본 발명은 첨부된 서열목록의 서열 5 또는 서열 6으로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소 세포막 ABC 운반 단백질 rtxB2 유전자;
서열 7 또는 서열 8로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소 세포막 ABC 운반 단백질 rtxD 유전자;
서열 3 또는 서열 4로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소 세포막 ABC 운반 단백질 rtxB1 유전자;
서열 11 또는 서열 12로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소 세포막 ABC 운반 단백질 rtxB1 유전자와 활성화 단백질 rtxC 사이에 존재하는 기능을 모르는 ORF;
서열 9 또는 서열 10으로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소 활성화 단백질 rtxC 유전자; 및
서열 1 또는 아미노산 서열 2로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)의 독력인자 RTX 독소 구조 단백질 rtxA 유전자;
로 이루어진 RTX 독소 오페론에 관한 것이다.
또 본 발명은 상기 RTX 독소 오페론을 구성하는 유전자 중 하나 이상을 결핍시킨 RTX 생산 결함 돌연변이 균주를 항비브리오 패혈증 생균 백신 제조에 사용하는 방법에 관한 것이다.
특히, 상기 RTX 독소 오페론을 구성하는 유전자 중 rtxA 유전자의 N-말단 부위의 182 아미노산부터 1,587 아미노산까지에 해당하는 약 4,200 염기쌍을 결손시켜 제조한 돌연변이 균주에 관한 것이다.
상기 균주는 2003년 5월 13일자로 한국 생명공학연구소 내 유전자은행에 기탁 의뢰하여, 수탁번호 KCTC10473BP를 부여받았다.
또한 본 발명은 서열 13 또는 서열 14로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소의 주변세포질(periplasm) 및 외막 운반 단백질 유전자 tolC 및 tolC 유전자를 결실시킨 돌연변이 균주에 관한 것이다.
또 본 발명은 상기에서 제조한 생균백신을 사용하여 유전자 면역(genetic immunization)을 위한 DNA를 운반하고, 사람을 포함한 여러 동물의 체내에서 이종의 유전자나 단백질을 발현시켜 면역반응을 유발하는 약독화 항원 운반 숙주에 관한 것이다.
본 발명에 의한 RTX 독소 오페론 및 tolC 유전자의 동정 및 rtxA 유전자 및 tolC 유전자가 결실된 돌연변이 균주의 백신 효과를 증명하는 과정은 다음과 같다:
1) 트랜스포존 라이브러리를 제조하는 단계
2) 접촉 세포독성에 관여하는 유전자에 돌연변이가 있는 트랜스포존 돌연변이 클론을 스크리닝하는 단계
3) RTX 독소 오페론 유전자를 클로닝 및 동정하는 단계
4) rtxA 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제조하는 단계
5) tolC 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제조하는 단계
6) RTX 돌연변이 균주의 세포독성과 마우스 치사력을 측정하는 단계
7) 비강내 면역 후 마우스에 대한 RTX 돌연변이 균주의 숙주 방어능력을 측정하는 단계.
본 발명에서 사용하는 돌연변이 균주 및 이들의 특성은 표 1에 정리하였다. 각각의 제조 방법과 자세한 특성은 해당 실시예 및 시험예에서 적시하였다.
