JP2002199891A - スタフィロコッカス・アウレウス由来の新規トリプトファニル−ｔＲＮＡシンセターゼ - Google Patents
スタフィロコッカス・アウレウス由来の新規トリプトファニル−ｔＲＮＡシンセターゼInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 感染、とりわけ細菌感染に対する防御のため
の方法が望まれていた。 【解決手段】 本発明によれば、ｔＲＮＡシンセターゼ
ポリペプチドが感染の予防に有用であることが見出され
た。さらに該ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ（ＲＮＡ）、ならびに組換え法による該ポ
リペプチドの製造方法も見出された。
の方法が望まれていた。 【解決手段】 本発明によれば、ｔＲＮＡシンセターゼ
ポリペプチドが感染の予防に有用であることが見出され
た。さらに該ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ（ＲＮＡ）、ならびに組換え法による該ポ
リペプチドの製造方法も見出された。
Description
【０００１】発明の分野 本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチドおよびポ
リペプチド、およびその製造および使用、ならびにそれ
らの変種、アゴニストおよびアンタゴニストおよびそれ
らの使用に関する。詳細には、これらのおよびその他の
点に関して、本発明は本明細書で「ｔＲＮＡシンセター
ゼ」と称するｔＲＮＡシンセターゼファミリーの新規ポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。 発明の背景 抗生物質の開発を目的として、スタフィロコッカス（Ｓ
taphylococcis）の遺伝子および遺伝子産物を用いるの
がとりわけ好ましい。スタフィロコッカス属は医学的に
重要な微生物の属である。これらは浸潤性および毒素原
性の２つの型の疾患を生み出すことが知られている。浸
潤性感染は一般的に、皮膚表面および深部の組織の両方
に影響を及ぼす膿瘍を形成する特徴がある。スタフィロ
コッカス・アウレウス（Ｓ．aureus）は癌患者の菌血症
を二次的に引き起こす原因となる。骨髄炎、敗血症性関
節炎、敗血症性血栓静脈炎および急性細菌性心内膜炎も
また比較的一般的である。スタフィロコッカス属の毒素
原特性から少なくとも３つの臨床病態が引き起こされ
る。これらの疾患の発現は、組織浸潤および菌血症に対
するものとしての外毒素の作用の結果である。これらの
病態には：スタフィロコッカスの食物汚染、熱傷様皮膚
症候群およびトキシックショック症候群等がある。
リペプチド、およびその製造および使用、ならびにそれ
らの変種、アゴニストおよびアンタゴニストおよびそれ
らの使用に関する。詳細には、これらのおよびその他の
点に関して、本発明は本明細書で「ｔＲＮＡシンセター
ゼ」と称するｔＲＮＡシンセターゼファミリーの新規ポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。 発明の背景 抗生物質の開発を目的として、スタフィロコッカス（Ｓ
taphylococcis）の遺伝子および遺伝子産物を用いるの
がとりわけ好ましい。スタフィロコッカス属は医学的に
重要な微生物の属である。これらは浸潤性および毒素原
性の２つの型の疾患を生み出すことが知られている。浸
潤性感染は一般的に、皮膚表面および深部の組織の両方
に影響を及ぼす膿瘍を形成する特徴がある。スタフィロ
コッカス・アウレウス（Ｓ．aureus）は癌患者の菌血症
を二次的に引き起こす原因となる。骨髄炎、敗血症性関
節炎、敗血症性血栓静脈炎および急性細菌性心内膜炎も
また比較的一般的である。スタフィロコッカス属の毒素
原特性から少なくとも３つの臨床病態が引き起こされ
る。これらの疾患の発現は、組織浸潤および菌血症に対
するものとしての外毒素の作用の結果である。これらの
病態には：スタフィロコッカスの食物汚染、熱傷様皮膚
症候群およびトキシックショック症候群等がある。
【０００２】ｔＲＮＡシンセターゼは以下のスキームに
従って、タンパク質合成に主要な役割を果たす： 酵素＋ＡＴＰ＋ＡＡ⇔酵素.ＡＡ-ＡＭＰ＋ＰＰｉ 酵素.ＡＡ-ＡＭＰ＋ｔＲＮＡ⇔酵素＋ＡＭＰ＋ＡＡ-ｔ
ＲＮＡ（ＡＡはアミノ酸である） この過程を阻害すると、荷電ｔＲＮＡのレベル低下を導
き、緊縮応答として知られている応答のカスケードの引
き金となり、結果的に生体の休眠状態を誘導する。細菌
性ｔＲＮＡシンセターゼの選択的阻害剤は、それ自体、
抗細菌剤としての可能性を有する。これに関する一つの
例として、イソロイシルｔＲＮＡシンセターゼを選択的
に阻害するムピロシンがある。ｔＲＮＡシンセターゼの
単離により、潜在的抗菌性の目的物質の同定および分析
のために、抗菌性化合物のスクリーニングを容易にな
る。イソロイシルｔＲＮＡシンセターゼはスタフィロコ
ッカス・アウレウス（Ｓtaphylococcus aureus）から単
離され、すでに報告されている（Chalker, A. F.、War
d, J. M., Fosberry, A. P. およびHodgson, J. E., Ge
ne 141:103-108 (1994)）。明らかに、化合物の抗生物
質活性をスクリーニングするために用いることができる
因子、ならびに感染、機能障害および疾患の病因におけ
る役割を決定するためにも用いることができる因子が必
要とされている。また、感染、機能障害または疾患の予
防、改善または抑制に役割を果たすことができるかかる
因子ならびにアンタゴニストおよびアゴニストの同定お
よび特徴づけも必要とされている。本発明のポリペプチ
ドは、既知のトリプトファニルｔＲＮＡシンセターゼタ
ンパク質に相同的なアミノ酸配列を有する。
従って、タンパク質合成に主要な役割を果たす： 酵素＋ＡＴＰ＋ＡＡ⇔酵素.ＡＡ-ＡＭＰ＋ＰＰｉ 酵素.ＡＡ-ＡＭＰ＋ｔＲＮＡ⇔酵素＋ＡＭＰ＋ＡＡ-ｔ
ＲＮＡ（ＡＡはアミノ酸である） この過程を阻害すると、荷電ｔＲＮＡのレベル低下を導
き、緊縮応答として知られている応答のカスケードの引
き金となり、結果的に生体の休眠状態を誘導する。細菌
性ｔＲＮＡシンセターゼの選択的阻害剤は、それ自体、
抗細菌剤としての可能性を有する。これに関する一つの
例として、イソロイシルｔＲＮＡシンセターゼを選択的
に阻害するムピロシンがある。ｔＲＮＡシンセターゼの
単離により、潜在的抗菌性の目的物質の同定および分析
のために、抗菌性化合物のスクリーニングを容易にな
る。イソロイシルｔＲＮＡシンセターゼはスタフィロコ
ッカス・アウレウス（Ｓtaphylococcus aureus）から単
離され、すでに報告されている（Chalker, A. F.、War
d, J. M., Fosberry, A. P. およびHodgson, J. E., Ge
ne 141:103-108 (1994)）。明らかに、化合物の抗生物
質活性をスクリーニングするために用いることができる
因子、ならびに感染、機能障害および疾患の病因におけ
る役割を決定するためにも用いることができる因子が必
要とされている。また、感染、機能障害または疾患の予
防、改善または抑制に役割を果たすことができるかかる
因子ならびにアンタゴニストおよびアゴニストの同定お
よび特徴づけも必要とされている。本発明のポリペプチ
ドは、既知のトリプトファニルｔＲＮＡシンセターゼタ
ンパク質に相同的なアミノ酸配列を有する。
【０００３】発明の概要 本発明の目的は、図２に示すアミノ酸配列とｔＲＮＡシ
ンセターゼなどの他のタンパク質の既知の一つのもしく
は複数のアミノ酸配列との相同性により、新規ｔＲＮＡ
シンセターゼポリペプチドとして同定されたポリペプチ
ドを提供することである。本発明のさらなる目的は、ｔ
ＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド、特に本明細書においてｔＲＮＡシンセターゼ
と称するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
提供することである。本発明のこの態様のとりわけ好ま
しい具体例では、ポリヌクレオチドは、図１［配列番号
１］に示す配列を含むトリプトファニルｔＲＮＡシンセ
ターゼポリペプチド、またはそれらの変種をコードする
領域を包含する。本発明のこの態様の別のとりわけ好ま
しい具体例では、図２［配列番号２］に示すアミノ酸配
列を含む、スタフィロコッカス・アウレウス由来の新規
トリプトファニルｔＲＮＡシンセターゼタンパク質、ま
たはそれらの変種がある。本発明のこの態様によれば、
ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１に含まれるスタフィロコ
ッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９株により発現されうる
成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供され
る。本発明のこの態様によれば、ｔＲＮＡシンセター
ゼ、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスのトリプ
トファニルｔＲＮＡシンセターゼをコードする、ｍＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等の単離核酸分子が提供さ
れる。本発明のこの態様のさらなる具体例は、生物学
的、診断学的、予防的、臨床的または治療的に有用なそ
れらの変種、およびこれらを含有してなる組成物を包含
する。
ンセターゼなどの他のタンパク質の既知の一つのもしく
は複数のアミノ酸配列との相同性により、新規ｔＲＮＡ
シンセターゼポリペプチドとして同定されたポリペプチ
ドを提供することである。本発明のさらなる目的は、ｔ
ＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド、特に本明細書においてｔＲＮＡシンセターゼ
と称するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
提供することである。本発明のこの態様のとりわけ好ま
しい具体例では、ポリヌクレオチドは、図１［配列番号
１］に示す配列を含むトリプトファニルｔＲＮＡシンセ
ターゼポリペプチド、またはそれらの変種をコードする
領域を包含する。本発明のこの態様の別のとりわけ好ま
しい具体例では、図２［配列番号２］に示すアミノ酸配
列を含む、スタフィロコッカス・アウレウス由来の新規
トリプトファニルｔＲＮＡシンセターゼタンパク質、ま
たはそれらの変種がある。本発明のこの態様によれば、
ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１に含まれるスタフィロコ
ッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９株により発現されうる
成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供され
る。本発明のこの態様によれば、ｔＲＮＡシンセター
ゼ、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスのトリプ
トファニルｔＲＮＡシンセターゼをコードする、ｍＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等の単離核酸分子が提供さ
れる。本発明のこの態様のさらなる具体例は、生物学
的、診断学的、予防的、臨床的または治療的に有用なそ
れらの変種、およびこれらを含有してなる組成物を包含
する。
【０００４】本発明の別の態様によれば、治療的または
予防的目的で、とりわけ遺伝学的免疫において本発明の
ポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明のこの態
様のとりわけ好ましい具体例は、ｔＲＮＡシンセターゼ
の自然発生対立遺伝子変種およびそれによりコードされ
るポリペプチドである。本発明のこの態様によれば、本
明細書でｔＲＮＡシンセターゼと称するスタフィロコッ
カス・アウレウスの新規ポリペプチド、ならびに生物学
的、診断学的、予防的、臨床的または治療的に有用なそ
れらの変種、およびこれらを含んでなる組成物が提供さ
れる。本発明のこの態様のとりわけ好ましい具体例は、
ｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子の自然発生対立遺伝子によ
りコードされるｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドの変
種である。本発明のこの態様の好ましい具体例では、前
述のｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドの製造方法が提
供される。本発明の別の態様によれば、例えば抗体等の
抗細菌物質として有用な、このようなポリペプチドの阻
害物質が提供される。
予防的目的で、とりわけ遺伝学的免疫において本発明の
ポリヌクレオチドの使用が提供される。本発明のこの態
様のとりわけ好ましい具体例は、ｔＲＮＡシンセターゼ
の自然発生対立遺伝子変種およびそれによりコードされ
るポリペプチドである。本発明のこの態様によれば、本
明細書でｔＲＮＡシンセターゼと称するスタフィロコッ
カス・アウレウスの新規ポリペプチド、ならびに生物学
的、診断学的、予防的、臨床的または治療的に有用なそ
れらの変種、およびこれらを含んでなる組成物が提供さ
れる。本発明のこの態様のとりわけ好ましい具体例は、
ｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子の自然発生対立遺伝子によ
りコードされるｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドの変
種である。本発明のこの態様の好ましい具体例では、前
述のｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドの製造方法が提
供される。本発明の別の態様によれば、例えば抗体等の
抗細菌物質として有用な、このようなポリペプチドの阻
害物質が提供される。
【０００５】本発明のこの態様のある好ましい具体例に
よれば、（i）ｔＲＮＡシンセターゼ発現の評価、（i
i）疾患、例えば上気道感染（例えば、中耳炎、細菌性
気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道感染（例え
ば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば、感染性心内
膜炎）、消化器感染（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、
腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、大脳膿瘍）、眼感
染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔
（preseptal）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および
尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、
トキシックショック症候群）、皮膚感染（例えば、膿痂
疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋
炎）、および骨および関節感染（例えば、敗血症性関節
炎、骨髄炎）などの処置、（iii）遺伝的変種のアッセ
イ、（iv）ならびに細菌とりわけスタフィロコッカス・
アウレウスに対する免疫学的応答を上昇させるための、
ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドの生体への投与のための製品、組成物および方法が
提供される。本発明のこの態様および他の態様のある好
ましい具体例によれば、ｔＲＮＡシンセターゼポリヌク
レオチド配列に、とりわけ厳密な条件下でハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドが提供される。本発明のこの態
様のある好ましい具体例において、ｔＲＮＡシンセター
ゼポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明の別
の態様によれば、各々好ましくは静細菌性または殺細菌
性をも有するｔＲＮＡシンセターゼアゴニストおよびア
ンタゴニストが提供される。本発明のさらなる態様にお
いて、ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドまたはｔ
ＲＮＡシンセターゼポリペプチドを含有する、細胞また
は多細胞生物への投与用の組成物が提供される。開示し
た本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾
は、以下の記載および本明細書のその他の部分を読むこ
とにより当業者に容易に明らかとなろう。
よれば、（i）ｔＲＮＡシンセターゼ発現の評価、（i
i）疾患、例えば上気道感染（例えば、中耳炎、細菌性
気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道感染（例え
ば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば、感染性心内
膜炎）、消化器感染（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、
腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、大脳膿瘍）、眼感
染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔
（preseptal）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および
尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、
トキシックショック症候群）、皮膚感染（例えば、膿痂
疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋
炎）、および骨および関節感染（例えば、敗血症性関節
炎、骨髄炎）などの処置、（iii）遺伝的変種のアッセ
イ、（iv）ならびに細菌とりわけスタフィロコッカス・
アウレウスに対する免疫学的応答を上昇させるための、
ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドの生体への投与のための製品、組成物および方法が
提供される。本発明のこの態様および他の態様のある好
ましい具体例によれば、ｔＲＮＡシンセターゼポリヌク
レオチド配列に、とりわけ厳密な条件下でハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドが提供される。本発明のこの態
様のある好ましい具体例において、ｔＲＮＡシンセター
ゼポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明の別
の態様によれば、各々好ましくは静細菌性または殺細菌
性をも有するｔＲＮＡシンセターゼアゴニストおよびア
ンタゴニストが提供される。本発明のさらなる態様にお
いて、ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドまたはｔ
ＲＮＡシンセターゼポリペプチドを含有する、細胞また
は多細胞生物への投与用の組成物が提供される。開示し
た本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾
は、以下の記載および本明細書のその他の部分を読むこ
とにより当業者に容易に明らかとなろう。
【０００６】用語集 以下の定義は、本明細書において汎用される特定の用語
の理解を容易にするために示すものである。「宿主細
胞」は外来ポリヌクレオチド配列により形質転換もしく
はトランスフェクトされたか、または形質転換もしくは
トランスフェクトされ得る細胞である。「同一性」と
は、当該分野に周知であるように、配列を比較して決定
される、二つもしくはそれ以上のポリペプチド配列また
は二つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関
係である。当該分野において、「同一性」とは、場合に
よってはかかる配列の鎖の合致により決定できる、ポリ
ペプチドまたはポリヌクレオチド配列の配列関連性の程
度をも意味する。「同一性」および「類似性」は既知の
方法により容易に算出できる（Computational Molecula
r Biology, Lesk, A. M. 編、オックスフォード・ユニ
バーシティー・プレス、ニューヨーク、1988年；Biocom
puting：Informatics and Genome Projects, Smith, D.
W. 編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、1993
年；Computer Analysis of Sequence Data, パートＩ,
Griffin, A. M. およびGriffin, H. G. 編、ヒューマン
・プレス、ニュージャージー、1994年；Sequence Analy
sis in Molecular Biology, vonHeinje, G.、アカデミ
ック・プレス、1987年；およびSequence Analysis Prim
er, Gribskov, M. およびDevereux, J. 編、Ｍストック
トン・プレス、ニューヨーク、1991年）。二つの配列間
の同一性および類似性を測定する方法は数多くあるが、
両用語とも当業者に周知である（Sequence Analysis in
Molecular Biology, von Heinje, G.、アカデミック・
プレス、1987年；Sequence Analysis Primer, Gribsko
v, M. およびDevereux, J. 編、Ｍストックトン・プレ
ス、ニューヨーク、1991年；ならびにCarillo, H. およ
びLipman, D., SIAM J. Applied Math.,48:1073 (198
8)）。配列間の同一性または類似性を測定するために通
常用いられる方法はCarillo, H. およびLipman, D., SI
AM J. Applied Math., 48:1073 (1988) に開示されてい
るが、これらに限定するものではない。同一性を決定す
るための好ましい方法は、試験する配列間で最も良く合
致するように設計される。同一性および類似性を決定す
る方法は、公に入手できるコンピュータープログラムで
集成されている。二つの配列間の同一性および類似性を
測定する好ましいコンピュータープログラム法には、Ｇ
ＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J.ら、Nucleic
Acids Research 12(1):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、
ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Atschul, S. F.ら、
J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990)））があるが、こ
れらに限定するものではない。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラ
ムはＮＣＢＩおよびその他の供給源より公に入手可能で
ある（BLAST Manual, Altschul, S.ら、NCBI NLM NIHメ
リーランド州２０８９４ベゼスダ；Altschul, S.ら、J.
Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）。
の理解を容易にするために示すものである。「宿主細
胞」は外来ポリヌクレオチド配列により形質転換もしく
はトランスフェクトされたか、または形質転換もしくは
トランスフェクトされ得る細胞である。「同一性」と
は、当該分野に周知であるように、配列を比較して決定
される、二つもしくはそれ以上のポリペプチド配列また
は二つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関
係である。当該分野において、「同一性」とは、場合に
よってはかかる配列の鎖の合致により決定できる、ポリ
ペプチドまたはポリヌクレオチド配列の配列関連性の程
度をも意味する。「同一性」および「類似性」は既知の
方法により容易に算出できる（Computational Molecula
r Biology, Lesk, A. M. 編、オックスフォード・ユニ
バーシティー・プレス、ニューヨーク、1988年；Biocom
puting：Informatics and Genome Projects, Smith, D.
W. 編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、1993
年；Computer Analysis of Sequence Data, パートＩ,
Griffin, A. M. およびGriffin, H. G. 編、ヒューマン
・プレス、ニュージャージー、1994年；Sequence Analy
sis in Molecular Biology, vonHeinje, G.、アカデミ
ック・プレス、1987年；およびSequence Analysis Prim
er, Gribskov, M. およびDevereux, J. 編、Ｍストック
トン・プレス、ニューヨーク、1991年）。二つの配列間
の同一性および類似性を測定する方法は数多くあるが、
両用語とも当業者に周知である（Sequence Analysis in
Molecular Biology, von Heinje, G.、アカデミック・
プレス、1987年；Sequence Analysis Primer, Gribsko
v, M. およびDevereux, J. 編、Ｍストックトン・プレ
ス、ニューヨーク、1991年；ならびにCarillo, H. およ
びLipman, D., SIAM J. Applied Math.,48:1073 (198
8)）。配列間の同一性または類似性を測定するために通
常用いられる方法はCarillo, H. およびLipman, D., SI
AM J. Applied Math., 48:1073 (1988) に開示されてい
るが、これらに限定するものではない。同一性を決定す
るための好ましい方法は、試験する配列間で最も良く合
致するように設計される。同一性および類似性を決定す
る方法は、公に入手できるコンピュータープログラムで
集成されている。二つの配列間の同一性および類似性を
測定する好ましいコンピュータープログラム法には、Ｇ
ＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J.ら、Nucleic
Acids Research 12(1):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、
ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Atschul, S. F.ら、
J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990)））があるが、こ
れらに限定するものではない。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラ
ムはＮＣＢＩおよびその他の供給源より公に入手可能で
ある（BLAST Manual, Altschul, S.ら、NCBI NLM NIHメ
リーランド州２０８９４ベゼスダ；Altschul, S.ら、J.
Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）。
【０００７】「単離」とは、「人間の手により」自然の
状態から変化させられた、すなわち、それが自然に存在
する場合、元来の環境から変化もしくは除去されたこ
と、またはその両方が行われたことを意味する。例え
ば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、自然の状
態で生存動物に存在している場合は「単離」されていな
いが、このポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然
に共存する物質から分離されている場合は、本明細書に
用いる用語である「単離」がなされている。「ポリヌク
レオチド」とは、一般に、修飾されていないＲＮＡもし
くはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡで
あってよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドを意味する。「ポリヌクレオチ
ド」としては、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖およ
び二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本
鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮ
Ａ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲ
ＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖もしくは三
本鎖、または一本鎖領域および二本鎖領域の混合物でよ
いＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げら
れるが、これに限定するものではない。さらに、本明細
書で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ
またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味す
る。そのような領域における鎖は同一の分子または異な
る分子由来のものでよい。この領域は一つまたはそれ以
上の分子の全体を含み得るが、より典型的には幾つかの
分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つ
は、しばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書で用
いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、一つまたはそれ
以上の修飾した塩基を含有する、上述のＤＮＡまたはＲ
ＮＡ等を含む。このように、安定性またはその他の理由
で修飾した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細
書の用語である「ポリヌクレオチド」である。さらに、
イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩基等
の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（二つの例だけを
示す）は、本明細書で用いる用語であるポリヌクレオチ
ドである。当業者に既知の多くの有用な目的を提供する
ＤＮＡおよびＲＮＡに非常に多くの修飾がなされている
ことは明らかであろう。本明細書で用いる「ポリヌクレ
オチド」なる用語は、ポリヌクレオチドのこのような化
学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびに
ウイルスおよび、例えば単純型細胞および複雑型細胞等
を含む細胞の特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態
を包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴ
ヌクレオチドと称する短いポリヌクレオチドを包含す
る。
状態から変化させられた、すなわち、それが自然に存在
する場合、元来の環境から変化もしくは除去されたこ
と、またはその両方が行われたことを意味する。例え
ば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、自然の状
態で生存動物に存在している場合は「単離」されていな
いが、このポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然
に共存する物質から分離されている場合は、本明細書に
用いる用語である「単離」がなされている。「ポリヌク
レオチド」とは、一般に、修飾されていないＲＮＡもし
くはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡで
あってよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドを意味する。「ポリヌクレオチ
ド」としては、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖およ
び二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本
鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮ
Ａ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲ
ＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖もしくは三
本鎖、または一本鎖領域および二本鎖領域の混合物でよ
いＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げら
れるが、これに限定するものではない。さらに、本明細
書で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ
またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味す
る。そのような領域における鎖は同一の分子または異な
る分子由来のものでよい。この領域は一つまたはそれ以
上の分子の全体を含み得るが、より典型的には幾つかの
分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つ
は、しばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書で用
いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、一つまたはそれ
以上の修飾した塩基を含有する、上述のＤＮＡまたはＲ
ＮＡ等を含む。このように、安定性またはその他の理由
で修飾した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細
書の用語である「ポリヌクレオチド」である。さらに、
イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩基等
の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（二つの例だけを
示す）は、本明細書で用いる用語であるポリヌクレオチ
ドである。当業者に既知の多くの有用な目的を提供する
ＤＮＡおよびＲＮＡに非常に多くの修飾がなされている
ことは明らかであろう。本明細書で用いる「ポリヌクレ
オチド」なる用語は、ポリヌクレオチドのこのような化
学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびに
ウイルスおよび、例えば単純型細胞および複雑型細胞等
を含む細胞の特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態
を包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴ
ヌクレオチドと称する短いポリヌクレオチドを包含す
る。
【０００８】「ポリペプチド」は、ペプチド結合または
修飾したペプチド結合により互いに結合している２個ま
たはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタ
ンパク質を意味する。「ポリペプチド」は、通常、例え
ばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称す
る短鎖、および一般的にタンパク質と称する長鎖の両方
を意味する。ポリペプチドは２０種の遺伝子によりコー
ドされたアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。
「ポリペプチド」には、プロセシングおよびその他の翻
訳後修飾のような自然の工程により修飾されたものが含
まれるが、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾
される。このような修飾は基礎的な参考書およびさらに
詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく開示され
ており、これらは当業者に周知である。同一の型の修飾
は該ポリペプチドのいくつかの部位で、同一または異な
る程度で存在し得ることは理解されよう。また、該ポリ
ペプチドは多くの型の修飾をも含み得る。修飾は、ペプ
チド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ
ル末端等のポリペプチドの任意の部位で起こりうる。修
飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、
アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、
ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂
質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシト
ールの共有結合、クロスリンキング、環化、ジスルフィ
ド結合形成、脱メチル化、共有結合クロスリンキング形
成、システイン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル
化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩア
ンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイ
ル化、酸化、タンパク質加水分解プロセシング、リン酸
化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、
硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、
水酸化およびＡＤＰリボシル化、セレノイル化、硫酸
化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡにより
媒介されるタンパク質へのアミノ酸の添加、ならびにユ
ビキチネーションなどがある。例えばPROTEINS-STRUCTU
RE AND MOLECULAR PROPERTIES、第２版、T. E. Creight
on, W. H. Freeman and Company、ニューヨーク (1993)
およびPOSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF
PROTEINS、B. C. Johnson編、アカデミックプレス、ニ
ューヨーク (1983) のWold, F., Posttranslational Pr
otein Modifications ：Perspective and Prospects、1
〜12頁；Seifterら、Meth. Enzymol. 182:626-646 (199
0)およびRattanら、Protein Synthesis：Posttranslati
onal Modifications andAging, Ann. N. Y. Acad. Sci.
663:48-62 (1992) を参照されたい。ポリペプチドは分
岐または環状でよく、分岐していてもいなくてもよい。
環状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後
の自然プロセスの結果であり、同様に全く合成的な方法
で合成できる。
修飾したペプチド結合により互いに結合している２個ま
たはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタ
ンパク質を意味する。「ポリペプチド」は、通常、例え
ばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称す
る短鎖、および一般的にタンパク質と称する長鎖の両方
を意味する。ポリペプチドは２０種の遺伝子によりコー
ドされたアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。
「ポリペプチド」には、プロセシングおよびその他の翻
訳後修飾のような自然の工程により修飾されたものが含
まれるが、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾
される。このような修飾は基礎的な参考書およびさらに
詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく開示され
ており、これらは当業者に周知である。同一の型の修飾
は該ポリペプチドのいくつかの部位で、同一または異な
る程度で存在し得ることは理解されよう。また、該ポリ
ペプチドは多くの型の修飾をも含み得る。修飾は、ペプ
チド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ
ル末端等のポリペプチドの任意の部位で起こりうる。修
飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、
アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、
ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂
質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシト
ールの共有結合、クロスリンキング、環化、ジスルフィ
ド結合形成、脱メチル化、共有結合クロスリンキング形
成、システイン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル
化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩア
ンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイ
ル化、酸化、タンパク質加水分解プロセシング、リン酸
化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、
硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、
水酸化およびＡＤＰリボシル化、セレノイル化、硫酸
化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡにより
媒介されるタンパク質へのアミノ酸の添加、ならびにユ
ビキチネーションなどがある。例えばPROTEINS-STRUCTU
RE AND MOLECULAR PROPERTIES、第２版、T. E. Creight
on, W. H. Freeman and Company、ニューヨーク (1993)
およびPOSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF
PROTEINS、B. C. Johnson編、アカデミックプレス、ニ
ューヨーク (1983) のWold, F., Posttranslational Pr
otein Modifications ：Perspective and Prospects、1
〜12頁；Seifterら、Meth. Enzymol. 182:626-646 (199
0)およびRattanら、Protein Synthesis：Posttranslati
onal Modifications andAging, Ann. N. Y. Acad. Sci.
663:48-62 (1992) を参照されたい。ポリペプチドは分
岐または環状でよく、分岐していてもいなくてもよい。
環状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後
の自然プロセスの結果であり、同様に全く合成的な方法
で合成できる。
【０００９】本明細書で用いる「変種」なる用語は、対
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、参照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、
以下に論じるように、参照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合およ
び切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別の参
照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に
は、差異は、参照ポリペプチドおよび変種の配列が、全
体的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるよ
うに限定される。変種および対照ポリペプチドは、１ま
たはそれ以上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせで
起こることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換ま
たは挿入したアミノ酸残基は、遺伝的コードによりコー
ドされたものであってもそうでなくてもよい。ポリヌク
レオチドまたはポリペプチドの変種は例えば対立遺伝子
変種のような自然発生的なものでよいか、または自然に
発生することが知られていない変種でよい。ポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの非自然発生変種は、突然変
異技術、直接的合成、および当業者に既知のその他の組
換え技術により製造できる。
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、参照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、
以下に論じるように、参照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合およ
び切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別の参
照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に
は、差異は、参照ポリペプチドおよび変種の配列が、全
体的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるよ
うに限定される。変種および対照ポリペプチドは、１ま
たはそれ以上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせで
起こることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換ま
たは挿入したアミノ酸残基は、遺伝的コードによりコー
ドされたものであってもそうでなくてもよい。ポリヌク
レオチドまたはポリペプチドの変種は例えば対立遺伝子
変種のような自然発生的なものでよいか、または自然に
発生することが知られていない変種でよい。ポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの非自然発生変種は、突然変
異技術、直接的合成、および当業者に既知のその他の組
換え技術により製造できる。
【００１０】発明の説明 本発明は以下により詳細に記載する、新規ｔＲＮＡシン
セターゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関す
る。特に、本発明は、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチ
ドにアミノ酸配列の相同性という点で関連している、ス
タフィロコッカス・アウレウスの新規ｔＲＮＡシンセタ
ーゼ遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関
する。本発明は特に図１および図２に各々示すヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列を有するｔＲＮＡシンセター
ゼ、ならびにＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１のＤＮＡの
ｔＲＮＡシンセターゼヌクレオチド配列およびそれらに
コードされるアミノ酸配列に関する。とりわけ研究室的
条件および宿主感染条件下での生存性に適用した場合
に、細菌における一時的な遺伝子発現を評価するのに有
用な技法がある。それ自体が生存するのに必須であるか
または感染の確立および／もしくは維持に必須である遺
伝子を同定するために、多くの方法を用いることができ
る。これらの方法の一つにより配列の発現を同定するこ
とにより、その機能についてのさらなる情報が得られ、
スクリーニングの目的物質としてさらなる開発のための
かかる配列の選別が助けられる。すなわち、これらの研
究は例えば以下に挙げられるものである：
セターゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関す
る。特に、本発明は、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチ
ドにアミノ酸配列の相同性という点で関連している、ス
タフィロコッカス・アウレウスの新規ｔＲＮＡシンセタ
ーゼ遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関
する。本発明は特に図１および図２に各々示すヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列を有するｔＲＮＡシンセター
ゼ、ならびにＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１のＤＮＡの
ｔＲＮＡシンセターゼヌクレオチド配列およびそれらに
コードされるアミノ酸配列に関する。とりわけ研究室的
条件および宿主感染条件下での生存性に適用した場合
に、細菌における一時的な遺伝子発現を評価するのに有
用な技法がある。それ自体が生存するのに必須であるか
または感染の確立および／もしくは維持に必須である遺
伝子を同定するために、多くの方法を用いることができ
る。これらの方法の一つにより配列の発現を同定するこ
とにより、その機能についてのさらなる情報が得られ、
スクリーニングの目的物質としてさらなる開発のための
かかる配列の選別が助けられる。すなわち、これらの研
究は例えば以下に挙げられるものである：
【００１１】１）シグニチャータグ化突然変異誘発（Ｓ
ignature Ｔagged Ｍutagenesis：ＳＴＭ） この技法はHenselら、Science 269:400-403 (1995) に
開示されている（引用して本明細書の記載とする）。シ
グニチャータグ化突然変異誘発は、該感染モデルにおけ
る感染の確立／維持に必要な遺伝子を同定するものであ
る。この技法は、種々の方法（例えばトランスポゾン）
により、標的生物のランダムな突然変異を誘発し、独特
なＤＮＡ配列タグを突然変異部位に非常に近接して挿入
することに基づく。細菌性突然変異体の混合集団からの
タグおよび感染した宿主から回収した細菌は、増幅、放
射性標識化およびハイブリダイゼーション分析により検
出される。毒性を減じた突然変異体は、感染宿主から回
収した細菌のプールにタグが存在しないことにより表さ
れる。スタフィロコッカス・アウレウスにおいては、ト
ランスポゾンシステムはよく発達していないので、タグ
化突然変異体を作るためのより有効な方法は、Morrison
ら、J. Bacteriol. 159:870 (1984) （引用して本明細
書の記載とする）に開示されている挿入−複製突然変異
誘発法を用いることである。
ignature Ｔagged Ｍutagenesis：ＳＴＭ） この技法はHenselら、Science 269:400-403 (1995) に
開示されている（引用して本明細書の記載とする）。シ
グニチャータグ化突然変異誘発は、該感染モデルにおけ
る感染の確立／維持に必要な遺伝子を同定するものであ
る。この技法は、種々の方法（例えばトランスポゾン）
により、標的生物のランダムな突然変異を誘発し、独特
なＤＮＡ配列タグを突然変異部位に非常に近接して挿入
することに基づく。細菌性突然変異体の混合集団からの
タグおよび感染した宿主から回収した細菌は、増幅、放
射性標識化およびハイブリダイゼーション分析により検
出される。毒性を減じた突然変異体は、感染宿主から回
収した細菌のプールにタグが存在しないことにより表さ
れる。スタフィロコッカス・アウレウスにおいては、ト
ランスポゾンシステムはよく発達していないので、タグ
化突然変異体を作るためのより有効な方法は、Morrison
ら、J. Bacteriol. 159:870 (1984) （引用して本明細
書の記載とする）に開示されている挿入−複製突然変異
誘発法を用いることである。
【００１２】２）インビボ発現技法（Ｉn Ｖivo Ｅxpre
ssion Ｔechnology：ＩＶＥＴ） この技術は、Camilliら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. US
A. 91:2634-2638 (1994) およびMahanら、Infectious A
gents and Diseases 2:263-268 (1994) に開示されてい
る（各々、引用して本明細書の記載とする）。ＩＶＥＴ
は、実験培養と比較した場合、感染中にアップレギュレ
ートされた遺伝子を同定し、感染における重要な役割を
果たす。この技法により同定される配列は感染の確立／
維持に重要な役割を果たす。この技法では、標的生物の
ランダムな染色体フラグメントは、プラスミドベクター
のプロモーター不含リポーター遺伝子の上流でクローン
化される。プールを宿主に導入し、感染後の種々の時間
に細菌を回収し、リポーター遺伝子発現の存在を評価す
る。発現したリポーター遺伝子の上流に担持された染色
体フラグメントは、感染中に正常にアップレギュレート
されたプロモーターまたは遺伝子部分を担持すべきであ
る。リポーター遺伝子の上流を配列決定すると、アップ
レギュレートされた遺伝子を同定できる。
ssion Ｔechnology：ＩＶＥＴ） この技術は、Camilliら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. US
A. 91:2634-2638 (1994) およびMahanら、Infectious A
gents and Diseases 2:263-268 (1994) に開示されてい
る（各々、引用して本明細書の記載とする）。ＩＶＥＴ
は、実験培養と比較した場合、感染中にアップレギュレ
ートされた遺伝子を同定し、感染における重要な役割を
果たす。この技法により同定される配列は感染の確立／
維持に重要な役割を果たす。この技法では、標的生物の
ランダムな染色体フラグメントは、プラスミドベクター
のプロモーター不含リポーター遺伝子の上流でクローン
化される。プールを宿主に導入し、感染後の種々の時間
に細菌を回収し、リポーター遺伝子発現の存在を評価す
る。発現したリポーター遺伝子の上流に担持された染色
体フラグメントは、感染中に正常にアップレギュレート
されたプロモーターまたは遺伝子部分を担持すべきであ
る。リポーター遺伝子の上流を配列決定すると、アップ
レギュレートされた遺伝子を同定できる。
【００１３】３）特徴的表示 この技法はChuangら、J. Bacteriol. 175:2026-2036 (1
993) に開示されている（引用して本明細書の記載とす
る）。この方法はランダムプライムＲＴ−ＰＣＲを用い
て存在するｍＲＮＡを同定することにより、生体に発現
する遺伝子を同定する。感染前および感染後のプロフィ
ールを比較することにより、感染中にアップレギュレー
トおよびダウンレギュレートされた遺伝子を同定でき、
ＲＴ−ＰＣＲ生成物を配列決定し、ライブラリー配列に
適合させられる。
993) に開示されている（引用して本明細書の記載とす
る）。この方法はランダムプライムＲＴ−ＰＣＲを用い
て存在するｍＲＮＡを同定することにより、生体に発現
する遺伝子を同定する。感染前および感染後のプロフィ
ールを比較することにより、感染中にアップレギュレー
トおよびダウンレギュレートされた遺伝子を同定でき、
ＲＴ−ＰＣＲ生成物を配列決定し、ライブラリー配列に
適合させられる。
【００１４】４）トランスポゾン突然変異誘発による条
件致死変異体の発生 この技法はde Lorenzo, V.ら、Gene 123:17-24 (1993)
；Neuwald, A. F.ら、Gene 125:69-73 (1993) およびT
akiff, H. E.ら、J. Bacteriol. 174:1544-1553(1992)
に開示されており（引用して本明細書の記載とする）、
発現が細胞の生存性に必須である遺伝子を同定する。こ
の技法では、一方向または両方向でトランスポゾンから
外側へ転写する、調節可能なプロモーターを担持するト
ランスポゾンを生じる。これらのトランスポゾンを標的
生物にランダムに挿入し、続いてプロモーター活性のイ
ンデューサーの存在下で挿入突然変異体を単離すると、
