JP2019533710A - 細菌の葉酸輸送の減弱による細菌毒性の弱毒化 - Google Patents

Abstract

本発明は、細菌感染症、そのような感染症に対するワクチンおよび細菌ワクチンに関する。より詳細には、本発明は、ブタにおける連鎖球菌感染症に対するワクチンに関する。葉酸を輸送する能力を低下させた細菌のΔＦｏｌＴ変異株であって、葉酸輸送体（ＦｏｌＴ）機能を機能的に欠失させることによりその能力が低下している、ΔＦｏｌＴ変異株を提供する。葉酸を輸送する細菌の能力を低下させるステップを含む、細菌の毒性を低下させる方法をさらに提供する。

Description

本出願は、細菌株、細菌感染症に対する薬剤、および細菌ワクチンに関する。より詳細には、ブタにおける連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）感染症に対するワクチンに関する。

植物、真菌、ある種の原生生物、および多くの細菌は、ＧＴＰおよびコリスミ酸から葉酸（ビタミンＢ９）を新規に生成するが、高等動物は、合成経路の鍵となる重要な酵素を欠いており、そのため食物性葉酸を必要とする。葉酸は、健康に重要であり、葉酸拮抗剤は、がん化学療法において広範に、また抗菌剤として使用されている。このような理由から、葉酸合成およびサルベージ経路は、モデル生物において広く特性が明らかとされており、細菌および植物両方の葉酸合成経路は、食物の葉酸含量を強化するために改変されている。テトラヒドロ葉酸は、多くの生合成酵素に必須の補助因子である。これは、メチオニン、プリン、グリシン、パントテン酸、およびチミジル酸のような重要な代謝物の合成において１炭素単位の担体として作用する。例えば、ｐａｎＢ遺伝子によりコードされる酵素、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼは、パントテン酸の前駆物質の合成にテトラヒドロ葉酸補助因子を必要とする。テトラヒドロ葉酸は、細菌において新規に合成されるため、その合成を阻害すると細胞が死滅する。実際、２つの非常に有効な抗生物質であるスルホンアミドおよびトリメトプリムは、テトラヒドロ葉酸の生成を遮断することにより細菌細胞を死滅させる。相互に組み合わせて使用されることが多い、このような２つの抗生物質は、尿路感染症、腸管感染症、例えば細菌性赤痢、および気道感染症の治療に一般に処方される。このような薬剤の成功は、テトラヒドロ葉酸合成の阻害物質に対して多くの病原菌が脆弱性を有することを意味している。細菌は、テトラヒドロ葉酸補助因子の合成に多段階経路を有する。この経路の１部門では、代謝物、コリスミ酸およびグルタミンは、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）遺伝子であるｐａｂＡおよびｐａｂＢによりコードされるアミノデオキシコリスミ酸シンターゼの基質であり、これは４−アミノ４−デオキシコリスミ酸を生成する。次いで、枯草菌ｐａｂＣによりコードされるアミノデオキシコリスミ酸リアーゼは、４−アミノ４−デオキシコリスミ酸を、重要な前駆物質であるパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）に変換する。別の部門では、枯草菌ｍｔｒＡ、ｆｏｌＡ、およびｆｏｌＫによりコードされるものを含む酵素のいくつかは、前駆物質２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチル−７，８−ジヒドロキスプテリジン二リン酸を生成する。この前駆物質およびＰＡＢＡは、枯草菌ｓｕｌ遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｄｈｐｓおよびｆｏｌＰ遺伝子と相同）によりコードされるジヒドロプロテイン酸シンテターゼの基質であり、これはジヒドロプロテイン酸を生成する。スルファメトキサゾール等のスルホンアミドは、ジヒドロプロテイン酸シンターゼの競合的阻害物質である。ジヒドロプロテイン酸は、枯草菌ｆｏｌＣによりコードされる二機能酵素により修飾されて、ジヒドロ葉酸を生成する。最終的には、枯草菌ｄｆｒＡによりコードされるＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）は、このジヒドロ葉酸を修飾して最終産物であるテトラヒドロ葉酸を産生する。トリメトプリムは、細菌ＤＨＦＲの競合的阻害物質である。この選択性は、真核生物ＤＨＦＲが抗生物質により妨げられないため重要である。葉酸は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）以外のすべての配列決定された細菌にとって、ほとんど確実に必須である。しかし、すべての細菌が葉酸を新規に合成するとは限らず、その代わりに外部供給に依存している。新規合成経路の欠如を予測するために、ＨＰＰＫ（ＦｏｌＫ）およびＤＨＰＳ（ＦｏｌＰ）タンパク質をシグネチャータンパク質として使用する。多くの細菌は、このような遺伝子両方の相同体を欠いており、そのため環境から取り入れたインタクトな葉酸の還元およびグルタミル化にほぼ確実に依存している。これらは、主に宿主関連細菌、例えばマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）もしくはトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）または葉酸に富んだ環境に生息する生物、例えば乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）である。

連鎖球菌種は、家畜およびヒトにおいて感染症を引き起こす広範な種があり、ランスフィールド群に従って分類されることが多い。とりわけ細菌の被膜中に存在する血清学的決定因子または抗原に基づいてランスフィールドによる分類を行い、近似決定のみを可能とする。異なる群由来の細菌は、相互に交差反応性を示すことが多いが、他の連鎖球菌は、群決定因子を帰属させることが全くできない。群の中には、血清型判定に基づいて、さらに分化可能であるものが多く、このような血清型は、連鎖球菌の広範な抗原多様性のさらなる一因となる。事実、これにより連鎖球菌感染症の診断および連鎖球菌感染症に対するワクチン接種において数々の困難が生じる。ランスフィールドＡ群連鎖球菌（ＧＡＳ、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ））は、小児によく見られ、鼻咽頭感染症およびその合併症を引き起こす。Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）は、ヒト新生児において細菌性敗血症および髄膜炎の主原因となり、途上国の新生児において顕著な病原として浮上している。ランスフィールドＢ群連鎖球菌（ＧＢＳ）はまた、ウシと関連することが分かっており、乳腺炎を引き起こす。ランスフィールドＣ群感染症、例えば腺疫菌（Ｓ．ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）他による感染症は、ウマ、ウシおよびブタに主に見られる。ランスフィールドＤ群（ウシ連鎖球菌（Ｓ．ｂｏｖｉｓ））感染症は、すべての哺乳類およびいくつかの鳥類に見られ、心内膜炎または敗血症を生じることがある。ランスフィールドＥ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、ＵおよびＶ群（ストレプトコッカス・ポルシナス（Ｓ．ｐｏｒｃｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・カニス（Ｓ．ｃａｎｉｓ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ）は、様々な宿主に見られ、新生児感染症、鼻咽頭感染症または乳腺炎を引き起こす。ランスフィールドＲ、Ｓ、およびＴ群（ならびに非分類型）では、ブタ連鎖球菌（Ｓ．ｓｕｉｓ）が見られ、これは若齢ブタにおける髄膜炎、敗血症、関節炎および突然死の重要な原因である。これはまた、ヒトにおいて髄膜炎を偶発的に引き起こし得る。非分類連鎖球菌種、例えばヒトにおいて齲蝕の原因となるミュータンス菌（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、ウシにおいて乳腺炎の原因となるストレプトコッカス・ウベリス（Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）、および侵襲性疾患、例えば肺炎、菌血症、および髄膜炎の原因となる肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）がある。

ブタ連鎖球菌は、人畜共通病原体であり、養豚産業におけるブタ集団中に偏在的に存在する。３３種の莢膜血清型が現在までに報告されており^[1]、血清型１、２、７、９および１４は、欧州において罹患ブタから多く単離されている^[2]。菌株の毒性は、血清型間および血清型中で異なり、血清型２中では、毒性、無毒性ならびに弱毒性の単離株は単離されており、これは毒性マーカー、ムラミダーゼ放出タンパク質（ＭＲＰ）および細胞外因子（ＥＦ）^[3]ならびにスリシン^[4、5]の発現に基づいて識別することができる。成体ブタにおけるブタ連鎖球菌の鼻咽頭保菌は無症候性であるが、若齢の仔ブタにおいては、この鼻咽頭保菌によりブタ連鎖球菌侵襲性疾患に対する感受性が高まり、髄膜炎、関節炎および漿膜炎、ならびに高い致死率が生じる。西洋諸国では、ブタまたは生の豚肉に職業的に触れるヒトはまた、ブタ連鎖球菌により感染する可能性があるが、この発生率は非常に低い。ヒトが浸潤性ブタ連鎖球菌に感染すると、ブタと同様の臨床徴候を生じ、患者は回復後も依然として難聴を患うことが多い^[6]。東南アジアでは、特に血清型２のブタ連鎖球菌は、ヒトに対する新興病原体と考えられており、細菌性髄膜炎の主因と認識されている^[7-10]。東南アジアでは、ブタ連鎖球菌によるヒト感染症の臨床徴候が、世界の他の地域と比較して、より重篤であると報告されており、患者は、毒素性ショック様症候群、敗血症および髄膜炎を発症する。ブタ連鎖球菌に起因する疾患の病態形成については、ほとんど知られていない。種々の細菌成分、例えば細胞外膜および細胞膜関連タンパク質は、病態形成において１つの役割を果たす。さらに、被膜が、このような微生物を食作用抵抗性とすることによって重要な毒性因子となることが示されている。ブタにおいてブタ連鎖球菌感染症を予防する現在の方法では、自家ワクチンによるワクチン接種方法を併用した罹患ブタの抗生物質療法を含む^[11]。血清型２に対するバクテリンワクチンによる自家ワクチン接種は、農場における臨床的アウトブレイクを減少させることが可能であると示されているが、これは血清型９には当てはまらず、この場合、自家ワクチン接種は、効果的に防御するとは考えられない^[12、13]。バクテリンワクチンが血清型９感染症に対して有効性が低いことに加えて、これらは、ワクチンに存在する血清型に対してのみ防御可能である。しかし、上述のように、いくつかの血清型が疾患を引き起こし得るため、自家ワクチンは、臨床的アウトブレイクに対する一時的な解決法となっている。ブタ連鎖球菌感染症に対する長期的な解決法として、すべての（病原性）血清型から広範に防御するワクチンが必要とされている。適切なワクチン候補を発見するために多くの研究がなされているが、交差防御可能なワクチンは、未だ提供されていない。