[표 1]
균주 혹은
플라스미드
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특 징
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출 처
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V. vulnificus
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MO6 24/O |
고병원성 임상분리균주 |
J. Glenn Morris Jr. |
ATCC29307 |
Type strain |
ATCC로부터 구입 |
CMM 740 |
rtxA에 결실 돌연변이가 있는 MO6-24/O |
발명자 |
CMM 750 |
vvpE에 결실 돌연변이가 있는 CMM740 |
발명자 |
CMM 1055 |
vvhA에 결실 돌연변이가 있는 CMM750 |
발명자 |
CMM 2400 |
tolC에 결실 돌연변이가 있는 MO6-24/O |
발명자 |
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Escherichia coli
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DH5α |
FrecA1; restriction negative |
실험실 기보유 |
SY327 λ pir
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Δ(lac pro)argE(Am)rif nalA recA56
λ pir lysogen; host for πrequiring plasmids |
John J. Mekalanos |
SM10 λ pir
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thi thr leu tonA lacY supE recA::RP4 2 TcR::Mu λ pir lysogen, oriT of RP4, KmR ; Conjugal donor |
John J. Mekalanos |
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Plasmids
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pLAFR3 |
IncP cosmid vector, TcR
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Staskawiczet al. (1987) |
pCVD702 |
3.4 kbpvvhBADNA 조각이 pBR325의HindIII 및EcoRI 위치에 클로닝되어 있는 플라스미드 |
J. Glenn Morris Jr. |
pDM4 |
자살벡터,oriR6K,sacB,CmR
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Debra Milton
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이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 트랜스포존 라이브러리 (transposon library) 제조
V. vulnificus MO6-24/O 표준균주(미국 University of Maryland School of Medicine, Division of Hospital Epidemiology의 J. Glenn Morris로부터 획득)와 mini-Tn5 lacZ1을 포함하고 있는 E. coli SM10 l pir 균주(독일 Braunschweig 소재 GBF-National Research Center for Biotechnology의 Kenneth N. Timmis로부터 획득)의 단일 집락을 10 ㎖의 2.5% NaCl heart infusion (이하 2.5HI) 액체배지와 20 ㎖의 Luria Bertani (이하 LB, ampicillin 100 ㎍/㎖, kanamycin 100 ㎍/㎖ 함유) 액체배지에 각각 접종하여 37℃, 210 rpm에서 하룻밤 교반 배양하였다.
다음날 각각의 배양액을 원침한 후 항생제가 들어있지 않은 새로운 LB 액체배지로 두 번 원심세척한 뒤 각각 100 ㎕의 새로운 LB 액체배지에 부유시켰다. 그리고 E. coli 와 V. vulnificus 균액을 서로 혼합하여 LB 한천배지 위에 떨어뜨렸다. 37℃에서 하룻밤 배양한 후 LB 한천배지 상에 자란 세균집락에 새로운 2.5HI 액체배지 800 ㎕를 떨어뜨린 후 멸균된 유리봉을 이용하여 잘 긁어내었다. 이 균액을 1.5 ㎖ 플라스틱 시험관으로 옮긴 뒤 충분히 교반하여 균질하게 부유되도록 하였다. 이 균액을 kanamycin 200 ㎍/㎖을 함유한 TCBS(thiosulfate citrate bile sucrose) 한천배지에 원액, 1/10, 1/100 희석액 100 ㎕씩을 각각 떨어뜨린 후 완전히 스며들도록 잘 도말한 뒤 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
다음날 TCBS 한천배지 상에 자란 비브리오 집락만을 이쑤시개를 이용하여 kanamycin 300 ㎍/㎖을 함유한 TCBS 한천배지에 접종하고 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날 형성된 비브리오 집락을 200 ㎍/㎖의 kanamycin을 함유한 100 ㎕의 2.5HI 액체배지가 담긴 96-well 배양판의 각 well에 접종하여 37℃에서 하룻밤 정체 배양하였다. 다음날 균이 자란 각 well에 80 ㎕의 50% 글리세롤(in 2.5 HI)을 가한 뒤 70℃ 초저온냉동기에 보관하다가 필요시 replica plater를 사용하여 2.5HI 한천배지에 접종하여 배양한 후 각 실험에 사용하였다.
[실시예 2] 접촉 세포독성 상실 트랜스포존 돌연변이 클론의 스크리닝
실시예 1과 같이 제조된 V. vulnificus MO6-24/O 균주의 트랜스포존 라이브러리 각 균주 클론들은 2.5HI 액체배지에 하룻저녁 배양한 후 1 ㎕ 씩 취해 2x104 세포씩 HeLa 세포가 역시 하룻저녁 배양된 각 well에 접종하여 37℃에서 90분 동안 배양하였다. 상등액을 제거하고 바닥에 남아 있는 세포들을 Trypan blue 염색(Sigma Co.)하여 세포독성 여부를 관찰하였다. 세포독성에 이상이 생겨 상기 검사 조건에서 HeLa 세포를 전혀 죽이지 못하는 것으로 나타난 클론들을 선발하여 세포독성의 감소를 정량적으로 측정하였다. 정량적 세포독성은 사멸된 HeLa 세포의 세포질에서 유리된 lactate dehydrogenase(LDH) 양을 CytoTox™ Non-Radioactive Cytotoxicity assay kit(Promega Co.)로 측정하였다.