発現が細胞の生存に必須である遺伝子のコーディング領
域からプロモーターを分離するインサートが確実に回収
される。このインサートは生存できないので、続いてイ
ンデューサー不含のレプリカ平板法でかかるインサート
を同定する。トランスポゾンに隣接する領域の配列決定
により挿入部位を同定し、分断された遺伝子を同定す
る。インデューサー不存在下での成長中の細胞の過程／
形態の変化を正確にモニターすることにより、遺伝子の
可能な機能に関する情報が得られる。このようなモニタ
ーリングとしては、フローサイトメトリー（細胞分割、
溶解、酸化還元能、ＤＮＡ複製）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タ
ンパク質、脂質、ペプチドグリカンへの放射化学的標識
化前駆体の取り込み、既知の細胞性ストレスに反応する
リポーター酵素遺伝子融合のモニター等がある。
件致死変異体の発生 この技法はde Lorenzo, V.ら、Gene 123:17-24 (1993)
；Neuwald, A. F.ら、Gene 125:69-73 (1993) およびT
akiff, H. E.ら、J. Bacteriol. 174:1544-1553(1992)
に開示されており（引用して本明細書の記載とする）、
発現が細胞の生存性に必須である遺伝子を同定する。こ
の技法では、一方向または両方向でトランスポゾンから
外側へ転写する、調節可能なプロモーターを担持するト
ランスポゾンを生じる。これらのトランスポゾンを標的
生物にランダムに挿入し、続いてプロモーター活性のイ
ンデューサーの存在下で挿入突然変異体を単離すると、
発現が細胞の生存に必須である遺伝子のコーディング領
域からプロモーターを分離するインサートが確実に回収
される。このインサートは生存できないので、続いてイ
ンデューサー不含のレプリカ平板法でかかるインサート
を同定する。トランスポゾンに隣接する領域の配列決定
により挿入部位を同定し、分断された遺伝子を同定す
る。インデューサー不存在下での成長中の細胞の過程／
形態の変化を正確にモニターすることにより、遺伝子の
可能な機能に関する情報が得られる。このようなモニタ
ーリングとしては、フローサイトメトリー（細胞分割、
溶解、酸化還元能、ＤＮＡ複製）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タ
ンパク質、脂質、ペプチドグリカンへの放射化学的標識
化前駆体の取り込み、既知の細胞性ストレスに反応する
リポーター酵素遺伝子融合のモニター等がある。
【００１５】５）化学的突然変異誘発による条件致死突
然変異の発生 この技法はBeckwith, J.、Methods in Enzymology 204:
3-18 (1991) に記載されている（引用して本明細書の記
載とする）。この技法では標的生物のランダム化学的突
然変異を誘発し、生理学的温度（許容温度）とは異なる
温度で増殖させ、続いてレプリカ平板法を行い、異なる
温度（例えばｔｓ同定のためには４２℃、ｃｓ同定のた
めには２５℃）で成長させ、その時成長できなかった単
離物（条件突然変異体）を同定する。上述のように、非
許容温度での増殖における変化を正確にモニターするこ
とにより、突然変異遺伝子の機能に関する情報が得られ
る。標的生物からのライブラリーによる条件致死突然変
異の相補性、および相補遺伝子を配列決定することによ
り、ライブラリー配列と適合させることができる。これ
らの技法の各々は、特定の適用に応じて有利であった
り、不利であったりする。当業者は意図する特定の使用
目的に最も関連する研究法を選択する。例えば、いくつ
かの遺伝子は感染に必須であると認識されているが、実
際には感染の開始にのみ必要であり、そのためそれらの
産物は、確立された慢性感染の治療のために開発された
抗細菌物質にはそれほど魅力的な標的ではない。
然変異の発生 この技法はBeckwith, J.、Methods in Enzymology 204:
3-18 (1991) に記載されている（引用して本明細書の記
載とする）。この技法では標的生物のランダム化学的突
然変異を誘発し、生理学的温度（許容温度）とは異なる
温度で増殖させ、続いてレプリカ平板法を行い、異なる
温度（例えばｔｓ同定のためには４２℃、ｃｓ同定のた
めには２５℃）で成長させ、その時成長できなかった単
離物（条件突然変異体）を同定する。上述のように、非
許容温度での増殖における変化を正確にモニターするこ
とにより、突然変異遺伝子の機能に関する情報が得られ
る。標的生物からのライブラリーによる条件致死突然変
異の相補性、および相補遺伝子を配列決定することによ
り、ライブラリー配列と適合させることができる。これ
らの技法の各々は、特定の適用に応じて有利であった
り、不利であったりする。当業者は意図する特定の使用
目的に最も関連する研究法を選択する。例えば、いくつ
かの遺伝子は感染に必須であると認識されているが、実
際には感染の開始にのみ必要であり、そのためそれらの
産物は、確立された慢性感染の治療のために開発された
抗細菌物質にはそれほど魅力的な標的ではない。
【００１６】６）ＲＴ−ＰＣＲ 細菌性メッセンジャーＲＮＡ、好ましくはスタフィロコ
ッカス・アウレウスの細菌性メッセンジャーＲＮＡを、
細菌感染した組織、例えば４８時間ネズミ肺感染の組織
から単離し、ランダムヘキサヌクレオチドでプライムし
たＲＮＡサンプルの逆転写、続いて遺伝子特異的プライ
マー対でのＰＣＲにより、各ｍＲＮＡ種の量を評価す
る。得られたＰＣＲ生成物の定量化による特定のｍＲＮ
Ａ種の存在および量の決定により、感染した組織におい
て転写された細菌遺伝子に関する情報が得られる。遺伝
子転写の分析は、感染の異なる時間で実施でき、細菌性
病因における遺伝子制御に関する詳細な知識を得ること
ができ、遺伝子産物が新規抗菌物質をスクリーニングす
る目的物質に相当することが明快に理解できるようにな
る。用いたＰＣＲプライマーの遺伝子特異的特性のため
に、細菌性ｍＲＮＡ調製物は遊離の哺乳動物ＲＮＡであ
る必要はないことが理解されるべきである。これにより
研究者は、感染組織から簡単で迅速にＲＮＡを調製で
き、細菌中で非常に短時間しか生育できない（半減期２
分程度）細菌性ｍＲＮＡ種を得ることができる。最適に
は、細菌性ｍＲＮＡは、感染ネズミ肺組織から、ＴＲＩ
ゾール試薬の製造者に従って、非常に短時間ＴＲＩゾー
ル（ギブコ−ＢＲＬ）の存在下で機械的に崩壊させ、続
いてプロセシングし、次いでＤＮＡａｓｅ処理して夾雑
ＤＮＡを除去することにより調製する。好ましくは、該
プロセスは、適切に標識化した配列特異的オリゴヌクレ
オチドプローブでノーザンブロットをプローブすること
により検出される場合に細菌性１６ＳリボソームＲＮ
Ａ、好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスの１６
ＳリボソームＲＮＡの最大量を得る条件を見出すことに
より最適化される。典型的には、至適には８から２５サ
イクルで終了するＰＣＲ反応における各ＰＣＲプライマ
ー対には５'色素標識プライマーを用いる。ＰＣＲ生成
物は６％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ＧeneＳcan
ner（ＡＢＩ製造）を用いて検出および定量する。本発
明の配列に適用する場合、これらの技法を用いると、感
染中に発現する細菌性タンパク質、抗細菌治療における
利用能を有する該細菌性タンパク質の阻害物質の同定が
可能になる。
ッカス・アウレウスの細菌性メッセンジャーＲＮＡを、
細菌感染した組織、例えば４８時間ネズミ肺感染の組織
から単離し、ランダムヘキサヌクレオチドでプライムし
たＲＮＡサンプルの逆転写、続いて遺伝子特異的プライ
マー対でのＰＣＲにより、各ｍＲＮＡ種の量を評価す
る。得られたＰＣＲ生成物の定量化による特定のｍＲＮ
Ａ種の存在および量の決定により、感染した組織におい
て転写された細菌遺伝子に関する情報が得られる。遺伝
子転写の分析は、感染の異なる時間で実施でき、細菌性
病因における遺伝子制御に関する詳細な知識を得ること
ができ、遺伝子産物が新規抗菌物質をスクリーニングす
る目的物質に相当することが明快に理解できるようにな
る。用いたＰＣＲプライマーの遺伝子特異的特性のため
に、細菌性ｍＲＮＡ調製物は遊離の哺乳動物ＲＮＡであ
る必要はないことが理解されるべきである。これにより
研究者は、感染組織から簡単で迅速にＲＮＡを調製で
き、細菌中で非常に短時間しか生育できない（半減期２
分程度）細菌性ｍＲＮＡ種を得ることができる。最適に
は、細菌性ｍＲＮＡは、感染ネズミ肺組織から、ＴＲＩ
ゾール試薬の製造者に従って、非常に短時間ＴＲＩゾー
ル（ギブコ−ＢＲＬ）の存在下で機械的に崩壊させ、続
いてプロセシングし、次いでＤＮＡａｓｅ処理して夾雑
ＤＮＡを除去することにより調製する。好ましくは、該
プロセスは、適切に標識化した配列特異的オリゴヌクレ
オチドプローブでノーザンブロットをプローブすること
により検出される場合に細菌性１６ＳリボソームＲＮ
Ａ、好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスの１６
ＳリボソームＲＮＡの最大量を得る条件を見出すことに
より最適化される。典型的には、至適には８から２５サ
イクルで終了するＰＣＲ反応における各ＰＣＲプライマ
ー対には５'色素標識プライマーを用いる。ＰＣＲ生成
物は６％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ＧeneＳcan
ner（ＡＢＩ製造）を用いて検出および定量する。本発
明の配列に適用する場合、これらの技法を用いると、感
染中に発現する細菌性タンパク質、抗細菌治療における
利用能を有する該細菌性タンパク質の阻害物質の同定が
可能になる。
【００１７】寄託物 スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９株を含有
する寄託物は、スコットランド、アベルディーンＡＢ２
１ＲＹ、セント・マッカードライブ２３番のナショナ
ル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・
マリン・バクテリア・リミテッド（ＮＣＩＭＢ）に１９
９５年９月１１日に寄託され、ＮＣＩＭＢ受託番号４０
７７１が付与された。寄託したスタフィロコッカス・ア
ウレウス株は本明細書では「寄託株」または「寄託株の
ＤＮＡ」と称する。寄託物は、寄託により「ＮＣＩＭＢ
４０７７１」と称された、ｔＲＮＡシンセターゼＤＮ
Ａの全長を含有する株である。寄託物に含まれるポリヌ
クレオチド配列、およびそれらにコードされるポリペプ
チドのアミノ酸配列は、本明細書の配列に関するいずれ
の記載にも矛盾する事象においてコントロールしてい
る。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に
関するブダペスト条約の条件下でなされている。該株
は、特許が発行されると何らの制限または条件もなく最
終的に分譲されるであろう。寄託は当業者の便宜のため
にのみ規定されており、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条
のもとに要求されるような実施可能要件であることを承
認するものではない。寄託物を製造、使用または販売す
るためにはライセンスが必要であるが、そのようなライ
センスはここでは賦与されない。
する寄託物は、スコットランド、アベルディーンＡＢ２
１ＲＹ、セント・マッカードライブ２３番のナショナ
ル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・
マリン・バクテリア・リミテッド（ＮＣＩＭＢ）に１９
９５年９月１１日に寄託され、ＮＣＩＭＢ受託番号４０
７７１が付与された。寄託したスタフィロコッカス・ア
ウレウス株は本明細書では「寄託株」または「寄託株の
ＤＮＡ」と称する。寄託物は、寄託により「ＮＣＩＭＢ
４０７７１」と称された、ｔＲＮＡシンセターゼＤＮ
Ａの全長を含有する株である。寄託物に含まれるポリヌ
クレオチド配列、およびそれらにコードされるポリペプ
チドのアミノ酸配列は、本明細書の配列に関するいずれ
の記載にも矛盾する事象においてコントロールしてい
る。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に
関するブダペスト条約の条件下でなされている。該株
は、特許が発行されると何らの制限または条件もなく最
終的に分譲されるであろう。寄託は当業者の便宜のため
にのみ規定されており、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条
のもとに要求されるような実施可能要件であることを承
認するものではない。寄託物を製造、使用または販売す
るためにはライセンスが必要であるが、そのようなライ
センスはここでは賦与されない。
【００１８】ポリペプチド 本発明のポリペプチドとしては、図２［配列番号２］の
ポリペプチド（詳細には成熟ポリペプチド）ならびにポ
リペプチド類およびフラグメント、とりわけｔＲＮＡシ
ンセターゼの生物学的活性を有するもの、および図２
［配列番号２］のポリペプチドまたは相当する部分に少
なくとも７０％の同一性を有するもの、好ましくは図２
［配列番号２］のポリペプチドに少なくとも８０％の同
一性を有するもの、およびさらに好ましくは図２［配列
番号２］のポリペプチドに少なくとも９０％の類似性
（さらに好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有す
るもの、なおさらに好ましくは図２［配列番号２］のポ
リペプチドに少なくとも９５％の類似性（なおさらに好
ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するものが挙
げられ、また、一般に少なくとも３０個のアミノ酸、よ
り好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含むポリペ
プチドのかかる部分を有するこのようなポリペプチドの
部分が挙げられる。本発明のポリペプチドのフラグメン
トである変種は、ペプチド合成により対応するポリペプ
チド全長を産生するのに用いることができる；従って、
これらの変種をポリペプチド全長を製造するための中間
体として用いることができる。本発明のポリヌクレオチ
ドのフラグメントである変種を用いて、本発明のポリヌ
クレオチド全長を合成することができる。
ポリペプチド（詳細には成熟ポリペプチド）ならびにポ
リペプチド類およびフラグメント、とりわけｔＲＮＡシ
ンセターゼの生物学的活性を有するもの、および図２
［配列番号２］のポリペプチドまたは相当する部分に少
なくとも７０％の同一性を有するもの、好ましくは図２
［配列番号２］のポリペプチドに少なくとも８０％の同
一性を有するもの、およびさらに好ましくは図２［配列
番号２］のポリペプチドに少なくとも９０％の類似性
（さらに好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有す
るもの、なおさらに好ましくは図２［配列番号２］のポ
リペプチドに少なくとも９５％の類似性（なおさらに好
ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するものが挙
げられ、また、一般に少なくとも３０個のアミノ酸、よ
り好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含むポリペ
プチドのかかる部分を有するこのようなポリペプチドの
部分が挙げられる。本発明のポリペプチドのフラグメン
トである変種は、ペプチド合成により対応するポリペプ
チド全長を産生するのに用いることができる；従って、
これらの変種をポリペプチド全長を製造するための中間
体として用いることができる。本発明のポリヌクレオチ
ドのフラグメントである変種を用いて、本発明のポリヌ
クレオチド全長を合成することができる。
【００１９】フラグメントは、前述のポリペプチドのア
ミノ酸配列の全てではなく一部と全く同一であるアミノ
酸配列を有する変種ポリペプチドである。ｔＲＮＡシン
セターゼポリペプチドに関しては、フラグメントは「フ
リースタンディング（free-standing）」であるか、ま
たはそれらが一部もしくは領域を形成する大きなポリペ
プチド内に含まれてもよく、最も好ましくは単一の連続
した領域として、単一の大きなポリペプチド内に含まれ
る。好ましいフラグメントとしては、例えば、アミノ末
端を含む連続する一連の残基の欠失もしくはカルボキシ
ル末端を含む連続する一連の残基の欠失またはアミノ末
端を含むものおよびカルボキシル末端を含むものからな
る二つの連続する一連の残基の欠失以外の、図２［配列
番号２］のアミノ酸配列またはそれらの変種の一部を有
する切断ポリペプチドが挙げられる。宿主細胞、とりわ
けスタフィロコッカス・アウレウスにおける本発明のポ
リペプチドの切断形態もまた好ましい。また、構造的ま
たは機能的属性により特徴づけられたフラグメント、例
えばアルファーヘリックスおよびアルファーヘリックス
形成領域、ベータ−シートおよびベータ−シート形成領
域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル
形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファー両親媒
性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成領
域、基質結合領域、および高抗原性指標領域を含むフラ
グメントなどがある。ｔＲＮＡシンセターゼの活性を媒
介するこれらのフラグメントである生物学的に活性なフ
ラグメントもまた好ましく、類似の活性もしくは改善さ
れた活性があるかまたは望ましくない活性を減じたフラ
グメント等がある。動物、とりわけヒトにおいて抗原的
または免疫原的であるこれらのフラグメントもまた含ま
れる。
ミノ酸配列の全てではなく一部と全く同一であるアミノ
酸配列を有する変種ポリペプチドである。ｔＲＮＡシン
セターゼポリペプチドに関しては、フラグメントは「フ
リースタンディング（free-standing）」であるか、ま
たはそれらが一部もしくは領域を形成する大きなポリペ
プチド内に含まれてもよく、最も好ましくは単一の連続
した領域として、単一の大きなポリペプチド内に含まれ
る。好ましいフラグメントとしては、例えば、アミノ末
端を含む連続する一連の残基の欠失もしくはカルボキシ
ル末端を含む連続する一連の残基の欠失またはアミノ末
端を含むものおよびカルボキシル末端を含むものからな
る二つの連続する一連の残基の欠失以外の、図２［配列
番号２］のアミノ酸配列またはそれらの変種の一部を有
する切断ポリペプチドが挙げられる。宿主細胞、とりわ
けスタフィロコッカス・アウレウスにおける本発明のポ
リペプチドの切断形態もまた好ましい。また、構造的ま
たは機能的属性により特徴づけられたフラグメント、例
えばアルファーヘリックスおよびアルファーヘリックス
形成領域、ベータ−シートおよびベータ−シート形成領
域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル
形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファー両親媒
性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成領
域、基質結合領域、および高抗原性指標領域を含むフラ
グメントなどがある。ｔＲＮＡシンセターゼの活性を媒
介するこれらのフラグメントである生物学的に活性なフ
ラグメントもまた好ましく、類似の活性もしくは改善さ
れた活性があるかまたは望ましくない活性を減じたフラ
グメント等がある。動物、とりわけヒトにおいて抗原的
または免疫原的であるこれらのフラグメントもまた含ま
れる。
【００２０】ポリヌクレオチド 本発明の別の態様は、図２[配列番号２]の推定アミノ酸
配列を有するトリプトファニルｔＲＮＡシンセターゼポ
リペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドおよびそ
れらに密接に関連したポリヌクレオチドおよびそれらの
変種を提供する。 本明細書に提供する情報を用いて、
例えば図１［配列番号１］に示すポリヌクレオチド配列
のような、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコード
する本発明のポリヌクレオチドを、例えば出発物質とし
てスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９細胞由
来の染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングし配列決
定するために用いるような標準的なクローニングおよび
スクリーニングを用いて得ることができ、次いで全長ク
ローンを得ることができができる。例えば、図１［配列
番号１］に示す配列のような本発明のポリヌクレオチド
配列を得るために、典型的には、イー・コリ（Ｅ. col
i）または何か別の適切な宿主におけるスタフィロコッ
カス・アウレウスＷＣＵＨ２９細胞の染色体ＤＮＡのク
ローンのライブラリーを、部分的配列に由来の、好まし
くは１７量体またはそれ以上の長さの放射性標識オリゴ
ヌクレオチドにてプローブする。次いで、プローブのＤ
ＮＡと同一のＤＮＡを有するクローンは、高い厳密な洗
浄を用いて区別できる。オリジナルの配列から設計した
配列決定プライマーでこのように同定した個々のクロー
ンを配列決定することにより、次に両方向に配列を伸長
させて、全遺伝子配列を決定することができる。このよ
うな配列決定は、プラスミドクローンから調製した変性
二本鎖ＤＮＡを用いて行うのが好都合である。適切な技
法については、Maniatis, T.、Fitsch, F. F.およびSam
brookら、Molecular Cloning, A LaboratoryManual、第
２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨ
ーク (1989) に開示されている（Screening By Hybridi
zation 1.90 and Sequencing Denatured Double-Strand
ed DNA Templates 13.70を参照）。本発明の説明のため
に、図１［配列番号１］に示すポリヌクレオチドは、ス
タフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９に由来する
ＤＮＡライブラリーで発見された。
配列を有するトリプトファニルｔＲＮＡシンセターゼポ
リペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドおよびそ
れらに密接に関連したポリヌクレオチドおよびそれらの
変種を提供する。 本明細書に提供する情報を用いて、
例えば図１［配列番号１］に示すポリヌクレオチド配列
のような、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコード
する本発明のポリヌクレオチドを、例えば出発物質とし
てスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９細胞由
来の染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングし配列決
定するために用いるような標準的なクローニングおよび
スクリーニングを用いて得ることができ、次いで全長ク
ローンを得ることができができる。例えば、図１［配列
番号１］に示す配列のような本発明のポリヌクレオチド
配列を得るために、典型的には、イー・コリ（Ｅ. col
i）または何か別の適切な宿主におけるスタフィロコッ
カス・アウレウスＷＣＵＨ２９細胞の染色体ＤＮＡのク
ローンのライブラリーを、部分的配列に由来の、好まし
くは１７量体またはそれ以上の長さの放射性標識オリゴ
ヌクレオチドにてプローブする。次いで、プローブのＤ
ＮＡと同一のＤＮＡを有するクローンは、高い厳密な洗
浄を用いて区別できる。オリジナルの配列から設計した
配列決定プライマーでこのように同定した個々のクロー
ンを配列決定することにより、次に両方向に配列を伸長
させて、全遺伝子配列を決定することができる。このよ
うな配列決定は、プラスミドクローンから調製した変性
二本鎖ＤＮＡを用いて行うのが好都合である。適切な技
法については、Maniatis, T.、Fitsch, F. F.およびSam
brookら、Molecular Cloning, A LaboratoryManual、第
２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨ
ーク (1989) に開示されている（Screening By Hybridi
zation 1.90 and Sequencing Denatured Double-Strand
ed DNA Templates 13.70を参照）。本発明の説明のため
に、図１［配列番号１］に示すポリヌクレオチドは、ス
タフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９に由来する
ＤＮＡライブラリーで発見された。
【００２１】このようにして得られたＤＮＡ配列を図１
［配列番号１］に示す。これは当該分野で周知のアミノ
酸残基分子量を用いて算出できる推定分子量を有する、
図２［配列番号２］に示すものとほぼ同数のアミノ酸残
基を有するタンパク質をコードする読み取り枠を含有す
る。本発明のトリプトファニルｔＲＮＡシンセターゼ
は、寄託株のｔＲＮＡシンセターゼをコードするＤＮＡ
の配列決定の結果により示されるように、ｔＲＮＡシン
セターゼファミリーの他のタンパク質に構造的に関連し
ている。該タンパク質は、既知のタンパク質の中でバシ
ラス・サチリス（Ｂacillus sabtilis）のトリプトファ
ニルｔＲＮＡシンセターゼタンパク質に対する最大の相
同性を示す。図２［配列番号２］のトリプトファニルｔ
ＲＮＡシンセターゼは、バシラス・サチリスのトリプト
ファニルｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドのアミノ酸
配列と、全長で約６５％の同一性、および全長にわたり
約８２％の類似性を有する。本発明の配列はまた、図１
［配列番号１］のコーディング配列と全長にわたり同一
であってもよい。
［配列番号１］に示す。これは当該分野で周知のアミノ
酸残基分子量を用いて算出できる推定分子量を有する、
図２［配列番号２］に示すものとほぼ同数のアミノ酸残
基を有するタンパク質をコードする読み取り枠を含有す
る。本発明のトリプトファニルｔＲＮＡシンセターゼ
は、寄託株のｔＲＮＡシンセターゼをコードするＤＮＡ
の配列決定の結果により示されるように、ｔＲＮＡシン
セターゼファミリーの他のタンパク質に構造的に関連し
ている。該タンパク質は、既知のタンパク質の中でバシ
ラス・サチリス（Ｂacillus sabtilis）のトリプトファ
ニルｔＲＮＡシンセターゼタンパク質に対する最大の相
同性を示す。図２［配列番号２］のトリプトファニルｔ
ＲＮＡシンセターゼは、バシラス・サチリスのトリプト
ファニルｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドのアミノ酸
配列と、全長で約６５％の同一性、および全長にわたり
約８２％の類似性を有する。本発明の配列はまた、図１
［配列番号１］のコーディング配列と全長にわたり同一
であってもよい。
【００２２】本発明はまた、成熟ポリペプチドまたはそ
れらのフラグメントのコーディング配列、ならびに単独
で他のコーディング配列を有する読み取り枠の成熟ポリ
ペプチドまたはフラグメントについてのコーディング配
列、例えばリーダーまたは分泌配列、プレ−、プロ−、
プレプロ−タンパク質配列をコードするコーディング配
列をも提供する。ポリヌクレオチドは、例えば、転写さ
れた非翻訳配列、停止シグナル、リボソーム結合部位、
ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン、ポリアデニル化シグ
ナル、および付加アミノ酸をコードする付加コーディン
グ配列などの非コーディング５'および３'配列などの非
コーディング配列をも含有しうるが、これらに限定する
のではない。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易に
するマーカー配列をコードすることができる。本発明の
この態様のある好ましい具体例において、マーカー配列
は、ｐＱＥベクター（キアゲン・インコーポレーテッ
ド）に提供されるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド
（Gentzら、Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 86:821-824
(1989) に記載される）またはＨＡタグ（Wilsonら、Cel
l, 37:767 (1984)）である。本発明のポリヌクレオチド
はまた、構造遺伝子および遺伝子発現を調節するその天
然において関連した配列をも含むが、これらに限定する
ものではない。
れらのフラグメントのコーディング配列、ならびに単独
で他のコーディング配列を有する読み取り枠の成熟ポリ
ペプチドまたはフラグメントについてのコーディング配
列、例えばリーダーまたは分泌配列、プレ−、プロ−、
プレプロ−タンパク質配列をコードするコーディング配
列をも提供する。ポリヌクレオチドは、例えば、転写さ
れた非翻訳配列、停止シグナル、リボソーム結合部位、
ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン、ポリアデニル化シグ
ナル、および付加アミノ酸をコードする付加コーディン
グ配列などの非コーディング５'および３'配列などの非
コーディング配列をも含有しうるが、これらに限定する
のではない。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易に
するマーカー配列をコードすることができる。本発明の
この態様のある好ましい具体例において、マーカー配列
は、ｐＱＥベクター（キアゲン・インコーポレーテッ
ド）に提供されるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド
（Gentzら、Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 86:821-824
