JP2000502890A

JP2000502890A - 新規ｎａｇｐｕ

Info

Publication number: JP2000502890A
Application number: JP9521843A
Authority: JP
Inventors: ウォリス，ニコラ; ホッジソン，ジョン・エドワード; バーナム，マーティン・カール・ラッセル
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
Priority date: 1995-12-11
Filing date: 1996-12-11
Publication date: 2000-03-14
Also published as: WO1997021819A1; EP0870034A1

Abstract

(57)【要約】新規ＮＡＧＰＵポリペプチドおよびかかる新規面タンパク質をコードしているＤＮＡ（ＲＮＡ）ならびに組み換え法によるかかるポリペプチドの製造方法を開示する。また、感染、詳細には、細菌感染の治療のためのかかる新規タンパク質の使用方法も開示する。また、該新規タンパク質に対するアンタゴニストおよびそれらの感染、詳細には、細菌感染の治療のための使用も開示する。新規タンパク質をコードしている核酸配列およびそのポリペプチドの宿主における存在に関連した疾病の検出のための診断アッセイも開示する。また、宿主における新規タンパク質ファミリーのタンパク質をコードしているポリヌクレオチドの検出ならびに該ポリペプチドの検出のための診断アッセイも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】新規ＮＡＧＰＵ発明の属する分野本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびに該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造、および、ポリヌクレオチドでトランスフォームされた組換え宿主細胞に関する。本発明は、また、該ポリペプチドの作用の阻害および治療における阻害剤の使用に関する。発明の背景Ｎ−アセチルグルコサミン１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ（ＮＡＧＰＵ）は、すべての細菌における細胞壁ペプチドグリカンの必須の前駆体であるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの形成およびグラム陰性菌におけるリポポリサッカライドおよび腸内細菌性の共通の抗原の形成を触媒する。酵素はエシェリシア・コリ(Escherichia coli)から精製されており、グルコサミン−１− フォスフェートのＮ−アセチレーションの先行する工程をも触媒する、２機能性である(Mengin-Lecreulx，D and van Heijenoort，J，J．Bacteriol．176:5788- 5795[1994])。チオール阻害剤によりアセチルトランスフェラーゼ活性を遮断することは可能であるが、ウリジルトランスフェラーゼ活性を遮断することができないことから、酵素は、２つのドメインを有することが示唆されている。酵素をコードする遺伝子ｇｌｍＵがイー・コリ（E．coli）からクローニングされ(Meng in-Lecreulx，D．and van Heijenoort，J，J．Bacrtriol．175: 6150-6157)、バシラス・サチリス(Bacillus subtilis)における対応物(gcaD)もまた同定されている(Hove-Jensen B，J．Bacteriol．174: 6852-6856[1992])。ｇｃａＤの遺伝子産物の必須の性質は、活性な酵素を生成することができず、制限的な温度において生育が止まるバシラス・サチリスの温度感受性変異株により示されている(Hove-Jensen[1992])。ヒト病原菌スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)由来のｇｃａＤに対応する遺伝子の発見により、以下に示すように新規な抗生物質のスクリーニングに用いることのできるＮＡＰＧＵ酵素を生成することが可能となる。最近、感染の間の全体的な遺伝子発現を追跡すると考えられるいくつかの新規な方法が記載されている(Chuang，S．ら、［1993］Global Regulation of GeneE xpression in Esherichia coli J．Bacteriol 175，2026-2036，Mahan，M．J．ら、[1993]Selection of Bacterial．Virulence Genes That Are Specifically Inducedin Host Tissues SCIENCE 259，686-688，Hensel，M．ら、[1995]Simult aneousIdentification of Bacterial Virulence Genes by Negative Selection SCIENCE269，400-403)。これらの新しい方法は、これまでのところ、グラム陰性病原菌感染で示されており、グラム陽性菌の感染では示されていないが、これはおそらく、全体的なトランスポゾン変異誘発法およびこれらの微生物におけるこのような方法に必要な適当なベクターの開発が大変遅れていること、Chuang，S. ら[1993]により記載される方法の場合、感染組織由来の哺乳動物ＲＮＡを含まない細菌ＲＮＡの適当な量を単離し、十分に高特異的な活性で標識された細菌ＲＮＡを得ることが難しいことによる。本発明は、新規な方法を適用し、哺乳動物宿主の感染の異なるステージでの病原菌の遺伝子発現を決定する。本発明の新規な態様は、感染組織由来の細菌ＲＮＡ調製物のノザンブロットにおいて、細菌リボソームのＲＮＡと特異的にアニールする、適当に標識化されたオリゴヌクレオチドプローブの使用に関する。ハイブリダイゼーション標的としてさらに多くのリボソームＲＮＡを用いることにより、感染組織からのＲＴ−ＰＣＲのための適当な大きさおよび量の細菌ＲＮＡを精製するプロトコールの最適化が促進される。この方法をスタフィロコッカス・アウレウスにおいて発現される遺伝子に適用するための有用な適当なオリゴヌクレオチドは、たとえば、5'-gctcctaaaaggtta ctccaccggc-3’（配列番号６）である。本発明の方法の使用により、感染の間に転写される細菌遺伝子、抗細菌治療において有用性を有する阻害剤の同定を可能とする。該遺伝子転写、またはその後の得られたｍＲＮＡの翻訳、または対応する発現されるタンパク質の機能の特異的阻害剤は、抗細菌治療における有用性を有している。発明の要約本発明は、配列番号２および配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸からなると解析された、エス・アウレウス（S．aureus）ＷＣＵＨ29由来の新規なタンパク質、または、それらのフラグメント、アナログまたは誘導体に関する。このタンパク質およびそれらの変異体、ならびに同じものをコードするポリヌクレオチドは、本明細書において、「ＮＡＰＧＵ」と呼ぶ。本発明は、また、配列番号２および配列番号５に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質のポリペプチドフラグメント、またはそれらの誘導体に関する。本発明の別の態様によれば、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド( ＤＮＡまたはＲＮＡ)が提供される。特に、本発明は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列、および、それらに相補的な配列を有するポリヌクレオチドを提供する。本発明は、また、配列番号２のアミノ酸１から４５０を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号５のアミノ酸１から４５２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド；該単離ポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド；該単離ポリヌクレオチドの少なくとも１５の連続する塩基を含むポリヌクレオチド；からなる群から選択されるメンバーを含む単離ポリヌクレオチドを提供する。さらに、配列番号１に示されるヌクレオチド５４から１４０６に相補的な配列、および、配列番号１に示されるヌクレオチド５４から１４１２に相補的な配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、配列番号２のアミノ酸１から４５０および配列番号５のアミノ酸１から４５２からなる群から選択されるアミノ酸を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明は、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７９４に含まれるＤＮＡにより発現されるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％の同一性を有し、配列番号１のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；該単離ポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド；および、該単離ポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続する塩基を有するポリヌクレオチドヌクレオチド；からなる群から選択されるメンバーを含む単離ポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、配列番号２の１から４５０および配列番号５のアミノ酸１から４５２からなる群から選択されるアミノ酸と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸および配列番号５に示されるアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。