JPH11506018A - スタフィロコッカス・アウレウス由来の２成分シグナルトランスダクションシステムタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規応答レギュレーターポリペプチドおよびかかるポリペプチドをコードしているＤＮＡ（ＲＮＡ）ならびに組み換え法によるかかるポリペプチドの製造方法を開示する。また、感染、詳細には、細菌感染の治療のためのかかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用方法も開示する。また、本発明のポリペプチドに対するアンタゴニストおよびそれらの感染、詳細には、細菌感染の治療のための使用も開示する。本発明の核酸配列およびそのポリペプチドの宿主における存在に関連した疾病の検出のための診断アッセイも開示する。また、宿主における応答レギュレーターをコードしているポリヌクレオチドの検出ならびに該ポリペプチドの検出のための診断アッセイも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 スタフィロコッカス・アウレウス由来の ２成分シグナルトランスダクションシステムタンパク質 技術分野 本発明は、一般に、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）由来のＲｅｓ Ｄ応答調節タンパク質のファミリーにおいて新たに同定されたポリヌクレオチド およびポリペプチドに関する。 背景技術 多くの２成分シグナルトランスダクションシステム（ＴＣＳＴＳ）が細菌にお いて同定されている(Stock，J.B．ら、(1989)Microbiol．Rev．53，450-490)。 これらは、その周囲を監視し、その環境の変化に適応する細菌の能力に関連して いる。これらの細菌のＴＣＳＴＳのいくつかは、宿主内での毒性および細菌性病 原性に関連する。応答レギュレーターは、ＴＣＳＴＳの成分である。これらのタ ンパク質は、ヒスチジンキナーゼによりリン酸化され、一度リン酸化されると、 しばしばＤＮＡ結合ドメインの活性化を介して、応答に作用する。応答レギュレ ーターは、約１００アミノ酸残基の保存Ｎ−末端ドメインにより特徴付けられる 。応答レギュレーターのＮ−末端ドメインならびにＣｈｅＹ中の残基Ｄ１２、Ｄ １３、Ｄ５７、Ｔ８７、Ｋ１０９（Matsumura，P．ら、(1984)J．Bacteriol．16 0，36-41）に対応する、保持された５個の機能的に重要な残基は、保存された構 造特性を有する(Volz，K．(1993)Biochemistry 32，11741-11753)。サルモネラ ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)（Stock，A.M.，ら、(1989)Nature ，337，745-749）およびエシェリシア・コリ(Escherichia coli)（Volz，K．& M atsumura，P．(1991)J．Biol．Chem．266，15511-15519）由来のＣｈｅＹの３次 元構造およびエス・チフィムリウム由来の窒素調節タンパク質ＣのＮ−末端ドメ イン（Volkman，B．F．ら、(1995)Biochemistry，34 1413-1424）は、バシラス ・サ チリス由来のＳｐｏＯＦの２次元構造(Feher，V.A．ら、(1995)Protein Science ，4，1801-1814)と同様、利用可能である。これらの構造は、(ａ／ｂ)₅の折りた たみ（fold）を有する。いくつかの構造残基は、異なる応答レギュレーター配列 間、特に、β−シート疎水性コアおよびα−ヘリックス由来の部位中の疎水性残 基で保存されている。この応答レギュレーターのファミリーには、ＲｅｓＤを含 む。ＲｅｓＤは、ビー・サチリス（B．subtilis）における好気的および嫌気的 呼吸の調節を制御し、さらに胞子形成、炭素源利用およびＰｈｏレギュロン調節 に作用できる、ＴＣＳＴＳの応答レギュレーターである(Sun，G．ら、(1996)J． Bacteriol.，178，1374-1385)。 ヒスチジンキナーゼは、ヒスチジン残基で自動リン酸化するＴＣＳＴＳの成分 である。ついで、リン酸基は関連する応答レギュレーターに移される。ヒスチジ ンキナーゼは、５個の短い保存されたアミノ酸配列を有する(Stock．J.B．ら、( 1989)Microbiol．Rev．53，450-490，Swanson，R.V．ら、(1994)TIBS 19 485-49 1)。これらは、リン酸化される、保存アスパラギン残基が約１００残基後に続く 、ヒスチジン残基である。さらに１５ないし４５残基後に、ＤＸＧＸＧモチーフ が見られ、さらに１０−２０残基後にＦＸＸＦモチーフが続く。さらに１０−２ ０残基には、他のグリシンモチーフ、ＧＸＧが見られる。２個のグリシンモチー フは、ヌクレオチド結合に関与するものと考えられている。 ＴＣＳＴＳにより調節されるプロセスには、毒性因子の生成、運動性、抗生物 質耐性および細胞複製がある。ＴＣＳＴＳタンパク質の阻害剤は、病因に必要な 因子の生成を妨げることにより、細菌が宿主の感染を確立し維持することを妨げ 、それにより、抗細菌治療において有用性がある。 明らかに、抗生物質活性を有する化合物をスクリーンするのに使用でき、感染 、機能障害および疾患の病因におけるそれらの役割を決定するのにも用いること のできる因子が必要とされている。それゆえ、感染、機能障害または疾患を妨げ 、改善しまたは調整する役割を担うことのできる該因子の同定および解析が必要 とされている。 発明の要約 これらの目的、およびその他に対し、本発明は、ポリペプチド、なかでも、図 ２に示されるアミノ酸配列およびＲｅｓＤタンパク質などの他のタンパク質の知 られたアミノ酸配列間の比較により、新規なペプチドであると同定されたポリペ プチドを提供することを目的とする。 さらに、本発明の新規なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供す ることを目的とする。 本発明のこの態様の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、図１（配 列番号１）に示される配列、またはそのフラグメント、アナログまたは誘導体に おいて、新規なポリペプチドをコードする領域を含む。 他の本発明の特に好ましい具体例において、図２（配列番号２）のアミノ酸配 列、またはそのフラグメント、アナログまたは誘導体を含む、スタフィロコッカ ス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来の新規なタンパク質がある。 本発明のこの態様によれば、National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd．(NCIMB)，Aberdeen，Scotland に、受託番号ＮＣＩＭＢ40711 として、１９９５年９月１１日に寄託されている、スタフィロコッカス・アウレ ウスＤＮＡにより発現可能な成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸分子 が提供される。 本発明のこの態様によれば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含む、新規 ポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供され、さらに本発明のこの態様の 具体例には、生物学的に、診断的に、予防的に、臨床的にまたは治療的に有用な それらの変種、アナログまたは誘導体、または、変種、アナログおよび誘導体の フラグメントを含むフラグメント、および、同じ物を含む組成物が含まれる。 本発明の他の態様によれば、本発明のポリヌクレオチドの治療的または予防的 目的、特に、遺伝学的免疫化における使用が提供される。 本発明のこの態様の特に好ましい具体例は、新規核酸配列の自然に生じる対立 遺伝子変種およびそれによりコードされるポリペプチドである。 本発明のこの態様によれば、配列番号２のアミノ酸配列により特徴付けられる 新規ポリペプチド、ならびに、生物学的に、診断的に、予防的に、臨床的にまた は治療的に有用なそれらのフラグメント、変種および誘導体、フラグメントの変 種および誘導体、前記のアナログ、同じ物を含む組成物が提供される。 本発明のこの態様の特に好ましい具体例は、配列番号１の核酸配列により特徴 付けられる本発明の遺伝子の自然に生じる対立遺伝子によりコードされるポリペ プチドの変種である。 本発明のこの態様の好ましい具体例において、上述したポリペプチドを製造す る方法が提供される。 本発明のさらに別の態様によれば、たとえば抗生物質を含む抗細菌剤として有 用な該ポリペプチドに対する阻害剤が提供される。 本発明のこの態様の特定の好ましい具体例によれば、生成物、組成物および方 法、なかでも：発現の評価；細菌感染の治療および防御；遺伝学的変化のアッセ イ；および、細菌、特にスタフィロコッカスに対する免疫学的応答を引き起こす ための生物への本発明の新規なポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与、が 提供される。 本発明のこの態様および他の態様の特定の好ましい具体例によれば、配列番号 １を含む本発明の新規なポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレ オチドが提供される。 本発明のこの態様のさらなる好ましい具体例によれば、本発明のポリペプチド に対する抗体が提供される。 本発明の他の態様によれば、好ましくは、静菌性または殺菌性でもある、本発 明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドに対するアゴニストが提供さ れる。 本発明のさらに別の態様によれば、好ましくは、静菌性または殺菌性でもある 、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドに対するアンタゴニス トが提供される。 本発明のさらなる態様によれば、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチ ドを含む、細胞または多細胞生物に投与するための、組成物が提供される。 以下の記載を読むことおよび本発明の開示の他の部分を読むことにより、開示 される発明の精神および範囲内の様々な変更および修飾が当業者に明らかとなる であろう。 一般的には、本発明は、新たに同定された応答レギュレーターのポリヌクレオ チドおよびポリヌクレオチド、特に、ＲｅｓＤファミリーに関する。また、本発 明は、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体；これ らのポリヌクレオチドおよびこれらのポリペプチド、ならびそれらの変種および 誘導体の製造方法；ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト；これらの ポリヌクレオチド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニ ストの使用を包含する。 特に、本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはそれらのフラグメ ント、アナログまたは誘導体を含むと解析された、エス・アウレウスＷＣＵＨ２ ９由来の新規な応答レギュレータータンパク質に関する。 本発明の別の態様によれば、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド( ＤＮＡまたはＲＮＡ)が提供される。 図面の簡単な説明 以下に、本発明の特定の具体例を示す。これらは単に例示であり、本明細書に 開示される発明を何ら限定するものではない。 図１は、本発明の遺伝子の核酸配列（配列番号１）を示す。 図２は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。 定義 以下の例示的な説明は、本明細書、特に実施例において汎用される特定の用語 の理解を容易にするために提供される。説明は、便宜上示すものであり、本発明 を限定するものではない。 本明細書で用いる「結合分子」は、例えば酵素基質、細胞膜成分および古典的 なレセプターを含め、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと特異的に 結合または相互作用する分子またはイオンをいう。結合または相互作用分子を含 め、本発明のポリペプチドと、そのような分子間の結合は、本発明のポリペプチ ドに対して独占的であることが好ましく、またはその結合は本発明のポリペプチ ドに高度に特異的であることもまた好ましく、またはその結合は本発明のポリペ プチドを包含するタンパク質群に高度に特異的であることも好ましく、または少 なくともその一つが本発明のポリペプチドを含む、数種のタンパク質群に特異的 であってもよい。結合分子はまた、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗 体および抗体由来の物質をも包含する。 「遺伝学的エレメント」は、一般に、ポリペプチドをコードする領域、もしく は複製、転写もしくは翻訳、もしくは宿主細胞においてポリペプチドを発現する のに重要なその他の過程を制御するポリヌクレオチド領域を含むポリヌクレオチ ド、またはポリペプチドをコードする領域およびそれらに機能的に連結した発現 を制御する領域の両方を含むポリヌクレオチドを意味する。遺伝学的エレメント は、エピソームエレメント、すなわち、宿主細胞ゲノムと物理的に独立した分子 として、複製するベクター内に含まれていてもよい。それらはプラスミド内に含 まれていてもよい。遺伝学的エレメントはまた、自然の状態ではなく、むしろ単 離、クローニングおよび宿主細胞への導入のような操作の後に、精製ＤＮＡの形 態で宿主細胞ゲノム内またはとりわけベクター内にも含まれていてもよい。 外来ＤＮＡが細胞膜中に導入されている時、細胞は外来ＤＮＡにより「トラン スフォーム」されている。外来ＤＮＡは、染色体ＤＮＡ中に組み込まれ（共有結 合して）細胞のゲノムを構成していてもよく、していないくてもよい。たとえば 、原核細胞および酵母では、外来ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソームエレメ ントとして保持され得る。真核細胞についてみると、安定にトランスフォームま たはトランスフェクトされた細胞は、染色体複製により娘細胞に遺伝するように 、外来ＤＮＡが染色体中に組み込まれているものである。この安定性は、細胞系 、または、外来ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなるクローンを確立する、真核細 胞の能力により示される。 「宿主細胞」は外来ポリヌクレオチド配列によりトランスダクション、トラン スフォーメーションまたはトランスフェクションされた細胞であるか、またはト ランスダクション、トランスフォーメーションまたはトランスフェクションする ことのできる細胞である。 「クローン」は、単一細胞または有糸分裂による共通の祖先由来の細胞の集団 である。「細胞系」は、多世代にわたりインビトロで安定に生育できる一次細胞の クローンである。 「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、す なわち、その自らの制御下で複製することのできる、遺伝的エレメント（たとえ ば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。 「ベクター」は、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンで あり、連結したセグメントの複製ができるように、これらに他のＤＮＡセグメン トを連結させることができる。 「二本鎖ＤＮＡ分子」は、弛緩型および超らせん型の両方の二本鎖ヘリックス におけるデオキシリボヌクレオチド（塩基アデニン、グアニン、チミン、または シトシン）のポリマー形態を意味する。この用語は、分子の一次元および二次元 構造を意味するのみであり、特定の三次元構造を限定するものではない。それゆ え、この用語は、とりわけ、直鎖状ＤＮＡ分子(たとえば、制限フラグメント)、 ウイルス、プラスミドおよび染色体に見られる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本 鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する場合、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍ ＲＮＡと相同性のある配列を有する鎖）にそって５’から３’方向にある配列の みを記載する慣例にしたがって明細書中に記載されるものである。 特定のタンパク質の「コーディング配列」または特定のタンパク質を「コード するヌクレオチド配列」のＤＮＡは、適当な調節配列の制御下に置かれると、転 写され、タンパク質に翻訳されるＤＮＡ配列である。 「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼと結合でき、下流（３ ’方向）コーディング配列の転写を開始できるＤＮＡ調節領域である。本発明を 定義する目的では、プロモーター配列は、コーディング配列の翻訳開始コドン（ たとえば、ＡＴＧ）により３’末端で境界が引かれ、上流（５’方向）にのび、 バ ックグラウンドよりも上の検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な塩基ま たはエレメントの最小数を含む。プロモーター配列中に、転写開始部位(通常、 ヌクレアーゼＳ１でマッピングにより定義される)、ならびにＲＮＡポリメラー ゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される 。