(1989) に記載される）またはＨＡタグ（Wilsonら、Cel
l, 37:767 (1984)）である。本発明のポリヌクレオチド
はまた、構造遺伝子および遺伝子発現を調節するその天
然において関連した配列をも含むが、これらに限定する
ものではない。
【００２３】前述によれば、本明細書で用いる「ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明のポリペプチド、とりわけ図２［配列番号２］に示
すアミノ酸配列を有する細菌性の、さらに詳細にはスタ
フィロコッカス・アウレウスｔＲＮＡシンセターゼをコ
ードする配列を含有するポリヌクレオチド包含する。こ
の用語はまた、付加領域と一緒になった、ポリペプチド
をコードする単一の連続領域または不連続領域（例え
ば、組み込まれたファージもしくは挿入配列または修正
により分断される）、さらにはコーディングおよび／ま
たは非コーディング配列をも含有し得るポリヌクレオチ
ドをも包含する。本発明はさらに、図２［配列番号２］
の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変種をコー
ドする、本明細書で上述したポリヌクレオチドの変種に
関する。
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明のポリペプチド、とりわけ図２［配列番号２］に示
すアミノ酸配列を有する細菌性の、さらに詳細にはスタ
フィロコッカス・アウレウスｔＲＮＡシンセターゼをコ
ードする配列を含有するポリヌクレオチド包含する。こ
の用語はまた、付加領域と一緒になった、ポリペプチド
をコードする単一の連続領域または不連続領域（例え
ば、組み込まれたファージもしくは挿入配列または修正
により分断される）、さらにはコーディングおよび／ま
たは非コーディング配列をも含有し得るポリヌクレオチ
ドをも包含する。本発明はさらに、図２［配列番号２］
の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変種をコー
ドする、本明細書で上述したポリヌクレオチドの変種に
関する。
【００２４】さらに、特に好ましい具体例は、図２［配
列番号２］に示すｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドの
アミノ酸配列にいくつか、少しの、５〜１０、１〜５、
１〜３、２、１または０個のアミノ酸残基を置換、欠失
または付加を任意の組み合わせて施したアミノ酸配列を
有するｔＲＮＡシンセターゼ変種をコードするポリヌク
レオチドである。中でもとりわけ好ましいものは、ｔＲ
ＮＡシンセターゼの特性および活性を変化させないサイ
レント置換、付加および欠失である。本発明のさらに好
ましい具体例は、図２［配列番号２］に示すアミノ酸配
列を有するｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド、およびこのようなポリヌクレオ
チドに相補的なポリヌクレオチドに対し、全長にわたり
少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチドである。
また別に、最も好ましいポリヌクレオチドは、寄託株の
スタフィロコッカス・アウレウスＤＮＡのｔＲＮＡシン
セターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
およびそれらに相補的なポリヌクレオチドに対し、全長
にわたり少なくとも８０％同一である領域を含むポリヌ
クレオチドである。これに関して、寄託株のスタフィロ
コッカス・アウレウスＤＮＡのｔＲＮＡシンセターゼポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそれ
らに相補的なポリヌクレオチドに対し、全長にわたり少
なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドがとりわけ
好ましく、これらのとりわけ好ましいポリヌクレオチド
の中でも少なくとも９５％の同一性を有するものが特に
好ましい。さらにまた、少なくとも９５％の同一性を有
するものの中でも少なくとも９７％であるものがより好
ましく、これらの中でも少なくとも９８％および少なく
とも９９％であるものがとりわけ非常に好ましく、さら
に少なくとも９９％であるものがより好ましい。
列番号２］に示すｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドの
アミノ酸配列にいくつか、少しの、５〜１０、１〜５、
１〜３、２、１または０個のアミノ酸残基を置換、欠失
または付加を任意の組み合わせて施したアミノ酸配列を
有するｔＲＮＡシンセターゼ変種をコードするポリヌク
レオチドである。中でもとりわけ好ましいものは、ｔＲ
ＮＡシンセターゼの特性および活性を変化させないサイ
レント置換、付加および欠失である。本発明のさらに好
ましい具体例は、図２［配列番号２］に示すアミノ酸配
列を有するｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド、およびこのようなポリヌクレオ
チドに相補的なポリヌクレオチドに対し、全長にわたり
少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチドである。
また別に、最も好ましいポリヌクレオチドは、寄託株の
スタフィロコッカス・アウレウスＤＮＡのｔＲＮＡシン
セターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
およびそれらに相補的なポリヌクレオチドに対し、全長
にわたり少なくとも８０％同一である領域を含むポリヌ
クレオチドである。これに関して、寄託株のスタフィロ
コッカス・アウレウスＤＮＡのｔＲＮＡシンセターゼポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそれ
らに相補的なポリヌクレオチドに対し、全長にわたり少
なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドがとりわけ
好ましく、これらのとりわけ好ましいポリヌクレオチド
の中でも少なくとも９５％の同一性を有するものが特に
好ましい。さらにまた、少なくとも９５％の同一性を有
するものの中でも少なくとも９７％であるものがより好
ましく、これらの中でも少なくとも９８％および少なく
とも９９％であるものがとりわけ非常に好ましく、さら
に少なくとも９９％であるものがより好ましい。
【００２５】これに関するとりわけ好ましい具体例は、
さらに、図１［配列番号１］のＤＮＡによりコードされ
る成熟ポリペプチドと同一の生物学的機能または活性を
実質的に保持するポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドである。本発明は、さらに本明細書で上述した配
列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。こ
れに関して、本発明は、特に、厳密な条件下で本明細書
で上述したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドに関する。本明細書で用いる場合、「厳密
な条件」および「厳密なハイブリダイゼーション条件」
なる用語は、ハイブリダイゼーションが配列間の同一性
が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％であ
る場合のみに起こることを意味する。厳密なハイブリダ
イゼーション条件の例としては、５０％ホルムアミド、
５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮaＣl、１５ｍＭ クエン酸三
ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（pＨ７.
６）、５ｘデンハーツ溶液、１０％硫酸デキストラン、
および２０μg／mlの、変性され剪断されたサケ精子Ｄ
ＮＡを含有する溶液中、４２℃で一晩インキュベート
し、続いて約６５℃で０.１ｘＳＳＣ中フィルターを洗
浄するものが挙げられる。ハイブリダイゼーションおよ
び洗浄条件は周知であり、Sambrookら、Molecular Clon
ing, A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリ
ング・ハーバー、ニューヨーク (1989）、とりわけその
第１１章に例示されている（引用して本明細書の記載と
する）。
さらに、図１［配列番号１］のＤＮＡによりコードされ
る成熟ポリペプチドと同一の生物学的機能または活性を
実質的に保持するポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドである。本発明は、さらに本明細書で上述した配
列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。こ
れに関して、本発明は、特に、厳密な条件下で本明細書
で上述したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドに関する。本明細書で用いる場合、「厳密
な条件」および「厳密なハイブリダイゼーション条件」
なる用語は、ハイブリダイゼーションが配列間の同一性
が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％であ
る場合のみに起こることを意味する。厳密なハイブリダ
イゼーション条件の例としては、５０％ホルムアミド、
５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮaＣl、１５ｍＭ クエン酸三
ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（pＨ７.
６）、５ｘデンハーツ溶液、１０％硫酸デキストラン、
および２０μg／mlの、変性され剪断されたサケ精子Ｄ
ＮＡを含有する溶液中、４２℃で一晩インキュベート
し、続いて約６５℃で０.１ｘＳＳＣ中フィルターを洗
浄するものが挙げられる。ハイブリダイゼーションおよ
び洗浄条件は周知であり、Sambrookら、Molecular Clon
ing, A Laboratory Manual、第２版；コールド・スプリ
ング・ハーバー、ニューヨーク (1989）、とりわけその
第１１章に例示されている（引用して本明細書の記載と
する）。
【００２６】本発明はまた、本質的に、厳密なハイブリ
ダイゼーション条件下で配列番号１に示すポリヌクレオ
チド配列について完全遺伝子を含有する適当なライブラ
リーを、配列番号１に示すポリヌクレオチド配列の配列
またはその断片を有するプローブでスクリーニングし、
該ＤＮＡ配列を単離することにより得られるポリヌクレ
オチド配列からなるポリヌクレオチドを提供するもので
もある。このようなポリヌクレオチドを得るために有用
なフラグメントとしては、例えば本明細書に別に記載す
るプローブおよびプライマーなどが挙げられる。本発明
のポリヌクレオチドアッセイに関してここでさらに論じ
るが、例えば上述の本発明のポリヌクレオチドをＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡについてのハイブリダ
イゼーションプローブとして用いて、ｔＲＮＡシンセタ
ーゼをコードするｃＤＮＡ全長およびゲノムクローンを
単離し、ｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子に高度な配列類似
性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローン
を単離することができる。このようなプローブは、通
常、少なくとも１５塩基を含む。好ましくは、このよう
なプローブは、少なくとも３０塩基を有し、少なくとも
５０塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプロー
ブは、少なくとも３０塩基を有し、５０塩基以下であ
る。
ダイゼーション条件下で配列番号１に示すポリヌクレオ
チド配列について完全遺伝子を含有する適当なライブラ
リーを、配列番号１に示すポリヌクレオチド配列の配列
またはその断片を有するプローブでスクリーニングし、
該ＤＮＡ配列を単離することにより得られるポリヌクレ
オチド配列からなるポリヌクレオチドを提供するもので
もある。このようなポリヌクレオチドを得るために有用
なフラグメントとしては、例えば本明細書に別に記載す
るプローブおよびプライマーなどが挙げられる。本発明
のポリヌクレオチドアッセイに関してここでさらに論じ
るが、例えば上述の本発明のポリヌクレオチドをＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡについてのハイブリダ
イゼーションプローブとして用いて、ｔＲＮＡシンセタ
ーゼをコードするｃＤＮＡ全長およびゲノムクローンを
単離し、ｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子に高度な配列類似
性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローン
を単離することができる。このようなプローブは、通
常、少なくとも１５塩基を含む。好ましくは、このよう
なプローブは、少なくとも３０塩基を有し、少なくとも
５０塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプロー
ブは、少なくとも３０塩基を有し、５０塩基以下であ
る。
【００２７】例えば、ｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子のコ
ーディング領域は、既知ＤＮＡ配列を用いてオリゴヌク
レオチドプローブを合成し、スクリーニングすることに
より単離できる。次いで、本発明の遺伝子の配列に相補
的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを用いて、
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリー
をスクリーニングし、プローブがハイブリダイズするラ
イブラリーのメンバーを決定する。本発明のポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドは、疾患、とりわけヒトの疾
患の処置法および診断法の発見のために研究試薬および
材料として使用でき、とりわけポリヌクレオチドアッセ
イに関連して本明細書でさらに論じる。オリゴヌクレオ
チドである本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１お
よび２の配列に由来する配列番号３および４を含み、本
明細書に記載する方法に使用できるが、ＰＣＲに用いる
のが好ましく、本明細書で同定したポリヌクレオチドの
全てまたは一部が感染した組織に転写されるか否かを決
定する。このような配列が、病原体が達成した感染の段
階および感染の型の診断にも有用であることが理解され
る。
ーディング領域は、既知ＤＮＡ配列を用いてオリゴヌク
レオチドプローブを合成し、スクリーニングすることに
より単離できる。次いで、本発明の遺伝子の配列に相補
的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを用いて、
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリー
をスクリーニングし、プローブがハイブリダイズするラ
イブラリーのメンバーを決定する。本発明のポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドは、疾患、とりわけヒトの疾
患の処置法および診断法の発見のために研究試薬および
材料として使用でき、とりわけポリヌクレオチドアッセ
イに関連して本明細書でさらに論じる。オリゴヌクレオ
チドである本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１お
よび２の配列に由来する配列番号３および４を含み、本
明細書に記載する方法に使用できるが、ＰＣＲに用いる
のが好ましく、本明細書で同定したポリヌクレオチドの
全てまたは一部が感染した組織に転写されるか否かを決
定する。このような配列が、病原体が達成した感染の段
階および感染の型の診断にも有用であることが理解され
る。
【００２８】ポリヌクレオチドは、付加アミノ酸もしく
はカルボキシル末端アミノ酸または成熟ポリペプチドに
内在するアミノ酸を加えた成熟タンパク質であるポリペ
プチドをコードできる（例えば成熟形態が一つ以上のポ
リペプチド鎖を有する場合）。このような配列は、前駆
体から成熟形態へのタンパク質のプロセシングにおいて
役割を果たし、タンパク質輸送を可能にし、タンパク質
の半減期を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッセ
イもしくは製造のためのタンパク質の操作を容易にする
ことができる。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸
は、細胞の酵素により処理され、成熟タンパク質から取
り除かれる。１またはそれ以上のプロ配列と融合したポ
リペプチドの成熟形態を有する前駆タンパク質は、ポリ
ペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去
されると、このような不活性前駆体が通常活性化され
る。プロ配列のいくつかまたは全てを活性化の前に除去
できる。通常、このような前駆体はプロタンパク質と称
される。
はカルボキシル末端アミノ酸または成熟ポリペプチドに
内在するアミノ酸を加えた成熟タンパク質であるポリペ
プチドをコードできる（例えば成熟形態が一つ以上のポ
リペプチド鎖を有する場合）。このような配列は、前駆
体から成熟形態へのタンパク質のプロセシングにおいて
役割を果たし、タンパク質輸送を可能にし、タンパク質
の半減期を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッセ
イもしくは製造のためのタンパク質の操作を容易にする
ことができる。一般的にインビボの場合、付加アミノ酸
は、細胞の酵素により処理され、成熟タンパク質から取
り除かれる。１またはそれ以上のプロ配列と融合したポ
リペプチドの成熟形態を有する前駆タンパク質は、ポリ
ペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去
されると、このような不活性前駆体が通常活性化され
る。プロ配列のいくつかまたは全てを活性化の前に除去
できる。通常、このような前駆体はプロタンパク質と称
される。
【００２９】要するに、本発明のポリヌクレオチドは、
成熟タンパク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク質
（プレタンパク質と称することができる）、プレタンパ
ク質のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配
列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配
列および１またはそれ以上のプロ配列を有するプロタン
パク質の前駆体であるプレプロタンパク質をコードで
き、プロ配列は通常ポリペプチドの活性および成熟形態
を生じるプロセシング段階で除去される。 ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクタ
ー、本発明のベクターで遺伝子操作する宿主細胞および
組換え技法による本発明のポリペプチドの製造にも関す
る。無細胞翻訳系を用い、本発明のＤＮＡ構築物に由来
するＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を製造するこ
ともできる。組換え体を製造するために、宿主細胞は、
遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、または
本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。ポ
リヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davis
ら、BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986)；Sa
mbrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、
第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク（1989）のように、多くの標準的な実験マニュア
ルに記載される方法により行うことができ、例えばリン
酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキス
トラン媒介トランスフェクション、トランスベクショ
ン、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介ト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、トラン
スダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入お
よび感染などがある。
成熟タンパク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク質
（プレタンパク質と称することができる）、プレタンパ
ク質のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配
列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配
列および１またはそれ以上のプロ配列を有するプロタン
パク質の前駆体であるプレプロタンパク質をコードで
き、プロ配列は通常ポリペプチドの活性および成熟形態
を生じるプロセシング段階で除去される。 ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクタ
ー、本発明のベクターで遺伝子操作する宿主細胞および
組換え技法による本発明のポリペプチドの製造にも関す
る。無細胞翻訳系を用い、本発明のＤＮＡ構築物に由来
するＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を製造するこ
ともできる。組換え体を製造するために、宿主細胞は、
遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、または
本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。ポ
リヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davis
ら、BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986)；Sa
mbrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、
第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク（1989）のように、多くの標準的な実験マニュア
ルに記載される方法により行うことができ、例えばリン
酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキス
トラン媒介トランスフェクション、トランスベクショ
ン、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介ト
ランスフェクション、エレクトロポレーション、トラン
スダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入お
よび感染などがある。
【００３０】適当な宿主の代表的な例としては、細菌細
胞、例えばストレプトコッカス細胞、スタフィロコッカ
ス細胞、イー・コリ（Ｅ．coli）細胞、ストレプトミセ
ス細胞およびバシラス・サチリス細胞；真菌細胞、例え
ば酵母細胞およびアスペルギルス（Ａspergillus）細
胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Ｄrosophila
Ｓ２）細胞およびスポドプテラＳｆ９（Ｓpodoptera Ｓ
ｆ９）細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬ
ａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ
（Ｂows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞などが挙げら
れる。非常に多くの発現系を用いて、本発明のポリペプ
チドを製造することができる。このようなベクターとし
ては、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由
来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオ
ファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由
来、インサートエレメント由来、酵母染色体エレメント
由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例え
ばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏
痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス
などのウイルス由来のベクター、ならびにそれらを組み
合わせた物に由来するベクター、例えばプラスミドおよ
びバクテリオファージ遺伝学的エレメント由来のベクタ
ー、例えばコスミドおよびファージミドなどが挙げられ
る。発現系の構築物は、発現を制御および引き起こす調
節領域を含有できる。通常、宿主中にポリヌクレオチド
を保持、伸長または発現するのに、および／またはポリ
ペプチドを発現するのに適したいずれの系またはベクタ
ーをも、この点に関する発現に使用できる。種々の周知
かつ慣用的な技術のいずれか（例えばSambrookら、MOLE
CULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL（上述）に記載さ
れている技術）により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿
入できる。
胞、例えばストレプトコッカス細胞、スタフィロコッカ
ス細胞、イー・コリ（Ｅ．coli）細胞、ストレプトミセ
ス細胞およびバシラス・サチリス細胞；真菌細胞、例え
ば酵母細胞およびアスペルギルス（Ａspergillus）細
胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Ｄrosophila
Ｓ２）細胞およびスポドプテラＳｆ９（Ｓpodoptera Ｓ
ｆ９）細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬ
ａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ
（Ｂows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞などが挙げら
れる。非常に多くの発現系を用いて、本発明のポリペプ
チドを製造することができる。このようなベクターとし
ては、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由
来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオ
ファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由
来、インサートエレメント由来、酵母染色体エレメント
由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例え
ばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏
痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス
などのウイルス由来のベクター、ならびにそれらを組み
合わせた物に由来するベクター、例えばプラスミドおよ
びバクテリオファージ遺伝学的エレメント由来のベクタ
ー、例えばコスミドおよびファージミドなどが挙げられ
る。発現系の構築物は、発現を制御および引き起こす調
節領域を含有できる。通常、宿主中にポリヌクレオチド
を保持、伸長または発現するのに、および／またはポリ
ペプチドを発現するのに適したいずれの系またはベクタ
ーをも、この点に関する発現に使用できる。種々の周知
かつ慣用的な技術のいずれか（例えばSambrookら、MOLE
CULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL（上述）に記載さ
れている技術）により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿
入できる。
【００３１】翻訳タンパク質を、小胞体内腔、ペリプラ
スミックスペースまたは細胞外環境へ分泌するために、
適当な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込む
ことができる。これらのシグナルはポリペプチドに対し
て内在性であってもよく、あるいは異種性のシグナルで
もよい。本発明のポリペプチドは、例えば硫酸アンモニ
ウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽
イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、
親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトク
ロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを
含む周知の方法により、組換え細胞培養物から回収およ