本発明は、また、配列番号１に示されるＤＮＡ配列、またはそれらのフラグメント、アナログまたは誘導体を含むと解析された遺伝子の発現により得ることができる、スタフィロコッカス・アウレウス由来の新規なタンパク質を提供する。本発明は、また、配列番号３、４および６に示されるオリゴヌクレオチドを含む新規なオリゴヌクレオチドに関連し、配列番号３および４は、配列番号１のポリヌクレオチド配列由来である。本発明は、配列番号２および配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる群から選択される推定アミノ酸配列により特徴付けられるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする上記に示したポリヌクレオチドの変異体を含む。本発明は、また、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、組換え法による本発明のポリペプチドの製造に関する。また、本発明は、配列番号２および配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるポリペプチドに対する抗体を提供する。さらに、本発明は、配列番号２および配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるポリペプチドの活性を阻害するアンタゴニストを提供する。本発明は、また、新規ＮＡＧＰＵポリペプチドを阻害する必要のある個体の治療のための方法であって：個体に治療学的に有効な量の本発明のポリペプチドに対するアンタゴニストを投与することからなる方法を提供する。本発明は、本発明のポリペプチドの発現に関連する疾患の診断の方法であって：配列番号２および配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を決定することからなる方法を提供する。診断方法は、宿主由来の試料中の、配列番号２および配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるポリペプチドの存在を解析することからなる。本発明のさらに別の態様によれば、本発明のポリペプチドの治療的または予防的目的、たとえば、抗細菌剤またはワクチンとしての使用を提供する。本発明の別の態様によれば、本発明のポリペプチドの治療的または予防的目的、特に、遺伝的免疫化における使用を提供する。本発明のさらに別の態様によれば、抗細菌剤として有用な、該ポリペプチドに対する阻害剤を提供する。本発明の態様は、上記の本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻害剤および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。特に、本発明の態様は、感染の予後に関連する、病原体と宿主との即時的身体的相互作用を妨げるための本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻害剤の使用を提供する。本発明は、さらに、該使用のための医薬の製造に関する。本発明は、医薬をスクリーニングし、タンパク質または活性フラグメントの哺乳動物細胞への相互作用を妨げる医薬を同定する方法を提供する。さらに、配列番号２および配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるポリペプチドに結合し、その活性を阻害する化合物を同定する方法であって、ポリペプチドに対する結合手段(該結合手段は、化合物の該結合手段への結合に応答する検出可能なシグナルを提供し得る２番目の成分と結合している )をその表面上に発現する細胞を、結合手段への結合が可能な条件下で、スクリーニングすべき化合物と接触させ；化合物と結合手段との相互作用により生じたシグナルの存在または非存在を検出することにより、化合物が結合し、結合を活性化するかまたは阻害するかどうかを測定することからなる方法を提供する。図面の簡単な説明以下に、本発明の特定の具体例を示す。これらは単に例示であり、本明細書に開示される発明を何ら限定するものではない。図１：図１（Ａ−Ｃ）は、アンチセンス方向の新規なエス・アウレウスＮＡＧＰＵ遺伝子のポリヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。２つの開始コドンの相補的な配列は、太文字でアンダーラインで示し、終止コドンの相補的な配列は、下線で示す。図１（Ａ−Ｃ）は、本明細書において、包括的に「図１」と呼ぶ。図２：図２は、図１（配列番号１）のポリヌクレオチド配列から推定される新規ＮＡＧＰＵタンパク質のポリペプチド配列（配列番号２）を示す。図３：図３は、図１（配列番号１）のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３および４）を示す。図４：図４は、図１（配列番号１）のポリペプチド配列から推定される交互のアミノ末端を有する新規ＮＡＧＰＵタンパク質（配列番号５）のポリペプチド配列を示す。発明の詳説本発明は、配列願号２および５に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそれらのフラグメント、アナログまたは誘導体を含むと解析された、スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ29由来の新規なＮ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼに関する。配列番号２および５のアミノ酸配列は、配列番号１の２種の翻訳可能な読み枠であり、ビー．サチリスＮＡＧＰＵ酵素配列に対し約５５％の相同性を示す。本発明の２種の好ましいＮＡＧＰＵ酵素は、それぞれ異なる末端メチオニンで開始し、アミノ末端で異なる。配列番号２および５は、これらの２種の形態を示す。エス・アウレウスＷＨＵＨ２９は、National Collection of Industrial andM arine Bacteria Ltd.(NCIMB),Aberdeen,Scotlandに、受託番号ＮＣＩＭＢ40711として、１９９５年９月11日に寄託されている。本発明は、また、配列番号２および５からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそれらの誘導体を有する、ＮＡＧＰＵ調節タンパク質のポリペプチドフラグメントに関する。以下、ポリペプチド（複数でも可）なる用語は、ＮＡＧＰＵ調節タンパク質、そのフラグメント、アナログまたは誘導体ならびにポリペプチドフラグメントまたはその誘導体を意味するのに用いる。本発明の他の態様によれば、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド( ＤＮＡまたはＲＮＡ)が提供される。特に、本発明は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを提供する。さらに、本発明は、エス・アウレウスＷＨＵＨ２９由来のＮＡＰＧＵタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１に示されるＤＮＡ配列を含むと解析されたポリヌクレオチドを提供する。本発明は、また、配列番号１に示されるＤＮＡ配列、またはそのフラグメント、アナログまたは誘導体を含むと解析された遺伝子の発現により得ることのできる、スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９由来の新規なタンパク質を提供する。また、本発明は、たとえば、本明細書において記載する方法においてＰＣＲプライマーとして作用し、感染組織において全体または部分的に転写される、本明細書において同定されたスタフィロコッカス・アウレウス遺伝子であるかどうかを決定できる配列番号１由来の配列番号３および４を含む、新規なオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、また、新規なオリゴヌクレオチド、たとえば、ハイブリダイゼーションプローブとして作用できる配列番号６に関する。該配列が、感染のステージおよび病原体が引き起こす感染の種類の診断において有用性を有することもまた認識される。配列番号１に示されるＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを、イー・コリにおいてエス・アウレウスＷＣＵＨ２９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリを配列決定して得た。これは、感染のマウスモデルにおいて、インビボで、エス・アウレウスＷＣＵＨ２９の確立された感染で転写されることが、本明細書に記載される方法により示されている。配列番号１に示されるＤＮＡ配列を用いてタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得るために、典型的には、イー・コリまたは他の適当な宿主中において、エス・アウレウスＷＣＵＨ２９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリを、好ましくは、部分配列由来の１７量体またはそれより長い放射活性標識化オリゴヌクレオチドでプローブ化する。ついで、プローブと同一のＤＮＡを有するクローンを高いストリンジェントな洗浄を用いて区別することができる。