몇 차례의 스크리닝 과정과 정량적 세포독성 측정을 통하여 세포독성이 거의 상실된 11개의 트랜스포존 돌연변이 클론들을 선발하여 트랜스포존이 삽입되어 돌연변이가 초래된 유전자를 동정하는 실험을 진행하였다.
[실시예 3] RTX 독소 오페론 유전자의 클로닝 및 동정
트랜스포존이 삽입된 주위 유전자들의 클로닝은 본 연구실에서 확립하여 사용해오고 있는 arbitrary PCR법을 사용하여 증폭한 DNA 조각을 표지자로 사용하여 코스미드(cosmid) 유전체 라이브러리를 스크리닝하여 실시하였다. 트랜스포존 삽입 주위 DNA 조각들의 증폭은 two-step PCR amplification 방법을 사용하였다. 첫 번째 PCR 반응에서는 서열 15로 표시되는 arbitrary primer 1(5'- GGCCACGCGTCGACTAGTCANNNNNNNNNNACGCCC-3')과 서열 16으로 표시되는 mini-Tn5 lacZ1 specific primer 1(5'-TTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGC-3')을 사용하여 증폭하였으며, 이 첫 번째 프라이머 세트에 의한 PCR 산물을 주형으로 하여 두 번째 PCR을 실시한다. 2번째 PCR 반응에서는 서열 17로 표시되는 arbitrary primer 2 (5'-GGCCAAGAGTCGACTAGTCA-3')와 서열 18로 표시되는 또다른 mini-Tn5 lacZ1 specific primer 2 (5'-CCGCACTTGTGTATAAGAGTCAG-3')를 이용하였으며, 이 PCR 산물을 아가로즈 (agarose) 전기영동한 후 겔에서 증폭 DNA 부위를 분리하여 염기서열 결정에 사용하였다. Arbitrary PCR 결과 11개의 균주들 중 5 균주는 약 300 bp, 나머지 6 균주들은 약 180 bp의 DNA 조각이 증폭되어 원래는 2개의 클론들로부터 유래했음을 알 수 있었다.
두가지 증폭 DNA 조각의 염기서열을 결정해 미국 National Center for Biological Information의 GenBank 데이터베이스에 수록되어 있는 유전자들과 BLAST 분석을 실시해본 바, 300bp 짜리는 콜레라균(Vibrio cholerae)의 RTX 독소 구조 유전자 rtxA와 92%, 180bp 짜리는 RTX 독소 분비운반 단백질 유전자 rtxB와 72% 상동성(identity)를 나타내었다.
V. vulnificus MO6-24/O 표준균주의 코스미드(cosmid) 유전체 라이브러리를 제조하여(Staskawicz, B. Dahlbeck, D, Keen, K., Napoli. C., J. Bacterol. 169:5789-5794, 1987), 300bp 짜리(rtxA)와 180bp 짜리(rtxB) DNA 조각을 nick translation 방법을 이용하여(Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) 32P-dCTP로 표지한 후 colony blot hybridization analysis를 통해 RTX 독소 유전자 오페론을 포함하고 있는 클론들을 스크리닝 하였다. 96-well plate에 보관하고 있는 약 2,100 개의 클론을 Luria Bertani 한천배지에 replica plater를 이용하여 접종하고 하룻저녁 배양한 후 니트로셀룰로오스 페이퍼에 블로팅하여 colony blot hybridization을 실시한 결과 각각의 표지자에 양성 반응을 나타내는 클론을 3개씩 발견할 수 있었다. 총 6개의 코스미드 클론들을 통상적인 서브클로닝 과정을 거쳐 각각의 서브클론들의 염기서열을 결정하였던 바, 도 1에 나타낸 것과 같이 약 20 kbp에 달하는 오페론 구조를 확인할 수 있었다. 염기서열을 확인하였던 바 rtxB는 2개가 존재하는 것으로 나타나 제일 바깥 쪽에 있는 유전자를 rtxB2로, rtxC와 rtxD 사이에 존재하는 유전자를 rtxB1으로 명명하였다.
