KR100512433B1 - 비브리오 패혈증균의 독력인자 발현을 조절하는범독력인자 발현 조절인자인 ｃＡＭＰ 수용체 단백질 및아데닐레이트 사이클라아제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)의 독력인자들의 발현을 조절하는 범독력인자 발현 조절인자(global virulence regulator)인 cAMP 수용체 단백질(CRP) 및 이에 결합하는 cAMP를 생합성하는 아데닐레이트 사이클라아제(adenylate cyclase) 유전자에 관한 것으로, cAMP 수용체 단백질 유전자 및 아데닐레이트 사이클라아제 유전자를 결실시킨 돌연변이 균주를 함유하는 항 비브리오 패혈증 백신, 특히 생균 백신으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

비브리오 패혈증균의 독력인자 발현을 조절하는 범독력인자 발현 조절인자인 ｃＡＭＰ 수용체 단백질 및 아데닐레이트 사이클라아제{cAMP receptor protein and adenylate cyclase of Vibrio vulnificus, global virulence regulators regulating virulence expression}

본 발명은 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)의 독력인자들의 발현을 조절하는 범독력인자 발현 조절인자(global virulence regulator)인 cAMP 수용체 단백질(cAMP receptor protein ; 이하 "CRP"라 한다) 및 이에 결합하는 cAMP를 생합성하는 아데닐레이트 사이클라아제(adenylate cyclase) 유전자에 관한 것으로, cAMP 수용체 단백질 유전자 및 아데닐레이트 사이클라아제 유전자를 결실시킨 돌연변이 균주를 함유하는 항 비브리오 패혈증 백신, 특히 생균 백신으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

비브리오 패혈증균 감염증은 역사가 비교적 짧으나 전 세계적으로 임상증례가 계속 보고 되고 있으며, 새로이 주목받고 있는 질환중의 하나이다. 비록 전세계적으로 절대적인 발병례는 콜레라나 살모넬라 식중독보다 적지만 높은 치명율과 비극적인 임상증상 때문에 심각한 사회적 문제를 야기하고 있다.

비브리오 패혈증균은 1976년 미국 질병통제센터(Centers for Disease Control; 이하 CDC로 약함)의 홀리스(Hollis) 등이 11년 동안 사람에서 분리된 호염성, 병원성 비브리오 균의 세균학적 성상을 처음 보고한 이후, 유당(lactose)을 분해하는 특징 때문에 유당 분해 비브리오(lactose-fermenting Vibrio 또는 Lac(+))라 명명되었다. 1979년 CDC의 블레이크(Blake) 등은 CDC에 보고된 39명의 환자들의 자료를 역학적으로 분석하여 임상증상에 따라 원발성 패혈증(primary septicemia)군과 창상감염(wound infection)군으로 분류하였다. 같은 해 파머(Farmer)는 새로운 종으로서 Vibrio vulnificus(vulnus=wound, ficus=forming)라 명명하였으며, 오늘에 이르고 있다(Farmer, J.J. III, Lancet 2:903, 1979).

V. vulnificus 패혈증은 잠복기가 짧고, 일단 발병하면 전격적으로 진행하여 효과적 항균제 치료 타이밍을 놓치기 쉽다. V. vulnificus 패혈증은 대부분 40대 이상(약 90-95%)의 남자(90% 이상)에서 발생하며, 정상인에서는 거의 볼 수 없고, 기저질환을 가지고 있는 환자들에서 주로 발병한다. 전 세계의 발생증례를 분석해보면 원발성 패혈증의 경우, 대부분의 환자들은 간장 질환과 음주벽 등 만성질환을 가지고 있으며, 간장 질환으로서는 간경변, 만성간염, 간암 등이 주종을 이루고, 그 외 당뇨병, 폐결핵, 만성골수염, 류마티스성 관절염 등의 기저질환이 확인되었다. 그러나 5% 이하에서는 특별한 기저질환을 찾을 수 없는 경우도 있다. 미국의 경우 당뇨병, 악성종양, 혈색소증(hemochromatosis), 지중해빈혈(thalassemia) 등의 빈도가 비교적 높게 나타난다. 최근에는 AIDS 환자들에서 V. vulnificus 패혈증의 발생보고가 나오고 있어, 미국 CDC에서는 AIDS 환자들에게 여름철에는 굴 등의 해산물을 생식하지 말 것을 권고하고 있다.

V. vulnificus에 의한 발병 기전에 관한 연구는 1980년 중반부터 본격적으로 시작되었다. 초기에는 주로 다른 비브리오 속들과는 달리 V. vulnificus가 패혈증을 잘 일으키는 이유와 원발성 패혈증이 주로 간장 질환이 있는 환자들에서 발생하는 이유를 구명하기 위한 연구가 진행되었다. 그 결과를 살펴보면, 어패류를 통해 섭취되어 장관에 이른 V. vulnificus는 장관 내 점액질을 통과하여 장관 상피세포에 부착한 다음, 장관 상피세포를 파괴하고 장관 점막층으로 침입하여 혈관으로 들어가는 것으로 생각되고 있다. 간장 질환 등의 기저질환을 가지고 있는 감수성이 높은 환자들의 혈류로 들어간 V. vulnificus는 활발하게 증식하고, 패혈증을 일으킨다(Linkous, D.A., and Oliver, J.D., FEMS Microbiol. Lett. 174:207-214, 1999).