元の配列から作成された配列決定用プライマーで同定された個々のクローンを配列決定することにより、配列を両方向に延ばし、完全遺伝子配列を決定することが可能である。便利には、該配列決定は、プラスミドクローンから調製された変性二本鎖ＤＮＡを用いて行う。適当な方法は、Maniatis，T.，Fritsch，E.F．and Sambrook， J．inMOLECULAR CL0NING，A Laboratory Manual[2nd edition 1989 Cold Spring HarborLaboratory． Screening By Hybridization 1.90 and Sequencing Dena turedDouble-Stranded DNA Templates 13.70参照]により記載されている。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であってよく、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、二本鎖でも一本鎖であってもよく、一本鎖の場合には、コーディング鎖でも非コーディング（アンチ−センス）鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコーディング配列は、配列番号１に示されるコーディング配列と同一であるか、または、遺伝子コードの重剰性または縮重の結果として、同じポリペプチドをコードする異なるコーディング配列であってもよい。本発明は、配列番号２および／または５からなる群から選択される推定アミノ酸配列により特徴付けられるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする上述のポリヌクレオチドの変異体を含む。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に起こる対立遺伝子変異体でも、または、ポリヌクレオチドの非天然に起こる変異体であってもよい。それゆえ、本発明は、配列番号２および／または５からなる群から選択される推定アミノ酸配列により特徴付けられる同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに、ポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする変異体である該ポリヌクレオチドの変異体が含まれる。該ヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体、および、付加または挿入変異体が含まれる。ポリヌクレオチドは、配列番号１のＤＮＡ配列により特徴付けられるコーディング配列の天然に起こる対立遺伝子変異体であるコーディング配列を有することができる。当業者に知られるように、対立遺伝子変異体は、一またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有する、コードされるポリペプチドの機能を本質的に変えない、ポリヌクレオチドの別の形態である。成熟ポリペプチド、すなわち、ＮＡＧＰＵタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドに対するコーディング配列のみを含むか、または、成熟ポリペプチドに対するコーディング配列、および、リーダーまたは分泌性配列またはプロタンパク質配列などの追加のコーディング配列を含むことができる。それゆえ、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、ポリペプチドに対するコーディング配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに、追加のコーディングおよび／または非コーディング配列を含むポリヌクレオチドを包含する。それゆえ、本発明は、成熟ポリペプチドに対するコーディング配列が、同じ読み枠中で、たとえば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌性配列として機能するリーダー配列などの、発現および宿主細胞からのポリペプチドの分泌の助けとなるポリヌクレオチド配列と、融合していてもよい。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、宿主細胞により開裂されポリペプチドの成熟形を形成する、リーダー配列を有する。ポリヌクレオチドは、また、成熟タンパク質プラス別の５’アミノ酸残基からなるプロタンパク質をコードしていてもよい。プロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であり、タンパク質の不活性形態である。プロ配列が開裂されると、活性な成熟タンパク質が残る。それゆえ、たとえば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク質、または、プロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有するタンパク質をコードしていてもよい。ペプチドの翻訳後修飾の間に、ＮＨ₂−末端のメチオニン残基が除去され得る。したがって、本発明は、本発明のタンパク質のメチオニン含有およびメチオニンのないアミノ末端変異体の両方の使用を考慮する。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子の５’または３’末端のいずれかにおいて、本発明のポリペプチドの精製を可能にするためのマーカー配列とフレーム中で融合したコーディング配列を有していてもよい。マーカー配列は、細菌宿主の場合に、マーカーに融合したポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥシリーズのベクター(Qiagen,Inc.より商業的に供給される)で得られるヘキサ−ヒスチジンタグであってもよい。さらに、本発明は、配列間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％の同一性がある場合に、本明細書において前記した配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、本明細書において前記したポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で用いる用語の「ストリンジェントな条件」とは、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。好ましい具体例において、本明細書において前記したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、配列番号２および／または５からなる群から選択される推定アミノ酸配列により特徴付けられるポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。本明細書中でいう寄託は、特許手続きの目的で微生物寄託の国際承認に関するブタペスト条約の条件下で保持される。寄託株は当業者の便宜のためにのみ提供され、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ．１１２条の下に要求されることを承認するものではない。寄託材料に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびに、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、出典明示により本明細書中に包含するものであり、本明細書における配列の記載とのいずれの不一致においても支配的である。寄託材料を製造、使用または販売するには、ライセンスが必要であるが、そのようなライセンスはここで付与されるものではない。配列番号２および／または５からなる群から選択される推定アミノ酸配列により特徴付けられるポリペプチドについて述べる場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」なる用語は、該ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能および活性を保持するポリペプチドを意味する。それゆえ、アナログは、活性な成熟ポリペプチドを生成するためのプロタンパク質部分の開裂より、活性化することが可能なプロタンパク質を包含する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは、組換えポリペプチドであってもよい。配列番号２および／または５からなる群から選択される推定アミノ酸配列により特徴付けられるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）により一またはそれ以上のアミノ酸残基が置換され、該置換アミノ酸残基が、遺伝コードによりコードされていてもされていなくてもよいもの、(ii)一またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、(iii)ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(たとえば、ポリエチレングリコール)などの、他の化合物と融合しているもの、または、(iv)付加アミノ酸が、リーダーまたは分泌性配列、または、ポリペプチドの精製を可能にする配列、または、プロタンパク質配列などのポリペプチドと融合しているもの、であることができる。該フラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示から当業者の範囲内であると考えられる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離形態で提供され、好ましくは、均一に精製される。