KR20040098202A - 비브리오 패혈증균의 접촉 세포독성과 동물 치사작용에관여하는 독력인자 ｒｔｘ와 연관 유전자들 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)의 접촉 세포독성과 동물 치사작용에 관여하는 독력인자인 RTX 독소와 이의 활성화와 분비 등에 관여하는 관련 유전자들에 관한 것으로, RTX를 결실시킨 돌연변이 균주를 항 비브리오 패혈증 백신, 특히 생균 백신으로 활용하는 방법에 관한 것이다.

Description

비브리오 패혈증균의 접촉 세포독성과 동물 치사작용에 관여하는 독력인자 ＲＴＸ와 연관 유전자들{RTX and related genes of Vibrio vulnificus responsible for the contact-cytotoxicity and lethality to animals}
본 발명은 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)의 접촉 세포독성과 동물 치사작용에 관여하는 독력인자인 RTX 독소와 이의 활성화와 분비 등에 관여하는 관련 유전자들에 관한 것으로, RTX를 결실시킨 돌연변이 균주를 항 비브리오 패혈증백신, 특히 생균 백신으로 활용하는 방법에 관한 것이다.
비브리오 패혈증균 감염증은 역사가 비교적 짧으나 전 세계적으로 임상증례가 계속 보고 되고 있으며 새로이 주목받고 있는 질환중의 하나이다. 비록 전세계적으로 절대적인 발병례는 콜레라나 살모넬라 식중독보다 적지만 높은 치명율과 비극적인 임상증상 때문에 심각한 사회적 문제를 야기하고 있다.
비브리오 패혈증균은 1976년 미국 질병통제센터 (Centers for Disease Control; 이하 CDC로 약함)의 홀리스 (Hollis)등이 11년 동안 사람에서 분리된 호염성, 병원성 비브리오 균의 세균학적 성상을 처음 보고한 이후, 유당(lactose)을 분해하는 특징 때문에 유당 분해 비브리오 (lactose-fermentingVibrio 또는Lac(+))라 명명되었다. 1979년 CDC의 블레이크 (Blake)등은 CDC에 보고된 39명의 환자들의 자료를 역학적으로 분석하여 임상증상에 따라 원발성 패혈증(primary septicemia)군과 창상감염(wound infection)군으로 분류하였다 (Blake, P.A., Merson, M.H., Weaver, R.E., Hollis, D.G., Heublein, P.C.,N. Engl. J. Med.300:1-6, 1979). 같은 해 파머 (Farmer)는 새로운 종으로서Vibrio vulnificus(vulnus=wound, ficus=forming)라 명명하였으며, 오늘에 이르고 있다(Farmer, J.J. III,Lancet2:903, 1979).
V. vulnificus패혈증은 잠복기가 짧고, 일단 발병하면 전격적으로 진행하여 효과적 항균제 치료 타이밍을 놓치기 쉽다.V. vulnificus패혈증은 대부분 40대 이상(약 90-95%)의 남자(90% 이상)에서 발생하며, 정상인에서는 거의 볼 수 없고, 기저질환을 가지고 있는 환자들에서 주로 발병한다. 전 세계의 발생증례를 분석해보면 원발성 패혈증의 경우, 대부분의 환자들은 간장 질환과 음주벽 등 만성질환을 가지고 있으며, 간장 질환으로서는 간경변, 만성간염, 간암 등이 주종을 이루고, 그 외 당뇨병, 폐결핵, 만성골수염, 류마티스성 관절염 등의 기저질환이 확인되었다. 그러나 5% 이하에서는 특별한 기저질환을 찾을 수 없는 경우도 있다. 미국의 경우 당뇨병, 악성종양, 혈색소증 (hemochromatosis), 지중해빈혈 (thalassemia) 등의 빈도가 비교적 높게 나타난다. 최근에는 AIDS 환자들에서V. vulnificus패혈증의 발생보고가 나오고 있어, 미국 CDC에서는 AIDS 환자들에게 여름철에는 굴 등의 해산물을 생식하지 말 것을 권고하고 있다.
V. vulnificus에 의한 발병 기전에 관한 연구는 1980년 중반부터 본격적으로 시작되었다. 초기에는 주로 다른 비브리오 속들과는 달리V. vulnificus가 패혈증을 잘 일으키는 이유와 원발성 패혈증이 주로 간장 질환이 있는 환자들에서 발생하는 이유를 구명하기 위한 연구가 진행되었다. 그 결과를 살펴보면, 어패류를 통해 섭취되어 장관에 이른V. vulnificus는 장관 내 점액질을 통과하여 장관 상피세포에 부착한 다음, 장관 상피세포를 파괴하고 장관 점막층으로 침입하여 혈관으로 들어가는 것으로 생각되고 있다. 간장 질환 등의 기저질환을 가지고 있는 감수성이 높은 환자들의 혈류로 들어간V. vulnificus는 활발하게 증식하고, 패혈증을 일으킨다(Linkous, D.A., Oliver, J.D.,FEMS Microbiol. Lett.174:207-214, 1999).
V. vulnificus의 독력인자로 그 동안 몇가지 세포구성성분들이나 산물들이 보고되었다. 즉, 용혈독소 (Kreger, A, Lockwood, D,Infect. Immun.33:583-590, 1981), 금속단백분해효소 (Kothary, M.H., Kreger, A.S.,J. Gen. Microbiol.133:1783-1791, 1987), 포스포리파아제 A2 (Testa, J., Daniel, L.W., Kreger, A.S.,Infect. Immun.45:458-463, 1984), 다당질 협막 (Wright, A.C., Simpson, L.M., Oliver J.D., Morris, J.G., Jr.,Infect. Immun.58:1769-1773, 1990), 시데로포어 (Simpson, L.M., Oliver, J.D.,Infect. Immun.41:644-649, 1983) 등이 알려졌다. 그러나 오늘날까지 어느 것도 비브리오 패혈증의 병인론을 완벽하게 설명해주지는 못하고 있다.
특히,V. vulnificus가 분비하는 외독소에 대한 연구가 비교적 많이 보고되고 있다. 외독소들 중에서 용혈독소가 가장 강력한 것으로 알려졌다. 마우스에 혈관내 주사하면 마이크로그램 단위에서 단시간 내에 사망을 초래한다 (이준행, 이시은, 권형철, 장흥식, 류필열, 정선식,대한미생물학회지29:381-398, 1994). 용혈독소를 분리하여 동물들에 투여하면 생균을 투여한 경우와 비슷한 증상이 관찰되기도 한다 (Gray, L.D., Kreger, A.S.,J. Infect. Dis.155:236-241, 1987). 금속단백분해효소도 분리 정제하여 동물에 투여하면 피부괴저, 결체조직의 파괴, 부종, 궤양 등의 임상증상을 재현한다 (Miyoshi, S., Sugiyama, K., Suzuki, Y., Furuta, H., Miyoshi, N., Shinoda, S.,FEMS Microbiol. Lett.40:95-98, 1987; Kothary, M.H., Kreger, A.S.,J. Gen. Microbiol.133:1783-1791, 1987).
그러나, 이들 외독소의 병인론적 의의에 대해서는 해당 유전자들이 밝혀지고, 특이적 돌연변이 균주들을 이용한 발병기작 연구결과가 발표되면서 논란이 일어났다. 즉, 용혈독소 유전자vvhA와 금속단백분해효소 유전자vvpE각각을 선택적으로 돌연변이시킨 균주들의 마우스에 대한 치사력이 자연형 균주들에 비하여 유의하게 변화하지 않는 것으로 나타났다 (Wright, A.C., Morris, J.G., Jr.,Infect. Immun.59:192-197, 1991; Shao, C.P., Hor, L.I.,Infect. Immun.68:3569-3573, 2000; Jeong, K.C., Jeong, H.S., Rhee, J.H., Lee, S.E., Chung, S.S., Starks, A.M., Escudero, G.M., Gulig, P.A., Choi, S.H.,Infect. Immun.68:5096-5106, 2000). 더욱이vvhA와vvpE가 모두 결실된 돌연변이주에서도 유의한 마우스 치사력의 변화가 관찰되지 않는다는 보고도 있다 (Fan, J.J., Shao, C,P., Ho, Y.C., Yu, C.K., Hor, L.I.,Infect. Immun.69:5943-5948, 2001).
V. vulnificus생균은 숙주 세포에 대하여 높은 세포독성을 나타낸다. 세균의 세포독성은 숙주에 대한 병원성의 대표적 지표로 간주되고 있다. 본 연구진이vvhA와vvpE유전자들의 단독 혹은 전부를 선택적 결실시킨 돌연변이주의 세포독성을 검사해 보았던 바 모두가 배양 동물세포주들에 대하여 높은 세포독성을 나타내는 사실을 관찰하였다 (Kim, Y.R., Rhee, J.H.,Biochem, Biophys. Res. Commun.304:405-410, 2003). 이러한 결과들은V. vulnificus의 세포독성과 마우스 치사력을 좌우하는 중요한 독력인자가 아직 발견되지 않고 있음을 시사한다.