[실시예 4] RTX 독소 구조 유전자 rtxA 결실 돌연변이 균주의 제조
rtxA 유전자는 14,106 bp의 핵산으로 구성되어 있으며, 5,206 아미노산으로 구성된 RTX 독소을 만드는 거대한 구조 유전자로 나타났다. 그 중 182 아미노산부터 1,587 아미노산까지(544bp-4,761bp) 에 해당하는 rtxA 유전자의 N-말단 부위의 약 4,200 염기쌍을 결손시킨 rtxA 결손 돌연변이주를 제조하였다. rtxA 유전자 일부의 결손은 PrtxA-1, PrtxA-2와 PrtxA-3, PrtxA-4라는 두쌍의 프라이머를 사용한 PCR 법을 사용하였다. rtxA의 5'부분의 증폭을 위해서는 서열 19로 표시되는 PrtxA-1(gaattcttgagcttgcaggcg)과 서열 20으로 표시되는 PrtxA- 2(tctagaaccacgcgagccttg)의 프라이머를 사용하였으며, 3'부분은 서열 21로 표시되는 PrtxA-3(tctagacacaatgatggactgggc)과 서열 22로 표시되는 PrtxA-4(gaattccgaaccacatcctgag)의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭하였다(클로닝을 위해 삽입한 제한효소 XbaI 제한효소인식부위(tctaga)를 밑줄로 그어 표시하였음). 즉 프라이머 PrtxA-1 및 PrtxA-2 쌍과 PrtxA-3 및 PrtxA-4 쌍을 사용한 PCR 반응은 초기변성 95℃ 4분 후, 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 확장 72℃ 60초, 25회 반복한 후 마지막 72℃에서 10분 반응시키는 조건으로 실시하였다. 증폭된 두개의 DNA 조각을 서로 연결하기 위해서 먼저 프라이머 PrtxA-3과 PrtxA-4 에 의해 증폭된 DNA 조각을 PCR 2.1-TOPO cloning vecter(Invitrogen Co.)에 클로닝 하였다. 이 재조합 DNA를 XbaI으로 자른 다음, 프라이머 PrtxA-1과 PrtxA-2에 의해 증폭된 DNA 조각을 같은 제한효소 XbaI으로 자른후 접합효소를 이용하여 클로닝하였다. 결손시키고자 하는 rtxA 부분의 상하부가 같은 방향으로 클로닝된 재조합 TOPO vector에서 XhoI과 SacI 제한효소를 사용하여 원하는 부위가 결손된 rtxA 유전자 조각을 잘라낸 후 같은 제한효소로 자른 pDM4 플라스미드(스웨덴 Umea University, Department of Molecular Biology의 Debra Milton으로부터 획득)에 클로닝하였다. 이렇게 제조된 재조합 플라스미드를 E. coli SM 10 λpir에 일렉트로포레이션시켜 생성된 형질전환 균주를 V. vulnificus와 접합시켜 재조합 플라스미드가 전달되게 하였다. V. vulnificus 안에서는 증식하지 못하는 pDM4의 rtxA 결실 DNA 조각과 염색체의 자연형 DNA 조각 사이에 대립형질 상호교환(allelic exchange)에 의하여 결실이 유발된 돌연변이 V. vulnificus 균주 는 PrtxA-1과 PrtxA-4 프라이머 짝을 이용하여 결실 여부를 확인하였다. PCR은 초기변성 95℃ 4분 후, 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 확장 72℃ 120초, 25회 반복한 후 마지막 72℃에서 10분 반응조건에서 실시하였다. 이와 같이 제조된 돌연변이 균주를 CMM 740으로 명명하였다. 결손시킨 DNA 염기서열과 아미노산 서열은 서열 1과 서열 2에 밑줄을 그어 표시하였다.
[실시예 5] RTX 독소와 용혈독소 및 금속단백분해효소 이중 또는 삼중 돌연변이 균주의 제조
rtxA 유전자 결손 돌연변이 균주에 용혈독소(vvhA) 및 금속단백분해효소(vvpE) 의 이중 또는 삼중 돌연변이 균주를 제조하기 위한 vvhA 와 vvpE 유전자들의 결손은 다음과 같이 실시하였다.
