JP2000509246A

JP2000509246A - 新規化合物

Info

Publication number: JP2000509246A
Application number: JP9529499A
Authority: JP
Inventors: ブラック，マイケル・テレンス; バーナム，マーティン・カール・ラッセル; ホッジソン，ジョン・エドワード; ノールズ，デイビッド・ジャスティン・チャールズ; ニコラス，リチャード・オークリー; プラット，ジュリー・エム; レイチャード，レイモンド・ウィンフィールド; ローゼンバーグ，マーティン; ウォード，ジュディス・エム
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1996-02-20
Filing date: 1997-02-19
Publication date: 2000-07-25
Also published as: US6248556B1; WO1997030070A1; EP0885297A4; EP0885297A1; JP2000506385A; EP0886646A1; WO1997030149A1; US6465621B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、新たに同定されたスタフィロコッカスのポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびに、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造、および、該ポリヌクレオチドでトランスフオームされた組換え宿主細胞に関する。本発明はまた、かかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの生合成または作用の阻害、ならびに、治療におけるかかる阻害剤の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】新規化合物発明の属する技術分野本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、特にスタフィロコッカスのポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびに、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造、および、該ポリヌクレオチドでトランスフォームされた組換え宿主細胞に関する。本発明はまた、かかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの生合成または作用の活性化または阻害、ならびに、治療におけるかかる活性化剤または阻害剤の使用に関する。従来の技術ストレプトコッカス属（Streptococci）は医学的に重要な微生物属を形成している。これらは二種の疾患、浸襲性および毒素原性の疾患を引き起こすことが知られる。浸襲性感染は、一般に、皮膚表面および深部組織の両方に作用する潰瘍形成により特徴付けられる。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus、エス・アウレウス、S．aureus）は癌患者における菌血症を引き起こす第二の主要原因である。骨髄炎、敗血症性関節炎、敗血症性血栓静脈炎および急性細菌性心内膜炎もまた、比較的よく見られる。スタフィロコッカスの毒素原的特性から生じる少なくとも三種の臨床的状態がある。これらの疾患の発現は、組織浸襲および菌血症とは対照的に、外毒素の作用の結果である。これらの状態には：スタフィロコッカス食中毒、熱傷様皮膚症候群およびトキシンショック症候群が含まれる。例えば、コアグラーゼ、溶血素、ロイコシジン、エキソおよびエンテロトキシンなどの病原性と関連する特定のストレプトコッカスのタンパク質が同定されているが、哺乳動物宿主における感染および疾患の進行の間のかかる遺伝子の一時的発現については、ほとんど知られていない。感染の異なる段階、特に、感染が確立する際に細菌が発現する可能性のある遺伝子のセットを見出すことにより、発病を防止できる新規な抗菌剤のスクリーニングおよび解析のための重要な情報が提供される。より十分な公知のタンパク質の理解の提供に加え、かかるアプローチは、以前に認識されていない標的を同定するであろう。発明の概要本発明は、本明細書で示されるアミノ酸配列、またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含むと解析された、スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９由来の新規タンパク質を提供する。本発明はまた、配列番号１ないし配列番号６２３、またはこれらの配列番号（配列番号１ないし６２３）のいずれかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、配列番号１ないし配列番号６２３のアミノ酸配列の一つをコードする単離核酸（本明細書においてまた「ポリヌクレオチド」という）、または配列番号６２４ないし１１６５、またはこれらの配列番号（配列番号６２４ないし１１６５）のいずれかの組み合わせからなる群から選択される単離ポリヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれらとハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列を提供する。本発明の他の態様によれば、かかるポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が提供される。特に、本発明は、本明細書において示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、本明細書において記載するプロセスにおいてＰＣＲプライマーとして作用し、本明細書で同定した遺伝子、特にスタフィロコッカス・アウレウスの遺伝子が、全体または部分的に、感染組織において発現しているかどうかを調べることのできる、本明細書において示す配列由来の新規オリゴヌクレオチドに関する。そのような配列はまた、病原体が達成した感染の段階および感染のタイプの診断においても有用性のあることが認識される。このように同定されたタンパク質は、抗細菌性化合物を同定するために設計されたスクリーンにおいて標的として有用である。発明の詳説本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列、特にＤＮＡ配列を、各々、抗細菌化合物の発見および開発に用いることができる。配列の各々は、読み枠（ＯＲＦ）または推定遺伝子を、適当な開始および終止コドンとともに含むので、コードされるタンパク質を、発現されたら、薬剤などの抗微生物化合物のスクリーニングの標的として用いることができる。加えて、コードされるタンパク質のアミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列を、アンチセンスまたはリボザイム配列を構築し、対象のコーディング配列の発現を制御するのに用いることができる。さらに、本明細書において開示される多くの配列はまた、コーディング配列から上流および下流の領域を提供する。これらの配列は、細菌性遺伝子発現の制御の調節エレメントの源として有用である。かかる配列を、都合よく、制限酵素作用により単離するか、または化学的に合成し、例えば、プロモーター同定株中に導入する。これらの株は、制限部位から下流に位置するレポーター構造遺伝子配列を含み、活性なプロモーターが挿入されると、レポーター遺伝子が発現される。各々の配列を上記のように用いることができるが、本発明はまた、特に有用な標的遺伝子を同定するためのいくつかの手段を提供する。これらのアプローチの第一は、関連する生物に対合する配列のための適当なデータベースの探索を必要とする。かくして、相同性が存在すれば、この遺伝子のスタフィロコッカス様型は、類似の役割を担うであろう。例えば、他の生物における細胞表面タンパク質に対する相同体であると同定されたスタフィロコッカスのタンパク質は、ワクチン候補として有用であろう。かかる相同体が本明細書において開示される配列について同定されており、それらはコーディング配列に沿って報告されている。最近、特に、実験室条件および宿主条件下での生存性に適用した場合に、細菌における一時的な遺伝子発現を評価するための技術が利用できるようになっている。それ自体生存に必須であるかまたは感染の確立および／もしくは維持に必須である遺伝子を同定するために、多くの方法を用いることができる。これらの方法の一つにより未知のＯＲＦを同定することにより、その機能についてのさらなる情報が得られ、かかるＯＲＦをスクリーニングの標的としてさらに開発するための選別が可能となる。簡単には、これらの研究には、例えば以下のものがある：１）シグナチャータグ化突然変異法（Signature Tagged Mutagenesis：STM）この技法は、Henselら、Science 269:400-403（1995）に記載されており、背景技術とする目的でその内容を出典明示により本明細書の一部とする。シグナチャータグ化突然変異誘発は、所定感染モデルにおける感染の確立／維持に必要な遺伝子を同定する。この技法は、種々の手段（例えばトランスポゾン）により、標的生物にランダムに突然変異を誘発し、独特なＤＮＡ配列タグを突然変異部位に非常に近接して挿入することに基づく。細菌性突然変異体および感染宿主から回収した細菌の混合集団由来のタグは、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーション分析により検出される。毒性を減じた突然変異体は、感染宿主から回収した細菌のプール由来のタグの欠如により表される。２）インビボ発現法（In Vivo Expression Technology：IVET）この技術はCamilliら、Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA．91，2634-2638（1994 ）に記載されており、各々の内容を背景技術とする目的で出典明示により本明細書の一部とする。IVETは、実験培養と比較した場合、感染において重要な役割を有する、感染中にアップレギュレーションする遺伝子を同定する。