PT89812B - Processo para a preparacao de uma proteina de endotoxina toxica para insectos - Google Patents
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Description
.^acillaá tiairlii;dQnsls í^·^·) ' «oa bactéria espõ ruíam e -iit; ^rouus íí* pxoacína cristalina delta-saãotosLaa ( <$ -e&;.*oi;oxi£a) 210 fia do seu estádio yogstativ© de eresei-m-iito· .jSTrâ ornou0.Ci.na) atoe rEUGLBuuo t>os ucoog(b l.g certos :η,Γ:θιθ;, ;:·:;Γ ;is efeitos cé.-iieos tuo inoluGu a cessação de blim-soa.ãot ^ueccxicnões uauGxc-iuiescinals, desidratação t li sei., vi. ;e mn-te. /:. delta- or. doteuir a ê produzida, geral ..mm, a , ;.air dc uuu fonte plasníãieu» eouo na recursos? acfi vo ou m, v- mim iv. 11.::0. protozina do poso uolsoulax de l;ArAe a 1' rr''C uditons [dalabrese, mnad9 ..âcrobiol. £0 (1 >oO) V' J]. I cmulucrbo ocorro ma clivagem pr-oteolítica, . ..λθθ xu .ova a χ·ο_-;;—a:..··ίΌυ Ueucu.0 '„o. ^·...., ju ./— tro-i’iiiÍÃial ê ,ov.._ uno vários a.duoáeiãos no d-tsminal, no izrGesti- n ..0 imvõf 0 00 jO roc-iltad© da asção tas prote-aoos iatesti asio e 0 r., ca. ..amo gxnvdaair a fouiiia aetiva oou um peso ia© l.cilar J. dfw a νΟΟΓα "" Τ Λ 1 1 ia- # om.. \ 0.0 p g· a r\ .'* .slíp 1 fel]. t ^Ljroll ot al, -j. Lact eri 0 logy
cC .;imtLficoa-sc· vo. uxucdG nluexo cio subvariedades ,tO:?a a taioria destas ce too sentem ma uomoideme a um-rica ca ou m: eaaacíxica 02a xelumo aos insectos da or- d·.·. :Oc 'iepiéôptoros-, mt númex-o limitado delas sosbraraui tai| á:,i sr ró leoa 0 ^ xalavão a inseetos de outras classifica-võut. 1 or aa _rlo} d»u« isr-aaloiiciG e tézico eu relação a larvas ·-· αα.ΐοχοε vuDctaitos e talhão do algodoeiro) e fora:.. receLte...-ste identificadas duas o atras subvauL c-dades ©μφ m:.0j,.u-/a,.,, uomòmadG ou relação a lautas ds Golséptsros Qofte cf ul, buc. m ia. l.es· ..aílo embora, se· tendam realisaclo numerosos traba-ldos no sentido n vreparação de tcrinas uais curtas e de perue es druturais çuo as cocÃifiaiieie, uenox ê 0 conl:ooio.es;GO eλitsοt-1 atnrea ct capaeidade das di-lta-endotozinas de ΒΛ, .....istireu a nuta^oec· pontuais meação;-, dmfxo ca parte aotí va ou fcouica c.c. .acanoia da eiidotoaiuc e do efecto de tais
auodtvõèè v.r';r·^ o aotiTidado -Ias ool*aulas de toziua. *Ja oo^eobivo da presente invenção e· proporcionar de novos autantes ãe porção activa da áeita-emctozista de · \j · * P 0u-jurt oo.jectivo Pa pranaec invenção § a prepa r-y :ão íe -;a puais são eficientes na produção da ηζψ ac/l d. l..a.e :u .plaunto à ondotozisz. i.t*, cr-ι odbaz as fornas corta,;as & ,:.o eon_ri-drio douai daa 5 -endotozixxas» ui» outro ooáootiv© da ps-ceíoje invenção S proporei o^ar auda.v“ís puc dc.aouvolva:.i a netividnde ince-eticida aaè •J . ·- . ·. v ^ -.1 'z X\-- Λ . C· .; _ . -J .. · J O » » ,ν acoi-do con. α proseóc 1ετΰζ§"ο8 a .:eenescuce a. 5ε criar uleacoriauciit c natações nen. a ou amliiplos pon tos t varras certonas c. ujaSncius do LJI * puo codificam ραία α, i lar-pa secção ao porção aebive. do noa endotozira de d. t. activa 00.1.0 iizaeticid& contra 0.0 Lepiclópteros, isolem c ro .aoio por t-f-Cí ;Ic~.g doconbirooòoo varias or.^otozizas ãs .-♦t. .ria -;· ~s ao uícíij eoribea a mexa-a notivicauo insectici-....a oaacot;.;i*í,.-.ticd contra os Lepicópimaca ano «f-Qnáofcozira dc pnu. laicural. J _ . . d.--.,.dd>..:i so iid 1 r ti t vA 0 dC Λ ff p *» .-t .v acL0 lo curo I po: . * · _ -c ' j“ iia .1-; etLoto.oix a ct-3 ‘J.l, v ui ν> nlia . cOíI—Sc d Là- íi ‘ acidai da nestes pontoj do mutação ΰοοοοοοΓΡοφ, ίο codificao pualpuer outro animo-iDDtiuiiíCoo para pzcduãlzoa protei I_ lLsa-g ;d aniacões aleatórias otioiO·.’. isso. activi>:adc· nodo sor ãezonsbra- 00 ii.^aio, or cocopio, eou α Ι.,ροοεα doo recentos do õa taco ( eliot/Po vironooro) ou eon α Trdcnopliu-la nt laperta couve i 00 oo o aoniGziezn.oni ds..„ezito na ata /a e t;d ;_u.-.. o o o etircOia οαΰθ aumento 11:.: O £> Λ ' Ui. X c i. -d a •'otocto atin ou a.» c Vv - ,0 o oop orior* do ti:. 0.0.. j. L \j. : oriaca. dor 1 "Gdr ce: 'iio a etcdda cox?. a estrutura da indiviáuainent c >
J tc '•-t V J -.-i. a .- . · . X v . u. u-v ·; acuda , ã aciác .· · .* J-w u ca . 3 Gç3- v*·1. Pã 1-. ^ J,*. q.. .0; à ta váais . lÍ! oca. .P-i UG! car Gt áuãi! «.USâvÕS-i. i aaia w iicioa -GO : UJ Ό * :0 aa. nufcaqõ :a. u:· acordo 00,:. a d âcaciroc j.iiã OÍJ r ... dar. G a í ;ai. dc d_ u x'D -..Θ 0 . :c i;rao.„:ns, : v., 1, ;p. V:od:.p:.C c-a-i : 0 COia.. acLioaoirco Õ..... . .:1: ; . d adao pol- a - : vl k j,._ -d na-Oão-:ia 0 .aco.... , laotro.diac õa Ob ......:i. sacis são sIuczvicgg eoíx-er-~/aãs.a ea-cc dx-iita-cndclGoaiicas cie *·\·* isâi·» :όοζοιζη α cxiieoMliõ.Xo oniiceipal ias zuta-a inToação c, uaci vacua vurcLodade de an.oioairas, nas suais ugí ^ aneas conscxcadas á* i&eocfcieidas. .ala ,; ~xdioiilamsnto ocz rxi-àrencia u sequência >idcx ò saa ..ar:oração iaiicada m daoela Λ, in£;ga '0 xia .a ajior/li:.a~-....ji) a caal s-o e&costâra 21a posiçâè
J d zoiaaai da ciiC:0'ío::Ir.a r-epres íntatiira ací:. :ρό...βρΐηχo, αριζοοηΰαάα sa cadela d, desço * i L· u U va ;. , r auái co o iiuact:.;Iaa oonãra ina:euoa ua capêcio dos Leui-j· U;a a> 0_ρ..χ..·χ: .... * u* n dó_L'clX £2 αο^^-χοΟ-Ο M-Oi i c?de aefciTs um uõãUvaoia ae a t· : Cá, -.aa
’.0 b0.1.i.LX. d~w Λ O 10 OlTGPcl £Q32£1£! * ΐ:-·'·' _ .a:, a dr: - --. , . _ _ ’'.·. ;.. . c • - -.- j :2'J : ooáoi,- j. ,-.1,...,2. ^0 ^pr. - 0* ú"* ^ 1 *P t ai, -: ; loa 2 resíduos de sequência do ??·:··sídnos dos 2.16 asiisioáci-.do a posição 'T í posição aC-d inelusiTe ,tá ulcTi 02. ....LixáoidOã de posições ur-2. c. /0-116) podea con-,o...atr u ; ou aaic 00.0- roei duos doo .muinócs aziiioácidoo, rd fco 1...- -O- rápõoa -.io^‘5loç:a.s epulTalen-0: 2ú posição a ca L,.ar*Cntcsos indicados "002.0a sxaiOnoiG 0.0 sxoíxuos de 116 sai— .......ao ca nas a· 1; -·, v,;azo 0... vO. ζΧΧ:,Λ; cio. d :.·.·. j .. O 3 V le * -j o.:;l...ão >ã \aoaieão n-p do aodoai·.·. .a. seçuoncia. dos 116 adi o'ci-03) pualonoi» aaiaoáeido codificado pelo código _·. 1 átioc, c-noe-psa-srao âsaç I. :.. 0'.. j~O'1·''·0 :o. :açao a—6 Pa .a sequência dos 116 τ
J
J u....iaoáoij;} U-,„ eiialaiier desses ã,.uiaoáoiuos naturais es-
Ctípcuar^o .ilr., c; na posição 101 (na posição a-12 da referida sequência uoá 11o aaiar,'eMos) ua Giialcniai? dosscs ariroãcidos naturais, erctctjuai ao ln.* c·) r 9,,;P;ão 1·' P çpc-rdá}ão n-lS da referida r .sí iro ;) a.,, eaádcaer desses a sie.-c ácidos luá. '.0 -.tíllj >, j 1:9 9 Λsi >5.0 lld (padeão i>2? na referida é I· . 91 ‘ v.' lraep.^es C.';-dr.Or.CÍdOG taar co lu* í·} 1:a. csivão IIP (posição r-3C U.dl PPUí.’. iod 1-tOe) a... pudl-jicr dosseo adiiãOd.di^oc ! ;,a; -0 „JL&j / / -U d 1,.: · çpx-ição d-pã da referida : . d •.*0d **— l^aar c.^kjirjtíS c lii.oã.ciaos 0 U 1 : i . '0 pr, - ) AJ.CÍ J. 9,_I;. ão 1P( (aOi. ição lá-ed da referida -.d '.-.oe) 99: pt-lcuaa ateses ariroáoiaos suai .:0 SSK; i) tá i. d d d \X0 -Lu. ^ ^ ·- .-';-<.!♦·./·L .0 i-d* d O aa referira Γο .d ',-..i09ç ».1. ‘ualtaoi? desses a^iscc.cidoà 9 '9. a i Ia i > «0 J t-t;ãa l;"-d (P-OoiáÕ.O Q—'-M da ráforid 11 d Γ, ,dd„.,Os( vi.-„ *,^-a^JL» - ruer desata arircdoiaos naturais, ei 9 ' Ι,ανιΐ.' :.·; >9 oaeep-· d/-' y.) er ;; "a, Iv-ão 111 (posição ir-95 da reisrida aecuêneia de 116 * · * ,’0ò) il: paalpaor deaeos amincácidcs naturais» ε ícep-· 0,0 ..èfe; 1; ra -a.lição 167 (posição u-9-3 da reforióc. sequCreia do 116
I I L.-..U vAi: -
Cl·***ut ,„dal.._s©n dossoo asiiLoaeidos satunaisg es^oep- *j u=.-- j -·λ0 ^ ai) na posição 1c>8 (posição ai-99 da xefepida scquenoia d& Xiè !?·. d Xo 3} vl: pnalouer ãosses aclix-acidoo mtareais eseop-
J
J i.) r.·; I- “o xpd (posição s-165 c'a dsfariaa sepeôxeia d© 116 rcaíiaos) as caftlçaex desses ssiinoáoidos s rã anais, : :c·;. .. .. a Aanj o) lu ^ori.ão J:'l (posição r.>112 da sedeis s secaiCncia· de 116 a a /ios) a.: onalpiios? desses esdzioáeidoe aasurais. a .... io dl:. atai ves co,_o ledeaSaeia â 2iaaei?acãç _ ,ds .la ... ss..'èeo: _© ceiísoáõidos s-resesiada na Jabe+ 1, .d.cã*-' X ciai a troca c.e dss ao asinoáeido na ρο- ;"o o o, sXeuia a: a._ii:oácidoc os? vsalcsisi? a.rineáeiuo ... ,·Χ. ,.) ‘ li; :-lo ooúi .o peaádiõo. i.ss oi -aítaios de aXnodeidofc pro-da nefexida ^ec aSncia de 1 -X ^ *- Xa. a-»u'a* J.0 i— Ju”l r #w .. «. X X. ã_‘V - i _ ; L?:0 xU L-.'υ 1;? D _ i'«-, i ., β ^.aodvaÍTel do acordo oos a invenção qus tal j-ι oaaaoa·-·risada, nomri-iib© ôoíu neisrencia à se Ή, A : ·. i.O-ia i:. . .',.-0- '.A L"" . · 1 O*..W '·»-. ·»_. v* *v -. lw - - w». ds.- ds.cela L (o d: > Ϊ Λ ei... de 116 ia aí duos), por n: ou sais d Lr.oá .6. o.,, i-a:;, ;,osipõos indicadasi . \ ^ J . · :> rs 1 ;.ão pt íposição 5 da ‘Ρΰ7! aê:_í2dO e,·* dc6;: i / y - „'·-> j. .. .psJ, ;:ão 5p (po.jioão 5 da ão a; eps I :· dosição 161 (aosiaão 15 d a sopaôaoia oooo): i . y c is. :ntlc~o lip (aooioão 16 õ .a oO p-Snoia : j-O ^ - ila .cosa-aos 115 rcaíãuou e< ou .· o asas o.ooaesa srp. dição 116 (posição
u,/ .> jitacda le 116 í?esídaGi5)> : r Lã o-oiição 1X9 (posição f'C ãc. oeouleieia de 116 resíduos) ; .'.1; to -o. ieao 112 (_ro.-:io"o 93 da soyaêacia de 116 resí-
J
J L- ; ^ C· y \ .2.5 (l:-£c£o : - /· :a6oGÍa. c.& 116 resi di aa ;o,^i>--3c 165 (ooeloão 96 da aO€;Ut aoia de 116 rs-oí- O f ' 3 Io Λ •..í‘ u. ' Λ , ':' ecb 15' · (oosioSo 61 da ,ve r ae-íicia do 116 reeí- • 1 _tio 1. '! {:,^;Λ-.β.ο 55 âa oô·:· iSaeia lo 116 pobí- - ....( Λ O i ... _·..·-. J.w-_.-0 ·... :. .l.v . -‘.j, G.-.O·. -. ·.' 1 Ju .y O tá-i.'™ ;„,O O j._ 'j 9i-if^-OOclO 90· OL. jjUíléiiGiO. CiO ii;0 j?‘d>iJL— 6. oão Ιοί (:d'eio*o lr5 do oovuôneie. da 116 oeeí
..-5·, ϊ,α , o.';,õo 2"I (o^ei/ã© 112 da oeouêiieXa 00 116 resí dãfO:;; .-011,.,0 0 doo S 0uu30ÍÕ-J.Í:,0 00 r.csi.J.o do Gulinoáoi- í ' d.· y rodoodi-oia to^doolooído ,00 :91/. d o.d-Io .1, o^/o^eiôada 00 dilo. d-j--oa siodoria doa-j-uOr-oia de aaoleéóidos e a seoaSooia ._o. re^alóavóo oele-jaoõo ;.ara a pro&uçãc i -;oxrui ai ell·o-or-dOy^lia dc « .-00. ezeepção, a so~ ·. .· - r .;·... a ,c . o^el _ óoi doa dei oetiaa ο ,αοό/α -de ao. plaeaxdio . Ο, 10 o. Ó-~ 1ΙΟ:000..2.00 Ο UãO 60 ΟΣΙΟΟΟυΓΟΙΙ 210 11. ο. lillia- 15 ^ ϊ ' *- · -* * «5L.·. Ό «i, 0,- _1μ>. Ο.,—uiltiO Ο /yOiiO Go lOO uLii.-u.i ϋΙΟΟϋ/Ο (Ç[ilÔ 3.0Í}U.S.jJ C ‘ 1 :L:0d
co 1 ’ rico : ggo oruerção cie própria onãotorim) provês ,o *,. .ul-.uee.i,i:j e a única ercopção s ene a secraencia aa- ό irai ta '*. cl;) z.o início cio pera estrutural é oripi cr- u.„ per.o proâatoa? cie Gnaolooira euistente eu B«t« -1 PcLoairnlo plcisníáio de ρ,ρ „lb „a classe i:.j i\i lo -1), contendo esta oopaoneia ãc montante. .í'r * · ; a -"o -u "aboacuas (11 p-<) deriva-ii© plasmai r-v , ;õe ôe uilai-rcina cie :.,Λ. mn^staei *α>·Χ. A secpaênaià ..oca- 0 0 coiccên. O .,:ÚtiO 0.0 i‘:i' GOGO Ú.O nlDOGOSaS tal
J o'' o .. vocoiocra ao P.pc. jpãiaç.&s£is nifoa-: mico .r. apoeseg. -.a a i.a ;.,1.. la à ^ara 2ÚI' ApSíÍSl"! ê ao diferenças eSo pos ,.-.i a··.'-.,.; ·. i^.,„icai:í o ra presente aoa.ôria âosexdtiTã. lio en G CO , .-V -—00 'Cúr C.O :COiCGO *3.110 €.. OCÍ-O GO SC-ÇticnO 2.0.3 CIOS SGÃ
J Λ., cu, caiaoáeioos cg ..rocuíra αε eiiiotoriria uliad-o ela oapren-ão lo pene estrutural sãip to,, p ururc/saar-rc· caim rarc-Uuosos go 1 a j.X-jl por t-al a.acác.Icgoíos ομε esrão gg área não traáasiáa οχ... ... v. ',··λ i”. ’v j ííG... 'í.íúgO na._ãvasieiJj íKí-uáúD síâ•a a· o* 'r o 1 L.rc. aoacao-ue ^ oca en nc.x b . - mo mio oao contacioíâ a o axiaãr- c ;: ii. e.sinoáoico) ·
ClÇv.C- - '1 C: 2.^· ;;· n
GO j :· -pç ψ Oíj i. OS . Ç-^CiCG Ga -•..'GCií.iiGGS bJ.G íiLi.LíGírGdOí3s) por c.ir.a ?c, linra en ene apareceu :.rc esPa aor ci-na -lo nucloétido ao .> Icl..'o.-- c"> ο no r..aolccõícoog nos ponoo e^crararais ί.·<-1 ãe jic.ai;cais « ·. «gu» _-.pratg.ui são ide-oticos ãeoie o iníoip ;1h - - ;c:oa :& encoro ei aa go 1οη_ο toda e. porção activa p .o- . .L-0- . ; .1Ό pi liiã ...· ρ>p.0 i.., p)ã.a Λ jl-Ij.. •.LiòiI-gI l..:Li. . ai. r, ΘΒΰθ.Ι1 ·' · -oPc # . « . llb^ o .. pn Z gg porção do protonira -' .......v í M •íg. éo,-,J.r^ Gctioa r õ.^úioGCceo gg 9 O p ./ _.v^n lec Igocgóog será L. A i-i.*-’. pj c-l/Ci. . í r>-;e -1 ; ..... .. -o.!., -'u* · — i j « U « nl-..:nensi8 o í/Go llUPBua-- íâ .1 c 1 e 61 i cl o z na :*?. pião na repião não tranis c* sítio re li G.eão is ritofíouas são m·*
