JPH10304884A - 新規ｒａｔ - Google Patents
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- JPH10304884A JPH10304884A JP10025773A JP2577398A JPH10304884A JP H10304884 A JPH10304884 A JP H10304884A JP 10025773 A JP10025773 A JP 10025773A JP 2577398 A JP2577398 A JP 2577398A JP H10304884 A JPH10304884 A JP H10304884A
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＲＡＴポリペプチドおよびＲＡＴポリペプチ
ドをコードしているＤＮＡ（ＲＮＡ）、および組み換え
法によるかかるポリペプチドの製造方法、ならびに感
染、詳細には細菌感染に対する防御のためのＲＡＴポリ
ペプチドの使用方法を提供する。 【解決手段】 新規ＲＡＴポリペプチドであると同定さ
れたポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオ
チド。
ドをコードしているＤＮＡ（ＲＮＡ）、および組み換え
法によるかかるポリペプチドの製造方法、ならびに感
染、詳細には細菌感染に対する防御のためのＲＡＴポリ
ペプチドの使用方法を提供する。 【解決手段】 新規ＲＡＴポリペプチドであると同定さ
れたポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオ
チド。
Description
【０００１】本発明は、新規に同定されたポリヌクレオ
チドおよびポリペプチド、およびその製造および使用、
ならびにそれらの変種、アゴニストおよびアンタゴニス
トおよびそれらの使用に関する。詳細には、これらのお
よびその他の点に関して、本発明は本明細書で「ＲＡ
Ｔ」と称する、アミドトランスフェラーゼファミリーの
新規ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
チドおよびポリペプチド、およびその製造および使用、
ならびにそれらの変種、アゴニストおよびアンタゴニス
トおよびそれらの使用に関する。詳細には、これらのお
よびその他の点に関して、本発明は本明細書で「ＲＡ
Ｔ」と称する、アミドトランスフェラーゼファミリーの
新規ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】スタフィロコッカスの遺伝子および遺伝
子産物を抗生物質開発の標的として用いることは特に好
ましいことである。スタフィロコッカスは微生物のなか
でも医学的に重要な属を構成している。それらは２つの
タイプの疾病、すなわち、侵入性および毒素発生性の疾
病を生じることが知られている。一般的には、侵入性感
染は、皮膚表面および深部組織の両方に影響する膿瘍形
成により特徴づけられている。エス・アウレウス（S.au
reus）は、癌患者における菌血症の２番目の主要病因で
ある。骨髄炎、敗血性関節炎、敗血性血栓静脈炎および
急性細菌性心内膜炎も比較的よく見られる。スタフィロ
コッカスの毒素発生特性により生じる少なくとも３つの
臨床的症状がある。これらの疾病発現は、組織侵入およ
び菌血症に対抗するものとしての外毒素の作用により生
じる。これらの状態は、スタフィロコッカスによる食品
汚染、熱傷皮膚症候群および毒素ショック症候群を包含
する。アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ａａＲ
Ｓ）は、すべての細胞性生物における同種のｔＲＮＡ種
へのアミノ酸の結合を触媒する。一般的には、伸長中の
ポリペプチド鎖に取り込まれる２０種のアミノ酸のそれ
ぞれが対応するａａＲＳを有している。しかしながら、
このことが普遍的真実でなはく、グルタミニル−ｔＲＮ
Ａシンセターゼ（ＱＲＳ）活性が試験したすべてのグラ
ム陽性原核生物、いくつかのグラム陰性原核生物および
いくつか（おそらくすべて）の真核生物のプラスチドに
は存在しないということは、現在十分に明らかにされて
いない。グルタミニル−ｔＲＮＡシンセターゼ活性の不
存在にもかかわらず、明らかに細胞は正確な蛋白合成に
必要なＧｌｎ−ｔＲＮＡＧｌｎを産生しうる。このこと
が行われる機構には、グルタミル−ｔＲＮＡシンセター
ゼ（ＥＲＳ）によるｔＲＮＡＧｌｎの誤ったアミノアシ
ル化により生じる中間体としてのＧｌｕ−ｔＲＮＡＧｌ
ｎの生成が関与している。「正しい」最終生成物Ｇｌｎ
−ｔＲＮＡＧｌｎは、結合したグルタミン酸残基へのア
ミン基の転移によりＧｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｎから生じ
る。この反応は、−ｔＲＮＡおよびＭｇ2+／ＡＴＰ−依
存性アミドトランスフェラーゼ（ＲＮＡ−依存性アミド
トランスフェラーゼ−ＲＡＴ）により触媒される。潜在
的には、グラム陽性生物およびいくつかのグラム陰性生
物におけるこの普遍的反応を阻害することは、効果的に
Ｇｌｎ−ｔＲＮＡＧｌｎ欠乏を引き起こし、その結果、
細菌蛋白合成を中断させるであろう。アミドトランスフ
ェラーゼ反応は多くの生物において明らかにされている
が、生物学的な系において徹底的な研究はほとんどされ
ておらず、当該反応は天然界において広く起こりうると
思われ、以下の生物において明らかとなっている：バチ
ルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチル
ス・ズブチリス（Bacullus subtilis）、ラクトバチル
ス・アシドフィルス（Lactobacillusacidophilus）、ラ
クトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaric
us）、ストレプトミセス・コエリコロル（Streptomyces
coelicolor）、エンテロコッカス・フェカリス（Enter
ococcus faecalis）、リゾビウム・メリロチ（Rhizobiu
m meliloti）およびいくつかの原始細菌、シアノバクテ
リア、ミトコンドリアおよび葉緑体。当該プロセスはい
くつかのグラム陰性真正細菌（例えば、エシェリシア・
コリ（Escherichia coli））には存在せず、さらにＱＲ
Ｓ活性の存在により当該反応が不要となっている真核細
胞の細胞質ゾルにも存在しない。当該酵素活性は、大
体、他のアミノトランスフェラーゼおよびグルタミンシ
ンターゼ（ＧＳ）の活性と類似しているが、後者の場合
には好ましいアミド供与体はグルタミンに対してはＮＨ
4+である。ＲＡＴの推定上の生理学的基質はグルタミン
であり、代謝においてグルタミンは大部分のアミドトラ
ンスフェラーゼ反応の好ましい基質であり、バチルス・
ズブチリス、クラミドモナス・ラインハルディ（Chlamy
domonas reinhardtii）およびラクトバチルス・ブルガ
リクスにおいてはＲＡＴについてインビトロ基質中最良
のものであることがわかっているが、アスパラギンおよ
びＮＨ4+はある程度基質となりうる（バチルス・ズブチ
リスにおいてはＫｍはＧｌｎに対して１０μＭ、Ａｓｎ
に対して１００−２００μＭ、ＮＨ4Ｃｌに対して５ｍ
Ｍまたはそれ以下）。証拠（１）は、ＧＳと同様、グル
タミン分子はアミド化反応において中間体としてγ−炭
素においてホスホリレーションを受けることを示唆して
いる。ＲＡＴ活性に必要なすべてのものはＭｇ2+、ＡＴ
Ｐ、Ｇｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｎおよびアミド供与体（グル
タミン）である。
子産物を抗生物質開発の標的として用いることは特に好
ましいことである。スタフィロコッカスは微生物のなか
でも医学的に重要な属を構成している。それらは２つの
タイプの疾病、すなわち、侵入性および毒素発生性の疾
病を生じることが知られている。一般的には、侵入性感
染は、皮膚表面および深部組織の両方に影響する膿瘍形
成により特徴づけられている。エス・アウレウス（S.au
reus）は、癌患者における菌血症の２番目の主要病因で
ある。骨髄炎、敗血性関節炎、敗血性血栓静脈炎および
急性細菌性心内膜炎も比較的よく見られる。スタフィロ
コッカスの毒素発生特性により生じる少なくとも３つの
臨床的症状がある。これらの疾病発現は、組織侵入およ
び菌血症に対抗するものとしての外毒素の作用により生
じる。これらの状態は、スタフィロコッカスによる食品
汚染、熱傷皮膚症候群および毒素ショック症候群を包含
する。アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ａａＲ
Ｓ）は、すべての細胞性生物における同種のｔＲＮＡ種
へのアミノ酸の結合を触媒する。一般的には、伸長中の
ポリペプチド鎖に取り込まれる２０種のアミノ酸のそれ
ぞれが対応するａａＲＳを有している。しかしながら、
このことが普遍的真実でなはく、グルタミニル−ｔＲＮ
Ａシンセターゼ（ＱＲＳ）活性が試験したすべてのグラ
ム陽性原核生物、いくつかのグラム陰性原核生物および
いくつか（おそらくすべて）の真核生物のプラスチドに
は存在しないということは、現在十分に明らかにされて
いない。グルタミニル−ｔＲＮＡシンセターゼ活性の不
存在にもかかわらず、明らかに細胞は正確な蛋白合成に
必要なＧｌｎ−ｔＲＮＡＧｌｎを産生しうる。このこと
が行われる機構には、グルタミル−ｔＲＮＡシンセター
ゼ（ＥＲＳ）によるｔＲＮＡＧｌｎの誤ったアミノアシ
ル化により生じる中間体としてのＧｌｕ−ｔＲＮＡＧｌ
ｎの生成が関与している。「正しい」最終生成物Ｇｌｎ
−ｔＲＮＡＧｌｎは、結合したグルタミン酸残基へのア
ミン基の転移によりＧｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｎから生じ
る。この反応は、−ｔＲＮＡおよびＭｇ2+／ＡＴＰ−依
存性アミドトランスフェラーゼ（ＲＮＡ−依存性アミド
トランスフェラーゼ−ＲＡＴ）により触媒される。潜在
的には、グラム陽性生物およびいくつかのグラム陰性生
物におけるこの普遍的反応を阻害することは、効果的に
Ｇｌｎ−ｔＲＮＡＧｌｎ欠乏を引き起こし、その結果、
細菌蛋白合成を中断させるであろう。アミドトランスフ
ェラーゼ反応は多くの生物において明らかにされている
が、生物学的な系において徹底的な研究はほとんどされ
ておらず、当該反応は天然界において広く起こりうると
思われ、以下の生物において明らかとなっている：バチ
ルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチル
ス・ズブチリス（Bacullus subtilis）、ラクトバチル
ス・アシドフィルス（Lactobacillusacidophilus）、ラ
クトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaric
us）、ストレプトミセス・コエリコロル（Streptomyces
coelicolor）、エンテロコッカス・フェカリス（Enter
ococcus faecalis）、リゾビウム・メリロチ（Rhizobiu
m meliloti）およびいくつかの原始細菌、シアノバクテ
リア、ミトコンドリアおよび葉緑体。当該プロセスはい
くつかのグラム陰性真正細菌（例えば、エシェリシア・
コリ（Escherichia coli））には存在せず、さらにＱＲ
Ｓ活性の存在により当該反応が不要となっている真核細
胞の細胞質ゾルにも存在しない。当該酵素活性は、大
体、他のアミノトランスフェラーゼおよびグルタミンシ
ンターゼ（ＧＳ）の活性と類似しているが、後者の場合
には好ましいアミド供与体はグルタミンに対してはＮＨ
4+である。ＲＡＴの推定上の生理学的基質はグルタミン
であり、代謝においてグルタミンは大部分のアミドトラ
ンスフェラーゼ反応の好ましい基質であり、バチルス・
ズブチリス、クラミドモナス・ラインハルディ（Chlamy
domonas reinhardtii）およびラクトバチルス・ブルガ
リクスにおいてはＲＡＴについてインビトロ基質中最良
のものであることがわかっているが、アスパラギンおよ
びＮＨ4+はある程度基質となりうる（バチルス・ズブチ
リスにおいてはＫｍはＧｌｎに対して１０μＭ、Ａｓｎ
に対して１００−２００μＭ、ＮＨ4Ｃｌに対して５ｍ
Ｍまたはそれ以下）。証拠（１）は、ＧＳと同様、グル
タミン分子はアミド化反応において中間体としてγ−炭
素においてホスホリレーションを受けることを示唆して
いる。ＲＡＴ活性に必要なすべてのものはＭｇ2+、ＡＴ
Ｐ、Ｇｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｎおよびアミド供与体（グル
タミン）である。
【０００３】他のアミドトランスフェラーゼとは異なる
本発明の新規ＲＡＴに関するユニークな特徴は、その活
性がＧｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｎに特異的に依存することで
ある（ＲＡＴは、リボヌクレアーゼ処理されたＧｌｕ−
ｔＲＮＡＧｌｎのアミド転移を触媒せず、かつＧｌｕ−
ｔＲＮＡＧｌｕのアミド転移を触媒しないであろう。さ
らにクラミドモナス由来のＲＡＴはＡＴＰ存在下グルタ
ミン不存在下においてＧｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｎと堅固な
複合体を形成するであろうということが示されてい
る）。それゆえ、ＲＡＴは、グルタミンおよびＡＴＰを
必ず認識する蛋白構造エレメントを有するのみならず
（例えば、ＧＳおよびＱＲＳも同様）、特異的に、そし
ておそらくユニークにＧｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｎを認識す
るに違いない。２つの刊行物には、阻害剤に対する感受
性が議論されている（２、３）。結果は各ケースで異な
り、この理由な不明である。酵素源は異なるが（ビー・
ズブチリス（B.subtilis）およびクラミドモナス・ライ
ンハルディ）、明らかに矛盾するデータが微妙な条件の
相違により生じうる。ビー・ズブチリス由来のＲＡＴの
場合、酵素は一般的なＧＳ阻害剤ＭＳＯＸ（メチオニン
スルホキシイミン）に対して感受性があるが、グルタミ
ンアミドランスフェラーゼ阻害剤ＤＯＮ（６−ジアゾ−
５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン）によっては阻害されな
い。シー・ラインハルディ（C.reinhardtii）由来のＲ
ＡＴはＤＯＮに対して完全に感受性があることが報告さ
れている。ビー・ズブチリス（３）およびクラミドモナ
ス・ラインハルディ（２）の両方からのＲＡＴの精製の
試みが行われた。ビー・ズブチリスからの生成物は部分
精製されただけであり、不安定で、−７０℃において一
晩でさえも活性を保持せず、熱に対して不安定であった
（ＧＳとは異なる）。シー・ラインハルディからの精製
はうまく行った。蛋白はサブユニット分子量６３ｋＤａ
未満であり、ホモダイマーであった。蛋白は均一または
ほぼ均一に精製された。１９９０年のこの精製手順の公
表にもかかわらず、蛋白またはＤＮＡ配列のデータは使
用不可能であると思われる。
本発明の新規ＲＡＴに関するユニークな特徴は、その活
性がＧｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｎに特異的に依存することで
ある（ＲＡＴは、リボヌクレアーゼ処理されたＧｌｕ−
ｔＲＮＡＧｌｎのアミド転移を触媒せず、かつＧｌｕ−
ｔＲＮＡＧｌｕのアミド転移を触媒しないであろう。さ
らにクラミドモナス由来のＲＡＴはＡＴＰ存在下グルタ
ミン不存在下においてＧｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｎと堅固な
複合体を形成するであろうということが示されてい
る）。それゆえ、ＲＡＴは、グルタミンおよびＡＴＰを
必ず認識する蛋白構造エレメントを有するのみならず
（例えば、ＧＳおよびＱＲＳも同様）、特異的に、そし
ておそらくユニークにＧｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｎを認識す
るに違いない。２つの刊行物には、阻害剤に対する感受
性が議論されている（２、３）。結果は各ケースで異な
り、この理由な不明である。酵素源は異なるが（ビー・
ズブチリス（B.subtilis）およびクラミドモナス・ライ
ンハルディ）、明らかに矛盾するデータが微妙な条件の
相違により生じうる。ビー・ズブチリス由来のＲＡＴの
場合、酵素は一般的なＧＳ阻害剤ＭＳＯＸ（メチオニン
スルホキシイミン）に対して感受性があるが、グルタミ
ンアミドランスフェラーゼ阻害剤ＤＯＮ（６−ジアゾ−
５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン）によっては阻害されな
い。シー・ラインハルディ（C.reinhardtii）由来のＲ
ＡＴはＤＯＮに対して完全に感受性があることが報告さ
れている。ビー・ズブチリス（３）およびクラミドモナ
ス・ラインハルディ（２）の両方からのＲＡＴの精製の
試みが行われた。ビー・ズブチリスからの生成物は部分
精製されただけであり、不安定で、−７０℃において一
晩でさえも活性を保持せず、熱に対して不安定であった
（ＧＳとは異なる）。シー・ラインハルディからの精製
はうまく行った。蛋白はサブユニット分子量６３ｋＤａ
未満であり、ホモダイマーであった。蛋白は均一または
ほぼ均一に精製された。１９９０年のこの精製手順の公
表にもかかわらず、蛋白またはＤＮＡ配列のデータは使
用不可能であると思われる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】明らかに、化合物の抗
生物質活性をスクリーニングするために用いることがで
きる因子、ならびに感染、機能障害および疾患の病因に
おける役割を決定するためにも用いることができる因子
が必要とされている。また、感染、機能障害または疾患
の予防、改善または抑制に役割を果たすことができるこ
のような因子ならびにアンタゴニストおよびアゴニスト
の同定および特徴づけも必要とされている。
生物質活性をスクリーニングするために用いることがで
きる因子、ならびに感染、機能障害および疾患の病因に
おける役割を決定するためにも用いることができる因子
が必要とされている。また、感染、機能障害または疾患
の予防、改善または抑制に役割を果たすことができるこ
のような因子ならびにアンタゴニストおよびアゴニスト
の同定および特徴づけも必要とされている。
【０００５】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
本発明の目的は、ＲＡＴポリペプチドの配列決定により
決定されるアミノ酸配列との相同性により、新規ＲＡＴ
ポリペプチドとして同定されたポリペプチドを提供する
ことである。
本発明の目的は、ＲＡＴポリペプチドの配列決定により
決定されるアミノ酸配列との相同性により、新規ＲＡＴ
ポリペプチドとして同定されたポリペプチドを提供する
ことである。
【０００６】本発明のさらなる目的は、ＲＡＴポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド、特に本明細書にお
いてＲＡＴと称するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを提供することである。本発明のこの態様のと
りわけ好ましい具体例において、ポリヌクレオチドはＲ
ＡＴポリペプチドをコードしている領域を含む。本発明
の別のとりわけ好ましい態様において、ＲＡＴ蛋白の配
列決定により決定されるアミノ酸配列含む、スタフィロ
コッカス・アウレウス（Staphylococcusaureus）由来の
新規ＲＡＴ蛋白、またはそれらの変種がある。本発明の
この態様によれば、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１中に
含まれるスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９
株により発現可能な成熟ポリペプチドをコードする単離
核酸分子が提供される。本発明のこの態様によれば、Ｒ
ＡＴ、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスのＲＡ
Ｔをコードする、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等
の単離核酸分子が提供される。本発明のこの態様のさら
なる態様は、生物学的、診断学的、予防的、臨床的また
は治療的に有用なそれらの変種、およびこれらを含んで
なる組成物を包含する。
チドをコードするポリヌクレオチド、特に本明細書にお
いてＲＡＴと称するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを提供することである。本発明のこの態様のと
りわけ好ましい具体例において、ポリヌクレオチドはＲ
ＡＴポリペプチドをコードしている領域を含む。本発明
の別のとりわけ好ましい態様において、ＲＡＴ蛋白の配
列決定により決定されるアミノ酸配列含む、スタフィロ
コッカス・アウレウス（Staphylococcusaureus）由来の
新規ＲＡＴ蛋白、またはそれらの変種がある。本発明の
この態様によれば、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１中に
含まれるスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９
株により発現可能な成熟ポリペプチドをコードする単離
核酸分子が提供される。本発明のこの態様によれば、Ｒ
ＡＴ、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスのＲＡ
Ｔをコードする、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等
の単離核酸分子が提供される。本発明のこの態様のさら
なる態様は、生物学的、診断学的、予防的、臨床的また
は治療的に有用なそれらの変種、およびこれらを含んで
なる組成物を包含する。
【０００７】本発明の別の態様によれば、治療的、予防
的目的の、とりわけ遺伝学的免疫のための本発明ポリヌ
クレオチドの使用が提供される。本発明のこの態様にお
けるとりわけ好ましい具体例は、ＲＡＴの自然発生対立
遺伝子変種およびそれによりコードされるポリペプチド
である。本発明のこの態様によれば、本明細書でＲＡＴ
と称するスタフィロコッカス・アウレウスの新規ポリペ
プチド、ならびに生物学的、診断学的、予防的、臨床的
または治療的に有用なそれらの変種、およびこれらを含
んでなる組成物が提供される。本発明のこの態様のとり
わけ好ましい具体例は、ＲＡＴ遺伝子の自然発生対立遺
伝子によりコードされるＲＡＴポリペプチドの変種であ
る。本発明のこの態様における好ましい具体例におい
て、前述のＲＡＴポリペプチドの製造方法が提供され
る。本発明のさらに別の態様によれば、例えば抗体等の
抗菌物質として有用な、このようなポリペプチドに対す
る阻害物質が提供される。
的目的の、とりわけ遺伝学的免疫のための本発明ポリヌ
クレオチドの使用が提供される。本発明のこの態様にお
けるとりわけ好ましい具体例は、ＲＡＴの自然発生対立
遺伝子変種およびそれによりコードされるポリペプチド
である。本発明のこの態様によれば、本明細書でＲＡＴ
と称するスタフィロコッカス・アウレウスの新規ポリペ
プチド、ならびに生物学的、診断学的、予防的、臨床的
または治療的に有用なそれらの変種、およびこれらを含
んでなる組成物が提供される。本発明のこの態様のとり
わけ好ましい具体例は、ＲＡＴ遺伝子の自然発生対立遺
伝子によりコードされるＲＡＴポリペプチドの変種であ
る。本発明のこの態様における好ましい具体例におい
て、前述のＲＡＴポリペプチドの製造方法が提供され
る。本発明のさらに別の態様によれば、例えば抗体等の
抗菌物質として有用な、このようなポリペプチドに対す
る阻害物質が提供される。
【０００８】本発明のこの態様における１の好ましい態
様によれば、（ｉ）発現の評価、（ｉｉ）疾病の治療、
例えば、上部気道感染（例えば、中耳炎、細菌性気道
炎、急性喉頭蓋炎、甲状腺炎）、下部気道感染（例え
ば、蓄膿、肺の膿瘍）、心臓の感染（例えば、感染性心
内膜炎）、胃腸の感染（例えば、分泌性下痢、脾臓の膿
瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、脳の膿瘍）、
目の感染（眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔お
よび眼かの蜂巣炎、涙嚢炎）、腎臓および尿道感染（例
えば、精巣上体炎、腎内および腎周囲の膿瘍、毒性ショ
ック症候群）、皮膚感染（例えば、インペチゴ、毛包
炎、皮膚の膿瘍、蜂巣炎、傷の感染、細菌性筋炎）、骨
および関節の感染（例えば、敗血性関節炎、骨髄炎）の
ごとき疾病の治療、（ｉｉｉ）遺伝学的変種のアッセ
イ、ならびに（ｉｖ）生物にＲＡＴポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドを投与して細菌（特に、スタフィロコ
ッカス・アウレウス細菌）に対する免疫学的応答の生起
のための製品、組成物および方法が提供される。
様によれば、（ｉ）発現の評価、（ｉｉ）疾病の治療、
例えば、上部気道感染（例えば、中耳炎、細菌性気道
炎、急性喉頭蓋炎、甲状腺炎）、下部気道感染（例え
ば、蓄膿、肺の膿瘍）、心臓の感染（例えば、感染性心
内膜炎）、胃腸の感染（例えば、分泌性下痢、脾臓の膿
瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、脳の膿瘍）、
目の感染（眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔お
よび眼かの蜂巣炎、涙嚢炎）、腎臓および尿道感染（例
えば、精巣上体炎、腎内および腎周囲の膿瘍、毒性ショ
ック症候群）、皮膚感染（例えば、インペチゴ、毛包
炎、皮膚の膿瘍、蜂巣炎、傷の感染、細菌性筋炎）、骨
および関節の感染（例えば、敗血性関節炎、骨髄炎）の
ごとき疾病の治療、（ｉｉｉ）遺伝学的変種のアッセ
イ、ならびに（ｉｖ）生物にＲＡＴポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドを投与して細菌（特に、スタフィロコ
ッカス・アウレウス細菌）に対する免疫学的応答の生起
のための製品、組成物および方法が提供される。
【０００９】本発明のこの態様および他の態様における
１の好ましい具体例によれば、詳細には、厳密な条件で
ＲＡＴポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドが提供される。
１の好ましい具体例によれば、詳細には、厳密な条件で
ＲＡＴポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドが提供される。
【００１０】本発明のこの態様における１の好ましい具
体例において、ＲＡＴポリペプチドに対する抗体が提供
される。
体例において、ＲＡＴポリペプチドに対する抗体が提供
される。
【００１１】本発明のもう１つの態様によれば、好まし
くは静菌性または殺菌性でもあるＲＡＴアゴニストおよ
びアンタゴニストがそれぞれ提供される。本発明のさら
なる態様において、細胞または多細胞生物に投与するＲ
ＡＴポリヌクレオチドまたはＲＡＴポリペプチドを含ん
でなる組成物が提供される。開示した本発明の意図およ
び範囲内での種々の変更および修飾は、以下の記載およ
び本明細書のその他の部分の知見により、当業者に容易
に明らかとなろう。
くは静菌性または殺菌性でもあるＲＡＴアゴニストおよ
びアンタゴニストがそれぞれ提供される。本発明のさら
なる態様において、細胞または多細胞生物に投与するＲ
ＡＴポリヌクレオチドまたはＲＡＴポリペプチドを含ん
でなる組成物が提供される。開示した本発明の意図およ
び範囲内での種々の変更および修飾は、以下の記載およ
び本明細書のその他の部分の知見により、当業者に容易
に明らかとなろう。
【００１２】用語集 以下の定義は、本明細書、とりわけ実施例において汎用
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。「宿主細胞」は外来ポリヌクレオチド配列により
形質転換もしくはトランスフェクションされた、または
形質転換もしくはトランスフェクションされ得る細胞で
ある。
される特定の用語の理解を容易にするために示すもので
ある。「宿主細胞」は外来ポリヌクレオチド配列により
形質転換もしくはトランスフェクションされた、または
形質転換もしくはトランスフェクションされ得る細胞で
ある。
【００１３】「同一性」とは、当該分野に周知であるよ
うに、二つもしくはそれ以上のポリペプチド配列また二
つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係で
あり、配列を比較して決定する。当該分野において、
「同一性」とは、場合によってはこのような配列の鎖の
適合性により決定できる、ポリペプチドまたはポリヌク
レオチド配列の配列関連性の程度をも意味する。「同一
性」および「類似性」は共に既知の方法により容易に算
出できる（Computational Molecular Biology，Lesk,A.