「単離された」とは、物質がその本来的な環境(すなわち、天然物の場合、天然の環境)から除去されることを意味する。例えば、生存する動物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されたものではないが、その天然状態で共存する物質のいくらかまたはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されたものである。該ポリヌクレオチドは、ベクターの部分であることができ、および／または、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、構成成分の一部分であることができ、さらに、かかるベクターまたは構成成分が天然環境の一部ではないという点において、単離されたものである。本発明は、また、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、組換え技法による本発明のポリペプチドの製造に関する。本発明のさらに別の態様によれば、それゆえ、宿主中において該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させることによる組換え方法により、本発明のポリペプチドを製造する方法を提供する。別法として、本発明のポリペプチドを通常のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。宿主細胞を、たとえばクローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺伝的に操作する(トランスダクション、トランスフォーメーション、トランスフェクション)。ベクターは、たとえば、プラスミド、コスミド、ファージなどの形態であることができる。操作された宿主細胞を、プロモーターの活性化、トランスフォーマントの選択または遺伝子の増幅に適当なように修飾された通常の栄養培地中で培養できる。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現の選択された宿主細胞においてすでに用いられたものであり、当業者に明らかなものであろう。適当な発現ベクターには、染色体、非染色体および合成DNA 配列、たとえば細菌プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNA の組み合わせ由来のベクターなどが含まれる。しかしながら、それが宿主中で複製可能で生存可能である限り、いかなる他のベクターをも用いることができる。適当な DNA 配列を様々な方法によりベクター中に挿入できる。一般的に、DNA 配列を、技術分野において知られた方法により、制限エンドヌクレアーゼ部位( 複数でも可)中に挿入する。発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適当な発現制御配列(複数でも可)(プロモーター)に作動的に結合しており、mRNA 合成を調節する。該プロモーターの代表例として、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、イー・コリｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰ_Lプロモーターおよび真核または原核細胞またはそれらのウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが知られた他のプロモーターが挙げられる。発現ベクターは、また、翻訳開始および転写終止のためのリボソーム結合部位を含む。ベクターは、また、発現増幅のために適当な配列を包含してもよい。加えて、発現ベクターは、好ましくは、一またはそれ以上の選択可能なマーカーを含み、真核細胞培養のためのジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマイシン耐性など、または、イー・コリにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性などの、トランスフォームされた宿主細胞選択のための表現型の特性を提供する。所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列がこの発現構築物を含むベクターによりトランスフォームされた宿主細胞中でＲＮＡに転写されるように、遺伝子をプロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現のため）および所望によりオペレーター(本明細書において、"制御(control)"エレメントとしてまとめて称する) の制御下に置くことができる。コーディング配列は、単一のペプチドまたはリーダー配列を含んでいても含まなくてもよい。本発明のポリペプチドを、たとえば、イー・コリｔａｃプロモーターまたはプロテインＡ遺伝子（ｓｐａ）プロモーターおよびシグナル配列を用いて、発現させることができる。リーダー配列を細菌宿主により翻訳後プロセシングで除去することができる。たとえば、米国特許第4,431,739；4,452,437；4,338,397 号参照。プロモーター領域を選択マーカーを有するＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは他のベクターを用いて所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特に挙げられる細菌プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびｔｒｐが含まれる。真核プロモーターには、レトロウイルス由来のＣＭＶ即時初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、ＬＴＲ、および、マウスメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者の通常のレベル内で十分可能である。制御配列に加えて、宿主細胞の生育に関連するタンパク質配列の発現の制御を可能にする調節配列を添加することが望ましい。調節配列は、当業者に知られるものであり、例には、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して開始または終止する遺伝子の発現を引き起こすものが含まれる。調節エレメントの他の種類は、ベクター中、たとえば、エンハンサー配列中に存在していてもよい。発現ベクターは、制御配列に関してコーディング配列の位置および方向がコーディング配列が制御配列の「制御」下に転写されるよう（すなわち、制御配列でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列を転写する）に、特定のコーディング配列が適当な調節配列とともにベクター中に位置するように、構築される。コーディング配列の修飾がこの目的を達成するために所望される。たとえば、いくらかの場合において、適当な方向で制御配列に結合できるように；すなわち、読み枠を維持するように、配列を修飾する必要があるであろう。制御配列および他の調節配列を、前記したクローニングベクターなどのベクター中に挿入する前に、コーディング配列に連結することができる。別法として、コーディング配列をすでに制御配列および適当な制限部位を有する発現ベクター中に直接クローニングすることができる。一般的に、組換え発現ベクターは、複製開始点および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能にする選択マーカー(たとえば、イー・コリのアンピシリン耐性遺伝子およびエス・セレビシアエ（S．cerevisiae）ＴＲＰ１遺伝子)、および下流構造配列の転写を調節するための高度に発現される遺伝子由来のプロモーターを含む。異種構造配列は、翻訳開始および終止配列、および好ましくは、ペリプラスム間隙または細胞外培地中に翻訳されたタンパク質を直接分泌できるようにするリーダー配列とともに適当な配置として組み込まれる。所望により、異種配列は、所望の特徴、たとえば、安定性または発現組換え産物の簡単な精製、を与えるＮ−末端同定ペプチドを含む、融合タンパク質をコードすることができる。本明細書において前記したような適当なＤＮＡ配列ならびに適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを、宿主がタンパク質を発現するように、適当な宿主をトランスフォームするのに用いることができる。特に、本発明はまた上で広く述べたような一またはそれ以上の配列を含む組換え構築物を含有する。構築物は、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されたプラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターを含む。この具体例の好ましい態様において、構築物はさらにたとえば、該配列に作動可能に連結したプロモーターを含む調節配列を含む。多くの適当なベクターおよびプロモータが当業者において周知であり、商業的に利用可能である。以下のベクターを例として示す。細菌系：ｐＥＴ−３ベクター(Stratagene)、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９(Qiagen)；ｐｂｓ、ｐＤ１０、ファージスクリプト(Phagescript)、ｐｓｉＸ１７４、ブルースクリプト（Bluescript）ＳＫ、ｐｂｓｋs、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ(Stratagene)；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５(Pharmacia)。