본 발명자들은 비브리오 패혈증균이 숙주세포를 효과적으로 파괴하기 위해서는 숙주세포와 반드시 접촉해야만 한다는 사실을 관찰하고, 그러한 접촉 세포독성에 관여하는 독력인자의 유전자를 찾기 위해 트랜스포존 라이브러리를 스크리닝하여 새로운 독력인자 RTX의 생성과 분비에 관여하는 오페론을 발견하였다. RTX 독소구조 유전자를 인코딩하는rtxA유전자를 결손시킨 돌연변이주는 세포독성이 현저하게 감소되었으며, 마우스에 감염시켰을 경우 치사력이 유의하게 감소하는 것이 관찰되었다.
또한 본 발명자들은rtxA결손 돌연변이 균주를 마우스 비강을 통하여 면역시켰을 때 숙주 방어효과가 우수함을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명에서는 RTX 독소 구조 유전자를 인코딩하는rtxA유전자 및 RTX 생산 결함 돌연변이 균주를 함유하는 생균백신을 제공하고자 한다.
도 1은 비브리오 패혈증균의 RTX 독소 오페론 구조를 보여준다.
도 2는 비브리오 패혈증균 RTX 구조 유전자rtxA,용혈독소 유전자vvhA,그리고 금속단백분해효소 유전자vvpE등의 단독, 이중, 삼중 결실 돌연변이 균주들의 HeLa 세포주에 대한 작용시간에 따른 세포독성을 보여주는 그래프이다.
도 3은 비브리오 패혈증균 RTX 독소의 주변세포질 및 외막 운반 단백질 유전자tolC의 결실 돌연변이 균주와rtxA돌연변이 균주 및 자연형 균주의 HeLa 세포주에 대한 90분 배양 후 세포독성을 보여주는 그래프이다.
본 발명은 첨부된 서열목록의 서열 5 또는 서열 6으로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소 세포막 ABC 운반 단백질rtxB2 유전자;
서열 7 또는 서열 8로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소 세포막 ABC 운반 단백질rtxD유전자;
서열 3 또는 서열 4로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소 세포막 ABC 운반 단백질rtxB1 유전자;
서열 11 또는 서열 12로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소 세포막 ABC 운반 단백질rtxB1 유전자와 활성화 단백질rtxC사이에 존재하는 기능을 모르는 ORF;
서열 9 또는 서열 10으로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)독력인자 RTX 독소 활성화 단백질rtxC유전자; 및
서열 1 또는 아미노산 서열 2로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)의 독력인자 RTX 독소 구조 단백질rtxA유전자;
로 이루어진 RTX 독소 오페론에 관한 것이다.
또 본 발명은 상기 RTX 독소 오페론을 구성하는 유전자 중 하나 이상을 결핍시킨 RTX 생산 결함 돌연변이 균주를 항비브리오 패혈증 생균 백신 제조에 사용하는 방법에 관한 것이다.
특히, 상기 RTX 독소 오페론을 구성하는 유전자 중rtxA유전자의 N-말단 부위의 182 아미노산부터 1,587 아미노산까지에 해당하는 약 4,200 염기쌍을 결손시켜 제조한 돌연변이 균주에 관한 것이다.
상기 균주는 2003년 5월 13일자로 한국 생명공학연구소 내 유전자은행에 기탁 의뢰하여, 수탁번호 KCTC10473BP를 부여받았다.
또한 본 발명은 서열 13 또는 서열 14로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소의 주변세포질(periplasm) 및 외막 운반 단백질 유전자tolC및tolC유전자를 결실시킨 돌연변이 균주에 관한 것이다.
또 본 발명은 상기에서 제조한 생균백신을 사용하여 유전자 면역(genetic immunization)을 위한 DNA를 운반하고, 사람을 포함한 여러 동물의 체내에서 이종의 유전자나 단백질을 발현시켜 면역반응을 유발하는 약독화 항원 운반 숙주에 관한 것이다.
본 발명에 의한 RTX 독소 오페론 및tolC유전자의 동정 및rtxA유전자 및tolC유전자가 결실된 돌연변이 균주의 백신 효과를 증명하는 과정은 다음과 같다:
1) 트랜스포존 라이브러리를 제조하는 단계
2) 접촉 세포독성에 관여하는 유전자에 돌연변이가 있는 트랜스포존 돌연변이 클론을 스크리닝하는 단계
3) RTX 독소 오페론 유전자를 클로닝 및 동정하는 단계
4)rtxA유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제조하는 단계
5)tolC유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제조하는 단계
6) RTX 돌연변이 균주의 세포독성과 마우스 치사력을 측정하는 단계
7) 비강내 면역 후 마우스에 대한 RTX 돌연변이 균주의 숙주 방어능력을 측정하는 단계.
본 발명에서 사용하는 돌연변이 균주 및 이들의 특성은 표 1에 정리하였다. 각각의 제조 방법과 자세한 특성은 해당 실시예 및 시험예에서 적시하였다.
[표 1]
균주 혹은 플라스미드 특 징 출 처
V. vulnificus
MO6 24/O 고병원성 임상분리균주 J. Glenn Morris Jr.
ATCC29307 Type strain ATCC로부터 구입
CMM 740 rtxA에 결실 돌연변이가 있는 MO6-24/O 발명자
CMM 750 vvpE에 결실 돌연변이가 있는 CMM740 발명자
CMM 1055 vvhA에 결실 돌연변이가 있는 CMM750 발명자
CMM 2400 tolC에 결실 돌연변이가 있는 MO6-24/O 발명자
Escherichia coli
DH5α FrecA1; restriction negative 실험실 기보유
SY327 λpir Δ(lac pro)argE(Am)rif nalA recA56λ pirlysogen; host for πrequiring plasmids John J. Mekalanos
SM10 λpir thi thr leu tonA lacY supE recA::RP4 2 TcR::Mu λpirlysogen, oriT of RP4, KmR; Conjugal donor John J. Mekalanos
Plasmids
pLAFR3 IncP cosmid vector, TcR Staskawiczet al. (1987)
pCVD702 3.4 kbpvvhBADNA 조각이 pBR325의HindIII 및EcoRI 위치에 클로닝되어 있는 플라스미드 J. Glenn Morris Jr.
pDM4 자살벡터,oriR6K,sacB,CmR Debra Milton
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 트랜스포존 라이브러리 (transposon library) 제조
V. vulnificusMO6-24/O 표준균주(미국 University of Maryland School of Medicine, Division of Hospital Epidemiology의 J. Glenn Morris로부터 획득)와 mini-Tn5lacZ1을 포함하고 있는E. coliSM10 lpir균주(독일 Braunschweig 소재 GBF-National Research Center for Biotechnology의 Kenneth N. Timmis로부터 획득)의 단일 집락을 10 ㎖의 2.5% NaCl heart infusion (이하 2.5HI) 액체배지와 20㎖의 Luria Bertani (이하 LB, ampicillin 100 ㎍/㎖, kanamycin 100 ㎍/㎖ 함유) 액체배지에 각각 접종하여 37℃, 210 rpm에서 하룻밤 교반 배양하였다.
다음날 각각의 배양액을 원침한 후 항생제가 들어있지 않은 새로운 LB 액체배지로 두 번 원심세척한 뒤 각각 100 ㎕의 새로운 LB 액체배지에 부유시켰다. 그리고E. coli와V. vulnificus균액을 서로 혼합하여 LB 한천배지 위에 떨어뜨렸다. 37℃에서 하룻밤 배양한 후 LB 한천배지 상에 자란 세균집락에 새로운 2.5HI 액체배지 800 ㎕를 떨어뜨린 후 멸균된 유리봉을 이용하여 잘 긁어내었다. 이 균액을 1.5 ㎖ 플라스틱 시험관으로 옮긴 뒤 충분히 교반하여 균질하게 부유되도록 하였다. 이 균액을 kanamycin 200 ㎍/㎖을 함유한 TCBS(thiosulfate citrate bile sucrose) 한천배지에 원액, 1/10, 1/100 희석액 100 ㎕씩을 각각 떨어뜨린 후 완전히 스며들도록 잘 도말한 뒤 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
다음날 TCBS 한천배지 상에 자란 비브리오 집락만을 이쑤시개를 이용하여 kanamycin 300 ㎍/㎖을 함유한 TCBS 한천배지에 접종하고 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날 형성된 비브리오 집락을 200 ㎍/㎖의 kanamycin을 함유한 100 ㎕의 2.5HI 액체배지가 담긴 96-well 배양판의 각 well에 접종하여 37℃에서 하룻밤 정체 배양하였다. 다음날 균이 자란 각 well에 80 ㎕의 50% 글리세롤(in 2.5 HI)을 가한 뒤 70℃ 초저온냉동기에 보관하다가 필요시 replica plater를 사용하여 2.5HI 한천배지에 접종하여 배양한 후 각 실험에 사용하였다.
[실시예 2] 접촉 세포독성 상실 트랜스포존 돌연변이 클론의 스크리닝
실시예 1과 같이 제조된V. vulnificusMO6-24/O 균주의 트랜스포존 라이브러리 각 균주 클론들은 2.5HI 액체배지에 하룻저녁 배양한 후 1 ㎕ 씩 취해 2x104세포씩 HeLa 세포가 역시 하룻저녁 배양된 각 well에 접종하여 37℃에서 90분 동안 배양하였다. 상등액을 제거하고 바닥에 남아 있는 세포들을 Trypan blue 염색(Sigma Co.)하여 세포독성 여부를 관찰하였다. 세포독성에 이상이 생겨 상기 검사 조건에서 HeLa 세포를 전혀 죽이지 못하는 것으로 나타난 클론들을 선발하여 세포독성의 감소를 정량적으로 측정하였다. 정량적 세포독성은 사멸된 HeLa 세포의 세포질에서 유리된 lactate dehydrogenase(LDH) 양을 CytoTox™ Non-Radioactive Cytotoxicity assay kit(Promega Co.)로 측정하였다.
