JP2002142786A - スタフィロコッカス・アウレウスのスレオニル−tRNAシンセターゼ - Google Patents
スタフィロコッカス・アウレウスのスレオニル−tRNAシンセターゼInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 感染、とりわけ細菌感染に対する防御のため
の方法が望まれていた。 【解決手段】 本発明によれば、tRNAシンセターゼ
ポリペプチドが感染の予防に有用であることが見出され
た。さらに該tRNAシンセターゼポリペプチドをコー
ドするDNA(RNA)、ならびに組換え法による該ポ
リペプチドの製造方法も見出された。
の方法が望まれていた。 【解決手段】 本発明によれば、tRNAシンセターゼ
ポリペプチドが感染の予防に有用であることが見出され
た。さらに該tRNAシンセターゼポリペプチドをコー
ドするDNA(RNA)、ならびに組換え法による該ポ
リペプチドの製造方法も見出された。
Description
【0001】(技術分野)本発明は、新規に同定された
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびその製造
および使用、ならびにそれらの変種、アゴニストおよび
アンタゴニストおよびそれらの使用に関する。詳細に
は、これらのおよびその他の点に関して、本発明は、本
明細書で「tRNAシンセターゼ」と称するtRNAシ
ンセターゼファミリーの新規ポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドに関する。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびその製造
および使用、ならびにそれらの変種、アゴニストおよび
アンタゴニストおよびそれらの使用に関する。詳細に
は、これらのおよびその他の点に関して、本発明は、本
明細書で「tRNAシンセターゼ」と称するtRNAシ
ンセターゼファミリーの新規ポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドに関する。
【0002】(背景技術)抗生物質の開発を目的とし
て、スタフィロコッカス(Staphylococcus)の遺伝子お
よび遺伝子産物を用いることがとりわけ好ましい。スタ
フィロコッカス属は医学的に重要な微生物の属である。
これらは浸潤性および毒素原性の2つの型の疾患を生み
出すことが知られている。浸潤性感染は一般的に、皮膚
表面および深部の組織の両方に影響を及ぼす膿瘍を形成
する特徴がある。エス・アウレウス(S.aureus)は癌患
者の菌血症を二次的に引き起こす原因となる。骨髄炎、
敗血症性関節炎、敗血症性血栓静脈炎および急性細菌性
心内膜炎もまた比較的一般的である。スタフィロコッカ
ス属の毒素原特性から少なくとも3つの臨床病態が引き
起こされる。これらの疾患の発現は、組織浸潤および菌
血症に対するものとしての外毒素の作用の結果である。
これらの病態には:スタフィロコッカスの食物汚染、熱
傷様皮膚症候群およびトキシックショック症候群等があ
る。
て、スタフィロコッカス(Staphylococcus)の遺伝子お
よび遺伝子産物を用いることがとりわけ好ましい。スタ
フィロコッカス属は医学的に重要な微生物の属である。
これらは浸潤性および毒素原性の2つの型の疾患を生み
出すことが知られている。浸潤性感染は一般的に、皮膚
表面および深部の組織の両方に影響を及ぼす膿瘍を形成
する特徴がある。エス・アウレウス(S.aureus)は癌患
者の菌血症を二次的に引き起こす原因となる。骨髄炎、
敗血症性関節炎、敗血症性血栓静脈炎および急性細菌性
心内膜炎もまた比較的一般的である。スタフィロコッカ
ス属の毒素原特性から少なくとも3つの臨床病態が引き
起こされる。これらの疾患の発現は、組織浸潤および菌
血症に対するものとしての外毒素の作用の結果である。
これらの病態には:スタフィロコッカスの食物汚染、熱
傷様皮膚症候群およびトキシックショック症候群等があ
る。
【0003】tRNAシンセターゼは以下のスキームに
従って、タンパク質合成に主要な役割を果たす: 酵素+ATP+AA⇔酵素.AA-AMP+PPi 酵素.AA-AMP+tRNA⇔酵素+AMP+AA-t
RNA (AAはアミノ酸である)この過程を阻害すると、荷電
tRNAのレベル低下を導き、緊縮応答として知られて
いる応答のカスケードの引き金となり、結果的に生体の
休眠状態を誘導する。そのようなものとして、細菌性t
RNAシンセターゼの選択的阻害剤は、抗細菌剤として
の可能性を有する。これに関する一つの例として、イソ
ロイシルtRNAシンセターゼを選択的に阻害するムピ
ロシンがある。tRNAシンセターゼの単離により、潜
在的抗菌性の目的物質の同定および分析のための、抗菌
性化合物のスクリーニングが容易になる。
従って、タンパク質合成に主要な役割を果たす: 酵素+ATP+AA⇔酵素.AA-AMP+PPi 酵素.AA-AMP+tRNA⇔酵素+AMP+AA-t
RNA (AAはアミノ酸である)この過程を阻害すると、荷電
tRNAのレベル低下を導き、緊縮応答として知られて
いる応答のカスケードの引き金となり、結果的に生体の
休眠状態を誘導する。そのようなものとして、細菌性t
RNAシンセターゼの選択的阻害剤は、抗細菌剤として
の可能性を有する。これに関する一つの例として、イソ
ロイシルtRNAシンセターゼを選択的に阻害するムピ
ロシンがある。tRNAシンセターゼの単離により、潜
在的抗菌性の目的物質の同定および分析のための、抗菌
性化合物のスクリーニングが容易になる。
【0004】イソロイシルtRNAシンセターゼはスタ
フィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureu
s)から単離され、すでに報告されている(Chalker,A.
F.、Ward,J.M.、Fosberry,A.P.およびHodgson,J.E.,Ge
ne 141:103-108(1994))。明らかに、化合物の抗生物
質活性をスクリーニングするために用いることができる
因子、ならびに感染、機能障害および疾患の発病におけ
る役割を決定するためにも用いることができる因子が必
要とされている。また、感染、機能障害または疾患の予
防、改善または抑制に役割を果たすことができるかかる
因子ならびにアンタゴニストおよびアゴニストの同定お
よび特徴づけも必要とされている。本発明のポリペプチ
ドは、既知のバチルス・ズブチリス(Bacillus subtili
s)trsSVtRNAシンセターゼタンパク質に相同
的なアミノ酸配列を有する。
フィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureu
s)から単離され、すでに報告されている(Chalker,A.
F.、Ward,J.M.、Fosberry,A.P.およびHodgson,J.E.,Ge
ne 141:103-108(1994))。明らかに、化合物の抗生物
質活性をスクリーニングするために用いることができる
因子、ならびに感染、機能障害および疾患の発病におけ
る役割を決定するためにも用いることができる因子が必
要とされている。また、感染、機能障害または疾患の予
防、改善または抑制に役割を果たすことができるかかる
因子ならびにアンタゴニストおよびアゴニストの同定お
よび特徴づけも必要とされている。本発明のポリペプチ
ドは、既知のバチルス・ズブチリス(Bacillus subtili
s)trsSVtRNAシンセターゼタンパク質に相同
的なアミノ酸配列を有する。
【0005】(発明の開示)本発明の目的は、図4に示
すアミノ酸配列とバチルス・ズブチリスtrsSVtR
NAシンセターゼタンパク質のごとき他のタンパク質の
既知の一つのもしくは複数のアミノ酸配列との相同性に
より、新規tRNAシンセターゼポリペプチドとして同
定されたポリペプチドを提供することである。本発明の
さらなる目的は、tRNAシンセターゼポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド、特に本明細書においてt
RNAシンセターゼと称するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを提供することである。本発明のとり
わけ好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、図1
ないし3[配列番号:1]に示す配列を含むスレオニルt
RNAシンセターゼポリペプチド、またはそれらの変種
をコードする領域を含む。
すアミノ酸配列とバチルス・ズブチリスtrsSVtR
NAシンセターゼタンパク質のごとき他のタンパク質の
既知の一つのもしくは複数のアミノ酸配列との相同性に
より、新規tRNAシンセターゼポリペプチドとして同
定されたポリペプチドを提供することである。本発明の
さらなる目的は、tRNAシンセターゼポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド、特に本明細書においてt
RNAシンセターゼと称するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを提供することである。本発明のとり
わけ好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、図1
ないし3[配列番号:1]に示す配列を含むスレオニルt
RNAシンセターゼポリペプチド、またはそれらの変種
をコードする領域を含む。
【0006】本発明の別のとりわけ好ましい態様におい
て、図4[配列番号:2]に示すアミノ酸配列を含む、ス
タフィロコッカス・アウレウス由来の新規スレオニルt
RNAシンセターゼタンパク質、またはそれらの変種が
ある。本発明のこの態様によれば、NCIMB受託番号
40771に含まれるスタフィロコッカス・アウレウス
WCUH29株により発現されうる成熟ポリペプチドを
コードする単離核酸分子が提供される。本発明のこの態
様によれば、tRNAシンセターゼ、とりわけスタフィ
ロコッカス・アウレウスtRNAシンセターゼをコード
する、mRNA、cDNA、ゲノムDNA等の単離核酸
分子が提供される。本発明のさらなる態様は、生物学
的、診断学的、予防的、臨床的または治療的に有用なそ
れらの変種、およびこれらを含んでなる組成物を包含す
る。本発明の別の態様によれば、治療的、予防的目的
で、とりわけ遺伝学的免疫における本発明のポリヌクレ
オチドの使用が提供される。本発明のこの態様における
とりわけ好ましい具体例は、tRNAシンセターゼの自
然発生対立遺伝子変種およびそれによりコードされるポ
リペプチドである。
て、図4[配列番号:2]に示すアミノ酸配列を含む、ス
タフィロコッカス・アウレウス由来の新規スレオニルt
RNAシンセターゼタンパク質、またはそれらの変種が
ある。本発明のこの態様によれば、NCIMB受託番号
40771に含まれるスタフィロコッカス・アウレウス
WCUH29株により発現されうる成熟ポリペプチドを
コードする単離核酸分子が提供される。本発明のこの態
様によれば、tRNAシンセターゼ、とりわけスタフィ
ロコッカス・アウレウスtRNAシンセターゼをコード
する、mRNA、cDNA、ゲノムDNA等の単離核酸
分子が提供される。本発明のさらなる態様は、生物学
的、診断学的、予防的、臨床的または治療的に有用なそ
れらの変種、およびこれらを含んでなる組成物を包含す
る。本発明の別の態様によれば、治療的、予防的目的
で、とりわけ遺伝学的免疫における本発明のポリヌクレ
オチドの使用が提供される。本発明のこの態様における
とりわけ好ましい具体例は、tRNAシンセターゼの自
然発生対立遺伝子変種およびそれによりコードされるポ
リペプチドである。
【0007】本発明のこの態様によれば、本明細書でt
RNAシンセターゼと称するスタフィロコッカス・アウ
レウスの新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診断学
的、予防的、臨床的または治療的に有用なそれらの変
種、およびこれらを含んでなる組成物が提供される。本
発明のとりわけ好ましい具体例は、tRNAシンセター
ゼ遺伝子の自然発生対立遺伝子によりコードされるtR
NAシンセターゼポリペプチドの変種である。本発明の
この態様における好ましい具体例において、前述のtR
NAシンセターゼポリペプチドの製造方法が提供され
る。本発明の別の態様によれば、例えば抗体等の抗細菌
物質として有用な、このようなポリペプチドの阻害物質
が提供される。
RNAシンセターゼと称するスタフィロコッカス・アウ
レウスの新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診断学
的、予防的、臨床的または治療的に有用なそれらの変
種、およびこれらを含んでなる組成物が提供される。本
発明のとりわけ好ましい具体例は、tRNAシンセター
ゼ遺伝子の自然発生対立遺伝子によりコードされるtR
NAシンセターゼポリペプチドの変種である。本発明の
この態様における好ましい具体例において、前述のtR
NAシンセターゼポリペプチドの製造方法が提供され
る。本発明の別の態様によれば、例えば抗体等の抗細菌
物質として有用な、このようなポリペプチドの阻害物質
が提供される。
【0008】本発明のこの態様における1の好ましい態
様によれば、(i)tRNAシンセターゼ発現の評価、
(ii)疾患、例えば上気道感染(例えば中耳炎、細菌性
気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下気道感染(例え
ば蓄膿症、肺膿瘍)、心臓感染(例えば感染性心内膜
炎)消化器感染(例えば分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後
膿瘍)、CNS感染(例えば大脳膿瘍)、眼感染(例え
ば眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔(presepta
l)および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管感染
(例えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシック
ショック症候群)、皮膚感染(例えば膿痂疹、毛嚢炎、
皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎)、骨および
関節感染(例えば敗血症性関節炎、骨髄炎)の処置、
(iii)遺伝学的変種のアッセイ、(iv)ならびに細菌
とりわけスタフィロコッカス・アウレウス菌に対する免
疫学的応答を上昇させるための、tRNAシンセターゼ
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの生体への投与の
ための製品、組成物および方法が提供される。
様によれば、(i)tRNAシンセターゼ発現の評価、
(ii)疾患、例えば上気道感染(例えば中耳炎、細菌性
気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下気道感染(例え
ば蓄膿症、肺膿瘍)、心臓感染(例えば感染性心内膜
炎)消化器感染(例えば分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後
膿瘍)、CNS感染(例えば大脳膿瘍)、眼感染(例え
ば眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔(presepta
l)および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管感染
(例えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシック
ショック症候群)、皮膚感染(例えば膿痂疹、毛嚢炎、
皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎)、骨および
関節感染(例えば敗血症性関節炎、骨髄炎)の処置、
(iii)遺伝学的変種のアッセイ、(iv)ならびに細菌
とりわけスタフィロコッカス・アウレウス菌に対する免
疫学的応答を上昇させるための、tRNAシンセターゼ
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの生体への投与の
ための製品、組成物および方法が提供される。
【0009】本発明のこのおよび他の態様における1の
好ましい具体例によれば、tRNAシンセターゼポリヌ
クレオチド配列に、とりわけ厳密な条件でハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチドが提供される本発明の
この態様における1の好ましい具体例において、tRN
Aシンセターゼポリペプチドに対する抗体が提供され
る。本発明の別の態様によれば、各々好ましい静細菌性
または殺細菌性をも有するtRNAシンセターゼアゴニ
ストおよびアンタゴニストを提供する。本発明のさらな
る態様において、tRNAシンセターゼポリヌクレオチ
ドまたはtRNAシンセターゼポリペプチドを含有す
る、細胞または多細胞生物への投与用の組成物が提供さ
れる。開示した本発明の精神および範囲内での種々の変
更および修飾は、以下の記載および本明細書のその他の
部分を読むことにより、当業者に容易に明らかとなろ
う。
好ましい具体例によれば、tRNAシンセターゼポリヌ
クレオチド配列に、とりわけ厳密な条件でハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチドが提供される本発明の
この態様における1の好ましい具体例において、tRN
Aシンセターゼポリペプチドに対する抗体が提供され
る。本発明の別の態様によれば、各々好ましい静細菌性
または殺細菌性をも有するtRNAシンセターゼアゴニ
ストおよびアンタゴニストを提供する。本発明のさらな
る態様において、tRNAシンセターゼポリヌクレオチ
ドまたはtRNAシンセターゼポリペプチドを含有す
る、細胞または多細胞生物への投与用の組成物が提供さ
れる。開示した本発明の精神および範囲内での種々の変
更および修飾は、以下の記載および本明細書のその他の
部分を読むことにより、当業者に容易に明らかとなろ
う。
【0010】用語集 以下の定義は、本明細書において汎用される特定の用語
の理解を容易にするために示すものである。「宿主細
胞」は外来性ポリヌクレオチド配列により形質転換もし
くはトランスフェクションされた、または形質転換もし
くはトランスフェクションされ得る細胞である。「同一
性」とは、当該分野に周知であるように、二つもしくは
それ以上のポリペプチド配列また二つもしくはそれ以上
のポリヌクレオチド配列間の関係であり、配列を比較し
て決定する。当該分野において、「同一性」とは、場合
によってはかかる配列の鎖の合致により決定できる、ポ
リペプチドまたはポリヌクレオチド配列の配列関連性の
程度をも意味する。「同一性」および「類似性」は共に
既知の方法により容易に算出できる(Computational Mo
lecular Biology,Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユ
ニバーシティー・プレス、ニューヨーク、1988年;Bioc
omputing:Informatics and Genome Projects,Smith,
D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、1993
年;Computer Analysis of Sequence Data,パートI,
Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒューマン・プレ
ス、ニュージャージー、1994年;Sequence Analysis in
Molecular Biology,von Heinje,G.、アカデミック・
プレス、1987年;およびSequence Analysis Primer,Gr
ibskov,M.およびDevereux,J.編、Mストックトン・プレ
ス、ニューヨーク、1991年)。二つの配列の同一性およ
び類似性を測定する方法は多くあるが、両用語共当業者
に周知である(Sequence Analysis in Molecular Biolo
gy,von Heinje,G.、アカデミック・プレス、1987年;S
equence Analysis Primer,Gribskov,M.およびDevereu
x,J.編、Mストックトン・プレス、ニューヨーク、1991
年;ならびにCarillo,H.およびLipman,D.,SIAM J.Appl
ied Math.,48:1073(1988))。配列間の同一性または
類似性を測定するために通常用いられる方法はCarillo,
H.およびLipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073
(1988)等に開示されているが、これらに限定するもの
ではない。同一性を決定するための好ましい方法は、試
験する配列間で最も良く合致するように設計される。同
一性および類似性を決定する方法は、公に入手できるコ
ンピュータープログラムに集成されている。二つの配列
間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュー
タープログラム法は、GCGプログラムパッケージ(De
vereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387(198
4)、BLASTP、BLASTN、およびFASTA(Atschul,S.F.ら、
J.Molec.Biol.215:403-410(1990)))を包含するが、
これらに限定するものではない。BLAST XプログラムはN
CBIおよびその他の供給源より公に入手可能である(BLA
ST Manual、Altschul,S.ら、NCBI NLMNIHベゼスダ、メ
リーランド州20894;Altschul,S.ら、J.Molec.Bio
l.215:403-410(1990))。
の理解を容易にするために示すものである。「宿主細
胞」は外来性ポリヌクレオチド配列により形質転換もし
くはトランスフェクションされた、または形質転換もし
くはトランスフェクションされ得る細胞である。「同一
性」とは、当該分野に周知であるように、二つもしくは
それ以上のポリペプチド配列また二つもしくはそれ以上
のポリヌクレオチド配列間の関係であり、配列を比較し
て決定する。当該分野において、「同一性」とは、場合
によってはかかる配列の鎖の合致により決定できる、ポ
リペプチドまたはポリヌクレオチド配列の配列関連性の
程度をも意味する。「同一性」および「類似性」は共に
既知の方法により容易に算出できる(Computational Mo
lecular Biology,Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユ
ニバーシティー・プレス、ニューヨーク、1988年;Bioc
omputing:Informatics and Genome Projects,Smith,
D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、1993
年;Computer Analysis of Sequence Data,パートI,
Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒューマン・プレ
ス、ニュージャージー、1994年;Sequence Analysis in
Molecular Biology,von Heinje,G.、アカデミック・
プレス、1987年;およびSequence Analysis Primer,Gr
ibskov,M.およびDevereux,J.編、Mストックトン・プレ
ス、ニューヨーク、1991年)。二つの配列の同一性およ
び類似性を測定する方法は多くあるが、両用語共当業者
に周知である(Sequence Analysis in Molecular Biolo
gy,von Heinje,G.、アカデミック・プレス、1987年;S
equence Analysis Primer,Gribskov,M.およびDevereu
x,J.編、Mストックトン・プレス、ニューヨーク、1991
年;ならびにCarillo,H.およびLipman,D.,SIAM J.Appl
ied Math.,48:1073(1988))。配列間の同一性または
類似性を測定するために通常用いられる方法はCarillo,
H.およびLipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073
(1988)等に開示されているが、これらに限定するもの
ではない。同一性を決定するための好ましい方法は、試
験する配列間で最も良く合致するように設計される。同
一性および類似性を決定する方法は、公に入手できるコ
ンピュータープログラムに集成されている。二つの配列
間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュー
タープログラム法は、GCGプログラムパッケージ(De
vereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387(198
4)、BLASTP、BLASTN、およびFASTA(Atschul,S.F.ら、
J.Molec.Biol.215:403-410(1990)))を包含するが、
これらに限定するものではない。BLAST XプログラムはN
CBIおよびその他の供給源より公に入手可能である(BLA
ST Manual、Altschul,S.ら、NCBI NLMNIHベゼスダ、メ
リーランド州20894;Altschul,S.ら、J.Molec.Bio
