JP2002142787A - スタフィロコッカス・アウレウス由来の新規プロリル−ｔＲＮＡシンセターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 感染、とりわけ細菌感染に対する防御のため
の方法が望まれていた。 【解決手段】 本発明によれば、ｔＲＮＡシンセターゼ
ポリペプチドが感染の予防に有用であることが見出され
た。さらに該ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ（ＲＮＡ）、ならびに組換え法による該ポ
リペプチドの製造方法も見出された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、新規に同定された
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびその製造
および使用、ならびにそれらの変種、アゴニストおよび
アンタゴニストおよびそれらの使用に関する。詳細に
は、これらのおよびその他の点に関して、本発明は、本
明細書で「ｔＲＮＡシンセターゼ」と称するｔＲＮＡシ
ンセターゼファミリーの新規ポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドに関する。

【０００２】（従来技術） 発明の背景 抗生物質の開発を目的として、スタフィロコッカス（St
aphylococcus）の遺伝子および遺伝子産物を用いること
がとりわけ好ましい。スタフィロコッカス属は医学的に
重要な微生物の属である。これらは浸潤性および毒素原
性の２つの型の疾患を生み出すことが知られている。浸
潤性感染は一般的に、皮膚表面および深部の組織の両方
に影響を及ぼす膿瘍を形成する特徴がある。エス・アウ
レウス（S.aureus）は癌患者の菌血症を二次的に引き起
こす原因となる。骨髄炎、敗血症性関節炎、敗血症性血
栓静脈炎および急性細菌性心内膜炎もまた比較的一般的
である。スタフィロコッカス属の毒素原特性から少なく
とも３つの臨床病態が引き起こされる。これらの疾患の
発現は、組織浸潤および菌血症に対するものとしての外
毒素の作用の結果である。これらの病態には：スタフィ
ロコッカスの食物汚染、熱傷様皮膚症候群およびトキシ
ックショック症候群等がある。

【０００３】ｔＲＮＡシンセターゼは以下のスキームに
従って、タンパク質合成に主要な役割を果たす： 酵素＋ＡＴＰ＋ＡＡ⇔酵素.ＡＡ-ＡＭＰ＋ＰＰｉ 酵素.ＡＡ-ＡＭＰ＋ｔＲＮＡ⇔酵素＋ＡＭＰ＋ＡＡ-ｔ
ＲＮＡ （ＡＡはアミノ酸である）この過程を阻害すると、荷電
ｔＲＮＡのレベル低下を導き、緊縮応答として知られて
いる応答のカスケードの引き金となり、結果的に生体の
休眠状態を誘導する。そのようなものとして、細菌性ｔ
ＲＮＡシンセターゼの選択的阻害剤は、抗細菌剤として
の可能性を有する。これに関する一つの例として、イソ
ロイシルｔＲＮＡシンセターゼを選択的に阻害するムピ
ロシンがある。ｔＲＮＡシンセターゼの単離により、潜
在的抗菌性の目的物質の同定および分析のための、抗菌
性化合物のスクリーニングが容易になる。

【０００４】イソロイシルｔＲＮＡシンセターゼはスタ
フィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureu
s）から単離され、すでに報告されている(Chalker,A.
F.、Ward,J.M.、Fosberry,A.P.およびHodgson,J.E.，Ge
ne 141:103-108（1994））。明らかに、化合物の抗生物
質活性をスクリーニングするために用いることができる
因子、ならびに感染、機能障害および疾患の発病におけ
る役割を決定するためにも用いることができる因子が必
要とされている。また、感染、機能障害または疾患の予
防、改善または抑制に役割を果たすことができるかかる
因子ならびにアンタゴニストおよびアゴニストの同定お
よび特徴づけも必要とされている。本発明のポリペプチ
ドは、既知のプロリルｔＲＮＡシンセターゼタンパク質
に相同的なアミノ酸配列を有する。

【０００５】（発明の開示）本発明の目的は、図２に示
すアミノ酸配列とプロリルｔＲＮＡシンセターゼタンパ
ク質のごとき他のタンパク質の既知の一つのもしくは複
数のアミノ酸配列との相同性により、新規ｔＲＮＡシン
セターゼポリペプチドとして同定されたポリペプチドを
提供することである。本発明のさらなる目的は、ｔＲＮ
Ａシンセターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド、特に本明細書においてｔＲＮＡシンセターゼと称
するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供
することである。

【０００６】本発明のとりわけ好ましい態様において、
ポリヌクレオチドは、図１[配列番号：１]に示す配列を
含むプロリルｔＲＮＡシンセターゼポリペプチド、また
はそれらの変種をコードする領域を含む。本発明の別の
とりわけ好ましい態様において、図２[配列番号：２]に
示すアミノ酸配列を含む、スタフィロコッカス・アウレ
ウス由来の新規プロリルｔＲＮＡシンセターゼタンパク
質、またはそれらの変種がある。本発明のこの態様によ
れば、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１に含まれるスタフ
ィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９株により発現さ
れうる成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子が提
供される。

【０００７】本発明のこの態様によれば、ｔＲＮＡシン
セターゼ、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスｔ
ＲＮＡシンセターゼをコードする、ｍＲＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ等の単離核酸分子が提供される。本発
明のさらなる態様は、生物学的、診断学的、予防的、臨
床的または治療的に有用なそれらの変種、およびこれら
を含んでなる組成物を包含する。本発明の別の態様によ
れば、治療的、予防的目的で、とりわけ遺伝学的免疫に
おける本発明のポリヌクレオチドの使用が提供される。
本発明のこの態様におけるとりわけ好ましい具体例は、
ｔＲＮＡシンセターゼの自然発生対立遺伝子変種および
それによりコードされるポリペプチドである。

【０００８】本発明のこの態様によれば、本明細書でｔ
ＲＮＡシンセターゼと称するスタフィロコッカス・アウ
レウスの新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診断学
的、予防的、臨床的または治療的に有用なそれらの変
種、およびこれらを含んでなる組成物が提供される。本
発明のとりわけ好ましい具体例は、ｔＲＮＡシンセター
ゼ遺伝子の自然発生対立遺伝子によりコードされるｔＲ
ＮＡシンセターゼポリペプチドの変種である。本発明の
この態様における好ましい具体例において、前述のｔＲ
ＮＡシンセターゼポリペプチドの製造方法が提供され
る。本発明の別の態様によれば、例えば抗体等の抗細菌
物質として有用な、このようなポリペプチドの阻害物質
が提供される。

【０００９】本発明のこの態様における１の好ましい態
様によれば、（i）ｔＲＮＡシンセターゼ発現の評価、
（ii）疾患、例えば上気道感染（例えば中耳炎、細菌性
気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道感染（例え
ば蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば感染性心内膜
炎）消化器感染（例えば分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後
膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば大脳膿瘍）、眼感染（例え
ば眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔（presepta
l）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および尿管感染
（例えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシック
ショック症候群）、皮膚感染（例えば膿痂疹、毛嚢炎、
皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、骨および
関節感染（例えば敗血症性関節炎、骨髄炎）の処置、
（iii）遺伝学的変種のアッセイ、（iv）ならびに細菌
とりわけスタフィロコッカス・アウレウス菌に対する免
疫学的応答を上昇させるための、ｔＲＮＡシンセターゼ
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの生体への投与の
ための製品、組成物および方法が提供される。

【００１０】本発明のこのおよび他の態様における１の
好ましい具体例によれば、ｔＲＮＡシンセターゼポリヌ
クレオチド配列に、とりわけ厳密な条件でハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチドが提供される。本発明
のこの態様における１の好ましい具体例において、ｔＲ
ＮＡシンセターゼポリペプチドに対する抗体が提供され
る。本発明の別の態様によれば、各々好ましい静細菌性
または殺細菌性をも有するｔＲＮＡシンセターゼアゴニ
ストおよびアンタゴニストを提供する。本発明のさらな
る態様において、ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチ
ドまたはｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドを含有す
る、細胞または多細胞生物への投与用の組成物が提供さ
れる。開示した本発明の精神および範囲内での種々の変
更および修飾は、以下の記載および本明細書のその他の
部分を読むことにより、当業者に容易に明らかとなろ
う。

【００１１】用語集 以下の定義は、本明細書において汎用される特定の用語
の理解を容易にするために示すものである。「宿主細
胞」は外来性ポリヌクレオチド配列により形質転換もし
くはトランスフェクションされた、または形質転換もし
くはトランスフェクションされ得る細胞である。

【００１２】「同一性」とは、当該分野に周知であるよ
うに、二つもしくはそれ以上のポリペプチド配列また二
つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係で
あり、配列を比較して決定する。当該分野において、
「同一性」とは、場合によってはかかる配列の鎖の合致
により決定できる、ポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ド配列の配列関連性の程度をも意味する。「同一性」お
よび「類似性」は共に既知の方法により容易に算出でき
る（Computational Molecular Biology，Lesk,A.M.編、
オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ニュー
ヨーク、1988年；Biocomputing：Informatics and Geno
me Projects，Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、
ニューヨーク、1993年；Computer Analysis of Sequenc
e Data，パートＩ，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.
編、ヒューマン・プレス、ニュージャージー、1994年；
Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinj
e,G.、アカデミック・プレス、1987年；およびSequence
Analysis Primer，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、
Ｍストックトン・プレス、ニューヨーク、1991年）。二
つの配列の同一性および類似性を測定する方法は多くあ
るが、両用語共当業者に周知である（Sequence Analysi
s in Molecular Biology，von Heinje,G.、アカデミッ
ク・プレス、1987年；Sequence Analysis Primer，Grib
skov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレ
ス、ニューヨーク、1991年；ならびにCarillo,H.および
Lipman,D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073（198
8））。配列間の同一性または類似性を測定するために
通常用いられる方法はCarillo,H.およびLipman,D.，SIA
M J.Applied Math.，48:1073（1988）等に開示されてい
るが、これらに限定するものではない。同一性を決定す
るための好ましい方法は、試験する配列間で最も良く合
致するように設計される。同一性および類似性を決定す
る方法は、公に入手できるコンピュータープログラムに
集成されている。二つの配列間の同一性および類似性を
測定する好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣ
Ｇプログラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic Aci
ds Research 12(1):387（1984）、BLASTP、BLASTN、お
よびFASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215:403-41
0（1990）)）を包含するが、これらに限定するものでは
ない。BLAST XプログラムはNCBIおよびその他の供給源
より公に入手可能である（BLAST Manual、Altschul,S.
ら、NCBI NLMNIHベゼスダ、メリーランド州２０８９
４；Altschul,S.ら、J.Molec.Biol.215:403-410（199
0））。

【００１３】「単離」とは、「人間の手により」天然の
状態から変化させられた、すなわち、それが天然に存在
する場合、元来の環境から変化または除去されたこと、
あるいはその両方が行われたことを意味する。例えばポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然の状態で生
存動物に存在する場合は、「単離」されていないが、同
一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然に共
存する物質から分離されている場合は、本明細書に用い
る用語「単離」がなされている。

【００１４】「ポリヌクレオチド」とは、修飾されてい
ないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡも
しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチ
ドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。
「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、
一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖
および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および
二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合
物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより普通には二本鎖も
しくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物
でよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を意
味するが、これに限定するものではない。さらに、本明
細書で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮ
ＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味
する。そのような領域における鎖は同一の分子または異
なる分子由来のものでよい。この領域は一つまたはそれ
以上の分子の全体を含み得るが、より典型的には幾つか
の分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一
つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書で
用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、一つまたはそ
れ以上の修飾した塩基を含有する、上述のＤＮＡまたは
ＲＮＡ等を含む。このように、安定性またはその他の理
由で修飾した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明
細書の用語である「ポリヌクレオチド」である。さら
に、イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩
基等の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは（二つの例
だけをを示す）、本明細書で用いる用語ポリヌクレオチ
ドである。当業者に既知の多くの有用な目的を提供する
ＤＮＡおよびＲＮＡに非常に多くの修飾がなされている
ことは、明らかであろう。本明細書で用いる「ポリヌク
レオチド」なる用語は、ポリヌクレオチドのこのような
化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならび
にウイルスおよび、例えば単純型細胞および複雑型細胞
等の細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を
包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌ
クレオチドと称する短いポリヌクレオチドを包含する。