몇 차례의 스크리닝 과정과 정량적 세포독성 측정을 통하여 세포독성이 거의 상실된 11개의 트랜스포존 돌연변이 클론들을 선발하여 트랜스포존이 삽입되어 돌연변이가 초래된 유전자를 동정하는 실험을 진행하였다.
[실시예 3] RTX 독소 오페론 유전자의 클로닝 및 동정
트랜스포존이 삽입된 주위 유전자들의 클로닝은 본 연구실에서 확립하여 사용해오고 있는 arbitrary PCR법을 사용하여 증폭한 DNA 조각을 표지자로 사용하여 코스미드(cosmid) 유전체 라이브러리를 스크리닝하여 실시하였다. 트랜스포존 삽입 주위 DNA 조각들의 증폭은 two-step PCR amplification 방법을 사용하였다. 첫 번째 PCR 반응에서는 서열 15로 표시되는 arbitrary primer 1(5'-GGCCACGCGTCGACTAGTCANNNNNNNNNNACGCCC-3')과 서열 16으로 표시되는 mini-Tn5lacZ1 specific primer 1(5'-TTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGC-3')을 사용하여 증폭하였으며, 이 첫 번째 프라이머 세트에 의한 PCR 산물을 주형으로 하여 두 번째 PCR을 실시한다. 2번째 PCR 반응에서는 서열 17로 표시되는 arbitrary primer 2 (5'-GGCCAAGAGTCGACTAGTCA-3')와 서열 18로 표시되는 또다른 mini-Tn5lacZ1 specific primer 2 (5'-CCGCACTTGTGTATAAGAGTCAG-3')를 이용하였으며, 이 PCR 산물을 아가로즈 (agarose) 전기영동한 후 겔에서 증폭 DNA 부위를 분리하여 염기서열 결정에 사용하였다. Arbitrary PCR 결과 11개의 균주들 중 5 균주는 약 300 bp, 나머지 6 균주들은 약 180 bp의 DNA 조각이 증폭되어 원래는 2개의 클론들로부터 유래했음을 알 수 있었다.
두가지 증폭 DNA 조각의 염기서열을 결정해 미국 National Center for Biological Information의 GenBank 데이터베이스에 수록되어 있는 유전자들과 BLAST 분석을 실시해본 바, 300bp 짜리는 콜레라균(Vibrio cholerae)의 RTX 독소 구조 유전자rtxA와 92%, 180bp 짜리는 RTX 독소 분비운반 단백질 유전자rtxB와 72% 상동성(identity)를 나타내었다.
V. vulnificusMO6-24/O 표준균주의 코스미드(cosmid) 유전체 라이브러리를 제조하여(Staskawicz, B. Dahlbeck, D, Keen, K., Napoli. C.,J. Bacterol.169:5789-5794, 1987), 300bp 짜리(rtxA)와 180bp 짜리(rtxB) DNA 조각을 nick translation 방법을 이용하여(Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring HarborLaboratory, 1989)32P-dCTP로 표지한 후 colony blot hybridization analysis를 통해 RTX 독소 유전자 오페론을 포함하고 있는 클론들을 스크리닝 하였다. 96-well plate에 보관하고 있는 약 2,100 개의 클론을 Luria Bertani 한천배지에 replica plater를 이용하여 접종하고 하룻저녁 배양한 후 니트로셀룰로오스 페이퍼에 블로팅하여 colony blot hybridization을 실시한 결과 각각의 표지자에 양성 반응을 나타내는 클론을 3개씩 발견할 수 있었다. 총 6개의 코스미드 클론들을 통상적인 서브클로닝 과정을 거쳐 각각의 서브클론들의 염기서열을 결정하였던 바, 도 1에 나타낸 것과 같이 약 20 kbp에 달하는 오페론 구조를 확인할 수 있었다. 염기서열을 확인하였던 바rtxB는 2개가 존재하는 것으로 나타나 제일 바깥 쪽에 있는 유전자를rtxB2로,rtxC와rtxD사이에 존재하는 유전자를rtxB1으로 명명하였다.
[실시예 4] RTX 독소 구조 유전자rtxA결실 돌연변이 균주의 제조
rtxA유전자는 14,106 bp의 핵산으로 구성되어 있으며, 5,206 아미노산으로 구성된 RTX 독소을 만드는 거대한 구조 유전자로 나타났다. 그 중 182 아미노산부터 1,587 아미노산까지(544bp-4,761bp) 에 해당하는rtxA유전자의 N-말단 부위의 약 4,200 염기쌍을 결손시킨rtxA결손 돌연변이주를 제조하였다.rtxA유전자 일부의 결손은 PrtxA-1, PrtxA-2와 PrtxA-3, PrtxA-4라는 두쌍의 프라이머를 사용한 PCR 법을 사용하였다.rtxA의 5'부분의 증폭을 위해서는 서열 19로 표시되는 PrtxA-1(gaattcttgagcttgcaggcg)과 서열 20으로 표시되는 PrtxA-2(tctagaaccacgcgagccttg)의 프라이머를 사용하였으며, 3'부분은 서열 21로 표시되는 PrtxA-3(tctagacacaatgatggactgggc)과 서열 22로 표시되는 PrtxA-4(gaattccgaaccacatcctgag)의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭하였다(클로닝을 위해 삽입한 제한효소XbaI 제한효소인식부위(tctaga)를 밑줄로 그어 표시하였음). 즉 프라이머 PrtxA-1 및 PrtxA-2 쌍과 PrtxA-3 및 PrtxA-4 쌍을 사용한 PCR 반응은 초기변성 95℃ 4분 후, 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 확장 72℃ 60초, 25회 반복한 후 마지막 72℃에서 10분 반응시키는 조건으로 실시하였다. 증폭된 두개의 DNA 조각을 서로 연결하기 위해서 먼저 프라이머 PrtxA-3과 PrtxA-4 에 의해 증폭된 DNA 조각을 PCR 2.1-TOPO cloning vecter(Invitrogen Co.)에 클로닝 하였다. 이 재조합 DNA를XbaI으로 자른 다음, 프라이머 PrtxA-1과 PrtxA-2에 의해 증폭된 DNA 조각을 같은 제한효소XbaI으로 자른후 접합효소를 이용하여 클로닝하였다. 결손시키고자 하는rtxA 부분의상하부가 같은 방향으로 클로닝된 재조합 TOPO vector에서XhoI과SacI 제한효소를 사용하여 원하는 부위가 결손된rtxA유전자 조각을 잘라낸 후 같은 제한효소로 자른 pDM4 플라스미드(스웨덴 Umea University, Department of Molecular Biology의 Debra Milton으로부터 획득)에 클로닝하였다. 이렇게 제조된 재조합 플라스미드를E. coliSM 10 λpir에 일렉트로포레이션시켜 생성된 형질전환 균주를V. vulnificus와 접합시켜 재조합 플라스미드가 전달되게 하였다.V. vulnificus안에서는 증식하지 못하는 pDM4의rtxA결실 DNA 조각과 염색체의 자연형 DNA 조각 사이에 대립형질 상호교환(allelic exchange)에 의하여 결실이 유발된 돌연변이V. vulnificus균주는 PrtxA-1과 PrtxA-4 프라이머 짝을 이용하여 결실 여부를 확인하였다. PCR은 초기변성 95℃ 4분 후, 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 확장 72℃ 120초, 25회 반복한 후 마지막 72℃에서 10분 반응조건에서 실시하였다. 이와 같이 제조된 돌연변이 균주를 CMM 740으로 명명하였다. 결손시킨 DNA 염기서열과 아미노산 서열은 서열 1과 서열 2에 밑줄을 그어 표시하였다.
[실시예 5] RTX 독소와 용혈독소 및 금속단백분해효소 이중 또는 삼중 돌연변이 균주의 제조
rtxA유전자 결손 돌연변이 균주에 용혈독소(vvhA) 및 금속단백분해효소(vvpE) 의 이중 또는 삼중 돌연변이 균주를 제조하기 위한vvhA와vvpE유전자들의 결손은 다음과 같이 실시하였다.