真核系：ｐＢｌｕｅＢａｃIII(Invitrogen)、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ(Stratagene)、ｐＳＶＫ３、ＰＢＰＶ、ＰＭＳＧ、ｐＳＶＬ(Pharmacia)。しかしながら、宿主中で複製可能であり生存可能である限り、いかなる他のプラスミドまたはベクターをも用いることができる。クローニング用の組換えＤＮＡベクターおよびそれらでトランスフォームされる宿主細胞の例には、バクテリオファージλ(イー・コリ)、ｐＢＲ３２２(イー・コリ)、ｐＡＣＹＣ１７７(イー・コリ)、ｐＫＴ２３０(グラム−陰性細菌)、ｐＧＶ１１０６(グラム−陰性細菌)、ｐＬＡＦＲ１(グラム−陰性細菌)、ｐＭＥ２９０(非イー・コリグラム−陰性細菌)、ｐＨＶ１４(イー・コリおよびバシラス・サチリス)、ｐＢＤ９(バシラス)、ｐＩＪ６１(ストレプトマイセス)、ｐＵＣ６(ストレプトマイセス)、ＹＩｐ５(サッカロマイセス)、バキュロウイルス昆虫細胞系、ＹＣｐ１９(サッカロマイセス)。一般には、″DNA Cloning″: Vols． I & II，Glover et al．ed．IRL Press Oxford(1985)(1987)および; T．Maniati set al．″Molecular Cloning″Cold Spring Harbor Laboratory(1982)を参照のこと。ある場合には、宿主微生物からポリペプチドの分泌を引き起こし、ついで、分泌シグナルの開裂を引き起こす、付加配列が所望される。ポリペプチドは、宿主細胞において適当なプロモーターの制御下に発現されうる。また、細胞非存在転写システムを用いて、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いて該タンパク質を製造することもできる。原核および真核宿主で用いられる適当なクローニングおよび発現ベクターは、出典明示によりその開示を本発明に包含する、Sambrook ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)により記載されている。適当な宿主株のトランスフォーメーションおよび宿主細胞の適当な細胞密度への生育に続き、選択的プロモーターを適当な手段（たとえば、温度シフトまたは化学的誘導）により誘導させ、細胞をさらなる期間培養する。典型的には細胞を遠心により収集し、物理的または化学的手段により破砕し、得られる粗抽出物をさらなる精製のために保持する。タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含むいかなる簡便な方法によっても破砕することができ、該方法は、当業者において周知である。選択した発現系および宿主に応じ、前記した発現ベクターでトランスフォームされた宿主細胞を対象のポリペプチドが発現される条件下で生育させることにより、本発明のポリペプチドを製造できる。ついで、ポリペプチドを宿主細胞から単離し、精製する。発現系がポリペプチドを生育培地中に分泌する場合、ポリペプチドを培地から直接精製することができる。ポリペプチドが分泌されない場合、細胞溶解物から単離するかまたは細胞膜フラクションから回収する。ポリペプチドが細胞表面上に位置する場合、細胞全体または単離膜を所望の遺伝子産物の解析可能源として用いることができる。イー・コリなどの細菌宿主において発現されたポリペプチドは、封入体からの単離および再生が必要であろう。成熟タンパク質がきわめて疎水性な領域を有しており過剰発現の産物を不溶性とする場合、疎水性領域が削除された末端切断されたタンパク質を発現することが所望される。適当な生育条件および回収方法の選択は、当業者の技術の範囲内である。ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホヤルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを包含する方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製できる。必要に応じ、タンパク質再生工程を、成熟タンパク質の構造を完全なものとするために用いることができる。最終的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に用いることができる。「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ複製の自律ユニットとして機能する、すなわち、それ自体の制御下で複製可能な、遺伝的エレメント（たとえば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。「ベクター」は、付随するセグメントの複製を引き起こすように他のＤＮＡセグメントが付随する、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。「二本鎖ＤＮＡ分子」は、弛緩型および超らせん型の両方の二本鎖ヘリックスにおけるデオキシリボヌクレオチド（塩基アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）のポリマー形態を意味する。この用語は、分子の一次元および二次元構造を意味するのみであり、特定の三次元構造を限定するものではない。それゆえ、この用語は、とりわけ、直鎖状ＤＮＡ分子(たとえば、制限フラグメント)、ウイルス、プラスミドおよび染色体に見られる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する場合、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同性のある配列を有する鎖）にそって５’から３’方向にある配列のみを記載する慣例に従って明細書中に記載されるものである。特定のタンパク質の「コーディング配列」または特定のタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」のＤＮＡは、適当な調節配列の制御下に置かれると、転写され、タンパク質に翻訳されるＤＮＡ配列である。「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼと結合でき、下流（３ ’方向）コーディング配列の転写を開始できるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的では、プロモーター配列は、コーディング配列の翻訳開始コドン（たとえば、ＡＴＧ）により３’末端で境界をひき、上流（５’方向）にのび、バックグラウンドよりも上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な塩基またはエレメントの最小数を含む。プロモーター配列中に、転写開始部位(通常、ヌクレアーゼＳ１でマッピングにより定義される)、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。真核プロモーターは、しばしば、いつもでなないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核プロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加え、シャイン−ダルガノ配列を含む。ＤＮＡ「制御配列」は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニレーションシグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサー、および宿主細胞中でコーディング配列の発現（すなわち、転写および翻訳）を提供するようなものを、ひとまとめにして意味する。制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、コーディング配列をｍＲＮＡに転写し、ついでｍＲＮＡをコーディング配列にコードされるポリペプチドに翻訳する時、細胞中でコーディング配列の「発現を制御」する。「宿主細胞」は、トランスフォームまたはトランスフェクトされた細胞であるか、または、外来ＤＮＡ配列によりトランスフォーメーションまたはトランスフェクション可能な細胞である。該外来ＤＮＡが細胞膜中に導入されている時、細胞は外来ＤＮＡにより「トランスフォーム」されている。外来ＤＮＡは、染色体ＤＮＡ中に組み込まれ（共有結合して）細胞のゲノムを構成していてもよく、していないくてもよい。たとえば、原核細胞および酵母では、外来ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソームエレメントとして保持され得る。真核細胞についてみると、安定にトランスフォームまたはトランスフェクトされた細胞は、染色体複製により娘細胞に遺伝するように、外来ＤＮＡが染色体中に組み込まれているものである。この安定性は、細胞系、または、外来ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなるクローンを確立する、真核細胞の能力により示される。「クローン」は、単一細胞または有糸分裂による共通の祖先由来の細胞の集団である。「細胞系」は、多世代にわたりインビトロで安定に生育できる一次細胞のクローンである。ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、天然の他の分子と関連して見出されない、他のＤＮＡ分子中または他のＤＮＡ分子に結合する、ＤＮＡの同定可能なセグメントである。本発明で提供される各々のＤＮＡ配列は、抗菌性化合物の発見または開発に用いることができる。発現時にコードされたタンパク質を、抗菌剤のスクリーニングのための標的として用いることができる。加えて、コードされたタンパク質のアミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列またはシャイン−ダルガノまたは他のそれぞれのｍＲＮＡの転写促進配列を、アンチセンス配列を構築し、対象のコーディング配列の発現を制御するのに用いることができる。