葉酸輸送および葉酸合成が一般に可能である親細菌株を選定するステップと、細菌の葉酸基質結合タンパク質をコードするＤＮＡ領域（ブタ連鎖球菌ではｆｏｌＴ遺伝子として知られる）において変異、欠失または挿入等の修飾を施すためにこの親菌株から細菌を選定するステップと、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは親菌株と同様の割合まで増殖するがｉｎ ｖｉｖｏでは親菌株と比較して低い割合まで増殖する能力を有する細菌を選定するステップとを含む、好ましくはワクチンにおける使用のため、好ましくは細菌感染症に対する防御をもたらすワクチンにおける使用のための細菌を生成する方法を提供する。葉酸輸送および葉酸合成が一般に可能である親細菌株を選定するステップと、好ましくは組換手段により、細菌の葉酸基質結合タンパク質をコードするＤＮＡ領域（ブタ連鎖球菌ではｆｏｌＴ遺伝子として知られる）において変異、欠失または挿入等の修飾を細菌に施すことにより、この親菌株由来の細菌を形質転換するステップと、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは親菌株と同様の割合まで増殖するがｉｎ ｖｉｖｏでは親菌株と比較して低い割合まで増殖する能力を有する細菌を選定するステップとを含む、好ましくはクチンにおける使用のため、好ましくは細菌感染症からの防御をもたらすワクチンにおける使用のための細菌を生成する方法をさらに提供する。本発明の選定もしくは形質転換方法で得ることができる、または得られた細菌、細菌培養物をさらに提供する。本明細書において提供する細菌は、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、好ましくは連鎖球菌、より好ましくはブタ連鎖球菌として分類可能であることが好ましい。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは親菌株と同様の割合まで増殖可能であるがｉｎ ｖｉｖｏでは親菌株と比較して低い割合まで増殖する、細菌または細菌の培養物を含む組成物をさらに提供する。このような組成物をワクチンの生成に使用することをさらに提供する。好ましくは、このようなワクチンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは親菌株と同様の割合まで増殖可能であるがｉｎ ｖｉｖｏでは親菌株と比較して低い割合まで増殖する、細菌または細菌の培養物を含む。

葉酸を輸送する細菌の能力を低下させるステップを含む、細菌、好ましくは新規に葉酸合成が可能である細菌の毒性を低下（弱毒化）させる方法をさらに提供する。本明細書においてΔＦｏｌＴ変異株と一般に呼ぶ細菌を提供し、詳細には、葉酸輸送体（ＦｏｌＴ）機能を機能的に欠失させることによりこの能力が強力に低下している、ブタ連鎖球菌株を本明細書において提供する。この細菌は、本明細書において提供する場合、その新規葉酸合成経路を適用することにより、それ自体の使用のための葉酸を生成する能力を依然として有する。このような合成経路をインタクトのままとすると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（培地中）では増殖するその能力が影響されないままとなるが、驚いたことに、宿主（ｉｎ ｖｉｖｏ）におけるその増殖および毒性が強力に低減したことが示される。このような細菌株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは良好に増殖するがｉｎ ｖｉｖｏではその親菌株ほど増殖せず、ｉｎ ｖｉｖｏでの毒性の強力な低下と関連し、ワクチン株として非常に有用である。本明細書により提供するこのような菌株または変異株では、一方では、葉酸合成において本質的に影響されず、したがって高力価まで増殖可能であり、そのため生成が比較的容易かつ安価であるが、他方では、親菌株と比較して宿主における増殖が減少し毒性が低下するため、ｉｎ ｖｉｖｏでの適用後に比較的無害であり、細菌感染症に対するワクチンとして極めて有用となる。

葉酸基質結合タンパク質をコードするＤＮＡ領域（ブタ連鎖球菌ではｆｏｌＴ遺伝子として知られる）において修飾を施され、培地中（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）では親菌株と同様の増殖率を有するがｉｎ ｖｉｖｏでは親菌株に対して低い増殖率を有する、プロトタイプΔＦｏｌＴ変異株は、「ＣＢＳ１４０４２５ブタ連鎖球菌ΔＦｏｌＴ変異株」として、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓにおいてブダペスト条約の法規に基づいた特許手続きを目的として２０１５年８月１９日に寄託されている。葉酸基質結合タンパク質をコードするＤＮＡ領域（ブタ連鎖球菌ではｆｏｌＴ遺伝子として知られる）において修飾を施され、培地中（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）では親菌株と同様の増殖率を有するがｉｎ ｖｉｖｏでは親菌株に対して低い増殖率を有する、別のプロトタイプΔＦｏｌＴ変異株は、「ＣＢＳ１４３１９２ブタ連鎖球菌ΔＦｏｌＴ２変異株」として、Ｗｅｓｔｅｒｄｉｊｋ Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて２０１７年８月２５日に寄託されている。

細菌の新規葉酸合成の能力は、当分野において既知の方法、例えば、葉酸を与えた培養培地と比較して、葉酸を与えない培養培地中で細菌の増殖を試験することにより、またはBMC Genomics 2007, 8:245（doi:IO.1186/1471-2164-8-245、参照により本明細書に組み込む）において検討されている他の方法により容易に試験することができる。ほとんどの細菌は、テトラヒドロ葉酸を獲得するための少なくとも２つの独立した経路を有し、１つは古典的な葉酸合成経路に従い、１つは葉酸を移入する葉酸輸送体を使用した迅速な方法に従う。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、古典的な合成経路を使用して利用可能な、十分な栄養素およびエネルギーがあることを本明細書においてここで提示する。理論により拘束されることは望まないが、発明者らにより見出された作用の可能な説明を提供すると、ｉｎ ｖｉｖｏでは、栄養素を欠き、したがってエネルギーを欠き得る場合、古典的経路によるＴＨＦ生成に投資することは、はるかに困難となり得る。そこで、葉酸を移入する代替法を選択することが考えられる。進行中の実験に基づいて、発明者らは、ｆｏｌＴの発現は、恐らく疎水性が高いため、細菌にとって負担であると仮定する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ｆｏｌＴの発現が増加すると、増殖率が低下する。これは恐らくｆｏｌＴの発現が、リボスイッチの存在により非常に厳密に制御されているためである。ｆｏｌＴは、絶対必要な場合にのみ発現するはずである。まとめると、栄養素の利用可能性およびＴＨＦの必要条件とタンパク質発現の負担との間にバランスが存在すると考えられる。このバランスをｉｎ ｖｉｔｒｏで片側に傾けると新規葉酸合成が増加し、ｉｎ ｖｉｖｏで反対側に傾けると葉酸輸送を増加することが、本発明において発明者らによりここで見出される。驚くべきことに、ｉｎ ｖｉｖｏ経路において葉酸輸送を減弱（低下）させる、好ましくは葉酸輸送体機能を機能的に欠失させることによりｉｎ ｖｉｖｏ経路において葉酸輸送をノックアウトすると、培地中ではなく宿主において細菌毒性が減少する。好ましい実施形態では、葉酸を輸送する能力が低下した細菌のΔＦｏｌＴ変異株であって、この能力が葉酸輸送体（ＦｏｌＴ）機能を機能的に欠失させることにより低下している、ΔＦｏｌＴ変異株を提供する。詳細には、細菌のｆｏｌＴ遺伝子において、または遺伝子のプロモーターにおいて変異、欠失または挿入を施すことにより、詳細には、細菌の葉酸基質結合タンパク質（ＦｏｌＴ）の発現および／または機能を減弱（低下）させる方法を本明細書において提供する。このような変異、欠失または挿入は、当分野において既知のようにＰＣＲおよび／または配列解析により検出することができる。本発明の特定の実施形態では、ｆｏｌＴ遺伝子をノックアウトして、ブタ連鎖球菌等の細菌を大幅に弱毒化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで容易に培養することもできるワクチン株としてｉｎ ｖｉｖｏでの使用に適したものとする方法を提供する。別の実施形態では、好ましくは、ＦｏｌＴの免疫原性を本質的にインタクトのままとしながら、最も好ましくは、ＦｏｌＴの親水性タンパク質ドメインを本質的にインタクトのままとしながら、葉酸基質結合タンパク質ＦｏｌＴの膜貫通領域をコードする細菌のＤＮＡにおいて変異、欠失または挿入を施すことにより毒性を減弱させる方法を提供する。別の実施形態では、基質結合に重要な領域である、ひと続きのアミノ酸ＦＹＲＫＰ（配列番号１６）を有するペプチドドメインを特徴とするブタ連鎖球菌における領域をコードする細菌のＤＮＡ領域をコードするＦｏｌＴにおいて変異、欠失または挿入を施すことにより毒性を減弱させる方法を提供する。ＦＹＲＫＰ（配列番号１６）のひと続きにおいてアルギニン（Ｒ）を少なくとも変異させて葉酸結合を消失させることが好ましい。本発明の好ましい方法では、細菌は、ファーミキューテス、好ましくは連鎖球菌、より好ましくはブタ連鎖球菌として分類可能である。本発明のΔＦｏｌＴ変異株は、葉酸を合成する能力を有していることが好ましく、このような合成経路をインタクトのままとするとｉｎ ｖｉｔｒｏ（培地中）で増殖する能力が影響されないままとなるが、宿主（ｉｎ ｖｉｖｏ）における毒性が強力に低下し、ワクチンへの使用に非常に適したものとなる。本発明のΔＦｏｌＴ変異は、ＦｏｌＴの発現が減弱して（減少して、または妨害されて）おり、例えば、ＦｏｌＴそれ自体の発現の減少または分子量が低下したＦｏｌＴ変異株タンパク質の発現を特徴とし、例えば、本明細書の実験セクションに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳試験における変異株の試験ＦｏｌＴ特異的ヌクレオチド構築物により試験され得ることが好ましい。特定の好ましい一実施形態では、「ＣＢＳ１４０４２５ブタ連鎖球菌ΔＦｏｌＴ変異株」としてＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおいて２０１５年８月１９日に寄託されている、本発明のΔＦｏｌＴ変異株を提供する。別の特定の好ましい実施形態では、「ＣＢＳ１４３１９２ブタ連鎖球菌ΔＦｏｌＴ２変異株」としてＷｅｓｔｅｒｄｉｊｋ Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて２０１７年８月２５日に寄託されている、本発明のΔＦｏｌＴ変異株を提供する。