먼저vvhA의 돌연변이 균주를 제조하기 위하여vvhBA를 포함하고 있는 플라스미드 pCVD702(미국 University of Maryland School of Medicine, Division of Hospital Epidemiology의 J. Glenn Morris로부터 획득)에서vvhA의 하부에 해당하는 1.76-kbKpnI-XbaI DNA 조각을 잘라내고 같은 제한효소로 자른 pDM4 (Debra Milton, Department of Molecular Biology, Umea University, Sweden)에 클로닝하였다.vvhA의 상부를 증폭하기 위해서는 서열 23으로 표시되는 프라이머 PvvhA-3(ttggtgcatatctattctcaaggacg)과 서열 24로 표시되는 Pvvh-4(cgggtaccctttgagctggtgatg)를 이용하여, 초기변성 95℃ 4분 후, 변성 94℃ 30초, 어닐링 65℃ 30초, 확장 72℃ 60초, 25회 반복한 후 마지막 72℃에서 10분 반응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응을 실시하였다.vvhA하부를 포함하고 있는 재조합 플라스미드에 PvvhA-3과 PvvhA-4의 PCR 증폭 DNA 조각을 클로닝하여vvhA유전자의 상하부가 포함된 DNA 조각을 가지고 있는 재조합 플라스미드를 얻고, 이렇게 제조된 재조합 플라스미드를E. coliSM 10λ pir에 일렉트로포레이션시켜 생성된 형질전환 균주를V. vulnificus와 접합시켜 재조합 플라스미드가 전달되도록 하였다.V. vulnificus안에서는 증식하지 못하는 pDM4의vvhA결실 DNA 조각과 염색체의 자연형 DNA 조각 사이에 대립형질 상호교환(allelic exchange)에 의하여 결실이 유발된 돌연변이V. vulnificus균주는 서열 25로 표시되는 PvvhA-1(cgggatccatgaaaaaaatgactc)과 서열 26으로 표시되는 PvvhA-4(cggaattcgcctagagtttgacttg) 프라이머 짝을 이용한 중합효소연쇄 반응에 의하여 확인하였다. 이와 같이 제조된 이와 같이 제조된rtxA와vvhA이중 돌연변이 균주를 CMM 751로 명명하였다.
vvpE의 돌연변이 균주를 제조하기 위하여vvpE유전자 일부의 결손은 PvvpE-5, PvvpE-6와 PvvpE-7, PvvpE-8이라는 두쌍의 프라이머를 사용한 PCR 법을 사용하였다.vvpE유전자의 상부 증폭을 위해서는 서열 27로 표시되는 PvvpE-5(gcagcttcgctaagagggaggcg)와 서열 28로 표시되는 PvvpE-6(cgggtaccaacacaggcaggccc)의 프라이머를 사용하였으며,vvpE유전자 하부 증폭을 위해서는 서열 29로 표시되는 PvvpE-7( cgggtacctcttcaagtcgaatgg)과 서열 30으로 표시되는 PvvpE-8(ggcggcaatcccaagagc)의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭하였다. 이하 결손 돌연변이 균주제조 방법은 [실시예 4]와 동일하다.이와 같이 제조된rtxA와vvpE이중 돌연변이 균주를 CMM 750으로 명명하였다.rtxA와vvhA,vvpE 의삼중 돌연변이 균주를 CMM 1055로 명명하였다.
[실시예 6] RTX 독소의 주변세포질 및 외막 운반 단백질tolC유전자의 결실 돌연변이주 제조
RTX 계열 독소들의 주변세포질 및 외막 운반 단백질 유전자로 알려진(Bina, J.E., Mekalanos, J.J.,Infect. Immun.69:4681-4685, 2001)tolC는 본 연구진이 수행한V. vulnificus게놈프로젝트 과정에서 발견되었다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/micr.html).tolC유전자 완전 결손 돌연변이 균주를 제조하기 위하여tolC유전자의 상부와 하부를 두 쌍의 프라이머(서열 31로 표시되는 PtolC-1, cgcgaaagcccgtgcggc; 서열 32로 표시되는 PtolC-2, tggaaaatg taatcgaagccacaaacgc 및 서열 33으로 표시되는 PtolC-3,gcttcgattacattttccattctcgccatg; 서열 34로 표시되는 PtolC-4, ctgaacacccacccgctgaaggat)를 사용하여 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭하였다. 프라이머 PtolC-1과 PtolC-2를 사용한tolC유전자 상부의 증폭과 PtolC-3과 PtolC-4를 사용한tolC하부의 증폭은 초기변성 95℃ 4분 후, 변성 94℃ 30초, 어닐링 70℃ 30초, 확장 72℃ 60초, 25회 반복한 후 마지막 72℃에서 10분 반응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응을 하였다. 이 때 PtolC-2와 PtolC-3의 앞부분의 9-10 염기서열이 서로 겹치도록 디자인(PtolC-2와 PtolC-3 프라이머에서 굵게 표시됨)하여 crossover PCR을 실시할 경우tolC구조 유전자 전부가 결손되도록 하였다. 즉,PtolC-1과 PtolC-2로 증폭된 DNA 조각과 PtolC-3와 PtolC-4로 증폭된 DNA 조각을 섞어주고, 이를 주형으로 하여 프라이머 PtolC-1과 PtolC-4로 위와 같은 조건에서 다시 중합효소연쇄반응을 하면tolC유전자 내부의 개시코돈과 종결코돈을 제외한 모든 DNA 조각이 결손된 DNA 조각을 얻을 수 있었다. 이렇게 증폭된tolC결손 DNA 조각을 PCR 2.1-TOPO cloning vecter(Invitrogen Co.)에 클로닝하였다. 이 재조합 플라스미드에서tolC유전자의 상하부가 포함된 DNA 조각을 제한효소BamHI과XbaI으로 잘라낸 후BglII와XbaI으로 자른 pDM4 플라스미드(Debra Milton, Department of Molecular Biology, Umea University, Sweden)에 클로닝하였다. 이렇게 제조된 재조합 플라스미드를E. coliSM 10 λpir에 일렉트로포레이션시켜 생성된 형질전환 균주를V. vulnificus와 접합시켜 재조합 플라스미드가 전달되도록 하였다.V. vulnificus안에서는 증식하지 못하는 pDM4의tolC결실 DNA 조각과 염색체의 자연형 DNA 조각 사이에 대립형질 상호교환(allelic exchange)에 의하여 결실이 유발된 돌연변이V. vulnificus균주는 PtolC-1과 PtolC-4 프라이머 짝을 이용한 중합효소연쇄 반응에 의하여 확인하였다. 이와 같이 제조된 돌연변이주를 CMM 2400으로 명명하였다.
[실시예 7] 각 균주의 배양 및 보관
대장균 균주들은 Luria Bertani 배지(Difco Co.)에, 비브리오 패혈증균은 heart infusion 배지(Difco Co.)에 배양하였다. 사용한 균주들은 배양 후 글리세롤을 50%되게 첨가하여 -80℃ 초저온 냉동고에서 보관하였다.
[시험예 1] 세포독성에 있어 비브리오 패혈증균과 숙주세포 접촉의 중요성 증명
'종래 기술의 문제점' 부분에서도 강조한 바와 같이, 기존에 분리된 단백질 형태로 투여하였을 경우 시험관내에서 세포에 독성을 나타낸다고 보고된 용혈독소와 금속단백분해효소 등의 외독소는 해당 유전자 각각 혹은 전부를 특이적으로 돌연변이 시켰을 경우에도 세포독성은 여전히 관찰되고, 마우스에 대한 LD50도 유의한 차이가 관찰되지 않는다. 이러한 현상은 용혈독소나 금속단백분해효소 말고도 중요한 세포독소가 존재하며, 그 세포독소가 마우스 치사력을 좌우하는 가장 중요한 독력인자로 작용할 가능성이 있음을 시사한다.
그리고 용혈독소나 금속단백분해효소는 배양 상청액으로 분비되기 때문에 만일 이 두 가지 외독소가 세포독성에 전적으로 관여한다면 숙주세포와 접촉하지 못하게 하더라도 세포독성이 관찰되어야 할 것이다. 이를 증명하기 위해 Transwell™ culture plate (Corning Costar Corp.)를 사용하여 실험하였다. 이 culture plate는 upper 및 lower chamber로 구성되어 있으면 이 둘은 직경 0.5 ㎛의 작은 구멍이 뚫린 polycarbonate membrane에 의하여 분리되어 있다. HeLa 세포주를 lower chamber에 배양하고, 세균은 upper chamber에 배양하여 서로 접촉하지 못하게 하였을 경우에는 37℃에서 2시간 이상 배양을 하여도 세포독성이 전혀 관찰되지 않았다. 이는 살아있는 비브리오 패혈증균과 동물세포를 동시에 배양할 때 관찰되는 세포독성은 세균과 숙주세포의 접촉을 필요로 하는 새로운 세포독성 인자가 존재한다는 사실을 강력히 시사한다.