この技法により同定されるＯＲＦは感染の確立/維持に重要な役割を有する。この技法では、標的生物のランダムな染色体フラグメントは、プラスミドベクターのプロモーター不含リコンビナーゼ遺伝子の上流でクローン化される。この構築物を、レソルバーゼ部位が隣接している抗生物質耐性遺伝子を有する標的性物中に導入する。抗生物質の存在下での生育により、レコンビナーゼ遺伝子の転写を支持しうるプラスミドベクター中にクローンされたそれらのフラグメントが集団から除去され、それゆえ抗生物質耐性の喪失が起こる。抵抗性プールを宿主に導入し、感染後の種々の時間に細菌を回収し、抗生物質耐性の存在を評価できる。各々の抗生物質感受性細菌が担持する染色体フラグメントは、感染中に正常なアップレギュレーションをうけるプロモーターまたは遺伝子部分を担持するはずである。組換え酵素遺伝子の上流の配列決定により、アップレギュレーションされた遺伝子を同定できる。３）引き算ディスプレイこの技法は、その内容を背景技術とする目的で出典明示により本明細書の一部とする、Chuangら、J．Bacteriol．175，2026-2036（1993）に記載されている。この方法はランダムプライムＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡの存在を同定することにより、生体において発現する遺伝子を同定する。感染前および感染後のプロフィールを比較することにより、感染中にアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされる遺伝子を同定でき、ＲＴ−ＰＣＲ生成物を配列決定し、未知の「ＯＲＦ」に適合させることができる。４）トランスポゾン突然変異誘発による条件致死変異体の発生この技法は、その内容を背景技術とする目的で出典明示により本明細書の一部とする、de Lorenzo，V.ら、Gene 123，17-24(1993)；Neuwald，A．F．ら、Gene 125，69-73(1993)およびTakiff，H．E．ら、J．Bacteriol．174，1544-1553(19 92)に記載されており、発現が細胞の生存に必須である遺伝子を同定する。この技法では、一方向または両方向でトランスポゾンから外側へ転写する、調節可能なプロモーターを担持するトランスポゾンを生じる。これらのトランスポゾンを標的生物にランダムに挿入し、続いてプロモーター活性のインデューサーの存在下で挿入突然変異体を単離すると、発現が細胞の生存に必須である遺伝子のコーディング領域とプロモーターとを分離するインサートが回収されることが確認される。このインサートは生存できないので、引き続いてインデューサー不含のレプリカ平板法でかかるインサートを同定する。トランスポゾンに隣接する領域の配列決定により挿入部位を同定し、分断された遺伝子を同定する。インデューサー不存在下での成長中の細胞の過程/形態の変化を精密にモニターし、遺伝子の可能な機能に関する情報を得る。このようなモニター観察には、フローサイトメトリー(細胞分割、溶解、酸化還元能、ＤＮＡ複製)、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、ペプチドグリカンへの放射性化学的標識前駆体の取り込み、既知の細胞性ストレスに応答するリポーター酵素遺伝子融合物のモニター等がある。５）化学的突然変異法による条件致死突然変異体の発生この技法は、出典明示により背景技術目的でその内容を本明細書の一部とする、Beckwith，J．Methods in Enzymology 204，3-18（1991）に記載されている。この技法では、標的生物のランダム化学的突然変異を誘発し、生理学的温度（許容温度）とは異なる温度で増殖させ、続いてレプリカ平板法を行い、異なる温度（例えばｔｓ同定のためには４２℃、ｃｓ同定のためには２５℃）で成長させ、その時成長できなかった単離物（条件付き突然変異体）を同定する。前記のように、非許容温度での増殖における変化を精密にモニターし、突然変異遺伝子の機能に関する情報を得る。標的生物からのライブラリーにより条件致死突然変異を相補し、および相補遺伝子を配列決定することにより、未知のＯＲＦと適合させることができる。これらの技法の各々は、特定の適用に応じて有利であったり、不利であったりする。当業者は意図する特定の使用目的に最も関連する研究法を選択する。例えば、いくつかの遺伝子は感染に必須であると認識されているが、実際には感染の開始にのみ必要であり、そのためそれらの産物は、確立された慢性の感染の治療のために開発された抗細菌物質にとってはそれほど魅力的な標的ではない。さらに別の変形において、感染組織由来の細菌性ＲＮＡ調製物のノザンブロットにおいて、細菌性リボソームＲＮＡに特異的にアニールする適当に標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いる。ハイブリダイゼーション標的としてのさらに豊富なリボソームＲＮＡの使用は、感染組織由来のＲＴ−ＰＣＲに適当な大きさの細菌性ＲＮＡを精製するプロトコールの最適化を大変促進する。これらの技法の使用は、本発明のＯＲＦに用いると、感染の間に発現する細菌性タンパク質、抗細菌性治療において有用性を有する阻害剤の同定を可能とする。エス・アウレウスＷＣＵＨ２９を、１９９５年９月１１日に、National Colle ctions of Industrial and Marine Bacteria Ltd．(ＮＣＩＭＢ)、Aberdeen，Sc otlandに、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１として寄託した。本明細書において開示するヌクレオチド配列は、当該分野にて公知の合成化学技法により得ることができ、または、本明細書において開示する特定の配列から構築されたプローブでＤＮＡ調製物をプロービングしてエス・アウレウスＷＣＵＨ２９から得ることもできる。別法として、開示された配列由来のオリゴヌクレオチドを、細菌性ゲノム源からの配列のＰＣＲ−ベースのクローニングのプロセスにおいてＰＣＲプライマーとして用いることができる。そのような配列はまた、病原体が達成した感染の段階およびタイプの診断においても有用性のあることが認識される。本明細書で示すＤＮＡ配列を用いてタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得るには、典型的には、イー・コリまたは他の適当な宿主中のエス・アウレウスＷＣＵＨ２９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーを、部分配列由来の放射標識したオリゴヌクレオチド、好ましくは1７量体またはそれ以上の長さのオリゴヌクレオチドでプローブする。ついで、該プローブと同じＤＮＡを有するクローンを高いストリンジェントな洗浄を使用して区別できる。該オリジナル配列から設計された配列決定プライマーで同定された個々のクローンを配列決定することにより、該配列を両方の方向に伸長し、完全長配列を決定することが可能である。都合よくは、プラスミド・クローンから調製された変性二本鎖ＤＮＡを用いてかかる配列決定を行う。適当な技法は、Maniatis,T.，Fritsch,E.F.およびS ambrook，J．in MOLECULAR CLONING，A Laboratory Manual，2nd edition，1989 ，Cold Spring Harbor Laboratory（Screening By Hybridization 1.90およびSe quencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70を参照のこと）により記載されている。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であってよく、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、二本鎖でも一本鎖であってもよく、一本鎖の場合には、コーディング鎖でも非コーディング（アンチ−センス）鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコーディング配列は、示されるコーディング配列と同一であるか、または、遺伝子コードの重剰性または縮重の結果として、同じポリペプチドをコードする異なるコーディング配列であってもよい。本発明は、本明細書に示される推定アミノ酸配列により特徴付けられるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする上記のポリヌクレオチドの変異体を含む。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に起こる対立遺伝子変異体でも、または、ポリヌクレオチドの非天然に起こる変異体であってもよい。核酸塩基に関する標準記号Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕに加えて、また「Ｎ」なる語を、本発明の特定のポリヌクレオチドを記載するのに用いることができる。「Ｎ」は、隣接するヌクレオチド位置と一緒になって作用する場合、正確な読み枠を読み取る場合で、Ｎがそのような読み枠において未成熟終止コドンを形成する効果を有する塩基でないことが好ましい場合を除き、４種のＤＮＡまたはＲＮＡ塩基のいずれかがＤＮＡまたはＲＮＡ配列のその指定位置にあることを意味する。よって、本発明は、本明細書に示される推定アミノ酸配列により特徴付けられる同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに、ポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする変異体である該ポリヌクレオチドの変異体が含まれる。該ヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体、および、付加または挿入変異体が含まれる。ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるＤＮＡ配列により特徴付けられるコーディング配列の天然に起こる対立遺伝子変異体であるコーディング配列を有することができる。