JP2002525048A - Ｒｎａｓｅｐポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規細菌リボヌクレオ蛋白複合体およびその成分に関する。より詳細には、本発明は、スタフィロコッカス・アウレウスから単離されたＲＮａｓｅＰ ＲＮＡならびに抗微生物化合物の同定のためのスクリーニングにおけるＲＮａｓｅＰＲＮＡの使用ならびに治療におけるかかる化合物の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチドおよびこれら特定のポリヌクレ
オチドの特定のものによりコードされるポリペプチド、ＲＮＡとポリペプチドの
分子複合体、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにかか
るポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造ならびにポリヌクレオチドで形質
転換された組み換え宿主細胞に関する。本発明は、特に、スタフィロコッカス属
（Staphylococci）、とりわけスタフィロコッカス・アウレウス（エス・アウレ
ウス（Staphlococcus aureus)）由来のかかるポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドに関する。また本発明は、かかるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプ
チドの生合成、アッセンブリーまたは作用を阻害することに関し、さらに治療に
おけるかかる阻害剤の使用にも関する。

【０００２】発明の背景 本発明は、新規細菌リボヌクレオ蛋白複合体およびその構成部分に関する。よ
り詳細には、本発明は、ＲＮａｓｅＰ、特に、スタフィロコッカス・アウレウス
由来のＲＮａｓｅＰならびに抗微生物化合物の同定のためのスクリーニングにお
けるＲＮａｓｅＰまたはその構成成分の使用ならびに治療におけるかかる化合物
の使用に関する。 スタフィロコッカス属は医学的に重要な微生物属を形成している。それらは、
２つの型の疾患、侵入性および毒素生産性の疾患を引き起こすことが知られてい
る。侵入感染は、一般に、皮膚表面および深部組織に影響する膿瘍形成により特
徴付けられている。癌患者において、エス・アウレウスは２番目に主要な要因の
大腸菌である。骨髄炎、敗血性関節炎、敗血性静脈炎および急性細菌性心内膜炎
もまた比較的一般的である。スタフィロコッカス属の毒素生産性特性による臨床
的症状は、少なくとも３つの症状ある。かかる疾患が発症することで、その結果
の発現により、組織感染症および菌血症に対抗する用に外毒素の作用が形成され
る。かかる症状は、スタフィロコッカス属による食中毒、熱傷様皮膚症候群およ
び毒素ショック症候群を包含する。

【０００３】 スタフィロコッカス・アウレウス感染の頻度は過去２０年間に劇的に上昇して
いる。これは多重抗生物質耐性株の出現、および免疫系が低下した人の集団の増
加に起因している。いくつかのまたは全ての標準的な抗生物質に対して耐性を有
するスタフィロコッカス・アウレウス株を単離することはもはやめずらしいこと
ではない。この現象がこの生物に対する新しい抗菌剤、ワクチンおよび診断試験
についての必要性を形成した。

【０００４】 病原性に関連したある種のスタフィロコッカスの蛋白、例えば凝固酵素、溶血
毒、白血球毒およびエキソおよびエンテロ毒素が同定されているが、さらなる標
的が常に有用である。なぜなら、抗微生物剤のスクリーニングの標的はしばしば
結果を片寄らせるからである。よって、新たな標的は新たなクラスの抗微生物剤
の発見を可能にするものである。

【０００５】発明の簡単な説明 本発明は、新規リボヌクレオ蛋白複合体、特に、スタフィロコッカス・アウレ
ウス由来のかかる複合体、ならびに別個に単離されたそのＲＮＡおよび蛋白成分
を提供する。 本発明のもう１つの態様によれば、かかる複合体の蛋白およびＲＮＡ成分をコ
ードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が提供される。 詳細には、本発明は、本明細書に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを
提供する。 また本発明は、例えば、ＲＮＡまたは蛋白成分の発現に対するアンチセンス阻
害剤として作用しうる、本明細書記載の配列由来の新規オリゴヌクレオチドにも
関する。オリゴヌクレオチドまたはそのフラグメントもしくは誘導体を用いて、
触媒活性を直接的に阻害でき、あるいはＲＮＡ蛋白複合体形成を妨害することに
より間接的に活性を阻害することもできる。蛋白およびＲＮＡ成分は、別個にあ
るいは複合体となって、抗微生物化合物を同定するように設計されたスクリーニ
ングにおける標的としても有用である。 表１［配列番号：２］に記載のアミノ酸配列および公知のアミノ酸配列または
他の蛋白、例えばビー・サチリス（B.sbtilis） ＲＮａｓｅ Ｐ 蛋白の配列
アミノ酸の間の相同関係により新規ＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドとして同定され
ているポリペプチドを提供することが本発明の一の目的である。 本発明のさらなる目的は、ＲＮａｓｅ Ｐポリペプチド、特にＲＮａｓｅ Ｐ
としてここに記載したポリペプチド、およびＲＮａｓｅ ＰＲＮＡ、特に触媒Ｒ
ＮＡに転写されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドをコードする
ポリヌクレオチドを提供することである。 本発明の特に好ましい具体例は、ポリヌクレオチドは、遺伝子の全長またはそ
の異型を含む表１［配列番号：１］に記載の配列を含むＲＮａｓｅ Ｐポリペプ
チドをコードする部位を含むポリヌクレオチドである。 本発明のもう一つの特に好ましい具体例は、表１［配列番号：２］のアミノ酸
配列またはその異型を含むスタフィロコッカス・アウレウスからの新規ＲＮａｓ
ｅ Ｐ蛋白である。 本発明のもう１つの態様によれば、寄託株中に含まれるスタフィロコッカス・
アウレウスＷＣＵＨ２９株により発現可能な生長したポリペプチドをコードする
単離核酸分子が提供される。

【０００６】 本発明のさらなる態様によれば、ＲＮａｓｅＰ、詳細にはスタフィロコッカス
・アウレウスのＲＮａｓｅ Ｐをコードしている単離核酸分子が提供され、それ
にはｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが包含される。本発明のさらなる具体例
は、生物学的、診断学的、予防的、臨床的もしくは治療的に有用なその変種、お
よびそれらを含む組成物を包含する。 本発明のもう１つの態様によれば、治療または予防を目的とした、特に遺伝学
的免疫を目的とした、本発明のポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明の
特に好ましい具体例には、ＲＮａｓｅ Ｐの天然に存在する対立遺伝子変種およ
びそれによりコードされるポリペプチドがある。 本発明のもう１つの態様として、本明細書においてＲＮａｓｅＰと称されるス
タフィロコッカス・アウレウスの新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診断学
的、予防的、臨床的もしくは治療的に有用なそのフラグメント、変種および誘導
体、および前記したフラグメントおよびアナログの変種および誘導体、およびそ
れらを含む組成物が提供される。 本発明の特に好ましい具体例には、ＲＮａｓｅＰ遺伝子の天然に存在する対立
遺伝子によりコードされるＲＮａｓｅＰポリペプチドの変種がある。 本発明の好ましい具体例において、上記ＲＮａｓｅＰポリペプチドの製造方法
がある。 本発明のさらに別の態様によれば、例えば、抗体を含め、抗細菌剤として有用
なかかるポリペプチドの阻害剤が提供される。 本発明の特定の好ましい具体例によれば、ＲＮａｓｅＰ発現の評価、疾病の治
療、例えば上気道疾患（例えば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺
炎）、下気道疾患（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓疾患（例えば、感染性心内
膜炎）、胃腸疾患（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ疾患
（例えば、大脳膿瘍）、眼疾患（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前
中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および尿管疾患（例えば、副睾丸炎、腎内
および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚疾患（例えば、膿痂疹、
毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、ならびに骨および関節疾
患（例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎）最も詳細には例えば脳脊髄液の感染のご
とき髄膜炎の治療、遺伝学的変異のアッセイ、ならびに細菌、特にスタフィロコ
ッカス・アウレウス細菌に対する免疫学的応答を生起するための生物へのＲＮａ
ｓｅＰポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与のための、製品、組成物およ
び方法が提供される。 本発明のこのおよび他の態様の特定の好ましい具体例によれば、特に、ストリ
ンジェントな条件下でＲＮａｓｅＰポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーシ
ョンするポリヌクレオチドが提供される。 本発明の特定の好ましい具体例において、ＲＮａｓｅＰポリペプチドに対する
抗体が提供される。

【０００７】 本発明の他の具体例において、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド
の結合、あるいは相互作用して、それらの活性を阻害または活性化する化合物の
同定方法が提供され、該方法は、化合物とポリペプチドまたはポリヌクレオチド
との間の結合あるいは他の相互作用を可能にする条件下で、本発明のポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチドをスクリーニングすべき化合物と接触させて、化合物
との結合あるいは他の相互作用を評価し（かかる結合または相互作用は、ポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドと化合物との結合あるいは相互作用に応答して検
出可能なシグナルを提供することのできる第２の化合物に関連している）、次い
で、化合物とポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの結合または相互作用から
生じるシグナルの存在または不存在を検出することにより、化合物がポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチドに結合あるいは相互作用して、それらの活性を活性化
または阻害するかどうかを決定することを含む。 本発明のさらにもう１つの態様によれば、ＲＮａｓｅＰのアゴニストおよびア
ンタゴニスト、好ましくは静細菌性または殺細菌性アゴニストおよびアンタゴニ
ストが提供される。 本発明のさらなる態様において、単細胞または多細胞生物に投与するための、
ＲＮａｓｅＰポリヌクレオチドまたはＲＮａｓｅＰポリペプチドを含む組成物が
提供される。 開示した本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、以下の記載
を読むこと、および本明細書のその他の部分を読むことにより、当業者に容易に
明らかとなろう。

【０００８】用語 以下の説明は、本明細書において汎用される特定の用語の理解を容易にす
るために示すものである。他の特定の定義は本明細書の他の場所で説明する。 「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配列により形質転換もしくはトランス
フェクションされた、または形質転換またはトランスフェクションすることので
きる細胞である。 当該分野にて周知であるように「同一性」は、配列を比較して測定されるよう
な、二つまたはそれ以上のポリペプチド配列間または二つまたはそれ以上のポリ
ヌクレオチド配列間の関係である。当該分野において、「同一性」とはまた、時
には、かかる配列の２つの鎖の間の合致により決定されるような２つのポリペプ
チドまたはポリヌクレオチド配列間の関連性の程度をも意味する。「同一性」は
ともに既知方法により容易に算出できる(Computational Molecular Biology,Les
k,A.M.編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、1988
年;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編、アカデミッ
ク・プレス、ニューヨーク、1993年;Computer Analysis of Sequence Data,ハ゜ート I,Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒューマナ・プレス、ニュージャージー 、1994年;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.、アカデミッ
ク・プレス、1987年;およびSequence Analysis Primer,Gribskov,M.およびDever
eux,J.編、Mストックトン・プレス、ニューヨーク、1991年;およびCarillo,H.,お
よびLipman,D.,SIAM J., Applied Math., 48:1073(1988)があるがこれらに限ら
ない)。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する２つの配列間で最も
良く適合するように設計される。同一性および類似性を測定する方法は、公に利
用できるコンピュータープログラムに集成されている。二つの配列間の同一性お
よび類似性を測定する好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラ
ムパッケージ(Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387(1984)、BLASTP
、BLASTNおよびFASTA(Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215:403(1990)))を包含する
が、これらに限定されるものではない。BLAST Xフ゜ロク゛ラムはNCBIおよび他のソースから 公に利用できる(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda
, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990))。

【０００９】 説明するように、配列番号：１の対照配列に対して少なくとも９５％の同一性
を有する単離ポリヌクレオチド配列を包含するポリヌクレオチド配列によって、
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は対照配列と同一であることが示される。
ただし、ポリヌクレオチド配列は配列番号：１の対照ヌクレオチド配列中の１０
０個当たり５個所までの変異を含んでいてもよい。言い換えれば、対照ヌクレオ
チド配列に少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を包含するポリ
ヌクレオチドを得るために、対照配列中５％までヌクレオチドが決死津するかま
たは他のヌクレオチドで置換されてもよいか、あるいは対照配列中の全ヌクレオ
チドの５％までのヌクレオチドが対照配列中に挿入されても良い。対照配列のか
かる変異は対照ヌクレオチド配列の５または３末端で起こっても、独立して対照
配列中または対照配列中の１個または１個以上の隣接する群中のヌクレオチドの
間で広がっているかかる末端間のいずれで起こってもよい。類似して、、配列番
号：２の対照配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する単離ポリペプチド
配列を包含するポリペプチド配列によって、ポリペプチドのヌクレオチド配列は
対照配列と同一であることが示される。ただし、ポリペプチド配列は配列番号：
２の対照ヌクレオチド配列中の１００個当たり５個所までの変異を含んでいても
よい。言い換えれば、対照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％の同一性を有す
るヌクレオチド配列を包含するポリペプチドを得るために、対照配列中５％まで
ヌクレオチドが決死津するかまたは他のヌクレオチドで置換されてもよいか、あ
るいは対照配列中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチドが対照配列中に挿
入されても良い。対照配列のかかる変異は対照ヌクレオチド配列の５または３末
端で起こっても、独立して対照配列中または対照配列中の１個または１個以上の
隣接する群中のヌクレオチドの間で広がっているかかる末端間のいずれで起こっ
てもよい。 「単離された」とは、「ヒトの手により」、その天然の状態から変えられるこ
と、すなわち、天然物の場合、その本来的な環境から変化または除去あるいは両
方されたことを意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態で共存する物質
から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書で用いる
用語としての「単離された」ものである。

【００１０】 「ポリペプチド（複数でも可）」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合で
互いに結合した２つまたはそれ以上のアミノ酸を含むいずれのペプチドまたは蛋
白をもいう。「ポリペプチド（複数でも可）」は、通常、ペプチド、オリゴペプ
チドまたはオリゴマーと称される短い鎖、および一般に蛋白と称される長い鎖の
両方をいう。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされている２０個のアミノ酸
以外のアミノ酸を含有してもよい。「ポリペプチド（複数でも可）」は、プロセ
ッシングおよび他の翻訳後の修飾のごとき自然の工程、または化学修飾技法のい
ずれかによって修飾されたものを有する。かかる修飾は、基本テキストにて、お
よびより詳細な研究論文にて、ならびに膨大な研究文献にて詳しく記載されてお
り、それらは当業者に周知である。同じ型の修飾が、所定のポリペプチド中、い
くつかの部位で、同じまたは異なる程度にて存在してもよいことは明らかであろ
う。また、所定のペプチドは多くの型の修飾を有していてもよい。修飾は、ペプ
チド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチド
のどこででも起こりうる。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リ
ボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド
またはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホス
ホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱
メチル化、共有交差結合の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホ
ルミル化、ガンマーカルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキ
シル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解的プロセッシン
グ、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、糖鎖形成、脂質付加、硫酸化、グルタミ
ン酸残基のガンマーカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化
、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のごとき転移ＲＮＡにより媒介される蛋
白へのアミノ酸付加、およびユビキチネーションを包含する。例えば、蛋白−ST
RUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 第2版,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Co
mpany,New York(1993)およびWold,F.,POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATIO
N OF PROTEIN,Posttranslational protein Modifications:Perspectives and Pr
ospects,pgs. 1-12,B.C.Johnson編,Academic Press,New York(1983);Seifterら,
Meth Enzymol.(1990)182:626-646、およびRattanら, proteinynthesis:Posttrans
lational Modifications and Aging,Ann N.Y. Acad Sci(1992)663:48-62を参照
のこと。ポリペプチドは、分枝してもよく、分枝を伴ったまたは伴わない環状で
あってもよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロ
セッシングの結果であり、同様に全く合成的な方法で合成できる。

【００１１】 本明細書で用いる「変種」なる用語は、対照ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドとは各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的な特
性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変種は、別の対照ポリヌクレオ
チドとはヌクレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列の変化は、対照ポ
リヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させるも
のであってもよく、変化させないものであってもよい。以下に論じるように、ヌ
クレオチドの変化は結果的に、対照配列によりコードされるポリペプチドにおけ
るアミノ酸置換、付加、欠失、融合および末端切断を招く。典型的なポリペプチ
ドの変種は、別の対照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的には、差
異は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体的に非常に類似しており、多
くの領域で同一なものに限られる。変種および対照ポリペプチドは、１またはそ
れ以上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせで起こることにより、アミノ酸配
列が変化し得る。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝学的コードにより
コードされたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドの変種は、例えば対立遺伝子変種のような自然発生的なものでもよく、または
自然発生することが知られていない変種でもよい。ポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの非自然発生変種は、突然変異技術または直接的合成、および当業者に
知られた他の組み換え法により製造できる。

【００１２】発明の詳細な説明 リボヌクレオ蛋白であるＲＮａｓｅ Ｐは生合成におけるＲＮＡ（ｔＲＮＡ）
の転移に重要な役割を示しており、それ自体蛋白生合成の重要中間体である。Ｒ
Ｎａｓｅ Ｐはエンドリボ核酸分解作用により前駆体ｔＲＮＡを成熟ｔＲＮＡに
プロセッシングする機能を果たしている。研究された原核細胞における複合体は
２個のサブユニットから構成されている。それらは触媒ＲＮＡおよび蛋白コファ
クターである。ある種のＲＮａｓｅ Ｐ分子に関する最近のレビューが存在する
。例えば、L. A. Kirsebom, Molecular Microbiology 17(3), 411-420 (1995)ま
たはN. R. Pace and J. W. Brown, J. Bacteriol. 177(8), 1919-1928 (1995)参
照。 本発明は、後でより詳細に説明する新規ＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドに関する。詳細には、本発明は、図２および５並びに配列番号：
２に示すＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドに対するアミノ酸配列相同性により関連づ
けられるスタフィロコッカス・アウレウススタフィロコッカス・アウレウスの新
規ＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。特に本発明は
、それぞれ表１、配列番号：１および配列番号：２に示すヌクレオチドおよびア
ミノ酸配列を有するＲＮａｓｅ Ｐならびに寄託株のＤＮＡのＲＮａｓｅ Ｐヌ
クレオチド配列およびそれらによってコードされたアミノ酸配列に関する。また
本発明は、ＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ成分、特にこの触媒形態ならびにかかる成分
が転写される配列に関する。

【００１３】ＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ成分 系統発生論的比較により、二次構造モデリングおよび最小コンセンサス構造の
同定が容易に可能となる（図１）。ＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ構造に関するデータ
が利用可能であり、w.w.w.(http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/RNaseP/home.html)上
のRNase Pテ゛ータヘ゛ースが利用可能である。RNA成分が転写される本発明のホ゜リヌクレオチト゛ を図３［配列番号：１４］に示す。 一般的には、少数のヌクレオチドは保存されているが、水素結合領域中の補正
的塩基変化は、ユーバクテリアにおいて全体構造が保存されていることを示す。
一次配列の普遍的保存(E. coli: 61-74, 353-360)は他の保存的または半保存的
ヌクレオチドとともに機能上の重要性を示すものであるが、それらの意義は不明
である。現在に至るまで、すべてのＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ分子は折り畳まれて
コンセンサス「カゴ様」構造に適合できるものであり、このドメインを越えたと
ころでは原核細胞および真核細胞のＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡの間には説得力のあ
る構造類似性はない。