M.編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、
ニューヨーク、1988年；Biocomputing：Informatics an
d Genome Projects，Smith,D.W.編、アカデミック・プ
レス、ニューヨーク、1993年；Computer Analysis of S
equenceData，パートＩ，Griffin,A.M.およびGriffin,
H.G.編、ヒューマン・プレス、ニュージャージー、1994
年；Sequence Analysis in Molecular Biology，vonHei
nje,G.、アカデミック・プレス、1987年；およびSequen
ce Analysis Primer，Gribskov,M.およびDevereux,J.
編、Ｍストックトン・プレス、ニューヨーク、1991
年）。二つの配列の同一性および類似性を測定する方法
は多くあるが、両用語共当業者に周知である（Sequence
Analysis in Molecular Biology，vonHeinje,G.、アカ
デミック・プレス、1987年；Sequence Analysis Prime
r，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトン
・プレス、ニューヨーク、1991年；ならびにCarillo,H.
およびLipman,D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073（19
88））。配列間の同一性または類似性を測定するために
通常用いられる方法はCarillo,H.およびLipman,D.，SIA
M J.Applied Math.，48:1073（1988）等に開示されてい
るが、これらに限定するものではない。同一性を決定す
るための好ましい方法は、試験する配列間で最も良く適
合するように設計される。同一性および類似性を決定す
る方法は、公に入手できるコンピュータープログラムに
集成されている。二つの配列間の同一性および類似性を
測定する好ましいコンピュータープログラム法には、Ｇ
ＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J.ら、NucleicAc
ids Research 12(1):387（1984）、BLASTP、BLASTN、お
よびFASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215:403-41
0（1990）））等があるが、これらに限定するものでは
ない。BLAST XプログラムはNCBIおよびその他の供給源
より公に入手可能である（BLAST Manual、Altschul,S.
ら、NCBI NLMNIHベゼスダ、メリーランド州20894；Alts
chul,S.ら、J.Molec.Biol.215:403-410（1990））。
うに、二つもしくはそれ以上のポリペプチド配列また二
つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係で
あり、配列を比較して決定する。当該分野において、
「同一性」とは、場合によってはこのような配列の鎖の
適合性により決定できる、ポリペプチドまたはポリヌク
レオチド配列の配列関連性の程度をも意味する。「同一
性」および「類似性」は共に既知の方法により容易に算
出できる（Computational Molecular Biology，Lesk,A.
M.編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、
ニューヨーク、1988年；Biocomputing：Informatics an
d Genome Projects，Smith,D.W.編、アカデミック・プ
レス、ニューヨーク、1993年；Computer Analysis of S
equenceData，パートＩ，Griffin,A.M.およびGriffin,
H.G.編、ヒューマン・プレス、ニュージャージー、1994
年；Sequence Analysis in Molecular Biology，vonHei
nje,G.、アカデミック・プレス、1987年；およびSequen
ce Analysis Primer，Gribskov,M.およびDevereux,J.
編、Ｍストックトン・プレス、ニューヨーク、1991
年）。二つの配列の同一性および類似性を測定する方法
は多くあるが、両用語共当業者に周知である（Sequence
Analysis in Molecular Biology，vonHeinje,G.、アカ
デミック・プレス、1987年；Sequence Analysis Prime
r，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトン
・プレス、ニューヨーク、1991年；ならびにCarillo,H.
およびLipman,D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073（19
88））。配列間の同一性または類似性を測定するために
通常用いられる方法はCarillo,H.およびLipman,D.，SIA
M J.Applied Math.，48:1073（1988）等に開示されてい
るが、これらに限定するものではない。同一性を決定す
るための好ましい方法は、試験する配列間で最も良く適
合するように設計される。同一性および類似性を決定す
る方法は、公に入手できるコンピュータープログラムに
集成されている。二つの配列間の同一性および類似性を
測定する好ましいコンピュータープログラム法には、Ｇ
ＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J.ら、NucleicAc
ids Research 12(1):387（1984）、BLASTP、BLASTN、お
よびFASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215:403-41
0（1990）））等があるが、これらに限定するものでは
ない。BLAST XプログラムはNCBIおよびその他の供給源
より公に入手可能である（BLAST Manual、Altschul,S.
ら、NCBI NLMNIHベゼスダ、メリーランド州20894；Alts
chul,S.ら、J.Molec.Biol.215:403-410（1990））。
【００１４】「単離」とは、「人間の手により」天然の
状態から変化させられた、すなわち、それが天然に存在
する場合、元来の環境から変化もしくは除去、またはそ
の両方が行われたことを意味する。例えばポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドが、天然の状態で生物に存在す
る場合は、「単離」されていないが、同一のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドが、天然に共存する物質から
分離されている場合は、本明細書に用いる用語である、
「単離」がなされている。
状態から変化させられた、すなわち、それが天然に存在
する場合、元来の環境から変化もしくは除去、またはそ
の両方が行われたことを意味する。例えばポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドが、天然の状態で生物に存在す
る場合は、「単離」されていないが、同一のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドが、天然に共存する物質から
分離されている場合は、本明細書に用いる用語である、
「単離」がなされている。
【００１５】「ポリヌクレオチド」とは、修飾されてい
ないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡも
しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチ
ドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。
「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、
一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖
および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および
二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合
物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより通常には二本鎖も
しくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物
であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド
分子を意味するが、これに限定するものではない。さら
に、本明細書で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもし
くはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領
域を意味する。そのような領域における鎖は同一の分子
または異なる分子からのものでよい。この領域は一つま
たはそれ以上の分子の全てを含み得るが、より典型的に
はいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領域
の分子の一つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、一
つまたはそれ以上の修飾した塩基を含有する、上述のＤ
ＮＡまたはＲＮＡ等を含む。このように、安定性または
その他の理由で修飾した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮ
Ａは、本明細書で意図する用語である「ポリヌクレオチ
ド」である。さらに、イノシン等の普通でない塩基、ま
たはトリチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲ
ＮＡも（二つの例だけをを示す）本明細書の用語、ポリ
ヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有用な目的
を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多くの修飾が
なされていることは、明らかであろう。本明細書で用い
る「ポリヌクレオチド」なる用語は、ポリヌクレオチド
のこのような化学的、酵素的または代謝的に修飾された
形態、ならびにウイルスおよび、例えば単細胞および複
合細胞等の細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的
形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしばオ
リゴヌクレオチドと称する短いポリヌクレオチドを包含
する。
ないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡも
しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチ
ドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。
「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、
一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖
および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および
二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合
物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより通常には二本鎖も
しくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物
であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド
分子を意味するが、これに限定するものではない。さら
に、本明細書で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもし
くはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領
域を意味する。そのような領域における鎖は同一の分子
または異なる分子からのものでよい。この領域は一つま
たはそれ以上の分子の全てを含み得るが、より典型的に
はいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領域
の分子の一つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、一
つまたはそれ以上の修飾した塩基を含有する、上述のＤ
ＮＡまたはＲＮＡ等を含む。このように、安定性または
その他の理由で修飾した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮ
Ａは、本明細書で意図する用語である「ポリヌクレオチ
ド」である。さらに、イノシン等の普通でない塩基、ま
たはトリチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲ
ＮＡも（二つの例だけをを示す）本明細書の用語、ポリ
ヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有用な目的
を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多くの修飾が
なされていることは、明らかであろう。本明細書で用い
る「ポリヌクレオチド」なる用語は、ポリヌクレオチド
のこのような化学的、酵素的または代謝的に修飾された
形態、ならびにウイルスおよび、例えば単細胞および複
合細胞等の細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的
形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしばオ
リゴヌクレオチドと称する短いポリヌクレオチドを包含
する。
【００１６】「ポリペプチド」は、ペプチド結合または
修飾ペプチド結合により互いに結合している２個または
それ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたは蛋白を
意味する。「ポリペプチド」は、通常、例えばペプチ
ド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖、
および一般的に蛋白と称する長鎖の両方を意味する。ポ
リペプチドは、遺伝子によりコードされた２０種のアミ
ノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。「ポリペプチ
ド」には、プロセッシングおよびその他の翻訳後修飾の
ような天然の工程により修飾されたものが含まれるが、
当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾される。こ
のような修飾は基礎的な参考書およびさらに詳細な論文
ならびに多数の研究文献にも詳しく記載されており、こ
れらは当業者に周知である。同一の型の修飾は、ポリペ
プチドのいくつかの部位において同一または異なる程度
で存在し得ることは理解されよう。また、ポリペプチド
は多くの型の修飾をも含み得る。修飾は、ペプチド骨
格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端
等のポリペプチドの任意の部位で起こりうる。修飾に
は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミ
ド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌク
レオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質ま
たは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール
の共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合形成、
脱メチル化、交差架橋共有結合形成、システイン形成、
ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキ
シル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、
ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解
的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、
グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基の
ガンマ−カルボキシル化、水酸化およびＡＤＰリボシル
化、セレノイル化、アルギニル化のようなトランスファ
ーＲＮＡにより媒介される蛋白へのアミノ酸の添加、な
らびにユビキチネーションなどがある。例えばProteins
-Structure and Molecular Properties、第２版、T.E.C
reighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク（1
993）およびPosttranslational Covalent Modification
of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレス、
ニューヨーク（1983）のWold,F.,Posttranslational Pr
oteinModifications ：Perspective and Prospects、1
〜12頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-646（199
0）およびRattanら、Protein Synthesis：Posttrans-la
tional Modifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.Sci.6
63:48-62（1992）を参照されたい。ポリペプチドは分岐
または環状でよく、分岐していてもいなくてもよい。環
状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後の
自然発生的プロセッシングの結果であり、同様に全く合
成的な方法で合成できる。
修飾ペプチド結合により互いに結合している２個または
それ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたは蛋白を
意味する。「ポリペプチド」は、通常、例えばペプチ
ド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖、
および一般的に蛋白と称する長鎖の両方を意味する。ポ
リペプチドは、遺伝子によりコードされた２０種のアミ
ノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。「ポリペプチ
ド」には、プロセッシングおよびその他の翻訳後修飾の
ような天然の工程により修飾されたものが含まれるが、
当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾される。こ
のような修飾は基礎的な参考書およびさらに詳細な論文
ならびに多数の研究文献にも詳しく記載されており、こ
れらは当業者に周知である。同一の型の修飾は、ポリペ
プチドのいくつかの部位において同一または異なる程度
で存在し得ることは理解されよう。また、ポリペプチド
は多くの型の修飾をも含み得る。修飾は、ペプチド骨
格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端
等のポリペプチドの任意の部位で起こりうる。修飾に
は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミ
ド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌク
レオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質ま
たは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール
の共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合形成、
脱メチル化、交差架橋共有結合形成、システイン形成、
ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキ
シル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、
ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解
的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、
グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基の
ガンマ−カルボキシル化、水酸化およびＡＤＰリボシル
化、セレノイル化、アルギニル化のようなトランスファ
ーＲＮＡにより媒介される蛋白へのアミノ酸の添加、な
らびにユビキチネーションなどがある。例えばProteins
-Structure and Molecular Properties、第２版、T.E.C
reighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク（1
993）およびPosttranslational Covalent Modification
of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレス、
ニューヨーク（1983）のWold,F.,Posttranslational Pr
oteinModifications ：Perspective and Prospects、1
〜12頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-646（199
0）およびRattanら、Protein Synthesis：Posttrans-la
tional Modifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.Sci.6
63:48-62（1992）を参照されたい。ポリペプチドは分岐
または環状でよく、分岐していてもいなくてもよい。環
状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後の
自然発生的プロセッシングの結果であり、同様に全く合
成的な方法で合成できる。
【００１７】本明細書で用いる「変種」なる用語は、対
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、参照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、
以下に論じるように、参照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠損、融合およ
び末端切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別
の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的
に差異は、参照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体
的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるよう
に限定される。変種および対照ポリペプチドは、１また
はそれ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで起
こることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換また
は挿入したアミノ酸残基は、遺伝的コードによりコード
されたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチド
またはポリペプチドの変種は例えば対立遺伝子変種のよ
うな自然発生的なものであってもよく、あるいは自然発
生することが知られていない変種であってもよい。ポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの非自然発生変種は、
突然変異技術、直接的合成、および当業者に既知のその
他の組換え技術により製造できる。
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、参照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、
以下に論じるように、参照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠損、融合およ
び末端切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別
の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的
に差異は、参照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体
的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるよう
に限定される。変種および対照ポリペプチドは、１また
はそれ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで起
こることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換また
は挿入したアミノ酸残基は、遺伝的コードによりコード
されたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチド
またはポリペプチドの変種は例えば対立遺伝子変種のよ
うな自然発生的なものであってもよく、あるいは自然発
生することが知られていない変種であってもよい。ポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの非自然発生変種は、
突然変異技術、直接的合成、および当業者に既知のその
他の組換え技術により製造できる。
【００１８】発明の説明 本発明は、以下により詳細に説明される新規ＲＡＴポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。特に、本発
明は、ＲＡＴ蛋白配列から得られるスタフィロコッカス
・アウレウスのものに相同的な新規ＲＡＴ遺伝子のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は特
に、ＲＡＴ蛋白の分析により決定されるヌクレオチド配
列およびアミノ酸配列を有するＲＡＴ、ならびにＮＣＩ
ＭＢ受託番号４０７７１中のＤＮＡのＲＡＴヌクレオチ
ド配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列に関
する。本発明は、エス・アウレウスＷＣＵＨ２９の細胞
溶解物から調製されるＲＡＴ蛋白を提供する。その溶解
物は、約０.１ないし０.３ナノモル／分／ｍｇのＲＡＴ
比活性またはＲＡＴ活性を有することが示された。本明