[시험예 2] RTX 결실 돌연변이가 세포독성에 미치는 영향
24-well culture plate에 HeLa 세포를 1.0x105세포씩 분주하여 10% 우태혈청을 가한 DMEM 배지에서 하룻저녁 배양하였다. 그 후 우태혈청을 첨가하지 않은 DMEM 배지로 2차례 세척하고, 지수증식기에 있는V. vulnificus를 우태혈청이 없는 DMEM으로 희석하여 HeLa 세포에 세균대 세포의 비율을 100으로 하여 90분 동안 배양한 후에 상청액에 유리된 lactate dehydrogenase (LDH)의 양을 CytoTox™ Non-Radioactive Cytotoxicity assay kit (Promega Co.)로 측정하여 세포독성을 비교한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 RTX 및 용혈독소(vvhA), 금속단백분해효소(vvpE) 유전자들의 돌연변이가V. vulnificus의 세포독성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. RTX 결손 돌연변이에 의하여 세포독성은 유의하게 감소하였으며, 세포독성 결함은 자연형rtxA유전자를 함유하고 있는 플라스미드를 도입시켜주면 정상으로 회복되었다. 용혈독소 및 금속단백분해효소 유전자 이중 돌연변이 균주(vvhA/vvpEdouble mutant)(Kim, Y.R., Rhee, J.H.,Biochem, Biophys. Res. Commun.304:405-410, 2003)는 자연형 균주와 거의 유사하게 90분부터 세포독성을 나타내었다. RTX 결손 돌연변이 균주도 3시간이 지나고 나면 세포독성을 나타내었다.rtxA/vvpE이중 돌연변이 균주는rtxA단일 돌연변이 균주와 유의한 차이를 나타내지 않았다. 반면rtxA/vvhA이중 돌연변이 균주와rtxA/vvhA/vvpE삼중 돌연변이 균주는 6시간 이상이 지나도 전혀 세포독성을 나타내지 않았다. 이상의 결과는 RTX가 가장 강력한 세포독소이고, RTX 결손 돌연변이 균주에서 관찰되는 지연성 세포독성에는 용혈독소가 관여한다는 사실을 보여준다. 또한, 약독화 생균백신 균주 개발에 있어 만일rtxA단일 돌연변이주가 지연형 세포독성 등의 부작용을 나타낼 경우 추가적으로 용혈독소와 금속단백분해효소 유전자를 돌연변이 시킴으로써 안전성을 확보할 수 있을 것임을 강력히 시사한다.
[시험예 3] TolC 결실 돌연변이가 세포독성에 미치는 영향
RTX 독소의 주변세포질 및 외막 운반 단백질로 추정되는 (Bina, J.E., Mekalanos, J.J.,Infect. Immun.69:4681-4685, 2001)tolC유전자를 제거한 돌연변이 균주의 세포독성 역시 RTX 결실 돌연변이 균주와 같은 방법으로 검사하였다. 도 3은 세균과 HeLa 세포를 90분 동안 작용시키고 TolC 돌연변이 균주와 RTX 돌연변이 균주의 세포독성을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다. TolC 돌연변이 균주 역시 90분에 세포독성을 거의 나타내지 않았다.
[시험예 4] RTX 결실 돌연변이가 마우스 치사력에 미치는 영향 검사
SPF(specific pathogen free) 8주령과 생후 5일 수유 CD-1 마우스에 각각 복강내와 위장내로 10배 순차 희석한 RTX 결실 돌연변이 균주와 자연형 균주를 각각투여하고 치사여부를 48시간동안 관찰하였다. 그 결과 RTX 결실 돌연변이 균주의 위장내 LD50는 7.0x107마리로서 자연형 균주의 5.0x105보다 치사력이 140배 감소한 것으로 나타났다. 복강내 LD50는 5.0x107마리로서 자연형 균주의 LD505.0x105마리 보다 치사력이 100배 감소한 것으로 나타났다(표 2).
[표 2]
RTX 결손 돌연변이가V. vulnificus의 마우스에 대한 LD50에 미치는 영향
균주 유전형 위장내 투여 LD50(증가 배수) 복강내 투여 LD50(증가 배수)
MO6 24/O V. vulnificus자연형,임상분리균주 5.0 X 105 5.0 X 105
CMM740 rtxA유전자에 결손 돌연변이가 있는 MO6 24/O 7.0 X 107(140) 5.0 X 107(100)
[시험예 5] TolC 결실 돌연변이가 마우스 치사력에 미치는 영향 검사
SPF(specific pathogen free) 8주령과 생후 5일 수유 CD-1 마우스에 각각 복강내로 10배 순차 희석한 RTX 결실 돌연변이 균주와 자연형 균주를 각각 투여하고 치사여부를 48시간동안 관찰하였다. 그 결과 RTX 결실 돌연변이 균주의 위장내 LD50는 5.5x107마리로서 자연형 균주의 5.5x105보다 치사력이 100배 감소한 것으로 나타났다. 이 마우스 치사력 검사 결과와 시험예 3의 세포독성 검사 결과는 RTX 독소의 생성뿐 만 아니라 세포 밖으로의 분비를 억제하여도 비브리오 패혈증균의 독력이 극적으로 감소한다는 사실을 보여준다.
[표 3]
TolC 결손 돌연변이가V. vulnificus의 마우스에 대한 LD50에 미치는 영향
균주 유전형 복강내 투여 LD50(증가 배수)
MO6 24/O V. vulnificus자연형,임상분리균주 5.5 X 105
CMM2400 tolC유전자에 결손 돌연변이가 있는 MO6 24/O 5.5 X 107(100)
[시험예 6] RTX 결손 돌연변이 균주의 백신으로서의 효능 검사
6주령 BALB/c 마우스를 두 그룹으로 나누어 대조군은 인산완충식염수로 실험군은 인산완충식염수로 부유한 각각 5x106마리와 1x107의 RTX 결손 돌연변이 균주를 2주 간격으로 2회 비강내 예방접종을 실시하였다. 비강내 예방접종을 위해서는 2% ketamine과 0.2% xylazine을 0.1㎖ 복강내 주사하여 마취시킨 후 균부유액이나 인산완충식염수를 마우스당 20㎕씩 비강 내에 점적하였다. 두 번째 예방접종이 끝난 1주일 후에V. vulnificus에 대한 감수성을 높이기 위하여 마우스당 600㎍씩의 구연산철 암모늄(ferric ammonium citrate; Sigma Co.) 복강내 주사하고, 그 후 30분에 마우스당 자연형 균주 1.0x1010마리씩을 위장내로 투여하고 72시간 동안 관찰한 결과를 표 4에 나타내었다. 표 4를 살펴보면 대조군 마우스 4마리는 24시간 이내에 완전히 사망하였으나, RTX 결손 돌연변이 균주로 비강내 예방접종한 마우스 6마리는 모두 생존하였으며, 거의 정상 마우스와 다름없는 외형을 나타내었다.
[표 4]
RTX 결손 돌연변이 균주의 마우스 비강내 예방접종에 의한 위장내V. vulnificus감염에 대한 방어효과
비강내 예방접종 물질 Challenge dose 마우스생존수/ 감염수
인산완충식염수 (음성대조) 1.0 X 1010 0/4
CMM740 (rtxA돌연변이 균주)1차: 5x106/마우스2차: 1x107/마우스 1.0 X 1010 6/6
본 발명에 의한 RTX 독소 구조유전자인rtxA유전자 및, RTX 독소의 주변세포질 및 외막 운반 단백질인tolC유전자를 결손시킨 돌연변이 균주는 세포독성을 거의 상실하였고, 마우스 치사력도 100배 이상 약화되었다. 또한 본 발명에 의한rtxA유전자 결손 돌연변이 균주를 약독화 생균백신으로 비강내 투여한 결과 치사량의V. vulnificus위장내 감염으로부터 숙주를 완벽히 보호하였다.
따라서, RTX 독소의 생성, 활성화, 운반 등에 관여하는 유전자들은 효과적 백신개발은 물론 새로운 치료제 검색에 있어 중요한 표적이 될 것이다. 본 발명에 의한 RTX 결손 돌연변이 균주는 비브리오 패혈증 예방 백신 자체는 물론, 유전자 면역(genetic immunization)을 위한 DNA를 운반하거나, 사람을 포함한 여러 동물의 체내에서 이종의 유전자나 단백질을 발현시켜 면역반응을 유발하는 약독화 항원 운반 숙주로도 사용할 수 있다.