as .V"' .v“tO anj?a tná 0 a ; “p p 0 1- st] i. lc-::.tro das ,;o 5 ponoão ê SOO mt òa cía 3i-l a a·- 11a t-ara os ecG-iroáeidos e de si-l a s.-34-S pam πε r:ucl..oi;x'os ãt tais a laoácidos, pana iiv..;lear uais espoai! le.t.. ...ε·,: u::a Γ3 Ião altaosnut eonosiuraãa na çaal a naioría ao -ava-õ;-s ;;χόtoreicradas psln ínannoão 33 ciioasòrazi Iccat li 2aias. ..sr-tc-c t.itico ds rsttrioão roloi/antes .ara a secuieji lai*. '.cV->^«Lc- uíL\0 n-0 :'-a θΛ.';.λ(.- D ‘d -0.1/ tli-iSL X-Ldialcl v·.. ioj rtaslsólidos onvolaiaoc .ai, 03 resinioão 3 0 a ''ca do po (ao CubíIo da ilss?. i_ porcao o o rd ca la auIoCoaitia as. ,j. εΊα â, sol co_.0 ao oocoalieea na áooniGas :.id.L'ia .1... à._in.oáciu.O£ aonopa na posição 1 0..j ,,.„.... a^d ,0b *v.. w,-jj :..a -iOiCi! a, ·., >“ α ;·θοηε·θ*θ jxu doo . 3 ''Uv.ia v , ta G í —·. ϋ aí?01utl íiU LvítâtlíCl?. <- 1 . , ..·,.ροο --r.noja-i.0 na οη,ΐε n, 0 co^ o oo.jeetivo -1. . ·.. . - _ ,a · ,a/ ·!- ..'··.. *. j-·’·-'' ...3.*. ..,-... .., ^ .00 $ j v. aà, .· o o o toso α.- 0313 0 s c-y a a. aa acata a u.·» a.av noáoi- | ..la aa" ii-s-no. i ctil
J .Ο:-. ,·α c ... . ao : 0 L,„ _:.g:.-oõõ·,^ zno tat.no! 1 λ ..· .,,- - ‘olcr.-pan aló ao Jttio >c .i.ro y,..d“71ã dco u.sinoáeic.oo g ; 'a ·!,.. atui nsdouidac zolú dor ,.s. :ur .ta ;1 “"h— la 1-1 d-, aí J id wC^ba-ώ r.i d, ί-:' vU ao ;:ãia,ã oanooo ροο,Θ.ά iy-aaas c partir Cg d? n íSú Ca classe 0r r c ãc 30.: ί I ;>t 0 'd,!.:.-. aa dos placaiCios ãe r.:V: 0 paa -o asados os ?ários eetájios e:· vaaoão o conprnsrslorio o n .t. codidicanao us. a.la donivtida ia l:Íy?si;cal9 aproeen í ara 1 roprGOGnaa titi Λ ':'·.·οΛν'ό 'alo i; • a . _ o ... .... .0 o „ aoaò ,a .:.= .a eo: io niaóõí;enoso 3a:;sGata'Ga u. 1 loaaG do plaenidio pJSrlX c-’ oinioaiao ano ./i-qu-^ítjs. úg onlou02:ia.a nd. :onto 110 '-naiGO ;.:;-.:lor ao oue v. codífi- t
0. I^igstatrl T;-l & ομβ 3a eortza Lepiãôpteros ca: a cor prb.' o : .·:·':' 1ζ?ζ· a i- · . a;ta ÍKOP iáa. aotiirilado
J
J kc í-i.^uras >a e 5b rcprezcaitCE: duas cadeias de AL·' ,o ja,,li i'pvro3C-ntativas, áe -puais podooi &05? siEteti- :a a iztro;, m -;e ;c‘ i.iaiãOGi; aa^^cvucis íiG GOvpLaooiu do Add codiiicadoi4 0*. ...... D ... O ^. λ > 9 Ç.J a « ...i ·*„·:'.. -;· d(pCZ0OOa.tQ lia i_COC. oC; OlciCíl2.CiÍO pí.,0 din, .,;u oo ;p ..-ruc 0 .... puo codifica p j.r-a todo 0 coíopidldexitt a .. o jC,i_a;·.a-a.2. OiiaPzu -,ο _,λό· ^αροζοζ-οίο» esic'oto^ij3f. . 1.. vo.:. o i. a M pio ao co ,.0 í; u ce -:a i.ãpa. m .ço-c - Cd .. .-,u .a, υν i.a.ii,o'ô.a anivoQeiaOG idCivõiea ζε. porção acti ‘a 1 ao„o a. „a.>oao.Aiâ. do ,..d. ^rstsud. „.y-l 000 oodificat o . i.- v 1- ^ a^Ã"o,.·. * aa :_a a abra/iado io plasní-- d, 00.:. u,.a a„χ-liaoão ,o a:_c; dada sccçacj) 202,0.0.1006 go pc*x?die~ i l.-iI-z^cc.õqs doe í'c*g 0.0oiò para. z. >o..õ.o o, por onero 1 A·, d.j,.a ·;ϋ,;ί ,„;itdóõ-ο ·αα! eoao ac pr-opyoveimacias pola i: 7. a ao. 1 . udd O GCO o Λ '·. CG···"· ia.-O o zoferivio pz a -3 i.; c i-o ;la,. Gid.O p ir.;„ -a- . - -“· — r ^ ^ _.· *_ v.·' f .L _ ;’ 0 - ~0?\ a " * ' ; Po cão oorajoc-iaOza i1·. ;; .L -, 1 -ão ...:. czpocid i..cias za zotac-ão z . :- r. do co.?õ. foi coli i.. ir-p rí;cj.i ^ pC'.1 .. :> .,.p .. aozia, . ^ .d j, ^.1 o v 2 *« * »· ^ • · Õ o ^7d0iGÍ.:/?^ : > ÍG-0 0 Χ'ΟΰΟϋΟΙί 0 Pa. i Λ .'0 .;u.-Cw,:a; + v .> L'sP**l, U Od.iy 2,,0» # . z-7 . tl»d -j« .íbio foi d^,o,.id,,do ooli a 103 .liiii iO,____L . ΟόΟΡΓΐ _?L' .li oíí.id?G . .. ^ ^ J.1L nv -5 ^ e.;» lo fo p/gvgí?gíi?g ug o peoobou o lii í - d- b (P . . v «w v,- --· - · ;.0 1» ^ ; „ ., JL'q
L _ ÍG.;,.GLÍG0 fei dG-;0:5ÍuGu0 £_l Cpli f,.d05 g; ide .-.1 ocogvoGi \ai±‘úií~:q ^cllccoioii * i^eorda, 1
i:3 .e&aeí?GÍ2?0 6θ 1363 e ZGGGh® 0 £& . w -' 3 - j_ . M _____*. .... .. ^... J^Ou/. jU \~.J i.O e J ... .. · o .-ai colo é essoiíOialaerte i-sa ’.ο&αο , as xmcações r. ou.diy.is 6a i.nv.^· }So po6g : 303? aplioa-lõs às sooaSi-oias das v. f,....:. . . ,- ,1. ^.r-Ouiisidas a-oa .áaGilliis jiea-l· í. :> j ou;í j ví.í'íu .liio.os o 3'j,sirai.'ii.-3ú.aaos, sociioncXas olaias çpLG aO 1 Ji o uõ t G 03 UC.3 3.0‘J3.VGS GOrtrU X0,i?VC.3 ú.-· IS GXO.O :"G01?0â ÇU&SJI o, coi .: ' i sa:.uíU;eia coiaior^ada do,3 116 euiac-áoilos aci·· i.:u li.l..vu n>_ eu uua s-osaCiieia c.ug e aX'Ga'.!ei.to íicnôlôia 6 as»* .,..O L>6-/ ,.._0 .. ele ‘ - ·". u -?"·. , x f*V - .1 --4..-.- õi:eoaiaGa.iJG epal- / xd j.X'0 : : . -Ί GtO xlCl-JUO 6 oa i ;.yl d . Λ ,-1:.-úo a Γ.ν.αΰ1ε.ώ qiu são trunoai aa por reao-
J . <-·. l. a a -.?eáa — O Jv .U V . ...a oi :.... a :' ;.acuÍT:.i .. .....cr,-.:., a a u cu . a .a., o a • ;l3, .. , peew ac pr-oto.:X2:o. ao jusairas ou ua...: - .-:..0 aouoloo coa oodoa 303? traseadas ’a -,,-tooo_Í2:al o ::.00 toas para a por™ooo.ôaa. .r.x erd.c- 5 ooõiáoroGG, ao enxoto 51 ύ 1-0 5.¾. 012.0-0^030-31 S oê-O ΰ··-0&8 Ο Σ?0-116 a...ii:oáei-os 6 "η.·. i.-oOtica e ôu.Gx*as toa. ou :.:10 ΐνίο,αο α aosaa u:caSãc;La cloo 116 ao.iaoá+ aereia Goui</aloi-t£ lar:o::ge;cs dovc-lo^a. .-or i‘JtL· 006.60, ò:ug£taiii „^-73 .'. .·i 0 6alleric.s são .jí: ooiàO.ooidos co.oo prodator&$ i., ruo 06a,...» co . j. ....uoua Goçaôacla oog 11o u-laoleio.oa apc .: 6. ,:ã.. o: -:00.0 ILlcriraj. pelo „oaos a: al^aas tutea-·· .-- .oa... õ.-.Gti,, sâ. o..ifieatiTGGoaò: taaúo ao oalaaoo d$i .; :.6.-;o:òaa 0 a:, o.-ceão 00. _::oto.:èaa. Cutros, tais • · : - ·.' 1 . . 1 . ·t v. .·... ...:- ·*,... . -.3C·.....:.HO.í.yJ.i-Λ'oi-..e· oalstduiiílo aa aeciaC^oia ia-lioala dt 115 o ; 4 -6y 5 6gq CDOtxicaua o outras altera ^ ' 1 . . . · - O.:: '. .· ΛΟ . ,- Í.O.- 0-V :. : ‘----:. . :V..' *Li.sj0' .L0. & .. ’·? a Ο'-οογοο :aoGGOoi to:? alteo-a-o õc-s olaoalares ou isál u .00ο·':!:·.:·· . * .... .ο. ;la õ
t.i J.GS aOs-OGC ..χ: aiêiiuáoidos 6o, polo aeros, eer-
ca ,· 7"V :· - raia.pão nenciOBeuSa seíoieneia dos 116 amiiioá- c.u.Ou, p-vip -pire la-iitar· uaia ou mais oJLtc-x^&çSes mutantes ua 1,.7-.1-.,.30 r.,· alisadas :/ατ<ι os sminoáoidGG m naierida sepuea-cá a r'ão-iuu.ia-la -os 116 aiiuoáclclos, pa^viculamest© quautío oáci
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J -. a* η., 0 i-VO .PUXOS. 1* V 1. .U; .>.. .._v v. *.-«... 7· ._.· -- ... 'j w u AJ i s .,0.:,, xosa,.,...iulo ú_ac · i “ i. „ X ·, ' . i ÚOlíGãv, - ·031"..Χ ’£lCC3 ί . *'yJ,o ,..J .> ' ...vt^,d,iO d-J___ Pi? -,.i * Λ , ., : ;u, p pr-pria 1 G L. y: : r\ a . u7uõ:U. i: J .. , 4 ’-J c-c-a; "o ,u axad 9 ...X-G Ui i/s. i-;-X*P-rSiiCÍci. : - ν'. Õ ;pl·.- t,rxá a ::a ao ... fx . aCv ,1,,.../ .põe Ί,Ρ-, ; , P i,, ,,r w *- „ ai : u' ' _. “o . í;.ia do .··. .7: • -.:.-1 c ..... .aaLlap: G ÓlG * Λ . r -i.. - - „ - Ui J ' - -p- :. ::· ·, r υ . 17 7..1/.-:., d” · . .a 1 C !~’J g . sã a axalia i:a 0 :J. ,, ", ' ,.a aoaa.-áado (o· lul o:... a .'a:Lvão 5“n ‘-“yG. - i.x .a d;. áj .ina H 0 J y. í " ^ > .. . ..ir··..:;i 9 i ^ ú I ,u. Π c 'j •a. " Uyis soa-ιορp· Λ ‘ ; jG ; _ l-.a,,:õiaaa} coai. 9 Jj " r*. L.Í o , o :: pp _op.ipp:bo da r-,. . ' _ · Gcadxr pusa a prs; ' . . .. . 7λ .u.:.:;:';- . . Ι. .0 0 _'... ÕCPii,· puSuei-s a ggp ,-,lj_z-ada -«..Elis s a- aiiaÕes na O \J s.. 1-i.O Is. 1 a a— d-!-» o j 0, aoáello pc ia. 1:1 SG2- õus oa as;: a. iaões .ivSUiuãiao assss,-.wi.sa oa o&-.<,a um -aos ssa$s oudaos ;..:.j,iioaôiuofc pac aasioGLi cof s c,-~ ,sG v.aCi:.'3Íà, uoa 11a auiao&eidoé as aiitaaõos la dapoiieão possam se# cs_inoáe.ÍL.os á....i slade doaôlopas de ,b au.r-ta ou mais tais ai?ao goi ,,aao.pp.oia suo ê toaiia-ti;.l 3G JUfcSr* iu GGGaaica.-·ο_·6ΐο jae ã-, aiinc-,õi o aiitaaucs -aa iaarai-pão pousa •s pua .ião oo.lílfica-ãa:B .^clo ida., câãoia liacar ao pnop í?ío sortido i ea iala uiij-la) do aoaapo úo a_a, ίο-l a proloa xardo-se ail à posi-ooi.uígcgs d.;. :1 sai lisa, ão ripo ao 5 lO yU ui ϋ-Ο i-PÍbcU-ci ’ΰΟ-.ί Oc UUul., £Λ-Β2»| 03?-;-ospoi2:i<2n aos 116 aulroúoidos da se- lleala pt-lo s?c -ooúão çue o emi— jopuãreia lo roferêroia» Á£ manei-p^p amostra ao lulridi-,s-átiea. át cordiuÕes de í «
}'i 'iíi:, ·~·^ eruvtas ε-ã© aquelas em que esta e efectuada a uf'° . .· tu.cpão do citrato salino (.xr.O a £»5i> sepuisião-se a 1 ..v.. λ;_. a -'-v0 ‘ i„x;;a Goncencoação do t&--i>,ão redusid© qao são afeitará a;, Irlcridisaeões pug teniiazi -feido lupas?» .0 · ari •-rac-rcia, as rataçõee cão realioadas em se- ctGJi aais ão uae ua, A. 0 . .. - . ~ .Cx. OJ. A i 0 Z..-1 ';i·: - á dá C.C., coadoeido sc côesioa ca:, a Estância Ce ., o elaede· - iic r.. c:.,PHOàdGC> pode for-ar uua porção do se-ã? x.c;; ... _._.o irãsae Ce csCotO-Llsus ãif^noitõec ou doutra edificadas, cise ΐδο aetioldade inseò
succcs iaoUifaC8.i}0©iS
Sr-cia sor-ão eoretaecntG- ceceobertap êcrJ.Q& aareiparep. jonseçueiafce- ^orção da ceççieíicija.
J ácidos . ·.!'. ,..C.C : -._'-C. ·:.·’ ·.·.· ·. —áeidoc difcresces pop 11 * -· ·.' “ ..... souco de paaor er ·. à GO.c iioscia oir rcdorás.e - % ..... í':o;'p.xacac I .·. . • 'Λ.. t-·. c."..,;7c. I-. p > ^ fX.. tOi U‘J. . ' . á.:;d,c ; cppSacia •'U- 0 v,-‘ -JOC de tácsi \ . ... aá:._aá..c -ue cg acro
Λ ; ("> voi í ( Cd SJ o :: v: a çrr á ar'lopa à porção de referencia d© o·., po;. cariar eu„j.. ^ ecec-oão considerável e ;.... cic.c d.è cer acdicieziuca para pi-opoi-cio-iai" a prj} : ororiaa, iraoetiGiearesro aotiva, ^or òreuplo ·. ca,-crc vela aeuiaiáave iaccaticlua contra as la— o., r dcruC,:: do teaxeeo. : veie a co-uârcia do a:vLroáeidoa a rortarto da por v> ..aua· . ç .y.encartada ou au .-varada ei oo^priaoEto ομ, cri ...1 ;,..,ru auuP.-da rvlatiTUiior&c a ceçaoreia r-epr-otentado. ·-· .a - ..-ir' r, inicia-co çeralcpcá;- oo- a cíctiorira cerdo v aalrr ulra-acro no.r'lowa (7”. ) cu ideutiea â : ...
ÚO ,2? otícíc to uue eesa '· -' · ,k ' r ' o j x. * ; ; opoioaal: -aCe ceatea? o rataste prefe- 3Íorado pela invenção •orção a iuocrrG Ca secdôncie. rabada recus- d„ão -V ao.,o ta-Jbóu. g arcu
PPC variar luc coada ou au,_~stada em. !
14 1 J
(JU*MA i ισι:ilií brio retro.; mt&âo na no irtssoino do lasso isbonioisaonte prolonga gol nas. porção inacti-ηιτί,ο,3-32.130 J.C· mjocto jjíitq. pno&or ~Λ."Τΰ. 00.00 iooocblol.-.a* iicàái sno οοαιριν-:ΐϊ·.ΐα·;ΐ ljh oaz co lifíceuií -ιό:..-, j-c-o oco;o a,3 proporcionavas pela inven :.0::.0 sob o eontr-oic- .o. oe^oe^eiao ro.pala*· o :1,.,T.adioo aoia for,-ar te atores bi or .; . . 7.C· ~'-T ..-:0: ,.,.-0 u. 0·.ϊ T.::*;„03. t-O utiUO3 O... Qlã" -1 0 ’ f/U si ϋν·’-..1.^·.·Ρβ _ JafO •.-.lli/O-O 0..0 . η.:, v ovooicao biobconolópions r^eo,ibiiianbeç, v ..οι -pio, oo.o a pro.iapno bo Irosas por tais 3vOlVO 03:. pOC-OO 1 31 02a aoóOtL o'. ll lo* hor-ação apropriada llOápO :0.0:0 00,30110 a .0: OOluiâl S_: 3C13 SJ.S. 6 o-:o: :i lioitas, nac tor. ^±áo caracterí atiça ©s· - t- ^‘*4 -- '1 Ί 'r*; b 3.f." /a oonto ao Lõll Op :y. *-,*1 ... Ί . >i- t, . » o) -.:3-a ; OOntO 3:.0 cliva,/ to o ovi bo 0 I,G C- y ' polo 011 não bên , ,1 ao ---unci bO it· for. iar ana ano’õO--ix: iT' U. '.o ao 1' w -L ~ - a ,: Λ ,1.17,. /33: 110 0171,0,303.13' C . Λ . ,d" -i,.-;t 00: : -. TO '3/3 •rtuina ; . j. ^l '· ' . "o ία. í, - - -' , , - -- - .:t b* Λη r< lais : m .. : ,ejil/; ,r, <- . cO? 370.73, * 3 --J - s. , J V rr: ». ,: ατ-Ι :/01,12:1 C i a :.0:4-:1 . ο ,*,οο - " - Π ,1 j v 1 ."Toco' 0 .· . oo^eioial j · ΰ β 2,0 f3as- o ecoteáclo iiitopral do ;rl,7ac-aa do ciy, final s OÕO OuOOi .-j- V;f. ãa ,ητ.-Ί j ,.·/ ... no/ n- ão no /· ..-...: poios utiiC ...OS 00117 30?, 7,: oioacão Ll ‘ .:". . ., tC33 ..oiooais tol iratnras cooo .3::00., ....·:.Τ:2?ϊο±3 ροβίθι! 3:1 aanoioiináod 0021 0 li,; : , -/,.-^7032,,3.3iS.,:.0 ÒG 010:,0.00¾ O.SpGiloSiidO 0.0 iiroan- 0 Cr 3 ] ,0 ,-003'. nist*ir..r-ae inôepcn~ ;o,iY’jo i-oooriao _,.octoiráeeas ,50 estas não ,0::000 0.0 óuaiTj0-,,.0.000 aoe'-.aa-o: no àinu&~ o ooíboioibo. bocbno ta líi; : 7!z · -.0, ,aO, ο ο Ίο . :1-, :03,:. : , 0 ,:-cla 012 f aibib: ’ 3. Οώ'ΰί _c;;a iliba. o9 poa’ eiasi J-- „./3. : 0 ·. : ,-.--3 .·. .,/3 -.:/1.. ..0,3.:.2. .,..,0.) 010*™ Π Ou 03010 b colalas trans: /¾ Θ Ι.ΟΣΊΙ,ίϋ__ν,ΙϊΰΟ V.jX'‘51?3ΐ?ΙΰΟ *G2?cljdi3£OJ*-1
.;..ur* ο οι g?.i: ;/ΐ:οο·:·;·τ· células baotericixuB ucOioO do tipo gnaa--m. awivc Ou M^à-paMbivO. dn dos tipos pr-oíer-idos de bac-b'rias -iruiVits e .·.· GOli, oon a caol ce alcançou ,:t'ateai tiVã, · · · ru-é SúSO. 0.1 p5?G eOí'i'Gu GBdouoMnis podoa orei ^ Λ ΐ·^ρΒΐϋυι..ο ia ea biotecnologia e Ο-Λ. Γ1. la Yai-ic :'e ús plascluios ade 0 \\.L· iorcis o 0; lo cauas v-0 uccoorag ue Cl,"·: wáé OOatiUa a ÔiSpOSição i -'w eauatitui U 3 autuo tia-O Oo tcicté.