細書の実施例はＲＡＴ活性測定方法を示す。高度に精製
された標品は約２５ナノモル／分／ｍｇの比活性を有す
る。この精製物をネイティブなＳＤＳポリアクリルアミ
ド電気泳動ゲルに供すと、分子量１１０ｋＤのところに
主要種が見いだされる。還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電
気泳動により、約５４ｋＤおよび５５ｋＤの２つの種が
示される。このことは、分子がヘテロダイマーとして存
在することを示唆する。ヘテロトリマーおよびモノマー
形態も本発明により提供される。本発明ポリペプチド
は、とりわけ、５４ｋＤ、５５ｋＤおよび１１０ｋＤヘ
テロダイマーを包含する。
ペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。特に、本発
明は、ＲＡＴ蛋白配列から得られるスタフィロコッカス
・アウレウスのものに相同的な新規ＲＡＴ遺伝子のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は特
に、ＲＡＴ蛋白の分析により決定されるヌクレオチド配
列およびアミノ酸配列を有するＲＡＴ、ならびにＮＣＩ
ＭＢ受託番号４０７７１中のＤＮＡのＲＡＴヌクレオチ
ド配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列に関
する。本発明は、エス・アウレウスＷＣＵＨ２９の細胞
溶解物から調製されるＲＡＴ蛋白を提供する。その溶解
物は、約０.１ないし０.３ナノモル／分／ｍｇのＲＡＴ
比活性またはＲＡＴ活性を有することが示された。本明
細書の実施例はＲＡＴ活性測定方法を示す。高度に精製
された標品は約２５ナノモル／分／ｍｇの比活性を有す
る。この精製物をネイティブなＳＤＳポリアクリルアミ
ド電気泳動ゲルに供すと、分子量１１０ｋＤのところに
主要種が見いだされる。還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電
気泳動により、約５４ｋＤおよび５５ｋＤの２つの種が
示される。このことは、分子がヘテロダイマーとして存
在することを示唆する。ヘテロトリマーおよびモノマー
形態も本発明により提供される。本発明ポリペプチド
は、とりわけ、５４ｋＤ、５５ｋＤおよび１１０ｋＤヘ
テロダイマーを包含する。
【００１９】とりわけ実験および宿主感染条件下での生
存性に適用する場合に、細菌における一時的な遺伝子発
現を評価するのに有用な技法がある。それ自体が生存す
るのに必須であるかまたは感染の確立および／もしくは
維持に必須である遺伝子を同定するために、多くの方法
を用いることができる。これらの方法の一つにより配列
の発現を同定することは、その機能についてのさらなる
情報を提供し、スクリーニングの目的物質としてさらに
開発するためにこのような配列の選別を助ける。簡単に
説明すると、これらの研究は例えば： １）シグニチャータグ化突然変異誘発（Signature Tagg
ed Mutagenesis：STM） この技法はHenselら、Science269:400-403（1995）に記
載されており、参照により本明細書に記載されているも
のとみなす。シグニチャータグ化突然変異誘発は、該感
染モデルにおける感染の確立／維持に必要な遺伝子を同
定するものである。この技法は、種々の方法（例えばト
ランスポゾン）により、標的生物を無作為に突然変異を
誘発し、ユニークなＤＮＡ配列タグを突然変異部位に非
常に近接して挿入することに基づく。細菌性突然変異体
の混合集団からのタグおよび感染した宿主から回収した
細菌は、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーシ
ョン分析により検出される。毒性を減じる突然変異体
は、感染した宿主から回収した細菌のプールのタグの欠
如により表される。スタフィロコッカス・アウレウスに
おいては、トランスポゾンシステムはよく発達していな
いので、タグ化突然変異体を作るためのより有効な方法
には、Morrisonら、J.Bacteriol.159:870（1984）に記
載される挿入-複製突然変異誘発法（参照により本明細
書に記載されているものとみなす）を用いる。
存性に適用する場合に、細菌における一時的な遺伝子発
現を評価するのに有用な技法がある。それ自体が生存す
るのに必須であるかまたは感染の確立および／もしくは
維持に必須である遺伝子を同定するために、多くの方法
を用いることができる。これらの方法の一つにより配列
の発現を同定することは、その機能についてのさらなる
情報を提供し、スクリーニングの目的物質としてさらに
開発するためにこのような配列の選別を助ける。簡単に
説明すると、これらの研究は例えば： １）シグニチャータグ化突然変異誘発（Signature Tagg
ed Mutagenesis：STM） この技法はHenselら、Science269:400-403（1995）に記
載されており、参照により本明細書に記載されているも
のとみなす。シグニチャータグ化突然変異誘発は、該感
染モデルにおける感染の確立／維持に必要な遺伝子を同
定するものである。この技法は、種々の方法（例えばト
ランスポゾン）により、標的生物を無作為に突然変異を
誘発し、ユニークなＤＮＡ配列タグを突然変異部位に非
常に近接して挿入することに基づく。細菌性突然変異体
の混合集団からのタグおよび感染した宿主から回収した
細菌は、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーシ
ョン分析により検出される。毒性を減じる突然変異体
は、感染した宿主から回収した細菌のプールのタグの欠
如により表される。スタフィロコッカス・アウレウスに
おいては、トランスポゾンシステムはよく発達していな
いので、タグ化突然変異体を作るためのより有効な方法
には、Morrisonら、J.Bacteriol.159:870（1984）に記
載される挿入-複製突然変異誘発法（参照により本明細
書に記載されているものとみなす）を用いる。
【００２０】２）インビボ発現技法（In Vivo Expressi
on Technology：IVET） この技術はCamilliら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA．91:2
634-2638（1994）およびMahanら、Infectious Agents a
nd Diseases 2:263-268（1994）に記載されている（そ
れぞれを参照により本明細書に記載されているものとみ
なす）。IVETは、実験培養と比較した場合、感染中にア
ップレギュレーション御する遺伝子を同定し、感染にお
ける重要な役割を果たす。この技法により同定される配
列は感染の確立/維持に重要な役割を果たす。この技法
では、標的生物のランダムな染色体フラグメントは、プ
ラスミドベクターのプロモーター不含リポーター遺伝子
の上流でクローン化される。プールを宿主に導入し、感
染後の種々の時間に細菌を回収し、リポーター遺伝子発
現の存在を評価する。発現したリポーター遺伝子の上流
に担持された染色体フラグメントは、感染中に正常なア
ップレギュレーションをうけるプロモーターまたは遺伝
子部分を担持しているはずである。リポーター遺伝子の
上流を配列決定すると、アップレギュレーションされた
遺伝子を同定できる。
on Technology：IVET） この技術はCamilliら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA．91:2
634-2638（1994）およびMahanら、Infectious Agents a
nd Diseases 2:263-268（1994）に記載されている（そ
れぞれを参照により本明細書に記載されているものとみ
なす）。IVETは、実験培養と比較した場合、感染中にア
ップレギュレーション御する遺伝子を同定し、感染にお
ける重要な役割を果たす。この技法により同定される配
列は感染の確立/維持に重要な役割を果たす。この技法
では、標的生物のランダムな染色体フラグメントは、プ
ラスミドベクターのプロモーター不含リポーター遺伝子
の上流でクローン化される。プールを宿主に導入し、感
染後の種々の時間に細菌を回収し、リポーター遺伝子発
現の存在を評価する。発現したリポーター遺伝子の上流
に担持された染色体フラグメントは、感染中に正常なア
ップレギュレーションをうけるプロモーターまたは遺伝
子部分を担持しているはずである。リポーター遺伝子の
上流を配列決定すると、アップレギュレーションされた
遺伝子を同定できる。
【００２１】３）特徴的表示 この技法はChuangら、J.Bacteriol.175:2026-2036（199
3）に記載されている（背景説明のため、参照により本
明細書に記載されているものとみなす）。この方法はラ
ンダムプライムＲＴＰＣＲを用いてｍＲＮＡの存在を同
定することにより、生体に発現する遺伝子を同定する。
感染前および感染後のプロフィールを比較することによ
り、感染中にアップレギュレーションおよびダウンレギ
ュレーションされる遺伝子を同定でき、ＲＴＰＣＲ生成
物を配列決定し、ライブラリー配列に適合させる。
3）に記載されている（背景説明のため、参照により本
明細書に記載されているものとみなす）。この方法はラ
ンダムプライムＲＴＰＣＲを用いてｍＲＮＡの存在を同
定することにより、生体に発現する遺伝子を同定する。
感染前および感染後のプロフィールを比較することによ
り、感染中にアップレギュレーションおよびダウンレギ
ュレーションされる遺伝子を同定でき、ＲＴＰＣＲ生成
物を配列決定し、ライブラリー配列に適合させる。
【００２２】４）トランスポゾン突然変異誘発による条
件付き致死変異体の発生 この技法はde Lorenzo，V.ら、Gene123:17-24（199
3）；Neuwald,A.F.ら、Gene125:69-73（1993）およびTa
kiff,H.E.ら、J.Bacteriol.174:1544-1553（1992）に記
載されており（参照により本明細書に記載されているも
のとみなす）、発現が細胞の生存性に必須である遺伝子
を同定する。この技法では、一方向または両方向でトラ
ンスポゾンから外側へ転写する、調節可能なプロモータ
ーを担持するトランスポゾンを得る。これらのトランス
ポゾンを標的生物に無作為に挿入し、続いてプロモータ
ー活性のインデューサーの存在下で挿入突然変異体を単
離すると、発現が細胞の生存に必須である遺伝子のコー
ディング領域からプロモーターを分離する挿入物が回収
されることが確認される。この挿入物は生存できないの
で、続いてインデューサー不含のレプリカ平板法でこの
ような挿入物を同定する。トランスポゾンに隣接する領
域の配列決定により挿入部位を同定し、分断された遺伝
子を同定する。インデューサー不存在下での成長中の細
胞の過程/形態の変化を正確にモニターし、遺伝子の適
当な機能に関する情報を得る。このようなモニターリン
グには、フローサイトメトリー（細胞分割、溶解、酸化
還元能、ＤＮＡ複製）ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂
質、ペプチドグリカンへの放射性化学的標識化前駆体の
取り込み、既知の細胞性ストレスに反応するリポーター
酵素遺伝子融合のモニター等がある。
件付き致死変異体の発生 この技法はde Lorenzo，V.ら、Gene123:17-24（199
3）；Neuwald,A.F.ら、Gene125:69-73（1993）およびTa
kiff,H.E.ら、J.Bacteriol.174:1544-1553（1992）に記
載されており（参照により本明細書に記載されているも
のとみなす）、発現が細胞の生存性に必須である遺伝子
を同定する。この技法では、一方向または両方向でトラ
ンスポゾンから外側へ転写する、調節可能なプロモータ
ーを担持するトランスポゾンを得る。これらのトランス
ポゾンを標的生物に無作為に挿入し、続いてプロモータ
ー活性のインデューサーの存在下で挿入突然変異体を単
離すると、発現が細胞の生存に必須である遺伝子のコー
ディング領域からプロモーターを分離する挿入物が回収
されることが確認される。この挿入物は生存できないの
で、続いてインデューサー不含のレプリカ平板法でこの
ような挿入物を同定する。トランスポゾンに隣接する領
域の配列決定により挿入部位を同定し、分断された遺伝
子を同定する。インデューサー不存在下での成長中の細
胞の過程/形態の変化を正確にモニターし、遺伝子の適
当な機能に関する情報を得る。このようなモニターリン
グには、フローサイトメトリー（細胞分割、溶解、酸化
還元能、ＤＮＡ複製）ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂
質、ペプチドグリカンへの放射性化学的標識化前駆体の
取り込み、既知の細胞性ストレスに反応するリポーター
酵素遺伝子融合のモニター等がある。
【００２３】５）化学的突然変異誘発による条件付き致
死突然変異の発生 この技法はBeckwith,J.、Methods in Enzymology204:3-
18（1991）に記載されており、参照により本明細書に記
載されているものとみなす。この技法では標的生物のラ
ンダム化学的突然変異を誘発し、生理学的温度（許容温
度）とは異なる温度で成長させ、続いてレプリカ平板法
を行い、異なる温度（例えばｔｓ同定のためには４２
℃、ｃｓ同定のためには２５℃）で増殖させ、その時増
殖できなかった単離物（条件突然変異体）を同定する。
上述のように、非許容温度での成長をにおける変化を正
確にモニターし、突然変異遺伝子の機能に関する情報を
得る。標的生物からのライブラリーによる条件致死突然
変異の相補、および相補遺伝子の配列決定により、ライ
ブラリー配列と適合させることができる。これらの技法
の各々は、特定の適用に応じて有利であったり、不利で
あったりする。当業者は意図する特定の使用目的に最も
関連する研究法を選択する。例えば、いくつかの遺伝子
は感染に必須であると認識されているが、実際には感染
の開始にのみ必要であり、そのためそれらの産物は確立
された慢性の感染の治療のために開発された抗菌物質に
とってはそれほど魅力的な標的ではない。
死突然変異の発生 この技法はBeckwith,J.、Methods in Enzymology204:3-
18（1991）に記載されており、参照により本明細書に記
載されているものとみなす。この技法では標的生物のラ
ンダム化学的突然変異を誘発し、生理学的温度（許容温
度）とは異なる温度で成長させ、続いてレプリカ平板法
を行い、異なる温度（例えばｔｓ同定のためには４２
℃、ｃｓ同定のためには２５℃）で増殖させ、その時増
殖できなかった単離物（条件突然変異体）を同定する。
上述のように、非許容温度での成長をにおける変化を正
確にモニターし、突然変異遺伝子の機能に関する情報を
得る。標的生物からのライブラリーによる条件致死突然
変異の相補、および相補遺伝子の配列決定により、ライ
ブラリー配列と適合させることができる。これらの技法
の各々は、特定の適用に応じて有利であったり、不利で
あったりする。当業者は意図する特定の使用目的に最も
関連する研究法を選択する。例えば、いくつかの遺伝子
は感染に必須であると認識されているが、実際には感染
の開始にのみ必要であり、そのためそれらの産物は確立
された慢性の感染の治療のために開発された抗菌物質に
とってはそれほど魅力的な標的ではない。
【００２４】６）ＲＴ−ＰＣＲ 細菌性メッセンジャーＲＮＡ、好ましくはスタフィロコ
ッカス・アウレウスの細菌性メッセンジャーＲＮＡを、
細菌感染した組織、例えば４８時間ネズミ肺感染組織か
ら単離し、無作為ヘキサヌクレオチドでプライムしたＲ
ＮＡサンプルの逆転写により、続いてプライマー対に特
異的な遺伝子でのＰＣＲにより、各ｍＲＮＡ種の量を評
価する。得られたＰＣＲ産物の定量化により特定のＲＮ
Ａ種の存在および量を決定し、感染した組織に転写した
細菌遺伝子に関する情報を得る。遺伝子転写の分析は、
感染の異なる時間で実施でき、細菌の発病学における遺
伝子制御に関する詳細な知識を得ることができ、遺伝子
産物が新規抗菌物質をスクリーニングする目的物質に相
当することが明快に理解できるようになる。用いたＰＣ
Ｒプライマーの遺伝子特異的特性のために、細菌性ｍＲ
ＮＡ調製物は遊離の哺乳動物ＲＮＡである必要はないこ
とは理解されるべきである。これにより研究者が、細菌
中で非常に短時間しか生育できない（半減期２分のオー
ダー）細菌性ｍＲＮＡ種を入手するために、感染組織か
ら簡単で迅速にＲＮＡを調製できる。製造者の指示に従
ってＴＲＩゾール（ギブコ−ＢＲＬ）を非常に短時間存
在させ、機械的に崩壊させることにより、細菌性ｍＲＮ
Ａを感染ネズミ肺組織から調製してもよく、続いてＴＲ
Ｉゾール試薬の製造者に準じてプロセッシングし、ＤＮ
Ａａｓｅ処理して夾雑ＤＮＡを除去する。プロセッシン
グは、細菌１６ＳリボソームＲＮＡ、好ましくは黄色ブ
ドウ球菌の１６ＳリボソームＲＮＡの最大量を得る条件
を見出すことにより最適化するのが好ましく、オリゴヌ
クレオチドプローブに特異的な適切に標識化した配列で
ノーザンプロービングにより検出する。典型的には、所
望により８ないし２５サイクルで終了するＰＣＲ反応に
おける各ＰＣＲプライマー対には５'色素標識プライマ
ーを用いる。ＰＣＲ産物は６％ポリアクリルアミドゲル
で分離し、GeneScanner（ＡＢＩ製造）を用いて検出お
よび定量する。本発明の配列に適用する場合、これらの
技法を用いると、感染中に発現する細菌性タンパク質、
抗菌治療に利用できる阻害物質の同定が可能になる。
ッカス・アウレウスの細菌性メッセンジャーＲＮＡを、
細菌感染した組織、例えば４８時間ネズミ肺感染組織か
ら単離し、無作為ヘキサヌクレオチドでプライムしたＲ
ＮＡサンプルの逆転写により、続いてプライマー対に特
異的な遺伝子でのＰＣＲにより、各ｍＲＮＡ種の量を評
価する。得られたＰＣＲ産物の定量化により特定のＲＮ
Ａ種の存在および量を決定し、感染した組織に転写した
細菌遺伝子に関する情報を得る。遺伝子転写の分析は、
感染の異なる時間で実施でき、細菌の発病学における遺
伝子制御に関する詳細な知識を得ることができ、遺伝子
産物が新規抗菌物質をスクリーニングする目的物質に相
当することが明快に理解できるようになる。用いたＰＣ
Ｒプライマーの遺伝子特異的特性のために、細菌性ｍＲ
ＮＡ調製物は遊離の哺乳動物ＲＮＡである必要はないこ
とは理解されるべきである。これにより研究者が、細菌
中で非常に短時間しか生育できない（半減期２分のオー
ダー）細菌性ｍＲＮＡ種を入手するために、感染組織か
ら簡単で迅速にＲＮＡを調製できる。製造者の指示に従
ってＴＲＩゾール（ギブコ−ＢＲＬ）を非常に短時間存
在させ、機械的に崩壊させることにより、細菌性ｍＲＮ
Ａを感染ネズミ肺組織から調製してもよく、続いてＴＲ
Ｉゾール試薬の製造者に準じてプロセッシングし、ＤＮ
Ａａｓｅ処理して夾雑ＤＮＡを除去する。プロセッシン
グは、細菌１６ＳリボソームＲＮＡ、好ましくは黄色ブ
ドウ球菌の１６ＳリボソームＲＮＡの最大量を得る条件
を見出すことにより最適化するのが好ましく、オリゴヌ
クレオチドプローブに特異的な適切に標識化した配列で
ノーザンプロービングにより検出する。典型的には、所
望により８ないし２５サイクルで終了するＰＣＲ反応に
おける各ＰＣＲプライマー対には５'色素標識プライマ
ーを用いる。ＰＣＲ産物は６％ポリアクリルアミドゲル
で分離し、GeneScanner（ＡＢＩ製造）を用いて検出お
よび定量する。本発明の配列に適用する場合、これらの
技法を用いると、感染中に発現する細菌性タンパク質、
抗菌治療に利用できる阻害物質の同定が可能になる。
【００２５】寄託物 スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９株を含有
する寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・イン
ダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッ
ド（ＮＣＩＭＢ）、２３ストリート、マッカードライ
ブ、アベルディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランドに１
９９５年９月１１日寄託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７
７１が付与された。スタフィロコッカス・アウレウス株
寄託物を、本明細書では「寄託株」または「寄託株のＤ
ＮＡ」と称する。寄託物質はＲＡＴ ＤＮＡの全長を含
有し、寄託されたことにより、「ＮＣＩＭＢ４０７７
１」と称される。寄託物質に含まれるポリヌクレオチド
ならびにそれによりコードされるポリペプチドは、本明
細書の配列に関する任意の記載に矛盾する事象において
支配的である。寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国
際承認に関するブダペスト条約の条件下でなされてい
る。特許が発行されると何らの制限または条件もなく、
最終的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のために
のみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条のもとに要求さ
れるような、寄託が実施可能要件であることを承認する
ものではない。寄託物を製造、使用または販売するため
にはライセンスが必要であるが、そのようなライセンス
はここでは賦与されていない。
する寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・イン
ダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッ
ド（ＮＣＩＭＢ）、２３ストリート、マッカードライ
ブ、アベルディーンＡＢ２１ＲＹ、スコットランドに１
９９５年９月１１日寄託し、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７
７１が付与された。スタフィロコッカス・アウレウス株
寄託物を、本明細書では「寄託株」または「寄託株のＤ
ＮＡ」と称する。寄託物質はＲＡＴ ＤＮＡの全長を含
有し、寄託されたことにより、「ＮＣＩＭＢ４０７７
１」と称される。寄託物質に含まれるポリヌクレオチド
ならびにそれによりコードされるポリペプチドは、本明
細書の配列に関する任意の記載に矛盾する事象において
支配的である。寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国
際承認に関するブダペスト条約の条件下でなされてい
る。特許が発行されると何らの制限または条件もなく、
最終的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のために
のみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条のもとに要求さ
れるような、寄託が実施可能要件であることを承認する
ものではない。寄託物を製造、使用または販売するため
にはライセンスが必要であるが、そのようなライセンス
はここでは賦与されていない。
【００２６】ポリペプチド 本発明ポリペプチドはＲＡＴポリペプチド（詳細には成
熟ポリペプチド）ならびにポリペプチドおよびフラグメ
ント、詳細にはＲＡＴの生物学的活性を有するものを包
含し、さらにＲＡＴポリペプチドまたはその重要部分に
対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％
の同一性を有するポリペプチドおよびフラグメント、よ
り好ましくはＲＡＴポリペプチドに対して少なくとも９
０％の類似性を有し（より好ましくは、少なくとも９０
％の同一性を有し）、さらにより好ましくはＲＡＴポリ
ペプチドに対して少なくとも９５％の類似性を有する
（さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有
する）ポリペプチドおよびフラグメント、さらに通常に
は少なくとも３０個、より好ましくは少なくとも５０個
のアミノ酸を含むかかるポリペプチドの部分を包含す
る。本発明ポリペプチドのフラグメントである変種を、
ペプチド合成による対応全長ポリペプチドの製造に使用
してもよく、それゆえ、これらの変種を全長のポリペプ
チド製造のための中間体として用いてもよい。本発明ポ
リヌクレオチドのフラグメントである変種を用いて本発
明の全長のポリヌクレオチドを合成してもよい。
熟ポリペプチド）ならびにポリペプチドおよびフラグメ
ント、詳細にはＲＡＴの生物学的活性を有するものを包
含し、さらにＲＡＴポリペプチドまたはその重要部分に
対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％
の同一性を有するポリペプチドおよびフラグメント、よ
り好ましくはＲＡＴポリペプチドに対して少なくとも９
０％の類似性を有し（より好ましくは、少なくとも９０
％の同一性を有し）、さらにより好ましくはＲＡＴポリ
ペプチドに対して少なくとも９５％の類似性を有する
（さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有
する）ポリペプチドおよびフラグメント、さらに通常に
は少なくとも３０個、より好ましくは少なくとも５０個
のアミノ酸を含むかかるポリペプチドの部分を包含す
る。本発明ポリペプチドのフラグメントである変種を、
ペプチド合成による対応全長ポリペプチドの製造に使用
してもよく、それゆえ、これらの変種を全長のポリペプ
チド製造のための中間体として用いてもよい。本発明ポ
リヌクレオチドのフラグメントである変種を用いて本発
明の全長のポリヌクレオチドを合成してもよい。
【００２７】フラグメントは、前述のポリペプチドのア
ミノ酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一であ
るアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。ＲＡ
Ｔポリペプチドでは、フラグメントは「独立して存在
（free standing）」してもよく、あるいはより大型の
ポリペプチド中に含まれていてもよく、かかる大型のポ
リペプチド中ではその一部分もしくは領域を形成し、最
も好ましくは単一の連続領域、すなわち単一の大きなポ
リペプチドを形成している。好ましいフラグメントは、
ＲＡＴアミノ酸配列の一部分を有する末端切断されたポ
リペプチド、またはそれらの変種を包含するが、アミノ
末端を含む一連の残基（すなわち連続領域、部分または
部位）の欠失、またはカルボキシル末端を含む一連の残
基の欠失、または二つの一連の残基（一つはアミノ末端
を含み、一つはカルボキシル末端を含）を除く。宿主、
とりわけスタフィロコッカス・アウレウスにおける、本
発明のポリペプチドの切断形態もまた好ましい。また、
構造的または機能的属性により特徴づけられたフラグメ
ント、例えばアルファーヘリックスおよびアルファーヘ
リックス形成領域、ベータシートおよびベータシート形
成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコ
イル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファー両
親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成
領域、基質結合領域、および高抗原性指標領域を含むフ
ラグメントなども好ましい。
ミノ酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一であ
るアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。ＲＡ
Ｔポリペプチドでは、フラグメントは「独立して存在
（free standing）」してもよく、あるいはより大型の
ポリペプチド中に含まれていてもよく、かかる大型のポ
リペプチド中ではその一部分もしくは領域を形成し、最
も好ましくは単一の連続領域、すなわち単一の大きなポ
リペプチドを形成している。好ましいフラグメントは、
ＲＡＴアミノ酸配列の一部分を有する末端切断されたポ
リペプチド、またはそれらの変種を包含するが、アミノ
末端を含む一連の残基（すなわち連続領域、部分または
部位）の欠失、またはカルボキシル末端を含む一連の残
基の欠失、または二つの一連の残基（一つはアミノ末端
を含み、一つはカルボキシル末端を含）を除く。宿主、
とりわけスタフィロコッカス・アウレウスにおける、本