<110> CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> RTX and related genes of Vibrio vulnificus responsible for the contact-cytotoxicity and lethality to animals <160> 35 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15621 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 1 atgggaaaac cattttggag aagtgttgaa tacttcttca cagggaacta ttccgccgac 60 gatggaaaca acagtattgt tgctatcggt tttggtggag aaatccatgc ctacggtggt 120 gatgatcatg tcactgtcgg atcgattggt gcaacggttt ataccggcag cggcaatgat 180 acggtcgtag gcggttcggc atatctaaga gtggaagaca ccactgggca cctttctgta 240 aaaggcgcag ctgggtatgc agacattaat aaaagtggcg atggcaatgt gtcattcgct 300 ggtgccgctg gcggtgtgtc gattgaccac ttaggtaatc atggtgatgt cagttacggc 360 ggtgcagcgg cttataatgg cattacccgc aaaggtttga gcggcaacgt cacctttaaa 420 ggcgctggcg gttacaatgc cctttggcat gaaaccaacc aaggtaatct ctcttttgct 480 ggcgcaggag cgggcaataa actagaccgt acttggttca accgttatca aggctcgcgt 540 ggtgatgtga cgtttgatgg cgctggcgcg gcaaacagca tcagttcacg tgttgaaacc 600 ggcaacatta ctttccgtgg ggctggtgct gacaaccatt tggtccgtaa 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10740 gataaaacca aggtcgtggt cgatttagcg caaatcttta cggtgcaaga gctgaaagaa 10800 agagcaaaag tttttgctaa accgattggc gcatcctacc aaggtattct cgatcaactc 10860 gaccttgtgc atcaggctaa aggccgcgat caaatcgcag cgagctttga gcttaataag 10920 aagattaatg actacatcgc tgaacatcca acttcggggc gtaatcaagc gctaacgcag 10980 ttgaaagagc aggtcaccag tgcgttgttt atcggtaaga tgcaagttgc ccaagcgggt 11040 attgatgcaa tcgcacaaac aagaccggag cttgccgctc gtatctttat ggtcgcgatt 11100 gaagaagcca acggtaaaca cgtaggtttg acggacatga tggttcgttg ggccaatgaa 11160 gacccatact tggcaccgaa gcatggttac aaaggcgaaa cgccaagtga ccttggtttt 11220 gatgcgaagt accacgtaga tctaggtgag cattacgctg atttcaaaca gtggttagaa 11280 acgtcccagt cgaacgggtt gttgagtaaa gcgacgttgg atgaatccac taaaacggtt 11340 catcttggct atagctatca agaacttcag gatttgacgg gtgctgaatc ggtgcaaatg 11400 gcgttctact tcctgaaaga agcggcgaag aaagcggatc cgatttctgg tgattcagct 11460 gaaatgatac tgctgaagaa atttgcagat caaagctact tatctcaact tgattccgac 11520 cgaatggatc aaattgaagg tatctaccgc agtagccatg agacggatat 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vulnificus <400> 6 Met Thr Ala Thr Leu Ser Ala Asn Glu His Ile Asp Thr Ile Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Pro Glu Glu Thr Thr Arg Asn Asn Trp Gly Ile Glu Ala Val 20 25 30 Val Tyr Ala Gly Gln Gln Phe His Lys Lys Ser Ser Ser Ser Gln Leu 35 40 45 Lys His Ala Leu Gly Val Ser His Ala His Leu Ser Asp Met Glu Met 50 55 60 Arg Glu Ala Ala Asp Tyr Leu Gly Leu Lys Ser Gln Val Thr Thr Leu 65 70 75 80 His Thr Gln Ala Leu Asp Thr Leu Pro Leu Pro Ala Leu Ile Glu Asn 85 90 95 Asn His Gly Trp Gln Val Ile Thr Gln Val Ser Asp Gly His Trp Thr 100 105 110 Phe Tyr Asp Pro Ser Thr Gln Gln Leu Gln Thr Gln Pro Val Ser Pro 115 120 125 Asn Pro Ser Gln Arg Lys His Lys Val Met Leu Leu Ala Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Ser Ser Lys Glu Val Lys Phe Gly Leu Ser Trp Phe Ala Pro Ser 145 150 155 160 Ile Leu Arg Gln Lys Ser Gln Leu Arg Asp Val Phe Leu Tyr Ala Ile 165 170 175 Ala Leu Gln Val Phe Ala Leu Val Ser Pro Met Leu Phe Glu Asn Val 180 185 190 Ile Asp Lys Val Leu Val Gly Arg Ser Leu Ser Ser Leu His Val Leu 195 200 205 Ala 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Ala Arg Ser Ala Leu Glu Ala Thr Glu Ala Gly Phe Asp Val Gly Thr 370 375 380 Arg Thr Ile Val Asp Val Leu Asp Ala Thr Arg Arg Leu Tyr Asp Ala 385 390 395 400 Asn Lys Asn Leu Ser Asn Ala Arg Tyr Asn Tyr Ile Leu Ser Val Leu 405 410 415 Gln Leu Arg Gln Ala Val Gly Thr Leu Ser Glu Gln Asp Val Leu Asp 420 425 430 Val Asp Ala Gly Leu Ile Ala Lys Lys 435 440 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 15 ggccacgcgt cgactagtca nnnnnnnnnn acgccc 36 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 16 ttcttcacga ggcagacctc agcgc 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 17 ggccaagagt cgactagtca 20 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 18 ccgcacttgt gtataagagt cag 23 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 19 gaattcttga gcttgcaggc g 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 20 tctagaacca cgcgagcctt g 21 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 21 tctagacaca atgatggact gggc 24 <210> 22 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<212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 33 gcttcgatta cattttccat tctcgccatg 30 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 34 ctgaacaccc acccgctgaa ggat 24 <210> 35 <211> 11403 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 35 atgggaaaac cattttggag aagtgttgaa tacttcttca cagggaacta ttccgccgac 60 gatggaaaca acagtattgt tgctatcggt tttggtggag aaatccatgc ctacggtggt 120 gatgatcatg tcactgtcgg atcgattggt gcaacggttt ataccggcag cggcaatgat 180 acggtcgtag gcggttcggc atatctaaga gtggaagaca ccactgggca cctttctgta 240 aaaggcgcag ctgggtatgc agacattaat aaaagtggcg atggcaatgt gtcattcgct 300 ggtgccgctg gcggtgtgtc gattgaccac ttaggtaatc atggtgatgt cagttacggc 360 ggtgcagcgg cttataatgg cattacccgc aaaggtttga gcggcaacgt cacctttaaa 420 ggcgctggcg gttacaatgc cctttggcat gaaaccaacc aaggtaatct ctcttttgct 480 ggcgcaggag cgggcaataa actagaccgt acttggttca accgttatca aggctcgcgt 540 ggtcacaatg atggactggg ctatatccta gataatgtcg tggcgaaatc ggaatcgtcg 600 caacaagcca acgcagtgag tgagcacgcg acacaaaatc aagcgtcgca gaatgcccta 660 tcagataaag agcgcgcaga agcggatcgc caacgtcttg aacaagaaaa gcagaaacag 720 cttgatgctg tcgcagggtc acaaagtcag ttggagtcga ccgaccaaca agcgctagga 780 aataacggtc aagctcaacg tgatgcggtg aaagaagagt cggaagccgt gaccgccgag 840 ttgacaaaac tggcgcaagg tctcgatgtg cttgatggcc aagcaacgca tagtggcgag 900 tccggcgacc aatggcgcaa tgattttgcc ggtggtctgc tcgatggcgt tcaaagccag 960 ctcgacgatg ccaagcaact cgcgaatgac aagattgctg cagcgaagca ggcgcagtct 1020 gacaataaca gcaaagtcaa agaatccgtt gcgaaatctg aagcgggtgt ggcaaaaggt 1080 gagcaaaatc gcgcaggtgc agagcaagac attgccgaag ctaaagccga tgcagaaaca 1140 cgcaaagccg atgctgtggc gaaaagtaac gatgcgaaac aggccgaatc tgacgcacac 1200 agcgccgcaa acgacgcgca atcgcgtggt gatcgcgata cgatgaatgc cgaaaacaaa 1260 gccaaccaag cgcagaatga tgccaaaggg accaagcaaa acgaaggcga tcgccctgac 1320 cgtgaaggcg tggctggcag cggtctttca ggtaacgctc atagcgtgga aggtgctggc 1380 gaaacgggca gtcatgtcac cactgacagc caaacaaacg ccgatggtcg attcagtgaa 1440 ggtctaagcg aacaagagca agaagcgctg gaaggtgcga caaacgcagt gaaccgtctg 1500 caaattaacg caggtattcg cggaaagaac agcggtagca ccatcacctc aatgttcacc 1560 gaaacaaact ccgacagcat tgtggtgcca accactgcgt ctcaggattt ggtccgaaaa 1620 gagatccgca tttctggggt gaacttagag gggcttggtg aaacttcgca tgactctgct 1680 