【００１５】「ポリペプチド」は、ペプチド結合または
修飾したペプチド結合により互いに結合している２個ま
たはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタ
ンパク質を意味する。「ポリペプチド」は、通常、ペプ
チド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短
鎖、および一般的にタンパク質と称する長鎖の両方を意
味する。ポリペプチドは２０種の遺伝子によりコードさ
れたアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。「ポリ
ペプチド」には、プロセッシングおよびその他の翻訳後
修飾のような天然のプロセスにより修飾されたものが含
まれるが、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾
される。このような修飾は基礎的な参考書およびさらに
詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載され
ており、これらは当業者に周知である。同一の型の修飾
が該ポリペプチドのいくつかの部位で、同一または異な
る程度で存在し得るということが理解されよう。また、
該ポリペプチドは多くの型の修飾をも含み得る。修飾
は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカ
ルボキシル末端等のポリペプチドの任意の部位で起こり
うる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボ
シル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共
有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有
結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジル
イノシトールの共有結合、クロスリンキング、環化、ジ
スルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合クロスリン
キング形成、システイン形成、ピログルタミン酸形成、
ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、
ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミ
リストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシン
グ、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、
脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボ
キシル化、水酸化およびＡＤＰリボシル化、セレノイル
化、硫酸化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮ
Ａにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸の添加、な
らびにユビキチネーションなどがある。例えばProteins
-Structure and Molecular Properties、第２版、T.E.C
reighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク(19
93)およびPosttranslational CovalentModification of
Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレス、ニュ
ーヨーク（1983）のWold,F.,Posttranslational Protei
n Modifications :Perspectiveand Prospects、1〜12
頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-646（1990）お
よびRattanら、Protein Synthesis：Posttranslational
Modifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-
62（1992）を参照されたい。ポリペプチドは分岐または
環状でよく、分岐していてもいなくてもよい。環状、分
岐および分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後の天然の
プロセッシングの結果であり、同様に全く合成的な方法
で合成できる。

【００１６】本明細書で用いる「変種」なる用語は、対
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、参照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、
以下に論じるように、参照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合およ
び切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別の参
照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に
は、差異は参照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体
的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるよう
なものに限られる。変種および対照ポリペプチドは、１
またはそれ以上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせ
で起こることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換
または挿入したアミノ酸残基は、遺伝的コードによりコ
ードされたものであってもそうでなくてもよい。ポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドの変種は例えば対立遺伝
子変種のような自然発生的なものでもよく、あるいは自
然に発生することが知られていない変種でよい。ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの自然に発生しない変種
は、突然変異技術、直接的合成、および当業者に既知の
その他の組換え技術により製造できる。

【００１７】（発明を実施するための最良の形態）本発
明は以下により詳細に記載する、新規ｔＲＮＡシンセタ
ーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。特
に、本発明は、アミノ酸配列の相同性という点でプロリ
ルｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドに関連している、
スタフィロコッカス・アウレウスの新規ｔＲＮＡシンセ
ターゼ遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに
関する。本発明は特に図１および図２に各々示すヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列を有するｔＲＮＡシンセター
ゼ、ならびにＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１のＤＮＡの
ｔＲＮＡシンセターゼヌクレオチド配列およびそれらに
コードされるアミノ酸配列に関する。

【００１８】とりわけ研究室的条件および宿主感染条件
下での生存性に適用された場合に、細菌における一時的
な遺伝子発現を評価するのに有用な技法がある。それ自
体生存に必須であるかまたは感染の確立および／もしく
は維持に必須である遺伝子を同定するために、多くの方
法を用いることができる。これらの方法の一つにより配
列の発現を同定することは、その機能についてのさらな
る情報を提供し、スクリーニングの目的物質としてさら
に開発するためのかかる配列の選別を助ける。簡単に説
明すると、これらの研究は例えば：

【００１９】１）シグニチャータグ化突然変異法（Sign
ature Tagged Mutagenesis：STM） この技法はHenselら、Science269:400-403（1995）に記
載されており、参照により本明細書に記載されているも
のとみなす。シグニチャータグ化突然変異誘発は、該感
染モデルにおける感染の確立／維持に必要な遺伝子を同
定するものである。この技法は、種々の方法（例えばト
ランスポゾン）により、標的生物をランダムに突然変異
を誘発し、ユニークなＤＮＡ配列タグを突然変異部位に
非常に近接して挿入することに基づく。細菌性突然変異
体および感染宿主から回収した細菌の混合集団からのタ
グは、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーショ
ン分析により検出される。毒性を減じた突然変異体は、
感染宿主から回収した細菌のプールのタグの欠如により
表される。スタフィロコッカス・アウレウスにおいて
は、トランスポゾンシステムはよく発達していないの
で、タグ化突然変異体を作るためのより有効な方法に
は、Morrisonら、J.Bacteriol.159:870（1984）（参照
によりその内容を本明細書に記載されているものともな
す）に記載される挿入-複製突然変異法を用いる。

【００２０】２）インビボ発現法（In Vivo Expression
Technology：IVET） この技術はCamilliら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA．91:2
634-2638（1994）およびMahanら、Infectious Agents a
nd Diseases 2:263-268（1994）に記載されており、各
々の内容を参照により本明細書に記載されているものと
みなす。IVETは、実験培養と比較した場合、感染中にア
ップレギュレーションする遺伝子を同定し、感染におけ
る重要な役割を有する。この技法により同定される配列
は感染の確立/維持に重要な役割を有する。

【００２１】この技法では、標的生物のランダムな染色
体フラグメントは、プラスミドベクターのプロモーター
不含リポーター遺伝子の上流でクローン化される。プー
ルを宿主に導入し、感染後の種々の時間に細菌を回収
し、リポーター遺伝子発現の存在を評価する。発現した
リポーター遺伝子の上流に担持された染色体フラグメン
トは、感染中に正常なアップレギュレーションをうける
プロモーターまたは遺伝子部分を担持すべきである。リ
ポーター遺伝子の上流を配列決定すると、アップレギュ
レーションされた遺伝子を同定できる。

【００２２】３）特徴ディスプレイ この技法はChuangら、J.Bacteriol.175:2026-2036（199
3）に記載されており、内容を参照により本明細書に記
載されているものとみなす。この方法はランダムプライ
ムＲＴＰＣＲを用いてｍＲＮＡの存在を同定することに
より、生体に発現する遺伝子を同定する。感染前および
感染後のプロフィールを比較することにより、感染中に
アップレギュレーションおよびダウンレギュレーション
される遺伝子を同定でき、ＲＴＰＣＲ産物が配列決定さ
れ、ライブラリー配列に適合させられる。

【００２３】４）トランスポゾン突然変異誘発による条
件致死変異体の発生 この技法はde Lorenzo，V.ら、Gene123:17-24（199
3）；Neuwald,A.F.ら、Gene125:69-73（1993）およびTa
kiff,H.E.ら、J.Bacteriol.174:1544-1553（1992）に記
載されており(参照により本明細書に記載されているも
のとみなす)、発現が細胞の生存性に必須である遺伝子
を同定する。

【００２４】この技法では、一方向または両方向でトラ
ンスポゾンから外側へ転写する、調節可能なプロモータ
ーを担持するトランスポゾンを生じる。これらのトラン
スポゾンを標的生物にランダムに挿入し、続いてプロモ
ーター活性のインデューサーの存在下で挿入突然変異体
を単離すると、発現が細胞の生存に必須である遺伝子の
コーディング領域とプロモーターとを分離するインサー
トが回収されることが確認される。このインサートは生
存できないので、引き続いてインデューサー不含のレプ
リカ平板法でかかるインサートを同定する。トランスポ
ゾンに隣接する領域の配列決定により挿入部位を同定
し、分断された遺伝子を同定する。インデューサー不存
在下での成長中の細胞の過程/形態の変化を正確にモニ
ターし、遺伝子の可能な機能に関する情報を得る。この
ようなモニタリングには、フローサイトメトリー（細胞
分割、溶解、酸化還元能、ＤＮＡ複製）、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、タンパク質、脂質、ペプチドグリカンへの放射性学
的標識前駆体の取り込み、既知の細胞性ストレスに反応
するリポーター酵素遺伝子融合物のモニター等がある。

【００２５】５）化学的突然変異法による条件致死突然
変異の発生 この技法はBeckwith,J.、Methods in Enzymology204:3-
18（1991）に記載されており、参照により本明細書に記
載されているものとみなす。この技法では標的生物のラ
ンダム化学的突然変異を誘発し、生理学的温度（許容温
度）とは異なる温度で増殖させ、続いてレプリカ平板法
を行い、異なる温度（例えばｔｓ同定のためには４２
℃、ｃｓ同定のためには２５℃）で成長させ、その時成
長できなかった単離物（条件突然変異体）を同定する。
上述のように、非許容温度での増殖における変化を正確
にモニターし、突然変異遺伝子の機能に関する情報を得
る。標的生物からのライブラリーにより条件致死突然変
異を相補し、および相補遺伝子を配列決定することによ
り、ライブラリー配列と適合させることができる。

【００２６】これらの技法の各々は、特定の適用に応じ
て有利であったり、不利であったりする。当業者は意図
する特定の使用目的に最も関連する研究法を選択する。
例えば、いくつかの遺伝子は感染に必須であると認識さ
れているが、実際には感染の開始にのみ必要であり、そ
のためそれらの産物は、確立された慢性の感染の治療の
ために開発された抗細菌物質にとってはそれほど魅力的
な標的ではない。

【００２７】６）ＲＴ−ＰＣＲ 細菌性メッセンジャーＲＮＡ、好ましくはスタフィロコ
ッカス・アウレウスの細菌性メッセンジャーＲＮＡを、
細菌感染した組織、例えば４８時間ネズミ・肺感染の組
織から単離し、ランダムヘキサヌクレオチドでプライム
したＲＮＡサンプルの逆転写により、続いて遺伝子特異
的プライマー対でのＰＣＲにより、各ｍＲＮＡ種の量を
評価する。得られたＰＣＲ産物の定量化により特定のｍ
ＲＮＡ種の存在および量を決定し、感染した組織に転写
された細菌遺伝子に関する情報を得る。遺伝子転写の分
析は、感染の異なる時間で実施でき、細菌による発病に
おける遺伝子制御に関する詳細な知識を得ることがで
き、遺伝子産物が新規抗菌物質をスクリーニングすべき
目的物質に相当することが明快に理解できるようにな
る。用いたＰＣＲプライマーの遺伝子特異的特性のため
に、細菌性ｍＲＮＡ調製物は遊離の哺乳動物ＲＮＡであ
る必要はないことが理解されるべきである。これにより
研究者は、感染組織から簡単で迅速にＲＮＡを調製し
て、細菌中で非常に短時間しか生育できない（半減期２
分程度）細菌性ｍＲＮＡ種を得ることができる。最適に
は、感染ネズミ肺をＴＲＩゾール（ギブコ−ＢＲＬ）存
在下で、非常に短時間機械的に破壊し、続いてＴＲＩゾ
ール試薬の製造者の指示に従ってプロセッシングし、Ｄ
ＮＡａｓｅ処理して混入しているＤＮＡを除去すること
によって、細菌性ｍＲＮＡを調製する。好ましくは、適
当に標識した配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを
用いるノーザンブロットでプロービングすることにより
検出されるような細菌性１６ＳリボソームＲＮＡ、好ま
しくはスタフィロコッカス・アウレウスの１６Ｓリボソ
ームＲＮＡの最大量を得る条件を見出すことにより、そ
のプロセスを最適化する。典型的には、所望により８か
ら２５サイクルで終了するＰＣＲ反応における各ＰＣＲ
プライマー対には５'色素標識プライマーを用いる。Ｐ
ＣＲ産物は、６％ポリアクリルアミドゲルで分離し、Ge
neScanner（ＡＢＩ製造）を用いて検出および定量す
る。本発明の配列に適用する場合、これらの技法を用い
ると、感染中に発現する細菌性タンパク質、抗細菌治療
に利用できる阻害物質の同定が可能になる。