発明のポリペプチドの切断形態もまた好ましい。また、
構造的または機能的属性により特徴づけられたフラグメ
ント、例えばアルファーヘリックスおよびアルファーヘ
リックス形成領域、ベータシートおよびベータシート形
成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコ
イル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファー両
親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成
領域、基質結合領域、および高抗原性指標領域を含むフ
ラグメントなども好ましい。
【００２８】ＲＡＴ活性を媒介する、生物学的に活性な
領域もまた好ましく、類似の活性もしくは改善された活
性のある、または望ましくない活性を減じたフラグメン
ト等がある。動物、とりわけヒトにおいて抗原的または
免疫原的なフラグメントもまた含まれる。
領域もまた好ましく、類似の活性もしくは改善された活
性のある、または望ましくない活性を減じたフラグメン
ト等がある。動物、とりわけヒトにおいて抗原的または
免疫原的なフラグメントもまた含まれる。
【００２９】ポリヌクレオチド 本発明の別の態様は、ＲＡＴ蛋白を配列決定することに
より決定されるアミノ酸配列を有するＲＡＴポリペプチ
ドをコードしている単離ポリヌクレオチドに関し、ＲＡ
Ｔ蛋白の特別な例としては実施例３に記載のものであ
り、５４ｋＤ、５５ｋＤおよび１１０ｋＤヘテロダイマ
ーを包含する。本明細書に提供される情報を用いて、例
えばＲＡＴポリペプチドをコードする本発明のポリヌク
レオチドを、出発物質スタフィロコッカス・アウレウス
ＷＣＵＨ２９細胞からの染色体ＤＮＡフラグメントをク
ローニングおよび配列決定するために用いるような標準
的なクローニングおよびスクリーニングを用いて得るこ
とができ、次いでクローン全長を得ることができる。例
えば、本発明ポリヌクレオチド配列を得るために、イー
・コリ（E.coli）またはいくつかの他の適切な宿主にお
けるスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９の染
色体ＤＮＡのクローンの典型的なライブラリーを、部分
的配列に由来の、好ましくは１７量体またはそれ以上の
長さの放射性標識オリゴヌクレオチドにてプローブす
る。プローブのＤＮＡに同一であるＤＮＡを担持するク
ローンは厳密な条件を用いて区別できる。元の配列から
設計した配列決定プライマーを用いてこのように同定し
た個々のクローンを配列決定することにより、次に両方
向で配列が伸長できるようになり、全遺伝子配列を決定
できる。このような配列決定は便宜的にプラスミドクロ
ーンから調製した変性二本鎖ＤＮＡを用いて実施する。
適切な技法については、Maniatis,T.、Fitsch,F.F.およ
びSambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manu
al、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク（1989）に記載されている。（Screening By
Hybridization 1.90およびSequencing Denatured Doubl
e-Stranded DNATemplates 13.70参照）。本発明の典型
例は、ＲＡＴ蛋白の配列決定により決定されるアミノ酸
配列を有するＲＡＴポリペプチドをコードしているポリ
ヌクレオチドである。スタフィロコッカス・アウレウス
から単離されたＲＡＴ蛋白は非変性ＰＡＧＥゲルによれ
ば約１１０ｋＤの分子量を有する。スタフィロコッカス
・アウレウスから単離されたＲＡＴ蛋白は変性ＰＡＧＥ
ゲルによれば２種の分子量の種を有し、１つは約５４ｋ
Ｄであり、もう１つは約５５ｋＤである。ＲＡＴ酵素活
性の結果により示されるように、本発明ＲＡＴは構造的
に他のアミドトランスフェラーゼファミリーの蛋白に関
連していると考えられる。
より決定されるアミノ酸配列を有するＲＡＴポリペプチ
ドをコードしている単離ポリヌクレオチドに関し、ＲＡ
Ｔ蛋白の特別な例としては実施例３に記載のものであ
り、５４ｋＤ、５５ｋＤおよび１１０ｋＤヘテロダイマ
ーを包含する。本明細書に提供される情報を用いて、例
えばＲＡＴポリペプチドをコードする本発明のポリヌク
レオチドを、出発物質スタフィロコッカス・アウレウス
ＷＣＵＨ２９細胞からの染色体ＤＮＡフラグメントをク
ローニングおよび配列決定するために用いるような標準
的なクローニングおよびスクリーニングを用いて得るこ
とができ、次いでクローン全長を得ることができる。例
えば、本発明ポリヌクレオチド配列を得るために、イー
・コリ（E.coli）またはいくつかの他の適切な宿主にお
けるスタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９の染
色体ＤＮＡのクローンの典型的なライブラリーを、部分
的配列に由来の、好ましくは１７量体またはそれ以上の
長さの放射性標識オリゴヌクレオチドにてプローブす
る。プローブのＤＮＡに同一であるＤＮＡを担持するク
ローンは厳密な条件を用いて区別できる。元の配列から
設計した配列決定プライマーを用いてこのように同定し
た個々のクローンを配列決定することにより、次に両方
向で配列が伸長できるようになり、全遺伝子配列を決定
できる。このような配列決定は便宜的にプラスミドクロ
ーンから調製した変性二本鎖ＤＮＡを用いて実施する。
適切な技法については、Maniatis,T.、Fitsch,F.F.およ
びSambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manu
al、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニ
ューヨーク（1989）に記載されている。（Screening By
Hybridization 1.90およびSequencing Denatured Doubl
e-Stranded DNATemplates 13.70参照）。本発明の典型
例は、ＲＡＴ蛋白の配列決定により決定されるアミノ酸
配列を有するＲＡＴポリペプチドをコードしているポリ
ヌクレオチドである。スタフィロコッカス・アウレウス
から単離されたＲＡＴ蛋白は非変性ＰＡＧＥゲルによれ
ば約１１０ｋＤの分子量を有する。スタフィロコッカス
・アウレウスから単離されたＲＡＴ蛋白は変性ＰＡＧＥ
ゲルによれば２種の分子量の種を有し、１つは約５４ｋ
Ｄであり、もう１つは約５５ｋＤである。ＲＡＴ酵素活
性の結果により示されるように、本発明ＲＡＴは構造的
に他のアミドトランスフェラーゼファミリーの蛋白に関
連していると考えられる。
【００３０】成熟ポリペプチドのコーディング配列また
はそれらのフラグメント、ならびにその他のコーディン
グ配列を有する読み枠中の成熟ポリペプチドのコーディ
ング配列またはそのフラグメント、例えばリーダーまた
は分泌配列、プレ、プロ、プレプロ蛋白配列をコードす
る配列も本発明により提供される。ポリヌクレオチド
は、例えば、転写された非翻訳配列、終止シグナル、リ
ボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配列、イント
ロン、ポリアデニル化シグナル等の転写非翻訳配列、お
よび付加アミノ酸をコードする付加コーディング配列等
の非コーディング５'および３'配列等の非コーディング
配列をも含有しうるが、これらに限定するのではない。
例えば、融合ポリペプチドの精製を促すマーカー配列を
コードすることもできる。本発明のある好ましい態様に
おいて、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（キアゲン・
インコーポレーティッド）に提供されるようなヘキサ−
ヒスチジンペプチド（Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,U
SA，86:821-824（1989）に記載される）またはＨＡタグ
（Wilsonら、Cell，37:767（1984））である。本発明の
ポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子および遺伝子発現
を調節する天然の配列をも含むが、これらに限定するも
のではない。
はそれらのフラグメント、ならびにその他のコーディン
グ配列を有する読み枠中の成熟ポリペプチドのコーディ
ング配列またはそのフラグメント、例えばリーダーまた
は分泌配列、プレ、プロ、プレプロ蛋白配列をコードす
る配列も本発明により提供される。ポリヌクレオチド
は、例えば、転写された非翻訳配列、終止シグナル、リ
ボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配列、イント
ロン、ポリアデニル化シグナル等の転写非翻訳配列、お
よび付加アミノ酸をコードする付加コーディング配列等
の非コーディング５'および３'配列等の非コーディング
配列をも含有しうるが、これらに限定するのではない。
例えば、融合ポリペプチドの精製を促すマーカー配列を
コードすることもできる。本発明のある好ましい態様に
おいて、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（キアゲン・
インコーポレーティッド）に提供されるようなヘキサ−
ヒスチジンペプチド（Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,U
SA，86:821-824（1989）に記載される）またはＨＡタグ
（Wilsonら、Cell，37:767（1984））である。本発明の
ポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子および遺伝子発現
を調節する天然の配列をも含むが、これらに限定するも
のではない。
【００３１】上記した本明細書の用語「ポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポリペプ
チド配列を含むポリヌクレオチドを包含し、詳細には、
細菌のＲＡＴ、より詳細にはＲＡＴ蛋白の配列決定によ
り決定されるアミノ酸配列を有するスタフィロコッカス
・アウレウスのＲＡＴを包含する。該用語は、コーディ
ング配列および／または非コーディング配列を含んでい
てもよいさらなる領域を伴った、ポリペプチドをコード
している単一の連続領域または不連続領域（例えば、組
み込まれたファージまたは配列の挿入または配列の編集
により分断されたもの）を含むポリヌクレオチドを包含
する。さらに本発明は、推定アミノ酸配列を有するポリ
ペプチドの変種をコードする上記ポリヌクレオチドの変
種にも関する。さらに特に好ましい具体例は、ＲＡＴ蛋
白の配列決定により決定されるＲＡＴポリペプチドのア
ミノ酸配列を有する、ＲＡＴ変種をコードしているポリ
ヌクレオチドであり、その中には、いくつか、少しの、
５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１または
０個のアミノ酸残基を置換、欠損または付加を任意の組
み合わせで施したアミノ酸配列を有する。中でもとりわ
け好ましいものは、ＲＡＴの特性および活性を変化させ
ないサイレント置換、付加および欠損である。
コードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポリペプ
チド配列を含むポリヌクレオチドを包含し、詳細には、
細菌のＲＡＴ、より詳細にはＲＡＴ蛋白の配列決定によ
り決定されるアミノ酸配列を有するスタフィロコッカス
・アウレウスのＲＡＴを包含する。該用語は、コーディ
ング配列および／または非コーディング配列を含んでい
てもよいさらなる領域を伴った、ポリペプチドをコード
している単一の連続領域または不連続領域（例えば、組
み込まれたファージまたは配列の挿入または配列の編集
により分断されたもの）を含むポリヌクレオチドを包含
する。さらに本発明は、推定アミノ酸配列を有するポリ
ペプチドの変種をコードする上記ポリヌクレオチドの変
種にも関する。さらに特に好ましい具体例は、ＲＡＴ蛋
白の配列決定により決定されるＲＡＴポリペプチドのア
ミノ酸配列を有する、ＲＡＴ変種をコードしているポリ
ヌクレオチドであり、その中には、いくつか、少しの、
５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１または
０個のアミノ酸残基を置換、欠損または付加を任意の組
み合わせで施したアミノ酸配列を有する。中でもとりわ
け好ましいものは、ＲＡＴの特性および活性を変化させ
ないサイレント置換、付加および欠損である。
【００３２】本発明のさらに好ましい態様は、ＲＡＴア
ミノ酸配列を有するＲＡＴポリペプチドをコードしてい
るポリヌクレオチドに対して、その全長にわたり少なく
とも７０％の同一性があるポリヌクレオチド、およびか
かるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチ
ドである。あるいはまた、寄託株のスタフィロコッカス
・アウレウスのＤＮＡのＲＡＴポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドに対してその全長にわたり少なくと
も８０％同一である領域を含むポリヌクレオチド、およ
びそれに対して相補的なポリヌクレオチドが最も非常に
好ましい。この点に関して、全長で少なくとも９０％同
一であるポリヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも
少なくとも９５％の同一性を有するものが特に好まし
く、さらに少なくとも９５％の同一性を有するものの中
でも少なくとも９７％であるのがより好ましく、中でも
少なくとも９８％および少なくとも９９％であるのが特
に好ましく、さらに少なくとも９９％であるのがより好
ましい。この点に関する好ましい具体例は、成熟ＲＡＴ
ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を
保持するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
ドである。
ミノ酸配列を有するＲＡＴポリペプチドをコードしてい
るポリヌクレオチドに対して、その全長にわたり少なく
とも７０％の同一性があるポリヌクレオチド、およびか
かるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチ
ドである。あるいはまた、寄託株のスタフィロコッカス
・アウレウスのＤＮＡのＲＡＴポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドに対してその全長にわたり少なくと
も８０％同一である領域を含むポリヌクレオチド、およ
びそれに対して相補的なポリヌクレオチドが最も非常に
好ましい。この点に関して、全長で少なくとも９０％同
一であるポリヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも
少なくとも９５％の同一性を有するものが特に好まし
く、さらに少なくとも９５％の同一性を有するものの中
でも少なくとも９７％であるのがより好ましく、中でも
少なくとも９８％および少なくとも９９％であるのが特
に好ましく、さらに少なくとも９９％であるのがより好
ましい。この点に関する好ましい具体例は、成熟ＲＡＴ
ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を
保持するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
ドである。
【００３３】本発明はさらに本明細書上述の配列にハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関
して、本発明は特に厳密な条件で本明細書上述のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
する。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳密な
ハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の同
一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％
である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意味
する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例として
は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハーツ溶液、
１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変成
し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２
℃で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０.
１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄するものである。ハイ
ブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Samb
rookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第
２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク
（1989）、とりわけその第１１章に実例が示されてお
り、参照によりその全開示を本明細書に記載されている
ものとみなす。
ブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関
して、本発明は特に厳密な条件で本明細書上述のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
する。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳密な
ハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間の同
一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％
である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを意味
する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例として
は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハーツ溶液、
１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変成
し、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２
℃で一晩インキュベーションし、続いて約６５℃で０.
１ｘＳＳＣ中でフィルターを洗浄するものである。ハイ
ブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Samb
rookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual、第
２版；コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク
（1989）、とりわけその第１１章に実例が示されてお
り、参照によりその全開示を本明細書に記載されている
ものとみなす。
【００３４】本発明はまた、厳密なハイブリダイゼーシ
ョン条件で、ＲＡＴポリヌクレオチド配列に関する完全
遺伝子を含む適当なライブラリーを、上記ＲＡＴポリヌ
クレオチド配列またはそのフラグメント配列を有するプ
ローブでスクリーニングし、ＤＮＡ配列を単離すること
により得ることのできるポリヌクレオチド配列を本質的
に含むポリヌクレオチドをも提供する。かかるポリヌク
レオチドを得るために有用なフラグメントには、例えば
本明細書の別の箇所において説明するプローブおよびプ
ライマー等がある。
ョン条件で、ＲＡＴポリヌクレオチド配列に関する完全
遺伝子を含む適当なライブラリーを、上記ＲＡＴポリヌ
クレオチド配列またはそのフラグメント配列を有するプ
ローブでスクリーニングし、ＤＮＡ配列を単離すること
により得ることのできるポリヌクレオチド配列を本質的
に含むポリヌクレオチドをも提供する。かかるポリヌク
レオチドを得るために有用なフラグメントには、例えば
本明細書の別の箇所において説明するプローブおよびプ
ライマー等がある。
【００３５】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
てここでさらに論じるが、例えば上述の本発明のポリヌ
クレオチドは、ＲＡＴをコードするｃＤＮＡ全長および
ゲノムクローンを単離するため、およびＲＡＴ遺伝子に
高度な配列類似性を有するその他の遺伝子のｃＤＮＡお
よびゲノムクローンを単離するための、ＲＮＡ、ｃＤＮ
ＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプロ
ーブとして使用することができる。このようなプローブ
は通常少なくとも１５塩基を含む。好ましくはこのよう
なプローブは少なくとも３０塩基を有し、少なくとも５
０塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプローブ
は少なくとも３０塩基を有し、５０塩基またはそれ以下
である。例えばＲＡＴ遺伝子のコーディング領域は、既
知ＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合
成してスクリーニングすることにより単離できる。次い
で、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識
オリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは
ｍＲＮＡのライブラリーのスクリーニングに用い、プロ
ーブがライブラリーのいずれのメンバーにハイブリダイ
ゼーションするのかを決定する。
てここでさらに論じるが、例えば上述の本発明のポリヌ
クレオチドは、ＲＡＴをコードするｃＤＮＡ全長および
ゲノムクローンを単離するため、およびＲＡＴ遺伝子に
高度な配列類似性を有するその他の遺伝子のｃＤＮＡお
よびゲノムクローンを単離するための、ＲＮＡ、ｃＤＮ
ＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプロ
ーブとして使用することができる。このようなプローブ
は通常少なくとも１５塩基を含む。好ましくはこのよう
なプローブは少なくとも３０塩基を有し、少なくとも５
０塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプローブ
は少なくとも３０塩基を有し、５０塩基またはそれ以下
である。例えばＲＡＴ遺伝子のコーディング領域は、既
知ＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合
成してスクリーニングすることにより単離できる。次い
で、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識
オリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは
ｍＲＮＡのライブラリーのスクリーニングに用い、プロ
ーブがライブラリーのいずれのメンバーにハイブリダイ
ゼーションするのかを決定する。
【００３６】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、例えば、疾病とりわけヒトの疾病の治療法およ
び診断法の発見のために研究物質および材料として使用
でき、とりわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本
明細書でさらに論じる。ＲＡＴポリヌクレオチド配列由
来のオリゴヌクレオチドである本発明ポリヌクレオチド
を本明細書記載の方法に使用してもよいが、好ましくは
ＰＣＲに使用して、本明細書で同定したポリヌクレオチ
ドの全体または一部が感染した組織に転写されるかどう
かを決定する。このような配列が、病原体が達成した感
染のステージおよび感染の型の診断にも有用であること
が理解される。
チドは、例えば、疾病とりわけヒトの疾病の治療法およ
び診断法の発見のために研究物質および材料として使用
でき、とりわけポリヌクレオチドアッセイに関連して本
明細書でさらに論じる。ＲＡＴポリヌクレオチド配列由
来のオリゴヌクレオチドである本発明ポリヌクレオチド
を本明細書記載の方法に使用してもよいが、好ましくは
ＰＣＲに使用して、本明細書で同定したポリヌクレオチ
ドの全体または一部が感染した組織に転写されるかどう
かを決定する。このような配列が、病原体が達成した感
染のステージおよび感染の型の診断にも有用であること
が理解される。
【００３７】また本発明は、付加アミノ酸もしくはカル
ボキシル末端アミノ酸または成熟ポリペプチドに内在す
るアミノ酸を加えた成熟蛋白であるポリペプチドをコー
ドできるポリヌクレオチドも提供する（例えば成熟形態
が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）。このよう
な配列は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセッシン
グに役割を担い、蛋白の輸送を可能にし、蛋白の半減期
を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッセイもしく
は製造のための蛋白の操作を容易にすることができる。
一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞酵素に
よりプロセッシングされ、成熟蛋白から取り除かれる。
１またはそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態のポリ
ペプチドを有する前駆蛋白は、ポリペプチドの不活性形
態でありうる。プロ配列が除去されると、通常にはこの
ような不活性前駆体が活性化される。プロ配列のいくつ
かまたはすべてを活性化の前に除去できる。通常、この
ような前駆体はプロ蛋白と称される。要するに、本発明
のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配列を加えた
成熟蛋白（プレ蛋白と称することができる）、プレ蛋白
のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を
有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列および１
またはそれ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体で
あるプレプロ蛋白をコードでき、プロ配列は通常ポリペ
プチドの活性および成熟形態を生成するプロセッシング
段階で除去される。
ボキシル末端アミノ酸または成熟ポリペプチドに内在す
るアミノ酸を加えた成熟蛋白であるポリペプチドをコー
ドできるポリヌクレオチドも提供する（例えば成熟形態
が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）。このよう
な配列は、前駆体から成熟形態への蛋白のプロセッシン
グに役割を担い、蛋白の輸送を可能にし、蛋白の半減期
を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッセイもしく
は製造のための蛋白の操作を容易にすることができる。
一般的にインビボの場合、付加アミノ酸は、細胞酵素に
よりプロセッシングされ、成熟蛋白から取り除かれる。
１またはそれ以上のプロ配列と融合した成熟形態のポリ
ペプチドを有する前駆蛋白は、ポリペプチドの不活性形
態でありうる。プロ配列が除去されると、通常にはこの
ような不活性前駆体が活性化される。プロ配列のいくつ