び精製することができる。精製のために高速液体クロマ
トグラフィーを用いるのが最も好ましい。ポリペプチド
が単離および／または精製中に変性した場合、タンパク
質再生のための周知の技法を用いて、再び活性な立体配
座にすることができる。 診断アッセイ 本発明はまた診断試薬として使用するための本発明のｔ
ＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドの使用にも関す
る。真核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるｔ
ＲＮＡシンセターゼの検出は、疾患の診断のための診断
法を提供する。真核生物（本明細書において「個体」と
も称する）、とりわけ哺乳動物、特にヒトがｔＲＮＡシ
ンセターゼ遺伝子を含む生物に感染すると、種々の方法
によりＤＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸は、感
染した個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、
軟骨および皮膚より得ることができる。ゲノムＤＮＡを
用いて、直接的に検出することができるか、または分析
の前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いることによ
り酵素的に増幅できる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同
じ方法で用いることができる。増幅法を用いると、真核
生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトに存在する原核生物
の株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づ
けすることができる。対照配列の遺伝子型に比較した増
幅産物の大きさの変化により、欠失および挿入を検出で
きる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識化ｔＲＮＡシン
セターゼポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするこ
とにより同定できる。完全に対合した配列はＲＮａｓｅ
消化により、または融解温度の差により、ミスマッチ二
重らせんと区別できる。ＤＮＡ配列の差は、また、変性
剤を伴うまたは伴わないゲル中のＤＮＡフラグメントの
電気泳動の移動度の変化により、または直接的なＤＮＡ
の配列決定により検出できる。例えばMeyersら、Scienc
e, 230: 1242 (1985) を参照。特異的な位置での配列の
変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮａ
ｓｅおよびＳ１保護または化学的切断法によっても明ら
かにすることができる。例えばCottonら、Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401 (1985) を参照。
スミックスペースまたは細胞外環境へ分泌するために、
適当な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込む
ことができる。これらのシグナルはポリペプチドに対し
て内在性であってもよく、あるいは異種性のシグナルで
もよい。本発明のポリペプチドは、例えば硫酸アンモニ
ウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽
イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、
親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトク
ロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを
含む周知の方法により、組換え細胞培養物から回収およ
び精製することができる。精製のために高速液体クロマ
トグラフィーを用いるのが最も好ましい。ポリペプチド
が単離および／または精製中に変性した場合、タンパク
質再生のための周知の技法を用いて、再び活性な立体配
座にすることができる。 診断アッセイ 本発明はまた診断試薬として使用するための本発明のｔ
ＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドの使用にも関す
る。真核生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるｔ
ＲＮＡシンセターゼの検出は、疾患の診断のための診断
法を提供する。真核生物（本明細書において「個体」と
も称する）、とりわけ哺乳動物、特にヒトがｔＲＮＡシ
ンセターゼ遺伝子を含む生物に感染すると、種々の方法
によりＤＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸は、感
染した個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、
軟骨および皮膚より得ることができる。ゲノムＤＮＡを
用いて、直接的に検出することができるか、または分析
の前にＰＣＲもしくはその他の増幅法を用いることによ
り酵素的に増幅できる。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同
じ方法で用いることができる。増幅法を用いると、真核
生物、とりわけ哺乳動物、特にヒトに存在する原核生物
の株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づ
けすることができる。対照配列の遺伝子型に比較した増
幅産物の大きさの変化により、欠失および挿入を検出で
きる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識化ｔＲＮＡシン
セターゼポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするこ
とにより同定できる。完全に対合した配列はＲＮａｓｅ
消化により、または融解温度の差により、ミスマッチ二
重らせんと区別できる。ＤＮＡ配列の差は、また、変性
剤を伴うまたは伴わないゲル中のＤＮＡフラグメントの
電気泳動の移動度の変化により、または直接的なＤＮＡ
の配列決定により検出できる。例えばMeyersら、Scienc
e, 230: 1242 (1985) を参照。特異的な位置での配列の
変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮａ
ｓｅおよびＳ１保護または化学的切断法によっても明ら
かにすることができる。例えばCottonら、Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401 (1985) を参照。
【００３２】本発明遺伝子の突然変異または多型性を担
持する細胞はまた、種々の技術により、ＤＮＡレベル
で、例えばセロタイピングすることにより検出できる。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、突然変異を検出するこ
とができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばＧene
Ｓcan等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。
ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ目的で、ＰＣＲまたは
ＲＴ−ＰＣＲに用いることができる。例を挙げると、ｔ
ＲＮＡシンセターゼをコードする核酸に相補的なＰＣＲ
プライマーを用いて、突然変異を同定および分析するこ
とができる。これらのプライマーは、個体に由来するサ
ンプルから単離したｔＲＮＡシンセターゼＤＮＡを増幅
するために用いてもよい。本発明はまた、５'および／
または３'末端から取り出した１、２、３または４ヌク
レオチドを有する表１のこれらのプライマーを提供する
ものでもある。該プライマーを用いて、感染した個体か
ら単離した遺伝子を増幅することができ、次いで、該遺
伝子を、ＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供する
ことができる。このように、ＤＮＡ配列における突然変
異を検出し、これを用いて、感染を診断し、感染性物質
のセロタイピングまたは分類することができる。
持する細胞はまた、種々の技術により、ＤＮＡレベル
で、例えばセロタイピングすることにより検出できる。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、突然変異を検出するこ
とができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばＧene
Ｓcan等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。
ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ目的で、ＰＣＲまたは
ＲＴ−ＰＣＲに用いることができる。例を挙げると、ｔ
ＲＮＡシンセターゼをコードする核酸に相補的なＰＣＲ
プライマーを用いて、突然変異を同定および分析するこ
とができる。これらのプライマーは、個体に由来するサ
ンプルから単離したｔＲＮＡシンセターゼＤＮＡを増幅
するために用いてもよい。本発明はまた、５'および／
または３'末端から取り出した１、２、３または４ヌク
レオチドを有する表１のこれらのプライマーを提供する
ものでもある。該プライマーを用いて、感染した個体か
ら単離した遺伝子を増幅することができ、次いで、該遺
伝子を、ＤＮＡ配列を調べるための種々の技法に供する
ことができる。このように、ＤＮＡ配列における突然変
異を検出し、これを用いて、感染を診断し、感染性物質
のセロタイピングまたは分類することができる。
【００３３】本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感
染、さらに好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス
による感染、最も好ましくは上気道感染（例えば、中耳
炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下気道
感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍)、心臓感染（例えば、
感染性心内膜炎）、消化器感染（例えば、分泌性下痢、
脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、大脳膿
瘍）、眼感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内
炎、前中隔（preseptal）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、
腎および尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周
囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例え
ば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細
菌性筋炎）、ならびに骨および関節感染（例えば、敗血
症性関節炎、骨髄炎）などの疾患の診断方法であって、
図１［配列番号１］の配列を有するポリヌクレオチドの
発現レベルの上昇を個体由来のサンプルから決定するこ
とを含む診断方法を提供するものである。ｔＲＮＡシン
セターゼポリヌクレオチドの発現の増加または減少は、
ポリヌクレオチドの定量について当該技術分野で周知の
方法のいずれか１つ、例えば、増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−Ｐ
ＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロッティングおよび
その他のハイブリダイゼーション法を用いて測定するこ
とができる。
染、さらに好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス
による感染、最も好ましくは上気道感染（例えば、中耳
炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下気道
感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍)、心臓感染（例えば、
感染性心内膜炎）、消化器感染（例えば、分泌性下痢、
脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、大脳膿
瘍）、眼感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内
炎、前中隔（preseptal）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、
腎および尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周
囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例え
ば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細
菌性筋炎）、ならびに骨および関節感染（例えば、敗血
症性関節炎、骨髄炎）などの疾患の診断方法であって、
図１［配列番号１］の配列を有するポリヌクレオチドの
発現レベルの上昇を個体由来のサンプルから決定するこ
とを含む診断方法を提供するものである。ｔＲＮＡシン
セターゼポリヌクレオチドの発現の増加または減少は、
ポリヌクレオチドの定量について当該技術分野で周知の
方法のいずれか１つ、例えば、増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−Ｐ
ＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロッティングおよび
その他のハイブリダイゼーション法を用いて測定するこ
とができる。
【００３４】さらに、正常対照組織サンプルと比較した
ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質の過剰発現を検出する
ための本発明の診断アッセイを用いて、例えば、感染の
存在を検出することができる。宿主由来のサンプル中の
ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質のレベルを決定するた
めに用いることができるアッセイ技法は、当業者に周知
である。このようなアッセイ法としては、ラジオイムノ
アッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析
およびＥＬＩＳＡアッセイなどが挙げられる。
ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質の過剰発現を検出する
ための本発明の診断アッセイを用いて、例えば、感染の
存在を検出することができる。宿主由来のサンプル中の
ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質のレベルを決定するた
めに用いることができるアッセイ技法は、当業者に周知
である。このようなアッセイ法としては、ラジオイムノ
アッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析
およびＥＬＩＳＡアッセイなどが挙げられる。
【００３５】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそ
れらを発現する細胞を免疫原として用いて、このような
ポリペプチドに対して免疫特異的な抗体を産生すること
ができる。本明細書で用いる場合、「抗体」としては、
モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ、一
本鎖、サル化抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ免
疫グロブリン発現ライブラリーの生成物などのＦａｂフ
ラグメントなどが挙げられる。本発明のポリペプチドに
対して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープが
付いたフラグメント、アナログまたは細胞を、動物、好
ましくはヒトはでない動物に、慣用のプロトコールを用
いて投与することにより得ることができる。連続的細胞
系培養により産生される抗体を提供する、当該技術分野
で周知の技術を用いて、モノクローナル抗体を調製する
ことができる。実例としては、Kohler,G.およびMilstei
n, C., Nature, 256: 495-497 (1975)；Kozborら、Immu
nologyToday, 4: 72 (1983)；Coleら、MONOCLONAL ANTI
BODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc.、77-
96頁 (1985) に記載されるような種々の技法がある。
れらを発現する細胞を免疫原として用いて、このような
ポリペプチドに対して免疫特異的な抗体を産生すること
ができる。本明細書で用いる場合、「抗体」としては、
モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ、一
本鎖、サル化抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ免
疫グロブリン発現ライブラリーの生成物などのＦａｂフ
ラグメントなどが挙げられる。本発明のポリペプチドに
対して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープが
付いたフラグメント、アナログまたは細胞を、動物、好
ましくはヒトはでない動物に、慣用のプロトコールを用
いて投与することにより得ることができる。連続的細胞
系培養により産生される抗体を提供する、当該技術分野
で周知の技術を用いて、モノクローナル抗体を調製する
ことができる。実例としては、Kohler,G.およびMilstei
n, C., Nature, 256: 495-497 (1975)；Kozborら、Immu
nologyToday, 4: 72 (1983)；Coleら、MONOCLONAL ANTI
BODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc.、77-
96頁 (1985) に記載されるような種々の技法がある。
【００３６】一本鎖抗体の産生についての技術（米国特
許第４,９４６,７７８号）を適用して、本発明のポリペ
プチドに対する一本鎖抗体を産生することができる。ま
た、トランスジェニックマウスまたは他の生物、例え
ば、他の哺乳動物を用いて、ヒト化抗体を発現すること
ができる。別法としては、ファージディスプレイ技法を
用いて、抗Ｆｂｐプロセシングについてスクリーニング
したヒト由来のリンパ球のＰＣＲ増幅したｖ遺伝子のレ
パートリー由来の、または無処理ライブラリー由来のポ
リペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選別
することができる（McCafferty, J.ら、Nature 348, 55
2-554 (1990)；Marks, J.ら、Biotechnology 10, 779-7
83 (1992)）。これらの抗体の親和性はまた、チェイン
シャフリング（chain shuffling）により改善すること
もできる（Clackson, T.ら、Nature 352, 624-628 (199
1)）。
許第４,９４６,７７８号）を適用して、本発明のポリペ
プチドに対する一本鎖抗体を産生することができる。ま
た、トランスジェニックマウスまたは他の生物、例え
ば、他の哺乳動物を用いて、ヒト化抗体を発現すること
ができる。別法としては、ファージディスプレイ技法を
用いて、抗Ｆｂｐプロセシングについてスクリーニング
したヒト由来のリンパ球のＰＣＲ増幅したｖ遺伝子のレ
パートリー由来の、または無処理ライブラリー由来のポ
リペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選別
することができる（McCafferty, J.ら、Nature 348, 55
2-554 (1990)；Marks, J.ら、Biotechnology 10, 779-7
83 (1992)）。これらの抗体の親和性はまた、チェイン
シャフリング（chain shuffling）により改善すること
もできる（Clackson, T.ら、Nature 352, 624-628 (199
1)）。
【００３７】二つの抗原結合ドメインが存在する場合、
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。上述の抗体を用いて、ポリペプ
チドを発現するクローンを単離または同定することがで
き、親和性クロマトグラフィーにより該ポリペプチドを
精製することができる。したがって、とりわけｔＲＮＡ
シンセターゼに対する抗体を用いて、感染、とりわけ細
菌感染、特に上気道感染（例えば、中耳炎、細菌性気管
炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道感染（例えば、
蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば、感染性心内膜
炎）、消化器感染（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹
膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、大脳膿瘍）、眼感染
（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔
（preseptal）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および
尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、
トキシックショック症候群）、皮膚感染（例えば、膿痂
疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋
炎）、骨および関節感染（例えば、敗血症性関節炎、骨
髄炎）などの疾患を処置することができる。
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。上述の抗体を用いて、ポリペプ
チドを発現するクローンを単離または同定することがで
き、親和性クロマトグラフィーにより該ポリペプチドを
精製することができる。したがって、とりわけｔＲＮＡ
シンセターゼに対する抗体を用いて、感染、とりわけ細
菌感染、特に上気道感染（例えば、中耳炎、細菌性気管
炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道感染（例えば、
蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば、感染性心内膜
炎）、消化器感染（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹
膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、大脳膿瘍）、眼感染
（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔
（preseptal）および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および
尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、
トキシックショック症候群）、皮膚感染（例えば、膿痂
疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋
炎）、骨および関節感染（例えば、敗血症性関節炎、骨
髄炎）などの疾患を処置することができる。
【００３８】ポリペプチド変種としては、抗原的、エピ
トープ的または免疫学的に等価な変種などが挙げられ、
これは、本発明の特定の態様を形成する。本明細書で用
いる場合、「抗原的に等価な誘導体」なる用語は、本発
明によるタンパク質またはポリペプチドに対して生起さ
れた場合に病原体と哺乳動物宿主との間での即時的な物
理的相互作用を妨害するある種の抗体により特異的に認
識されるポリペプチドまたはその等価物を包含する。本
明細書で用いる場合、「免疫学的に等価な誘導体」なる
用語は、脊椎動物における抗体を生起させるのに適した
処方において用いた場合に抗体が病原体と哺乳動物宿主
との間での即時的な物理的相互作用を妨害するように作
用するペプチドまたはその等価物を包含する。ポリペプ
チド、例えば抗原的もしくは免疫学的に等価な誘導体、
またはそれらの融合タンパク質を抗原として用いて、マ
ウスまたは他の動物、例えばラットもしくはニワトリを
免疫化することができる。融合タンパク質は、ポリペプ
チドに安定性を付与できる。抗原は、例えばコンジュゲ
ーションにより、免疫原性キャリヤタンパク質、例えば
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リン
ペット・ヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin：
ＫＬＨ）と結合することができる。別法としては、タン
パク質もしくはポリペプチド、またはそれらの抗原的も
しくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピーを含
む多重抗原ペプチドは、免疫原性を改良するのに充分な
抗原性を有しているので、キャリヤを用いなくてすむ。
トープ的または免疫学的に等価な変種などが挙げられ、
これは、本発明の特定の態様を形成する。本明細書で用
いる場合、「抗原的に等価な誘導体」なる用語は、本発
明によるタンパク質またはポリペプチドに対して生起さ
れた場合に病原体と哺乳動物宿主との間での即時的な物
理的相互作用を妨害するある種の抗体により特異的に認
識されるポリペプチドまたはその等価物を包含する。本
明細書で用いる場合、「免疫学的に等価な誘導体」なる
用語は、脊椎動物における抗体を生起させるのに適した
処方において用いた場合に抗体が病原体と哺乳動物宿主
との間での即時的な物理的相互作用を妨害するように作
用するペプチドまたはその等価物を包含する。ポリペプ
チド、例えば抗原的もしくは免疫学的に等価な誘導体、
またはそれらの融合タンパク質を抗原として用いて、マ
ウスまたは他の動物、例えばラットもしくはニワトリを
免疫化することができる。融合タンパク質は、ポリペプ
チドに安定性を付与できる。抗原は、例えばコンジュゲ
ーションにより、免疫原性キャリヤタンパク質、例えば
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リン
ペット・ヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin：
ＫＬＨ）と結合することができる。別法としては、タン
パク質もしくはポリペプチド、またはそれらの抗原的も
しくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピーを含
む多重抗原ペプチドは、免疫原性を改良するのに充分な
抗原性を有しているので、キャリヤを用いなくてすむ。
【００３９】好ましくは、抗体またはそれらの変種を修
飾して、個体においてあまり免疫原性ではないようにす
る。例えば、個体がヒトである場合、抗体は、最も好ま
しくは「ヒト化」される；この場合、例えば、Jones,
P.ら、Nature 321, 522-525 (1986) またはTempestら、
Biotechnology 9, 266-273 (1991) に開示されているよ
うに、ハイブリドーマ由来の抗体の相補性決定領域は、
ヒトモノクローナル抗体に移植されてきた。本発明のポ
リヌクレオチドを遺伝学的免疫化において使用するに
は、例えばプラスミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolf
fら、Hum Mol Genet 1:363 (1992)；Manthorpeら、Hum.
Gene Ther. 4, 419 (1963)）、特異的タンパク質キャ
リヤとのＤＮＡ複合体の送達（Wuら、J. Biol. Chem. 2
64, 16985 (1989)）、リン酸カルシウムとのＤＮＡ共沈
（Benvenisty & Reshef、PNAS 83, 9551 (1986)）、種
々の形態のリポソーム中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Sc
ience 243, 375 (1989))、微粒子爆撃（Tangら、Nature
356:152 (1992)；Eisenbraunら、DNA Cell Biol. 12:7
91, (1993)）およびクローン化レトロウイルスベクター
を用いたインビボ感染（Seegerら、PNAS 81, 5849 (198
4)）などの適切なデリバリー方法を用いるのが好まし
い。
飾して、個体においてあまり免疫原性ではないようにす
る。例えば、個体がヒトである場合、抗体は、最も好ま
しくは「ヒト化」される；この場合、例えば、Jones,
P.ら、Nature 321, 522-525 (1986) またはTempestら、
Biotechnology 9, 266-273 (1991) に開示されているよ
うに、ハイブリドーマ由来の抗体の相補性決定領域は、
ヒトモノクローナル抗体に移植されてきた。本発明のポ
リヌクレオチドを遺伝学的免疫化において使用するに
は、例えばプラスミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolf
fら、Hum Mol Genet 1:363 (1992)；Manthorpeら、Hum.