【００２８】寄託物 スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９株を含有
する寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・イン
ダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッ
ド（ＮＣＩＭＢ）、スコットランド、アバーディーンＡ
Ｂ２ １ＲＹ、セント・マッカー・ドライブ２３番に、
１９９５年９月１１日寄託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４０
７７１が付与された。寄託したスタフィロコッカス・ア
ウレウス株は本明細書では「寄託株」または「寄託株の
ＤＮＡ」と称する。寄託物質はｔＲＮＡシンセターゼＤ
ＮＡの全長を含有し、寄託に関して「ＮＣＩＭＢ４０７
７１」と称する。

【００２９】本明細書の配列に関する任意の記載に矛盾
する事象は、寄託物質に含まれるポリヌクレオチド配
列、およびそれらにコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列に従う。寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国
際承認に関するブダペスト条約の条件下でなされてい
る。特許が発行されると何らの制限または条件もなく、
最終的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のために
のみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条のもとに要求さ
れるような、寄託が実施可能要件であることを承認する
ものではない。寄託物を製造、使用または販売するため
にはライセンスが必要であるが、そのようなライセンス
はここでは賦与されていない。

【００３０】ポリペプチド 本発明ポリペプチドは、図２[配列番号：２]のポリペプ
チド（詳細には成熟ポリペプチド）、とりわけｔＲＮＡ
シンセターゼの生物学的活性を有するポリペプチドおよ
びフラグメント、ならびに図２[配列番号：２]のポリペ
プチドまたは相当する部分に少なくとも７０％の同一性
を有するポリペプチド、好ましくは図２[配列番号：２]
のポリペプチドに少なくとも８０％の同一性を有するポ
リペプチド、およびさらに好ましくは図２[配列番号：
２]のポリペプチドに少なくとも９０％の類似性（さら
に好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有するポリ
ペプチド、なおさらに好ましくは図２[配列番号：２]の
ポリペプチドに少なくとも９５％の類似性（なおさらに
好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペ
プチドを包含し、また通常少なくとも３０個のアミノ
酸、さらに好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含
むようなポリペプチド部分を有する、かかるポリペプチ
ドの部分も包含する。

【００３１】本発明ポリペプチドのフラグメントである
変種は、ペプチド合成により対応するポリペプチド全長
を製造するのに用いることができる；従って、これらの
変種をポリペプチドの全長を製造するための中間体とし
て用いることができる。本発明ポリヌクレオチドのフラ
グメントである変種は本発明ポリヌクレオチド全長を合
成するために用いることができる。フラグメントは、前
述のポリペプチドのアミノ酸配列の全てではなく一部に
対して全く同一であるアミノ酸配列を有する変種ポリペ
プチドである。ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドで
は、フラグメントは「フリースタンディング（freestan
ding）」であるか、または一部もしくは領域を形成する
より大きなポリペプチド内に含まれていてもよく、最も
好ましくは単一の連続した領域として、単一のより大き
なポリペプチドに含まれる。

【００３２】好ましいフラグメントは、例えば、アミノ
末端を含む連続した一連の残基の欠失、またはカルボキ
シル末端を含む連続した一連の残基の欠失、またはアミ
ノ末端を含む残基とカルボキシル末端を含む残基、２個
の連続した一連の残基の欠失を除く、図２［配列番号：
２］のアミノ酸配列の一部を有する切断ポリペプチドま
たはその変種を包含する。宿主細胞、とりわけスタフィ
ロコッカス・アウレウスにおける本発明ポリペプチドの
切断形態もまた好ましい。また、構造的または機能的属
性により特徴づけられたフラグメント、例えばアルファ
ーヘリックスおよびアルファーヘリックス形成領域、ベ
ータシートおよびベータシート形成領域、ターンおよび
ターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性
領域、疎水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両
親媒性領域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、
および高抗原性指標領域を含むフラグメントも好まし
い。

【００３３】ｔＲＮＡシンセターゼの活性を媒介する、
生物学的に活性なフラグメントもまた好ましく、類似の
活性もしくは改善された活性、または望ましくない活性
を減じたフラグメントを包含する。動物、とりわけヒト
において抗原性または免疫原性フラグメントも包含す
る。本発明の別の態様は、図２[配列番号：２]の推定ア
ミノ酸配列を有するｔＲＮＡシンセターゼポリペプチド
をコードする単離ポリヌクレオチド、ならびにそれら
に、およびそれらの変種に密接に関連したポリヌクレオ
チドに関する。

【００３４】本明細書に提供する情報を用いて、例えば
図１[配列番号：１]に示すポリヌクレオチド配列のよう
な、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードする本
発明ポリヌクレオチドを、例えば、出発物質としてスタ
フィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９細胞から染色
体ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列決定す
るために用いるような標準的なクローニングおよびスク
リーニングを用いて得ることができ、次いでクローン全
長を得ることができる。例えば、図１[配列番号：１]に
示す配列のごとき本発明ポリヌクレオチド配列を得るた
めには、典型的には、イー・コリ（E.coli）またはいく
つかの異なる適当な宿主におけるスタフィロコッカス・
アウレウスＷＣＵＨ２９細胞由来の染色体ＤＮＡのクロ
ーンのライブラリーを、部分的配列由来の、好ましくは
１７塩基またはそれ以上の長さの放射性標識オリゴヌク
レオチドにてプローブする。プローブのＤＮＡに同一で
あるＤＮＡを担持するクローンは厳密な条件を用いて区
別できる。元の配列から設計した配列決定プライマーを
用いてこのように同定した個々のクローンを配列決定す
ることにより、両方向で配列が伸長できるようになり、
全遺伝子配列を決定することができる。便利には、かか
る配列決定はプラスミドクローンから調製した変性二本
鎖ＤＮＡを用いて実施する。適切な技法については、Man
iatis,T.、Fritsch,E.F.およびSambrookら、Molecular
Cloning，A Laboratory Manual、第２版；コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド
・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記載
されている（Screening By Hybridization 1.90 and Se
quencing Denatured Double-Stranded DNA Templates1
3.70参照）。本発明の実例として、図１[配列番号：１]
に示すポリヌクレオチドは、スタフィロコッカス・アウ
レウスＷＣＵＨ２９に由来するＤＮＡライブラリーで発
見された。

【００３５】このように得られたＤＮＡ配列を図１[配
列番号：１]に示す。これは当該分野で周知のアミノ酸
残基分子量を用いて算出できる推定分子量を有する、図
２[配列番号：２]に示すものとほぼ同数のアミノ酸残基
を有するタンパク質をコードするオープンリーディング
フレームを含有する。本発明のｔＲＮＡシンセターゼ
は、寄託株のｔＲＮＡシンセターゼをコードするＤＮＡ
の配列決定の結果により示されるように、ｔＲＮＡシン
セターゼファミリーの他のタンパク質に構造的に関連し
ている。該タンパク質は、既知タンパク質の中で、プロ
リルｔＲＮＡシンセターゼタンパク質に最も相同的であ
る。図２[配列番号：２]のプロリルｔＲＮＡシンセター
ゼは、エスチェレチア・コリ（Escherechia coli）由来
のプロリルｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドのアミノ
酸配列に対して、全長にわたり約４５％の同一性、およ
び全長にわたり約６６％の類似性を有する。

【００３６】本発明配列はまた、図１[配列番号：１]の
コーディング配列に全長にわたり同一であってもよい。
本発明はまた、成熟ポリペプチドまたはそれらのフラグ
メントのコーディング配列自体、ならびに他のコーディ
ング配列（例えばリーダーまたは分泌配列、プレ、プ
ロ、プレプロタンパク質配列をコードする）を伴ったリ
ーディングフレーム中の該成熟ポリペプチドまたはフラ
グメントのコーディング配列をも提供する。ポリヌクレ
オチドは、例えば、転写された非翻訳配列、停止シグナ
ル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イント
ロン、ポリアデニル化シグナル、および付加アミノ酸を
コードする付加コーディング配列のごとき非コーディン
グ５'および３'配列等の非コーディング配列をも包含し
うるが、これらに限定するのではない。例えば、融合ポ
リペプチドの精製を容易にするマーカー配列をコードし
てもよい。本発明のある好ましい態様において、マーカ
ー配列は、ｐＱＥベクター（キアゲン・インコーポレー
ティッド）に提供されるようなヘキサ−ヒスチジンペプ
チド（Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-824
（1989）に記載される）またはＨＡタグ（Wilsonら、Ce
ll，37:767（1984））である。また本発明ポリヌクレオ
チドは、構造遺伝子および遺伝子発現を調節するその天
然において関連した配列を含んでなるポリヌクレオチド
を包含するが、これらに限定するものではない。

【００３７】前述によれば、本明細書で用いる「ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明ポリペプチド、とりわけ図２[配列番号：２]に示す
アミノ酸配列を有する細菌性の、さらに詳細にはスタフ
ィロコッカス・アウレウスのｔＲＮＡシンセターゼをコ
ーディングする配列を含有するポリヌクレオチドを包含
する。この用語はまた、付加領域と一緒になった、ポリ
ペプチドをコードする単一の連続領域または不連続領域
（例えば組み込まれたファージもしくは挿入配列または
修正により分断される）、さらにはコーディングおよび
／または非コーディング配列をも含み得るポリヌクレオ
チドをも包含する。

【００３８】本発明はさらに、図２[配列番号：２]の推
定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変種をコードす
る、本明細書ですでに述べたポリヌクレオチドの変種に
関する。本発明の特に好ましい態様は、図２[配列番
号：２]に示すｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドのア
ミノ酸配列にいくつか、少しの、５〜１０、１〜５、１
〜３、２、１または０個のアミノ酸残基の置換、欠失ま
たは付加を任意の組み合わせで施したアミノ酸配列を有
するｔＲＮＡシンセターゼ変種をコードするポリヌクレ
オチドである。中でもとりわけ好ましいものは、ｔＲＮ
Ａシンセターゼの特性および活性を変化させないサイレ
ント置換、付加および欠失である。

【００３９】本発明のさらに好ましい態様は、図２[配
列番号：２]に示すアミノ酸配列を有するｔＲＮＡシン
セターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
およびこのようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌク
レオチドに対し、全長で少なくとも７０％同一であるポ
リヌクレオチドである。また別に、最も好ましいポリヌ
クレオチドは、寄託株スタフィロコッカス・アウレウス
のＤＮＡのｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコード
しているポリヌクレオチドおよびそれらに相補的なポリ
ヌクレオチドに対し、全長にわたり少なくとも８０％同
一である領域を含むポリヌクレオチドである。この点に
関して、全長にわたり少なくとも９０％同一であるポリ
ヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも少なくとも９
５％の同一性を有するものが特に好ましい。さらに少な
くとも９５％の同一性を有するものの中でも少なくとも
９７％であるのがより好ましく、中でも少なくとも９８
％および少なくとも９９％であるのが特に好ましく、さ
らに少なくとも９９％であるのがより好ましい。