かまたはすべてを活性化の前に除去できる。通常、この
ような前駆体はプロ蛋白と称される。要するに、本発明
のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配列を加えた
成熟蛋白（プレ蛋白と称することができる）、プレ蛋白
のリーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を
有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列および１
またはそれ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体で
あるプレプロ蛋白をコードでき、プロ配列は通常ポリペ
プチドの活性および成熟形態を生成するプロセッシング
段階で除去される。
【００３８】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌ
クレオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝子操
作される宿主細胞および組換え技法による本発明のポリ
ペプチドの製造にも関する。本発明ＤＮＡ構築物に由来
するＲＮＡを用い、無細胞翻訳系を用いてこのような蛋
白を製造できる。組換え体を製造するために、宿主細胞
を遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、また
は本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。
ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davi
sら、Basic Methods inMolecular Biology（1986）；Sa
mbrookら、Molecular Cloning；A LaboratoryManual、
第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク（1989）のように、多くの標準的な実験マニュア
ルに記載される方法により行うことができ、例えばリン
酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキス
トラン媒介トランスフェクション、トランスベクショ
ン、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トラ
ンスフェクション、エレクトロポレーション、トランス
ダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入およ
び感染等がある。
クレオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝子操
作される宿主細胞および組換え技法による本発明のポリ
ペプチドの製造にも関する。本発明ＤＮＡ構築物に由来
するＲＮＡを用い、無細胞翻訳系を用いてこのような蛋
白を製造できる。組換え体を製造するために、宿主細胞
を遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、また
は本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。
ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davi
sら、Basic Methods inMolecular Biology（1986）；Sa
mbrookら、Molecular Cloning；A LaboratoryManual、
第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク（1989）のように、多くの標準的な実験マニュア
ルに記載される方法により行うことができ、例えばリン
酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキス
トラン媒介トランスフェクション、トランスベクショ
ン、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トラ
ンスフェクション、エレクトロポレーション、トランス
ダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入およ
び感染等がある。
【００３９】適当な宿主の代表的なものには、細菌細
胞、例えばストレプトコッカス属（Streptococci）、ス
タフィロコッカス属（staphylococci）、イー・コリ
（E.coli）、ストレプトミセス（Streptomyces）および
バチルス・ズブチリス（Bacillus subtiis）細胞；真菌
細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Asperg
illus）細胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Dro
sophila S2）およびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera S
f9）細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬ
ａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ
（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞等がある。
胞、例えばストレプトコッカス属（Streptococci）、ス
タフィロコッカス属（staphylococci）、イー・コリ
（E.coli）、ストレプトミセス（Streptomyces）および
バチルス・ズブチリス（Bacillus subtiis）細胞；真菌
細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Asperg
illus）細胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Dro
sophila S2）およびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera S
f9）細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬ
ａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ
（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞等がある。
【００４０】本発明のポリペプチドを製造するために非
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来
するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファ
ージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコス
ミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は発
現を制御および引き起こす調節領域を含有していてもよ
い。この点に関して、一般的には、宿主中にポリヌクレ
オチドを保持、伸長または発現するのに、および／また
はポリペプチドを発現するのに適した任意の系またはベ
クターを発現に使用できる。周知のおよび通常的な種々
の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入
してもよく、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A
Laboratory Manual（上述）に記載されている。
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来
するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファ
ージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコス
ミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は発
現を制御および引き起こす調節領域を含有していてもよ
い。この点に関して、一般的には、宿主中にポリヌクレ
オチドを保持、伸長または発現するのに、および／また
はポリペプチドを発現するのに適した任意の系またはベ
クターを発現に使用できる。周知のおよび通常的な種々
の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入
してもよく、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A
Laboratory Manual（上述）に記載されている。
【００４１】翻訳蛋白を、小胞体内腔、ペリプラスミッ
クスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために、適当
な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的な
ものであってもく、あるいは異種性のシグナルでもよ
い。
クスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために、適当
な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的な
ものであってもく、あるいは異種性のシグナルでもよ
い。
【００４２】本発明のポリペプチドは周知の方法によ
り、組換え細胞培養物から回収および精製でき、その方
法には、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよび
レクチンクロマトグラフィー等がある。高速液体クロマ
トグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポリペ
プチドが単離および／または精製中に変性した場合、再
び活性なコンホーメーションにするために、蛋白再生の
ための周知の技法を用いることができる。
り、組換え細胞培養物から回収および精製でき、その方
法には、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよび
レクチンクロマトグラフィー等がある。高速液体クロマ
トグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポリペ
プチドが単離および／または精製中に変性した場合、再
び活性なコンホーメーションにするために、蛋白再生の
ための周知の技法を用いることができる。
【００４３】診断アッセイ 本発明はまた診断試薬として使用するための本発明のＲ
ＡＴポリヌクレオチドの使用にも関する。真核生物とり
わけ哺乳動物、特にヒトにおけるＲＡＴの検出は、疾患
の診断のための診断法を提供する。ＲＡＴ遺伝子を含む
生物に感染した真核生物（本明細書において「個体」と
も称する）とりわけ哺乳動物、特にヒトを種々の方法に
よりＤＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸を、感染
した個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟
骨および皮膚より得てもよい。ゲノムＤＮＡを直接検出
に使用してもよく、あるいは分析の前にＰＣＲもしくは
その他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅でき
る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法で用いること
ができる。増幅法を用いると、真核生物とりわけ哺乳動
物、特にヒトに存在する原核生物株を、原核生物遺伝子
の遺伝子型の分析により特徴づけすることができる。対
照配列の遺伝子型と比較した場合の増幅産物の大きさの
変化により、欠損および挿入を検出できる。点突然変異
は、増幅ＤＮＡを標識化ＲＡＴポリヌクレオチド配列に
ハイブリダイズさせることにより同定できる。完全に対
合した配列はＲＮアーゼ消化により、または融解温度の
差により、誤対合二重らせんから区別できる。変性剤含
有または不含ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の
移動度の変化を検出することにより、または直接的なＤ
ＮＡの配列決定によりＤＮＡ配列の差を検出してもよ
い。例えばMeyersら、Science，230:1242（1985）参
照。また、特異的な位置での配列の変化を、ヌクレアー
ゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護また
は化学的切断法によっても明らかにしてもよい。例えば
Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:4397-4401（1
985）参照。
ＡＴポリヌクレオチドの使用にも関する。真核生物とり
わけ哺乳動物、特にヒトにおけるＲＡＴの検出は、疾患
の診断のための診断法を提供する。ＲＡＴ遺伝子を含む
生物に感染した真核生物（本明細書において「個体」と
も称する）とりわけ哺乳動物、特にヒトを種々の方法に
よりＤＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸を、感染
した個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟
骨および皮膚より得てもよい。ゲノムＤＮＡを直接検出
に使用してもよく、あるいは分析の前にＰＣＲもしくは
その他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅でき
る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法で用いること
ができる。増幅法を用いると、真核生物とりわけ哺乳動
物、特にヒトに存在する原核生物株を、原核生物遺伝子
の遺伝子型の分析により特徴づけすることができる。対
照配列の遺伝子型と比較した場合の増幅産物の大きさの
変化により、欠損および挿入を検出できる。点突然変異
は、増幅ＤＮＡを標識化ＲＡＴポリヌクレオチド配列に
ハイブリダイズさせることにより同定できる。完全に対
合した配列はＲＮアーゼ消化により、または融解温度の
差により、誤対合二重らせんから区別できる。変性剤含
有または不含ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の
移動度の変化を検出することにより、または直接的なＤ
ＮＡの配列決定によりＤＮＡ配列の差を検出してもよ
い。例えばMeyersら、Science，230:1242（1985）参
照。また、特異的な位置での配列の変化を、ヌクレアー
ゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護また
は化学的切断法によっても明らかにしてもよい。例えば
Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，85:4397-4401（1
985）参照。
【００４４】本発明の遺伝子の突然変異または多型性を
担持する細胞はまた、種々の技術により、ＤＮＡレベル
で、例えばセロタイピングすることにより検出できる。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて突然変異を検出すること
ができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばGeneScan
等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡもを同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣ
Ｒに用いてもよい。例を挙げると、ＲＡＴをコードする
核酸に相補的なＰＣＲプライマーは、突然変異を同定お
よび分析するのに用いることができる。これらのプライ
マーを用いて、個体由来の試料から単離されたＲＡＴ
ＤＮＡを増幅してもよい。本発明はまた、５'および／
または３'末端から１、２、３または４個のヌクレオチ
ド除去したプライマーをも提供する。該プライマーを用
いて、感染個体から単離された遺伝子を増幅してもよ
く、次いで、該遺伝子をＤＮＡ配列を調べるための種々
の技法に供してもよい。このように、ＤＮＡ配列におけ
る突然変異を検出し、感染の診断および感染性物質のセ
ロタイピングまたは分類に使用することができる。
担持する細胞はまた、種々の技術により、ＤＮＡレベル
で、例えばセロタイピングすることにより検出できる。
例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて突然変異を検出すること
ができる。ＲＴ−ＰＣＲは自動検出系、例えばGeneScan
等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。ＲＮＡ
またはｃＤＮＡもを同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣ
Ｒに用いてもよい。例を挙げると、ＲＡＴをコードする
核酸に相補的なＰＣＲプライマーは、突然変異を同定お
よび分析するのに用いることができる。これらのプライ
マーを用いて、個体由来の試料から単離されたＲＡＴ
ＤＮＡを増幅してもよい。本発明はまた、５'および／
または３'末端から１、２、３または４個のヌクレオチ
ド除去したプライマーをも提供する。該プライマーを用
いて、感染個体から単離された遺伝子を増幅してもよ
く、次いで、該遺伝子をＤＮＡ配列を調べるための種々
の技法に供してもよい。このように、ＤＮＡ配列におけ
る突然変異を検出し、感染の診断および感染性物質のセ
ロタイピングまたは分類に使用することができる。
【００４５】本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感
染、より好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスに
よる感染、および最も好ましくは、上部気道感染（例え
ば、中耳炎、細菌性気道炎、急性喉頭蓋炎、甲状腺
炎）、下部気道感染（例えば、蓄膿、肺の膿瘍）、心臓
の感染（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸の感染（例え
ば、分泌性下痢、脾臓の膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感
染（例えば、脳の膿瘍）、目の感染（眼瞼炎、結膜炎、
角膜炎、眼内炎、前中隔および眼かの蜂巣炎、涙嚢
炎）、腎臓および尿道感染（例えば、精巣上体炎、腎内
および腎周囲の膿瘍、毒性ショック症候群）、皮膚感染
（例えば、インペチゴ、毛包炎、皮膚の膿瘍、蜂巣炎、
傷の感染、細菌性筋炎）、骨および関節の感染（例え
ば、敗血性関節炎、骨髄炎）のごとき疾病の診断方法を
提供し、該方法は、ＲＡＴポリヌクレオチドの発現レベ
ルの上昇を個体由来の試料から検出することを特徴とす
る。ＲＡＴポリヌクレオチドの発現の増加または低下
は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野でよく知
られたいずれかの方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴＰＣ
Ｒ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびそ
の他のハイブリダイゼーション法を用いて測定できる。
染、より好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスに
よる感染、および最も好ましくは、上部気道感染（例え
ば、中耳炎、細菌性気道炎、急性喉頭蓋炎、甲状腺
炎）、下部気道感染（例えば、蓄膿、肺の膿瘍）、心臓
の感染（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸の感染（例え
ば、分泌性下痢、脾臓の膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感
染（例えば、脳の膿瘍）、目の感染（眼瞼炎、結膜炎、
角膜炎、眼内炎、前中隔および眼かの蜂巣炎、涙嚢
炎）、腎臓および尿道感染（例えば、精巣上体炎、腎内
および腎周囲の膿瘍、毒性ショック症候群）、皮膚感染
（例えば、インペチゴ、毛包炎、皮膚の膿瘍、蜂巣炎、
傷の感染、細菌性筋炎）、骨および関節の感染（例え
ば、敗血性関節炎、骨髄炎）のごとき疾病の診断方法を
提供し、該方法は、ＲＡＴポリヌクレオチドの発現レベ
ルの上昇を個体由来の試料から検出することを特徴とす
る。ＲＡＴポリヌクレオチドの発現の増加または低下
は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野でよく知
られたいずれかの方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴＰＣ
Ｒ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびそ
の他のハイブリダイゼーション法を用いて測定できる。
【００４６】さらに、正常対照組織サンプルと比較し
て、ＲＡＴ蛋白の過剰発現を検出するために本発明診断
アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出してもよ
い。宿主由来のサンプル中のＲＡＴ蛋白のレベルを決定
するために用いることができるアッセイ技法は、当業者
に周知である。このようなアッセイ法には、ラジオイム
ノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分
析およびＥＬＩＳＡアッセイ等がある。
て、ＲＡＴ蛋白の過剰発現を検出するために本発明診断
アッセイを用いて、例えば感染の存在を検出してもよ
い。宿主由来のサンプル中のＲＡＴ蛋白のレベルを決定
するために用いることができるアッセイ技法は、当業者
に周知である。このようなアッセイ法には、ラジオイム
ノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分
析およびＥＬＩＳＡアッセイ等がある。
【００４７】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそ
れらを発現する細胞を免疫源として用いて、かかるポリ
ペプチドに免疫特異的な抗体を得ることができる。本明
細書で用いる「抗体」には、モノクローナルおよびポリ
クローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒ
ト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントが包含され、さ
らに免疫グロブリン発現ライブラリーの産物等のＦａｂ
フラグメントも包含される。本発明のポリペプチドに対
して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープ担持
フラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくはヒト
はでない動物に通常の実験法を用いて投与することによ
り得ることができる。連続的細胞系培養により産生され
る抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モノク
ローナル抗体を調製することができる。実例としては、
Kohler，G.およびMilstein,C.，Nature，256:495-497
（1975）；Kozborら、Immunology Today，4:72（198
3）；Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Ther
apy,Alan R Liss,Inc.、77-96頁（1985）に記載される
ような種々の技法がある。一本鎖抗体の産生のために記
載された技術（米国特許第４９４６７７８号）を適用し
て、本発明ポリペプチドに対する一本鎖抗体を得ること
ができる。また、トランスジェニックマウスまたはその
他の生物、例えばその他の哺乳動物を用いてヒト化抗体
等の抗体を発現させてもよい。
れらを発現する細胞を免疫源として用いて、かかるポリ
ペプチドに免疫特異的な抗体を得ることができる。本明
細書で用いる「抗体」には、モノクローナルおよびポリ
クローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒ
ト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントが包含され、さ
らに免疫グロブリン発現ライブラリーの産物等のＦａｂ
フラグメントも包含される。本発明のポリペプチドに対
して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープ担持
フラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくはヒト
はでない動物に通常の実験法を用いて投与することによ
り得ることができる。連続的細胞系培養により産生され
る抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モノク
ローナル抗体を調製することができる。実例としては、
Kohler，G.およびMilstein,C.，Nature，256:495-497
（1975）；Kozborら、Immunology Today，4:72（198
3）；Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Ther
apy,Alan R Liss,Inc.、77-96頁（1985）に記載される
ような種々の技法がある。一本鎖抗体の産生のために記
載された技術（米国特許第４９４６７７８号）を適用し
て、本発明ポリペプチドに対する一本鎖抗体を得ること
ができる。また、トランスジェニックマウスまたはその
他の生物、例えばその他の哺乳動物を用いてヒト化抗体
等の抗体を発現させてもよい。
【００４８】別法として、ファージディスプレイ技法を
用いて、抗−ポリペプチドを有することにつきスクリー
ニングされたヒト・リンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ遺伝
子のレパートリーまたは無処理のライブラリーから、ポ
リペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選別
することもできる（McCafferty,J.ら、Nature 348:552-
554（1990）；Marks,J.ら、Biotechnology 10:779-783
（1992））。これらの抗体の親和性はチェインシャフリ
ング（chain shuffling）により改善することもできる
（Clackson,T.ら、Nature 352:624-628（1991））。
用いて、抗−ポリペプチドを有することにつきスクリー
ニングされたヒト・リンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ遺伝
子のレパートリーまたは無処理のライブラリーから、ポ
リペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選別
することもできる（McCafferty,J.ら、Nature 348:552-
554（1990）；Marks,J.ら、Biotechnology 10:779-783
（1992））。これらの抗体の親和性はチェインシャフリ
ング（chain shuffling）により改善することもできる
（Clackson,T.ら、Nature 352:624-628（1991））。
【００４９】二つの抗原結合ドメインが存在する場合、
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。
【００５０】上記抗体を用いて、ポリペプチドを発現す