Jseud0£10“ va_> fceuu esioorporaciõG plasuídios conpreen&en :.2. jq::.o íorodatore
Old ι οί·:: dact ud aço- c"ceidi:.t,l. 000.00 Ό -o ; h ΟΛ'1· OC".:" - 'Λ 'GÍ“lO j ai L ',0 ;,ãj · c r-nui. ic. ".o 'MG 3 .. , . M # - d, GUJC .'MU., e i?u^uleyao 'ósío oca© ':;ai*gxo tilareisΐϊνo as ético de li :aoão d·: i-ibosoEas pac a sua Jtxu ·.* o õoçoapoaadac 00/¾ oapncoião 3d células torélo aiò» tais eoae coli. aual pau a ac c-n ΐ,ο iiouinas untar-iilaoaGaão incduíôo no âibito cia ... 7-do o ,-ãc< pou ela coute- .alaáaa a tnansionmção M/ncaMo do oaetôriao do tipo laeillas cou vooto- ·.: :·' oro aiGeotcado o ítc ouo codifico cana oná© tn Λ.1Χ e ti,· ;d.a.r # -
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j .-U.d;p \J-J. ,L ;€ :3¾ C -ν'· aolllus ds par .* v,r::7.et í-jvai uaAuÂlS ClG a. t. « oélUlGS áõ 1« C0gSUS dado, .d- iUlojilio. -Ma béoniea oculto uelaorada para 0 v. ., .oi.f. "0 células da jacilluGí, paubieMaoaGnte do r©i a:.o, 0 occòg dc,.)Oobcoí.c o é dc...erita m aeuónia . „ 1.1 lo ao IcitOi-te .uibloaca C ydl ?2ov Os ti-a.-cçoadac paca a tr-anafor.aapão colo puoceoso .· ··· ·· · · * Ο U·;; / ---0-.:.. ..O '·-’ -,-..1.’·,.. ·... . / e U o .vU.aO— a o_.:uoo oias_,íd5oc c- uoa ao células ae ti- indi. i ii_ ^ a i o l i.....0 o a · oc* *..a.-. o. oél Γ: a:, a o ___= LOaoCOOCiõ Uw adr-cccponcfao ou iQlUo de ,J » ϋ a ..^aocou inas o células a. .OCj por oue.cp, naturais Os plasiil·-clllus tais lo3 o pias-
!.í;.io p'7:i'õ.l (rreít et al., .jole-c. r;en. . [l97'f] 1Q2 5 3) o o.;: oeas ili.i'-:xdío& aaoieaitoxci. os oa&is powsa. ser usu ocs ou douiiMc-a cr aplicação das tóexieas recoaMnantes coLvercionaic ;:ar& vcioiilaz? as soaiiSaeias ou© eodificaa a eá daieabe i: ín.ixão, α CO.-.ÍO e bea coxiis-·
J .. oar> n-ã ,11-,-11 x. c' o ii, xíx dca, · . eíialc 'ti? .·· i ; t», -v ....nu um c-.e-se.-ja.zas açc.iias auraz·.·'·* tc Λ -i . .iidie li..- oapoidiiucc.o e, coimori yiiío.;mih;g? s&o cal ti.7a m ea e...odeio u-sr alcaroalo ao bOireico àa neliior O v 2. 1 O . . „ X. 2 .. · ^ :.. ·.· . lO.-O · ··..' Ci, -dlXC w*X01li.;:-.£ » ο Ί-. .. 1 5‘os ox v-aotc-ues a·.-. e..;r.-i:í.-b&ãõ pror-oroiojac.áos 7 e xxoxlxxio âd· -our-c; ao ondodoxiMXS mutactes cr* ·:·.ο,. exxxox e„ colulas 1.·..-· ..«aaillas oim aodea ser x. ^aeillus 'ΟΓ-οοαπε.- ca;..5acteaxc+
i , ulM ;1 o:-:..'.í5los ;ao -atores xx ciiMioiir-xx ou andei: dá
i-- - o a.- o., .-alá doe r-;. xiildo .-7,.. liO :'*J · - ad„ j lí cV W l. "' ...Λ. .1 i.... ία o :i.. U a íd, J vV-d. ,\‘J. .-di---. .-ll u i Í iiiiiieão apK·e:?a ara· ri . ' . ..; - x.ici'iii.a ...0 w d i.^ ϋ a,'à3 OTJ t. .-·:· ;.-!i .i-d y*o'ua:-‘0í.i ^ ca V1 i-dl, vlliii 0 ..i tkwui. 5w iixuCGO - lOO í ' : - la ra.iãe id. aiietir aa ecteai x X i 1-1.ηχΐ J... .... ,:iu£.a.o o.i ÔC.1J i-i-iluaio ,.e C- ” 1 rd:..,3ii dixaiaiuas o .: i ' 1 d. ..,1 do os-iotoaiaa OXliMc.X al-l- ) 1 a ; . . ;c?-v-vd'.id.o mxxgxo ao uxmLuo cia rliiTc-uçao traza- i' ..a- . células 51 ;.aeillus eoa al...a...í^ioe produtores de .. r - ό,χ.μ j-5,àe--a -;.a:ua l-epiãô-j/teros ia aresoMco irTeneão ί'i-í ;o t ia,., i,.-.2.uhlx ãCxMueu xXxx....M.:x.oy ueu?x ii_,.:.ObOeieiô .xao -. , .a.,.i a a.x,cxxvx.3 ooiitx-x Mx/iMíOpuercD» a xixi ao aro ’ia .á; a .•-aaoralaoc.õ esdotoxinis cuo „ ooaeisaai pa ri a. A:à? :..a μ,,χχ dc aetividude ineuctici χι ...xic aixr n m. . ia, oá alae .íoioa cue eaeiaecíalea xouaenciae i; ao ndci.. . i .... „o oz.do icziiiiaa mixdc. j ίο·.,;'..- -^-.r .· usados .a i:i ί .... .a. ΐι,ι...ϋ .>»υ» a a aaa a j. os ou o ou. ,.»b« u a 2i e :..::1 o íil s cnie -.1 i -i. . ^ ...I t :-:.:-.-1- .iO vI.LO i-l:.:.' vll ll.:,2.l:.1 li 111 „ll'ilÍ1 COi.-.H/c: i.o. ; í .i ΊΟι. .ί. _a:.i-.uO> a pre..j-^-uaediivg-íivao ut.i οοχο i.eiioiís^raaa
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.tia a .íOoíÍlíií dv orC.OuOzsinac Ίο tipo &a-. :;;;tr oospleto c tpur.easup, 5 no'raalsieirce pso u^aa as encofconir··^ ..atastes cUrsctanent© '.p.s ·,,:. co. ...ais. esto acis cosploto, as cpials ;. os .-.a...vl.:ca_tas ao do ti.,o aataaal v.-=lo ..anos r opt rsdlp-p:: do alcdtpdt uso jirotslsa :le ondo ro.. -a _·, oapnoio-:.ie ai ,ilaa o..., rolaoão â. ©apaoi-os ira efeito sultiplicsjiiro aeihorado :;a to . i Λ
Pititt l-í ..:· _·;. iiLtuaiwOG sc- acordo coai a ρΐ’ί t oitis. seo ia asiles ao peaos.& -e u^a Λο, ;-:?'ΐΌΐ:0“ΠΘ poe .ãjái ο.^.ζ:·ο jUdas as ..?· ti .a trunco,.-o, p- ose.i? co as soçuGziciaé - .. · ·.· .’) ·.:....... u'_.·... .: . ·::-:? "rotalosasost Λ# - ^ " ..,.o :s\s se la-enees - 5,1 ...r-^cdc-i ;t, 0C--...-.0 r- ,i do //.pptaotoaiu;, pplpcionos Gle-ó-cropu-Jcsaiir.cão, ipstoieoo sonolsai/òo,;,. ..-ais técnicas e soa aíJjac são t-a. codioeiclas polos eo prol, rãs.oia, o coosesoia ão £Ps 1 ,S:-. o ;u?.l pado ps.5?a Ou 0.:.1 101’ ‘ -------rr.r,. : ÍGrO“Í"jOCçãO, b:Oc.SS£OCpão ¥Í- idiasa.: ou adoentes. v. ao, i-;. - . *7 127/0-3, 0 a. 0 u„- Jrõ--,l9l ,0 -._ão ds pL .. ·,η.’ ic·., ' -i..os::.·to* >e u ', 0 . - P vi .i .; ΡαΡο.,Ιιιο. . -Γ , w'. -J_ :ó;os.. .: ο; ο*' ss.iPus, 1 TO 0; XíA. *
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iv.:· ,ãc .a,,. ooltttea para c α.,ϊ·οtua ©- r>«QQli esceneiul-iL^iív. mu ._:i· ; Ir.u áu ltio.~o «st a_o-_. ·...οα uC^enuc/tfoains. de ,->«t» trai.oo 3. 01, -c :· „ «;, ΰοόοΐ 6o 741 ad.ooáclCos s o composta 'Λ c ;lr i.,.5 j o'.et. -.Os via soerão ãe pvotociaa oatural ce 13 ama Oo u.:: a-·... a oripoia oa p;t5^-=--· ata proteína 3a fusão ',.:... . . o-. oravei-ta ‘jc.. ·.-:; ul-ovcto nível c,c aot±vlt.aao insisti- ci c ,3vl _____ ; o_ ·;· _-ro ..ósito u.o , .vali ar o,» nes^v-otivos iv . " av . V5 "V :0.,:..0 oraoalin» „uta acOiviáalfe é ss*· - - .V.,, i ,/a 1:. ·, irvlrjuívei cia te ova .roteíra v. àalta-on-
J o · n "1 v v.·;,uya:wo eravcv. c. ruo toa apenas os to.:iaa. aetivaòa (a. iroáeidos 1 © 61'’· cia .1 - j
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λ oio O ;o .·:. .. r} d.lO 8Jm -í-0 n d:iJ ...V ~ 00-.8 , COiíVOZ '8800 --08 .raies c-_._ _ icíjc-cliii·' no -i u / 0.^0 .. 2-- - cdr-o px-o 08 ' 1 -' ;. .·—.O,. b :-201 OS prjii.- oantl no .vó-cpõe-s L. 8 .l. d. _i .. 2 ÓOS Ôw pn.l..' tiO C0:„ 0 -.0 ί.;·.. j,...l-·.'.C.O 1 dõi Qca.o .Οΐ .. .._ vIol l'8p, oá; 1! vá.·.:02α;0η::.ηθτά lon 8 - 2 2 .v X X *'j k " 2 - - -- - - ~ Λ ’ i "y z : % 8 o - /' C0...0 o - .· ^ -i Γ* /2 . - ááO L/d-.oO Pí.l í;i.O : 0;:·· -.-.ΟΙ
• 8 u/cr jL O idlL ZL j í/i u iO w JÁ‘> 88-C<íOO 80 -J8O Oa: 8802,08 -,.>8.8?. ....>8 O „ ml j-o_o ... - .... . '08 - '· ‘ ' c · '- n - Γ- Olnn UJL.-- /_.· r... : .o r‘- . , w‘ pro.-.. 1- u8 80 ji-iina 1;. 2a. ^L- ol; 0: 808 / já Uu os ao Joa 0 ·-’’ i- M .00:0 r*-... -· -.1’ L V- £c:,si Ιοοϋ'ϋο ooll -7, ?l. J 'ϋ V .'»· „·. 2ΐοηοΓ:θ.-.νθ£5 í 1 vl. e oll g\-r uole 0 ϋίθ-Oib ίο aapla -O -- -.- U..: O.: 0 o o.nr..l o o O-.-on ué aos pno :/l0 » õ.c 9 --- s pox . f?., v., ·. .;... oadoi o únion siii oi.-.n cacloia nd.d oon nónoloz, coa-
vencionais. No caso dos mutantes L-l, usando pr£A coao im veículo da mutação, os plasmídios mutados de cadeia dupla resultantes foram transformados em B.coli JklOJ, placados em agar II* contendo 50 g/rnl de amplicilina e incubaram-se durante a noite para se obter uma pluralidade de colónias com uma variedade de mutações diferentes nos mesmos plasai-dios que prAÀ excepto para as xautações.
No caso dos mutantes L-2, a região da dupla cadeia imitada entre os sítios de Bara 'ZX e Noa 1 nos veículos de mutação foi cortada usando para tal as cndonueleases de restrição Bam ui e Aba I, reopcetivamente* e foi ligada em vec tores prAA-5 diferidos cosi as mesmas duas ensinas. Os plas-míaios prAE-3 contendo a região nutarte ...-2 resultante foram transformados em jj. coli Jr.103, placados ea agar Ϊ2 com 50 g/ml de ampicilina e incubados durante a noite a fim de se obter uma outra pluralidade de colónias envolvendo uma varie dade de diferentes mutações. foram realizados ensaios para a demonstração da actividade de sequências de endotoxina mutagenisadas expres sas a partir do ABH contido ea, por exemplo, ti.coli JA1G5 ou B.coli oG4044 (publicaaente disponível ea Agricultura! Research Gulture dollection (IuíEI»), feoria, Illinois, jS.U.A. , sob o Numero de referência (Eepositorj) no. 2-15969) num ou era ambos os ensaios com. larvas de rebentos do tabaco (Sobacoo 3udworm)(1?3i) ou no ensaio com g.ni, como m presente memória descritiva se descreve posteriormente no Bxemplo A. 0 Ai32Ϊ de mutantes que possuem una actividade aumentada sobre a endotoxina não mutante padrão foi seque-neiado nas áreas relevantes de mutação para determinar a mutação do ABII e con sequentemente na sequência da proteína, nais cio que 6.000 co lónias diferentes com plasmídios qu© contêm secções mutage-nizadas ou w-1 ou m-2 foram portanto avaliadas e verificou--se que na generalidade ocorreram alterações em cerca de 1
a 3 aminoácidos eia cada experiência de mutação. A Tabela 3 que abaixo se apresenta, identifica os mutartes superiores recuperados directamente como resultado das experiências de mutação, a posição ãôs aminoâeidos com referência aos números das posições assinaladas na Tabela A e.n que ocorreu caia mutação, cada codão matado era. cada matail te e a alteração do aminoáciclo resultante na posição indicada como resuluedo da alteração do codão. *,a iaaela B, os números com o sinal - ou negativos indicativos da posição dos aminoâeidos indicam as alt^raçoef entre o sítio de dam dl e a posição um de Let 210 início da sequência d-\ endocoxi ua, não afeetoado essas alterações no e ntant0 a sequênc endotoxira codificada pela sequência mutante.
Os mutantes identificados na Tabela. B, abaixo aoro sentada, foram avaliados em todas as trê-s fases do nnsaio do TB;, produzindo resultados cono se descreve na -rabela 3-1. Vários desses mutantes foram também avaliados no ensaio de Γ. ni« cutjos resultados são abaixo ilustrados na Tabela B-2 •BABAM 3 SBCÇlO Jtf-Allc, .AJfAi 23 posição do aminoáciuo í.í-1 p26-p 119 1>0 £.VÍ. ή,-1 p48al4 1C1 ne 217 *.“1 p43c5 116 187
Alteração na área da endotoxina ácido irucloíoo Aminoácido GOA a ABA Ala a 2br AxG a ArA a J.le GC.3 a GAO 61y a Âsp GM a ALA G-lu a %y& π λ οι vTilC* a ÃAQ. G-lu a lyo óCv; a J&M Arg a Ais GAG a Glu a IjJS η n a AOG Ala a 2b r
Alteração na área da -Áiijjjuá jJ (Gõiitiiiuaçao) O-iv yAe posição do endotoxina ...uaaímja iwíí aminoácido ácido imcieído iminoácido Xi " X p36ab3 122 A32 a kn rhr a 11e 125 GOA a 02A Ala a Vai ,-2 p95a?G 123 Alt a 1M Asn a íyr iw-2 p95att6 188 105 a SOI 2hr a Ber ... -2 p93cl 188 105 *·' d- 535 lar a 3 cr «-2 P99c62 204 AOA a AO 5 liir a rhr 105 Ml a 512 Asa a 2^r 4 Ml a MJ Isn a 2yr pl07c22 194 Mi a MA Asn a lys 94 AAO a AM Asa. a Lgrs ,-2 plC7c25 184 a 125 Bie a Ilô -11 520 a ©AG —-------— ,,-2 pll4a3G 95 OAA o. jfi Gin a I»ys -15 M2 a : Λ Γ _ ——
Ha Habela B-l, abaixo, o valor sais baixo da elas sificação na coluna do toxicidade indica o aais elevado nível de actividade (ver Axesplo A para usa explicação sobre as classificações de toxicidade) e os controlos envolvidos' numa quantidade equivalente de células cl© .©« coli «31.103 e de células de Ã.çoli 854044 as quais não tinham sido transformadas com qualquer plasmídio. .aota-se cue todos os autantes fora- ir iicaios para serem substaucialssnte mais activos do ouan que as endotoxinas naturais truncadas pradusidas por uma tidade equivalente dessas células que contem o plasmídio prà; . - 24 -
JLL ^utante coro. referência a xcdoela 3
Glassificaçao da ‘cozicraaa® toxicidade· aédia 0 & 3.ãrao, 'OU-r atribuíáa p26-3 2,75 p48al4 O O:- p48c5 2,63 p36a65 1,50 p95a?6 2,50 P93a86 1,30 p98cl 1*35 P99c62 1,85 pl07c22 1,42 pll4a30 .> Uê* ^ ^ -¾ -1 controlo (Oélulas J6103) 4,68 prAIC 3*35 controlo (Células iáG4C44) 4,12 •2&BJ^â J>2
kutante com referência Potência à tabela 3 relativa P26-3 217 P36A65 237 P95a76 291 plC7c22 357 pll4a30 239 controlo (6Ai\415) 59 P99301 ICC í'a tateia B-2 aeina, ao uma potência relativa do ICO, de acordo coei SXi^q (para usa descrição mais completa ver ο C&e&pl© A) e, assim qualquer valor relativo da potência mais elevado do que este indica um aumento do nível da toxicidade causada pela natação. «
n hum trabalho adicional es prosseguimento da inven í ção, certos mutantes de kJa apresentados na Sabela B acima, no sentido de envolver mutações múltiplas foram analisados para determinação do efeito de mutações individuais e de pa res de mutações em tais secções nutadas múltiplas. lissa sub--clonação de mutações individuais ou de pares de mutações fo ram realizadas usando uma estratégia que envolve o isolamen to de um fragmento matado múltiplo etiquetado e ©a seguida o corte deste num sítio do restrição interno do fragmento e localizada entre dois eodões matados· As duas metades ou se4 gmentos dos fragmentos foram então isoladas em gel e cada uma delas misturada coz as suas metades complementares não imitadas ou com os seus segmentos dos fragmentos não matados obtidos cortando de maneira semelhante os mesmos fragmentos de prAI. 0 vector prAZ» que tinaa sido cortado para isolar o fragmento complementar de maior dimensão foi então misturado com as duas metades complementares misturadas © formar uu plasmídio prAf modificado compreendendo a mutação pontual ou as nutaçÕes pontuais existentes na metade fragmentada ori ginada a partir do clone autant© múltiplo» mais particular-a^ te, um sítio para a restrição com endonucleaee iilio II foi trategicamente localizado dentro de certos mutantes múltipió de forma a permitir o isolamento de fragmentos que tem um ηφ· nor número de mutações no segmento mutante total. Qo&o será evidente, o uso da en&onuclease Αήσ II foi aplicável a um ntl mero de segmentos mutantes múltiplos na fabela B com a finalidade de obtenção do fragmentos com uma mutação num único ponto de outros fragmentos coa duas mutações, hoste caso, οφ plasmídios mutantes múltiplos foram primeiramente tratados com as endoincleases de restrição lísi 1 e Sst 1 e os fr tos com 1430 pares de bases resultantes foram, separados por isolamento com gel. dada um desses fragmentos d© 1430 bp fo*f ram ontâo tratados coa a endonuclease de restrição lho II © os fragmentos resultantes com 330 bp (lisi/lbo II) e 1100 bp i
(lho II/ost I) foram isolados por meio de gel para cada mu-tante múltiplo. Por outro lado, foram então semellianteaente obtidos fragmentos não mutantes do 33? a 11C0 bp Q fragmento maior com aproxioadamente 4 E’b £ísi 1 / Sst X de prAn* nuns especificainente, pequenas quantidades do segmento maior zo-ram misturadas com o fragmento matado do 350 bp o ooa o ira gmento não mutado prAZ com 11C0 bp e a mistura resultante f<^i então ligada a fia de formar uma serie de piasaídios mutau-tes híbridos de pi-AZ. da mesma forma, quantidades desses s© gmentos maiores do prAZ foram misturadoe eom os fragmentos prAK não mutados com 3^0 bp e ooa os fragmentos mutantes cosji 1100 bp, e com este AX7 ligado no sentido de formar outras jêries de plasaldloe híbridos mutantes. Os plasmídios-níbri dos mutantes ou clones resultantes da estratégia acima mai cada são sumarizados abaixo m Aabola 0 que refere os três se xer.tos COiTibinadO': > e as nutc icões no pia .smídio resultante em compara ção com o glssi.-· zui o prAZ. -J t Z^J. 1 v Designação •Jegmen Origem do Origem do Posição do anino- do novo to vec segmento segmento ácido da mutação prAZ for- tor e de íísil/ de 2X1011/ ma do origem /Ãho 11 /SstI com 11GC bp A prAZ p43a!4 prAZ Giu para Zjs (3101 lísil/ &ia para Lyo @ 116 /SstI 4 :„b J II p26-$ prAZ Ala para fhr @119 . T II p48c5 prAZ ;:lu para L-ys g 11S J It prAZ p48a!4 Ar.2 para His(3 217 Zf «I práZ p26-3 ._.ôt para Ile g 130 Gly para Asp (3 201 ff M prAZ p48c3 Ala liara aSar @ 137
I
í’.um secundo conjunta de operações de preparação de clones híbridos mirantes usando a mesma técnica análoga na preparação dos clones da debela o, preparou-se uma serie de combinações mistas de plasmídios mutartes pela combinação dos três segmentos do maior* segmento (apronisaclamente 4 Eb) a partir da digestão dc prAL de yyC bp com i.si 1 / ml'-o 5 tabela h e um fragmento de tii· uc u.. clone diferente c com l;si I e Set X* um fragmento Cl a partir do um dos clones da 11CG bp com AEo XX / 8 st Ia par -a rabela 3. Gs clone-s Mbridos mutantes resultantes Gosta segunda série de ensaios são abai xo apresentemos na u-cudgIu lij cemo nocacio ou© mors piasiiiidiLOs oriundos desta segunda serie do ensaios coo o aesmo protocolo continham çaatro alterações do aminoácidos se comparavam com os plasmídios prAG progenitores. AASEl fi D Designação Sepmeri Origem do Origem do Posição do smino- do novo to vec segmento segoierto ácido G£ i mutação prAi for- tor e de Ϊ,sil/ do IJcloTI/ nado origem /.jio XI /SstX com com 33 Om 1100 bp prAL-J pm: p42sl4 p26-3 6-lu por Ays (b 1G1 Isi/ eiu por Igys d 116 /dst 4 Eet por Tl© g lpO 1b Gly por Asp g 201 prAK-K H p48al4 g48ep Glu por XidTS @ 101 Glu por l&B @ 116 Ala por' ;.2hr ê 18? pr.AK-1 II p43c3 p26-3 C-ln por XjsQ 116 net por IXe@ 13 0 61<y por Asp 0. 201 pICAid.**^ - !l p26-p p4Ga!4 Ala por I$ir @ 119 Arg por Ais (8 21?
