KR20190084097A

KR20190084097A - 세균의 폴레이트 수송의 약화에 의한 세균 병독성의 약독화

Info

Publication number: KR20190084097A
Application number: KR1020197016646A
Authority: KR
Inventors: 알라이나 인게브릿슨; 악셀 노이바우어; 힐다 엘리자베스 스미스; 그리프 아스트리드 드
Original assignee: 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하
Priority date: 2016-11-11
Filing date: 2017-11-10
Publication date: 2019-07-15
Also published as: US11684663B2; DK3538143T3; CN110582296A; MY201256A; WO2018089841A9; CA3043039A1; RS63524B1; PT3538143T; US20220226456A1; WO2018089841A1; MX2019005499A; JP2022036982A; CL2019001275A1; EA201991126A1; US11992522B2; EP4159231A1; ES2926543T3; CN110582296B; JP2019533710A; EP3538143B1

Abstract

본 발명은 세균성 감염, 이러한 감염에 대한 백신 및 세균성 백신에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 돼지에서 스트렙토코쿠스 감염에 대한 백신에 관한 것이다. 폴레이트 수송 능력이 감소된 세균의 ΔFolT 돌연변이체로서, 상기 능력이 폴레이트 수송체 (FolT) 기능을 기능적으로 제거시킴으로써 감소된, 세균의 ΔFolT 돌연변이체가 제공된다. 상기 세균의 폴레이트 수송 능력을 감소시키는 것을 포함하는, 세균의 병독성을 감소시키는 방법이 또한 제공된다.

Description

세균의 폴레이트 수송의 약화에 의한 세균 병독성의 약독화

본 출원은 세균성 균주, 세균성 감염에 대한 약물 및 세균성 백신에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 출원은 돼지에서 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 감염에 대한 백신에 관한 것이다.

식물, 진균, 특정 원생 생물 및 대부분의 세균은 GTP와 코리스메이트에서부터 출발하여 폴레이트 (folate) (비타민 B9)을 새로 만들지만, 고등 동물은 합성 경로의 주요 효소가 부족하여 식이성 폴레이트를 필요로 한다. 폴레이트는 건강에 중요하며, 항폴레이트 약물은 암 화학 요법에서 및 항균제로서 널리 사용된다. 이러한 이유로, 폴레이트 합성 및 회수 경로 (salvage pathway)는 모델 생물체에서 광범위하게 특성화되었으며, 세균과 식물 둘 다의 폴레이트 합성 경로는 식품의 폴레이트 함량을 높이기 위해 조작되었다. 테트라하이드로폴레이트는 다수의 생합성 효소에 필수적인 보조인자이다. 이것은 메티오닌, 퓨린, 글리신, 판토테네이트 및 티미딜레이트와 같은 중요한 대사산물의 합성에서 1 탄소 단위의 운반체로서 작용한다. 예를 들어, panB 유전자에 의해 암호화된 케토판토테이트 하이드록시메틸 트랜스퍼라아제 효소는, 판토테네이트의 전구체를 합성하기 위해 테트라하이드로폴레이트 보조인자를 필요로 한다. 테트라하이드로폴레이트가 세균에서 새롭게 합성되기 때문에, 이의 합성의 억제는 세포를 사멸시킨다. 실제로, 2종의 매우 효과적인 항생제인 설폰아미드 및 트리메토프림은, 테트라하이드로폴레이트 생산을 차단함으로써 세균 세포를 사멸시킨다. 종종 서로 조합하여 사용되는 이들 2종의 항생제는, 요로 감염, 세균성 이질과 같은 장 감염, 및 기도 감염의 치료를 위해 일반적으로 처방된다. 이들 약물의 성공은 테트라하이드로폴레이트 합성 억제제에 대한 많은 병원성 세균의 취약성을 나타낸다. 세균은 테트라하이드로폴레이트 보조인자의 합성을 위한 다단계 경로를 갖고 있다. 경로의 한 지점에서, 대사산물 코리스메이트 및 글루타민은, 4-아미노-4-데옥시코리스메이트를 생성하는, 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis) 유전자 pabA 및 pabB에 의해 암호화된 아미노데옥시코리스메이트 신타아제에 대한 기질이다. 바실러스 서브틸리스 pabC에 의해 암호화된 아미노데옥시코리스메이트 리아제는, 4-아미노-4-데옥시코리스메이트를, 중요한 전구체인 파라-아미노벤조산 (PABA)으로 전환시킨다. 다른 지점에서, 바실러스 서브틸리스 mtrA, folA 및 folK에 의해 암호화된 것들을 비롯한 다수의 효소는, 전구체 2-아미노-4-하이드록시-6-하이드록시메틸-7,8-디하이드로프테리딘 디포스페이트를 생성한다. 당해 전구체 및 PABA는, 디하이드로프테로에이트를 생산하는, 바실러스 서브틸리스 sul 유전자 (이. 콜라이 (E. coli) dhps 및 folP 유전자와 상동)에 의해 암호화된 디하이드로프테로에이트 신세타아제에 대한 기질이다. 설파메톡사졸과 같은 설폰아미드는 디하이드로프테로에이트 신타아제의 경쟁적 억제제이다. 디하이드로프테로에이트는 디하이드로폴레이트를 생산하기 위해 바실러스 서브틸리스 folC에 의해 암호화된 이작용성 효소에 의해 변형된다. 마지막으로, 바실러스 서브틸리스 dfrA에 의해 암호화된 DHFR (디하이드로폴레이트 리덕타아제)은, 이 디하이트로폴레이트를 변형시켜 최종 생성물 테트라하이드로폴레이트를 생성한다. 트리메토프림은 세균 DHFR의 경쟁적 억제제이다. 이러한 선택성은 중요한데, 이는 진핵 생물 DHFR이 항생제에 의해 방해받지 않기 때문이다. 폴레이트는 아마도 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 (M. hyopneumoniae)를 제외한 모든 서열분석된 세균에 가장 필수적이다. 그러나, 모든 세균은 폴레이트를 새롭게 합성하는 대신에 외부 공급에 의존한다. 새로운 합성 경로의 부재를 예측하기 위해, HPPK (FolK) 및 DHPS (FolP) 단백질이 시그니처 단백질 (signature protein)로서 사용된다. 많은 세균은 이들 두 유전자의 동족체가 결여되어 있으며, 그래서 환경으로부터 수득한 온전한 폴레이트를 줄이고 글루타밀화하는데 거의 확실히 의존한다. 이들은 주로 마이코플라스마 또는 트레포네마 (Treponema)와 같은 숙주-관련 세균 또는 락토바실리 (Lactobacilli)와 같은 폴레이트-풍부 환경에 사는 유기체이다.

가축 및 사람에서 감염을 유발하는 다양한 변종이 있는 스트렙토코쿠스 종은 종종 란스필드 (Lancefield)의 그룹에 따라 분류된다. 란스필드에 따른 분류는 특히 세균의 캡슐에 존재하는 혈청학적 결정인자 또는 항원을 기초로 하여 이루어지며 대략적인 결정만을 허용하는데, 상이한 그룹의 세균은 서로 교차 반응성을 보이는 반면, 기타 스트렙토코쿠스는 그룹 결정인자를 전혀 할당받을 수 없다. 그룹 내에서, 추가의 구분이 종종 혈청형 분석에 기초하여 가능하다: 이들 혈청형은 스트렙토코쿠스의 큰 항원 가변성에 추가로 기여하며, 이것은 스트렙토코쿠스 감염의 진단 및 이에 대한 백신접종에서 다수의 어려움을 초래하는 사실이다. 란스필드 그룹 A의 스트렙토코쿠스 (Group A Streptococcus: GAS, 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes))는 이린이들에게 흔하며, 비인두 감염 및 이의 합병증을 일으킨다. 그룹 B의 스트렙토코쿠스 (Group B Streptococcus: GBS)는 사람 신생아들 중에서 세균성 패혈증 및 수막염의 주요 원인이 되며, 개발 도상국에서 중요한 신생아 병원체로 부상하고 있다. 란스필드 그룹 B의 스트렙토코쿠스 (GBS)는 또한 소와 관련되어 있는 것으로 밝혀졌으며, 유방염을 일으킨다. 스트렙토코쿠스 에퀴 (S. equi), 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 (S. zooepidemicus), 스트렙토코쿠스 다이스칼락티아에 (S. dysgalactiae) 및 기타와 같은 란스필드 그룹 C 감염은, 주로 말, 소 및 돼지에서 발견된다. 란스필드 그룹 D (스트렙토코쿠스 보비스 (S. bovis)) 감염은 모든 포유류 및 일부 조류에게 발견되며, 종종 심내막염 또는 패혈증을 유발한다. 란스필드 그룹 E, G, L, P, U 및 V (스트렙토코쿠스 포시누스 (S. porcinus), 스트렙토코쿠스 카니스 (S, canis), 스트렙토코쿠스 다이스칼락티아에)는 다양한 숙주에서 발견되며, 신생아 감염, 비인두 감염 또는 유방염을 일으킨다. 란스필드 그룹 R, S 및 T (및 미분류된 유형)에서, 스트렙토코쿠스 수이스가 발견되며, 어린 돼지에서 수막염, 패혈증, 관절염 및 급사의 주요 원인이다. 부수적으로, 이것은 사람에서 수막염을 일으킬 수 있다. 미분류된 스트렙토코쿠스 종에는, 예를 들어, 사람에게 충치를 일으키는 스트렙토코쿠스 무탄스 (S. mutans), 소에서 유방염을 일으키는 스트렙토코쿠스 우베리스 (S. uberis), 폐렴, 균혈증 및 수막염과 같은 침습성 질환을 일으키는 스트렙토코쿠스 뉴모니아 (S. pneumonia)가 있다.

스트렙토코쿠스 수이스는 돼지 산업에서 돼지 개체군 중에 보편적으로 존재하는 인수공통 병원체이다. 33종의 피막 혈청형이 현재까지 기술되었으며^[1], 혈청형 1, 2, 7, 9 및 14는 유럽에서 질병 돼지로부터 자주 단리된다^[2]. 균주 병독성은 혈청형들 사이에서 뿐만 아니라 혈청형 내에서도 상이하다: 혈청형 2에서, 병독성 마커, 뮤라미다아제 방출 단백질 (muramidase release protein: MRP) 및 세포외 인자 (extracellular factor: EF)^[3] 및 수이리신^[4,5]의 발현에 기초하여 구별될 수 있는 병독성, 무병독성 및 약병독성 분리주가 단리되었다. 성인 돼지에서는 스트렙토코쿠스 수이스의 비인두 보균이 무증상인 반면, 어린 새끼 돼지에서는 이것이 침습성 질병에 대한 감수성을 증가시켜 수막염, 관절염 및 장막염을 일으켜 사망률을 높인다. 서방 국가에서, 직업적으로 돼지 또는 익히지 않은 돼지고기에 노출된 사람도 또한 스트렙토코쿠스 수이스에 감염될 수 있지만, 발병률은 매우 낮다. 사람의 침습성 스트렙토코쿠스 수이스 감염은 돼지에서와 유사한 임상 징후를 나타내며, 환자들은 종종 회복 후에 남아 있는 난청으로 고통을 겪는다^[6]. 동남 아시아에서, 스트렙토코쿠스 수이스, 특히 혈청형 2는 사람에 대한 신생 병원체로 간주되어 세균성 수막염의 주요 원인으로 인식되고 있다^[7~10]. 동남 아시아에서, 스트렙토코쿠스 수이스에 의한 사람 감염의 임상 징후는 독성 쇼크-유사 증후군, 패혈증 및 수막염을 앓고 있는 환자들이 있는 세계의 기타 지역과 비교하여 더 심각한 것으로 보고된다. 스트렙토코쿠스 수이스에 기인하는 질병의 발병 기전에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 세포외 및 세포막 관련 단백질과 같은 다양한 세균 구성성분은 발병 기전에 중요한 역할을 한다. 더욱이, 피막은 이들 미생물로 하여금 식세포 작용에 저항할 수 있도록 함으로써 중요한 병독성 인자인 것으로 밝혀졌다. 돼지에서의 스트렙토코쿠스 수이스 감염을 예방하기 위한 현재 전략으로는 자가 백신에 의한 백신접종 전략과 결합된 질병 돼지의 항생제 치료가 포함된다^[11]. 혈청형 2에 대한 박테린 백신에 의한 자가 백신접종이 농장에서 임상 발생을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났지만, 자가 백신접종이 효율적으로 보호되지 않는 혈청형 9에 대해서는 그렇지 않다^[12,13]. 박테린 백신은, 혈청형 9 감염에 덜 효과적이라는 사실 이외에도, 백신에 존재하는 혈청형에 대해서만 보호할 수 있다. 그러나, 이전에 언급한 바와 같이, 여러 혈청형이 질병을 일으킬 수 있으므로, 자가 백신접종은 임상 발생에 대한 일시적인 해결책이다. 스트렙토코쿠스 수이스 감염에 대한 장기적인 해결책으로, 모든 (병원성) 혈청형에 대해 광범위하게 보호하는 백신이 필요하다. 적합한 백신 후보 물질을 찾기 위해 많은 연구가 이루어졌지만, 아직 교차 보호 백신은 이용가능하지 않다.

일반적으로 폴레이트 수송 및 폴레이트 합성을 할 수 있는 모 균주를 선택하고, 상기 세균의 폴레이트 기질 결합 단백질 (스트렙토코쿠스 수이스에서 folT 유전자로서 알려짐)을 암호화하는 DNA 영역에서 돌연변이, 결실 또는 삽입과 같은 변형을 갖기 위해 상기 모 균주로부터 세균을 선택하고, 시험관내에서 상기 모 균주와 유사한 속도로 성장하지만 생체내에서 상기 모 균주와 비교하여 감소된 속도로 성장하는 능력을 위해 상기 세균을 선택하는 것을 포함하는, 바람직하게는 백신에서 사용하기 위한, 바람직하게는 세균성 감염에 대한 보호를 발생시키기 위한 백신에서 사용하기 위한 세균을 생성하는 방법이 제공된다. 일반적으로 폴레이트 수송 및 폴레이트 합성을 할 수 있는 모 균주를 선택하고, 상기 세균의 폴레이트 기질 결합 단백질 (스트렙토코쿠스 수이스에서folT 유전자로서 공지됨)을 암호화하는 DNA 영역에서 돌연변이, 결실 또는 삽입과 같은 변형을 상기 세균에 제공함으로써 상기 모 균주로부터의 세균을 바람직하게는 재조합 수단에 의해 형질전환시키고, 시험관내에서 상기 모 균주와 유사한 속도로 성장하지만 생체내에서 상기 모 균주와 비교하여 감소된 속도로 성장하는 능력을 위해 상기 세균을 선택하는 것을 포함하는, 바람직하게는 백신, 바람직하게는 세균성 감염에 대한 보호를 발생시키기 위해 사용하기 위한 백신에서 사용하기 위한 세균을 생성하는 방법이 또한 제공된다. 본 출원의 선택하거나 형질전환시키는 방법으로 수득가능하거나 수득되는 세균 또는 세균 배양물이 또한 제공된다. 본 출원에서 제공되는 바와 같은 상기 세균은 퍼미큐티스, 바람직하게는 스트렙토코쿠스, 보다 바람직하게는 스트렙토코쿠스 수이스로서 분류가능한 것이 바람직하다. 시험관내에서 상기 모 균주와 유사한 속도로 성장하지만 생체내에서 상기 모 균주와 비교하여 감소된 속도로 성장할 수 있는 세균 또는 세균의 배양물을 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 백신의 생산을 위해 이러한 조성물을 사용하는 것이 또한 제공된다. 바람직하게는, 이러한 백신은 시험관내에서 상기 모 균주와 유사한 속도로 성장하지만 생체내에서 상기 모 균주와 비교하여 감소된 속도로 성장할 수 있는 세균 또는 세균의 배양물을 포함한다.