병원성 세균의 독력 인자들(virulence factors)은 특이적 조절 인자들에 의하여 적재적소에서 발현되도록 정교하게 조절된다. 한 가지 독력발현 조절인자가 다수의 독력인자들의 발현 조절에 관여하는 경우가 있는데, 이를 범독력인자 발현 조절인자(global virulence regulator)라 한다(Mahan, M. J., Slauch, J. M., and Mekalanos, J. J., p 2803-2815, In Neidhardt(ed.) Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 2nd ed. American Society for Microbiology, Washington D.C., 1996). 범독력인자 발현 조절인자가 결손되면 그것에 의하여 발현이 조절되는 다수의 독력인자들의 발현에 이상이 오기 때문에 병원균의 독력이 현저하게 감소된다. 따라서, 범독력인자 발현 조절인자들은 생균백신 개발에 있어 주요 표적 중의 하나가 되고 있다(Curtiss, R., III, J. Clin. Invest. 110:1061-1066, 2002).

본 발명자들은 비브리오 패혈증균에서 cAMP 수용체 단백질 유전자 및 cAMP를 생합성하는데 관여하는 아데닐레이트 사이클라아제(adenylate cyclase) 유전자를 결손시키면 각종 독소, 예를 들어 용혈독소나 단백분해효소 생성능, 세포독성, 운동성, 협막생성, 마우스 치사력 등이 유의하게 감소하는 것을 발견하였다.

또한 본 발명자들은 CRP 유전자 결손 돌연변이 균주에 대하여 비강을 통해 면역시켰을 때 숙주 방어효과가 우수함을 발견하고, CRP 유전자 결손 돌연변이 균주를 생균 백신으로 사용할 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명에서는 상기 생체내 독력발현 조절인자의 발현을 조절하는 CRP 유전자 및 아데닐레이트 사이클라아제 유전자를 선택적으로 결실시킨 돌연변이 균주, 및 이들 돌연변이 균주들을 함유하는 항 비브리오 패혈증 백신, 특히 생균 백신의 제조 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 DNA 서열 1 또는 아미노산 서열 2로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 범독력발현 조절인자인 crp 유전자에 관한 것이다.

또 본 발명은 DNA 서열 3 또는 아미노산 서열 4로 표시되는 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus) 범독력발현 조절인자인 CRP를 활성화시키는 cAMP를 합성하는 효소인 아데닐레이트 사이클라아제를 인코딩하는 cya 유전자에 관한 것이다.

또한 본 발명은 crp 유전자 및 cya 유전자 결실 돌연변이 균주를 함유하는 항비브리오 패혈증 생균 백신의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 crp 유전자 및 cya 유전자의 동정, 및 crp 유전자 및 cya 유전자가 결실된 돌연변이 균주의 백신 효과를 증명하는 과정은 다음과 같다:

1) CRP 및 아데닐레이트 사이클라아제 유전자를 클로닝 및 동정한다.

2) 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제조한 후 Glutathione S transferase-CRP 융합 단백질을 제조한 다음 토끼에서 항혈청을 제조하고 이를 사용한 Western blot analysis에 의하여 돌연변이 여부를 확인한다.

3) 제조된 돌연변이 균주의 독력인자 발현과 마우스 치사력을 측정하고 자연형 균주와 비교하여 유의성을 판단한다.

4) 비강내 면역 후 마우스에 대한 돌연변이 균주의 숙주 방어능력을 측정한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예로만 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용하는 돌연변이 균주 및 이들 특성은 표 1에 정리하였다. 각각의 제조 방법과 자세한 특성은 해당 실시예 및 시험예에서 적시하였다.

[표 1]

균주 및플라스미드	특 징	출 처
V. vulnificus
MO6-24/O	고병원성 임상분리 표준균주	J. Glenn Morris Jr.
CMM 2100	Streptomycin 자연 내성 MO6-24/O	발명자
CMM 710	crp 결손 돌연변이 CMM 2100	발명자
CMM 713	pLAFR3 함유 CMM 710	발명자
CMM 714	pCMM712 함유 CMM 710	발명자
E. coli
CH1105	lacI Q lacZ ΔM15	발명자
CH1133	crp::CAT (CH1105xp1/G1043), CmR	발명자
CH1134	cyaΔ854 (CH1105xp1/G1043)	발명자
SM10 λ pir	thi thr leu tonA lacY supE recA::RP4-2-TcR::Mu λ pir lysogen, oriT of RP4, KmR ; Conjugal donor	Miller and Mekalanos(1988)
Pasmids
pLAFR3	IncP cosmid vector, TcR	Staskawiczet al.(1987)
pKAS32	자살벡터oriR6K,rpsL and ApR	Skorupski and Taylor (1996)
pCMM712	V. vulnificus crp유전자를 포함하는 6 kbpHindIII fragment를 클로닝한 pLAFR3	발명자
pCMM714	V. vulnificus crp 유전자를 포함하는 1,721bpHindIII-SalI fragment를 클로닝한 pUC19 벡터	발명자
pCMM715	pCMM714에서crp ORF의 대부분에 해당하는 513 bpPstI-SphI DNA fragment를 결손시킨 플라스미드	발명자
pCMM716	pCMM715의crp유전자가 결손된EcoRI-EcoRV fragment를 pKAS32에 클로닝한 플라스미드	발명자

또한, 본 발명에서 사용하는 돌연변이 균주의 독력 시험방법은 다음과 같다.