【００１４】ＲＮａｓｅ Ｐ蛋白成分 蛋白の正確な機能上の役割は依然不明である。インビトロにおいては、蛋白成
分が触媒活性に必要とされないような実験条件を確立することもできるが、イン
ビボにおいて蛋白成分は必要であるように思われる。エス・アウレウス由来の新
規なＲＮａｓｅ Ｐ成分は、エス・アウレウス（Ｓａｕ）配列が他の微生物由来
の配列と一緒に配置した図２［配列番号：２］中に示されるアミノ酸配列により
同定され、特徴付けられている。 例えば、図５［配列番号：１および２］に示される配列から作成したプローブ
を用いて、Maniatis ら(後掲)に記載のインサイテューコロニーハイブリダイゼ
ーションによりスタフィロコッカス・アウレウスゲノムライブラリーを探索する
ことにより、無傷のＲＮａｓｅ Ｐ蛋白成分をコードする全長配列を得てもよい
。

【００１５】 表１ ＲＮａｓｅ Ｐポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列 （Ａ）スタフィロコッカス・アウレウスのＲＮａｓｅ Ｐポリヌクレオチド配列
由来の配列［配列番号：１］ 5’-ATG TTA TTG GAA AAA GCT TAC CGA ATT AAA AAG AAT GCA GAT TTT CAG AGA
ATA TAT AAA AAA GGT CAT TCT GTA GCC AAC AGA CAA TTT GTT GTA TAC ACT TGT
AAT AAT AAA GAA ATA GAC CAT TTT CGC TTA GGT ATT AGT GTT TCT AAA AAA CTA
GGT AAT GCA GTG TTA AGA AAC AAG ATT AAA AGA GCA ATA CGT GAA AAT TTC AAA
GTA CAT AAG TCG CAT ATA TTG GCC AAA GAT ATT ATT GTA ATA GCA AGA CAG CCA
GCT AAA GAT ATG ACG ACT TTA CAA ATA CAG AAT AGT CTT GAG CAC GTA CTT AAA
ATT GCC AAA GTT TTT AAT AAA AAG ATT AAG TAA-3’

【００１６】 （Ｂ）この表のポリヌクレオチド配列から推定されるスタフィロコッカス・ＲＮ
ａｓｅ Ｐポリペプチド配列［配列番号：２］ NH₂- MLLEK VYRIK KNADF GRIYK KGHSV ANRQF VVYTC NNKEI DHFRL GISVS KKLGN A
VLRN KIKRA IRENF KVHKS HILAK DIIVI ARQPA KDMTT LQIQN SLEHV LKIAK VFNKK I
K-COOH

【００１７】 （Ｃ）ポリヌクレオチド配列の具体例［配列番号：１］ X-(R₁)_n-ATG TTA TTG GAA AAA GCT TAC CGA ATT AAA AAG AAT GCA GAT TTT CAG
AGA ATA TAT AAA AAA GGT CAT TCT GTA GCC AAC AGA CAA TTT GTT GTA TAC ACT
TGT AAT AAT AAA GAA ATA GAC CAT TTT CGC TTA GGT ATT AGT GTT TCT AAA AAA
CTA GGT AAT GCA GTG TTA AGA AAC AAG ATT AAA AGA GCA ATA CGT GAA AAT TTC
AAA GTA CAT AAG TCG CAT ATA TTG GCC AAA GAT ATT ATT GTA ATA GCA AGA CAG
CCA GCT AAA GAT ATG ACG ACT TTA CAA ATA CAG AAT AGT CTT GAG CAC GTA CTT
AAA ATT GCC AAA GTT TTT AAT AAA AAG ATT AAG TAA-(R₂)_n-Y （Ｄ） ポリヌクレオチド配列の具体例 ［配列番号：２］． X-(R₁)_n-MLLEK VYRIK KNADF GRIYK KGHSV ANRQF VVYTC NNKEI DHFRL GISVS KKLG
N AVLRN KIKRA IRENF KVHKS HILAK DIIVI ARQPA KDMTT LQIQN SLEHV LKIAK VFNK
K IK-(R₂)_n-Y （Ｅ） スタフィロコッカス・アウレウスＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ遺伝
子［配列番号：３]. 5'-GTTCTGATATTTTGGGTAATCGCTATATTATATAGAGGAAAGTCCATGCTCACACAGTCTGAGATGATT
GTAGTGTTCGTGCTTGATGAAACAATAAATCAAGGCATTAATTTGACGGCAATGAAATATCCTAAGTCT TTCGATATGGATAGAGTAATTTGAAAGTGCCACAGTGACGTAGCTTTTATAGAAATATAAAAGGTGGAA CGCGGTAAACCCCTCGAGTGAGCAATCCAAATTTGGTAGGAGCACTTGTTTAACGGAATTCAACGTAT AAACGAGACACACTTCGCGAAATGAAGTGGTGTACGACAGATGGTTATCACCTGAGTACCAGTGTGA CTAGTGCACGTGATGAGTACGATGGAACAGAACATGGCTTATAGAAATATCACTACTA G-3' (F) ポリヌクレオチド配列の具体例[配列番号：３]. X-(R₁)_n-GTTCTGATATTTTGGGTAATCGCTATATTATATAGAGGAAAGTCCATGCTCACACAGTCTGAGA
TGATT GTAGTGTTCGTGCTTGATGAAACAATAAATCAAGGCATTAATTTGACGGCAATGAAATATCCTAAGTCT TTCGATATGGATAGAGTAATTTGAAAGTGCCACAGTGACGTAGCTTTTATAGAAATATAAAAGGTGGAA CGCGGTAAACCCCTCGAGTGAGCAATCCAAATTTGGTAGGAGCACTTGTTTAACGGAATTCAACGTAT AAACGAGACACACTTCGCGAAATGAAGTGGTGTACGACAGATGGTTATCACCTGAGTACCAGTGTGA CTAGTGCACGTGATGAGTACGATGGAACAGAACATGGCTTATAGAAATATCACTACTA G-(R₂)_n-Y

【００１８】本発明のポリペプチド 本発明のポリペプチドは、表１［配列番号：２］に示すポリペプチド（特に成
熟ポリペプチド）ならびにポリペプチドおよびフラグメント、特にＲＮａｓｅ
Ｐの生物学的活性を有するものを包含し、さらに表１［配列番号：２］のポリペ
プチドまたはその重要部分に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプ
チドおよびフラグメント、より好ましくは表１［配列番号：２］のポリペプチド
に対して少なくとも８０％の同一性を有し、さらにより好ましくは表１［配列番
号：２］のポリペプチドに対して少なくとも９０％の類似性を有し（さらにより
好ましくは少なくとも９０％の同一性を有し）、さらに好ましくは表１［配列番
号：２］のポリペプチドに対して少なくとも９５％の類似性を有する（さらによ
り好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する）ポリペプチドおよびフラグメ
ント、さらに通常には少なくとも３０個、より好ましくは少なくとも５０個のア
ミノ酸を含むかかるポリペプチドの部分を包含する。

【００１９】 本発明はまた、表１（Ｄ）［配列番号：２］（式中、アミノ末端においてＸは
水素であり、カルボキシル末端においてＹが水素または金属、Ｒ_１およびＲ_２は
アミノ酸残基であり、ｎは１および１０００の間整数である）に示す式のポリペ
プチドを包含する。どちらのＲ基（ここでＲは１以上である）によっても示され
るアミノ酸残基の鎖は、ヘテロポリマーであってもホモポリマーであってもよく
、好ましくはヘテロポリマーである。 フラグメントは、前述のポリペプチドのアミノ酸配列のすべてではなく一部に
対して全く同一であるアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。ＲＮａｓ
ｅＰポリペプチドについては、フラグメントは「独立して存在（ｆｒｅｅ ｓｔ
ａｎｄｉｎｇ）」しているか、または一部分もしくは領域を形成することにより
、大型のポリペプチド内に含まれていてもよく、最も好ましくは単一の連続した
領域、すなわち大型の単一ポリペプチドとして含まれる。

【００２０】 好ましいフラグメントは、例えば、表１［配列番号：２］またはそれらの変種
のアミノ酸配列、の一部を有する末端切断ポリペプチドを包含し、例えば、アミ
ノ末端を含む一連の残基、またはカルボキシル末端を含む一連の残基も含まれる
。宿主細胞、特にスタフィロコッカス・アウレウススタフィロコッカスアウレウ
ス中の本発明のポリペプチドの分解形態も好ましい。また、構造的または機能的
属性により特徴づけられたフラグメント、例えばアルファーヘリックスおよびア
ルファーヘリックス形成領域、ベータシートおよびベータシート形成領域、ター
ンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領
域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成領域、
基質結合領域、および高抗原性指標領域を含むフラグメントなども好ましい。 ＲＮａｓｅＰの活性を媒介し、あるいは活性を改善し、望ましくない活性を減
じられたフラグメントである生物学的に活性のあるフラグメントも好ましい。動
物、とりわけヒトにおいて抗原的または免疫原的なフラグメントもまた含まれる
。個体、特にヒトにおけるスタフィロコッカス・アウレウスの生存に必須の機能
、あるいは疾病開の開始または維持する能力を付与する酵素の受容体またはドメ
インを含むフラグメントが特に好ましい。 本発明のポリペプチドのフラグメントである変種を、ペプチド合成による対応
全長ポリペプチドの製造に使用してもよく、それゆえ、これらの変種を全長のポ
リペプチド製造のための中間体として用いてもよい。本発明のポリヌクレオチド
のフラグメントである変種を用いて本発明の全長のポリヌクレオチドを合成して
もよい。

【００２１】本発明のポリヌクレオチド 本発明の別の態様は単離ポリヌクレオチドに関するものであり、それには表１
［配列番号：２］の推定アミノ酸配列を有するＲＮａｓｅＰポリペプチドをコー
ドする全長遺伝子、ならびにそれらに密接に関連したポリヌクレオチドおよびそ
れらの変種が包含される。 本明細書に提供される情報を用いて、例えば配列番号：１、３、４および１４
に示すポリヌクレオチド配列を用い、出発物質スタフィロコッカス・アウレウス
ＷＣＵＨ２９細胞からの染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列決
定するために用いるような標準的なクローニングおよびスクリーニングを用いて
、ＲＮａｓｅＰポリペプチドまたはＲＮＡ（配列番号：３から転写されるものの
ごとき）をコードしている本発明のポリヌクレオチドを得て、次いで、全長のク
ローンを得てもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチド配列、例えば配列番号
：１、３、４および１４に示す配列またはＲＮａｓｅＰ構造蛋白遺伝子を得るた
めに、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはいくつかの他の適切な宿主におけるス
タフィロコッカス・アウレウス ＷＣＵＨ２９の染色体ＤＮＡのクローンの典型
的なライブラリーを、部分的配列に由来する配列に由来する、好ましくは１７量
体またはそれ以上の長さの放射性標識化オリゴヌクレオチドにてプローブする。
プローブのＤＮＡに同一であるＤＮＡを担持するクローンはストリンジェントな
条件を用いて区別できる。元の配列から設計した配列決定プライマーを用いてこ
のように同定した個々のクローンを配列決定することにより、両方向で配列が伸
長できるようになり、全遺伝子配列を決定できる。このような配列決定は便宜的
にプラスミドクローンから調製した変性二本鎖ＤＮＡを用いて実施する。適切な
技法については、Maniatis,T.、Fitsch,F.F.およびSambrookら、Molecular Clonin
g,A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記載さ
れている(Screening By Hybridization 1.90およびSequencing Denatured Doubl
e-Stranded DNA Templates 13.70参照)。本発明の典型例において、表２［配列
番号：１、４および５］に示すポリヌクレオチドが、スタフィロコッカス・アウ
レウス ＷＣＵＨ２９由来のＤＮＡライブラリー中に見いだされた。

【００２２】 表１［配列番号：１］に示す特定のＤＮＡ配列は、当該分野において周知であ
るアミノ酸残基分子量を用いて算出できる推定分子量を有する、おおよその表１
［配列番号：２］に示すアミノ酸残基の数を有する蛋白をコードする読み取り枠
を含有する。配列番号：１のヌクレオチド番号１から３５１番の間にあるポリヌ
クレオチドが配列番号：２のポリペプチドをコードする。終止コドンは配列番号
：１のヌクレオチド番号３５２から始まる。 本発明のＲＮａｓｅＰは、寄託株のＲＮａｓｅＰをコードするＤＮＡを配列決
定した結果により明らかなように、構造的にＲＮａｓｅＰファミリーの他の蛋白
に関係する。蛋白は、公知の蛋白中ビー・サチリス蛋白と最大の相同性を示す。
表１［配列番号：２］のＲＮａｓｅＰは、その全長にわたりビー・サチリスＲＮ
ａｓｅＰポリペプチドのアミノ酸配列と有意な同一性および類似性を有している
。

【００２３】 本発明は、全長にわたって、表１［配列番号：１］にコーディング配列と同一
のポリヌクレオチド配列を提供する。さらに、本発明により提供するされるもの
は、成熟ポリペプチドのコーディング配列またはそれらのフラグメント、ならび
にその他のコーディング配列を有する読み枠中の成熟ポリペプチドのコーディン
グ配列またはそのフラグメント、例えばリーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、
プレプロ蛋白配列をコードする配列を提供する。ポリヌクレオチドは、例えば、
転写された非翻訳配列、終止シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化
する配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル等の転写非翻訳配列、および付
加アミノ酸をコードする付加コーディング配列等の非コーディング５’および３
’配列等の非コーディング配列をも含有しうるが、これらに限定するのではない
。例えば、融合ポリペプチドの精製を促すマーカー配列をコードすることもでき
る。本発明のある好ましい態様において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Ｑ
ｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）中に提供されるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド(G
entzら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:821-824(1989)に記載される）または
ＨＡタグ（Wilsonら、Cell,37:767(1984)）である。本発明のポリヌクレオチドは
また、構造遺伝子および遺伝子発現を調節する天然の配列をも含むが、これらに
限定するものではない。 好ましい本発明の具体例は、ＲＮａｓｅＰポリペプチドをコードする表１の配
列番号：１に示すヌクレオチド１ないし３５１または３５４を有するポリヌクレ
オチドである。

【００２４】 また本発明は、表１（Ｃ）［配列番号：１］および（Ｆ）［配列番号：３］に
示す式のポリヌクレオチドを包含し、式中の５’末端においてＸは水素であり、
３’末端においてＹは水素または金属であり、Ｒ１およびＲ２は核酸残基、ｎは
１ないし３０００の整数である。いずれかのＲ基（Ｒは１個よりも多い）により
示される核酸残基の伸長部分はヘテロポリマーであってもホモポリマーであって
もよく、好ましくはヘテロポリマーである。表１（Ｆ）［配列番号：３］に示す
配列の好ましい具体例は、Ｒ_１またはＲ_２が１ないし１０個または１ないし２０
個、特別には１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチド
である。また本発明は、かかるポリヌクレオチドから転写されるＲＮＡ、特に触
媒ＲＮＡを提供する。

【００２５】 上記した本明細書の用語「ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド」
は、本発明のポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含
し、詳細には、細菌のポリペプチド、より詳細には表１［配列番号：２］に示す
アミノ酸配列を有するスタフィロコッカス・アウレウスのＲＮａｓｅ Ｐのポリ
ペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。該用語は、コー
ディング配列および／または非コーディング配列を含んでいてもよいさらなる領
域を伴った、ポリペプチドをコードしている単一の連続領域または不連続領域（
例えば、組み込まれたファージまたは配列の挿入または配列の編集により分断さ
れたもの）を含むポリヌクレオチドを包含する。 さらに本発明は、表１［配列番号：２］の推定アミノ酸配列を有するポリペプ
チドの変種をコードする本明細書記載のポリヌクレオチドの変種にも関する。本
発明のポリヌクレオチドのフラグメントである変種を用いて本発明の全長ポリヌ
クレオチドを合成してもよい。 核酸塩基の標準Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕ表記に加えて、「Ｎ」なる文字も用いる。
「Ｎ」は、４つのＤＮＡまたはＲＮＡ塩基のいずれかが、ＤＮＡまたはＲＮＡ配
列の指定位置にあることを意味する。ただし、好ましい具体例において、隣接し
たヌクレオチド位置と一緒になって作用する場合、正確な読み取り枠を読み取っ
た場合で、Ｎがかかる読み取り枠中で未成熟終止コドンを生成する効果を有する
塩基とすることができない。

【００２６】 さらに特に好ましい具体例は、表１［配列番号：２］のＲＮａｓｅ Ｐポリペ
プチドのアミノ酸配列を有するＲＮａｓｅ Ｐ変種をコードするポリヌクレオチ
ドであり、その中には、いくつか、少しの、５ないし１０、１ないし５、１ない
し３、２、１または０個のアミノ酸残基を置換、欠失または付加を任意の組み合
わせで施したアミノ酸配列を有する。中でもとりわけ好ましいものは、ＲＮａｓ
ｅ Ｐの特性および活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失である
。

【００２７】 本発明のさらに好ましい具体例は、表１［配列番号：２］に示すアミノ酸を有
するＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して、
その全長にわたり少なくとも５０％、６０％または７０％の同一性があるポリヌ
クレオチド、およびかかるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド
である。あるいはまた、寄託株のＲＮａｓｅ Ｐポリペプチドをコードしている
ポリヌクレオチドに対してその全長にわたり少なくとも８０％同一である領域を
含むポリヌクレオチド、およびそれに対して相補的なポリヌクレオチドが最も非
常に好ましい。この点に関して、全長で少なくとも９０％同一であるポリヌクレ
オチドがとりわけ好ましく、中でも少なくとも９５％の同一性を有するものが特
に好ましく、さらに少なくとも９５％の同一性を有するものの中でも少なくとも
９７％であるのがより好ましく、中でも少なくとも９８％および少なくとも９９
％の同一性であるのが特に好ましく、さらに少なくとも９９％の同一性であるの
がより好ましい。 本発明の好ましい具体例は、配列番号：３、４または１４に示すヌクレオチド
配列を有するＲＮａｓｅＰポリヌクレオチドおよびかかるポリヌクレオチドに対
して相補的なポリヌクレオチドに対して全長にわたり少なくとも５０％、６０％
または７０％の同一性を有するポリヌクレオチドである。あるいはまた、寄託株
のＲＮａｓｅＰポリヌクレオチドおよびそれに対して相補的なポリヌクレオチド
に対して全長にわたり少なくとも８０％の同一性を有する領域を含むポリヌクレ
オチドが最も好ましい。この点において、これらの特に好ましいポリヌクレオチ
ドのうち、上記ポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％の同一性を有するポ
リヌクレオチドが好ましく、少なくとも９５％の同一性を有するものが特に好ま
しい。さらにそのうえ、少なくとも９５％の同一性を有するもののうち少なくと
も９７％の同一性を有するものが非常に好ましく、さらに少なくとも９８％の同
一性、そのうえさらに少なくとも９９％の同一性を有するものが特に非常に好ま
しい。これらのポリヌクレオチドがＲＮＡ、とりわけ、触媒ＲＮＡであるのが特
に好ましい。