真核プロモーターは、しばしば、いつもでなないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよ び「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核プロモーターは、−１０および−３５コンセ ンサス配列に加え、シャイン−ダルガノ配列を含む。 「ＤＮＡ制御配列」は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニ レーションシグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサー、および 宿主細胞中でコーディング配列の発現（すなわち、転写および翻訳）を提供する ようなものを、ひとまとめにして意味する。制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼが プロモーター配列に結合し、コーディング配列をｍＲＮＡに転写し、ついでコー ディング配列にコードされるポリペプチドに翻訳する時、細胞中でコーディング 配列の発現を制御する。 「ＤＮＡの消化」とは、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素によるＤＮ Ａの触媒的切断をいう。本明細書で用いられる種々の制限酵素は商業上入手可能 であり、それらの反応条件、補因子およびその他の必要事項は、当業者において 知られるものを用いた。分析の目的では、典型的には、１μｇのプラスミドある いはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素とともに約２０μｌの緩衝液中で用い る。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的では、典型的に は、５ないし５０μｇのＤＮＡが、大容量にて２０ないし２５０単位の酵素で消 化される。特定の制限酵素に対する適当な緩衝液および基質濃度は製造者によっ て特定される。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが 、供給者の指導にしたがって変更してもよい。消化後、反応物をポリアクリルア ミドゲル上で直接電気泳動に付し、所望のフラグメントを単離する。切断フラグ メントのサイズ分離を、Goeddel,D.ら、Nucleic Acids Res.,8:4057(1980)に記 載される、８パーセントポリアクリルアミドゲルを用いて行う。 ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、天然の他の分子と関連して見出されない、他 のＤＮＡ分子中または他のＤＮＡ分子に結合する、ＤＮＡの同定可能なセグメン トである。 当該分野にて周知であるように「同一性」または「類似性」は、配列を比較し て測定される、二つまたはそれ以上のポリペプチド配列間または二つまたはそれ 以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該分野において、同一性とはま た、時には、かかる配列の２つの鎖の間の合致により決定されるようなポリペプ チドまたはポリヌクレオチド配列間の配列の関連性の程度をも意味する。同一性 および類似性は共に容易に算出できる(Computational Molecular Biology，Lesk ,A.M.編、Oxford University Press、New York、1988 年；Biocomputing：Infor matics and Genome Projects，Smith,D.W.編、Academic Press、New York、1993 年；Computer Analysis of Sequence Data，PARTＩ，Griffin,A.M.およびGriff in,H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994 年；Sequence Analysis in Molec ular Biology，von Heinje,G.、Academic Press、1987 年；およびSequence Ana lysis Primer,Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍ Stockton Press、New York 、1991 年)。２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド間の同一性およ び類似性を測定するための多くの方法がある一方で、その両方の用語は当業者に 周知である(Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Acade micPress，1987; Squence AnalysisPrimer,Gribskov,M.およびDevereux,J.，編 、M Stockton Press，New York，1991;およびCarillo，H.,およびLipman，D.，S IAM J.，AppliedMath.，48:1073(1988))。配列間で同一性または類似性を測定す るのに通常用いられる方法は、Carillo,H.および Lipman,D.，SIAM J．Applied Math.，48:1073(1988)に開示されている方法を包含するが、これらに限定される ものではない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間で最も 良く適合するように設計される。同一性および類似性を測定する方法は、コンピ ュータープログラムに集成されている。二つの配列間の同一性および類似性を測 定する好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（ Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387(1984)、BLASTP、BLASTNお よびFASTA(Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215：403(1990))）を包含するが、 これらに限定されるものではない。 「単離」とは、「人工的に」天然の状態から変化させられた、すなわち、天然 物の場合、その本来の環境から変化または除去あるいはその両方が行われたこと を意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチ ドは、「単離」されていないが、その天然状態で共存する物質から分離された同じ ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用いる用語としての「単離 」がなされている。単離の一部として、または単離の後に、かかるポリヌクレオ チドは、例えば、突然変異誘発のために、ＤＮＡなどの他のポリヌクレオチドに 結合し、宿主における伸長および発現のために、融合タンパク質を形成したりす ることができる。単離ポリヌクレオチドは単独で、またはベクターなどの他のポ リヌクレオチドと結合して、培養物中または全生物中の宿主細胞に導入できる。 培養物中または全生物中の宿主細胞に導入されたかかるＤＮＡも本明細書に用い る用語である、単離されたといえる。というのはこれらは天然の形態または環境 にはないからである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、組成物 、例えば、培地処方、例えば細胞にポリヌクレオチドまたはポリペプチドを導入 するための溶液、化学的または酵素的反応のための組成物または溶液中に生じさ せてもよく、これらは自然には存在しない組成物であり、本明細書に用いる用語 の単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドの意味の範囲内である。 「ポリヌクレオチド(複数でも可)」は、一般に、修飾されていないＲＮＡもし くはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いずれのポ リリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをも意味する。したが って、例えば、本明細書で用いるポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二 本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本 鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖およ び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖もし くは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよ びＲＮＡを含むハイブリッド分子を意味する。加えて、本明細書で用いるポリヌ クレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖 領域を意味する。かかる領域における鎖は同一の分子または異なる分子由来のも のでよい。この領域はこれらの分子の一つまたはそれ以上の全てを含んでいても よいが、より典型的にはいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の 分子の一つは、オリゴヌクレオチドであることがしばしばである。本明細書で用 いる場合、ポリヌクレオチドなる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基を 含有する、前記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。このように、安定性または 他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも、該用語を本明細書が 意図するろところの「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシン等の普通で ない塩基、またはトリチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（二つ の例だけを示す）も、かかる用語を本明細書で用いる場合のポリヌクレオチドで ある。当業者に既知の多くの有用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに、非常 に多くの修飾がなされていることは、明らかであろう。ポリヌクレオチドなる用 語は、本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドのこのような化学的、酵素的ま たは代謝的に修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型細胞および複雑 型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。ポ リヌクレオチドは、しばしば、オリゴヌクレオチド（複数でも可）と称される短 鎖ポリヌクレオチドを包含する。 「連結」とは、二つの二本鎖核酸フラグメント間でリン酸ジエステル結合を形 成する過程をいう(Maniatis，T.ら，Id.，p．146)。特記しない限り、連結は既 知の緩衝液および条件を用い、連結させるべきほぼ等モル量のＤＮＡフラグメン ト０．５μｇ当たり、１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて行 ってもよい。 本明細書で用いる「ポリペプチド」は、以下に記載する全てのポリペプチドを 包含する。ポリペプチドの基本的な構造は周知であり、非常に多くのテキストお よび当該分野の他の発行物に記載されている。これに関連して、この用語は、本 明細書において、ペプチド結合により直鎖で互いに結合している２個またはそれ 以上のアミノ酸を含むいずれかのペプチドまたはタンパク質をいうのに用いる。 本明細書で用いる場合、この用語は、当該分野で通常例えばペプチド、オリゴペ プチドおよびオリゴマーとも称される短鎖、および多くの型があり、当該分野で 一般的にタンパク質と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、しばしば 、一般に２０種の天然アミノ酸と称される２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含 有し、末端アミノ酸を含め、多くのアミノ酸は、プロセッシングおよび他の翻訳 後修飾のような自然の工程により所定のポリペプチドで修飾されたものが含まれ るが、当業者に周知の化学的修飾技術によっても修飾できることは理解されよう 。ポリペプチドに自然に起こる一般的な修飾でさえ余り多すぎて、余すところな く列挙することはできないが、基礎的なテキストおよびさらに詳細な論文ならび に多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当業者に周知である。本 発明のポリペプチドに施すことができる既知の修飾には、例を挙げると、アセチ ル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部 分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または 脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化 、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋形成、シスチン形成、ピロ グルタミン酸塩形成、ホルミル化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰ Ｉアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化 、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレ ノイル化、硫酸化、アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介のタンパク質へのアミノ 酸付加、およびユビキチネーションがある。かかる修飾は当業者に周知であり、 科学文献に非常に詳細に記載されている。いくつかの特に一般的な修飾、例えば 糖鎖形成、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマーカルボキシル化、ヒ ドロキシル化およびＡＤＰリボシル化は最も基礎的なテキスト、例えば Protein s-Structure and Molecular Properties、第２版、T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、New York(1993)に記載されている。例えば、Posttranslational Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson編、Academic Press，New Yo rk(1983)の Wold,F.,Posttranslational Protein Modifications：Perspective and Prospects、1〜12頁;Seifter ら、Meth.Enzymol.182:626-646(1990)およびR attan ら、Protein Synthesis：Posttranslational Modifications and Aging， Ann.N． Y．Acad．Sci．663:48-62（1992）で提供される論文などの多くの詳細な論文が 、本主題に利用できる。ポリペプチドはいつも完全に直鎖であるとは限らないと いうことは周知であり、前記した通りであると理解されよう。例えばポリペプチ ドはユビキチン化の結果分岐していてもよく、一般には、天然のプロセッシング 事象を含む翻訳後の事象、および天然では起こらない人為的操作によりもたらさ れる事象の結果、分岐のある、または分岐のない環状にできる。環状、分岐およ び分岐した環状ポリペプチドは、非翻訳天然のプロセッシングにより、および同 様に全く合成的な方法で合成できる。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖および アミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチドのどこででも起こり得る。 実際、共有結合の修飾による、ポリペプチドのアミノまたはカルボキシル基また はその両方のブロックは、天然および合成ポリペプチドに共通し、かかる修飾は 同様に本発明のポリペプチドにも存在し得る。例えば、イー・コリ（E.coli）ま たは他の細胞で作られるポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質溶解のプ ロセッシングの前にほとんど必ずＮ−ホルミルメチオニンになるであろう。ペプ チドの翻訳後の修飾の間に、ＮＨ₂末端においてメチオニン残基を除去できる。 したがって、本発明は、本発明タンパク質のメチオニン含有およびメチオニン不 含の両方のアミノ末端変種の使用を意図する。ポリペプチドに起こる修飾はしば しばそれの作り方に影響される。例えば、宿主にクローン化遺伝子を発現するこ とにより作られるポリペプチドでは、修飾の特性および程度は、大部分、宿主細 胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチドアミノ酸配列に存在する修飾シグナルに より決定される。例えば、周知のように、糖鎖形成はイー・コリのような細菌宿 主では起こらないことがはしばしばである。