1) 용혈독소(hemolysin) 역가 측정방법 -- 시노다 등의 방법(Shinoda, S., Miyoshi, S., Yamanaka, H., Miyoshi, N.N., Microbiol. Immunol. 29:583-590, 1985)을 이용한다.

2) 금속단백분해효소(metalloprotease) 역가 측정방법 -- Kreger와 Lockwood의 방법(Kreger, A., and Lockwood, D., Infect. Immun. 33:583-590, 1981)을 이용한다.

3) 세포독성은 사멸된 HeLa 세포의 세포질에서 유리된 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase; LDH) 양을 CytoTox™ Non-Radioactive Cytotoxicity assay kit(Promega, Madison, WI, USA)로 측정한다.

4) 협막 형성 -- 고병원성 V. vulnificus 균주들은 협막을 가지고 있으며, 불투명 집락형태를 나타내며, 협막의 생산이 감소되면 독력이 감소되며 heart infusion 한천배지 상에서 투명한 집락형태를 나타낸다고 알려져 있다(Wright, A. C., Simpson, L. M., Zane, S. F., and Oliver, J. D., Infect. Immun. 58:2706-2709, 1987). 협막 생산 여부는 heart infusion 한천배지 상에 도말 배양하여 집락을 형성시킨 후 집락의 투명도로 판단하였다.

5) 운동성(Richardson, K., Infect. Immun. 59:2727-2736, 1991) -- 운동성을 검사하기 위해서는 0.3% 한천 함유 반고형 heart infusion 한천배지에 멸균된 이쑤시개를 이용하여 균을 접종하고 약 6시간 동안 37℃에서 배양한 후 균이 증식하며 움직인 범위를 측정하여 운동성의 정도를 판단하였다.

[실시예 1] CRP 및 아데닐레이트 사이클라아제 유전자 클로닝

V. vulnificus MO6-24/O 표준균주(J. Glenn Morris, Division of Hospital Epidemiology, University of Maryland School of Medicine로부터 얻었음)의 코스미드(cosmid) 유전체 라이브러리를 제조하여(Staskawicz, B. et al, J. Bacterol. 169:5789-5794, 1987), 이로부터 분리한 플라스미드를 CRP와 아데닐레이트 사이클라아제 결손 대장균 돌연변이 균주인 CH1133과 CH1134에 일렉트로포레이션에 의하여 형질전환(transformation)시켜 돌연변이 표현형을 다시 자연형 표현형으로 되돌리는 클론을 찾아 서브클로닝 과정을 거쳐 염기서열을 결정하였다.

돌연변이주 CH1133과 CH1134를 제조하는데 사용한 CH1105 균주는 DH5α 대장균 균주의 염색체에 있는 lacZΔM15 돌연변이 대립형질을 T4 박테리오파지 보편형 형질도입(generalized transduction)을 이용하여 MG1655 대장균 균주에 옮김으로써 제조하였다.

CH1133 대장균 균주는 G1043 대장균 균주(미국 NIH의 Sue Garges로부터 획득)에 있는 crp::CAT 돌연변이 대립형질을 P1 박테리오파지를 이용한 보편형 형질도입법에 의하여 CH1105균주로 옮김으로써 제조하였다. 이 균주는 글리세롤과 소비톨을 동시에 발효시키는 능력을 상실하게 되는데 여기에 코스미드 라이브러리 플라스미드를 형질전환시켜 동시 발효능력을 다시 획득한 클론을 선택하였다.

CH1134 대장균 균주는 G1044 대장균 균주(미국 NIH의 Sue Garges로부터 획득)에 있는 cyaΔ854 돌연변이 대립형질을 P1 박테리오파지를 이용한 보편형 형질도입법에 의하여 CH1105 균주로 옮기어 제조하였다. 이 균주 역시 글리세롤과 소비톨을 동시에 발효시키는 능력을 상실하게 되는데 여기에 코스미드 라이브러리 플라스미드를 형질전환시켜 동시 발효능력을 다시 획득한 클론을 선택하였다. 이상에 사용한 박테리오파지 보편형 형질도입은 밀러에 의하여 기술된 방법에 따랐다(Miller, J.H., A short course in bacterial genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992).

pCMM714 플라스미드는 CH1133의 글리세롤 및 소비톨 동시 발효능을 회복시킨 코스미드 클론으로부터 비브리오 패혈증균의 crp 유전자를 포함하는 1,721 bp HindIII-SalI DNA 조각을 pUC19 플라스미드에 클로닝하여 얻었다.

pCMM715 플라스미드는 pCMM714 플라스미드를 제한효소 PstI과 SphI으로 처리하여 crp의 프로모터 부위 20 bp와 구조 유전자 부위 492 bp를 절제한 후 다시 연결효소(ligase)를 처리하여 제조하였다.