【００２８】 好ましい具体例は、表１［配列番号：１］のＤＮＡによりコードされる成熟ポ
リペプチドあるいは配列番号：３、４または１４のＤＮＡにより転写されるＲＮ
ａｓｅＰのＲＮＡ成分と実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドである。

【００２９】 本発明はさらに本明細書上述の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに
関する。この点に関して、本発明は特にストリンジェントな条件で本明細書上述
のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書
で用いる「ストリンジェントな条件」および「ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件」なる用語は、配列間の同一性が少なくとも９５％、好ましくは
少なくとも９７％である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意味する。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、５０％ホルムア
ミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）
、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハーツ溶液、１０％硫酸
デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含
有する溶液中、４２℃で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０．１ｘ
ＳＳＣ中でフィルターを洗浄するものである。ハイブリダイゼーションおよび洗
浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；コールド・スプリング
・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）、とりわけその第１１章に実例が示され
ている。

【００３０】 本発明はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、配列番号
：１、配列番号：３、配列番号：４または配列番号１４に示すポリヌクレオチド
配列に関する完全遺伝子を含む適当なライブラリーを、各々、配列番号：１、配
列番号：３、配列番号：４または配列番号１４に示す上記ポリヌクレオチド配列
またはそのフラグメントの配列を有するプローブでスクリーニングし、ＤＮＡ配
列を単離することにより得ることのできるポリヌクレオチド配列を本質的に含む
ポリヌクレオチドをも提供する。かかるポリヌクレオチドを得るために有用なフ
ラグメントには、例えば本明細書の別の箇所において説明するプローブおよびプ
ライマー等がある。

【００３１】 本発明のポリヌクレオチドアッセイに関してここでさらに論じるが、例えば上
述の本発明のポリヌクレオチドを、ＲＮａｓｅ ＰをコードするｃＤＮＡ全長お
よびゲノムクローンを単離するための、およびＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子に高度な配
列類似性を有するその他の遺伝子の全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離す
るための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプ
ローブとして使用することができる。このようなプローブは通常少なくとも１５
塩基を含む。好ましくはこのようなプローブは少なくとも３０塩基を有し、少な
くとも５０塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプローブは少なくとも３
０塩基を有し、５０塩基またはそれ以下である。 配列番号：１および／または２および／または３および／または４および／ま
たは１４の配列由来のオリゴヌクレオチドである本発明のポリヌクレオチドを本
明細書記載の方法に使用してもよいが、好ましくはＰＣＲに使用して、本明細書
で同定したポリヌクレオチドの全体または一部が感染した組織に転写されるかど
うかを決定する。かかる配列が、病原体が達成した感染段階および感染型の診断
にも有用であることが理解される。

【００３２】 また本発明は、さらなるアミノもしくはカルボキシル末端アミノ酸、または成
熟ポリペプチドに内在するアミノ酸を加えた成熟蛋白であるポリペプチドをコー
ドできるポリヌクレオチドも提供する（例えば成熟形態が一つ以上のポリペプチ
ド鎖を有する場合）。このような配列は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセ
ッシングに役割を担い、蛋白の輸送を可能にし、蛋白の半減期を延長もしくは短
縮し、またはとりわけアッセイもしくは製造のための蛋白の操作を容易にするこ
とができる。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞性酵素によりプロ
セッシングされ、成熟蛋白から取り除かれる。 １またはそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態のポリペプチドを有する前駆
蛋白は、ポリペプチドの不活性形態でありうる。プロ配列が除去されると、通常
にはこのような不活性前駆体が活性化される。プロ配列のいくつかまたはすべて
を活性化の前に除去できる。通常、このような前駆体はプロ蛋白と称される。 要するに、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配列を加えた成熟
蛋白（プレ蛋白と称することができる）、プレ蛋白のリーダー配列ではない１ま
たはそれ以上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列および
１またはそれ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコ
ードしていてもよく、プロ配列は通常ポリペプチドの活性および成熟形態を生成
するプロセッシング段階で除去される。

【００３３】スタフィロコッカス・アウレウスのＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ構造遺伝子のクロー ニング ビー・サチリスＲＮａｓｅＰＲＮＡに対する部分的相同性を、無作為に配列さ
れたイー・コリ宿主中のエスアウレウスＤＮＡライブラリーからの配列を含む一
の管理下にあるエス・アウレウスデータベース中にて同定した。この相同性（Ａ
３３２０２：ビー・スブチリスＲＮＡヌクレオチド３１１−４６０）は図３［配
列番号：１４］に示される。 これらのデータに基づくＰＣＲプライマーを遺伝子の３’末端に設計し（プラ
イマー： ５’−ＣＧＣ ＧＡＡ ＧＴＧ ＴＧＴ ＣＴＣ ＧＴＴ ＴＡＴ
ＡＣＧ−３’）［配列番号：５］、５’ドメイン内の普遍的保存配列（５’−Ｇ
ＡＧ ＧＡＡ ＡＧＴ ＣＣＡ ＴＧＣ ＴＣ−３’）［配列番号：６］（ＲＮ
ａｓｅ Ｐデータベースw.w.w.から入手可能）に基づく別のプライマーは、遺伝
子の約９０％を復元することができる。完全な構造遺伝子を、ＲＮＡ産物により
予測されるヘリックスＰ１およびＰ２（図１）が形成される縮重プライマー（５
’−^Ｃ／_ＴＧＡＴＡＴＴＴＣ^Ｇ／_ＴＧ^Ａ／_ＧＴＡＡ^Ｔ／_ＣＣ−３’） ［配列番
号：１３］を用いて増幅させた。構造遺伝子を、Ｔ７プロモーターの後方にクロ
ーンし、配列決定し、ビー・スブチリス相同体と高度に関係付けられていること
がわかった（図２）。ヘリックスＰ１およびＰ２をコードした（転写した）厳密
なエス・アウレウスゲノム配列は、本発明の方法および化合物、例えば上記した
縮重プライマー［配列番号：１３］を用いて当業者であれば決定できる。正確な
５’末端は、エス・アウレウスＷＣＵＨ２９から単離した内因性エス・アウレウ
スＲＮＡを用いてプライマー伸長分析により決定されている。プライマー伸長分
析により決定されたＲＮａｓｅＰＲＮＡ５’の始めの２０個のヌクレオチドの配
列は： ５’−ＧＵＵＣＵＧＡＵＡＵＵＵＵＧＧＧＵＡＡＵ−３’ ［配列番号：１５］
である。 予測される二次構造を図４に示し、これは推定ビー・スブチリスＲＮＡｓｅ
Ｐ ＲＮの二次構造、および実験用ＲＮＡ構造プロービング分析に利用可能なデ
ータの基づいている。さらなる説明および定義 ＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ遺伝子のコーディング領域は、例えば、ナショナル・コ
レクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッ
ド（本明細書中、「ＮＣＩＭＢ」という）、２３ストリート、マッカードライブ
、アベルディーンＡＢ２ １ＲＹ、スコットランドに１９９５年９月１１日に寄
託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１が付与されたスタフィロコッカス・アウレ
ウスＷＣＵＨ２９株を含む寄託菌を用いてスクリーニングすることにより、単離
してもよい。寄託したことにより、寄託株をスタフィロコッカス・アウレウスＷ
ＣＵＨ２９株という。本明細書においてエス・ニューモニアエ株寄託物を「寄託
株」または「寄託株のＤＮＡ」という。 寄託株は全長のＲＮａｓｅＰ遺伝子を含んでいる。寄託株中に含まれるポリヌ
クレオチド配列ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は
、本明細書の配列に関するいずれの記載といずれの不一致においても支配的であ
る。 寄託株の寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条
約の条件下でなされている。特許が発行されると何らの制限または条件もなく、
最終的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ．
Ｓ．Ｃ．１１２条のもとに要求されるような、寄託が実施可能要件であることを
承認するものではない。 寄託株、それに由来の化合物を製造、使用または販売するためにはライセンス
が必要であるが、そのようなライセンスはここでは付与さるものではない。

【００３４】 当該分野で知られた合成化学的方法により本明細書記載のヌクレオチド配列を
得ることができ、また本明細書開示の個々の配列から構築されたプローブを用い
てＤＮＡ調製物をプローブすることによりスタフィロコッカス・アウレウスＷＣ
ＵＨ２９から得ることもできる。別法として、開示配列由来のオリゴヌクレオチ
ドを、細菌ゲノム源からの配列をＰＣＲによるクローニングプロセスにおいてＰ
ＣＲプライマーとして作用させることもできる。かかる配列もまた、病原体が達
成した感染のタイプの診断において有用であることが認識される。 本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であってよく、
該ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを包含する。ＤＮＡは２本
鎖または１本鎖であってよく、１本鎖の場合、コーディング鎖または非コーディ
ング（アンチセンス）鎖であってよい。ポリペプチドをコードするコーディング
配列は、示されたコーディング配列と同一であってもよく、あるいは同じポリペ
プチドをコードするが遺伝コードの重複または縮重の結果、異なるコーディング
配列となったものでもよい。 よって、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ
ドのコーディング配列のみを含むポリヌクレオチドならびにさらなるコーディン
グ配列および／または非コーディング配列を含むポリヌクレオチドを包含する。 それゆえ、本発明は、ポリヌクレオチド中の成熟ポリペプチドのコーディング
配列が、同じ読み枠において、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を
助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御す
る分泌配列として機能するリーダー配列に融合していてもよいポリヌクレオチド
を包含する。リーダー配列を有するポリペプチドはプレ蛋白であり、宿主により
開裂されて成熟形態のポリペプチドを生じるリーダー配列を有していてもよい。
ポリヌクレオチドは、成熟蛋白にさらなる５’アミノ酸残基が付加したプロ蛋白
をコードしていてもよい。プロ配列を有する成熟蛋白はプロ蛋白であり、蛋白の
不活性形態である。プロ配列が開裂されると、活性成熟蛋白が残る。 よって、例えば、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白をコードしていてもよ
く、あるいはプロ配列を有する蛋白をコードし、またはプロ配列およびプレ配列
（リーダー配列）の両方を有する蛋白をコードしていてもよい。さらに、本明細
書に示すアミノ酸配列はＮＨ_２−末端にメチオニン残基が示されている。しかし
ながら、ペプチドの翻訳後修飾の間に、この残基が欠失されてもよい。したがっ
て、本発明は、本明細書に開示した各蛋白のメチオニン含有およびメチオニン欠
失アミノ末端変種の両方の使用を企図する。

【００３５】 本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子の５’または３’末端においてイン・フ
レームでマーカー配列に融合したコーディング配列を有していて、本発明のポリ
ペプチドの精製を可能にするものであってもよい。マーカー配列は、細菌宿主の
場合にマーカー配列に融合したポリペプチドの精製を可能にするためのｐＱＥシ
リーズのベクター（Ｑｕｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．から市販されている）により提供
されるヘキサ−ヒスチジンタグであってもよい。別法として、マルトース結合蛋
白（ＭＢＰ）融合系を用いてもよい。この系において、目的遺伝子はＭＢＰをコ
ードするｍａｌＥ遺伝子（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓにより提供
される）に融合される。マルトースに対するＭＢＰのアフィニティーにより１工
程で融合生成物を精製する。予め処理されたＸａ開裂部位は、目的の遺伝子産物
からのＭＢＰ成分の効果的な除去を可能にする。 下記する実施例を容易に理解するために、特定の頻繁に用いる方法および／ま
たは用語を説明する。 「プラスミド」は、一般に、当業者に馴染みの標準的命名法に従って、小文字
ｐを前に、および／または大文字および／または数字が続くようにデザインされ
ている。本明細書に記載の出発プラスミドは、市販されているか、汎用されてい
るか、または周知の公知操作を汎用することにより利用可能なプラスミドより構
築することができる。さらに、記載したものと等価なプラスミドが周知であり、
当業者に明らかであろう。

【００３６】 ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡの特定配列にのみ作用する制限酵素でのＤＮＡの
触媒的開裂をいう。本発明に使用する種々の制限酵素は市販されており、それら
の反応条件、コファクターおよび他の必須因子は当業者に知られているであろう
。分析を目的とする場合、典型的には、１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグ
メントを約２ユニットの酵素とともに約２０μｌのバッファー溶液中に使用する
。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントの単離を目的とする場合には、典
型的には、より多い体積中で５ないし５０μｇのＤＮＡを２０ないし２５０ユニ
ットの酵素で消化する。個々の制限酵素に関する適当なバッファーおよび基質量
は製造者により詳述されている。約３７℃で約１時間のインキュベーション時間
を通常使用するが、供給者の説明に従って変更してもよい。消化後、反応物をア
ガロースゲルで直接電気泳動して所望フラグメントを単離する。開裂フラグメン
トのサイズ分離は、一般に１％アガロースゲルを用いて行う。 「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２本の相
補的なポリデオキシヌクレオチド鎖であり、化学合成されたものであってもよい
。かかる合成オリゴヌクレオチドは５’リン酸を欠いているので、キナーゼ存在
下でＡＴＰを用いてリン酸を付加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連結しな
いであろう。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸されていないフラグメントに連
結するであろう。 「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメント間のホスホジエステル結合形成プ
ロセスをいう（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．ら、前掲、１４６頁）。特記しないか
ぎり、連結すべきほぼ等モルのＤＮＡフラグメント０．５μｇにつき１０ユニッ
トのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（リガーゼという）を用いて既知バッファーおよび条
件下で連結を行ってもよい。 好ましくは、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離形態であり
、好ましくは、均一にまで精製されているものである。

【００３７】 「レプリコン」は、インビボにおいてＤＮＡ複製の自律的単位として機能する
、すなわち、それ自身の制御下で複製しうる遺伝学的エレメント（例えば、プラ
スミド、染色体、ウイルス）である。 「ベクター」はプラスミド、ファージまたはコスミドのごときレプリコンであ
り、別のＤＮＡセグメントを結合して、結合セグメントの複製を引き起こすこと
ができるものである。 「２本鎖ＤＮＡ分子」は、２重ヘリックスポリマー形態（弛緩およびスーパー
コイル状の両方）のデオキシリボヌクレオチドをいう。この用語は分子の一次お
よび二次構造についてのみ使用し、個々の三次形態に限るものではない。よって
、この用語は、特に直鎖状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス
、プラスミドおよび染色体に見られる２本鎖ＤＮＡを包含する。特定の２本鎖Ｄ
ＮＡ分子の構造をいう場合、通常の慣習に従って、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち
、ｍＲＮＡに対して相同的な配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向の配
列のみを示す。 特定の蛋白のＤＮＡ「コーディング配列」またはを「コードするヌクレオチド
配列」は、適当な調節配列の制御下におかれた場合、転写され、ポリペプチドに
まで翻訳されるＤＮＡ配列である。 「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’
方向）のコーディング配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域であ
る。本発明を定義するために、プロモーター配列は翻訳開始コドン（例えば、Ａ
ＴＧ）によってコーディング配列の３’末端に結合され、上流（５’方向）に伸
長しており、バックグラウンド以上の検出可能なレベルの転写を開始させるに必
要な最小数の塩基またはエレメントを含んでいる。プロモーター配列中に、転写
開始部位（便利には、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングにより決定される）なら
びにＲＮＡポリメラーゼの結合に応答しうる蛋白結合ドメイン（コンセンサス配
列）がみられる。真核生物プロモーターは、常にではないがしばしば、「ＴＡＴ
Ａ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核生物プロモーターは−１０
および−３５コンセンサス配列を含む。 ＤＮＡ「制御配列」は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニ
ル化シグナル、転写ターミネーション配列、上流調節ドメイン、エンハンサー等
を総称し、それらは包括的に宿主細胞におけるコーディング配列の発現（すなわ
ち、転写および翻訳）を行うものである。 ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、コーディング配列をｍＲＮ
Ａに転写する場合、制御配列は細胞においてコーディング配列の「発現を指令」
するのであり、該ｍＲＮＡはその後コーディング配列によりコードされるポリペ
プチドへと翻訳される。

【００３８】 「宿主細胞」は、外来ＤＮＡ配列により形質転換またはトランスフェクション
された細胞、あるいは形質転換またはトランスフェクションされうる細胞である
。 かかる外来ＤＮＡが細胞膜内部に導入された場合、細胞は外来ＤＮＡにより「
形質転換」されたものである。外来ＤＮＡは染色体ＤＮＡ中の組込まれて（共有
結合して）細胞のゲノムを形成してもよく、しなくてもよい。原核細胞および酵
母においては、例えば、外来ＤＮＡはプラスミドのごときエピソームエレメント
上に維持されてもよい。真核細胞については、安定に形質転換またはトランスフ
ェクションされた細胞系は、外来ＤＮＡが染色体中に組込まれて染色体複製によ
りそれが娘細胞に遺伝するようになった細胞である。この安定性は、外来ＤＮＡ
を含む娘細胞の集団を含む細胞系またはクローンを確立する真核細胞の能力によ
り示される。 「クローン」は、単一細胞に由来するかまたは有糸分裂により共通の祖先に由
来する細胞集団である。「細胞系」は、インビトロにおいて多くの世代にわたり
安定に増殖しうる一次細胞のクローンである。 ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、別のＤＮＡ分子中に存在するかまたは結合し
た同定可能なＤＮＡセグメントであって、天然において他の分子に結合した状態
で見いだされないものである。