Ujj ^UOlltíXIillfíLÇâLO^
Designação Segmen Origem do Origem do los. Íção do j amimo- do novo to vec segmento segmento ácido da mutação prAI'·. for- tor e de iisil/ de Alio 11/ maáo origeni //.lio II /SstX com coei 330bp 11CO bc prAD-K prAL p2õ-3 p48c5 Ala por ríir Q 119 1' si/ /.oSt 4 Ala por -V‘I;rr- 0 IS? c 1 t Cl* n p40c5 ^ u r:ini h Glu por ’Lj s @ 116 Ai?g por Ais ê 21? prAi.-P II p25-3 -:-7 Ala por ;:;hr 0 119 I‘l?.r por Ile e 122 Ala por Tal 0 125 ?rÁ'\-Ç «r p4Bcp w3*v/ Glu por JLffiS 0 116 Ibr por Ilo 0 122 2,-.la por Tal 0 125 prAí-P 11 p4Gal4 Ala por Ljs @ 101 Glu por Lys e 116 2lir por lie 0 122 Ala por Tal 0 125 prAI.-β II p26-5 pf95a06 Ala por SAr 0 119 Im? por Ser 0 188 pγΑλ-ι II p4Se5 P95a86 Crlm por IjJB 0 116 11,r por Ser s 1SB ΡΓΑα-J' H p4Sa!4 p95sS5 61u por Jjjs 0 101 Ala por lí/s 0 116 por Ser 0 188 prAr. -¾ 11 plC?c25 Asn por A^r 0 105 Afee por lie 0 184 prA: "-Ô3 u p99^S2 p2S-3 Asm por 2yr 0 105 por 11© δ 130 a\r7 por Âsp 0 201 !
AZA B (Gon* jinuação) jeeignação do novo prAi. formado .je.^aen to vec tor e origem Origem do se^aento de l.sil/ Ano II com 33G Cp Omgen. no segmento de mfcoll/ /SstI com 110 bp Posição do aiiino-ácido da mutação poAK-70 prAh ' si/ /bSt 4 p26-3 pl0?c25 Ala por Sfcr Q, 119 Pb© por 11 <2 (3 184 prAK-39 X. . u II Í?99c62 p9Scl Asn por ryr Q 105
Afcr põr Ser (3 188
Os vários mutantes HfcriO.cc referidos ms Sabelas G e u foram avaliados de acordo con o Ansaio da lagarta dos I-.ebentos do tabaco (robacco Budwora Assay) do nxernplo A e a avaliação incluiu os clones mutantes la Safce-la S para eoapa ração "inter alia", do efeito resultante de ossor.ciolmome se anular ou remover uma ou duas mutações a partir dos mata: tes originais da rabela b. Os resultados cio. avaliação desta toxicidade ou aetivi&ade insecticida são indicados aa tabela ή em que se realça: 1) o mais baixa classificação na coluna de toxicidade indi ca o mais elevado nível de aetividade (ver exemplo A pa ra uma melhor explanação das avaliações) $ e 2) ο& controles envolvem uma quantidade equivalente de células Jv.lCp 0 de células 3G4044 que não foram transiornadas com qualquer plasníúios, notando-se que a maioria senão todos os mutantes avaliados em ambos tipos dessas células de ^.coli e os autantes resultam nos dados a-nre ««mmmémkmw» m «as, sentados ras tabelas que referem que ambos os controles serão tonados como uma média dos resultados para os aaa-
I
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Olassifioaeão ãa toxioiúaúe utarte cor. reíer-treia às .abalas B, - οα 1» 53 toxicidade aêdia
3,OS -I*\ >** _*· * · £*** ^ tj? U. vo
1»5C »50 â invenção inclui ainda a demonstração cia capacidade de substituição geral de amiaoáeiGos nas posições de uiíiinoácidos em que as mutações de APl iniciais aleatúrias produziram alterações nos aainoáei&os, em que uma. larga variedade de novas orobeínas de endotoxims de D.t. insectiei ΙΙ·||·||Ι|ΙΜ plasnídio prAu e xcepto ia endofcoxina truncada li- .ficada para prAK. . © excep· das no plasmídio aparen- l extremidade do Ôasaste àamente activ&s são desenvolvidos* Asta capacidade foi áeiaoíj® traua com relativa facilidade pelas experiências denominadas ?,codão rotação" eil que os eodões envolvidos nas alterações da mutação inicial foram substituídos -pelos cofiões de outrQfjs aodnoáciuos naturais· metes novos mutantes expressaram uno. proteína de· endotoxina apresentando actividade inseetieida contra a lagarta ims rebentos do tabaco. Lo sentido de conduzir tal investigação com maior eficiência, foi preparada uma série de plasmídios únicos úo tipo prAd, a partir essen cialmunte da prib e acabando no plasmídio prAIL-7·» © sendo çueneialai&nte usaclos outros glasaídios aio sentido de preparar prAt-3, pi’M-4, prán-5 e prAL-G, cono se descreve no pio 1. 0 plas^ídio prAA tal coao se representa na Ligara 2 I eu todos Os asoectos idêntico t geiramente mais comprida que a codificada
do gene estrutural do eadotosiina do íiJL truncada* mostrando o referido gene estrutural como ê apresentado na. figura 2 o sítio de fpn 1 no gene natural* enquanto no prâE o sítio ê anulado e o gene estrutural pr&E termina aproxinadamente na anterior posição do referido sitio. C placaiôio prAm~7 © de sinado no sentido á„ expressar a mesma sequência de SíSíso-ácidos da erdotoxina como placmídio prAL nas tinta a sua se quencia de ãjí, modificada de modo a incluir não anonas o sí tio de i\ru I do prá:>p, nas também um sítio de -Und III» iist Π e Sssíí IX e, em adição, o sítio do find III que se encoa tra originalmonte em 6 <1g preferencia removido* íal eo-mo mais particularmente ce indica no muenplo 1, a ordem sequencial da preparação de prAE-7 a partir do prfC o a adição ou anulação ãe um sítio a om em cada fase pode ser susarisa-* ao da seguinte formas prAl. —— -------—>. prMd-5 (adicionar lira I) vrv>5 —- ------.—.> (adicionar iSiad III) ΡγΑλ-4· — —-----·—.v prAI>5 (adicionar Lst II) prii-5 — ——·——·“> prim>*6 (adicionar Bssd II) prAl-6 — —-------*· prAA-7 (anulai or* ^isal Aim tti'|
Ce sítios acima indicados foram introduaiãos cerca de 4C pares de rases afastados do tal modo que um siatetisa-· aor auúomarizaào cace cer efeetivauente usado para fa zqt pequenos fragmentos de APIs de dupla cadeia os quais terminam nas suas duas extremidades por nueloôtidos representai do o resíduo complementar dos resíduos do sítio de restrição a ser criaaos em prAL-7 quando I cortado com as duas endonu-cleaaes de restrição relevantes, ^osos fragmentos podem ser facilmente substituídos em priiE—7 por maneiras de proceder ae corte e técnicas ds ligação correntes (ver micemplo j?, in·* fra) para proporcionar um plasmídio capas de expressar n^a prot-ina de onaotoxina igual â. do prAA exoepto as alterações
de aiuinoácidas codificados pelo fragmento sintetizado substituído prA?,-7 para o correspondente fragmento em poA&-7<( como se exemplifica.
As Piguras 3A e 33 representas dois poquenos fra-jatntos de AjA;. ãe cadeia dupla preparados da acordo com a estratégica u© codão-rotacão acima descrita, para ser subs-tituídos na secção de aind Ili/uiet li gel pri&.~7· G frag&en-to ue uupla c-ieia representado na Pleura $A foi concebido para produzir um qualquer amiaoáoido na posição 116 dos ad noácidos nas endotoxinas truncadas de li.t. opressas pelos plasmíaios oz-Ar, pela selecção apropriada do coõão AA2. de acbr do com o eóaigo genético, Aemeluanteaontc o :ò?agnerto de du-f :.la cadeia representado na Pigura 33 foi concebido com o fii de pro luzir um aminoácido na posição 119 nas indotosinas de B.t» trancadas produzidas pelos plasoídios prAIL por aelecção apropriada do codão in-1 neste fragmento. Domo é evidente, os outros fragmentos de cadeia dupla requeridos para a substituição no lugar do 3pe ϊ/llr-u 1 (um intervalo- de fragmento com cerca de 11$ pares de base o qual I também preparado por sintetizalores de Adi automatizados), o lugar do Id?m I/Aind XXI e a posição de .·-st ll/àssd II no priii>7 e concebido para codificar todos os aninoáci&os on todos os pontos de mutação encontrados nestas secções podem ser preparados por técnicas padronizadas análogas. Gonsequentemente, oLin* A?© *Ei> O tnl2.Lt/ ©Í3 «ILq-ϊ c*-í* terações ou mutações de a&inoácidos naturais oa 19 alterações ou mutações de a.-iinoácidos naturais a serem realizadas em c4 ia ponto de mutação entro os sítios do iiru I e BbsíI 11 em prAf-7, podem ser facilmente realizadas usando plasmídios prA:-7,
Para cobrir todos os portos de mutação dentro da sequência de 116 aainoácidos para rotação conveniente dos cj» •Iões relevantes, pode ser usado o plasnídio psoK-7 para a preparaçao do plasmado prAE-3, o qual por sua ves e usado
J por último na preparação doprAE-9» tal como se descreve no Kxemplo 1. ila Pleura 5, todos os sítios de restrição relevai tts, tal como são por último acumulados no prAE-9» são repro sentados num corte ampliado do prM-9· C sítio de Sp© I representado na figura 5 I tinibem ma sítio único, a qual estava já presente &>·. prAA, p®ftãH5* etc., ral como se apreciará também, os plaemídios prAiE-7, prdn-Q © prán.-9 podem ser usa dos para introduzir alterações de mutação múltiplas entre qualquer par de sítios de restrição e/ou para produzir iLDH que codifica para pelo menos, uma alteração dentro de uma ou n;ais dessas localizações, de tal modo <pe uma larga variedade de combinações matastes múltiplas envolvendo os pontos originais de mutação encontrados de acordo com a presente in venção podem ser construídos para produzir uma larga variedu ce ce novas proteínas de entlotoidnas de B.t. iiiseetioidasen-te actívas.
J ial como ce potorá também apreciar, plasaíáios ta:.s como prAf-7* prAt-ó e prán-9 cão plasuíciios completamente ca pazes de alterar um çualotior ou vários codões dentro de qualquer das localizações de pares de restrição proporcionadas nestes plusmídios, Çuando se desejam alterações com una ou duas mas nao mais do guô trus dessas locálisações, plasmídios tais como prA, -4· oa grã,·-p podem ser usados s© cobrirem a lo calizaçao desejada das alterações, preferivelmente apés a re moção uo sitio do ;ind XII original no prAí:, e, so esses pls.s míuios nao adequados, também se aprecia qu© ua plasmí-· dio do tipo prA.-k compreendendo un ou mais de tais sítios po-preparados convencionalmente variando ou limitando s. selecçao ^ara intro.uiç&o cie pores do sítios de restrição uss. los para modificar pr-uf rn. produção de- p rAv>9. Qons©ouent e-moiite, a invenção proporciona também uma variedade de novos pl&smi-ios úteis para a produção de mutanteo e de combinações ue mataste* de acorao com a invenção θ contendo ua ou m&is
pares de sítios de restrição por fim produsidas em prAE-9· lo.uo taiibés. se apreciará* o Aj)B' compreendendo um qualquer ou maia uítios ãe pares de restrição pode ser ezci-òaêo, antes oa depois da modificação com fli de conter uma ou uais matações de acordo coo a pros-cate invenção* a partir •uc jt-iar.uív.ios uo tipo prAl, por corte ea sítios ãe restrição ac quaie v-sííuo fora da região ou das regiões de mutação desejadas - as quais são correspondentenente encontradas raia outro plasuídio para a enuotoxina de d.t. o inserindo então (ligação por meios correntes) o segmento da âl/ã ezoisado n©g se outro plasnídio* «qae pode ssr saielâa^tonieHte cortado * pos si&iiitanúo portanto a ooíivonientc modificação desses tais í/Iss-íImÍos ou eo.m o ppopésiio do inserir direetanente as mu. tações vie acordo coc a presente irvenção. tom a finalidade de se incorporarem mutações proporcionadas pela presente intenção ama sequência codifica-acra de endotoxinas de comprimento completo* mi plaomídio ia corporando c pene estrutural de Aúl. para a delta-endotozina d° _B · t. wulanensig foi usado ea virtude da conveniência. © disponibilidade fácil no momento, mste plasmídio, pB$21G, e representado na dipura 4. 0 plasmídio pBrSIO incorpora o gef ne estrutural da enlotoxira de comprimento completo de B.t. wudanensis como ae indica pela linna escura espessa na 5lg. 4* e por analogia com a figura 1* incorpora também uma sequência compreendendo um sitio de libação dc rifeosomas de B.t. a qual foi obtida a partir ãe B.t. wu&anensis com o m ne esuxutural e a qual e indicada na figura 4 pela caiza e& cura. C plasmídio pnlSlO 6 um vector ae ezprossão completa- mente de coli incluindo o mesmo sistema -promotor ãe a» ©o— li que os plasmíaios prAl, uma origem da roplieação de L. coli (não representada) e um gene para resistência ao cloran-ftnicol como se indica na figura 4.
As setas da figura 4 representam o sentido da lei-
tara do gene de t. t. wuhanensis 30¾ controlo do promotor de x,, coli e ao gene cia resistência ao cloramfônieol. Gõb base ras informações de sequências na nossa posse, o operão inteiro (gene estrutural, secção õa secraenoia de ligação de ribOoOiiiâs uòrivada de d«t. 0 seoueaeia promotor do d* coli operador) S mui co aomelnaL-to e apenas insignificantene&t© difóivnté do operão no plasuídio do prAd * particiilar» 0 ά'-i. codificado para os 610 aaisoáeidoe de porção activa da endotoxina de .^«t» (rabela Δ) e que se prolongam para,, dentro da região da protctóra pelo senos atê cerca do sítio de Γρη Z representado na Srigura 4 para gEBSXO é idêntico à cor re epondente sequência do Ati" no plasmídio pr/iE* I?a região dc- cadeia cio „<1 :.y, a .jusante do sítio do Spn X no gene estrutural de P.t. em p.rtíSlC ate â extremidade de um tal gene es tru curai exiotem diferenças deaaosriôeicias aas nuito pequenas comparadas cor·, a secção correspondente do gene truncado de a>.t* kurstaki .,„,-1 ao produzir prúl.« Jstas diferenças sã> in*. .cauaa pelo mapa ã& endolmclease ãe restrição'· '0 plasai-dío pár<ilO cocifica ame. ensotorira de eonprinento completo tal como se apresenta na labola A 0 é eonplGtamente homólogo na porção activa (e através do pelo nenos os aminoácidos produzidos até ao ssa sítio de dpn I para a dolta-cndotorl-na òo »·ν* korstaki -.c-1 em donos p®&E e pBSrlI) e tem uma substancial nomoiogia. no resto da secção de protosina. Pinai-0 sítio de ligação dos ribosomas em pB2210 é idêntico ao c-xist^nte no erAl e 0 AkU inteiro cug inclui o sítio de li cação lo ribosoma (1B.3) e que ce prolonga para montante a partir 00 precisamente a /...et do iniciação para trás at:ía vés do sítio de .dam ,1 juntando a secção promotora, são os 1UèO1à0a çue e.: pucdlC e ©a p2?AC «ssrcepto q\ie, ea pt^210, ©:ris tem duas alterações de nuoloóbidoe iaediataaeate após © sítio de .^am -I (JB em vez de 62 como eoi prâE) © três meleó-tidos ( -ui) como se encontra em pr/£ inodiatameno © depois de esses dois nucleóticlos serem anulados on pB221O0 tornaa-
do-se ectac diferenças mommosbo cano um resultado de estra tecias de libação diferentes era guntcir as secções de 03 de B.t. à secção promotora de L· ooli através do sítio de Asm. I. 0 plasmídio 431210 pode ser usa-ão para produzir a proteí na da lolta-enõ.oto.zim de 3»t. niibarte do comprimento eon-„1λο t·. κ'ο u,:a- ou ma:Lc das alterações do aminoáoiclos propor cior ovias r-vla-invenção. d sítio de rsi 2, os dois -ítios d5 da d, o cibic do 3st Zoo primeiro sítio de .'lind P"r :\\iq aparaoe a (jusante na Figura 4 sara pXAmlO corresponde ao·.· air^acs eíiíios representados m Figura 1 para prM: (o Â/A par.., aAbos oc p lasmídios nesta região são idênticos aos ari v.a ir..'.iraise) . 1. mis? lo com ..-rienopiusis si (a. in.) Ά ensaios são realisados sobr-s as larvas da se^un da fase de de ^envolvimento. iodos os insectos forem mantidoπ e ·. câmaras climáticas soe condições ao temperatura © Aunida-de xiadronisaias, ate. durante todo o período do ensaio e fome alimentadas com uma iiota artificial padrão. As suDstâsr· ci ;ó a eneaiar fora;- ãadaa aos ineoctoc coao parte da dieta., sclj.0 dua uaia uo.iccirbnavão da jubstíUoia ensaiada administrada a u.u lote úe vinte insectos. ds insectos são observados luimuibe uu período de sete dias apôs o tratamento, depois do euè se modo o valor de 31^ cLojsoc insoetos. A TjL^q poA ..>i.-r definida como uma dose de substâncias ealculada re auci-i la para ^x-ovoear a mortalidade de 502 dos indivíduos. 0 rcmaAn firal * expresso cono potência relativa em. que* : oíArmia relativa Μ50 do padrão jk.-r. enpõrinõntal
;; ICO
Ammio a técnica acima referida os valores ábsolu tos te . -oOeji ser loterninaãoc ds forma que a istorpre-
tação do& resultados ê simples, todos os valores de potência relativa mais elevados do que os valores do padr-ão indicam una actividade superior do que a do padrão. Além disso,, a substância com uma potência relativa de í?or exemplo 4C0 oua:i co comparada com o padrão de ICO, o 4 veses aais activa do qUO O padrão. .-aGrão apresentando uma potência relativa igual a 1-0 1*0 ensaio á-*to.jicr» foi o pla&eidio p6A5Cl, que contên usua sequência de meita-en&ot oxina do tipo selvagem de co&pr:. mesto corroííto, sendo idêntico ao pBlâlO exeepto ao facto do conter dois promotores de jd coli cada un dos quais iadivi-cualmente ê o ^esmo que o contido em pB221C.