るクローンを単離または同定してもよく、上記抗体を親
和性クロマトグラフィーにより精製することができる。
従って、とりわけＲＡＴに対する抗体を、感染、とりわ
け細菌感染、特に上部気道感染（例えば、中耳炎、細菌
性気道炎、急性喉頭蓋炎、甲状腺炎）、下部気道感染
（例えば、蓄膿、肺の膿瘍）、心臓の感染（例えば、感
染性心内膜炎）、胃腸の感染（例えば、分泌性下痢、脾
臓の膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、脳の膿
瘍）、目の感染（眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前
中隔および眼かの蜂巣炎、涙嚢炎）、腎臓および尿道感
染（例えば、精巣上体炎、腎内および腎周囲の膿瘍、毒
性ショック症候群）、皮膚感染（例えば、インペチゴ、
毛包炎、皮膚の膿瘍、蜂巣炎、傷の感染、細菌性筋
炎）、骨および関節の感染（例えば、敗血性関節炎、骨
髄炎）のごとき疾病の治療に用いてもよい。
るクローンを単離または同定してもよく、上記抗体を親
和性クロマトグラフィーにより精製することができる。
従って、とりわけＲＡＴに対する抗体を、感染、とりわ
け細菌感染、特に上部気道感染（例えば、中耳炎、細菌
性気道炎、急性喉頭蓋炎、甲状腺炎）、下部気道感染
（例えば、蓄膿、肺の膿瘍）、心臓の感染（例えば、感
染性心内膜炎）、胃腸の感染（例えば、分泌性下痢、脾
臓の膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例えば、脳の膿
瘍）、目の感染（眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前
中隔および眼かの蜂巣炎、涙嚢炎）、腎臓および尿道感
染（例えば、精巣上体炎、腎内および腎周囲の膿瘍、毒
性ショック症候群）、皮膚感染（例えば、インペチゴ、
毛包炎、皮膚の膿瘍、蜂巣炎、傷の感染、細菌性筋
炎）、骨および関節の感染（例えば、敗血性関節炎、骨
髄炎）のごとき疾病の治療に用いてもよい。
【００５１】ポリペプチド変種には抗原的、エピトープ
的または免疫学的に等価な変種等があり、本発明の特定
の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明により蛋白またはポリペプチド
に対して生成した場合、病原および哺乳動物宿主間での
即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗体により特
異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含
する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」な
る用語は、脊椎動物において抗体を産生させるのに適し
た処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間
での即時的な物理的相互作用を妨害するように作用する
ペプチドまたはその等価物を包含する。
的または免疫学的に等価な変種等があり、本発明の特定
の態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明により蛋白またはポリペプチド
に対して生成した場合、病原および哺乳動物宿主間での
即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗体により特
異的に認識されるポリペプチドまたはその同等物を包含
する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」な
る用語は、脊椎動物において抗体を産生させるのに適し
た処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳動物宿主間
での即時的な物理的相互作用を妨害するように作用する
ペプチドまたはその等価物を包含する。
【００５２】ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に
等価な誘導体、またはそれらの融合蛋白は、マウスまた
はその他の動物例えばラットもしくはニワトリを免疫化
するための抗原として使用できる。融合蛋白はポリペプ
チドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合するこ
とにより、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモ
シアニン（keyholelimpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結
合することができる。あるいはまた、蛋白もしくはポリ
ペプチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等
価なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原ペプチド
は、免疫原性を改良するための十分な抗原性を有してい
るので、キャリヤーを使用しなくてすむ。
等価な誘導体、またはそれらの融合蛋白は、マウスまた
はその他の動物例えばラットもしくはニワトリを免疫化
するための抗原として使用できる。融合蛋白はポリペプ
チドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱合するこ
とにより、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リンペット・ヘモ
シアニン（keyholelimpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結
合することができる。あるいはまた、蛋白もしくはポリ
ペプチド、またはそれらに抗原的もしくは免疫学的に等
価なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原ペプチド
は、免疫原性を改良するための十分な抗原性を有してい
るので、キャリヤーを使用しなくてすむ。
【００５３】好ましくは、抗体またはそれらの変種を、
個体における免疫原性を減じるために修飾する。例え
ば、個体がヒトである場合、最も好ましくは、抗体は
「ヒト化」されており；この場合、ハイブリドーマ由来
の抗体の相補性決定領域がヒト・モノクローナル抗体に
移植されており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-5
25（1986）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273
（1991）に記載されている。本発明のポリヌクレオチド
を遺伝学的免疫化において使用する場合、例えばプラス
ミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Gen
et.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419
（1963））、特異的蛋白キャリヤーとＤＮＡとの複合体
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リ
ン酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshe
f、PNAS 83:9551（1986））、種々の形態のリポソーム
中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375（198
9））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356:152（199
2）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:791（1993））
およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたイン
ビボ感染（Seegerら、PNAS 81:5849（1984））等の適切
な送達方法を用いるのが好ましい。
個体における免疫原性を減じるために修飾する。例え
ば、個体がヒトである場合、最も好ましくは、抗体は
「ヒト化」されており；この場合、ハイブリドーマ由来
の抗体の相補性決定領域がヒト・モノクローナル抗体に
移植されており、例えばJones,P.ら、Nature 321:522-5
25（1986）またはTempestら、Biotechnology 9:266-273
（1991）に記載されている。本発明のポリヌクレオチド
を遺伝学的免疫化において使用する場合、例えばプラス
ミドＤＮＡの筋肉への直接注射（Wolffら、Hum.Mol.Gen
et.1:363（1992）；Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419
（1963））、特異的蛋白キャリヤーとＤＮＡとの複合体
の送達（Wuら、J.Biol.Chem.264:16985（1989））、リ
ン酸カルシウムとのＤＮＡ共沈（Benvenisty & Reshe
f、PNAS 83:9551（1986））、種々の形態のリポソーム
中へのＤＮＡ封入（Kanedaら、Science 243:375（198
9））、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356:152（199
2）；Eisenbraunら、DNA Cell Biol.12:791（1993））
およびクローン化レトロウイルスベクターを用いたイン
ビボ感染（Seegerら、PNAS 81:5849（1984））等の適切
な送達方法を用いるのが好ましい。
【００５４】本発明ポリペプチドを用いて、例えば、細
胞、無細胞調合物、化学ライブラリー、および天然産物
混合物中における小型分子基質およびリガンドの結合を
評価してもよい。これらの基質およびリガンドは天然基
質およびリガンドであってもよく、構造上または機能上
の模倣物であってもよい。例えば、Coligan et al.,Cur
rent Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)
参照。
胞、無細胞調合物、化学ライブラリー、および天然産物
混合物中における小型分子基質およびリガンドの結合を
評価してもよい。これらの基質およびリガンドは天然基
質およびリガンドであってもよく、構造上または機能上
の模倣物であってもよい。例えば、Coligan et al.,Cur
rent Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)
参照。
【００５５】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 また本発明は、ＲＡＴポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドの作用を増強（アゴニスト）または阻害（アンタゴ
ニスト）する化合物を同定するための、化合物のスクリ
ーニング方法をも提供する。例えば、アゴニストまたは
アンタゴニストをスクリーニングするために、ＲＡＴポ
リペプチドを含む、合成反応混合物、膜、細胞表面膜も
しくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、またはそ
れらのいずれかの調製物、およびこのようなポリペプチ
ドの標識基質またはリガンドを、ＲＡＴアゴニストまた
はアンタゴニストとなりうる候補分子の存在下または不
在下でインキュベーションする。候補分子がＲＡＴポリ
ペプチドにアゴナイズまたは拮抗する能力は、標識化リ
ガンドの結合の低下またはこのような基質からの生成物
の産生の低下に反映される。結合しても影響を及ぼさな
い分子、すなわちＲＡＴの効果を誘導しない分子は、最
も良好なアンタゴニストである可能性がある。結合性が
良好で、基質からの生成物の生成速度を高める分子はア
ゴニストである。基質からの生成物の生成速度またはレ
ベルはリポーターシステムを用いることにより強調でき
る。この点に関して有用なリポーターシステムには、生
成物に転換される比色測定用標識化基質、ＲＡＴ活性の
変化に反応するリポーター遺伝子、および当該分野で周
知の結合アッセイ等があるが、これらに限定するもので
はない。
イおよび分子 また本発明は、ＲＡＴポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドの作用を増強（アゴニスト）または阻害（アンタゴ
ニスト）する化合物を同定するための、化合物のスクリ
ーニング方法をも提供する。例えば、アゴニストまたは
アンタゴニストをスクリーニングするために、ＲＡＴポ
リペプチドを含む、合成反応混合物、膜、細胞表面膜も
しくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、またはそ
れらのいずれかの調製物、およびこのようなポリペプチ
ドの標識基質またはリガンドを、ＲＡＴアゴニストまた
はアンタゴニストとなりうる候補分子の存在下または不
在下でインキュベーションする。候補分子がＲＡＴポリ
ペプチドにアゴナイズまたは拮抗する能力は、標識化リ
ガンドの結合の低下またはこのような基質からの生成物
の産生の低下に反映される。結合しても影響を及ぼさな
い分子、すなわちＲＡＴの効果を誘導しない分子は、最
も良好なアンタゴニストである可能性がある。結合性が
良好で、基質からの生成物の生成速度を高める分子はア
ゴニストである。基質からの生成物の生成速度またはレ
ベルはリポーターシステムを用いることにより強調でき
る。この点に関して有用なリポーターシステムには、生
成物に転換される比色測定用標識化基質、ＲＡＴ活性の
変化に反応するリポーター遺伝子、および当該分野で周
知の結合アッセイ等があるが、これらに限定するもので
はない。
【００５６】ＲＡＴアンタゴニストのアッセイの他の例
は競争アッセイであり、競争阻害アッセイに適した条件
下で、ＲＡＴおよび潜在的アンタゴニストを、ＲＡＴ結
合分子、組換えＲＡＴ結合分子、天然基質もしくはリガ
ンド、または基質もしくはリガンド模倣物と混合する。
例えば放射活性または比色測定用化合物によりＲＡＴを
標識し、結合分子に結合した、または生成物に変換され
たＲＡＴ分子の数を正確に決定して、潜在的なアンタゴ
ニストの効果を評価できる。潜在的アンタゴニストに
は、本発明ポリペプチドに結合し、そのことによりその
活性を阻害し消失させる小型有機分子、ペプチド、ポリ
ペプチドおよび抗体などがある。また、潜在的アンタゴ
ニストは、密接に関連した蛋白または抗体のごとき小型
有機分子、ペプチド、ポリペプチドであってもよく、そ
れらは結合分子の同じ部位に結合するが、ＲＡＴにより
誘導される活性を誘導せず、それゆえＲＡＴを結合から
排除することによりＲＡＴの作用を妨害する。潜在的ア
ンタゴニストには、ポリペプチドの結合部位に結合し、
およびそれを占領し、それにより細胞性結合分子への結
合を防御して、正常の生物学的活性を防御する小型分子
等がある。小型分子の例としては、小型有機分子、ペプ
チド、ペプチド様分子等があるが、これらに限定するも
のではない。その他の潜在的アンタゴニストにはアンチ
センス分子等がある（これらの分子についての記載に関
してはOkano,J.，Neurochem.56:560（1991）；Oligodeo
xy-nucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expr
ession，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリダ州
（1988）参照）。好ましい潜在的アンタゴニストには、
ＲＡＴ関連化合物およびＲＡＴ変種等がある。
は競争アッセイであり、競争阻害アッセイに適した条件
下で、ＲＡＴおよび潜在的アンタゴニストを、ＲＡＴ結
合分子、組換えＲＡＴ結合分子、天然基質もしくはリガ
ンド、または基質もしくはリガンド模倣物と混合する。
例えば放射活性または比色測定用化合物によりＲＡＴを
標識し、結合分子に結合した、または生成物に変換され
たＲＡＴ分子の数を正確に決定して、潜在的なアンタゴ
ニストの効果を評価できる。潜在的アンタゴニストに
は、本発明ポリペプチドに結合し、そのことによりその
活性を阻害し消失させる小型有機分子、ペプチド、ポリ
ペプチドおよび抗体などがある。また、潜在的アンタゴ
ニストは、密接に関連した蛋白または抗体のごとき小型
有機分子、ペプチド、ポリペプチドであってもよく、そ
れらは結合分子の同じ部位に結合するが、ＲＡＴにより
誘導される活性を誘導せず、それゆえＲＡＴを結合から
排除することによりＲＡＴの作用を妨害する。潜在的ア
ンタゴニストには、ポリペプチドの結合部位に結合し、
およびそれを占領し、それにより細胞性結合分子への結
合を防御して、正常の生物学的活性を防御する小型分子
等がある。小型分子の例としては、小型有機分子、ペプ
チド、ペプチド様分子等があるが、これらに限定するも
のではない。その他の潜在的アンタゴニストにはアンチ
センス分子等がある（これらの分子についての記載に関
してはOkano,J.，Neurochem.56:560（1991）；Oligodeo
xy-nucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expr
ession，ＣＲＣプレス、ボッカラートン、フロリダ州
（1988）参照）。好ましい潜在的アンタゴニストには、
ＲＡＴ関連化合物およびＲＡＴ変種等がある。
【００５７】特別な態様において、本発明は、感染の続
発症に関与する病因および哺乳動物宿主間の最初の物理
的相互作用を妨害するための本発明ポリペプチド、ポリ
ヌクレオチドまたは阻害物質の使用を提供する。とりわ
け本発明分子を、ｉ）内在デバイス上の哺乳動物細胞外
マトリックス蛋白または傷における細胞外マトリックス
蛋白への細菌の付着、詳細にはグラム陽性細菌の付着の
防止；ｉｉ）例えば、哺乳動物チロシンキナーゼのホス
ホリレーションを開始することによる、ＲＡＴ蛋白によ
り媒介される哺乳動物細胞への侵入のブロック（Rosens
hine et al.,Infect.Immunol.60:2211(1992)）；ｉｉ
ｉ）哺乳動物細胞外マトリックス蛋白と細菌ＲＡＴ蛋白
との間の、組織ダメージを媒介する細菌付着のブロッ
ク；ｉｖ）内在デバイスの移植または他の外科的方法以
外により開始される、感染における通常の病状の進行の
ブロックに使用することができる。
発症に関与する病因および哺乳動物宿主間の最初の物理
的相互作用を妨害するための本発明ポリペプチド、ポリ
ヌクレオチドまたは阻害物質の使用を提供する。とりわ
け本発明分子を、ｉ）内在デバイス上の哺乳動物細胞外
マトリックス蛋白または傷における細胞外マトリックス
蛋白への細菌の付着、詳細にはグラム陽性細菌の付着の
防止；ｉｉ）例えば、哺乳動物チロシンキナーゼのホス
ホリレーションを開始することによる、ＲＡＴ蛋白によ
り媒介される哺乳動物細胞への侵入のブロック（Rosens
hine et al.,Infect.Immunol.60:2211(1992)）；ｉｉ
ｉ）哺乳動物細胞外マトリックス蛋白と細菌ＲＡＴ蛋白
との間の、組織ダメージを媒介する細菌付着のブロッ
ク；ｉｖ）内在デバイスの移植または他の外科的方法以
外により開始される、感染における通常の病状の進行の
ブロックに使用することができる。
【００５８】本明細書に示す各ＤＮＡ配列を、抗細菌化
合物の発見および開発に使用してもよい。コードされて
いる蛋白は、発現した場合、抗細菌剤のスクリーニング
のための標的として使用されうる。さらに、コードされ
ている蛋白のアミノ末端領域または各ｍＲＮＡのシャイ
ン−ダルガノ配列または他の翻訳容易化配列をコードし
ているＤＮＡ配列を用いてアンチセンス配列を構築し、
目的コーディング配列の発現を制御することもできる。
合物の発見および開発に使用してもよい。コードされて
いる蛋白は、発現した場合、抗細菌剤のスクリーニング
のための標的として使用されうる。さらに、コードされ
ている蛋白のアミノ末端領域または各ｍＲＮＡのシャイ
ン−ダルガノ配列または他の翻訳容易化配列をコードし
ているＤＮＡ配列を用いてアンチセンス配列を構築し、
目的コーディング配列の発現を制御することもできる。
【００５９】本発明アンタゴニストおよびアゴニスト
を、例えば、感染、とりわけ細菌感染、特に上部気道感
染（例えば、中耳炎、細菌性気道炎、急性喉頭蓋炎、甲
状腺炎）、下部気道感染（例えば、蓄膿、肺の膿瘍）、
心臓の感染（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸の感染
（例えば、分泌性下痢、脾臓の膿瘍、腹膜後膿瘍）、Ｃ
ＮＳ感染（例えば、脳の膿瘍）、目の感染（眼瞼炎、結
膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔および眼かの蜂巣炎、涙
嚢炎）、腎臓および尿道感染（例えば、精巣上体炎、腎
内および腎周囲の膿瘍、毒性ショック症候群）、皮膚感
染（例えば、インペチゴ、毛包炎、皮膚の膿瘍、蜂巣
炎、傷の感染、細菌性筋炎）、骨および関節の感染（例
えば、敗血性関節炎、骨髄炎）のごとき疾病の抑制に用
いてもよい。
を、例えば、感染、とりわけ細菌感染、特に上部気道感
染（例えば、中耳炎、細菌性気道炎、急性喉頭蓋炎、甲
状腺炎）、下部気道感染（例えば、蓄膿、肺の膿瘍）、
心臓の感染（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸の感染
（例えば、分泌性下痢、脾臓の膿瘍、腹膜後膿瘍）、Ｃ
ＮＳ感染（例えば、脳の膿瘍）、目の感染（眼瞼炎、結
膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔および眼かの蜂巣炎、涙
嚢炎）、腎臓および尿道感染（例えば、精巣上体炎、腎
内および腎周囲の膿瘍、毒性ショック症候群）、皮膚感
染（例えば、インペチゴ、毛包炎、皮膚の膿瘍、蜂巣
炎、傷の感染、細菌性筋炎）、骨および関節の感染（例
えば、敗血性関節炎、骨髄炎）のごとき疾病の抑制に用
いてもよい。
【００６０】ワクチン 本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免
疫学的反応を誘起する方法に関し、該方法は、感染、詳
細には細菌感染、最も詳細にはスタフィロコッカス・ア
ウレウス感染から個体を防御する抗体を産生させるに十
分なＲＡＴまたはそのフラグメントもしくは変種を個体
に接種することを特徴とする。本発明のさらにもう１つ
の態様は、個体における免疫学的応答の誘導方法に関
し、該方法は、遺伝子治療により、ＲＡＴまたはそのフ
ラグメントもしくは変種をコードしている遺伝子を送達
して、ＲＡＴまたはそのフラグメントもしくは変種をイ
ンビボで発現させて、免疫学的応答を誘導し、該個体を
疾病から防御する抗体を産生させることを特徴とする。
疫学的反応を誘起する方法に関し、該方法は、感染、詳
細には細菌感染、最も詳細にはスタフィロコッカス・ア
ウレウス感染から個体を防御する抗体を産生させるに十
分なＲＡＴまたはそのフラグメントもしくは変種を個体
に接種することを特徴とする。本発明のさらにもう１つ
の態様は、個体における免疫学的応答の誘導方法に関
し、該方法は、遺伝子治療により、ＲＡＴまたはそのフ
ラグメントもしくは変種をコードしている遺伝子を送達
して、ＲＡＴまたはそのフラグメントもしくは変種をイ
ンビボで発現させて、免疫学的応答を誘導し、該個体を
疾病から防御する抗体を産生させることを特徴とする。
【００６１】本発明のさらなる態様は、免疫反応を誘導
されうる細胞内、または誘導されている細胞内に導入さ
れた場合、ＲＡＴまたはそれによりコードされている蛋
白に対する免疫学的反応を該宿主に誘導する免疫学的組
成物に関し、その組成物は組換えＲＡＴまたはそれによ
りコードされている蛋白を含み、ＲＡＴまたはそれによ
りコードされている蛋白に対する抗原をコードし発現す
るＤＮＡを含む。
されうる細胞内、または誘導されている細胞内に導入さ
れた場合、ＲＡＴまたはそれによりコードされている蛋
白に対する免疫学的反応を該宿主に誘導する免疫学的組
成物に関し、その組成物は組換えＲＡＴまたはそれによ
りコードされている蛋白を含み、ＲＡＴまたはそれによ
りコードされている蛋白に対する抗原をコードし発現す
るＤＮＡを含む。
【００６２】ＲＡＴまたはそれらのフラグメントを、そ
れ自身は抗体を産生しないが、第１の蛋白を安定化し、
免疫原的および保護特性を有する融合蛋白を産生する能
力のある共存蛋白（co-protein）と融合させてもよい。
好ましくは、かかる融合組換え蛋白は、抗原補蛋白、例
えばヘモフィルス・インフルエンザエ（Hemophilusinfl
uenzae）由来のリポ蛋白Ｄ、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシダー
ゼのごとき共存蛋白、蛋白を可溶化してそれらの産生お
よび精製を促進する比較的大きな共存蛋白等を含む。さ
らに、共存蛋白は免疫系において普遍的な刺激を提供す
るという意味で、アジュバントとして作用することがで
きる。共存蛋白は第１の蛋白のアミノまたはカルボキシ
ル末端のどちらかに結合できる。
れ自身は抗体を産生しないが、第１の蛋白を安定化し、
免疫原的および保護特性を有する融合蛋白を産生する能
力のある共存蛋白（co-protein）と融合させてもよい。
好ましくは、かかる融合組換え蛋白は、抗原補蛋白、例
えばヘモフィルス・インフルエンザエ（Hemophilusinfl
uenzae）由来のリポ蛋白Ｄ、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシダー
ゼのごとき共存蛋白、蛋白を可溶化してそれらの産生お
よび精製を促進する比較的大きな共存蛋白等を含む。さ
らに、共存蛋白は免疫系において普遍的な刺激を提供す
るという意味で、アジュバントとして作用することがで
きる。共存蛋白は第１の蛋白のアミノまたはカルボキシ
ル末端のどちらかに結合できる。
【００６３】本発明は、本発明のポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドおよびSato Y.ら、Science 273:352(199
6)に記載されているような免疫刺激ＤＮＡ配列を含む組
成物、とりわけワクチン組成物、および方法を提供す
る。
リヌクレオチドおよびSato Y.ら、Science 273:352(199
6)に記載されているような免疫刺激ＤＮＡ配列を含む組
成物、とりわけワクチン組成物、および方法を提供す
る。
【００６４】また、本発明は、スタフィロコッカス・ア
ウレウスに感染した動物モデルにおいて、かかる遺伝的
免疫化実験に用いられるＤＮＡ構築物中の細菌細胞表面
蛋白の不変領域をコードすることが示されている、説明
したポリヌクレオチドまたはとりわけそれらのフラグメ
ントを用いる方法を提供し、これらはとりわけ予防的ま
たは治療的免疫反応を刺激することができる蛋白エピト
ープを同定するのに有用である。この研究は、哺乳動
物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけスタフィロ
コッカス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置の
開発のために、感染に抵抗しこれを一掃するのに成功し
た動物の必須器官から特に価値あるモノクローナル抗体
をうまく調製することを可能にすると思われる。
ウレウスに感染した動物モデルにおいて、かかる遺伝的
免疫化実験に用いられるＤＮＡ構築物中の細菌細胞表面
蛋白の不変領域をコードすることが示されている、説明
したポリヌクレオチドまたはとりわけそれらのフラグメ
ントを用いる方法を提供し、これらはとりわけ予防的ま
たは治療的免疫反応を刺激することができる蛋白エピト
ープを同定するのに有用である。この研究は、哺乳動
物、とりわけヒトにおける細菌感染とりわけスタフィロ
コッカス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置の
開発のために、感染に抵抗しこれを一掃するのに成功し
た動物の必須器官から特に価値あるモノクローナル抗体
をうまく調製することを可能にすると思われる。
【００６５】ポリペプチドを宿主接種用抗原として用い
て、例えば損傷組織への細菌の付着を阻害することによ
り細菌の侵入に対して防御する特異的抗体を得てもよ
い。組織損傷の例としては、例えば機械的、化学的もし