別の特定の好ましい実施形態では、本発明のΔＦｏｌＴ変異株を提供する。さらなる細菌ΔＦｏｌＴ変異株を用いた発現試験における対照構築物としてΔＦｏｌＴ変異ヌクレオチド構築物を用意するために、このような寄託物の任意のものを使用して、ＦｏｌＴ変異株遺伝子発現またはＦｏｌＴ変異株タンパク質発現を試験することもできる。本発明のΔＦｏｌＴ変異細菌培養物、またはΔＦｏｌＴ変異細菌培養物を含む組成物を用意するために、このような寄託物の任意のものを使用することもできる。本明細書において提供する方法で得ることができる、または得られた、毒性を減弱させた細菌、およびこのような細菌の培養物をさらに提供する。本発明のΔＦｏｌＴ変異細菌またはΔＦｏｌＴ変異株培養物を含む組成物、およびワクチンの生成のためのこのような組成物の使用をさらに提供する。本明細書において提供するΔＦｏｌＴ変異細菌またはΔＦｏｌＴ変異培養物を含む、ワクチンをさらに提供する。好ましい実施形態では、非連鎖球菌タンパク質の発現が可能なΔＦｏｌＴ変異株を含む、連鎖球菌ワクチン株またはワクチンを提供する。このようなベクター連鎖球菌ΔＦｏｌＴ変異ワクチン株により、ワクチンに使用した場合、連鎖球菌以外の病原体からの防御が可能となる。その無毒性特性のため、本明細書において提供する連鎖球菌ワクチン株またはΔＦｏｌＴ変異株は、連鎖球菌抗原に対してだけでなく、この菌株により発現する他の抗原に対しても、特異的かつ持続的な免疫応答を生じるのに適合する。詳細には、さもなければ宿主に有害である抗原または病原体の有害作用もなく、別の病原体由来の抗原をここで発現させる。このようなベクターの例は、連鎖球菌ワクチン株またはΔＦｏｌＴ変異株であり、この場合この抗原は、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、大腸菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、セルプリナ（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ）等の病原体に由来する。連鎖球菌ワクチン株またはΔＦｏｌＴ変異株および薬学的に許容される担体もしくはアジュバントを含む、ワクチンをさらに提供する。担体またはアジュバントは、当分野において周知であり、例としては、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水、水中油（中水）エマルジョン、水酸化アルミニウム、Ｓｐｅｃｏｌ、ブロックポリマーまたはコポリマー等が挙げられる。本発明のワクチンは、死菌形態または生形態いずれかのワクチン株を含むことができる。例えば、連鎖球菌もしくは異種抗原等の毒性因子を（過剰）発現した株を含む死菌ワクチンは、免疫応答の誘発に非常に適合する。特定の実施形態では、その無毒性特性のため菌株が生きているワクチンを提供し、本明細書において提供するΔＦｏｌＴ変異株をベースとする連鎖球菌ワクチン株は、特異的かつ持続的免疫応答を生じるのに適合する。集団における連鎖球菌疾患を制御または根絶する方法であって、本発明のΔＦｏｌＴ変異ワクチンを集団の対象にワクチン接種するステップを含む、方法をさらに提供する。ブタ連鎖球菌の病態形成および／または毒性において重要な役割を有するオペロンをブタ連鎖球菌が有することを本明細書において提示する。オペロンは、葉酸の獲得および葉酸のテトラヒドロ葉酸へのプロセシングに関与する２つの遺伝子をコードする。葉酸は、水溶性ビタミンＢ群の一般用語であり、この場合、葉酸は、種々のテトラヒドロ葉酸誘導体を指す。このような誘導体は、直接またはテトラヒドロ葉酸への最初の還元およびメチル化後、主要な葉酸代謝サイクル入ることができる。葉酸は、すべての生きた生物、原核生物および真核生物の両方に必須であり、葉酸代謝を重要なプロセスとしている。ｆｏｌＴ−ｆｏｌＣオペロンは、例えばｉｎ ｖｉｖｏで、宿主がそれ自体の使用のために葉酸を隔離するように、回避経路を形成して、葉酸制限条件下で葉酸を獲得すると考えられる。このような条件下では、ｆｏｌＴ−ｆｏｌＣオペロンの発現は、リボスイッチにより誘導される。葉酸レベルが低下した場合、リボスイッチを開放させて、そこからテトラヒドロ葉酸を放出する。これは、リボソーム結合部位の解放による翻訳の開始を可能とする。ｆｏｌＴ−ｆｏｌＣの発現は、葉酸輸送複合体によりブタ連鎖球菌が葉酸を直接移行し、続いてｆｏｌＣにより葉酸をテトラヒドロ葉酸にプロセシングすることを可能とする。葉酸がヌクレオチド合成に重要であるため、葉酸を獲得すると、ブタ連鎖球菌の増殖率に対して直接的に影響する。ｉｎ ｖｉｖｏ増殖率の低下により、毒性の低下が生じる。ＣＢＳ１４０４２５として、またはＣＢＳ１４３１９２として寄託されている変異株等のｆｏｌＴの同系ノックアウト変異株が強力に弱毒化され、ワクチンとして有用であることを実証することにより、この知見がさらに支持された。オペロンは、ｉｎ ｖｉｖｏ病態形成に実際に関与する。本明細書に記載の本発明は、このような変異株および培養物、ならびに毒性が低下したこのようなＦｏｌＴノックアウト変異株を含む組成物およびワクチンをここで提供する。このように毒性が低下した細菌を含む免疫原性組成物、およびワクチンの生成のためのこのような組成物の使用をさらに提供する。さらに、ΔＦｏｌＴ変異細菌株、例えばＣＢＳ１４０４２５として、またはＣＢＳ１４３１９２として寄託されている変異株を含むワクチン、またはその培養物もしくは組成物を本明細書において提供する。ワクチンを動物、好ましくはブタへ投与するためのディスペンサーと、ΔＦｏｌＴ変異株、例えばＣＢＳ１４０４２５として、またはＣＢＳ１４３１９２として寄託されている本発明の変異株、またはその培養物もしくは組成物と、任意選択で使用説明書とを含む、ブタ連鎖球菌感染に関連する疾患に対する動物、好ましくはブタへのワクチン接種用のキットをさらに提供する。結論として、葉酸を輸送する細菌の能力を低下させるステップを含む、細菌の毒性を低下させる一般的な方法であって、詳細には、細菌が新規葉酸合成の能力を有する、適用可能な方法を提供する。本発明の方法は、機能的な葉酸基質結合タンパク質を有する細菌を選定するステップと、次いで、細菌の葉酸基質結合タンパク質（ＦｏｌＴ）の発現および／または機能を減弱させるステップであって、詳細には、細菌のｆｏｌＴ遺伝子において変異、欠失または挿入を施すことにより、例えば、ｆｏｌＴ遺伝子のプロモーターをコードする細菌のＤＮＡにおいて変異、欠失または挿入を施すことにより毒性を減弱させる、ステップとを含む。本発明の特定の実施形態では、葉酸基質結合タンパク質ＦｏｌＴの膜貫通領域をコードする細菌のＤＮＡにおいて変異、欠失または挿入を施すことにより毒性を減弱させることが好ましい。別の特定の実施形態では、基質結合に重要な領域をコードする細菌のＤＮＡ領域をコードするＦｏｌＴにおいて変異、欠失または挿入を施すことにより毒性を減弱させる。さらに、免疫原性組成物またはワクチンを得る方法であって、細菌がファーミキューテス、好ましくは連鎖球菌、より好ましくはブタ連鎖球菌、より好ましくは「ＣＢＳ１４０４２５ブタ連鎖球菌ΔＦｏｌＴ変異株」としてＣｅｎｔｒａａｌ ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおいて２０１５年８月１９日に寄託されているΔＦｏｌＴ変異株、最も好ましくは「ＣＢＳ１４３１９２ブタ連鎖球菌ΔＦｏｌＴ２変異株」としてＷｅｓｔｅｒｄｉｊｋ Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて２０１７年８月２５日に寄託されているΔＦｏｌＴ変異株である、細菌に適用可能な方法を本明細書において提供する。ＦｏｌＴ発現を減弱させることにより毒性を減弱させる本発明の方法で得ることができる、または得られた、毒性を減弱させた細菌をさらに提供し、このような細菌の培養物、および毒性が低下したこのような細菌を含む組成物または毒性が低下したこのような細菌の培養物、および毒性が低下した細菌を含む免疫原性組成物または毒性が低下した細菌の培養物を提供し、ＦｏｌＴ発現を減弱させたこのような細菌の培養物またはＦｏｌＴ発現を減弱させた細菌培養物の組成物のワクチンの生成のための使用を提供する。ＦｏｌＴ発現を減弱させた細菌もしくはＦｏｌＴ発現を減弱させた細菌の培養物を含む、またはＦｏｌＴ発現を減弱させた細菌の培養物の組成物を含む、ワクチンをさらに提供する。ａ）ワクチンを動物へ投与するためのディスペンサーと、ｂ）ＦｏｌＴ発現を減弱させた特定の細菌の同系ノックアウト株（変異株）、もしくはＦｏｌＴ発現を減弱させた特定の細菌の同系ノックアウト株の培養物、またはＦｏｌＴ発現を減弱させた特定の細菌の同系ノックアウト株の培養物を含む組成物と、ｃ）任意選択で使用説明書とを含む組成物を含む、ＦｏｌＴ発現感染能を有する特定の細菌に関連する疾患に対する動物へのワクチン接種用のキットをさらに提供する。ＦｏｌＴ発現の減弱が施され、葉酸を輸送する能力が低下した、本発明のこのような特定の細菌であって、葉酸輸送体（ＦｏｌＴ）機能を機能的に欠失させることによりこの能力が低下している、細菌は概して、葉酸を合成する能力を有する本発明のΔＦｏｌＴ変異株を使用する場合は特に、培養培地中で良好な増殖特性を有し、このような合成経路をインタクトのままとすると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（培地中）で増殖する能力が影響されないままとなるが、宿主（ｉｎ ｖｉｖｏ）における毒性が強力に低下し、ワクチンへの使用に非常に適したものとなる。