Os controlos usados no ensaio anterior foram; a) ,'ãe 6u9 — uma estirpe de jt coli que contêm, plasmidios que não prouusem delta-endotoxina e mão têm actividaae ir-secticida (obtido a partir de G m dross, Department oi Jacteriolog^, of . isconoiii), activida.de per se; b) *A1 41$ - um ins€cticic.a de B.t. comorcialmeste disporá vel, octico soo a marca registada JAVmblXT. f. ..LSâio com a lagarta do rebento do tabaco (ensaio sobre *m.) C teste --obre -j£d usado foi o oue 6 basicamente descrito per dulmage et al, (1971) J. Invsrtbr. matii. 18 240-t. foi realizado com amostras feitas em triplicado numa cápsula de plástico transparente para 51 g (1 onça) coa uma larva ós ·£!».- na segunda fase do desenvolvimento (4 a 5 -Mos ôe iclac.e, peso médio 1,6 3) om caóa cápsula. As amostras foram combinadas com 1$ ml do dieta (compre·sndendo 0 pé nutriente, vitamina on mó, agar © outros ingredientes) como ue:-.c*.ito gor -ulmage ot al, J6AA feclxieal .yalletin 172.1528; -5 d dieta foi dividida igualm-ente pelas três cápsu las que se ueixaran arrefecer durante meia bora. Uma -IBvV -fo3
adicionada (abando uma escova de pelo de camelo do tasam© CO) a cada asa -ias cápsulas e as tampas foram seguramente aportadas. amostras foran colocadas numa incubadora a c-7 / 0 a numaus· le relativa de durante 4 a 5 dias* 0 tamanho dos nrupos usados na avaliarão de tonicidade contra .cor. tsuOLd.e às 0ams indicadas na -abola que se segue. lamardo Io dana de peco leso sedio druoo (na) úd) l»c 1,3“ 1,9 1,6 1,0 2,7“ 3,1 2, ε Λ Λ ·, 3,5“ 6,5 5, d <->5 11,7- 12,3 12,0 ; ,r 1-7 O» C'·*» o 13,6 0,0 pC , c— 34, ^ 32,8 59,1- 52,4 51,1 dl 75,6- 94,3 64,8 119,3-114,7 113,5 ,,C 119,6-134,5 140,0 0 11 ^aaarlto do Grupo” atina indicado defere-se &1— recfcaiuôijfce àa avaliações de to:riciiade· indicadas na presente memória descritiva, donseoiicnteaento, o peso da larva foi det erainado ap ós cada ensaio e afcrihaí-lo o valor da classi ficarão Ia to:ricidade- ipual ao eosrespoadeafc© ao inter valo de peso no çu&l esto poso recai, n não ser que se especifique infra, todas as larvas nortas foram atribuídas a am. tamanho de grupo e a classificação da tonicidade igual a se ro. ..'etc-rmincu-se a nédia das classificações da to^d.cidade u fia Is r5tvr oíí resultados indicados na. nresente memória de: critira e tipioai-conte todos os r«multados se baseiam ea jjêIo menos 34 repetições, ds cápsulas foram abertas até que as jsLúaa dc yamarúo diferentes tle ff,: fosses localizadas, pg. tês - O' forais pesados até que fosse looaliaaõa uma SBd em cs
da gama de peso. ás cápsulas do amostras contendo as 23., de ui" dado intervalo de peso donas* então ^arcadas coa o ná&er© correspondente ao tamanho* istas cápsulas foram então arrumadas por ordem crescente na bancada do laboratório. As res carvoea amostras foram cantão obaervndas e avaliada a sua to-,, ioiuuut ror corpararão visual do b&naiiao eoa as amostras do voadas coo. o respsctivo numero numa folha de registo, for ar rt pi:.varai as larvas mortas ecr. um !V* e atribuída una classificarão i,,ual a soro. Aa larvas aortas quo eras cor de rosa brilhante oa eos o aspecto de terem sido liquefeitas . . *. a-a verem morrido devido a causas mo relacionadas som u aolta-erc ©bonina. ndt&s larvas foram registadas coia Ha!í © ião foraa contadas termos do rosaltados. A amostra padrão é cie 1 r;.l da cultura do prAi dividido ,or- ν:·Λ s cápsulas teve cotio resultado o atraso do ores vú.rruo xo ponto nédio do intervalo ds classificação da tom:.· elidiu. ortar.to, o onraio foi útil para distinguir clones co. to ci cidade aumentada cios cie tomicidade irmal ou reduzi da ao raorarfLior não mutarte. ç ensaio produzia uma resgos-ca à core pue h^-rafle da quantidade da cultura de prAL utiliza ia no ensaio, vcnseçueut emente, -quanto maior for a quan cidade dc- lactárias tu© cortem práf cuo foi adicionado âs a LOctrao, maior prau de tonicidade em relação a Pid foi obs£. vada. L Curva de respostas de doses de prAP foi útil na ara liaqão cc prau pelo -pus as colónias são nais tónicas do que oc propecitorer não nubentes. L tabela que se segue ilustra a resposta uore de bactérias quo contêm prAíi. uaj ti dado dc ardi adiciona J a a cultura estacionária cação da fornicidade 5 ml 1,5 1,5 2,0 a t *· G* —»5 2,5 ~u 0 5 5,5 - 41 - /*
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Quantidade de r-rá adicionada açaltura estacionâria '^laesificaçâo da Toxicidade 0,5 0,25 5 3,5 43,5 4 4 w-oí.0 oaee w» avaliaçao aciiza descrita, todas as calcaras forau ensaiadas usando X ai da cultura a fia de, e .* rcia.v-a.0 ec«* os baasmios «os grupos obtidos, permitir ua intervalo anolo para n/cjrjLíjUar acuexas oue possusR activida cie ^.oj.âCu.\ra oíc-icr ou ROnOi θη rolciçao a peu (® outros pias mí cios não Rdtuntes, coro padrão* r :-5 nutriente- usado no ensaio de dl,, foi obbido por fui st ara i's componentes coci as seguintes proporções eu ^.so: fa-irQa d* eoó& 1103,4 G5 gêruen de trigo 429,4 gj tura salina ae ..eeson 252,4 g. sacarose 104,£ S| parabenaoa to de mutilo 24,6 g; e doido sórbiee 14,0 g. r _.ó ú3 Titcuninao usado no ensaio de ir.; foi obti4 ao por sistura da,, capiinbeo proporções ea pe30 dos 00ap0. rentes; pneutotenato de cdlcio 12,0 a; sicotinoaida 6,0 g$ riboflavina 3,2 35 ácido fálico p,C g5 fcioaunã .„01 l5p ^ pi ri ·r·i, a . ...1 i,p ._>5 oro uj.no. j,·-··* «5 e ^xtoaina P 12 6,0 β ds t,-ê~ s..c>uxnue3 aplicações ao escolúa por ensaies .... ^riUirtâ, secjiriSria e e&Aoa Se úiluiçSo) íoica usada! vários âstóiics do avaliação o são seSonaas nssta espa-ciíicação. ^saioasia^io: Alioootas íc 1 sl Se 5¾¾ a* 18h de doií. olonee separados foras ooibinados 00.2 a â:ls-ba de «3p riía tu-. 00 Se oo.utrilu;:;ação cínico e áiviãiâas e®4utaeâeí»»^e£ tre crês oirsalas (oos as Ξ- por cápsula). jEtas aaosteas foram avaliadas er. coarurução con crnt2?ol0e oe essaios de células irara,fornadas o não trarfefornadas do tÍT10 lat^ pWíT ou pá .-:210 .reparadas da ãcszia forsa.
4Ρ - -aisaxo secundário; Amostras que apresentaram tonicidade aumenta." a em. relação ao ensaio primário foram submetidas a \xã ae0unao vi.wàio. iolónias mutantes sc-laccionadas foram inocu-la7ac. a partir de placam ãe- arguido ca aei© nutritivo ff/Asp (una colonia por oultur-a). Lez amostras de 1 ni foras avalia -as wu eo.npuração oo.x c ensaio co,i o controlo apropriado· .. ioiiGo caibiudo tonicidade aumentada em relação ao ensaio J. fora , ceei nados αοαο "prováveis sobro - smianues” o fo ri,: avaliados u a vcreeira ves. Aqueles que repetiras η·& "so ora1' Xenoui^o ama uv.roeira ves foram identificados coso Hso ore - ma «arte e“ c avaliados nun ensaio da series do diluição para a&is p:nol©dn3:;úo determinar o nível do ausento da acti vi ..aua eu relação aos propendi oras do tipo lato. ...ris.aio c-1 séries de diluição; Os mutauáes ene eoinimaraa. a aprestncação de um "sobre” fenotir-o ei rolaoão às construções não mut&ntes foram submetidos no ensaio de ibd a uma serie ãe diluição tascada na peso soco do células baeteria-nas li ofi li ciadas -pie continnau ua mutanto ou a touina de ti ρο lato λΟ cloro prAV. ou pnldiC ouo ao desenvolveram durante- lò h (e as cá lulas foram peleti sacias primeiremente para liofilização). As aaosurac foras· feitas cm triplicado con caia uma das seguintes diluições num volune final d e 15 nli 167 /m/ml, 67 /p/rl, o 33 jug/sl· Analises .aPt-AMbi e i,.esteri; (immunouiot) foram realisaâas iia proteína destes mutantes, tipicamente em células d© 75 /3 de poso seoo por fila., Os rj_ sultatos uas séries de diluição confirmarsn essercialnente os resulrados doe ensaios prévios g não são de outra forma açui rt- piscado ou indleamaB as nédias em tabelas que refiras. reouluauos biológicos. ' f.v .:·. qjjV j:_—| | p.édJ.IãA: - os ; uintes ©ze-mplos nane-ra-dos ou referidos por outro late n ata especificação, as seguintes técnicas regu-
lares ou laboratoriais padrao forse usadas onde referenoia-do no que se se^ue ou de outra forna reyueri&o, a manes que no texto sc indique o contrário» β ;:;'·1θ -. -1; . nnaGP.n,-ão e reecçlf-giCbq„/bactcriai-as e de fardos .jsoirpes o òl,105 do ^ coli foras* hospedei ros para todas as construções plssnídicas. L estirpe J>.,105 de coli e os fapos ,..18 e Í..P19 foram obtidos m laboratórios dc deu .eiqland» nstas estirpes baotoriaras ercscerss e.u seio ··. ; (5 p/1 do omtracto de levedura, 10 g/1 baetotríp-tona, 5 3/1 de ...aol). 0 iicio foi suplementado coe 50 s.g/1 do aaplicilina para c-rescincnto dc células compreendendo prAU ou ;crlvauoa deste placaidio c coe 28 Eg/al de clorsmfesteai para células compreendendo plif-SlC ou derivados deste plassii- í alO 1 ju-.eiii.plq p.—u:
Propagação e igglanenbo -..:.0 Agi; Jfcgo 2.. preparação de stoclia do fauo rccoobinante deriva do i..lú e Isolamento do Adi: fapo foi roalisada usando as técnicas i- rcvia-;„entfc Uuccritas (Lessin&s, u. (1985) Letliods 'jm.-· zyiuolo£. 101; 28-78)· cxenplo Γ-5:
Preparação ue. olicormcleótidos sintéticos Οε oliporucleotidos foram preparados usando síste &cv automatizadas con uma máquina de síntese cie ú,uL 5G0 A de Applied r.yos/stejis (mester Gity, (Jfi J * Uiirdi- ves o ciclo eomplq to, as Ov orações de purificação forcai os sue so seques.» Cs oliponucleótidos sintéticos foragi desbloqueados por adição de u..· vclUuiC- i0aai de liidrónido de amónio 0 incubados a 55°( durante a noite. Αρδε ε> remoção do úidrónido de amónio sedi-
ante eaceseivas etapas 5.0 centrifugação rápi&a/váeuo © res-suspensões em água destilada, os oligomncleétiáos sintáticos foram purificados por eloetroíorese en gol do ureia-poliacri laaiaa (ΓΑΧi m). Iara visualizar a banda, o gol foi colocado i,ana placa cromatográfica cie dupla camada coberta com maran e o oli iionuclootimo foi iluminado com lus ultra violeta de co-.i-ri^ento termo O oli oe οπόν curto OlUClvÓtidO , . Após cortar uma porção de i?el cojl •a o oliponueleotido fqâ com una la eluíao a partir tc pel com acetato mo amémia 0,3 .oiiná. 1 d; , p 0,0 a y/° j durante a noite com agitação* Apos a elui-vão óurun a noite, os fragmentos me wel foram peletisados a o eco 1:.., mm rátor èm20 e o supornudante compreendendo o oiigouuclcotido foi transferido para na tubo fresco. Λ gre-ci^i taçSo com ^*0.. foi usada para concentrar o oligonucleo-ti .o e foi quantificado por observância a D.0.260. bua©atos pmoles Go i.mcieôtido foi submetido u aoç.ão da crainase em uma rcacvão me 40 μi cem· duas unidades cie polioaueleotido ojaiaa-st· :4 e à*a· Ί,ιρ n*.,. ^xesplo p;-4t nransformaç|o dg, joí laias de A. coll a ar maia A.) - .... coli J11C3 ou íXACVl·. competentes para a transformarão ue AmI. foram preparadas como e descrito por uma têc rd ca com incerto usada (comem, o. *1., dbang, A.O.P. and ©u, 1. (Ip/f) „rcc. i-afcl· Acad. bei. UBOA 59í21100--2114). . ara c-npe-riôneias da lautapoaese :ie oligonucleô tidos .liriâda ao sítio, adicionou-se fago recozabinan-te detercdáplen (i._13) Abn (60 mg) a 0,2 ml ã® células competentes e manteve-se a C°s durante 19 minutos. As células foram eubseçuoEtemente mantidas ο. 42°0 durante íeis minutos o pG jjjX desta mistura foraa adicionados a 3 iíl dc. meio nutritivo ff compreendendo G,?,G de bacto ti 1.0 a 42° J a fim de prevenir a solidificação 45 - 6 0,2 ml da cultura fresca durante a noite cls JIJL03 ou 024044. A mistura foi inodiatamcnte esisalhada suma pia ca de aaar ±j; (meio ir mais. 1,5;- ae bact© agar) e as placas (invertidas) foram incubadas durante a noite a • o ~0 - ''· ^.I-asuí .io .i. >u (10d np) das eapcrienoias de autac.lne-o-ι uma outra çualauior libação c-mrolvendo prAA ou veo toras P-.-21C come açiii foi descrito foi adicionado a 0,2 ml ue células competentes (ed-lOp ou ώ&4044) e aan-tiioc a CUC durante 30 nínuhee. dc células foram subse-•:u,x.tumente nar-tidas a 42w0 durante dois minutos e vol fcarum „η.ι*η nu banho de pêlo. dorna colocadas amostras •u pudutiúados c"o dois microlitroc a SCO jOL em agar fr c o...cr: ernier do 3r: X’/nl de amplicilina para clones basea nos e.„ uma. e 2r-yul/ίΛ de eloranfericol para clones ba~ coados no pOfflO e incubadas durante a noite a 37°0, n—,.,10 d'~5. fines tão da enzima -;c restrição . oáas ac ensinas dc restrição foras compradas tan to a ,etbe-sdy. j.esoarc!'. labs (Caithersburp, lTj) ou Xleg Ángland eiolab. ks condições de incubação foras as recomendadas pelo fabricante. -.xeuiplo f—ó:
Li ..ayâo,f ra /0 - eacçõc^» do ligação iddl (20 /** continham 60 rd de Sris-- , p.. y,5; -dnlg 10 Ei,., UitiofreitoX 1 m, á£P pOyn, kj] te mini nO m.. o 20 unidade o do 04 A 011 ligase .(i-iew Λι,Ι'άϊϊή ^iolabs). L incubação foi realizada a 14°ê durante- d noras. -) - -t-Co libações cu; fragmentos foram estabelecidas com frs.~ c.iiit-nto^- presentes numa proporção molar de Iglsl a uma
concenoragõe-s de C,€4 ρηοίο de cada nua, voluae reaceioral do *0/*· A incubação deu-se a lô°d durante 4 noras auando se li :ava apenas m ertrseiiãade fina (por ozeaplo Aho II naaa zona inttrna) ou durante a noite par-a a libação de ua elo (por cncrplo, ur sítio I-’nu^2). Aiguse 21 de deu Jnglaiiâ Oiolaby foi ue&ia a u=m eonc^utra-çSo de 10 unidades (u...fiLd..“o ' por /& do voluus reaoeioral. oi_ jucnciação, oe Ί, clelto-sadotozina 1.1¾ c i·?. .iiaeac·ao da ;.iQSíbàilp9 ci a 9 Θ j ergue naioçSo de ACl! doe goros de
e jcj.b viereveaos iOx r-eoiisaua. j^eXo .ueuOtiO co via *.· .e.LCloeuor et al. (^eídeersr, G·, : coneu, orr. d (1>ív) Cone 10: 6>*73)·
..imO X ucoj. grg^ão^e^laê^pgeg ,-s£C-5, èr/iv-4, erê:·,-d, orâC-6 s fnnciZ . a .^o.a) ..rorçxranão aq. i ur&g-3 1 -do plaj_.iídio pCSr.cr (rsi-re^rtado na tlgura 2 e aei...a descrito) e a forna replicativa do LJL a partir i jos condoeidos vcotoreG ,..1-2 e J..2L9 de alonage.u do £&§o I v 15 fora:: sivultãneane-nte digeridos eon as endonuelease-s cie j restrição ...ee. _.I (d tuJ/lades) e Αρη I (IO miiclades) durante eé >'ii:u.eoe a y}j0} rura solução tangão de eloroto Ce sódio lf'r .... , c-o.....;;iue:.d^nCo Canoía iris-ndl 6 a. (gA 7,9)¾ L&*lo 6 n. , al ααηΐι,α de oOrc tovino ICO >2/91» €s fragnentos de&e Ga;oe .·.- .i-tus .íiisturae Ce A C, resultantes foras purificados icivico correr Ioda a ai atura eu gol dc a.garose preparativo a 1. no contigo Ce separar Ce acordo cor o tauaniio* As bancas foca" visualizadas gor nareúaiie-nto eos. fcroneto do etídic e ila: iii&cão coc lus ultravioleta Ce ccapriricnto cie onda longo.