세균의 병독성을 감소시키는 (약독화시키는) 방법이 또한 제공되며, 상기 세균은 바람직하게는 상기 세균의 폴레이트 수송 능력을 감소시키는 것을 포함한다. 세균, 본 출원에서 일반적으로 호칭되는 ΔFolT 돌연변이체, 특히 스트렙토코쿠스 수이스 균주가 본 출원에서 제공되며, 상기 능력은 폴레이트 수송체 (FolT) 기능을 기능적으로 제거시킴으로써 강력하게 감소되었다. 본 출원에서 제공되는 바와 같은 상기 세균은 이의 새로운 폴레이트 합성 경로를 적용함으로써 자기 자신의 사용을 위해 폴레이트를 생산할 수 있는 능력을 여전히 가지고 있다. 그러나, 놀랍게도, 이러한 합성 경로는 (배양에서) 시험관내 성장에 대한 능력에 영향을 주지 않은 채로 온전하게 남아 있기 때문에, 숙주에서 (생체내에서) 성장 및 병독성을 강하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 시험관내에서 잘 성장하지만 생체내에서 이의 모 균주보다 덜 성장하고 생체내에서 관련된 병독성이 강력하게 감소된 균주는, 백신 균주로서 매우 유용하다. 본 출원에 의해 제공되는 바와 같은 이러한 균주 또는 돌연변이체는, 한편으로는, 폴레이트 합성에서 본질적으로 영향을 받지 않으므로, 높은 역가로 성장할 수 있고, 이에 따라 상대적으로 용이하고 저렴하게 생산될 수 있으며, 다른 한편으로는, 이의 모 균주와 비교하여 이의 숙주에서 이의 감소된 성장 및 감소된 병독성으로 인해, 생체내 적용 후에 상대적으로 무해하며 세균 감염에 대한 백신으로서 매우 유용하다.

폴레이트 기질 결합 단백질 (스트렙토코쿠스 수이스에서folT 유전자로서 공지됨)을 암호화하는 DNA 영역에서 변형이 제공되며 배양 (시험관내)에서 이의 모 균주와 유사한 성장을 갖지만 이의 모 균주와는 대조적으로 생체내에서 감소된 성장을 갖는 프로토타입 ΔFolT 돌연변이에 균주는, 2015년 8월 19일에 부다페스트 조약의 규정에 따라 특허 절차의 목적으로 진균 배양 중앙 사무국 (Centraalbureau voor Schimmelcultures)에서 "CBS 140425 스트렙토코쿠스 수이스 ΔFolT 돌연변이체"로서 기탁되었다. 폴레이트 기질 결합 단백질 (스트렙토코쿠스 수이스에서folT 유전자로서 공지됨)을 암호화하는 DNA 영역에서 변형이 제공되며 배양 (시험관내)에서 이의 모 균주와 유사한 성장을 갖지만 이의 모 균주와는 대조적으로 생체내에서 감소된 성장을 갖는 또 다른 프로토타입 ΔFolT 돌연변이 균주는, 2017년 8월 25일에 웨스터디지크 진균 다양성 연구소 (Westerdijk Fungal Biodiversity Institute)에서 "CBS 143192 스트렙토코쿠스 수이스 ΔFolT2 돌연변이체"로서 기탁되었다.

세균의 새로운 폴레이트 합성 능력은, 예를 들어, 폴레이트가 제공된 배양 배지와 비교하여, 폴레이트 없는 배양 배지에서 세균의 성장을 시험함으로써 또는 문헌 [BMC Genomics 2007, 8:245]　(doi:10.1186/1471-2164-8-245, 본 출원에 참조로 포함됨)에서 검토된 기타 방법과 같은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 용이하게 시험될 수 있다. 대부분의 세균은 테트라하이드로폴레이트를 획득하기 위한 적어도 2개의 독립적인 경로를 가지고 있다: 하나는 고전적인 폴레이트 합성 경로를 따르며, 다른 하나는 폴레이트 수송체를 사용하여 폴레이트를 도입하는 신속한 방법을 따른다. 시험관내에서, 고전적인 합성 경로를 이용하여 이용가능한 충분한 영양분과 에너지가 존재한다는 것이 지금부터 본 출원에서 제공된다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들에 의해 밝혀진 효과에 대한 가능한 설명을 제공하자면, 영양분이 부족하여 에너지가 부족할 수 있는 생체내에서는 고전적인 경로에 따른 THF 생산에서 투자하는 것이 훨씬 더 어려울 수 있다. 이어서, 폴레이트를 도입하는 기타 방법이 분명히 선택된다. 진행중인 실험에 기초하여, 본 발명자들은 folT의 발현이 아마도 이의 높은 소수성으로 인해 세균에 부담이 되는 것으로 상정한다. 시험관내에서, folT의 증가된 발현은 성장 속도를 감소시킨다. 이것은 아마도 folT의 발현이 리보스위치의 존재에 의해 엄격히 조절되는 이유이다. 이것은 절대적인 필요성이 있을 때에만 발현되어야 한다. 결론적으로, 단백질 발현의 부담에 비해 영양분 이용가능성과 THF 요구 사이에는 균형이 있는 것으로 보인다. 본 발명자들은, 이러한 균형이 시험관내에서는 한쪽으로, 즉, 증가된 새로운 폴레이트 합성으로 기울어지고, 생체내에서는 다른 한쪽으로, 즉, 증가된 폴레이트 수송으로 기울어진다는 것을 본 출원에서 현재 밝혀냈다. 놀랍게도, 폴레이트 수송체 기능을 기능적으로 제거함으로써 생체내 경로에서 폴레이트 수송을 약화시키고 (감소시키고), 바람직하게는 생체내 경로에서 폴레이트 수송을 녹아웃 (knock out)시키면, 세균 병독성이 숙주에서 감소하지만 배양물에서 감소하지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 폴레이트 수송 능력이 감소된 세균의 ΔFolT 돌연변이체로서, 상기 능력이 폴레이트 수송체 (FolT) 기능을 기능적으로 제거시킴으로써 감소된, 세균의 ΔFolT 돌연변이체가 제공된다. 특히, 특히 상기 세균의 folT 유전자에서 또는 상기 유전자의 프로모터에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 제공함으로써 상기 세균의 폴레이트 기질 결합 단백질 (FolT)의 발현 및/또는 기능을 약화시키는 (감소시키는) 방법이 본 출원에서 제공된다. 이러한 돌연변이, 결실 또는 삽입은 당해 분야에 공지된 바와 같이 PCR 및/또는 서열 분석에 의해 검출될 수 있다. 본 출원의 특정 실시형태에서, folT 유전자를 녹아웃시키고, 스트렙토코쿠스 수이스와 같은 세균를 상당히 약독화시키고, 시험관내에서 여전히 용이하게 배양될 수 있는 백신 균주로서 생체내 사용에 적합하도록 만드는 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 병독성이 폴레이트 기질 결합 단백질 FolT의 막관통 영역을 암호화하는 상기 세균의 DNA에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 제공하고, 바람직하게는 FolT의 면역원성을 본질적으로 온전하게 남기고, 가장 바람직하게는 FolT의 친수성 단백질 도메인을 본질적으로 온전하게 남김으로써 약독화되는, 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 병독성이 기질 결합에 중요한 영역을 암호화하는 상기 세균의 DNA 영역을 암호화하는 FolT에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 제공함으로써 약독화되고, 스트렙토코쿠스 수이스에서의 상기 영역이 아미미노산 FYRKP (서열 번호 16)의 스트트레치를 갖는 펩타이드 도메인을 특징으로 하는, 방법이 제공된다. 폴레이트 결합을 제거하기 위해서는 적어도 FYRKP (서열 번호 16) 스트레치에서 아르기닌 (R)을 돌연변이시키는 것이 바람직하다. 본 출원의 바람직한 방법에서, 상기 세균은 퍼미큐티스, 바람직하게는 스트렙토코쿠스, 보다 바람직하게는 스트렙토코쿠스 수이스로서 분류가능한 것이 바람직하다. 본 출원의 ΔFolT 돌연변이체는 폴레이트 합성 능력을 갖는 것이 바람직하며; 그러나, 이러한 합성 경로는 (배양에서) 시험관내 성장에 대한 능력에 영향을 주지 않은 채로 온전하게 남아 있기 때문에, 숙주에서 (생체내에서) 병독성을 강하게 감소시켜 백신 사용에 매우 적합하도록 만든다. 본 출원의 상기 ΔFolT 돌연변이체는, 예를 들어, FolT 그 자체의 감소된 발현 또는 감소된 분자량을 갖는 FolT 변이체 단백질의 발현을 특징으로 하는 FolT의 약화된 (감소 또는 방해된) 발현을 가지며, 예를 들어, 본 출원의 실험 부문에 기재된 바와 같이 시험관내 전사/번역 연구에서 상기 돌연변이체의 FolT 특이적인 뉴클레오티드 작제물을 시험함으로써 시험될 수 있다. 하나의 특정한 바람직한 실시형태에서, 2015년 8월 19일에 진균 배양 중앙 사무국에서 "CBS 140425 스트렙토코쿠스 수이스 ΔFolT 돌연변이체"로서 기탁된, 본 출원의 ΔFolT 돌연변이체가 제공된다. 또 다른 특정한 바람직한 실시형태에서, 2017년 8월 25일에 웨스터디지크 진균 다양성 연구소에서 "CBS 143192 스트렙토코쿠스 수이스 ΔFolT2 돌연변이체"로서 기탁된, 본 출원의 ΔFolT 돌연변이체가 제공된다.

또 다른 특정한 바람직한 실시형태에서, 본 출원의 ΔFolT 돌연변이체 균주가 제공된다. 이들 기탁물 모두는 FolT 변이체 유전자 발현 또는 FolT 변이체 단백질 발현의 발현 연구를 위해 추가의 세균 ΔFolT 돌연변이체와 함께 발현 연구에서 대조군 작제물로서 ΔFolT 돌연변이 뉴클레오타이드 작제물을 제공하는데 사용될 수 있다. 이들 기탁물 모두는 또한 ΔFolT 돌연변이체 세균 배양물 또는 본 출원의 ΔFolT 돌연변이체 세균 배양물을 포함하는 조성물을 제공하는데 사용될 수 있다. 본 출원에서 제공되는 방법으로 수득가능하거나 수득되는 약독화된 병독성을 갖는 세균, 및 이러한 세균의 배양물이 또한 제공된다. 본 출원의 ΔFolT 돌연변이체 세균 또는 ΔFolT 돌연변이체 배양물을 포함하는 조성물, 및 백신의 생산을 위한 이러한 조성물의 용도가 또한 제공된다. 본 출원에서 제공되는 바와 같은 ΔFolT 돌연변이체 세균 또는 ΔFolT 돌연변이체 배양물을 포함하는 백신이 또한 제공된다. 바람직한 실시형태에서, 비-스트렙토코쿠스 단백질을 발현할 수 있는ΔFolT 돌연변이체를 포함하는 스트렙토코쿠스 백신 균주 또는 백신이 제공된다. 이러한 벡터-스트렙토코쿠스 ΔFolT 돌연변이체 백신 균주는, 백신에서 사용될 때, 스트렙토코쿠스 이외의 병원체에 대한 보호를 허용한다. 이의 무병독성 특성으로 인해, 본 출원에서 제공되는 바와 같은 스트렙토코쿠스 백신 균주 또는 ΔFolT 돌연변이체는 스트렙토코쿠스 항원에 대해서 뿐만 아니라 당해 균주에 의해 발현되는 기타 항원에 대해서도 특이적이고 오래 지속되는 면역 반응을 생성하는데 매우 적합하다. 구체적으로, 또 다른 병원체로부터 유래된 항원은 지금 항원 또는 병원체의 해로운 효과없이 발현되며, 그렇지 않으면 숙주에게 해로울 것이다. 이러한 벡터의 예는 스트렙토코쿠스 백신 균주 또는 ΔFolT 돌연변이체이며, 항원은 액티 노바시로 루스 플 루오로 바이러스 (악티노바실러스 플레우로뉴모니아 (Actinobacillus pleuropneumonia)), 보르데텔라 (Bordetella), 파스퇴렐라 (Pasteurella), 이. 콜라이, 살모넬라 (Salmonella), 캄필로박터 (Campylobacter), 세르풀리나 (Serpulina) 및 기타와 같은 병원체로부터 유래한다. 스트렙토코쿠스 백신 균주 또는 ΔFolT 돌연변이체 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 아쥬반트를 포함하는 백신이 또한 제공된다. 담체 또는 아쥬반트는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 예로는 포스페이트 완충 식염수, 생리 식염수, (이중-) 수중유 유화액, 수산화 알루미늄, 스페콜, 블록 중합체, 공중합체 및 기타가 있다. 본 출원의 백신은 죽거나 살아 있는 형태의 백신 균주를 포함할 수 있다. 예를 들어, 스트렙토코쿠스 또는 이종 항원 또는 병독성 인자를 (과)발현하는 균주를 포함하는 사백신은 면역 반응을 유도하는데 매우 적합하다. 특정 실시형태에서, 균주가 무병독성 특성으로 인해 살아있는 백신이 제공되며; 본 출원에서 제공되는 바와 같은 ΔFolT 돌연변이체를 기본으로 하는 스트렙토코쿠스 백신 균주는, 특이적이고 오래 지속되는 면역 반응을 생성하는데 매우 적합하다. 또한, 개체군에서 스트렙토코쿠스 질병을 제어 또는 근절하기 위한 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 본 출원의 ΔFolT 돌연변이체 백신으로 개체군의 대상체에게 백신접종하는 것을 포함한다. 스트렙토코쿠스 수이스는 스트렙토코쿠스 수이스의 발병 기전 및/또는 병독성에서 중요한 역할을 하는 오페론을 갖고 있다. 오페론은 폴레이트 획득 및 폴레이트의 테트라하이드로폴레이트로의 처리에 관련된 2종의 유전자를 암호화한다. 폴레이트는 수용성 비타민 B 그룹에 대한 일반적인 용어이며, 여기서, 폴레이트는 다양한 테트라하이드로폴레이트 유도체를 지칭한다. 이들 유도체는 직접 또는 초기 환원 및 테트라하이드로폴레이트로의 메틸화 후에 주요 폴레이트 대사 사이클에 진입할 수 있다. 폴레이트는 모든 생물, 즉, 원핵 생물과 진핵 생물 둘 다에게 필수적이므로, 폴레이트 대사를 중요한 과정으로 만든다. folT-folC 오페론은, 예를 들어, 숙주가 자신의 사용을 위해 격리시키는 생체내에서 처럼 폴레이트-한정 조건하에 폴레이트를 획득하기 위한 탈출 경로를 형성하는 것으로 보인다. 이러한 조건하에, folT-folC 오페론의 발현은 리보스위치에 의해 유도된다. 폴레이트 수준이 떨어질 때, 테트라하이드로폴레이트는 리보스위치로부터 방출되어 펼쳐질 수 있다. 이것은 리보솜 결합 부위의 방출에 의한 번역의 개시를 허용한다. folT-folC의 발현은 스트렙토코쿠스 수이스가 폴레이트 수송체 복합체에 의해 직접 폴레이트를 도입하고, 후속적으로 folC에 의해 폴레이트를 테트라 하이드로 처리하는 것을 가능하게 한다. 폴레이트가 뉴클레오타이드 합성에 중요하기 때문에 폴레이트의 획득은 스트렙토코쿠스 수이스의 성장 속도에 직접적인 영향을 미친다. 생체내 성장 속도의 감소는 병독성 감소를 초래한다. CBS 140425로서 또는 CBS 143192로서 기탁된 돌연변이체와 같은 folT의 동종 녹아웃 돌연변이체가 강력하게 약독화되고 백신으로서 유용하다는 것을 증명함으로써, 이러한 결과는 더욱 지지되었다. 오페론은 실제로 생체내 발병 기전에 관련되어 있다. 이와 함께, 본 발명은 현재 이러한 돌연변이체 및 배양물, 및 감소된 병독성을 갖는 이러한 FolT 녹아웃 돌연변이체 균주를 포함하는 조성물 및 백신을 제공한다. 이러한 감소된 병독성을 갖는 세균을 포함하는 면역원성 조성물, 및 이러한 조성물의 용도가 또한 제공되며, 백신, 더욱이, CBS 140425로서 또는 CBS 143192로서 기탁된 이러한 돌연변이체와 같은 세균 ΔFolT 돌연변이체 또는 이의 배양물 또는 조성물을 포함하는 백신의 제조가 본 출원에 제공된다. 하기를 포함하는, 스트렙토코쿠스 수이스 감염과 관련된 질병에 대해 동물, 바람직하게는 돼지를 백신접종하기 위한 키트가 또한 제공된다: 동물, 바람직하게는 돼지에게 백신을 투여하기 위한 디스펜서; 및 본 출원의 CBS 140425로서 또는 CBS 143192로서 기탁된 돌연변이체와 같은 ΔFolT 돌연변이체 균주, 또는 이의 배양물 또는 조성물; 및 임의로, 설명 전단지. 결론적으로 말하면, 상기 세균의 폴레이트 수송 능력을 감소시키는 것을 포함하는, 세균의 병독성을 감소시키는 일반적인 방법이 제공되며, 상기 세균이 새로운 폴레이트 합성을 할 수 있는 상기 방법이 특히 적용가능하다. 본 출원의 방법은 기능성 폴레이트 기질 결합 단백질을 갖는 세균을 선택하고, 이어서 상기 세균의 폴레이트 기질 결합 단백질 (FolT)의 발현 및/또는 기능을 약화시키는 것을 포함하며, 특히 상기 병독성은 상기 세균의 folT 유전자에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 제공함으로써, 예를 들어, 상기 folT 유전자의 프로모터를 암호화하는 상기 세균의 DNA에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 제공함으로써 약독화된다. 본 출원의 특정 실시형태에서, 폴레이트 기질 결합 단백질 FolT의 막관통 영역을 암호화하는 상기 세균의 DNA에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 제공함으로써 상기 병독성을 약독화하는 것이 바람직하다. 또 다른 특정 실시형태에서, 상기 병독성은 기질 결합에 중요한 영역을 암호화하는 상기 세균의 DNA 영역을 암호화하는 FolT에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 제공함으로써 약독화된다. 또한, 세균에 적용가능한 면역원성 조성물 또는 백신을 수득하는 방법이 본 출원에 제공되며, 상기 세균은 퍼미큐티스, 바람직하게는 스트렙토코쿠스, 보다 바람직하게는 스트렙토코쿠스 수이스, 보다 바람직하게는 2015년 8월 19일에 진균 배양 중앙 사무국에서 "CBS 140425 스트렙토코쿠스 수이스 ΔFolT 돌연변이체"로서 기탁된 ΔFolT 돌연변이체, 가장 바람직하게는 2017년 8월 25일에 웨스터디지크 진균 다양성 연구소에서 "CBS 143192 스트렙토코쿠스 수이스 ΔFolT2 돌연변이체"로서 기탁된 ΔFolT 돌연변이체이다. 본 출원의 FolT 발현을 약화시킴으로서 병독성을 약화시키는 방법으로 수득가능하거나 수득되는 약독화된 병독성을 갖는 세균이 또한 제공되며, 이러한 세균의 배양물, 병독성이 감소된 이러한 세균 또는 병독성이 감소된 이러한 세균의 배양물을 포함하는 조성물, 및 병독성이 감소된 세균 또는 병독성이 감소된 세균의 배양물을 포함하는 면역원성 조성물이 제공되며, 백신의 생산을 위한, FolT 발현이 약화된 이러한 세균 배양물 또는 FolT 발현이 약화된 세균 배양물의 조성물의 용도가 제공된다. FolT 발현이 약화된 세균 또는 FolT 발현이 약화된 세균의 배양물을 포함하거나, FolT 발현이 약화된 세균의 배양물의 조성물을 포함하는 백신이 또한 제공된다. A) 백신을 동물에게 투여하기 위한 디스펜서, 및 (b) FolT 발현이 약화된 특정 세균의 동종 녹아웃 균주 (돌연변이체), 또는 FolT 발현이 약화된 특정 세균의 동종 녹아웃 균주의 배양물, 또는 FolT 발현이 약화된 특정 세균의 동종 녹아웃 균주의 배양물을 포함하는 조성물, 및 임의로, 설명 전단지를 포함하는, FolT 발현 감염을 갖는 특정 세균과 관련된 질병에 대해 동물을 백신접종하기 위한 키트가 또한 제공된다. 약화된 FolT 발현이 제공되고 폴레이트 수송 능력이 감소되며 당해 능력이 폴레이트 수송체 (FolT) 기능을 기능적으로 제거시킴으로써 감소되는 본 출원의 이러한 특정 세균은, 특히 폴레이트 합성 능력을 갖지만 이러한 합성 경로가 (배양에서) 시험관내 성장에 대한 능력에 영향을 주지 않은 채로 온전하게 남아 있으므로 숙주에서 (생체내에서) 병독성을 강하게 감소시켜 백신 사용에 매우 적합하도록 만드는 본 출원의 ΔFolT 돌연변이체가 사용될 때, 일반적으로 배양 배지에서 우수한 성장 특징을 갖는다.