l.215:403-410(1990))。
【0011】「単離」とは、「人間の手により」天然の
状態から変化させられた、すなわち、それが天然に存在
する場合、元来の環境から変化または除去されたこと、
あるいはその両方が行われたことを意味する。例えばポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然の状態で生
存動物に存在する場合は、「単離」されていないが、同
一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然に共
存する物質から分離されている場合は、本明細書に用い
る用語「単離」がなされている。
状態から変化させられた、すなわち、それが天然に存在
する場合、元来の環境から変化または除去されたこと、
あるいはその両方が行われたことを意味する。例えばポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然の状態で生
存動物に存在する場合は、「単離」されていないが、同
一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然に共
存する物質から分離されている場合は、本明細書に用い
る用語「単離」がなされている。
【0012】「ポリヌクレオチド」とは、修飾されてい
ないRNAもしくはDNA、または修飾されたRNAも
しくはDNAであってよい、任意のポリリボヌクレオチ
ドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。
「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖DNA、
一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖
および三本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および
二本鎖RNA、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合
物であるRNA、一本鎖もしくはより普通には二本鎖も
しくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物
でよいDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子を意
味するが、これに限定するものではない。さらに、本明
細書で用いるポリヌクレオチドは、RNAもしくはDN
AまたはRNAとDNAの両方を含む三本鎖領域を意味
する。そのような領域における鎖は同一の分子または異
なる分子由来のものでよい。この領域は一つまたはそれ
以上の分子の全体を含み得るが、より典型的には幾つか
の分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一
つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書で
用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、一つまたはそ
れ以上の修飾した塩基を含有する、上述のDNAまたは
RNA等を含む。このように、安定性またはその他の理
由で修飾した骨格を有するDNAまたはRNAは、本明
細書の用語である「ポリヌクレオチド」である。さら
に、イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩
基等の修飾塩基を含むDNAまたはRNAは(二つの例
だけをを示す)、本明細書で用いる用語ポリヌクレオチ
ドである。当業者に既知の多くの有用な目的を提供する
DNAおよびRNAに非常に多くの修飾がなされている
ことは、明らかであろう。本明細書で用いる「ポリヌク
レオチド」なる用語は、ポリヌクレオチドのこのような
化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならび
にウイルスおよび、例えば単純型細胞および複雑型細胞
等の細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を
包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌ
クレオチドと称する短いポリヌクレオチドを包含する。
ないRNAもしくはDNA、または修飾されたRNAも
しくはDNAであってよい、任意のポリリボヌクレオチ
ドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。
「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖DNA、
一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖
および三本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および
二本鎖RNA、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合
物であるRNA、一本鎖もしくはより普通には二本鎖も
しくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物
でよいDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子を意
味するが、これに限定するものではない。さらに、本明
細書で用いるポリヌクレオチドは、RNAもしくはDN
AまたはRNAとDNAの両方を含む三本鎖領域を意味
する。そのような領域における鎖は同一の分子または異
なる分子由来のものでよい。この領域は一つまたはそれ
以上の分子の全体を含み得るが、より典型的には幾つか
の分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一
つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書で
用いる「ポリヌクレオチド」なる用語は、一つまたはそ
れ以上の修飾した塩基を含有する、上述のDNAまたは
RNA等を含む。このように、安定性またはその他の理
由で修飾した骨格を有するDNAまたはRNAは、本明
細書の用語である「ポリヌクレオチド」である。さら
に、イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩
基等の修飾塩基を含むDNAまたはRNAは(二つの例
だけをを示す)、本明細書で用いる用語ポリヌクレオチ
ドである。当業者に既知の多くの有用な目的を提供する
DNAおよびRNAに非常に多くの修飾がなされている
ことは、明らかであろう。本明細書で用いる「ポリヌク
レオチド」なる用語は、ポリヌクレオチドのこのような
化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならび
にウイルスおよび、例えば単純型細胞および複雑型細胞
等の細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を
包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌ
クレオチドと称する短いポリヌクレオチドを包含する。
【0013】「ポリペプチド」は、ペプチド結合または
修飾したペプチド結合により互いに結合している2個ま
たはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタ
ンパク質を意味する。「ポリペプチド」は、通常、ペプ
チド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短
鎖、および一般的にタンパク質と称する長鎖の両方を意
味する。ポリペプチドは20種の遺伝子によりコードさ
れたアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。「ポリ
ペプチド」には、プロセッシングおよびその他の翻訳後
修飾のような天然のプロセスにより修飾されたものが含
まれるが、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾
される。このような修飾は基礎的な参考書およびさらに
詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載され
ており、これらは当業者に周知である。同一の型の修飾
が該ポリペプチドのいくつかの部位で、同一または異な
る程度で存在し得るということが理解されよう。また、
該ポリペプチドは多くの型の修飾をも含み得る。修飾
は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカ
ルボキシル末端等のポリペプチドの任意の部位で起こり
うる。修飾には、アセチル化、アシル化、ADP−リボ
シル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共
有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有
結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジル
イノシトールの共有結合、クロスリンキング、環化、ジ
スルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合クロスリン
キング形成、システイン形成、ピログルタミン酸形成、
ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、
GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミ
リストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシン
グ、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、
脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボ
キシル化、水酸化およびADPリボシル化、セレノイル
化、硫酸化、アルギニル化のようなトランスファーRN
Aにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸の添加、な
らびにユビキチネーションなどがある。例えばProteins
-Structure and Molecular Properties、第2版、T.E.C
reighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク(1
993)およびPosttranslational Covalent Modification
of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレス、
ニューヨーク(1983)のWold,F.,Posttranslational Pr
otein Modifications :Perspective and Prospects、1
〜12頁;Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-646(199
0)およびRattanら、Protein Synthesis:Posttranslat
ional Modifications and Aging,Ann.N.Y.Acad.Sci.66
3:48-62(1992)を参照されたい。ポリペプチドは分岐
または環状でよく、分岐していてもいなくてもよい。環
状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後の
天然のプロセッシングの結果であり、同様に全く合成的
な方法で合成できる。
修飾したペプチド結合により互いに結合している2個ま
たはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタ
ンパク質を意味する。「ポリペプチド」は、通常、ペプ
チド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短
鎖、および一般的にタンパク質と称する長鎖の両方を意
味する。ポリペプチドは20種の遺伝子によりコードさ
れたアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。「ポリ
ペプチド」には、プロセッシングおよびその他の翻訳後
修飾のような天然のプロセスにより修飾されたものが含
まれるが、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾
される。このような修飾は基礎的な参考書およびさらに
詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載され
ており、これらは当業者に周知である。同一の型の修飾
が該ポリペプチドのいくつかの部位で、同一または異な
る程度で存在し得るということが理解されよう。また、
該ポリペプチドは多くの型の修飾をも含み得る。修飾
は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカ
ルボキシル末端等のポリペプチドの任意の部位で起こり
うる。修飾には、アセチル化、アシル化、ADP−リボ
シル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共
有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有
結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジル
イノシトールの共有結合、クロスリンキング、環化、ジ
スルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合クロスリン
キング形成、システイン形成、ピログルタミン酸形成、
ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、
GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミ
リストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシン
グ、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、
脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボ
キシル化、水酸化およびADPリボシル化、セレノイル
化、硫酸化、アルギニル化のようなトランスファーRN
Aにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸の添加、な
らびにユビキチネーションなどがある。例えばProteins
-Structure and Molecular Properties、第2版、T.E.C
reighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク(1
993)およびPosttranslational Covalent Modification
of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレス、
ニューヨーク(1983)のWold,F.,Posttranslational Pr
otein Modifications :Perspective and Prospects、1
〜12頁;Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-646(199
0)およびRattanら、Protein Synthesis:Posttranslat
ional Modifications and Aging,Ann.N.Y.Acad.Sci.66
3:48-62(1992)を参照されたい。ポリペプチドは分岐
または環状でよく、分岐していてもいなくてもよい。環
状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後の
天然のプロセッシングの結果であり、同様に全く合成的
な方法で合成できる。
【0014】本明細書で用いる「変種」なる用語は、対
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、参照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、
以下に論じるように、参照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合およ
び切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別の参
照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に
は、差異は参照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体
的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるよう
なものに限られる。変種および対照ポリペプチドは、1
またはそれ以上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせ
で起こることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換
または挿入したアミノ酸残基は、遺伝的コードによりコ
ードされたものであってもそうでなくてもよい。ポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドの変種は例えば対立遺伝
子変種のような自然発生的なものでもよく、あるいは自
然に発生することが知られていない変種でよい。ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの自然に発生しない変種
は、突然変異技術、直接的合成、および当業者に既知の
その他の組換え技術により製造できる。
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、参照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、
以下に論じるように、参照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合およ
び切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別の参
照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に
は、差異は参照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体
的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるよう
なものに限られる。変種および対照ポリペプチドは、1
またはそれ以上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせ
で起こることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換
または挿入したアミノ酸残基は、遺伝的コードによりコ
ードされたものであってもそうでなくてもよい。ポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドの変種は例えば対立遺伝
子変種のような自然発生的なものでもよく、あるいは自
然に発生することが知られていない変種でよい。ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの自然に発生しない変種
は、突然変異技術、直接的合成、および当業者に既知の
その他の組換え技術により製造できる。
【0015】(発明を実施するための最良の態様)本発
明は以下により詳細に記載する、新規tRNAシンセタ
ーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。特
に、本発明は、アミノ酸配列の相同性という点でバチル
ス・ズブチリスtrsSVtRNAシンセターゼポリペ
プチドに関連している、スタフィロコッカス・アウレウ
スの新規tRNAシンセターゼ遺伝子のポリペプチドお
よびポリヌクレオチドに関する。本発明は特に図1ない
し3および図4に各々示すヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を有するtRNAシンセターゼ、ならびにNCIM
B受託番号40771のDNAのtRNAシンセターゼ
ヌクレオチド配列およびそれらにコードされるアミノ酸
配列に関する。
明は以下により詳細に記載する、新規tRNAシンセタ
ーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。特
に、本発明は、アミノ酸配列の相同性という点でバチル
ス・ズブチリスtrsSVtRNAシンセターゼポリペ
プチドに関連している、スタフィロコッカス・アウレウ
スの新規tRNAシンセターゼ遺伝子のポリペプチドお
よびポリヌクレオチドに関する。本発明は特に図1ない
し3および図4に各々示すヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を有するtRNAシンセターゼ、ならびにNCIM
B受託番号40771のDNAのtRNAシンセターゼ
ヌクレオチド配列およびそれらにコードされるアミノ酸
配列に関する。
【0016】とりわけ研究室的条件および宿主感染条件
下での生存性に適用された場合に、細菌における一時的
な遺伝子発現を評価するのに有用な技法がある。それ自
体生存に必須であるかまたは感染の確立および/もしく
は維持に必須である遺伝子を同定するために、多くの方
法を用いることができる。これらの方法の一つにより配
列の発現を同定することは、その機能についてのさらな
る情報を提供し、スクリーニングの目的物質としてさら
に開発するためのかかる配列の選別を助ける。簡単に説
明すると、これらの研究は例えば:
下での生存性に適用された場合に、細菌における一時的
な遺伝子発現を評価するのに有用な技法がある。それ自
体生存に必須であるかまたは感染の確立および/もしく
は維持に必須である遺伝子を同定するために、多くの方
法を用いることができる。これらの方法の一つにより配
列の発現を同定することは、その機能についてのさらな
る情報を提供し、スクリーニングの目的物質としてさら
に開発するためのかかる配列の選別を助ける。簡単に説
明すると、これらの研究は例えば:
【0017】1)シグニチャータグ化突然変異法(Sign
ature Tagged Mutagenesis:STM) この技法はHenselら、Science269:400-403(1995)に記
載されており、参照により本明細書に記載されているも
のとみなす。シグニチャータグ化突然変異誘発は、該感
染モデルにおける感染の確立/維持に必要な遺伝子を同
定するものである。この技法は、種々の方法(例えばト
ランスポゾン)により、標的生物をランダムに突然変異
を誘発し、ユニークなDNA配列タグを突然変異部位に
非常に近接して挿入することに基づく。細菌性突然変異
体および感染宿主から回収した細菌の混合集団からのタ
グは、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーショ
ン分析により検出される。毒性を減じた突然変異体は、
感染宿主から回収した細菌のプールのタグの欠如により
表される。スタフィロコッカス・アウレウスにおいて
は、トランスポゾンシステムはよく発達していないの
で、タグ化突然変異体を作るためのより有効な方法に
は、Morrisonら、J.Bacteriol.159:870(1984)(参照
によりその内容を本明細書に記載されているものともな
す)に記載される挿入-複製突然変異法を用いる。
ature Tagged Mutagenesis:STM) この技法はHenselら、Science269:400-403(1995)に記
載されており、参照により本明細書に記載されているも
のとみなす。シグニチャータグ化突然変異誘発は、該感
染モデルにおける感染の確立/維持に必要な遺伝子を同
定するものである。この技法は、種々の方法(例えばト
ランスポゾン)により、標的生物をランダムに突然変異
を誘発し、ユニークなDNA配列タグを突然変異部位に
非常に近接して挿入することに基づく。細菌性突然変異
体および感染宿主から回収した細菌の混合集団からのタ
グは、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーショ
ン分析により検出される。毒性を減じた突然変異体は、
感染宿主から回収した細菌のプールのタグの欠如により
表される。スタフィロコッカス・アウレウスにおいて
は、トランスポゾンシステムはよく発達していないの
で、タグ化突然変異体を作るためのより有効な方法に
は、Morrisonら、J.Bacteriol.159:870(1984)(参照
によりその内容を本明細書に記載されているものともな
す)に記載される挿入-複製突然変異法を用いる。
【0018】2)インビボ発現法(In Vivo Expression
Technology:IVET) この技術はCamilliら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA.91:2