当業者に知られるように、対立遺伝子変異体は、一またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有する、コードされるポリペプチドの機能を本可的に変えない、ポリヌクレオチドの別の形態である。成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドに対するコーディング配列のみを含むか、または、成熟ポリペプチドに対するコーディング配列、および、リーダーまたは分泌性配列またはプロタンパク質配列などの追加のコーディング配列を含んでいてもよい。よって、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、ポリペプチドに対するコーディング配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに、追加のコーディングおよび／または非コーディング配列を含むポリヌクレオチドを包含する。それゆえ、本発明は、成熟ポリペプチドに対するコーディング配列が、同じ読み枠中で、例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌性配列として機能するリーダー配列などの、発現および宿主細胞からのポリペプチドの分泌の助けとなるポリヌクレオチド配列と、融合していてもよい。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、宿主細胞により開裂されポリペプチドの成熟形を形成する、リーダー配列を有していてもよい。ポリヌクレオチドは、また、成熟タンパク質に加え、さらなる５’アミノ酸残基からなるプロタンパク質をコードしていてもよい。プロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であり、タンパク質の不活性形態である。プロ配列が開裂されると、活性な成熟タンパク質が残る。よって、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク質、または、プロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有するタンパク質をコードしていてもよい。さらに、本明細書で提供されるアミノ酸配列はＮＨ₂−末端においてメチオニン残基を示す。しかしながら、ペプチドの翻訳後修飾の間に、この残基が除去され得ることが認識される。したがって、本発明は、本明細書で開示される各々のタンパク質のメチオニン含有およびメチオニンのないアミノ末端変異体の両方の使用を考慮する。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子の５’または３’末端のいずれかにおいて、本発明のポリペプチドの精製を可能にするためのマーカー配列とフレーム中で融合したコーディング配列を有していてもよい。マーカー配列は、細菌宿主の場合に、マーカーに融合したポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥシリーズのベクター(Qiagen,Inc.より商業的に供給される)により提供されるヘキサ−ヒスチジンタグであってもよい。さらに、本発明は、配列間に少なくとも５０％または６０％、好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％の同一性がある場合に、本明細書において前記した配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、本明細書において前記したポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするスタフィロコッカスのポリヌクレオチドに関する。本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」なる用語は、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。好ましい具体例において、本明細書において前記したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本明細書に示す推定アミノ酸配列により特徴付けられるポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。本明細書中でいう寄託は、特許手続きの目的で微生物寄託の国際承認に関するブタペスト条約の条件下で保持される。これらの寄託株は当業者の便宜のためにのみ提供され、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条の下に要求されることを承認するものではない。寄託材料に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびに、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、出典明示により本明細書中に包含するものであり、本明細書における配列の記載とのいずれの不一致においても支配的である。寄託材料を製造、使用または販売するには、ライセンスが必要であるが、そのようなライセンスはここで付与されるものではない。本明細書の推定アミノ酸配列により特徴付けられるポリペプチドについて述べる場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」なる用語は、該ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。それゆえ、アナログは、活性な成熟ポリペプチドを生成するためのプロタンパク質部分の開裂より、活性化することが可能なプロタンパク質を包含する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは、組換えポリペプチドであってもよい。本明細書の推定アミノ酸配列により特徴付けられるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、(ｉ)保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）により一またはそれ以上のアミノ酸残基が置換され、該置換アミノ酸残基が、遺伝コードによりコードされていてもされていなくてもよいもの、(ii)一またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、(iii)ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)などの、他の化合物と融合しているもの、または、(iv)付加アミノ酸が、リーダーまたは分泌性配列、または、ポリペプチドの精製を可能にする配列、または、プロタンパク質配列などのポリペプチドと融合しているもの、であってもよい。該フラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示から当業者の範囲内であると考えられる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離形態で提供され、好ましくは、均一に精製される。「単離された」なる用語は、物質がその本来的な環境（すなわち、天然物の場合、天然の環境）から除去されることを意味する。例えば、生存する動物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されたものではないが、その天然状態で共存する物質のいくらかまたはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されたものである。該ポリヌクレオチドは、ベクターの部分であることができ、および／または、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、構成成分の一部分であることができ、さらに、かかるベクターまたは構成成分が天然環境の一部ではないという点において、単離されたものである。本発明は、また、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、組換え技法による本発明のポリペプチドの製造に関する。本発明のさらに別の態様によれば、それゆえ、宿主中において該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させ、発現された生成物を回収することによる組換え方法により、本発明のポリペプチドを製造する方法を提供する。別法として、本発明のポリペプチドを通常のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。宿主細胞を、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺伝的に操作する(トランスダクション、トランスフォーメーション、トランスフェクション)。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージなどの形態であることができる。操作された宿主細胞を、プロモーターの活性化、トランスフォーマントの選択または遺伝子の増幅に適当なように修飾された通常の栄養培地中で培養できる。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現の選択された宿主細胞においてすでに用いられたものであり、当業者に明らかなものであろう。適当な発現べクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせ由来のベクターなどが含まれる。しかしながら、それが宿主中で複製可能で生存可能である限り、いかなる他のベクターをも用いることができる。適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクター中に挿入できる。一般的に、ＤＮＡ配列を、技術分野において公知の方法により、制限エンドヌクレアーゼ部位（複数でも可）中に挿入する。発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適当な発現制御配列(複数でも可)(プロモーター)に作動的に結合しており、ｍＲＮＡ合成を調節する。