먼저 vvhA의 돌연변이 균주를 제조하기 위하여 vvhBA를 포함하고 있는 플라스미드 pCVD702(미국 University of Maryland School of Medicine, Division of Hospital Epidemiology의 J. Glenn Morris로부터 획득)에서 vvhA의 하부에 해당하는 1.76-kb KpnI-XbaI DNA 조각을 잘라내고 같은 제한효소로 자른 pDM4 (Debra Milton, Department of Molecular Biology, Umea University, Sweden)에 클로닝하였다. vvhA의 상부를 증폭하기 위해서는 서열 23으로 표시되는 프라이머 PvvhA-3(ttggtgcatatctattctcaaggacg)과 서열 24로 표시되는 Pvvh-4(cgggtaccctttgagctggtgatg)를 이용하여, 초기변성 95℃ 4분 후, 변성 94℃ 30초, 어닐링 65℃ 30초, 확장 72℃ 60초, 25회 반복한 후 마지막 72℃에서 10분 반 응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응을 실시하였다. vvhA 하부를 포함하고 있는 재조합 플라스미드에 PvvhA-3과 PvvhA-4의 PCR 증폭 DNA 조각을 클로닝하여 vvhA 유전자의 상하부가 포함된 DNA 조각을 가지고 있는 재조합 플라스미드를 얻고, 이렇게 제조된 재조합 플라스미드를 E. coli SM 10 λ pir에 일렉트로포레이션시켜 생성된 형질전환 균주를 V. vulnificus와 접합시켜 재조합 플라스미드가 전달되도록 하였다. V. vulnificus 안에서는 증식하지 못하는 pDM4의 vvhA 결실 DNA 조각과 염색체의 자연형 DNA 조각 사이에 대립형질 상호교환(allelic exchange)에 의하여 결실이 유발된 돌연변이 V. vulnificus 균주는 서열 25로 표시되는 PvvhA-1(cgggatccatgaaaaaaatgactc)과 서열 26으로 표시되는 PvvhA-4(cggaattcgcctagagtttgacttg) 프라이머 짝을 이용한 중합효소연쇄 반응에 의하여 확인하였다. 이와 같이 제조된 이와 같이 제조된 rtxA와 vvhA 이중 돌연변이 균주를 CMM 751로 명명하였다.
vvpE의 돌연변이 균주를 제조하기 위하여 vvpE 유전자 일부의 결손은 PvvpE-5, PvvpE-6와 PvvpE-7, PvvpE-8이라는 두쌍의 프라이머를 사용한 PCR 법을 사용하였다. vvpE 유전자의 상부 증폭을 위해서는 서열 27로 표시되는 PvvpE-5(gcagcttcgctaagagggaggcg)와 서열 28로 표시되는 PvvpE-6(cgggtaccaacacaggcaggccc)의 프라이머를 사용하였으며, vvpE 유전자 하부 증폭을 위해서는 서열 29로 표시되는 PvvpE-7( cgggtacctcttcaagtcgaatgg)과 서열 30으로 표시되는 PvvpE-8(ggcggcaatcccaagagc)의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭하였다. 이하 결손 돌연변이 균주제조 방법은 [실시예 4]와 동일하다. 이와 같이 제조된 rtxA와 vvpE 이중 돌연변이 균주를 CMM 750으로 명명하였다. rtxA와 vvhA, vvpE 의 삼중 돌연변이 균주를 CMM 1055로 명명하였다.