【００４０】この点に関するとりわけ好ましい態様は、
さらに、図１[配列番号：１]のＤＮＡによりコードされ
る成熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能また
は活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドである。さらに本発明は、本明細書ですでに述べ
た配列にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド
に関する。この点に関して、本発明は、厳密な条件にて
本明細書ですでに述べたポリヌクレオチドにハイブリダ
イゼーションするポリヌクレオチドに特に関連してい
る。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳密なハ
イブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の同一
性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％で
ある場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意味す
る。厳密なハイブリダイゼーション条件の例としては、
５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン
酸ナトリウム（ｐＨ7.6）、５ｘデンハーツ溶液、１０
％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性され
剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃で
一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０.１ｘ
ＳＳＣ中フィルターを洗浄するものである。ハイブリダ
イゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Sambrook
ら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第２
版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク
（1989）、とりわけその第２章に実例が示されており、
その全開示を参照により本明細書に記載されているもの
とみなす。

【００４１】本発明はまた、厳密なハイブリダイゼーシ
ョン条件で配列番号：１に示すポリヌクレオチド配列の
完全遺伝子を含有する適当なライブラリーを、配列番
号：１に示す該ポリヌクレオチド配列またはそのフラグ
メントの配列を有するプローブでスクリーニングし、該
ＤＮＡ配列を単離することにより得られるポリヌクレオ
チド配列を必須としてなるポリヌクレオチドをも提供す
る。このようなポリヌクレオチドを得るために有用なフ
ラグメントは、例えば本明細書に別に記載するプローブ
およびプライマーを包含する。

【００４２】本発明ポリヌクレオチドのアッセイに関し
てここでさらに論じるが、例えば上述の本発明ポリヌク
レオチドをＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハ
イブリダイゼーションプローブとして用いて、ｔＲＮＡ
シンセターゼをコードするｃＤＮＡ全長およびゲノムク
ローンを単離し、ｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子に高度な
配列類似性を有するその他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲ
ノムクローンを単離することができる。このようなプロ
ーブは通常少なくとも１５塩基を含む。好ましくはこの
ようなプローブは少なくとも３０塩基を有し、少なくと
も５０塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプロ
ーブは少なくとも３０塩基を有し、５０塩基以下であ
る。

【００４３】例えばｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子のコー
ディング領域は、既知ＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレ
オチドプローブを合成し、スクリーニングすることによ
り単離できる。次いで、本発明遺伝子の配列に相補的な
配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡ、
ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーのスクリー
ニングに用い、プローブがハイブリダイゼーションする
ライブラリーのメンバーを決定する。本発明ポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドは、疾患、とりわけヒトの疾
患の処置法および診断法の発見のために研究試薬および
材料として使用でき、とりわけポリヌクレオチドアッセ
イに関連して本明細書でさらに論じる。

【００４４】配列番号：１および２の配列に由来するオ
リゴヌクレオチドである本発明ポリヌクレオチドは、本
明細書に記載するプロセスに使用できるものであるが、
ＰＣＲに用いるのが好ましく、本明細書で全てまたは一
部が同定したポリヌクレオチドが感染した組織に転写さ
れるかどうかを決定する。このような配列が、病原体が
達成した感染の段階および感染の型の診断にも有用であ
ることが理解される。ポリヌクレオチドは、付加アミノ
酸もしくはカルボキシル末端アミノ酸または成熟ポリペ
プチドに内在するアミノ酸を加えた成熟タンパク質であ
るポリペプチドをコードできる（例えば成熟形態が一つ
以上のポリペプチド鎖を有する場合）。このような配列
は、前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシン
グに役割を担い、タンパク質輸送を可能にし、タンパク
質の半減期を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッ
セイもしくは製造のためのタンパク質の操作を容易にす
ることができる。一般的にインビボの場合、付加アミノ
酸は、細胞の酵素によりプロセッシングされ、成熟タン
パク質から取り除かれる。

【００４５】１またはそれ以上のプロ配列と融合したポ
リペプチドの成熟形態を有する前駆タンパク質は、ポリ
ペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去
されると、このような不活性前駆体が通常活性化され
る。プロ配列のいくつかまたは全てを活性化の前に除去
できる。通常、このような前駆体はプロタンパク質と称
される。要するに、本発明ポリヌクレオチドは成熟タン
パク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク質（プレタ
ンパク質と称することができる）、プレタンパク質のリ
ーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有す
る成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列および
１またはそれ以上のプロ配列を有するプロタンパク質の
前駆体であるプレプロタンパク質をコードでき、プロ配
列は通常ポリペプチドの活性および成熟形態を生じるプ
ロセッシング段階で除去される。

【００４６】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明ポリヌク
レオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝子操作
する宿主細胞および組換え技法による本発明ポリペプチ
ドの製造にも関する。本発明のＤＮＡ構築物に由来する
ＲＮＡを用い、無細胞翻訳系を用いてかかるタンパク質
を製造できる。

【００４７】組換え体を製造するために、宿主細胞を、
遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、または
本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。ポ
リヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davis
ら、Basic Methods in Molecular Biology（1986）；Sa
mbrookら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、
第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク（1989）のような多くの標準的な研究室マニュア
ルに記載される方法により行うことができ、例えばリン
酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキス
トラン媒介トランスフェクション、トランスベクショ
ン、マイクロインジェクション、カチオン性脂質により
媒介されるトランスフェクション、エレクトロポレーシ
ョン、トランスダクション、スクレープ負荷、バリステ
ィック導入および感染等がある。

【００４８】適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例えば
ストレプトコッカス属（streptococci）、スタフィロコ
ッカス属（staphylococci）、イー・コリ（E.coli）、
ストレプトミセスおよびバチルス・ズブチリス（Bacill
us subtiis）細胞；真菌細胞例えば酵母細胞およびアス
ペルギルス属（Aspergillus）細胞；昆虫細胞例えばド
ロソフィラＳ２（Drosophila S2）およびスポドプテラ
Ｓｆ９（Spodoptera Sf9）細胞；動物細胞例えばＣＨ
Ｏ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２
９３およびボウズ（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細
胞を包含する。

【００４９】本発明ポリペプチドを製造するために非常
に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせた物に由来す
るベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファー
ジ遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミド
およびファージミド等がある。発現系の構築物は、発現
を制御および引き起こす調節領域を含有していてもよ
い。通常宿主中にポリヌクレオチドを保持、伸長または
発現するのに適した、および／またはポリペプチドを発
現するのに適した任意の系またはベクターを、この点に
関する発現に使用できる。周知のおよび通常的な種々の
任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入で
き、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A Laborat
ory Manual（上述）に記載されている。

【００５０】翻訳タンパク質を、小胞体内腔、細胞周辺
腔または細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグ
ナルを発現するポリペプチドに組み込むことができる。
これらのシグナルはポリペプチドに対して内在性であっ
てもよく、あるいは異種性のシグナルでもよい。本発明
のポリペプチドは周知の方法により、組換え細胞培養物
から回収および精製でき、その方法は、例えば硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまた
は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース
クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシル
アパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィーを包含する。高速液体クロマトグラフィー
（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いるのが最も好ましい。ポ
リペプチドが単離および／または精製中に変性した場
合、再び活性な立体配座にするために、タンパク質再生
のための周知の技法を用いることができる。

【００５１】診断アッセイ 本発明はまた診断試薬として使用するための本発明ｔＲ
ＮＡシンセターゼポリヌクレオチドの使用にも関する。
真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるｔＲＮＡ
シンセターゼの検出は、疾患の診断のための診断方法を
提供する。真核生物（本明細書において「個体」とも称
する）とりわけ哺乳動物、特にヒトがｔＲＮＡシンセタ
ーゼ遺伝子を含む生物に感染すると、種々の方法により
ＤＮＡレベルで検出できる。

【００５２】診断用核酸は、感染した個体の細胞および
組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚より得る
ことができる。ゲノムＤＮＡは直接的に検出するのに使
用できるか、または分析の前にＰＣＲもしくはその他の
増幅法を用いることにより酵素的に増幅できる。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡも同じ方法に使用することができる。増
幅を用いると、真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトに
存在する原核生物株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分
析により特徴づけすることができる。対照配列の遺伝子
型と比較した増幅産物の大きさの変化により、挿入およ
び欠失を検出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識
ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチド配列にハイブリ
ダイゼーションすることにより同定できる。完全に対合
した配列はＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差
により、誤対合二重らせんから区別できる。ＤＮＡ配列
の差はまた、変性剤を伴うまたは伴わないゲル中のＤＮ
Ａフラグメントの電気泳動の移動度の変化を検出するこ
とにより、または直接的なＤＮＡの配列決定により検出
できる。例えばMyersら、Science，230:1242（1985）参
照。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ
保護アッセイ例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化
学的切断法によっても明らかにすることができる。例え
ばCottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:4397-4401
（1985）参照。

【００５３】本発明遺伝子の突然変異または多型性を担
持する細胞はまた、種々の技術により、ＤＮＡレベル
で、例えばセロタイピングすることにより検出できる。
例えば、ＲＴＰＣＲは突然変異を検出するために用いる
ことができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばGene
Scan等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。Ｒ
ＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ目的で、ＰＣＲまたはＲ
ＴＰＣＲに用いることができる。例を挙げると、ｔＲＮ
Ａシンセターゼをコードする核酸に相補的なＰＣＲプラ
イマーを用いて突然変異を同定および分析することがで
きる。これらのプライマーを用いて、個体に由来するサ
ンプルから単離したｔＲＮＡシンセターゼＤＮＡを増幅
することができる。本発明はまた５'および／または３'
末端から１、２、３または４ヌクレオチド除去したプラ
イマーをも提供する。該プライマーを用いて、感染した
個体から単離した遺伝子を増幅することができ、次い
で、該遺伝子をＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に
供することができる。このように、ＤＮＡ配列における
突然変異を検出し、これを用いて感染の診断および感染
性物質のセロタイピングまたは分類をすることができ
る。

【００５４】本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感
染、さらに好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス
による感染、および最も好ましくは上気道感染（例えば
中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下
気道感染(例えば蓄膿症、肺膿瘍)、心臓感染（例えば感
染性心内膜炎）、消化器感染（例えば分泌性下痢、脾臓
膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば大脳膿瘍）、
眼感染（例えば眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中
隔（preseptal）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および
尿管感染（例えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、ト
キシックショック症候群）、皮膚感染（例えば膿痂疹、
毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、
骨および関節感染（例えば敗血症性関節炎、骨髄炎）の
ごとき疾患の診断方法を提供し、図１[配列番号：１]の
配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの上昇を、
個体由来のサンプルから決定することを特徴とする。ｔ
ＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドの発現の増加また
は低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野で
周知の方法の任意の方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴＰ
ＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよび
その他のハイブリダイゼーション法を用いて測定でき
る。

【００５５】さらに、正常対照組織サンプルと比較して
ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質の過剰発現を検出する
ための本発明による診断アッセイは、例えば感染の存在
を検出するために用いることができる。宿主由来のサン
プル中のｔＲＮＡシンセターゼタンパク質のレベルを決
定するために用いることができるアッセイ技法は、当業
者に周知である。このようなアッセイ法は、ラジオイム
ノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分
析およびＥＬＩＳＡアッセイを包含する。

【００５６】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそ
れらを発現する細胞は、このようなポリペプチドに免疫
特異的な抗体を産生する免疫原として用いることができ
る。本明細書で用いる「抗体」には、モノクローナルお
よびポリクローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体
およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ免疫グロブリン発現
ライブラリーの生成物を包含するＦａｂフラグメント等
がある。