Gene Ther. 4, 419 (1963)）、特異的タンパク質キャ
リヤとのＤＮＡ複合体の送達（Wuら、J. Biol. Chem. 2
64, 16985 (1989)）、リン酸カルシウムとのＤＮＡ共沈
（Benvenisty & Reshef、PNAS 83, 9551 (1986)）、種
々の形態のリポソーム中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Sc
ience 243, 375 (1989))、微粒子爆撃（Tangら、Nature
356:152 (1992)；Eisenbraunら、DNA Cell Biol. 12:7
91, (1993)）およびクローン化レトロウイルスベクター
を用いたインビボ感染（Seegerら、PNAS 81, 5849 (198
4)）などの適切なデリバリー方法を用いるのが好まし
い。
【００４０】また、本発明のポリペプチドを用いて、例
えば、細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、およ
び天然産物の混合物中の、小さな分子基質およびリガン
ドの結合を評価することもできる。これらの基質および
リガンドは、天然の基質およびリガンドでよく、または
構造的もしくは機能的擬似物質でもよい。例えば、Coli
ganら、Current Protocols in Immunology 1(2): 第５
章 (1991) を参照。 アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子 本発明はまた、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドまた
はポリヌクレオチドの作用を増強する化合物（アゴニス
ト）または阻害する化合物（アンタゴニスト）を同定す
るための、化合物のスクリーニング方法を提供するもの
でもある。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストを
スクリーニングするために、ｔＲＮＡシンセターゼポリ
ペプチドおよびかかるポリペプチドの標識基質を含んで
なる、合成反応混合物、細胞コンパートメント、例えば
膜、細胞表面膜もしくは細胞壁、またはそれらのいずれ
かの調製物を、ｔＲＮＡシンセターゼアゴニストまたは
アンタゴニストとなりうる候補分子の存在下または不在
下で、インキュベートする。候補分子がｔＲＮＡシンセ
ターゼポリペプチドをアゴナイズまたは拮抗する能力
は、標識化リガンドの結合の低下またはかかる基質から
の生成物の生産低下に反映される。結合しても影響を及
ぼさない分子、すなわちｔＲＮＡシンセターゼの効果を
誘起しない分子は、おそらく良好なアンタゴニストとで
あろう。結合性が良好であって、基質からの生成物の生
成速度を高める分子はアゴニストである。基質からの生
成物の生成速度またはレベルは、リポーターシステムを
用いることにより増強できる。これに関して有用なリポ
ーターシステムとしては、生成物に転換される比色標識
化基質、ｔＲＮＡシンセターゼ活性の変化に応答するリ
ポーター遺伝子、および当該技術分野で周知の結合アッ
セイなどが挙げられるが、これらに限定するものではな
い。
えば、細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、およ
び天然産物の混合物中の、小さな分子基質およびリガン
ドの結合を評価することもできる。これらの基質および
リガンドは、天然の基質およびリガンドでよく、または
構造的もしくは機能的擬似物質でもよい。例えば、Coli
ganら、Current Protocols in Immunology 1(2): 第５
章 (1991) を参照。 アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子 本発明はまた、ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドまた
はポリヌクレオチドの作用を増強する化合物（アゴニス
ト）または阻害する化合物（アンタゴニスト）を同定す
るための、化合物のスクリーニング方法を提供するもの
でもある。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストを
スクリーニングするために、ｔＲＮＡシンセターゼポリ
ペプチドおよびかかるポリペプチドの標識基質を含んで
なる、合成反応混合物、細胞コンパートメント、例えば
膜、細胞表面膜もしくは細胞壁、またはそれらのいずれ
かの調製物を、ｔＲＮＡシンセターゼアゴニストまたは
アンタゴニストとなりうる候補分子の存在下または不在
下で、インキュベートする。候補分子がｔＲＮＡシンセ
ターゼポリペプチドをアゴナイズまたは拮抗する能力
は、標識化リガンドの結合の低下またはかかる基質から
の生成物の生産低下に反映される。結合しても影響を及
ぼさない分子、すなわちｔＲＮＡシンセターゼの効果を
誘起しない分子は、おそらく良好なアンタゴニストとで
あろう。結合性が良好であって、基質からの生成物の生
成速度を高める分子はアゴニストである。基質からの生
成物の生成速度またはレベルは、リポーターシステムを
用いることにより増強できる。これに関して有用なリポ
ーターシステムとしては、生成物に転換される比色標識
化基質、ｔＲＮＡシンセターゼ活性の変化に応答するリ
ポーター遺伝子、および当該技術分野で周知の結合アッ
セイなどが挙げられるが、これらに限定するものではな
い。
【００４１】ｔＲＮＡシンセターゼアンタゴニストのア
ッセイの他の例は、競争阻害アッセイに適した条件下
で、ｔＲＮＡシンセターゼおよび潜在的なアンタゴニス
トをｔＲＮＡシンセターゼ結合分子、組換えｔＲＮＡシ
ンセターゼ結合分子、天然基質もしくはリガンド、また
は基質もしくはリガンド擬似物質と組み合わせる競争ア
ッセイである。ｔＲＮＡシンセターゼを、例えば放射活
性または比色化合物などにより標識化して、結合分子に
結合した、または生成物に変換したｔＲＮＡシンセター
ゼ分子の数を正確に決定して、潜在的なアンタゴニスト
の効果を評価することができる。さらなる態様におい
て、本発明は、トリプトファニルｔＲＮＡシンセターゼ
の相互作用を妨害する薬物を同定するための薬物スクリ
ーニング法を提供するものである。酵素により媒介され
る放射性標識化アミノ酸のｔＲＮＡへの組み込みは、ｔ
ＲＮＡおよびＡＴＰの存在下、アミノ酸−ｔＲＮＡを放
射性標識アミノ酸からのトリクロロ酢酸沈殿放射活性と
して測定するアミノアシル化法により測定され得る（Hu
ghes J.、Mellows G. および Soughton S.、FEBS Lette
rs 122:322-324 (1980)）。かくして、トリプトファニ
ルｔＲＮＡシンセターゼ阻害物質は、対照と比較して、
トリクロロ酢酸沈殿放射性活性の減少により検出するこ
とができる。また別に、ＰＰｉからの放射性標識化ＡＴ
Ｐの形成を測定する、部分ＰＰｉ／ＡＴＰ交換反応を触
媒するｔＲＮＡシンセターゼを用いて、トリプトファニ
ルｔＲＮＡシンセターゼ阻害物質を検出することができ
る（Calender R.& BergP.、Biochemistry 5, 1681-1690
(1966)）。
ッセイの他の例は、競争阻害アッセイに適した条件下
で、ｔＲＮＡシンセターゼおよび潜在的なアンタゴニス
トをｔＲＮＡシンセターゼ結合分子、組換えｔＲＮＡシ
ンセターゼ結合分子、天然基質もしくはリガンド、また
は基質もしくはリガンド擬似物質と組み合わせる競争ア
ッセイである。ｔＲＮＡシンセターゼを、例えば放射活
性または比色化合物などにより標識化して、結合分子に
結合した、または生成物に変換したｔＲＮＡシンセター
ゼ分子の数を正確に決定して、潜在的なアンタゴニスト
の効果を評価することができる。さらなる態様におい
て、本発明は、トリプトファニルｔＲＮＡシンセターゼ
の相互作用を妨害する薬物を同定するための薬物スクリ
ーニング法を提供するものである。酵素により媒介され
る放射性標識化アミノ酸のｔＲＮＡへの組み込みは、ｔ
ＲＮＡおよびＡＴＰの存在下、アミノ酸−ｔＲＮＡを放
射性標識アミノ酸からのトリクロロ酢酸沈殿放射活性と
して測定するアミノアシル化法により測定され得る（Hu
ghes J.、Mellows G. および Soughton S.、FEBS Lette
rs 122:322-324 (1980)）。かくして、トリプトファニ
ルｔＲＮＡシンセターゼ阻害物質は、対照と比較して、
トリクロロ酢酸沈殿放射性活性の減少により検出するこ
とができる。また別に、ＰＰｉからの放射性標識化ＡＴ
Ｐの形成を測定する、部分ＰＰｉ／ＡＴＰ交換反応を触
媒するｔＲＮＡシンセターゼを用いて、トリプトファニ
ルｔＲＮＡシンセターゼ阻害物質を検出することができ
る（Calender R.& BergP.、Biochemistry 5, 1681-1690
(1966)）。
【００４２】潜在的なアンタゴニストとしては、本発明
のポリペプチドに結合し、それによりその活性を阻害ま
たは消滅させる小さな有機分子、ペプチド、ポリペプチ
ドおよび抗体などが挙げられる。潜在的アンタゴニスト
はまた、結合分子の同一部位に結合する、密接に関連し
たタンパク質または抗体のような小さな有機分子、ペプ
チド、ポリペプチド、例えばｔＲＮＡシンセターゼ誘起
活性を誘起しない結合分子であってよく、それによりｔ
ＲＮＡシンセターゼを結合から排除して、ｔＲＮＡシン
セターゼの作用を妨げる。
のポリペプチドに結合し、それによりその活性を阻害ま
たは消滅させる小さな有機分子、ペプチド、ポリペプチ
ドおよび抗体などが挙げられる。潜在的アンタゴニスト
はまた、結合分子の同一部位に結合する、密接に関連し
たタンパク質または抗体のような小さな有機分子、ペプ
チド、ポリペプチド、例えばｔＲＮＡシンセターゼ誘起
活性を誘起しない結合分子であってよく、それによりｔ
ＲＮＡシンセターゼを結合から排除して、ｔＲＮＡシン
セターゼの作用を妨げる。
【００４３】潜在的なアンタゴニストとしては、ポリペ
プチドの結合部位に結合し、かつ該結合部位を占領し、
それにより細胞性結合分子への結合を防御して、正常な
生物学的活性を防御する小さな分子が挙げられる。小さ
な分子の例としては、小さな有機分子、ペプチド、ペプ
チド様分子などが挙げられるが、これらに限定するもの
ではない。他の潜在的なアンタゴニストとしては、アン
チセンス分子などが挙げられる（これらの分子について
の記載に関しては、Okano, J.，Neurochem. 56: 560 (1
991)；OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITOR
S OF GENE EXPRESSION, ＣＲＣプレス、ボッカ・ラート
ン、フロリダ州（1988）を参照）。好ましい潜在的アン
タゴニストとしては、ｔＲＮＡシンセターゼに関連する
化合物およびｔＲＮＡシンセターゼの変種が挙げられ
る。特定の態様において、本発明は、感染の続発症に関
与する、病原体と哺乳動物宿主との間の最初の物理的相
互作用を妨害するための本発明ポリペプチド、ポリヌク
レオチドまたは阻害物質の使用を提供するものである。
とりわけ本発明の分子は、ｉ）細菌、とりわけグラム陽
性細菌の、内在デバイス上の哺乳動物細胞外マトリック
スタンパク質または創傷の細胞外マトリックスタンパク
質への付着の防御；ii）例えば哺乳動物チロシンキナー
ゼのリン酸化の開始により、哺乳動物細胞侵入を媒介す
るｔＲＮＡシンセターゼタンパク質の阻害（Rosenshine
ら、Infect. Immun. 60:2211 (1992)）；iii）哺乳動物
細胞外マトリックスタンパク質と組織損傷を媒介する細
菌性ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質との間の細菌付着
の阻害；iv）内在デバイスの埋め込みまたは他の外科的
手技以外により開始された感染における病因の通常の進
行の防御に使用することができる。
プチドの結合部位に結合し、かつ該結合部位を占領し、
それにより細胞性結合分子への結合を防御して、正常な
生物学的活性を防御する小さな分子が挙げられる。小さ
な分子の例としては、小さな有機分子、ペプチド、ペプ
チド様分子などが挙げられるが、これらに限定するもの
ではない。他の潜在的なアンタゴニストとしては、アン
チセンス分子などが挙げられる（これらの分子について
の記載に関しては、Okano, J.，Neurochem. 56: 560 (1
991)；OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITOR
S OF GENE EXPRESSION, ＣＲＣプレス、ボッカ・ラート
ン、フロリダ州（1988）を参照）。好ましい潜在的アン
タゴニストとしては、ｔＲＮＡシンセターゼに関連する
化合物およびｔＲＮＡシンセターゼの変種が挙げられ
る。特定の態様において、本発明は、感染の続発症に関
与する、病原体と哺乳動物宿主との間の最初の物理的相
互作用を妨害するための本発明ポリペプチド、ポリヌク
レオチドまたは阻害物質の使用を提供するものである。
とりわけ本発明の分子は、ｉ）細菌、とりわけグラム陽
性細菌の、内在デバイス上の哺乳動物細胞外マトリック
スタンパク質または創傷の細胞外マトリックスタンパク
質への付着の防御；ii）例えば哺乳動物チロシンキナー
ゼのリン酸化の開始により、哺乳動物細胞侵入を媒介す
るｔＲＮＡシンセターゼタンパク質の阻害（Rosenshine
ら、Infect. Immun. 60:2211 (1992)）；iii）哺乳動物
細胞外マトリックスタンパク質と組織損傷を媒介する細
菌性ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質との間の細菌付着
の阻害；iv）内在デバイスの埋め込みまたは他の外科的
手技以外により開始された感染における病因の通常の進
行の防御に使用することができる。
【００４４】本明細書で提供する各々のＤＮＡ配列は、
抗細菌化合物の発見および開発に用いることができる。
発現してコードされたタンパク質は、抗菌薬物のスクリ
ーニングのための目的物質として用いることができる。
さらに、コードされたタンパク質もしくはＳhine−Ｄel
garnoまたは他の個々のｍＲＮＡの翻訳促進配列のアミ
ノ末端領域をコードするＤＮＡ配列を用いて、目的のコ
ーディング配列の発現を調節するアンチセンス配列を構
築することができる。アンタゴニストおよびアゴニスト
を用いて、例えば、疾患、例えば、上気道感染（例え
ば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺
炎）、下気道感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感
染（例えば、感染性心内膜炎）、消化器感染（例えば、
分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例
えば、大脳膿瘍）、眼感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、
角膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、
腎および尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周
囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例え
ば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細
菌性筋炎）、骨および関節感染（例えば、敗血症性関節
炎、骨髄炎）などを阻害することができる。
抗細菌化合物の発見および開発に用いることができる。
発現してコードされたタンパク質は、抗菌薬物のスクリ
ーニングのための目的物質として用いることができる。
さらに、コードされたタンパク質もしくはＳhine−Ｄel
garnoまたは他の個々のｍＲＮＡの翻訳促進配列のアミ
ノ末端領域をコードするＤＮＡ配列を用いて、目的のコ
ーディング配列の発現を調節するアンチセンス配列を構
築することができる。アンタゴニストおよびアゴニスト
を用いて、例えば、疾患、例えば、上気道感染（例え
ば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺
炎）、下気道感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感
染（例えば、感染性心内膜炎）、消化器感染（例えば、
分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例
えば、大脳膿瘍）、眼感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、
角膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、
腎および尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周
囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例え
ば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細
菌性筋炎）、骨および関節感染（例えば、敗血症性関節
炎、骨髄炎）などを阻害することができる。
【００４５】ワクチン 本発明の別の態様は、個体、とりわけ哺乳動物における
免疫学的応答を誘起する方法であって、該個体を感染、
とりわけ細菌感染、特にスタフィロコッカス・アウレウ
ス感染から保護する抗体を産生するのに充分なｔＲＮＡ
シンセターゼ、またはそれらのフラグメントもしくは変
種を個体に接種することを含んでなる方法に関する。本
発明の別の態様は、個体における免疫学的応答を誘起す
る方法であって、遺伝子治療により、ｔＲＮＡシンセタ
ーゼまたはそれらのフラグメントもしくは変種をコード
する遺伝子を送達し、ｔＲＮＡシンセターゼまたはそれ
らのフラグメントもしくは変種をインビボで発現し、該
個体を疾患から保護する抗体を産生する免疫学的応答を
誘起することを含んでなる方法に関する。本発明のさら
なる態様は、免疫学的反応を宿主内に誘起できるかまた
は誘起した宿主に導入した場合、該宿主におけるｔＲＮ
Ａシンセターゼまたはそれによりコードされたタンパク
質に対する免疫学的応答を誘起する免疫学的組成物であ
って、該組成物が、組換えｔＲＮＡシンセターゼまたは
それによりコードされたタンパク質を含んでなり、該ｔ
ＲＮＡシンセターゼの抗原をコードし発現するＤＮＡま
たはそれからコードされるタンパク質を含んでなる。ｔ
ＲＮＡシンセターゼまたはそれらのフラグメントは、そ
れ自身は抗体を産生しないが、第１のタンパク質を安定
化し、免疫原性および保護特性を有する融合タンパク質
を産生する能力を有する補タンパク質（co-protein）と
融合できる。かくして、融合した組換えタンパク質は、
さらに、抗原補タンパク質、例えばグルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベータ−ガラクト
シダーゼ、タンパク質を可溶化し、それらの産生および
精製を容易にする比較的大きな補タンパク質などを含ん
でなるのがより好ましい。さらにまた、補タンパク質
は、免疫系の一般化された刺激を提供するという意味
で、アジュバントとして作用することができる。補タン
パク質は、第１のタンパク質のアミノまたはカルボキシ
ル末端のいずれに結合していてもよい。
免疫学的応答を誘起する方法であって、該個体を感染、
とりわけ細菌感染、特にスタフィロコッカス・アウレウ
ス感染から保護する抗体を産生するのに充分なｔＲＮＡ
シンセターゼ、またはそれらのフラグメントもしくは変
種を個体に接種することを含んでなる方法に関する。本
発明の別の態様は、個体における免疫学的応答を誘起す
る方法であって、遺伝子治療により、ｔＲＮＡシンセタ
ーゼまたはそれらのフラグメントもしくは変種をコード
する遺伝子を送達し、ｔＲＮＡシンセターゼまたはそれ
らのフラグメントもしくは変種をインビボで発現し、該
個体を疾患から保護する抗体を産生する免疫学的応答を
誘起することを含んでなる方法に関する。本発明のさら
なる態様は、免疫学的反応を宿主内に誘起できるかまた
は誘起した宿主に導入した場合、該宿主におけるｔＲＮ
Ａシンセターゼまたはそれによりコードされたタンパク
質に対する免疫学的応答を誘起する免疫学的組成物であ
って、該組成物が、組換えｔＲＮＡシンセターゼまたは
それによりコードされたタンパク質を含んでなり、該ｔ
ＲＮＡシンセターゼの抗原をコードし発現するＤＮＡま
たはそれからコードされるタンパク質を含んでなる。ｔ
ＲＮＡシンセターゼまたはそれらのフラグメントは、そ
れ自身は抗体を産生しないが、第１のタンパク質を安定
化し、免疫原性および保護特性を有する融合タンパク質
を産生する能力を有する補タンパク質（co-protein）と
融合できる。かくして、融合した組換えタンパク質は、
さらに、抗原補タンパク質、例えばグルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベータ−ガラクト
シダーゼ、タンパク質を可溶化し、それらの産生および
精製を容易にする比較的大きな補タンパク質などを含ん
でなるのがより好ましい。さらにまた、補タンパク質
は、免疫系の一般化された刺激を提供するという意味
で、アジュバントとして作用することができる。補タン
パク質は、第１のタンパク質のアミノまたはカルボキシ
ル末端のいずれに結合していてもよい。
【００４６】本発明は、本発明のポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドおよび免疫刺激ＤＮＡ配列を含むことか
らなる、例えばSato Y.ら、Science 273:352 (1969) に
記載されているもののような、組成物、とりわけワクチ
ン組成物、および方法を提供するものである。また、本
発明は、スタフィロコッカス・アウレウスに感染した動
物モデルにおけるこのような遺伝的免疫化実験で用いら
れるＤＮＡ構築物における細菌細胞表面タンパク質の非
可変領域をコードすることが示されている上記ポリヌク
レオチドまたはとりわけそのフラグメントを用いる方法
を提供するものであり、これらはとりわけ予防的または
治療的免疫応答を生じることができるタンパク質エピト
ープを同定するのに有用である。この研究は、哺乳動
物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけスタフィロ
コッカス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置の
開発のために、感染に抵抗するかまたは一掃するのに成
功した動物の必須器官から特に価値あるモノクローナル
抗体を引き続き調製することを可能にすると思われる。
該ポリペプチドは、宿主のワクチン化のための抗原とし
て使用して、例えば細菌の損傷組織への付着を阻害する
ことなどにより、細菌の侵入に対して保護する特異的抗
体を産生することができる。組織損傷の例としては、例
えば機械的損傷、化学的損傷もしくは熱損傷によるかま
たは内在デバイスの埋め込みにより引き起こされた皮膚
または結合組織の創傷、または粘膜、例えば口、乳腺、
尿道または膣の創傷などが挙げられる。本発明は、ま
た、免疫原性組換えタンパク質を適切な担体と共に含ん
でなるワクチン処方を包含する。該タンパク質は、胃で
分解されるので、非経口的、例えば皮下、筋肉内、静脈
内または皮内投与するのが好ましい。非経口投与に適し
た処方としては、抗酸化剤、緩衝液、静細菌剤、および
処方を個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶質を
含有していてもよい、水性または非水性無菌注射液；お
よび懸濁化剤または増粘剤を含有していてもよい水性ま
たは非水性無菌懸濁液などが挙げられる。処方は、単位
投与または多回投与用容器、例えば密封したアンプルお
よびバイアルに入れてよく、使用直前に無菌液体担体の
添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存する。ワクチ
ン処方は、例えば水中油系および当該技術分野で周知の
他の系など、処方の免疫原性を増強するアジュバント系
をも含有できる。投与量は、ワクチンの特異的活性に依
存するであろうし、慣用の実験法により容易に決定する
ことができる。本発明は、ある種のｔＲＮＡシンセター
ゼに関して記載したが、これは、天然タンパク質およ
び、実質的に組換えタンパク質の免疫原性に影響しない
付加、欠失または置換を施した類似のタンパク質のフラ
グメントを包含することが理解されよう。 組成物、キットおよび投与 本発明は、また、上述のポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを
含んでなる組成物にも関する。本発明のポリペプチド
は、細胞、組織もしくは生物用の非無菌もしくは無菌担
体、例えば対象への投与に適した医薬的担体と組み合わ
せて用いることができる。このような組成物は、例えば
溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポリペプチド、
および医薬的に許容できる担体または賦形剤を含んでな
る。このような担体としては、生理食塩水、緩衝化生理
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせななどが挙げられるが、こ
れらに限定するものではない。処方は、投与の形態に適
したものにすべきである。本発明は、さらに、本発明の