도 1: V[10]은 오페론의 추정 프로모터 (명확화를 위해, 추정 프로모터의 -35 영역의 서열 (TGGACA)만이 다이어그램에 도시된다)에 후행하는 2개의 불완전한 ORF (회청색 화살표)와, orf2[10] 및 folC[10]을 포함하는 추정 오페론 (자주색)을 포함하는 보완 전략을 사용하여 확인된 클론을 도시한 것이다. 오페론의 추정 프로모터 영역의 추정 -35 영역 (자주색)에 후행하는 orf2[10]또는 folC[10] (자주색)을 포함하는 작제물을 제조하였다. 추정 S735 프로모터의 -35 영역 (TGGTCA) (녹색)과 함께 S735 균주 유래의 orf2 (녹색)를 포함하는 작제물을 제조하였다. 균주 10의 추정 프로모터 서열의 -35 영역 (TGGACA) (자주색)을 포함하도록 동일한 작제물을 돌연변이시켜 orf2[S735][t488a]를 수득하였다.
도 2: FolC 및 ORF2/FolT의 시험관내 전사/번역. 대조군 작제물 pCOM1 (1번 레인), 및 작제물 pCOM1-V[10] (2번 레인) 및 pCOM1-folc[10] (3번 레인). 분자량 마커는 우측에 kDa로 표시된다. FolC 발현은 46.8 kDa의 예상 분자량 (폐쇄 화살촉)으로 검출된 반면, OR2/FolT의 발현은 예상 (20.5 kDa)보다 낮은 14 kDa의 분자량 (개방 화살촉)으로 검출되었다.
도 3: Rfam을 사용하는 테트라하이드로폴레이트에 대한 예측 리보스위치. RNA의 3차원 구조화는, 2개의 추정 리보솜 결합 부위 (청색 화살표)가 접힘으로 인해 리보솜에 접근할 수 없는 리보스위치를 제시하였다.
도 4: 상이한 FolT 서열의 Clustal W 정렬. ^*는 동일한 아미노산을 나타내며; :은 매우 유사한 특성의 그룹들 사이의 보존을 나타내며; .은 약간 유사한 특성의 그룹들 사이의 보존을 나타낸다. CB = 클로스트리듐 볼테아에 (Clostridium bolteae) (서열 번호 17); CP = 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 (Clostridium phytofermentans) (서열 번호 18); AM = 알칼리필루스 메탈리레디겐스 (Alkaliphilus metalliredigens) (서열 번호 19); TT = 써모언에어로박터 텡콘게네시스 (Thermoanaerobacter tengcongensis) (서열 번호 20); EFM = 엔테로코쿠스 패시움 (Enterococcus faecium) (서열 번호 21); EFS = 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) (서열 번호 22); LB = 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) (서열 번호 23); SM = 스트렙토코쿠스 무탄스 (Streptococcus mutans) (서열 번호 24); SG = 스트렙토코쿠스 갈롤리티쿠스 (Streptococcus gallolyticus) (서열 번호 25); SUB = 스트렙토코쿠스 우베리스 (Streptococcus uberis) (서열 번호 26); SSU = 스트렙토코쿠스 수이스 (Streptococcus suis) P1/7 (서열 번호 27).

도 5: 스트렙토코쿠스 수이스의 폴레이트 대사.
스트렙토코쿠스 수이스의 추정 폴레이트 대사의 도식적 설명.
도 6: 스트렙토코쿠스 수이스 야생형 분리주 및 돌연변이체에서 orf2 및 folC의 발현 수준.
토드 헤위트 (Todd Hewitt)에서 기하급수적으로 성장한 스트렙토코쿠스 수이스 야생형 분리주 균주 10 (흑색 막대) 및 S735 (백색 막대)에서의 orf2 및 folC의 발현 수준 (패널 A); 및 토드 헤위트에서 기하급수적으로 성장한 빈 대조군 플라스미드 pCOM1 (흑색 막대), orf2[10] (백색) 또는 orf2[S735] (빗금 막대)로 보완된 S735 균주에서의 orf2 및 folC의 발현 수준 (패널 B). 초기 지수기 (early exponential phase: EEP) (백색 막대), 지수기 (exponential phase: EP) (작은 빗금 막대), 후기 지수기 (late exponential phase: LEP) (큰 빗금 막대) 및 정지기 (stationary phase: SP) (흑색 막대)까지 토드 헤위트에서 성장한 후 orf2[10], orf2[S735] 및 orf2[S735][t488a]로 보완된 S735에서 orf2의 발현 수준 (패널 C). qPCR을 사용하여 발현 수준을 결정하였고, 하우스키핑 유전자 recA에 대한 상대적인 발현으로 표현하였다. 실험은 3회 수행되었으며, 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 유의성을 대응표본 t-검정 (paired t-test)에 의해 결정하였다. ^* p < 0.05; ^** p < 0.01.
도 7: 스트렙토코쿠스 수이스의 FolT 단백질에 대한 예측 3차원 구조.
도 8: 스트렙토코쿠스 수이스 감염 후 새끼 돼지의 체온, 실험 1. 야생형 균주 10 (분홍색) 또는 균주 10ΔfolT (CBS 140425)로 감염된 새끼 돼지 (n = 5)의 평균 체온이 도시되어 있다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 9: 스트렙토코쿠스 수이스 감염 후 새끼 돼지의 균혈증, 실험 1. 야생형 균주 10 (분홍색) 또는 균주 10ΔfolT (CBS 140425) (청색)로 감염된 새끼 돼지 (n = 5)의 평균 균혈증이 도시되어 있다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 10: 스트렙토코쿠스 수이스로 감염된 돼지의 생존 곡선, 실험 1. 돼지를 야생형 균주 10 또는 균주 10ΔfolT (CBS 140425)로 감염시켰다. 윤리적 이유로, 예정된 인도적인 종료 시점에 도달하면 돼지를 안락사시켰다. 로그 순위법 (Mantel-Cox)을 이용하여 통계 분석을 수행하였다.
도 11: 스트렙토코쿠스 수이스로 감염된 새끼 돼지의 세균학적 검사, 실험 1. 돼지를 야생형 균주 10 또는 균주 10ΔfolT (CBS 140425)로 감염시켰다. 세균을 연속 희석 및 플레이팅에 의해 계수하였다. 세균 계수치를 CFU/ml로서 산출하였다. 상이한 색상은 상이한 각각의 새끼 돼지를 나타냈다.
도 12: 스트렙토코쿠스 수이스로 감염된 새끼 돼지의 생존 곡선, 실험 2. 새끼 돼지 (n = 10)를 야생형 균주 10 또는 균주 10ΔfolT (CBS 140425)로 감염시켰다. 윤리적 이유로, 예정된 인도적인 종료 시점에 도달하면 돼지를 안락사시켰다.
도 13: 스트렙토코쿠스 수이스 감염 후 새끼 돼지의 체온, 실험 2. 야생형 균주 10 (청색) 또는 균주 10ΔfolT (CBS 140425) (녹색)로 감염된 새끼 돼지 (n = 10)의 평균 체온이 도시되어 있다.
도 14: 스트렙토코쿠스 수이스 감염 후 새끼 돼지의 보행, 실험 2. 야생형 균주 10 (청색) 또는 균주 10ΔfolT (CBS 140425)로 감염된 새끼 돼지에서 양성 관찰의 백분율이 도시되어 있다. 보행 중증도: 1: 가벼운 파행; 2: 중간 정도의 파행 또는 서 있는 것을 꺼림; 3: 심각한 파행 (인도적인 종료 시점으로서의 역할을 함)
도 15: 스트렙토코쿠스 수이스 감염 후 새끼 돼지의 의식, 실험 2. 야생형 균주 10 (청색) 또는 균주 10ΔfolT (CBS 140425)로 감염된 새끼 돼지에서 양성 관찰의 백분율. 의식 중증도: 1: 우울증; 2: 무관심; 3: 혼수 상태
도 16: Δ FolT 2 균주 (CBS 143192)에 의한 돼지의 백신접종 및 스트렙토코쿠스 수이스 유형 2에 의한 시험감염 (challenge) 후의 보호. 1일째 및 21일째에 돼지를 ΔFolT2 균주 (CBS 143192)로 백신접종하였다. 35일째에, 상기 동물을 대략 2×10⁹ CFU의 병독성 스트렙토코쿠스 수이스 유형 2 분리주로 복강내로 (ip) 시험감염시켰다. 시험감염 후 7일 동안, 스트렙토코쿠스 수이스와 관련된 질병의 징후에 대해 상기 동물을 관찰하였다. 사망한 채로 발견되거나 동물 복지를 이유로 오프-테스트 전에 안락사시켜야 했던 동물을 부검하였다. 본 도면은 시험감염 후에 사망하거나 안락사시킨 동물의 백분율 (사망률)을 도시한 것이다.
도 17: Δ FolT 균주 (CBS 140425)에 의한 돼지의 백신접종 및 스트렙토코쿠스 수이스 유형 2에 의한 시험감염 (challenge) 후의 보호.
1일째 및 21일째에 돼지를 ΔFolT 균주 (CBS 140425)로 백신접종하였다. 36일째에, 상기 동물을 대략 2×10⁹ CFU의 병독성 스트렙토코쿠스 수이스 유형 2 분리주로 복강내로 시험감염시켰다. 시험감염 후, 7일 동안 스트렙토코쿠스 수이스와 관련된 질병의 징후에 대해 상기 동물을 관찰하였다. 사망한 채로 발견되거나 동물 복지를 이유로 오프-테스트 전에 안락사시켜야 했던 동물을 부검하였다. 본 도면은 시험감염 후에 사망하거나 안락사시킨 동물의 백분율 (사망률)을 도시한 것이다.

서론

이전에, 본 발명자들은 백신 후보 물질의 역할을 할 수 있는 병독성 인자를 확인하기 위해 보완 전략을 사용하였다. 이러한 전략을 사용하여, 감염 후 24시간 이내에 사망에 이르게 하는 감염 후의 새끼 돼지에서 심각한 독성 쇼크 유사 증후군을 일으키는 고병독성 스트렙토코쿠스 수이스 분리주 (S735-pCOM1-V[10])를 생성하였다^[14]. 병독성 혈청형 2 분리주 (균주 10)로부터 무작위로 클로닝된 게놈 DNA 단편을 보유하는 약 30,000개의 풀링된 클론으로부터 단리된 플라스미드 DNA로 형질전환시킨 후, 약병독성 혈청형 2 분리주 (S735)에서 생성된 클론 라이브러리로부터 S735-pCOM1-V[10]을 선택하였다. 균주 10으로부터의 게놈 단편의 플라스미드 라이브러리를 함유하는 S735 균주로 새끼 돼지를 감염시킴으로써, 병독성이 증가된 분리주를 선택하였다. 감염된 새끼 돼지로부터 단리된 하나의 우세한 클론은, V[10]으로 명명된 균주 10으로부터의 3 kb의 게놈 단편을 함유하며, 후속 동물 실험에서 고병독성인 것으로 입증되었다. V[10]은 불완전한 오픈 리딩 프레임 (open reading frame: ORF)를 포함하고, 이어서 제2의 불완전한 ORF 뿐만 아니라 오페론 구조에서의 2개의 유전자 (orf2 및 folC)를 포함하였다. 전장 ORF만이 본 분리주의 고병독성에 기여할 수 있다고 가정하고, 본 발명자들은 orf2-folC-오페론을 추가로 특성화하였다. 오페론의 제1 ORF는 주석을 달 수 없었으며, orf2로 명명되었으며, 오페론의 제2 ORF는 폴리폴릴폴리글루타메이트 신타아제 (polyfolylpolyglutamate synthase: FolC)를 암호화하는 유전자와 상동성을 나타냈다. 이 오페론은 모 균주 S735를 포함하여 모든 스트렙토코쿠스 수이스 혈청형에 존재하였다. 병독성이 낮은 S735 균주는, 균주 10과 비교하여, orf2-folC 및 비암호화 영역에서 여러 단일 뉴클레오타이드 다형체 (single nucleotide polymorphism: SNP)를 포함하였다. 병독성을 증가시킨 오페론의 두 유전자 모두는 추정 병독성 인자일 수 있으며, 그렇다면, 추정 백신 후보 물질일 수 있다. 여기서, 본 발명자들은 1) orf2-folC-오페론의 고병독성이 orf2 또는 folC 또는 둘 다에 의해 유발되는지 여부와 2) 병독성에 대한 orf2-folC-오페론의 프로모터 영역에서의 단일 뉴클레오타이드 다형체의 영향을 조사하였다.