C frabíuento de .^1 ecnpreenderdo o MM desejado foi cortado e o A.vi. eiaíúo por eleetroforsse g-i tubo Cie diálise. C fra-i.çr ento .jau. .Ι,^'ρη I de p38r 11 foi lipado a vectores cortadas coa mpl8 e riplp dam ul/fpn e purificados os pel por incubarão ararão d borac a m,i voIuelg total ãe 20 aierolitros r. * ardo Mis-.·. Ml £0 n. , p~ 7,5? ...pAM 3.5 svi, ditiotrei- c,r , 20 m de Ma. tereini» C Aid resultante co . 'T tol 1 a , fo'. tr-..rsfoi\;c'.,,o para células eoropot entes 2. coli J....1C3 c©nd> ix ac -jplo f-4 eace:; to cus as placas ccntirdieiQ isopropil-tio palaotôéiic· (Xd n j e 5“br-oao-4-Gloro-3-ináolil-M“5alactosid4 (;. cal) jMgos obtidos a partir da ,Μρ-ΐα unoaieal òonpar^. ηΦ u.o o fa o rvcoo-biinnte (eosipreesdoado o irserto de AJL corta ao io pbdrdd) ori/.ina placas transparentes nestas condições. íilacsud transpa· ;sai.to ...is e ...15 ori^ii-aa placas atais, são adicionadas a £ a! de células de _goli 1 1C3 @ãi .ucio nutritivo incuba^-so durante a noite a 57°0 e o Ma 0 w v aoeia -lu S foi pai tu o vr d . .....V.c„i Cl 0 .» e « ,c - .et- cloros ;; G - M c.-o 0 Ci Cí C «vS ,ts a o... a -.t M .1- - Md let do el eccrofo : eee G,. ; - el At < irado sc-uiaso as técnicas descri-oMAods .nisinoi. (1533), 1C1s2C-7S. ;enão oo insortos de iMd eonoridoé
Lil,i ’ai a.... co:·:ar&c.uo coa. nplO ou icpld. .ae-.iiioneianâo uaa voaso olores íji-ô incluíaa o Md de endotoaina pelo ia: ;Õo ca cadeia do cidosoai eorfirziou-se a .. i r o . aro . : '· a ca-.:eia to sortido inverso e ml9 adquiriu cadeia do sentido •-•irecto, Mr.no aríos recupereuLos. 17:=· olipomicleótido de ca-di.a lo ml eido inverso do 26 bases tendo a seouercia /, lo toxina e indicou que ciplS adquiriu a
I AM Md Adi
•-Γ r· -» AM '· “Μ Γ/Α * ^"3 coei o Ml- pli gcóo descrito μγ ^aniatis et al., tx.
foi rreparado por síntese ôe fase oéli o.a ati siutetisador dé .uto.eático e eu Mote u-se â accão de -Ivétic o -viirato o dM molecular Oloning (1932); A Laboratorj Mamai; Golà Spring Earbor Laboratory, 11.1.. Uma mistura com um -volume total de 6G jjOl compreendendo 0,4 ^g do fago recombxnante mp!9 compre·)· enclendo a cadeia no sentido directo da endotoxina, ‘Íris HOl 20 mi.., pK 7*5} LgOlg 7 mM$ ditiotreitol 1 ml; cloreto de sS uio 50 rm. e 10 rg de oligonucleótido de cadeia no sentido inverso de 26 bases foi aquecida a 6S°C durante 15 minutos., e depois a 37°0 durante 10 minutos e colocada a 0°0* A mistura resultante eompreendendo o ADI recombxnante mpl9 com o oligonucleótido mutagenxeo anelado foi então tratado por -adj. ção dc 0,2 mí.i de cada dos dâfP, dQ2P, d22P e dCHEP, 1 mM de AZ?, 5 unidades do fragmento de Ilenow de AM polimerase I (de lqyi iJingland Biolabs), 0*5 de proteína de ligação de cadeia simples de D. coli (de Pbarmaeia, Biscataway, EUJ,) o 20 unidades de 24 A31 ligase (lew Bngland Biolabs), A mis tura resultante foi incubada a 14°0 durante 4 noras para oeqr rer a poli&erizaçâo e a ligação e o. ADI íieterodúplêx de cadeia dupla circular foi transformado no 1» coli JM103 © colocado ea placas como descrito no Sxemplo P-4. 20 placas individuais foram então seleecionadas e o ADI de cadeia simples foi isolado do fago como descrito p<|>r i. aniatis et al, supra. 0 ADíí do fago das 20 placas cada um no volume total de 20 /»1 e contendo 2ris-H01, pH8,0, 50 ml; £01 50 BLi; ríg81~ 10 mia; 10 ng do oligonucleótido de 26 basei de cadeia, no sentido inverso anteriormente indicado, e 0,2 de moléculas de fago ADI de cadeia simples circular dife rentes foram cada um aquecidos a 68°0 durante 15 minutos e colocados a 37durante 10 minutos. A endonuclease de restrição EruI (8 unidades) foi adicionada a cada umá das misturas resultantes e a mistura incubada a 37°0 durante uma liora* A mistura foi submetida a electroforese através de ge de agarose a 0,8^. Oerca de 1 Çf/ò das amostras continham ADI migrando como ADI linear para permitir a identificação de
clones positivos contendo o desejado sítio de Jfeu I< e os clones positivos foram transformados em 1» coli Jial03 para assegurar a purificação. 0 ADI entre os sítios de Bam EI e 3a 1 nos clones positivos foi exisado (após anelaçao com oligossequêneiã ml3 e polimerização para se obter a dupla cadeia como descrito acima para o oligó Iru I) por corte simultâneo com as endonucleases para estes sítios e ligado (jíixemplo P-δ A) com o fragmento · comprido (cerca de 5004 pares de bases e sem o fragmento 749 bp entre o sítio Bam SI e o segundo sítio Iba 1 no prllí) o qual foi obtido e purificado em. gel apôs digestão completa do priZ simultaneamente com as mesmas duas enzimas de restrição, tudo sob a forma convenci o nal no sentido de formar õ plasmídio prAK~3·
Passo b~) Preparação do prM-4
Seguindo essencialmente a técnica total análoga ao passo a), acima, o fago ADI de cadeia simples obtido no, passo a) foi anelizado para obtenção de um oligonucleotido de sentido inverso de 25 bases compreendendo a sequência 5’ OCA CIO 202 AM <XJ2 22G 2G0 QrM A? concebido para introduzir o sítio de iiind III entre as posi ções do nucleôtido 327 © 351 da sequência nucleôtidos da Ia bela A. Os clones positivos apresentando agora ambos os sítios desejados Iru I e Ilind III .foram identificados com uma. frequência de cerca 6,6% por avaliação de clivagem com a nu clease Eind III, e foram usados para. preparar prAE-4 por li gação do fragmento Ban !ll/iíba I com os novos sítios ao fragmento comprido de 50C4 pb do prAE da mesma maneira que no casso a)· lasso c) Preparação do prAE-5 «W' -'.Μ -I.· mtieea «ιιϋ*<» ..... mimiilriu nijllti ι ιι~Τ| ιι ι ΓΤΠΓγΤΤ
Seguindo essencialmente ο modo de proceder total análoga ao 1-asso a), acima, o fago ADI de cadeia simples obt 50
do no Passo b) foi analisado para obtenção de um oligonucleó tido de sentido inverso com 26 bases compreendendo a sequên cia 5’ GOA TOO? OTT COO UA GGG GiG GA2? concebido para introduzir o sítio de ílst II entre as posiçoes 536 e 391 da Sabela A' da sequência de nucleótídos. Os clonef positivos que possuem agora todas os três sítios*desejados liru I, Aind III e ást II foram identificados com uma,frequên cia de cerca de 9»1% por avaliação de clivagem com enzima de restrição mst II e foram usadas na preparação de prAK-5*
Passo d) - Preparação do i>rAS>6
Seguindo essencialmente a maneira de proçeder am Ioga ao asso a)·, acima, o fago AD2I de cadeia, simples obtido no Passo c) foi ane3.izado num oligonucleótido de sentido inverso com 26 bases compreendendo a sequência GCGGSlIGSâAGCGGGOIGSIGâSIGíEG^ , concebido para introduzir o sítio Bss Hl entre os nucleóti-dos das posições números 406 e 431 da pabela A da sequência dos nucleótidos. Os clones positivos que têm agora todos os sítios últisamemte desejados no prAK~7 foram identificados com uma frequência de cerca de 12,5% por avaliação da cliva gem com a enzima Bss HUI, e foram usados na preparação do prAH-6« passo e) - Preparação de prAE-7
Seguindo essencialmente a maneira de proceder total análoga do passo a), o ABI fago de cadeia simples- obtido no Passo d), anueriormente descrito, foi anelizado de modo a obter-se um oligonucleótido de sentido inverso com 26 pares de base sintetizadas compreendendo a sequêneia 91 ~
concebido para eliminar a zona de Jiind III entre as posições de nucleótido numeros 1682 e 170? na labela A com a. sequência do nucleótido * Os clones positivos repre sentando a sequência total desejada para prAE-7 foram identificados com uma frequência de cerca de 2,8% por filtração com endonucleu se de restrição da forma replicativa (dupla cadeia) do fago recombinante AD1T para a perda do sítio na de Hind III .entre os nucleótidos 1682 e 1707* A dupla cadeia ADI isolada do mutante foi usada para preparar prAK-?.
Para completar a formação de um plasmídio (prAí£-9> apresentando sítios únicos e adequadamente distanciados de restidção para a realização de experiências de rotação do codão em outros pontos da mutação entre òs dois sítios de Zba I e o desenvolvimento dos plasmídios-prlE pode ser continuado analogamente a. fim de se preparar o plasmídio prAE--8 e a partir deste o prAE-9» como abaixo se indica nos pas SOS f) e g).
Seguindo essencialmente o procedimento total análogo ao Passo a), acima, o fago ADI de cadeia simples obtido no Passo e) foi amelízado de modo a obter-se um oligómer) de sentido inverso com 27 bases sintetizadas compreendendo a secuencxa ruuuGAOOITIC^aâAâOACSSAAAO y concebido para introduzir um sítio de restrição de Bal I na posição do nucleótido cerca de ηδ. 53^ da íabela À de seque cia dos nueleótidos. Ôs clones positivos (prAK-8) tendo ago ra tolos os cinco pontos desejados de Iru I, Eind III, Sst II, BssMII, e Bal I e sem a zona ílind III removida na prepa
c ração do prAU-7 são identificados seguindo a mesma técnica do anterior Passo a).
Passo g) - Preparação de prAK-9
Seguindo esseneialmente a maneira d© proceder aná Ioga à do Passo a), acima descrito,, a cadeia simples do fago JkOIí obtido no Passo f) foi anelizado de modo a obter-se um oligõmero sintetizado de sentido inverso com 30 bases, apre sentando a sequência:’ 5’· concebido para introduzir um sítio de restrição de Ml» I en tre as posições do nucleôtidos números 538 e 595 da Xabela; A da sequência de meleotidos. Os clones positivos apresentando agora todas as seis zonas de restrição desejadas Iru X Ilind III* iist II, BssHII, Bal I e HL» I e sem a zona Hind III removida, durante a formação do prAE-7 são identificados de forma idêntica ao passo a) e denominados como o plasmídio prAÃ:'-9. . i?al como se tornará evidente, a cassete de ÃBH ade quada para a substituição entre os sítios Bal I e klu Γ no prAF-9 -pode ser codificada apropriadaaente para introduzir todos os codões possíveis e variações de aminoácidosnas p£ sições mutadas de aminoácidos 184, 187» 188 e 194*
De forma semelhante, a cassete ADlf adequada para a substituição entre o sítio de restrição de Mlu I e o segundo sítio de Xba I pode ser codificada apropriadamente no sentido de introduzir todos os codões possíveis e variações de aminoácidos nas posições de aminoácidos mutadas 201 e 204. A Figura 5 © uma representação esquemática dos sí tios de restrição introduzíveis entre os dois sítios originais ^ba I encontrados no prAE (o primeiro 'de tal sítio Xba I no prAIt-9 seno.o agora o sítio Kru I).
Os oligonucleotidos de sentido inverso sublinhados inferiormente representados nos vários passos do Sxemplo 2 indicam a alteração ou as alterações a serem introduzidas* hxperiências âe rotação do codão A) Cligonucleótidos de cadeia simples apresentando a sequên cia de cada uma das duas cadeias apresentadas nas figuras 3Δ e 33 foram preparados como se descreveu no JSmemplo F~3 com o sintotizador de ABI? programado para inserir aleatória mente todos os nucleôtidos A, S, 0 e G em cada uma das posi ções A ea cada cadeia representada na Figura 3A. Um total de aproxinadamente 200 g (após purificação) de AI)1·: em cada operação da máquina de tal cadeia simples (representando uma família de oligonucleótldos idênticos ercepto nas posições X de cada cadeia) foram preparados seguindo a tal técnica* 10 rmioles de cada cadeia, no sentido directo e inverso, por cada rotação de codão foram combinados en masse e anelizados por aquecimento a 68°G durante 10 minutos, depois a' 37°0 du rante 10 minutos arrefecendo ate â temperatura ambiente e colocando nua banho de gelo* A massa resultante de oligômero de dupla cadeia conforme o ABI representado na Figura 34» pensou-se conter nas posições SS (posição de aminoáeido llíj>) todas as combinações permitidas pelo código genético incluin do sinais de interrupção e múltiplos mas variáveis números de codão por cada um dos 20 aminoácidos naturais mais sinais de terminação. 1 pmole destes oligómeros de dupla cadeia ou cassetes foi então submetida â aeção duma quinas© com Ϊ4 po linucleótido quinase de Hew Bngland Biolabs e misturada en masse com o fragmento mais longo (presente numa concentração molar 10 vezes inferior) obtida por isolamento em gel após · a clivagem simultânea do plasmídio prAE>7 com as endonuciea ses de restrição Hind Xli e j&st il em laOl 100 mM, Xris-HOl
ρA 7,5, 10 mlij iagOlg 10 w&t 2-mercaptoetanbl 10 ml e 100 jsg/ /ml de BSA, e a mistura resultante foi submetida a ligação de acordo com o Sxeoplo P-6 A» Uma alíquota (5 1) da mistu ra resultante da ligação foi usada para transformar 1* coli cemplo P-4 b« Um número ( JB.1C3 solo as condiçoes do Exemplo p-4 b» Um número (200) daè células transformadas resultantes' foras submetidas individu-· almente aos ensaios com PBw e T* ni (coa eonh.ecimento prévio de qual o ooãão que se encontrava. na posição E£2 num qualque; elone particular) e descobriu-se que origina a produção de uma actividade de nível regular indicando que todos oe difje rentes autantes resultaram numa proteína activa como insec-ticida apresentando a actividade de pelo menos a endotoxina de controlo truncada, com os sobre-mutantes evidentes (5 x o controlo) também indicadoi Anterior a tal, células aleató rias de transformação foram também seleccionadas, colocadas em placas e as colónias desenvolvidas tal como no Exemplo P—1 para se isolar 0 AM plasnídio para análise da sequência de AD1Í elonando o ‘fragmento Ban Ηϊ/Xba I em vectores de sequenciaiuento apl8 e mp!9 cortados com as mesmas enzimas* 0 ΑΌ1; na região de cada uma das onze (11) mutações na posição dos 116 sobre-mutantes identificados foi então uma sequência para determinar o aminoácido codificado para a sua posição 116* ?erificou~se que um dos dois sobre-mutantes er4 o sobre-mutante original (116-Lys, mas codificado por AAA)*
C outro, sobre-mutante foi‘ encontrado para 116-Árg codificado por OCfi. Um dos outros clones encontrado foi o 116-Glu natural (mas codificado por GAA)· Sete dos outros mutantes leves foram 116-Ile (Air), 116-Cys (TGC), llô-Leu (020), 116-Asp (GAi), 116-Asn (AAO) 116-Ile (ATT) e 116-Qly (G&A), todos únicos à excepção do novo 116-Ile (Air!) foi representado por clois dos clones. Os clones finais foram codificado^ pura 116-fePGP (TGI B) A técnica da Parte A do ISxemplo 2 foi repetida para a pq
clones resultantes produziu um. nível de aotividade nos ensanos com f£SV; e f. ni, indicando razoavelmente que todos os clone^ tartes do conjunto eram activos* (A °/σ de moléculas inacti vas foi apromimadamente igual â frequência que seria de esperar dos codões finais UM» UM e UCL4 a partir do introdu-sido aleatoriamente pela máquina de nueleotidos nas posiçõe^ AM) ♦ 7 clones individuais selecciornados ao acaso foram indicados como tendo ua nível de aotividade de pelo menos apró ximadamente o da endoioxina da sequência natural truncada p:?0 duzida pelo prAE mas nenhum era um sobre-mutante de acordo com o padrão arbitrário escolhido* 0 sequenciamento dos 7 clones individuais mostrou que eles eram todos diferentes e únicos, como se seguei 119 - Leu (GTA), 119 ~ fyr (TAG), 119 - Asp (GA-j?), 119 - His (CÃS), 119 - Bro (CGA), 119 ~ 11a (Air) e 119 ~ Ser (TGX1)* AZ-MPliO 3
Andotozlna âe n.t, mutante de comprimento completo O plasmídio pBT210 (1 jig) foi simultaneamente cor tado com a endonucleases de restrição Bam 1 I (8 unidades) e Sst I (8 unidades) durante 60 minutos numa solução tampão de cloreto de sódio 100 mil compreendendo também fris-AGl 6 jel- (p,.-. 7»9), ivigOl^ 8 mA e 100 /ig/m.1 de albumina de soro bovino. C fragmento mais longo de cerca de 7180 pares de base foi purificado em gel para ser usado como um vector. União 1 de plasmídio prAE-26-3 envolvendo as mutações Ala —> llir (Θ 119, net —> Ile <3 130 © <Jly —* Asp |3 201 foi tam bem simultaneamente cortado com as endonucleases de restrição Bam .'II (8 unidades) e Sst I (8-unidades) em uma solução tampão de cloreto de sódio 100 mM compreendendo também Tris*· -Ml 6 sL (pn 7,9)» i^gOlg e 100 ^ítg/ml de albumina de sox*o bq
vino. 0 fragmento mais pequeno com cerca de. 14-28 pares de bs. se compreendendo as mutações bem eomo a secção BBS B.t. foi purificada com gel e tal fragmento numa quantidade de cerca de 0,06 pmtíles foi combinado para ligação com 0,02 pmoles do fragmento vector de 7180 pares de base acima obtido e matado ^juntanente com 20 juX d e meio de ligação compreendendo dris— díl píi, 7,5 60 imá, mgíilg 10 mg, ditiotreitol 1 mA, ΑΪΡ 50 hl... e 20 unidades de 24 ABB ligase, e a mistura resultante foi incubada durante 4 beras a 14°0. 0 plasmídio resultaii te, designado por pB*2 26-3, foi transformado em E» coli JmIOJ mantido inicialmente a 0°0 durante 30 minutos e então retido a 42°G durante 2 minutos voltando para um banho de gelo* Vá rias quantidades (2^1, 20 ^ e ISO da mistura resultante foram então imediatamente espalhados em placas de agar líí com 20 β,L/al de cloramphenieol (meio nutritivo 12 mais l,5>í de bacto-agar) e as placas foram incubadas durante a noite a 37°0 invertido. Apenas uma célula transformada com a resistência a cloranfenicol pôde crescer nestas placas·. Jclônias resistentes a cloranfenicol cresceram na cultura líquida durante a noite a 37°0 e o MTâ plasmídio foi prepara do para a digestão de restrição com BeoBl reagentes e ADI de secruenciamento para determinar realmente a presença de pontos de mutações, fransíormantes bem sucedidos compreendendo 0 plasmídio pB*3? 26-3 foram então avaliados em Ensaios com '•/D. e r. ni. Procedendo analogamente ao íksemplo 3, prepararam-se as endo toxinas mutantes de comprimento completo adicionais seguintes produzindo sistemas de plasmídios/cêlulas que foram assim preparadas, todos com resultados aproximada mente obtidos em tal ensaio para 0 produto de Exemplo 3, a endotoxina de B»,t. wuhanensis natural produzida em J. coli 1,..103 © um controlo envolvendo as células não transformadas J, ÍOJ são na iabela seguinte. JL TKBELL· ff nzemplo Identifica- fonte de se- Kntacão ou Classificação Ί?Οβ gão do novo quência de mmtações do ensaio da plasmidio Bam Sl/Sst I reais en- tonicidade só- de cojiipri- ΗθΙΐυΟ C023.— nleto vúutaji i*KM* ue mutante . volvidas bre SBW Γ7 P pBS26-3 prlIi-26-3 119-fhr 130-lle 201-Asp 1 3-A pBf236a65 prilE"36a6 122-ile 125-Val 2 3-3 p£?2—0 prlid-G lÍ6“lys 1 3“G JjÚS“èí prAK-E 130-lle 201-Asp ‘ 2 3-3 pBf-0 II—t Μι llΜι)1 M|||l"Wíliiii Γ··ιnlM-‘—'ir.-»"—* prAK-C 116-Lys 217“Sis 2 p—JJ pBS-B prAIÇ-B 101-¾¾ 116—lys 122-lle . 125-?al 2 3-1' p3S9Scl prAE-9Scl 188—Ser 2 3-fi pB2-B 1 ! 1 j ] rq t ígl 5¾ 119-2iir 2 p~-- ρΒΪ-Β prÂE-D 217-His 3 ?> WWk P-i. p32-j? prAE~ff 187-SAn 2,5 p-J pB2-J prAS-J lOl-Bys 116-Xiys 130-lle 201-Asp 3
ϊΑΒίίΐΑ 3? (GpKuimaeão) "TM ili ifn iriliiTi ιΐ|ΐι·ι·ιι^ Tli irrn 11; m. ιιι·«ιιιιιιι ir.n i)« ιι·ιΐ ι>ι ιίι· ιιι m rnliiiairtn ...xonplo m. Identificação do novo plasaídio de comprimento completo mutan te Ponte de sequência de Bam. Hl/Sst 1 mntante Eutação ou mutações reais envolvidas Classificação· do ensa: da toxicidade sobre S3W 3-Γ pB-l-II · prAE-fl 119-liir 217-His 2,5 3-1· pB2-H prAE-H 119-©ar 187-l%r 3 3-j.í ppl—S prM-S 119-i‘lir 188-Ser 1 gBM prAK-Φ 116-Lys 188-8er 1*5 3-0 oBl-iT prAA-ΰ 101-lys 116-lys 188-Ser 2 pB£LC7e22 plG7e22 94-Lys 194-Iys 3 ' ò pB299cõ2 p99c26 d-lhr 105-iyr 204-2yr *9 rJ ^ 7 Λ pB3l07ô25 pl07c2$ 184-Ile 3 3“S pBf-A prAK-A 101-Lys 116-lys 3 “> <···> pur-k prM-E 101-lys 116-Lys 187“itr 3
ϋΑΒϋΧΑ F (Continuação) txeaplo 212*. Identificação do novo ylasLríilio de cosipni— mento completo mutan te Fonte de sequência de Bam ΗΙ/Sst I sutante Mutação ou mutações reais envolvidas Classificação do ensa da toxicidade sotre . m: "" T ........... · r -•.'ViíTn IJipx-r prM-P 119-Síar 122-Ile 125-?al 2,3 3-? pBS-Q prll-q 116-lys 122-Ile 125-?al 3 3-ϊ. P3239 priUí-39 103-fyr 188-.8e2? 3 - 3-4 ρ3ϊ?0 prM-70 119-2ÍU? 184-Ile 1 3-τ pB!68 prAIi-68 ICp-Iyn 130-Ile 201-Âsp 1 2-Z PB253 prilS-53 105-lyr 184—lie 3 Controlo p Γ-1 Jp « Λ » iVuhanensis m — 3 Controlo JL103 — 4,9? jjuLteiEijO 4
Indotoxinas de B. t. mutantes de coBrorimentò mais com- .............· IH.T ......... » ...................... *..... 1' i 1 Ti" i τ'·—·ΐτ· - ί···«· ............. n ....................... irimriini-- — - ~ ii ' ι i ‘n i «i -----, —— - - --- pleto CMmkwwhh
0 plasmídio pBS210 (1^g) foi simultaneamente digerido com as endonucleases de restrição Bam HX (8 unidadesΊ e Sst X (8 unidades) e o fragmento com 7180 pb de comprimen to resultante foi isolado em gel, Euaa serie de experiências separadas, cada um (1 ^u-g) dos plaomídios prAI» prAIÍ-1, p26--3 5 p36a65 e p95a86 foi também simultaneamente diferido com · as endonucleases de restrição Baa ΠΙ (8 unidades) e Sst I (8 unidades) e cada fragmento resultante com 1428 pb compre endendo uma porção de uma sequência que codifica a endotoxi-na truncada foi isolado em gel. Cada quantidade destes fragmentos com 1428 pb foi então digerida separadamente com a en dmmclease de restrição Wm D2 (4 unidades) em IfaOl 6 mia* ·. •';-ris-i4>l 6 bil. (pn 7,4), mgGlP 6 miii, 2-mercaptoetanoi 6 mm, : lCC^g/ml de albumina de soro bovino. A endônuclease de res trição Fmi D2 (também conhecida como Acc2) corta cada um dos vários fragmentos com 1428 pb de Bam ΒΙ/Sst I apenas uma ves q num fragmento' com 640 pb Bam ΗΙ/Pnu B2 e num fragmento con 78j pb de pua Z)2/Sst I, sendo os fragmentos diferentes provenientes de cada experiência purificados por electroforese eiii gel* poraa então obtidos uma série de diferentes fragmentos diferentes com 788 Pb Pnu DS/Sst X. Seleccionando um fragmento de cada uma destas duas séries e ligando (Exemplo p-6 8) com um fragmento aais longo com 7180 pb obtido a par bir de pBS210, foi obtido um numero de novos plasmídios, diferentes em termos de comprimento dos genes de B.t. mutantes. Os novos plasmídios assim obtidos, identificados abaixo na fabe-la G, foram usados para transformar a 1. coli de acordo com o procedimento do Exemplo P-4 A e as células resultantes foram avaliadas relativaaente à produção de endo-toxisas de n*t. no ensaio com 33BW do Bxeaplo A, sendo os re : soltados aproisima&oe obtidos no referido ensaio também indi cados na fabela G. Yarias células transformadas compreender.