したがって、糖鎖形成が望ましい場 合、ポリペプチドを、糖鎖形成宿主、一般に、真核細胞にて発現させるべきであ る。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物細胞と同じ翻訳後糖鎖形成を行い、この理 由で昆虫細胞発現系が、とりわけ、糖鎖形成の本来のパターンを有する哺乳動物 タンパク質を効率よく発現するように開発されている。同様の考察が他の修飾に も適用される。修飾の同一の型が、所定のポリペプチドのいくつかの部位で、同 じまたは異なる程度で存在し得ることは理解されよう。また、所定のポリペプチ ドは 多くの型の修飾を有していてもよい。一般に、本明細書で用いる場合、ポリペプ チドなる用語は、全てのこのような修飾、特に宿主細胞においてポリヌクレオチ ドを発現することにより合成したポリペプチドに存在する修飾を包含する。 本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「変種(複数で も可)」なる用語は、対照標準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異 なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。この意味の変種は、本明細書 の以下およびその他の部分でより詳細に記載する。(１)ヌクレオチド配列にて他 の対照標準のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチド。一般に、違いは対照 標準と変種のヌクレオチド配列が、全体的に非常に類似しており、多くの領域で 同一であるものに限られる。以下に記すように、変種におけるヌクレオチドの配 列の変化はサイレントであってもよい。すなわち、その変化がポリヌクレオチド によりコードされるアミノ酸を変えなくてもよい。変化がこの型のサイレント変 化に限定される場合、変種は、対照標準と同一のアミノ酸配列を有するポリペプ チドをコードする。また以下に記すように、変種のヌクレオチド配列における変 化が、対照標準のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸 配列を変化させてもよい。このようなヌクレオチドの変化は、以下に論じるよう に、対照標準配列によりコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加 、欠失、融合および末端切断をもたらす。(２)アミノ酸配列にて他の対照標準の ポリペプチドと異なるポリペプチド。一般に、違いは対照標準と変種の配列が全 体的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるものに限られる。変種およ び対照標準のポリペプチドは、１またはそれ以上の置換、付加、欠失、融合およ び末端切断（いずれかの組み合わせで生じていてもよい）により、アミノ酸配列 にて異なっていてもよい。 発明の詳説 本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、またはそのフラグメント、ア ナログまたは誘導体を含むことで特徴付けられる、スタフィロコッカス・アウレ ウス由来の新規な応答レギュレーターに関する。以下、ポリペプチド（複数でも 可）なる用語は応答レギュレータータンパク質、そのフラグメント、アナログま たは誘導体ならびにポリペプチドフラグメントまたはその誘導体を意味するのに 用いる。 本発明は、本質的に、各々、図１および図２に示すヌクレオチドおよびアミノ 酸配列を有する遺伝子、１９９５年９月１１日にＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１ として、National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd．(NCIM B)，Aberdeen，Scotlandに寄託されているエス・アウレウスＷＣＵＨ２９のＤＮ Ａのヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関する。本明細書において、これを「寄 託ＤＮＡ」と称する。図１（配列番号１）および図２（配列番号２）に示される ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、寄託菌のＤＮＡを配列決定することにより 得られたことは理解されよう。それゆえ、寄託菌の配列は、その配列（およびそ れをコードする配列）と図１（配列番号１）および図２（配列番号２）の配列の 間のいずれの不一致についても支配的である。 特に、実験室条件および宿主感染条件下での生存性に適用すると、その技法は 細菌における一時的な遺伝子発現を評価するのに利用できる。それ自体生存に必 須であるかまたは感染の確立および／もしくは維持に必須である遺伝子を同定す るために、多くの方法を用いることができる。これらの方法の一つにより配列の 発現を同定することにより、その機能についてのさらなる情報が得られ、かかる 配列をスクリーニングの標的としてさらに開発するための選別が可能となる。簡 単には、これらの研究には、例えば以下のものがある： １）シグナチャータグ化突然変異法（Signature Tagged Mutagenesis：STM） この技法は、Hensel ら、Science 269:400-403（1995）に記載されており、背 景技術とする目的でその内容を出典明示により本明細書の一部とする。シグナチ ャータグ化突然変異誘発は、所定感染モデルにおける感染の確立／維持に必要な 遺伝子を同定する。 この技法は、種々の手段（例えばトランスポゾン）により、標的生物にランダ ムに突然変異を誘発し、独特なＤＮＡ配列タグを突然変異部位に非常に近接して 挿入することに基づく。細菌性突然変異体および感染宿主から回収した細菌の混 合集団由来のタグは、増幅、放射性標識化およびハイブリダイゼーション分析に より検出される。毒性を減じた突然変異体は、感染宿主から回収した細菌のプー ル由来のタグの欠如により表される。 ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）においては 、トランスポゾンシステムはあまりよく開発されていないので、タグ化突然変異 体を作るためのより有効な方法として、その内容を背景技術とする目的で出典明 示により本明細書の一部とする、Morrison ら、J．Bacteriol．159:870（1984） に記載される挿入-複製突然変異法を用いる。 ２）インビボ発現法（In Vivo Expression Technology：IVET） この技術はCamilli ら、Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA．91，2634-2638（1994 ）に記載されており、各々の内容を背景技術とする目的で出典明示により本明細 書の一部とする。IVETは、実験培養と比較した場合、感染において重要な役割を 有する、感染中にアップレギュレーションする遺伝子を同定する。この技法によ り同定される配列は感染の確立/維持に重要な役割を有する。 この技法では、標的生物のランダムな染色体フラグメントは、プラスミドベク ターのプロモーター不含リポーター遺伝子の上流でクローン化される。プールを 宿主に導入し、感染後の種々の時間に細菌を回収し、リポーター遺伝子発現の存 在を評価できる。発現したリポーター遺伝子の上流に担持される染色体フラグメ ントは、感染中に正常なアップレギュレーションをうけるプロモーターまたは遺 伝子部分を担持するはずである。組換え酵素遺伝子の上流を配列決定により、ア ップレギュレーションされた遺伝子を同定できる。 ３）引き算ディスプレイ この技法は、その内容を背景技術とする目的で出典明示により本明細書の一部 とする、Chuang ら、J．Bacteriol．175，2026-2036（1993）に記載されている 。この方法はランダムプライムＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡの存在を同定する ことにより、生体において発現する遺伝子を同定する。感染前および感染後のプ ロフィールを比較することにより、感染中にアップレギュレーションおよびダウ ンレギュレーションされる遺伝子を同定でき、ＲＴ−ＰＣＲ生成物を配列決定し 、 ライブラリー配列に適合させることができる。 ４）トランスポゾン突然変異誘発による条件致死変異体の発生 この技法は、その内容を背景技術とする目的で出典明示により本明細書の一部 とする、de Lorenzo，V.ら、Gene 123，17-24(1993)；Neuwald，A．F．ら、Gene 125，69-73(1993)およびTakiff，H．E．ら、J．Bacteriol．174，1544-1553(199 2)に記載されており、発現が細胞の生存に必須である遺伝子を同定する。 この技法では、一方向または両方向でトランスポゾンから外側へ転写する、調 節可能なプロモーターを担持するトランスポゾンを生じる。これらのトランスポ ゾンを標的生物にランダムに挿入し、続いてプロモーター活性のインデューサー の存在下で挿入突然変異体を単離すると、発現が細胞の生存に必須である遺伝子 のコーディング領域とプロモーターとを分離するインサートが回収されることが 確認される。このインサートは生存できないので、引き続いてインデューサー不 含のレプリカ平板法でかかるインサートを同定する。トランスポゾンに隣接する 領域の配列決定により挿入部位を同定し、分断された遺伝子を同定する。インデ ューサー不存在下での成長中の細胞の過程/形態の変化を精密にモニターし、遺 伝子の可能な機能に関する情報を得る。このようなモニター観察には、フローサ イトメトリー(細胞分割、溶解、酸化還元能、ＤＮＡ複製)、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タ ンパク質、脂質、ペプチドグリカンへの放射性化学的標識前駆体の取り込み、既 知の細胞性ストレスに応答するリポーター酵素遺伝子融合物のモニター等がある 。 ５）化学的突然変異法による条件致死突然変異体の発生 この技法は、出典明示により背景技術目的でその内容を本明細書の一部とする 、Beckwith，J．Methods in Enzymo1ogy 204，3-18（1991）に記載されている。 この技法では、標的生物のランダム化学的突然変異を誘発し、生理学的温度（許 容温度）とは異なる温度で増殖させ、続いてレプリカ平板法を行い、異なる温度 (例えばｔｓ同定のためには４２℃、ｃｓ同定のためには２５℃)で成長させ、そ の時成長できなかった単離物（条件付き突然変異体）を同定する。前記のように 、非許容温度での増殖における変化を精密にモニターし、突然変異遺伝子の機能 に関する情報を得る。標的生物からのライブラリーにより条件致死突然変異を相 補 し、および相補遺伝子を配列決定することにより、ライブラリー配列と適合させ ることができる。 これらの技法の各々は、特定の適用に応じて有利であったり、不利であったり する。当業者は意図する特定の使用目的に最も関連する研究法を選択する。例え ば、いくつかの遺伝子は感染に必須であると認識されているが、実際には感染の 開始にのみ必要であり、そのためそれらの産物は、確立された慢性の感染の治療 のために開発された抗細菌物質にとってはそれほど魅力的な標的ではない。 ６）ＲＴ−ＰＣＲ 細菌のメッセンジャーＲＮＡ、好ましくはスタフィロコッカスのものを、細菌 感染した組織、例えば４８時間ネズミ・肺感染の組織から単離し、ランダムヘキ サヌクレオチドでプライムしたＲＮＡサンプルの逆転写により、続いて遺伝子特 異的プライマー対でのＰＣＲにより、ｍＲＮＡ種の各々の量を評価する。得られ たＰＣＲ生成物の定量化により特定のｍＲＮＡ種の存在および量を決定し、感染 した組織に転写された細菌遺伝子に関する情報を得る。遺伝子転写の分析は、感 染の種々の時間で実施でき、細菌による発病における遺伝子制御に関する詳細な 知識を得ることができ、遺伝子産物が新規な抗菌物質をスクリーニングする標的 に相当することが明快に理解できるようになる。用いたＰＣＲプライマーの遺伝 子特異的特性のために、細菌性ｍＲＮＡ調製物は遊離の哺乳動物ＲＮＡである必 要はないことが理解されるべきである。これにより研究者は、感染組織から簡単 かつ迅速にＲＮＡを調製して、細菌中で非常に短時間しか生育できない（半減期 ２分程度）細菌性ｍＲＮＡ種を得ることができる。最適には、ＴＲＩゾール（ギ ブコ−ＢＲＬ）を非常に短時間存在させ、機械的に破壊することにより、細菌性 ｍＲＮＡを感染ネズミ肺組織から調製し、続いてＴＲＩゾール試薬の製造者の指 示にしたがってプロセッシングし、ＤＮＡａｓｅ処理して夾雑ＤＮＡを除去する 。好ましくは、適宜標識した配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてノ ーザンをプロービングすることにより検出されるような細菌性の１６Ｓリボソー ムＲＮＡ、好ましくはスタフィロコッカス・アウレウスのものの最大量を得る条 件を見出すことによりプロセッシングが最適化される。典型的には、最適には８ か ら２５サイクルで終了するＰＣＲ反応における各ＰＣＲプライマー対には５’色 素標識プライマーを用いる。ＰＣＲ生成物は６％ポリアクリルアミドゲルで分離 し、GeneScanner（ＡＢＩ製）を用いて検出および定量する。 本発明の配列に適用する場合、これらの技法を用いると、感染中に発現する細 菌性タンパク質、抗細菌治療において利用できる阻害剤の同定が可能になる。 ポリヌクレオチド 本発明の一つの態様によれば、図２（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有す るポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。本明細書中で 用いる「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語には、本発明の ポリペプチド、特に細菌性、さらに詳細には、図２（配列番号２）に示されるア ミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードする配列を含む、ポリヌクレ オチドが包含される。該用語には、コーディングおよび／または非コーディング 配列をも含む付加領域と共に、ポリペプチドをコードする単一の連続する領域ま たは非連続領域（たとえば、組み込まれたファージまたは挿入配列または修正に より中断されたもの）を含む、ポリヌクレオチドが包含される。 図１（配列番号１）に示すポリヌクレオチド配列などの本明細書にて提供され る情報を用いて、配列番号２をコードする本発明のポリヌクレオチドまたはその フラグメントを、標準的なクローニングおよびスクリーニングの手法、例えば、 出発物質としてスタフィロコッカス・アウレウス細胞由来の染色体ＤＮＡフラグ メントをクローニングおよび配列決定し、つづいて完全長のクローンを得るため の手法を用いて得ることができる。例えば、図１（配列番号１）に示す配列など の本発明の配列のポリヌクレオチドを得るためには、典型的には、イー・コリま たはいくつかの他の適当な宿主中のスタフィロコッカス・アウレウスの染色体Ｄ ＮＡのクローンのライブラリーを、部分配列に由来する、好ましくは１７量体ま たはそれ以上の長さの、放射標識したオリゴヌクレオチドでプローブする。つい で、該プローブと同一のＤＮＡを有するクローンは、非常にストリンジェントな 洗浄により区別できる。元の配列から設計された配列決定プライマーで同定され た個々のクローンを配列決定することにより、該配列を両方向に伸長し、完全遺 伝子配列を決定することが可能である。便利には、かかる配列決定をプラスミド クローンから調製された変性二本鎖ＤＮＡを用いて実施する。適当な技術につい ては、Maniatis，T.，Fritsch,E.F.および Sambrook ら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold S pring Harbor，New York(1989)に記載されている。(Screening By Hybridizatio n 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70参照) 本発明の例として、図１（配列番号１）に示されるポリヌクレオチドは、スタフ ィロコッカス・アウレウスに由来するＤＮＡライブラリー中で見出したものであ る。 寄託されたエス・アウレウスＷＣＵＨ２９のＤＮＡにより特徴付けられた遺伝 子の配列決定の結果に示されるように、本発明の遺伝子は(配列番号１)、構造的 に他の応答レギュレーターに関連する。こうして得られたＤＮＡ配列を図１（配 列番号１）に示す。これは、当該分野に周知のアミノ酸残基の分子量を用いて計 算することのできる推定分子量を有する、図２（配列番号２）に示すおよその数 のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードする読み枠を有する。図２（配列番 号２）のポリペプチドは、バシラス・サチリス由来のＲｅｓＤ調節タンパク質に 対し約６６％の同一性を有する。 本発明のポリヌクレオチドは、クローニングにより得るか、もしくは化学合成 技術により得るか、またはそれらを組み合わせて得た、ｍＲＮＡ等のＲＮＡの形 態、または例えばｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態であってもよ い。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖のいずれであってもよい。一本鎖ＤＮＡはセン ス鎖としても知られているコーディング鎖であってもよく、またはアンチセンス 鎖とも称される非コーディング鎖であってもよい。 ポリペプチドをコードする配列は、図１（配列番号１）に示されるポリヌクレ オチドのコーディング配列と同一であってもよい。