[실시예 2] CRP 결손 돌연변이 균주 제조

pCMM715 플라스미드를 EcoRI과 EcoRV로 처리하여 CRP 유전자(crp) 프로모터 부위 20 bp와 구조 유전자 부위 493 bp가 절제된 약 1.2 kbp의 인서트 DNA 조각을 떼어 내어 자살 벡터(suicide vector)인 pKAS32(미국 Dartmouth Medical School의 Karen Skorupski로부터 획득)에 클로닝하여 pCMM716을 제조하였다.

재조합 자살 플라스미드 pCMM716를 CMM 2100에 접합(conjugation)방법을 사용하여 도입시켜 대립형질 상호교환(allelic exchange)을 유도함으로써(Reyart, J.M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R., Infect. Immun. 66:4011-4017, 1998), CRP 결손 돌연변이주인 CMM 710를 제조하였다.

V. vulnificus CMM710 균주 crp 유전자의 결실 돌연변이는 Pcrp1(5'-tacctactggcgatgatcgatg-3')과 Pcrp7(5'-cggaatctgagagggtttagt-3') 프라이머 짝을 이용한 중합효소연쇄 반응에 의하여 확인하였다. 이때, 프라이머 Pcrp-1과 Pcrp-7를 사용한 crp 상하부의 유전자 증폭은 초기변성 95℃ 4분 후, 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 확장 72℃ 60초, 25회 반복한 후 마지막 72℃에서 10분 반응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응을 하였다. 또한 결실 돌연변이 여부는 항 CRP 다클론성 항체를 이용한 Western blot analysis에 의해서도 확인하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. CRP 단백질의 분자량은 23 KDa으로 추정되었다(Lane A, 자연형 V. vulnificus MO6-24/O 균주; lane B, CRP 결손 돌연변이 균주 CMM710; lane C, CMM710에 pLAFR3 만을 도입시킨 CMM713 균주; lane D, CMM710에 pCMM712(pLAFR3::crp)를 도입시킨 CMM714 균주).

CRP 결손 돌연변이주 CMM 710에서 관찰되는 다양한 표현형 변화가 crp 유전자의 결실에 의한 것이라는 것을 증명하기 위한 complementation 실험에 사용할 균주 CMM 714를 제조하였다. CMM 714 균주는 비브리오 패혈증균의 crp 유전자를 포함하고 있는 6 kbp의 HindIII DNA 조각을 pLAFR3 벡터에 클로닝시켜 제조한 pCMM712 플라스미드를 CMM 710 균주에 접합에 의하여 도입시킴으로 얻었다. 이에 대한 대조균주로는 CMM 710 균주에 pLAFR3만을 도입시켜 만든 CMM 713 균주를 제조하여 사용하였다.

[실시예 3] 항 CRP 다클론성 항체 제조

crp 유전자의 open reading frame 부분을 Pcrpgst1 (5'-ggatccatggttctaggtaaacctc-3)와 Pcrpgst2 (5'-gaattccttaacgagtaccagtaccgtaaac) 프라이머 짝을 이용하여 증폭한 후 제한효소 BamHI과 EcoRI으로 잘라, GST 유합 발현 벡터인 pGEX-2T(Amersham Pharmacia Biotech Co.)에 클로닝하여 pCMM720 프라스미드를 제조하였다. 유전자 증폭은 초기변성 95℃ 4분 후, 변성 94℃ 30초, 어닐링 54℃ 30초, 확장 72℃ 60초, 25회 반복한 후 마지막 72℃에서 10분 반응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응을 하였다.

이 플라스미드를 DH5a 대장균에 일렉트로포레이션 시켜 넣어주고 5-bromo-indol-3-chloro-isopropyl-b-D-galactopyranoside(IPTG) 0.2 mM을 가하여 발현을 유도시켰다. 제조사(Amersham Pharmocia Biotech Co.)의 지침에 따라 글루타치온 비드 칼럼을 이용하여 GST-CRP 융합단백질을 분리 정제하였다. GST-CRP 융합단백질을 칼럼에서 용출시킨 후 동량의 완전 프로인드 아쥬반트(Sigma Co.)와 잘 섞은 후 2주 간격으로 2번 New Zealand White 토끼 피내로 주사하였다. 두 번째 면역 3주 후에 융합 단백질을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 시키고, 해당 단백질 밴드를 잘라내어 액체질소로 급냉시킨 후 분쇄하여 인산완충식염수로 부유시켜 피내에 주사하였다. 그 일주일 후 혈청내 항체 역가를 확인한 후 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청을 다클론성 항체로 사용하여 Western blot analysis를 시행하였다.

[실시예 4] 각 균주의 배양 및 보관

대장균 균주들은 Luria Bertani 배지(Difco Co.)에, 비브리오 패혈증균은 heart infusion 배지(Difco Co.)에 배양하였다. 사용한 균주들은 배양 후 글리세롤을 50%되게 첨가하여 -80℃ 초저온 냉동고에서 보관하였다.