くは熱的ダメージにより、または内在デバイスの埋め込
みにより引き起こされた皮膚または結合組織の創傷、ま
たは粘膜、例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷等があ
る。
て、例えば損傷組織への細菌の付着を阻害することによ
り細菌の侵入に対して防御する特異的抗体を得てもよ
い。組織損傷の例としては、例えば機械的、化学的もし
くは熱的ダメージにより、または内在デバイスの埋め込
みにより引き起こされた皮膚または結合組織の創傷、ま
たは粘膜、例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷等があ
る。
【００６６】また本発明は、適切な担体と一緒になった
免疫原性組換え蛋白を含有するワクチン処方を包含す
る。蛋白は胃で分解するので、非経口的に、例えば皮
下、筋肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好ま
しい。非経口投与に適した処方には、抗酸化剤、緩衝
液、静菌剤、および処方を個体の体液（好ましくは血
液）と等張にする溶質を含有していてもよい水性または
非水性滅菌注射液、および懸濁化剤または増粘剤を含有
していてもよい水性または非水性滅菌懸濁液等がある。
処方は１回投与または多回投与用容器、例えばシールし
たアンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に無
菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として
保存してもよい。ワクチン処方は処方の免疫原性を高め
るアジュバント系を含有していてもよく、例えば水中油
系または当該分野で周知のその他の系等がある。用量は
ワクチンの特異的活性に依存し、通常の実験法により容
易に決定できる。本発明を特定のＲＡＴ蛋白に関して説
明したが、本発明は天然に存在する蛋白および、実質的
に組換え蛋白の免疫原特性に影響しない付加、欠失また
は置換を施した類似の蛋白のフラグメントを包含するこ
とが理解されよう。
免疫原性組換え蛋白を含有するワクチン処方を包含す
る。蛋白は胃で分解するので、非経口的に、例えば皮
下、筋肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好ま
しい。非経口投与に適した処方には、抗酸化剤、緩衝
液、静菌剤、および処方を個体の体液（好ましくは血
液）と等張にする溶質を含有していてもよい水性または
非水性滅菌注射液、および懸濁化剤または増粘剤を含有
していてもよい水性または非水性滅菌懸濁液等がある。
処方は１回投与または多回投与用容器、例えばシールし
たアンプルおよびバイアルに入れてよく、使用直前に無
菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態として
保存してもよい。ワクチン処方は処方の免疫原性を高め
るアジュバント系を含有していてもよく、例えば水中油
系または当該分野で周知のその他の系等がある。用量は
ワクチンの特異的活性に依存し、通常の実験法により容
易に決定できる。本発明を特定のＲＡＴ蛋白に関して説
明したが、本発明は天然に存在する蛋白および、実質的
に組換え蛋白の免疫原特性に影響しない付加、欠失また
は置換を施した類似の蛋白のフラグメントを包含するこ
とが理解されよう。
【００６７】組成物、キットおよび投与 本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。本発明ポリペプチドを、細
胞、組織もしくは生物に用いられる未滅菌もしくは滅菌
済み担体と混合して、例えば対象への投与に適した医薬
的担体と混合して用いることができる。このような組成
物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポ
リペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦形
剤を含む。このような担体には生理食塩水、緩衝化生理
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限定
するものではない。処方は投与法に適したものにすべき
である。さらに本発明は、１またはそれ以上の上記本発
明組成物成分を充填した１またはそれ以上の容器を含ん
でなる診断用および医薬用パックおよびキットにも関す
る。
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。本発明ポリペプチドを、細
胞、組織もしくは生物に用いられる未滅菌もしくは滅菌
済み担体と混合して、例えば対象への投与に適した医薬
的担体と混合して用いることができる。このような組成
物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明ポ
リペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦形
剤を含む。このような担体には生理食塩水、緩衝化生理
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限定
するものではない。処方は投与法に適したものにすべき
である。さらに本発明は、１またはそれ以上の上記本発
明組成物成分を充填した１またはそれ以上の容器を含ん
でなる診断用および医薬用パックおよびキットにも関す
る。
【００６８】本発明ポリペプチドおよびその他の化合物
を、単独で、あるいは治療用化合物等のその他の化合物
と組み合わせて用いてもよい。いずれかの有効かつ利便
的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、肛門、経膣、
静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮膚
内の経路で医薬組成物を投与してもよい。治療におい
て、または予防薬として、活性物質を注射用組成物とし
て、例えば好ましくは等張の無菌水性分散物として個体
に投与できる。別法として、組成物を局所適用用、例え
ば軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳
液、洗口剤、染み込ませた包帯および縫合用の糸、なら
びにエアロゾール等の形態に処方してもよく、適当な慣
用的な添加物、例えば保存剤、薬物の浸透を補助する溶
媒、ならびに軟膏およびクリームには軟化剤を含有して
いてもよい。かかる局所用処方は、適合した慣用的な担
体、例えばクリームまたは軟膏基剤、およびローション
にはエタノールまたはオレイルアルコールを含有してい
てもよい。このような担体は重量で処方の約１％から約
９８％であってよく、より通常には重量で処方の約８０
％までとする。哺乳動物とりわけヒトに投与するため
に、活性物質の１日あたりの投与量は、０.０１ｍｇ／
ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／
ｋｇである。医者はあらゆる場合、個体に最も適した実
際の投与量を決定し、年齢、体重および特に個体の反応
性に応じて変化させる。上述の投与量は、平均的なケー
スの典型例である。もちろん、高用量および低用量の範
囲が適合する個々の例もあり、かかる例は本発明の範囲
内である。
を、単独で、あるいは治療用化合物等のその他の化合物
と組み合わせて用いてもよい。いずれかの有効かつ利便
的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、肛門、経膣、
静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮膚
内の経路で医薬組成物を投与してもよい。治療におい
て、または予防薬として、活性物質を注射用組成物とし
て、例えば好ましくは等張の無菌水性分散物として個体
に投与できる。別法として、組成物を局所適用用、例え
ば軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳
液、洗口剤、染み込ませた包帯および縫合用の糸、なら
びにエアロゾール等の形態に処方してもよく、適当な慣
用的な添加物、例えば保存剤、薬物の浸透を補助する溶
媒、ならびに軟膏およびクリームには軟化剤を含有して
いてもよい。かかる局所用処方は、適合した慣用的な担
体、例えばクリームまたは軟膏基剤、およびローション
にはエタノールまたはオレイルアルコールを含有してい
てもよい。このような担体は重量で処方の約１％から約
９８％であってよく、より通常には重量で処方の約８０
％までとする。哺乳動物とりわけヒトに投与するため
に、活性物質の１日あたりの投与量は、０.０１ｍｇ／
ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／
ｋｇである。医者はあらゆる場合、個体に最も適した実
際の投与量を決定し、年齢、体重および特に個体の反応
性に応じて変化させる。上述の投与量は、平均的なケー
スの典型例である。もちろん、高用量および低用量の範
囲が適合する個々の例もあり、かかる例は本発明の範囲
内である。
【００６９】内在デバイスには外科的インプラント、補
てつデバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体
に導入し、長時間その位置に存在するものである。かか
るデバイスには、例えば人工関節、心臓弁、ペースメー
カー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャン
ト、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析（continuo
us ambulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カテ
ーテル等がある。本発明の組成物を注射により投与し、
内在デバイスの挿入の直前に、関連細菌に対する全身的
な効果を得てもよい。手術後、デバイスが体内に存在す
る期間中、処置を続けてもよい。さらに、外科的手技中
に広げるカバーに用いて、細菌性創傷感染、とりわけス
タフィロコッカス・アウレウスの創傷感染を防御するこ
ともできる。
てつデバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体
に導入し、長時間その位置に存在するものである。かか
るデバイスには、例えば人工関節、心臓弁、ペースメー
カー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャン
ト、尿カテーテル、継続的歩行可能腹膜透析（continuo
us ambulatory peritoneal dialysis：ＣＡＰＤ）カテ
ーテル等がある。本発明の組成物を注射により投与し、
内在デバイスの挿入の直前に、関連細菌に対する全身的
な効果を得てもよい。手術後、デバイスが体内に存在す
る期間中、処置を続けてもよい。さらに、外科的手技中
に広げるカバーに用いて、細菌性創傷感染、とりわけス
タフィロコッカス・アウレウスの創傷感染を防御するこ
ともできる。
【００７０】多くの整形外科医は、補てつ関節を有する
ヒトについては、菌血症を生じうる歯科的処置の前に抗
生物質予防法を考慮すべきであると考えている。遅延性
の重篤な感染は、時々補てつ関節を失うに至る深刻な合
併症であり、有意性のある罹病率および死亡率を伴う。
従って、この場合、予防的な抗生物質に代わるものとし
て、活性物質の使用を拡張することが可能である。
ヒトについては、菌血症を生じうる歯科的処置の前に抗
生物質予防法を考慮すべきであると考えている。遅延性
の重篤な感染は、時々補てつ関節を失うに至る深刻な合
併症であり、有意性のある罹病率および死亡率を伴う。
従って、この場合、予防的な抗生物質に代わるものとし
て、活性物質の使用を拡張することが可能である。
【００７１】上述の治療に加え、一般的には本発明組成
物を一般的に創傷の治療薬として使用して、創傷組織に
曝露したマトリックス蛋白に細菌が付着するのを防いで
もよく、歯科治療においては抗生物質による予防法に代
えて、またはそれと組み合わせて予防的に使用してもよ
い。
物を一般的に創傷の治療薬として使用して、創傷組織に
曝露したマトリックス蛋白に細菌が付着するのを防いで
もよく、歯科治療においては抗生物質による予防法に代
えて、またはそれと組み合わせて予防的に使用してもよ
い。
【００７２】別法として、本発明の組成物を用いて挿入
直前の内在デバイスを浸してもよい。創傷または内在デ
バイスを浸すためには、活性物質は１μｇ／ｍｌから１
０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。ワクチン組成
物を便宜的に注射可能な形態にする。慣用的なアジュバ
ントを用いて免疫反応を高めてもよい。ワクチン化に適
した単位投与量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、
このような投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するの
が好ましい。本発明化合物については、指示した投与量
範囲では、適切な個体への投与を妨げるような不利な毒
性効果は観察されない。上記抗体を診断試薬として用い
てＲＡＴ蛋白を有する細菌の存在を検出してもよい。
直前の内在デバイスを浸してもよい。創傷または内在デ
バイスを浸すためには、活性物質は１μｇ／ｍｌから１
０ｍｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。ワクチン組成
物を便宜的に注射可能な形態にする。慣用的なアジュバ
ントを用いて免疫反応を高めてもよい。ワクチン化に適
した単位投与量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、
このような投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するの
が好ましい。本発明化合物については、指示した投与量
範囲では、適切な個体への投与を妨げるような不利な毒
性効果は観察されない。上記抗体を診断試薬として用い
てＲＡＴ蛋白を有する細菌の存在を検出してもよい。
【００７３】
【実施例】以下の実施例は、詳細に説明したこと以外
は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を用いて実施
する。実施例は説明のためにのみ示すもので、本発明を
限定するものではない。 実施例１：ライブラリーの製造 ＲＡＴポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を有す
る各ＲＡＴポリヌクレオチドを、イー・コリ中のスタフ
ィロコッカス・アウレウスの染色体ＤＮＡのクローンの
ライブラリーから得た。重複するスタフィロコッカス・
アウレウスのＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のク
ローンからの配列決定データを用いて隣接ＤＮＡ配列を
構築した場合もある。通常の方法、例えば以下の方法１
および２によりライブラリーを製造できる。全細胞ＤＮ
Ａは、スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９か
ら、標準法に準じて単離し、二つの方法のどちらかによ
りサイズ分画する。
は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を用いて実施
する。実施例は説明のためにのみ示すもので、本発明を
限定するものではない。 実施例１：ライブラリーの製造 ＲＡＴポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を有す
る各ＲＡＴポリヌクレオチドを、イー・コリ中のスタフ
ィロコッカス・アウレウスの染色体ＤＮＡのクローンの
ライブラリーから得た。重複するスタフィロコッカス・
アウレウスのＤＮＡを含有する２個またはそれ以上のク
ローンからの配列決定データを用いて隣接ＤＮＡ配列を
構築した場合もある。通常の方法、例えば以下の方法１
および２によりライブラリーを製造できる。全細胞ＤＮ
Ａは、スタフィロコッカス・アウレウスＷＣＵＨ２９か
ら、標準法に準じて単離し、二つの方法のどちらかによ
りサイズ分画する。
【００７４】方法１ 標準法に準じてサイズ分画化するために、全細胞ＤＮＡ
を注射針に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの
大きさのフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよびＤ
ＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断されているベクターラムダＺａｐＩＩに
連結し、標準法によりライブラリーをパッケージング
し、次いでパッケージングしたライブラリーで大腸菌を
感染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。 方法２ 全細胞性ＤＮＡは、ライブラリーベクター（例えば、Ｒ
ｓａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）にク
ローニングするための一連のフラグメントを適切に生じ
る１の制限酵素または制限酵素の組み合わせで部分的加
水分解し、かかるフラグメントを標準法に準じてサイズ
分画化する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグ
メントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断されているベ
クターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライブ
ラリーをパッケージングし、次いでパッケージングした
ライブラリーで大腸菌を感染させる。ライブラリーを標
準法により増幅する。
を注射針に通して機械的に剪断する。１１ｋｂｐまでの
大きさのフラグメントを、エクソヌクレアーゼおよびＤ
ＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化
し、ＥｃｏＲＩリンカーを加える。フラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断されているベクターラムダＺａｐＩＩに
連結し、標準法によりライブラリーをパッケージング
し、次いでパッケージングしたライブラリーで大腸菌を
感染させる。ライブラリーは標準法により増幅する。 方法２ 全細胞性ＤＮＡは、ライブラリーベクター（例えば、Ｒ
ｓａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓｈｌ２３５Ｉ）にク
ローニングするための一連のフラグメントを適切に生じ
る１の制限酵素または制限酵素の組み合わせで部分的加
水分解し、かかるフラグメントを標準法に準じてサイズ
分画化する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグ
メントに連結し、次いでＥｃｏＲＩで切断されているベ
クターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライブ
ラリーをパッケージングし、次いでパッケージングした
ライブラリーで大腸菌を感染させる。ライブラリーを標
準法により増幅する。
【００７５】実施例２：ＲＡＴの特徴づけ ＲＡＴ酵素活性のアッセイ 放射性標識14Ｃ−グルタミン酸を用いて（14Ｃ−Ｇｌ
ｕ）−ｔＲＮＡＧｌｎの（14Ｃ−Ｇｌｎ）−ｔＲＮＡＧ
ｌｎへの変換をモニターする。（14Ｃ−Ｇｌｘ）−ｔＲ
ＮＡＧｌｎを脱アシル化し、その生成物を小型（２ｘ
０．５ｃｍ）のDowex 1（クロライド型）カラムで分離
する。９５％以上のグルタミンが洗い流され、９９％以
上のグルタミン酸が保持される。 ＲＡＴ作用の分析のための生物学的材料 １）Ｇｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｎ ２）Ｇｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｎ製造のためのスタフィロコ
ッカスのグルタミル−ｔＲＮＡシンセターゼ（本明細書
では「ＥＲＳ」ともいう） ＥＲＳ遺伝子および蛋白配列については図３および図４
参照 ３）実質的に精製されたエス・アウレウス由来のｔＲＮ
Ａ−依存性アミドトランスフェラーゼ ＲＡＴ分析 １）ＥＲＳの過剰発現および精製 ＥＲＳの全コーディング配列を単離した。ＥＲＳ遺伝子
および蛋白配列については図３および４参照。この配列
を適当な発現ベクター中にクローン化して蛋白を精製
し、ＲＡＴ反応において基質として用いるＧｌｕ−ｔＲ
ＮＡＧｌｎを得る。 ２）ｔＲＮＡＧｌｎの適当な種の取得 合成オリゴヌクレオチドからエス・アウレウスのｔＲＮ
ＡＧｌｎ遺伝子を構築し、過剰発現させ、精製し、そし
て／またはイー・コリ（E.coli）ｔＲＮＡＧｌｎ−１／
２を得る。そのようにして得られたｔＲＮＡＧｌｎを、
エス・アウレウスのＥＲＳでの誤アシル化効率について
試験することができる。 ３）エス・アウレウスのＲＡＴの精製 （14Ｃ−Ｇｌｕ）−ｔＲＮＡＧｌｎを用いてＲＡＴを精
製して精製状況を追跡する。脱アシル化および上記Dowe
x 1によるグルタミンからのグルタミン酸の分離により
蛋白をアッセイする。 ４）アミノ酸配列決定 Ｎ−末端配列および蛋白分解による内部ペプチドのＮ−
末端配列を標準的方法を用いて得る。これらの配列を用
いてプローブを調製し、エス・アウレウスＷＣＵＨ２９
ファージライブラリーから全長のＲＡＴ遺伝子を単離す
る。 ５）ＲＡＴの過剰発現および精製 クローニングおよび配列決定の後、ＲＡＴ蛋白を過剰発
現させ、生物学的／酵素学的／構造上の研究のために、
そして化合物スクリーニングのための材料を得るために
精製する。 ６）化合物スクリーニング 高処理量スクリーニング 放射性標識グルタミン酸およびイオン交換クロマトグラ
フィーに頼らないで高処理量化合物スクリーニングをセ
ットアップする。アミドトランスフェラーゼ反応はＡＴ
Ｐを用いて一時的にγ−ホスホリル中間体を精製するも
のである。ＡＴＰからのＰｉの遊離をフォトメトリー的
に測定することにより酵素活性を評価する［Ｐｉの比色
アッセイ（５）］。このアッセイはｎＭの感度でＰｉレ
ベルを検知すると考えられる。 天然生成物スクリーニング14 Ｃ−グルタミンからの14Ｃ−グルタミン酸の分離によ
りＲＡＴ活性の天然生成物スクリーニングアッセイを行
ってもよい。既知方法を用いるDowex 1へのバッチ吸着
により、イオン交換カラムからの溶離を用いて14Ｃ−グ
ルタミン酸を14Ｃグルタミンから分離してもよい。 ７）対照グルタミンシンターゼ（例）は、陽性であるこ
とを試験する化合物の特異性についての対照として役立
ちうる。グルタミンシンターゼは市販されている。必要
ならば、蛋白が非常によく知られたものであるので、お
そらく蛋白を調製することができよう（すなわち、精
製、生化学的方法、結晶構造により）。アミドトランス
フェラーゼの既知阻害剤である多くのグルタミンアナロ
グ（アザセリン、メチオニン、スルホキシイミンおよび
６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン）が存在す
る。これらの化合物は市販されており、上記のごとく、
また既知アッセイにおいて試験する。またそれらはイン
ビトロアッセイにおける試験化合物の陽性対照としても
役立つ。陽性化合物を全細胞アッセイにおいて試験する
こともできる。イー・コリはＧｌｎＲＳを有し、それゆ
えＲＡＴ特異的阻害剤により影響を受けないが、アール
・メリロチ（R.meliloti）（おそらく同様の透過性の障
壁を有するグラム陰性菌）はＧｌｎＲＳを有しないの
で、ＲＡＴに依存し、感受性があると考えられる。
ｕ）−ｔＲＮＡＧｌｎの（14Ｃ−Ｇｌｎ）−ｔＲＮＡＧ
ｌｎへの変換をモニターする。（14Ｃ−Ｇｌｘ）−ｔＲ
ＮＡＧｌｎを脱アシル化し、その生成物を小型（２ｘ
０．５ｃｍ）のDowex 1（クロライド型）カラムで分離
する。９５％以上のグルタミンが洗い流され、９９％以
上のグルタミン酸が保持される。 ＲＡＴ作用の分析のための生物学的材料 １）Ｇｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｎ ２）Ｇｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｎ製造のためのスタフィロコ
ッカスのグルタミル−ｔＲＮＡシンセターゼ（本明細書
では「ＥＲＳ」ともいう） ＥＲＳ遺伝子および蛋白配列については図３および図４
参照 ３）実質的に精製されたエス・アウレウス由来のｔＲＮ
Ａ−依存性アミドトランスフェラーゼ ＲＡＴ分析 １）ＥＲＳの過剰発現および精製 ＥＲＳの全コーディング配列を単離した。ＥＲＳ遺伝子
および蛋白配列については図３および４参照。この配列
を適当な発現ベクター中にクローン化して蛋白を精製
し、ＲＡＴ反応において基質として用いるＧｌｕ−ｔＲ
ＮＡＧｌｎを得る。 ２）ｔＲＮＡＧｌｎの適当な種の取得 合成オリゴヌクレオチドからエス・アウレウスのｔＲＮ
ＡＧｌｎ遺伝子を構築し、過剰発現させ、精製し、そし
て／またはイー・コリ（E.coli）ｔＲＮＡＧｌｎ−１／
２を得る。そのようにして得られたｔＲＮＡＧｌｎを、
エス・アウレウスのＥＲＳでの誤アシル化効率について
試験することができる。 ３）エス・アウレウスのＲＡＴの精製 （14Ｃ−Ｇｌｕ）−ｔＲＮＡＧｌｎを用いてＲＡＴを精
製して精製状況を追跡する。脱アシル化および上記Dowe
x 1によるグルタミンからのグルタミン酸の分離により
蛋白をアッセイする。 ４）アミノ酸配列決定 Ｎ−末端配列および蛋白分解による内部ペプチドのＮ−
末端配列を標準的方法を用いて得る。これらの配列を用
いてプローブを調製し、エス・アウレウスＷＣＵＨ２９
ファージライブラリーから全長のＲＡＴ遺伝子を単離す
る。 ５）ＲＡＴの過剰発現および精製 クローニングおよび配列決定の後、ＲＡＴ蛋白を過剰発
現させ、生物学的／酵素学的／構造上の研究のために、
そして化合物スクリーニングのための材料を得るために
精製する。 ６）化合物スクリーニング 高処理量スクリーニング 放射性標識グルタミン酸およびイオン交換クロマトグラ
フィーに頼らないで高処理量化合物スクリーニングをセ
ットアップする。アミドトランスフェラーゼ反応はＡＴ
Ｐを用いて一時的にγ−ホスホリル中間体を精製するも
のである。ＡＴＰからのＰｉの遊離をフォトメトリー的
に測定することにより酵素活性を評価する［Ｐｉの比色
アッセイ（５）］。このアッセイはｎＭの感度でＰｉレ
ベルを検知すると考えられる。 天然生成物スクリーニング14 Ｃ−グルタミンからの14Ｃ−グルタミン酸の分離によ
りＲＡＴ活性の天然生成物スクリーニングアッセイを行
ってもよい。既知方法を用いるDowex 1へのバッチ吸着
により、イオン交換カラムからの溶離を用いて14Ｃ−グ
ルタミン酸を14Ｃグルタミンから分離してもよい。 ７）対照グルタミンシンターゼ（例）は、陽性であるこ
とを試験する化合物の特異性についての対照として役立
ちうる。グルタミンシンターゼは市販されている。必要
ならば、蛋白が非常によく知られたものであるので、お
そらく蛋白を調製することができよう（すなわち、精
製、生化学的方法、結晶構造により）。アミドトランス
フェラーゼの既知阻害剤である多くのグルタミンアナロ
グ（アザセリン、メチオニン、スルホキシイミンおよび
６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン）が存在す
る。これらの化合物は市販されており、上記のごとく、
また既知アッセイにおいて試験する。またそれらはイン
ビトロアッセイにおける試験化合物の陽性対照としても
役立つ。陽性化合物を全細胞アッセイにおいて試験する
こともできる。イー・コリはＧｌｎＲＳを有し、それゆ
えＲＡＴ特異的阻害剤により影響を受けないが、アール
・メリロチ（R.meliloti）（おそらく同様の透過性の障
壁を有するグラム陰性菌）はＧｌｎＲＳを有しないの
で、ＲＡＴに依存し、感受性があると考えられる。
【００７６】実施例３ ＲＡＴアッセイ（Ｇｌｕ−ｔＲ
ＮＡｇｌｎアミドトランスフェラーゼ） 使用アッセイはZalkin（Methods in Enzymology(1985)1