【００３９】ＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ成分の調製 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含むベク
ター、本発明ベクターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技法による本発
明のポリペプチドの製造にも関する。 それゆえ、本発明のさらなる態様によれば、上記ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを宿主中で発現させ、発現生成物を回収することによる組み換え
法による、本発明のポリペプチドの製造方法が提供される。別法として、本発明
のポリペプチドを慣用的なペプチド合成装置により合成的に製造することもでき
る。 本発明のベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであっ
てよい）を用いて宿主細胞を遺伝子操作（トランスダクションまたは形質転換ま
たはトランスフェクション）する。ベクターはプラスミド、コスミド、ファージ
等の形態であってよい。遺伝子操作した宿主細胞を、プロモーター活性化、形質
転換体の選択または遺伝子の増幅に適するように改変した慣用的な栄養培地で培
養する。温度、ｐＨ等の培養条件はすでに発現のためにその宿主細胞に使用され
たものであり、それらは当業者に明らかであろう。 適当な発現ベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、細
菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミ
ドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクターを包含する。しかしな
がら、宿主中で複製可能で生存可能である限り、他のベクターを用いてもよい。 発現系もしくはそれらの一部、または本発明のポリヌクレオチドを組み込むこ
とができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Ｄａｖｉｓら、
Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１
９８６）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１
９８９）のように、多くの標準的な実験マニュアルに記載される方法により行う
ことができ、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキス
トラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクシ
ョン、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トラ
ンスダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入および感染等がある。

【００４０】 適当な宿主の代表的なものには、細菌細胞、例えばスタフィロコッカス属 （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｉ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、イー・コリ（Ｅ．
ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびバチルス・
ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｉｓ）細胞；真菌細胞、例えば酵母
細胞およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞；昆虫細胞、例え
ばドロソフィラＳ２（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２）およびスポドプテラＳｆ９
（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９）細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈ
ｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Ｂｏｗｓ）黒色腫細
胞；ならびに植物細胞等がある。

【００４１】 本発明のポリペプチドを製造するために非常に多くの発現系を使用できる。こ
のようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例
えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母
エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノ
ウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイル
ス由来のベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来するベクター、例
えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター
、例えばコスミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は発現を制御お
よび引き起こす調節領域を含有していてもよい。この点に関して、一般的には、
宿主中にポリヌクレオチドを保持、伸長または発現するのに、および／またはポ
リペプチドを発現するのに適した任意の系またはベクターを発現に使用できる。
周知のおよび通常的な種々の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿
入してもよく、例えばSambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual(上
記)に記載されている。

【００４２】 種々の方法により適当なＤＮＡ配列をベクターに挿入することができる。一般
的には、当該分野で知られた方法により、ＤＮＡ配列を適当な制限エンドヌクレ
アーゼ部位中に挿入する。 発現ベクター中のＤＮＡ配列を適当な発現制御配列（プロモーター）に連結し
てｍＲＮＡ合成を指令するようにしてもよい。かかるプロモーターの典型例とし
ては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、イー・コリのｌａｃまたはｔｒｐ、
ラムダファージのＰ_Ｌプロモーターならびに真核または原核細胞あるいはそれら
のウイルス中の遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターが
挙げられる。発現ベクターは翻訳開始用のリボソーム結合部位および／または転
写ターミネーターを含んでいてもよい。ベクターは発現増強に適した配列を含ん
でいてもよい。

【００４３】 さらに、好ましくは、発現ベクターは、形質転換宿主細胞の選択のための表現
型を付与する１またはそれ以上の選択可能マーカー遺伝子を含み、そのマーカー
遺伝子は、例えば、真核細胞培養にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイ
シン耐性であり、イー・コリにおいてはテトラサイクリンもしくはアンピシリン
耐性である。 プロモーター、リボソーム結合部位（細菌での発現の場合）、そして所望によ
りオペレーター（本明細書では、包括的に「制御」エレメントという）の制御下
に遺伝子を置くことができ、その結果、この発現構築物を含むベクターにより形
質転換された宿主細胞中で、所望の蛋白をコードするＤＮＡ配列がＲＮＡに転写
される。コーディング配列はシグナルまたはリーダー配列を含んでいても、いな
くてもよい。例えば、イー・コリのｔａｃプロモーターまたはプロテインＡ遺伝
子（ｓｐａ）プロモーターおよびシグナル配列を用いて本発明のポリペプチドを
発現させることができる。リーダー配列は、翻訳後プロセッシングにおいて細菌
宿主により除去されうる。例えば、米国特許第４４３１７３９号、第４４２５４
３７号、第４３３８３９７号参照。ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェ
ラーゼ）ベクターまたは選択可能マーカーを有する他のベクターを用いて所望遺
伝子からプロモーター領域を選択することができる。２種の適当なベクターはｐ
ＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐ
ｔ、ラムダＰ_Ｒ、Ｐ_Ｌおよびｔｒｐ等を特に挙げておく。真核細胞プロモーター
はＣＭＶ即時初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロ
ウイルス由来のＬＴＲｓ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉを包含する。適当
なベクターおよびプロモーターの選択は当業者のレベル内のことである。 制御配列のほかに、宿主細胞の増殖に関連して蛋白配列の発現を調節可能な調
節配列を付加することが望ましいかもしれない。調節配列は当業者に知られてお
り、例としては、調節化合物の存在などの化学的または物理的刺激に応じて遺伝
子発現をオンまたはオフにするもの等が挙げられる。他のタイプの調節エレメン
ト、例えば、エンハンサー配列がベクター中に存在してもよい。 特定のコーデイング配列が適当な調節配列とともにベクター中に存在するよう
に発現ベクターを構築し、制御配列に対するコーディング配列の位置および方向
は、コーディング配列が制御配列の「制御」下で転写されるようなものとする（
すなわち、制御配列のところでＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコー
ディング配列を転写するようにする）。コーディング配列の修飾はこの目的の達
成にとり望ましいかもしれない。例えば、いくつかの場合、配列を修飾して適当
な方向で、すなわち読み枠を維持するように制御配列に結合させることが必要で
あるかもしれない。上記クローニングベクターのごときベクター中に挿入する前
に制御配列および他の調節配列をコーディング配列に連結してもよい。別法とし
て、コーディング配列を、すでに制御配列および適当な制限部位を有する発現ベ
クター中に直接クローンしてもよい。

【００４４】 一般的には、組み換え発現ベクターは複製開始点および宿主細胞の形質転換を
可能にする選択可能マーカー、例えばイー・コリのアンピシリン耐性遺伝子およ
びエス・セレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＲＰ１遺伝子ならび
に下流構造遺伝子の直接転写のための高発現遺伝子由来のプロモーターを含むで
あろう。翻訳開始および終結配列ならびに好ましくは周辺腔または細胞外培地中
に翻蛋白を直接分泌させうるリーダー配列とともに異種構造配列を集合させて適
当な配置とする。所望により、異種配列は、所望特性を付与する、例えば安定化
させ、あるいは発現組み換え生成物の精製を容易にするＮ−末端同定ペプチドを
含む融合蛋白をコードしていてもよい。 適当な上記ＤＮＡ配列ならびに適当なプロモーターまたは制御配列を含むベク
ターを用いて適当な宿主を形質転換して、宿主に蛋白を発現させてもよい。 より詳細には、本発明は、上記に広範囲にわたって説明した１またはそれ以上
の配列を含む組み換え構築物をも包含する。構築物は、プラスミドもしくはウイ
ルスベクターのごときベクターを含み、ベクター中に本発明配列が順方向または
逆方向に挿入されている。この具体例の好ましい態様において、構築物はさらに
調節配列（例えば当該配列に作動可能に連結されたプロモーターを包含）を含む
。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、市販され
ている。例えば、下記ベクターがある。細菌ベクター：ｐＥＴ３ベクター（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、
ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｒｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐ
ＮＨ４６Ａ、（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２３３−３、
ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核細胞ベクター：ｐＢｌ
ｕｅＢａｃＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、
ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰ
Ｖ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、宿主中で複製
可能で生存可能である限り、他のプラスミドまたはベクターを用いてもよい。

【００４５】 クローニング用の組み換えＤＮＡベクターおよびそれらが形質転換可能な宿主
細胞の例は、バクテリオファージλ（イー・コリ）、ｐＢＲ３２２（イー・コリ
）、ｐＡＣＹＣ１７７（イー・コリ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性細菌）、ｐＧ
Ｖ１１０６（グラム陰性細菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性細菌）、ｐＭＥ２９
０（非イー・コリグラム陰性細菌）、ｐＨＶ１４（イー・コリおよびバチルス・
ズブチリス）、ｐＢＤ９（バチルス）、ｐＩＪ６１（ストレプトミセス）、ｐＵ
Ｃ６（ストレプトミセス）、ＹＩｐ５（サッカロミセス）、バキュロウイルス昆
虫細胞系、ＹＣｐ１９（サッカロミセス）。一般的には、”DNA Cloning”: Vol
s. I & II, Gloverら、 ed. IRL Press Oxford (1985)(1987)およびT. Maniatis
ら ”Molecular Cloning” Cold Spring Harbor Laboratory (1982)参照。

【００４６】 いくつかの場合、宿主細胞からのポリペプチドの分泌、その後の分泌シグナル
の開裂を引き起こす配列を付加することが望ましい。 適当なプロモーターの制御下でポリペプチドを宿主細胞中で発現させることが
できる。無細胞翻訳系を用い、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてかか
る蛋白を得てもよい。原核細胞および真核細胞に使用する適当なクローニングお
よび発現ベクターはSambrook,ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, S
econd Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989)により記載されており、こ
れを参照により本明細書に記載されているものとみなす。 適当な宿主株の形質転換および適当な細胞密度までの宿主細胞の増殖の後、適
当な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により選択プロモーターを誘
導し、さらなる期間細胞を培養する。 典型的には、遠心分離により細胞を集め、物理的または化学的手段により細胞
を破壊し、ついで、得られた粗抽出物をさらなる精製のためにとっておく。 凍結溶解繰り返し、超音波処理、機械的破壊、あるいは細胞溶解剤の使用を包
含する慣用的方法により、蛋白発現に使用される微生物細胞を破壊することがで
き、かかる方法は当業者によく知られている。 選択した発現系および宿主にもよるが、上記発現ベクターにより形質転換した
宿主細胞を目的ポリペプチドが発現される条件下で増殖させることにより本発明
のポリペプチドを製造してもよい。ついで、ポリペプチドを宿主細胞から単離し
、精製する。発現系がポリペプチドを増殖培地中に分泌する場合、ポリペプチド
を培地から直接精製することができる。ポリペプチドが分泌されない場合、ポリ
ペプチドを細胞溶解物から単離するか、あるいは細胞膜フラクションから回収す
る。ポリペプチドが細胞表面に局在化する場合、細胞全体または単離細胞膜を所
望遺伝子産物のアッセイ可能ソースとして使用することができる。イー・コリの
ごとき細菌宿主において発現されたポリペプチドは封入体からの単離および再生
を必要とするかもしれない。成熟蛋白が不溶性生成物の過剰発現を導く非常に疎
水性の領域を有する場合、疎水性領域が欠失された末端切断蛋白を発現させるこ
とが望ましいかもしれない。適当な増殖条件および回収方法の選択は当業者のな
しうるところである。 硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交
換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタ
イトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを包含する方法に
より、ポリペプチドを組み換え細胞培養物から回収し、精製することができる。
天然蛋白の立体配置を完成させることにおいて、必要に応じて蛋白再生工程を用
いることができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終
精製工程に用いてもよい。 組み換え製造方法に用いる宿主にもよるが、本発明のポリペプチドは糖鎖付加
されていてもよく、あるいはされていなくてもよい。本発明のポリペプチドは、
最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでいてもよい。

【００４７】ＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ成分の調製 ＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ分子は、標準的条件（供給者、例えば、Ｐｒｏｍｅｇ
ａの推奨条件）下でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるインビトロ転写のラン−
オフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）により調製でき、調製される。適当な制限酵素を用いて
プラスミドを直鎖状にし、ＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡをコードする全長遺伝子を含
む直鎖状ｄｓＤＮＡを得る。調製用変性アクリルアミドゲルからＲＮＡを精製す
るか、あるいはインビトロ開裂アッセイに使用する前に沈殿させる。ＲＮａｓｅ
ＰのＲＮＡおよびその蛋白と複合体となったＲＮＡ（ＲＮａｓｅ Ｐ蛋白）の
基質を、クローン化遺伝子のインビトロ転写により得ることができる。有用な基
質はプレ−ｔＲＮＡ^Ｍｅｔまたはイー・コリのプレ−４．５Ｓまたはビー・ズブ
チリスのプレ−４．５Ｓ分子を包含し（これらに限らない）、上記のごとくＴ７
ＲＮＡポリメラーゼにより指令されるインビトロ転写系を用いて発現させても
よい。ＲＮＡはまた、オートメーション合成により調製することもできる。

【００４８】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子 本発明は、本明細書記載のＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ部分、蛋白部分および／ま
たは無傷のＲＮＡ／蛋白複合体を妨害する薬剤をスクリーニングする方法を提供
し、該方法は、試験薬剤による蛋白および／またはＲＮＡの活性の妨害を測定す
ることを含む。例えば、選択されたＲＮＡ部分が触媒活性を有するので、適当な
精製および処方を行った後、その天然または合成ＲＮＡ基質を変換する能力によ
りＲＮＡの活性を追跡できる。化学合成された異なる試験化合物または天然産物
をかかる酵素活性アッセイに用いることにより、天然または合成基質を競合、あ
るいは酵素活性を阻害する添加物を検出することができる。 本発明のポリペプチドを用いて、例えば、細胞、無細調製物、化学ライブラ
リー、および天然産物混合物中における小型分子基質およびリガンドの結合を評
価してもよい。これらの基質およびリガンドは天然基質およびリガンドであって
もよく、構造上または機能上の模倣物であってもよい。例えば、Coligan et al.
,Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)参照。 また本発明は、ＲＮａｓｅＰポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用を増
強（アゴニスト）またはブロック（アンタゴニスト）する化合物、詳細には、静
菌性および／または殺菌性化合物を同定するための、化合物のスクリーニング方
法をも提供する。該スクリーニング方法は高処理量の方法である。例えば、アゴ
ニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために、ＲＮａｓｅＰポリペ
プチドおよびこのようなポリペプチドの標識基質またはリガンドを含む、合成反
応混合物、膜、細胞表面膜もしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、また
はそれらのいずれかの調製物を、ＲＮａｓｅＰのアゴニストまたはアンタゴニス
トとなりうる候補分子の存在下または不在下でインキュベーションする。候補分
子がＲＮａｓｅＰポリペプチドの作用を増強またはブロックする能力は、標識化
リガンドの結合の低下またはこのような基質からの生成物の産生の低下に反映さ
れる。結合しても影響を及ぼさない分子、すなわちＲＮａｓｅＰポリペプチドの
効果を誘導しない分子は、最も良好なアンタゴニストである可能性がある。結合
性が良好で、基質からの生成物の生成速度を高める分子はアゴニストである。基
質からの生成物の生成速度またはレベルの検出はリポーターシステムを用いるこ
とにより強調できる。この点に関して有用なリポーターシステムには、生成物に
転換される比色測定用標識化基質、ＲＮａｓｅＰポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド活性、変化に応答するリポーター遺伝子、および当該分野で周知の結合ア
ッセイ等があるが、これらに限定するものではない。

【００４９】 ＲＮａｓｅＰに対するアンタゴニストのアッセイのもう１つの例は競争アッセ
イであり、競争阻害アッセイに適した条件下で、ＲＮａｓｅＰおよび可能性のあ
るアンタゴニストを、ＲＮａｓｅＰ結合分子、組換えＲＮａｓｅＰ結合分子、天
然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド模倣物と混合する。例え
ば放射活性または比色測定用化合物によりＲＮａｓｅＰを標識し、結合分子に結
合した、または生成物に変換されたＲＮａｓｅＰ分子の数を正確に決定して、可
能性のあるアンタゴニストの効果を評価できる。 可能性のあるアンタゴニストには、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドに結合し、そのことによりその活性を阻害し消失させる小型有機分子、ペプ
チド、ポリペプチドおよび抗体などがある。また、可能性のあるアンタゴニスト
は、密接に関連した蛋白または抗体のごとき小型有機分子、ペプチド、ポリペプ
チドであって、アンタゴニストは結合分子の同じ部位に結合するが、ＲＮａｓｅ
Ｐの活性を誘導せず、それゆえＲＮａｓｅＰを結合から排除することによりＲＮ
ａｓｅＰの作用を妨害するものである。 可能性のあるアンタゴニストには、ポリペプチドの結合部位に結合し、および
それを占領し、それにより細胞性結合分子への結合を妨害して、正常な生物学的
活性を妨害する小型分子等がある。小型分子の例としては、小型有機分子、ペプ
チド、ペプチド様分子等があるが、これらに限定するものではない。その他の可
能性のあるアンタゴニストにはアンチセンス分子等がある（これらの分子につい
ての記載に関してはOkano,J.,Neurochem.56:560(1991);Oligodeoxy-nucleotides
as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Press, Boca Raton, FL (1
988)参照)。好ましい可能性のあるアンタゴニストには、ＲＮａｓｅＰ関連化合
物およびＲＮａｓｅＰ変種等がある。

【００５０】 本明細書に示す各ＤＮＡ配列を、抗細菌化合物の発見および開発に使用しても
よい。コードされている蛋白は、発現した場合、抗細菌剤のスクリーニングのた
めの標的として使用されうる。さらに、コードされている蛋白のアミノ末端領域
または各ｍＲＮＡのシャイン−ダルガルノ配列または他の翻訳容易化配列をコー
ドしているＤＮＡ配列を用いてアンチセンス配列を構築し、目的とするコーディ
ング配列の発現を制御することもできる。 本発明はまた、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは阻害剤を使用
し、感染の後遺症の原因である病原および哺乳動物宿主間での初期の物理的相互
作用を妨害するものである。細菌、特にグラム陽性菌の内在デバイス上の哺乳動
物の細胞外マトリックス蛋白への、もしくは、創傷部のある細胞外マトリックス
蛋白への付着を防ぐことができ；例えば哺乳類のチロシンキナーゼのリン酸化を
開始することによりＲＮａｓｅ Ｐ蛋白介在の哺乳類細胞侵入（Rosenshineら、
infact, Immun 60:2211(1992）；哺乳類の細胞外マトリックス蛋白と組織の損傷
を媒介する細菌ＲＮａｓｅ蛋白の間への細菌の付着を阻害；内在デバイスの移植
または他の外科的手術以外を原因とする感染の発生病因の通常の進行を遮断する
のに用いても良い。

【００５１】 本発明のアンタゴニストおよびアゴニストを、例えば、上気道疾患（例えば、中
耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道疾患（例えば、蓄膿症
、肺膿瘍）、心臓疾患（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸疾患（例えば、分泌性
下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ疾患（例えば、大脳膿瘍）、眼疾患（例
えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、
腎および尿管疾患（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショ
ック症候群）、皮膚疾患（例えば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感
染、細菌性筋炎）、ならびに骨および関節疾患（例えば、敗血症性関節炎、骨髄
炎）のごとき疾病の抑制および治療に用いてもよい。