634-2638(1994)およびMahanら、Infectious Agents a
nd Diseases 2:263-268(1994)に記載されており、各
々の内容を参照により本明細書に記載されているものと
みなす。IVETは、実験培養と比較した場合、感染中にア
ップレギュレーションする遺伝子を同定し、感染におけ
る重要な役割を有する。この技法により同定される配列
は感染の確立/維持に重要な役割を有する。この技法で
は、標的生物のランダムな染色体フラグメントは、プラ
スミドベクターのプロモーター不含リポーター遺伝子の
上流でクローン化される。プールを宿主に導入し、感染
後の種々の時間に細菌を回収し、リポーター遺伝子発現
の存在を評価する。発現したリポーター遺伝子の上流に
担持された染色体フラグメントは、感染中に正常なアッ
プレギュレーションをうけるプロモーターまたは遺伝子
部分を担持すべきである。リポーター遺伝子の上流を配
列決定すると、アップレギュレーションされた遺伝子を
同定できる。
Technology:IVET) この技術はCamilliら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA.91:2
634-2638(1994)およびMahanら、Infectious Agents a
nd Diseases 2:263-268(1994)に記載されており、各
々の内容を参照により本明細書に記載されているものと
みなす。IVETは、実験培養と比較した場合、感染中にア
ップレギュレーションする遺伝子を同定し、感染におけ
る重要な役割を有する。この技法により同定される配列
は感染の確立/維持に重要な役割を有する。この技法で
は、標的生物のランダムな染色体フラグメントは、プラ
スミドベクターのプロモーター不含リポーター遺伝子の
上流でクローン化される。プールを宿主に導入し、感染
後の種々の時間に細菌を回収し、リポーター遺伝子発現
の存在を評価する。発現したリポーター遺伝子の上流に
担持された染色体フラグメントは、感染中に正常なアッ
プレギュレーションをうけるプロモーターまたは遺伝子
部分を担持すべきである。リポーター遺伝子の上流を配
列決定すると、アップレギュレーションされた遺伝子を
同定できる。
【0019】3)特徴ディスプレイ この技法はChuangら、J.Bacteriol.175:2026-2036(199
3)に記載されており、内容を参照により本明細書に記
載されているものとみなす。この方法はランダムプライ
ムRTPCRを用いてmRNAの存在を同定することに
より、生体に発現する遺伝子を同定する。感染前および
感染後のプロフィールを比較することにより、感染中に
アップレギュレーションおよびダウンレギュレーション
される遺伝子を同定でき、RTPCR産物が配列決定さ
れ、ライブラリー配列に適合させられる。
3)に記載されており、内容を参照により本明細書に記
載されているものとみなす。この方法はランダムプライ
ムRTPCRを用いてmRNAの存在を同定することに
より、生体に発現する遺伝子を同定する。感染前および
感染後のプロフィールを比較することにより、感染中に
アップレギュレーションおよびダウンレギュレーション
される遺伝子を同定でき、RTPCR産物が配列決定さ
れ、ライブラリー配列に適合させられる。
【0020】4)トランスポゾン突然変異誘発による条
件致死変異体の発生 この技法はde Lorenzo,V.ら、Gene123:17-24(199
3);Neuwald,A.F.ら、Gene125:69-73(1993)およびTa
kiff,H.E.ら、J.Bacteriol.174:1544-1553(1992)に記
載されており(参照により本明細書に記載されているも
のとみなす)、発現が細胞の生存性に必須である遺伝子
を同定する。この技法では、一方向または両方向でトラ
ンスポゾンから外側へ転写する、調節可能なプロモータ
ーを担持するトランスポゾンを生じる。これらのトラン
スポゾンを標的生物にランダムに挿入し、続いてプロモ
ーター活性のインデューサーの存在下で挿入突然変異体
を単離すると、発現が細胞の生存に必須である遺伝子の
コーディング領域とプロモーターとを分離するインサー
トが回収されることが確認される。このインサートは生
存できないので、引き続いてインデューサー不含のレプ
リカ平板法でかかるインサートを同定する。トランスポ
ゾンに隣接する領域の配列決定により挿入部位を同定
し、分断された遺伝子を同定する。インデューサー不存
在下での成長中の細胞の過程/形態の変化を正確にモニ
ターし、遺伝子の可能な機能に関する情報を得る。この
ようなモニタリングには、フローサイトメトリー(細胞
分割、溶解、酸化還元能、DNA複製)、DNA、RN
A、タンパク質、脂質、ペプチドグリカンへの放射性学
的標識前駆体の取り込み、既知の細胞性ストレスに反応
するリポーター酵素遺伝子融合物のモニター等がある。
件致死変異体の発生 この技法はde Lorenzo,V.ら、Gene123:17-24(199
3);Neuwald,A.F.ら、Gene125:69-73(1993)およびTa
kiff,H.E.ら、J.Bacteriol.174:1544-1553(1992)に記
載されており(参照により本明細書に記載されているも
のとみなす)、発現が細胞の生存性に必須である遺伝子
を同定する。この技法では、一方向または両方向でトラ
ンスポゾンから外側へ転写する、調節可能なプロモータ
ーを担持するトランスポゾンを生じる。これらのトラン
スポゾンを標的生物にランダムに挿入し、続いてプロモ
ーター活性のインデューサーの存在下で挿入突然変異体
を単離すると、発現が細胞の生存に必須である遺伝子の
コーディング領域とプロモーターとを分離するインサー
トが回収されることが確認される。このインサートは生
存できないので、引き続いてインデューサー不含のレプ
リカ平板法でかかるインサートを同定する。トランスポ
ゾンに隣接する領域の配列決定により挿入部位を同定
し、分断された遺伝子を同定する。インデューサー不存
在下での成長中の細胞の過程/形態の変化を正確にモニ
ターし、遺伝子の可能な機能に関する情報を得る。この
ようなモニタリングには、フローサイトメトリー(細胞
分割、溶解、酸化還元能、DNA複製)、DNA、RN
A、タンパク質、脂質、ペプチドグリカンへの放射性学
的標識前駆体の取り込み、既知の細胞性ストレスに反応
するリポーター酵素遺伝子融合物のモニター等がある。
【0021】5)化学的突然変異法による条件致死突然
変異の発生 この技法はBeckwith,J.、Methods in Enzymology204:3-
18(1991)に記載されており、参照により本明細書に記
載されているものとみなす。この技法では標的生物のラ
ンダム化学的突然変異を誘発し、生理学的温度(許容温
度)とは異なる温度で増殖させ、続いてレプリカ平板法
を行い、異なる温度(例えばts同定のためには42
℃、cs同定のためには25℃)で成長させ、その時成
長できなかった単離物(条件突然変異体)を同定する。
上述のように、非許容温度での増殖における変化を正確
にモニターし、突然変異遺伝子の機能に関する情報を得
る。標的生物からのライブラリーにより条件致死突然変
異を相補し、および相補遺伝子を配列決定することによ
り、ライブラリー配列と適合させることができる。これ
らの技法の各々は、特定の適用に応じて有利であった
り、不利であったりする。当業者は意図する特定の使用
目的に最も関連する研究法を選択する。例えば、いくつ
かの遺伝子は感染に必須であると認識されているが、実
際には感染の開始にのみ必要であり、そのためそれらの
産物は、確立された慢性の感染の治療のために開発され
た抗細菌物質にとってはそれほど魅力的な標的ではな
い。
変異の発生 この技法はBeckwith,J.、Methods in Enzymology204:3-
18(1991)に記載されており、参照により本明細書に記
載されているものとみなす。この技法では標的生物のラ
ンダム化学的突然変異を誘発し、生理学的温度(許容温
度)とは異なる温度で増殖させ、続いてレプリカ平板法
を行い、異なる温度(例えばts同定のためには42
℃、cs同定のためには25℃)で成長させ、その時成
長できなかった単離物(条件突然変異体)を同定する。
上述のように、非許容温度での増殖における変化を正確
にモニターし、突然変異遺伝子の機能に関する情報を得
る。標的生物からのライブラリーにより条件致死突然変
異を相補し、および相補遺伝子を配列決定することによ
り、ライブラリー配列と適合させることができる。これ
らの技法の各々は、特定の適用に応じて有利であった
り、不利であったりする。当業者は意図する特定の使用
目的に最も関連する研究法を選択する。例えば、いくつ
かの遺伝子は感染に必須であると認識されているが、実
際には感染の開始にのみ必要であり、そのためそれらの
産物は、確立された慢性の感染の治療のために開発され
た抗細菌物質にとってはそれほど魅力的な標的ではな
い。
【0022】6)RT−PCR 細菌性メッセンジャーRNA、好ましくはスタフィロコ
ッカス・アウレウスの細菌性メッセンジャーRNAを、
細菌感染した組織、例えば48時間ネズミ・肺感染の組
織から単離し、ランダムヘキサヌクレオチドでプライム
したRNAサンプルの逆転写により、続いて遺伝子特異
的プライマー対でのPCRにより、各mRNA種の量を
評価する。得られたPCR産物の定量化により特定のm
RNA種の存在および量を決定し、感染した組織に転写
された細菌遺伝子に関する情報を得る。遺伝子転写の分
析は、感染の異なる時間で実施でき、細菌による発病に
おける遺伝子制御に関する詳細な知識を得ることがで
き、遺伝子産物が新規抗菌物質をスクリーニングすべき
目的物質に相当することが明快に理解できるようにな
る。用いたPCRプライマーの遺伝子特異的特性のため
に、細菌性mRNA調製物は遊離の哺乳動物RNAであ
る必要はないことが理解されるべきである。これにより
研究者は、感染組織から簡単で迅速にRNAを調製し
て、細菌中で非常に短時間しか生育できない(半減期2
分程度)細菌性mRNA種を得ることができる。最適に
は、感染ネズミ肺をTRIゾール(ギブコ−BRL)存
在下で、非常に短時間機械的に破壊し、続いてTRIゾ
ール試薬の製造者の指示に従ってプロセッシングし、D
NAase処理して混入しているDNAを除去すること
によって、細菌性mRNAを調製する。好ましくは、適
当に標識した配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを
用いるノーザンブロットでプロービングすることにより
検出されるような細菌性16SリボソームRNA、好ま
しくはスタフィロコッカス・アウレウスの16Sリボソ
ームRNAの最大量を得る条件を見出すことにより、そ
のプロセスを最適化する。典型的には、所望により8か
ら25サイクルで終了するPCR反応における各PCR
プライマー対には5'色素標識プライマーを用いる。P
CR産物は、6%ポリアクリルアミドゲルで分離し、Ge
neScanner(ABI製造)を用いて検出および定量す
る。本発明の配列に適用する場合、これらの技法を用い
ると、感染中に発現する細菌性タンパク質、抗細菌治療
に利用できる阻害物質の同定が可能になる。
ッカス・アウレウスの細菌性メッセンジャーRNAを、
細菌感染した組織、例えば48時間ネズミ・肺感染の組
織から単離し、ランダムヘキサヌクレオチドでプライム
したRNAサンプルの逆転写により、続いて遺伝子特異
的プライマー対でのPCRにより、各mRNA種の量を
評価する。得られたPCR産物の定量化により特定のm
RNA種の存在および量を決定し、感染した組織に転写
された細菌遺伝子に関する情報を得る。遺伝子転写の分
析は、感染の異なる時間で実施でき、細菌による発病に
おける遺伝子制御に関する詳細な知識を得ることがで
き、遺伝子産物が新規抗菌物質をスクリーニングすべき
目的物質に相当することが明快に理解できるようにな
る。用いたPCRプライマーの遺伝子特異的特性のため
に、細菌性mRNA調製物は遊離の哺乳動物RNAであ
る必要はないことが理解されるべきである。これにより
研究者は、感染組織から簡単で迅速にRNAを調製し
て、細菌中で非常に短時間しか生育できない(半減期2
分程度)細菌性mRNA種を得ることができる。最適に
は、感染ネズミ肺をTRIゾール(ギブコ−BRL)存
在下で、非常に短時間機械的に破壊し、続いてTRIゾ
ール試薬の製造者の指示に従ってプロセッシングし、D
NAase処理して混入しているDNAを除去すること
によって、細菌性mRNAを調製する。好ましくは、適
当に標識した配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを
用いるノーザンブロットでプロービングすることにより
検出されるような細菌性16SリボソームRNA、好ま
しくはスタフィロコッカス・アウレウスの16Sリボソ
ームRNAの最大量を得る条件を見出すことにより、そ
のプロセスを最適化する。典型的には、所望により8か
ら25サイクルで終了するPCR反応における各PCR
プライマー対には5'色素標識プライマーを用いる。P
CR産物は、6%ポリアクリルアミドゲルで分離し、Ge
neScanner(ABI製造)を用いて検出および定量す
る。本発明の配列に適用する場合、これらの技法を用い
ると、感染中に発現する細菌性タンパク質、抗細菌治療
に利用できる阻害物質の同定が可能になる。
【0023】寄託物 スタフィロコッカス・アウレウスWCUH29株を含有
する寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・イン
ダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッ
ド(NCIMB)、スコットランド、アバーディーンA
B2 1RY、セント・マッカー・ドライブ23番に、
1995年9月11日寄託し、NCIMB受託番号40
771が付与された。寄託したスタフィロコッカス・ア
ウレウス株は本明細書では「寄託株」または「寄託株の
DNA」と称する。寄託物質はtRNAシンセターゼD
NAの全長を含有し、寄託に関して「NCIMB407
71」と称する。本明細書の配列に関する任意の記載に
矛盾する事象は、寄託物質に含まれるポリヌクレオチド
配列、およびそれらにコードされるポリペプチドのアミ
ノ酸配列に従う。
する寄託物は、ナショナル・コレクション・オブ・イン
ダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッ
ド(NCIMB)、スコットランド、アバーディーンA
B2 1RY、セント・マッカー・ドライブ23番に、
1995年9月11日寄託し、NCIMB受託番号40
771が付与された。寄託したスタフィロコッカス・ア
ウレウス株は本明細書では「寄託株」または「寄託株の
DNA」と称する。寄託物質はtRNAシンセターゼD
NAの全長を含有し、寄託に関して「NCIMB407
71」と称する。本明細書の配列に関する任意の記載に
矛盾する事象は、寄託物質に含まれるポリヌクレオチド
配列、およびそれらにコードされるポリペプチドのアミ
ノ酸配列に従う。
【0024】寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際
承認に関するブダペスト条約の条件下でなされている。
特許が発行されると何らの制限または条件もなく、最終
的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ
提供され、35U.S.C.112条のもとに要求される
ような、寄託が実施可能要件であることを承認するもの
ではない。寄託物を製造、使用または販売するためには
ライセンスが必要であるが、そのようなライセンスはこ
こでは賦与されていない。
承認に関するブダペスト条約の条件下でなされている。
特許が発行されると何らの制限または条件もなく、最終
的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ
提供され、35U.S.C.112条のもとに要求される
ような、寄託が実施可能要件であることを承認するもの
ではない。寄託物を製造、使用または販売するためには
ライセンスが必要であるが、そのようなライセンスはこ
こでは賦与されていない。
【0025】ポリペプチド 本発明ポリペプチドは、図4[配列番号:2]のポリペプ
チド(詳細には成熟ポリペプチド)、とりわけtRNA
シンセターゼの生物学的活性を有するポリペプチドおよ
びフラグメント、ならびに図4[配列番号:2]のポリペ
プチドまたは相当する部分に少なくとも72%の同一性
を有するポリペプチド、好ましくは図4[配列番号:2]
のポリペプチドに少なくとも80%の同一性を有するポ
リペプチド、およびさらに好ましくは図4[配列番号:
2]のポリペプチドに少なくとも90%の類似性(さら
に好ましくは少なくとも90%の同一性)を有するポリ
ペプチド、なおさらに好ましくは図4[配列番号:2]の
ポリペプチドに少なくとも95%の類似性(なおさらに
好ましくは少なくとも95%の同一性)を有するポリペ
プチドを包含し、また通常少なくとも30個のアミノ
酸、さらに好ましくは少なくとも50個のアミノ酸を含
むようなポリペプチド部分を有する、かかるポリペプチ
ドの部分も包含する。
チド(詳細には成熟ポリペプチド)、とりわけtRNA
シンセターゼの生物学的活性を有するポリペプチドおよ
びフラグメント、ならびに図4[配列番号:2]のポリペ
プチドまたは相当する部分に少なくとも72%の同一性
を有するポリペプチド、好ましくは図4[配列番号:2]
のポリペプチドに少なくとも80%の同一性を有するポ
リペプチド、およびさらに好ましくは図4[配列番号:
2]のポリペプチドに少なくとも90%の類似性(さら
に好ましくは少なくとも90%の同一性)を有するポリ
ペプチド、なおさらに好ましくは図4[配列番号:2]の
ポリペプチドに少なくとも95%の類似性(なおさらに
好ましくは少なくとも95%の同一性)を有するポリペ
プチドを包含し、また通常少なくとも30個のアミノ
酸、さらに好ましくは少なくとも50個のアミノ酸を含
むようなポリペプチド部分を有する、かかるポリペプチ
ドの部分も包含する。
【0026】本発明ポリペプチドのフラグメントである
変種は、ペプチド合成により対応するポリペプチド全長
を製造するのに用いることができる;従って、これらの
変種をポリペプチドの全長を製造するための中間体とし
て用いることができる。本発明ポリヌクレオチドのフラ
グメントである変種は本発明ポリヌクレオチド全長を合
成するために用いることができる。フラグメントは、前
述のポリペプチドのアミノ酸配列の全てではなく一部に
対して全く同一であるアミノ酸配列を有する変種ポリペ
プチドである。tRNAシンセターゼポリペプチドで
は、フラグメントは「フリースタンディング(freestan
ding)」であるか、または一部もしくは領域を形成する
より大きなポリペプチド内に含まれていてもよく、最も
好ましくは単一の連続した領域として、単一のより大き
なポリペプチドに含まれる。
変種は、ペプチド合成により対応するポリペプチド全長
を製造するのに用いることができる;従って、これらの
変種をポリペプチドの全長を製造するための中間体とし
て用いることができる。本発明ポリヌクレオチドのフラ
グメントである変種は本発明ポリヌクレオチド全長を合
成するために用いることができる。フラグメントは、前
述のポリペプチドのアミノ酸配列の全てではなく一部に
対して全く同一であるアミノ酸配列を有する変種ポリペ
プチドである。tRNAシンセターゼポリペプチドで
は、フラグメントは「フリースタンディング(freestan
ding)」であるか、または一部もしくは領域を形成する
より大きなポリペプチド内に含まれていてもよく、最も
好ましくは単一の連続した領域として、単一のより大き
なポリペプチドに含まれる。
【0027】好ましいフラグメントは、例えば、アミノ
末端を含む連続した一連の残基の欠失、またはカルボキ
シル末端を含む連続した一連の残基の欠失、またはアミ
ノ末端を含む残基とカルボキシル末端を含む残基、2個
の連続した一連の残基の欠失を除く、図4[配列番号:
2]のアミノ酸配列の一部を有する切断ポリペプチドま
たはその変種を包含する。宿主細胞、とりわけスタフィ
ロコッカス・アウレウスにおける本発明ポリペプチドの
切断形態もまた好ましい。また、構造的または機能的属
性により特徴づけられたフラグメント、例えばアルファ
ーヘリックスおよびアルファーヘリックス形成領域、ベ
ータシートおよびベータシート形成領域、ターンおよび
ターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性
領域、疎水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両
親媒性領域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、
および高抗原性指標領域を含むフラグメントも好まし
い。
末端を含む連続した一連の残基の欠失、またはカルボキ
シル末端を含む連続した一連の残基の欠失、またはアミ
ノ末端を含む残基とカルボキシル末端を含む残基、2個
の連続した一連の残基の欠失を除く、図4[配列番号:
2]のアミノ酸配列の一部を有する切断ポリペプチドま
たはその変種を包含する。宿主細胞、とりわけスタフィ
ロコッカス・アウレウスにおける本発明ポリペプチドの
切断形態もまた好ましい。また、構造的または機能的属
性により特徴づけられたフラグメント、例えばアルファ
ーヘリックスおよびアルファーヘリックス形成領域、ベ
ータシートおよびベータシート形成領域、ターンおよび
ターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性
領域、疎水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両
親媒性領域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、
および高抗原性指標領域を含むフラグメントも好まし
い。
【0028】tRNAシンセターゼの活性を媒介する、
生物学的に活性なフラグメントもまた好ましく、類似の
活性もしくは改善された活性、または望ましくない活性
を減じたフラグメントを包含する。動物、とりわけヒト
において抗原性または免疫原性フラグメントも包含す
る。本発明の別の態様は、図4[配列番号:2]の推定ア
ミノ酸配列を有するtRNAシンセターゼポリペプチド
をコードする単離ポリヌクレオチド、ならびにそれら
に、およびそれらの変種に密接に関連したポリヌクレオ
チドに関する。
生物学的に活性なフラグメントもまた好ましく、類似の
活性もしくは改善された活性、または望ましくない活性
を減じたフラグメントを包含する。動物、とりわけヒト
において抗原性または免疫原性フラグメントも包含す
る。本発明の別の態様は、図4[配列番号:2]の推定ア
ミノ酸配列を有するtRNAシンセターゼポリペプチド
をコードする単離ポリヌクレオチド、ならびにそれら
に、およびそれらの変種に密接に関連したポリヌクレオ
チドに関する。
【0029】本明細書に提供する情報を用いて、例えば
図1ないし3[配列番号:1]に示すポリヌクレオチド配
列のような、tRNAシンセターゼポリペプチドをコー
ドする本発明ポリヌクレオチドを、例えば、出発物質と
してスタフィロコッカス・アウレウスWCUH29細胞
から染色体DNAフラグメントをクローニングおよび配
列決定するために用いるような標準的なクローニングお
よびスクリーニングを用いて得ることができ、次いでク
ローン全長を得ることができる。例えば、図1ないし3
[配列番号:1]に示す配列のごとき本発明ポリヌクレオ
チド配列を得るためには、典型的には、イー・コリ(E.
coli)またはいくつかの異なる適当な宿主におけるスタ
フィロコッカス・アウレウスWCUH29細胞由来の染
色体DNAのクローンのライブラリーを、部分的配列由
来の、好ましくは17塩基またはそれ以上の長さの放射
性標識オリゴヌクレオチドにてプローブする。プローブ
のDNAに同一であるDNAを担持するクローンは厳密
な条件を用いて区別できる。元の配列から設計した配列
決定プライマーを用いてこのように同定した個々のクロ
ーンを配列決定することにより、両方向で配列が伸長で
きるようになり、全遺伝子配列を決定することができ
る。便利には、かかる配列決定はプラスミドクローンか
ら調製した変性二本鎖DNAを用いて実施する。適切な
技法については、Maniatis,T.、Fritsch,E.F.およびSam
brookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual、
第2版;コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク(1989)に記載されている(Screening ByHybrid
ization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stran
ded DNA Templates 13.70参照)。本発明の実例とし
て、図1ないし3[配列番号:1]に示すポリヌクレオチ
ドは、スタフィロコッカス・アウレウスWCUH29に
由来するDNAライブラリーで発見された。
図1ないし3[配列番号:1]に示すポリヌクレオチド配
列のような、tRNAシンセターゼポリペプチドをコー
ドする本発明ポリヌクレオチドを、例えば、出発物質と
してスタフィロコッカス・アウレウスWCUH29細胞
から染色体DNAフラグメントをクローニングおよび配
列決定するために用いるような標準的なクローニングお
よびスクリーニングを用いて得ることができ、次いでク
ローン全長を得ることができる。例えば、図1ないし3
[配列番号:1]に示す配列のごとき本発明ポリヌクレオ
チド配列を得るためには、典型的には、イー・コリ(E.