本発明のさらに他の態様によれば、たとえば、抗菌剤として有用な該ポリペプチドに対する阻害剤が提供される。ＮＡＧＰＵタンパク質の阻害剤は、抗菌的治療における有用性を有する。本発明の他の態様は、上記の本発明のポリペプチドの阻害剤および医薬上許容される担体を含む医薬組成物である。特に、本発明は、抗菌剤としての本発明の阻害剤の使用を提供する。本発明は、さらに、かかる使用のための医薬の製造に関する。本発明は、薬物のＮＡＧＰＵタンパク質によるウリジルジホスフェートＮ−アセチルグルコサミンの生合成を阻害する能力を測定することによる、抗菌剤を同定するための医薬をスクリーニングする方法を提供する。イー・コリＮＡＧＰＵは、ピロフォスフォリラーゼとして作用し、正反応の産物、ＵＤＰ−Ｎ−アヤチルグルコサミンおよびピロフォスフェートからＮ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェートへの逆反応を触媒することが知られている (Strominger，J.R．and Smith，M.S．[1959]J．Biol．Chem．234: 1822-7)。反応に無機ピロホスフェートを導入することにより、制限なく正方向へ進行する(M engin-Lecreulx，D．and van Heijenoort，J.，J．Bacteriol．176: 5788-5795[ 1994])。好ましい具体例において、ＮＡＧＰＵタンパク質の存在下、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェートをＵＴＰおよび無機ピロホスフェートとインキュベートし、Malachite Green 法(Itaya,K．& Ui,M．Clin.Chim.Acta 14,361-366[1 966])などの適当な感受性方法を用いて比色的に測定できる無機ホスフェートを生成させ、ＮＡＧＰＵ酵素活性の測定を提供する。この反応における酵素活性の現象は、阻害剤の存在を示唆する。本発明は、また、これにより同定された阻害剤に関する。治療あるいは予防において、有効な薬剤は、注射組成物、例えば、滅菌水性分散液、好ましくは等張液として患者に投与される。別法として、該組成物は、例えば、軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏剤、点眼剤、点耳剤、洗口剤、含浸ガーゼおよび縫合糸、およびエアロゾルなどの局所的塗布用に処方されてもよく、または従来の添加剤、例えば、保存剤、薬剤浸透を助ける溶剤、および軟膏ならびクリーム中のエモリエントを含有してもよい。該局所処方はまた、適合する従来の担体、例えば、クリームあるいは軟膏の基剤、およびローションのためのエタノールならびにオレイルアルコールを含んでもよい。該担体は、処方約１重量％から約９８重量％までを構成してもよい；より一般的には、それらは処方約８０重量％までを構成する。ヒト患者に投与するために、活性薬剤の日用量レベルは０．０１から１０ｍｇ／ｋｇ、典型的には、約１ｍｇ／ｋｇである。医者はどんな場合でも、個々の患者に最も適した、年齢、体重および個々の患者の応答によって変化する実際の用量を決定する。上記の用量は平均的なケースの典型例である。もちろん、より多いあるいはより少ない用量範囲が良い個々の事例があり、そのような事例も、本発明の範疇である。示した用量の範囲において、本発明の化合物で、適当な患者への投与を妨げるような不利な毒性効果は観察されないであろう。実施例本発明を以下の実施例によりさらに記載する。これらの例は、本発明のある特定の態様を例示するものであるが、開示される発明の範囲を限定または制限するものではない。以下の実施例の理解を容易にするために、特定のは汎用する方法および／あるいは用語を記載する。「プラスミド」は、小文字ｐを前に、および／または大文字および／または数字が続くように表される。本明細書における出発プラスミドは商業上入手可能であるか汎用されているか、あるいは公表された手法でもって入手可能なプラスミドから構築できるものである。加えて、記載されているプラスミドと等価なプラスミドは当該分野にて公知であり、当業者に自明である。ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡのある塩基配列にのみ作用する制限酵素によるＤＮＡの触媒的切断をいう。本明細書で用いられる種々の制限酵素は商業上入手可能であり、それらの反応条件、補因子およびその他の必要事項は、当業者において知られるものを用いた。分析の目的では、典型的には、１μｇのプラスミドあるいはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素とともに約２０μｌの緩衝溶液中で用いた。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的では、典型的には、５ないし５０μｇのＤＮＡが、大容量にて２０ないし２５０単位の酵素で消化される。特定の制限酵素に対する適当な緩衝液および基質濃度は製造者によって特定される。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、供給者の指導に従って変更してもよい。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動に付し、所望のフラグメントを単離する。切断フラグメントのサイズ分離を、Goeddel,D．ら、Nucleic AcidsRes.,8:405 7(1980)に記載される、８パーセントポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成される一本鎖ポリデオキシヌクレオチドあるいは二つの相補性ポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいう。該合成ポリデオキシヌクレオチドは５’リン酸を持たず、したがって、キナーゼ存在下でＡＴＰとともにリン酸を添加しなければ、別のオリゴヌクレオチドと連結しないであろう。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていないフラグメントと連結するであろう。「連結」とは、二つの二本鎖核酸フラグメント間でリン酸ジエステル結合を形成する過程をいう(Maniatis，T.ら，Id.，p．146)。特記しない限り、連結は既知の緩衝液および条件を用い、連結させるべきほぼ等モル量のＤＮＡフラグメント０．５μｇ当たり、１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて行ってもよい。すべての実施例は、詳細に記載する場合を除き、当業者に周知の慣用的な標準的な方法を用いて行った。以下の実施例の通常の分子生物学的手法は、Sambrook ら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL，2nd Ed.; Cold Spring HarborL aboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y．(1989)などの標準的な実験室マニュアルに記載されるように行うことができる。実施例１エス・アウレウスＷＣＵＨ２９由来のＮＡＧＰＵタンパク質をコードするＤＮＡの単離イー・コリ中のエス・アウレウスＷＣＵＨ２９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーから、配列番号１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを得た。いくつかの場合、重複するエス・アウレウスＷＣＵＨ２９ＤＮＡを含んでいる２個またはそれ以上のクローンからの配列決定データを用いて配列番号１の連続したＤＮＡ配列を構築した。常套的方法、例えば下記によりライブラリーを調製してもよい：方法１および２標準的方法によりスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９株（ＮＣＩＭＢ４０７７１）から全細胞ＤＮＡを単離し、２つの方法のいずれかによりサイズ分画する。方法１注射針に通すことにより全細胞ＤＮＡを機械的に剪断して、標準的方法に従ってサイズ分画する。１１ｋｂまでのサイズのＤＮＡフラグメントをエキソヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼでの処理により平滑末端化し、ＥｃｏＲIリンカーを付加する。ＥｃｏＲIで切断しておいたベクターラムダＺａｐII中にフラグメントを連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージングし、イー・コリをパッケージングされたライブラリーに感染させる。標準的方法によりライブラリーを増幅する。方法２全細胞ＤＮＡを４種の制限酵素の組み合わせ（ＲｓａI、ＰａｌI、ＡｕｌIおよびＢｓｈ１２３５I）を用いて部分加水分解し、標準的方法によりサイズ分画する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡに連結し、ついで、ＥｃｏＲI で切断しておいたベクターラムダＺａｐII中にフラグメントを連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージングし、イー・コリをパッケージングされたライブラリーに感染させる。標準的方法によりライブラリーを増幅する。実施例２感染の問におけるスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９由来の遺伝子発現の検出スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９での感染４日目のマウスの鼠蹊部からの壊死脂肪組織を効果的に破砕し、カオトロピック剤およびＲＮＡａｓｅ阻害剤の存在下で処理して動物および細菌ＲＮＡの混合物を得る。