【００５２】ＨＴＰスクリーニング方法 ＲＮａｓｅ ＰによるＲＮＡ基質の開裂を阻害する化合物を検出するためのア
ッセイを開発することができる。いくつかの可能なアッセイフォーマットは、化
学合成により部位特異的にＲＮＡ中に標識を取り入れる能力に基づくＨＴＰスク
リーニングに適している。慣用的な放射活性に基づくフォーマットが好ましいが
、均質な蛍光に基づくフォーマットはその後のリード化合物のフォローアップに
有用である。いずれのフォーマットの使用も、本発明の意図するところである。

【００５３】機能的ＲＮａｓｅ Ｐアッセイ ビオチンをＲＮＡ基質中の適当な位置に導入し、５’末端を^３２Ｐで標識する
。ストレプトアビジンを介して基質を９６ウェルプレートに結合させる。基質の
ＲＮａｓｅ Ｐ依存的加水分解の後、放射標識５’リーダー開裂生成物がバルク
溶液相中に放出され、シンチレーションカウンティングにかける。別法としては
、ＲＮＡ基質をストレプトアビジン被覆フラッシュプレートに結合させて、放射
活性６量体の溶液相中への放出によりシグナルを減少させる。これは、均質かつ
連続的アッセイフォーマットである、アッセイ開始後、さらなる操作を要しない
という利点を有する。いずれのフォーマットも本発明の実施において有用である
。なぜなら、どちらも同じＲＮＡ基質を使用するからである。

【００５４】ＲＮＡフラグメントライブラリーレスキュー ＲＮＡと相互作用する化合物を同定するための有効な方法も意図するものであ
る。その概念は、薬剤を隔離し、無傷のリボザイムの機能発揮を継続させること
となる、ＲＮＡフラグメント上に再生される薬剤結合部位の過剰発現に基づく（
図６）。この方法は、リボソームＲＮＡに結合するリガンドを検索する関係上、
最近になって記載されたものである（Howard, B-A, et al., Biochem. Cell Bio
. 73 (11/12): 1161-1166 (1995))。選択後、薬剤認識のための最小標的構造を
明らかに示す任意のＲＮＡフラグメントを合理的な薬剤設計のためのプロトコー
ル中に取り入れる。したがって、ＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡに基づくランダムなフ
ラグメントライブラリーが得られ、ＲＮＡ／蛋白相互作用を破壊する化合物を同
定するためのＨＴＰスクリーニングに使用される（図７）。

【００５５】環状ペプチドファージライブラリー コンホーメーション上の束縛をフレキシブルなリード化合物中に取り入れるこ
とは、リード化合物の潜在能力を高めるための強力な戦略であり、ペプチド模倣
設計の分野において特に有用である(Al-Obeidi, F. et al., J. Med. Chem. 32:
2555-2561 (1989); Barker, P. L., et al., J. Med. Chem. 35: 2040-2048 (1
992))。 環化は、ペプチドでのベーターターン形成の傾向が増加することで明らかにさ
れ、その可能性はスロレプタビジンとの高い親和性リガンドを同棲することで示
される（Lee, M.S.ら、FEBS Lett. 359: 113-118(1995))。 この場合、隣接システイン残基を含めて環状ペプチドライブラリーを構築して
、ファージアッセンブリー中の効果的なジスルフィド結合形成および環化を可能
にする。ジスルフィド架橋された２個のペプチドのストレプトアビジン結合結晶
構造は、いずれもベータ−ターンコンホーメーションとなることが示された（Ka
hn, M. (Guest, Ed., 1993) Tetrahedron 49, Symp. 50, 3433-3677)。 ベータ−ターンは多くの生物学的相互作用における重要な認識エレメントであ
り、それゆえ、小型の束縛されたベータ−ターン模倣物の設計に努力が注がれて
きた(Kahn, M. (Guest Ed., 1993) Tetrahedron 49, Symp. 50, 3433-3677)。こ
の方法は、ＲＮａｓｅ Ｐに適用した場合、阻害剤分子としてのペプチド模倣物
の合成に適した環状ペプチドを同定することができる。環状オクタペプチドファ
ージディスプレイライブラリーを構築し、一定のＲＮＡドメインと相互作用する
ペプチドを同定するために使用することができる。

【００５６】二次的評価 ＳＥＬＥＸ：指数的豊富化によるリガンドの系統的発展 合理的な薬剤の設計およびＨＴＰスクリーニングにより同定された化合物の二
次的評価を促進するものとして、構造分析のためにＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ（Ｍ
１ ＲＮＡ）蛋白が結合するＲＮＡ認識モチーフを同定する目的で、この方法を
用いてもよい。その方法は、繰り返し選択ならびに高いアフィニティーで蛋白に
特異的に結合するＲＮＡフラグメントの増幅に基づく(Szostak, J.W., TIBS 17:
89-93 (1992))。ＲＮＡのインビトロでの合成を行い、それらの個々の蛋白に結
合する分子のその後の選択を行うためにスタフィロコッカス・アウレウスおよび
イー・コリのＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡに基づくフラグメントライブラリーを構築
することができる。化学構造および酵素の構造を探索する方法を蛋白／ＲＮＡ保
護の研究と組み合わせて用いて、相互作用部位をマッピングしてもよい。生じた
ＲＮＡフラグメントに基づくＳＥＬＥＸをさらに利用して、ＲＮＡ認識のための
最小構造必須要件を決定してもよい。

【００５７】ＲＮａｓｅ Ｐアッセンブリーの破壊 蛋白／ＲＮＡ−フラグメントペアーの同定により、それらのアッセンブリーを
破壊する化合物のスクリーニングを開発することができる。固定化蛋白に結合し
た標識ＲＮＡ（ビオチン／ストレプトアビジン）の薬剤により誘発される破壊は
、ＲＮＡの存在により生じたシグナルの減少／消失を併発させる。

【００５８】ＲＮＡ／薬剤相互作用 薬剤耐性を付与するＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡフラグメント（上記のＲＮＡフラ
グメントレスキューライブラリー）を配列決定し、薬剤存在下および不存在下で
の化学構造および酵素構造の探索を行うためにインビトロで発現させて結合部位
をマッピングしてもよい。一の試みにおいて、ＳＥＬＥＸをリード化合物に適用
して、薬剤結合のための最小構造必須要件を同定してもよい。

【００５９】ＲＮａｓｅ Ｐの基質 プレ−ｔＲＮＡおよびプレ−４．５Ｓ ＲＮＡ誘導体を包含する最小ＲＮＡ基
質をＨＴＰスクリーニング用に化学合成してもよい（例えば図８）。特定ヌクレ
オチドの２’−ヒドロキシル基が関与するＲＮＡ−リガンド相互作用を、適当に
修飾されたＲＮＡフラグメントを化学合成することにより探索してもよい。リボ
ヌクレオチドに特徴的なＣ^３’−エンド立体配置を保持するために、２’−メト
キシおよび２’−フルオロリボヌクレオチドアナログを用いることができ、立体
上の理由から後者が好ましい。２’−置換基を欠くヌクレオチドは望ましくない
Ｃ^２’−エンド立体配置をとる。 さらに本発明は、本明細書に記載のいずれかの方法により同定される阻害剤に
関する。ＲＮａｓｅ Ｐ作用の酵素的性質のため、遷移状態の模倣物、生成物放
出に対する阻害剤または基質結合に対する阻害剤として作用する阻害剤を同定で
きることが理解される。

【００６０】診断アッセイ また本発明は診断試薬として使用するためのＲＮａｓｅ Ｐポリヌクレオチド
の使用にも関する。真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるＲＮａｓｅ
Ｐの検出は、疾患の診断のための診断法を提供する。ＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子を含
む生物に感染した真核生物（本明細書において「個体」とも称する）とりわけ哺
乳動物、特にヒトを種々の方法によりＤＮＡレベルで検出できる。 診断用の核酸は、感染した個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟
骨および皮膚より得ることができる。ゲノムＤＮＡを直接検出に使用してもよく
、あるいは分析の前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いることにより酵素的
に増幅できる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法で用いることができる。増
幅法を用いると、真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトに存在する原核生物株を
、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけることができる。対照配列の
遺伝子型と比較した場合の増幅産物の大きさの変化により、欠失および挿入を検
出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識したＲＮａｓｅ Ｐポリヌクレオチ
ド配列にハイブリダイズさせることにより同定できる。完全に対合した配列はＲ
Ｎアーゼ消化により、または融解温度の差により、誤対合二重らせんから区別で
きる。変性剤含有または不含ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動度の
変化を検出することにより、または直接的なＤＮＡの配列決定により、ＤＮＡ配
列の差を検出してもよい。例えばＭｅｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１
２４２（１９８５）参照。また、特異的な位置での配列の変化を、ヌクレアーゼ
保護アッセイ、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的切断法によって明
らかにしてもよい。例えばCottonら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:4397-44
01 (1985)参照。

【００６１】 本発明の遺伝子の突然変異または多型性を担持する細胞を、種々の技術により
、ＤＮＡレベルで、例えばセロタイピングすることにより検出してもよい。例え
ば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて突然変異を検出することができる。ＲＴ−ＰＣＲは自
動検出系、例えばＧｅｎｅＳｃａｎ等と組み合わせて用いるのがとりわけ好まし
い。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに用いてもよ
い。一例として、ＲＮａｓｅ Ｐをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマー
は、突然変異を同定および分析するのに用いることができる。代表的なプライマ
ーの例を実施例に示す。本発明はさらに５’および／または３’末端より１、２
、３または４個のヌクレオチドを除去した、これらのプライマーを提供する。こ
れらのプライマーを用いて、個体から由来の試料により単離されたＲＮａｓｅ
Ｐ ＤＮＡを増幅してもよい。そのプライマーを用いて、感染個体から単離され
た遺伝子を増幅し、ついで、ＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に該遺伝子を
供してもよい。このようにして、ＤＮＡ配列における突然変異を検出し、感染の
診断および感染性物質のセロタイピングおよび／または分類に使用することがで
きる。

【００６２】 本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感染、より好ましくはスタフィロコッカ
ス・アウレウスによる感染、最も好ましくは例えば、上気道疾患（例えば、中耳
炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道疾患（例えば、蓄膿症、
肺膿瘍）、心臓疾患（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸疾患（例えば、分泌性下
痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ疾患（例えば、大脳膿瘍）、眼疾患（例え
ば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎
および尿管疾患（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショッ
ク症候群）、皮膚疾患（例えば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染
、細菌性筋炎）、ならびに骨および関節疾患（例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎
）のような疾病の診断方法を提供し、該方法は、表１［配列番号：１］の配列を
有するポリヌクレオチドのの発現レベルの上昇を個体由来の試料から検出するこ
とを特徴とする。ＲＮａｓｅ Ｐポリヌクレオチドの発現の増加または低下は、
ポリヌクレオチドの定量法として当該分野でよく知られたいずれかの方法、例え
ば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよ
びその他のハイブリダイゼーション法を用いて測定できる。 さらに、正常対照組織サンプルと比較して、ＲＮａｓｅ Ｐ蛋白の過剰発現を
検出するための本発明診断アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出してもよ
い。宿主由来のサンプル中のＲＮａｓｅ Ｐ蛋白のレベルを決定するために用い
ることができるアッセイ技法は、当業者に周知である。かかるアッセイ法には、
ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析および ＥＬＩＳＡアッセイ等がある。

【００６３】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそれらを発現する細胞を
免疫源として用いて、かかるポリペプチドに免疫特異的な抗体を得ることができ
る。本明細書で用いる「抗体」には、モノクローナルおよびポリクローナル抗体
、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント
が包含され、さらに免疫グロブリン発現ライブラリーの産物等のＦａｂフラグメ
ントも包含される。 酵素処理、例えば、パパインを用いてＦａｂ部分をＦｃ部分から開裂すること
により、Ｆａｂフラグメントをその親モノクローナル抗体から調製してもよい。 本発明のポリペプチドに対して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープ
が付いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくはヒトはでない動物に
通常の実験法を用いて投与することにより得ることができる。そのようにして得
られた抗体はポリペプチド自体に結合するであろう。このようにして、ポリペプ
チドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、生のポリペプチド全体に結
合する抗体を得るために使用することができる。かかる抗体を用いて、ポリペプ
チドを発現する組織からポリペプチドを単離することができる。連続的細胞系培
養により産生される抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モノクローナ
ル抗体を調製することができる。例としては、Kohler, G.およびMilstein, C.,N
ature, 256:495-497 (1975); Kozborら、Immunology Today, 4:72 (1983);Coleら
、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc.、77-96頁(198
5)に記載されるような種々の技法がある。 １またはそれ以上の元のポリペプチドおよび／または融合蛋白を用いて、高ア
フィニティーを有し、他のスタフィロコッカス種と好ましい交差反応をする細胞
系を選択するためにハイブリドーマをスクリーニングしてもよい。 一本鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）を
適用して、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を得ることができる。また
、トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例えばその他の哺乳動物を用
いてヒト化抗体等の抗体を発現させてもよい。

【００６４】 別法として、ファージディスプレイ技法を用いて、抗−ポリペプチドを有する
ことにつきスクリーニングされたヒト・リンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ−遺伝子
のレパートリーから、抗−ＲＮａｓｅＰを有することについてスクリーニングさ
れたヒトから、あるいは無処理のライブラリーから、ポリペプチドに対する結合
活性を有する抗体遺伝子を選別することもできる(McCafferty, J.ら、Nature 348
:552-554 (1990); Marks, J.ら、Biotechnology 10:779-783 (1992))。これらの
抗体の親和性はチェインシャフリング(chain shuffling)により改善することも
できる(Clackson, T.ら、Nature 352:624-628 (1991))。 ポリペプチドおよび／または融合蛋白に対する高アフィニティーに関して抗体
を再度スクリーニングすべきである。 上記のごとく、最終抗体のフラグメントを調製してもよい。 抗体は分子量約１５００００の無傷の抗体あるいはその誘導体、例えばSkerra
, A and Pluckthum, A., Science 240:1038-1040 (1988)に記載されたようなＦ
ａｂフラグメントまたはＦｖフラグメントであってもよい。二つの抗原結合ドメ
インが存在する場合、各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトープ
に対して指向される。 詳細には、本発明の無傷の蛋白またはポリペプチドフラグメントよりもわずか
に長いあるいはわずかに短い誘導体を使用してもよい。さらに、１またはそれ以
上のアミノ酸残基が修飾されているポリペプチドを使用してもよい。かかるペプ
チドを、例えば、アミノ酸の置換、付加または転移により、あるいは化学的修飾
により調製してもよい。かかるすべての置換および修飾はペプチド化学の当業者
に広く知られている。

【００６５】 上記抗体を用いて、ポリペプチドを発現するクローンを単離し同定し、アフィ
ニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製することができる。 よって、特に、ＲＮａｓｅＰポリペプチドまたは例えばＲＮａｓｅＰのＲＮＡ
を包含するＲＮａｓｅＰのポリヌクレオチドに対する抗体を用いて、感染、とり
わけ細菌感染、特に例えば、上気道疾患（例えば、中耳炎、細菌性気管炎、急性
咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道疾患（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓疾患（例
えば、感染性心内膜炎）、胃腸疾患（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿
瘍）、ＣＮＳ疾患（例えば、大脳膿瘍）、眼疾患（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角
膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および尿管疾患（例えば
、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚疾患（
例えば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、ならび
に骨および関節疾患（例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎）のような疾病を治療し
てもよい。 好ましくは、本発明のポリペプチドの発現について上記したような適当な発現
系において該抗体をコードしているＤＮＡポリマーを発現させることにより抗体
を調製する。発現系のベクターの選択は、一部には宿主に応じてなされるであろ
うし、宿主としては、例えばイー・コリ（好ましくはＢ株）もしくはストレプト
ミセス種のごとき原核細胞、あるいはマウスＣ１２７、マウスミエローマ、ヒト
ＨｅＬａ、チャイニーズハムスター卵巣、糸状菌もしくは単細胞真菌または昆虫
細胞であってもよい。宿主はトランスジェニック動物またはトランスジェニック
植物（例えば、Hiatt, A. et al., Nature 340:76-78 (1989)に記載されたよう
な）であってもよい。適当なベクターはプラスミド、バクテリオファージ、コス
ミド、ならびに例えばバキュロウイルスおよびワクシニアに由来する組み換えウ
イルスを包含する。

【００６６】 ポリペプチド変種には抗原的、エピトープ的または免疫学的に等価な変種等が
あり、本発明の特定の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導体」
なる用語は、本発明により蛋白またはポリペプチドに対して生成した場合、病原
および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗体により
特異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含する。本明細書で用い
る「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、脊椎動物において抗体を産生させる
のに適した処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間での即時的な物
理的相互作用を妨害するように作用するペプチドまたはその等価物を包含する。 ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に等価な誘導体、またはそれらの融合
蛋白は、マウスまたはその他の動物例えばラットもしくはニワトリを免疫するた
めの抗原として使用できる。融合蛋白はポリペプチドに安定性を付与できる。抗
原は、例えば抱合することにより、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモシアニン(keyhole limpe
t haemocyanin:KLH)に結合することができる。あるいはまた、蛋白もしくはポリ
ペプチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重
コピーを含む多重抗原ペプチドは、免疫原性を改良するための十分な抗原性を有
しているので、キャリヤーを使用しなくてすむ。 好ましくは、抗体またはそれらの変種を、個体における免疫原性を減じるため
に修飾する。例えば、個体がヒトである場合、最も好ましくは、抗体は「ヒト化
」されており；この場合、ハイブリドーマ由来の抗体の相補性決定領域がヒト・
モノクローナル抗体に移植されており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-525(
1986)またはTempestら、Biotechnology 9:266-273(1991)に記載されている。ヒト
化モノクローナル抗体または結合活性を有するそのフラグメントは本発明の特定
の態様を形成する。 修飾は「ヒト化」したものに限らず、他の霊長類の配列（例えば、Newman R.
ら、Biotechnology 10:1455-1460(1992)を用いてもよい。 本発明のポリヌクレオチドを遺伝学的免疫において使用する場合、例えばプラ
スミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Ｗｏｌｆｆら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ
．１：３６３（１９９２）；Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒ．４：４１９（１９６３））、特異的蛋白キャリヤーとＤＮＡとの複合体のデ
リバリー（Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５（１９８９）
）、リン酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ ＆ Ｒｅｓｈｅ
ｆ、ＰＮＡＳ ８３：９５５１（１９８６））、種々の形態のリポソーム中への
ＤＮＡ封入（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：３７５（１９８９））
、微粒子爆撃（Ｔａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３５６：１５２（１９９２）；Ｅｉ
ｓｅｎｂｒａｕｎら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：７９１（１９９３）
）およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたインビボ感染（Ｓｅｅｇｅ
ｒら、ＰＮＡＳ ８１：５８４９（１９８４））等の適切なデリバリー方法を用
いるのが好ましい。