[실시예 5] 아데닐레이트 사이클라아제 결손 돌연변이 균주 제조

CRP는 cAMP와 결합되었을 때 기능을 나타낸다고 알려져 있다(Kolb, A, Busby, S., Buc, H., Garges, S., and Adhya, S., Ann. Rev. Biochem. 62:749-795, 1993). cAMP 합성효소 유전자 cya를 crp와 동일한 방법에 의하여 클로닝하였고, 결손 돌연변이 균주를 제조하였다. 결손 돌연변이 균주를 제조하기 위하여 cya 유전자의 상부와 하부를 두 쌍의 프라이머(Pcya-1, ggcctttgccacccac; Pcya-2, aagcttgggctatccttggtttc 및 Pcya-3, aagcttttacctagccgcttaatg; Pcya-4, gtacaaagcgcccgattgac)를 사용하여 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭하였다. 프라이머 Pcya-1과 Pcya-2를 사용한 cya 유전자 상부의 증폭과 Pcya-3과 Pcya-4를 사용한 cya 하부의 증폭은 초기변성 95℃ 4분 후, 변성 94℃ 30초, 어닐링 60℃ 30초, 확장 72℃ 60초, 25회 반복한 후 마지막 72℃에서 10분 반응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응을 하였다. 증폭된 두개의 DNA 조각을 서로 연결하기 위해서 프라이머 Pcya-1과 Pcya-2 에 의해 증폭된 DNA 조각을 PCR 2.1-TOPO cloning vecter(Invitrogen)에 클로닝하였다. 이 재조합 DNA를 HindIII(aagctt, primer에서 밑줄로 표시됨)로 자른 다음 이것을 벡터로 사용하여, 프라이머 PcyaU-3과 Pcya-4에 의해 증폭된 DNA 조각을 같은 PCR 2.1-TOPO 클로닝 벡터(Invitrogen)에 클로닝하여 이 재조합 DNA에서 제한효소 HindIII 로 자른 cya 하부 유전자 조각을 클로닝하였다. cya의 상하부가 같은 방향으로 클로닝된 재조합 TOPO 벡터에서 XbaI 과 SacI 제한효소를 사용하여 cya 상하부를 포함한 유전자 조각을 잘라낸 후 같은 제한효소로 자른 pDM4 플라스미드(Debra Milton, Department of Molecular Biology, Umea University, Sweden)에 클로닝하였다. 증폭된 두개의 DNA 조각을 서로 연결한 후 pDM4 플라스미드(Debra Milton, Department of Molecular Biology, Umea University, Sweden)에 클로닝하였다. 이렇게 제조된 재조합 플라스미드를 E. coli SM 10 λ pir에 일렉트로포레이션시켜 생성된 형질전환 균주를 V. vulnificus와 접합시켜 재조합 플라스미드가 전달되도록 하였다. V. vulnificus 안에서는 증식하지 못하는 pDM4의 cya 결실 DNA 조각과 염색체의 자연형 DNA 조각 사이에 대립형질 상호교환(allelic exchange)에 의하여 결실이 유발된 돌연변이 V. vulnificus 균주는 Pcya-1과 Pcya-4 프라이머 짝을 이용한 중합효소연쇄 반응에 의하여 확인하였다. 이렇게 제조된 아데닐레이트 사이클라아제 결손 돌연변이 균주의 독력 관련 표현형을 검사하였던 바 CRP 결손 돌연변이 균주와 거의 일치하는 표현형을 나타내었다.

[시험예 1] CRP 결손 돌연변이에 의한 외독소 생산 검사

V. vulnificus가 생산하는 대표적인 외독소인 용혈독소와 금속단백분해효소(Strom, M. S., and Paranjpye, R. N., Microbes Infect. 2:177-188, 2000)의 생산에 미치는 CRP 결손 돌연변이의 영향을 검사하였다. Shinoda 등의 방법(Shinoda, S., Miyoshi, S., Yamanaka, H., and Miyoshi, N.N., Microbiol. Immunol. 29:583-590, 1985)으로 측정한 용혈독소의 활성과, Kreger와 Lockwood의 방법(Kreger, A., and Lockwood, D., Infect. Immun. 33:583-590, 1981)으로 측정한 금속단백분해효소의 활성은 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.

도 2a는 CRP 결손 돌연변이가 V. vulnificus의 용혈독소의 생산에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서, CRP 결손 돌연변이 균주 CMM710에서는 의하여 용혈독소가 전혀 생산되지 않았음을 보여준다. 도 2b는 CRP 결손 돌연변이가 V. vulnificus의 금속단백분해효소의 생산에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서, CRP 결손 돌연변이 균주에서 금속단백분해효소의 생산이 훨씬 늦게 시작되었으며, 그 양도 유의하게 감소되어 있는 것을 보여준다.

이상과 같은 CRP 결손 돌연변이 균주의 외독소 생산에 있어서의 이상은 플라스미드에 자연형 crp 유전자를 클로닝하여 돌연변이 균주에 도입시켜주면 정상화되는 것으로 보아 CRP 결손 돌연변이에 의하여 외독소 생산 감소가 초래되었음을 확실히 증명할 수 있었다.