Ｖ［１０］が、２つの不完全ＯＲＦ（灰青色の矢印）ならびにオペロンの推定プロモーターが先行するｏｒｆ２［１０］およびｆｏｌＣ［１０］を含む推定オペロン（紫）を含む、相補性試験法を使用して同定されたクローンを示す図である（明確には、推定プロモーターの−３５領域（ＴＧＧＡＣＡ）の配列のみを図に示す）。オペロンの推定プロモーター領域の推定−３５領域（紫）が先行するｏｒｆ２［１０］またはｆｏｌＣ［１０］のいずれか（紫）を含んだ構築物を生成した。推定Ｓ７３５プロモーターの−３５領域（ＴＧＧＴＣＡ）（緑）を有する菌株Ｓ７３５由来のｏｒｆ２（緑）を含む構築物を生成した。同構築物を変異誘発して菌株１０の推定プロモーター配列の−３５領域（ＴＧＧＡＣＡ）（紫）を含有させ、ｏｒｆ２［Ｓ７３５］［ｔ４８８ａ］を得た。 ＦｏｌＣおよびＯＲＦ２／ＦｏｌＴのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳を示す図である。対照構築物ｐＣＯＭ１（レーン１）、および構築物ｐＣＯＭ１−Ｖ［１０］（レーン２）、およびｐＣＯＭ１−ｆｏｌｃ［１０］（レーン３）のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳。分子量マーカーをｋＤａで右側に示す。ＦｏｌＣ発現は４６．８ｋＤａの予測量で検出し（閉矢頭）、一方、ＯＲ２／ＦｏｌＴの発現は予測量（２０．５ｋＤａ）よりも低い分子量１４ｋＤａで検出した（開矢頭）。 Ｒｆａｍを使用したテトラヒドロ葉酸の予測リボスイッチを示す図である。ＲＮＡの３次元構造により、２つの推定リボソーム結合部位（青色矢印）は、折りたたまれているためリボソームの接近が難しいリボスイッチであることが示された。 種々のＦｏｌＴ配列のＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを示す図である。＊は同一のアミノ酸を示し、：は強類似性を有する群間の保存性を示し、．は弱類似性を有する群間の保存性を示す。ＣＢ＝クロストリジウム・ボルテアエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ）（配列番号１７）、ＣＰ＝クロストリジウム・フィトフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）（配列番号１８）、ＡＭ＝アルカリフィルス・メタリレディジェンス（Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｉｇｅｎｓ）（配列番号１９）、ＴＴ＝サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）（配列番号２０）、ＥＦＭ＝エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）（配列番号２１）、ＥＦＳ＝エンテロコッカス・フェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（配列番号２２）、ＬＢ＝ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（配列番号２３）、ＳＭ＝ミュータンス菌（配列番号２４）、ＳＧ＝ストレプトコッカス・ガロリティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（配列番号２５）、ＳＵＢ＝ストレプトコッカス・ウベリス（配列番号２６）、ＳＳＵ＝ブタ連鎖球菌Ｐ１／７（配列番号２７）を示す。 ブタ連鎖球菌における葉酸代謝を示す図である。ブタ連鎖球菌の推定葉酸代謝の模式図である。 ブタ連鎖球菌野生型単離株および変異株におけるｏｒｆ２およびｆｏｌＣの発現レベルを示すグラフである。Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培地中で指数関数的に増殖した、ブタ連鎖球菌野生型単離株である菌株１０（黒色棒グラフ）およびＳ７３５（白色棒グラフ）におけるｏｒｆ２およびｆｏｌＣの発現レベル（パネルＡ）、およびＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培地中で指数関数的に増殖した、空の対照プラスミドｐＣＯＭ１（黒色棒グラフ）、ｏｒｆ２［１０］（白色棒グラフ）またはｏｒｆ２［Ｓ７３５］（斜線棒グラフ）で補完した菌株Ｓ７３５におけるｏｒｆ２およびｆｏｌＣの発現レベル（パネルＢ）を示す。初期対数期（ＥＥＰ）（白色棒グラフ）、対数期（ＥＰ）（細斜線棒グラフ）、後期対数期（ＬＥＰ）（粗斜線棒グラフ）および静止期（ＳＰ）（黒色棒グラフ）までＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培地中で培養後、ｏｒｆ２［１０］、ｏｒｆ２［Ｓ７３５］およびｏｒｆ２［Ｓ７３５］［ｔ４８８ａ］で補完したＳ７３５におけるｏｒｆ２の発現レベル（パネルＣ）を示す。発現レベルは、ｑＰＣＲを使用して定量し、ハウスキーピング遺伝子ｒｅｃＡに対する相対発現値として示した。実験を３回ずつ実施した。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。有意性は、対応ｔ検定により判定した。^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１である。 ブタ連鎖球菌のＦｏｌＴタンパク質の予測３次元構造を示す図である。 実験１のブタ連鎖球菌感染後の仔ブタの体温を示すグラフである。野生型菌株１０（ピンク）または菌株１０ΔｆｏｌＴ（ＣＢＳ１４０４２５）のいずれかに感染した仔ブタ（ｎ＝５）の平均体温を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 実験１のブタ連鎖球菌感染後の仔ブタの菌血値を示すグラフである。野生型菌株１０（ピンク）または菌株１０ΔｆｏｌＴ（ＣＢＳ１４０４２５）（青色）のいずれかに感染した仔ブタ（ｎ＝５）の平均菌血値を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 実験１のブタ連鎖球菌に感染した仔ブタの生存曲線を示すグラフである。野生型菌株１０または菌株１０ΔｆｏｌＴ（ＣＢＳ１４０４２５）のいずれかにブタを感染させた。倫理的理由から所定の人道的エンドポイントにこれらが達した場合、ブタを安楽死させた。対数順位（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用して統計学的分析を行った。 実験１のブタ連鎖球菌に感染した仔ブタの細菌学的検査を示すグラフである。野生型菌株１０または菌株１０ΔｆｏｌＴ（ＣＢＳ１４０４２５）のいずれかにブタを感染させた。段階希釈およびプレーティングにより細菌を数え上げた。細菌数をＣＦＵ／ｍｌとして算出した。種々の色は、種々の各仔ブタを示した。 実験２のブタ連鎖球菌に感染した仔ブタの生存曲線を示すグラフである。野生型菌株１０または菌株１０ΔｆｏｌＴ（ＣＢＳ１４０４２５）のいずれかに仔ブタ（ｎ＝１０）を感染させた。倫理的理由から所定の人道的エンドポイントにこれらが達した場合、ブタを安楽死させた。 実験２のブタ連鎖球菌感染後の仔ブタの体温を示すグラフである。野生型菌株１０（青色）または菌株１０ΔｆｏｌＴ（ＣＢＳ１４０４２５）（緑色）のいずれかに感染した仔ブタ（ｎ＝１０）の平均体温を示す。 実験２のブタ連鎖球菌感染後の仔ブタの歩行運動を示すグラフである。野生型菌株１０（青色）または菌株１０ΔｆｏｌＴ（ＣＢＳ１４０４２５）のいずれかに感染した仔ブタにおける陽性観察結果の割合を示す。歩行運動重症度１：軽度の跛行、２：中程度の跛行または立ち上がろうとしない、３：重度の跛行（人道的エンドポイントとして扱う）を示す。 実験２のブタ連鎖球菌感染後の仔ブタの意識状態を示すグラフである。野生型菌株１０（青色）または菌株１０ΔｆｏｌＴ（ＣＢＳ１４０４２５）のいずれかに感染した仔ブタにおける陽性観察結果の割合を示すグラフである。意識状態重症度１：鬱、２：アパシー、３：昏睡を示す。 ΔＦｏｌＴ２菌株（ＣＢＳ１４３１９２）によるブタへのワクチン接種およびブタ連鎖球菌血清型２への曝露後の防御を示すグラフである。１日目および２１日目にΔＦｏｌＴ２株（ＣＢＳ１４３１９２）をブタにワクチン接種した。３５日目に、約２×１０⁹ＣＦＵの毒性ブタ連鎖球菌血清型２単離株を腹腔内（ｉｐ）投与により動物に曝露した。曝露後７日間、ブタ連鎖球菌と関連する疾患の徴候について動物を観察した。致死していた動物または動物福祉のためオフテスト前に安楽死させる必要があった動物を剖検した。数値は、曝露後に致死した動物または安楽死させた動物の割合（致死率）を示す。 ΔＦｏｌＴ菌株（ＣＳＢ１４０４２５）によるブタへのワクチン接種およびブタ連鎖球菌血清型２への曝露後の防御を示すグラフである。１日目および２１日目にΔＦｏｌＴ菌株（ＣＢＳ１４０４２５）をブタにワクチン接種した。３６日目に、約２×１０⁹ＣＦＵの毒性ブタ連鎖球菌血清型２単離株を腹腔内投与により動物に曝露した。曝露後７日間、ブタ連鎖球菌と関連する疾患の徴候について動物を観察した。致死していた動物または動物福祉のためオフテスト前に安楽死させる必要があった動物を剖検した。数値は、曝露後に致死した動物または安楽死させた動物の割合（致死率）を示す。

導入
これまでに発明者らは相補性試験法を使用して、ワクチン候補として作用し得る新規の毒性因子を同定した。この試験法を使用して、感染後の仔ブタにおいて重度の毒素性ショック様症候群を引き起こし、感染後２４時間以内に死に至らせる^[14]、強毒性ブタ連鎖球菌単離株（Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［１０］）を生成した。毒性血清型２単離株（菌株１０）由来のランダムにクローン化されたゲノムＤＮＡ断片を有する約３０，０００種の貯蔵したクローンから単離したプラスミドＤＮＡによる形質転換の後、Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［１０］を弱毒性血清型２単離株（Ｓ７３５）で生成したクローンのライブラリから選定した。菌株１０由来のゲノム断片のプラスミドライブラリを含む菌株Ｓ７３５を仔ブタに感染させることにより、毒性が高まった単離株を選定した。感染した仔ブタから単離した１つの流行性クローンは、Ｖ［１０］と名付けた菌株１０由来のゲノム断片３ｋｂを含んでおり、後続の動物実験において強毒性であると実証された。Ｖ［１０］は、不完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、続いて、オペロン構造ならびに第２の不完全なＯＲＦ中に２つの遺伝子（ｏｒｆ２およびｆｏｌＣ）を含んでいた。全長ＯＲＦのみが、この単離株の強毒性に寄与し得ると仮定して、発明者らはｏｒｆ２−ｆｏｌＣ−オペロンの特性をさらに明らかにした。オペロン中の第１のＯＲＦは、アノテーションすることができず、ポリホリルポリグルタミン酸シンターゼ（ＦｏｌＣ）をコードする遺伝子に対して相同性を示すオペロン中の第２のＯＲＦとしてｏｒｆ２と名付けた。このオペロンは、親菌株Ｓ７３５を含む、すべてのブタ連鎖球菌血清型に存在した。毒性の低い菌株Ｓ７３５は、菌株１０と比較してｏｒｆ２−ｆｏｌＣおよび非コード領域中にいくつかの一塩基多型（ＳＮＰ）を含んでいた。毒性が高まったオペロンの両遺伝子は、推定毒性因子である可能性があり、そうである場合、推定ワクチン候補となり得る。ここで発明者らは、１）ｏｒｆ２−ｆｏｌＣ−オペロンの強毒性がｏｒｆ２によって、もしくはｆｏｌＣによって、またはその両方によって起こるのかどうか、および２）ｏｒｆ２−ｆｏｌＣ−オペロンのプロモーター領域における一塩基多型の毒性に対する作用を検討した。

材料と方法
細菌株およびプラスミド
ブタ連鎖球菌をＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ培地（Ｏｘｏｉｄ製、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）で培養し、６％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウマ血液を含むＣｏｌｕｍｂｉａ血液ベース寒天プレート（Ｏｘｏｉｄ製）上に播種した。大腸菌をＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈで培養し、１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の寒天を含むＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ上に播種した。必要に応じて、エリスロマイシンをブタ連鎖球菌に１μｇ ｍｌ^-1、大腸菌に２００μｇ ｍｌ^-1加えた。この試験において使用する、菌株１０由来のゲノム断片（Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［１０］）３ｋｂを含むプラスミドで補完したブタ連鎖球菌株Ｓ７３５、および他のブタ連鎖球菌は、これまでに説明している^[14]（図１）。