【００６７】ワクチン 本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免疫学的反応を誘導する
方法に関し、該方法は、感染、詳細には細菌感染、最も詳細にはスタフィロコッ
カス・アウレウス感染から個体を防御するための抗体および／またはＴ細胞免疫
応答を生じさせるに十分なＲＮａｓｅＰまたはそのフラグメントもしくは変種を
個体に接種することを特徴とする。かかる免疫学的応答が細菌の複製を遅らせる
方法も提供される。本発明のさらにもう１つの態様は、個体における免疫学的応
答の誘導方法に関し、該方法は、疾病が個体においてすでに確立されているか否
かにかかわらず、インビボでＲＮａｓｅＰ、またはそのフラグメントもしくは変
種を発現させるためにＲＮａｓｅＰまたはそのフラグメントもしくは変種の発現
を指令する核酸ベクターをかかる個体にデリバリーして、例えば、抗体および／
またはＴ細胞免疫応答（例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞または細胞毒性Ｔ細胞
）を生じさせる免疫学的応答を誘導して、該個体を疾病から防御する抗体を産生
させることを特徴とする。迅速に遺伝子を所望細胞中に投与する方法としては、
粒子上にコーディングすること等がある。 かかる核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイ
ブリッドを含んでいてもよい。

【００６８】 本発明のさらなる態様は、免疫学的反応を宿主内に誘導できる、または誘導さ
れた宿主に導入した場合、ＲＮａｓｅＰまたはそれによりコードされている蛋白
に対する免疫学的反応を該宿主に誘導する免疫学的組成物に関し、その組成物は
組換えＲＮａｓｅＰまたはそれによりコードされている蛋白を含み、ＲＮａｓｅ
Ｐまたはそれによりコードされている蛋白に対する抗原をコードし発現するＤＮ
Ａを含む。免疫学的応答を治療的または予防的に用いてもよく、また免疫学的応
答はＣＴＬまたはＣＤ４＋Ｔ細胞から生じるような抗体免疫または細胞性免疫の
形態であってもよい。 ＲＮａｓｅＰポリペプチドまたはそれらのフラグメントを、それ自身は抗体を
産生しないが、第１の蛋白を安定化し、免疫原的および保護特性を有する融合蛋
白を産生する能力のある共存蛋白（ｃｏ−蛋白）と融合させてもよい。好ましく
は、かかる融合組換え蛋白は、抗原補蛋白、例えばヘモフィルス・インフルエン
ザエ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来のリポ蛋白Ｄ、グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシダーゼ
のごとき共存蛋白、蛋白を可溶化してそれらの産生および精製を促進する比較的
大きな共存蛋白等を含む。さらに、共存蛋白は免疫系において普遍的な刺激を提
供するという意味で、アジュバントとして作用することができる。共存蛋白は第
１の蛋白のアミノまたはカルボキシいずれの末端に結合していてもよい。

【００６９】 本発明は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよびＳａｔｏ Ｙ
．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２ （１９６６）に記載されているような
免疫刺激ＤＮＡ配列を含む組成物、とりわけワクチン組成物、および方法を提供
する。 また、本発明は、スタフィロコッカス・アウレウスに感染した動物モデルにお
いて、かかる遺伝的免疫化実験に用られるＤＮＡ構築物中の細菌細胞表面蛋白の
不変領域をコードすることが示されている、説明したポリヌクレオチドまたはと
りわけそれらのフラグメントを用いる方法を提供し、これらはとりわけ予防的ま
たは治療的免疫反応を刺激することができる蛋白エピトープを同定するのに有用
である。この方法は、哺乳動物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけスタフ
ィロコッカス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置の開発のために、感染
に抵抗しこれを一掃するのに成功した動物の必須器官から特に価値あるモノクロ
ーナル抗体をうまく調製することを可能にすると思われる。 ポリペプチドを宿主接種用抗原として用いて、例えば損傷組織への細菌の付着
をブロックすることにより細菌の侵入に対して防御する特異的抗体を得てもよい
。組織損傷の例としては、例えば機械的、化学的もしくは熱的ダメージにより、
または内在デバイスの埋め込みにより引き起こされた皮膚または結合組織の創傷
、または粘膜、例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷等がある。

【００７０】 また本発明は、適切な担体と一緒になった免疫原性組換え蛋白を含有するワク
チン処方を包含する。蛋白は胃で分解されうるので、非経口的に、例えば皮下、
筋肉内、静脈内または皮内等に投与するのが好ましい。非経口投与に適した処方
には、抗酸化剤、緩衝液、静細菌剤、および処方を個体の体液（好ましくは血液
）と等張にする溶質を含有していてもよい水性または非水性滅菌注射液、および
懸濁化剤または増粘剤を含有していてもよい水性または非水性滅菌懸濁液等があ
る。処方は１回投与または多回投与用容器、例えばシールしたアンプルおよびバ
イアルに入れてよく、使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥
状態として保存してもよい。ワクチン処方は処方の免疫原性を高めるアジュバン
ト系を含有していてもよく、例えば水中油系または当該分野で周知のその他の系
等がある。投与量はワクチンの特異的活性に依存し、通常の実験法により容易に
決定できる。 本発明を特定のＲＮａｓｅＰ蛋白に関して説明したが、本発明は天然に存在す
る蛋白および、実質的に組換え蛋白の免疫原特性に影響しない付加、欠失または
置換を施した類似の蛋白のフラグメントを包含することが理解されよう。

【００７１】組成物、キットおよび投与 本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはそれらの
アゴニストもしくはアンタゴニストを含む組成物にも関する。本発明のポリペプ
チドを、細胞、組織もしくは生物に用いられる未滅菌もしくは滅菌済み担体と混
合して、例えば対象への投与に適した医薬的担体と混合して用いることができる
。このような組成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明のポリペ
プチド、および医薬的に許容できる担体または賦形剤を含む。このような担体に
は生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ールおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限定するものではない。 処方は投与法に適したものにすべきである。さらに本発明は、１またはそれ以上
の上記本発明組成物成分を充填した１またはそれ以上の容器を含む診断用および
医薬用パックおよびキットにも関する。

【００７２】 本発明のポリペプチドおよびその他の化合物を、単独で、あるいは治療用化合
物等のその他の化合物と組み合わせて用いてもよい。 いずれかの有効かつ利便的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、経膣、静脈
内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮膚内の経路で医薬組成物を投与
してもよい。 治療において、または予防薬として、活性物質を注射用組成物として、例えば
好ましくは等張の滅菌水性分散物として個体に投与できる。 別法として、組成物を局所適用用、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼軟
膏、点眼液、点耳液、洗口剤、含浸包帯および縫合用の糸、ならびにエアロゾー
ル等の形態に処方してもよく、適当な慣用的な添加物、例えば保存剤、薬物の浸
透を補助する溶媒、ならびに軟膏およびクリームには軟化剤を含有していてもよ
い。かかる局所用処方は、適合した慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基
剤、およびローションにはエタノールまたはオレイルアルコールを含有していて
もよい。このような担体は重量で処方の約１％から約９８％であってよく、より
通常には重量で処方の約８０％までとする。 哺乳動物とりわけヒトに投与するために、活性物質の１日あたりの投与量は、
０．０１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇであ
る。医者はあらゆる場合、個体に最も適した実際の投与量を決定し、年齢、体重
および特に個体の反応性に応じて変化させる。上述の投与量は、平均的なケース
の典型例である。もちろん、高用量および低用量の範囲が適合する個々の例もあ
り、かかる例は本発明の範囲内である。

【００７３】 内在デバイスには外科的インプラント、補てつデバイスおよびカテーテル等が
あり、即ち個体の体に導入し、長時間その位置に存在するものである。このよう
なデバイスには、例えば人工関節、心臓弁、ペースメーカー、血管移植片、血管
カテーテル、脳脊髄液シャント、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析（ｃｏ
ｎｔｉｎｕｏｕｓ ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｉａｌｙ
ｓｉｓ：ＣＡＰＤ）カテーテル等がある。 本発明の組成物を注射により投与し、内在デバイスの挿入の直前に、関連細菌
に対する全身的な効果を得てもよい。手術後、デバイスが体内に存在する期間中
、処置を続けてもよい。さらに、外科的手技中に広げるカバーに用いて、細菌性
創傷感染、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスの創傷感染を防御すること
もできる。 多くの整形外科医は、補てつ関節を有するヒトについては、菌血症を生じうる
歯科的処置の前に抗生物質予防法を考慮すべきであると考えている。遅延性の重
篤な感染は、時々補てつ関節を失うに至る深刻な合併症であり、有意性のある罹
病率および死亡率を伴う。それゆえ、この状況において、予防的な抗生物質に代
わるものとして、活性物質の使用を拡張することが可能である。

【００７４】 上述の治療に加え、一般的には本発明組成物を創傷の治療薬として使用して、
創傷組織において曝露されたマトリックス蛋白に細菌が付着するのを防いでもよ
く、歯科治療においては抗生物質による予防法に代えて、またはそれと組み合わ
せて予防的に使用してもよい。 別法として、本発明の組成物を用いて挿入直前の内在デバイスを浸してもよい
。創傷または内在デバイスを浸すためには、活性物質は１μｇ／ｍｌから１０ｍ
ｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。 ワクチン組成物を便宜的に注射可能な形態にする。慣用的なアジュバントを用
いて免疫反応を高めてもよい。ワクチン化に適した単位投与量は、抗原０．５〜
５μｇ／ｋｇであり、このような投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが
好ましい。本発明化合物については、指示した投与量範囲では、適切な個体への
投与を妨げるような不利な毒性効果は観察されない。 本明細書に開示した各文献を、参照によりその全体が本明細書に記載されてい
るものとみなす。本願が優先権を主張しているいずれの特許出願も、参照により
その全体が本明細書に記載されているものとみなす。

【００７５】 実施例 本発明をさらに、下記の実施例を用いて説明する。実施例は、詳細な具体例を
参照することにより単に本発明を説明するに提供されるものである。かかる具体
例は本発明の特定の態様を説明しているが、開示する発明の範囲を制限また限定
するものではない。 すべての実施例は、標準的な技法、当業者に公知であり慣例の方法を用いて実
施される。ただし、詳細に記載される場合は例外とする。下記の実施例の慣例の
分子生物学的技法は標準の実験マニュアル、例えばSambrook ら、 MOLECULAR CLO
NING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載のように実行することができる。． 特記しない限り、下記の実施例に示したすべての部または量は、重量である。

【００７６】 特記しない限り、フラグメントのサイズ単離は、Sambrookら、 MOLECULAR CLON
ING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)およびその他多数の文献、例えばGoeddel ら、N
ucleic Acids Res. 8: 4057 (1980)に記載のアガロースおよびポリアクリルアミ
ドゲルの電気泳動（ＰＡＧＥ）の標準的な技法を用いて実施された。

【００７７】 実施例１ ランダムなプライマーを用いたＰＣＲ この方法は、ゲノムライブラリーのプローブとは別に部分的遺伝子フラグメン
トから別の配列データを入手するための方法を記載する。 エス・アウレウスのゲノムライブラリーのランダム配列決定を行い、つづいて
、ビー・サチリスＰ−蛋白配列で配列の相同性の検索を行い、３２４塩基対（こ
こでは“ｂｐ”と示す）フラグメントを同定した。ビー・サチリス蛋白このフラ
グメントの始めの１９３個のヌクレオチドは、ビー・サチリス Ｐ−蛋白および
他の原核生物のＲｎａｓｅＰ蛋白のＣ−末端ハーフに対して有意な相同性を示し
た。推定エス・アウレウス ＲＮａｓｅＰ蛋白のＮ−末端ドメインは、推定上消
失した。 推定エス・アウレウスＲＮａｓｅ Ｐ蛋白配列はビー・スブチリスに対して５
８．７％の類似性、３４．９％の同一性（図２のＲＮａｓｅ Ｐ蛋白配列の配置
を参照）を示した。 公知の配列に相補的な位置１―３９およぶ１９４−２１５（下記参照、表２）
にある２つの愛顧となる逆方向プライマー、ならびにランダムな六量体プライマ
ー（Gibco）と比較した２つの異なった再生プライマーを用いた新規な二段階Ｐ
ＣＲを、エス・アウレウスｓｐｐ遺伝子の完全な５’末端配列を得るために用い
たＨｉｎｄＩＩＩまたはＰｓｔＩで部分的に消化した。エス・アウレウスゲノム
ＤＮＡは、鋳型として供したプライマー＃１(位置１９４−２１５)は、終止コド
ンＴＡＡのすぐ下流をアニールし、プライマー＃２は（位置１５−３９）は、公
知の配列（表２参照）の末端の近くをアニ-ルした。

【００７８】 表２ プライマー部位

【表１】

【００７９】 第一工程において、蛋白のＣ−末端をコードし、鎖および不明なＮ−末端の上流
にある逆方向鎖をプライマ＃１を用いて増幅し、図９に示すような一本鎖生成物
を得た。所望の配列をこの増幅に付し、ランダムプライマーを次の工程にてその
配列への結合を有利にした。 第二工程において、^３２Ｐ−末端−標識されたプライマー＃２およびランダムな
六量体を加え、アニール温度を２５℃に落とし、ショートランダムプライマーを
ＤＮＡにアニールさせた。

【００８０】 ＰＣＲにより多くの異なるフラグメントの生成が期待されるが、主要な生成物は
プライマー＃２およびランダムプライマー（下記参照）によりプライムされたも
のでなければならない。かかる生成物のみが、蛋白のＮ−末端ハーフをコードす
べき物として重要であり、またそれらは標識されるため、それらをモニターする
ことができる。ゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を分離し、フィルムに暴露した後
、限定数の標識したバンドを、放射能写真上で観測することができる。この方法
は、図１０に示されている。かかるフラグメントは、その後、適当なベクター、
例えばｐＵＣ１９にクローンされ、慣例の方法を用いて配列決定される。

【００８１】 実施例２ ランダムプライマーを用いたｓｐｐ５’ドメインのＰＣＲ ｓｐｐ遺伝子の５’ハーフを、本明細書中に記載の通り２工程のＰＣＲ反応に
より増幅した。ＰＣＲ生成物を、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製カラムを用いて浄化
し、水５０μｌ中に回収した。サンプルを、ＳｐｅｅｄＶａｃＳＣ１１０（Ｓａ
ｖａｎｔ）中減圧下で最終体積が２５μｌになるように濃縮した。２０μｌを７
Ｍの尿素を含む１．６ｍｍ、８％ポリアシルアミドゲル上に負荷し、ゲル電気泳
動により分析した。ＤＮＡを可視化するために、このゲルを臭化エチジウム（水
中１μｇ／ｍｌ）で着色して写真を撮影した。次いで、ゲルを乾燥させフィルム
に曝した。 臭化エチジウム染色ゲルだけでなく、放射能写真上にも数個の特定された可視
バンドが観測された。それらは５０ｂｐから２０００ｂｐを越える大きさにあり
、あるバンドは他のバンドよりも強度が大きかった。最も重要な結合は、５０ｂ
ｐ、１５０ｂｐ、４００ｂｐおよび８００ｂｐの大きさである。

【００８２】 実施例３ ＰＣＲフラグメントのショットガンクローンニング：ＰＣＲフラグメ
ントのクローニングおよび配列決定 ＰＣＲフラグメントをＳｍａＩカットｐＵＣ１９Ｔに平滑末端クローン処理に
付した。１．０μｌおよび１．５μｌのＰＣＲ生成物と１００ｎｇのベクターＤ
ＮＡを１６℃で一晩連結した。イー・コリＸＬ１青色細胞（α−補足）をエレク
トロポレーションにより形質転換させ、ＩＰＴＧおよびｘ−ガル（青色／白色ス
クリーニング）を含む選択的プレートに置いた。 かかる細胞の形質転換によりＰＣＲ生成物の存在下約８．５％白色コロニーを
得た。これに対して、挿入していない対照連結体では、４．６％の白色コロニー
が観測できた。白色コロニーは、ＩａｃZ’遺伝子中において読み取り枠が破壊
したためβ−ガラクトシダーゼホロ酵素を形成する能力を喪失しており、もはや
ｘ−ガルを開裂することができなかった。読み取り枠は、挿入により破壊される
か（PCR生成物の存在下）または制限酵素の調製物のエクソヌクレアーゼ活性に
より破壊され、末端ヌクレオチドを開裂させてベクターのＳｍａＩ部位を破壊し
、その結果連結後に枠シフトが起こる。 １８個の白色コロニーを取り出し、２ｍｌ培養体となるまで培養してプラスミ
ドを得た。個々のプラスミドのサンプルをＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ（マ
ルチクローニング部位に切断）で直線にし、元のｐＵＣ１９と一緒にに沿って１
％ＴＡＥアガロースゲル上を泳動させた。

【００８３】 その結果、７個のプラスミドが制限消化後にショートフラグメントを放出する
ことがわかった。ｐＵＣ１９にはわずか一つのＡｃｃＩ部位しかないため、かか
る組換えプラスミドは、この酵素のための制限部位を有する挿入体を含まなけれ
ばならない。３個のプラスミドはｐＵＣ１９より大きいが、フラグメントを放出
しなかった。他の８個のプラスミドはｐＵＣ１９と同サイズであり挿入体は含ま
たいようであった。 挿入体を含む１０個のプラスミドを、順および逆方向ｐＵＣ／Ｍ１３シーケン
シングプライマーの両方を用いて配列決定した。 ＡｃｃＩ消化の後にフラグメントを放出する６個のプラスミド中５個は、プラ
イマー＃２配列で開始する２１３ｂｐ挿入体および既知の１４ｂｐを、つづいて
すべてのポラスミドに共通の１７４ヌクレオチドの配列を有した（配列１、表３
）。６個中の１個のプラスミドにおいて、挿入体（配列２、表３）は微妙に異な
っており：始めの１３７ヌクレオチドは配列１（点線部）と共通するが、挿入し
た配列はこの部分を超えて伸びており、配列１とは逸脱した（表３を参照）。

【００８４】 表３ 配列１、２および３の増幅生成物

【表２】

【００８５】 プライマー＃２配列を太字で、また既知の１４個の塩基を下線を付して示す（
既知配列と比べて３個の変化をイタリック体で示す）。 配列１および２の予測される翻訳生成物は、ビー・サチリス Ｐ−蛋白と有意
な相同性を示し、かかる挿入体はｓｐｐ遺伝子の５’ドメインの全配列情報を含
有することを示した。 ２個のプラスミドにおいて、ｓｐｐ遺伝子の３’ハーフがプライマー＃１の配
列で始まる挿入体の後にあった（配列３、表３）。この配列はすでに公知である
が、エス・アウレウスライブラリーのランダムな配列決定により得られた最初の
配列データと比較して新規な配列は９個の塩基変化（太字で示す）を示した。 ２個のプラスミドは、ＰＣＲの間に非特異なプライミングの結果である異なっ
た配列を有する挿入体を含んでいた。