coli)またはいくつかの異なる適当な宿主におけるスタ
フィロコッカス・アウレウスWCUH29細胞由来の染
色体DNAのクローンのライブラリーを、部分的配列由
来の、好ましくは17塩基またはそれ以上の長さの放射
性標識オリゴヌクレオチドにてプローブする。プローブ
のDNAに同一であるDNAを担持するクローンは厳密
な条件を用いて区別できる。元の配列から設計した配列
決定プライマーを用いてこのように同定した個々のクロ
ーンを配列決定することにより、両方向で配列が伸長で
きるようになり、全遺伝子配列を決定することができ
る。便利には、かかる配列決定はプラスミドクローンか
ら調製した変性二本鎖DNAを用いて実施する。適切な
技法については、Maniatis,T.、Fritsch,E.F.およびSam
brookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual、
第2版;コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク(1989)に記載されている(Screening ByHybrid
ization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stran
ded DNA Templates 13.70参照)。本発明の実例とし
て、図1ないし3[配列番号:1]に示すポリヌクレオチ
ドは、スタフィロコッカス・アウレウスWCUH29に
由来するDNAライブラリーで発見された。
【0030】このように得られたDNA配列を図1ない
し3[配列番号:1]に示す。これは当該分野で周知のア
ミノ酸残基分子量を用いて算出できる推定分子量を有す
る、図4[配列番号:2]に示すものとほぼ同数のアミノ
酸残基を有するタンパク質をコードするオープンリーデ
ィングフレームを含有する。本発明の新規tRNAシン
セターゼは、寄託株のtRNAシンセターゼをコードす
るDNAの配列決定の結果により示されるように、tR
NAシンセターゼファミリーの他のタンパク質に構造的
に関連している。該タンパク質は、既知タンパク質の中
で、バチルス・ズブチリスtrsSVtRNAシンセタ
ーゼタンパク質に最も相同的である。図4[配列番号:
2]のtRNAシンセターゼは、バチルス・ズブチリス
trsSVtRNAシンセターゼポリペプチドのアミノ
酸配列に対して、全長にわたり約71%の同一性、およ
び全長にわたり約83%の類似性を有する。
し3[配列番号:1]に示す。これは当該分野で周知のア
ミノ酸残基分子量を用いて算出できる推定分子量を有す
る、図4[配列番号:2]に示すものとほぼ同数のアミノ
酸残基を有するタンパク質をコードするオープンリーデ
ィングフレームを含有する。本発明の新規tRNAシン
セターゼは、寄託株のtRNAシンセターゼをコードす
るDNAの配列決定の結果により示されるように、tR
NAシンセターゼファミリーの他のタンパク質に構造的
に関連している。該タンパク質は、既知タンパク質の中
で、バチルス・ズブチリスtrsSVtRNAシンセタ
ーゼタンパク質に最も相同的である。図4[配列番号:
2]のtRNAシンセターゼは、バチルス・ズブチリス
trsSVtRNAシンセターゼポリペプチドのアミノ
酸配列に対して、全長にわたり約71%の同一性、およ
び全長にわたり約83%の類似性を有する。
【0031】本発明配列はまた、図1ないし3[配列番
号:1]のコーディング配列に全長にわたり同一であっ
てもよい。本発明はまた、成熟ポリペプチドまたはそれ
らのフラグメントのコーディング配列自体、ならびに他
のコーディング配列(例えばリーダーまたは分泌配列、
プレ、プロ、プレプロタンパク質配列をコードする)を
伴ったリーディングフレーム中の該成熟ポリペプチドま
たはフラグメントのコーディング配列をも提供する。ポ
リヌクレオチドは、例えば、転写された非翻訳配列、停
止シグナル、リボソーム結合部位、mRNA安定化配
列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、および付加
アミノ酸をコードする付加コーディング配列のごとき非
コーディング5'および3'配列等の非コーディング配列
をも包含しうるが、これらに限定するのではない。例え
ば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列
をコードしてもよい。本発明のある好ましい態様におい
て、マーカー配列は、pQEベクター(キアゲン・イン
コーポレーティッド)に提供されるようなヘキサ−ヒス
チジンペプチド(Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,
86:821-824(1989)に記載される)またはHAタグ(Wi
lsonら、Cell,37:767(1984))である。また本発明ポ
リヌクレオチドは、構造遺伝子および遺伝子発現を調節
するその天然において関連した配列を含んでなるポリヌ
クレオチドを包含するが、これらに限定するものではな
い。
号:1]のコーディング配列に全長にわたり同一であっ
てもよい。本発明はまた、成熟ポリペプチドまたはそれ
らのフラグメントのコーディング配列自体、ならびに他
のコーディング配列(例えばリーダーまたは分泌配列、
プレ、プロ、プレプロタンパク質配列をコードする)を
伴ったリーディングフレーム中の該成熟ポリペプチドま
たはフラグメントのコーディング配列をも提供する。ポ
リヌクレオチドは、例えば、転写された非翻訳配列、停
止シグナル、リボソーム結合部位、mRNA安定化配
列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、および付加
アミノ酸をコードする付加コーディング配列のごとき非
コーディング5'および3'配列等の非コーディング配列
をも包含しうるが、これらに限定するのではない。例え
ば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列
をコードしてもよい。本発明のある好ましい態様におい
て、マーカー配列は、pQEベクター(キアゲン・イン
コーポレーティッド)に提供されるようなヘキサ−ヒス
チジンペプチド(Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,
86:821-824(1989)に記載される)またはHAタグ(Wi
lsonら、Cell,37:767(1984))である。また本発明ポ
リヌクレオチドは、構造遺伝子および遺伝子発現を調節
するその天然において関連した配列を含んでなるポリヌ
クレオチドを包含するが、これらに限定するものではな
い。
【0032】前述によれば、本明細書で用いる「ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明ポリペプチド、とりわけ図4[配列番号:2]に示す
アミノ酸配列を有する細菌性の、さらに詳細にはスタフ
ィロコッカス・アウレウスのtRNAシンセターゼをコ
ーディングする配列を含有するポリヌクレオチドを包含
する。この用語はまた、付加領域と一緒になった、ポリ
ペプチドをコードする単一の連続領域または不連続領域
(例えば組み込まれたファージもしくは挿入配列または
修正により分断される)、さらにはコーディングおよび
/または非コーディング配列をも含み得るポリヌクレオ
チドをも包含する。本発明はさらに、図4[配列番号:
2]の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変種を
コードする、本明細書ですでに述べたポリヌクレオチド
の変種に関する。
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明ポリペプチド、とりわけ図4[配列番号:2]に示す
アミノ酸配列を有する細菌性の、さらに詳細にはスタフ
ィロコッカス・アウレウスのtRNAシンセターゼをコ
ーディングする配列を含有するポリヌクレオチドを包含
する。この用語はまた、付加領域と一緒になった、ポリ
ペプチドをコードする単一の連続領域または不連続領域
(例えば組み込まれたファージもしくは挿入配列または
修正により分断される)、さらにはコーディングおよび
/または非コーディング配列をも含み得るポリヌクレオ
チドをも包含する。本発明はさらに、図4[配列番号:
2]の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドの変種を
コードする、本明細書ですでに述べたポリヌクレオチド
の変種に関する。
【0033】本発明の特に好ましい態様は、図4[配列
番号:2]に示すtRNAシンセターゼポリペプチドの
アミノ酸配列にいくつか、少しの、5〜10、1〜5、
1〜3、2、1または0個のアミノ酸残基の置換、欠失
または付加を任意の組み合わせで施したアミノ酸配列を
有するtRNAシンセターゼ変種をコードするポリヌク
レオチドである。中でもとりわけ好ましいものは、tR
NAシンセターゼの特性および活性を変化させないサイ
レント置換、付加および欠失である。
番号:2]に示すtRNAシンセターゼポリペプチドの
アミノ酸配列にいくつか、少しの、5〜10、1〜5、
1〜3、2、1または0個のアミノ酸残基の置換、欠失
または付加を任意の組み合わせで施したアミノ酸配列を
有するtRNAシンセターゼ変種をコードするポリヌク
レオチドである。中でもとりわけ好ましいものは、tR
NAシンセターゼの特性および活性を変化させないサイ
レント置換、付加および欠失である。
【0034】本発明のさらに好ましい態様は、図4[配
列番号:2]に示すアミノ酸配列を有するtRNAシン
セターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
およびこのようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌク
レオチドに対し、全長で少なくとも72%同一であるポ
リヌクレオチドである。また別に、最も好ましいポリヌ
クレオチドは、寄託株スタフィロコッカス・アウレウス
のDNAのtRNAシンセターゼポリペプチドをコード
しているポリヌクレオチドおよびそれらに相補的なポリ
ヌクレオチドに対し、全長にわたり少なくとも80%同
一である領域を含むポリヌクレオチドである。この点に
関して、全長にわたり少なくとも90%同一であるポリ
ヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも少なくとも9
5%の同一性を有するものが特に好ましい。さらに少な
くとも95%の同一性を有するものの中でも少なくとも
97%であるのがより好ましく、中でも少なくとも98
%および少なくとも99%であるのが特に好ましく、さ
らに少なくとも99%であるのがより好ましい。
列番号:2]に示すアミノ酸配列を有するtRNAシン
セターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
およびこのようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌク
レオチドに対し、全長で少なくとも72%同一であるポ
リヌクレオチドである。また別に、最も好ましいポリヌ
クレオチドは、寄託株スタフィロコッカス・アウレウス
のDNAのtRNAシンセターゼポリペプチドをコード
しているポリヌクレオチドおよびそれらに相補的なポリ
ヌクレオチドに対し、全長にわたり少なくとも80%同
一である領域を含むポリヌクレオチドである。この点に
関して、全長にわたり少なくとも90%同一であるポリ
ヌクレオチドがとりわけ好ましく、中でも少なくとも9
5%の同一性を有するものが特に好ましい。さらに少な
くとも95%の同一性を有するものの中でも少なくとも
97%であるのがより好ましく、中でも少なくとも98
%および少なくとも99%であるのが特に好ましく、さ
らに少なくとも99%であるのがより好ましい。
【0035】この点に関するとりわけ好ましい態様は、
さらに、図1ないし3[配列番号:1]のDNAによりコ
ードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的
機能または活性を保持するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドである。さらに本発明は、本明細書です
でに述べた配列にハイブリダイゼーションするポリヌク
レオチドに関する。この点に関して、本発明は、厳密な
条件にて本明細書ですでに述べたポリヌクレオチドにハ
イブリダイゼーションするポリヌクレオチドに特に関連
している。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳
密なハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間
の同一性が少なくとも95%、好ましくは少なくとも9
7%である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを
意味する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例とし
ては、50%ホルムアミド、5xSSC(150mM
NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム)、50m
Mリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハーツ溶
液、10%硫酸デキストラン、および20μg/mlの
変性され剪断されたサケ精子DNAを含有する溶液中、
42℃で一晩インキュベーションし、続いて約65℃で
0.1xSSC中フィルターを洗浄するものである。ハ
イブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Sa
mbrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual、
第2版;コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク(1989)、とりわけその第2章に実例が示されてお
り、その全開示を参照により本明細書に記載されている
ものとみなす。
さらに、図1ないし3[配列番号:1]のDNAによりコ
ードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的
機能または活性を保持するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドである。さらに本発明は、本明細書です
でに述べた配列にハイブリダイゼーションするポリヌク
レオチドに関する。この点に関して、本発明は、厳密な
条件にて本明細書ですでに述べたポリヌクレオチドにハ
イブリダイゼーションするポリヌクレオチドに特に関連
している。本明細書で用いる「厳密な条件」および「厳
密なハイブリダイゼーション条件」なる用語は、配列間
の同一性が少なくとも95%、好ましくは少なくとも9
7%である場合のみに起こるハイブリダイゼーションを
意味する。厳密なハイブリダイゼーション条件の例とし
ては、50%ホルムアミド、5xSSC(150mM
NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム)、50m
Mリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハーツ溶
液、10%硫酸デキストラン、および20μg/mlの
変性され剪断されたサケ精子DNAを含有する溶液中、
42℃で一晩インキュベーションし、続いて約65℃で
0.1xSSC中フィルターを洗浄するものである。ハ
イブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Sa
mbrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual、
第2版;コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク(1989)、とりわけその第2章に実例が示されてお
り、その全開示を参照により本明細書に記載されている
ものとみなす。
【0036】本発明はまた、厳密なハイブリダイゼーシ
ョン条件で配列番号:1に示すポリヌクレオチド配列の
完全遺伝子を含有する適当なライブラリーを、配列番
号:1に示す該ポリヌクレオチド配列またはそのフラグ
メントの配列を有するプローブでスクリーニングし、該
DNA配列を単離することにより得られるポリヌクレオ
チド配列を必須としてなるポリヌクレオチドをも提供す
る。このようなポリヌクレオチドを得るために有用なフ
ラグメントは、例えば本明細書に別に記載するプローブ
およびプライマーを包含する。
ョン条件で配列番号:1に示すポリヌクレオチド配列の
完全遺伝子を含有する適当なライブラリーを、配列番
号:1に示す該ポリヌクレオチド配列またはそのフラグ
メントの配列を有するプローブでスクリーニングし、該
DNA配列を単離することにより得られるポリヌクレオ
チド配列を必須としてなるポリヌクレオチドをも提供す
る。このようなポリヌクレオチドを得るために有用なフ
ラグメントは、例えば本明細書に別に記載するプローブ
およびプライマーを包含する。
【0037】本発明ポリヌクレオチドのアッセイに関し
てここでさらに論じるが、例えば上述の本発明ポリヌク
レオチドをRNA、cDNAおよびゲノムDNA用のハ
イブリダイゼーションプローブとして用いて、tRNA
シンセターゼをコードするcDNA全長およびゲノムク
ローンを単離し、tRNAシンセターゼ遺伝子に高度な
配列類似性を有するその他の遺伝子のcDNAおよびゲ
ノムクローンを単離することができる。このようなプロ
ーブは通常少なくとも15塩基を含む。好ましくはこの
ようなプローブは少なくとも30塩基を有し、少なくと
も50塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプロ
ーブは少なくとも30塩基を有し、50塩基以下であ
る。
てここでさらに論じるが、例えば上述の本発明ポリヌク
レオチドをRNA、cDNAおよびゲノムDNA用のハ
イブリダイゼーションプローブとして用いて、tRNA
シンセターゼをコードするcDNA全長およびゲノムク
ローンを単離し、tRNAシンセターゼ遺伝子に高度な
配列類似性を有するその他の遺伝子のcDNAおよびゲ
ノムクローンを単離することができる。このようなプロ
ーブは通常少なくとも15塩基を含む。好ましくはこの
ようなプローブは少なくとも30塩基を有し、少なくと
も50塩基を有していてもよい。とりわけ好ましいプロ
ーブは少なくとも30塩基を有し、50塩基以下であ
る。
【0038】例えばtRNAシンセターゼ遺伝子のコー
ディング領域は、既知DNA配列を用いてオリゴヌクレ
オチドプローブを合成し、スクリーニングすることによ
り単離できる。次いで、本発明遺伝子の配列に相補的な
配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、cDNA、
ゲノムDNAまたはmRNAのライブラリーのスクリー
ニングに用い、プローブがハイブリダイゼーションする
ライブラリーのメンバーを決定する。本発明ポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドは、疾患、とりわけヒトの疾
患の処置法および診断法の発見のために研究試薬および
材料として使用でき、とりわけポリヌクレオチドアッセ
イに関連して本明細書でさらに論じる。
ディング領域は、既知DNA配列を用いてオリゴヌクレ
オチドプローブを合成し、スクリーニングすることによ
り単離できる。次いで、本発明遺伝子の配列に相補的な
配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、cDNA、
ゲノムDNAまたはmRNAのライブラリーのスクリー
ニングに用い、プローブがハイブリダイゼーションする
ライブラリーのメンバーを決定する。本発明ポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドは、疾患、とりわけヒトの疾
患の処置法および診断法の発見のために研究試薬および
材料として使用でき、とりわけポリヌクレオチドアッセ
イに関連して本明細書でさらに論じる。
【0039】配列番号:1および2の配列に由来するオ
リゴヌクレオチドである本発明ポリヌクレオチドは、本
明細書に記載するプロセスに使用できるものであるが、
PCRに用いるのが好ましく、本明細書で全てまたは一
部が同定したポリヌクレオチドが感染した組織に転写さ
れるかどうかを決定する。このような配列が、病原体が
達成した感染の段階および感染の型の診断にも有用であ
ることが理解される。ポリヌクレオチドは、付加アミノ
酸もしくはカルボキシル末端アミノ酸または成熟ポリペ
プチドに内在するアミノ酸を加えた成熟タンパク質であ
るポリペプチドをコードできる(例えば成熟形態が一つ
以上のポリペプチド鎖を有する場合)。このような配列
は、前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシン
グに役割を担い、タンパク質輸送を可能にし、タンパク
質の半減期を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッ
セイもしくは製造のためのタンパク質の操作を容易にす
ることができる。一般的にインビボの場合、付加アミノ
酸は、細胞の酵素によりプロセッシングされ、成熟タン
パク質から取り除かれる。
リゴヌクレオチドである本発明ポリヌクレオチドは、本
明細書に記載するプロセスに使用できるものであるが、
PCRに用いるのが好ましく、本明細書で全てまたは一
部が同定したポリヌクレオチドが感染した組織に転写さ
れるかどうかを決定する。このような配列が、病原体が
達成した感染の段階および感染の型の診断にも有用であ
ることが理解される。ポリヌクレオチドは、付加アミノ
酸もしくはカルボキシル末端アミノ酸または成熟ポリペ
プチドに内在するアミノ酸を加えた成熟タンパク質であ
るポリペプチドをコードできる(例えば成熟形態が一つ
以上のポリペプチド鎖を有する場合)。このような配列
は、前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシン
グに役割を担い、タンパク質輸送を可能にし、タンパク
質の半減期を延長もしくは短縮し、またはとりわけアッ
セイもしくは製造のためのタンパク質の操作を容易にす
ることができる。一般的にインビボの場合、付加アミノ
酸は、細胞の酵素によりプロセッシングされ、成熟タン
パク質から取り除かれる。
【0040】1またはそれ以上のプロ配列と融合したポ
リペプチドの成熟形態を有する前駆タンパク質は、ポリ
ペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去
されると、このような不活性前駆体が通常活性化され
る。プロ配列のいくつかまたは全てを活性化の前に除去
できる。通常、このような前駆体はプロタンパク質と称
される。要するに、本発明ポリヌクレオチドは成熟タン
パク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク質(プレタ
ンパク質と称することができる)、プレタンパク質のリ
ーダー配列ではない1またはそれ以上のプロ配列を有す
る成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列および
1またはそれ以上のプロ配列を有するプロタンパク質の
前駆体であるプレプロタンパク質をコードでき、プロ配
列は通常ポリペプチドの活性および成熟形態を生じるプ
ロセッシング段階で除去される。
リペプチドの成熟形態を有する前駆タンパク質は、ポリ
ペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去
されると、このような不活性前駆体が通常活性化され
る。プロ配列のいくつかまたは全てを活性化の前に除去
できる。通常、このような前駆体はプロタンパク質と称
される。要するに、本発明ポリヌクレオチドは成熟タン
パク質、リーダー配列を加えた成熟タンパク質(プレタ
ンパク質と称することができる)、プレタンパク質のリ
ーダー配列ではない1またはそれ以上のプロ配列を有す
る成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列および
1またはそれ以上のプロ配列を有するプロタンパク質の
前駆体であるプレプロタンパク質をコードでき、プロ配
列は通常ポリペプチドの活性および成熟形態を生じるプ
ロセッシング段階で除去される。
【0041】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明ポリヌク
レオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝子操作
する宿主細胞および組換え技法による本発明ポリペプチ
ドの製造にも関する。本発明のDNA構築物に由来する
RNAを用い、無細胞翻訳系を用いてかかるタンパク質
を製造できる。
レオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝子操作
する宿主細胞および組換え技法による本発明ポリペプチ
ドの製造にも関する。本発明のDNA構築物に由来する
RNAを用い、無細胞翻訳系を用いてかかるタンパク質
を製造できる。
【0042】組換え体を製造するために、宿主細胞を、
遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、または
本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。ポ
リヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davis
ら、Basic Methods in Molecular Biology(1986);Sa
mbrookら、Molecular Cloning;A Laboratory Manual、
第2版;コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク(1989)のような多くの標準的な研究室マニュア
ルに記載される方法により行うことができ、例えばリン
酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキス
トラン媒介トランスフェクション、トランスベクショ
ン、マイクロインジェクション、カチオン性脂質により
媒介されるトランスフェクション、エレクトロポレーシ
ョン、トランスダクション、スクレープ負荷、バリステ
ィック導入および感染等がある。
遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、または
本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。ポ
リヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davis
ら、Basic Methods in Molecular Biology(1986);Sa
mbrookら、Molecular Cloning;A Laboratory Manual、
第2版;コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク(1989)のような多くの標準的な研究室マニュア
ルに記載される方法により行うことができ、例えばリン
酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキス
トラン媒介トランスフェクション、トランスベクショ
ン、マイクロインジェクション、カチオン性脂質により
媒介されるトランスフェクション、エレクトロポレーシ
ョン、トランスダクション、スクレープ負荷、バリステ
ィック導入および感染等がある。
【0043】適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例えば
ストレプトコッカス属(streptococci)、スタフィロコ
ッカス属(staphylococci)、イー・コリ(E.coli)、
ストレプトミセスおよびバチルス・ズブチリス(Bacill
us subtiis)細胞;真菌細胞例えば酵母細胞およびアス
ペルギルス属(Aspergillus)細胞;昆虫細胞例えばド
ロソフィラS2(Drosophila S2)およびスポドプテラ
Sf9(Spodoptera Sf9)細胞;動物細胞例えばCH
O、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、2
93およびボウズ(Bows)黒色腫細胞;ならびに植物細
胞を包含する。
ストレプトコッカス属(streptococci)、スタフィロコ
ッカス属(staphylococci)、イー・コリ(E.coli)、
ストレプトミセスおよびバチルス・ズブチリス(Bacill
us subtiis)細胞;真菌細胞例えば酵母細胞およびアス
ペルギルス属(Aspergillus)細胞;昆虫細胞例えばド
ロソフィラS2(Drosophila S2)およびスポドプテラ
Sf9(Spodoptera Sf9)細胞;動物細胞例えばCH
O、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、2
93およびボウズ(Bows)黒色腫細胞;ならびに植物細
胞を包含する。
【0044】本発明ポリペプチドを製造するために非常
に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばSV40、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせた物に由来す
るベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファー
ジ遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミド
およびファージミド等がある。発現系の構築物は、発現
を制御および引き起こす調節領域を含有していてもよ
い。通常宿主中にポリヌクレオチドを保持、伸長または
発現するのに適した、および/またはポリペプチドを発
現するのに適した任意の系またはベクターを、この点に
関する発現に使用できる。周知のおよび通常的な種々の
任意の技術により、適当なDNA配列を発現系に挿入で
き、例えばSambrookら、Molecular Cloning,A Laborat
ory Manual(上述)に記載されている。
に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばSV40、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせた物に由来す
るベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファー
ジ遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミド
およびファージミド等がある。発現系の構築物は、発現
を制御および引き起こす調節領域を含有していてもよ
い。通常宿主中にポリヌクレオチドを保持、伸長または
発現するのに適した、および/またはポリペプチドを発
現するのに適した任意の系またはベクターを、この点に
関する発現に使用できる。周知のおよび通常的な種々の
任意の技術により、適当なDNA配列を発現系に挿入で
き、例えばSambrookら、Molecular Cloning,A Laborat
ory Manual(上述)に記載されている。
【0045】翻訳タンパク質を、小胞体内腔、細胞周辺
腔または細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグ
ナルを発現するポリペプチドに組み込むことができる。
これらのシグナルはポリペプチドに対して内在性であっ
てもよく、あるいは異種性のシグナルでもよい。本発明
のポリペプチドは周知の方法により、組換え細胞培養物
から回収および精製でき、その方法は、例えば硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまた
は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース
クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシル
アパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィーを包含する。高速液体クロマトグラフィー
(「HPLC」)を精製に用いるのが最も好ましい。ポ
リペプチドが単離および/または精製中に変性した場
合、再び活性な立体配座にするために、タンパク質再生
のための周知の技法を用いることができる。
腔または細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグ
ナルを発現するポリペプチドに組み込むことができる。
これらのシグナルはポリペプチドに対して内在性であっ
てもよく、あるいは異種性のシグナルでもよい。本発明
のポリペプチドは周知の方法により、組換え細胞培養物
から回収および精製でき、その方法は、例えば硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまた
は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース
クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシル
アパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィーを包含する。高速液体クロマトグラフィー
(「HPLC」)を精製に用いるのが最も好ましい。ポ
リペプチドが単離および/または精製中に変性した場
合、再び活性な立体配座にするために、タンパク質再生
のための周知の技法を用いることができる。
【0046】診断アッセイ 本発明はまた診断試薬として使用するための本発明tR
NAシンセターゼポリヌクレオチドの使用にも関する。
真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるtRNA
シンセターゼの検出は、疾患の診断のための診断方法を
提供する。真核生物(本明細書において「個体」とも称
する)とりわけ哺乳動物、特にヒトがtRNAシンセタ
ーゼ遺伝子を含む生物に感染すると、種々の方法により
DNAレベルで検出できる。
NAシンセターゼポリヌクレオチドの使用にも関する。
真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトにおけるtRNA
シンセターゼの検出は、疾患の診断のための診断方法を
提供する。真核生物(本明細書において「個体」とも称
する)とりわけ哺乳動物、特にヒトがtRNAシンセタ
ーゼ遺伝子を含む生物に感染すると、種々の方法により
DNAレベルで検出できる。
【0047】診断用核酸は、感染した個体の細胞および
組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚より得る
ことができる。ゲノムDNAは直接的に検出するのに使
用できるか、または分析の前にPCRもしくはその他の
増幅法を用いることにより酵素的に増幅できる。RNA
またはcDNAも同じ方法に使用することができる。増
幅を用いると、真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトに
存在する原核生物株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分
析により特徴づけすることができる。対照配列の遺伝子
型と比較した増幅産物の大きさの変化により、欠失およ
び挿入を検出できる。点突然変異は、増幅DNAを標識
tRNAシンセターゼポリヌクレオチド配列にハイブリ
ダイゼーションすることにより同定できる。完全に対合
した配列はRNアーゼ消化により、または融解温度の差
により、誤対合二重らせんから区別できる。DNA配列
の差はまた、変性剤を伴うまたは伴わないゲル中のDN
Aフラグメントの電気泳動の移動度の変化を検出するこ
とにより、または直接的なDNAの配列決定により検出
できる。例えばMyersら、Science,230:1242(1985)参
照。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ
保護アッセイ例えばRNアーゼおよびS1保護または化
学的切断法によっても明らかにすることができる。例え
ばCottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401
(1985)参照。
組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚より得る
ことができる。ゲノムDNAは直接的に検出するのに使
用できるか、または分析の前にPCRもしくはその他の
増幅法を用いることにより酵素的に増幅できる。RNA
またはcDNAも同じ方法に使用することができる。増
幅を用いると、真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトに
存在する原核生物株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分
析により特徴づけすることができる。対照配列の遺伝子
型と比較した増幅産物の大きさの変化により、欠失およ
び挿入を検出できる。点突然変異は、増幅DNAを標識
tRNAシンセターゼポリヌクレオチド配列にハイブリ
ダイゼーションすることにより同定できる。完全に対合
した配列はRNアーゼ消化により、または融解温度の差
により、誤対合二重らせんから区別できる。DNA配列
の差はまた、変性剤を伴うまたは伴わないゲル中のDN
Aフラグメントの電気泳動の移動度の変化を検出するこ
とにより、または直接的なDNAの配列決定により検出
できる。例えばMyersら、Science,230:1242(1985)参
照。特異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ
保護アッセイ例えばRNアーゼおよびS1保護または化
学的切断法によっても明らかにすることができる。例え
ばCottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401
(1985)参照。
【0048】本発明遺伝子の突然変異または多型性を担
持する細胞はまた、種々の技術により、DNAレベル
で、例えばセロタイピングすることにより検出できる。
例えば、RTPCRは突然変異を検出するために用いる
ことができる。RT−PCRは自動検出系、例えばGene
Scan等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。R
NAまたはcDNAもまた同じ目的で、PCRまたはR
TPCRに用いることができる。例を挙げると、tRN
Aシンセターゼをコードする核酸に相補的なPCRプラ
イマーを用いて突然変異を同定および分析することがで
きる。これらのプライマーを用いて、個体に由来するサ
ンプルから単離したtRNAシンセターゼDNAを増幅
することができる。本発明はまた5'および/または3'
末端から1、2、3または4ヌクレオチド除去したプラ
イマーをも提供する。該プライマーを用いて、感染した
個体から単離した遺伝子を増幅することができ、次い
で、該遺伝子をDNA配列を調べるための種々の技法に
供することができる。このように、DNA配列における
突然変異を検出し、これを用いて感染の診断および感染
性物質のセロタイピングまたは分類をすることができ
る。
持する細胞はまた、種々の技術により、DNAレベル
で、例えばセロタイピングすることにより検出できる。
例えば、RTPCRは突然変異を検出するために用いる
ことができる。RT−PCRは自動検出系、例えばGene
Scan等と組み合わせて用いるのがとりわけ好ましい。R
NAまたはcDNAもまた同じ目的で、PCRまたはR
TPCRに用いることができる。例を挙げると、tRN
Aシンセターゼをコードする核酸に相補的なPCRプラ
イマーを用いて突然変異を同定および分析することがで
きる。これらのプライマーを用いて、個体に由来するサ
ンプルから単離したtRNAシンセターゼDNAを増幅
することができる。本発明はまた5'および/または3'
末端から1、2、3または4ヌクレオチド除去したプラ
イマーをも提供する。該プライマーを用いて、感染した
個体から単離した遺伝子を増幅することができ、次い
で、該遺伝子をDNA配列を調べるための種々の技法に
供することができる。このように、DNA配列における
突然変異を検出し、これを用いて感染の診断および感染
性物質のセロタイピングまたは分類をすることができ
る。
【0049】本発明はまた、疾患、好ましくは細菌感
染、さらに好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス
による感染、および最も好ましくは上気道感染(例えば
中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下
気道感染(例えば蓄膿症、肺膿瘍)、心臓感染(例えば感
染性心内膜炎)、消化器感染(例えば分泌性下痢、脾臓
膿瘍、腹膜後膿瘍)、CNS感染(例えば大脳膿瘍)、
眼感染(例えば眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中
隔(preseptal)および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および
尿管感染(例えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、ト
キシックショック症候群)、皮膚感染(例えば膿痂疹、
毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎)、
骨および関節感染(例えば敗血症性関節炎、骨髄炎)の
ごとき疾患の診断方法を提供し、図1ないし3[配列番
号:1]の配列を有するポリヌクレオチドの発現レベル
の上昇を、個体由来のサンプルから決定することを特徴
とする。tRNAシンセターゼポリヌクレオチドの発現
の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法として
当該分野で周知の方法の任意の方法、例えば増幅、PC
R、RTPCR、RNアーゼ保護、ノーザンブロッティ
ングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いて
測定できる。
染、さらに好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス
による感染、および最も好ましくは上気道感染(例えば
中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下
気道感染(例えば蓄膿症、肺膿瘍)、心臓感染(例えば感
染性心内膜炎)、消化器感染(例えば分泌性下痢、脾臓
膿瘍、腹膜後膿瘍)、CNS感染(例えば大脳膿瘍)、
眼感染(例えば眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中
隔(preseptal)および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および
尿管感染(例えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、ト
キシックショック症候群)、皮膚感染(例えば膿痂疹、
毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎)、
骨および関節感染(例えば敗血症性関節炎、骨髄炎)の
ごとき疾患の診断方法を提供し、図1ないし3[配列番
号:1]の配列を有するポリヌクレオチドの発現レベル
の上昇を、個体由来のサンプルから決定することを特徴
とする。tRNAシンセターゼポリヌクレオチドの発現
の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法として
当該分野で周知の方法の任意の方法、例えば増幅、PC
R、RTPCR、RNアーゼ保護、ノーザンブロッティ
ングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いて
測定できる。
【0050】さらに、正常対照組織サンプルと比較して
tRNAシンセターゼタンパク質の過剰発現を検出する
ための本発明による診断アッセイは、例えば感染の存在
を検出するために用いることができる。宿主由来のサン
プル中のtRNAシンセターゼタンパク質のレベルを決
定するために用いることができるアッセイ技法は、当業
者に周知である。このようなアッセイ法は、ラジオイム
ノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分
析およびELISAアッセイを包含する。
tRNAシンセターゼタンパク質の過剰発現を検出する
ための本発明による診断アッセイは、例えば感染の存在
を検出するために用いることができる。宿主由来のサン
プル中のtRNAシンセターゼタンパク質のレベルを決
定するために用いることができるアッセイ技法は、当業
者に周知である。このようなアッセイ法は、ラジオイム
ノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分
析およびELISAアッセイを包含する。
【0051】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそ
れらを発現する細胞は、このようなポリペプチドに免疫
特異的な抗体を産生する免疫原として用いることができ
る。本明細書で用いる「抗体」には、モノクローナルお
よびポリクローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体
およびヒト化抗体、ならびにFab免疫グロブリン発現
ライブラリーの生成物を包含するFabフラグメント等
がある。
れらを発現する細胞は、このようなポリペプチドに免疫
特異的な抗体を産生する免疫原として用いることができ
る。本明細書で用いる「抗体」には、モノクローナルお
よびポリクローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体
およびヒト化抗体、ならびにFab免疫グロブリン発現
ライブラリーの生成物を包含するFabフラグメント等
がある。
【0052】本発明のポリペプチドに対して生じる抗体
は、ポリペプチドまたはエピトープが付いたフラグメン
ト、アナログまたは細胞を、好ましくはヒトはでない動
物に、通常の実験法を用いて投与することにより得るこ
とができる。連続的細胞系培養により産生される抗体を
提供する当業者周知の技術を用いて、モノクローナル抗
体を調製することができる。実例としては、Kohler,G.
およびMilstein,C.,Nature,256:495-497(1975);Ko
zborら、Immunology Today,4:72(1983);Coleら、Mo
noclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Lis
s,Inc.、77-96頁(1985)に記載されるような種々の技
法がある。
は、ポリペプチドまたはエピトープが付いたフラグメン
ト、アナログまたは細胞を、好ましくはヒトはでない動
物に、通常の実験法を用いて投与することにより得るこ
とができる。連続的細胞系培養により産生される抗体を
提供する当業者周知の技術を用いて、モノクローナル抗
体を調製することができる。実例としては、Kohler,G.
およびMilstein,C.,Nature,256:495-497(1975);Ko
zborら、Immunology Today,4:72(1983);Coleら、Mo
noclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Lis
s,Inc.、77-96頁(1985)に記載されるような種々の技
法がある。
【0053】一本鎖抗体の製造のための記載された技術
(米国特許第4946778号)は、本発明のポリペプ
チドに対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。ま
た、トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例
えばその他の哺乳動物は、ヒト化抗体等の抗体を発現す
るのに用いることができる。別法としてファージディス
プレイ(phage display)技法を用いて、抗Fbpを有
することについてスクリーニングしたヒトのリンパ球の
PCR増幅したv遺伝子のレパートリー由来の、または
無処理のライブラリー由来のポリペプチドに対する結合
活性を有する抗体遺伝子を選別することができる(McCa
fferty,J.ら、Nature 348:552-554(1990);Marks,J.
ら、Biotechnology 10:779-783(1992))。これらの抗体
の親和性はチェインシャフリング(chain shuffling)
により改善することもできる(Clackson,T.ら、Nature
352:624-628(1991))。
(米国特許第4946778号)は、本発明のポリペプ
チドに対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。ま
た、トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例
えばその他の哺乳動物は、ヒト化抗体等の抗体を発現す
るのに用いることができる。別法としてファージディス
プレイ(phage display)技法を用いて、抗Fbpを有
することについてスクリーニングしたヒトのリンパ球の
PCR増幅したv遺伝子のレパートリー由来の、または
無処理のライブラリー由来のポリペプチドに対する結合
活性を有する抗体遺伝子を選別することができる(McCa
fferty,J.ら、Nature 348:552-554(1990);Marks,J.
ら、Biotechnology 10:779-783(1992))。これらの抗体
の親和性はチェインシャフリング(chain shuffling)
により改善することもできる(Clackson,T.ら、Nature
352:624-628(1991))。
【0054】二つの抗原結合ドメインが存在する場合、
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。上述の抗体を、ポリペプチドを
発現するクローンを単離または同定するために用いて、
アフィニティークロマトグラフィーにより該ポリペプチ
ドを精製することができる。従って、とりわけtRNA
シンセターゼに対する抗体を、感染、とりわけ細菌感
染、特に上気道感染(例えば中耳炎、細菌性気管炎、急
性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下気道感染(例えば蓄膿症、
肺膿瘍)、心臓感染(例えば感染性心内膜炎)、消化器
感染(例えば分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍)、C
NS感染(例えば大脳膿瘍)、眼感染(例えば眼瞼炎、
結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔(preseptal)および眼
窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管感染(例えば副睾丸
炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候
群)、皮膚感染(例えば膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂
巣炎、創傷感染、細菌性筋炎)、骨および関節感染(例
えば敗血症性関節炎、骨髄炎)のごとき疾患の処置に用
いることができる。
各ドメインは「二特異性」抗体と称する異なるエピトー
プに対して指向される。上述の抗体を、ポリペプチドを
発現するクローンを単離または同定するために用いて、
アフィニティークロマトグラフィーにより該ポリペプチ
ドを精製することができる。従って、とりわけtRNA
シンセターゼに対する抗体を、感染、とりわけ細菌感
染、特に上気道感染(例えば中耳炎、細菌性気管炎、急
性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下気道感染(例えば蓄膿症、
肺膿瘍)、心臓感染(例えば感染性心内膜炎)、消化器
感染(例えば分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍)、C
NS感染(例えば大脳膿瘍)、眼感染(例えば眼瞼炎、
結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔(preseptal)および眼
窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管感染(例えば副睾丸
炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候
群)、皮膚感染(例えば膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂
巣炎、創傷感染、細菌性筋炎)、骨および関節感染(例
えば敗血症性関節炎、骨髄炎)のごとき疾患の処置に用