[시험예 2] CRP 결손 돌연변이에 의한 상피세포에 대한 부착능 검사

HeLa 세포를 1x10⁵ cells/ml되게 4-well LabTec chamber slide(Nunc Co.)에 10% 우태혈청을 가한 DMEM 배지에서 하룻저녁 배양하였다. 그 후, 우태혈청을 첨가하지 않은 DMEM 배지로 2차례 세척하고, 지수증식기에 있는 V. vulnificus를 HeLa 세포에 우태혈청이 없는 DMEM 배지에서 250:1이 되게 접종하여 30분 동안 작용시킨 후 Hank's Balanced Salt solution으로 3회 세척하여 부착하지 않고 남아 있는 세균들을 제거시켰다. 남아 있는 세균과 HeLa 세포를 Giemsa 염색액(Merck사 제품, Darmstadt, Germany)으로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. 최소 100개의 HeLa 세포를 관찰하여 부착한 세균의 수를 세었다. 부착능은 HeLa 세포당 부착 세균수로 나타내었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 CRP 결손 돌연변이가 V. vulnificus의 상피세포 부착능에 미치는 영향을 보여준다. CRP 결손 돌연변이 균주에서 부착능이 약 10배 감소되었음이 관찰되었다.

돌연변이 균주의 부착능 결함은 자연형 crp 유전자를 함유하고 있는 플라스미드를 도입시켜 주면 정상으로 회복되었다. *** 심볼은 Students' t test 상 통계학적 유의성 P < 0.001을 나타낸다.

[시험예 3] CRP 결손 돌연변이에 의한 세포독성 검사

HeLa 세포주에 대한 세포독성을 검사하였다. 부착능 실험과 같은 조건에서 세균대 세포의 비율을 100으로 하여 90분 동안 배양한 후에 상청액에 유리된 lactate dehydrogenase(LDH)의 양을 CytoTox™ Non-Radioactive Cytotoxicity assay kit(Promega Co.)로 측정하여 세포독성을 비교한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4는 CRP 결손 돌연변이가 V. vulnificus의 세포독성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 세균대 세포의 비를 100으로 하여 90분 동안 배양한 후 유리된 LDH의 양을 세포독성의 지표로 삼아 비교해 본 바 CRP 결손 돌연변이 균주에서 세포독성이 1/8 이하로 유의하게 감소되었음이 관찰되었다. 돌연변이 균주의 세포독성 결함은 자연형 crp 유전자를 함유하고 있는 플라스미드를 도입시켜 주면 정상으로 회복되었다. *** 심볼은 Students' t test 상 통계학적 유의성 P < 0.001을 나타낸다.

[시험예 4] CRP 결손 돌연변이에 의한 집락형태의 변화

고병원성 V. vulnificus 균주들은 협막을 가지고 있으며, 불투명 집락형태를 나타내며, 협막의 생산이 감소되면 독력이 감소되며 투명한 집락형태를 나타낸다고 알려져 있다(Wright, A. C., Simpson, L. M., Zane, S. F., and Oliver, J. D., Infect. Immun. 58:2706-2709, 1987). Heart infusion 한천배지에 도말배양하여 집락형태를 관찰하여 CRP가 협막 생산에 관여하는지 관찰한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5는 CRP 결손 돌연변이가 V. vulnificus의 집락형태에 미치는 영향을 보여준다. CRP 결손 돌연변이에 의하여 불투명형 집락형태가 투명형으로 변하여 협막의 생산이 유의하게 감소되었음을 알 수 있었다. 돌연변이 균주의 투명형 집락형태는 자연형 crp 유전자를 함유하고 있는 플라스미드를 도입시켜 주면 다시 자연형과 같은 불투명형으로 회복되었다(A, 자연형; B, CRP 결손 돌연변이 균주; C, CRP 결손 돌연변이 균주에 pLAFR3 플라스미드만 도입시켜준 경우; D, CRP 결손 돌연변이 균주에 자연형 crp 유전자를 클로닝한 플라스미드(pLAFR3::crp)를 도입시켜준 경우).

[시험예 5] CRP 결손 돌연변이에 의한 운동성 검사

세균의 운동성과 병원성은 밀접한 관계가 있다고 알려져 있다(Richardson, K., Infect. Immun. 59:2727-2736, 1991). 운동성을 검사하기 위해서는 0.3% 한천 함유 반고형 heart infusion 한천배지에 멸균된 이쑤시개를 이용하여 균을 접종하고 약 6시간 동안 37℃에서 배양한 후 균이 움직인 면적을 비교한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6은 CRP 결손 돌연변이가 V. vulnificus의 운동성에 미치는 영향을 보여준다. 운동성은 0.3% 한천 함유 반고형 heart infusion 배지에서 검사하였다. CRP 결손 돌연변이에 의하여 운동성이 유의하게 감소되었음을 알 수 있었다. 돌연변이 균주의 운동성 결함은 자연형 crp 유전자를 함유하고 있는 플라스미드를 도입시켜 주면 다시 자연형과 같은 수준으로 회복되었다(A, 자연형; B, CRP 결손 돌연변이 균주; C, CRP 결손 돌연변이 균주에 pLAFR3 플라스미드만 도입시켜준 경우; D, CRP 결손 돌연변이 균주에 자연형 crp 유전자를 클로닝한 플라스미드(pLAFR3::crp)를 도입시켜준 경우).