【００８６】 実施例４ 配列データの分析 新たに得られた配列データを一緒に描写し、ｓｐｐ構造遺伝子の完全な配列を
予測して示した。読み取り枠を３’ドメインの部分配列から決定した。この読み
取り枠により開始コドンＡＴＧはプライマ−＃２配列の１７４ｂｐ上流であると
同定された（上記参照）。この遺伝子の全長は、３５４ｂｐである。 ｓｐｐ遺伝子のヌクレオチド配列を表１［配列番号：２］に示す；開始コドン
（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＡ）はいずれも太字で示す。ｓｐｐ遺伝子の
推定翻訳生成物（ＳＰ蛋白）は１１７アミノ酸であり、それも表１［配列番号：
２］に示す。 翻訳された配列を、５個の異なったプロカリオート（prokaryote）からのＲＮ
ａｓｅＰ蛋白の公知のアミノ酸配列と共に配置した。かかる配置は図２に示され
ている。エス・アウレウスＳＰ蛋白配列は、ビー・サチリスＰ−蛋白配列によく
対合し、ビー・サチリス蛋白と有意な相同性を有する。

【００８７】 実施例５ ｓｐｐ遺伝子のＰＣＲ 新規に得られた配列データは、全長ｓｐｐ構造遺伝子を増幅するためのＰＣＲ
プライマーを、デザインするために用いられた。 このＰＣＲによって、分光学的測定で測定されるように全ＤＮＡ収量が２μｇ
の約３６０ｂｐの単一バンドであることがわかった。該ＤＮＡフラグメントはＱ
ＩＡクイックＰＣＲ精製カラムを用いて浄化され、８０μｌの水中で回収された
。

【００８８】 実施例６ ｓｐｐのｐＭａｌｃ２へのクローニング ｐＭａｌｃ２ベクターは、クローン遺伝子から生成された蛋白の発現および精
製方法を提供する(New England BioLabs)(Guan, C., Li, P., Riggs, P.D. およ
び Inouye, H. (1987) Gene 67, 21-30; Maina, C.V. ら、 (1988) Gene 74, 365
-373: Riggs, P. in Ausubel, F.M. ら、 (eds) Current prot. in Molecular Bi
ol. (1992): Kellerman および Ferenci (1982) Methods in Enzymol. 90, 459-
463; Yanisch-Perron, C. ら (1985) Gene 33, 103-119; Zagursky, R.J. and B
erman, M.L. (1984) Gene 27, 183-191, regarding the vector and its usesも
参照)。 クローン遺伝子を、マルトース−結合−蛋白（ＭＢＰ）をコードするイー・コ
リのｍａｌＥ遺伝子から下流に挿入し、ＭＢＰ融合蛋白の発現が得られた。該方
法は、ｌａｃリプレッサーの制御下、ストロングな”ｔａｃ”プロモーターを使
用し、マルトースに対するＭＢＰのアフィニティーを用いて融合蛋白の一工程の
精製を用いる。目的の遺伝子の目的の為にｍａｌＥおよびｌａｃＺａ間にある独
特な制限部位を利用し、形質転換体を青色／白色のスクリーニングに付す。ベク
ターもまた、ちょうどポリリンカーの丁度５’の位置に特異的な因子Ｘａプロテ
アーゼを認識する部位を含んでいる。これにより遺伝子がＸｍｎＩ部位にクロー
ンされた場合、目的の蛋白に付着した残基にベクター誘導のざんきを残すことな
く、精製後にＭＢＰが切断させるようになる。

【００８９】 実施例７ ｓｐｐＰＣＲ生成物のｐＭａｌｃ２への連結 １μｇの蛋白融合ベクターｐＭａｌｃ２をＸｍｎＩおよびＢａｍＨＩ制限エン
ドヌクレアーゼで切断し、ｓｐｐ構造遺伝子を直接クローンニングすることを可
能にした。小さな１５ｂｐ挿入体を除去するために、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製
カラムを用いて消化物を浄化し、ＤＮＡを９０μＬの水中に回収した。サンプル
をアガロースゲル電気泳動を用いて分析し、ベクターの完全な消化を確認した。
３７℃で３０分間両方の酵素と一緒にインキュベーションした後、ベクターは完
全に切断された。 ｓｐｐＰＣＲ生成物はＢａｍＨＩで消化され、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製カラ
ムを用いて浄化した。 ベクターおよび挿入体を２０μｌ反応物中１６℃で一晩連結した。挿入部位に
対するベクターのモル比率は、１：５であった。エレクトロポレーション用のＤ
ＮＡを調製するために、ＱＩＡクイックヌクレオチド除去カラムを用いて連結物
の脱塩を行った。

【００９０】 実施例８ イー・コリＸＬ−１青色細胞の形質転換 ４０μｌの電気能力イー・コリＸＬ−１青色細胞を２μｌの脱塩された連結反
応物で形質転換させた。細胞をエレクトロポレーション後、１ｍｌのＳＯＣ培地
に回収した。１：１００の希釈体５０μｌをアンピシリン、ＩＰＴＧおよびｘ−
ガルを含むＬＢプレート上に置き、３７℃で一晩インキュベートした。１１個の
白色および１個の青色コロニーを回収した。この１１個の白色コロニーを増殖さ
せ、そのプラスミドをクローンから単離した。プラスミドを配列決定に付し、１
１個のプラスミドのうち６個が正しいｓｐｐ挿入体を含むことを確認した。得ら
れたプスミドはｐＭａｌｃ２：：ｓｐｐを示し、融合蛋白はＭＢＰ−ＳＰＰを生
成した。

【００９１】 実施例９ イー・コリＸＬ−１青色ｐＭａｌｃ２：：ｓｐｐにおける細胞増殖お
よび融合蛋白誘導 イー・コリＸＬ−１青色ｐＭａｌｃ２：：ｓｐｐの１リットルの培養基を３７
℃、２２０ｒｐｍで増殖させ１ｍＭのＩＰＴＧをＡ^６００が０．６になるまで加
えることによりＭＢＰ−ＳＰＰ融合の発現を誘導した。誘導は２時間続けられた
。この間にわたって、Ａ^６００をモニターし、細胞が誘導の間なおも増殖してい
ることを確認した。０．５、１．０、１．５および２時間後に１ｍｌのサンプル
を倍容器から取り出し、細胞をペレットにし、そのペレットを１００μｌのＳＤ
Ｓゲル負荷バッファーに再懸濁させた。３μｌのサンプルをクーマシー染色を用
いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。 該細胞は、融合蛋白の過剰発現に影響されることなく、増殖を続け、ＩＰＴＧ
誘導の２時間後Ａ^６００が１．４３に達した。 サンプルからの蛋白抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタントランス
ファーよるニトロ−セルロース膜に移した。ＭＢＰ−ＳＰＰ融合蛋白は、その膜
を抗−ＭＢＰウサギ血清およびＨＲＰ−結合した抗−ウサギ抗体ト一緒にインキ
ュベートし、続いてＥＣＬ検出を行うことで免疫−検出を行うことができた。ウ
エスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）は２個の蛋白が、ＩＰＴＧの付
加後に誘導されたことを示した。主要な蛋白は、略５６ｋＤの推定の大きさであ
り、少量に生産された第２の蛋白は１０−１５ｋＤ以上であった。 ｓｐｐ配列の分析は、イー・コリ中では稀なＡＵＡ（ｉｌｅ）およびＡＧＡ（
ａｒｇ）コドンの蓄積を示した。イー・コリ中のＡＧＡの通常頻度は、０．２７
％、ＡＵＡの頻度は０．５１％である。ｓｐｐ配列は４．３％のＡＧＡと５．１
％のＡＵＡとからなる。かかるコドンは、レアなコドンが高い存在量で存在する
蛋白を過剰に発現した場合、枠シフトおよび他の改変翻訳事象を引き起こす下も
知れない。 プラスミドｐＲＩ９５２から由来のＡｒｇＵ ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^ＵＣＵ）お
よびＩｌｅＸ ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^ＵＡＵ）を構造的に発現するもう一つのイー
・コリ株を入手した。

【００９２】 実施例１０ イー・コリＷ３１１０ ｐＲＩ９５２の形質転換 ５０μｌの電気能力イー・コリＷ３１１０ ｐＲＩ９５２細胞を２μｌの脱塩
した連結反応体と形質転換した。細胞を、エレクトロポーテーション後、１ｍｌ
ＳＯＣ培地中で回収した。１００μｌの培地をＩＰＴＧおよびｘ−ガルを含む選
択的ＬＢプレート（アンピリン、ｃａｍ）上に置き、３７℃で一晩インキュベー
トした。過剰なコロニーがプレート上で増殖し、計数できなかった。５個の白色
コロニーを選択し、そのプラスミドを単離した。プラスミドの配列決定により、
すべてが正確なｓｐｐ挿入物を有することがわかった。

【００９３】 実施例１１ 細胞増殖およびイー・コリＷ３１１０ ｐＲＩ９５２ ｐＭａｌｃ
２：：ｓｐｐの融合蛋白誘導 細胞を増殖させ、融合蛋白の発現を上記のように誘導した。細胞はＡ^６００が
０．６ないし１．４５の誘導期間中増殖しつづけた。ＩＰＴＧ付加後０．０、０
．５、１．５および２．５時間で培養基からサンプルを採り、蛋白抽出物をクー
マシー染色体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥならびに免疫検出（immunodection)を用
いたウエスタン移動法によって分析した。レア−ｔＲＮＡｓ ＩｌｅＸおよびＡ
ｒｇＵの過剰発現により、抗−ＭＢＰ血清により検出されるようなＩＰＴＧ誘導
の間に過剰発現するわずか一のＭＢＰ−ＳＰＰ融合蛋白だけが得られた。

【００９４】 実施例１２ アフィニティークロマトグラフィーによりＭＢＰ−ＳＰＰ融合蛋白
の精製 最適誘導につづいて、細胞（イー・コリＷ３１１０ｐＲＩ９５２ ｐＭａｌｃ
２：：ｓｐｐ）を収穫し、凍結−解凍サイクルに付した後に音波処理に供し、公
知の技法を用いて細胞壁を弱化することにより破壊した。細胞片を遠心分離によ
り除去し、粗抽出物の蛋白濃度をＢＩＯ−ＲＡＤ蛋白アッセイを用いて決定した
。粗抽出物のタンパク質の総量は８６ｍｇであった。粗抽出物のサンプルを、融
合蛋白が音波処理中に細胞から放出したことを示すクーマシー染色を用いたＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを用いて分析した。 ついで粗抽出物を、アミロース樹脂カラムに通し、ポンプを用いて、それにＭ
ＢＰ−ＳＰＰ融合体を結合させ、結合していない蛋白をカラムバッファーで十分
に洗浄してカラムから除去した。次いで、本明細書に記載の方法を用いて、１０
ｍＭマルトースを補充したカラムバッファーで融合蛋白を溶出した。溶出液を３
ｍｌづつのフラクションとして収集した。サンプルを精製工程中に取り出し、ク
ーマシー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ほとんどすべての融合蛋白
がアミロース樹脂と結合し、ほんのわずかな量のみが流れ経路中にあることが見
られ、非融合蛋白はカラムから洗い出された。フラクション４−１１は適当な量
の蛋白を含んでおり、それをプールし、１ｍ／ｍｌ濃度の２５ｍｌ蛋白溶液を得
た。

【００９５】 実施例１３ 融合蛋白の因子Ｘａ開裂およびＭＢＰおよびＳＰＰの分離 ５００μｇの因子Ｘａプロテアーゼを溶液に加え、融合蛋白を一晩かけて４℃
で開裂した。因子Ｘａのインキュベーションの前後にＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて
サンプルを分析し、完全な開裂をモニターした。１５時間後、ほとんどすべての
融合蛋白が開裂し、４２ｋＤＭＢＰおよび約１４ｋＤのＳＰＰを得た。 ＳＰ蛋白は因子Ｘａの開裂で容易に沈澱し、遠心分離にかけてＭＢＰより分離
した。ＳＰＰペレットを３回洗浄し、次いで５ｍｌのカラムバッファーに再懸濁
した。ＭＢＰは溶液中に残存して上清に見られるが、ペレットは主にＳＰ蛋白か
らなり、ある少量の汚染蛋白を含有し、ＳＰＰの適当な純調製物が得られた。Ｓ
ＰＰの総収量は２．１８ｍｇ／リットル培養基であった。ＳＰＰ調製物を、最終
濃度が０．３２ｍｇ／ｍｌになるまでカラムバッファーで希釈した。１ｍＭ Ｄ
ＴＴを加えて、システイン残渣間の分子内部のジスルフィド結合形成を阻害した
。７Ｍ尿素の添加により変性し、蛋白が再び完全に溶解したのは明らかであった
。蛋白をアリコートし、スナップ−凍結させて−８０℃で保存した。

【００９６】 実施例１４ ＳＰ ＲＮＡのインビトロ転写 ＳＰ ＲＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてプラスミドｐＳＰＲからイ
ンビトロにて転写した。ｐＳＰＲはＴ７プロモーターの後方にエス・アウレウス
ｓｐｒ遺伝子を有するｐＵＣ１９誘導体である。プラスミドを、ＢａｍＨＩ制限
エンドヌクレアーゼで直線状にし、転写が可能になった。Ａｍｂｉｏｎ ＭＥＧ
Ａｓｃｒｉｐｔ^ＴＭＴ７キッドはＳＰＲＮＡの大規模な転写に用いられた。転写
反応を３０℃で実行し、合成の間ＲＮＡが正確な構造にゆっくりと折りたためる
ようにした。該ＲＮＡは、非−変性条件下においてＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｃｈｒｏ
ｍａ−Ｓｐｉｎ ３０カラムを用いて洗浄し、ＲＮＡを４０μｌの水中に回収し
た。転写物の性質を７Ｍの尿素を含む５％ポリアクリルアミドＴＢＥゲル上をゲ
ル電気泳動させてモニターした。ＲＮＡをＴＬＣプレート上のＵＶ−シャドーイ
ングによって可視化した。 ｐＳＰＲからのＳＰＲＮＡのインビトロ転写により、予想される大きさの４０
１ヌクレオチドからなる単ＲＮＡ生成物を得た。ＲＮＡの総収量は１４０μｇで
あった（分光光度計により決定する）。浄化した後、ＲＮＡを４０μｌの水中に
回収し、２９μＭの溶液とし、それを−２０℃で保存した。

【００９７】 実施例１５ ［α−^３２Ｐ］ ＵＴＰを組み入れたイー・コリｐｔＲＮＡ^ｍｅｔ のインビトロ転写 ＲＮａｓｅ Ｐ用の基質であるイーコリｐｔＲＮＡ^ｍｅｔを、［α−^３２Ｐ］
ＵＴＰの存在下、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ
））によりインビトロで転写し、ＲＮＡを内部標識した。ＤＮＡ鋳型ｐＧｅｍ３
Ｚ−ｐｔＲＮＡをＢｓｔＮ制限エンドヌクレアーゼで直線状しして転写させた。
２０μｌの反応物中３７℃で６０分間該転写を行った。組み込まれていないヌク
レオチドを除去するため、９３ｎｔ ＲＮＡ（下記に示す配列）を非−変性条件
下でＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｃｈｒｏｍａ−Ｓｐｉｎ １０カラムを用いて浄化した
。ＲＮＡプローブの比活性を計算するため、１μｌのサンプルを浄化の前後に取
り出し、５ｍｌのシンチレーションカクテルと混合し、シンチレーション計数器
で測定した。 ｐＧｅｍ−３Ｚ中ｐｔＲＮＡ^ｍｅｔ、転写物の配列（９３量体） ５’→３’ ［配列番号：１２］： GGGCG AAUUC GCCUC GGCUA CGUAG CUCAG UUGGU UAGAG CACAU CACUC AUAAU GAUGG
GGUCA CAGGU UCGAA UCCCG UCGUA GCCAC CAG ｐｔＲＮＡ^ｍｅｔの転写により２μＭ（６ｎｇ／μｌ）溶液を得た。６４．３
％のヌクレオチドを転写物中に組み込み、その比活性は２．１７１^．１０^８ｃｐ
ｍ／μｇであった。

【００９８】 実施例１６ ｐ６ＡＴ−１の５’末端標識 化学的に合成された４２ｎｔＲＮＡ分子ｐ６ＡＴ−１を、バクテリオファージ
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、高比活性［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ （６
０００μＣｉ／μｌ）で５’−末端標識した。標識は、３７℃で３０分間１０μ
ｌの反応物中で行った。該酵素を９５℃で２時間、熱−不活性化した。塩、組み
込まれていないヌクレオチドおよび酵素を除去するため、ｐ６ＡＴ−１を、７Ｍ
尿素を含む２０％ポリアクリルアミドＴＢＥゲルからゲル精製した。ＲＮＡをゲ
ルスライスから抽出し、３００ｍＭＮａＯＡｃおよび２．５倍容量の１００％エ
タノールを用いて沈澱させた。１４０００ｇ、４℃でスピンした後、ＲＮＡペレ
ットを冷却した７０％エタノールで２回洗浄した。ペレットを風乾させ、つづい
て５０μｌの水で再懸濁した。０．５μｌを濾紙にスポットし、シンチレーショ
ン計数器で計測した（Ｃｈｅｒｅｎｋｏｖ 分析）。 末端標識は、６４０，０００ ｃｐｍ／μｌの活性を有するｐ６ＡＴ−１調製
物が得られたことを示した。

【００９９】 実施例１７ ＳＰ ＲＮＡ反応のための最適バッファー条件の決定 イー・コリＭ１ ＲＮＡは、１００ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１００ｍＭ トリスＣ
ｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭＭｇＣｌ_２中でｐｔＲＮＡ^ｍｅｔまたは最小基質ｐ
６ＡＴ−１を開裂することができる。エス・アウレウス ＳＰ ＲＮＡによるい
ずれの基質の開裂の条件も不明であり、イー・コリに最適な条件より逸脱するこ
とは明らかである。エス・アウレウスリボザイムによる基質開裂に対する最適な
バッファー条件を決定するために多数の異なるバッファー条件を調査した。 ホロ酵素反応における１００ｎＭ ＳＰ ＲＮＡおよびさらに２００ｎＭのＳ
Ｐ蛋白との開裂反応（２０μｌ）を用いて、３７℃で３０分間行った。基質（ｐ
ｔＲＮＡ^ｍｅｔまたはｐ６ＡＴ−１）を微量加えた（シングル−ターンオーバー
反応）。 無傷の善久体をサイズ分割に付し、開裂したリーダー配列を変性ゲル電気泳動
またはリン光画像装置を用いて、可視化することにより開列をモニター観察した
(Molecular Dynamics Storm 860)。