いることができる。
【0055】ポリペプチド変種は抗原的、エピトープ的
または免疫学的に等価な変種を包含し、本発明の特定の
態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明によりタンパク質またはポリペ
プチドに対して生起された場合、病原体および哺乳動物
宿主間での即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗
体により特異的に認識されるポリペプチドまたはその同
等物を包含する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な
誘導体」なる用語は、脊椎動物において抗体を生起させ
るのに適した処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳
動物宿主間での即時的な物理的相互作用を妨害するよう
に作用するペプチドまたはその等価物を包含する。
または免疫学的に等価な変種を包含し、本発明の特定の
態様である。本明細書で用いる「抗原的に等価な誘導
体」なる用語は、本発明によりタンパク質またはポリペ
プチドに対して生起された場合、病原体および哺乳動物
宿主間での即時的な物理的相互作用を妨害する特定の抗
体により特異的に認識されるポリペプチドまたはその同
等物を包含する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な
誘導体」なる用語は、脊椎動物において抗体を生起させ
るのに適した処方を用いた場合、抗体が病原および哺乳
動物宿主間での即時的な物理的相互作用を妨害するよう
に作用するペプチドまたはその等価物を包含する。
【0056】ポリペプチド、例えば抗原的、免疫学的に
等価な誘導体、またはそれらの融合タンパク質は、マウ
スまたは他の動物、例えばラットもしくはニワトリを免
疫するための抗原として使用できる。融合タンパク質は
ポリペプチドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱
合することにより、免疫原性キャリヤタンパク質、例え
ばウシ血清アルブミン(BSA)またはキーホール・リ
ムペット・ヘモシアニン(keyhole limpet haemocyani
n:KLH)に結合することができる。あるいはまた、
タンパク質もしくはポリペプチド、またはそれらに抗原
的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピー
を含む多重抗原ペプチドは、免疫原性を改良するための
十分な抗原性を有しているので、キャリヤを使用しなく
てすむ。
等価な誘導体、またはそれらの融合タンパク質は、マウ
スまたは他の動物、例えばラットもしくはニワトリを免
疫するための抗原として使用できる。融合タンパク質は
ポリペプチドに安定性を付与できる。抗原は、例えば抱
合することにより、免疫原性キャリヤタンパク質、例え
ばウシ血清アルブミン(BSA)またはキーホール・リ
ムペット・ヘモシアニン(keyhole limpet haemocyani
n:KLH)に結合することができる。あるいはまた、
タンパク質もしくはポリペプチド、またはそれらに抗原
的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重コピー
を含む多重抗原ペプチドは、免疫原性を改良するための
十分な抗原性を有しているので、キャリヤを使用しなく
てすむ。
【0057】抗体またはそれらの変種を、個体における
免疫原性を減じるために修飾するのが好ましい。例え
ば、個体がヒトである場合、抗体は最も好ましくは「ヒ
ト化」されており;ハイブリドーマ由来の抗体の相補性
決定領域がヒトモノクローナル抗体に移植されており、
例えばJones,P.ら、Nature 321:522-525(1986)または
Tempestら、Biotechnology 9:266-273(1991)に記載さ
れている。
免疫原性を減じるために修飾するのが好ましい。例え
ば、個体がヒトである場合、抗体は最も好ましくは「ヒ
ト化」されており;ハイブリドーマ由来の抗体の相補性
決定領域がヒトモノクローナル抗体に移植されており、
例えばJones,P.ら、Nature 321:522-525(1986)または
Tempestら、Biotechnology 9:266-273(1991)に記載さ
れている。
【0058】本発明ポリヌクレオチドを遺伝学的免疫に
おいて使用する場合、好ましくは、例えばプラスミドD
NAの筋肉への直接注射(Wolffら、Hum.Mol.Genet.1:3
63(1992);Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419(196
3))、特異的タンパク質キャリヤとのDNA複合体の
送達(Wuら、J.Biol.Chem.264:16985(1989))、リン
酸カルシウムとのDNA共沈(Benvenisty & Reshef、P
NAS 83:9551(1986))、種々の形態のリポソーム中へ
のDNA封入(Kanedaら、Science 243:375(1989))、微
粒子衝撃(Tangら、Nature 356:152(1992);Eisenbra
unら、DNA Cell Biol.12:791(1993))およびクローン
化レトロウイルスベクターを用いたインビボ感染(Seeg
erら、PNAS 81:5849(1984))のごとき適切な送達方法
を用いる。
おいて使用する場合、好ましくは、例えばプラスミドD
NAの筋肉への直接注射(Wolffら、Hum.Mol.Genet.1:3
63(1992);Manthorpeら、Hum.Gene Ther.4:419(196
3))、特異的タンパク質キャリヤとのDNA複合体の
送達(Wuら、J.Biol.Chem.264:16985(1989))、リン
酸カルシウムとのDNA共沈(Benvenisty & Reshef、P
NAS 83:9551(1986))、種々の形態のリポソーム中へ
のDNA封入(Kanedaら、Science 243:375(1989))、微
粒子衝撃(Tangら、Nature 356:152(1992);Eisenbra
unら、DNA Cell Biol.12:791(1993))およびクローン
化レトロウイルスベクターを用いたインビボ感染(Seeg
erら、PNAS 81:5849(1984))のごとき適切な送達方法
を用いる。
【0059】本発明のポリペプチドはまた、例えば細
胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然産
物の混合物中の、小型分子基質とリガンドとの結合を評
価するために用いることもできる。これらの基質および
リガンドは天然の基質およびリガンドでよく、または構
造上もしくは機能上の擬似物質でもよい。例えばColiga
nら、Current Protocols in Immunology 1(2):第5章(1
991)参照。
胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、および天然産
物の混合物中の、小型分子基質とリガンドとの結合を評
価するために用いることもできる。これらの基質および
リガンドは天然の基質およびリガンドでよく、または構
造上もしくは機能上の擬似物質でもよい。例えばColiga
nら、Current Protocols in Immunology 1(2):第5章(1
991)参照。
【0060】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明はまたtRNAシンセターゼポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドの作用を増強(アゴニスト)または阻
害(アンタゴニスト)する化合物を同定するための化合
物のスクリーニング方法をも提供する。
イおよび分子 本発明はまたtRNAシンセターゼポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドの作用を増強(アゴニスト)または阻
害(アンタゴニスト)する化合物を同定するための化合
物のスクリーニング方法をも提供する。
【0061】例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト
をスクリーニングするために、tRNAシンセターゼポ
リペプチドおよびかかるポリペプチドの標識基質または
リガンドを含んでなる合成反応混合物、膜、細胞包膜も
しくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、またはそ
れらのいずれかの調製物を、tRNAシンセターゼアゴ
ニストまたはアンタゴニストとなりうる候補分子の存在
下または不在下でインキュベーションする。候補分子が
tRNAシンセターゼポリペプチドにアゴナイズまたは
拮抗する能力は、標識リガンドの結合の低下またはかか
る基質からの生成物の生成低下に反映される。結合して
も影響を及ぼさない分子、すなわちtRNAシンセター
ゼの効果を誘起しない分子は、最も良好なアンタゴニス
トとなるであろう。結合性が良好で、基質からの生成物
の生成速度を高める分子はアゴニストである。基質から
の生成物の生成速度またはレベルはリポーターシステム
を用いることにより増強できる。この点に関して有用な
リポーターシステムは、生成物に転換される比色標識基
質、tRNAシンセターゼ活性の変化に応答するリポー
ター遺伝子、および当該分野で周知の結合アッセイを包
含するが、これらに限定するものではない。
をスクリーニングするために、tRNAシンセターゼポ
リペプチドおよびかかるポリペプチドの標識基質または
リガンドを含んでなる合成反応混合物、膜、細胞包膜も
しくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、またはそ
れらのいずれかの調製物を、tRNAシンセターゼアゴ
ニストまたはアンタゴニストとなりうる候補分子の存在
下または不在下でインキュベーションする。候補分子が
tRNAシンセターゼポリペプチドにアゴナイズまたは
拮抗する能力は、標識リガンドの結合の低下またはかか
る基質からの生成物の生成低下に反映される。結合して
も影響を及ぼさない分子、すなわちtRNAシンセター
ゼの効果を誘起しない分子は、最も良好なアンタゴニス
トとなるであろう。結合性が良好で、基質からの生成物
の生成速度を高める分子はアゴニストである。基質から
の生成物の生成速度またはレベルはリポーターシステム
を用いることにより増強できる。この点に関して有用な
リポーターシステムは、生成物に転換される比色標識基
質、tRNAシンセターゼ活性の変化に応答するリポー
ター遺伝子、および当該分野で周知の結合アッセイを包
含するが、これらに限定するものではない。
【0062】tRNAシンセターゼアンタゴニストのア
ッセイの他の例は競争アッセイであり、競争阻害アッセ
イに適した条件下で、tRNAシンセターゼおよび潜在
的なアンタゴニストをtRNAシンセターゼ結合分子、
組換えtRNAシンセターゼ結合分子、天然基質もしく
はリガンド、または基質もしくはリガンド擬似物質と混
合する。tRNAシンセターゼを例えば放射活性または
比色化合物により標識し、結合分子に結合した、または
生成物に変換したtRNAシンセターゼ分子の数を正確
に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価でき
る。
ッセイの他の例は競争アッセイであり、競争阻害アッセ
イに適した条件下で、tRNAシンセターゼおよび潜在
的なアンタゴニストをtRNAシンセターゼ結合分子、
組換えtRNAシンセターゼ結合分子、天然基質もしく
はリガンド、または基質もしくはリガンド擬似物質と混
合する。tRNAシンセターゼを例えば放射活性または
比色化合物により標識し、結合分子に結合した、または
生成物に変換したtRNAシンセターゼ分子の数を正確
に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価でき
る。
【0063】さらなる態様において、本発明は、本発明
の新規tRNAシンセターゼの相互作用を妨害する薬物
を同定するための薬物のスクリーニング方法を提供す
る。酵素により媒介される放射性標識アミノ酸のtRN
Aへの組み込みを、tRNAおよびATPの存在下、ア
ミノ酸−tRNAを放射性標識アミノ酸からのトリクロ
ロ酢酸沈殿放射活性として測定するアミノアシル化法に
より測定できる(HughesJ.、Mellows G.およびSoughton
S.、FEBSLetters 122:322-324(1980))。このように
本発明tRNAシンセターゼ阻害物質を対照と比較し
て、トリクロロ酢酸沈殿放射性活性の減少により検出で
きる。あるいはまた、PPiからの放射性標識ATPの
形成を測定する、部分PPi/ATP交換反応を触媒す
る新規tRNAシンセターゼを、新規tRNAシンセタ
ーゼ阻害物質を検出するために使用できる(Calender
R. & Berg P.、Biochemistry 5:1681-1690(1966))。
の新規tRNAシンセターゼの相互作用を妨害する薬物
を同定するための薬物のスクリーニング方法を提供す
る。酵素により媒介される放射性標識アミノ酸のtRN
Aへの組み込みを、tRNAおよびATPの存在下、ア
ミノ酸−tRNAを放射性標識アミノ酸からのトリクロ
ロ酢酸沈殿放射活性として測定するアミノアシル化法に
より測定できる(HughesJ.、Mellows G.およびSoughton
S.、FEBSLetters 122:322-324(1980))。このように
本発明tRNAシンセターゼ阻害物質を対照と比較し
て、トリクロロ酢酸沈殿放射性活性の減少により検出で
きる。あるいはまた、PPiからの放射性標識ATPの
形成を測定する、部分PPi/ATP交換反応を触媒す
る新規tRNAシンセターゼを、新規tRNAシンセタ
ーゼ阻害物質を検出するために使用できる(Calender
R. & Berg P.、Biochemistry 5:1681-1690(1966))。
【0064】潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリ
ペプチドに結合し、それによりその活性を阻害し、また
は消滅させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドお
よび抗体を包含する。潜在的アンタゴニストはまた、結
合分子の同一部位に結合する、密接に関連したタンパク
質または抗体のような小型有機分子、ペプチド、ポリペ
プチド、例えばtRNAシンセターゼ誘起活性を誘起し
ない結合分子であってもよく、そのことによりtRNA
シンセターゼを結合から排除して、tRNAシンセター
ゼの作用を妨げる。
ペプチドに結合し、それによりその活性を阻害し、また
は消滅させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドお
よび抗体を包含する。潜在的アンタゴニストはまた、結
合分子の同一部位に結合する、密接に関連したタンパク
質または抗体のような小型有機分子、ペプチド、ポリペ
プチド、例えばtRNAシンセターゼ誘起活性を誘起し
ない結合分子であってもよく、そのことによりtRNA
シンセターゼを結合から排除して、tRNAシンセター
ゼの作用を妨げる。
【0065】潜在的なアンタゴニストには、ポリペプチ
ドの結合部位に結合し、およびそれを占領し、それによ
り細胞性結合分子への結合を防御して、正常な生物学的
活性を防御する小型分子等がある。小型分子の例は、小
型有機分子、ペプチド、ペプチド様分子を包含するが、
これらに限定するものではない。その他の潜在的なアン
タゴニストはアンチセンス分子を包含する(これらの分
子についての記載に関してはOkano,J.,Neurochem.56:5
60(1991);Oligodeoxy-nucleotides as Antisense In
hibitors of Gene Expression,CRCプレス、ボッカ
ラートン、フロリダ州(1988)参照)。好ましい潜在的
アンタゴニストは、tRNAシンセターゼ関連化合物お
よびtRNAシンセターゼの変種を包含する。
ドの結合部位に結合し、およびそれを占領し、それによ
り細胞性結合分子への結合を防御して、正常な生物学的
活性を防御する小型分子等がある。小型分子の例は、小
型有機分子、ペプチド、ペプチド様分子を包含するが、
これらに限定するものではない。その他の潜在的なアン
タゴニストはアンチセンス分子を包含する(これらの分
子についての記載に関してはOkano,J.,Neurochem.56:5
60(1991);Oligodeoxy-nucleotides as Antisense In
hibitors of Gene Expression,CRCプレス、ボッカ
ラートン、フロリダ州(1988)参照)。好ましい潜在的
アンタゴニストは、tRNAシンセターゼ関連化合物お
よびtRNAシンセターゼの変種を包含する。
【0066】特定の態様において、本発明は、感染の続
発症に関与する、病因および哺乳動物宿主間の最初の物
理的相互作用を妨害するための本発明ポリペプチド、ポ
リヌクレオチドまたは阻害物質の使用を提供する。とり
わけ本発明の分子を、i)細菌とりわけグラム陽性細菌
の内在デバイス上の哺乳動物細胞外マトリックスタンパ
ク質、または創傷の細胞外マトリックスタンパク質への
付着の防御;ii)例えば哺乳動物チロシンキナーゼのリ
ン酸化の開始により、哺乳動物細胞侵入を媒介するtR
NAシンセターゼタンパク質の阻害(Rosenshineら、Inf
ect.Immun.60:2211(1992));iii)哺乳動物細胞外マト
リックスタンパク質と組織損傷を媒介する細菌性tRN
Aシンセターゼタンパク質との間の細菌付着の阻害;i
v)内在デバイスの埋め込みまたはその他の外科的手技
以外により開始した感染における病因の通常の進行の防
御に使用することができる。
発症に関与する、病因および哺乳動物宿主間の最初の物
理的相互作用を妨害するための本発明ポリペプチド、ポ
リヌクレオチドまたは阻害物質の使用を提供する。とり
わけ本発明の分子を、i)細菌とりわけグラム陽性細菌
の内在デバイス上の哺乳動物細胞外マトリックスタンパ
ク質、または創傷の細胞外マトリックスタンパク質への
付着の防御;ii)例えば哺乳動物チロシンキナーゼのリ
ン酸化の開始により、哺乳動物細胞侵入を媒介するtR
NAシンセターゼタンパク質の阻害(Rosenshineら、Inf
ect.Immun.60:2211(1992));iii)哺乳動物細胞外マト
リックスタンパク質と組織損傷を媒介する細菌性tRN
Aシンセターゼタンパク質との間の細菌付着の阻害;i
v)内在デバイスの埋め込みまたはその他の外科的手技
以外により開始した感染における病因の通常の進行の防
御に使用することができる。
【0067】本明細書で提供する各々のDNA配列は抗
細菌化合物の発見および開発に用いることができる。発
現すると、コードされたタンパク質は、抗菌薬物のスク
リーニングのための目的物質として用いることができ
る。さらに、コードされたタンパク質もしくはShine-De
lgarnoまたはその他の個々のmRNAの翻訳容易化配列
のアミノ末端領域をコードするDNA配列を、目的のコ
ーディング配列の発現を調節するアンチセンス配列を構
築するために用いることができる。
細菌化合物の発見および開発に用いることができる。発
現すると、コードされたタンパク質は、抗菌薬物のスク
リーニングのための目的物質として用いることができ
る。さらに、コードされたタンパク質もしくはShine-De
lgarnoまたはその他の個々のmRNAの翻訳容易化配列
のアミノ末端領域をコードするDNA配列を、目的のコ
ーディング配列の発現を調節するアンチセンス配列を構
築するために用いることができる。
【0068】アンタゴニストおよびアゴニストは、疾
患、例えば、上気道感染(例えば中耳炎、細菌性気管
炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下気道感染(例えば蓄
膿症、肺膿瘍)、心臓感染(例えば感染性心内膜炎)、
消化器感染(例えば分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿
瘍)、CNS感染(例えば大脳膿瘍)、眼感染(例えば
眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔(presepta
l)および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管感染(例
えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショ
ック症候群)、皮膚感染(例えば膿痂疹、毛嚢炎、皮膚
膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎)、骨および関節
感染(例えば敗血症性関節炎、骨髄炎)の阻止に用いる
ことができる。
患、例えば、上気道感染(例えば中耳炎、細菌性気管
炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎)、下気道感染(例えば蓄
膿症、肺膿瘍)、心臓感染(例えば感染性心内膜炎)、
消化器感染(例えば分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿
瘍)、CNS感染(例えば大脳膿瘍)、眼感染(例えば
眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔(presepta
l)および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管感染(例
えば副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショ
ック症候群)、皮膚感染(例えば膿痂疹、毛嚢炎、皮膚
膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎)、骨および関節
感染(例えば敗血症性関節炎、骨髄炎)の阻止に用いる
ことができる。
【0069】ワクチン 本発明の別の態様は、個体とりわけ哺乳動物における免
疫学的応答を誘起する方法に関し、その方法には、tR
NAシンセターゼ、またはそれらのフラグメントもしく
は変種を個体に接種し、該個体を感染とりわけ細菌感
染、特にスタフィロコッカス・アウレウス感染から防御
する抗体を十分に産生させることを含む。本発明のまた
別の態様は、個体における免疫学的応答を誘起する方法
に関し、その方法は、遺伝子治療により、インビボにて
tRNAシンセターゼまたはそれらのフラグメントもし
くは変種を発現するために、tRNAシンセターゼまた
はそれらのフラグメントもしくは変種をコードする遺伝
子を送達し、免疫学的応答を誘起させて、該個体を疾患
から保護する抗体を産生することを含む。
疫学的応答を誘起する方法に関し、その方法には、tR
NAシンセターゼ、またはそれらのフラグメントもしく
は変種を個体に接種し、該個体を感染とりわけ細菌感
染、特にスタフィロコッカス・アウレウス感染から防御
する抗体を十分に産生させることを含む。本発明のまた
別の態様は、個体における免疫学的応答を誘起する方法
に関し、その方法は、遺伝子治療により、インビボにて
tRNAシンセターゼまたはそれらのフラグメントもし
くは変種を発現するために、tRNAシンセターゼまた
はそれらのフラグメントもしくは変種をコードする遺伝
子を送達し、免疫学的応答を誘起させて、該個体を疾患
から保護する抗体を産生することを含む。
【0070】本発明のさらなる態様は免疫学的組成物に
関し、該組成物は、免疫学的応答を体内に誘起できる、
あるいは誘起している宿主に導入した場合、宿主中でt
RNAシンセターゼまたはそれによりコードされるタン
パク質に対する免疫学的応答を誘起するものであり、該
組成物は組換えtRNAシンセターゼ、またはそれによ
りコードされたタンパク質を含んでなり、また該tRN
Aシンセターゼの抗原をコードし発現するDNA、また
はそれによりコードされるタンパク質を含んでなる。
関し、該組成物は、免疫学的応答を体内に誘起できる、
あるいは誘起している宿主に導入した場合、宿主中でt
RNAシンセターゼまたはそれによりコードされるタン
パク質に対する免疫学的応答を誘起するものであり、該
組成物は組換えtRNAシンセターゼ、またはそれによ
りコードされたタンパク質を含んでなり、また該tRN
Aシンセターゼの抗原をコードし発現するDNA、また
はそれによりコードされるタンパク質を含んでなる。
【0071】tRNAシンセターゼまたはそれらのフラ
グメントは、それ自身は抗体を産生しないが、第1のタ
ンパク質を安定化し、免疫原性があり防御特性を有する
融合タンパク質を形成することのできる補タンパク質
(co-protein)と融合できる。このように融合した組換
えタンパク質には、さらに抗原補タンパク質、例えばグ
ルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)または
ベーターガラクトシダーゼ、タンパク質を可溶化し、そ
れらの生成および精製を容易にする比較的大型の補タン
パク質等が含まれるのがより好ましい。さらに、補タン
パク質は免疫系において一般的な刺激を提供するという
意味で、アジュバントとして作用しうる。補タンパク質
は第1のタンパク質のアミノまたはカルボキシル末端の
いずれに結合していてもよい。
グメントは、それ自身は抗体を産生しないが、第1のタ
ンパク質を安定化し、免疫原性があり防御特性を有する
融合タンパク質を形成することのできる補タンパク質
(co-protein)と融合できる。このように融合した組換
えタンパク質には、さらに抗原補タンパク質、例えばグ
ルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)または
ベーターガラクトシダーゼ、タンパク質を可溶化し、そ
れらの生成および精製を容易にする比較的大型の補タン
パク質等が含まれるのがより好ましい。さらに、補タン
パク質は免疫系において一般的な刺激を提供するという
意味で、アジュバントとして作用しうる。補タンパク質
は第1のタンパク質のアミノまたはカルボキシル末端の
いずれに結合していてもよい。
【0072】本発明は、本発明ポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドおよび免疫刺激DNA配列を含んでなる組
成物、とりわけワクチン組成物ならびに方法を提供し、
免疫刺激DNA配列はSato Y.ら、Science 273:352(199
6)に記載されている。また、本発明は、スタフィロコッ
カス・アウレウスに感染した動物モデルにおける、この
ような遺伝的免疫化実験で用いるDNA構築物の、細菌
細胞表面タンパク質の非可変領域をコードすることが示
されている記載されたポリヌクレオチドまたはとりわけ