do plasmídio como os descritos nas tabelas E e G foram tam çuqos resultados são ilus bém avaliados no ensaio com nit trados na rabela E.
TÂ3MA G jseaplo Τ.ΪΟ . A; · Identifi cação do novo pias rnídlo de comprimento còm pleto mu~ tante ponte de sequência Baa Hl/ /fnu 32 fragmento Ponte de sequência Pnu 32/ /Sst I fragmento mutação ou muta çoes re ais envolvidas Glassificação do ensaio da toxicidade sobre YBW % 4~A 66 p56a65 p26-3 122-Ile 125-Yal 201-Âsp 3 »sír«s*»*^«sr%=t:x'.ífi_a*;s3»ia»i 4—B 67 p28-3 p95aS6 ll9-2br 130-Ile 188-Ser 1 4-0 74 p56a65 p95a86 122-Ile 125-Yal 188-Ser 3 4-3 1G5 p26~3 prAK. 119-liir 130-Ile 1 » 107 prilll p26-3 201-Âsp 2*5 «>«» W ϋ»1»'^Μ·Β«Ι»Ιί·ι 4~p 108 prAK— iá prAK 130-Ile 3
J
SABALA H Identificação do Ponte na labela Potência plasmidio relativa pBIA F 391 pBiíO F 299 pBrGS F 169 pBI107c25 F 254 pBAi? F 340 F 255 pBI67 & 304 pjirlOe a 567 padrão ρΰ2301 100 controlo BAH415 59 controlo CAG629 0 Μϊ&,ΙΡΙΟ 5 3
As células transformadas com ASE' que codifica uma sequência de endotoxina autante são cultivadas num fermenta dor, sob condições coubecidas e consideradas como padrão pa ra tal. C conteúdo total do fermentados· I, no fim do cresojL mento das células e imediatamente antes à colheita,' submeti do a um aumento da temperatura para apropriada 7§~80 0» Esta temperatura ê mantida durante 10 minutos antes de arrefecer e é suficiente para inactivar os microrganismos reeombi nantes sem afectar a actividade biológica das proteínas das endotoxinas* 0 conteúdo do fermentador ê então evaporado sot pressão para concentrar até um terço do seu volume prévio e o concentrado resultante é submetido a secagem por pulverização a uma pressão de inserção de cerca de 140 Eg/em2 .(200C psi) usando uma contra corrente de ar aquecido com uma tem- · peratura de entrada da ordem dos 20~5G°v* 0 pú resultante I misturado com um veículo tal como soga desengordurada para formar- um concentrado molbável. As proporções adequadas de 63 - tais compostos dependerão, entre outros faotores da intensi dade para o produto final mas,-pode, por exemplo, ser de 60:4C partes em peso de pó para substância veicular. 0 con centrado concentrado resultante contem preferivelmente 0,4 a 1C" e mais preferivelmente 0,8 a do im de actr
©ώ. bermos de esporos ou de proteínas de endotosinas» 0 umedicível I diluído adequadamente com água tal como sé contoce na prática, para aplicação de spraj. ( : a) GG ATC CGT TTT AAA TTG Ile Arg Phe Lys Leu TAT CAT AAT GAA TTG GTA TCT TAA Tyr His Asn Glu Leu Vai Ser *** (-1Í 5) ATG GAT AAC AAT CCG AAC ATC AAT Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn (1) (4) TTA AGT AAC CCT GAA GTA GAA GTA Leu Ser Asn Pro Glu Vai Glu Vai ACT GGT TAC ACC CCA ATC GAT ATT. Thr Gly Tyr Thr Pro Ile Asp Ile CTT TTG AGT GAA TTT GTT CCC GGT Leu Leu Ser Glu Phe Vai Pro Gly dTT GAT ATA ATA TGG GGA ATT TTT Vai Asp Ile Ile Trp Gly Ile Phe TTT CTT GTA CAA ATT GAA CAG TTA Phe Leu Vai Gin Ile Glu Gin Leu TTC GCT AGG AAC CAA GCC ATT 0 TCT Phe Ala Arg Asn Gin Ala Ile Ser CTT TAT CAA ATT TAC GCA GAA TCT Leu Tyr Gin Ile Tyr Ala Glu Ser CCT ACT AAT CCA GCA TTA AGA GAA Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu -46 TAG TAA TGA AAA ACA GTA TTA *** *** *** Lys Thr Vai Leu TAA AAG AGA TGG. AGG TAA CTT *** Lys Arg Trp Arg *** Leu 45 GAA TGC ATT CCT TAT AAT TGT Glu Cvs Ilè Pro Tyr Asn Cys (15) TTA GGT GGA GAA AGA ATA GAA Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu TCC TTG TCG CTA ACG CAATTT Ser Leu Ser Leu Thr Gin Phe (b) GCT GGA TTT GTG TTA GGA CTA Ala Gly Phe Vai Leu Gly Leu (60) GGT CCC TCT CAA TGG GAC GCA Gly Pro Ser Gin Trp Asp Ala n-1 ATT AAC CAA AGA ATA GAA GAA Ile Asn Gin Arg Ile Glu Glu (tn-1) :) i 300 AGA TTA GAA GGA CTA AGÇ AAT. Arg Leu Glu Gly.Leu Ser Asn (100) (105) TTT AGA GAG TGG GAA GCA GAT Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp GAG ATG CGT ATT CAA TTC AAT Glu Met Arg Ile Gin Phe Asn I f * - 64 -
GAC ATG AAC AGT GCC CTT ACA ACC GCT ATT CCT CTT TTT GCA GTT
Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr (140)
Ala Ile Pro Leu Phe Ala Vai
J
CAA AAT TAT CAA GTT CCT CTT TTA Gin Asn Tyr Gin Vai Pro Leu Leu AAT TTA CAT TTA TCA GTT TTG AGA Asn Leu His Leu Ser Vai Leu Arg 549 AGG TGG GGA TTT GAT GCC GCG ACT Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr 606 TTA ACT AGG CTT ATT GGC AAC TAT Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr | TAC AAT ACG GGA TTA GAG CGT GTA I Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Vai
TGG ATA AGA TAT AAT CAA TTT AGA
Trp Ile Arg Tyr Asn Gin Phe Arg
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AAC AGT ATA ACC ATC TAT ACG GAT
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Trp Ser Gly His Gin Ile Met Ala 495 TCA GTA TAT GTT CAA GCT GCA Ser Vai Tyr Vai Gin Ala Ala (165) 523 GAT GTT TCA GTG TTT GGA CAA Asp Vai Ser Vai Phe Gly Gin (180) 577
ATC AAT AGT CGT TAT AAT GAT
Ile Asn Ser Arg Tyr Asn Asp (195) n-348 624 ACA GAT CAT GCT GTA CGC TGG Thr Asp His Ala Vai Arg Trp (m-116) (210) (d) , 675 TGG GGA CCG GAT TCT AGA GAT Trp Gly Pro Asp Ser Arg Asp (225)
AGA GAA TTA ACA CTA ACT GTA
Arg Glu Leu Thr Leu Thr Vai
AAC TAT GAT AGT AGA ACG TAT
Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr ( 255 )
ACA AGA GAA ATT TAT ACA AAC
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Pro His Leu Met Asp Ile. Leu
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C CA GAA TTC ACT TTT CCG CTA TAT GGA ACT ATG GGA AAT GCA GCT
Pro Glu Phe Thr Phe Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn- Ala Ala CCA CAA CAA CGT ATT GTT GCT CAA CTA GGT CAG GGC GTG TAT AGA
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J ACA TTA TCG TCC ACT TTA TAT AGA AGA CCT TTT AAT ATA GGG ATA Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile AAT AAT CAA Asn Asn Gin GGA ACC TCC Gly Thr Ser ACG GTA GAT Thr Vai Asp CAA CTA TCT Gin Leu Ser TC A AAT TTG Ser Asn Leu TCG CTG GAT Ser Leu Asp GTT CTT GAC Vai Leu Asp CCA TCC GCT Pro Ser Ala GAA ATA CCG Glu Ile Pro GGG ACA GAA Gly Thr Glu GTA TAC AGA Vai Tyr Arg CCA CAG AAT Pro Gin Asn TTT GCT TAT Phe Ala Tyr AAA AGC GGA Lys Ser Gly AAC AGC GTG Asn Asn Vai CCA CCT AGG CAA GGA TTT AGT CAT CGA TTA AGC CAT GTT TC A ATG Pro Pro Arg Gin Gly Phe Ser Hls Arg Leu Ser His Vai Ser Met 1350
J TTG CGT TCA GGC TTT AGT AAT Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn
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TTA AGT GCT CAT GTC Leu Ser Ala His Vai CGA ATT GAA TTT GTT Arg He Glu Phe Vai GAT TTA GAA AGA GCA Asp Leu Glu Arg Ala TCC AAT CAA ATC GGG Ser Asn Gin Ile Gly GAT CAA GTA TCC AAT Asp Gin Vai Ser Asn CTG GAT GAA AAA AAA Leu Asp Glu Lys Lys CGA CTT AGT GAT GAG Arg Leu Ser Asp Glu GGG ATC AAT AGA CAA Gly Ile Asn Arg Gin ATT ACC ATC CAA GGA Ile Thr Ile Gin Gly (e) ACG CTA TTG GGT ACC Thr Leu Leu Gly Thr ( 723) TTC AAT TCA GGC AAT Phe Asn Ser Gly Asn CCG GCA GAA GTA ACC Pro Ala Glu Vai Thr (610 CAA AAG GCG GTG AAT Gin Lys Ala Vai Asn TTA AAA ACA GAT GTG Leu Lys Thr Asp Vai TTA GTT GAG TGT TTA Leu Vai Glu Cys Leu GAA TTG TCC GAG AAA Glu Leu Ser Glu Lys CGG AAT TTA CTT CAA Arg Asn Leu Leu Gin CTA GAC CGT GGC TGG Leu Asp Arg Gly Trp GGC GAT GAC GTA TTC Gly Asp Asp Vai Phe GAA GTT TAT ATA GAT Glu Vai Tyr Ile Asp TTT GAG GCA GAA TAT Phe Glu Ala Glu Tyr GAG CTG TTT ACT TCT Glu Leu Phe Thr Ser ACG GAT TAT CAT ATT Thr Asp Tyr His Ile TCT GAT GAA TTT TGT Ser Asp Glu Phe Cys GTC AAA CAT GCG AAG Vai Lys His Ala Lys GAT CCA AAC TTT AGA Asp Pro Asn Phe Arg AGA GGA AGT ACG GAT Arg Gly Ser Thr Asp AAA GAG AAT TAC GTT Lys Glu Asn Tyr Vai TTT GAT GAG TGC TAT Phe Asp Glu Cys Tyr CCA ACG TAT TTA TAT Pro Thr Tyr Leu Tyr CAA AAA ATA GAT GAG Gin Lys Ile Asp Glu TTA AGA GGG TAT ATC Leu Arg Gly Tyr Ile ATT CGC TAC AAT GCC Ile Arg Tyr Asn Ala GGT TCC TTA TGG CCG Gly Ser Leu Trp Pro TCG AAA TTA AAA GCC Ser Lys Leu Lys Ala GAA GAT AGT CAA GAC Glu Asp Ser Gin Asp AAA CAC GAA ACA GTA Lys His Glu Thr Vai CTT TCA GCC CCA AGT Leu Ser Ala Pro Ser 2250 TAT ACC CGT TAC CAA Tyr Thr Arg Tyr Gin (750] TTA GAA ATC TAT TTA Leu Glu Ile Tyr Leu AAT GTG CCA GGT· ACG Asn Vai Pro Gly Thr CCA ATC GGA AAA TGT Pro Ile Gly Lys Cys «
GGA GAA CCG AAT CGA Gly Glu Pro Asn Arg CTA GAT TGT TCC TGC Leu Asp Cys Ser Cys CAT CAT TTC TCC TTG His His Phe Ser Leu TGC GCA CCA CAA CTT Cys Ala Pro Gin Lêu AGA GAC GGA GAA AAA Arg Asp Gly Glu Lys GAC ATT GAT GTT GGA Asp Ile Asp Vai Gly
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68
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(a) é ui sítio de Bam Hl, (b) 4 um sítio de Spe I, (c) 4 iua sítio de Iba (d) ê um sítio de Xba I,
(e) 4 um sítio de £pu X
As mutações de maior preferência da invenção incluem as das posições 116 (Zys ou Arg), 119 (Bir), 130 (Ile] q IBS (Ser) e combinações incluindo uma ou mais das mesmas que se encontram em pB226-3» pBXIOS, pBX-ôS, pBX-O, pBS-67, e ρΒ2~70 (alguns destes encontram-se na Sabela G)* Sambém são consideradas de interesse relevante as mutações individuais e combinadas em p36a65, particularmente para en&otoxi-nas truncadas #
As mutações encontradas e permitidas de acordo con a invenção, na posição do aminoácido 4 são de interesse visto que cáea dentro da secção de 25 aminoácidos (posição 1 a 25 inclusive, na rabela â) a qual foi postulada para formar tan bem uma. porção de pré-toxina ou de pro-toxina da endotoxina o submetida a clivagem por protease no intestino a fim de formar a endotoxina activa ou a endotoxina mais activa* Oon sequentemente, as mutações permitidas na posição 4 dos ami-noáciclos são indicadas como sendo relevantes para a sequência de endotoxinas compreendendo os 25 aminoácidos ou apresentando uma substancial (pelo menos 7G}1) bomologia com esta e mais parbicularmente relevante para as endotoxinas codificadas para tal região pelo JUDS as quais podem bibridiaat antes da mutação na posição 4 e sob condições estritas para o L.jZ apresentando a sequência da f abe la A para as posições dos ineleotiãos que se prolongam desde a posição do núcleo-tido 1 ate ao e incluindo o mcleotido de posição 7% in&e-. pendentcmcnte das anulações e das adições equivalentes codi i> ILO nbXb·'*.'·' 0 os aminoácidos correspondentes como prêviamente di_s eutido em conexão com a área da sequência dos. 116 aminoáei- dos conservada. A mutação não coberta pelo presente trabalho na posição 217 dos aminoácidos e registada na Sabei a B ’e ava-liada como aqui 3a foi mencionado', julga-se que indica que todos os a· inoáci&os naturais codificados podem estar presen tes nesta posição em endotoxinas activas tendo a sequência relevante apresentada na fabela A que ,se prolonga, desde o fim da sequência de referência de 116 aminoácidos para e ir cluináo a posição 217 dos aminoácidos. Be acordo, .a situação em vue 0 aminoácido na posição 217 numa dada sequência ou nu -a sua equivalente ê 0 aminoácido natural codificado exce]^ to 4rs s incluído no âmbito da invenção* lo entanto, como a •utacão indicada na posição 217 produz resultados menos interessantes á principalmente de interesse na combinação com outras mutações referidas na presente memória descritiva e
Í2K cardo que a posição 217 pode ser alterada em endotoxinas ocorre naturalnente nesta posição.