[실시예 6] RTX 독소의 주변세포질 및 외막 운반 단백질 tolC 유전자의 결실 돌연변이주 제조
RTX 계열 독소들의 주변세포질 및 외막 운반 단백질 유전자로 알려진(Bina, J.E., Mekalanos, J.J., Infect. Immun. 69:4681-4685, 2001) tolC는 본 연구진이 수행한 V. vulnificus 게놈프로젝트 과정에서 발견되었다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/micr.html). tolC 유전자 완전 결손 돌연변이 균주를 제조하기 위하여 tolC 유전자의 상부와 하부를 두 쌍의 프라이머(서열 31로 표시되는 PtolC-1, cgcgaaagcccgtgcggc; 서열 32로 표시되는 PtolC-2, tggaaaatg taatcgaagccacaaacgc 및 서열 33으로 표시되는 PtolC-3, gcttcgattacattttccattctcgccatg; 서열 34로 표시되는 PtolC-4, ctgaacacccacccgctgaaggat)를 사용하여 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭하였다. 프라이머 PtolC-1과 PtolC-2를 사용한 tolC 유전자 상부의 증폭과 PtolC-3과 PtolC-4를 사용한 tolC 하부의 증폭은 초기변성 95℃ 4분 후, 변성 94℃ 30초, 어닐링 70℃ 30초, 확장 72℃ 60초, 25회 반복한 후 마지막 72℃에서 10분 반응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응을 하였다. 이 때 PtolC-2와 PtolC-3의 앞부분의 9-10 염기서열이 서로 겹치도록 디자인(PtolC-2와 PtolC-3 프라이머에서 굵게 표시됨)하여 crossover PCR을 실시할 경우 tolC 구조 유전자 전부가 결손되도록 하였다. 즉, PtolC-1과 PtolC-2로 증폭된 DNA 조각과 PtolC-3와 PtolC-4로 증폭된 DNA 조각을 섞어주고, 이를 주형으로 하여 프라이머 PtolC-1과 PtolC-4로 위와 같은 조건에서 다시 중합효소연쇄반응을 하면 tolC 유전자 내부의 개시코돈과 종결코돈을 제외한 모든 DNA 조각이 결손된 DNA 조각을 얻을 수 있었다. 이렇게 증폭된 tolC 결손 DNA 조각을 PCR 2.1-TOPO cloning vecter(Invitrogen Co.)에 클로닝하였다. 이 재조합 플라스미드에서 tolC 유전자의 상하부가 포함된 DNA 조각을 제한효소 BamHI과 XbaI으로 잘라낸 후 BglII와 XbaI으로 자른 pDM4 플라스미드(Debra Milton, Department of Molecular Biology, Umea University, Sweden)에 클로닝하였다. 이렇게 제조된 재조합 플라스미드를 E. coli SM 10 λ pir에 일렉트로포레이션시켜 생성된 형질전환 균주를 V. vulnificus와 접합시켜 재조합 플라스미드가 전달되도록 하였다. V. vulnificus 안에서는 증식하지 못하는 pDM4의 tolC 결실 DNA 조각과 염색체의 자연형 DNA 조각 사이에 대립형질 상호교환(allelic exchange)에 의하여 결실이 유발된 돌연변이 V. vulnificus 균주는 PtolC-1과 PtolC-4 프라이머 짝을 이용한 중합효소연쇄 반응에 의하여 확인하였다. 이와 같이 제조된 돌연변이주를 CMM 2400으로 명명하였다.
[실시예 7] 각 균주의 배양 및 보관
대장균 균주들은 Luria Bertani 배지(Difco Co.)에, 비브리오 패혈증균은 heart infusion 배지(Difco Co.)에 배양하였다. 사용한 균주들은 배양 후 글리세롤을 50%되게 첨가하여 -80℃ 초저온 냉동고에서 보관하였다.
[시험예 1] 세포독성에 있어 비브리오 패혈증균과 숙주세포 접촉의 중요성 증명
'종래 기술의 문제점' 부분에서도 강조한 바와 같이, 기존에 분리된 단백질 형태로 투여하였을 경우 시험관내에서 세포에 독성을 나타낸다고 보고된 용혈독소와 금속단백분해효소 등의 외독소는 해당 유전자 각각 혹은 전부를 특이적으로 돌연변이 시켰을 경우에도 세포독성은 여전히 관찰되고, 마우스에 대한 LD50도 유의한 차이가 관찰되지 않는다. 이러한 현상은 용혈독소나 금속단백분해효소 말고도 중요한 세포독소가 존재하며, 그 세포독소가 마우스 치사력을 좌우하는 가장 중요한 독력인자로 작용할 가능성이 있음을 시사한다.