gaatcgcttg tggctgctcg cgcggaaaaa gtggcgaatc tctatcgctg gctagacact 1740 gataatgacg tggcgacgga caagtatgta cctgtccctg gctttgaacg cgtcgatgct 1800 gatgtctctg atgaagtcaa gcagcgcatg attcaatcta tgagcggtta catcgaacac 1860 accgacaatc aagtaccgaa agatcaagcg gaagcattag ccactttgtt tgttgaagcg 1920 acgctcgatt atgactggga caaacgcgtt gagtttctca ctaagcttga gagctatggt 1980 tatagttttg aagcgccaca cgcagagaaa agcattgttt ccttctggtc tggtaaaaac 2040 ttcaagcaat accgagacgt tctcgacaat gcccagactg atggcaaaaa ggtcgtgtac 2100 gacatcgatg ttaaaggcaa cgcatttgca atcgacctga ataagcattt aatgcgttgg 2160 ggtggcctgt tccttgaccc agataacgcc gagcaaaatc aattgaaatc gtcaattgat 2220 gcagcaacgt tcagcaatac aggtttttgg agttcggtct atgcgacggg ggcacaaaat 2280 gatgtgtatg tcatcgcaga aggtggtgtg cgtcttggca actatttctg gaatgttgag 2340 ctacctgcat tacgccaatt gcagcgtgaa gggttagtcg gtgaaattcg actgcttgat 2400 aagccagtat ccgagtacaa agatctacca gcagaccaga ttggacgccg acttaccgat 2460 gcaggtgttg ccgttaaagt acgctttgat gcgttgagtc acgagagaca agctgagctt 2520 ttggccgaca atccagatgg ttacaaagcc gatacgctgg ttgagttgga tgtgaagcta 2580 agtgcgatcg atagcatgtt gcgtgaatct ctaccattct attcacttcg tactgagcgc 2640 aacctcttag tgcaagaagg cgaagaagga tttgaagttc gctcatggcc gggaatcgat 2700 ggaaagagca agactattct gcttgataac ccagaagatg cagctcaaca aaaatccatt 2760 gagcgcttta tcttggcaaa cttcgacaac ttcgagcaga tgccagatga acttttctta 2820 gtggataaca aggtgctctc gcatcacgat ggccgcacgc gaattatagt gcaaaaagaa 2880 gacggtgctt ggacgtacaa caccaatgtt gaactgatgt ctgtcactga gctactcgat 2940 gctgctcatg tgaacggtaa agttcgcggt gatagttacc aacaagtgat cgacgccctg 3000 acggagtatc atgcgagtac ggttgaacac gcagattacg aactagaatc tgtggaaaaa 3060 ctgctcaacc tgcgtaaaca gattgaaggt tatgtactcg ggcatccgga ttctggccgt 3120 gtggaagcaa tgaactcact gttaaatcag gtgaattctc gtctggaaga agtctctgtt 3180 cttgcggtct ctgagcaaag catcaaagcg cacgatagct ttagccgcct atatgaccag 3240 cttgataatg ccaacttaaa agaaagtaaa catctgtatc tggatggaaa cggcgatttc 3300 gtcactaagg gcaaaggcaa cctagccact atcgatcagc taggtggtag cgatgctgta 3360 cttgaaaaag taaaagcagc cgtaactcat gagtatggtc aagtcgttgc cgatacgatc 3420 ttcgcagggc tttctgcaaa cgatctggca aaagatggta aaggcattga tattgctggt 3480 ttaaacaaag tacaccaagc gattgaacag cacatgtcgc cagtgagcgc gaccatgtac 3540 atctggaagc cgagtgatca cagcgcacta ggtcatgccg cattgcaaat tggccaaggt 3600 cgcacgcagc ttgaaggtca agccgcagca gacttcaata agcagaatta cgtgagttgg 3660 tggccactcg gtagcaagtc atccaatatc cgcaatatct tcaacgttgc aacagaagat 3720 cagccggatc ttaaactacg ttggagcgat ttcagccaac ctgctcatca aaatgacaca 3780 cttgagcacg atatggcatc ggaagaaaac gacggctttg gtttgaaaga tggtgaaact 3840 aagctgaaac gctttatcga aaaactcaac gccgcgaaag gtattgatgc ttcatacaaa 3900 gatgcttctg aaggctatgc gagtgtgcta ctgggcaatc cagatatgct tgcatcgaca 3960 ggcattcctg cgcatgtatt ccagccattc gtcgaccaat ggaatgacac cagctacgac 4020 atgatggacg tagcaaaccg ttttgctgaa gagctacaga aacaagctca ggcaagtggt 4080 gatcccgccc tagtggaaaa acgcatcgac aacgtggttc gcctgtttgc tgaaagagcg 4140 ctggaagaaa tcgaagcctt taaggccagc caagcagatg aaggccgagt gttccgcatt 4200 aacctagaag ggttggatgt ggcggcgatg caagctgaat ggaaccgtct aagcaacgat 4260 ccggatgctc gatatcagtt attgaccaaa aactgctcaa gtaccgtcgc aaaagttttg 4320 aaagcgggtg gcgctgacaa acttatcggc cacacatggc gacctaagtt tggtgtttgg 4380 acgccgacag agcttttcaa ctttggtcag gcgctgcagg aagctcagct tgaaattgcc 4440 gcgaagaagc aaagtcatca agtcactgat gtccttgatg ccttgtcagg taatgagaag 4500 cacaaagaaa acgtggcgat tgaaaatgat ggcacgccac cgcgcgataa agaatctctt 4560 agcccactga ctcgattcct caacaatgag ttatatggtg agaaagacgc acgtcgtaag 4620 attggcgaaa tcacgcaaac cttacttgac catgcggtag aaaatggaga atcgcagaaa 4680 gttaccctca aaggggaagc gggtcgtcta acggggtatt accatcaggg agcggtttca 4740 agcgaaggtg aaacaagcgc gaccagcggc aaagtcgtgt tgttcttgca cggttctggt 4800 tcttctgctg aagagcaagc gagcgagatt cgcaaccact accaaaaaca aggtatcgac 4860 atgctcgcag tcaacctgcg tggctatggt gaaagcgacg gcggaccaag cgaaaaaggc 4920 ttgtaccaag acgctcgcac catgttcaac tacctagtga acgacaaggg tattgaccca 4980 agcaatatca tcattcacgg ctactcaatg ggtggtccaa ttgccgcaga tttagcacgt 5040 tatgccgcgc aaaacggcca agcggtgtct ggcttattgc ttgaccgtcc tatgccaagc 5100 atgaccaaag cgatcaccgc tcatgaagtg gcgaatcctg cgggcattgt gggggctatc 5160 gcgaaagcgg ttaacggcca gttctcagtg gagaagaacc taaaaggctt gccaaaagag 5220 acgccgattc tgctgctaac ggacaacgaa ggcttaggcg aagaaggcga gaagctacga 5280 gctaaactcg cgattgctgg ctacaacgtc acgggtgaac aaaccttcta tggccacgaa 5340 gcgagcaacc gcttgatggg gcagtacgtg gatcaaattg tctccggtct gttcaatgca 5400 gagcaagcag cggtagaagc gggcgaagtg ctgaaaggac tagagaaaga ctttaaacgc 5460 tatggcgacg cgctgaaacc agatacgagc gtgccgggta aatcgaaaga cattcgcacc 5520 actaaagatt tcctaaatgg ttacaaaaat gaccatgcga aagagatcgt tgacggcttc 5580 cgctcagata tgagtatcaa gcaactggtg gatctgtttg ttaaaggtaa ctggagtgca 5640 gagcaaaaag gtgcgcttgc ttgggaaatc gaaagtcgtg cactgaaagt gacgttccag 5700 aacaagtctg agaagtacaa ccgattgttc cgtgagattg cttctgctgg cgtggtggat 5760 gcgaaagcga ctgaacagct tgcgccacag ttaatgctgc tgaacctatc gaatgacggt 5820 tttggtgggc gttgtgatcc actttctaaa ctcgttttgg ttgcgaaaca gcttgaaaac 5880 gatggtcaag ttggcgtggc aagacaactg ctagaaaaga tgtactctgc ggcagcggtg 5940 ctgagcaatc caacccttta ctcagacagt gaaaaagcca atgcaagcaa gttgctcagc 6000 agcttggcgg ccattcatgc gaagaaccca atgcatgata cgtcgatgaa agtgtggcag 6060 gaaaagctgg aagggaagca agcgctgacc gtaaacggtg tggttgagaa aatcactgat 6120 gcatcggcta acggtaaacc tgtgctgttg gaacttgatg ctccggggca tgcgatggca 6180 gcttgggcaa aaggctcagg cgacgatcgt gtttacggct tctacgatcc aaatgctggc 6240 atcgttgagt tttcgtcagc agagaagttt ggcgactacc taacgcgttt cttcggcaag 6300 tccgatctga acatggctca aagctataag ctgggtaaaa acgacgcagg tgaagcaatc 6360 ttcaaccgcg tggtggtaat ggatggcaat acattagcaa gctacaagcc gaccttcggt 6420 gacaagacca ccatgcaggg gatcctagat ctacctgtgt ttgacgctac accgattaaa 6480 aagcctacgg gtggagtcgc gagcgatctc gaagcattgg gtgataaaac caaggtcgtg 6540 gtcgatttag cgcaaatctt tacggtgcaa gagctgaaag aaagagcaaa agtttttgct 6600 aaaccgattg gcgcatccta ccaaggtatt ctcgatcaac tcgaccttgt gcatcaggct 6660 aaaggccgcg atcaaatcgc agcgagcttt gagcttaata agaagattaa tgactacatc 6720 gctgaacatc caacttcggg gcgtaatcaa gcgctaacgc agttgaaaga gcaggtcacc 6780 agtgcgttgt ttatcggtaa gatgcaagtt gcccaagcgg gtattgatgc aatcgcacaa 6840 acaagaccgg agcttgccgc tcgtatcttt atggtcgcga ttgaagaagc caacggtaaa 6900 cacgtaggtt tgacggacat gatggttcgt tgggccaatg aagacccata cttggcaccg 6960 aagcatggtt acaaaggcga aacgccaagt gaccttggtt ttgatgcgaa gtaccacgta 7020 gatctaggtg agcattacgc tgatttcaaa cagtggttag aaacgtccca gtcgaacggg 7080 ttgttgagta aagcgacgtt ggatgaatcc actaaaacgg ttcatcttgg ctatagctat 7140 caagaacttc aggatttgac gggtgctgaa tcggtgcaaa