Claims (2)
- REIVIII ϋ 10 AÇÕES: 1Μ. - Processo para a'preparação-de uma proteína de endotoxina toxica para insectos, caracterizado pelo fac-, to de compreender a transformação ou a transafectação de uma célula com, um .vector de expressão que contém uma sequência de ADB que inclui uma parte codificando para uma sequência de aminoácidos apresentando uma substancial homologia com a sequência de 116 aminoácidos que se inicia na•posição m-1 e se prolonga ate a posição m-116 indicadas na seguinte Tabela (a) -46 GG ATC CGT TTT AAA TTG TAG TAA TGA ÃAA ACA GTA TTA Ile Arg Phe Lys Leu * ** * * * *** Lys Thr Vai Leu TAT CAT AAT GAA TTG GTA TCT TA A TA A AAG AGA TGG AGG TAA CTT Tvr H is Asn Glu Leu Vai Ser *** *** Lys Arg Trp Arg ** * Leu (-1! 5) 45 ATG GAT AAC AAT CCG AAC ATC AAT GAA TGC ATT CCT TAT AAT TGT Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys (1) (4) (15) TTA . AGT AAC CCT GAA GTA GAA GTA TTA GGT GGA GAA AGA ATA GAA Leu Se r Asn Pro Glu Vai Glu Vai Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu ACT GGT TAC ACC CCA ATC GAT ATT TCC TTG TCG CTA ACG CAA TTT Thr Gly Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gin Phe CTT TTG AGT GAA TTT GTT CCC GGT GCT GGA TTT GTG TTA GGA (b) CTA Leu Leu Ser Glu Phe Vai Pro Gly Ala Gly Phe Vai LêU Gly Leu (60) Stt GAT ATA ATA TGG GGA ATT TTT GGT CCC TCT CAA TGG GAC GCA Vai Asp Ile Ile Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gin Trp Asp Ala TTT CTT GTA CAA ATT GAA CAG TTA ATT AAC CAA AGA ATA n- GAA -1 GAA Phe Leu Vai Gin Ile Glu Gin Leu Ile Asn Gin Arg Ile Glu Glu: (m-1) (c) 300 TTC GCT AGG AAC CAA GCC ATT TCT AGA TTA GAA GGA CTA AGC AAT Phe Ala Arg Asn Gin Ala Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn ( 100) ( 105) CTT TAT CAA ATT TAC GCA GAA TCT TTT AGA GAG TGG GAA GCA GAT Leu Tyr Gin Ile Tyr Ala Glu Ser Phe Arg GlU Trp Glu Ala Asp CCT ACT AAT CCA GCA TTA AGA GAA GAG ATG CGT ATT CAA TTC AAT Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu Met Arg Ile Gin Phe Asn « « s i72 - GAC ATG AAC AGT GCC CTT ACA ACC GCT ATT CCT CTT TTT GCA GTT Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala Ile Pro Leu Phe Ala Vai (140) 495 CAA AAT TAT CAA GTT CCT CTT TTA TCA GTA TAT GTT CAA GCT GCA Gin Asn Tyr Gin Vál Pro Leu Leu Ser Vai Tyr Vai Gin Ala Ala AAT TTA CAT TTA TCA GTT TTG AGA GAT GTT TCA GTG TTT GGA CAA J Asn Leu His Leu Ser Vai Leu Arg Asp Vai Ser Vai Phe Gly Gin (180) 549 ,577 AGG TGG GGA TTT GAT GCC GCG ACT ATC AAT AGT CGT TAT AAT GAT Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg Tyr Asn Asp (195) 606 n-348 624 TTA ACT AGG CTT ATT GGC AAC TAT ACA GAT CAT GCT GTA CGC TGG Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Vai Arg Trp (m-116) (210) (d) . 675 TAC AAT ACG GGA TTA GAG CGT GTA TGG GGA CCG GAT TCT AGA GAT Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Vai Trp Gly Pro Asp Ser Arg Asp (225) TGG ATA AGA TAT AAT CAA TTT AGA AGA GAA TTA ACA CTA ACT GTA Trp Ile Arg Tyr Asn Gin Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr VaiTTA GAT ATC GTT TCT CTA TTT CCG AAC TAT GAT AGT AGA ACG TAT Leu Asp Ile Vai Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr ( 255 ) CCA ATT CGA ACA GTT TCC CAA TTA ACA AGA GAA ATT TAT ACA AAC Pro Ile Arg Thr Vai Ser Gin Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn CCA GTA TTA GAA AAT TTT GAT GGT AGT TTT CGA GGC TCG GCT CAG Pro Vai Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gin GGC ATA GAA GGA AGT ATT AGG AGT CCA CAT TTG ATG GAT ·ATA .CTT Gly Ile Glu Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu AAC AGT ATA ACC ATC TAT ACG GAT GCT CAT AGA GGA GAA TAT TAT Asn Ser Ile Thr Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr TGG TCA GGG CAT CAA ATA ATG GCT TCT CCT GTA GGG TTT TCG GGG Trp Ser Gly His Gin Ile Met Ala Ser Pro Vai Gly Phe Ser Gly'J C CA GAA TTC ACT TTT CCG CTA TAT GGA ACT ATG GGA AAT GCA GCT Pro Glu Phe Thr Phe Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn· Ala Ala CCA CAA CAA CGT ATT GTT GCT CAÀ CTA GGT CAG GGC GTG TAT AGA Pro Gin Gin Arg Ile Vai Ala Gin Leu Gly Gin Gly Vai Tyr Arg ACA TTA TCG TCC ACT TTA TAT AGA AGA CCT TTT AAT ATA GGG ATA Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile AAT AAT CAA CAA CTA TCT GTT CTT GAC GGG ACA GAA TTT GCT TAT Asn Asn Gin Gin Leu Ser Vai Leu Asp Gly Thr Glu Phe Ala Tyr GGA ACC TCC Gly Thr Ser ACG GTA GAT Thr Vai Asp CCA CCT AGG Pro Pro Arg TC A AAT TTG Ser Asn Leu TCG CTG GAT Ser Leu Asp CAA GGA TTT Gin Gly Phe CCA TCC GCT Pro Ser Ala GAA ATA CCG Glu Ile Pro AGT CAT CGA Ser His Arg GTA TAC AGA Vai Tyr Arg CCA CAG AAT Pro Gin Asn TTA AGC CAT Leu Ser His AAA AGC GGA Lys Ser Gly AAC AGC GTG Asn Asn Vai GTT TC A ATG Vai Ser Met 1350 TTG CGT TC A GGC TTT AGT AAT AGT AGT GTA AGT ATA ATA AGA GCT Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Vai Ser Ile Ile Arg Ala (450) CCT ATG TTC TCT TGG ATA CAT CGT AGT GCT GAA TTT AAT AAT ATA Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile ATT CCT TCA TCA CAA ATT ACA CAA ATA CCT TTA ACA AAA TCT ACT Ile Pro Ser Ser Gin Ile Thr Gin Ile Pro Leu Thr Lys Ser ThrAAT CTT GGC TCT GGA ACT TCT GTC GTT AAA GGA CCA GGA TTT ACA Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Vai Vai Lys Gly Pro Gly Phe Thr GGA GGA GAT ATT CTT CGA AGA ACT TCA CCT GGC CAG ATT TCA ACC Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gin Ile Ser Thr J TTA AGA GTA AAT ATT ACT GCA CCA TTA TCA CAA AGA TAT CGG GTA Leu Arg Vai Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gin Arg Tyr Arg Vai AGA ATT CGC TAC GCT TCT ACC ACA AAT TTA CAA TTC CAT ACA TCA Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gin Phe His Thr Ser ATT GAC GGA AGA CCT ATT AAT CAG GGG AAT TTT TCA GCA ACT ATG Ile Asp Gly Arg Pro Ile Asn Gin Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met AGT AGT GGG AGT AAT TTA CAG TCC GGA AGC TTT AGG ACT GTA GGT Ser Ser Gly Ser Asn Leu Gin Ser Gly Ser Phe Arg Thr Vai Gly TTT ACT ACT CCG TTT AAC TTT TCA AAT GGA TCA AGT GTA TTT ACG Phe Thr Thr Pro Phe Asn Phe Ser Asn Gly Ser Ser Vai Phe Thr JTTA AGT GCT Leu Ser Ala CGA ATT GAA Arg Ile Glu Λ CAT GTC TTC His Vai Phe TTT GTT CCG Phe Vai Pro GAT TTA GAA Asp Leu Glu TCC AAT CAA Ser Asn Gin GAT CAA GTA Asp Gin Vai CTG GAT GAA Leu Asp Glu CGA CTT AGT Arg Leu Ser GGG ATC AAT Gly Ile Asn ATT ACC ATC Ile Thr Ile AAT TC A GGC Asn Ser Gly GCA GAA GTA Ala Glu VaiTTT ACT TCT Phe Thr Ser TAT CAT ATT Tyr His Ile GAA TTT TGT Glu Phe Cys CAT GCG AAG His Ala Lys AAC TTT AGA Asn Phe Arg AGT ACG GAT Ser Thr Asp AAT TAC GTT Asn Tyr Vai AGA GCA CAA Arg Ala Gin ATC GGG TTA Ile Gly Leu TCC AAT TTA Ser Asn Leu AAA AAA GAA Lys Lys Glu GAT GAG CGG Asp Glu Arg AGA CAA CTA Arg Gin Leu CAA GGA GGC Gin Gly Gly AAG GCG GTG Lys Ala Vai AAA ACA GAT Lys Thr Asp GTT GAG TGT Vai Glu Cys TTG TCC GAG Leu Ser Glu AAT TTA CTT Asn Leu Leu GAC CGT GGC Asp Arg Gly GAT GAC GTA Asp Asp Vai AAT GAA GTT Asn Glu Vai ACC TTT GAG Thr Phe Glu 610) AAT GAG CTG Asn Glu Leu GTG ACG GAT Vai Thr Asp TTA TCT GAT Leu Ser Asp AAA GTC AAA Lys Vai Lys CAA GAT CCA Gin Asp Pro TGG AGA GGA Trp Arg Gly TTC AAA GAG Phe Lys Glu TAT ATA GAT Tyr Ile Asp GCA GAA TAT Ala Glu Tyr( e) ACG CTA TTG GGT ACC TTT GAT GAG TGC TAT CCA ACG TAT TTA TAT Thr Leu Leu Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr ( 723 )'! CAA AAA ATA Gin Lys Ile TTA AGA GGG Leu Arg Gly ATT CGC TAC Ile Arg Tyr GGT TCC TTA Gly Ser Leu GAT GAG TCG Asp Glu Ser TAT ATC GAA Tyr Ile Glu AAT GCC AAA Asn Ala Lys TGG CCG CTT Trp Pro Leu AAA TTA AAA Lys Leu Lys GAT AGT CAA Asp Ser Gin CAC GAA ACA His Glu Thr TCA GCC CCA Ser Ala Pro GCC TAT ACC Ala Tyr Thr GAC TTA GAA Asp Leu Glu GTA AAT GTG Vai Asn Vai AGT CCA ATC Ser Pro Ile 2250 CGT TAC CAA' Arg Tyr Gin (750: ATC TAT TTA Ile Tyr Leu CCA GGT ACG Pro Gly Thr GGA AAA TGT Gly Lys Cys c JGGA GAA CCG AAT CGA TGC GCA Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala CTA GAT TGT TCC TGC AGA GAC Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp CAT CAT TTC TCC TTG GAC ATT His His Phe Ser Leu Asp lie GAG GAC TTA GGT GTA TGG GTG Glu Asp Leu Gly Vai Trp Vai GGC CAT GCA AGA CTA GGA AAT Gly His Ala Arg Leu Gly Asn TTA GTA GGA GAA GCA CTA GCT Leu Vai Gly Glu Ala Leu Ala TGG AGA GAC AAA CGT GAA AAA Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys TAT AAA GAG GCA AAA GAA TCT Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser CAA TAT GAT AGA TTA CAA GCG Gin Tyr Asp Arg Leu Gin Ala GCG GCA GAT ÀAA CGC GTT CAT Ala Ala Asp Lys Arg Vai His GAG CTG TCT GTG ATT CCG GGT Glu Leu Ser. Vai rle Pro Gly TTA GAA GGG CGT ATT TTC ACT Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr AAT GTC ATT AAA AAT GGT GAT Asn Vai Ile Lys Asn Gly Asp AAC GTG AAA GGG CAT GTA GAT Asn Vai Lys Gly His Vai Asp TCG GTC CTT GTT GTT CCG GAA Ser Vai Leu Vai Vai Pro Glu GTT CGT GTC TGT CCG GGT CGT Vai Arg Vai Cys Pro Gly ArgCCA CAA CTT GAA TGG AAT CCA GAT Pro Gin Leu Glu Trp Asn Pro Asp GGA GAA AAA TGT GCC CAT CAT TCC Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser GAT GTT GGA TGT ACA GAC TTA AAT Asp Vai Gly Cys Thr Asp Leu Asn (840) ATA TTC AAG ATT AAG ACG CAA GAT Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gin Asp CTA GAA TTT CTC GAA GAG AAA CCA Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro CGT GTG AAA AGA GCG GAG AAA AAA Arg Vai Lys Arg Ala Glu Lys Lys 2700 TTG GAA TGG GAA ACA AAT ATT GTT Leu Glu Trp Glu Thr Asn Ile Vai (900] GTA GAT GCT TTA TTT GTA AAC TCT Vai Asp Ala Leu Phe Vai Asn Ser GAT ACC AAC ATÇ GCG ATG ATT CAT Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His AGC ATT CGA GAA GCT TAT CTG CCT Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro GTC AAT GCG GCT ATT TTT GAA GAA Vai Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu GCA TTC TCC CTA TAT GAT GCG AGA Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg TTT AAT AAT GGC TTA TCC TGC TGG Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp GTA GAA GAA CAA AAC AAC CAC CGT Vai Glu Glu Gin Asn Asn His Arg TGG GAA GCA GAA GTG TCA CAA GAA Trp Glu Ala Glu Vai Ser Gin Glu , GGC TAT ATC CTT CGT GTC ACA GCG Gly Tyr Ile Leu Arg Vai Thr Ala J iTAC AAG GAG *GGA TAT Tyr Lys Glu Gly Tyr GAG AAC AAT ACA GAC Glu Asn Asn Thr Asp GAA GTA TAT CCA AAC Glu Vai Tyr Pro Asn JGGA GAA GGT TGC GTA Gly Glu Gly Cys Vai GAA CTG AAG TTT AGC Glu Leu Lys Phe Ser ACT CAA GAA GAA TAT Thr Gin Glu Glu Tyr TAT GAC GGA GCT TAT Tyr Asp Gly Ala Tyr GCA TCA GCC TAT GAA Ala Ser Ala Tyr Glu AAT CCT TGT GAA TCT Asn Pro Cys Glu Ser CCA GCT GGC TAT GTG Pro Ala Gly Tyr Vai GAT AAG · GTA TGG ATT Asp Lys Vai Trp Ile AAC ACG GTA ACG TGT Asn Thr Vai Thr Cys GAG GGT ACG TAC ACT Glu Gly Thr Tyr Thr GAA AGC AAT TCT TCT Glu Ser Asn Ser Ser GAA AAA GCA TAT ACA Glu Lys Ala Tyr Thr AAC AGA GGA TAT GGG Asn Arg Gly Tyr Gly ACA AAA GAA TTA GAG Thr Lys Glu Leu Glu GAG ATC GGA GAA ACG Glu Ile Gly Glu Thr AGC ATT CAT GAG ATC Thr Ile His Glu Ile (1 0 5 C) AAC TGT GTA GAA GAG Asn Cys Vai Glu Gli 3 24 C AAT GAT TAT ACT GCC Asn Asp Tyr Thr Ala ( 1 080 ) TCT CGT AAT CGA GGA Ser Arg Asn Arg Gly GTA CCA GCT GAT ΤΑΊ1 Vai Pro Ala Asp Tyi GAT GGA CG A AGA GAC Asp Gly Arg Arg Asp GAT TAC ACA CCA CTA Asp Tyr Thr Pro Lei TAC TTC CCA GAA ACC Tyr Phe Pro Glu Thr GAA GGA ACA TTC ATC Glu Gly Thr Phe Ilír. (1 170 GTG GAT AGC GTG GAA TTA CTC CTT ATG GAG GAA TAG Vai Asp Ser Vai Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu *** (1181) 12 - r em cjuc (a) ê um sítio de Baa Hl, (b) é um sítio de Spe I, (c) e um sítio de Xba 1, (d.) é ua sítio de Iba I, (e) ê ua sítio de Epu I, Q em que os referidos números das posições se aplieam â inen cionada sequência Homóloga, in&ôpendenteaente de quaisquer supressões ou adições à citada sequência, sendo o mencionado 1MT modificado de forma que um qualquer ou vários dos ami noâeidos seguintes é codificado na jjosição de referência de aminoácido s indicada a) r·^ posição m-5 qualquer aminoácido natural excepto Asn; d]) na posição m-6 qualquer aminoácido natural excepto Gin c) na posição bi-12 qualquer aminoácido natural excepto Glu d) na posição rn-16 qualquer aminoácido natural excepto Asn· e) na posição m*27 qualquer aminoácido natural excepto Glu; f ) na posição m-30 qualquer aminoácido natural excepto Ala: o) na posição a-33 qualquer aminoácido natural excepto Sbr-i ii) na posição m-3^ qualquer aminoácido natural excepto Asn; i) na posição m-36 qualquer aminoácido natural excepto Ala; á) na posição a-41 qualquer aminoácido natural excepto £et! i=) na posição m-95 qualquer aminoácido natural excepto PHe; i) na nosicão m~9S qualquer aminoácido natural excepto Ala; m) na posição m-99 qualquer aminoácido natural excepto Shr: n) Ilci posição m-103 qualquer aminoácido natural excepto Asn: o) na posição m-112 qualquer àminoacido natural excepto Gly; a im mcionada seou ência do i IDE fica sob o controlo do ABK operacional de modo a provocar a expressão do mesmo, e se realisar a cultura das células resultantes a fim de produzir a citada endotoxina. 2 Processo de acordo com a reivindicação 1, eâ -Αβ - Ji racterisado |>elo facto de a bomologia entre a sequência dos aminoácidos codificada por uma parte da sequência do AM eon tida no veetor de expressão e a sequência de 116 aminoácidojs oue começa na posição m-1 e se prolonga até à posição m~116, ser pelo menos igual a 7Cfé, %-. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, earacterizado pelo facto de o AM contido no vector do expressão ter sido modificado de forma que um qualquer ou vjt rios dos aminoácidos seguintes serem codificados para a posição de referência do aminoácido indicada: a) na posição m-5, Lys b) na posição a-6, Lys c) na posição m~12} Lys d) na posição m-16, lyr e) na posição m-27» lys ou Arg f) na posição m-3Q» fbr g) na posição m-33, Ile I;<) na posição m-34, fyr i) na posição hi-36» Tal Ô) na posição m-41, Ile k) na posição m-95» Ile l) na posição m-9S, Sbr ia) na posição m-99» Ser n) na posição m-105» lys5 e 0) na posição m-112* Asp. 4l. - Processo de acordo com a reivindicação 3» ca racterizado pelo facto de 0 AM ter sido modificado de. manei, ra a incorporar a alteração numa ou em ambas as posições de referência dos aminoácidos m-27 0 m-30. 5-·. - Processo de acordo com a reivindicação 4* ca racterizado pelo facto de se bibridizar a parte do AM sem 79 c nenhuma das modificações especificadas nas reivindicações 1, 3 ou 4 soo condições rigorosas de Mbridização com um oligõ mero de 348 nueleótidos que tem uma sequência de nucleótidon referida na. reivindicação 1, a qual começa na posição n-1 e se prolonga atê à posição do úueleótido n-348. 6-* - Processo de acordo com a reivindicação 5¾ cu ractexlzado pelo facto de a parte do ABii, antes de qualquer modificação especificada nas reivindicações 1, 3‘ ou 4, eodi ficar para a sequência de 116 aminoácidos indicada na reiviji dicação 1, que se inicia na posição m-1 e se prolonga até â ^oaicão m-116. 7;:·· - Processo'de acordo com a reivindicação 6, c|i racterizado pelo facto dê o ADK que codifica para a endoto-«:ina compreender ADP que codifica para a sequência de amino ácidos mencionados na reivindicação 1» que se inicia na posição 1, dos aminoácidos e seprolonga até à posição 205 dos aminoácidos. 8m. - Processo para a preparação de uma proteína de en-lotosina tónica para insectos, caractsrizado pelo facto do compreender a transformação ou a transfectação de uma cé lula com um vector da expressão que contém uma parte de ABE que codifica uma sequência de aminoácidos que apresenta uma Pomologia de aminoácidos substancial com a sequência de 205 aminoácidos, a qual se inicia na posição 1 e se prolonga até & posição 2C5 dos aminoácidos citada na reivindicação 1, em Que o aminoácido na posição 4 ê qualquer aminoácido excepto , Asn. - Processo de acordo com a reivindicação 8, oar-acterizado pelo facto de o aminoácido na posição.4 ser 2yr. 10~. - Processo de acordo com qualquer das reivin r Idicaçoes 1 a 9, caraeterizado pelo facto de a célula transformada ou transfectada ser uma célula de "bactérias. 11*1, - Processo de acordo com a reivindicação 10» caraeterizado pelo facto de a célula transformada ou transf^c ta;·]a ser uma célula de B.I. (Bacillus SImringiensis).
- 12- Processo de acordo com qualquer das reivin Cicações 1 a 9, caraeterizado pelo facto de a célula -transformada ou transfectada ser- uma célula de uma planta. 13~. - Processo para a preparação de composições inseeticidas caraeterizado pelo facto de se misturar uma quán tiiade eficaz como insecticida de uma proteína de acordo con a reivindicação 1» com uma mistura veicular aceitável do poji to do vista agrícola. .;fboa, 2p de Peirereiro de 1989 I {~ Agente Oficial da Propriedade Industrial TJLàXn S1LVINA VIEIRA PEREIRA FERREIRA Ajunto Américo de Silva Carvalha Agrafo Ollcbl i» Pf»ptl«We InefuMal Rua Castilho, 201 - 3.Q Esq. Talei. 6513-39-»1000 LISBOA
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