（例１）ブタ連鎖球菌株Ｓ７３５の相補性試験
菌株１０由来のオペロンの推定プロモーター領域が先行する、Ｖ［１０］オペロン中の２つのＯＲＦ（すなわちｏｒｆ２［１０］またはｆｏｌＣ［１０］）のうちの１つを含むプラスミドｐＣＯＭ１で、またはｏｒｆ２およびＳ７３５由来の同族の上流プロモーター（ｏｒｆ２［Ｓ７３５］）を含むプラスミドｐＣＯＭ１でＳ７３５を補完した（図１）。このようなプラスミドを構築するために、制限部位を有するプライマーをｏｒｆ２［１０］もしくはｏｒｆ２［Ｓ７３５］（ｃｏｍＥ１〜ｃｏｍＥ２）、ｆｏｌＣ［１０］（ｃｏｍＥ４〜ｃｏｍＥ６）またはオペロンのプロモーター領域（ｃｏｍＥ１〜ｃｏｍＥ３）を増幅するように設計した（表１）。得られたＰＣＲ産物ｏｒｆ２［１０］およびｏｒｆ２［Ｓ７３５］を制限酵素ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩを使用して分解し、ｐＫＵＮ１９^[15]にクローン化し、同制限酵素で分解し、続いてｐＣＯＭ１にクローン化して、それぞれｐＣＯＭ１−ｏｒｆ２［１０］およびｐＣＯＭ１−ｏｒｆ２［Ｓ７３５］を得た。ｆｏｌＣ［１０］のＰＣＲアンプリコンを制限酵素ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩを使用して分解し、同制限酵素で切断されるｐＫＵＮ１９にクローン化した。Ｖ［１０］のプロモーター領域を含むＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｃＩおよびＳｍａＩを使用してｆｏｌＣ［１０］の前でクローン化した。続いて、プロモーターＶ［１０］−ｆｏｌＣ［１０］の完全な断片をＳａｃＩおよびＢａｍＨＩを使用してｐＫＵＮ１９から分解し、同制限酵素で切断されるｐＣＯＭ１にクローン化して、ｐＣＯＭ１−ｆｏｌＣ［１０］を得た。プロモーター−ｆｏｌＣ［１０］の融合産物が転写されたことを確認するために、³⁵Ｓ−メチオニンを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳を実施した。ＦｏｌＣの分子量（４６．８ｋＤａ）の明白なバンドが検出され、融合産物が発現し、翻訳され得ることを実証した（図２）。すべてのプラスミドをエレクトロポレーションによりブタ連鎖球菌株Ｓ７３５に導入した。さらに、ｐＣＯＭ１−Ｖ［１０］をエレクトロポレーションにより無毒性血清型２菌株Ｔ１５に導入してＴ１５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［１０］を得た。

（例２）相補単離株による実験感染
帝王切開で誕生した無菌仔ブタの実験感染を既報のように^[14]実施した。感染前に、６％のウマ血液を含むＣｏｌｕｍｂｉａ寒天プレート上に扁桃腺のスワブを播種することにより仔ブタの無菌状態を確認した。簡潔には、１週齢の無菌ブタ４または５匹を１０⁶コロニー形成単位（ＣＦＵ）のブタ連鎖球菌に静脈内投与により感染させ、次いで、４０ｍｇ ｋｇ^-1体重のエリスロマイシン（エリスロマイシン−ステアリン酸塩、Ａｂｂｏｔｔ Ｂ．Ｖ．製、Ａｍｓｔｅｌｖｅｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を１日２回、直ちに経口投与して、ｐＣＯＭプラスミドを有するブタ連鎖球菌単離株に対する選択圧を保った。感染したブタを１日２回、臨床徴候および細菌学的分析のために採取した扁桃腺スワブについてモニターした。ブタ連鎖球菌による感染の後、関節炎、髄膜炎、または敗血症の臨床徴候が見られた場合、ブタを安楽死させた。ＣＮＳ、漿膜および関節の組織試料を剖検の間に採取し、均質化し、６％のウマ血液および１μｇ ｍｌ^-1のエリスロマイシンを含むＣｏｌｕｍｂｉａ寒天プレート上に段階希釈物を播種することにより細菌細胞数を定量した。本明細書に含まれる種々の動物実験からの結果を比較可能とするために、非特異的および特異的症状の一律の採点法をすべての動物実験に適用した。非特異的症状は、食欲不振および鬱を含んでおり、これは０（無）、０．５（軽度の食欲不振／鬱）または１（重度の食欲不振／鬱）で採点された。特異的症状には、これらはすべて敗血症または漿膜炎の症状であるため、跛行、中枢神経系（ＣＮＳ）症状（循環動作すなわち円を描いて歩行すること、後弓反張、眼振のような運動性障害）ならびに逆毛、円背（脊柱後湾症）および震えが含まれた。このような観察結果に基づいて、特異的または非特異的症状のいずれかが見られた観察結果の数を、このパラメータについての観察結果の総数で割ることにより臨床的指標を算出した。これは、特異的または非特異的症状のいずれかが見られた観察結果の割合を示す。「発熱指標（Ｆｅｖｅｒ Ｉｎｄｅｘ）」に同様の方法を採用した。発熱は、体温＞４０℃と定義した。「平均致死日数」を生存パラメータとして使用した。人道的エンドポイント（ＨＥＰ）に達した後、動物を安楽死させたが、接種からＨＥＰ到達までの期間は、感染の重症度を同様に意味している。これは、接種から致死までの日数の生存率を平均することにより算出する。

Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ ＵＲ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、ＮＬのＣｅｎｔｒａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（現在はＷａｇｅｎｉｎｇｅｎ Ｂｉｏｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＷＢＶＲ）と呼ばれる）の施設で菌株ＣＢＳ１４０４２５による動物実験を実施し、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ ＵＲ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、ＮＬのＣｅｎｔｒａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの倫理委員会により動物実験に関するオランダ法規（＃８０９．４７１２６．０４／００／０１および＃８７０．４７１２６．０４／０１／０１）に従って承認された。菌株ＣＢＳ１４０４２５および１４３１９２による動物実験もまた、動物実験に関する米国法規に従って実施した。

群の臨床的指標（発熱指標、特異的症状および非特異的症状）について、群間で分散の均一性がなかったため、ノンパラメトリックなＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を使用して統計学的分析を実施した。後続の分析では、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を使用して、３パラメータすべてについて、すべての群を対で対照群（Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１）と比較した。差異は、ｐ＜０．０５で統計学的に有意であるとみなされた。ＳＰＳＳ１９（ＩＢＭ製、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）を使用して算定を行った。

（例３）菌株１０ΔｆｏｌＴ（ＣＢＳ１４０４２５）による実験感染、実験１
４週齢の仔ブタ１０匹を動物５匹の２群としてＣＶＩ動物施設で飼育した。仔ブタは、餌および清浄水を自由に得ることができた。温暖な光および遊具を与えられた動物が実験を通して利用可能であった。実験の開始前に仔ブタの扁桃腺スワブをＰＣＲによりブタ連鎖球菌血清型２のコロニー形成に関してスクリーニングした。ＰＣＲ陰性仔ブタのみが実験の対象となった。１０日後、１．１×１０⁶ＣＦＵの野生型菌株１０または９．２×１０⁵ＣＦＵの変異株１０ΔｆｏｌＴのいずれかに、頸静脈からの静脈内投与により動物を感染させた。感染前に仔ブタの基礎体温を３日の期間毎日モニターした。感染前にＥＤＴＡ血液を採取して感染前血漿試料、ならびに白血球（ＷＢＣ）数の基礎レベルを得た。感染したブタを１日３回、午後８時、午前３時および午前９時に臨床徴候についてモニターした。非特異的症状には、食欲不振および鬱が含まれ、一方、特異的症状には、跛行、中枢神経系（ＣＮＳ）症状（循環動作すなわち円を描いて歩行すること、後弓反張（ｏｐｉｓｔｏｔｏｎｕｓ）、眼振のような運動性障害）ならびに逆毛、円背（脊柱後湾症）および震えが含まれ、これらはすべて敗血症または漿膜炎の症状であった。扁桃腺および糞便スワブを毎日、細菌学的分析のために採取した。血液を毎日、細菌学的分析、ＷＢＣ計数および血漿採取のために採取した。ブタ連鎖球菌による感染の後、関節炎、髄膜炎、または敗血症の臨床徴候が見られた場合、ブタを安楽死させた。剖検では、内臓（腎臓、肝臓、脾臓、腹膜および心膜）を６％のウマ血液を含むＣｏｌｕｍｂｉａ寒天プレート上に播種することによりブタ連鎖球菌について細菌学的にスクリーニングした。化膿性関節炎、心膜炎または腹膜炎のようなブタ連鎖球菌に肉眼的に感染している臓器を段階希釈で播種して細菌量を測定した。このような臓器の組織試料を組織学的検査のためにホルマリン中に固定した。動物実験は、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ ＵＲ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓのＣｅｎｔｒａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの倫理委員会により動物実験に関するオランダ法規（＃２０１４０１１）に従って承認された。

（例４）菌株１０ΔｆｏｌＴ（ＣＢＳ１４０４２５）による実験感染、実験２
第２の実験では、約３週齢の仔ブタ（市販の交配種）を使用した。仔ブタは、ブタ連鎖球菌に対してワクチン接種されておらず、ＰＲＲＳＶ陰性群に由来しており、薬物混入飼料を一度も与えておらず、登録時、ブタ連鎖球菌血清型２についてＰＣＲにより扁桃腺スワブ陰性であった。処置群（各仔ブタ１０匹）を別々に飼育した。動物に３．４８Ｅ＋０７ＣＦＵの野生型菌株１０または１．４５Ｅ＋０７の変異株１０ΔｆｏｌＴのいずれかを静脈内投与により接種した。１日１回、ブタ連鎖球菌関連疾患の臨床徴候（例えば、体温の上昇、跛行、および行動の変化）について７日間、動物を観察した。人道的エンドポイントに達した臨床徴候（例えば、ＣＮＳ徴候、衰弱性跛行）を示す任意の動物を安楽死させて苦痛を最小限とした。安楽死させた動物を剖検して、ブタ連鎖球菌疾患と典型的に関連する病変を同定した。観察期間の終了まで生存した動物を同様に安楽死させ、剖検した。

（例５ａ）ΔＦｏｌＴ２菌株（ＣＢＳ１４３１９２）によるブタへのワクチン接種およびブタ連鎖球菌血清型２への曝露後の防御
市販の交配ブタにおいて試験を実施した。第１のワクチン接種日時点でブタは２１±７日齢であった。動物は、ブタ連鎖球菌に対してワクチン接種されたことがなく、ブタ連鎖球菌血清型２についてＰＣＲにより扁桃腺スワブ陰性であり、血清学的検査によりＰＲＲＳＶ陰性であり、ブタ連鎖球菌血清型２についてＰＣＲにより扁桃腺スワブ陰性であった雌のブタに由来した。試験群、ワクチン接種経路および用量、ワクチン接種の日数、ならびに曝露の日程および経路を表６に列挙する。使用した培地を表７に記載する。
３４日目に、血液および扁桃腺のスワブをすべての動物から採取し、次いで、厳格対照動物は別の区域に移し、一方、他のすべての群は混合した。３５日目に、約２×１０⁹ＣＦＵの毒性ブタ連鎖球菌血清型２単離株を腹腔内（ｉｐ）投与により動物に曝露した。