[시험예 6] CRP 결손 돌연변이에 의한 마우스 치사력 검사

SPF(specific pathogen free) 8주령과 생후 7일 수유 CD-1 마우스에 각각 복강내와 위장내로 10배 순차 희석한 CRP 결실 돌연변이 균주와 자연형 균주를 각각 주사하고 치사여부를 48시간동안 관찰하였다. 그 결과 CRP 결실 돌연변이 균주의 복강내 LD₅₀는 8.9x10⁷ 마리로서 자연형 균주의 LD₅₀ 7.0x10⁵ 마리 보다 치사력이 127배 감소한 것으로 나타났다. 위장내 LD₅₀는 7.9x10⁹ 마리로서 자연형 균주의 2.0x10 ⁷ 보다 치사력이 395배 감소한 것으로 나타났다(표 2).

[표 2]

CRP 결손돌연변이가 V. vulnificus의 마우스에 대한 LD₅₀에 미치는 영향

균주	유전형	위장내 투여 LD50 (증가 배수)	복강내 투여 LD50 (증가 배수)
MO6-24/O	V. vulnificus 자연형, 임상분리균주	2.0 X 107	7.0 X 105
CMM710	crp 유전자에 결손 돌연변이가 있는 MO6-24/O	7.9 X 109 (395)	8.9 X 107 (127)

[시험예 7] CRP 결손 돌연변이 균주의 백신으로서의 효능 검사

6주령 BALB/c 마우스를 두 그룹으로 나누어 대조군은 인산완충식염수로 실험군은 인산완충식염수로 부유한 5x10⁶ 마리의 CRP 결손 돌연변이 균주를 2주 간격으로 2회 비강내 예방접종을 실시하였다. 비강내 예방접종을 위해서는 2% 케타민(ketamine)과 0.2% xylazine을 0.1㎖ 복강내 주사하여 마취시킨 후 균부유액이나 인산완충식염수를 마우스당 20㎕씩 비강 내에 점적하였다. 두 번째 예방접종이 끝난 1주일 후에 V. vulnificus에 대한 감수성을 높이기 위하여 마우스당 600㎎씩의 구연산철 암모늄(ferric ammonium citrate; Sigma Co.) 복강내 주사하고, 그 후 30분에 마우스당 자연형 균주 1.0x10¹⁰ 마리씩을 위장내로 투여하고, 72시간 동안 관찰한 결과를 표 3에 나타내었다. 표 3을 살펴보면 대조군 마우스 5마리는 24시간 이내에 완전히 사망하였으나, CRP 결손 돌연변이 균주로 비강내 예방접종한 마우스 6마리는 모두 생존하였으며, 거의 정상 마우스와 다름없는 외형을 나타내었다.

[표 3]

CRP 결손 돌연변이 균주의 마우스 비강내 예방접종에 의한 위장내 V. vulnificus 감염에 대한 방어효과

비강내 예방접종 물질	Challenge dose	마우스생존수/ 감염수
인산완충식염수 (음성대조)	1.0 X 1010	0/5
CMM710 (crp-돌연변이 균주) 5x106/마우스	1.0 X 1010	6/6

패혈증 비브리오균 V. vulnificus의 cAMP 수용체 단백질은 범독력인자 발현 조절인자로서 용혈독소와 금속단백분해효소 등의 외독소 생산, 상피세포에의 부착능, 세포독성, 협막 생산, 운동성, 및 마우스 치사력 등을 조절하는 것으로 나타났다. crp 유전자 결손 돌연변이 균주를 약독화 생균백신으로 비강내 투여한 결과 치사량의 V. vulnificus 위장내 감염으로부터 숙주를 완벽히 보호하였다. CRP 및 아데닐레이트 사이클라아제 유전자는 효과적 백신개발은 물론 새로운 치료제 검색에 있어 중요한 표적이 될 것이다. CRP 및 아데닐레이트 사이클라아제 결손 돌연변이 균주는 유전자 면역(genetic immunization)을 위한 DNA를 운반하거나, 사람을 포함한 여러 동물의 체내에서 이종의 유전자나 단백질을 발현시켜 면역반응을 유발하는 약독화 항원 운반 숙주로도 사용할 수 있다.

도 1은 CRP 결손 돌연변이의 Western blot analysis 결과를 보여준다.

도 2a는 V. vulnificus의 CRP 결손 돌연변이 균주가 hemolysin의 생산에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.

도 2b는 V. vulnificus의 CRP 결손 돌연변이 균주가 protease의 생산에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.

도 3은 V. vulnificus의 CRP 결손 돌연변이가 상피세포 부착능에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.

도 4는 V. vulnificus의 CRP 결손 돌연변이가 세포독성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.

도 5는 V. vulnificus의 CRP 결손 돌연변이가 집락형태에 미치는 영향을 보여준다.

도 6은 V. vulnificus의 CRP 결손 돌연변이가 운동성에 미치는 영향을 보여준다.