tggcgttcta cttcctgaaa 7200 gaagcggcga agaaagcgga tccgatttct ggtgattcag ctgaaatgat actgctgaag 7260 aaatttgcag atcaaagcta cttatctcaa cttgattccg accgaatgga tcaaattgaa 7320 ggtatctacc gcagtagcca tgagacggat attgacgctt gggatcgtcg ttactctggt 7380 acaggctatg atgagctgac gaataagctt gctagtgcaa cgggcgttga cgagcagctt 7440 gcggttcttc tggatgatcg taaaggcctc ttgattggtg aagtgcatgg cagcgacgtc 7500 aacggcctac gctttgttaa tgaacagatg gatgcactga aaaaacaggg agtcacagtc 7560 attggccttg agcatttacg ctcagacctt gcgcaaccgc tgattgatcg ctacctagct 7620 acgggtgtga tgtcgagtga actaagcgca atgctgaaaa caaagcatct cgatgtcact 7680 ctttttgaaa acgcacgtgc taacggtatg cgcatcgtcg cgctggatgc aaacagctct 7740 gcgcgtccaa atgttcaggg aacagaacat ggtctgatgt accgtgctgg tgctgcgaac 7800 aacattgcgg tggaagtatt acaaaatctg cctgatggcg aaaagttcgt tgctatctac 7860 ggtaaagcgc atttgcagtc tcacaaaggg attgaagggt tcgttcctgg tatcacgcac 7920 cgtctcgatc ttcctgcgct taaagtcagt gactcgaacc agttcacagt tgaacaagac 7980 gatgtaagtc tacgtgttgt ctacgatgat gttgctaaca aaccgaagat cacgttcaag 8040 ggcagtttga gtggcgcaaa taccgctctt cacaaccaaa atgtgaatga ctgggaacgt 8100 gttgttgtga ctccgaccgc ggacggcggt gaaagccgtt ttgatggtca aatcatcgtg 8160 caaatggaga acgatgatgt cgttgcaaaa gccgctgcga accttgcggg taagcaccca 8220 gaaagcagtg tggtggtgca gatcgattca gacggcaact atcgcgtggt gtatggggat 8280 ccgtcaaagc tggatggaaa gctacgttgg cagttagtag gtcatggtcg agatgactca 8340 gaaagtaaca acacgcgttt aagtggctac agtgccgatg agctggccgt gaaattggcc 8400 aagttccaac agtcgtttaa tcaagcggaa aacatcaaca ataagcctga tcatatcagt 8460 attgttggtt gttctttggt gagtgacgac aagcaaaaag gctttggtca tcagtttatt 8520 aacgcgatgg atgcgaatgg tcttcgtgtc gatgtctctg tacgcagttc tgaactggcg 8580 gtagacgagg cagggcgtaa acataccaag gacgcgaatg gcgattgggt ccaaaaagca 8640 gaaaacaaca aagtttcgct aagctgggac gagcaaggtg aagttgttgc caaggatgaa 8700 cgtattcgca atggtattgc ggaaggcgac atcgatctct ctcgtattgg tgtcagcgac 8760 gttgacgagc cagctcgtgg tgcaatcggt ggcaacaatg atgtgtttga tgcgccagaa 8820 aaacgcaaag cggagacaga aacctcatct tcttctgcaa acaataaact cagctactca 8880 ggtaacattc aagtcaatgt aggtgatggt gagtttacgg cagtgaactg gggcacatcg 8940 aatgtgggca ttaaagtcgg cacgggtggc tttaagtcgc tggcctttgg tgacaataac 9000 gtcatggttc acatcggcaa tggtgagagc aagcacagct tcgatattgg tggttatcag 9060 gcactggaag gtgcgcaaat gttcatcggt aatcgtaatg tgagcttcaa cttaggtcga 9120 agtaatgatc tgattgtgat gatggacaag tcgattccga ctccgccatt ggttaatccg 9180 ttcgatggtg ccgctcgtat ttcgggcgta ctgcaaagca ttgccacctc gggtgagggc 9240 caagattggc tagcggctca agagcagcaa tggacattgt ctggcgccaa gaagtttgtc 9300 aaagatatgt ctggtttgga tcagagcagc agcgttgatt acaccagttt ggttgaacta 9360 gactcgcaga acgagcgaag cagccgtggc ttgaagcacg atgcagaagc ggctctgaac 9420 aagcagtaca atcaatggtt aagtggcaat agcgattctg acaccagcaa gctcagccgc 9480 gcagataagc ttcgtcaagc caatgaaaag cttgcgttta actttgccgt gggtggtcaa 9540 ggtgcggata tccaagtgac gacaggtaac tggaacttca tgtttggtga caacatccag 9600 tctattttgg ataccaacct aggctcactg tttggcctca tgacacagca gttctctgct 9660 acgggtcagg ccaagacaac cttcacctac acgccagaag atttgcctcg tcagcttaag 9720 aacaagctac ttgggcagtt agcgggtgta ggagccgaga ccacgctagc ggatattttt 9780 ggtgtggatt acaccgcgtc aggtcacatt gtttcgcgta atggtgaagc cgttgacggc 9840 gtggcgattc tcaaagagat gttggaggtc attggtgagt tcagtggtga tcaactgcaa 9900 gcctttgtcg acccagctaa gttactggat agcttgaagt cgggtatcaa catgggggcg 9960 gatggcatta agtcttttgc tgaaactcat ggactgaaag agaaggcgcc agaagaggaa 10020 gaggacaact cttcggtttc tgttaatggt gcgaacgtaa acagtgcaca aggcgcgacg 10080 gtggctgatg gcagcactga aacagcagaa acaccagatc gtgcctttgg ctttaactcg 10140 cttaacctgc cgaacttgtt cgccactatc tttagtcaag acaagcagaa agagatgaaa 10200 tcgctggtgg aaaatctcaa agagaatctc accgctgatc tgctgaatat gaaagagaaa 10260 acgtttgatt tccttcgtaa cagtggtcat ctccaaggtg atggtgatat caacatctcc 10320 ctaggaaact acaacttcaa ctggggtggt gatggtaaag atctcggagc gtatctagga 10380 gacaacaaca acttctgggg cggacgaggc gatgatgtgt tctacgcaac aggcacgtca 10440 aacatcttca cgggcggcga aggcaacgac atgggcgttc tgatgggacg tgaaaacatg 10500 atgtttggcg gtgatggcaa cgacacagca gtggttgcag gacgcattaa ccatgtcttc 10560 cttggtgccg gtgatgacca gtcgtttgtc tttggtgagg gcggtgaaat tgacaccggt 10620 tcaggccgtg actacgtggt gacgtctggc aacttcaacc gtgtggatac gggtgacgat 10680 caagactact ccgttacgat tggcaacaac aaccaagtag agctaggcgc tggcaatgac 10740 tttgctaatg tcttcggtaa ctacaaccgc atcaatgcaa gcgctggcaa cgatgttgtg 10800 aagctaatgg gctatcacgc cgtgttgaat ggcggtgagg gcgaagacca tctcatcgca 10860 gcggccatct ctaagttcag tcaattcaac ggtggcgaag ggcacgatct gatggtgttg 10920 ggtggttatc aaaacacgtt caaaggtggc acggatgtgg acagctttgt ggtgagcggt 10980 gatgttatcg acaaccttgt tgaagacatt cgcagcgaag ataacattgt cttcaatggc 11040 atcgattggc agaaactgtg gttcgaacgc agcggatatg acctgaagtt gtctattctt 11100 cgtgacccgg caagcgacag tgaccaagcg aagtttgagc atattggttc ggtgacgttc 11160 agtgattact ttaacggtaa tcgagcgcag gtgatcatcg caatgggtga gaaagacgcg 11220 acgggtgaac gtgagtacac caccttgtct gagagtgcaa ttgatgcgct ggtacaagcc 11280 atgagtggct ttgaccctca ggcgggtgac aatggattca tcgataacct agacagcaaa 11340 tctcgcgtgg cgattaccac tgcgtgggca gacgttgtcc ataaaaaggg tataacggtg 11400 taa 11403

Claims (5)

  1. 서열 5로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소 세포막 ABC 운반 단백질rtxB2 유전자;
    서열 7로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소 세포막 ABC 운반 단백질rtxD유전자;
    서열 3으로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소 세포막 ABC 운반 단백질rtxB1 유전자;
    서열 11로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소 세포막 ABC 운반 단백질rtxB1 유전자와 활성화 단백질rtxC사이에 존재하는 기능을 모르는 ORF;
    서열 9로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자 RTX 독소 활성화 단백질rtxC유전자; 및
    서열 1로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)의 독력인자 RTX 독소 구조 단백질rtxA유전자;
    로 이루어진 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)의 독력인자인 RTX 오페론에서 상기 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자가 결손된 돌연변이 균주.
  2. 제 1항에 있어서, 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)의 독력인자인 RTX 오페론에서 상기rtxA유전자의 N-말단 부위의 182 아미노산부터 1,587 아미노산까지에 해당하는 4,200 염기쌍을 결손시켜 제조된 서열 35로 표시되는rtxA돌연변이 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 서열 35로 표시되는 돌연변이 균주.
  3. 제 1항에 의한 RTX 독소 생산 결함 돌연변이 균주를 사용하여 항비브리오 패혈증 생균 백신을 제조하는 방법.
  4. 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 독력인자인 RTX 독소의 주변세포질(periplasm) 및 외막 운반 단백질인 서열 13으로 표시되는 유전자tolC를 결실시킨 돌연변이 균주를 사용하여 항비브리오 패혈증 생균 백신을 제조하는 방법.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 의하여 제조된 생균백신을 사용하여 유전자 면역(genetic immunization)을 위한 DNA를 운반하고, 사람을 포함한 여러 동물의 체내에서 이종의 유전자나 단백질을 발현시켜 면역반응을 유발하는 것을 특징으로 하는 약독화 항원 운반 숙주.
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