曝露後７日間、ブタ連鎖球菌に関連する疾患の徴候について動物を観察した。致死していた動物または動物福祉のためオフテスト前に安楽死させた動物を剖検した。剖検の間、ブタ連鎖球菌疾患と典型的に関連する肉眼的徴候について動物を評価し、ＣＮＳ（すなわち脳）および関節のスワブを採取した。オフテストでは、すべての残存動物を安楽死させ、剖検し、試料を採取した。
ワクチンおよびプラセボの調製について表７に記載する。
曝露物質の調製について表８に記載する。
ブタ連鎖球菌ΔＦｏｌＴ変異株のワクチン接種により、致死した動物または曝露後観察期間に動物福祉のため安楽死させる必要があった動物の数が減少した（表９および図１６参照）。さらに、ΔＦｏｌＴのワクチン接種により、重度の跛行の所見（すなわち、立つことができない、または立ち上がろうとしない動物の数）、ならびに周囲に無関心であるように非常に制限される状態を動物が示す、アパシーの所見が減少した（表１０および表１１参照）。
剖検の間、フィブリンおよび／または髄液の存在により示される脳の炎症の徴候が、ΔＦｏｌＴワクチン接種動物において、陰性対照と比較して少ない頻度で見られた（表１２参照）。
ΔＦｏｌＴ菌株をワクチン接種した動物より剖検で採取した脳および関節のスワブから、ブタ連鎖球菌曝露単離株は、陰性対照と比較して少ない頻度で回収された（表１３および表１４参照）。

（例５ｂ）菌株１０ΔｆｏｌＴ（ＣＢＳ１４０４２５）によるブタへのワクチン接種およびブタ連鎖球菌血清型２への曝露後の防御
第１のワクチン接種日の時点で２１＋／−５日齢の市販の交配ブタにおいて試験を行った。動物は、ブタ連鎖球菌に対してワクチン接種されたことがなく、ブタ連鎖球菌血清型２についてＰＣＲにより扁桃腺スワブ陰性であり、血清学的検査によりＰＲＲＳＶ陰性であり、ブタ連鎖球菌血清型２についてＰＣＲにより扁桃腺スワブ陰性であった雌のブタに由来した。試験群、試験開始時点の動物／群の数、ワクチン接種用量、ワクチン接種の日数、ワクチン接種経路、曝露の日程および曝露経路を表１５に記載する。
３５日目に、血液および扁桃腺のスワブをすべての動物から採取し、厳格対照動物を安楽死させた。３６日目に、約２×１０⁹ＣＦＵの毒性ブタ連鎖球菌血清型２単離株を腹腔内投与により動物に曝露した。

曝露後７日間、ブタ連鎖球菌と関連する疾患の徴候について動物を観察した。致死していた動物または動物福祉のためオフテスト前に安楽死させる必要があった動物を剖検した。剖検の間、ブタ連鎖球菌疾患と典型的に関連する肉眼的徴候について動物を評価し、ＣＮＳスワブを採取した。オフテストでは、すべての残存動物を安楽死させ、剖検し、試料を採取した。
ワクチンおよびプラセボの調製について表１６に記載する。曝露物質の調製について表１７に記載する。
ブタ連鎖球菌ＦｏｌＴ変異株により、跛行を示す動物の数、曝露後、異常行動（すなわち鬱、昏睡）を示す動物の数ならびに致死した動物または曝露後観察期間に動物福祉のため安楽死させる必要があった動物の数が減少した（表１８、表１９および表２０ならびに図１７参照）。
オフテスト（すなわち曝露後７日目または致死もしくは安楽死による試験からの解除時）では、脳における異常所見（すなわちフィブリン、髄液）ならびに胸腔における異常所見（すなわちフィブリン、胸水、肺うっ血、肺炎）について動物を観察した。さらに、ブタ連鎖球菌の回収のために脳から試料を採取した。結果を表２１、表２２および表２３に列挙する。

（例６）ｃＤＮＡ合成および定量ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲ
２００ｎｇのＲＮＡを使用して、２５ｎｇ μｌ^-1のランダムプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ製、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）、１０ｍＭのＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、４０ＵのＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用する反応において製造者の説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。
ｑＰＣＲ
ｑＰＣＲ解析用にｃＤＮＡを２０倍に希釈した。ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してプライマーを設計した（表１）。各反応では、１２．５ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１２．５ｐｍｏｌのリバースプライマーおよびＰＯＷＥＲ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を製造者の説明書に従って使用した。ＡＢＩ７５００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用してｑＰＣＲを実施した。ＧｅＮｏｒｍソフトウェア（ＧｅＮｏｒｍ）を使用して最も安定に発現した参照遺伝子を定量した。ブタ連鎖球菌では、試験した６つの潜在的参照遺伝子（ホスホグリセリン（ｐｈｏｓｐｈｏｇｅｌｙｃｅｒａｔｅ）酸デヒドロゲナーゼ（ｐｇｄ）、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ａｃａ）、ｍｕｔＳ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ））の発現においてｒｅｃＡの可変性が最も少なかった。Ｇｅｎｏｒｍにより発現データを発現の安定性を示す数値に統合し、この場合、１は最も安定な遺伝子を示す。ブタ連鎖球菌の安定数は、ｇｄｈの１．６６７からｒｅｃＡの１．２１７までの範囲であった。このような参照遺伝子の発現のレベルを測定してＲＮＡ回収条件およびＲＴ反応条件における差異を調整した。各ｑＰＣＲの実行において、その反応における標的遺伝子のクローンＰＣＲ産物を含むベクターのデータからなる検量線を組み込んだ。検量線は、対照ベクターの７つの１０倍希釈物のデータから構成された。このように標的遺伝子の発現レベルと外部参照遺伝子の発現レベルの両方が、検量線から算出され得る。各反応では、ｃＤＮＡまたは陰性対照としての鋳型の配置に水を使用した。ＡＢＩ７５００ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用して解析を実施した。

配列解析
配列決定反応および配列解析をＢａｓｅｃｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により実施した。

（例７）部位特異的変異導入
Ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的変異導入キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造者の説明書に従って使用し部位特異的変異導入を達成した。添付のソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）によりＰＣＲプライマーを設計した（表１）。プライマーｔ４４８ａおよびｔ４８８ａ＿アンチセンスを使用することにより、プラスミドｐＣＯＭ−ｏｒｆ２［Ｓ７３５］を増幅して、Ｓ７３５のｏｒｆ２−ｆｏｌＣ−オペロンの推定プロモーター領域の−３５領域を５’−ＴＧＧＴＣＡ−３’から５’−ＴＧＧＡＣＡ−３’まで変える所望の変異を導入した（図１）。ＤｐｎＩを使用して反応混合物を分解して元の鋳型ベクターを不活性化し、続いてＸＬ−１−ｂｌｕｅコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）に形質転換した。ベクター骨格にＰＣＲエラーが生じる可能性を除外するために、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩによる分解後にプラスミドの挿入断片（ｏｒｆ２［Ｓ７３５］）を鋳型ベクターから単離し、同制限酵素により分解されるｐＣＯＭ１にクローン化した。得られたプラスミドをブタ連鎖球菌単離株Ｓ７３５にエレクトロポレーションにより導入し、１μｇ ｍｌ^-1のエリスロマイシンを含むＣｏｌｕｍｂｉａ寒天上で形質転換体を選定して、Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−ｏｒｆ２［Ｓ７３５］［ｔ４８８ａ］を得た。配列決定を利用して最終構築物におけるＰＣＲエラーの存在を除外した。

（例８）ブタ連鎖球菌葉酸基質結合タンパク質（ｆｏｌＴ）のノックアウト変異株の構築
スペクチノマイシン耐性カセットを用いてｆｏｌＴを破壊することにより同系ｆｏｌＴノックアウト変異株を菌株１０において構築した。ｐＣＯＭ１−Ｖ［１０］^[14]をＢａｍＨＩで分解し、ＢａｍＨＩで分解したｐＫＵＮプラスミドに連結して、ｐＫＵＮ−Ｖ［１０］を得た。Ｖ［１０］の３’部分を除去するために、ｐＫＵＮ−Ｖ［１０］をＳｐｈＩで分解し、その後、ベクター断片を精製、連結して、ｐＫＵＮ−Ｖ［１０］^*を得た。ｐＫＵＮ−Ｖ［１０］^*をＸｍｎＩで部分的に分解し、線状ベクター断片を精製し、平滑末端スペクチノマイシン耐性カセットにより連結して、ｐＫＵＮ−Ｖ［１０］^*−Ｓｐｅｃ^Rを得た。変異株の構築では、Ｖ［１０］^*−Ｓｐｅｃ^RをＰＣＲによりＶ７３５−ｆｗおよびＭ１３−ｒｅｖを使用して増幅した。ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を使用してＰＣＲ産物を精製した。精製したＰＣＲ産物を使用し、Ｚａｃｃａｒｉａらにより記載されているように^[16]コンピテンス誘導因子としてＣｏｍＳを使用してブタ連鎖球菌株１０を形質転換し、相同組換を誘導した。６％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウマ血液および１００μｇ ｍｌ^-1のスペクチノマイシンを含むＣｏｌｕｍｂｉａ寒天プレート上で形質転換体を選定した。ＰＣＲにより二重交差をチェックし、サザンブロット法を使用して確認した。点変異が生じる可能性を除外するために、同系ノックアウト変異株の染色体ＤＮＡを単離し、菌株１０に形質転換した。さらに６％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウマ血液および１００μｇ ｍｌ^-1のスペクチノマイシンを含むＣｏｌｕｍｂｉａ寒天プレート上で変異株を選定し、ＰＣＲによりスクリーニングして、菌株１０ΔｆｏｌＴを得た。このプロトタイプ組換ΔＦｏｌＴ変異株は、「ＣＢＳ１４０４２５ブタ連鎖球菌ΔＦｏｌＴ変異株」として、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおいて、ブダペスト条約の法規に基づいた特許手続きを目的として２０１５年８月１９日に寄託されている。

（例９）スペクチノマイシン耐性遺伝子を含まないΔｆｏｌＴ欠失変異株
スペクチノマイシン耐性遺伝子を含まないΔｆｏｌＴ欠失変異株もまた構築した。このために、温度感受性シャトルベクターｐＳＥＴ５ｓ（Takamatsu D., Osaki, M. and Sekizaki, T. 2001. Plasmids 46:140-148）を使用した。プラスミドｐＳＥＴ５ｓは、温度感受性複製起点を含み、大腸菌において３７℃で増殖させることができるが、プラスミドの複製は、ブタ連鎖球菌において３７℃超で阻止される（Takamatsu et al）。ｐＳＥＴ５ｓは、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ）を含み、これは、大腸菌ならびにブタ連鎖球菌における形質転換体の選定に使用することができる。スペクチノマイシン耐性遺伝子を含まないプロトタイプ組換ΔＦｏｌＴ変異株は、「ＣＢＳ１４３１９２ブタ連鎖球菌ΔＦｏｌＴ２変異株」として、Ｗｅｓｔｅｒｄｉｊｋ Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて、ブダペスト条約の法規に基づいた特許手続きを目的として２０１７年８月２５日に寄託されている。