該プロモーターの代表例として、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、イー・コリｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰ_Lプロモーターおよび真核または原核細胞またはそれらのウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが知られる他のプロモーターが挙げられる。発現ベクターは、また、翻訳開始および転写終止のためのリボソーム結合部位を含む。ベクターは、また、発現増幅のために適当な配列を包含してもよい。加えて、発現ベクターは、好ましくは、一またはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含み、真核細胞培養のためのジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマイシン耐性など、または、イー・コリにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性などの、トランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型の特性を提供する。所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列がこの発現構築物を含むベクターによりトランスフォームされた宿主細胞中でＲＮＡ中に転写されるように、遺伝子をプロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現のため）および所望によりオペレーター(本明細書において、”制御(control)”エレメントとしてまとめて称する)の制御下に置くことができる。コーディング配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでいても含まなくてもよい。本発明のポリペプチドを、例えば、イー・コリｔａｃプロモーターまたはプロテインＡ遺伝子（ｓｐａ）プロモーターおよびシグナル配列を用いて、発現させることができる。リーダー配列を細菌宿主により翻訳後プロセシングで除去することができる。例えば、米国特許第４，４３１，７３９；４，４５２，４３７；４，３３８，３９７号参照。プロモーター領域を選択マーカーを有するＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは他のベクターを用いて所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特に挙げられる細菌プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびtｒｐが含まれる。真核プロモーターには、レトロウイルス由来のＣＭＶ即時初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、ＬＴＲ、および、マウスメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者の通常のレベル内で十分可能である。制御配列に加えて、宿主細胞の生育に関連するタンパク質配列の発現の制御を可能にする調節配列を添加することが望ましい。調節配列は、当業者に知られるものであり、例には、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答してターンオンまたはターンオフする遺伝子の発現を引き起こすものが含まれる。調節エレメントの他の種類は、ベクター中、例えば、エンハンサー配列中に存在していてもよい。発現ベクターは、制御配列に関してコーディング配列の位置および方向がコーディング配列が制御配列の「制御」下に転写されるよう（すなわち、制御配列でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列を転写する）に、特定のコーディング配列が適当な調節配列とともにベクター中に位置するように、構築される。コーディング配列の修飾がこの目的を達成するために所望される。例えば、いくらかの場合において、適当な方向で制御配列に結合できるように；すなわち、読み枠を維持するように、配列を修飾する必要があるであろう。制御配列および他の調節配列を、前記したクローニングベクターなどのベクター中に挿入する前に、コーディング配列に連結することができる。別法として、コーディング配列をすでに制御配列および適当な制限部位を有する発現ベクター中に直接クローニングすることができる。一般的に、組換え発現ベクターは、複製開始点および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能にする選択マーカー(例えば、イー・コリのアンピシリン耐性遺伝子およびエス・セレビシアエ（S．cerevisiae）ＴＲＰ１遺伝子)、および下流構造配列の転写を調節するための高度に発現される遺伝子由来のプロモーターを含む。異種構造配列は、翻訳開始および終止配列、および好ましくは、ペリプラスム間隙または細胞外培地中に翻訳されたタンパク質を直接分泌できるようにするリーダー配列とともに適当な配置として組み込まれる。所望により、異種配列は、所望の特徴、例えば、安定性または発現組換え産物の簡単な精製、を与えるＮ−末端同定ペプチドを含む、融合タンパク質をコードすることができる。本明細書において前記したような適当なＤＮＡ配列ならびに適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを、宿主がタンパク質を発現するように、適当な宿主をトランスフォームするのに用いることができる。より詳細には、本発明はまた、上で広く述べたような一またはそれ以上の配列を含む組換え構築物を含有する。構築物は、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されたプラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを含む。この具体例の好ましい態様において、構築物はさらに例えば、該配列に作動可能に連結したプロモーターを含む調節配列を含む。多くの適当なベクターおよびプロモータが当業者において知られており、商業的に利用可能である。以下のベクターを例として示す。細菌系：ｐＥＴ−３ベクター(Stratagene)、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９(Qiagen)；ｐｂｓ、ｐＤ１０、ファージスクリプト(Phagescri pt)、ｐｓｉＸ１７４、ピーブルースクリプト（pbluescript）ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ(Stratagene)；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５ (Pharmacia)。真核系：ｐＢｌｕｅＢａｃIII(Invitrogen)、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ(Stratagene)、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ(Pharmacia)。しかしながら、宿主中で複製可能であり生存可能である限り、いかなる他のプラスミドまたはベクターをも用いることができる。クローニング用の組換えＤＮＡベクターおよびそれらでトランスフォームされる宿主細胞の例には、バクテリオファージ１(イー・コリ)、ｐＢＲ３２２(イー・コリ)、ｐＡＣＹＣ１７７(イー・コリ)、ｐＫＴ２３０(グラム−陰性細菌)、ｐＧＶ１１０６(グラム−陰性細菌)、ｐＬＡＦＲ１(グラム−陰性細菌)、ｐＭＥ２９０(非イー・コリグラム−陰性細菌)、ｐＨＶ１４(イー・コリおよびバシラス・サチリス)、ｐＢＤ９(バシラス)、ｐＩＪ６１(ストレプトマイセス)、ｐＵＣ６(ストレプトマイヤス)、ＹＩｐ５(サッカロマイセス)、バキュロウイルス昆虫細胞系、ＹＣｐ１９(サッカロマイセス)。一般には、"DNA Cloning":Vols.Ｉ& II，Glover et al．ed．IRL Press Oxford(1985)(1987)および;T．Maniatis et al．"Molecular Cloning"Cold Spring Harbor Laboratory(1982)を参照のこと。ある場合には、宿主生物からポリペプチドの分泌を引き起こし、ついで、分泌シグナルの開裂を引き起こす、付加配列が所望される。ポリペプチドは、宿主細胞において適当なプロモーターの制御下に発現されうる。また、細胞非存在転写システムを用いて、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いて該タンパク質を製造することもできる。原核および真核宿主で用いられる適当なクローニングおよび発現ベクターは、出典明示によりその開示を本発明に包含する、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)により記載されている。適当な宿主株のトランスフォーメーションおよび宿主細胞の適当な細胞密度への生育に続き、選択的プロモーターを適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により誘導させ、細胞をさらなる期間培養する。典型的には細胞を遠心により収集し、物理的または化学的手段により破砕し、得られる粗抽出物をさらなる精製のために保持する。タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含むいかなる簡便な方法によっても破砕することができ、該方法は、当業者において周知である。選択した発現系および宿主に応じ、前記した発現ベクターでトランスフォームされた宿主細胞を対象のポリペプチドが発現される条件下で生育させることにより、本発明のポリペプチドを製造できる。ついで、ポリペプチドを宿主細胞から単離し、精製する。発現系がポリペプチドを生育培地中に分泌する場合、ポリペプチドを培地から直接精製することができる。ポリペプチドが分泌されない場合、細胞溶解物から単離するかまたは細胞膜フラクションから回収する。ポリペプチドが細胞表面上に位置する場合、細胞全体または単離膜を所望の遺伝子産物の解析可能源として用いることができる。イー・コリなどの細菌宿主において発現されたポリペプチドは、封入体からの単離および再生が必要であろう。