그리고 용혈독소나 금속단백분해효소는 배양 상청액으로 분비되기 때문에 만일 이 두 가지 외독소가 세포독성에 전적으로 관여한다면 숙주세포와 접촉하지 못하게 하더라도 세포독성이 관찰되어야 할 것이다. 이를 증명하기 위해 Transwell™ culture plate (Corning Costar Corp.)를 사용하여 실험하였다. 이 culture plate는 upper 및 lower chamber로 구성되어 있으면 이 둘은 직경 0.5 ㎛의 작은 구멍이 뚫린 polycarbonate membrane에 의하여 분리되어 있다. HeLa 세포주를 lower chamber에 배양하고, 세균은 upper chamber에 배양하여 서로 접촉하지 못하게 하였을 경우에는 37℃에서 2시간 이상 배양을 하여도 세포독성이 전혀 관찰되지 않았다. 이는 살아있는 비브리오 패혈증균과 동물세포를 동시에 배양할 때 관찰되는 세 포독성은 세균과 숙주세포의 접촉을 필요로 하는 새로운 세포독성 인자가 존재한다는 사실을 강력히 시사한다.
[시험예 2] RTX 결실 돌연변이가 세포독성에 미치는 영향
24-well culture plate에 HeLa 세포를 1.0x105 세포씩 분주하여 10% 우태혈청을 가한 DMEM 배지에서 하룻저녁 배양하였다. 그 후 우태혈청을 첨가하지 않은 DMEM 배지로 2차례 세척하고, 지수증식기에 있는 V. vulnificus를 우태혈청이 없는 DMEM으로 희석하여 HeLa 세포에 세균대 세포의 비율을 100으로 하여 90분 동안 배양한 후에 상청액에 유리된 lactate dehydrogenase (LDH)의 양을 CytoTox™ Non-Radioactive Cytotoxicity assay kit (Promega Co.)로 측정하여 세포독성을 비교한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 RTX 및 용혈독소(vvhA), 금속단백분해효소(vvpE) 유전자들의 돌연변이가 V. vulnificus의 세포독성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. RTX 결손 돌연변이에 의하여 세포독성은 유의하게 감소하였으며, 세포독성 결함은 자연형 rtxA 유전자를 함유하고 있는 플라스미드를 도입시켜주면 정상으로 회복되었다. 용혈독소 및 금속단백분해효소 유전자 이중 돌연변이 균주(vvhA/vvpE double mutant)(Kim, Y.R., Rhee, J.H., Biochem, Biophys. Res. Commun. 304:405-410, 2003)는 자연형 균주와 거의 유사하게 90분부터 세포독성을 나타내었다. RTX 결손 돌연변이 균주도 3시간이 지나고 나면 세포독성을 나타내었다. rtxA/vvpE 이중 돌 연변이 균주는 rtxA 단일 돌연변이 균주와 유의한 차이를 나타내지 않았다. 반면 rtxA/vvhA 이중 돌연변이 균주와 rtxA/vvhA/vvpE 삼중 돌연변이 균주는 6시간 이상이 지나도 전혀 세포독성을 나타내지 않았다. 이상의 결과는 RTX가 가장 강력한 세포독소이고, RTX 결손 돌연변이 균주에서 관찰되는 지연성 세포독성에는 용혈독소가 관여한다는 사실을 보여준다. 또한, 약독화 생균백신 균주 개발에 있어 만일 rtxA 단일 돌연변이주가 지연형 세포독성 등의 부작용을 나타낼 경우 추가적으로 용혈독소와 금속단백분해효소 유전자를 돌연변이 시킴으로써 안전성을 확보할 수 있을 것임을 강력히 시사한다.
[시험예 3] TolC 결실 돌연변이가 세포독성에 미치는 영향
RTX 독소의 주변세포질 및 외막 운반 단백질로 추정되는 (Bina, J.E., Mekalanos, J.J., Infect. Immun. 69:4681-4685, 2001) tolC 유전자를 제거한 돌연변이 균주의 세포독성 역시 RTX 결실 돌연변이 균주와 같은 방법으로 검사하였다. 도 3은 세균과 HeLa 세포를 90분 동안 작용시키고 TolC 돌연변이 균주와 RTX 돌연변이 균주의 세포독성을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다. TolC 돌연변이 균주 역시 90분에 세포독성을 거의 나타내지 않았다.