【０１００】 実施例１８ ｐ６ＡＴ−１開裂におけるＫＣｌ対ＮＨ_４Ｃｌの効果 すべての実験を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ^．Ｃｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ_２および１Ｍまたは２Ｍ 一価の塩（ＫＣｌまたはＮＨ_４Ｃｌ）で実行し
た。 １Ｍ ＫＣｌまたはＮＨ_４Ｃｌで検出できる開裂生成物は、ほとんど存在しな
かった。２Ｍの一価の塩が用いられた場合に開裂が起こった。塩化カリウムは、
塩化アンモニウムより良い結果を提供した。

【０１０１】 次のセクションに記載のさらなるパラメーターが最適となる一価のエンの濃度
の最適条件を調べた。 実施例１９ １００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２Ｍ ＫＣｌおよび１００ｍＭ Ｔｒｉｓ^．Ｃｌ（
ｐＨが７．０、７．５および８．０）を含むバッファーを用いてＳＰ ＲＮＡに
よるｐ６ＡＴ−１の開列を促進する能力について試験した。 基質は３つすべてのバッファーで開裂されたが、ｐＨ７．０では開裂は非常に
少なく、ｐＨ８．０が最適であった。

【０１０２】 実施例２０ ｐ６ＡＴ−１開裂に対するＰＥＧ８０００の影響 ポリエチレングリコールの添加によって、イー・コリＭ１ ＲＮＡによる基質
の開裂が改善された。本明細書において、ＳＰ ＲＮＡによるｐ６ＡＴ−１開裂
に対する異なったＰＥＧ８０００の濃度の効果を測定した。１％、２．５％およ
いの５％ＰＥＧを１Ｍ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ^．Ｃｌ（ｐＨ８）、１０
０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む反応物に加えた。 基質の開裂能はＰＥＧ濃度を高めることで改善され、それゆえ５％ＰＥＧが次
の反応使用すべきものとして選択された。

【０１０３】 実施例２１ ｐ６ＡＴ−１処理のためのＭｇＣｌ_２の要件 ＭｇＣｌ_２濃度を１００ｍＭから１０ｍＭまで連続的に低下させ、ＳＰ ＲＮ
Ａが基質を処理することができる最低マグネシウムイオン濃度を決定した。１０
０ｍＭ、５０ｍＭ、２５ｍＭおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ_２を２Ｍ ＫＣｌ、１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ^．Ｃｌ（ｐＨ８）および５％ ＰＥＧを含むバッファー中で試
験した。 １００ｍＭ ＭｇＣｌ_２で開裂した。しかしながら、ＳＰ ＲＮＡは５０ｍＭ
で、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２でもある程度はｐ６ＡＴ−１を処理することができた
。１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２では開列を観察できなかった。

【０１０４】 実施例２２ ｐ６ＡＴ−１開裂のためのＫＣｌの要件の決定 ＫＣｌ濃度を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ^．Ｃｌ（ｐＨ８）、 １００ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ_２および５％ ＰＥＧ中で４０ｍＭから１．５Ｍまで連続的に増加させた。 ４００ｍＭ以下のＫＣｌ濃度では開裂は見られなかった。４００ｍＭ ＫＣｌ ｐ６ＡＴ−１ での処理は非常乏しいが、塩の濃度と共に増加して１．５Ｋｃ
ｌで２７％の最大値に達した。これは、２０分後に３５％の基質が開裂した、イ
ー・コリＭ１ ＲＮＡによるｐ６ＡＴ−１開裂に匹敵した。ＳＰ ＲＮＡによる
ｐ６ＡＴ−１の開裂の最適バッファー条件は、１．５Ｍ ＫＣｌ、１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ^．Ｃｌ ｐＨ８、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％ ＰＥＧであった。

【０１０５】 実施例２３ ＳＰ ＲＮＡによるｐｔＲＮＡ^ｍｅｔ開裂のためのＫＣｌ要件 ｐｔＲＮＡ^ｍｅｔは、上記と同様のバッファー条件下で開裂された。ｐｔＲＮ
Ａ^ｍｅｔは、ｐ６ＡＴ−１より良い基質であった。ｐ６ＡＴ−１と比較して、ｐ
ｔＲＮＡｍｅｔはＫＣｌ濃度が４００ｍＭ以下であっても処理することができた
。ある程度の開裂は、２０ＭＭ ＫＣｌで検出できたが、これらの条件下ではｐ
６ＡＴ−１の開列は観察されなっかった。開裂率はＫＣｌの濃度により上昇した
。５０％以上の基質が１５０ｍＭ ＫＣｌで処理され、８００ｍＭ ＫＣｌで８
２％に到達した。１Ｍまたはそれ以上の濃度で８５％のｐｔＲＮＡは開裂され、
さらなる増加は検出できなかった；これは１５％の基質が開裂できなかったこと
を意味する。正対照であるイー・コリＭ１ ＲＮＡは、２０分以内に１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、１００ｍＭ ＭｇＣ
ｌ_２中の基質の８０％を開裂した。ＳＰＲＮＡによるｐｔＲＮＡ^ｍｅｔ開裂の最
適なバッファー条件は、１Ｍ ＫＣｌ， １００ｍＭ Ｔｒｉｓ^．Ｃｌ ｐＨ８
、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％ ＰＥＧであった。

【０１０６】 実施例２４ エス・アウレウス Ｒｎａｓｅ Ｐ ホロ酵素反応：ホロ酵素によ
るｐ６ＡＴ １開裂の最適バッファー条件の決定 ｐ６ＡＴ １のエス・アウレウス ＲＮａｓｅ Ｐ ホロ酵素開裂は、低いマ
グネシウム濃度において、異なるＫＣｌの濃度の範囲にわたって調査された。全
ての反応は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ^．Ｃｌ ｐＨ８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５
％ ＰＥＧおよび４０ｍＭないし１．５ＭのＫＣｌ中で行われた。４０ｍＭ Ｋ
Ｃｌにおいて、開列はすでに観測することができた。一価の塩の濃度と共に開裂
の割合は増加して、１５０ｍＭにてピークを迎え、そのとき基質の５０％が処理
された。より高いＫＣｌ濃度において、開裂割合は再度減少し、６００ｍＭのＫ
Ｃｌ濃度およびそれ以上の濃度においてｐ６ＡＴ−１の処理は行われなかった。
イー・コリのホロ酵素対照は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ７．５、１０
０ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２中において２０分以内にｐ６ＡＴ・
１の５７％を開裂した。ホロ酵素によるｐ６ＡＴ−１開裂についての最適バッフ
ァーは、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ ８．０、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ_２である。５％ ＰＥＧ ８０００であった。ｐ６ＡＴ−１は
、ＳＰ ＲＮＡに対するよりもホロ酵素に対してより良い基質であり、最適条件
下においてわずか２７％のｐ６ＡＴ−１が開裂されたにすぎないがエス・アウレ
ウス ＲＮａｓｅ Ｐ ホロ酵素では５０％が開裂された。

【０１０７】 実施例２５ ホロ酵素によるｐｔＲＮＡ開裂のためのＭｇＣｌ_２の要件 エス・アウレウス ＲＮａｓｅ Ｐ ホロ酵素は、ｐ６ＡＴ・１の処理と同様
の条件下で、ｐｔＲＮＡ^ｍｅｔを開裂することができなかった。ホロ酵素は、与
えられたいずれのＫＣｌ濃度であっても１０ｍＭのＭｇＣｌ_２で基質を開裂でき
なかった。マグネシウムイオンの濃度は２０ｍＭまで上昇し、ホロ酵素ならびに
ＳＰＲＮＡリボザイムをによるｐｔＲＮＡ開裂異なるＫＣｌ濃度で試験した。バ
ッファーは、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ^．Ｃｌ ｐＨ８、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５
％ ＰＥＧおよび１０ｍＭ、５０ｍＭ、１５０ｍＭ、６００ｍＭまたは１．５Ｍ
ＫＣｌを含有した。 １０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および低いＫＣｌ濃度におけるホロ酵素によるｐｔＲＮ
Ａの開裂は、非常に乏しかった。２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１５０ｍＭ ＫＣ
ｌにおいてホロ酵素はｐｔＲＮＡを非常によく処理し、基質の５４％が２０分間
のインキュベーション中に開裂した。６００ｍＭ ＫＣｌでは低い割合の基質の
処理が検出できたにすぎなかったが、１．５Ｍ ＫＣｌでは良好な開裂が起こっ
た。ＳＰ ＲＮＡ単独でも、かかる条件下でｐｔＲＮＡを開裂することができた
が、塩の濃度が低い場合にはｐｔＲＮＡを開裂できなかった。それゆえホロ酵素
によるｐｔＲＮＡｍｅｔ開裂のための最適ＭｇＣｌ_２濃度は、２０ｍＭであった
。

【０１０８】 実施例２６ 最適ＫＣｌ濃度の決定 エス・アウレウス ＲＮａｓｅ Ｐ ホロ酵素を２０ｍＭないし１．５Ｍの範
囲の異なるＫＣｌ濃度の下、ｐｔＲＮＡ^ｍｅｔを開裂する能力について試験した
。バッファーは、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ^．Ｃｌ ｐＨ８、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_{２ 、} ５％ ＰＥＧ ８０００およびｘＭ ＫＣｌを含有した。 ホロ酵素は２０ｍＭと同程度のＫＣｌ濃度ではｐｔＲＮＡを開裂できた。開裂
の割合は１５０ｍＭをピークに上昇し、そこでは基質の５５％が処理された。Ｋ
Ｃｌ濃度が２００ｍＭ以上で開裂の割合は減少するが、１Ｍ ＫＣｌで再び改善
され、１，５Ｍで最大に達する。塩の濃度が高い場合の開裂はホロ酵素活性によ
るものではなく、高いＫＣｌ濃度におけるＳＰ ＲＮＡリボザイム活性によるも
のであった。 ｐｔＲＮＡ^ｍｅｔは、エス・アウレウス ＲＮａｓｅ Ｐ ホロ酵素よりもＳ
ＰＲＮＡのためのよりよい基質であった。ホロ酵素によるｐｔＲＮＡ^ｍｅｔ開裂
の最適バッファー条件は１５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ^．Ｃｌ ｐ
Ｈ８、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％ ＰＥＧであった。

【０１０９】 実施例２６ 株選択、ライブラリーの生成および配列決定 配列番号：１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドは、イー・コリ中のス
タヒロコッカス・アウレウスの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーから得ら
れた。重複するスタフィロコッカス・アウレウスのＤＮＡを含有する２個または
それ以上のクローンから得た配列データは配列番号：１と類似したＤＮＡ配列を
構築するのに用いられた。ライブラリーは、慣例の方法：例えば下記する方法１
および２により調製した。 全細胞のＤＮＡはスタフィロコッカス・アウレウス ＷＣＵＨ ２９から、慣
例方法および両方法のいずれかによるサイズにしたがって単離された。

【０１１０】 方法１ 標準的方法に従ってサイズ分画するために、全細胞DNAをニードルに通して機
械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの大きさのDNAフラグメントをエキソヌクレア
ーゼおよびDNAポリメラーゼで処理することによって末端切断し、ＥｃｏＲＩリ
ンカーを付加する。フラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断したベクター、ラムダＺ
ａｐＩＩに連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージングし、次いで
パッケージングしたライブラリーでエシェリキア・コリを感染させる。ライブラ
リーを標準方法により増幅させる。

【０１１１】 方法２ 全細胞DNAをライブラリーベクターにクローニングするための一連のフラグメ
ントを得るのに適当な１つの制限酵素（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ
、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）またはその組み合わせで部分的に加水分解し、かかるフラ
グメントを標準的方法に従ってサイズ分画する。ＥｃｏＲＩリンカーをDNAに連
結し、次いでそのフラグメントをＥｃｏＲＩで切断したベクター、ラムダＺａｐ
ＩＩに連結し、標準的方法によりライブラリーをパッケージングし、パッケージ
ングしたライブラリーでエシェリキア・コリを感染させる。ライブラリーを標準
方法により増幅させる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 公開されている配列情報に基づいたＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡの二
次的構造モデルを示す。

【図２】 文献に記載される他の蛋白成分と比較した本発明のスタフィロコ
ッカスＲＮａｓｅ Ｐ 蛋白成分の配列を示す。

【図３】 ビー・サチリスから得たＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ成分の遺伝子を
コードするＤＮＡ配列と比較した、無傷の遺伝子をクローンするために用いたＲ
ＮＡ成分をコードする一連のＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子（配列番号：１４）をコード
するスフィロコッカスＤＮＡを示す。

【図４】 本発明のＲＮａｓｅ ＰのＰＮＡ成分の推定二次的構造を示す。

【図５】 エス・アウレウスＲＮａｓｅ Ｐの蛋白成分のアミノ酸配列およ
びそれをコードするＤＮＡの配列を示す［配列番号：１および２］。

【図６】 薬物／ＲＮＡの相互作用を同定するための全細胞のレスキュー分
析の模式図を示す。

【図７】 ＲＮＡ／蛋白の相互作用を混乱させる化合物を同定するためのス
クリーンの模式図を示す。

【図８】 最小ＲＮａｓｅ Ｐ基質の具体例を示す。

【図９】 ＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子の第1の増幅工程における具体例の模式図
を示す。詳細な具体例の模式図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｃ０８４ 9/00 11/00 ４Ｃ０８５ 11/00 13/00 13/00 17/00 17/00 19/02 19/02 27/02 27/02 31/04 31/04 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 9/22 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/34 9/22 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/34 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｐ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 (Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｒ 1:445） //(Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:445） 5/00 Ａ (71)出願人 スミスクライン・ビーチャム・パブリッ ク・リミテッド・カンパニー ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ｐ．ｌ．ｃ． イギリス国ミドルセックス・ティーダブリ ュ８・９イーピー、ブレンフォード、ニュ ー・ホライズンズ・コート (72)発明者 ザビーネ・グート ドイツ連邦共和国デー−3626ヘリンゲン、 ジートルング10番 (72)発明者 ジョアン・ジェニングズ イギリス、ティエヌ12・０キュージー、ケ ント、ステープルハースト、ステーショ ン・ロード、シングルトン (72)発明者 キャサリン・ディ・プレスコット イギリス、シービー１・１イーエル、ケン ブリッジ、エデン・ストリート６番 (72)発明者 リサ・エイ・ヘッグ アメリカ合衆国19333ペンシルベニア州デ ボン、タングルウッド・レイン554番 (72)発明者 フ・リ アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州カ レッジビル、イースト・フィフス・アベニ ュー74番、アパートメント・ジー−301 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 CB21 DA12 DA13 DA14 DA77 FB02 4B024 AA01 BA11 CA04 CA07 CA11 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 HA01 4B050 CC01 CC03 CC05 DD02 LL03 LL10 4B063 QA01 QA19 QQ01 QQ34 QQ42 QQ52 QR08 QR14 QR33 QR42 QR55 QR59 QR62 QR74 QR80 QS05 QS25 QS34 QS36 QX02 QX07 4B065 AA01X AA53Y AA57X AA87X AB01 BA02 CA31 CA44 CA46 4C084 AA17 MA01 NA14 ZA332 ZA362 ZA592 ZA662 ZA812 ZA892 ZA962 ZB352 4C085 AA03 AA13 AA14 BA13 CC32 EE01 GG01

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号:３の核酸配列を含むポリヌクレオチドに対
   して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）寄託株のスタフィロコッカス・アウレウス中に含まれるＲＮａｓｅＰの
   ＲＮＡ遺伝子により発現されるのと同じ触媒ＲＮＡを含むポリヌクレオチドに対
   して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオ
   チド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドの少なくとも３０個の
   連続した塩基を含むポリヌクレオチド からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ＲＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号：３に示す核酸配列を含む請求項２のポリヌクレオ
   チド。
5. 【請求項５】 請求項１のポリヌクレオチドを含むベクター。
6. 【請求項６】 請求項５のベクターを含む宿主細胞。
7. 【請求項７】 上記ＤＮＡによりコードされたポリペプチドを請求項６の宿
   主から発現させることを特徴とするポリペプチドの製造方法。
8. 【請求項８】 ＲＮａｓｅＰのＲＮＡまたは触媒フラグメントの生産に十分
   な条件下で請求項６の宿主を培養することを特徴とする、ＲＮａｓｅＰのＲＮＡ
   または触媒フラグメントの製造方法。
9. 【請求項９】 配列番号３の核酸配列に対して少なくとも９０％同一である
   ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
10. 【請求項１０】 請求項９のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡの活性
    または発現を阻害するアンタゴニスト。
11. 【請求項１１】 治療上有効量の請求項１０のアンタゴニストを個体に投与
    することを特徴とする、ＲＮａｓｅＰのポリヌクレオチドを阻害する必要のある
    個体の治療方法。
12. 【請求項１２】 個体における請求項９のポリヌクレオチドの発現または活
    性に関連した疾病の診断方法であって、 （ａ）上記ポリヌクレオチドでコードされたＲＮＡ配列を決定すること、およ
    び／または （ｂ）個体由来の試料中の該ＲＮＡの触媒作用、存在または量を分析すること
    を特徴とする方法。
13. 【請求項１３】 請求項１のポリヌクレオチドと相互作用して、その活性を
    阻害または活性化する化合物の同定方法であって、 化合物とポリヌクレオチドとを相互作用させる条件下で、ポリヌクレオチドを
    含む組成物とスクリーニングべき化合物とを接触させて化合物の相互作用を評価
    し（かかる相互作用はポリヌクレオチドと化合物との相互作用に応答した検出可
    能シグナルを提供しうる第２の成分に関連したものである）、 次いで、化合物とポリヌクレオチドとの相互作用により生じるシグナルの存在
    または不存在を検出することにより、化合物がポリヌクレオチドと相互作用して
    、その活性を活性化または阻害するかどうかを決定する ことを特徴とする方法。
14. 【請求項１４】 スタフィロコッカス・アウレスエ由来の単離されたＲＮａ
    ｓｅ Ｐ ＲＮＡ。
15. 【請求項１５】 配列番号：３の配列のＲＮＡ成分をを含むＲＮａｓｅ Ｐ
    ホモ酵素。
16. 【請求項１６】 配列番号：２の配列の蛋白成分および配列番号：３のＤＮ
    ＡでコードされたＲＮＡ成分を含むＲＮａｓｅ Ｐホロ酵素。
17. 【請求項１７】 請求項１６の成分をコードする単離されたＤＮＡ。
18. 【請求項１８】 請求項１７のＤＮＡを個体または共同的発現する方法。
19. 【請求項１９】 ＤＮＡまたは配列番号：３またはこれからコードされたＲ
    ＮＡを含むＲＮａｓｅ Ｐの阻害剤を同定するためのスクリーン。