ΔｆｏｌＴ変異単離株を構築するために、ｆｏｌＴ遺伝子の５’−および３’−フランキング配列を含むＰＣＲ産物を生成した。この断片をｐＳＥＴ５ｓにクローン化し、Ｃｍ耐性形質転換体を大腸菌において３７℃で選定する。次いで、プラスミドを大腸菌から単離し、ブタ連鎖球菌株１０に導入した。Ｃｍを含む３０℃のＣｏｌｕｍｂｉａ寒天プレート上で形質転換体を選定した。形質転換したコロニーを用いてＣｍを含む１ｍｌのＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培地（ＴＨＢ）に播種し、この培養物を３０℃で一晩増殖させた。この一晩増殖させた培養物を同培地で１００倍に希釈し、６００ｎｍでの光学濃度が０．２〜０．３に達するまで上記のようにインキュベートし、ここで培養物は３８℃に達する。この温度では、プラスミドは複製することができない。このステップにより、単一の組換現象によってプラスミドが染色体に組み込んだ菌株が選定される。この培養物の段階希釈物をＣｍを含むＣｏｌｕｍｂｉａウマ血液プレートに播種した。プレートを３８℃で一晩インキュベートした。染色体に組み込まれた組換プラスミドを含むコロニーを選び、Ｃｍを含んだ１ｍｌのＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ 培地（ＴＨＢ）に播種して３８℃で一晩インキュベートした。Ｃｍを含まないＴＨＢで培養物を１００倍に希釈し、５代後の継代のために２８℃で増殖させた。この温度では、プラスミドは複製することができ、複製された標的遺伝子配列に対する第２の組換現象により染色体から切り出される。プラスミドの切除により、野生型の遺伝子型が生じ得るか、またはｆｏｌＴ欠失変異株が生じ得る。培養物の段階希釈物をＣｏｌｕｍｂｉａウマ血液プレート（Ｃｍを含まない）上に播種し、３８℃で一晩インキュベートした。次いで、Ｃｍを含む、または含まないＣｏｌｕｍｂｉａウマ血液プレート上に単一コロニーをレプリカプレーティングした。Ｃｍ感受性コロニーをＰＣＲによりスクリーニングして、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含まないΔｆｏｌＴ変異単離株を同定した。

ハイブリダイゼーション試験
染色体ＤＮＡを静置培養したブタ連鎖球菌株培養物から単離した。２００ナノグラムの精製ＤＮＡについてＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎ−Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製、ＵＳＡ）上に印をつけた。³²Ｐによるプローブの標識、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を前述のように^[17]行った。ｆｏｌＴおよびｆｏｌＣのＰＣＲ産物をプローブとして使用し、一方、１６Ｓ ｒＲＮＡプローブを陽性対照として使用した。

Ｓ７３５菌株において強毒性を誘導するのに十分なｆｏｌＴの過剰発現
毒性血清型２菌株１０由来の３ｋｂのゲノム断片であるＶ［１０］の導入により、弱毒性血清型２菌株Ｓ７３５の毒性が上昇して^[14]、強毒性単離株（Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［１０］）が生成された。Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［１０］に感染したすべてのブタは、感染後（ｐ．ｉ．）１日以内に致死し、ブタは高い割合で重度の疾患臨床徴候を示したが（表２）、一方、対照菌株Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１に感染したほとんどすべてのブタは、実験を通して生存した。Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［１０］とＳ７３５−ｐＣＯＭ１に感染したブタとの間で臨床的指標は有意に異なった（ｐ≦０．０１）（表２）。対照として、発明者らはまた、Ｓ７３５由来の相同な３ｋｂの断片（Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［Ｓ７３５］）を含むプラスミドで形質転換したＳ７３５の毒性を試験した。Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［Ｓ７３５］に感染したブタは、実験を通して高い割合で生存した。対照的に、Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［Ｓ７３５］に感染したブタは、Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１に感染したブタよりも特異的な臨床徴候を有意に示したが（ｐ≦０．０１）（表２）、発熱および非特異的症状の臨床的指標における差は、群間で有意には異ならなかった（ｐ＝０．０６）。したがって、プラスミドｐＣＯＭ１−Ｖ［Ｓ７３５］の導入によるＳ７３５におけるＶ［Ｓ７３５］のコピー数の増加によって、ブタ連鎖球菌の特異的臨床徴候が増加した。それにもかかわらず、Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［１０］によるブタ感染症に起因する特異的および非特異的臨床徴候は、Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［Ｓ７３５］に感染したブタと比較して有意に増加し（ｐ≦０．０１）、菌株Ｓ７３５においてＶ［１０］を導入すると、Ｖ［Ｓ７３５］の導入を上回って毒性が増加することを実証した。この結果は、菌株Ｓ７３５ｐＣＯＭ−１−Ｖ［１０］の強毒性がＶ［１０］においてＶ［Ｓ７３５］と比較して種々の塩基多型に起因し得ることを示した。

ｏｒｆ２とｆｏｌＣ遺伝子の両方が、観察された毒性の増加に必要かどうかを判定するために、同族のプロモーター配列が先行する、菌株１０から得たオペロンの両遺伝子を菌株Ｓ７３５に別々に導入して、菌株Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−ｏｒｆ２［１０］およびＳ７３５−ｐＣＯＭ１−ｆｏｌＣ［１０］を生成した。このような単離株の毒性を仔ブタの実験感染において、Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［１０］およびＳ７３５−ｐＣＯＭ１を対照として使用して判定した。表２は、Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［１０］またはＳ７３５−ｐＣＯＭ１−ｏｒｆ２［１０］に感染したブタが、重度の臨床徴候とともに感染後１日以内に致死したことを示す。感染したブタは、実験感染において野生型菌株１０を使用した場合に見られなかった毒性ショック様症候群を発症して、断片Ｖ［１０］およびｏｒｆ２［１０］によりＳ７３５の毒性が増加し、菌株１０よりも毒性の単離株が得られた^[3]ことを示唆した。特異的および非特異的症状はともに、Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［１０］またはＳ７３５−ｐＣＯＭ１−ｏｒｆ２［１０］に感染したブタにおいて、Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１と比較して有意に増加した（ｐ＜０．０１）（表２）。

細菌学的検査により、ＣＮＳ、漿膜および関節において、ブタ連鎖球菌が高いＣＦＵでコロニー形成したことが示された。対照的に、Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−ｆｏｌＣ［１０］またはＳ７３５−ｐＣＯＭ１に感染したブタは、実験を通して生存し（感染後１１日）、発熱のような軽度の感染症状を示した。Ａ７３５−ｐＣＯＭ１−ｆｏｌＣ［１０］とＳ７３５−ｐＣＯＭ１に感染したブタとの間で臨床結果において有意差は見られなかった。これは、ｆｏｌＣ［１０］を導入すると、菌株Ｓ７３５の毒性は上昇しないが、Ｖ［１０］およびｏｒｆ２［１０］を導入すると、菌株Ｓ７３５の毒性が上昇することを明白に実証した。したがって、発明者らは、Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１と比較して観察したＳ７３５−ｐＣＯＭ１−Ｖ［１０］の毒性の上昇は、ｏｒｆ２［１０］の導入に起因すると結論付けた。
結論として、Ｖ［１０］のコピー数とｏｒｆ２−ｆｏｌＣオペロンの遺伝的背景の両方が、所与の単離株の毒性の決定要因であると考えられる。

ｉｎ ｓｉｌｉｃｏデータの測定によりＯＲＦ２が葉酸輸送を促進するタンパク質に結合する基質であることが実証される
毒性の上昇がｏｒｆ２［１０］の複数のコピーの導入に起因したため、ｏｒｆ２の推定機能を探求した。ｏｒｆ２−ｆｏｌＣオペロンに先行する５’遺伝子間領域のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析により、予測二次構造の存在が明らかとなり、これは、テトラヒドロ葉酸リボスイッチに対して強い相同性を示した（図３）。テトラヒドロ葉酸リボスイッチは、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）に結合する特定の細菌における、ある種の相同ＲＮＡである^[18]。これは、タンパク質コード遺伝子の推定５’非翻訳領域にほとんど例外なく位置しており、このような遺伝子の多くが、葉酸輸送体または葉酸代謝に関与する酵素のいずれかをコードすることで知られている。このような理由で、ＲＮＡがリボスイッチとして機能することが推測された。ＴＨＦリボスイッチは、種々のファーミキューテス、詳細にはクロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）およびラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）に、よりまれには他の細菌系統に見出されている。ＴＨＦリボスイッチは、比較ゲノム学に基づいたプロジェクトに見られる、多くの保存されたＲＮＡ構造のうちの１つであった^[19]。葉酸代謝との関係がＥｕｄｅｓらにより確認され、ブタ連鎖球菌においてｆｏｌＣの上流に位置する遺伝子が、葉酸輸送体ＦｏｌＴをコードすることが実証された^[20]。このアノテーションは、ブタ連鎖球菌の新規のゲノム配列ＳＣ０７０７３１にも適用され、この場合、ｓｓｕ０１３５の相同遺伝子がＦｏｌＴをコードするとアノテートされた（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＧＧ６３６４８．１）。ラクトバチルス・ブレビスの葉酸エネルギー共役因子輸送の３次元構造が確定し^[21]、葉酸輸送体の多重タンパク質モデルが提唱されることとなった。このモデルにおいて、ＯＲＦ２／ＦｏｌＴは、膜貫通基質特異的結合タンパク質として機能する。エネルギー共役モジュールを形成する、より一般的な膜貫通タンパク質および２つのヌクレオチド結合タンパク質とともに、この複合体は、葉酸の膜貫通輸送を促進する。基質結合タンパク質（ＦｏｌＴ）のみが、葉酸に対して特異的であり、他の要素はまた、チアミンまたはリボフラビンのような他の基質の輸送に使用される。ブタ連鎖球菌のＦｏｌＴのタンパク質配列を他の生物の推定ＦｏｌＴ配列と比較した場合、保存アミノ酸がブタ連鎖球菌においても保存されることは明らかである^[21]（図４）。興味深いことに、図４はまた、アルギニンがヒト葉酸輸送体ならびに大腸菌において非常によく保存されたことを示す。図４では、赤色は小さい疎水性アミノ酸（芳香族−Ｔｙｒを含む）を示し、青色は酸性アミノ酸を示し、マゼンタは塩基性アミノ酸を示し、緑色はヒドロキシル、スルフヒドリルのアミンおよびＧｌｙを示す。テトラサイクリン輸送体はまた、ブタ連鎖球菌（Ａｒｇ９９）ｆｏｌＴにおいて保存され、この残基がヒトから細菌の範囲に及ぶ輸送体に重要となることを示唆した^[22]。まとめると、このようなデータは、相補性試験法を使用して同定された、保存された機能不明なタンパク質であるＯＲＦ２が、葉酸輸送を促進する基質結合タンパク質をコードすることを強く示唆する。