また、それは、遺伝暗号の重 複性（縮重性）の結果、図２（配列番号２）のポリペプチドをコードする異なる 配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。 図２（配列番号２）のポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは 、成熟ポリペプチドのコーディング配列自体；成熟ポリペプチドのコーディング 配 列および付加コーディング配列、例えばプレ、プロ、プレプロタンパク質配列等 のリーダーまたは分泌配列をコードするコーディング配列；付加非コーディング 配列と一緒に、前記した付加コーディング配列と共にまたはなしで、例えば、限 定するものではないが、転写にて役割を果たす転写された非翻訳配列（例えば、 終止シグナルを含む）などの非コーディング５′および３′配列、リボソーム結 合部位、ｍＲＮＡ安定性エレメント、付加機能を供給する配列などの付加アミノ 酸をコードする付加コーディング配列を有する成熟ポリペプチドのコーディング 配列を包含するが、これらに限定されるものではない。かくして、例えば、ポリ ペプチドは、融合ポリペプチドの精製を促す、ペプチドなどのマーカー配列に融 合していてもよい。本発明のこの態様のある具体例において、マーカー配列はヘ キサ−ヒスチジンペプチド、例えば、とりわけｐＱＥベクター（Qiagen,Inc.） 中に提供されるタグであり、多くが市販により入手可能である。例えば、Gentz ら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，86:821-824（1989）に記載されるように、 ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の通常の精製法を提供する。ＨＡタグもま た融合タンパク質の生成に使用でき、インフルエンザ・ヘマググルチニン・タン パク質由来のエピトープに対応する(これについては例えばWilson ら、Cell，37 ，767（1984）に記載されている。)。本発明のポリヌクレオチドはまた、構造遺 伝子およびその天然において関連している遺伝学的エレメントを含むポリヌクレ オチドを包含するが、これに限定されるものではない。 本発明はさらに、図２（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ ドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、本明細書で前記したポ リヌクレオチドの変種に関する。ポリヌクレオチドの変種は、自然に生じる対立 遺伝子変種などの自然に生じる変種であってもよく、または自然に発生すること が知られていない変種であってもよい。このようなポリヌクレオチドの非天然変 種は、ポリヌクレオチド、細胞または生物に適用される方法を含め、突然変異誘 発技術により作ることができる。 この点における変種には、ヌクレオチド置換、欠失または付加により前記のポ リヌクレオチドとは異なる変種がある。置換、欠失または付加は１またはそれ以 上のヌクレオチドに起こる。変種はコーディングもしくは非コーディング領域ま たはその両方において変化していてもよい。コーディング領域における変化が保 存的または非保存的アミノ酸置換、欠損または付加を生成するかもしれない。 この点に関する本発明の特に好ましい具体例には、図２（配列番号２）に示す アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；それらの変 種、アナログ、誘導体およびフラグメントならびに変種、アナログおよび誘導体 のフラグメントがある。 この点において、さらに特に好ましくは、図２（配列番号２）のポリペプチド で、そのうち、数個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または０個 のアミノ酸残基がいずれかの組み合わせで置換、欠失または付加されているアミ ノ酸配列を有する、配列番号１の変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、 ならびにそのフラグメントの変種、アナログおよび誘導体をコードするポリヌク レオチドである。中でもとりわけ好ましいものは、サイレント置換、付加および 欠失であり、配列番号１の遺伝子の特性および活性を変えないものである。また 、この点に関してとりわけ好ましいものは、保存的置換である。最も好ましいも のは、置換されていない、図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有するポリペプ チドをコードするポリヌクレオチドである。 本発明のさらに好ましい態様は、図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列を有 するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して全長にわたって少なく とも７０％同一のポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチドに相補的な ポリヌクレオチドである。また、寄託エス・アウレウスＷＣＵＨ２９のＤＮＡの ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して全長にわたって少なくとも ８０％同一である領域を含むポリヌクレオチド、およびそれらに相補的なポリヌ クレオチドが最も好ましい。この点において、その同じものに対して全長にわた って少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドがとりわけ好ましく、 中でも少なくとも９５％の同一性を有するものが特に好ましい。さらには、少な くとも９５％の同一性を有するものの中でも少なくとも９７％であるのがより好 ましく、その中でも少なくとも９８％および少なくとも９９％であるのが特に好 ましく、さらに少なくとも９９％であるのがより好ましい。好ましい具体例にお いて、本明細書において前記したポリヌクレオチドに対しハイブリダイズするポ リヌクレオチドは、配列番号２の推定アミノ酸配列により特徴付けられるポリペ プチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコード する。 この点に関して好ましい具体例は、さらには、図１（配列番号１）のＤＮＡに よりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能または活性を 保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明はさらに本 明細書で前記した配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点 において、本発明は、特に、ストリンジェントな条件下で本明細書で前記したポ リヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で用 いる「ストリンジェントな条件」なる用語は、ハイブリダイゼーションが配列間 で少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ起 こることを意味する。 本発明のポリヌクレオチドアッセイについて本明細書でさらに説明するように 、例えば、前記したように本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよ びゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして用い、配列番号１の配 列をコードする完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、ならびに配列番 号１に対して高度な配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクロ ーンを単離することができる。かかるプローブは、一般に、少なくとも１５塩基 を含む。好ましくは、かかるプローブは少なくとも３０塩基を含み、少なくとも ５０塩基を含んでいてもよい。特に好ましいプローブは少なくとも３０塩基を含 み、５０以下の塩基を含む。例えば、本発明の遺伝子のコーディング領域は、既 知ＤＮＡ配列を用いてスクリーニングして単離し、オリゴヌクレオチドプローブ を合成することができる。ついで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有す る標識化オリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ のライブラリーをスクリーニングし、ライブラリーのどのメンバーがプローブと ハイブリダイズするかを決定する。 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、さらにポリヌクレオチドア ッセイに関連して本明細書でさらに説明するように、疾患、特にヒト疾患の治療 法および診断法の発見のための研究試薬および材料として使用できる。 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、さらにはポリヌクレオチド アッセイに関連して本明細書でさらに説明するように、疾患、特にヒト疾患の治 療法および診断法の発見のための研究試薬および材料として使用できる。 配列番号１の配列由来のオリゴヌクレオチドである本発明のポリヌクレオチド は、本明細書にて記載した方法、好ましくはＰＣＲにて使用でき、本明細書にお いて同定された配列が、全体としてまたは部分的に、感染組織にて転写されるか どうかを決定できる。かかる配列はまた、病原体が達成した感染の段階および型 の診断にも有用であると認識される。 ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質に、さらなるアミノもしくはカルボキシ ル末端アミノ酸が加わるか、または成熟ポリペプチドの内部にアミノ酸が加わっ た（例えば成熟形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）ポリペプチドを コードできる。かかる配列は前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセッシン グにおいて役割を有し、タンパク質を輸送し、タンパク質の半減期を長くしたり 短くしたり、またはとりわけアッセイもしくは製造のためのタンパク質の取り扱 いを容易にすることができる。インビボで一般的なように、付加アミノ酸は、細 胞酵素により成熟タンパク質からプロセッシングで取り除かれる。 １またはそれ以上のプロ配列と融合したポリペプチドの成熟形態を有する前駆 体タンパク質は、ポリペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去さ れると、このような不活性前駆体は一般に活性化される。プロ配列のいくつかま たは全てを、活性化の前に除去してもよい。一般に、このような前駆体はプロタ ンパク質と称される。 総じて、本発明のポリヌクレオチドは成熟タンパク質、リーダー配列を加えた 成熟タンパク質(プレタンパク質と称することもできる)、プレタンパク質のリー ダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体 、またはリーダー配列および１またはそれ以上のポリペプチドの活性および成熟 形 態を生じるプロセッシング工程で除去されるプロ配列を有するプロタンパク質の 前駆体であるプレプロタンパク質をコードしていてもよい。 寄託材料 寄託は、特許手続きの目的で微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約の 条件下で行われている。特許が発行されると何らの制限または条件もなく、最終 的には株は分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ．Ｓ ．Ｃ．１１２条のもとに要求されるような、寄託が実施可能要件であることを承 認するものではない。エス・アウレウスＷＨＵＨ２９は、National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd．(NCIMB),23 St．Machar Drive，Abe rdeen，AB2 IRY Aberdeen，Scotland に、受託番号ＮＣＩＭＢ40711 として、１ ９９５年９月１１日に寄託されている。、 寄託材料に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされ るポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の配列の記載と矛盾する事象におい て支配的である。 寄託材料を製造、使用または販売するためにはライセンスが必要であるが、そ のようなライセンスはここで付与されるものではない。 ポリペプチド 本発明はさらには、図２（配列番号２）に示されるような２３３アミノ酸の長 さの推定アミノ酸配列を有する新規なスタフィロコッカス・アウレウス応答レギ ュレータータンパク質に関する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド 、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであってもよく、好ましくは、組換 えポリペプチドである。 また、本発明は、これらのポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導 体にも関する。「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」なる用語は、図２ （配列番号２）のポリペプチドをいう場合、かかるポリペプチドと本質的に同一 の生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。それゆえ、アナ ログには、プロタンパク質部分を切断して活性成熟ポリペプチドを生成して活性 化できるプロタンパク質が包含される。 図２（配列番号２）のポリペプチドのフラグメント、誘導体もしくはアナログ は、(ｉ)１またはそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基 （好ましくは保存的アミノ酸残基）により置換されたもので、かかる置換アミノ 酸残基は遺伝暗号によりコードされたものであってもなくてもよい、または（ｉ ｉ）１またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成 熟ポリペプチドが別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を長くする化合物( 例えばポリエチレングリコール)と融合したもの、または（ｉｖ）付加アミノ酸 がリーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質 配列の精製に用いられる配列などの成熟ポリペプチドと融合したものであっても よい。かかるフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示より当業 者に明らかであると考えられる。 この点において、本発明の特に好ましい具体例には、図２（配列番号２）に示 される新規応答レギュレータータンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチド 、その変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、およびそのフラグメントの 変種、アナログおよび誘導体がある。また、この点において、本発明の特に好ま しい具体例は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変種、ア ナログ、誘導体およびフラグメント、およびそのフラグメントの変種、アナログ および誘導体である。 好ましい変種には、保存的アミノ酸置換により対照標準と異なる変種がある。 かかる置換は、ポリペプチドの所定のアミノ酸を特性の類似した別のアミノ酸で 置換したものである。典型的には、保存的置換として認められるのは、脂肪族ア ミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間での相互の置換；ヒドロキシル残 基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基 ＡｓｎおよびＧｌｎ間での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換および芳 香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間での置換である。 この点においてさらに好ましいのは、数個、わずかな、５〜１０、１〜５、１ 〜３、２、１または０個のアミノ酸残基をいずれか組み合わせて置換、欠失また は付加した、図２（配列番号２）のポリペプチドのアミノ酸配列を有する、変種 、 アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびにそのフラグメントの変種、アナ ログおよび誘導体である。これらの中でもとりわけ好ましいのは、本発明のポリ ペプチドの特性および活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失であ る。またこの点において特に好ましいのは、保存的置換である。最も好ましいの は、置換していない図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有するポリペプチドで ある。