それらのフラグメントを用いる方法を提供し、これらは
とりわけ、予防的または治療的免疫反応を生じることが
できるタンパク質エピトープを同定するのに有用であ
る。このアプローチは、哺乳動物、とりわけヒトにおけ
る細菌感染とりわけスタフィロコッカス・アウレウス感
染の予防薬または治療的処置の開発のために、感染に抵
抗し、または一掃するのに成功した動物の必須器官から
特に価値あるモノクローナル抗体を引き続き調製するこ
とを可能にすると考えられる。
ヌクレオチドおよび免疫刺激DNA配列を含んでなる組
成物、とりわけワクチン組成物ならびに方法を提供し、
免疫刺激DNA配列はSato Y.ら、Science 273:352(199
6)に記載されている。また、本発明は、スタフィロコッ
カス・アウレウスに感染した動物モデルにおける、この
ような遺伝的免疫化実験で用いるDNA構築物の、細菌
細胞表面タンパク質の非可変領域をコードすることが示
されている記載されたポリヌクレオチドまたはとりわけ
それらのフラグメントを用いる方法を提供し、これらは
とりわけ、予防的または治療的免疫反応を生じることが
できるタンパク質エピトープを同定するのに有用であ
る。このアプローチは、哺乳動物、とりわけヒトにおけ
る細菌感染とりわけスタフィロコッカス・アウレウス感
染の予防薬または治療的処置の開発のために、感染に抵
抗し、または一掃するのに成功した動物の必須器官から
特に価値あるモノクローナル抗体を引き続き調製するこ
とを可能にすると考えられる。
【0073】ポリペプチドは、例えば細菌の損傷組織へ
の付着を阻害することにより、細菌の侵入に対して防御
的な特異的抗体を産生するための宿主のワクチン化のた
めの抗原として使用することができる。組織損傷の例
は、例えば機械的、化学的もしくは熱損傷により、また
は内在デバイスの埋め込みにより、引き起こされた皮膚
または結合組織の創傷、または粘膜例えば口、乳腺、尿
道または膣の創傷を包含する。
の付着を阻害することにより、細菌の侵入に対して防御
的な特異的抗体を産生するための宿主のワクチン化のた
めの抗原として使用することができる。組織損傷の例
は、例えば機械的、化学的もしくは熱損傷により、また
は内在デバイスの埋め込みにより、引き起こされた皮膚
または結合組織の創傷、または粘膜例えば口、乳腺、尿
道または膣の創傷を包含する。
【0074】本発明にはまた免疫原性組換えタンパク質
を適切な担体と共に含むワクチン処方を包含する。タン
パク質は胃で分解されるので、非経口的例えば皮下、筋
肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好ましい。
非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝液、静細菌
剤および個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶質
を含有していてもよい水性または非水性滅菌注射液;お
よび懸濁化剤または増粘剤を含有していてもよい水性ま
たは非水性滅菌懸濁液を包含する。処方は単位投与また
は多回投与用容器、例えば密封したアンプルおよびバイ
アルに入れてよく、凍結乾燥状態で保存し、使用直前に
滅菌液体担体の添加のみを必要とする。ワクチン処方は
処方の免疫原性を高めるアジュバント系をも含めること
ができ、例えば水中油系または当該分野で周知のその他
の系がある。投与量はワクチンの特異的活性に依存し、
通常の実験法により容易に決定できる。
を適切な担体と共に含むワクチン処方を包含する。タン
パク質は胃で分解されるので、非経口的例えば皮下、筋
肉内、静脈内または皮膚内等に投与するのが好ましい。
非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、緩衝液、静細菌
剤および個体の体液、好ましくは血液と等張にする溶質
を含有していてもよい水性または非水性滅菌注射液;お
よび懸濁化剤または増粘剤を含有していてもよい水性ま
たは非水性滅菌懸濁液を包含する。処方は単位投与また
は多回投与用容器、例えば密封したアンプルおよびバイ
アルに入れてよく、凍結乾燥状態で保存し、使用直前に
滅菌液体担体の添加のみを必要とする。ワクチン処方は
処方の免疫原性を高めるアジュバント系をも含めること
ができ、例えば水中油系または当該分野で周知のその他
の系がある。投与量はワクチンの特異的活性に依存し、
通常の実験法により容易に決定できる。
【0075】本発明は特定のtRNAシンセターゼに関
して記載したが、これは天然に存在するタンパク質およ
び、実質的に組換えタンパク質の免疫原特性に影響しな
い付加、欠失または置換を施した類似のタンパク質のフ
ラグメントを包含することが理解されよう。
して記載したが、これは天然に存在するタンパク質およ
び、実質的に組換えタンパク質の免疫原特性に影響しな
い付加、欠失または置換を施した類似のタンパク質のフ
ラグメントを包含することが理解されよう。
【0076】組成物、キットおよび投与 本発明はまた上述のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。本発明のポリペプチドは未滅
菌もしくは滅菌担体と、または細胞、組織もしくは生物
に用いられる担体、例えば対象への投与に適した医薬的
担体と組み合わせて用いることができる。このような組
成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明
ポリペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦
形剤を含む。このような担体にはセイライン、緩衝化セ
イライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ールおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限
定するものではない。処方は投与法に適したものにすべ
きである。本発明はさらに、本発明の前述の組成物成分
を1またはそれ以上を充填した1またはそれ以上の容器
を含む診断用および医薬用パックおよびキットにも関す
る。
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを含ん
でなる組成物にも関する。本発明のポリペプチドは未滅
菌もしくは滅菌担体と、または細胞、組織もしくは生物
に用いられる担体、例えば対象への投与に適した医薬的
担体と組み合わせて用いることができる。このような組
成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明
ポリペプチド、および医薬的に許容できる担体または賦
形剤を含む。このような担体にはセイライン、緩衝化セ
イライン、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ールおよびそれらの組み合わせ等があるが、これらに限
定するものではない。処方は投与法に適したものにすべ
きである。本発明はさらに、本発明の前述の組成物成分
を1またはそれ以上を充填した1またはそれ以上の容器
を含む診断用および医薬用パックおよびキットにも関す
る。
【0077】本発明のポリペプチドおよびその他の化合
物は、単独でまたは治療用化合物等のその他の化合物と
組み合わせて用いることができる。医薬組成物は任意の
有効な、利便的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、
経肛門、経膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔
内、または皮膚内の経路で投与できる。 治療におい
て、または予防として、活性物質を注射用組成物とし
て、例えば、好ましくは等張の、滅菌水性分散物として
個体に投与できる。
物は、単独でまたは治療用化合物等のその他の化合物と
組み合わせて用いることができる。医薬組成物は任意の
有効な、利便的な方法、例えば、とりわけ局所、経口、
経肛門、経膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔
内、または皮膚内の経路で投与できる。 治療におい
て、または予防として、活性物質を注射用組成物とし
て、例えば、好ましくは等張の、滅菌水性分散物として
個体に投与できる。
【0078】また別に、組成物は局所適用用、例えば軟
膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳液、
洗口剤、染み込ませた包帯および縫合用の糸、ならびに
エアロゾル等の形態に処方でき、適当な慣用的な添加
物、例えば軟膏およびクリーム中に、保存料、薬物の浸
透を補助する溶媒および軟化剤を含有してもよい。この
ような局所用処方はまた、適合した慣用的な担体、例え
ばクリームまたは軟膏基剤、およびローションにはエタ
ノールまたはオレイルアルコールを含有してもよい。こ
のような担体は処方の約1重量%から約98重量%でよ
く;より通常的には処方の約80重量%までとする。
膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼液、点耳液、
洗口剤、染み込ませた包帯および縫合用の糸、ならびに
エアロゾル等の形態に処方でき、適当な慣用的な添加
物、例えば軟膏およびクリーム中に、保存料、薬物の浸
透を補助する溶媒および軟化剤を含有してもよい。この
ような局所用処方はまた、適合した慣用的な担体、例え
ばクリームまたは軟膏基剤、およびローションにはエタ
ノールまたはオレイルアルコールを含有してもよい。こ
のような担体は処方の約1重量%から約98重量%でよ
く;より通常的には処方の約80重量%までとする。
【0079】哺乳動物とりわけヒトに投与するために、
有効成分の1日あたりの投与量は、0.01mg/kg
から10mg/kgであり、典型的には約1mg/kg
である。医者はいずれの場合にも、個体に最も適した実
際の投与量を決定し、年齢、体重および特に個体の応答
に応じて変化させる。上述の投与量は、平均的なケース
の模範例である。もちろん、高量および低量の範囲が適
合する個々の例もあり、これらは本発明の範囲内であ
る。内在デバイスには外科的インプラント、プロテーゼ
デバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体に導
入し、長時間その位置に存在するデバイスである。この
ようなデバイスは、例えば人工関節、心臓弁、ペースメ
ーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャン
ト、尿カテーテル、持続的外来可能腹膜透析カテーテル
を包含する。
有効成分の1日あたりの投与量は、0.01mg/kg
から10mg/kgであり、典型的には約1mg/kg
である。医者はいずれの場合にも、個体に最も適した実
際の投与量を決定し、年齢、体重および特に個体の応答
に応じて変化させる。上述の投与量は、平均的なケース
の模範例である。もちろん、高量および低量の範囲が適
合する個々の例もあり、これらは本発明の範囲内であ
る。内在デバイスには外科的インプラント、プロテーゼ
デバイスおよびカテーテル等があり、即ち個体の体に導
入し、長時間その位置に存在するデバイスである。この
ようなデバイスは、例えば人工関節、心臓弁、ペースメ
ーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャン
ト、尿カテーテル、持続的外来可能腹膜透析カテーテル
を包含する。
【0080】本発明組成物を注射により投与すると、内
在デバイスの挿入の直前に、関連する細菌に対する全身
的な効果を得ることができる。手術後、デバイスが体内
に在る時間中、処置を続けてよい。さらに、任意の外科
的手技のために手術中用カバーを広げて、細菌性創傷感
染、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスの創傷感
染を防御するために用いることができる。多くの整形外
科医は、プロテーゼ関節を有するヒトは、菌血症を生じ
得る歯科的処置の前に、抗生物質予防法を考慮されるべ
きであると考える。遅延性の重篤な感染は、時々プロテ
ーゼ関節を失うに至る深刻な合併症であり、有意性のあ
る羅病率および死亡率を伴う。従って、この場合、予防
的な抗生物質の代わりに、活性物質の用途を拡張するこ
とが可能である。
在デバイスの挿入の直前に、関連する細菌に対する全身
的な効果を得ることができる。手術後、デバイスが体内
に在る時間中、処置を続けてよい。さらに、任意の外科
的手技のために手術中用カバーを広げて、細菌性創傷感
染、とりわけスタフィロコッカス・アウレウスの創傷感
染を防御するために用いることができる。多くの整形外
科医は、プロテーゼ関節を有するヒトは、菌血症を生じ
得る歯科的処置の前に、抗生物質予防法を考慮されるべ
きであると考える。遅延性の重篤な感染は、時々プロテ
ーゼ関節を失うに至る深刻な合併症であり、有意性のあ
る羅病率および死亡率を伴う。従って、この場合、予防
的な抗生物質の代わりに、活性物質の用途を拡張するこ
とが可能である。
【0081】上述の治療に加え、本発明の組成物は一般
的に創傷の治療薬として使用でき、創傷組織に曝露した
マトリックスタンパク質に細菌が付着するのを防ぎ、歯
科治療において抗生物質の予防法に代わって、またはそ
れと組み合わせて、予防的に使用できる。あるいはま
た、本発明の組成物は、挿入直前に内在デバイスを浸す
ために使用できる。有効成分は創傷または内在デバイス
を浸すために1μg/mlから10mg/mlの濃度で
あるのが好ましい。
的に創傷の治療薬として使用でき、創傷組織に曝露した
マトリックスタンパク質に細菌が付着するのを防ぎ、歯
科治療において抗生物質の予防法に代わって、またはそ
れと組み合わせて、予防的に使用できる。あるいはま
た、本発明の組成物は、挿入直前に内在デバイスを浸す
ために使用できる。有効成分は創傷または内在デバイス
を浸すために1μg/mlから10mg/mlの濃度で
あるのが好ましい。
【0082】便利には、ワクチン組成物を注射可能な形
態にする。慣用的なアジュバントは免疫反応を高めるた
めに用いることができる。ワクチン化に適した単位投与
量は、抗原0.5〜5μg/kgであり、このような投
与量は1〜3週間隔で1〜3回投与するのが好ましい。
提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適切な個
体への投与を妨げるような、不利な毒性効果は観察され
ない。上述の抗体もまたtRNAシンセターゼタンパク
質を含有する細菌の存在を検出するための診断試薬とし
て使用できる。
態にする。慣用的なアジュバントは免疫反応を高めるた
めに用いることができる。ワクチン化に適した単位投与
量は、抗原0.5〜5μg/kgであり、このような投
与量は1〜3週間隔で1〜3回投与するのが好ましい。
提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適切な個
体への投与を妨げるような、不利な毒性効果は観察され
ない。上述の抗体もまたtRNAシンセターゼタンパク
質を含有する細菌の存在を検出するための診断試薬とし
て使用できる。
【0083】(実施例)以下の実施例は、詳細に記載し
たこと以外は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を
用いて実施する。実施例は説明のためにのみ示すもの
で、本発明を限定するものではない。
たこと以外は、当業者に周知で通常的な標準的な技法を
用いて実施する。実施例は説明のためにのみ示すもの
で、本発明を限定するものではない。
【0084】実施例1:ライブラリーの作製 配列番号:1に示すDNA配列を有するポリヌクレオチ
ドはイー・コリにおけるスタフィロコッカス・アウレウ
スの染色体DNAのクローンのライブラリーより入手し
た。重複するスタフィロコッカス・アウレウスのDNA
を含有する2個またはそれ以上のクローンからの配列決
定データを、配列番号:1に示す連続したDNA配列を
構築するために使用した場合もある。ライブラリーは通
常の方法、例えば以下の方法1および2により作製でき
る。全細胞DNAは、スタフィロコッカス・アウレウス
WCUH29より、標準法に準じて単離し、二つの方法
のどちらかによりサイズ分画する。
ドはイー・コリにおけるスタフィロコッカス・アウレウ
スの染色体DNAのクローンのライブラリーより入手し
た。重複するスタフィロコッカス・アウレウスのDNA
を含有する2個またはそれ以上のクローンからの配列決
定データを、配列番号:1に示す連続したDNA配列を
構築するために使用した場合もある。ライブラリーは通
常の方法、例えば以下の方法1および2により作製でき
る。全細胞DNAは、スタフィロコッカス・アウレウス
WCUH29より、標準法に準じて単離し、二つの方法
のどちらかによりサイズ分画する。
【0085】方法1 標準法によりサイズ分画するために、全細胞DNAをニ
ードルに通して機械的に剪断する。11kbpまでの大
きさのDNAフラグメントを、エキソヌクレアーゼおよ
びDNAポリメラーゼで処理することにより、平滑末端
化し、EcoRIリンカーを加える。フラグメントを、
EcoRIで切断したベクターラムダZapIIに連結
し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、パ
ッケージングしたライブラリーでイー・コリを感染させ
る。ライブラリーは標準法により増幅する。
ードルに通して機械的に剪断する。11kbpまでの大
きさのDNAフラグメントを、エキソヌクレアーゼおよ
びDNAポリメラーゼで処理することにより、平滑末端
化し、EcoRIリンカーを加える。フラグメントを、
EcoRIで切断したベクターラムダZapIIに連結
し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、パ
ッケージングしたライブラリーでイー・コリを感染させ
る。ライブラリーは標準法により増幅する。
【0086】方法2 全細胞DNAは、ライブラリーベクター(例えば、Rs
aI、PalI、AluI、Bshl235I)にクロ
ーニングするための一連のフラグメントを生じるのにふ
さわしい1つの制限酵素または制限酵素を組み合わせた
もので部分加水分解し、このようなフラグメントを標準
法によりサイズ分画する。EcoRIリンカーはDNA
およびフラグメントに連結し、次いでEcoRIで切断
したベクターラムダZapIIに連結し、標準法により
ライブラリーをパッケージングし、パッケージングした
ライブラリーでイー・コリを感染させる。ライブラリー
を標準法により増幅する。
aI、PalI、AluI、Bshl235I)にクロ
ーニングするための一連のフラグメントを生じるのにふ
さわしい1つの制限酵素または制限酵素を組み合わせた
もので部分加水分解し、このようなフラグメントを標準
法によりサイズ分画する。EcoRIリンカーはDNA
およびフラグメントに連結し、次いでEcoRIで切断
したベクターラムダZapIIに連結し、標準法により
ライブラリーをパッケージングし、パッケージングした
ライブラリーでイー・コリを感染させる。ライブラリー
を標準法により増幅する。
【0087】実施例2:スレオニルtRNAシンセター
ゼ(TRS)活性の測定 酵素はtRNAThrのアミノアシル化を触媒し、これ
は2段階メカニズムで進行する。最初の段階では、AT
PおよびL−スレオニンの特異的結合および反応の結
果、安定な酵素:スレオニルアデニル化複合体を形成す
る。続いて、酵素結合tRNAThrの3'末端アデノ
シンがアミノアシルアデニレートと反応し、tRNAの
エステル化、およびAMPの放出を導く。これらの段階
を以下にまとめる;
ゼ(TRS)活性の測定 酵素はtRNAThrのアミノアシル化を触媒し、これ
は2段階メカニズムで進行する。最初の段階では、AT
PおよびL−スレオニンの特異的結合および反応の結
果、安定な酵素:スレオニルアデニル化複合体を形成す
る。続いて、酵素結合tRNAThrの3'末端アデノ
シンがアミノアシルアデニレートと反応し、tRNAの
エステル化、およびAMPの放出を導く。これらの段階
を以下にまとめる;
【0088】a) L-Thr+ATP.Mg+TRS⇒
TRS:Thr-AMP+PPi.Mg b) TRS:Thr-AMP+tRNAThr⇒TRS
+Thr-tRNAThr+AMP 多くの方法で、酵素を特徴づけ、またはその活性の特異
的阻害物質を同定をするために、この反応をアッセイす
ることができる:Thr-tRNAThrの形成の測定
は、放射性標識スレオニンを用いて特異的に決定でき、
および沈殿/ろ過技法(例えば冷トリクロロ酢酸1,
2中)を用いてThr-tRNAから遊離のスレオニン
を分離できる。
TRS:Thr-AMP+PPi.Mg b) TRS:Thr-AMP+tRNAThr⇒TRS
+Thr-tRNAThr+AMP 多くの方法で、酵素を特徴づけ、またはその活性の特異
的阻害物質を同定をするために、この反応をアッセイす
ることができる:Thr-tRNAThrの形成の測定
は、放射性標識スレオニンを用いて特異的に決定でき、
および沈殿/ろ過技法(例えば冷トリクロロ酢酸1,
2中)を用いてThr-tRNAから遊離のスレオニン
を分離できる。
【0089】全アシル化反応もまた、tRNAアシル化
に対して化学量論的比率で生成されるPPiまたはAM
Pのどちらかの生成を分析することにより測定できる。
これは、例えば比色3;または過剰の無機ピロホスファ
ターゼを添加した後のPiの酵素結合4測定を用いる、
または直接的にAMPもしくはPPi生成5を測定する
酵素結合アッセイを用いる等の多くの方法により達成で
きる。部分反応(a)は、反応のこの部分の各段階は自
由に可逆的であるので、ATPおよびPPi間の放射性
標識アイソトープ交換によりアッセイできる。これは典
型的には、全アシル化反応(a+b)よりも約20倍高
いkcat有し、ATPからPPiを分離するクロマト
グラフィーの原理を用いて(すなわち活性炭1,2を用
いて)容易に測定される。
に対して化学量論的比率で生成されるPPiまたはAM
Pのどちらかの生成を分析することにより測定できる。
これは、例えば比色3;または過剰の無機ピロホスファ
ターゼを添加した後のPiの酵素結合4測定を用いる、
または直接的にAMPもしくはPPi生成5を測定する
酵素結合アッセイを用いる等の多くの方法により達成で
きる。部分反応(a)は、反応のこの部分の各段階は自
由に可逆的であるので、ATPおよびPPi間の放射性
標識アイソトープ交換によりアッセイできる。これは典
型的には、全アシル化反応(a+b)よりも約20倍高
いkcat有し、ATPからPPiを分離するクロマト
グラフィーの原理を用いて(すなわち活性炭1,2を用
いて)容易に測定される。
【0090】TRSへのリガンド結合 基質のターンオーバーを触媒する酵素に依存しない実験
において、リガンドのTRSとの相互作用を決定するこ
とも可能である。この型の実験は、多くの方法で実施で
きる:酵素固有の蛍光へのリガンド結合の影響(例えば
トリプトファン)。天然のリガンドかまたは阻害物質の
結合は、酵素の立体配座を変化させ、それは酵素の蛍光
を変化させる。このことを利用して、ストップトフロー
蛍光装置(stopped-flow fluorescence equipment)を
用いて、結合を表す顕微鏡的速度定数を決定することが
できる。別法として、定常状態蛍光滴定法(steady-sta
te fluorescence titration methods)は、酵素阻害実
験により評価されるのと同一の方法で正味の解離定数を
得ることができる。
において、リガンドのTRSとの相互作用を決定するこ
とも可能である。この型の実験は、多くの方法で実施で
きる:酵素固有の蛍光へのリガンド結合の影響(例えば
トリプトファン)。天然のリガンドかまたは阻害物質の
結合は、酵素の立体配座を変化させ、それは酵素の蛍光
を変化させる。このことを利用して、ストップトフロー
蛍光装置(stopped-flow fluorescence equipment)を
用いて、結合を表す顕微鏡的速度定数を決定することが
できる。別法として、定常状態蛍光滴定法(steady-sta
te fluorescence titration methods)は、酵素阻害実
験により評価されるのと同一の方法で正味の解離定数を
得ることができる。
【0091】リガンドのスペクトル効果。リガンド自身
が蛍光性であるかまたは酵素トリプトファン蛍光と重複
する発色団を有する場合、結合はリガンド蛍光特性(例
えば強度、寿命または分極)における変化、または酵素
トリプトファンとの蛍光共鳴エネルギー転移により検出
できる。リガンドは阻害物質であるか、または天然リガ
ンドの変種である(すなわち蛍光ATP誘導体または発
蛍光団で標識したtRNAThr)。 酵素:リガンド複合体の熱分析。熱量測定法(例えば等
温熱量測定、示差スキャンニング熱量測定)を用いる
と、温度変化または、リガンド結合を示し、したがって
リガンド結合を特徴づけることができるTRSの安定性
のシフトの検出が可能になる。
が蛍光性であるかまたは酵素トリプトファン蛍光と重複
する発色団を有する場合、結合はリガンド蛍光特性(例
えば強度、寿命または分極)における変化、または酵素
トリプトファンとの蛍光共鳴エネルギー転移により検出
できる。リガンドは阻害物質であるか、または天然リガ
ンドの変種である(すなわち蛍光ATP誘導体または発
蛍光団で標識したtRNAThr)。 酵素:リガンド複合体の熱分析。熱量測定法(例えば等
温熱量測定、示差スキャンニング熱量測定)を用いる
と、温度変化または、リガンド結合を示し、したがって
リガンド結合を特徴づけることができるTRSの安定性
のシフトの検出が可能になる。
【0092】文献 1.Calender & Berg、Biochemistry5:1681-1690(196
6) 2.Toth,M.J. & Schimmel,P.、J.Biol.Chem.265:1000-
1004(1990) 3.Hoenig、J.Biochem.Biophys.Meth.19:249-252(198
9) 4.Webb,T.M.、Anal.Biochem.218:449-454(1994) 5.Sigma Chemicals Catalogue(1986)
6) 2.Toth,M.J. & Schimmel,P.、J.Biol.Chem.265:1000-
1004(1990) 3.Hoenig、J.Biochem.Biophys.Meth.19:249-252(198
9) 4.Webb,T.M.、Anal.Biochem.218:449-454(1994) 5.Sigma Chemicals Catalogue(1986)
【0093】実施例3:TRS活性についてのアミノア
シル化アッセイ イー・コリにて過剰発現した精製スタフィロコッカス・
アウレウスのTRSを用いるか、またはTRSを過剰発
現したイー・コリからの粗細胞溶解物を用いて、アッセ
イを実施する。後者は通常、全タンパク質の約10%を
TRSとして含有する。酵素は、液体窒素中急速冷凍し