【００５７】本発明のポリペプチドに対して生じる抗体
は、ポリペプチドまたはエピトープが付いたフラグメン
ト、アナログまたは細胞を、好ましくはヒトはでない動
物に、通常の実験法を用いて投与することにより得るこ
とができる。連続的細胞系培養により産生される抗体を
提供する当業者周知の技術を用いて、モノクローナル抗
体を調製することができる。実例としては、Kohler，G.
およびMilstein,C.，Nature，256:495-497（1975）；Ko
zborら、Immunology Today，4:72（1983）；Coleら、Mo
noclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Lis
s,Inc.、77-96頁（1985）に記載されるような種々の技
法がある。

【００５８】一本鎖抗体の製造のための記載された技術
（米国特許第４９４６７７８号）は、本発明のポリペプ
チドに対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。ま
た、トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例
えばその他の哺乳動物は、ヒト化抗体等の抗体を発現す
るのに用いることができる。別法としてファージディス
プレイ（phage display）技法を用いて、抗Ｆｂｐを有
することについてスクリーニングしたヒトのリンパ球の
ＰＣＲ増幅したｖ遺伝子のレパートリー由来の、または
無処理のライブラリー由来のポリペプチドに対する結合
活性を有する抗体遺伝子を選別することができる（McCa
fferty,J.ら、Nature 348:552-554（1990）；Marks,J.
ら、Biotechnology 10:779-783(1992)）。これらの抗体
の親和性はチェインシャフリング（chain shuffling）
により改善することもできる（Clackson,T.ら、Nature
352:624-628（1991））。

【００５９】二つの抗原結合ドメインが存在する場合、
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。上述の抗体を、ポリペプチドを
発現するクローンを単離または同定するために用いて、
アフィニティークロマトグラフィーにより該ポリペプチ
ドを精製することができる。

【００６０】従って、とりわけｔＲＮＡシンセターゼに
対する抗体を、感染、とりわけ細菌感染、特に上気道感
染(例えば中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状
腺炎)、下気道感染（例えば蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感
染（例えば感染性心内膜炎）、消化器感染（例えば分泌
性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば
大脳膿瘍）、眼感染（例えば眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、
眼内炎、前中隔(preseptal)および眼窩蜂巣炎、涙嚢
炎)、腎および尿管感染（例えば副睾丸炎、腎内および
腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染
（例えば膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感
染、細菌性筋炎）、骨および関節感染（例えば敗血症性
関節炎、骨髄炎）のごとき疾患の処置に用いることがで
きる。

【００６１】ポリペプチド変種は抗原的、エピトープ的
または免疫学的に等価な変種を包含し、本発明の特定の
態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明によりタンパク質またはポリペ
プチドに対して生起された場合、病原体および哺乳動物
宿主間での即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗
体により特異的に認識されるポリペプチドまたはその同
等物を包含する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な
誘導体」なる用語は、脊椎動物において抗体を生起させ
るのに適した処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳
動物宿主間での即時的な物理的相互作用を妨害するよう
に作用するペプチドまたはその等価物を包含する。

【００６２】ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に
等価な誘導体、またはそれらの融合タンパク質は、マウ
スまたは他の動物、例えばラットもしくはニワトリを免
疫するための抗原として使用できる。融合タンパク質は
ポリペプチドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱
合することにより、免疫原性キャリヤタンパク質、例え
ばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リ
ムペット・ヘモシアニン（keyhole limpet haemocyani
n：ＫＬＨ）に結合することができる。あるいはまた、
タンパク質もしくはポリペプチド、またはそれらに抗原
的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピー
を含む多重抗原ペプチドは、免疫原性を改良するための
十分な抗原性を有しているので、キャリヤを使用しなく
てすむ。

【００６３】抗体またはそれらの変種を、個体における
免疫原性を減じるために修飾するのが好ましい。例え
ば、個体がヒトである場合、抗体は最も好ましくは「ヒ
ト化」されており；ハイブリドーマ由来の抗体の相補性
決定領域がヒトモノクローナル抗体に移植されており、
例えばJones,P.ら、Nature 321:522-525（1986）または
Tempestら、Biotechnology 9:266-273（1991）に記載さ
れている。

【００６４】本発明ポリヌクレオチドを遺伝学的免疫に
おいて使用する場合、好ましくは、例えばプラスミドＤ
ＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Genet.1:3
63（1992）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419（196
3））、特異的タンパク質キャリヤとのＤＮＡ複合体の
送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リン
酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshef、P
NAS 83:9551（1986））、種々の形態のリポソーム中へ
のＤＮＡ封入(Kanedaら、Science 243:375(1989))、微
粒子衝撃（Tangら、Nature 356:152（1992）；Eisenbra
unら、DNA Cell Biol.12:791（1993））およびクローン
化レトロウイルスベクターを用いたインビボ感染（Seeg
erら、PNAS 81:5849（1984））のごとき適切な送達方法
を用いる。

【００６５】本発明のポリペプチドはまた、例えば細
胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然産
物の混合物中の、小型分子基質とリガンドとの結合を評
価するために用いることもできる。これらの基質および
リガンドは天然の基質およびリガンドでよく、または構
造上もしくは機能上の擬似物質でもよい。例えばColiga
nら、Current Protocols in Immunology 1(2):第5章（1
991）参照。

【００６６】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明はまたｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドの作用を増強（アゴニスト）または阻
害（アンタゴニスト）する化合物を同定するための化合
物のスクリーニング方法をも提供する。例えば、アゴニ
ストまたはアンタゴニストをスクリーニングするため
に、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドおよびかかるポ
リペプチドの標識基質またはリガンドを含んでなる合成
反応混合物、膜、細胞包膜もしくは細胞壁のごとき細胞
コンパートメント、またはそれらのいずれかの調製物
を、ｔＲＮＡシンセターゼアゴニストまたはアンタゴニ
ストとなりうる候補分子の存在下または不在下でインキ
ュベーションする。候補分子がｔＲＮＡシンセターゼポ
リペプチドにアゴナイズまたは拮抗する能力は、標識リ
ガンドの結合の低下またはかかる基質からの生成物の生
成低下に反映される。結合しても影響を及ぼさない分
子、すなわちｔＲＮＡシンセターゼの効果を誘起しない
分子は、最も良好なアンタゴニストとなるであろう。結
合性が良好で、基質からの生成物の生成速度を高める分
子はアゴニストである。基質からの生成物の生成速度ま
たはレベルはリポーターシステムを用いることにより増
強できる。この点に関して有用なリポーターシステム
は、生成物に転換される比色標識基質、ｔＲＮＡシンセ
ターゼ活性の変化に応答するリポーター遺伝子、および
当該分野で周知の結合アッセイを包含するが、これらに
限定するものではない。

【００６７】ｔＲＮＡシンセターゼアンタゴニストのア
ッセイの他の例は競争アッセイであり、競争阻害アッセ
イに適した条件下で、ｔＲＮＡシンセターゼおよび潜在
的なアンタゴニストをｔＲＮＡシンセターゼ結合分子、
組換えｔＲＮＡシンセターゼ結合分子、天然基質もしく
はリガンド、または基質もしくはリガンド擬似物質と混
合する。ｔＲＮＡシンセターゼを例えば放射活性または
比色化合物により標識し、結合分子に結合した、または
生成物に変換したｔＲＮＡシンセターゼ分子の数を正確
に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価でき
る。

【００６８】さらなる態様において、本発明は、プロリ
ルｔＲＮＡシンセターゼの相互作用を妨害する薬物、例
えばアンタゴニストおよびアゴニストを同定するための
薬物のスクリーニング方法を提供する。酵素により媒介
される放射性標識アミノ酸のｔＲＮＡへの組み込みを、
ｔＲＮＡおよびＡＴＰの存在下、アミノ酸−ｔＲＮＡを
放射性標識アミノ酸からのトリクロロ酢酸沈殿放射活性
として測定するアミノアシル化法により測定できる（Hu
ghes J.、Mellows G.およびSoughton S.、FEBSLetters
122:322-324（1980））。このようにプロリルｔＲＮＡ
シンセターゼ阻害物質を対照と比較して、トリクロロ酢
酸沈殿放射性活性の減少により検出できる。あるいはま
た、ＰＰｉからの放射性標識ＡＴＰの形成を測定する、
部分ＰＰｉ／ＡＴＰ交換反応を触媒する新規ｔＲＮＡシ
ンセターゼを、プロリルｔＲＮＡシンセターゼ阻害物質
を検出するために使用できる（Calender R. & Berg
P.、Biochemistry 5:1681-1690（1966））。

【００６９】潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリ
ペプチドに結合し、それによりその活性を阻害し、また
は消滅させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドお
よび抗体を包含する。潜在的アンタゴニストはまた、結
合分子の同一部位に結合する、密接に関連したタンパク
質または抗体のような小型有機分子、ペプチド、ポリペ
プチド、例えばｔＲＮＡシンセターゼ誘起活性を誘起し
ない結合分子であってもよく、そのことによりｔＲＮＡ
シンセターゼを結合から排除して、ｔＲＮＡシンセター
ゼの作用を妨げる。

【００７０】潜在的なアンタゴニストには、ポリペプチ
ドの結合部位に結合し、およびそれを占領し、それによ
り細胞性結合分子への結合を防御して、正常な生物学的
活性を防御する小型分子等がある。小型分子の例は、小
型有機分子、ペプチド、ペプチド様分子を包含するが、
これらに限定するものではない。その他の潜在的なアン
タゴニストはアンチセンス分子を包含する（これらの分
子についての記載に関してはOkano,J.，Neurochem.56:5
60（1991）；Oligodeoxy-nucleotides as Antisense In
hibitors of Gene Expression，ＣＲＣプレス、ボッカ
ラートン、フロリダ州（1988）参照）。好ましい潜在的
アンタゴニストは、ｔＲＮＡシンセターゼ関連化合物お
よびｔＲＮＡシンセターゼの変種を包含する。

【００７１】特定の態様において、本発明は、感染の続
発症に関与する、病因および哺乳動物宿主間の最初の物
理的相互作用を妨害するための本発明ポリペプチド、ポ
リヌクレオチドまたは阻害物質の使用を提供する。とり
わけ本発明の分子を、i）細菌とりわけグラム陽性細菌
の内在デバイス上の哺乳動物細胞外マトリックスタンパ
ク質、または創傷の細胞外マトリックスタンパク質への
付着の防御；ii）例えば哺乳動物チロシンキナーゼのリ
ン酸化の開始により、哺乳動物細胞侵入を媒介するｔＲ
ＮＡシンセターゼタンパク質の阻害(Rosenshineら、Inf
ect.Immun.60:2211(1992))；iii）哺乳動物細胞外マト
リックスタンパク質と組織損傷を媒介する細菌性ｔＲＮ
Ａシンセターゼタンパク質との間の細菌付着の阻害；i
v）内在デバイスの埋め込みまたはその他の外科的手技
以外により開始した感染における病因の通常の進行の防
御に使用することができる。

【００７２】本明細書で提供する各々のＤＮＡ配列は抗
細菌化合物の発見および開発に用いることができる。発
現すると、コードされたタンパク質は、抗菌薬物のスク
リーニングのための目的物質として用いることができ
る。さらに、コードされたタンパク質もしくはShine-De
lgarnoまたはその他の個々のｍＲＮＡの翻訳容易化配列
のアミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列を、目的のコ
ーディング配列の発現を調節するアンチセンス配列を構
築するために用いることができる。