成熟タンパク質がきわめて疎水性な領域を有しており過剰発現の産物を不溶性とする場合、疎水性領域が削除された末端切断されたタンパク質を発現することが所望される。適当な生育条件および回収方法の選択は、当業者の技術の範囲内である。ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを包含する方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製できる。必要に応じ、タンパク質再生工程を、成熟タンパク質の構造を完全なものとするために用いることができる。最終的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に用いることができる。組換え生成方法において用いた宿主に応じ、本発明のポリペプチドはグリコシル化されるかまたはグリコシル化されていなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を包含してもよい。「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ複製の自律ユニットとして機能する、すなわち、それ自体の制御下で複製可能な、遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。「ベクター」は、付随するセグメントの複製を引き起こすように他のＤＮＡセグメントが付随する、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。「二本鎖ＤＮＡ分子」は、弛緩型および超らせん型の両方の二本鎖ヘリックスにおけるデオキシリボヌクレオチド（塩基アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）のポリマー形態を意味する。この用語は、分子の一次元および二次元構造を意味するのみであり、特定の三次元構造を限定するものではない。それゆえ、この用語は、とりわけ、直鎖状ＤＮＡ分子(例えば、制限フラグメント)、ウイルス、プラスミドおよび染色体に見られる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する場合、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同性のある配列を有する鎖）にそって５’から３’方向にある配列のみを記載する慣例に従って明細書中に記載されるものである。特定のタンパク質の「コーディング配列」または特定のタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」のＤＮＡは、適当な調節配列の制御下に置かれると、転写され、タンパク質に翻訳されるＤＮＡ配列である。「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼと結合でき、下流（３’ 方向）コーディング配列の転写を開始できるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的では、プロモーター配列は、コーディング配列の翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧ、ＧＴＧ）により３’末端で境界をひき、上流（５’方向）にのび、バックグラウンドよりも上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な塩基またはエレメントの最小数を含む。プロモーター配列中に、転写開始部位(通常、ヌクレアーゼＳ１でマッピングにより定義される)、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。真核プロモーターは、しばしば、いつもでなないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核プロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加え、シャイン−ダルガノ配列を含む。ＤＮＡ「制御配列」は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニレーションシグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサー、および宿主細胞中でコーディング配列の発現（すなわち、転写および翻訳）を提供するようなものを、ひとまとめにして意味する。制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、コーディング配列をｍＲＮＡに転写し、ついでコーディング配列にコードされるポリペプチドに翻訳する時、細胞中でコーディング配列の「発現を制御」する。「宿主細胞」は、トランスフォームまたはトランスフェクトされた細胞であるか、または、外来ＤＮＡ配列によりトランスフォーメーションまたはトランスフェクション可能な細胞である。該外来ＤＮＡが細胞膜中に導入されている時、細胞は外来ＤＮＡにより「トランスフォーム」されている。外来ＤＮＡは、染色体ＤＮＡ中に組み込まれ（共有結合して）細胞のゲノムを構成していてもよく、していないくてもよい。例えば、原核細胞および酵母では、外来ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソームエレメントとして保持され得る。真核細胞についてみると、安定にトランスフォームまたはトランスフェクトされた細胞は、染色体複製により娘細胞に遺伝するように、外来ＤＮＡが染色体中に組み込まれているものである。この安定性は、細胞系、または、外来ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなるクローンを確立する、真核細胞の能力により示される。「クローン」は、単一細胞または有糸分裂による共通の祖先由来の細胞の集団である。「細胞系」は、多世代にわたりインビトロで安定に生育できる一次細胞のクローンである。ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、天然の他の分子と関連して見出されない、他のＤＮＡ分子中または他のＤＮＡ分子に結合する、ＤＮＡの同定可能なセグメントである。本発明のさらに別の態様によれば、例えば、抗細菌剤またはワクチンなどの治療的または予防的目的のための本発明のポリペプチドの使用が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、治療的または予防的目的、特に、遺伝学的免疫化における本発明のポリペプチドの使用が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、抗細菌剤として有用な、かかるポリペプチドの阻害剤が提供される。特に、かかるポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明の他の態様は、上記の本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻害剤および医薬上許容される担体を含む医薬組成物である。本発明の特定の態様は、抗細菌剤としての本発明の阻害剤の使用を提供する。本発明は、さらに、かかる使用のための医薬の製造に関する。ポリペプチドを宿主を免疫化するための抗原として用い、抗細菌作用を有する特異的抗体を生成させるのに用いてもよい。ポリペプチドまたはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生成する免疫原として用いることができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であることができる。抗体なる用語には、キメラ、一本鎖およびヒト化または類似化抗体、ならびにＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で知られる様々な方法をかかる抗体またはフラグメントの製造に用いることができる。発明の配列に対応するポリペプチドに対して得られる抗体は、ポリペプチドを、動物に直接注射するかまたはポリペプチドを動物、好ましくはヒト以外の動物に投与することにより得ることができる。このようにして得られた抗体はポリペプチドそのものと結合する。この方法ではポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列であっても元のポリペプチド全体に結合する抗体の生成に用いることができる。かかる抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織から該ポリペプチドを単離することができる。ポリペプチド誘導体は、本発明の特定の態様を形成する、抗原的または免疫学的に等価な変種を包含する。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導体」なる用語は、本発明にしたがって、タンパク質またはポリペプチドに対して誘起された場合、病原体および哺乳動物宿主間での相互作用を妨げるある種の抗体により特異的に認識されるであろうポリペプチドまたはそれの同等物を包含する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊椎動物において抗体を誘起させるのに適した処方にて用いた場合、抗体が病原体および哺乳動物宿主間での相互作用を妨げるように作用するペプチドまたはその同等物を包含する。特に、本発明の自然のタンパク質またはポリペプチドフラグメントに比べ僅かに長いかまたは僅かに短い誘導体を用いてもよい。加えて、１またはそれ以上のアミノ酸残基が修飾されたポリペプチドを用いてもよい。かかるペプチドを、例えば、アミノ酸の置換、付加または配列組換えにより、または、その化学的修飾により調製してもよい。かかる置換および修飾はすべて、一般にペプチド化学の分野において当業者に周知である。抗原的または免疫学的に等価な誘導体またはその融合タンパク質などのポリペプチドは、マウスまたはその他の動物、例えばラットもしくはニワトリを免疫するための抗原として使用する。融合タンパク質はポリペプチドに安定性を付与する。