安定な調合品および高収量の細菌ＲＮＡを得るための破砕および処理の最適条件は、ノーザンブロットによるスタフィロコッカス・アウレウス１６ＳＲＮＡに特異的な放射性標識オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの使用によるものである。得られたＲＮＡａｓｅ不含、ＤＮＡａｓｅ不含、ＤＮＡおよびタンパク質不含のＲＮＡ調合品は、スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９の各遺伝子配列から設計した独特なプライマー対を用いる逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に適する。ａ）マウス動物感染モデルからのスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９で感染した組織の単離寒天培養プレートから単離した個々のスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９のコロニーを容積１０ｍｌの滅菌栄養ブロス（No.2 Oxoid）に撒く。培養物を３７℃で１６ないし２０時間好気的にインキュベーションする（静置培養）。４週齢のマウス（メス、１８ないし２２ｇＮＭＦＩ株）を、このスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９のブロス培養物０．５ｍｌ（約１０⁸ｃｆｕ／ｍｌまでブロスを希釈）を前方の右の下方四分円（鼠蹊部）に皮下注射することにより感染させる。感染後最初の２４時間はマウスを規則的にモニターすべきであり、ついで、研究終了まで毎日モニターすべきである。全身感染の徴候、すなわち昏睡、毛の逆立ち、群からの孤立を有する動物を詳細にモニターすべきであり、徴候が瀕死状態にまで進行した場合、すぐに動物を選別すべきである。傷害進行の可視的外部徴候は感染後２４ないし４８時間で現れるであろう。動物の腹部の検査により、皮膚下の膿瘍の盛り上がった輪郭が示されるであろう。局在化した傷害は右の下方四分円に残るはずであるが、場合によっては左の下方四分円に広がるかもしれず、上昇して胸部に至るかもしれない。かかる場合、罹病動物をすぐに選択し、可能ならば組織試料を採る。動物を選択しない場合、膿瘍上にある壊死皮膚組織が脱落し、腹部筋肉壁が露出するかもしれない。感染から約９６時間後、二酸化炭素窒息を用いて動物を殺す。死亡時と組織処理／保存時の隔たりを最小化するため、マウスを群としてではなく個別に殺すべきである。死亡した動物を背を下にして置き、毛を７０％アルコールでおおまかに拭く。左の下方四分円の皮膚から上部へと、ついで、胸部を通るように、はさみを用いて最初の切開を行う。腹部の右の下方四分円の株を切ることにより切開を完了する。腹膜を貫通しないように注意する。垂れ下がった皮膚を鉗子で持ち、皮膚を静かに腹部から引き上げる。腹膜を覆っているが筋肉シートを完全には貫通していない膿瘍が露出しており、内蔵に穴をあけないように注意しながらこれを切除する。液体窒素中での瞬間凍結の前に、膿瘍／筋肉シートおよび他の感染組織を断片に切る必要があるかもしれず、そのことによりプラスチック製収集バイアル中での貯蔵が簡単になる。ｂ）感染組織試料からのスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９ＲＮＡの単離２ｍｌのスクリューキャップ試験管中の４ないし６種の組織試料（それぞれ約０．５ないし０．７ｇ）を−８０℃の貯蔵庫からドライアイスエタノール浴中に取り出す。微生物学的安全キャビネット中で、試料をドライアイスエタノール浴中で冷却しながら試料を個々に破砕する。組織試料中の細菌を破砕するために、１ｍｌの TRIzol 試薬（Gibco BRL，Life Tehnologies）を添加し、次いで、十分な０．１ｍｍジルコニア／シリカビーズを試験管をほとんど満たすまで添加し、密封性を良好にし、エアロゾル発生をなくすために、ねじ山にビーズが入らないように注意しながら蓋を戻す。ついで、Mini-BeadBeaterBX-4 型（BiospecPro ducts）を用いて試料をホモジナイズする。壊死脂肪組織を５０００ｒｐｍで１００秒間処理して細菌を溶解させる。インビボで増殖した細菌にっいてはインビトロで増殖したエス・アウレウスＷＣＵＨ２９（３Ｏ秒間ビーズでビートすることにより破砕）よりも長時間の処理が必要である。ビーズでビートした後、ヒュームフード中で開栓するまで試験管を氷で冷却する。なぜなら破砕中に発生する熱がTRIzol を分解し、シアニドを遊離させるかもしれないからである。ついで、２００マイクロリットルのクロロホルムを添加し、試験管を１５秒間手で振り混ぜ、混合を完全にする。室温で２ないし３分後、試験管を１２０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、ついで、TRIzol 試薬の製造者により示された方法に従ってＲＮＡ抽出を継続する。すなわち、水相約０．６ｍｌを滅菌エッペンドルフチューブに移し、０．５ｍｌのイソプロパノールを添加する。室温で１０分後、試料を１２０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離する。上清を取り、これを捨てて、ＲＮＡペレットを１ｍｌの７５％エタノールで洗浄する。ボルテックスを用いて短時間撹拌して試料を混合し、ついで、７５００ｇ、４℃で５分間遠心分離する。エタノールを除去し、ＲＮＡペレットを５分間ほど減圧乾燥する。ついで、１００マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水中に繰り返しピペッティングすることにより試料を再溶解し、ついで、５ないし１０分間５５℃に置く。最後に、少なくとも１分間氷上に置き、２００ユニットのRnasin（Promega）を添加する。ＲＮＡ調合品は−８０℃で１カ月まで保存される。長期保存には、プロトコールの７５％エタノール洗浄段階でＲＮＡ沈殿を少なくとも１年間−２０℃で保存できる。試料を１％アガロースゲル上に泳動させることにより単離ＲＮＡの品質を評価する。臭化エチジウムで染色した１ｘＴＢＥゲルを用いて全ＲＮＡ収量を可視化する。感染組織からの細菌ＲＮＡの単離を示すために、１ｘＭＯＰＳ、２．２Ｍホルムアミドゲルで泳動を行い、Hybond-N（Amersham）に減圧ブロッティングする。ついで、エス・アウレウスの１６ｓｒＲＮＡに特異的な³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブ（K.Greisen,M.Loeffelholz,A.Purohit and D.Leong.J.Clin .(1994)Microbiol．32 335-351）にブロットをハイブリダイゼーションさせる。配列が：5'-gctcctaaaaggttactccaccggc-3'（配列番号６）であるオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる。ハイブリダイゼーションするバンドのサイズを、インビトロで増殖したエス・アウレウスＷＣＵＨ２９から単離された対照ＲＮＡのサイズとノーザンブロッドにおいて比較する。全ＲＮＡ試料中に正しいサイズの細菌１６ｓｒＲＮＡバンドを検出でき、ＴＢＥゲル上で可視化すると哺乳動物ＲＮＡの進んだ分解が示される。ｃ）ＲＮＡ由来のスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９からのＤＮＡの除去２００ユニットの Rnasin（Promega）を添加したバッファー中(最終体積９０マイクロリットル)で３ユニットのＤＮＡａｓｅＩ(増幅グレード(Gibco BRL,Lif eTechnologies))で１５分間氷上にて処理することにより、７３マイクロリットルのＲＮＡ試料からＤＮＡを除去した。製造者のプロトコールに従ってＤＮＡａｓｅを不活性化し、TRIzol LS 試薬（ Gibco BRL,Life Technologies）で処理することにより除去した。ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡを、方法１と同様に Rnasin を添加した７３マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水中に再懸濁した。ｄ）感染組織由来のＲＮＡ試料からのｃＤＮＡの調製ＤＮＡａｓｅ処理したＲＮＡの１０マイクロリットルの試料を、製造者の指示に従ってSuperScript Preamplification System for First Strand cDNA Synthe sisKit（Gibco BRL,Life Technologies）を用いて逆転写する。１ナノグラムのランダムヘキサマーを用いて各反応を開始させる。SuperScriptII 逆転写酵素を添加していない対照も反応させる。＋／−両方のＲＴ試料をＲＮａｓｅＨ処理し、ついで、ＰＣＲ反応を進行させる。ｅ）細菌ｃＤＮＡ種の存在を調べるためのＰＣＲの使用ＰＣＲ反応物を下記成分を添加して、氷上で０．２ｍｌのチューブ中にセットアップする：４５マイクロリットルの PCR SUPER MIX （Gibco BRL，Life Technologies）１マイクロリットルの５０ｍＭＭｇＣｌ₂(最終濃度を２．５ｍＭに調節する) １マイクロリットルのＰＣＲプライマー(長さ１８ないし２５塩基対であってよく、類似のアニーリング温度を有するように設計されている)、各プライマーの最終濃度１０ｍＭ２マイクロリットルのｃＤＮＡ下記のごとく Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600 によりＰＣＲ反応を行う：９５℃で５分、その後、９４℃、４２℃および７２℃でそれぞれ３０秒、ついで、７２℃で３分のサイクルを５０回行い、その後、温度を４℃に維持する (ＰＣＲ生成物の出現または不存在を決定するには、最適にはサイクル数は３０ないし５０回であり、ＲＴ反応から得られたｃＤＮＡの初発量の評価を行う場合には、最適には８ないし３０サイクル)。