재료 및 방법

균주 및 플라스미드

스트렙토코쿠스 수이스 분리주를 토드 헤위트 브로쓰 (Oxoid, London, United Kingdom)에서 성장시키고, 6% (vol/vol)의 말 혈액을 함유하는 콜럼비아 혈액 기본 아가 플레이트 (Columbia blood base agar plate; Oxoid)상에 플레이팅하였다. 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli)를 루리아 브로쓰 (Luria Broth)에서 성장시키고, 1.5% (wt/vol)의 아가를 함유하는 루리아 브로쓰상에 플레이팅하였다. 필요에 따라, 에리트로마이신을 스트렙토코쿠스 수이스에 1 μg/ml로 첨가하고, 이. 콜라이에 200 μg/ml로 첨가하였다. 본 연구에서 사용된 균주 10 (S735-pCOM1-V[10]) 및 기타 스트렙토코쿠스 수이스 균주로부터 유래된 3kb의 게놈 단편을 함유하는 플라스미드로 보완된 스트렙토코쿠스 수이스 균주 S735는 이전에 기재되었다^[14] (도 1).

실시예 1: 스트렙토코쿠스 수이스 S735의 보완

S735를 균주 10 유래의 오페론의 추정 프로모터 영역에 후행되는 V[10] 오페론 (즉, orf2[10] 또는 folC[10]) 내의 2개의 ORF 중 하나를 함유하는 플라스미드 pCOM1로 또는 균주 S735 유래의 orf2 및 동족 업스트림 프로모터를 함유하는 플라스미드 pCOM1 (orf2[S735])로 보완하였다 (도 1). 이들 플라스미드를 작제하기 위해, 제한 효소 부위를 갖는 프라이머는 orf2 10] 또는 orf2[S735] (comE1-comE2), folC[10] (comE4-comE6) 또는 오페론의 프로모터 영역 (comE1-comE3)을 증폭시키도록 설계되었다 (표 1). 제한 효소 SacI 및 BamHI를 사용하여, 생성된 PCR 생성물 orf2[10] 및 orf2[S735]를 분해하고, pKUN19에 클로닝하고^[15], 동일한 제한 효소로 분해하고, 후속적으로 pCOM1에 클로닝하여, pCOM1-orf2[10] 및 pCOM1-orf2[S735]를 각각 수득하였다. 제한 효소 SmaI 및 BamHI를 사용하여 folC[10]의 PCR 증폭물을 분해하고, 동일한 제한 효소로 절단된 pKUN19에 클로닝하였다. 제한 효소 SacI 및 SmaI를 사용하여, V[10]의 프로모터 영역을 포함하는 PCR 생성물을 folC[10]의 앞에 클로닝시켰다. 후속적으로, SacI 및 BamHI을 사용하여 pKUN19로부터 프로모터 V[10]-folC[10]의 완전한 단편을 분해하고, 동일한 제한 효소로 분해된 pCOM1에 클로닝하여, pCOM1-folC[10]을 수득하였다. 프로모터-folC[10]의 융합 생성물이 전사되었는지를 확인하기 위해, ³⁵S-메티오닌을 사용하여 시험관내 전사/번역을 수행하였다. 융합 생성물이 발현되고 번역될 수 있다는 것을 증명하는 FolC (46.8 kDa)의 분자량의 명확한 밴드가 검출되었다 (도 2). 전기천공에 의해 모든 플라스미드를 스트렙토코쿠스 수이스 균주 S735에 도입하였다. 또한, 전기천공에 의해 pCOM1-V[10]을 무병독성 혈청형 균주 T15에 도입하여 T15-pCOM1-V[10]을 수득하였다.

실시예 2: 보완된 분리주에 의한 실험 감염

제왕절개 수술 유도된 무균 새끼 돼지의 실험실 감염을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다^[14]. 감염 전에, 6%의 말 혈액을 함유하는 콜럼비아 아가 플레이트상에 편도 면봉을 플레이팅하여 새끼 돼지의 무균 상태를 확인하였다. 간단히 말하자면, 4 또는 5 마리의 1주령 무균 돼지를 10⁶ 콜로니 형성 단위 (colony-forming unit: CFU)의 스트렙토코쿠스 수이스로 정맥내로 감염시킨 다음, 즉시 40 mg/kg 체중의 에리트로마이신 (에리트로마이신-스테아레이트, Abbott B.V., Amstelveen, The Netherlands)을 하루 2 회 투여하여 pCOM 플라스미드를 보유하는 스트렙토코쿠스 수이스 분리주에 대한 선택적인 압박을 유지하였다. 감염된 돼지를 임상 징후에 대해 매일 2회 모니터링하고, 세균학적 분석을 위해 편도 면봉을 수집하였다. 스트렙토코쿠스 수이스에 의한 감염 후 관절염, 수막염 또는 패혈증의 임상 징후가 관찰될 때, 돼지를 안락사시켰다. CNS, 장막 및 관절의 조직 검체를 부검 동안 수집하고, 균질화하고, 6%의 말 혈액 및 1 μg/ml의 에리트로마이신을 함유하는 콜롬비아 아가 플레이트 상에 연속 희석액을 플레이팅하여 세균 세포 수를 측정하였다. 본 출원에 포함된 상이한 동물 실험으로부터의 결과를 비교할 수 있도록 하기 위해, 비특이적 증상 및 특이적 증상의 균일한 채점을 모든 동물 실험에 적용하였다. 비특이적 증상에는 0 (없음), 0.5 (가벼운 식욕 부진/우울증) 또는 1 (심각한 식욕 부진/우울증)로 채점된 식욕 부진과 우울증이 포함되었다. 특이적 증상으로는 파행, 중추 신경계 (central nervous system: CNS) 증상 (사이클링 (cycling) 또는 제자리 걷기 (walking in circle)와 같은 보행 장애; 후궁반장; 안진) 뿐만 아니라, 소름 돋음 (raised hair), 아치형 등 (척추후만증) 및 떨림이 포함되는데, 이는 이들이 패혈증 또는 장막염의 모든 증상이기 때문이다. 이러한 관찰에 근거하여, 특이적 증상 또는 비특이적 증상이 관찰된 관찰 수를 이러한 파라미터에 대한 총 관찰 수로 나눔으로써 임상 지수를 산출하였다. 이것은 특이적 증상 또는 비특이적 증상이 관찰된 관찰 백분율을 나타낸다. "발열 지수"에 대해서 유사한 접근법을 사용하였다. 발열을 40℃ 초과의 체온으로 정의하였다. "사망까지의 평균 일수"를 생존 파라미터로서 사용하였다. 인도적인 종료 시점 (humane end point: HEP)에 도달한 후 동물을 안락사시켰지만, 접종과 HEP 도달 사이의 시간은 여전히 감염의 중증도를 나타낸다. 이것은 접종에서부터 사망까지의 생존 (일)을 평균하여 계산된다.

CBS 140425 균주에 의한 동물 실험은 네덜란드 렐리스타트 소재의 바헤닝언 대학교의 중앙 수의학 연구소 (Central Veterinary Institute of Wageningen UR) (현재 바헤닝언 생물수의학 연구 (Wageningen Bioveterinary Research: WBVR)로 명명)의 구내에서 수행되었으며, 동물 실험에 관한 네덜란드 법률 (809.47126.04/00/01 & #870.47126.04/01/01)에 따라 네덜란드 렐리스타트 소재의 바헤닝언 대학교의 중앙 수의학 연구소의 윤리위원회에 의해 승인되었다. CBS 140425 및 143192 균주에 의한 동물 실험은 또한 동물 실험에 관한 미국 법률에 따라 수행되었다.

그룹간에 변화의 균질성이 없었기 때문에, 비모수적 크러스칼-왈리스 검정 (non-parametric Kruskal-Wallis test)을 사용하여 그룹의 임상 지수 (발열 지수, 특이적 증상 및 비특이적 증상)에 대해 통계 분석을 수행하였다. 후속 분석에서, 맨-휘트니 U 검정 (Mann-Whitney U test)을 사용하여 모든 그룹을 3개의 모든 파라미터에 대해 대조군 (S735-pCOM1)과 쌍으로 비교하였다. 차이는 p < 0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. SPSS 19 (IBM, New York, USA)를 사용하여 계산을 수행하였다.

실시예 3: 균주 10ΔfolT (CBS 140425)에 의한 실험 감염, 실험 1

10 마리의 4주령 새끼 돼지 를 CVI 동물 시설에 5 마리 동물의 2개의 그룹에 수용하였다. 새끼 돼지는 사료 및 신선한 물에 무제한으로 접근하였다. 빛은 동물에게 온기를 제공하였으며, 놀이감은 실험 전체에 걸쳐 이용가능하였다. 실험 개시 전, 스트렙토코쿠스 수이스 혈청형 2의 콜로니화에 대해 PCR에 의해 새끼 돼지의 편도 면봉을 스크리닝하였다. PCR-음성 새끼 돼지만을 실험에 포함시켰다. 10일 후, 동물을 경정맥에서 1.1×10⁶ CFU의 야생형 균주 10 또는 9.2×10⁵ CFU의 돌연변이체 균주 10ΔfolT에 의해 정맥내로 감염시켰다. 감염 전에, 새끼 돼지의 기초 체온을 3일의 기간 동안 매일 모니터링하였다. 감염 전에 EDTA 혈액을 수집하여 감염 전 혈장 샘플 및 백혈구 수 (white blood cell: WBC)의 기저 수준을 수득하였다. 감염된 돼지를 오후 8시, 오전 3시 및 오전 9시에 임상 징후에 대해 하루 3회 모니터링하였다. 비특이적 증상으로는 식욕 부진 및 우울증이 포함된 반면, 특이적 증상으로는 파행, 중추 신경계 (CNS) 증상 (사이클링 또는 제자리 걷기와 같은 보행 장애; 후궁반장; 안진) 뿐만 아니라, 소름 돋음, 아치형 등 (척추후만증) 및 떨림이 포함되는데, 이는 이들 모두가 패혈증 또는 장막염의 모든 증상이기 때문이다. 세균학적 분석을 위해 편도 및 배설물 면봉을 매일 수집하였다. 세균학적 분석, WBC 계수 및 혈장 수집을 위해 매일 혈액을 수집하였다. 스트렙토코쿠스 수이스에 의한 감염 후 관절염, 수막염 또는 패혈증의 임상 징후가 관찰될 때, 돼지를 안락사시켰다. 부검시, 6%의 말 혈액을 함유하는 컬럼비아 아가 플레이트상에 내부 장기 (신장, 간, 비장, 복막 및 심막)를 플레이팅함으로써 스트렙토코쿠스 수이스에 대해 세균 학적으로 스크리닝하였다. 화농성 관절염 관절, 심막염 또는 복막염과 같은 스트렙토코쿠스 수이스에 의해 육안으로 영향을 받은 장기를 연속 희석으로 플레이팅하여 세균 부하를 측정하였다. 조직학적 검사를 위해 이들 장기의 조직 검체를 포르말린으로 고정시켰다. 동물 실험은 동물 실험에 관한 네덜란드 법률 (#2014011)에 따라 네덜란드 렐리스타트 소재의 바헤닝언 대학교의 중앙 수의학 연구소의 윤리위원회에 의해 승인되었다.

실시예 4: 균주 10ΔfolT (CBS 140425)에 의한 실험 감염, 실험 2

제2 실험에서, 대략 3주령의 새끼 돼지 (Commercial Cross)를 사용하였다. 새끼 돼지는 스트렙토코쿠스 수이스에 대해 백신접종받지 않았고, PRRSV 음성 무리로부터 수득되었고, 약물 첨가 사료를 결코 제공받지 않았으며, 등록시 PCR에 의해 스트렙토코쿠스 수이스 혈청형 2에 대해 편도 면봉 음성이었다. 처리군 (각각 10 마리의 새끼 돼지)을 따로따로 수용하였다. 동물을 3.48E+07 CFU의 야생형 균주 10 또는 1.45E+07의 돌연변이체 균주 10ΔfolT로 정맥내 접종하였다. 동물을 스트렙토코쿠스 수이스 관련 질병의 임상 징후 (예를 들어, 체온 상승, 파행 및 거동 변화)에 대해 하루에 1회 관찰하였다. 고통을 최소화하기 위해 인도적인 종료 시점에 도달한 임상 징후 (예를 들어, CNS 징후, 쇠약성 파행)를 나타내는 모든 동물을 안락사시켰다. 안락사된 동물을 부검하여 스트렙토코쿠스 수이스 질병과 전형적으로 관련된 병변을 확인하였다. 관찰 기간의 종료까지 생존하는 동물도 마찬가지로 안락사시켜 부검하였다.

실시예 5a: ΔFolT2 균주 (CBS 143192)에 의한 돼지의 백신접종 및 스트렙토코쿠스 수이스 유형 2에 의한 시험감염 후의 보호 본 연구를 돼지 (Commercial Cross)에서 수행하였으며; 1차 백신접종일에, 돼지는 21±7일령이었다. 동물은 스트렙토코쿠스 수이스에 대해 백신접종받지 않았고, PCR에 의해 스트렙토코쿠스 수이스 유형 2에 대해 편도 면봉 음성이었고, 혈청 검사에 의해 PRRSV 음성이었으며, PCR에 의해 스트렙토코쿠스 수이스 유형 2에 대해 편도 면봉 음성인 암퇘지로부터 유래되었다. 연구 그룹, 백신접종 경로 및 용량, 예방접종일, 시험감염일 및 시험감염 경로는 표 6에 나열되어 있다. 사용된 배지는 표 7에 기재되어 있다.

34일째에, 모든 동물로부터 혈액 및 편도 면봉을 수집한 다음, 엄격한 대조군 동물을 별도의 에어스페이스로 옮기는 동안 모든 기타 집단을 혼합하였다. 35일째에, 상기 동물을 대략 2×10⁹ CFU의 병독성 스트렙토코쿠스 수이스 유형 2 분리주로 복강내로 (ip) 시험감염시켰다.

시험감염 후 7일 동안, 스트렙토코쿠스 수이스와 관련된 질병의 징후에 대해 상기 동물을 관찰하였다. 사망한 채로 발견되거나 동물 복지를 이유로 오프-테스트 전에 안락사시켜야 했던 동물을 부검하였다. 부검 동안, 상기 동물을 스트렙토코쿠스 수이스 질병과 전형적으로 관련된 육안 징후에 대해 평가하고, CNS (즉, 뇌) 및 관절 면봉을 수집하였다. 오프-테스트에서, 나머지 모든 동물을 안락사시키고, 부검하고, 샘플을 수집하였다.

백신의 제조 및 위약은 표 7에 나열되어 있다.

시험감염 물질의 제조는 표 8에 나열되어 있다.

스트렙토코쿠스 수이스 ΔFolT 돌연변이체에 의한 백신접종은 시험감염 후 관찰 기간 동안 사망하였거나 동물 복지를 이유로 안락사시켜야 했던 동물의 수를 감소시켰다 (표 9 및 도 16 참조). 또한, ΔFolT에 의한 백신종은 심각한 파행 (즉, 서 있을 수 없거나 서 있는 것을 꺼리는 동물의 수) 뿐만 아니라, 동물이 환경에 아무런 관심을 보이지 않는 것을 나타내는 무관심의 결과를 감소시켰다 (표 10 및 11 참조).

부검 동안, 피브린 및/또는 체액의 존재로 표시되는 뇌의 염증 징후는, 음성 대조군과 비교하여, ΔFolT 백신접종 동물에서 덜 빈번하게 관찰되었다 (표 12 참조).