抗原は、例えば接合することにより、免疫原性キャリヤタンパク質、例えばウシ・血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リムペット・ヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結合させるてもよい。別法として、タンパク質もしくはポリペプチド、またはその抗原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫原生を改良するために十分な抗原性を有しており、キャリヤーを使用しなくてよい。モノクローナル抗体を調製するために、連続的細胞系培養により産生される抗体を提供する技法を用いることができる。例には、ハイブリドーマ法(Kohler an d Milstein，Nature，256:495-497(1975))、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法(Kozbor et al.，Immunology Today 4:72(1983))、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＶＢ−ハイブリドーマ法(Cole，et al.，1985 ，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R．Liss，Inc.，pp．7 7-96)が包含される。一本鎖抗体を製造するための技術（米国特許第４９４６７７８号）を用いて、本発明の免疫原性ポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生することができる。 KohlerおよびMilstein(前掲，(1975))の方法を用いて、免疫化哺乳動物からの抗体含有細胞をミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を作成する。元のポリペプチドおよび／または融合タンパク質の１またはそれ以上を用いて、ハイブリドーマをスクリーニングし、高い結合親和性を有し、他のスタフィロコッカス種と好ましく交差反応する細胞系を選択する。選択した細胞系を培養して所望のモノクローナル抗体を得る。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系は、本発明の他の態様である。別法として、ファージディスプレイ（phage display）技法を利用して、抗‐ Ｆｂｐの保持に関してスクリーニングしたヒトのリンパ球のＰＣＲ増幅したｖ遺伝子のレパートリー、または無処理のライブラリーから、ポリペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選択してもよい(McCafferty，J.ら、Nature348， 552-554（1990）；Marks，J.ら、Biotechnology 10，779-783(1992))。これらの抗体の親和性は、チェインシャフリング(chain shuffling)により改善することもできる(Clackson，T.ら、Nature352:624-628(1991))。抗体をポリペプチドおよび／または融合タンパク質に対する高親和性について、再度スクリーニングすべきである。上記したように、最終抗体のフラグメントを調製してもよい。抗体は、Ｍｒ約150,000の完全な抗体、または例えば、ＦａｂフラグメントまたはＦｖフラグメントなどのその誘導体のいずれであってもよい(Skerra,A and Pluckthun，A.，Science 240:1038-1040(1988))。二つの抗原結合ドメインが存在する場合、各ドメインは異なるエピトープに向けることができ、それを「二特異性」抗体と称する。本発明の抗体を、例えば、確立されたモノクローナル抗体技術(Kohler,G.andM ilstein,C.（前掲，(1975)）などの通常の手段、または、例えばHuse,W.D.et al .，Science 246:1275-1281(1989)に記載されるような、コンビナトリアルライブラリーなどの組換え手段を用いて、調製してもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドの発現について前記したような適当な発現系において、該抗体をコードするＤＮＡポリマーの発現により、抗体を調製する。発現系のベクターの選択は、イー・コリ(好ましくは、株Ｂ)、ストレプトマイセス・エスピイ（Streptomyces sp.）などの原核細胞、マウスＣ１２７、マウスミエローマ、ヒトＨｅＬａ、チャイニーズハムスター卵巣、糸状または単細胞菌類または昆虫細胞などの真核細胞などである宿主により部分的に決定される。また、宿主は、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物(例えば、H iatt，A．et al.，Nature 340:76-78(1989)において記載されるような)であってもよい。適当なベクターには、プラスミド、バキュロウイルスおよびワクシニアが包含される。Ｆａｂフラグメントを親のモノクローナル抗体から、酵素処理、例えば、パパインを用いてＦｃ部分からＦａｂ部分を開裂することにより、調製してもよい。好ましくは、抗体またはその変種を修飾して患者における免疫原性を減少させる。例えば、患者がヒトである場合、抗体は最も好ましくは「ヒト化」されており、例えばJones,P.ら、Nature 321，522−525（1986）またはTempestら、Biote chnology 9，266-273（1991）に記載されているように、ハイブリドーマ由来の抗体の相補性決定領域または複数の領域がヒトモノクローナル抗体に移植されている。修飾は、「ヒト化」のひとつに制限される必要はなく、他の霊長類配列(例えば、Newman，R．et al.，Biotechnology 10:1455-1460(1992))もまた、用いることができる。ヒト化モノクローナル抗体、または結合活性を有するそのフラグメントは、本発明の特定の態様を形成する。本発明は、化合物、例えば、薬剤をスクリーニングし、本明細書において標的として選択したタンパク質を活性化するかまたは好ましくは妨害する化合物を同定する方法であって、試験化合物または薬剤によるタンパク質の活性の活性化または妨害を測定することを含む方法を提供する。例えば、選択されたタンパク質が触媒活性を有する場合、適当な精製および処方の後、その天然の基質を変換する能力により、酵素の活性を追跡できる。酵素活性のかかる活性において、化学合成された異なる試験化合物または天然産物を酵素活性についてのかかるアッセイに取り入れることにより、天然基質と競合する、または、さもなければ、酵素活性を阻害する添加剤を検出できる。本発明はまた、それにより同定される阻害剤に関する。好ましくは、遺伝学的免疫化における本発明のポリペプチドの使用を、筋肉中へのプラスミドＤＮＡの直接注射（Wolff et al.，Hum．Mol．Genet．1:363(199 2);Manthorpe et al.，Hum．Gene Ther．4:419(1963))、特異的タンパク質担体と複合したＤＮＡのデリバリー(Wu et al.，J．Biol．Chem．264:16985(1989)) 、ＤＮＡとリン酸カルシウムの共沈(Benvenisty & Reshef，Proc．Nat'l Acad． Sci．USA，83:9551(1986))、様々な形態のリポソームのへのＤＮＡの封入(Kaned a et al.，Science 243:375(1989))、微粒子爆撃（Tang et al.，Nature 356:15 2(1992))；Eisenbraun et al.，DNA Cell Biol．12:791(1993))およびクローン化レトロウイルスベクターを用いるインビボ感染(Seeger et al.，Proc．Nat'l ．Acad．Sci．USA 81:5849(1984))などに、適用する。筋肉トランスフェクション用の適当なプロモーターには、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＲａ、アクチン、ＭＣＫ、アルファグロビン、アデノウイルスおよびジヒドロフォレートレダクターゼが含まれる。治療あるいは予防において、活性剤、すなわち本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻害剤は、注射可能な組成物、例えば、滅菌水性分散液、好ましくは等張液として患者に投与できる。別法として、該組成物は、例えば、軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏剤、点眼剤、点耳剤、洗口剤、含浸ガーゼおよび縫合糸、およびエアロゾルなどの局所的塗布用に処方されてもよく、または、例えば、保存剤、薬剤浸透を助ける溶剤、および軟膏ならびクリーム中のエモリエントを含む、適当な通常の添加剤を含有してもよい。該局所処方はまた、適合する通常の担体、例えば、クリームあるいは軟膏の基剤、およびローションのためのエタノールならびにオレイルアルコールを含んでもよい。該担体は、処方の約１重量％から約９８重量％までを構成してもよい；より一般的には、それらは処方の約８０重量％までを構成する。ヒト患者に投与するために、活性薬剤の日用量レベルは０．０１から１０ｍｇ／ｋｇ、典型的には、約１ｍｇ／ｋｇである。医者はどんな場合でも、個々の患者に最も適した、年齢、体重および個々の患者の応答によって変化する実際の用量を決定する。上記の用量は平均的なケースの典型例である。もちろん、より多いあるいはより少ない用量範囲が良い個々の事例があり、そのような事例も、本発明の範囲内である。ワクチン組成物は、都合よくは、注射剤の形態である。通常のアジュバントを使用して免疫応答を促進できる。ワクチン用の適当な単位投与量は抗体０.５〜５μｇ／ｋｇであり、この用量を、好ましくは１〜３週間の間隔で１〜３回投与する。指示した用量範囲で、本発明の化合物では、その化合物の適当な患者への投与を妨げる、有害な毒作用は何も観察されない。実施例以下の限定するものではない実施例の理解を容易にするために、特定の汎用する方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、小文字ｐを前に、および／または大文字および／または数字が続くように表される。