【００７３】アンタゴニストおよびアゴニストは、疾
患、例えば、上気道感染（例えば中耳炎、細菌性気管
炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道感染（例えば蓄
膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば感染性心内膜炎）、
消化器感染（例えば分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿
瘍）、ＣＮＳ感染（例えば大脳膿瘍）、眼感染（例えば
眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔（presepta
l）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管感染（例
えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショ
ック症候群）、皮膚感染（例えば膿痂疹、毛嚢炎、皮膚
膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、骨および関節
感染（例えば敗血症性関節炎、骨髄炎）の阻止に用いる
ことができる。

【００７４】ワクチン 本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免
疫学的応答を誘起する方法に関し、その方法には、ｔＲ
ＮＡシンセターゼ、またはそれらのフラグメントもしく
は変種を個体に接種し、該個体を感染とりわけ細菌感
染、特にスタフィロコッカス・アウレウス感染から防御
する抗体を十分に産生させることを含む。本発明のまた
別の態様は、個体における免疫学的応答を誘起する方法
に関し、その方法は、遺伝子治療により、インビボにて
ｔＲＮＡシンセターゼまたはそれらのフラグメントもし
くは変種を発現するために、ｔＲＮＡシンセターゼまた
はそれらのフラグメントもしくは変種をコードする遺伝
子を送達し、免疫学的応答を誘起させて、該個体を疾患
から保護する抗体を産生することを含む。

【００７５】本発明のさらなる態様は免疫学的組成物に
関し、該組成物は、免疫学的応答を体内に誘起できる、
あるいは誘起している宿主に導入した場合、宿主中でｔ
ＲＮＡシンセターゼまたはそれによりコードされるタン
パク質に対する免疫学的応答を誘起するものであり、該
組成物は組換えｔＲＮＡシンセターゼ、またはそれによ
りコードされたタンパク質を含んでなり、また該ｔＲＮ
Ａシンセターゼの抗原をコードし発現するＤＮＡ、また
はそれによりコードされるタンパク質を含んでなる。

【００７６】ｔＲＮＡシンセターゼまたはそれらのフラ
グメントは、それ自身は抗体を産生しないが、第１のタ
ンパク質を安定化し、免疫原性があり防御特性を有する
融合タンパク質を形成することのできる補タンパク質
（co-protein）と融合できる。このように融合した組換
えタンパク質には、さらに抗原補タンパク質、例えばグ
ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）または
ベーターガラクトシダーゼ、タンパク質を可溶化し、そ
れらの生成および精製を容易にする比較的大型の補タン
パク質等が含まれるのがより好ましい。さらに、補タン
パク質は免疫系において一般的な刺激を提供するという
意味で、アジュバントとして作用しうる。補タンパク質
は第１のタンパク質のアミノまたはカルボキシル末端の
いずれに結合していてもよい。

【００７７】本発明は、本発明ポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドおよび免疫刺激ＤＮＡ配列を含んでなる組
成物、とりわけワクチン組成物ならびに方法を提供し、
免疫刺激ＤＮＡ配列はSato Y.ら、Science 273:352(199
6)に記載されている。また、本発明は、スタフィロコッ
カス・アウレウスに感染した動物モデルにおける、この
ような遺伝的免疫化実験で用いるＤＮＡ構築物の、細菌
細胞表面タンパク質の非可変領域をコードすることが示
されている記載されたポリヌクレオチドまたはとりわけ
それらのフラグメントを用いる方法を提供し、これらは
とりわけ、予防的または治療的免疫反応を生じることが
できるタンパク質エピトープを同定するのに有用であ
る。このアプローチは、哺乳動物、とりわけヒトにおけ
る細菌感染とりわけスタフィロコッカス・アウレウス感
染の予防薬または治療的処置の開発のために、感染に抵
抗し、または一掃するのに成功した動物の必須器官から
特に価値あるモノクローナル抗体を引き続き調製するこ
とを可能にすると考えられる。

【００７８】ポリペプチドは、例えば細菌の損傷組織へ
の付着を阻害することにより、細菌の侵入に対して防御
的な特異的抗体を産生するための宿主のワクチン化のた
めの抗原として使用することができる。組織損傷の例
は、例えば機械的、化学的もしくは熱損傷により、また
は内在デバイスの埋め込みにより、引き起こされた皮膚
または結合組織の創傷、または粘膜例えば口、乳腺、尿
道または膣の創傷を包含する。

【００７９】本発明にはまた免疫原性組換えタンパク質
を適切な担体と共に含むワクチン処方を包含する。タン
パク質は胃で分解されるので、非経口的例えば皮下、筋
肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好ましい。
非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝液、静細菌
剤および個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶質
を含有していてもよい水性または非水性滅菌注射液；お
よび懸濁化剤または増粘剤を含有していてもよい水性ま
たは非水性滅菌懸濁液を包含する。処方は単位投与また
は多回投与用容器、例えば密封したアンプルおよびバイ
アルに入れてよく、凍結乾燥状態で保存し、使用直前に
滅菌液体担体の添加のみを必要とする。ワクチン処方は
処方の免疫原性を高めるアジュバント系をも含めること
ができ、例えば水中油系または当該分野で周知のその他
の系がある。投与量はワクチンの特異的活性に依存し、
通常の実験法により容易に決定できる。

【００８０】本発明は特定のｔＲＮＡシンセターゼに関
して記載したが、これは天然に存在するタンパク質およ
び、実質的に組換えタンパク質の免疫原特性に影響しな
い付加、欠失または置換を施した類似のタンパク質のフ
ラグメントを包含することが理解されよう。

【００８１】組成物、キットおよび投与 本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。本発明のポリペプチドは未滅
菌もしくは滅菌担体と、または細胞、組織もしくは生物
に用いられる担体、例えば対象への投与に適した医薬的
担体と組み合わせて用いることができる。このような組
成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明
ポリペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦
形剤を含む。このような担体にはセイライン、緩衝化セ
イライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ールおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限
定するものではない。処方は投与法に適したものにすべ
きである。本発明はさらに、本発明の前述の組成物成分
を１またはそれ以上を充填した１またはそれ以上の容器
を含む診断用および医薬用パックおよびキットにも関す
る。

【００８２】本発明のポリペプチドおよびその他の化合
物は、単独でまたは治療用化合物等のその他の化合物と
組み合わせて用いることができる。医薬組成物は任意の
有効な、利便的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、
経肛門、経膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔
内、または皮膚内の経路で投与できる。 治療におい
て、または予防として、活性物質を注射用組成物とし
て、例えば、好ましくは等張の、滅菌水性分散物として
個体に投与できる。

【００８３】また別に、組成物は局所適用用、例えば軟
膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳液、
洗口剤、染み込ませた包帯および縫合用の糸、ならびに
エアロゾル等の形態に処方でき、適当な慣用的な添加
物、例えば軟膏およびクリーム中に、保存料、薬物の浸
透を補助する溶媒および軟化剤を含有してもよい。この
ような局所用処方はまた、適合した慣用的な担体、例え
ばクリームまたは軟膏基剤、およびローションにはエタ
ノールまたはオレイルアルコールを含有してもよい。こ
のような担体は処方の約１重量％から約９８重量％でよ
く；より通常的には処方の約８０重量％までとする。

【００８４】哺乳動物とりわけヒトに投与するために、
有効成分の１日あたりの投与量は、０.０１ｍｇ／ｋｇ
から１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇ
である。医者はいずれの場合にも、個体に最も適した実
際の投与量を決定し、年齢、体重および特に個体の応答
に応じて変化させる。上述の投与量は、平均的なケース
の模範例である。もちろん、高量および低量の範囲が適
合する個々の例もあり、これらは本発明の範囲内であ
る。内在デバイスには外科的インプラント、プロテーゼ
デバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体に導
入し、長時間その位置に存在するデバイスである。この
ようなデバイスは、例えば人工関節、心臓弁、ペースメ
ーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャン
ト、尿カテーテル、持続的外来可能腹膜透析カテーテル
を包含する。

【００８５】本発明組成物を注射により投与すると、内
在デバイスの挿入の直前に、関連する細菌に対する全身
的な効果を得ることができる。手術後、デバイスが体内
に在る時間中、処置を続けてよい。さらに、任意の外科
的手技のために手術中用カバーを広げて、細菌性創傷感
染、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスの創傷感
染を防御するために用いることができる。多くの整形外
科医は、プロテーゼ関節を有するヒトは、菌血症を生じ
得る歯科的処置の前に、抗生物質予防法を考慮されるべ
きであると考える。遅延性の重篤な感染は、時々プロテ
ーゼ関節を失うに至る深刻な合併症であり、有意性のあ
る羅病率および死亡率を伴う。従って、この場合、予防
的な抗生物質の代わりに、活性物質の用途を拡張するこ
とが可能である。

【００８６】上述の治療に加え、本発明の組成物は一般
的に創傷の治療薬として使用でき、創傷組織に曝露した
マトリックスタンパク質に細菌が付着するのを防ぎ、歯
科治療において抗生物質の予防法に代わって、またはそ
れと組み合わせて、予防的に使用できる。あるいはま
た、本発明の組成物は、挿入直前に内在デバイスを浸す
ために使用できる。有効成分は創傷または内在デバイス
を浸すために１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度で
あるのが好ましい。

【００８７】便利には、ワクチン組成物を注射可能な形
態にする。慣用的なアジュバントは免疫反応を高めるた
めに用いることができる。ワクチン化に適した単位投与
量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、このような投
与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好ましい。
提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適切な個
体への投与を妨げるような、不利な毒性効果は観察され
ない。上述の抗体もまたｔＲＮＡシンセターゼタンパク
質を含有する細菌の存在を検出するための診断試薬とし
て使用できる。

【００８８】（実施例）以下の実施例は、詳細に記載し
たこと以外は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を
用いて実施する。実施例は説明のためにのみ示すもの
で、本発明を限定するものではない。

【００８９】実施例１：ライブラリーの作製 配列番号：１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチ
ドはイー・コリにおけるスタフィロコッカス・アウレウ
スの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーより入手し
た。重複するスタフィロコッカス・アウレウスのＤＮＡ
を含有する２個またはそれ以上のクローンからの配列決
定データを、配列番号：１に示す連続したＤＮＡ配列を
構築するために使用した場合もある。ライブラリーは通
常の方法、例えば以下の方法１および２により作製でき
る。全細胞ＤＮＡは、スタフィロコッカス・アウレウス
ＷＣＵＨ２９より、標準法に準じて単離し、二つの方法
のどちらかによりサイズ分画する。

【００９０】方法１ 標準法によりサイズ分画するために、全細胞ＤＮＡをニ
ードルに通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの大
きさのＤＮＡフラグメントを、エキソヌクレアーゼおよ
びＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端
化し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、
ＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結
し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、パ
ッケージングしたライブラリーでイー・コリを感染させ
る。ライブラリーは標準法により増幅する。

【００９１】方法２ 全細胞ＤＮＡは、ライブラリーベクター（例えば、Ｒｓ
ａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）にクロ
ーニングするための一連のフラグメントを生じるのにふ
さわしい１つの制限酵素または制限酵素を組み合わせた
もので部分加水分解し、このようなフラグメントを標準
法によりサイズ分画する。ＥｃｏＲＩリンカーはＤＮＡ
およびフラグメントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断
したベクターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法により
ライブラリーをパッケージングし、パッケージングした
ライブラリーでイー・コリを感染させる。ライブラリー
を標準法により増幅する。