ついで、１０マイクロリットルの部分試料を１％の１ｘＴＢＥゲルで泳動し、ＰＣＲ生成物を臭化エチジウム染色し、存在する場合には、ＤＮＡラダー（Gibc oBRL，Life Technologies）を用いて標識した１００ｂｐのとの比較によりサイズを評価する。別法として、ＰＣＲ生成物が標識ＰＣＲプライマー（例えば、色素で５’末端を標識されたもの）により便利に標識される場合には、ＰＣＲ生成物の適当な部分試料をボリアクリルアミド配列決定ゲルで泳動し、適当なゲルスキャンニングシステム（例えば、Perkin Elmer により提供される GeneScan^TMソフトウェアを用いる ABI Prism^TM377 シークエンサー）を用いてその存在および量を検出する。ＲＴ／ＰＣＲ対照は、＋／−逆転写酵素反応物、１６ｓｒＲＮＡプライマーまたは非転写エス・アウレウスＷＣＵＨ２９ゲノム配列からＰＣＲ生成物を得るように設計されたＤＮＡ特異的プライマー対を含んでもよい。プライマー対の効率を試験するために、それらをＷＣＵＨ２９全ＤＮＡを用いるＤＮＡＰＣＲに使用する。ＰＣＲ反応をセットアップし、ｃＤＮＡのかわりに約１マイクログラムのＤＮＡを用いて３５サイクルのＰＣＲを上記のごとく行う。ＤＮＡＰＣＲにおいてもＲＴ／ＰＣＲにおいても予想サイズの生成物を生じないプライマー対はＰＣＲを失敗させるものであり、それゆえ有用でない。ＤＮＡＰＣＲを用いて正しいサイズの生成物を生じるプライマーのうち２つのクラスがＲＴ／ＰＣＲにおいて区別される：１．インビボで再現可能に転写されない遺伝子はＲＴ／ＰＣＲにおいて生成物を生じない。２．インビボで再現可能に転写される遺伝子は、ＲＴ／ＰＣＲにおいて正しいサイズの生成物を生じ、−ＲＴ対照におけるシグナル（存在する場合）よりも強力なシグナルを＋ＲＴ試料において示す。上記試験において、下記ヌクレオチド配列（配列番号１）をインビボで転写されるものとして同定した。推定アミノ酸配列を配列番号２および５に示す。遺伝子同定に使用するＰＣＲプライマー対は、配列番号３および４に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/45 Ａ６１Ｋ 39/085 39/085 45/00 45/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/573 ＡＧ０１Ｎ 33/573 Ａ６１Ｋ 37/52 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号９６０４５８１．０ (32)優先日平成８年３月４日(1996．3．4) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９６１２８８７．１ (32)優先日平成８年６月20日(1996．6．20) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号６０／０２７，９７２ (32)優先日平成８年10月８日(1996．10．8) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ホッジソン，ジョン・エドワードアメリカ合衆国19426―0989ペンシルベニア州カレッジビル、ポスト・オフィス・ボックス5089、サウス・カレッジビル・ロード1250番、スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ (72)発明者バーナム，マーティン・カール・ラッセルアメリカ合衆国19426―0989ペンシルベニア州カレッジビル、ポスト・オフィス・ボックス5089、サウス・カレッジビル・ロード1250番、スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ

Claims

【特許請求の範囲】１．(ａ)配列番号２のアミノ酸１から４５０までを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号５のアミノ酸１から４５２までを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチドヌクレオチド、 (ｃ)(ａ)のポリヌクレオチドに対して相捕的なポリヌクレオチド、 (ｄ)(ｂ)のポリヌクレオチドに対して相捕的なポリヌクレオチド、および、 (ｅ) (ａ)、(ｂ)、(ｃ) または(ｄ) のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続した塩基を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるメンバーを含む単離ポリヌクレオチド。２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。３．ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。４.配列番号１に示されるヌクレオチド５４から１４０６までと相補的な配列、および、配列番号１に示されるヌクレオチド５４から１４１２までと相補的な配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項２記載のポリヌクレオチド。５．新規ＮＡＧＰＵポリペプチドをコードしている、配列番号１に示されるポリヌクレオチドを含む請求項２記載のポリヌクレオチド。６．配列番号２のアミノ酸１から４５０、および、配列番号５のアミノ酸１から４５２からなる群から選択されるアミノ酸を含むポリペプチドをコードしている請求項２記載のポリヌクレオチド。７．（ａ）ＮＣＩＭＢ受託番号４０７９４に含まれるＤＮＡにより発現されるのと同じ成熟ポリペプチドをコードしていて配列番号１のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド、（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相捕的なポリヌクレオチド、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の塩基を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるメンバーを含む単離ポリヌクレオチド。８．請求項２記載のＤＮＡを含むベクター。９．請求項８記載のベクターを含む宿主細胞。１０．請求項９記載の宿主細胞から該ＤＮＡによりコードされているポリペプチドを発現させることを含む、ポリペプチドの製造方法。１１．請求項８記載のベクターで細胞をトランスフォーメーションまたはトランスフェクションして、ベクター中に含まれるｃＤＮＡによりコードされているポリペプチドを細胞が発現するようにすることを含む、ポリペプチドを発現する細胞の製造方法。１２．配列番号２の１から４５０および配列番号５の１から４５２からなる群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。１３．配列番号２に示されるアミノ酸および配列番号５に示されるアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。１４．請求項１２記載のポリペプチドに対する抗体。１５．請求項１２記載のポリペプチドの活性を阻害するアンタゴニスト。１６．治療上有効量の請求項１２記載のポリペプチドを個体に投与することを含む、新規ＮＡＧＰＵタンパク質を必要とする個体の治療方法。１７．該ポリペプチドをコードしていてインビボで該ポリペプチドを発現するＤＮＡを個体に提供することにより該治療上有効量のポリペプチドが投与される請求項１６記載の方法。１８．治療上有効量の請求項１５記載のアンタゴニストを個体に投与することを含む、新規ＮＡＧＰＵタンパク質ポリペプチドを阻害する必要のある個体の治療方法。１９．請求項１２記載のポリペプチドの発現に関連した疾病の診断方法であって、該ポリペプチドをコードしている核酸配列を決定することを含む方法。２０．宿主由来の試料中の請求項１２記載のポリペプチドの存在について分析することを含む診断方法。２１．結合手段への結合を可能にする条件下にて、ポリペプチドに対する結合手段（該結合手段は、該結合手段への化合物の結合に応答して検出可能シグナルを発しうる第２の成分に結合しているものである）を表面上に発現する細胞をスクリーニングすべき化合物と接触させ、次いで、化合物と結合手段との相互作用により生じるシグナルの存在または不存在を検出することにより、化合物が結合物質に結合し、これを活性化または阻害するかどうかを決定することを含む、請求項１２のポリペプチドに結合し、その活性を阻害する化合物の同定方法。２２．哺乳動物を疾病から防御する抗体を産生させるに十分な新規ＮＡＧＰＵタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変種を哺乳動物に接種することを含む、哺乳動物における免疫学的応答を誘導する方法。２３．遺伝子治療により、新規ＮＡＧＰＵタンパク質、またはそのフラグメントもしくは変種をインビボで送達して哺乳動物を疾病から防御する抗体を産生させる免疫学的応答を誘導することを含む、哺乳動物における免疫学的応答を誘導する方法。２４．新規ＮＡＧＰＵポリヌクレオチドをコードしていてこれを発現するＤＮＡまたはそれによりコードされているタンパク質を含んでなる免疫学的組成物であって、哺乳動物中に導入された場合、新規ＮＡＧＰＵタンパク質のポリヌクレオチドまたはそれによりコードされているタンパク質に対する免疫学的応答を哺乳動物において誘導する組成物。