<110> CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> cAMP receptor protein and adenylate cyclase of Vibrio vulnificus, global virulence regulators regulating virulence expression <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 633 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 1 atggttctag gtaaacctca aaccgatcca acactagagt ggtttctttc acactgtcat 60 attcataagt acccatcaaa aagcacgctc attcatgcgg gcgaaaaagc agaaacgctt 120 tactacatcg taaaaggttc tgtggcggta ctaattaagg atgaagaagg taaagaaatg 180 atcctttctt acctaaatca aggtgacttt attggtgaac taggcctgtt cgaagaaggt 240 caagagcgta ccgcatgggt tcgtgcaaaa tcaccttgtg aagtcgcaga aatctcattc 300 aagaaattcc gtcagctcat tcaggtcaac cctgacatcc tgatgcgtct atctgctcag 360 atggcaagcc gtctgcaagt aaccagccaa aaagtgggtg acttagcatt cctagacgta 420 actggtcgta tcgctcagac gctattgaat ctggctaaac aaccagatgc gatgacgcac 480 ccagatggca tgcagatcaa gatcactcgt caagaaatcg gtcaaatcgt tggctgttct 540 cgtgagacag taggtcgtat cttgaagatg ctcgaagagc agaacctgat ttctgcacac 600 ggcaagacta tcgttgttta cggtactcgt taa 633 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Leu Asp Ala Leu Met Gln Ser Tyr Arg Asn Leu Ile Gln Phe 385 390 395 400 Ala Arg Arg Asn Asp Ile Thr Ser Ala Ile Ser Pro Gln Asp Ile Ser 405 410 415 Ile Leu Ala Arg Lys Leu Tyr Ala Ala Phe Glu Val Leu Pro Gly Lys 420 425 430 Val Thr Leu Leu Asn Pro Gln Ile Ser Pro Asp Leu His Glu Pro Asp 435 440 445 Leu Ser Phe Ile Glu Val Arg Glu Gly Arg Ile Asn Lys Ser Gly Trp 450 455 460 Tyr Leu Tyr Lys Gln Pro Leu Ile Ala His Arg Ile Leu Gly Gln Pro 465 470 475 480 Tyr Leu Glu His His Glu Tyr Leu Ser Lys Leu Val Ala Trp Ala Phe 485 490 495 Phe Asn Gly Leu Ile Thr Glu Ser Thr Arg Leu His Ala Val Val Arg 500 505 510 Glu Ala Gln Leu Asp Ile Asp Lys Phe Tyr Gln Met Val Ser Asp Leu 515 520 525 Arg Asn Thr Phe Ser Leu Arg Lys Arg Arg Pro Thr Met Gln Ala Leu 530 535 540 Ala Ser Pro Cys Glu Ile Ser Gln Leu Ala Met Phe Ile Asn Phe Glu 545 550 555 560 Asn Asp Pro Thr Ala Glu Leu Ser Gly Arg Ser Leu Lys Val Asp Leu 565 570 575 Lys Asn Ala Asp Ile Phe Ser Phe Gly Thr Glu Gln Lys Cys Leu Ile 580 585 590 Gly Ser Val Asp Leu Val Tyr Arg Asn Ser Trp His Glu Val Arg Thr 595 600 605 Leu His Phe Arg Gly Glu Thr Ala Met Leu Asp Ala Leu Lys Thr Val 610 615 620 Leu Gly Lys Met His Gln Asp Ala Ile Pro Pro Glu Ser Val Asp Val 625 630 635 640 Phe Cys Tyr Ser Lys Asn Leu Arg Gly Val Met Arg Asn Met Val Tyr 645 650 655 Gln Leu Leu Ala Glu Cys Ile Asp Leu Arg Leu Lys Pro Val Glu Gln 660 665 670 Glu Lys Arg Arg Arg Phe Lys Ala Ile Arg Leu Ala Ala Gln Thr Phe 675 680 685 Gly Leu Phe Phe Glu Arg Arg Gly Val Ser Val Gln Lys Leu Glu Asn 690 695 700 Ser Val Asp Phe Tyr Arg Ser Ile Ser Thr Asn Lys Leu Lys Gly Ser 705 710 715 720 Pro Leu Leu Met Leu Asp Arg Glu Asp Asp Tyr His Leu Pro Pro Val 725 730 735 Val Asp Gly Phe Ala Ser Glu Gly Leu Ile Gln Phe Phe Phe Glu Asp 740 745 750 Thr Glu Lys Gly Phe Asn Ile Tyr Val Leu Asp Glu Ala Asn Gln Val 755 760 765 Glu Val Tyr His Gln Phe Ser Gly Ser Lys Asp Glu Met Ile Ala Ser 770 775 780 Val Asn Ser Phe Tyr Thr Ala Val Lys Asp Asp Lys His Val Ala Ser 785 790 795 800 Lys Cys Ile Asn Phe Asn Leu Pro Gln Tyr Tyr Gln Ile Ile His Pro 805 810 815 Gln Glu Glu Gly Gln Glu Ser Tyr Ile Ile Pro Tyr Arg Asn Asp Ala 820 825 830 Cys Thr Gln Thr Lys Met Ser Lys Ala Val Asn Val 835 840

Claims (3)

1. 삭제
2. 삭제
3. DNA 서열 1 또는 아미노산 서열 2로 표시되고 cAMP 수용체 단백질(cAMP receptor protein; CRP)을 인코딩하는 crp 유전자; 및 DNA 서열 3 또는 아미노산 서열 4로 표시되고 cAMP를 생합성하는 아데닐레이트 사이클라아제를 인코딩하는 cya 유전자로 이루어진 군에서 1종 이상을 결실시켜 제조한 돌연변이 균주를 함유하는 항비브리오 패혈증 백신.