스트렙토코쿠스 수이스 시험감염 분리주는, 음성 대조군과 비교하여, ΔFolT 균주로 백신접종된 동물로부터 부검시 수집된 뇌 및 관절 면봉으로부터 덜 빈번하게 회수되었다 (표 13 및 14 참조).

실시예 5b: 10ΔfolT 균주 (CBS 140425)에 의한 돼지의 백신접종 및 스트렙토코쿠스 수이스 유형 2에 의한 시험감염 후의 보호

본 연구를 1차 백신접종일에 21±5일령인 돼지 (Commercial Cross)에서 수행하였다. 동물은 스트렙토코쿠스 수이스에 대해 백신접종받지 않았고, PCR에 의해 스트렙토코쿠스 수이스 유형 2에 대해 편도 면봉 음성이었고, 혈청 검사에 의해 PRRSV 음성이었으며, PCR에 의해 스트렙토코쿠스 수이스 유형 2에 대해 편도 면봉 음성인 암퇘지로부터 유래하였다. 연구 그룹, 연구 개시 당시의 동물/그룹의 수, 백신접종 용량, 백신접종일, 백신접종 경로, 시험감염일 및 시험감염 경로는 표 15에 나열되어 있다.

35일째에, 모든 동물로부터 혈액 및 편도 면봉을 수집하고, 엄격한 대조군 동물을 안락사시켰다. 36일째에, 상기 동물을 대략 2×10⁹ CFU의 병독성 스트렙토코쿠스 수이스 유형 2 분리주로 복강내로 시험감염시켰다.

시험감염 후, 7일 동안 스트렙토코쿠스 수이스와 관련된 질병의 징후에 대해 상기 동물을 관찰하였다. 사망한 채로 발견되거나 동물 복지를 이유로 오프-테스트 전에 안락사시켜야 했던 동물을 부검하였다. 부검 동안, 상기 동물을 스트렙토코쿠스 수이스 질병과 전형적으로 관련된 육안 징후에 대해 평가하고, CNS 면봉을 수집하였다. 오프-테스트에서, 나머지 모든 동물을 안락사시키고, 부검하고, 샘플을 수집하였다.

백신 및 위약의 제조는 표 16에 나열되어 있다. 시험감염 물질의 제조는 표 17에 나열되어 있다.

스트렙토코쿠스 수이스 돌연변이체는 시험감염 후 파행을 나타내는 동물의 수를 감소시켰고, 시험감염 후 이상 거동 (즉, 우울증, 혼수 상태)을 나타내는 동물의 수 뿐만 아니라 시험감염 후 관찰 기간 동안 사망하였거나 동물 복지를 이유로 안락사시켜야 했던 동물의 수를 감소시켰다 (표 18, 19 및 20 및 도 17 참조).

오프-테스트에서 (즉, 시험감염 후 7일째에 또는 사망 또는 안락사로 인해 연구부터의 제거시), 동물을 뇌 (즉, 피브린, 체액) 뿐만 아니라 흉강 (즉, 피브린, 유체, 폐 울혈, 폐렴)에서의 비정상 결과에 대해 관찰하였다. 또한, 스트렙토코쿠스 수이스의 회수를 위해 뇌로부터 샘플을 수집하였다. 상기 결과는 표 21, 22 및 23에 나열되어 있다.

실시예 6: cDNA 합성 및 정량적 PCR

RT-PCR

200 ng의 RNA를 사용하여, 제조업자의 설명서에 따라 25 ng/μl 랜덤 프라이머 (Promega, Madison, WI, USA), 10 mM dNTP (Promega), 10 mM DTT (Invitrogen), 40 U RNAsin (Promega ) 및 SuperScriptII 역전사 효소 (Invitrogen)를 함유하는 반응물에서 cDNA 합성하였다.

qPCR

qPCR 분석을 위해 cDNA를 20배 희석시켰다. PrimerExpress 소프트웨어 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 프라이머를 설계하였다 (표 1). 각 반응물은 제조업자의 설명서에 따라 12.5 pmol의 정방향 프라이머, 12.5 pmol의 역방향 프라이머 및 POWR SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)를 함유하였다. ABI7500 (Applied Biosystems)을 사용하여 qPCR을 수행하였다. GeNorm 소프트웨어 (GeNorm)를 사용하여 가장 안정하게 발현된 기준 유전자를 결정하였다. 스트렙토코쿠스 수이스의 경우, recA는 시험된 6개의 잠재적 기준 유전자 (포스포글리세레이트 데하이드로게나아제 (pgd), 아세틸-coA 아세틸트랜스퍼라아제 (aca), mutS, 글루타메이트 데하이드로게나아제 (gdh))의 발현에서 변수가 가장 적었다. Genorm은 발현 데이터를 발현의 안정성을 나타내는 숫자로 결합하며, 여기서, 1은 가장 안정한 유전자를 나타낸다. 스트렙토코쿠스 수이스에 대한 안정성 수치는 gdh에 대해 1.667 내지 recA에 대해 1.217의 범위이었다. 이들 기준 유전자의 발현 수준을 측정하여 RNA 수율 및 RT 반응 조건의 변화를 제어하였다. 각 qPCR 실행에서, 해당 반응의 표적 유전자의 클로닝된 PCR 생성물을 함유하는 벡터로 이루어진 표준 곡선을 통합하였다. 표준 곡선은 대조군 벡터의 7번의 10배 희석으로 이루어졌다. 이러한 방식으로, 표적 유전자의 발현 수준과 외부 기준 유전자의 발현 수준 둘 다는 표준 곡선으로부터 산출될 수 있다. 각 반응에 대해, 음성 대조군으로서 cDNA 또는 주형 대신에 물을 포함시켰다. ABI7500 소프트웨어 (Applied Biosystems)를 사용하여 분석을 수행하였다.

서열 분석

서열 반응 및 분석을 Baseclear (Leiden, The Netherlands)에 의해 수행하였다.

실시예 7: 부위 특이적 돌연변이유발

Quick-change II 부위 특이적 돌연변이유발 키트 (Agilent Technologies, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 부위 특이적 돌연변이유발을 달성하였다. PCR 프라이머를 첨부된 소프트웨어 (Agilent Technologies)로 설계하였다 (표 1). 프라이머 t448a 및 t488a_안티센스를 사용하여 플라스미드 pCOM-orf2[S735]를 증폭시켜, S735의 orf2-folC-오페론의 추정 프로모터 영역의 -35 영역을 5'-TGGTCA-3'에서 5'-TGGACA-3'로 변경시킨 목적하는 돌연변이를 도입하였다 (도 1). DpnI를 사용하여 반응 혼합물을 분해하여, 원래의 주형 벡터를 불활성화시킨 후, XL-1-블루 컴피턴트 세포 (Invitrogen)로 형질전환시켰다. PCR 오류를 벡터 백본에 도입할 가능성을 배제하기 위해, 제한 효소 BamHI 및 SacI에 의한 분해 후 플라스미드 (orf2[S735])의 삽입물을 주형 벡터로부터 단리하고, 동일한 제한 효소로 분해된 pCOM1에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 전기천공에 의해 스트렙토코쿠스 수이스 분리주 S735에 도입하고, 1 μg/ml 에리트로마이신을 함유하는 컬럼비아 아가 상에서 형질전환체를 선별하여, S735-pCOM1-orf2[S735][t488a]를 수득하였다. 서열 분석을 사용하여 최종 작제물에서 PCR 오류의 존재를 배제하였다.

실시예 8: 스트렙토코쿠스 수이스 폴레이트 기질 결합 단백질 (folT)의 녹아웃 돌연변이체의 작제

스펙티노마이신 내성 카세트로 folT를 파괴함으로써 균주 10에서 동종 folT 녹아웃 돌연변이체를 작제하였다. pCOM1-V[10][14]을 BamHI으로 분해하고, BamHI 분해된 pKUN 플라스미드에 연결시켜, pKUN-V[10]을 수득하였다. V[10]의 3' 부분을 제거하기 위해, pKUN-V[10]을 SphI로 분해한 후, 벡터 단편을 정제하고 연결하여, pKUN-V[10]^*을 수득하였다. pKUN-V[10]^*을 XmnI로 부분적으로 분해하고, 선형 벡터 단편을 정제하고, 평활 말단의 스펙티노마이신 내성 카세트와 연결하여, pKUN-V[10]^*-Spec^R을 수득하였다. 돌연변이체의 작제를 위해, V735-fw 및 M13-rev를 사용하여 PCR로 V[10]^*-Spec^R을 증폭시켰다. PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 PCR 생성물을 정제 하였다. 정제된 PCR 생성물을 사용하고 자카리아 (Zaccaria) 등^[16]에 의해 기술된 바와 같이 컴피턴스 유도물질로서 ComS를 사용하여 스트렙토코쿠스 수이스 균주 10을 형질전환시켜 상동성 재조합을 유도하였다. 6% (vol/vol)의 말 혈액 및 100 μg/ml의 스펙티노마이신을 함유하는 컬럼비아 아가 플레이트 상에서 형질전환체를 선별하였다. 이중 교차를 PCR로 체크하고, 서던 블롯팅을 사용하여 확인하였다. 점 돌연변이의 도입 가능성을 배제하기 위해, 동종 녹아웃 돌연변이체의 염색체 DNA를 단리하고, 균주 10으로 형질전환시켰다. 6% (vol/vol)의 말 혈액 및 100 μg/ml의 스펙티노마이신을 함유하는 컬럼비아 아가 플레이트 상에서 돌연변이체를 다시 선별하여 10ΔfolT 균주를 수득하였다. 이러한 프로토타입 재조합 ΔFolT 돌연변이체 균주는 2015년 8월 19일에 부다페스트 조약의 규정에 따라 특허 절차의 목적으로 진균 배양 중앙 사무국에서 "CBS 140425 스트렙토코쿠스 수이스 ΔFolT 돌연변이체"로서 기탁되었다.

실시예 9: 스펙티노마이신 내성 유전자를 함유하지 않는 ΔfolT 결실 돌연변이체

스펙티노마이신 내성 유전자를 함유하지 않는 ΔfolT 결실 돌연변이체도 작제하였다. 이를 위해, 온도 감응성 셔틀 벡터 pSET5 (문헌 [Takamatsu, D., Osaki, M. and Sekizaki, T. 2001. Plasmids 46: 140-148])를 사용하였다. 플라스미드 pSET5는 온도 감응성 복제 원점을 함유하며, 이. 콜라이에서 37℃에서 증식할 수 있지만, 플라스미드의 복제는 스트렙토코쿠스 수이스에서 37℃ 초과에서 차단된다 (타카마츠 등 (Takamatsu et al.)). pSET5는 스트렙토코쿠스 수이스 뿐만 아니라 이. 콜라이에서 형질전환체의 선별에 사용될 수 있는 클로람페니콜 내성 유전자 (Cm)를 함유한다. 스펙티노마이신 내성 유전자를 함유하지 않는 프로토타입 재조합체 ΔFolT 돌연변이체 균주는, 2017년 8월 25일에 부다페스트 조약의 규정에 따라 특허 절차의 목적으로 웨스터디지크 진균 다양성 연구소에서 "CBS 143192 스트렙토코쿠스 수이스 ΔFolT2 돌연변이체"로서 기탁되었다.

ΔfolT 돌연변이체 분리주를 작제하기 위해, folT 유전자의 5'- 및 3'-플랭킹 서열을 함유하는 PCR 생성물을 생성하였다. 이러한 단편을 pSET5에 클로닝하고, Cm 내성 형질전환체를 이. 콜라이에서 37℃에서 선별한다. 이어서, 플라스미드를 이. 콜라이로부터 단리하고, 스트렙토코쿠스 수이스 균주 10에 도입하였다. Cm을 함유하는 컬럼비아 아가 플레이트 상에서 30℃에서 형질전환체를 선별하였다. 형질전환된 콜로니를 사용하여, Cm을 함유하는 토드 헤위트 브로쓰 (Todd Hewitt Broth: THB) 1 ml에 접종하고, 배양물을 30℃에서 밤새 성장시켰다. 밤새 배양물을 동일한 배지에서 100배 희석시키고, 600 nm에서의 광학 밀도가 0.2~0.3에 도달할 때까지 상기와 같이 배양하고, 이 시점에서 배양물을 38℃로 옮긴다. 당해 온도에서, 플라스미드를 복제할 수 없다. 당해 단계는 플라스미드가 단일 재조합 이벤트를 통해 염색체에 통합된 균주를 선별한다. Cm을 함유하는 컬럼비아 말 혈액 플레이트에 당해 배양물의 연속 희석액을 플레이팅하였다. 플레이트를 밤새 38℃에서 인큐베이션하였다. 염색체에 통합된 재조합 플라스미드를 함유하는 콜로니를 취하고, 38℃에서 밤새 인큐베이션을 위해 Cm으로 토드 헤위트 브로쓰 (THB) 1 ml에 접종하였다. 배양물을 Cm 무함유 THB로 100배 희석시키고, 5회의 후속 계대를 위해 28℃에서 성장시켰다. 당해 온도에서, 플라스미드를 복제할 수 있고, 복제된 표적 유전자 서열에 대한 제2 재조합 이벤트를 통해 염색체로부터 절제한다. 플라스미드의 절단은 야생형 유전자형을 생성할 수 있거나 folT 결실 돌연변이체를 초래할 수 있다. 배양물의 연속 희석액을 컬럼비아 말 혈액 플레이트 (Cm 무함유) 상에 플레이팅하고, 38℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, Cm을 함유하거나 함유하지 않은 컬럼비아 말 혈액 플레이트 상에 단일 콜로니를 복제 플레이팅하였다. Cm 민감성 콜로니를 PCR로 스크리닝하여 스펙티노마이신 내성 유전자를 함유하지 않은 ΔfolT 돌연변이 분리주을 동정하였다.

하이브리드화 연구

정지된 성장을 하는 스트렙토코쿠스 수이스 배양물로부터 염색체 DNA를 단리하였다. 200 나노그램의 정제된 DNA을 Genescreen-Plus (Perkin Elmer, USA) 상에 스폿팅하였다. ³²P에 의한 프로브의 라벨링, 하이브화 및 세척을 전술한 바와 같이 수행하였다^[17]. folT 및 folC의 PCR 생성물을 프로브로서 사용한 반면, 16S rRNA 프로브를 양성 대조군으로서 사용하였다.

folt의 과발현은 S735 균주에서 고병독성을 유도하는데 충분하다.