た後、50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.8)、1
0mM MgCl2および10mM β−メルカプトエタ
ノール中−70℃で保存する。酵素サンプルの活性を決
定する実験では、これらの貯蔵物を50mMトリスpH
7.8、10mM MgCl2、1mMジチオスレイトー
ル中で広範に(100倍から10000倍)希釈し、ア
ッセイ前に氷上で貯蔵する。
シル化アッセイ イー・コリにて過剰発現した精製スタフィロコッカス・
アウレウスのTRSを用いるか、またはTRSを過剰発
現したイー・コリからの粗細胞溶解物を用いて、アッセ
イを実施する。後者は通常、全タンパク質の約10%を
TRSとして含有する。酵素は、液体窒素中急速冷凍し
た後、50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.8)、1
0mM MgCl2および10mM β−メルカプトエタ
ノール中−70℃で保存する。酵素サンプルの活性を決
定する実験では、これらの貯蔵物を50mMトリスpH
7.8、10mM MgCl2、1mMジチオスレイトー
ル中で広範に(100倍から10000倍)希釈し、ア
ッセイ前に氷上で貯蔵する。
【0094】アッセイ方法は以下のとおりである;上述
のとおり調製し、希釈した酵素50mlを、0.25μ
Ci L−[U−14C]−スレオニン(アメルシャム・
インターナショナル)、4mg/mlイー・コリMRE
600混合tRNA(ベーリンガー・マンハイムよ
り)、5mM ATP、15mM MgSO4、3mM
DTT、75mM KClおよび50mM トリス−塩酸
pH7.8をからなる反応混合物(100ml)と混合
する。他に記載しないかぎり、全ての試薬はシグマ・ケ
ミカル・カンパニー・リミテッドより入手した。濃度は
最終反応混合物での濃度である。酵素を添加して反応を
開始した後、アッセイサンプルを37℃でインキュベー
トし、所望時間、2検体ずつ(50μl)取り出し、7
%トリクロロ酢酸(100μl)で不活性化し、氷上で
30分放置する。パッカードフィルターメート196セ
ルハーベスト[パッカード・インストラメント・リミテ
ッド]を用いてグラスファイバーフィルター上で沈殿物
を回収し、フィルターを7%トリクロロ酢酸およびエタ
ノールで順次洗浄する。フィルターを70℃で1時間乾
燥し、放射活性のレベルをシンチレーションカウンティ
ング(パッカード・トップカウント)により測定する。
のとおり調製し、希釈した酵素50mlを、0.25μ
Ci L−[U−14C]−スレオニン(アメルシャム・
インターナショナル)、4mg/mlイー・コリMRE
600混合tRNA(ベーリンガー・マンハイムよ
り)、5mM ATP、15mM MgSO4、3mM
DTT、75mM KClおよび50mM トリス−塩酸
pH7.8をからなる反応混合物(100ml)と混合
する。他に記載しないかぎり、全ての試薬はシグマ・ケ
ミカル・カンパニー・リミテッドより入手した。濃度は
最終反応混合物での濃度である。酵素を添加して反応を
開始した後、アッセイサンプルを37℃でインキュベー
トし、所望時間、2検体ずつ(50μl)取り出し、7
%トリクロロ酢酸(100μl)で不活性化し、氷上で
30分放置する。パッカードフィルターメート196セ
ルハーベスト[パッカード・インストラメント・リミテ
ッド]を用いてグラスファイバーフィルター上で沈殿物
を回収し、フィルターを7%トリクロロ酢酸およびエタ
ノールで順次洗浄する。フィルターを70℃で1時間乾
燥し、放射活性のレベルをシンチレーションカウンティ
ング(パッカード・トップカウント)により測定する。
【0095】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Hodgson,John Lawlor,Elizabeth <120> Novel tRNA Synthetase <130> 179984 <150> 9601096.2 <151> 1996−01−19 <150> 9622617.0 <151> 1996−10−30 <160> 2 <210> 1 <211> 1938 <212> DNA <213> <400> 1 ATGGAACAAA TTAATATTCA ATTTCCAGAT GGTAATAAAA AGGCGTTTGA TAAAGGTACT 60 ACTACTGAAG ATATAGCACA ATCAATTAGT CCTGGATTAC GTAAAAAAGC TGTTGCCGGC 120 AAATTTAACG GGCAACTTGT AGATTTAACT AAACCGCTTG AAACTGATGG ATCAATTGAA 180 ATTGTGACAC CAGGTAGTGA AGAAGCGTTA GAGGTATTAC GTCATTCTAC TGCACATTTA 240 ATGGCACACG CGATTAAAAG GTTATATGGT AATGTTAAAT TTGGTGTAGG TCCTGTAATA 300 GAAGGTGGAT TCTACTATGA CTTCGACATT GACCAAAACA TCTCATCTGA TGACTTTGAA 360 CAAATTGAAA AAACAATGAA ACAAATCGTT AACGAAAATA TGAAAATCGA ACGAAAAGTG 420 GTTTCACGAG ATGAAGCGAA AGAGTTATTC AGCAATGATG AATACAAATT AGAATTAATC 480 GACGCGATTC CTGAAGATGA AAATGTAACA TTATATAGTC AAGGTGATTT TACTGATTTA 540 TGTCGTGGAG TTCACGTTCC ATCAACAGCT AAAATTAAAG AGTTTAAACT ATTATCTACA 600 GCAGGTGCAT ACTGGCGTGG AGATAGTAAC AACAAAATGT TACAACGTAT ATACGGTACT 660 GCTTTCTTTG ATAAAAAAGA ATTAAAAGCA CATTTACAAA TGTTAGAAGA GCGTAAAGAA 720 CGTGATCATC GTAAAATTGG TAAAGAGTTA GAATTATTCA CAAATAGCCA ATTAGTTGGT 780 GCTGGTTTGC CATTATGGTT ACCTAACGGT GCAACAATTA GACGTGAAAT TGAACGTTAC 840 ATTGTTGATA AAGAGGTGAG CATGGGTTAT GACCACGTTT ATACACCAGT ACTTGCTAAT 900 GTTGATTTAT ACAAAACATC TGGTCACTGG GATCACTATC AAGAAGATAT GTTCCCACCA 960 ATGCAGTTAG ATGAAACTGA ATCTATGGTA TTACGTCCAA TGAACTGTCC ACATCATATG 1020 ATGATTTATG CGAATAAACC ACATTCATAT CGTGAATTAC CTATCCGTAT CGCTGAGCTA 1080 GGAACGATGC ATAGATATGA AGCAAGTGGT GCTGTATCAG GATTACAACG TGTTCGTGGT 1140 ATGACTTTAA ATGATTCACA TATCTTTGTT CGACCTGATC AAATTAAAGA AGAATTCAAA 1200 CGCGTTGTAA ACATGATTAT TGATGTGTAT AAAGACTTTG GTTTCGAGGA TTATAGCTTT 1260 AGATTAAGTT ATAGAGACCC TGAAGATAAA GAAAAGTACT TTGATGATGA TGACATGTGG 1320 AATAAAGCTG AAAATATGCT TAAAGAGGCA GCGGATGAGC TTGGCTTATC GTACGAAGAA 1380 GCGATTGGTG AAGCGGCATT CTATGGTCCG AAACTAGATG TTCAAGTTAA AACAGCGATG 1440 GGTAAAGAAG AGACATTATC AACAGCACAA CTTGATTTCT TATTACCAGA ACGTTTTGAT 1500 TTAACTTATA TTGGTCAAGA TGGTGAACAT CATCGTCCAG TTGTTATTCA TCGTGGTGTT 1560 GTATCAACAA TGGAACGATT TGTAGCATTT TTAACTGAAG AAACTAAAGG TGCATTCCCA 1620 ACTTGGTTAG CGCCAAAACA AGTTCAAATC ATTCCAGTTA ACGTTGATTT ACATTATGAT 1680 TATGCGCGCC AATTGCAAGA TGAATTGAAA TCTCAAGGTG TTCGTGTAAG TATTGATGAC 1740 CGTAATGAAA AAATGGGTTA TAAAATCAGA GAAGCTCAAA TGCAAAAAAT ACCTTATCAA 1800 ATCGTAGTTG GGGATAAGGA AGTTGAAAAT AATCAAGTGA ATGTGCGTCA ATATGGATCG 1860 CAAGACCAAG AAACAGTTGA AAAAGATGAA TTTATCTGGA ATCTAGTTGA TGAAATTCGT 1920 TTGAAAAAAC ATAGATAG 1938 <210> 2 <211> 645 <212> PRT <213> <400> 2 Met Glu Gln Ile Asn Ile Gln Phe Pro Asp Gly Asn Lys Lys Ala Phe 1 5 10 15 Asp Lys Gly Thr Thr Thr Glu Asp Ile Ala Gln Ser Ile Ser Pro Gly 20 25 30 Leu Arg Lys Lys Ala Val Ala Gly Lys Phe Asn Gly Gln Leu Val Asp 35 40 45 Leu Thr Lys Pro Leu Glu Thr Asp Gly Ser Ile Glu Ile Val Thr Pro 50 55 60 Gly Ser Glu Glu Ala Leu Glu Val Leu Arg His Ser Thr Ala His Leu 65 70 75 80 Met Ala His Ala Ile Lys Arg Leu Tyr Gly Asn Val Lys Phe Gly Val 85 90 95 Gly Pro Val Ile Glu Gly Gly Phe Tyr Tyr Asp Phe Asp Ile Asp Gln 100 105 110 Asn Ile Ser Ser Asp Asp Phe Glu Gln Ile Glu Lys Thr Met Lys Gln 115 120 125 Ile Val Asn Glu Asn Met Lys Ile Glu Arg Lys Val Val Ser Arg Asp 130 135 140 Glu Ala Lys Glu Leu Phe Ser Asn Asp Glu Tyr Lys Leu Glu Leu Ile 145 150 155 160 Asp Ala Ile Pro Glu Asp Glu Asn Val Thr Leu Tyr Ser Gln Gly Asp 165 170 175 Phe Thr Asp Leu Cys Arg Gly Val His Val Pro Ser Thr Ala Lys Ile 180 185 190 Lys Glu Phe Lys Leu Leu Ser Thr Ala Gly Ala Tyr Trp Arg Gly Asp 195 200 205 Ser Asn Asn Lys Met Leu Gln Arg Ile Tyr Gly Thr Ala Phe Phe Asp 210 215 220 Lys Lys Glu Leu Lys Ala His Leu Gln Met Leu Glu Glu Arg Lys Glu 225 230 235 240 Arg Asp His Arg Lys Ile Gly Lys Glu Leu Glu Leu Phe Thr Asn Ser 245 250 255 Gln Leu Val Gly Ala Gly Leu Pro Leu Trp Leu Pro Asn Gly Ala Thr 260 265 270 Ile Arg Arg Glu Ile Glu Arg Tyr Ile Val Asp Lys Glu Val Ser Met 275 280 285 Gly Tyr Asp His Val Tyr Thr Pro Val Leu Ala Asn Val Asp Leu Tyr 290 295 300 Lys Thr Ser Gly His Trp Asp His Tyr Gln Glu Asp Met Phe Pro Pro 305 310 315 320 Met Gln Leu Asp Glu Thr Glu Ser Met Val Leu Arg Pro Met Asn Cys 325 330 335 Pro His His Met Met Ile Tyr Ala Asn Lys Pro His Ser Tyr Arg Glu 340 345 350 Leu Pro Ile Arg Ile Ala Glu Leu Gly Thr Met His Arg Tyr Glu Ala 355 360 365 Ser Gly Ala Val Ser Gly Leu Gln Arg Val Arg Gly Met Thr Leu Asn 370 375 380 Asp Ser His Ile Phe Val Arg Pro Asp Gln Ile Lys Glu Glu Phe Lys 385 390 395 400 Arg Val Val Asn Met Ile Ile Asp Val Tyr Lys Asp Phe Gly Phe Glu 405 410 415 Asp Tyr Ser Phe Arg Leu Ser Tyr Arg Asp Pro Glu Asp Lys Glu Lys 420 425 430 Tyr Phe Asp Asp Asp Asp Met Trp Asn Lys Ala Glu Asn Met Leu Lys 435 440 445 Glu Ala Ala Asp Glu Leu Gly Leu Ser Tyr Glu Glu Ala Ile Gly Glu 450 455 460 Ala Ala Phe Tyr Gly Pro Lys Leu Asp Val Gln Val Lys Thr Ala Met 465 470 475 480 Gly Lys Glu Glu Thr Leu Ser Thr Ala Gln Leu Asp Phe Leu Leu Pro 485 490 495 Glu Arg Phe Asp Leu Thr Tyr Ile Gly Gln Asp Gly Glu His His Arg 500 505 510 Pro Val Val Ile His Arg Gly Val Val Ser Thr Met Glu Arg Phe Val 515 520 525 Ala Phe Leu Thr Glu Glu Thr Lys Gly Ala Phe Pro Thr Trp Leu Ala 530 535 540 Pro Lys Gln Val Gln Ile Ile Pro Val Asn Val Asp Leu His Tyr Asp 545 550 555 560 Tyr Ala Arg Gln Leu Gln Asp Glu Leu Lys Ser Gln Gly Val Arg Val 565 570 575 Ser Ile Asp Asp Arg Asn Glu Lys Met Gly Tyr Lys Ile Arg Glu Ala 580 585 590 Gln Met Gln Lys Ile Pro Tyr Gln Ile Val Val Gly Asp Lys Glu Val 595 600 605 Glu Asn Asn Gln Val Asn Val Arg Gln Tyr Gly Ser Gln Asp Gln Glu 610 615 620 Thr Val Glu Lys Asp Glu Phe Ile Trp Asn Leu Val Asp Glu Ile Arg 625 630 635 640 Leu Lys Lys His Arg 645
【図1】 スタフィロコッカス・アウレウスのグリシル
tRNAシンセターゼ[配列番号:1]のポリヌクレオチ
ド配列を示す。
tRNAシンセターゼ[配列番号:1]のポリヌクレオチ
ド配列を示す。
【図2】 スタフィロコッカス・アウレウスのグリシル
tRNAシンセターゼ[配列番号:1]のポリヌクレオチ
ド配列を示す。
tRNAシンセターゼ[配列番号:1]のポリヌクレオチ
ド配列を示す。
【図3】 スタフィロコッカス・アウレウスのグリシル
tRNAシンセターゼ[配列番号:1]のポリヌクレオチ
ド配列を示す。
tRNAシンセターゼ[配列番号:1]のポリヌクレオチ
ド配列を示す。
【図4】 図1ないし3のポリヌクレオチド配列から推
定したスタフィロコッカス・アウレウスのスレオニルt
RNAシンセターゼ[配列番号:2]のアミノ酸配列を示
す。
定したスタフィロコッカス・アウレウスのスレオニルt
RNAシンセターゼ[配列番号:2]のアミノ酸配列を示
す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 1/12 A61P 11/02 4C084 11/00 11/04 4H045 11/02 13/12 11/04 15/00 13/12 17/00 101 15/00 19/00 17/00 101 19/02 19/00 21/00 19/02 27/02 21/00 31/04 27/02 43/00 101 31/04 C07K 16/40 43/00 101 C12N 1/15 C07K 16/40 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 9/00 1/21 C12Q 1/02 5/10 1/25 9/00 1/68 A C12Q 1/02 G01N 33/15 Z 1/25 33/50 Z 1/68 33/53 D G01N 33/15 C12N 15/00 ZNAA 33/50 5/00 A 33/53 A61K 37/02 (72)発明者 ジョン・エドワード・ホッジソン アメリカ合衆国19426−0989ペンシルベニ ア州カレッジビル、ピー・オー・ボックス 5089、サウス・カレッジビル・ロード1250 番 スミスクライン・ビーチャム・ファー マシューティカルズ (72)発明者 エリザベス・ローラー アメリカ合衆国19426−0989ペンシルベニ ア州カレッジビル、ピー・オー・ボックス 5089、サウス・カレッジビル・ロード1250 番 スミスクライン・ビーチャム・ファー マシューティカルズ Fターム(参考) 2G045 AA40 DA36 FB01 FB03 4B024 AA01 AA11 AA20 BA07 CA03 DA01 DA02 DA05 EA04 GA11 HA17 4B050 CC01 CC03 DD02 LL01 LL03 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ20 QR08 QR20 QR55 QR62 QR80 QS25 QS34 4B065 AA01X AA53Y AA57X AA87X AB01 AC14 BA02 CA27 CA43 CA46 4C084 AA01 AA07 AA13 BA35 DC50 NA14 ZA012 ZA332 ZA362 ZA592 ZA812 ZA902 ZA962 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA76 EA50
Claims (26)
- 【請求項1】 (a) 配列番号:2のアミノ酸1から
645を有してなるポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドに対して少なくとも72%の同一性を有するポ
リヌクレオチド; (b) (a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌク
レオチド;および (c) (a)または(b)のポリヌクレオチドの少な
くとも15個の連続した塩基を有してなるポリヌクレオ
チド;からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列
を有してなる単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項2】 ポリヌクレオチドがDNAである請求項
1記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項3】 ポリヌクレオチドがRNAである請求項
1記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項4】 配列番号:1に示すヌクレオチド1から
1938を有する請求項2記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項5】 配列番号:1に示すヌクレオチド1から
1935を有する請求項2記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項6】 配列番号:2のアミノ酸1から645を
有してなるポリペプチドをコードする請求項2記載のポ
リヌクレオチド。 - 【請求項7】 (a) NCIMB受託番号40771
に含まれるtRNAシンセターゼ遺伝子により発現され
る同一の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドに対して少なくとも72%の同一性を有するポリヌク
レオチド; (b) (a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌク
レオチド;および (c) (a)または(b)のポリヌクレオチドの少な
くとも15個の塩基を有してなるポリヌクレオチド;か
らなる群から選択される構成ポリヌクレオチドを有して
なる単離ポリヌクレオチド。 - 【請求項8】 請求項2記載のDNAを有するベクタ
ー。 - 【請求項9】 請求項8記載のベクターを有する宿主細
胞。 - 【請求項10】 該DNAによりコードされるポリペプ
チドを請求項9記載の宿主細胞から発現させることを特
徴とするポリペプチドの製造方法。 - 【請求項11】 ポリペプチドを発現する細胞の製造方
法であって、該細胞が請求項8記載のベクターに含まれ
るcDNAによりコードされるポリペプチドを発現する
ように、該ベクターで該細胞を形質転換またはトランス
フェクションすることを特徴とする方法。 - 【請求項12】 tRNAシンセターゼポリペプチドま
たはフラグメントの製造方法であって、該tRNAシン
セターゼポリペプチドまたはフラグメントを生成するの
に十分な条件下で請求項9記載の宿主を培養することを
特徴とする方法。 - 【請求項13】 配列番号:2のアミノ酸1から645
に対して少なくとも72%同一であるアミノ酸配列を有
してなるポリペプチド。 - 【請求項14】 配列番号:2に示すアミノ酸配列を有
してなるポリペプチド。 - 【請求項15】 請求項13記載のポリペプチドに対す
る抗体。 - 【請求項16】 治療上有効量の請求項13記載のポリ
ペプチドを個体に投与することを特徴とする、tRNA
シンセターゼの必要性を有する個体の治療方法。 - 【請求項17】 ポリペプチドをコードするDNAを個
体に提供し、該ポリペプチドをインビボで発現させるこ
とにより、該治療上有効量のポリペプチドを投与する、
請求項16記載の方法。 - 【請求項18】 治療上有効量の配列番号:2のアミノ
酸1から645に対して少なくとも72%同一であるア
ミノ酸配列を有してなるポリペプチドの活性を阻害する
アンタゴニストを個体に投与することを特徴とする、t
RNAシンセターゼポリペプチドを阻害する必要性を有
する個体の治療方法。 - 【請求項19】 請求項13記載のポリペプチドをコー
ドする核酸配列を決定することを特徴とする、該ポリペ
プチドの発現に関与する疾患の診断方法。 - 【請求項20】 宿主由来のサンプル中の請求項13記
載のポリペプチドの存在を分析することを特徴とする診
断方法。 - 【請求項21】 請求項13記載のポリペプチドに結合
し、活性を阻害する化合物の同定方法であって:結合部
位との結合を可能にする条件下で、ポリペプチドについ
ての結合部位をその表面に発現する細胞を、スクリーニ
ングされる化合物と接触させること(ここに該結合部位
は、化合物の該結合部位への結合に反応して検出可能な
シグナルを提供する能力のある第2の成分に結合するも
のである);次いで、 該化合物と該結合部位との相互作用から生じるシグナル
の存在または不存在を検出することにより、該化合物が
該結合部位に結合して活性化するかまたは阻害するかを
決定すること;を特徴とする方法。 - 【請求項22】 哺乳動物を疾患から防御する抗体を産
生させるに十分なtRNAシンセターゼまたはそのフラ
グメントもしくは変種を哺乳動物に接種することを特徴
とする、哺乳動物における免疫学的応答を誘起する方
法。 - 【請求項23】 遺伝子治療により、インビボにてtR
NAシンセターゼまたはそのフラグメントもしくは変種
を発現させるために、tRNAシンセターゼフラグメン
トもしくはその変種をコードする遺伝子を送達し、免疫
学的応答を誘発させて抗体を産生し、該動物を疾患から
防御する、哺乳動物における免疫学的応答を誘起する方
法。 - 【請求項24】 tRNAシンセターゼポリヌクレオチ
ドまたはそれによりコードされるタンパク質をコード
し、発現するDNAを含んでなる免疫学的組成物であっ
て、哺乳動物に導入した場合、哺乳動物において所定の
tRNAシンセターゼポリヌクレオチドまたはそれによ
りコードされるタンパク質を生じる免疫学的応答を誘起
する免疫学的組成物。 - 【請求項25】 厳密なハイブリダイゼーション条件下
で、配列番号:1に示すポリヌクレオチド配列の完全遺
伝子を含む適当なライブラリーを、配列番号:1に示す
該ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントの配列
を有するプローブでスクリーニングし、次いで、そのD
NA配列を単離することにより得られるDNA配列を必
須としてなるポリヌクレオチド。 - 【請求項26】 新規tRNAシンセターゼの相互作用
を妨害する薬物を同定するための薬物のスクリーニング
方法であって、全アミノアシル化反応または部分PPi
/ATP交換反応による酵素活性の測定を特徴とするス
クリーニング方法。
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GBGB9622617.0A GB9622617D0 (en) | 1996-10-30 | 1996-10-30 | Novel compounds |
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