本明細書における出発プラスミドは商業上利用可能であり、制限なく公的に利用可能であるか、あるいは公表された手法でもって利用可能なプラスミドから構築できるものである。加えて、記載されているプラスミドと等価なプラスミドは当該分野にて公知であり、当業者に自明である。ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡのある塩基配列にのみ作用する制限酵素によるＤＮＡの触媒的切断をいう。本明細書で用いられる種々の制限酵素は商業上利用可能であり、それらの反応条件、補因子およびその他の必要事項は、当業者において知られるものを用いた。分析の目的では、典型的には、１μｇのプラスミドあるいはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素とともに約２０μｌの緩衝溶液中で用いた。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的では、典型的には、５ないし５０μｇのＤＮＡが、大容量にて２０ないし２５０単位の酵素で消化される。特定の制限酵素に対する適当な緩衝液および基質量は製造者によって特定される。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、供給者の指導に従って変更してもよい。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動に付し、所望のフラグメントを単離する。切断フラグメントのサイズ分離を、Goeddel,D.ら、Nucleic Acids Res.,8:405 7(1980)に記載される、８パーセントポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成される一本鎖ポリデオキシヌクレオチドあるいは二つの相補性ポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいう。該合成ポリデオキシヌクレオチドは５’リン酸を持たず、したがって、キナーゼ存在下でＡＴＰとともにリン酸を添加しなければ、別のオリゴヌクレオチドと連結しないであろう。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていないフラグメントと連結するであろう。「連結」とは、二つの二本鎖核酸フラグメント間でリン酸ジエステル結合を形成する過程をいう(Maniatis，T.ら，前掲、p．146)。特記しない限り、連結は既知の緩衝液および条件を用い、連結させるべきほぼ等モル量のＤＮＡフラグメント０．５μｇ当たり、１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて行ってもよい。実施例１エス・アウレウスＷＣＵＨ２９由来の新規タンパク質をコードするＤＮＡの単離イー・コリ中のエス・アウレウスＷＣＵＨ２９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーから、本明細書に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを得ることができる。常套的方法、例えば下記によりライブラリーを調製してもよい：方法１および２標準的方法によりスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９株（ＮＣＩＭＢ４０７７１）から全細胞ＤＮＡを単離し、２つの方法のいずれかによりサイズ分画する。方法１注射針に通すことにより全細胞ＤＮＡを機械的に剪断して、標準的方法に従ってサイズ分画する。１１ｋｂまでのサイズのＤＮＡフラグメントをエキソヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼでの処理により平滑末端化し、ＥｃｏＲIリンカーを付加する。ＥｃｏＲIで切断しておいたベクターラムダＺａｐII中にフラグメントを連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージングし、イー・コリをパッケージングされたライブラリーに感染させた。標準的方法によりライブラリーを増幅する。方法２全細胞ＤＮＡを４種の制限酵素の組み合わせ（ＲｓａI、ＰａｌI、ＡｕｌIおよびＢｓｈ１２３５I）を用いて部分加水分解し、標準的方法によりサイズ分画する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡに連結し、ついで、ＥｃｏＲIで切断しておいたベクターラムダＺａｐIIにフラグメントを連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージングし、イー・コリをパッケージングされたライブラリーに感染させる。標準的方法によりライブラリーを増幅する。実施例２感染の間におけるスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９由来の遺伝子発現の検出スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９での感染４日目のマウスの鼠蹊部からの壊死脂肪組織を効果的に破砕し、カオトロピック剤およびＲＮＡａｓｅ阻害剤の存在下で処理して動物および細菌ＲＮＡの混合物を得る。安定な調合品および高収量の細菌ＲＮＡを得るための破砕および処理の最適条件は、ノーザンブロットによるスタフィロコッカス・アウレウス１６ＳＲＮＡに特異的な放射性標識オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの使用によるものである。得られたＲＮａｓｅ不含、ＤＮａｓｅ不含、ＤＮＡおよびタンパク質不含のＲＮＡ調合品は、スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９の各遺伝子配列から設計した独特なプライマー対を用いる逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に適する。ａ）マウス動物感染モデルからのスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９で感染した組織の単離寒天培養プレートから単離した個々のスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９のコロニーを容積１０ｍｌの滅菌栄養ブロス（No.2 Oxoid）に撒く。培養物を３７℃で１６ないし２０時間好気的にインキュベーションする(静置培養)。４週齢のマウス（メス、１８ないし２２ｇ、ＭＦ１株）を、このスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９のブロス培養物０．５ｍｌ（約１０⁸ｃｆｕ／ｍｌまでブロスを希釈）を前方の右の下方四分円（鼠蹊部）に皮下注射することにより感染させる。感染後最初の２４時間はマウスを規則的にモニターすべきであり、ついで、研究終了まで毎日モニターすべきである。全身感染の徴候、すなわち昏睡、毛の逆立ち、群からの孤立を有する動物を詳細にモニターすべきであり、徴候が瀕死状態にまで進行した場合、すぐに動物を選別すべきである。傷害進行の可視的外部徴候は感染後２４ないし４８時間で現れるであろう。動物の腹部の検査により、皮膚下の膿瘍の盛り上がった輸郭が示されるであろう。局在化した傷害は右の下方四分円に残るはずであるが、場合によっては左の下方四分円に広がるかもしれず、上昇して胸部に至るかもしれない。場合により、腫瘍は皮膚層を覆って破裂するかもしれない。罹病動物をすぐに選択し、可能ならば組織試料を採る。動物を選択しない場合、膿瘍上にある壊死皮膚組織が脱落し、腹部筋肉壁が露出するかもしれない。感染から約９６時間後、二酸化炭素窒息を用いて動物を殺す。死亡時と組織処理／保存時の隔たりを最小化するため、マウスを群としてではなく個別に殺すべきである。死亡した動物を背を下にして置き、毛を７０％アルコールでおおまかに拭く。左の下方四分円の皮膚から上部へと、ついで、胸部を通るように、はさみを用いて最初の切開を行う。腹部の右の下方四分円の株を切ることにより切開を完了する。腹膜を貫通しないように注意する。垂れ下がった皮膚を鉗子で持ち、皮膚を静かに腹部から引き上げる。腹膜を覆っているが筋肉シートを完全には貫通していない膿瘍が露出しており、内蔵に穴をあけないように注意しながらこれを切除する。液体窒素中での瞬間凍結の前に、膿瘍／筋肉シートおよび他の感染組織、腹部の下方右および左四方円の脂肪組織の壊死パッドなどを断片に切る必要があるかもしれず、そのことによりプラスチック製収集バイアル中での貯蔵が簡単になる。ｂ）感染組織試料からのスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９ＲＮＡの単離２ｍｌのスクリューキャップ試験管中の４ないし６種の感染組織試料（それぞれ約０．５ないし０．７ｇ）を−８０℃の貯蔵庫からドライアイスエタノール浴中に取り出す。微生物学的安全キャビネット中で、試料をドライアイスエタノール浴中で冷却しながら試料を個々に破砕する。組織試料中の細菌を破砕するために、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（Gibco BRL，Life Tehnologies）を添加し、次いで、十分な０．１ｍｍジルコニア／シリカビーズを試験管をほとんど満たすまで添加し、密封性を良好にし、エアロゾル発生をなくすために、ねじ山にビーズが入らないように注意しながら蓋を戻す。ついで、Mini-BeadBeaterBX-4（Biosp ec Products）を用いて試料をホモジナイズする。壊死脂肪組織を５０００ｒｐｍで１００秒間処理して細菌を溶解させる。インビボで増殖した細菌についてはインビトロで増殖したエス・アウレウスＷＣＵＨ２９（３０秒間ビーズでビートすることにより破砕）よりも長時間の処理が必要である。ビーズでビートした後、ヒュームフード中で開栓するまで試験管を氷で冷却する。なぜなら破砕中に発生する熱がＴＲＩｚｏｌを分解し、シアニドを遊離させるかもしれないからである。ついで、２００マイクロリットルのクロロホルムを添加し、試験管を１５秒間手で振り混ぜ、混合を完全にする。室温で２ないし３分後、試験管を１２０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、ついで、ＴＲＩｚｏｌ試薬の製造者により示された方法に従つてＲＮＡ抽出を継続する。