병독성 혈청형 2 균주 10, V[10])으로부터 3 kb 게놈 단편을 도입함으로써, 약병독성 혈청형 2 균주 S735의 병독성을 증가시켜^[14], 고병독성 분리주 (S735-pCOM1-V[10])를 생성시켰다. S735-pCOM1-V[10]으로 감염된 모든 돼지가 감염 후 (p.i.) 1일 이내에 사망하고, 높은 백분율의 돼지가 질병의 심각한 임상 징후를 보인 반면 (표 2), 대조군 균주 S735-pCOM1로 감염된 모든 돼지는 거의 실험 전체에 걸쳐 생존하였다. 임상 지수는 S735-pCOM1-V[10] 및 S735-pCOM1로 감염된 돼지들 사이에 유의한 차이 (p ≤ 0.01)가 있었다 (표 2). 대조군으로서, 본 발명자들은 또한 S735 (S735-pCOM1-V[S735]) 균주로부터 상동성 3 kb 단편을 함유하는 플라스미드로 형질전환된 S735의 병독성을 시험하였다. S735-pCOM1-V[S735]로 감염된 높은 백분율의 돼지가 실험 전체에 걸쳐 생존하였다. 대조적으로, 발열 및 비특이적 증상에 대한 임상 지수의 차이가 그룹들 사이에서 유의하게 상이하지 않지만 (p = 0.06), S735-pCOM1-V[S735]로 감염된 돼지는 S735-pCOM1로 감염된 돼지보다 유의하게 더 많은 특이적 임상 징후 (p ≤ 0.01)를 나타냈다 (표 2). 따라서, 플라스미드 pCOM1-V[S735]의 도입으로 인한 S735에서의 V[S735]의 증가된 카피 수는 스트렙토코쿠스 수이스의 특이적 임상 징후를 증가시켰다. 그럼에도 불구하고, S735-pCOM1-V[10]의 돼지 감염으로 인한 특이적 임상 징후 및 비특이적 임상 징후 (p ≤ 0.01)는, S735-pCOM1-V[S735]로 감염된 돼지와 비교하여, 유의하게 증가하였는데, 이는 S735 균주에서의 V[10]의 도입이 V[S735]의 도입 보다 병독성을 증가시키는 것을 증명하였다. 본 결과는 S735-pCOM1-V[10] 균주의 고병독성이 V[S735]와 비교하여 V[10]에서의 상이한 뉴클레오타이드 다형체에 기인할 수 있다는 것을 나타냈다.

orf2와 folC 유전자 둘 다가 관찰된 병독성 증가에 필요한지 여부를 결정하기 위해, 동족 프로모터 서열에 후행하는 균주 10으로부터 수득된 오페론의 두 유전자를 S735 균주에 따로따로 도입하여 S735-pCOM1-orf2[10] 및 S735-pCOM1-folC[10] 균주를 생성하였다. S735-pCOM1-V[10] 및 S735-pCOM1을 대조군으로서 사용하여, 새끼 돼지에서 실험 감염으로 이들 분리주의 병독성을 결정하였다. 표 2는 S735-pCOM1-V[10] 또는 S735-pCOM1-orf2[10]으로 감염된 돼지가 심각한 임상 징후에 의해 감염 후 (p.i.) 하루 이내에 사망한 것을 나타낸다. 감염된 돼지는 실험 감염에서 야생형 균주 10을 사용하여 관찰되지 않은 독성 쇼크 유사 증후군을 발생시켰는데, 이는 단편 V[10] 및 orf2[10]이 S735의 병독성을 증가시켜 균주 10보다 더 병독성인 분리주를 생성한다는 것을 시사한다^[3]. 특이적 증상과 비특이적 증상 둘 다는, S735-pCOM1과 비교하여, S735-pCOM1-V[10] 또는 S735-pCOM1-orf2[10]으로 감염된 돼지에서 유의하게 증가하였다 (p < 0.01) (표 2).

세균학적 검사는 CNS, 장막 및 관절이 높은 CFU의 스트렙토코쿠스 수이스에 의해 콜로니화되는 것을 나타냈다. 대조적으로, S735-pCOM1-folC[10] 또는 S735-pCOM1로 감염된 돼지는 발열과 같은 감염의 가벼운 증상을 나타내면서 실험 전체에 걸쳐 (감염 후 11일) 생존하였다. S735-pCOM1-folC[10] 및 S735-pCOM1으로 감염된 돼지들 사이에는 임상 결과에서 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 이것은 folC[10]의 도입이 S735 균주의 병독성을 증가시키지 않는 반면, V[10] 및 orf2[10]의 도입이 S735 균주의 병독성을 증가시킨다는 것을 명확하게 증명한다. 따라서, 본 발명자들은, S735-pCOM1과 비교하여 S735-pCOM1-V[10]의 관찰된 병독성 증가가 orf2의 도입에 기인하였다고 결론을 내렸다.

결론적으로, V[10]과 orf2-folC 페론의 유전적 배경 둘 다의 카피 수는 주어진 분리주의 병독성에서 결정적인 것으로 보인다.

가상 환경 데이터의 데이터 마이닝 (datamining)은 ORF2가 폴레이트 수송을 촉진하는 기질 결합 단백질이다는 것을 증명한다.

증가된 병독성이 orf2[10]의 복수의 카피의 도입에 기인한 것이므로, orf2의 추정 기능을 찾아냈다. Orf2-folC 오페론에 선행하는 5' 유전자간 영역의 가상 환경 분석은, 예측된 2차 구조의 존재가 테트라하이드로폴레이트 리보스위치와 강한 상동성을 나타낸다는 것을 밝혀냈다 (도 3). 테트라하이드로폴레이트 리보스위치는 테트라하이드로폴레이트 (THF)에 결합하는 특정 세균에서의 상동성 RNA의 부류이다^[18]. 이것은 단백질 암호화 유전자의 가능한 5 '비번역 영역에 거의 배타적으로 위치하고 있으며, 이들 유전자의 대부분은 폴레이트 수송체 또는 폴레이트 대사에 관여하는 효소를 암호화하는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로, RNA가 리보스위치로서 기능하는 것으로 추측된다. THF 리보스위치는 다양한 퍼미큐티스, 구체적으로는 클로스트리듐 목 (클로스트리디알레스 (Clostridiales)) 및 락토바실러스 목 (락토바실알레스 (Lactobacillales)), 보다 드물게는 기타 세균의 계통에서에서 발견된다. THF 리보스위치는 비교 게놈학을 기반으로 하는 프로젝트에서 발견된 다수의 보존된 RNA 구조 중 하나이었다^[19]. 폴레이트 대사와의 관계는, 스트렙토코쿠스 수이스에서 folC의 업스트림 유전자가 폴레이트 수송체, 즉, FolT를 암호화하는 것을 증명하는 유드 (Eudes) 등에 의해 확인되었다^[20]. 이러한 주석은 스트렙토코쿠스 수이스의 새로운 게놈 서열, 즉, SC070731에도 적용되었으며, 여기서, ssu0135의 상동 유전자는 FolT (GenBank AGG63648.1)를 암호화하는 것으로 주석을 붙였다. 락토바실러스 브레비스의 폴레이트 에너지-커플링 인자 수송을 위한 3차원 구조를 결정하고^[21], 폴레이트 수송체의 다단백질 모델의 제안에 이르렀다. 본 모델에서, ORF2/FolT는 막관통 기질-특이적 결합 단백질로서 기능한다. 보다 포괄적인 막관통 단백질 및 에너지-커플링 모듈을 형성하는 2종의 뉴클레오타이드-결합 단백질과 함께, 이러한 복합체는 폴레이트의 막관통 수송를 촉진한다. 기질-결합 단백질 (FolT)만이 폴레이트에 특이적이며, 기타 구성요소는 또한 티아민 또는 리보플라빈과 같은 기타 기질의 수송에 사용된다. 스트렙토코쿠스 수이스의 FolT의 단백질 서열을 기타 유기체의 추정 FolT 서열과 비교할 때, 보존된 아미노산이 또한 스트렙토코쿠스 수이스에서 보존된다는 것은 명백하였다^[21] (도 4). 흥미롭게도, 도 4는 또한 사람 폴레이트 수송체 뿐만 아니라 에세리키아 콜라이에서도 매우 보존된 아르기닌을 도시한다. 도 4에서, 적색은 작은 소수성 아미노산 (방향족 -Tyr 포함)을 나타내고; 청색은 산성 아미노산을 나타내고; 자홍색은 염기성 아미노산을 나타내고; 녹색은 하이드록실, 설프하이드릴, 아민 및 Gly를 나타낸다. 테트라사이클린 수송체도 또한 스트렙토코쿠스 수이스 (Arg99) folT에서 보존되었으며, 상기 잔기는 사람 내지 세균 범위의 수송체에 중요한 것으로 제안하였다^[22]. 종합해 보면, 이러한 데이터는, 보완 전략을 사용하여 확인된, 미지의 기능의 보존된 단백질, 즉, ORF2가 폴레이트 수송체를 촉진하는 기질 결합 단백질을 암호화한다는 것을 강력히 시사한다.

스트렙토코쿠스 수이스에서의 폴레이트 수송

P1/7 (균주 10의 게놈과 매우 상동임)의 서열 분석은, 스트렙토코쿠스 수이스가 고전적인 폴레이트 생합성 경로를 통해 테트라하이드로폴레이트 (THF)를 합성하는데 필요한 모든 효소를 암호화한다는 것을 나타낸다 (도 5). KEGG 데이터베이스 (www.kegg.jp)에 근거하면, 스트렙토코쿠스 수이스에서의 폴레이트 대사는 도식에 기술된 바와 같이 folE, folQ, folB, folK, folC, folA 및 기질 GTP, p-아미노벤조에이트 (PABA) 및 글루타밀 (GLU)을 사용하는 고전적인 폴레이트 경로를 이용한다. 그러나, V[10] 오페론에 존재하는 추가의 유전자를 이용하여, 스트렙토코쿠스 수이스는 folT의 발현을 유도하여 폴레이트를 직접 도입할 수 있으며, FolC의 추가의 카피의 동시 유도된 발현을 이용하여, 폴레이트를 최종 생성물 테트라하이드로폴레이트 (THF)로 즉시 처리할 수 있다. 이러한 방식으로, folT와 folC의 조합은 THF의 생산을 허용하는 추가의 "지름길"을 형성한다. folT-folC 오페론의 업스트림 THF 리보스위치의 존재는, folT-folC 오페론이 특정 조건, 예를 들어, 폴레이트 불충분 조건하에서만 발현된다는 것을 암시할 수 있는 이러한 2종 유전자 오페론의 엄격한 조절을 시사한다. 상기에서 기재된 동물 실험의 결과에 근거하면, folT-folC 오페론은 적어도 생체내 조건하에 발현되는 것이 제안된다.

스트렙토코쿠스 수이스에서의 folT의 존재와 발현

혈청형 32 및 34를 제외하고 시험된 모든 스트렙토코쿠스 수이스 혈청형에서 folT 유전자의 존재를 증명하였다. 그러나, 혈청형 32 및 34를 스트렙토코쿠스 수이스 대신에 스트렙토코쿠스 오리스라티 (Streptococcus orisratti)의 속에 속하도록 재할당하였다^[1]. 따라서, 결론적으로, 모든 스트렙토코쿠스 수이스 혈청형은 FolT 및 FolC를 암호화하는 유전자를 갖는 것으로 간주된다.

orf2의 추정 프로모터의 서열 분석은, 균주 S735 (TGGTCA)와 비교하여, 균주 10 (TGGACA)에서의 추정 프로모터의 -35 영역에서 하나의 뉴클레오타이드 위치에서의 차이를 나타냈다^[14]. qPCR 분석을 사용하여, 균주 10 및 S735에서 orf2 및 folC의 발현 수준에 대한 당해 SNP의 영향을 결정하였다. 균주 S735와 비교하여, 균주 10에서 orf2 뿐만 아니라 folC의 유의하게 높은 수준의 발현을 관찰하였다 (도 6a). 이것은, 추정 프로모터의 -35 영역에서의 SNP가 orf2 및 folC의 전사에 영향을 미친다는 것을 명확하게 나타낸다. 따라서, 이것은 확인된 SNP가 실제로 오페론에서 rf2 및 folC를 공동으로 전사하는 프로모터 영역에 위치한다는 것을 증명한다. 더욱이, pCOM1-orf2[10]의 S735로의 도입은, pCOM1의 도입과 비교하여, orf2의 발현을 31배 증가시킨 반면, pCOM1-orf2[S735]의 도입은 orf2의 발현을 단지 5배만 증가시켰다 (도 6b). 예상한 바와 같이, folC의 발현 수준은 재조합 균주 둘 다에서 유사하였다 (도 6b). 프로모터의 -35 영역에서 확인된 SNP가 균주 S735 및 10에서 orf2의 전사에서의 차이에 대해 책임이 있는지를 확인하기 위해, orf2[S735]의 TGGTCA를 orf2[10]의 프로모터에서 발견되는 바와 같은 TGGACA로 돌연변이시켰다 (균주 S735-pCOM1-orf2[S735][t488a] 수득). S735-pCOM1-orf2[S735][t488a]에서의 orf2의 전사 수준은 상이한 성장 단계에서 S735-pCOM1-orf2[10] 균주의 것과 유사하고 S735-pCOM1-orf2[S735] 균주의 것 보다 4배 더 높은 것으로 나타났다 (도 6c). 2종의 프로모터는, 토드 헤위트 브로쓰에서 배양할 때, 스트렙토코쿠스 수이스의 성장 단계 초기에 가장 활성이다 (도 6c). 종합해 보면, 이러한 결과는, 균주 10에서의 orf2-folC 오페론의 업스트림 프로모터가 -35 영역에서의 SNP로 인해 S735 균주에서 당해 오페론의 업스트림 프로모터 보다 더 강력하다는 것을 명확하게 증명한다.

orf2-folC 오페론의 발현 증가와 연관된 SNP가 스트렙토코쿠스 수이스의 특정 클론 유형 또는 혈청형과 관련되는지 여부를 결정하기 위해, 다수의 분리주의 프로모터 영역을 서열 분석하였다 (표 3). 사용된 모든 분리주는 최근에 CGH 및 MLST에 의해 특성화되고 분류되었다^[23]. 수득된 서열 데이터에 근거하여, 분리주는 2가지 주요 그룹으로 나누어 질 수 있다 (표 3). 강력한 -35 프로모터 영역은, CGH 클러스터 A 및 MLST 클론 복합체 1에 속하고 EF-단백질을 발현하는 혈청형 1 및 2 분리주에서 배타적으로 발견되었다. 보다 낮은 프로모터 활성과 관련된 SNP는, EF의 발현에 대해 모두 음성인, CGH 그룹 B에 속하는 혈청형 7 및 9 분리주 (2종 제외)에서 뿐만 아니라, 보다 큰 형태의 EF 단백질 (EF^*)의 발현에 대해 양성인 CGH 그룹 A/클론 복합체 1 (Clonal Complex 1: CC1)에 속하는 혈청형 2의 약병독성 분리주에서도 발견되었다. 2가지의 예외가 있었으며; CC1에 속하지만 EF-단백질을 발현하지 않는 혈청형 7 분리주 (C126)는, 보다 강력한 프로모터에 연결된 SNP와, 프로모터 강도가 미확인된 상이한 -35 프로모터 서열 (TTGTCA)을 갖는 혈청형 7 분리주 (7711)를 함유하였다. 결론적으로, EF 단백질 (및 1종의 혈청형 7 분리주)을 발현하는 CC1 분리주만이 강력한 프로모터 활성과 연관된 SNP를 함유한다. 표현형과 유전자형의 이러한 조합의 분리주는 병독성과 상관 관계가 강하게 있기 때문에^{[23, 24]}, 본 발명자들은 orf2-folC 오페론의 강력한 업스트림 프로모터가 스트렙토코쿠스 수이스의 병독성 분리주와 관련되어 있다고 결론 내릴 수 있다. 이러한 관찰은, folT[10]의 추가의 카피의 도입 후에 관찰된 병독성 증가와 함께, 카피 수의 증가 또는 강력한 프로모터로 인한 folT의 발현의 증가가 스트렙토코쿠스 수이스에서 병독성을 증가시킨다는 것을 시사한다.

배양물에서 folT의 추가의 카피를 함유하거나 folT를 함유하지 않는 스트렙토코쿠스 수이스의 성장

시험관내에서 모 균주와 비교하여, folT 의 추가의 카피를 함유하거나 folT 를 함유하지 않는 스트렙토코쿠스 수이스의 배양물에서 성장에서의 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다.

FolT의 단백질 발현

FolT의 단백질 서열에 근거하여, FolT는 적어도 5개의 막관통 도메인을 갖는 매우 소수성의 단백질인 것으로 예측되었다. 상동성 모델링 (Expacy 서버)은 6종의 공지의 FolT 구조를 사용하였으며, 락토바실러스 브레비스 로부터 유래된 FolT의 공개 3D 구조 중에서 스트렙토코쿠스 수이스의 FolT에 대한 3D 구조가 예측되었다 (도 7).