好ましくは、配列番号２の推定アミノ酸配列により特徴付けられるポリペ プチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、該ポリペプチドと本質的に同 じ生物学的機能または活性を保持する。それゆえ、アナログには、プロタンパク 質部分を切断して活性成熟ポリペプチドを生成して活性化できるプロタンパク質 が包含される。 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離形態で提供されるのが好 ましく、均質になるまで精製するのが好ましい。 本発明のポリペプチドは、図２（配列番号２）のポリペプチド（特に成熟ポリ ペプチド）ならびに図２(配列番号２)のポリペプチドに対して少なくとも７０％ の同一性を有するポリペプチド、好ましくは図２（配列番号２）のポリペプチド に対して少なくとも８０％の同一性、さらに好ましくは図２（配列番号２）のポ リペプチドに対して少なくとも９０％の類似性(さらに好ましくは少なくとも９ ０％の同一性)、その上さらに好ましくは図２（配列番号２）のポリペプチドに 対して少なくとも９５％の類似性（そのうえさらに好ましくは９５％の同一性） を有するポリペプチドを包含し、また一般に少なくとも３０個のアミノ酸、さら に好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含むポリペプチドのそのような部分 を有する、かかるポリペプチドの部分も包含する。 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成による対応 完全長ポリペプチドの製造に用いることができる；したがって、フラグメントを 完全長のポリペプチドを製造するための中間体として用いることができる。本発 明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分を用いて本発明の完全長のポリ ヌクレオチドを合成することができる。 フラグメント また本発明のこの態様の好ましい具体例には、配列番号２（図２）のフラグメ ント、および図２（配列番号２）のポリペプチドの変種および誘導体のフラグメ ントを含むポリペプチドがある。 この点において、フラグメントは前記のポリペプチドおよびその変種または誘 導体のアミノ酸配列が、全てではなく一部に対して全く同一であるアミノ酸配列 を有するポリペプチドである。 かかるフラグメントは、「独立している」ものであってもよく、すなわち他のア ミノ酸またはポリペプチドの一部ではないか、もしくはそれに融合しておらず、 または一部もしくは領域を形成するより大きなポリペプチド内に含まれていても よい。より大きなポリペプチド内に含まれる場合、本明細書で説明するフラグメ ントは単一の連続した領域を形成するのが最も好ましい。しかしながら、数個の フラグメントが単一の、より大きなポリペプチド内に含まれてもよい。例えば、 ある好ましい具体例は、フラグメントのアミノ末端に融合した異型のプレおよび プロポリペプチド領域、および該フラグメントのカルボキシル末端に融合した付 加領域を有し、宿主中に発現するように設計された前駆体ポリペプチド内に含ま れる本発明のポリペプチドのフラグメントに関する。したがって、本明細書の意 図するところの一の態様におけるフラグメントは、配列番号２由来の融合ポリペ プチドまたは融合タンパク質の一つのまたは複数の部分を意味する。 本発明のポリペプチドフラグメントの代表例は、例えば、アミノ酸番号約１な いし約２０、約２１ないし約４０、約４１ないし約６０、約６１ないし約８０、 約８１ないし約１００、および約１０１ないし約２２４のフラグメント、ならび にこれらの２０個のアミノ酸からなるフラグメントの組み合わせを包含する。 この意味からすると、本明細書で用いる「約」は、詳細には、いずれかの末端 または両末端において数個、少し、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ 酸だけ長いまたは短いことを包含する。 本発明の好ましいフラグメントは、例えば、配列番号２の末端切断ポリペプチ ドを包含する。末端切断ポリペプチドは、アミノ末端を含む一連の残基（すなわ ち、連続領域、一部または部分）もしくはカルボキシル末端を含む一連の残基の 欠失、または二重末端切断突然変異体のように一つはアミノ末端を含み、一つは カルボキシル末端を含む二つの連続した一連の残基の欠失を除けば、図２のアミ ノ酸配列を有するポリペプチド、またはその変種もしくは誘導体を包含する。前 記した大きさの範囲のフラグメントもまた末端切断フラグメントの好ましい具体 例であり、一般に、フラグメントの中でも特に好ましい。宿主細胞、特にスタフ ィロコッカスにおける本発明のポリヌクレオチドの縮重形態もまた好ましい。 また本発明のこの態様にて、配列番号２の配列により特徴付けられるポリペプ チドの構造的または機能的属性により特徴づけられるフラグメントも好ましい。 この点において本発明の好ましい具体例は、本発明のポリペプチドのアルファー ヘリックスおよびアルファーヘリックス形成領域、ベータシートおよびベータシ ート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親 水領域、疎水領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、 界面形成領域、基質結合領域および高抗原指数領域を含むフラグメントおよびか かるフラグメントの組み合わせを包含する。好ましい領域は、本発明のポリペプ チドの活性を媒介する領域である。この点において、類似活性もしくは改善され た活性を有するもの、または望ましくない活性を減じたものを含め、本発明の応 答レギュレーターポリペプチドの化学的、生物学的またはその他の活性を有する フラグメントが最も好ましい。さらに好ましいポリヌクレオチドフラグメントは 、動物特にヒトにおいて抗原的または免疫原的であるフラグメントである。 本発明はまた、とりわけ、前記のフラグメントをコードするポリヌクレオチド 、そのフラグメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌ クレオチド、特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオ チド、およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを増幅するための ＰＣＲプライマーなどのポリヌクレオチドに関することが理解されよう。この点 において、好ましいポリヌクレオチドは、前記するような、好ましいフラグメン トに対応するポリヌクレオチドである。 ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを含 むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術に よる本発明のポリペプチドの製造にも関する。 宿主細胞（本明細書中に定義するような）は、遺伝子操作して、本発明のポリ ヌクレオチドを組み込み、本発明のポリペプチドを発現させることができる。ポ リヌクレオチドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション 、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マ イクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロ ポレーション、トランスダクション、スクレープ・ローディング、弾道導入、感 染または他の方法により行うことができる。かかる方法は多くの標準的実験室マ ニュアル、例えば、Davis ら、Basic Methods in Molecular Biology，(1986)お よびSambrook ら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold S pring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)に記載 されている。操作された宿主細胞を、プロモーターの活性化、トランスフォーマ ントの選択または遺伝子の増幅に適当なように修飾された通常の栄養培地中で培 養できる。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現の選択された宿主細胞にお いてすでに用いられたものであり、当業者に明らかなものであろう。 宿主細胞内のポリヌクレオチド構築物を通常の方法に用いて、組換え配列によ りコードされる遺伝子産物を製造することができる。また、本発明のポリペプチ ドは通常のペプチド合成により合成的に製造できる。 成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌または他の細胞中、適当なプロ モーターの制御下で発現させることができる。無細胞翻訳系を用いて、本発明の ＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてかかるタンパク質を製造することもでき る。原核および真核生物宿主で用いる適当なクローニングおよび発現ベクターは 、Sambrook ら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spr ing Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)に記載さ れている。 本発明のこの態様によれば、ベクターは、例えば、プラスミドベクター、一本 鎖または二本鎖ファージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイ ルスベクターであってもよい。プラスミドは、一般に、当業者に馴染みの標準的 命名法にしたがって、小文字ｐを前に、および／または大文字および／または数 字が続くようにデザインされている。本明細書に開示される出発プラスミドは、 市販されているか、汎用されているか、または周知の公知操作を汎用することに より利用可能なプラスミドより構築することができる。本発明にしたがって用い ることのできる、多くのプラスミドおよび他のクローニングおよび発現ベクター が周知であり、当業者であれば容易に利用することもできる。 ある点において、とりわけ好ましいベクターは、本発明のポリヌクレオチドお よびポリペプチの発現のためのベクターである。一般に、かかるベクターは、発 現させるべきポリヌクレオチドに機能的に連結した、宿主における発現に有効な シス作用調節領域を含む。適当なトランス作用性因子は宿主により供給されるか 、補足ベクターにより供給されるか、または宿主への導入時にベクター自身によ り供給されるかのいずれかである。 この点におけるある好ましい具体例では、ベクターは特異的発現を提供する。 かかる特異的発現は、誘導可能な発現であるか、もしくはある型の細胞でのみ発 現するか、または誘導可能かつ細胞特異性の両方での発現であってもよい。誘導 可能なベクターのうち、特に好ましいベクターは、温度および栄養添加物などの 操作が容易である環境因子により発現を誘導できるベクターである。本発明のこ の態様に適当な種々のベクターは、原核および真核宿主で用いられる構成および 誘導可能な発現ベクターを含め、当業者に周知であり、かつ慣用されている。 非常に多くの種類の発現ベクターを用いて、本発明のポリペプチドを発現でき る。かかるベクターには、とりわけ染色体、エピソームおよびウイルス由来のベ クター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン 由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、 例えばバキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス 、アデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロ ウ イルス等のウイルス由来のベクター、ならびにコスミドおよびファージミド(pha gemids)などのプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝的エレメント由来のベ クターのごとき、その組み合わせに由来するベクターがあり、全て本発明のこの 態様にしたがって発現に用いることができる。一般に、宿主にてポリペプチドを 発現するためにポリヌクレオチドを保持、伸長または発現するのに適したいずれ のベクターも、この点における発現に使用できる。適当なベクターの選択は、当 業者のレベルにおいてよく行うことができる。 適当なＤＮＡ配列は、例えば、Sambrook ら、Molecular Cloning，A Laborato ry Manual，2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Har bor，New York(1989)に記載されている方法などの種々の周知かつ慣用的技法に よりベクターに正方向または逆方向に挿入できる。 発現ベクター中のＤＮＡ配列は、例えば、ｍＲＮＡ転写を指令するプロモータ ー、リボソーム結合部位（細菌発現のため）および所望によりオペレーター（本 明細書において、「制御（control）エレメント」としてまとめて称する）を含む 、適当な発現制御配列（複数でも可）に作動するように連結され、発現を可能と する。かかるプロモーターの代表例としては、これに限定されるものではないが 、ファージラムダＰＬプロモーター、イー・コリ・ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃ プロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルスＬ ＴＲのプロモーター、プロテインＡ遺伝子（ｓｐａ）遺伝子プロモーターおよび シグナル配列、および他の真核または原核細胞またはそれらのウイルスにおいて 遺伝子の発現を制御することが知られる他のプロモーターが含まれる。 一般に、発現構築物は転写開始および終止部位を含み、転写された領域では翻 訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物により発現される成熟転写物のコ ーディング部分は、開始部分に翻訳開始ＡＵＧ、そして翻訳されるべきポリペプ チドの終末部分に適当に位置する終止コドンを含む。 制御配列に加えて、宿主細胞の生育に関連するタンパク質配列の発現の制御を 可能にする調節配列を添加することが望ましい。調節配列は、当業者に知られる ものであり、例には、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答し てスイッチオンまたはオフにされる遺伝子の発現を引き起こすものが含まれる。 調節エレメントの他の種類は、ベクター中、たとえば、エンハンサー配列中に存 在していてもよい。一般に、多くの常套手段によれば、かかる領域は、転写、例 えばとりわけ転写因子、レプレッサー結合部位および終止部位を調節することに より機能するであろう。伸長および発現のためのベクターは、一般に、選択可能 なマーカーおよび増幅領域、例えば、上記に引用したSambrookらに示される領域 を有するであろう。 発現ベクターは、制御配列に関してコーディング配列の位置および方向がコー ディング配列が制御配列の「制御」下に転写されるよう（すなわち、制御配列で ＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列を転写する）に、 特定のコーディング配列が適当な調節配列とともにベクター中に位置するように 、構築される。コーディング配列の修飾がこの目的を達成するために所望される 。たとえば、いくつかの場合において、適当な方向で制御配列に結合できるよう に；すなわち、読み枠を維持するように、配列を修飾する必要があるであろう。 制御配列および他の調節配列を、前記したクローニングベクターなどのベクター 中に挿入する前に、コーディング配列に連結することができる。別法として、コ ーディング配列をすでに制御配列および適当な制限部位を有する発現ベクター中 に直接クローニングすることができる。コーディング配列は、シグナルペプチド またはリーダー配列を含んでいてもよい。リーダー配列は、細菌宿主により翻訳 後プロセシングにおいて除去できる。たとえば、米国特許第4,431,739；4,452,4 37；4,338,397 号参照。 一般的に、組換え発現ベクターは、複製開始点および宿主細胞のトランスフォ ーメーションを可能にする選択マーカー(たとえば、イー・コリのアンピシリン 耐性遺伝子およびエス・セレビシアエ（S．cerevisiae）ＴＲＰ１遺伝子)、およ び下流構造配列の転写を調節するための高度に発現される遺伝子由来のプロモー ターを含む。異種構造配列は、翻訳開始および終止配列、および好ましくは、ペ リプラスム間隙または細胞外培地中に翻訳されたタンパク質を直接分泌できるよ うにするリーダー配列とともに適当な配置として組み込まれる。所望により、異 種配列は、たとえば、安定性または発現組換え産物の簡単な精製などの所望の特 徴を与えるＮ−末端同定ペプチドを含む、融合タンパク質をコードすることがで きる。 適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例えばストレプトコッカス(連鎖球菌)、ス タフィロコッカス(ブドウ球菌)、イー・コリ(大腸菌)、ストレプトマイセスおよ びバシラス・サチリス細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス細 胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞；動物細 胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨeＬa、Ｃ１２７、３T３、ＢＨＫ、２９３および ボーウェス（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞を包含する。 