前記組成物の成分を１またはそれ以上充填した１または
それ以上の容器を含んでなる診断用および医薬用パック
およびキットにも関する。
リヌクレオチドおよび免疫刺激ＤＮＡ配列を含むことか
らなる、例えばSato Y.ら、Science 273:352 (1969) に
記載されているもののような、組成物、とりわけワクチ
ン組成物、および方法を提供するものである。また、本
発明は、スタフィロコッカス・アウレウスに感染した動
物モデルにおけるこのような遺伝的免疫化実験で用いら
れるＤＮＡ構築物における細菌細胞表面タンパク質の非
可変領域をコードすることが示されている上記ポリヌク
レオチドまたはとりわけそのフラグメントを用いる方法
を提供するものであり、これらはとりわけ予防的または
治療的免疫応答を生じることができるタンパク質エピト
ープを同定するのに有用である。この研究は、哺乳動
物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけスタフィロ
コッカス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置の
開発のために、感染に抵抗するかまたは一掃するのに成
功した動物の必須器官から特に価値あるモノクローナル
抗体を引き続き調製することを可能にすると思われる。
該ポリペプチドは、宿主のワクチン化のための抗原とし
て使用して、例えば細菌の損傷組織への付着を阻害する
ことなどにより、細菌の侵入に対して保護する特異的抗
体を産生することができる。組織損傷の例としては、例
えば機械的損傷、化学的損傷もしくは熱損傷によるかま
たは内在デバイスの埋め込みにより引き起こされた皮膚
または結合組織の創傷、または粘膜、例えば口、乳腺、
尿道または膣の創傷などが挙げられる。本発明は、ま
た、免疫原性組換えタンパク質を適切な担体と共に含ん
でなるワクチン処方を包含する。該タンパク質は、胃で
分解されるので、非経口的、例えば皮下、筋肉内、静脈
内または皮内投与するのが好ましい。非経口投与に適し
た処方としては、抗酸化剤、緩衝液、静細菌剤、および
処方を個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶質を
含有していてもよい、水性または非水性無菌注射液；お
よび懸濁化剤または増粘剤を含有していてもよい水性ま
たは非水性無菌懸濁液などが挙げられる。処方は、単位
投与または多回投与用容器、例えば密封したアンプルお
よびバイアルに入れてよく、使用直前に無菌液体担体の
添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存する。ワクチ
ン処方は、例えば水中油系および当該技術分野で周知の
他の系など、処方の免疫原性を増強するアジュバント系
をも含有できる。投与量は、ワクチンの特異的活性に依
存するであろうし、慣用の実験法により容易に決定する
ことができる。本発明は、ある種のｔＲＮＡシンセター
ゼに関して記載したが、これは、天然タンパク質およ
び、実質的に組換えタンパク質の免疫原性に影響しない
付加、欠失または置換を施した類似のタンパク質のフラ
グメントを包含することが理解されよう。 組成物、キットおよび投与 本発明は、また、上述のポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを
含んでなる組成物にも関する。本発明のポリペプチド
は、細胞、組織もしくは生物用の非無菌もしくは無菌担
体、例えば対象への投与に適した医薬的担体と組み合わ
せて用いることができる。このような組成物は、例えば
溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポリペプチド、
および医薬的に許容できる担体または賦形剤を含んでな
る。このような担体としては、生理食塩水、緩衝化生理
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせななどが挙げられるが、こ
れらに限定するものではない。処方は、投与の形態に適
したものにすべきである。本発明は、さらに、本発明の
前記組成物の成分を１またはそれ以上充填した１または
それ以上の容器を含んでなる診断用および医薬用パック
およびキットにも関する。
【００４７】本発明のポリペプチドおよび他の化合物
は、単独で、または治療用化合物などの他の化合物と組
み合わせて用いることができる。医薬組成物は、例え
ば、とりわけ局所、経口、肛門、経膣、静脈内、腹腔
内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内の経路による投
与を含む、いずれかの有効なかつ好都合な方法で投与さ
れてよい。治療において、または予防として、活性物質
を注射用組成物として、例えば、好ましくは等張の、無
菌水性分散物として、個体に投与できる。また別に、該
組成物は、局所適用用に、例えば軟膏剤、クリーム剤、
ローション剤、眼軟膏剤、点眼液、点耳液、洗口剤、染
み込ませた包帯および縫合用の糸、ならびにエアロゾー
ルなどの形態に処方でき、適当な慣用的な添加物、例え
ば保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟膏お
よびクリームには軟化剤を含有してよい。このような局
所用処方はまた、適合した慣用的な担体、例えばクリー
ムまたは軟膏基剤、およびローションについてはエタノ
ールまたはオレイルアルコールを含有してよい。このよ
うな担体は、処方の約１重量％から約９８重量％を構成
してよ；より通常的には、処方の約８０重量％までを構
成する。哺乳動物、とりわけヒトに投与するために、活
性物質の１日あたりの投与量は、０.０１mg／kg〜１０m
g／kgであり、典型的には約１mg／kgである。医者は如
何なる場合にも、個体に最も適した実際の投与量を決定
し、とりわけ個体の年齢、体重および反応性に応じて変
化させる。上記投与量は、平均的なケースの模範例であ
る。もちろん、高い投与量の範囲または低い投与量の範
囲が適合する個々の例もあり、これらは本発明の範囲内
である。
は、単独で、または治療用化合物などの他の化合物と組
み合わせて用いることができる。医薬組成物は、例え
ば、とりわけ局所、経口、肛門、経膣、静脈内、腹腔
内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内の経路による投
与を含む、いずれかの有効なかつ好都合な方法で投与さ
れてよい。治療において、または予防として、活性物質
を注射用組成物として、例えば、好ましくは等張の、無
菌水性分散物として、個体に投与できる。また別に、該
組成物は、局所適用用に、例えば軟膏剤、クリーム剤、
ローション剤、眼軟膏剤、点眼液、点耳液、洗口剤、染
み込ませた包帯および縫合用の糸、ならびにエアロゾー
ルなどの形態に処方でき、適当な慣用的な添加物、例え
ば保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟膏お
よびクリームには軟化剤を含有してよい。このような局
所用処方はまた、適合した慣用的な担体、例えばクリー
ムまたは軟膏基剤、およびローションについてはエタノ
ールまたはオレイルアルコールを含有してよい。このよ
うな担体は、処方の約１重量％から約９８重量％を構成
してよ；より通常的には、処方の約８０重量％までを構
成する。哺乳動物、とりわけヒトに投与するために、活
性物質の１日あたりの投与量は、０.０１mg／kg〜１０m
g／kgであり、典型的には約１mg／kgである。医者は如
何なる場合にも、個体に最も適した実際の投与量を決定
し、とりわけ個体の年齢、体重および反応性に応じて変
化させる。上記投与量は、平均的なケースの模範例であ
る。もちろん、高い投与量の範囲または低い投与量の範
囲が適合する個々の例もあり、これらは本発明の範囲内
である。
【００４８】内在デバイスとしては、外科的インプラン
ト、プロテーゼデバイスおよびカテーテル、すなわち個
体の体に導入し、長時間その位置に存在するデバイスが
挙げられる。このようなデバイスとしては、例えば人工
関節、心臓弁、ペースメーカー、血管移植片、血管カテ
ーテル、脳脊髄液シャント、尿カテーテル、持続的外来
腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテーテルが挙げられる。本発明
の組成物を注射により投与して、内在デバイスの挿入の
直前に、関連する細菌に対する全身的な効果を得ること
ができる。手術後、デバイスが体内に在る時間中、処置
を続けてよい。さらに、任意の外科的手技の手術中のカ
バーを広げて、細菌性創傷感染、とりわけスタフィロコ
ッカス・アウレウスの創傷感染を防御するために用いる
こともできる。多くの整形外科医は、プロテーゼ関節を
有するヒトが菌血症を生み出し得る歯科的処置の前に、
抗生物質予防法を考慮されるべきであると考える。遅延
性の重篤な感染は、時々プロテーゼ関節を失うに至る重
篤な合併症であり、有意性のある羅病率および死亡率を
伴う。従って、この場合、予防的な抗生物質の代わりと
して活性物質の使用を拡張することが可能である。
ト、プロテーゼデバイスおよびカテーテル、すなわち個
体の体に導入し、長時間その位置に存在するデバイスが
挙げられる。このようなデバイスとしては、例えば人工
関節、心臓弁、ペースメーカー、血管移植片、血管カテ
ーテル、脳脊髄液シャント、尿カテーテル、持続的外来
腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテーテルが挙げられる。本発明
の組成物を注射により投与して、内在デバイスの挿入の
直前に、関連する細菌に対する全身的な効果を得ること
ができる。手術後、デバイスが体内に在る時間中、処置
を続けてよい。さらに、任意の外科的手技の手術中のカ
バーを広げて、細菌性創傷感染、とりわけスタフィロコ
ッカス・アウレウスの創傷感染を防御するために用いる
こともできる。多くの整形外科医は、プロテーゼ関節を
有するヒトが菌血症を生み出し得る歯科的処置の前に、
抗生物質予防法を考慮されるべきであると考える。遅延
性の重篤な感染は、時々プロテーゼ関節を失うに至る重
篤な合併症であり、有意性のある羅病率および死亡率を
伴う。従って、この場合、予防的な抗生物質の代わりと
して活性物質の使用を拡張することが可能である。
【００４９】上記治療に加え、本発明の組成物は、一般
的に創傷治療薬として使用して、創傷組織に曝露したマ
トリックスタンパク質に細菌が付着するのを防ぎ、抗生
物質予防法に代わって、またはそれと組み合わせて、歯
科治療において予防的に使用できる。また別に、本発明
の組成物を用いて、挿入直前に内在デバイスを浸すこと
ができる。活性物質は、創傷または内在デバイスを浸す
ために１μg／ml〜１０mg／mlの濃度であるのが好まし
い。ワクチン組成物は、便宜的には、注射可能な形態で
ある。慣用のアジュバントを用いて、免疫応答を増強す
ることができる。ワクチン化に適した単位投与量は、抗
原０.５〜５μg／kgであり、かかる投与量は、１〜３週
間隔で１〜３回投与するのが好ましい。示した投与量範
囲では、本発明の化合物について、適切な個体への投与
を妨げるような不利な毒性効果は観察されない。上記抗
体は、また、ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質を含有す
る細菌の存在を検出するための診断試薬として使用でき
る。
的に創傷治療薬として使用して、創傷組織に曝露したマ
トリックスタンパク質に細菌が付着するのを防ぎ、抗生
物質予防法に代わって、またはそれと組み合わせて、歯
科治療において予防的に使用できる。また別に、本発明
の組成物を用いて、挿入直前に内在デバイスを浸すこと
ができる。活性物質は、創傷または内在デバイスを浸す
ために１μg／ml〜１０mg／mlの濃度であるのが好まし
い。ワクチン組成物は、便宜的には、注射可能な形態で
ある。慣用のアジュバントを用いて、免疫応答を増強す
ることができる。ワクチン化に適した単位投与量は、抗
原０.５〜５μg／kgであり、かかる投与量は、１〜３週
間隔で１〜３回投与するのが好ましい。示した投与量範
囲では、本発明の化合物について、適切な個体への投与
を妨げるような不利な毒性効果は観察されない。上記抗
体は、また、ｔＲＮＡシンセターゼタンパク質を含有す
る細菌の存在を検出するための診断試薬として使用でき
る。
【００５０】実施例 以下の実施例は、詳細に記載したこと以外は、当業者に
周知かつ慣用的である標準的な技法を用いて行われる。
該実施例は、説明のためにのみ示すもので、本発明を限
定するものではない。 実施例１ ライブラリーの製造 配列番号１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチド
は、イー・コリにおけるスタフィロコッカス・アウレウ
スＷＣＵＨ２９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリ
ーより入手した。重複するスタフィロコッカス・アウレ
ウスのＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローン
から配列決定データを、配列番号１に示す連続したＤＮ
Ａ配列を構築するために使用した場合もある。ライブラ
リーは、慣用的な方法、例えば以下の方法１および２に
より製造できる。標準的な方法により、スタフィロコッ
カス・アウレウス株ＷＣＵＨ２９から全細胞ＤＮＡを単
離し、二つの方法のどちらかによりサイズ分画する。
周知かつ慣用的である標準的な技法を用いて行われる。
該実施例は、説明のためにのみ示すもので、本発明を限
定するものではない。 実施例１ ライブラリーの製造 配列番号１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチド
は、イー・コリにおけるスタフィロコッカス・アウレウ
スＷＣＵＨ２９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリ
ーより入手した。重複するスタフィロコッカス・アウレ
ウスのＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のクローン
から配列決定データを、配列番号１に示す連続したＤＮ
Ａ配列を構築するために使用した場合もある。ライブラ
リーは、慣用的な方法、例えば以下の方法１および２に
より製造できる。標準的な方法により、スタフィロコッ
カス・アウレウス株ＷＣＵＨ２９から全細胞ＤＮＡを単
離し、二つの方法のどちらかによりサイズ分画する。
【００５１】方法１ 標準的な方法によりサイズ分画化するために、全細胞Ｄ
ＮＡをニードルに通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐ
までの大きさのフラグメントをエキソヌクレアーゼおよ
びＤＮＡポリメラーゼによる処理により平滑末端化し、
ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントをＥｃｏＲ
Ｉで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結させ、標
準的な方法により該ライブラリーをパッケージングし、
次いでパッケージングしたライブラリーでイー・コリを
感染させる。該ライブラリーを標準的方法により増幅す
る。
ＮＡをニードルに通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐ
までの大きさのフラグメントをエキソヌクレアーゼおよ
びＤＮＡポリメラーゼによる処理により平滑末端化し、
ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントをＥｃｏＲ
Ｉで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結させ、標
準的な方法により該ライブラリーをパッケージングし、
次いでパッケージングしたライブラリーでイー・コリを
感染させる。該ライブラリーを標準的方法により増幅す
る。
【００５２】方法２ 全細胞性ＤＮＡを、ライブラリーベクターにクローニン
グするためにの一連のフラグメントを生じさせるのに適
している制限酵素（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、Ａｌ
ｕＩ、Ｂｓｈ１２３５Ｉ）の１つまたはこれを組み合わ
たもので部分的加水分解し、標準的方法により、かかる
フラグメントをサイズ分画化する。ＥｃｏＲＩリンカー
をＤＮＡおよびフラグメントに連結させ、次いでＥｃｏ
ＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結させ、
標準的方法によりライブラリーをパッケージングし、パ
ッケージングしたライブラリーでイー・コリを感染させ
る。該ライブラリーを標準法により増幅する。
グするためにの一連のフラグメントを生じさせるのに適
している制限酵素（例えば、ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、Ａｌ
ｕＩ、Ｂｓｈ１２３５Ｉ）の１つまたはこれを組み合わ
たもので部分的加水分解し、標準的方法により、かかる
フラグメントをサイズ分画化する。ＥｃｏＲＩリンカー
をＤＮＡおよびフラグメントに連結させ、次いでＥｃｏ
ＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結させ、
標準的方法によりライブラリーをパッケージングし、パ
ッケージングしたライブラリーでイー・コリを感染させ
る。該ライブラリーを標準法により増幅する。
【００５３】実施例２：トリプトファニルｔＲＮＡシン
セターゼ（ＷＲＳ）活性の測定 酵素は、ｔＲＮＡＴｒｐのアミノアシル化を触媒し、こ
れは２段階メカニズムで進行する。最初の段階では、Ａ
ＴＰおよびＬ−トリプトファンの特異的結合および反応
の結果、安定な酵素：トリプトファニルアデニル化複合
体を形成する。次いで、酵素結合ｔＲＮＡＴｒｐの３'
末端アデノシンは、アミノアシルアデニレートと反応
し、ｔＲＮＡがエステル化され、およびＡＭＰが放出さ
れる。これらの反応を以下にまとめる； ａ） Ｌ-Ｔrp＋ＡＴＰ.Ｍg＋ＷＲＳ⇒ＷＲＳ：Ｔrp-Ａ
ＭＰ＋ＰＰi.Ｍg ｂ） ＷＲＳ:Ｔrp-ＡＭＰ＋ｔＲＮＡＴｒｐ⇒ＷＲＳ＋
Ｔrp-ｔＲＮＡＴｒｐ＋ＡＭＰ 酵素を特徴付けするため、または以下のような多くの方
法でのその活性の特異的阻害物質を同定するために、こ
の反応をアッセイすることができる： １．Ｔｒｐ−ｔＲＮＡＴｒｐの形成の測定は、放射性標
識化トリプトファンを用いて特異的に決定することがで
き、沈殿／濾過技法（例えば、冷トリクロロ酢酸中１,
２）を用いてＴｒｐ-ｔＲＮＡから遊離のトリプトファ
ンを分離できる。 ２．全アシル化反応もまた、ｔＲＮＡアシル化に対して
化学量論的比率で産生されるＰＰｉまたはＡＭＰのどち
らかの産生を分析することにより測定できる。これは、
例えば比色測定３；または過剰の無機ピロホスファター
ゼを添加した後のＰｉの酵素結合測定４を用いるか、ま
たは直接的にＡＭＰもしくはＰＰｉ産生を測定する酵素
結合アッセイ５を用いるなどの多くの方法により達成で
きる。 ３．部分反応（ａ）は、反応のこの部分の各段階が自由
に可逆的であるので、ＡＴＰとＰＰｉとの間の放射性標
識アイソトープ交換により評価することができる。これ
は、典型的には，全アシル化反応（ａ＋ｂ）よりも約２
０倍高いｋｃａ ｔを有し、ＡＴＰからＰＰｉを分離する
クロマトグラフィーの原理を用いて（すなわち活性
炭１,２を用いて）容易に測定される。
セターゼ（ＷＲＳ）活性の測定 酵素は、ｔＲＮＡＴｒｐのアミノアシル化を触媒し、こ
れは２段階メカニズムで進行する。最初の段階では、Ａ
ＴＰおよびＬ−トリプトファンの特異的結合および反応
の結果、安定な酵素：トリプトファニルアデニル化複合
体を形成する。次いで、酵素結合ｔＲＮＡＴｒｐの３'
末端アデノシンは、アミノアシルアデニレートと反応
し、ｔＲＮＡがエステル化され、およびＡＭＰが放出さ
れる。これらの反応を以下にまとめる； ａ） Ｌ-Ｔrp＋ＡＴＰ.Ｍg＋ＷＲＳ⇒ＷＲＳ：Ｔrp-Ａ
ＭＰ＋ＰＰi.Ｍg ｂ） ＷＲＳ:Ｔrp-ＡＭＰ＋ｔＲＮＡＴｒｐ⇒ＷＲＳ＋
Ｔrp-ｔＲＮＡＴｒｐ＋ＡＭＰ 酵素を特徴付けするため、または以下のような多くの方
法でのその活性の特異的阻害物質を同定するために、こ
の反応をアッセイすることができる： １．Ｔｒｐ−ｔＲＮＡＴｒｐの形成の測定は、放射性標
識化トリプトファンを用いて特異的に決定することがで
き、沈殿／濾過技法（例えば、冷トリクロロ酢酸中１,
２）を用いてＴｒｐ-ｔＲＮＡから遊離のトリプトファ
ンを分離できる。 ２．全アシル化反応もまた、ｔＲＮＡアシル化に対して
化学量論的比率で産生されるＰＰｉまたはＡＭＰのどち
らかの産生を分析することにより測定できる。これは、
例えば比色測定３；または過剰の無機ピロホスファター
ゼを添加した後のＰｉの酵素結合測定４を用いるか、ま
たは直接的にＡＭＰもしくはＰＰｉ産生を測定する酵素
結合アッセイ５を用いるなどの多くの方法により達成で
きる。 ３．部分反応（ａ）は、反応のこの部分の各段階が自由
に可逆的であるので、ＡＴＰとＰＰｉとの間の放射性標
識アイソトープ交換により評価することができる。これ
は、典型的には，全アシル化反応（ａ＋ｂ）よりも約２
０倍高いｋｃａ ｔを有し、ＡＴＰからＰＰｉを分離する
クロマトグラフィーの原理を用いて（すなわち活性
炭１,２を用いて）容易に測定される。
【００５４】ＷＲＳへのリガンド結合 基質のターンオーバーを触媒する酵素に依存しない実験
において、リガンドのＷＲＳとの相互作用を決定するこ
とも可能である。この型の実験は、多くの方法で実施で
きる： １．酵素固有の蛍光に対するリガンド結合の影響（例え
ばトリプトファン）。天然リガンドまたは阻害物質を結
合させることにより、酵素の蛍光を変化させる酵素の立
体配座の変化が生じる。これを用いて、ストップトフロ
ー蛍光装置を用いて、結合を表す顕微鏡的速度定数を定
義することができる。また別に、定常状態蛍光滴定法
は、これらが酵素阻害実験で評価されるのと同一の方法
で全体的な解離定数を得ることができる。 ２．リガンドのスペクトル効果。リガンド自体が蛍光性
であるか、または酵素トリプトファン蛍光と重複する発
色団を有する場合、結合は、リガンド蛍光特性（例え
ば、強度、寿命または分極）の変化、または酵素トリプ
トファンとの蛍光共鳴エネルギー転移により検出でき
る。該リガンドは、阻害物質であるか、または天然リガ
ンドの変種である（すなわち、蛍光ＡＴＰ誘導体または
発蛍光団で標識化したｔＲＮＡＴｒｐ）。 ３．酵素：リガンド複合体の熱分析。熱量測定法（例え
ば、等温熱量測定、示差スキャンニング熱量測定）を用
いると、温度変化、または報告によりリガンド結合を特
徴付けすることができるＷＲＳの安定性のシフトの検出
が可能になる。
において、リガンドのＷＲＳとの相互作用を決定するこ
とも可能である。この型の実験は、多くの方法で実施で
きる： １．酵素固有の蛍光に対するリガンド結合の影響（例え
ばトリプトファン）。天然リガンドまたは阻害物質を結
合させることにより、酵素の蛍光を変化させる酵素の立
体配座の変化が生じる。これを用いて、ストップトフロ
ー蛍光装置を用いて、結合を表す顕微鏡的速度定数を定
義することができる。また別に、定常状態蛍光滴定法
は、これらが酵素阻害実験で評価されるのと同一の方法
で全体的な解離定数を得ることができる。 ２．リガンドのスペクトル効果。リガンド自体が蛍光性
であるか、または酵素トリプトファン蛍光と重複する発
色団を有する場合、結合は、リガンド蛍光特性（例え
ば、強度、寿命または分極）の変化、または酵素トリプ
トファンとの蛍光共鳴エネルギー転移により検出でき
る。該リガンドは、阻害物質であるか、または天然リガ
ンドの変種である（すなわち、蛍光ＡＴＰ誘導体または
発蛍光団で標識化したｔＲＮＡＴｒｐ）。 ３．酵素：リガンド複合体の熱分析。熱量測定法（例え
ば、等温熱量測定、示差スキャンニング熱量測定）を用
いると、温度変化、または報告によりリガンド結合を特
徴付けすることができるＷＲＳの安定性のシフトの検出
が可能になる。
【００５５】文献 １．Calender & Berg、Biochemistry 5, 1681-1690（19
66） ２．Toth M. J. & Schimmel P、J. Biol. Chem. 265, 1
000-1004（1990） ３．Hoenig、J. Biochem. Biophys. Meth. 19, 249-252
（1989） ４．Webb, T. M.、Anal. Biochem. 218, 449-454（199
4） ５．Sigma Chemicals Catalogue（1986）
66） ２．Toth M. J. & Schimmel P、J. Biol. Chem. 265, 1
000-1004（1990） ３．Hoenig、J. Biochem. Biophys. Meth. 19, 249-252
（1989） ４．Webb, T. M.、Anal. Biochem. 218, 449-454（199
4） ５．Sigma Chemicals Catalogue（1986）
【００５６】実施例３：ＷＲＳ活性についてのアミノア
シル化アッセイ イー・コリにて過剰発現した精製スタフィロコッカス・
アウレウスＷＲＳを用いるか、またはＷＲＳを過剰発現
するイー・コリからの粗製細胞溶解物を用いて、アッセ
イを実施する。後者は、通常、全タンパク質の約１０％
をＷＲＳとして含有する。酵素は、液体窒素中急速冷凍
した後、５０mＭトリス−ＨＣl緩衝液（pＨ７.８）、１
０mＭ ＭgＣl２および１０mＭ Ｂ−メルカプトエタノー
ル中−７０℃で保存する。酵素サンプルの活性を決定す
る実験では、これらの貯蔵物を５０mＭトリス（pＨ７.