すなわち、水相約０．６ｍｌを滅菌エッペンドルフチューブに移し、０．５ｍｌのイソプロパノールを添加する。室温で１０分後、試料を１２０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離する。上清を取り、これを捨てて、ついで、ＲＮＡペレットを１ｍｌの７５％エタノールで洗浄する。ボルテックスを用いて短時間撹拌して試料を混合し、ついで、７５００ｇ、４ ℃で５分間遠心分離する。エタノールを除去し、ＲＮＡペレットを５分間ほど減圧乾燥する。ついで、１００マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水中に繰り返しピペッティングすることにより試料を再溶解し、ついで、５ないし１０分間５５℃に置く。最後に、少なくとも１分間氷上に置き、２００ユニットのRnasin(Promega )を添加する。ＲＮＡ調合品は−８０℃で１カ月まで保存される。長期保存には、プロトコールの７５％エタノール洗浄段階でＲＮＡ沈殿を少なくとも１年間−２０℃で保存できる。試料を１％アガロースゲル上に泳動させることにより単離ＲＮＡの品質を評価する。臭化エチジウムで染色した１ｘＴＢＥゲルを用いて全ＲＮＡ収量を可視化する。感染組織からの細菌ＲＮＡの単離を示すために、１ｘＭＯＰＳ、２．２Ｍホルムアミドゲルで泳動を行い、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（Amersham）に減圧ブロッテイングする。ついで、エス・アウレウスの１６ｓｒＲＮＡに特異的な³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブ（K．Greisen，et al.，J．Clin．Microbiol．3233 5-351(1994)）にブロットをハイブリダイゼーションさせる。配列が:5'-gctccta aaaggttactccaccggc-3'（配列番号１１６６）であるオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる。ハイブリダイゼーションするバンドのサイズを、インビトロで増殖したエス・アウレウスＷＣＵＨ２９から単離された対照ＲＮＡのサイズと比較する。全ＲＮＡ試料中に正しいサイズの細菌１６ｓｒＲＮＡバンドを検出でき、ＴＢＥゲル上で可視化すると捕乳動物ＲＮＡの進んだ分解が示される。ｃ）ＲＮＡ由来のスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９からのＤＮＡの除去２００ユニットのRnasin（Promega）を添加したバッファー中（最終体積９０マイクロリットル）で３ユニットのＤＮａｓｅI（増幅グレード(Gibco BRL,Life Technologies))で１５分間氷上にて処理することにより、７３マイクロリットルのＲＮＡ試料からＤＮＡを除去した。製造者のプロトコールに従ってＤＮａｓｅを不活性化し、ＴＲＩｚｏｌＬＳ試薬（Gibco BRL,Life Technologies）で処理することにより除去した。ＤＮａｓｅ処理したＲＮＡを、方法１と同様にRnasinを添加した７３マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水中に再懸濁した。ｄ）感染組織由来のＲＮＡ試料からのｃＤＮＡの調製ＤＮａｓｅ処理したＲＮＡの１０マイクロリットルの試料を、製造者の指示に従つてSuperScript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesi s Kit（Gibco BRL,Life Technologies）を用いて逆転写する。１ナノグラムのランダムヘキサマーを用いて各反応を開始させる。SuperScriptII逆転写酵素を添加していない対照も反応させる。＋／−両方のＲＴ試料をＲＮａｓｅＨ処理し、ついで、ＰＣＲ反応を進行させる。ｅ）細菌ｃＤＮＡ種の存在を調べるためのＰＣＲの使用ＰＣＲ反応物を下記成分を添加して、氷上で０．２ｍｌのチューブ中にセットアップする：４５マイクロリットルのPCR SUPERMIX（Gibco BRL，Life Technologies）１マイクロリットルの５０ｍＭＭｇＣｌ₂（最終濃度を２．５ｍＭに調節する）１マイクロリットルのＰＣＲプライマー(１８ないし２５塩基対であってよく、類似のアニーリング温度を有するように設計されている)、各プライマーの最終濃度１０ｍＭ２マイクロリットルのｃＤＮＡ下記のごとくPerkin Elmer GeneAmp PCR System 9600によりＰＣＲ反応を行う：９５℃で５分、その後、９４℃、４２℃および７２℃でそれぞれ３０秒、ついで、７２℃で３分のサイクルを５０回行い、その後、温度を４℃に維持する。ついで、１０マイクロリットルの部分試料を１％の１ｘＴＢＥゲルで泳動し、ＰＣＲ生成物を臭化エチジウム染色し、１００ｂｐのＤＮＡラダー（Gibco BRL ，Life Technologies）との比較によりサイズを評価する。ＲＴ／ＰＣＲ対照は、＋／−逆転写酵素反応物、１６ｓｒＲＮＡプライマーまたは非転写エス・アウレウスＷＣＵＨ２９ゲノム配列からＰＣＲ生成物を得るように設計されたＤＮＡ特異的プライマー対を含んでもよい。プライマー対の効率を試験するために、それらをＷＣＵＨ２９全ＤＮＡを用いるＤＮＡＰＣＲに使用する。ＰＣＲ反応をセットアップし、ｃＤＮＡのかわりに約１マイクログラムのＤＮＡを用いて５０サイクルよりも３５サイクルのＰＣＲを上記のごとく行う。ＤＮＡＰＣＲにおいてもＲＴ／ＰＣＲにおいても予想サイズの生成物を生じないプライマー対（約２０％）は、ＰＣＲを失敗させるものであり、それゆえ有用でない。ＤＮＡＰＣＲを用いて正しいサイズの生成物を生じるプライマーのうち３つのクラスがＲＴ／ＰＣＲにおいて区別される：１．インビボで再現可能に発現されない遺伝子はＲＴ／ＰＣＲにおいて生成物を生じない。２．インビボで再現可能に発現される遺伝子は、ＲＴ／ＰＣＲにおいて正しいサイズの生成物を生じ、−ＲＴ対照におけるシグナルよりも強力なシグナルを＋ＲＴ試料において示す。３．インビボで発現されうる遺伝子は、＋／−ＲＴ試料の両方において同様な量の生成物を生じる。表１は、配列表の各ポリヌクレオチド上の読み枠方向(正または逆)、相同性検索に基づく推定同一性、読み枠の始めと終わりの核酸の番号、ＯＲＦ中のコドンの数（終止コドンを含む）などの、本発明のＯＲＦのクローニングおよび同定に関する特定の情報を示す。この情報を用い、選択されたタンパク質を提供する発現ベクターを調製し、タンパク質を抗微生物剤の同定のための適当なスクリーン中に配置する。配列番号１が表１において示される最初の配列に対応し、配列番号６２３が表１において示される最後のアミノ酸配列に対応するように、アミノ酸（ポリペプチド）配列について示した配列番号を連続番号として、表１に示す情報と関連させる。ポリヌクレオチド配列では、配列番号６２４が表１において示される最初のポリヌクレオチド配列に対応し、配列番号１１６５が表１において示される最後の配列に対応する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/02 Ｃ１２Ｑ 1/00 ＺＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＣ１２Ｑ 1/00 15/00 Ｃ 5/00 Ｂ (72)発明者バーナム，マーティン・カール・ラッセルアメリカ合衆国19403ペンシルベニア州ノーリスタウン、タングルウッド・レイン 2927番 (72)発明者ホッジソン，ジョン・エドワードアメリカ合衆国19355ペンシルベニア州マルバーン、ラップ・ロード260番 (72)発明者ノールズ，デイビッド・ジャスティン・チャールズイギリス、アールエイチ１・６エルワイ、サリー、レッドヒル、ダウンズビュー・ハウス (72)発明者ニコラス，リチャード・オークリーアメリカ合衆国19426ペンシルベニア州カレッジビル、カーメン・ドライブ355番 (72)発明者プラット，ジュリー・エムイギリス、エルイー８・１エヌピー、レスター、ウィグストン、ハイフィールド・ドライブ77番 (72)発明者レイチャード，レイモンド・ウィンフィールドアメリカ合衆国18951ペンシルベニア州クエイカータウン、クローバー・ミル・ロード2091番 (72)発明者ローゼンバーグ，マーティンアメリカ合衆国19468ペンシルベニア州ロイヤーズフォード、ミンゴ・ロード241 番 (72)発明者ウォード，ジュディス・エムイギリス、アールエイチ４・２ビーティ、サリー、ドーキング、コトマンディーン19 番、カーメラ・コテージ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号８、１０、１４、１９、２５、２７、２８、３０、３２および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。２．請求項１記載のアミノ酸配列の一つをコードする単離核酸、および、ストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能な核酸配列。３．請求項２記載の核酸配列を含む組換えベクター、および、それらでトランスフォームまたはトランスフェクトされた宿主細胞。４．候補化合物を請求項１記載のポリペプチドと接触させ、該ポリペプチドの生物学的活性を阻害できる化合物を選択することを含む、抗微生物化合物を同定する方法。５．請求項４記載の方法により同定される抗微生物化合物。６．配列番号１ないし配列番号６２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。７．請求項６記載のアミノ酸配列の一つをコードする単離核酸、および、ストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能な核酸配列。８．配列番号６３１、６３３、６３６、６４１、６４７、６４９、６５０、６５２、６５４および６５８からなる群から選択される核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド。９．配列番号６２４ないし配列番号１１６５からなる群から選択される核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド。１０．請求項６記載のポリペプチドに対する抗体。