市販されている以下のベクターを例示として示す。細菌中で使用するのに好ま しいベクターには、キアゲン（Qiagen）より入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０ およびｐＱＥ−９；ストラタジン（Stratagene）より入手可能なｐＥＴ−３ベク ター(Stratagene)、ｐＤ１０、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢＳベクター、ファージェス クリプト（Phagescript）ベクター、ブルースクリプト（Bluescript）ベクター 、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ＡおよびｐＮＨ４６Ａ；ならびにファ ルマシア（Pharmacia）より入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐ ＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；およびｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３ ７０１７）がある。好ましい真核生物ベクターには、ストラタジンより入手可能 なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならび にファルマシアより入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ がある。クローニング用の組換えＤＮＡベクターおよびそれらでトランスフォー ムされる宿主細胞の例には、バクテリオファージ(イー・コリ)、ｐＢＲ３２２( イー・コリ)、ｐＡＣＹＣ１７７(イー・コリ)、ｐＫＴ２３０(グラム−陰性細菌 )、ｐＧＶ１１０６(グラム−陰性細菌)、ｐＬＡＦＲ１(グラム−陰性細菌)、ｐ ＭＥ２９０(非イー・コリグラム−陰性細菌)、ｐＨＶ１４(イー・コリおよびバ シラス・サチリス)、ｐＢＤ９(バシラス)、ｐＩＪ６１(ストレプトマイセス)、 ｐＵＣ６(ストレプトマイセス)、ＹＩｐ５(サッカロマイセス)、バキュロウイル ス昆虫細胞系、ＹＣｐ１９(サッカロマイセス)。一般には、″DNA Cloning″: V ols． I & II，Glover et al．ed．IRL Press Oxford(1985)（1987）および; T．Mania tis et al．″Molecular Cloning″Cold Spring Harbor Laboratory(1982)を参 照のこと。これらのベクターは単に多くの市販されている周知のベクターを例示 するために列挙してあるにすぎず、本発明のこの態様にしたがって使用するのに 、当業者に入手可能なベクターである。宿主にて本発明のポリヌクレオチドまた はポリペプチドを、例えば、導入、保持、伸長または発現するのに適した他のプ ラスミドまたはベクターが、本発明のこの態様において使用できることは理解さ れよう。 制限部位または候補プロモーターフラグメント、すなわちプロモーターを有す るかもしれないフラグメントを導入するための部位の下流に、プロモーター領域 を欠いたリポーター転写ユニット、例えばクロラムフェニコールアセチルトラン スフェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットを含有するベクターを用いて、いずれか 望ましい遺伝子からプロモーター領域を選択することができる。周知のように、 プロモーター含有フラグメントをｃａｔ遺伝子の上流の制限部位でベクターに導 入すると、ＣＡＴ活性の産生を引き起こし、その活性は標準的なＣＡＴアッセイ により検出できる。ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７などのこの目的に適するベ クターが周知であり、容易に入手可能である。本発明のポリヌクレオチドを発現 するためのプロモーターには、周知の容易に入手できるプロモーターのみならず 、リポーター遺伝子を用いて前記の技術により容易に得ることができるプロモー ターもある。 本発明によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適した公知の原核 生物プロモーターには、イー・コリのｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモータ ーおよびｔｒｐプロモーターがある。 この点において適当な公知の真核生物プロモーターには、ＣＭＶ即時型プロモ ーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモ ーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター、例えばラウス肉腫ウイルス(「Ｒ ＳＶ」)のプロモーターならびにマウス・メタロチオネイン−Ｉプロモーターなど のメタロチオネインプロモーター例えばがある。 組換え発現ベクターは、例えば、複製開始点、好ましくは、高発現遺伝子に由 来し、下流の構造配列の転写を指令するプロモーターおよびベクターに暴露した 後のベクター含有細胞の単離を可能とする選択可能なマーカーを含む。たとえば 、選択可能なマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロフォレートレダクター ゼまたはネオマイシン耐性など、または、イー・コリにおけるテトラサイクリン またはアンピシリン耐性などの、トランスフォームされた宿主細胞選択のための 表現型の特性を提供する。 本発明のポリペプチドの異種構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチド を、一般に、標準法を用いてベクターに挿入し、発現用プロモーターに機能的に 連結させる。ポリヌクレオチドを、転写開始部位がリボソーム結合部位に対して 適宜５′にあるように位置させる。リボソーム結合部位は、発現させるべきポリ ペプチドの翻訳を開始するＡＵＧの５′にある。一般に、開始コドン、通常ＡＵ Ｇで始まり、リボソーム結合部位および開始ＡＵＧの間にある、読み枠は他にな い。また、一般に、ポリペプチドの末端に翻訳停止コドンがあり、真核生物宿主 で用いられる構築物中に、ポリアデニル化シグナルがあるであろう。転写領域の ３′末端に適宜配置される転写終止シグナルはまた、ポリヌクレオチド構築物に 含まれていてもよい。 翻訳タンパク質を、小胞体内腔、ペリプラスム間隙または細胞外環境へ分泌す るために、適当な分泌シグナルが発現するポリペプチドに組み込まれていてもよ い。これらのシグナルはポリペプチドに対する本来のものであってもよく、また は異種シグナルであってもよい。 ポリペプチドは、修飾された形態、例えば融合タンパク質の形態で発現しても よく、分泌シグナルのみならず付加的な異種機能性領域を有していてもよい。こ のように、例えば付加アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を、ポリペプチドのＮ −末端に付加し、精製中またはその後の操作および貯蔵中の、宿主細胞内での安 定性および持続性を改善する。また、精製を容易にするために、ポリペプチドに 領域を付加することもできる。かかる領域はポリペプチドの最終的な調製の前に 除去できる。ペプチド部分をポリペプチドに付加し、とりわけ、分泌または放出 を誘起し、安定性を改善するかまたは精製を容易にするのは、当該分野でよくあ ることであり、慣用される技術である。好ましい融合タンパク質は、ポリペプチ ドを可溶化または精製するのに有用な免疫グロブリンに由来する異種領域を含む 。例えばＥＰ−Ａ−０４６４５３３（カナダ国の対応特許２０４５８６９）は、 免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分と、別のタンパク質またはその一部 とからなる融合タンパク質を開示する。薬物の開発において、例えば、タンパク 質を、高処理能力スクリーニングアッセイの目的で抗体のＦｃ部分と融合させ、 アンタゴニストを同定することができる。D.Bennett ら、Journal of Molecular Recognition，8，52-58（1995）およびK.Johanson ら、The Journal of Biolog ical Chemistry，270(16)，9459-9471（1995）を参照のこと。 選択した発現系および宿主に応じ、前記した発現ベクターでトランスフォーム された宿主細胞を対象のポリペプチドが発現される条件下で生育させることによ り、本発明のポリペプチドを製造できる。成熟タンパク質がきわめて疎水性な領 域を有しており過剰発現の産物を不溶性とする場合、疎水性領域が削除された末 端切断されたタンパク質を発現することが所望される。適当な生育条件および回 収方法の選択は、当業者の技術の範囲内である。 組換え製造方法において用いた宿主に応じ、本発明のポリペプチドはグリコシ ル化されてもよく、グリコシル化されなくてもよい。本発明のポリペプチドは、 開始メチオニンアミノ酸残基を含んでいてもよい。ついで、ポリペプチドは宿主 細胞から単離され、精製される。発現系がポリペプチドを生育培地中に分泌する 場合、ポリペプチドを培地から直接精製することができる。ポリペプチドが分泌 されない場合、細胞溶解物から単離するかまたは細胞膜フラクションから回収す る。ポリペプチドが細胞表面上に位置する場合、細胞全体または単離膜を所望の 遺伝子産物の解析可能源として用いることができる。 ついで、典型的には、細胞を遠心分離により収穫し、物理的または化学的手段 により破壊し、得られた粗抽出物をさらに精製するために保持する。タンパク質 の発現に用いた微生物細胞は、凍結−融解サイクル、ソニケーション、機械的破 壊または細胞溶解剤の使用を含め、常法により破壊でき、かかる方法は当業者に 周知である。 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、 アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ ラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフ ィーを包含する周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製でき る。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィーを精製に用いる。ポリペプ チドが単離および／または精製中に変性する場合、再び活性なコンホーメーショ ンを得るために、タンパク質を再生するための周知の技術を用いてもよい。 ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、例えば診断用試薬として相補的ポリヌクレオチドを検出するた めの本発明のポリヌクレオチドの使用にも関する。真核生物、特に哺乳動物、特 にヒトにおいて配列番号１の配列により特徴付けられる遺伝子を検出することに より、疾患の診断方法が得られるであろう。本発明の遺伝子を有する生物に感染 した真核生物(本明細書において「個体」とも称する)、特に哺乳動物、特にヒト を、種々の技術により、ＤＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸は感染した個 体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚から入手できる。 ゲノムＤＮＡは検出に直接使用してもよく、または分析前にＰＣＲを用いて酵素 的に増幅させてもよい(Saiki ら、Nature，324，163-166(1986))。ＲＮＡまたは ｃＤＮＡもまた同様に用いることができる。一例として、配列番号１の核酸に相 補的なＰＣＲプライマーを用いて、遺伝子の存在および／または発現を同定およ び分析できる。ＰＣＲを用いて、真核生物、特に哺乳動物、特にヒトに存在する 原核生物の株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけできる。例え ば、対照標準の配列の遺伝子型と比較し、増幅産物の大きさの変化により欠失お よび挿入を検出できる。点突然変異は増幅したＤＮＡを放射性標識したＲＮＡに 、また別法として放射性標識したアンチセンスＤＮＡにハイブリダイゼーション させることにより同定できる。完全に対合する配列は、ＲＮaseＡ消化により、 または融解温度の差異により、誤対合二重らせんと区別できる。 対照標準の遺伝子および突然変異を有する遺伝子間の配列の違いはまた、直接 的ＤＮＡ配列決定により明らかにすることもできる。加えて、クローン化ＤＮＡ セグメントを特異的ＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして用いるこ とができる。かかる方法の感度は、ＰＣＲまたは別の増幅法を適宜使用すること により、非常に増強させることができる。例えば、配列決定プライマーを二本鎖 ＰＣＲ生成物または修飾ＰＣＲにより生じた一本鎖鋳型分子と共に用いる。配列 決定は、放射標識したヌクレオチドを用いる従来の方法により、または蛍光タグ を用いる自動配列決定法により行うことができる。 ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝的特徴付けは、変性剤を含むまたは含まないゲ ル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動度の変化を検出することにより達成できる 。小さな配列の欠失および挿入は高分解ゲル電気泳動により可視化できる。異な る配列のＤＮＡフラグメントは、その個々の融解または部分的融解温度によって 、異なるＤＮＡフラグメントの移動がゲル中の異なる位置で遅くなる、変性ホル ムアミド勾配ゲル上にて区別できる(例えばMeyers ら、Science，230:1242(1985 )参照)。 特異的な位置での配列の変化はまた、ＲＮaseおよびＳ１保護などのヌクレア ーゼ保護アッセイまたは化学的切断法によって明らかにすることができる(例え ば、Cotton ら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，85:4397-4401(1985))。 このように、ハイブリダイゼーション、ＲＮase保護、化学的切断、直接的Ｄ ＮＡ配列決定または制限酵素の使用、例えば、制限フラグメント長多形性（rest riction fragment length polymorphism「ＲＦＬＰ」）およびゲノムＤＮＡのサザ ンブロッティングなどの方法により、特異的ＤＮＡ配列を検出できる。 従来のゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決定法に加えて、突然変異をまたイン サイチュー分析（in situ analysis）により検出することもできる。 本発明の遺伝子の突然変異または多形型を有する細胞をまた、例えば、抗原型 決定を可能とする種々の技法により、ＤＮＡレベルで検出することもできる。例 えば、ＲＴ−ＰＣＲを突然変異を検出するのに使用できる。ＲＴ−ＰＣＲを、例 えば、GeneScanなどの自動検出系と組み合わせて用いるのが特に好ましい。ＲＮ ＡまたはｃＤＮＡもまた同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに用いることがで きる。一例として、配列番号２をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを 変異を同定および分析するのに用いることができる。適当なプライマーは、配列 番号１のフラグメント、好ましくは少なくとも１５塩基対の長さのもの、ならび に、それらに相補的な配列を含む。該プライマーを用いて個体から単離した遺伝 子を増幅し、ついでその遺伝子をＤＮＡ配列を明らかにするための種々の技法に 供してもよい。このようにして、ＤＮＡ配列における突然変異を診断してもよい 。 本発明は、疾患、好ましくは細菌感染、さらに好ましくはスタフィロコッカス 感染を診断する方法であって、個体由来のサンプルより、図１（配列番号１）の 配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルの増加を測定することからなる方法 を提供する。本発明のポリヌクレオチドの発現の増加は、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ −ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼー ションなどのポリヌクレオチドの定量について当該分野にて周知の方法を用いて 測定することができる。 ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、正常および異常なレベルの測定を含め、細胞および組織中の本 発明のタンパク質およびポリペプチドのレベルを検出するための定量および診断 アッセイなどの診断アッセイに関する。このように、例えば、正常な対照標準の 組織サンプルと比較し、本発明のタンパク質の過剰発現を検出することについて 本発明による診断アッセイを用いて、感染の存在を検出することができる。宿主 由来のサンプル中の本発明のタンパク質のレベルを測定するために用いることが できるアッセイ技法は当業者に周知である。かかるアッセイ方法は、ラジオイム ノアッセイ、競争結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッ セイを包含する。このうちＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡアッセイではまず 、本発明のポリペプチド、特に配列番号２のアミノ酸配列により特徴付けられる ポリペプチドまたはそれらの誘導体に特異的な抗体を調製する。