[시험예 4] RTX 결실 돌연변이가 마우스 치사력에 미치는 영향 검사
SPF(specific pathogen free) 8주령과 생후 5일 수유 CD-1 마우스에 각각 복강내와 위장내로 10배 순차 희석한 RTX 결실 돌연변이 균주와 자연형 균주를 각각 투여하고 치사여부를 48시간동안 관찰하였다. 그 결과 RTX 결실 돌연변이 균주의 위장내 LD50는 7.0x107 마리로서 자연형 균주의 5.0x105 보다 치사력이 140배 감소한 것으로 나타났다. 복강내 LD50는 5.0x107 마리로서 자연형 균주의 LD50 5.0x105 마리 보다 치사력이 100배 감소한 것으로 나타났다(표 2).
[표 2]
RTX 결손 돌연변이가 V. vulnificus의 마우스에 대한 LD50에 미치는 영향
균주 |
유전형 |
위장내 투여 LD50
(증가 배수) |
복강내 투여 LD50
(증가 배수) |
MO6 24/O |
V. vulnificus 자연형, 임상분리균주 |
5.0 X 105
|
5.0 X 105
|
CMM740 |
rtxA 유전자에 결손 돌연변이가 있는 MO6 24/O |
7.0 X 107
(140) |
5.0 X 107
(100) |
[시험예 5] TolC 결실 돌연변이가 마우스 치사력에 미치는 영향 검사
SPF(specific pathogen free) 8주령과 생후 5일 수유 CD-1 마우스에 각각 복강내로 10배 순차 희석한 RTX 결실 돌연변이 균주와 자연형 균주를 각각 투여하고 치사여부를 48시간동안 관찰하였다. 그 결과 RTX 결실 돌연변이 균주의 위장내 LD50는 5.5x107 마리로서 자연형 균주의 5.5x105 보다 치사력이 100배 감소한 것으로 나타났다. 이 마우스 치사력 검사 결과와 시험예 3의 세포독성 검사 결과는 RTX 독소의 생성뿐 만 아니라 세포 밖으로의 분비를 억제하여도 비브리오 패혈증균의 독력이 극적으로 감소한다는 사실을 보여준다.
[표 3]
TolC 결손 돌연변이가 V. vulnificus의 마우스에 대한 LD50에 미치는 영향
균주 |
유전형 |
복강내 투여 LD50
(증가 배수) |
MO6 24/O |
V. vulnificus 자연형, 임상분리균주 |
5.5 X 105
|
CMM2400 |
tolC 유전자에 결손 돌연변이가 있는 MO6 24/O |
5.5 X 107
(100) |
[시험예 6] RTX 결손 돌연변이 균주의 백신으로서의 효능 검사
6주령 BALB/c 마우스를 두 그룹으로 나누어 대조군은 인산완충식염수로 실험군은 인산완충식염수로 부유한 각각 5x106 마리와 1x107 의 RTX 결손 돌연변이 균주를 2주 간격으로 2회 비강내 예방접종을 실시하였다. 비강내 예방접종을 위해서는 2% ketamine과 0.2% xylazine을 0.1㎖ 복강내 주사하여 마취시킨 후 균부유액이나 인산완충식염수를 마우스당 20㎕씩 비강 내에 점적하였다. 두 번째 예방접종이 끝난 1주일 후에 V. vulnificus에 대한 감수성을 높이기 위하여 마우스당 600㎍씩의 구연산철 암모늄(ferric ammonium citrate; Sigma Co.) 복강내 주사하고, 그 후 30분에 마우스당 자연형 균주 1.0x1010 마리씩을 위장내로 투여하고 72시간 동안 관찰한 결과를 표 4에 나타내었다. 표 4를 살펴보면 대조군 마우스 4마리는 24시간 이내에 완전히 사망하였으나, RTX 결손 돌연변이 균주로 비강내 예방접종한 마우스 6마리는 모두 생존하였으며, 거의 정상 마우스와 다름없는 외형을 나타내었다.
[표 4]
RTX 결손 돌연변이 균주의 마우스 비강내 예방접종에 의한 위장내 V. vulnificus 감염에 대한 방어효과
비강내 예방접종 물질 |
Challenge dose |
마우스 생존수/ 감염수 |
인산완충식염수 (음성대조) |
1.0 X 1010
|
0/4 |
CMM740 (rtxA 돌연변이 균주) 1차: 5x106/마우스 2차: 1x107/마우스 |
1.0 X 1010
|
6/6 |