【００９２】実施例２：プロリルｔＲＮＡシンセターゼ
（ＰＲＳ）活性の測定 酵素はｔＲＮＡ^Ｐｒｏのアミノアシル化を触媒し、これ
は２段階メカニズムで進行する。最初の段階では、ＡＴ
ＰおよびＬ−プロリンの特異的結合および反応の結果、
安定な酵素：プロリルアデニル化複合体を形成する。続
いて、酵素結合ｔＲＮＡＰｒｏの３'末端アデノシンが
アミノアシルアデニレートと反応し、ｔＲＮＡのエステ
ル化、およびＡＭＰの放出を導く。これらの段階を以下
にまとめる；

【００９３】ａ） Ｌ-Ｐｒｏ＋ＡＴＰ.Ｍｇ＋ＰＲＳ⇒
ＰＲＳ：Ｐｒｏ-ＡＭＰ＋ＰＰｉ.Ｍｇ ｂ） ＰＲＳ:Ｐｒｏ-ＡＭＰ＋ｔＲＮＡ^Ｐｒｏ⇒ＰＲＳ
＋Ｐｒｏ-ｔＲＮＡ^{Ｐｒ ｏ}＋ＡＭＰ 多くの方法で、酵素を特徴づけ、またはその活性の特異
的阻害物質を同定をするために、この反応をアッセイす
ることができる：

【００９４】１．Ｐｒｏ-ｔＲＮＡ^Ｐｒｏの形成の測定
は、放射性標識プロリンを用いて特異的に決定でき、お
よび沈殿/ろ過技法（例えば冷トリクロロ酢酸^１,^２中）
を用いてＰｒｏ-ｔＲＮＡから遊離のプロリンを分離で
きる。 ２．全アシル化反応もまた、ｔＲＮＡアシル化に対して
化学量論的比率で生成されるＰＰｉまたはＡＭＰのどち
らかの生成を分析することにより測定できる。これは、
例えば比色^３；または過剰の無機ピロホスファターゼを
添加した後のＰｉの酵素結合^４測定を用いる、または直
接的にＡＭＰもしくはＰＰｉ生成^５を測定する酵素結合
アッセイを用いる等の多くの方法により達成できる。 ３．部分反応（ａ）は、反応のこの部分の各段階は自由
に可逆的であるので、ＡＴＰおよびＰＰｉ間の放射性標
識アイソトープ交換によりアッセイできる。これは典型
的には、全アシル化反応（ａ＋ｂ）よりも約２０倍高い
ｋ_ｃａｔ有し、ＡＴＰからＰＰｉを分離するクロマトグ
ラフィーの原理を用いて（すなわち活性炭 ^１,^２を用い
て）容易に測定される。

【００９５】ＰＲＳへのリガンド結合 基質のターンオーバーを触媒する酵素に依存しない実験
において、リガンドのＰＲＳとの相互作用を決定するこ
とも可能である。この型の実験は、多くの方法で実施で
きる：

【００９６】１．酵素固有の蛍光へのリガンド結合の影
響（例えばトリプトファン）。天然のリガンドかまたは
阻害物質の結合は、酵素の立体配座を変化させ、それは
酵素の蛍光を変化させる。このことを利用して、ストッ
プトフロー蛍光装置（stopped-flow fluorescence equi
pment）を用いて、結合を表す顕微鏡的速度定数を決定
することができる。別法として、定常状態蛍光滴定法
（steady-state fluorescence titration methods）
は、酵素阻害実験により評価されるのと同一の方法で正
味の解離定数を得ることができる。

【００９７】２．リガンドのスペクトル効果。リガンド
自身が蛍光性であるかまたは酵素トリプトファン蛍光と
重複する発色団を有する場合、結合はリガンド蛍光特性
（例えば強度、寿命または分極）における変化、または
酵素トリプトファンとの蛍光共鳴エネルギー転移により
検出できる。リガンドは阻害物質であるか、または天然
リガンドの変種である（すなわち蛍光ＡＴＰ誘導体また
は発蛍光団で標識したｔＲＮＡＰｒｏ）。

【００９８】３．酵素：リガンド複合体の熱分析。熱量
測定法（例えば等温熱量測定、示差スキャンニング熱量
測定）を用いると、温度変化または、リガンド結合を示
し、したがってリガンド結合を特徴づけることができる
ＰＲＳの安定性のシフトの検出が可能になる。

【００９９】文献 １．Calender & Berg、Biochemistry5:1681-1690（196
6） ２．Toth,M.J. & Schimmel,P.、J.Biol.Chem.265:1000-
1004（1990） ３．Hoenig、J.Biochem.Biophys.Meth.19:249-252（198
9） ４．Webb,T.M.、Anal.Biochem.218:449-454（1994） ５．Sigma Chemicals Catalogue（1986）

【０１００】実施例３：ＰＲＳ活性についてのアミノア
シル化アッセイ イー・コリにて過剰発現した精製スタフィロコッカス・
アウレウスのＰＲＳを用いるか、またはＰＲＳを過剰発
現したイー・コリからの粗細胞溶解物を用いて、アッセ
イを実施する。後者は通常、全タンパク質の約１０％を
ＰＲＳとして含有する。酵素は、液体窒素中急速冷凍し
た後、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７.８）、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１０ｍＭ β−メルカプトエタ
ノール中−７０℃で保存する。酵素サンプルの活性を決
定する実験では、これらの貯蔵物を５０ｍＭトリスｐＨ
７.８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオスレイトー
ル中で広範に（１００倍から１００００倍）希釈し、ア
ッセイ前に氷上で貯蔵する。

【０１０１】アッセイ方法は以下のとおりである；上述
のとおり調製し、希釈した酵素５０ｍｌを、０.２５μ
Ｃｉ Ｌ−[Ｕ−^１４Ｃ]−プロリン（アメルシャム・イ
ンターナショナル）、４ｍｇ／ｍｌイー・コリＭＲＥ６
００混合ｔＲＮＡ（ベーリンガー・マンハイムより）、
５ｍＭ ＡＴＰ、１５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、３ｍＭ ＤＴ
Ｔ、７５ｍＭ ＫＣｌおよび５０ｍＭ トリス−塩酸 ｐ
Ｈ７.８をからなる反応混合物（１００ｍｌ）と混合す
る。他に記載しないかぎり、全ての試薬はシグマ・ケミ
カル・カンパニー・リミテッドより入手した。濃度は最
終反応混合物での濃度である。酵素を添加して反応を開
始した後、アッセイサンプルを３７℃でインキュベート
し、所望時間、２検体ずつ（５０μｌ）取り出し、７％
トリクロロ酢酸（１００μｌ）で不活性化し、氷上で３
０分放置する。パッカードフィルターメート１９６セル
ハーベスト[パッカード・インストラメント・リミテッ
ド]を用いてグラスファイバーフィルター上で沈殿物を
回収し、フィルターを７％トリクロロ酢酸およびエタノ
ールで順次洗浄する。フィルターを７０℃で１時間乾燥
し、放射活性のレベルをシンチレーションカウンティン
グ（パッカード・トップカウント）により測定する。

【０１０２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SmithKline Beecham P.l.C. <120> Novel tRNA Synthetase <130> 179985 <150> 9601099.6 <151> 1996-01-19 <150> 9615845.6 <151> 1996-07-27 <160> 2 <210> 1 <211> 1704 <212> DNA <213> <400> 1 ATGAAGCAAT CCAAAGTTTT TATACCAACG ATGCGTGATG TGCCATCAGA AGCAGAAGCA 60 CAAAGTCATC GTTTATTATT GAAATCGGGT TTGATAAAAC AAAGTACAAG TGGGATTTAT 120 AGTTATTTAC CGCTAGCAAC ACGTGTGTTA AATAATATTA CTGCAATTGT GCGACAAGAA 180 ATGGAACGTA TCGATTCTGT TGAAATTTTA ATGCCAGCGT TACAACAAGC TGAATTATGG 240 GAAGAATCAG GACGTTGGGG TGCATATGGC CCAGAATTAA TGCGTTTACA AGATAGACAT 300 GGAAGACAAT TTGCATTAGG TCCAACACAT GAAGAATTAG TTACATCAAT AGTAAGAAAT 360 GAATTGAAAT CATACAAACA ATTACCGATG ACATTATTCC AAATTCAATC TAAATTCCGT 420 GATGAAAAGA GACCACGTTT TGGTTTACTT CGTGGGCGTG AATTTATTAT GAAAGATGCG 480 TATTCATTCC ATGCTGACGA GGCATCATTA GATCAAACGT ATCAAGATAT GTATCAAGCG 540 TATAGCCGTA TTTTTGAGAG AGTTGGCATT AATGCTAGAC CAGTTGTAGC AGATTCAGGT 600 GCTATAGGCG GTAGCCATAC ACATGAATTT ATGGCATTAA GTGCTATCGG TGAGGATACA 660 ATCGTTTACA GTAAAGAAAG TGACTATGCT GCTAATATCG AAAAAGCAGA AGTCGTTTAC 720 GAACCAAATC ATAAGCATTC TACTGTGCAA CCTTTAGAAA AAATTGAAAC ACCAAATGTT 780 AAGACTGCAC AAGAATTGGC AGACTTCTTA GGTAGACCAG TAGATGAAAT CGTTAAAACG 840 ATGATTTTCA AAGTTGATGG CGAATATATT ATGGTTTTAG TGCGTGGCCA TCATGAAATT 900 AATGACATTA AATTAAAATC TTATTTCGGC ACAGATAATA TTGAATTAGC AACACAAGAC 960 GAAATTGTTA ATTTAGTTGG TGCAAATCCG GGTTCACTAG GTCCTGTTAT TGATAAAGAA 1020 ATCAAAATTT ATGCAGATAA TTTTGTGCAA GATTTAAATA ATTTAGTTGT CGGTGCTAAC 1080 GAAGATGGCT ATCACTTAAT TAATGTAAAT GTAGGTAGAG ACTTCAACGT TGATGAATAT 1140 GGCGATTTCC GTTTTATTTT AGAAGGCGAA AAGTTAAGTG ATGGTTCAGG CGTTGCACAT 1200 TTTGCTGAAG GTATTGAAGT TGGTCAAGTA TTCAAATTGG GTACTAAGTA TTCAGAATCA 1260 ATGAATGCTA CATTCTTAGA TAACCAAGGA AAAGCTCAAC CTTTAATTAT GGGCTGTTAC 1320 GGTATTGGAA TTTCTAGAAC GCTAAGTGCG ATTGTTGAAC AAAATCACGA TGATAATGGA 1380 ATTGTTTGGC CTAAATCAGT TACTCCATTT GATTTACATT TAATTTCTAT TAATCCTAAG 1440 AAAGATGATC AACGAGAGCT AGCAGATGCA CTATATGCTG AATTTAATAC TAAATTTGAT 1500 GTGTTGTACG ATGATCGTCA GGAACGTGCA GGTGTCAAAT TTAATGATGC CGATTTAATT 1560 GGTTTACCAC TGCGAATTGT TGTTGGTAAA CGTGCATCGG AAGGTATTGT AGAAGTTAAA 1620 GAACGTTTAA CAGGTGATAG CGAAGAAGTT CACATTGATG ACTTAATGAC TGTCATTACA 1680 AATAAATATG ATAACTTAAA ATAA 1704 <210> 2 <211> 567 <212> PRT <213> <400> 2 Met Lys Gln Ser Lys Val Phe Ile Pro Thr Met Arg Asp Val Pro Ser 1 5 10 15 Glu Ala Glu Ala Gln Ser His Arg Leu Leu Leu Lys Ser Gly Leu Ile 20 25 30 Lys Gln Ser Thr Ser Gly Ile Tyr Ser Tyr Leu Pro Leu Ala Thr Arg 35 40 45 Val Leu Asn Asn Ile Thr Ala Ile Val Arg Gln Glu Met Glu Arg Ile 50 55 60 Asp Ser Val Glu Ile Leu Met Pro Ala Leu Gln Gln Ala Glu Leu Trp 65 70 75 80 Glu Glu Ser Gly Arg Trp Gly Ala Tyr Gly Pro Glu Leu Met Arg Leu 85 90 95 Gln Asp Arg His Gly Arg Gln Phe Ala Leu Gly Pro Thr His Glu Glu 100 105 110 Leu Val Thr Ser Ile Val Arg Asn Glu Leu Lys Ser Tyr Lys Gln Leu 115 120 125 Pro Met Thr Leu Phe Gln Ile Gln Ser Lys Phe Arg Asp Glu Lys Arg 130 135 140 Pro Arg Phe Gly Leu Leu Arg Gly Arg Glu Phe Ile Met Lys Asp Ala 145 150 155 160 Tyr Ser Phe His Ala Asp Glu Ala Ser Leu Asp Gln Thr Tyr Gln Asp 165 170 175 Met Tyr Gln Ala Tyr Ser Arg Ile Phe Glu Arg Val Gly Ile Asn Ala 180 185 190 Arg Pro Val Val Ala Asp Ser Gly Ala Ile Gly Gly Ser His Thr His 195 200 205 Glu Phe Met Ala Leu Ser Ala Ile Gly Glu Asp Thr Ile Val Tyr Ser 210 215 220 Lys Glu Ser Asp Tyr Ala Ala Asn Ile Glu Lys Ala Glu Val Val Tyr 225 230 235 240 Glu Pro Asn His Lys His Ser Thr Val Gln Pro Leu Glu Lys Ile Glu 245 250 255 Thr Pro Asn Val Lys Thr Ala Gln Glu Leu Ala Asp Phe Leu Gly Arg 260 265 270 Pro Val Asp Glu Ile Val Lys Thr Met Ile Phe Lys Val Asp Gly Glu 275 280 285 Tyr Ile Met Val Leu Val Arg Gly His His Glu Ile Asn Asp Ile Lys 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Phe Gly Thr Asp Asn Ile Glu Leu Ala Thr Gln Asp 305 310 315 320 Glu Ile Val Asn Leu Val Gly Ala Asn Pro Gly Ser Leu Gly Pro Val 325 330 335 Ile Asp Lys Glu Ile Lys Ile Tyr Ala Asp Asn Phe Val Gln Asp Leu 340 345 350 Asn Asn Leu Val Val Gly Ala Asn Glu Asp Gly Tyr His Leu Ile Asn 355 360 365 Val Asn Val Gly Arg Asp Phe Asn Val Asp Glu Tyr Gly Asp Phe Arg 370 375 380 Phe Ile Leu Glu Gly Glu Lys Leu Ser Asp Gly Ser Gly Val Ala His 385 390 395 400 Phe Ala Glu Gly Ile Glu Val Gly Gln Val Phe Lys Leu Gly Thr Lys 405 410 415 Tyr Ser Glu Ser Met Asn Ala Thr Phe Leu Asp Asn Gln Gly Lys Ala 420 425 430 Gln Pro Leu Ile Met Gly Cys Tyr Gly Ile Gly Ile Ser Arg Thr Leu 435 440 445 Ser Ala Ile Val Glu Gln Asn His Asp Asp Asn Gly Ile Val Trp Pro 450 455 460 Lys Ser Val Thr Pro Phe Asp Leu His Leu Ile Ser Ile Asn Pro Lys 465 470 475 480 Lys Asp Asp Gln Arg Glu Leu Ala Asp Ala Leu Tyr Ala Glu Phe Asn 485 490 495 Thr Lys Phe Asp Val Leu Tyr Asp Asp Arg Gln Glu Arg Ala Gly Val 500 505 510 Lys Phe Asn Asp Ala Asp Leu Ile Gly Leu Pro Leu Arg Ile Val Val 515 520 525 Gly Lys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Val Glu Val Lys Glu Arg Leu Thr 530 535 540 Gly Asp Ser Glu Glu Val His Ile Asp Asp Leu Met Thr Val Ile Thr 545 550 555 560 Asn Lys Tyr Asp Asn Leu Lys 565