好ましくは、抗 体はモノクローナル抗体である。加えて、一般に、モノクローナル抗体に結合す るリポーター抗体が調製される。リボーター抗体は放射活性、蛍光または酵素試 薬、 たとえばセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼなどの検出可能な試薬に結合する。 抗体 ポリペプチド、そのフラグメントもしくは他の誘導体、またはそのアナログ、 またはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生成する免疫原として用 いることができる。本発明は、例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗 体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントまたはＦａ ｂ発現ライブラリーの産物を包含する。 発明の配列に対応するポリペプチドに対して得られる抗体は、ポリペプチドを 、動物に直接注射するかまたはポリペプチドを動物、好ましくはヒト以外の動物 に投与することにより得ることができる。このようにして得られた抗体はポリペ プチドそのものと結合する。この方法ではポリペプチドのフラグメントのみをコ ードする配列であっても元のポリペプチド全体に結合する抗体の生成に用いるこ とができる。かかる抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織から該ポリペプ チドを単離することができる。 モノクローナル抗体を調製するには、連続的細胞系培養により産生される抗体 を提供する当該分野において公知のいずれの技術をも用いることができる。例え ば、Kohler，G.およびMilstein，C.，Nature，256，495-497(1975)；Kozbor ら 、Immunology Today，4：72(1983))；Cole ら、Monoclonal Antibodies and Can cer Therapy，Alan R Liss,Inc.、77-96頁（1985）に記載の方法などの種々の方 法が挙げられる。 一本鎖抗体の生成のために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）を 適用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体を産生するこ とができる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物などの他の生 物を用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現させ ることができる。 別法として、ファージディスプレイ技術を利用して、抗Ｆｂｐの保持に関して スクリーニングしたヒト由来のリンパ球のＰＣＲ増幅したｖ−遺伝子のレパート リー由来の、または未処理のライブラリー由来のポリペプチドに対する結合活性 を有する抗体遺伝子を選択することができる(McCafferty，J.ら、Nature 348，5 52-554(1990)；Marks，J.ら、Biotechnology 10，779-783(1992))。これらの抗 体の親和性は、チェーンシャフリング(chain shuffling)（Clackson，T.ら、Nat ure 352，624-628(1991)）により改善することもできる。 ２つの抗原結合ドメインがあるならば、各ドメインを、「二特異的」抗体と称さ れる、異なるエピトープに向けることができる。 前記の抗体を用いて、本発明のポリペプチドを発現するクローンを単離もしく は同定し、該抗体を単離および／または精製するための固体支持体に結合させる ことで、アフィニティクロマトグラフィーにより、該ポリペプチドを精製するこ とができる。 したがって、とりわけ本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて、感染、特 に細菌感染およびスタフィロコッカス感染を阻害および／または治療することが できる。 ポリペプチド誘導体は、本発明の特定の態様を形成する、抗原的に、エピトー プ的にまたは免疫学的に等価な誘導体を包含する。本明細書で用いる「抗原的に 等価な誘導体」なる用語は、本発明にしたがって、タンパク質またはポリペプチ ドに対して誘起された場合、病原体および哺乳動物宿主間での即時的身体的相互 作用を妨げるある種の抗体により特異的に認識されるであろうポリペプチドまた はそれの同等物を包含する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」なる 用語は、脊椎動物において抗体を誘起させるのに適した処方にて用いた場合、抗 体が病原体および哺乳動物宿主間での即時的身体的相互作用を妨げるように作用 するペプチドまたはその同等物を包含する。 ポリペプチド、例えば抗原的または免疫学的に等価な誘導体またはその融合タ ンパク質は、マウスまたはその他の動物、例えばラットもしくはニワトリを免疫 するための抗原として使用できる。融合タンパク質はポリペプチドに安定性を付 与できる。抗原は、例えば接合することにより、免疫原性キャリヤタンパク質、 例えばウシ・血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホール・リムペット・ヘモシ アニン（keyhole limpet haemocyanin：ＫＬＨ）に結合させることができる。別 法として、タンパク質もしくはポリペプチド、またはその抗原的もしくは免疫学 的に等価なポリペプチドの多重コピーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫原生を 改良するために十分な抗原性を有しており、キャリヤーを使用しなくてよい。 好ましくは、抗体またはその誘導体を修飾して、個体における免疫原性を低下 させる。例えば、個体がヒトである場合、抗体は「ヒト化」されているのが最も 好ましく；その場合、ハイブリドーマ由来の抗体の相補性決定領域（複数でも可 ）がヒト・モノクローナル抗体に移されており、例えば、Jones，P.ら、Nature 321，522-525（1986）またはTempest ら、Biotechnology 9，266-273（1991）に 記載されている。 本発明のポリヌクレオチドを遺伝的免疫に使用する場合、好ましくは、例えば プラスミドＤＮＡの筋肉への直接注射(Wolffら、HumMol Genet，1:363(1992)；M anthorpe ら、Hum．Gene Ther.，4，419(1963))、特異的タンパク質キャリヤを 複合させたＤＮＡの送達(Wuら、J．Biol．Chem.，264，16985(1989))、リン酸カ ルシウムを用いるＤＮＡ共沈(Benvenisty & Reshef、Proc．Natl．Acad．Sci.， 83，9551(1986))、種々の形態のリボソーム中へのＤＮＡ封入(Kanedaら、Scienc e 243，375(1989))、微粒子爆撃（Tang ら、Nature 356，152(1992)；Eisenbrau n ら、DNA Cell Biol.，12，91(1993)）およびクローン化レトロウイルスを用い たインビボ感染（Seeger ら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，81，5849(1984)） などの適当な送達方法を用いる。 結合分子およびアッセイ 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに結合する結合 分子などの分子の同定方法をも提供する。該結合タンパク質をコードする遺伝子 は、当業者に公知の多くの方法、例えばリガンドパンニングおよびＦＡＣＳソー ティングより同定できる。かかる方法は多くの実験室マニュアル、例えば、Colig an ら、Current Protocols in Immunology、1(2)：Chapter 5（1991）に記載さ れている。また、標識されたリガンドを細胞抽出物に光親和性結合させることも できる。 また、本発明のポリペプチドを用いて、細胞中、または無細胞調製物中の、こ れらの結合分子の結合能力を評価することができる。 本発明のポリペプチドを用いて、例えば、細胞、無細胞調製物、化学的ライブ ラリー、および天然産物の混合物中における小型分子基質とリガンドとの結合を 評価することもできる。 アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子 本発明はまた、本発明の結合分子との相互作用などの、本発明のポリペプチド またはポリヌクレオチドの作用を充進（アゴニスト）または遮断（アンタゴニス ト）する化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法をも提供する。 例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために、膜、 細胞エンベロープもしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、またはそれら のいずれかの調製物を、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと結合す る分子を発現する細胞より調製することができる。該調製物を、アゴニストまた はアンタゴニストであるかもしれない候補分子の存在下または不在下で標識した 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと一緒にインキュベーションする 。候補分子が結合分子に結合する能力は、標識リガンドの結合の低下に反映され る。結合しても影響を及ぼさない分子は、ほとんどの場合、良好なアンタゴニス トであろう。よく結合し、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同じ または密接に関連する効果を誘起する分子はアゴニストである。 たとえば、抗細菌効果などの潜在的アゴニストおよびアンタゴニストの効果は 、例えば、候補分子と細胞または適当な細胞調製物との相互反応の後の、リポー ターシステムの活性を測定し、本発明の組成物と同じ効果を惹起する本発明のポ リヌクレオチドおよびポリペプチドまたは分子の効果と比較することにより測定 される。この点に関して有用なリポーターシステムは、生成物に転換される比色 標識基質、活性の変化に応答するリポーター遺伝子、および当該分野で公知の結 合アッセイを包含するが、これらに限定するものではない。 アンタゴニストのアッセイの別の例は、競争阻害アッセイに適した条件下で、 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび潜在的なアンタゴニストを 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと結合する膜結合分子、組換え結 合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド擬似物質と組 み合わせる、競合アッセイである。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチ ドを例えば放射活性または比色化合物により標識し、結合分子に結合した、また は生成物に変換した本発明の分子の数を正確に決定して、潜在的なアンタゴニス トの効果を評価できる。 潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリペプチドに結合し、それによりその 活性を阻害し、消滅させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体を 包含する。潜在的アンタゴニストはまた、結合分子などの、本発明のポリペプチ ドまたはポリヌクレオチドの活性を誘導することなく、結合分子の同一部位に結 合し、それにより分子を結合より排除することにより分子の作用を妨げる、密接 に関連したタンパク質または抗体などの、小型有機分子、ペプチド、ポリペプチ ドであってもよい。 潜在的なアンタゴニストは、ポリペプチドの結合部位に結合して占領し、それ により細胞性結合分子への結合を妨げ、正常な生物学的活性を妨げる小型分子を 包含する。小型分子の例は、小型有機分子、ペプチド、ペプチド様分子を包含す るが、これらに限定するものではない。 その他の潜在的なアンタゴニストはアンチセンス分子を包含する(これらの分 子についての記載に関しては、Okano，J．Neurochem.，56，560(1991)；Oligode oxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Bo ca Raton，FL(1988)を参照のこと)。 他の潜在的アンタゴニストは、本発明の遺伝子に関連する化合物およびその誘 導体を包含する。 特定の態様において、本発明は、感染の続発症に関与する、病因および哺乳動 物宿主間の最初の物理的相互作用を妨害するための本発明のポリペプチド、ポリ ヌクレオチドまたは阻害剤の使用を提供する。特に本発明の分子を、ｉ）細菌、 特にグラム陽性細菌の内在装置上の哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質、ま たは創傷部の細胞外マトリックスタンパク質への付着の妨げ；ｉｉ）例えば、哺 乳動物チロシンキナーゼのリン酸化の開始により、哺乳動物細胞侵入を媒介する 応答レギュレータータンパク質の遮断(Rosenshineら、Infect．Immun．60，2211 (1992))；ｉｉｉ)哺乳動物細胞外マトリックスタンパク質と組織損傷を媒介する 細菌性応答レギュレータータンパク質との間の細菌付着の遮断；ｉｖ）内在装置 の埋め込みまたはその他の手術以外により開始した感染における病状の通常の進 行の遮断に使用することができる。 本明細書で提供される各々のＤＮＡ配列は抗細菌化合物の発見および開発に用 いることができる。発現された場合、コードされたタンパク質は、抗菌薬物のス クリーニングのための標的として用いることができる。加えて、コードされたタ ンパク質のアミノ末端領域をコードしているＤＮＡ配列または個々のｍＲＮＡの Shine-Delgarno もしくは他の翻訳促進配列を用いて、目的のコーディング配列 の発現を調節するアンチセンス配列を構築することができる。 アンタゴニストおよびアゴニストは、例えば、細菌感染、特にスタフィロコッ カス感染の抑制に用いることができる。 さらなる態様において、本発明は、薬剤をスクリーニングし、それらを同定す る方法であって、ｉ）応答レギュレーターとヒスチジンキナーゼとの相互作用を 妨害する薬剤について、応答レギュレーターとヒスチジンキナーゼを薬剤の存在 下でインキュベートし、この相互作用を遮断する薬剤の能力を測定することを含 む方法、ｉｉ）ヒスチジンキナーゼからそれ自身へのリン酸基の輸送を触媒する 応答レギュレーターの能力を妨害する薬剤について、応答レギュレーターと薬剤 をインキュベートし、リン酸化ヒスチジンキナーゼからのリン酸の除去を触媒す る応答レギュレーターの能力を測定することを含む方法、、および／またはｉｉ ｉ）リン酸がいったん輸送された場合に分子が自己脱リン酸化する能力を妨害す る薬剤について、リン酸化応答レギュレーターと薬剤をインキュベートし、自己 脱リン酸化を触媒する応答レギュレーターの能力を測定することを含む方法、を 提供する。 好ましくは、ヒスチジンキナーゼは、応答レギュレーターの同種のヒスチジン キナーゼであるか、または、応答レギュレーターの基質として作用できる他のヒ スチジンキナーゼであり、好ましくは、スタフィロコッカス・アウレウス由来で あるが、たとえば、バシラスなどの他の微生物由来であってもよい。一般に、ヒ スチジンキナーゼおよびその同種の応答レギュレーターの遺伝子は、染色体上の 近くで共に見られるので、適当なヒスチジンキナーゼは、染色体に沿ってさらに 配列決定することにより、簡便に同定できる。 本発明はそれにより同定された阻害剤にも関する。 ワクチン 本発明の別の態様は、個体、特に哺乳動物における免疫学的応答を誘起する方 法であって、抗体を生成するのに適当な本発明の遺伝子、またはそのフラグメン トもしくは変種を個体に接種し、該個体を感染、特に細菌感染、とりわけスタフ ィロコッカス感染から保護することからなる方法に関する。本発明のまた別の態 様は、個体にて免疫学的応答を誘起する方法であって、遺伝子治療により、免疫 学的応答を誘発させるために、インビボで、遺伝子、またはそのフラグメントも しくは変種を発現させるため、配列番号１および２の配列により特徴付けられる 遺伝子またはそのフラグメントもしくは変種を送達し、抗体を生成し、該個体を 疾患から防御する方法に関する。 本発明のさらなる態様は、免疫学的応答を宿主内に誘起できる、または誘起し た宿主に導入した場合、そのような宿主中で本発明のポリヌクレオチド配列によ り特徴付けられる遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質に対する免疫 学的応答を誘起する免疫学的組成物であって、該遺伝子の抗原をコードし、発現 するＤＮＡまたはそれによりコードされるタンパク質を含んでなる、組換え遺伝 子またはそれによりコードされるタンパク質を含んでなる組成物に関する。 遺伝子またはそのフラグメントは、それ自身は抗体を産生しないが、第１のタ ンパク質を安定化し、免疫原性があり防御特性を有する融合タンパク質を形成す ることができる補タンパク質（co-protein）と融合できる。このように融合した 組換えタンパク質は、好ましくはさらに抗原性補タンパク質、例えばグルタチオ ン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはベーターガラクトシダーゼ、タン パク質を可溶化し、その生成および精製を容易にする比較的大きな補タンパク質 を含む。