FolT는 생체내에서 생존에 중요하다: folT 녹아웃 균주 10ΔfolT의 병독성

약병독성 스트렙토코쿠스 수이스 균주에서 folT의 과발현이 병독성의 강력한 증가를 초래하였기 때문에, 본 발명자들은 FolT가 생체내에서 중요한 역할을 한다고 가설을 세웠다. 이러한 가설이 사실인지 여부를 시험하기 위해, 스펙티노마이신 내성 카세트를 folT 유전자에 삽입하여 병독성 스트렙토코쿠스 수이스 균주 10에서 동종 녹아웃을 작제하였다. folT 및 folC가 오페론 구조에 존재하기 때문에, 아마도 이러한 녹아웃을 folC의 추가의 카피에 대해서도 또한 녹아웃시킬것이다. 폴레이트 수송이 생체내에서 병독성에 필수적인지 여부를 결정하기 위해, 실험 1에서, 10 마리의 돼지를 야생형 균주 10 또는 녹아웃 균주 10ΔfolT로 정맥내 감염시켰다. 모든 돼지는 체온의 상승과 함께 접종에 반응하였다 (도 8). 그러나, 야생형 균주 10으로 감염된 돼지는, 녹아웃 균주 10ΔfolT로 감염된 돼지와 비교하여, 보다 긴 시간 동안 보다 높은 온도를 나타냈다. 이것은 또한 두 그룹 사이의 발열 지수 (돼지가 발열을 나타내는 관측의 백분율)에서의 차이에 의해서도 반영된다 (p = 0.06). 이것은, 야생형 균주와 비교하여, 10ΔfolT 균주가 덜 화농성인 것을 시사한다. 이것은, 현저하게 적은 세균이 10ΔfolT 균주로 감염된 새끼 돼지의 혈액으로부터 단리되었다는 사실의 결과일 수 있다. 10ΔfolT 균주로 감염된 2 마리의 돼지만이, 균주 10으로 감염된 5 마리의 돼지와 비교하여, 짧은 균혈증 기간을 나타냈으며; 균주 10으로 감염된 돼지는 또한 보다 오랜 기간 동안 혈액에서 현저하게 보다 많은 수의 세균을 보유하였다 (도 9). 이것은, 10ΔfolT 균주가 혈액으로부터 보다 효율적으로 제거되거나, 혈액에서 생존할 수 없다는 것을 시사한다. 백혈구 수치는, 야생형 균주 10으로 감염된 돼지가 보다 오랜 기간 동안 백혈구 (white blood cell: WBC)의 보다 력한 증가를 나타냈다. 균주 10으로 감염된 모든 돼지는 WBC 증가를 나타냈지만, 10ΔfolT 균주로 감염된 돼지 중 단지 1 마리만이 WBC 증가를 나타냈다. WBC 지수의 계산치는 그룹 사이에 유의미한 차이가 있다 (표 5). 2개의 그룹 사이의 생존율은 유의미한 차이가 있었다: 균주 10으로 감염된 돼지의 평균 생존은 감염 후 2.6일이었으며, 10ΔfolT 균주로 감염된 돼지는 감염 후 6.2일 생존하였다. (도 10). 예정된 인도적인 종료 시점에 도달했을 때 돼지를 안락사시켰지만, 생존은 감염의 중중도를 반영한다. 도 10에 도시된 바와 같이, 생존 곡선은 그룹 사이에 현저한 차이가 있다. 육안 병리학에 의하면, 균주 10으로 감염된 돼지 중 4/5가 관절염, 늑막염, 심막염 또는 복막염과 같은 스트렙토코쿠스 수이스 감염에 대한 특이적 임상 징후를 나타낸 반면, 10ΔfolT 균주로 감염된 돼지 중 3/5이 특이적 임상 징후를 나타낸 것으로 밝혀졌다. 감염된 모든 장기의 세균학적 검사에 의하면, 더 많은 장기가 10ΔfolT 균주와 비교하여 야생형 균주 10에 대한 더 높은 세균 부하에 의해 콜로니화된 것으로 밝혀졌다 (도 11).

제2 동물 실험 (실험 2)은 일반적으로 실험 1에서 생성된 데이터를 확인하였다. 제1 실험에서와 같이, 야생형 균주 10 및 균주 10ΔfolT 분리주의 생존 곡선은 현저하게 차이가 있었다. 실험 2에서, 균주 10ΔfolT로 접종된 모든 동물은 실험의 종료까지 생존하였으나, 균주 10으로 접종된 동물 중 60%를 실험 과정에서 안락사시켜야 했다 (도 12). 또한, 임상 징후 (예를 들어, 온도, 보행 및 의식; 도 13, 14 및 15 참조)의 빈도 및 중증도는 야생형 균주 10 및 균주 10ΔfolT로 접종된 동물들 사이에 상당한 차이가 있었다. 부검에서 수득된 관절 및 복막에서의 육안 병리학적 병변의 빈도도 또한 야생형과 10ΔfolT 돌연변이 분리주 사시에서 상당한 차이가 있었다.

새끼 돼지에서의 감염 실험 결과에 근거하여, 동종 녹아웃 돌연변이 균주 10ΔfolT는 야생형 균주와 비교하여 강하게 약독화된 것으로 결론지어 졌다. 이것은, 폴레이트 수송체가 생체내 조건하에 세균의 생존에 필요하다는 것을 나타낸다. 2개의 연구 결과를 종합해 보면, 이들 실험은 ΔfolT 분리주가 모 균주와 비교하여 사망이 거의 없고 임상 징후가 최소이고 관절 염증 및 복막염의 빈도가 감소하였다는 것을 분명히 나타낸다. 따라서, ΔfolT 균주는 매우 약독화하고 안전한 것으로 결론 지어질 수 있다.

요약 결과 세균의 폴레이트 기질 결합 단백질을 암호화하는 DNA 영역에서 돌연변이, 결실 또는 삽입과 같은 변형이 제공된 세균 (세균의 ΔfolT 분리주 )을 포함하는 백신은 상기 상기 변형을 가지고 있지 않은 세균의 병독성 분리주에 의한 시험감염에 대해 숙주를 보호한다.

일반적으로 폴레이트 수송 및 폴레이트 합성을 할 수 있는 모 균주를 선택하고, 상기 세균의 폴레이트 기질 결합 단백질 (스트렙토코쿠스 수이스에서 folT 유전자로서 알려짐)을 암호화하는 DNA 영역에서 돌연변이, 결실 또는 삽입과 같은 변형을 갖기 위해 상기 모 균주로부터 세균을 선택하고, 시험관내에서 상기 모 균주와 유사한 속도로 성장하지만 생체내에서 상기 모 균주와 비교하여 감소된 속도로 성장하는 능력을 위해 상기 세균을 선택하는 것을 포함하는, 바람직하게는 백신에서 사용하기 위한, 바람직하게는 세균성 감염에 대한 보호를 발생시키기 위한 백신에서 사용하기 위한 세균을 생성하는 방법이 제공된다. 일반적으로 폴레이트 수송 및 폴레이트 합성을 할 수 있는 모 균주를 선택하고, 상기 세균의 폴레이트 기질 결합 단백질 (스트렙토코쿠스 수이스에서folT 유전자로서 공지됨)을 암호화하는 DNA 영역에서 돌연변이, 결실 또는 삽입과 같은 변형을 상기 세균에 제공함으로써 상기 모 균주로부터의 세균을 바람직하게는 재조합 수단에 의해 형질전환시키고, 시험관내에서 상기 모 균주와 유사한 속도로 성장하지만 생체내에서 상기 모 균주와 비교하여 감소된 속도로 성장하는 능력을 위해 상기 세균을 선택하는 것을 포함하는, 바람직하게는 백신, 바람직하게는 세균성 감염에 대한 보호를 발생시키기 위해 사용하기 위한 백신에서 사용하기 위한 세균을 생성하는 방법이 또한 제공된다. 본 출원에서 제공되는 바와 같은 이러한 세균은 이의 새로운 폴레이트 합성 경로를 적용함으로써 자기 자신의 사용을 위해 폴레이트를 생산할 수 있는 능력을 여전히 가지고 있다. 그러나, 놀랍게도, 이러한 합성 경로는 (배양에서) 시험관내 성장에 대한 능력에 영향을 주지 않은 채로 온전하게 남아 있기 때문에, 숙주에서 (생체내에서) 성장 및 병독성을 강하게 감소시키는 것으로 본 출원에서 밝혀졌다.

시험관내에서 잘 성장하지만 생체내에서 이의 모 균주보다 덜 성장하고 생체내에서 관련된 병독성이 강력하게 감소된 균주는, 백신 균주로서 매우 유용하다. 본 출원에 의해 제공되는 바와 같은 이러한 균주 또는 돌연변이체는, 한편으로는, 폴레이트 합성에서 본질적으로 영향을 받지 않으므로, 높은 역가로 성장할 수 있고, 이에 따라 상대적으로 용이하고 저렴하게 생산될 수 있으며, 다른 한편으로는, 이의 모 균주와 비교하여 이의 숙주에서 이의 감소된 성장 및 감소된 병독성으로 인해, 생체내 적용 후에 상대적으로 무해하며 세균 감염에 대한 백신으로서 매우 유용하다.

본 출원의 제1 시리즈의 실험에서, 스트렙토코쿠스 수이스에 대해 백신접종을 받지 않고 약물 첨가 사료를 결코 제공받지 않은 대략 3주령의 새끼 돼지 (Commercial Cross)를 효능 연구에 사용하였다. 동물은 등록시 PCR에 의해 스트렙토코쿠스 수이스 혈청형 2에 대해 편도 면봉 음성이었으며, PRRSV 음성 무리로부터 유래되었다. 2개의 처리군을 연구 장소에서 따로따로 수용하였다.

연구 장소에 도착시, 모든 동물로부터 혈액 및 편도 면봉을 수집하였다. 연구 0일째에, 적절한 순화 기간 후, 하나의 동물 그룹을 10ΔFolT 균주로 백신접종하였다. 또 다른 동물 그룹은 백신접종을 하지 않은 채로 남겨 두었다. 백신접종된 동물을 21일째에 동일한 용량의 돌연변이 분리주로 목의 우측에 각각 다시 백신접종하였다. 각 백신접종 후, 동물을 국소 및 전신 반응에 대해 관찰 하였다. 연구 35일째에, 두 그룹의 동물을 시험감염 균주 ATCC700794로 시험감염시키기 전에, 모든 동물로부터 혈액 및 편도 면봉을 수집하였다. 동물을 스트렙토코쿠스 수이스 관련 질병의 징후 (예를 들어, 체온 상승, 파행, 이상 거동 및 CNS 징후)에 대해 시험감염 후 7일 동안 관찰하였다. 사망한 채로 발견되거나 동물 복지를 이유로 오프-테스트 전에 안락사시켜야 했던 동물을 부검하였다. 부검 동안, 상기 동물을 스트렙토코쿠스 수이스 질병과 전형적으로 관련된 육안 징후 (예를 들어, CNS, 관절 및 흉강의 염증)에 대해 평가하고, CNS 면봉을 수집하였다. 또한, 시험감염 분리주의 회수를 위해 CNS 면봉을 수집하였다. 42일째에, 상기에서 기재된 바와 같이 나머지 모든 동물을 안락사시키고, 부검하고, 샘플을 수집하였다. 백신접종된 동물은 시험감염 후 스트렙토코쿠스 수이스 질병의 상당히 낮은 징후를 나타냈다.

제2 시리즈의 실험을 돼지 (Commercial Cross)에서 수행하였으며; 1차 백신접종일에, 돼지는 21±7일령이었다. 동물은 스트렙토코쿠스 수이스에 대해 백신접종받지 않았고, 스트렙토코쿠스 수이스 유형 2에 대해 편도 면봉 음성이었고, 혈청 검사에 의해 PRRSV 음성이었으며, 스트렙토코쿠스 수이스 유형 2에 대해 편도 면봉 음성인 암퇘지로부터 유래되었다. 연구 장소에 도착시, 모든 동물로부터 혈액 및 편도 면봉을 수집하였다. 연구 0일째에, 적절한 순화 기간 후, 하나의 동물 그룹을 ΔFolT2 균주로 목의 우측에 백신접종하였다. 또 다른 동물 그룹은 백신접종을 하지 않은 채로 남겨 두었다. 백신접종된 동물을 21일째에 동일한 용량의 돌연변이 분리주로 목의 우측에 각각 다시 백신접종하였다. 각 백신접종 후, 동물을 국소 및 전신 반응에 대해 관찰 하였다. 34일째에, 모든 동물로부터 혈액 및 편도 면봉을 수집한 다음, 엄격한 대조군 동물을 별도의 에어스페이스로 옮기는 동안 모든 기타 집단을 혼합하였다. 35일째에, 상기 동물을 대략 병독성 스트렙토코쿠스 수이스 유형 2 분리주로 복강내로 (ip) 시험감염시켰다.

시험감염 후 7일 동안, 스트렙토코쿠스 수이스와 관련된 질병의 징후에 대해 상기 동물을 관찰하였다. 사망한 채로 발견되거나 동물 복지를 이유로 오프-테스트 전에 안락사시켜야 했던 동물을 부검하였다. 부검 동안, 상기 동물을 스트렙토코쿠스 수이스 질병과 전형적으로 관련된 육안 징후에 대해 평가하고, CNS (즉, 뇌) 및 관절 면봉을 수집하였다. 오프-테스트에서, 나머지 모든 동물을 안락사시키고, 부검하고, 샘플을 수집하였다. ΔfolT2 돌연변이체에 의한 백신접종은 시험감염 후 관찰 기간 동안 사망하였거나 동물 복지를 이유로 안락사시켜야 했던 동물의 수를 감소시켰다. 부검 동안, 피브린 및/또는 체액의 존재로 표시되는 뇌의 염증 징후는, 음성 대조군과 비교하여, ΔfolT2 백신접종 동물에서 덜 빈번하게 관찰되었다. 스트렙토코쿠스 수이스 시험감염 분리주는, 음성 대조군과 비교하여, ΔfolT2 균주로 백신접종된 동물로부터 부검시 수집된 뇌 및 관절 면봉으로부터 덜 빈번하게 회수되었다.