８）、１０mＭ ＭgＣl２、１mＭジチオスレイトールで
広範に（１００倍〜１００００倍）希釈し、アッセイ前
に氷上で貯蔵する。該アッセイ方法は、以下のとおりで
ある；上記のとおり調製し、希釈した酵素５０mlを、
０.２５μＣi Ｌ−[Ｕ−１４Ｃ]−トリプトファン（ア
メルシャム・インターナショナル（Ａmersham Ｉnterna
tional)）、４mg／mlイー・コリＭＲＥ６００混合ｔＲ
ＮＡ（ベーリンガー・マンハイム（Ｂoehringer Ｍannh
eim）より）、５mＭ ＡＴＰ、１５mＭ ＭgＳＯ４、３m
Ｍ ＤＴＴ、７５mＭ ＫＣlおよび５０mＭトリス−ＨＣl
（pＨ７.８）を含有してなる反応混合物（１００ml）と
混合する。特記しない限り、全ての試薬は、シグマ・ケ
ミカル・カンパニー・リミテッド（Ｓigma Ｃhemical
Ｃompany Ｌtd.）より入手した。濃度は、最終反応混合
物での濃度である。酵素を添加して反応を開始した後、
アッセイサンプルを３７℃でインキュベートし、所望の
時間、２検体ずつ（５０μl）取り出し、７％トリクロ
ロ酢酸（１００μl）でクエンチし、氷上で３０分放置
する。沈殿物を、パッカード・フィルターメート・１９
６・セル・ハーベスター［パッカード・インストラメン
ト・リミテッド（Ｐackard Ｉnstrumets Ｌtd.)］を用
いて、ガラス繊維フィルター上で回収し、７％トリクロ
ロ酢酸、次いでエタノールで順次洗浄する。フィルター
を７０℃で１時間乾燥させ、放射活性のレベルをシンチ
レーションカウンティング（パッカード・トップカウン
ト）により測定する。
シル化アッセイ イー・コリにて過剰発現した精製スタフィロコッカス・
アウレウスＷＲＳを用いるか、またはＷＲＳを過剰発現
するイー・コリからの粗製細胞溶解物を用いて、アッセ
イを実施する。後者は、通常、全タンパク質の約１０％
をＷＲＳとして含有する。酵素は、液体窒素中急速冷凍
した後、５０mＭトリス−ＨＣl緩衝液（pＨ７.８）、１
０mＭ ＭgＣl２および１０mＭ Ｂ−メルカプトエタノー
ル中−７０℃で保存する。酵素サンプルの活性を決定す
る実験では、これらの貯蔵物を５０mＭトリス（pＨ７.
８）、１０mＭ ＭgＣl２、１mＭジチオスレイトールで
広範に（１００倍〜１００００倍）希釈し、アッセイ前
に氷上で貯蔵する。該アッセイ方法は、以下のとおりで
ある；上記のとおり調製し、希釈した酵素５０mlを、
０.２５μＣi Ｌ−[Ｕ−１４Ｃ]−トリプトファン（ア
メルシャム・インターナショナル（Ａmersham Ｉnterna
tional)）、４mg／mlイー・コリＭＲＥ６００混合ｔＲ
ＮＡ（ベーリンガー・マンハイム（Ｂoehringer Ｍannh
eim）より）、５mＭ ＡＴＰ、１５mＭ ＭgＳＯ４、３m
Ｍ ＤＴＴ、７５mＭ ＫＣlおよび５０mＭトリス−ＨＣl
（pＨ７.８）を含有してなる反応混合物（１００ml）と
混合する。特記しない限り、全ての試薬は、シグマ・ケ
ミカル・カンパニー・リミテッド（Ｓigma Ｃhemical
Ｃompany Ｌtd.）より入手した。濃度は、最終反応混合
物での濃度である。酵素を添加して反応を開始した後、
アッセイサンプルを３７℃でインキュベートし、所望の
時間、２検体ずつ（５０μl）取り出し、７％トリクロ
ロ酢酸（１００μl）でクエンチし、氷上で３０分放置
する。沈殿物を、パッカード・フィルターメート・１９
６・セル・ハーベスター［パッカード・インストラメン
ト・リミテッド（Ｐackard Ｉnstrumets Ｌtd.)］を用
いて、ガラス繊維フィルター上で回収し、７％トリクロ
ロ酢酸、次いでエタノールで順次洗浄する。フィルター
を７０℃で１時間乾燥させ、放射活性のレベルをシンチ
レーションカウンティング（パッカード・トップカウン
ト）により測定する。
【００５７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SmithKline Beecham P.l.C. <120> Novel tRNA Synthetase <130> 179982 <150> 9601068.1 <151> 1996-01-19 <160> 2 <210> 1 <211> 990 <212> DNA <213> <400> 1 ATGGAGACAT TATTTTCAGG CATCCAACCT AGTGGAATTC CTACTATTGG AAATTATATT 60 GGCGCACTAA AACAATTTGT TGATGTGCAA AATGACTATG ATTGTTATTT CTGTATCGTA 120 GATCAACATG CAATTACAAT GCCACAAGAT CGTTTAAAAT TACGTAAACA GACCAGACAA 180 TTAGCAGCGA TTTATTTAGC TTCTGGTATA GATCCAGACA AAGCAACATT GTTCATACAA 240 TCTGAAGTCC CTGCACACGT ACAAGCAGGA TGGATGTTAA CTACGATTGC TTCTGTTGGA 300 GAATTAGAGC GTATGACGCA ATACAAAGAT AAAGCTCAGA AAGCAGTTGA AGGTATACCA 360 GCTGGTCTAT TAACATATCC ACCTTTAATG GCAGCTGATA TTGTTCTTTA CAATACTAAT 420 ATCGTTCCAG TTGGAGATGA CCAAAAGCAG CATATCGAAT TGACTCGTAA CCTTGTAGAT 480 AGATTTAATA GTCGCTATAA TGATGTGCTT GTGAAACCTG AAATTCGTAT GCCTAAAGTT 540 GGTGGACGTG TCATGAGTTT ACAAGACCCA ACAAGAAAAA TGAGTAAGAG TGATGATAAT 600 GCTAAAAACT TCATTTCATT ATTGGACGAG CCGAATGTTG CAGCTAAAAA AATTAAAAGC 660 GCAGTAACTG ATTCAGATGG TATTATTAAA TTTGATCGTG ACAACAAGCC AGGTATAACA 720 AATTTAATTT CAATATACGC TGGATTAACC GACATGCCAA TTAAAGATAT TGAGGCAAAA 780 TATGAAGGGG AAGGTTATGG TAAATTTAAA GGTGACCTTG CTGAAATAGT TAAAGCATTT 840 TTAGTAGAAT TCCAAGAAAA ATACGAAAGT TTCTATAACT CAGATAAACT TGATGATATT 900 TTAGATCAAG GTAGAGATAA AGCACACAAA GTTTCATTTA AAACTGTCAA AAAAATGGAA 960 AAAGCGATGG GATTAGGACG TAAGAGATAA 990 <210> 2 <211> 329 <212> PRT <213> <400> 2 Met Glu Thr Leu Phe Ser Gly Ile Gln Pro Ser Gly Ile Pro Thr Ile 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Ile Gly Ala Leu Lys Gln Phe Val Asp Val Gln Asn Asp 20 25 30 Tyr Asp Cys Tyr Phe Cys Ile Val Asp Gln His Ala Ile Thr Met Pro 35 40 45 Gln Asp Arg Leu Lys Leu Arg Lys Gln Thr Arg Gln Leu Ala Ala Ile 50 55 60 Tyr Leu Ala Ser Gly Ile Asp Pro Asp Lys Ala Thr Leu Phe Ile Gln 65 70 75 80 Ser Glu Val Pro Ala His Val Gln Ala Gly Trp Met Leu Thr Thr Ile 85 90 95 Ala Ser Val Gly Glu Leu Glu Arg Met Thr Gln Tyr Lys Asp Lys Ala 100 105 110 Gln Lys Ala Val Glu Gly Ile Pro Ala Gly Leu Leu Thr Tyr Pro Pro 115 120 125 Leu Met Ala Ala Asp Ile Val Leu Tyr Asn Thr Asn Ile Val Pro Val 130 135 140 Gly Asp Asp Gln Lys Gln His Ile Glu Leu Thr Arg Asn Leu Val Asp 145 150 155 160 Arg Phe Asn Ser Arg Tyr Asn Asp Val Leu Val Lys Pro Glu Ile Arg 165 170 175 Met Pro Lys Val Gly Gly Arg Val Met Ser Leu Gln Asp Pro Thr Arg 180 185 190 Lys Met Ser Lys Ser Asp Asp Asn Ala Lys Asn Phe Ile Ser Leu Leu 195 200 205 Asp Glu Pro Asn Val Ala Ala Lys Lys Ile Lys Ser Ala Val Thr Asp 210 215 220 Ser Asp Gly Ile Ile Lys Phe Asp Arg Asp Asn Lys Pro Gly Ile Thr 225 230 235 240 Asn Leu Ile Ser Ile Tyr Ala Gly Leu Thr Asp Met Pro Ile Lys Asp 245 250 255 Ile Glu Ala Lys Tyr Glu Gly Glu Gly Tyr Gly Lys Phe Lys Gly Asp 260 265 270 Leu Ala Glu Ile Val Lys Ala Phe Leu Val Glu Phe Gln Glu Lys Tyr 275 280 285 Glu Ser Phe Tyr Asn Ser Asp Lys Leu Asp Asp Ile Leu Asp Gln Gly 290 295 300 Arg Asp Lys Ala His Lys Val Ser Phe Lys Thr Val Lys Lys Met Glu 305 310 315 320 Lys Ala Met Gly Leu Gly Arg Lys Arg 325
【図１】 スタフィロコッカス・アウレウスのトリプト
ファニルｔＲＮＡシンセターゼのポリヌクレオチド配列
［配列番号１］を示す。
ファニルｔＲＮＡシンセターゼのポリヌクレオチド配列
［配列番号１］を示す。
【図２】 図１のポリヌクレオチド配列から推定したス
タフィロコッカス・アウレウスのトリプトファニルｔＲ
ＮＡシンセターゼのアミノ酸配列［配列番号２］を示
す。
タフィロコッカス・アウレウスのトリプトファニルｔＲ
ＮＡシンセターゼのアミノ酸配列［配列番号２］を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｃ０８４ 7/02 11/00 ４Ｃ０８５ 9/00 11/02 ４Ｃ０８６ 11/00 11/04 ４Ｈ０４５ 11/02 13/00 11/04 13/02 １０５ 13/00 17/00 13/02 １０５ １０１ 17/00 19/02 １０１ 25/00 19/02 27/02 25/00 27/16 27/02 31/04 27/16 35/00 31/04 37/04 35/00 43/00 １１１ 37/04 Ｃ０７Ｋ 16/40 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/00 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/25 9/00 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/25 33/48 Ｍ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/48 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/48 (72)発明者 ジョン・エドワード・ホッジソン アメリカ合衆国19426−0989ペンシルベニ ア州カレッジビル、ピー・オー・ボックス 5089、サウス・カレッジビル・ロード1250 番 スミスクライン・ビーチャム・ファー マシューティカルズ (72)発明者 エリザベス・ローラー アメリカ合衆国19426−0989ペンシルベニ ア州カレッジビル、ピー・オー・ボックス 5089、サウス・カレッジビル・ロード1250 番 スミスクライン・ビーチャム・ファー マシューティカルズ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 BB20 CA25 CB01 CB09 CB13 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA80 FB01 FB02 FB03 FB04 JA20 4B024 AA01 AA13 BA07 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 HA11 HA17 4B050 CC03 DD02 LL01 LL03 4B063 QA01 QA07 QQ08 QQ43 QR32 QR48 QR55 QS02 QS34 4B065 AA26X AA49Y AB01 AC14 BA02 CA27 CA44 CA46 4C084 AA07 AA13 BA01 BA22 BA23 CA04 DA42 DC32 NA14 ZA021 ZA331 ZA341 ZA361 ZA591 ZA661 ZA811 ZA821 ZA891 ZA901 ZA961 ZB091 ZB351 ZC202 4C085 AA13 BB22 BB23 DD61 4C086 AA01 AA03 EA16 NA14 ZA02 ZA33 ZA34 ZA36 ZA59 ZA66 ZA81 ZA82 ZA89 ZA90 ZA96 ZB09 ZB35 ZC20 4H045 AA11 BA10 CA11 DA75 EA22 EA52 FA74
Claims (26)
- 【請求項１】 （ａ）配列番号２のアミノ酸１から３２
９を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに
対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオ
チド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の連続した塩基を含むポリヌクレオチドから
なる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含んでな
る単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号１に示すヌクレオチド１から９
８７を含む請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 配列番号１に示すヌクレオチド１から９
９０を含む請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項６】 配列番号２のアミノ酸１から３２９を含
むポリペプチドをコードする請求項２記載のポリヌクレ
オチド。 - 【請求項７】 （ａ）ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１に
含まれるｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子により発現される
同一の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレ
オチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の塩基を含むポリヌクレオチドからなる群か
ら選択されるものを含んでなる単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項８】 請求項２記載のＤＮＡを含んでなるベク
ター。 - 【請求項９】 請求項８記載のベクターを含んでなる宿
主細胞。 - 【請求項１０】 該ＤＮＡにコードされるポリペプチド
を請求項９記載の宿主細胞から発現させることを特徴と
するポリペプチドの製造方法。 - 【請求項１１】 細胞が請求項８記載のベクターに含ま
れるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現す
るように、該ベクターで細胞を形質転換またはトランス
フェクトすることを特徴とする、ポリペプチドを発現す
る細胞の製造方法。 - 【請求項１２】 ｔＲＮＡシンセターゼポリペプチドま
たはフラグメントを製造するのに充分な条件下で、請求
項９記載の宿主を培養することを特徴とする、ｔＲＮＡ
シンセターゼポリペプチドまたはフラグメントの製造方
法。 - 【請求項１３】 配列番号２のアミノ酸１から３２９に
対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含ん
でなるポリペプチド。 - 【請求項１４】 配列番号２に示すアミノ酸を含んでな
るポリペプチド。 - 【請求項１５】 請求項１３記載のポリペプチドに対す
る抗体。 - 【請求項１６】 治療上有効量の請求項１３記載のポリ
ペプチドを個体に投与することを特徴とする、ｔＲＮＡ
シンセターゼを必要とする個体の処置方法。 - 【請求項１７】 該ポリペプチドをコードするＤＮＡを
個体に提供し、該ポリペプチドをインビボで発現させる
ことにより、治療上有効量の該ポリペプチドが投与され
る請求項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 治療上有効量の配列番号２のアミノ酸
１から３２９に対して少なくとも７０％同一であるアミ
ノ酸配列を含んでなるポリペプチドの活性を阻害するア
ンタゴニストを個体に投与することを特徴とする、ｔＲ
ＮＡシンセターゼポリペプチドを阻害することを必要と
する個体の処置方法。 - 【請求項１９】 請求項１３記載のポリペプチドをコー
ドする核酸配列を決定することを特徴とする、該ポリペ
プチドの発現に関与する疾患の診断方法。 - 【請求項２０】 宿主由来のサンプル中の請求項１３記
載のポリペプチドの存在を分析することを特徴とする診
断方法。 - 【請求項２１】 請求項１３記載のポリペプチドに結合
し、該ポリペプチドの活性を阻害する化合物の同定方法
であって；結合部位との結合を可能にする条件下、ポリ
ペプチドの結合部位を表面に発現する細胞を、スクリー
ニングしようとする化合物と接触させること（ここで、
該結合部位は、化合物の該結合部位への結合に反応して
検出可能なシグナルを提供する能力を有する第２の成分
に関連するものである）；次いで、 該化合物と該結合部位との相互作用により生じるシグナ
ルの存在または不在を検出することにより、該化合物が
該結合部位に結合して該結合部位を活性化するかまたは
阻害するかを決定すること；を特徴とする方法。 - 【請求項２２】 哺乳動物を疾患から防御する抗体を産
生させるに充分なｔＲＮＡシンセターゼまたはそのフラ
グメントもしくは変種を哺乳動物に接種することを特徴
とする、哺乳動物における免疫学的応答を誘起する方
法。 - 【請求項２３】 免疫学的応答を誘起させて哺乳動物を
疾患から防御する抗体を産生するために、インビボでｔ
ＲＮＡシンセターゼ、またはそのフラグメントもしくは
変種を発現させるために、遺伝子治療によりｔＲＮＡシ
ンセターゼフラグメントまたはその変種をコードする遺
伝子を送達することを特徴とする、哺乳動物における免
疫学的応答を誘起する方法。 - 【請求項２４】 ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチ
ドまたはそれによりコードされるタンパク質をコード
し、発現するＤＮＡを含んでなる免疫学的組成物であっ
て、哺乳動物に導入されると、哺乳動物において所定の
ｔＲＮＡシンセターゼポリヌクレオチドまたはそれらに
よりコードされるタンパク質に対する免疫学的応答を誘
起する免疫学的組成物。 - 【請求項２５】 厳密なハイブリダイゼーション条件下
で、配列番号１に示すポリヌクレオチド配列の完全遺伝
子を含有する適当なライブラリーを、配列番号１に示す
該ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントの配列
を有するプローブでスクリーニングし、次いで、ＤＮＡ
配列を単離することにより得られるＤＮＡ配列を必須と
してなるポリヌクレオチド。 - 【請求項２６】 トリプトファニルｔＲＮＡシンセター
ゼの相互作用を妨害する薬物を同定するための、薬物の
スクリーニング方法であって、全アミノアシル化反応ま
たは部分ＰＰｉ／ＡＴＰ交換反応による酵素活性の測定
を特徴とするスクリーニング方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| GBGB9601068.1A GB9601068D0 (en) | 1996-01-19 | 1996-01-19 | Novel compounds |
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-
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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