さらには、補タンパク質は、免疫系の全身的刺激を提供するという意味 で、アジュバントとして作用し得る。補タンパク質は第１のタンパク質のアミノ 末端またはカルボキシル末端のいずれに結合してもよい。 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよびSato，Y.ら、Science 27 3，352(1996)に記載されるような免疫刺激性ＤＮＡ配列を含んでなる組成物、特 にワクチン組成物、および方法が本発明により提供される。 また、本発明は、スタフィロコッカス・アウレウスに感染した動物モデルにお ける、このような遺伝的免疫化実験で用いるＤＮＡ構築物の、細菌性細胞表面タ ンパク質の不変領域をコードすることが示されている前記のポリヌクレオチドま たはとりわけそのフラグメントを用いる方法であって、とりわけ予防的または治 療的免疫反応を生じることができるタンパク質エピトープを同定するのに有用な 方法を提供するものである。このアプローチは、哺乳動物、とりわけヒトにおけ るスタフィロコッカス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置の開発のため に、感染に抵抗しまたは一掃するのに成功した動物の必須器官から特に価値ある モノクローナル抗体をうまく調製することを可能にすると考えられる。 ポリペプチドは、例えば細菌の損傷組織への付着を阻害することにより、細菌 の侵入に対して防御的な特異的抗体を産生するための宿主のワクチン化のための 抗原として使用することができる。組織損傷の例は、例えば機械的、化学的もし くは熱損傷により、または内在装置の埋め込みにより、引き起こされた皮膚また は結合組織の創傷、または粘膜例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷を包含する 。 本発明はまた、免疫原性組換えタンパク質および適当な担体を含んでなるワク チン処方を包含する。タンパク質は胃で分解するので、例えば、皮下、筋肉内、 静脈内または皮内投与を含め、非経口的に投与するのが好ましい。非経口投与に 適した処方は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤およびその処方を個体の体液、好まし くは血液と等張にする溶質を含有してもよい水性または非水性滅菌注射液；およ び懸濁化剤または増粘剤を含有していてもよい水性または非水性滅菌懸濁液を包 含する。処方は１回投与または複数回投与用容器、例えば密封したアンプルおよ びバイアルに入れてよく、使用直前に滅菌液体担体を添加するだけでよい凍結乾 燥状態で貯蔵することができる。ワクチン処方はまた、処方の免疫原性を高める アジュバント系、例えば水中油系または当該分野で公知の他の系を含んでいても よい。投与量はワクチンの比活性に依存し、慣用的実験操作により容易に決定で きる。 本発明は配列番号１のポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列 により特徴付けられる遺伝子に関して記載されているが、これは天然のタンパク 質および、実質的に組換えタンパク質の免疫原特性に影響しない付加、欠失また は置換を有する類似のタンパク質のフラグメントを包含することが理解されよう 。 組成物 また、本発明は前記のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニ ストもしくはアンタゴニストを含んでなる組成物にも関する。したがって、本発 明のポリペプチドは、対象に投与するのに適した医薬担体などの、細胞、組織ま たは生物で使用するための非滅菌もしくは滅菌した担体と組み合わせて用いるこ とができる。このような組成物は、例えば媒体添加物または治療上有効量の本発 明のポリペプチド、および医薬上許容できる担体または賦形剤からなる。このよ うな担体は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノ ールおよびそれらの組み合わせを包含するが、これらに限定するものではない。 処方は投与法に適合させなければならない。 キット 本発明はさらに、前記した本発明の組成物の成分を１またはそれ以上を充填し た１またはそれ以上の容器からなる診断用および医薬用パックおよびキットに関 する。このような容器（複数でも可）に、医薬または生物学的生成物の製造、使 用または販売を規制する政府機関により規定された形態の、ヒトへの投与用の産 物の製品、使用または販売に関する該政府機関の承認を示す注意書きを添付する ことができる。 投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独でまたは治療用化合物などの 他の化合物と組み合わせて用いることができる。 医薬組成物は、例えば、とりわけ局所、経口、経肛門、経膣、静脈内、腹膜腔 内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内の経路を含め、効果的な、簡便な方法で投 与できる。 医薬組成物は、一般に、個々の適応症または複数の適応症の治療または予防に 有効な量にて投与される。一般に、この組成物は少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体 重の量で投与される。大抵の場合、投与量は１日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を越 えない量で投与される。好ましくは、大抵の場合、投与量は１日あたり約１０μ ｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ体重である。至適投与量は、適応症、その重篤度、 投与経路、合併症等を考慮に入れて、各々の治療様式および適応症についての標 準法により決定されることは理解されよう。 治療において、または予防用に、活性物質を注射用組成物として、例えば、好 ましくは等張の滅菌水性分散物として個体に投与できる。 また、組成物は、局所塗布用に、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏 、点眼液、点耳液、洗口剤、含浸包帯および縫合糸ならびにエアゾルの形態に処 方してもよく、例えば保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟膏および クリームにおける軟化剤を含め、適当な慣用的添加剤を含有してもよい。このよ うな局所用処方はまた、適合する慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基剤 、およびローションの場合、エタノールまたはオレイルアルコールも含めること ができる。このような担体は処方の約１％から約９８重量％であってもよく；よ り一般的には、処方の約８０重量％までとする。 哺乳動物、特にヒトに投与する場合、有効成分の１日あたりの投与量は、０． ０１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇである。 医者はいずれの場合も、個体に最も適した実際の投与量を決定し、個々の個体の 年齢、体重および応答に応じて変える。前記の投与量は、平均的なケースの一例 である。もちろん、高いおよび低い用量の範囲が適当な個体もあり、それらも本 発明の範囲内である。 内在装置には外科移植、補綴およびカテーテル、即ち個体の体内に導入され、 長時間その位置に止まる装置が包含される。このような装置には、例えば人工関 節、心臓弁、ペースメーカー、血管移植片、血管カテーテル、脊髄液シャント、 尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテーテル等を包含する。 本発明の組成物を注射により投与し、内在装置の挿入の直前に、関連する細菌 に対する全身的効果を得ることができる。手術後、装置が体内に在る時間、治療 を続けてよい。加えて、手術用の手術周辺カバーを広げて、スタフィロコッカス 創傷感染を防御するために用いることができる。 多くの整形外科医は、補綴関節を有するヒトは、菌血症が生じ得る歯の治療前 に、抗生物質による予防を考慮すべきであると考えている。後の重い感染は、重 篤な合併症であり、時には補綴関節を喪失し、著しい羅病率および死亡率を伴う 。従って、該活性物質をこの状況の予防的抗生物質の代替品として使用すること にまで拡張することが可能である。 前記の治療に加え、本発明の組成物は、一般に、創傷組織に露出したマトリッ クスタンパク質に細菌が付着するのを防ぐための創傷治療薬として使用でき、歯 科治療において抗生物質の予防法に代わって、またはそれと組み合わせて、予防 的に使用できる。また、本発明の組成物は、挿入直前に内在装置を浸すのに使用 できる。有効成分は、創傷または内在装置を浸す場合、１ｍｇ／ｍｌから１０ｍ ｇ／ｍｌの濃度であるのが好ましい。 ワクチン組成物は、注射可能な形態であるのが都合がよい。慣用的なアジュバ ントは免疫応答を高めるために用いることができる。 予防接種に適した単位投与量は、抗原０.５〜５ｍｇ／ｋｇであり、このよう な投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好ましい。 提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適当な個体への投与を妨げるよ うな、不利な毒性効果は観察されない。 前記の抗体もまた、本発明の応答レギュレーターを含有する細菌の存在を検出 するための診断試薬として使用できる。 実施例 本発明を以下の実施例を用いてさらに詳しく説明する。これらの例示は本発明 の特定の具体的な態様を説明するものであり、本発明に開示する範囲を限定また は規定するものではない。 本明細書で用いる特定の用語は前記した定義で説明する。 全ての実施例は、別に詳細に記載するもの以外は、当業者に周知で慣用される 標準法を用いて実施した。以下の実施例の慣用的な分子生物学的技術は、例えば 上記に引用したSambrook らなどの標準的な実験室マニュアルに記載されるよう に実施できる。 実施例１ エス・アウレウスＷＣＵＨ２９由来の新規な応答レギュレータータンパク質を コードするＤＮＡの単離 配列番号１に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドをエーコリにおけるエ ス・アウレウスＷＣＵＨ２９の染色体ＤＮＡのクローンのライブラリーから得た 。ライブラリーは慣用的方法、例えば方法１および２により製造できる。 全細胞ＤＮＡは、スタフィロコッカス・アウレウス株ＷＣＵＨ２９（ＮＣＩＭ Ｂ４０７１１）から、標準的な方法にしたがって単離し、二つの方法のどちらか によりサイズ分画する。 方法１ 標準法によりサイズ分画するために、全細胞ＤＮＡを注射針に通して機械的に 剪断する。１１ｋｂｐまでの大きさのＤＮＡフラグメントを、エクソヌクレアー ゼおよびＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化し、ＥｃｏＲＩ リンカーを加える。フラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断したベクターラムダＺａ ｐＩＩに連結し、標準法によりライブラリーをパッケージングし、およびパッケ ージングしたライブラリーでイー・コリを感染させる。ライブラリーは標準法に より増幅する。 方法２ 全細胞ＤＮＡを、四種の制限酵素（ＲｓａＩ、ＰａｌＩ、ＡｌｕＩおよびＢｓ ｈ１２３５Ｉ）を組み合わせたもので部分加水分解し、標準法によりサイズ分画 する。ＥｃｏＲＩリンカーをＤＮＡおよびフラグメントに連結し、次いでＥｃｏ ＲＩで切断したベクターラムダＺａｐＩＩに連結し、標準法によりライブラリー をパッケージングし、そのパッケージングしたライブラリーでイー・コリを感染 させる。ライブラリーは標準法により増幅する。 新規化合物の配列を図１および図２、配列番号１および２に示す。配列番号２ のアミノ酸配列は、配列番号１の読み枠を翻訳したものであり、バシラス・サチ リス由来のＲｅｓＤ調節タンパク質に対し相同性（６６％の同一性）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｃ０７Ｋ 16/12 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ホッジソン，ジョン・エドワード アメリカ合衆国19426―0989ペンシルベニ ア州 カレッジビル、ポスト・オフィス・ ボックス5089、サウス・カレッジビル・ロ ード1250番、スミスクライン・ビーチャ ム・ファーマシューティカルズ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．(ａ)配列番号２のアミノ酸１から２４３までを含むポリペプチドをコード しているポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌク レオチド、 （ｂ）(ａ)のポリヌクレオチドに対して相捕的なポリヌクレオチド、および、 （ｃ）(ａ)または(ｂ)のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続した塩基を 含むポリヌクレオチド からなる群より選択されるメンバーを含む単離ポリヌクレオチド。 ２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。 ３．ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１記載のポリヌクレオチド。 ４．配列番号１に示されるヌクレオチド１から９００までを含む、請求項２記 載のポリヌクレオチド。 ５．配列番号２のアミノ酸１から２４３までを含むポリペプチドをコードして いる請求項２記載のポリヌクレオチド。 ６．(ａ) National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd．( ＮＣＩＭＢ)受託番号４０７７１に含まれる遺伝子により発現されるのと同じ成 熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の 同一性を有するポリヌクレオチド、 （ｂ）(ａ)のポリヌクレオチドに対して相捕的なポリヌクレオチド、および （ｃ）(ａ)または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の塩基を含む ポリヌクレオチド からなる群より選択されるメンバーを含む単離ポリヌクレオチド。 ７．請求項２記載のＤＮＡを含むベクター。 ８．請求項７記載のベクターを含む宿主細胞。 ９．請求項８記載の宿主細胞から該ＤＮＡによりコードされているポリペプチ ドを発現させることを含む、ポリペプチドの製造方法。 １０．請求項７記載のベクターで細胞をトランスフォーメーションまたはトラ ンスフェクションして、ベクター中に含まれるｃＤＮＡによりコードされている ポリペプチドを細胞が発現するようにすることを含む、ポリペプチドを発現する 細胞の製造方法。 １１．配列番号２のアミノ酸１から２４３までに対して少なくとも７０％同一 であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。 １２．配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。 １３．請求項１１記載のポリペプチドに対する抗体。 １４．請求項１１記載のポリペプチドの活性を阻害するアンタゴニスト。 １５．治療上有効量の請求項１１記載のポリペプチドを個体に投与することを 含む、抗細菌剤を必要とする個体の治療方法。 １６．該ポリペプチドをコードしていてインビボで該ポリペプチドを発現する ＤＮＡを個体に提供することにより該治療上有効量のポリペプチドが投与される 請求項１５の方法。 １７．治療上有効量の請求項１４記載のアンタゴニストを個体に投与すること を含む、細菌感染を阻害する必要のある個体の治療方法。 １８．請求項１１記載のポリペプチドの発現に関連した疾病の診断方法であっ て、該ポリペプチドをコードしている核酸配列を決定することを含む方法。 １９．宿主由来の試料中の請求項１１記載のポリペプチドの存在について分析 することを含む診断方法。 ２０．結合手段への結合を可能にする条件下にて、ポリペプチドに対する結合 手段（該結合手段は、該結合手段への化合物の結合に応答して検出可能シグナル を発しうる第２の成分に結合しているものである）を表面上に発現する細胞をス クリーニングすべき化合物と接触させ、 化合物と結合手段との相互作用により生じるシグナルの存在または不存在を検 出することにより、化合物が結合物質に結合し、これを活性化または阻害するか どうかを決定することを含む、請求項１１記載のポリペプチドに結合し、その活 性を阻害する化合物の同定方法。 ２１．哺乳動物を細菌感染から防御する抗体を産生させるに十分な請求項１１ または１２に記載のポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは変種を哺乳 動物に接種することを含む、哺乳動物における免疫学的応答を誘導する方法。 ２２．遺伝子治療により、配列番号２により特徴付けられるポリペプチド、ま たはそのフラグメントまたは変種を発現させるために、配列番号１をコードする 遺伝子、そのフラグメントもしくは変種を、インビボで送達して、哺乳動物を疾 病から防御する抗体を産生させる免疫学的応答を誘導することを含む、哺乳動物 における免疫学的応答を誘導する方法。 ２３．配列番号１の配列により特徴付けられるポリヌクレオチドをコードして いてこれを発現するＤＮＡまたはそれによりコードされているタンパク質を含ん でなる免疫学的組成物であって、哺乳動物中に導入された場合、該ポリヌクレオ チドまたはそれによりコードされているタンパク質に対する免疫学的応答を哺乳 動物において誘導する組成物。