참고문헌

표

기탁기관명 : 진균 배양 중앙 사무국

수탁번호 : CBS 140425

수탁일자 : 20150819

기탁기관명 : 웨스터디지크 진균 다양성 연구소

수탁번호 : CBS 143192

수탁일자 : 20170825

<110> Smith, Hilde Ingebritson, Alaina Neubauer, Axel de Greeff, Astrid <120> Attenuating bacterial virulence by attenuating bacterial folate transport <130> 3811-P111017US <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer comE1 <400> 1 cgagctcgga agaattggtt attgcgcgtg 30 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer comE3 <400> 2 cgggatcccg ggggatgacc tgttgcttg 29 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer comE3 <400> 3 tcccccgggg gagtcgtgtg tattcgacag cgg 33 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer comE4 <400> 4 tcccccgggg gacaagcaac aggtcatccc c 31 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer comE6 <400> 5 cgggatcccg gttgaatgcc cggcaagcc 29 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Orf2-fw <400> 6 ctacggctgg ttcttctatc gaa 23 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Orf2-rev <400> 7 gcaatcggtg tcatgataaa gg 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer folC-fw <400> 8 gtttgtccgt ccatcggttt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer folC-rev <400> 9 ctggtcggtc gcatagatga 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RecA-fw <400> 10 ggtttgcagg ctcgtatgat g 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RecA-rev <400> 11 accaaacatg acaccgactt ttt 23 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer t488a <400> 12 gaaaggtata gtttttagca agtggacaaa atatatagtg tgtgatacaa t 51 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer t488a_antisense <400> 13 attgtatcac acactatata ttttgtccac ttgctaaaaa ctataccttt c 51 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer V735-fw <400> 14 tatgcgcaat gacgtagtag aagg 24 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer M13-rev <400> 15 aacagctatg accatg 16 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 16 Phe Tyr Arg Lys Pro 1 5 <210> 17 <211> 168 <212> PRT <213> Clostridium bolteae <400> 17 Met Thr Lys Thr Lys His Met Val Trp Met Gly Ile Leu Ile Ala Val 1 5 10 15 Ser Ile Val Leu Ser Arg Phe Leu Ser Phe Ser Ala Trp Asn Val Lys 20 25 30 Ile Gly Phe Ala Phe Ile Pro Ile Val Ile Gly Ala Val Leu Phe Gly 35 40 45 Pro Val Gln Gly Gly Ile Ala Ala Ala Ala Ala Asp Phe Leu Gly Ala 50 55 60 Ile Leu Phe Pro Ile Gly Met Tyr Phe Pro Gly Phe Thr Val Thr Ala 65 70 75 80 Phe Leu Thr Gly Leu Thr Tyr Gly Ile Leu Leu His Lys Asn Arg Ser 85 90 95 Met Phe Arg Ile Ala Cys Ala Val Leu Ile Val Gln Leu Val Tyr Gly 100 105 110 Leu Leu Leu Asn Thr Cys Trp Ile Ser Leu Leu Tyr Gly Ala Pro Tyr 115 120 125 Leu Ala Leu Leu Ser Thr Arg Ile Val Gln Tyr Val Val Leu Ile Pro 130 135 140 Val Gln Phe Val Ile Ile Ala Arg Met Tyr Val Leu Gly Ser Lys Lys 145 150 155 160 Tyr His Ile Leu Gln Glu Asn Ser 165 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Val Gly Met Leu Leu Phe Pro Lys Ala Gly Tyr Phe Pro Gly Phe 65 70 75 80 Thr Leu Asn Ala Phe Leu Ala Gly Ala Ile Tyr Gly Tyr Phe Tyr Tyr 85 90 95 Lys Lys Glu Met Thr Trp Gln Arg Val Ile Leu Ala Thr Leu Leu Val 100 105 110 Thr Val Leu Ile Asn Ile Ile Leu Thr Pro Leu Trp Leu Ser Leu Met 115 120 125 Tyr Gly Val Asn Leu Ala Asn Phe Ala Trp Trp Val Pro Arg Leu Ile 130 135 140 Lys Thr Val Ile Phe Phe Pro Ile Gln Val Ile Ala Thr Tyr Tyr Leu 145 150 155 160 Gly Asn Lys Ile Pro Phe Lys Arg Leu Phe Gly Lys Pro Leu Ser Glu 165 170 175 Leu Asp Gln <210> 23 <211> 177 <212> PRT <213> Lactobacillus brevis <400> 23 Met Lys Thr Met Ala Lys Thr Gln Leu Pro Lys Leu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Met Val Thr Met Gly Val Leu Met Ala Leu Gln Leu Val Ile Ser Arg 20 25 30 Phe Ser Val Gly Asn Asn Phe Ile Lys Val Ser Phe Thr Phe Leu Ile 35 40 45 Val Ala Leu Ile Ala Lys Trp Phe Gly Pro Trp Trp Gly Met Leu Thr 50 55 60 Ala Ala Val Val Asp Val Ile Gly Thr Leu Met Thr Gly Gly Pro Phe 65 70 75 80 Phe Ile Gly Phe Thr Val Ser Ala Val Leu Gly Ser Leu Ile Tyr Ala 85 90 95 Val Phe Leu Tyr Arg Gln Pro Val Ser Trp Trp Arg Val Ile Gly Ala 100 105 110 Ser Val Leu Ile Ala Leu Leu Val Asn Thr Leu Leu Asn Thr Leu Trp 115 120 125 Val Thr Ile Met Tyr Gln Thr Pro Phe Trp Ser Leu Leu Pro Val Arg 130 135 140 Ala Leu Lys Glu Leu Ile Val Thr Pro Val Gln Ile Val Leu Val Tyr 145 150 155 160 Leu Leu Leu Lys Ser Gln Val Ile Gln Met Ile Gln Ala Arg Leu Asn 165 170 175 Lys <210> 24 <211> 186 <212> PRT <213> Streptococcus mutans <400> 24 Met Asn Thr Met Phe Lys Ser Pro Lys Leu Ser Pro Gln Arg Leu Val 1 5 10 15 Thr Leu Ala Met Leu Ile Ala Leu Ala Phe Ala Ile Gly Lys Phe Ser 20 25 30 Ile Pro Ile Ile Pro Gln Gln Leu Ile Ile Ser Pro Thr Phe Ile Val 35 40 45 Asn Val Met Ile Gly Met Ile Gly Gly Pro Ile Trp Ala Phe Ile Ser 50 55 60 Leu Ala Ile Leu Asp Ile Val Asp Asn Leu Ser Ser Gly Ala Gly Asn 65 70 75 80 Phe Ile Ile Trp Trp Thr Leu Leu Glu Ala Val Gln Gly Leu Phe Tyr 85 90 95 Gly Leu Phe Phe Tyr Gln Lys Ser Leu Ser Trp Thr Asn Lys Lys Asp 100 105 110 Trp Leu His Val Thr Ile Ala Thr Ala Ile Ile Met Leu Ile Gly Ser 115 120 125 Phe Ile Phe Thr Pro Leu Leu Val Gln Ile Tyr Tyr Gly Val Pro Phe 130 135 140 Trp Ala Gln Phe Ala Ala Gly Arg Trp Leu Lys Ile Phe Glu Ile Pro 145 150 155 160 Ile Arg Ile Leu Val Thr Met Ala Ile Met Pro Gln Leu Gln Arg Ile 165 170 175 Pro Glu Leu Arg Lys Leu Ala Asn Phe Lys 180 185 <210> 25 <211> 186 <212> PRT <213> Streptococcus gallolyticus <400> 25 Met Asn Leu Phe Phe Lys Thr Pro Lys Leu Thr Leu Lys Arg Leu Val 1 5 10 15 Ser Leu Ala Met Leu Ile Ala Leu Ala Phe Ile Val Gly Lys Phe Ser 20 25 30 Ile Pro Val Ile Pro Gln Gln Leu Val Val Ser Leu Thr Phe Ile Val 35 40 45 Asn Thr Ile Ile Gly Met Ile Gly Gly Pro Ile Trp Gly Phe Ile Ser 50 55 60 Leu Gly Ile Leu Asp Val Val Asp Thr Leu Ser Ser Ser Ser Ala Gly 65 70 75 80 Asn Phe Ile Ile Trp Trp Thr Leu Met Glu Ala Ile Gln Gly Phe Phe 85 90 95 Tyr Gly Leu Phe Phe Tyr Gly Lys Pro Leu Ser Trp Ser Ser Lys Lys 100 105 110 Asp Trp Leu His Val Thr Ile Ala Thr Val Val Ile Met Leu Ile Gly 115 120 125 Thr Phe Ile Leu Thr Pro Leu Leu Ile Gln Ile Tyr Phe Gly Val Pro 130 135 140 Phe Trp Ala Gln Tyr Leu Ala Gly Arg Trp Leu Lys Ile Phe Glu Ile 145 150 155 160 Pro Leu Arg Ile Ile Ile Thr Met Leu Val Ile Pro Arg Leu Gln Lys 165 170 175 Ile Pro Glu Leu Arg Lys Leu Ala Asn Leu 180 185 <210> 26 <211> 185 <212> PRT <213> Streptococcus uberis <400> 26 Met Pro Lys Gln Leu Tyr Phe Pro Lys Leu Thr Val Gln Arg Leu Val 1 5 10 15 Thr Leu Ala Met Leu Ile Ala Leu Ala Val Ile Val Ser Lys Phe Ser 20 25 30 Val Ser Ile Ile Pro Asn Gln Leu Val Ile Ser Phe Thr Phe Ile Val 35 40 45 Asn Thr Val Ile Gly Ile Ile Ala Gly Pro Phe Trp Ser Phe Ile Thr 50 55 60 Leu Ala Met Ile Asp Leu Ile Asp Ser Leu Met Gly Gly Thr Ser His 65 70 75 80 Phe Ile Ile Trp Trp Thr Val Met Glu Ala Phe Gln Gly Leu Leu Tyr 85 90 95 Gly Phe Phe Phe Tyr Lys Arg Pro Leu Arg Ser Asn Gln Lys Lys Asp 100 105 110 Trp Ile Tyr Val Ser Ala Val Thr Leu Val Ile Met Leu Phe Ser Thr 115 120 125 Phe Leu Ile Thr Pro Leu Leu Ile Gln Ile Tyr Phe His Val Pro Phe 130 135 140 Trp Ala Gln Tyr Ala Ala Gly Arg Trp Phe Lys Ile Phe Glu Ile Pro 145 150 155 160 Leu Arg Val Leu Leu Thr Met Phe Leu Ile Pro Pro Leu Gln Arg Ile 165 170 175 Pro Glu Ile Lys Lys Leu Ser Ala Leu 180 185 <210> 27 <211> 183 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 27 Met Glu Lys Lys Ile Pro Lys Leu Thr Val Gln Leu Leu Ala Ala Ile 1 5 10 15 Ala Met Thr Leu Ala Leu Val Met Ile Val Glu Asn Tyr Phe Ser Ile 20 25 30 Arg Ile Ser Asp Thr Leu Gln Val Gln Phe Thr Phe Ile Pro Asn Thr 35 40 45 Ile Leu Gly Ala Ile Ala Gly Pro Val Trp Ala Ala Val Phe Ala Ala 50 55 60 Ile Ser Asp Pro Val Phe Val Leu Phe Ser Gly Gln Thr Val Leu Phe 65 70 75 80 Thr Trp Ile Leu Ile Glu Ala Val Ser Ala Phe Ile Tyr Gly Trp Phe 85 90 95 Phe Tyr Arg Lys Pro Leu Asp Thr Lys Asn Lys Ala Asp Trp Leu Tyr 100 105 110 Val Ala Gly Val Val Val Leu Ile Gln Val Val Ile Ser Phe Ile Met 115 120 125 Thr Pro Ile Ala Leu His Phe His Phe Gly Thr Pro Trp Ile Val Leu 130 135 140 Tyr Ser Ser Arg Leu Ile Lys Ala Val Phe Glu Ile Pro Leu Arg Ile 145 150 155 160 Val Val Thr Met Leu Val Leu Pro Ser Leu Gln Lys Ile Pro Glu Leu 165 170 175 Ala Lys Leu Met Gly Ile Lys 180

Claims

폴레이트 (folate) 수송 능력이 감소된 세균의 ΔFolT 돌연변이체로서, 상기 능력이 폴레이트 수송체 (FolT) 기능을 기능적으로 제거시킴으로써 감소된, 세균의 ΔFolT 돌연변이체.
제1항에 있어서, 스트렙토코쿠스 (Streptococcus)로서, 바람직하게는 스트렙토코쿠스 수이스 (S. suis)로서 분류가능한, 세균의 ΔFolT 돌연변이체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 폴레이트 합성 능력을 갖는, 세균의 ΔFolT 돌연변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, FolT의 발현이 감소된, 세균의 ΔFolT 돌연변이체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 도메인 FYRKP의 돌연변이 또는 결실, 또는 펩타이드 도메인 FYRKP에서의 돌연변이 또는 결실, 또는 펩타드 도메인 FYRKP에서의 삽입, 바람직하게는 펩타이드 도메인 FYRKP에서의 R의 돌연변이를 갖는, 세균의 ΔFolT 돌연변이체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 2015년 8월 19일에 진균 배양 중앙 사무국 (Centraalbureau voor Schimmelcultures)에서 "CBS 140425 스트렙토코쿠스 수이스 ΔFolT 돌연변이체"로서 기탁된, 세균의 ΔFolT 돌연변이체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 2017년 8월 25일에 웨스터디지크 진균 다양성 연구소 (Westerdijk Fungal Biodiversity Institute)에서 "CBS 143192 스트렙토코쿠스 수이스 ΔFolT2 돌연변이체"로서 기탁된, 세균의 ΔFolT 돌연변이체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 세균의 배양물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 세균 또는 제8항의 배양물을 포함하는 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 세균 또는 제8항의 배양물을 포함하는 면역원성 조성물.
백신의 생산을 위한, 제9항 또는 제10항의 조성물의 용도.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 세균, 제8항의 배양물, 또는 제9항 또는 제10항의 조성물을 포함하는 백신.
하기를 포함하는, 스트렙토코쿠스 수이스 감염과 관련된 질병에 대해 동물, 바람직하게는 돼지를 백신접종하기 위한 키트:
a. 동물, 바람직하게는 돼지에게 백신을 투여하기 위한 디스펜서; 및
b. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 ΔFolT 돌연변이체 균주 또는 제8항에 따른 배양물 또는 제9항 또는 제10항에 따른 조성물; 및
c. 임의로, 설명 전단지.
2015년 8월 19일에 진균 배양 중앙 사무국에서 "CBS 140425 스트렙토코쿠스 수이스 ΔFolT 돌연변이체"로서 기탁된 세균 또는 이의 배양물.
2017년 8월 25일에 웨스터디지크 진균 다양성 연구소에서 "CBS 143192 스트렙토코쿠스 수이스 ΔFolT2 돌연변이체"로서 기탁된 세균 또는 이의 배양물.
세균의 폴레이트 수송 능력을 감소시키는 것을 포함하는, 세균의 병독성을 감소시키는 방법.
제16항에 있어서, 상기 세균이 새로운 폴레이트 합성을 할 수 있는, 세균의 병독성을 감소시키는 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 세균의 폴레이트 기질 결합 단백질 (FolT)의 발현 및/또는 기능을 약화시키는 것을 포함하는, 세균의 병독성을 감소시키는 방법.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병독성이 상기 세균의 foltT 유전자에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 제공함으로써 약독화되는, 세균의 병독성을 감소시키는 방법.
제19항에 있어서, 상기 병독성이 상기 foltT 유전자의 프로모터를 암호화하는 상기 세균의 DNA에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 제공함으로써 약독화되는, 세균의 병독성을 감소시키는 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 병독성이 폴레이트 기질 결합 단백질 (FolT)의 막관통 영역을 암호화하는 상기 세균의 DNA에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 제공함으로써 약독화되는, 세균의 병독성을 감소시키는 방법.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병독성이 기질 결합에 중요한 영역을 암호화하는 상기 세균의 DNA 영역을 암호화하는 FolT에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 제공함으로써 약독화되는, 세균의 병독성을 감소시키는 방법.
제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균이 퍼미큐티스 (Firmicutes), 바람직하게는 스트렙토코쿠스, 보다 바람직하게는 스트렙토코쿠스 수이스, 보다 바람직하게는 2015년 8월 19일에 진균 배양 중앙 사무국에서 "CBS 140425 스트렙토코쿠스 수이스 ΔFolT 돌연변이체"로서 기탁된 ΔFolT 돌연변이체, 가장 바람직하게는 2017년 8월 25일에 웨스터디지크 진균 다양성 연구소에서 "CBS 143192 스트렙토코쿠스 수이스 ΔFolT2 돌연변이체"로서 기탁된 ΔFolT 돌연변이체인, 세균의 병독성을 감소시키는 방법.
제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득가능하거나 수득되는 약독화된 병독성을 갖는 세균.
제24항에 따른 세균의 배양물.
제24항의 세균 또는 제25항의 배양물을 포함하는 조성물.
제24항의 세균 또는 제25항의 배양물을 포함하는 면역원성 조성물.
백신의 생산을 위한, 제25항의 배양물 또는 제26항 또는 제27항의 조성물의 용도.
제24항의 세균 또는 제25항의 배양물 또는 제26항 또는 제27항의 조성물을 포함하는 백신.
일반적으로 폴레이트 수송 및 폴레이트 합성을 할 수 있는 모 균주를 선택하고, 상기 세균의 폴레이트 기질 결합 단백질을 암호화하는 DNA에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 갖도록 하기 위해 상기 모 균주로부터 세균을 선택하고, 시험관내에서 상기 모 균주와 유사한 속도로 성장하지만 생체내에서 상기 모 균주와 비교하여 감소된 속도로 성장하는 능력을 위해 상기 세균을 선택하는 것을 포함하는, 세균을 생성하는 방법.
일반적으로 폴레이트 수송 및 폴레이트 합성을 할 수 있는 모 균주를 선택하고, 상기 세균의 폴레이트 기질 결합 단백질을 암호화하는 DNA에서 돌연변이, 결실 또는 삽입을 상기 세균에 제공함으로써 상기 모 균주로부터의 세균을 형질전환시키고, 시험관내에서 상기 모 균주와 유사한 속도로 성장하지만 생체내에서 상기 모 균주와 비교하여 감소된 속도로 성장하는 능력을 위해 상기 세균을 선택하는 것을 포함하는, 세균을 생성하는 방법.
제30항 또는 제31항에 따른 방법으로 수득가능하거나 수득되는 세균.
제32항에 있어서, 퍼미큐티스, 바람직하게는 스트렙토코쿠스, 보다 바람직하게는 스트렙토코쿠스 수이스로서 분류가능한, 세균.
제32항 또는 제33항에 따른 세균의 배양물.
제32항 또는 제33항의 세균 또는 제34항의 배양물을 포함하는 조성물.
제32항 또는 제33항의 세균 또는 제34항의 배양물을 포함하는 면역원성 조성물.
백신의 생산을 위한, 제35항 또는 제36항의 조성물의 용도.
제32항 또는 제33항의 세균 또는 제34항의 배양물 또는 제35항 또는 제36항의 조성물을 포함하는 백신.