13,303-305）のものである。 反応は以下のとおり： Ｇｌｕ−ｔＲＮＡGln＋ＡＴＰ＋グルタミン Ｇｌｎ−ｔＲＮＡGln＋ＡＴＰ＋Ｐｉ＋グルタミン酸 アッセイは以下のとおり：最終反応混合物は５０μｌ。
下記試薬を添加する（各５μｌ）カコジル酸カリウム
（５００ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５０ｍ
Ｍ）、ＭｇＣｌ2（５ｍＭ）、（14Ｃ）エス・アウレウ
スのＧｌｕ−ｔＲＮＡｇｌｎ（精製エス・アウレウスの
ｔＲＮＡのＥＲＳチャージングにより調製）、ＡＴＰ
（１００ｍＭ）。次いで、水および酵素を添加して最終
体積５０μｌとする。アッセイ系を３０℃で５分インキ
ュベーションする。０.５ｍｌのＫＯＨ（０.０２Ｍ）を
添加することにより反応を停止し、さらに２分間インキ
ュベーションし、０.１ｍｌ ＨＣｌ（０.１Ｍ）を添加
することにより中和する。水で平衡化したDowex 1（Ｃ
ｌ-型）カラム（０.５ｘ２ｃｍ）に試料を適用する。カ
ラムを１.５ｍｌの水で洗浄し、溶離した物質を集め、W
allac Microbetaplateカウンターでカウントする。エス
・アウレウスOxfordの細胞溶解物は約０.１ないし０.３
ナノモル／分／ｍｇの比活性を有する。高度に精製され
た標品は約２５ナノモル／分／ｍｇの比活性を有する。
この精製物質をネイティブＳＤＳポリアクリルアミド電
気泳動ゲルに供すると、分子量１１ｋＤのところに主要
種が示される。還元的ＳＤＳ ＰＡＧＥでの電気泳動に
より、約５４および５５ｋＤの２つの種が示される。こ
のことは、本発明の１の具体例はヘテロダイマーとして
存在する分子であることが示唆される。実質的に精製さ
れた物質の試験を、当該分野において知られたＮ−末端
分析（２回）法を用いて行ってもよい。Ｎ−末端をブロ
ックした蛋白をトリプシン消化して内部配列を得る。質
量決定法はＭＡＬＤＩ ＭＳである。
ＮＡｇｌｎアミドトランスフェラーゼ） 使用アッセイはZalkin（Methods in Enzymology(1985)1
13,303-305）のものである。 反応は以下のとおり： Ｇｌｕ−ｔＲＮＡGln＋ＡＴＰ＋グルタミン Ｇｌｎ−ｔＲＮＡGln＋ＡＴＰ＋Ｐｉ＋グルタミン酸 アッセイは以下のとおり：最終反応混合物は５０μｌ。
下記試薬を添加する（各５μｌ）カコジル酸カリウム
（５００ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５０ｍ
Ｍ）、ＭｇＣｌ2（５ｍＭ）、（14Ｃ）エス・アウレウ
スのＧｌｕ−ｔＲＮＡｇｌｎ（精製エス・アウレウスの
ｔＲＮＡのＥＲＳチャージングにより調製）、ＡＴＰ
（１００ｍＭ）。次いで、水および酵素を添加して最終
体積５０μｌとする。アッセイ系を３０℃で５分インキ
ュベーションする。０.５ｍｌのＫＯＨ（０.０２Ｍ）を
添加することにより反応を停止し、さらに２分間インキ
ュベーションし、０.１ｍｌ ＨＣｌ（０.１Ｍ）を添加
することにより中和する。水で平衡化したDowex 1（Ｃ
ｌ-型）カラム（０.５ｘ２ｃｍ）に試料を適用する。カ
ラムを１.５ｍｌの水で洗浄し、溶離した物質を集め、W
allac Microbetaplateカウンターでカウントする。エス
・アウレウスOxfordの細胞溶解物は約０.１ないし０.３
ナノモル／分／ｍｇの比活性を有する。高度に精製され
た標品は約２５ナノモル／分／ｍｇの比活性を有する。
この精製物質をネイティブＳＤＳポリアクリルアミド電
気泳動ゲルに供すると、分子量１１ｋＤのところに主要
種が示される。還元的ＳＤＳ ＰＡＧＥでの電気泳動に
より、約５４および５５ｋＤの２つの種が示される。こ
のことは、本発明の１の具体例はヘテロダイマーとして
存在する分子であることが示唆される。実質的に精製さ
れた物質の試験を、当該分野において知られたＮ−末端
分析（２回）法を用いて行ってもよい。Ｎ−末端をブロ
ックした蛋白をトリプシン消化して内部配列を得る。質
量決定法はＭＡＬＤＩ ＭＳである。
【００７７】文献 １）Wilcox,M.,Eur.J.Biochem.11.405-412,1969 ２）Jahn,D.,et al,J.Biol.Chem.265,8059-8064,1990 ３）Strauch,M.A.,et al.,J.Bacteriol 170,916-920,19
88 ４）Lamour,V.,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.91,8670-867
4,1994 ５）Lanzetta,P.A.et al,Anal.Biochem.100,95-97,1979
88 ４）Lamour,V.,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.91,8670-867
4,1994 ５）Lanzetta,P.A.et al,Anal.Biochem.100,95-97,1979
【００７８】
【００７９】（１）一般的情報： （ｉ）出願人：ブラック，マイケル・ティルイス，セリ
・ジェイ （ｉｉ）発明の名称：新規ＲＡＴ （ｉｉｉ）配列の数：２ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛て名：デチャート，ブライス・アンド・ローズ （Ｂ）通り名：アーチ・ストート１７１７番、ベル・ア
トランティック・タワー４０００ （Ｃ）都市名：フィラデルフィア （Ｄ）州名：ペンシルベニア （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９１０３−２７９３ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）作動システム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：Windowsバージョン２.０用FastSE
Q （ｖｉ）現出願のデータ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日：１９９７年１０月１７日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号：６０／０３７８５７ （Ｂ）出願日：１９９７年２月７日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：フォーク，スティーブン・ティ （Ｂ）登録番号：３６７９５ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＭ５００１２ （ｘｉ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：２１５−９９４−２４８８ （Ｂ）ファックス番号：２１５−９９４−２２２２ （Ｃ）テレックス：
・ジェイ （ｉｉ）発明の名称：新規ＲＡＴ （ｉｉｉ）配列の数：２ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛て名：デチャート，ブライス・アンド・ローズ （Ｂ）通り名：アーチ・ストート１７１７番、ベル・ア
トランティック・タワー４０００ （Ｃ）都市名：フィラデルフィア （Ｄ）州名：ペンシルベニア （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９１０３−２７９３ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）作動システム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：Windowsバージョン２.０用FastSE
Q （ｖｉ）現出願のデータ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日：１９９７年１０月１７日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号：６０／０３７８５７ （Ｂ）出願日：１９９７年２月７日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：フォーク，スティーブン・ティ （Ｂ）登録番号：３６７９５ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＭ５００１２ （ｘｉ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：２１５−９９４−２４８８ （Ｂ）ファックス番号：２１５−９９４−２２２２ （Ｃ）テレックス：
【００８０】（２）配列番号：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１４５８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：２本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： ATGAGCGATC GTATAAGAGT AAGATATGCA CCAAGTCCAA CTGGTTATCT TCATATTGGT 60 AATGCAAGAA CAGCATTATT CAATTACTTG TATGCTAAAC ATTACAACGG AGATTTTGTG 120 ATTCGAATTG AAGATACTGA TAAAAAACGT AATTTAGAAG ATGGAGAAAC ATCACAATTT 180 GATAATCTTA AATGGTTAGG ATTAGATTGG GATGAGTCTG TAGATAAAGA CAATGGCTAC 240 GGACCATATC GTCAATCTGA ACGTCAACAT ATCTACCAAC CATTAATAGA TCAGTTACTA 300 GCAGAAGATA AAGCATATAA ATGCTATATG ACAGAAGAAG AATTAGAAGC TGAACGTGAA 360 GCGCAAATCG CTCGTGGTGA AATGCCTCGC TATGGTGGTC AACATGCGCA TTTGACTGAA 420 GAACAACGTC AACAATTTGA AGCAGAAGGA CGCCAACCAT CAATTCGTTT CCGAGTACCT 480 CAAAACCAAA CGTATTCATT TGATGATATG GTAAAAGGAA ATATTTCATT TGATTCAAAT 540 GGTATTGGTG ACTGGGTTAT CGTAAAAAAA GATGGCATTC CAACGTACAA TTTTGCAGTA 600 GCTATAGATG ATCATTACAT GCAAATTTCA GATGTAATTC GTGGTGATGA TCATATTTCA 660 AACACGCCTA AACAAATTAT GATTTATGAA GCATTTGGCT GGGAGCCACC TCGTTTTGGT 720 CATATGTCAT TAATTGTTAA TGAAGAACGT AAAAAGTTAA GTAAACGTGA TGGGCAAATT 780 TTACAATTTA TTGAGCAATA TCGTGACTTA GGTTATTTAC CTGAAGCGTT ATTTAATTTT 840 ATTGCGTTAT TAGGTTGGTC TCCTGAAGGT GAAGAAGAAA TCTTTTCTAA AGAAGAATTT 900 ATCAAAATCT TTGATGAAAA GCGTTTGTCA AAATCACCAG CATTTTTCGA TAAGCAAAAA 960 TTAGCATGGG TTAATAACCA ATATATGAAA CAAAAAGATA CTGAAACAGT ATTCCAATTA 1020 GCATTACCTC ATTTAATTAA AGCAAATTTG ATTCCTGAGG TGCCGTCAGA AGAGGATTTA 1080 TCTTGGGGAC GCAAATTAAT TGCGCTTTAT CAAAAAGAAA TGAGTTATGC CGGTGAAATT 1140 GTACCTTTAT CAGAAATGTT CTTTAAAGAA ATGCCAGCTC TTGGTGAAGA AGAACAACAA 1200 GTGATTAATG GAGAGCAAGT ACCAGAGTTA ATGACGCACT TATTCAGTAA ATTAGAAGCA 1260 CTTGAACCAT TTGAAGCGGC TGAAATTAAA AAGACAATTA AAGAAGTTCA AAAAGAAACA 1320 GGAATAAAAG GCAAGCAATT ATTTATGCCT ATTCGTGTTG CTGTAACAGG CCAAATGCAT 1380 GGTCCTGAAT TACCAAATAC AATTGAAGTA CTTGGTAAAG AAAAAGTGCT AAACCGTTTA 1440 AAACAATATA AGTAATGA 1458
【００８１】（２）配列番号：２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４８４アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Met Ser Asp Arg Ile Arg Val Arg Tyr Ala Pro Ser Pro Thr Gly Tyr 1 5 10 15 Leu His Ile Gly Asn Ala Arg Thr Ala Leu Phe Asn Tyr Leu Tyr Ala 20 25 30 Lys His Tyr Asn Gly Asp Phe Val Ile Arg Ile Glu Asp Thr Asp Lys 35 40 45 Lys Arg Asn Leu Glu Asp Gly Glu Thr Ser Gln Phe Asp Asn Leu Lys 50 55 60 Trp Leu Gly Leu Asp Trp Asp Glu Ser Val Asp Lys Asp Asn Gly Tyr 65 70 75 80 Gly Pro Tyr Arg Gln Ser Glu Arg Gln His Ile Tyr Gln Pro Leu Ile 85 90 95 Asp Gln Leu Leu Ala Glu Asp Lys Ala Tyr Lys Cys Tyr Met Thr Glu 100 105 110 Glu Glu Leu Glu Ala Glu Arg Glu Ala Gln Ile Ala Arg Gly Glu Met 115 120 125 Pro Arg Tyr Gly Gly Gln His Ala His Leu Thr Glu Glu Gln Arg Gln 130 135 140 Gln Phe Glu Ala Glu Gly Arg Gln Pro Ser Ile Arg Phe Arg Val Pro 145 150 155 160 Gln Asn Gln Thr Tyr Ser Phe Asp Asp Met Val Lys Gly Asn Ile Ser 165 170 175 Phe Asp Ser Asn Gly Ile Gly Asp Trp Val Ile Val Lys Lys Asp Gly 180 185 190 Ile Pro Thr Tyr Asn Phe Ala Val Ala Ile Asp Asp His Tyr Met Gln 195 200 205 Ile Ser Asp Val Ile Arg Gly Asp Asp His Ile Ser Asn Thr Pro Lys 210 215 220 Gln Ile Met Ile Tyr Glu Ala Phe Gly Trp Glu Pro Pro Arg Phe Gly 225 230 235 240 His Met Ser Leu Ile Val Asn Glu Glu Arg Lys Lys Leu Ser Lys Arg 245 250 255 Asp Gly Gln Ile Leu Gln Phe Ile Glu Gln Tyr Arg Asp Leu Gly Tyr 260 265 270 Leu Pro Glu Ala Leu Phe Asn Phe Ile Ala Leu Leu Gly Trp Ser Pro 275 280 285 Glu Gly Glu Glu Glu Ile Phe Ser Lys Glu Glu Phe Ile Lys Ile Phe 290 295 300 Asp Glu Lys Arg Leu Ser Lys Ser Pro Ala Phe Phe Asp Lys Gln Lys 305 310 315 320 Leu Ala Trp Val Asn Asn Gln Tyr Met Lys Gln Lys Asp Thr Glu Thr 325 330 335 Val Phe Gln Leu Ala Leu Pro His Leu Ile Lys Ala Asn Leu Ile Pro 340 345 350 Glu Val Pro Ser Glu Glu Asp Leu Ser Trp Gly Arg Lys Leu Ile Ala 355 360 365 Leu Tyr Gln Lys Glu Met Ser Tyr Ala Gly Glu Ile Val Pro Leu Ser 370 375 380 Glu Met Phe Phe Lys Glu Met Pro Ala Leu Gly Glu Glu Glu Gln Gln 385 390 395 400 Val Ile Asn Gly Glu Gln Val Pro Glu Leu Met Thr His Leu Phe Ser 405 410 415 Lys Leu Glu Ala Leu Glu Pro Phe Glu Ala Ala Glu Ile Lys Lys Thr 420 425 430 Ile Lys Glu Val Gln Lys Glu Thr Gly Ile Lys Gly Lys Gln Leu Phe 435 440 445 Met Pro Ile Arg Val Ala Val Thr Gly Gln Met His Gly Pro Glu Leu 450 455 460 Pro Asn Thr Ile Glu Val Leu Gly Lys Glu Lys Val Leu Asn Arg Leu 465 470 475 480 Lys Gln Tyr Lys
【図１】 スタフィロコッカス・アウレウスのＥＲＳ遺
伝子配列を示す図である。
伝子配列を示す図である。
【図２】 スタフィロコッカス・アウレウスのＥＲＳ遺
伝子配列を示す図である。
伝子配列を示す図である。
【図３】 スタフィロコッカス・アウレウスのＥＲＳ蛋
白配列を示す図である。
白配列を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＤＺ 48/00 ＡＤＺ Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｃ０７Ｋ 14/31 16/12 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/10 9/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｑ 1/48 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/52 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:445） (71)出願人 595047190 スミスクライン・ビーチャム・パブリッ ク・リミテッド・カンパニー ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ｐ．ｌ．ｃ. イギリス国ミドルセックス・ティーダブリ ュ８・９イーピー、ブレンフォード、ニュ ー・ホライズンズ・コート（番地の表示な し) (72)発明者 マイケル・ティ・ブラック アメリカ合衆国19425ペンシルベニア州チ ェスター・スプリングス、ミルハウス・ウ ェイ502番 (72)発明者 セリ・ジェイ・ルイス イギリス、ケンブリッジシャー、リント ン、シェパーズ・ホール４番
Claims (26)
- 【請求項１】 （ａ） ＲＡＴ蛋白を配列決定すること
により決定されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
ードしているポリヌクレオチドにに対して少なくとも７
０％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ） （ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的であ
るポリヌクレオチド；および （ｃ） （ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少な
くとも１５個の連続した塩基を含むポリヌクレオチド；
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む
単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチ
ド。 - 【請求項３】 ＲＮＡである請求項１のポリヌクレオチ
ド。 - 【請求項４】 ＲＡＴ蛋白の配列決定により決定される
アミノ酸配列を有するＲＡＴポリペプチドをコードして
いるＲＡＴ遺伝子を含む請求項２のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 ＲＡＴポリヌクレオチドを含む請求項２
のポリヌクレオチド。 - 【請求項６】 ＲＡＴ蛋白の配列決定により決定される
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている請求
項２のポリヌクレオチド。 - 【請求項７】 （ａ）ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１中
に含まれるＲＡＴ遺伝子により発現されるのと同じ成熟
ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対し
て少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチ
ド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的である
ポリヌクレオチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
とも１５個の塩基を含むポリヌクレオチドからなる群よ
り選択されるメンバーを含む単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項８】 請求項２のＤＮＡを含むベクター。
- 【請求項９】 請求項８のベクターを含む宿主細胞。
- 【請求項１０】 上記ＤＮＡによりコードされるポリペ
プチドを請求項９記載の宿主細胞から発現させることを
特徴とする、ポリペプチドの製造方法。 - 【請求項１１】 ベクター中に含まれるｃＤＮＡにより
コードされるポリペプチドを細胞が発現するように請求
項８のベクターで細胞を形質転換またはトランスフェク
ションすることを特徴とする、ポリペプチドを発現する
細胞の製造方法。 - 【請求項１２】 ＲＡＴポリペプチドまたはフラグメン
トの生成に十分な条件下で請求項９記載の宿主を培養す
ることを特徴とする、ＲＡＴポリペプチドまたはフラグ
メントの製造方法。 - 【請求項１３】 ＲＡＴ蛋白の配列決定により決定され
るアミノ酸配列を有するＲＡＴポリペプチドに対して少
なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプ
チド； - 【請求項１４】 ＲＡＴ蛋白の配列決定により決定され
るアミノ酸配列を有するＲＡＴポリペプチドをコードし
ているアミノ酸配列を含むポリペプチド。 - 【請求項１５】 請求項１３のポリペプチドに対する抗
体。 - 【請求項１６】 請求項１３のポリペプチドの活性を阻
害するアンタゴニスト。 - 【請求項１７】 治療上有効量の請求項１３のポリペプ
チドを個体に投与することを特徴とする、ＲＡＴを必要
とする個体の治療方法。 - 【請求項１８】 ポリペプチドをコードしているＤＮＡ
を個体に提供し、次いで、該ポリペプチドをインビボで
発現させることにより、治療上有効量のポリペプチドが
投与されるものである請求項１６の方法。 - 【請求項１９】 治療上有効量の請求項１６のアンタゴ
ニストを個体に投与することを特徴とする、ＲＡＴポリ
ペプチドを阻害する必要のある個体の治療方法。 - 【請求項２０】 請求項１３のポリペプチドをコードし
ている核酸配列を決定することを特徴とする、請求項１
３のポリペプチドの発現に関連した疾病の診断方法。 - 【請求項２１】 宿主由来の試料中の請求項１３のポリ
ペプチドの存在を分析することを特徴とする診断方法。 - 【請求項２２】 請求項１３のポリペプチドに結合し、
その活性を阻害する化合物の同定方法であって、 該ポリペプチドに対する結合物質を表面に発現する細胞
を、結合物質への結合を可能にする条件下にてスクリー
ニングすべき化合物と接触させること（ここに該結合物
質は、化合物の結合に応答して検出可能なシグナルを発
生しうる第２の成分に関連している）、 次いで、化合物と結合物質との相互作用により生じるシ
グナルの存在または不存在を検出することにより、化合
物が結合物質に結合し、結合物質を活性化または阻害す
るかどうかを決定することを特徴とする方法。 - 【請求項２３】 哺乳動物を疾病から防御する抗体を生
成させるに十分なＲＡＴ、またはそのフラグメントもし
くは変種を哺乳動物に接種することを特徴とする、哺乳
動物における免疫学的応答の誘導方法。 - 【請求項２４】 遺伝子治療によってインビボにおいて
ＲＡＴまたはそのフラグメントもしくは変種を発現させ
るためにＲＡＴフラグメントもしくはその変種をコード
している遺伝子を送達して、哺乳動物を疾病から防御す
る抗体を産生する免疫学的応答を誘導することを特徴と
する、哺乳動物における免疫学的応答の誘導方法。 - 【請求項２５】 ＲＡＴポリヌクレオチドまたはそれに
よりコードされる蛋白をコードし発現するＤＮＡを含む
免疫学的組成物であって、該ＤＮＡが哺乳動物中に導入
された場合にＲＡＴポリヌクレオチドまたはそれにより
コードされる蛋白に対する免疫学的応答が哺乳動物にお
いて誘導されるものである組成物。 - 【請求項２６】 厳密なハイブリダイゼーション条件下
で、ＲＡＴポリヌクレオチド配列またはそのフラグメン
トの配列を有するプローブを用いてＲＡＴポリヌクレオ
チド配列に関する完全な遺伝子を含む適当なライブラリ
ーをスクリーニングすることにより得ることのできるＤ
ＮＡ配列を必須として含むポリヌクレオチド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3785797P | 1997-02-07 | 1997-02-07 | |
| US60/037857 | 1997-04-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10304884A true JPH10304884A (ja) | 1998-11-17 |
Family
ID=21896746
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10025773A Withdrawn JPH10304884A (ja) | 1997-02-07 | 1998-02-06 | 新規ｒａｔ |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10304884A (ja) |
| CA (1) | CA2222984A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112773325B (zh) * | 2020-12-31 | 2023-08-01 | 北京市环境保护科学研究院 | 一种巴西龟眼炎的早期预警方法及系统 |
-
1998
- 1998-02-06 JP JP10025773A patent/JPH10304884A/ja not_active Withdrawn
- 1998-02-06 CA CA002222984A patent/CA2222984A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2222984A1 (en) | 1998-08-07 |
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