zijn.

17. Een endotoxine-eiwit geproduceerd met een gen volgens conclusie 8 of 9.

18. Werkwijze voor het bereiden van een endotoxine- eiwit , met het kenmerk, dat men een cel transformeert of transvecteert met een expressievector volgens één der conclusies 8-11 en de verkregen cellen kweekt ter 8900481. -68- verkrijging van het genoemde endotoxine.

19. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat de getransformeerde of getransvecteerde cel een plantencel is.

20. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat de getransformeerde of getransvecteerde cel een bacteriëncel is.

21. Een plant bevattende cellen die een structurele gen volgens één der conclusies 1-9 bevat.

22. Bacteriele cellen die een expressievector volgens één der conclusies 10-12 bevatten.

23. Een DNA volgorde bevattende DNA met de volgorde van nucleotideplaats n-1 verdergaande tot en met nucleo-tideplaats n-348 in tabel A of mutantvariaties daarvan en 15 met één of een aantal uit elkaar liggende restrictieplaatsen gekozen uit de groep bestaande uit Hind III, Mst II, Bssh II, Bal I en Mlu I, welke plaatsen niet de aminozuurvolgorde veranderen waarvoor het DNA codeert.

24. Preparaat met insecticide werking dat een insec- 20 ticidaal doeltreffende hoeveelheid van een eiwit verkregen uit een DNA volgens één der conclusies 1-9 desgewenst met een op landbouwgebied aanvaardbare drager bevat.

25. Preparaat met insecticide werking dat een insec-ticidaal doeltreffende hoeveelheid van een eiwit volgens één 25 der conclusies 13-17 , desgewenst tezamen met een op landbouwgebied aanvaardbare drager bevat.

26. Structurele genen, expressievectoren, endotoxine-eiwitten, werkwijzen en preparaten met insecticide werking als beschreven in de beschrijving en/of voorbeelden. 30 -o-o-o-o-o- 780 00481.