【図面の簡単な説明】

【図１】 スタフィロコッカス・アウレウスのプロリル
ｔＲＮＡシンセターゼ[配列番号：１]のポリヌクレオチ
ド配列を示す。

【図２】 図１のポリヌクレオチド配列から推定したス
タフィロコッカス・アウレウスのプロリルｔＲＮＡシン
セターゼ[配列番号：２]のアミノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 13/02 １０５ ４Ｃ０８４ 11/04 17/00 ４Ｃ０８５ 13/02 １０５ 19/00 ４Ｈ０４５ 17/00 27/02 19/00 27/16 27/02 29/00 27/16 31/04 29/00 43/00 １１１ 31/04 Ｃ０７Ｋ 16/40 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/00 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/25 9/00 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/25 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ジョン・エドワード・ホッジソン アメリカ合衆国19426−0989ペンシルベニ ア州カレッジビル、ピー・オー・ボックス 5089、サウス・カレッジビル・ロード1250 番 スミスクライン・ビーチャム・ファー マシューティカルズ (72)発明者 エリザベス・ローラー アメリカ合衆国19426−0989ペンシルベニ ア州カレッジビル、ピー・オー・ボックス 5089、サウス・カレッジビル・ロード1250 番 スミスクライン・ビーチャム・ファー マシューティカルズ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BB20 CB01 CB21 DA20 DA36 DA77 FB01 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 AA20 BA07 CA03 DA01 DA02 DA05 EA04 GA11 HA17 4B050 CC01 CC03 DD02 LL01 LL03 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ20 QR08 QR20 QR55 QR62 QR80 QS25 QS34 4B065 AA01X AA53Y AA57X AA87X AB01 AC14 BA02 CA27 CA43 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 CA53 DC01 NA14 ZA332 ZA342 ZA362 ZA592 ZA662 ZA812 ZA902 ZA962 ZB352 ZC192 4C085 AA13 AA14 BB22 CC04 CC05 DD22 DD33 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA76 EA50

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ） 配列番号：２のアミノ酸１から
   ５６７を有してなるポリペプチドをコードするポリヌク
   レオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポ
   リヌクレオチド； （ｂ） （ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌク
   レオチド；および （ｃ） （ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少な
   くとも１５個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオ
   チド；からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列
   を有してなる単離ポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
   １記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
   １記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号：１に示すヌクレオチド１から
   １７０４を含む請求項２記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号：１に示すヌクレオチド１から
   １７０１を有する請求項２記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列番号：２のアミノ酸１から５６７を
   有してなるポリペプチドをコードする請求項２記載のポ
   リヌクレオチド。
7. 【請求項７】 （ａ） ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１
   に含まれるｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子により発現され
   る同一の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
   ドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌク
   レオチド； （ｂ） （ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌク
   レオチド；および （ｃ） （ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少な
   くとも１５個の塩基を有してなるポリヌクレオチド；か
   らなる群から選択される構成ポリヌクレオチドを有して
   なる単離ポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項２記載のＤＮＡを有するベクタ
   ー。
9. 【請求項９】 請求項８記載のベクターを有する宿主細
   胞。
10. 【請求項１０】 該ＤＮＡによりコードされるポリペプ
    チドを請求項９記載の宿主細胞から発現させることを特
    徴とするポリペプチドの製造方法。
11. 【請求項１１】 ポリペプチドを発現する細胞の製造方
    法であって、該細胞が請求項８記載のベクターに含まれ
    るｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現する
    ように、該ベクターで該細胞を形質転換またはトランス
    フェクションすることを特徴とする方法。
12. 【請求項１２】 ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドま
    たはフラグメントの製造方法であって、該ｔＲＮＡシン
    セターゼポリペプチドまたはフラグメントを生成するの
    に十分な条件下で請求項９記載の宿主を培養することを
    特徴とする方法。
13. 【請求項１３】 配列番号：２のアミノ酸１から５６７
    に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有
    してなるポリペプチド。
14. 【請求項１４】 配列番号：２に示すアミノ酸配列を有
    してなるポリペプチド。
15. 【請求項１５】 請求項１３記載のポリペプチドに対す
    る抗体。
16. 【請求項１６】 治療上有効量の請求項１３記載のポリ
    ペプチドを個体に投与することを特徴とする、ｔＲＮＡ
    シンセターゼの必要性を有する個体の治療方法。
17. 【請求項１７】 ポリペプチドをコードするＤＮＡを個
    体に提供し、該ポリペプチドをインビボで発現させるこ
    とにより、該治療上有効量のポリペプチドを投与する、
    請求項１６記載の方法。
18. 【請求項１８】 治療上有効量の配列番号：２のアミノ
    酸１から５６７に対して少なくとも７０％同一であるア
    ミノ酸配列を有してなるポリペプチドの活性を阻害する
    アンタゴニストを個体に投与することを特徴とする、ｔ
    ＲＮＡシンセターゼポリペプチドを阻害する必要性を有
    する個体の治療方法。
19. 【請求項１９】 請求項１３記載のポリペプチドをコー
    ドする核酸配列を決定することを特徴とする、該ポリペ
    プチドの発現に関与する疾患の診断方法。
20. 【請求項２０】 宿主由来のサンプル中の請求項１３記
    載のポリペプチドの存在を分析することを特徴とする診
    断方法。
21. 【請求項２１】 請求項１３記載のポリペプチドに結合
    し、活性を阻害する化合物の同定方法であって：結合部
    位との結合を可能にする条件下で、ポリペプチドについ
    ての結合部位をその表面に発現する細胞を、スクリーニ
    ングされる化合物と接触させること（ここに該結合部位
    は、化合物の該結合部位への結合に反応して検出可能な
    シグナルを提供する能力のある第２の成分に結合するも
    のである）；次いで、該化合物と該結合部位との相互作
    用から生じるシグナルの存在または不存在を検出するこ
    とにより、該化合物が該結合部位に結合して活性化する
    かまたは阻害するかを決定すること；を特徴とする方
    法。
22. 【請求項２２】 哺乳動物を疾患から防御する抗体を産
    生させるに十分なｔＲＮＡシンセターゼまたはそのフラ
    グメントもしくは変種を哺乳動物に接種することを特徴
    とする、哺乳動物における免疫学的応答を誘起する方
    法。
23. 【請求項２３】 遺伝子治療により、インビボにてｔＲ
    ＮＡシンセターゼまたはそのフラグメントもしくは変種
    を発現させるために、ｔＲＮＡシンセターゼフラグメン
    トもしくはその変種をコードする遺伝子を送達し、免疫
    学的応答を誘起させて抗体を産生し、該動物を疾患から
    防御する、哺乳動物における免疫学的応答を誘起する方
    法。
24. 【請求項２４】 ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチ
    ドまたはそれによりコードされるタンパク質をコード
    し、発現するＤＮＡを含んでなる免疫学的組成物であっ
    て、哺乳動物に導入した場合、哺乳動物において所定の
    ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドまたはそれによ
    りコードされるタンパク質を生じる免疫学的応答を誘起
    する免疫学的組成物。
25. 【請求項２５】 厳密なハイブリダイゼーション条件下
    で、配列番号：１に示すポリヌクレオチド配列の完全遺
    伝子を含む適当なライブラリーを、配列番号：１に示す
    該ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントの配列
    を有するプローブでスクリーニングし、次いで、そのＤ
    ＮＡ配列を単離することにより得られるＤＮＡ配列を必
    須としてなるポリヌクレオチド。
26. 【請求項２６】 プロリルｔＲＮＡシンセターゼの相互
    作用を妨害する薬物を同定するための薬物のスクリーニ
    ング方法であって、全アミノアシル化反応または部分Ｐ
    Ｐｉ／ＡＴＰ交換反応による酵素活性の測定を特徴とす
    るスクリーニング方法。