ブタ連鎖球菌における葉酸輸送
Ｐ１／７（菌株１０のゲノムと高度に相同である）の配列解析により、古典的葉酸生合成経路を介してテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）の合成に必要とされるすべての酵素をブタ連鎖球菌がコードすることが示される（図５）。ＫＥＧＧデータベース（www.kegg.jp）において利用可能なデータに基づいて、ブタ連鎖球菌における葉酸代謝は、スキームに示すようにｆｏｌＥ、ｆｏｌＱ、ｆｏｌＢ、ｆｏｌＫ、ｆｏｌＣ、ｆｏｌＡならびに基質ＧＴＰ、ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）およびグルタミル（ＧＬＵ）を使用して古典的葉酸経路を利用する。しかし、Ｖ［１０］オペロン上に存在する追加の遺伝子により、ブタ連鎖球菌はまた、ｆｏｌＴの発現を誘導して葉酸を直接移入し、ｆｏｌＣの追加のコピーの同時誘導発現を使用することが可能であり、葉酸を最終産物であるテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）に直ちにプロセシングすることができると考えられる。このようにｆｏｌＴとｆｏｌＣの組合せにより、追加の「ショートカット」が形成され、これによりＴＨＦの生成が可能となる。ｆｏｌＴ−ｆｏｌＣオペロンの上流に位置するＴＨＦリボスイッチの存在により、この２遺伝子オペロンの厳格な調整が示唆され、これはｆｏｌＴ−ｆｏｌＣオペロンが特異的条件下、例えば、葉酸が乏しい条件のみで発現することを意味し得る。上記の動物実験の結果に基づいて、ｆｏｌＴ−ｆｏｌＣオペロンが少なくともｉｎ ｖｉｖｏ条件下で発現することが示唆される。

ブタ連鎖球菌におけるｆｏｌＴの存在および発現
血清型３２および血清型３４を除いて試験したすべてのブタ連鎖球菌血清型においてｆｏｌＴ遺伝子の存在を実証した。しかし、血清型３２および血清型３４をブタ連鎖球菌の代わりにストレプトコッカス・オリスラッティ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒｉｓｒａｔｔｉ）属に帰するように再割り当てした^[1]。したがって、結論として、すべてのブタ連鎖球菌血清型は、ＦｏｌＴおよびＦｏｌＣをコードする遺伝子を有すると考えられることとなる。

ｏｒｆ２の推定プロモーターの配列解析により、菌株Ｓ７３５（ＴＧＧＴＣＡ）と比較して、菌株１０における推定プロモーターの−３５領域（ＴＧＧＡＣＡ）中に１つのヌクレオチド位置の差異が明らかとなった^[14]。菌株１０およびＳ７３５におけるｏｒｆ２およびｆｏｌＣの発現レベルに対するこのＳＮＰの作用をｑＰＣＲ解析を使用して判定した。有意に高いレベルのｏｒｆ２ならびにｆｏｌＣの発現が、菌株Ｓ７３５と比較して菌株１０において認められた（図６Ａ）。これは、推定プロモーターの−３５領域におけるＳＮＰがｏｒｆ２およびｆｏｌＣの転写に影響することを明白に示す。これにより、同定されたＳＮＰが、オペロン中のｏｒｆ２およびｆｏｌＣを同時転写するプロモーター領域に実際に位置することが実証される。さらに、ｐＣＯＭ１−ｏｒｆ２［１０］をＳ７３５へ導入すると、ｐＣＯＭ１の導入と比較してｏｒｆ２の発現が３１倍に増加したが、ｐＣＯＭ１−ｏｒｆ２［Ｓ７３５］を導入すると、ｏｒｆ２の発現が５倍だけ増加した（図６Ｂ）。予想どおり、ｆｏｌＣの発現レベルは、両組換菌株で類似していた（図６Ｂ）。プロモーターの−３５領域の同定したＳＮＰが、菌株Ｓ７３５および菌株１０におけるｏｒｆ２の転写の差異の原因であることを確認するために、ｏｒｆ２［１０］のプロモーターに見られた場合は、ｏｒｆ２［Ｓ７３５］のＴＧＧＴＣＡをＴＧＧＡＣＡに変異させた（菌株Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−ｏｒｆ２［Ｓ７３５］［ｔ４８８ａ］が得られる）。Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−ｏｒｆ２［Ｓ７３５］［ｔ４８８ａ］におけるｏｒｆ２の転写レベルが、菌株Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−ｏｒｆ２［１０］の転写レベルに類似し、種々の増殖期において菌株Ｓ７３５−ｐＣＯＭ１−ｏｒｆ２［Ｓ７３５］の転写レベルよりも４倍高くなることが示された（図６Ｃ）。両方のプロモーターは、Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培地中で培養した場合、ブタ連鎖球菌の増殖期の初期において最も活性である（図６Ｃ）。まとめると、このような結果は、菌株１０において、ｏｒｆ２−ｆｏｌＣ−オペロンの上流に位置するプロモーターが、−３５領域中のＳＮＰのため、菌株Ｓ７３５のこのオペロンの上流に位置するプロモーターよりも強力であることを明白に実証する。

ｏｒｆ２−ｆｏｌＣオペロンの発現の増加に関連するＳＮＰがブタ連鎖球菌の特定のクローン型または血清型と関連したかどうかを判定するために、単離株の多数の採取物のプロモーター領域を配列決定した（表３）。使用したすべての単離株は最近、特性が明らかとなり、ＣＧＨおよびＭＬＳＴにより分類された^[23]。得られた配列データに基づいて、単離株を２つの主群に分類することができる（表３）。強力な−３５プロモーター領域は、血清型１および２の単離株にもっぱら認められ、これはＣＧＨクラスターＡおよびＭＬＳＴクローン複合体１に属し、ＥＦタンパク質を発現した。低いプロモーター活性を伴うＳＮＰは、ＥＦの発現についてすべて陰性であるＣＧＨ群Ｂに属する（２つを除いて）血清型７および９の単離株において、ならびに大きな構造のＥＦタンパク質（ＥＦ^*）の発現について陽性であるＣＧＨ群Ａ／クローン複合体１（ＣＣ１）に属する血清型２の弱毒性単離株において認められた。ここで２つの例外がある。ＣＣ１に属するが、より強力なプロモーターに関連するＳＮＰを含むＥＦタンパク質を発現しない血清型７単離株（Ｃ１２６）と、プロモーター強度が未確定である異なる−３５プロモーター配列（ＴＴＧＴＣＡ）を有した血清型７単離株（７７１１）である。結論として、ＥＦタンパク質を発現するＣＣ１単離株（および１つの血清型７単離株）のみが、強力なプロモーター活性と関連するＳＮＰを含む。表現型および遺伝子型のこの組合せの単離株が毒性と強力に相関するため^[23、24]、発明者らは、ｏｒｆ２−ｆｏｌＣ−オペロンの上流に位置する強力なプロモーターが、ブタ連鎖球菌の毒性単離株と関連すると結論付けることができる。この知見は、ｆｏｌＴ［１０］の追加のコピー導入後に認められた毒性の上昇とともに、コピー数の増加またはより強力なプロモーターのいずれかによってｆｏｌＴの発現が増加すると、ブタ連鎖球菌の毒性が上昇することを示唆する。

培養においてｆｏｌＴの追加のコピーを用いた、またはｆｏｌＴを用いないブタ連鎖球菌の増殖
ｆｏｌＴの追加のコピーを用いた、または機能性ｆｏｌＴを用いないブタ連鎖球菌の培養において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで親菌株と比較して増殖に有意差は認められなかった。

ＦｏｌＴのタンパク質発現
ＦｏｌＴのタンパク質配列に基づいて、ＦｏｌＴが、少なくとも５つの膜貫通ドメインを有する非常に疎水性のタンパク質であることが予想された。６つの既知のＦｏｌＴ構造、この中でもラクトバチルス・ブレビス由来のＦｏｌＴの公表された３Ｄ構造を使用する相同モデリング（Ｅｘｐａｃｙサーバ）により、ブタ連鎖球菌のＦｏｌＴの３Ｄ構造を予測した（図７）。

ＦｏｌＴはｉｎ ｖｉｖｏでの生存に重要である：ｆｏｌＴノックアウト菌株１０ΔｆｏｌＴの毒性
弱毒性ブタ連鎖球菌株におけるｆｏｌＴの過剰発現により毒性が強力に増加したため、発明者らは、ＦｏｌＴがｉｎ ｖｉｖｏで重要な役割を果たすと仮定した。この仮定が正しいかどうかを試験するため、毒性ブタ連鎖球菌株１０において、スペクチノマイシン耐性カセットをｆｏｌＴ遺伝子に挿入することにより、同系ノックアウトを構築した。ｆｏｌＴおよびｆｏｌＣがオペロン構造中にあるため、このノックアウトによりｆｏｌＣの追加したコピーも恐らくノックアウトされ得る。ｉｎ ｖｉｖｏで葉酸輸送が毒性に必須であるかどうかを判定するため、実験１において、１０匹のブタを野生型菌株１０またはノックアウト菌株１０ΔｆｏｌＴのいずれかに静脈内投与により感染させた。すべてのブタが、この播種に反応し、体温が上昇した（図８）。しかし、野生型菌株１０に感染したブタは、ノックアウト菌株１０ΔｆｏｌＴに感染したブタと比較して、より長い期間より高い体温を示した。これはまた、両群間の発熱指標（ブタが発熱を示した観察結果の割合）の差によって反映された（ｐ＝０．０６）。これは、菌株１０ΔｆｏｌＴが、野生型菌株と比較して化膿性が低いことを示唆する。これは、有意に少数の細菌が、菌株１０ΔｆｏｌＴに感染した仔ブタの血液から単離されたという事実の結果となり得る。菌株１０ΔｆｏｌＴに感染した２匹のブタのみが、菌株１０に感染した５匹のブタと比較して短い菌血症期間を示し、菌株１０に感染したブタはまた、これらの血中の細菌数が、より長い期間有意に高かった（図９）。これは、菌株１０ΔｆｏｌＴが、血液からより効率的に除去されるか、または血中で生存することができないことを示唆する。白血球数により、野生型菌株１０に感染したブタがＷＢＣの強力な増加をより長い期間示すことが明らかとなった。菌株１０に感染したすべてのブタがＷＢＣの増加を示したが、菌株１０ΔｆｏｌＴに感染したブタのうちの１匹のみがＷＢＣの増加を示した。算出したＷＢＣ指標は、群間で有意に異なる（表５）。２つの群間の生存率は有意に異なり、菌株１０に感染したブタは、感染後２．６日の平均的生存を有したが、菌株１０ΔｆｏｌＴに感染したブタは、感染後６．２日生存した（図１０）。所定の人道的エンドポイントに達した場合、ブタを安楽死させたが、生存は、感染の重症度を反映する。図１０に示すように、生存曲線は、群間で有意に異なる。肉眼的所見により、菌株１０に感染したブタの４／５が、関節炎、胸膜炎、心膜炎または腹膜炎のようなブタ連鎖球菌株感染に対して特異的な臨床徴候を示したが、菌株１０ΔｆｏｌＴに感染したブタの３／５が、特異的臨床徴候を示したことが明らかとなった。感染した臓器すべての細菌学的検査により、野生型菌株１０では、菌株１０ΔｆｏｌＴと比較してより多くの臓器において高い細菌量でコロニー形成されたことが明らかとなった（図１１）。

第２の動物実験（実験２）では概して、実験１において得たデータを確認した。第１の実験でのように、野生型菌株１０および菌株１０ΔｆｏｌＴ単離株の生存曲線は、有意に異なった。実験２では、菌株１０ΔｆｏｌＴを接種したすべての動物は、実験終了まで生存したが、菌株１０を接種した動物の６０％は、実験の過程で安楽死させる必要があった（図１２）。さらに、臨床徴候の頻度および重症度（例えば、体温、歩行運動および意識状態、図１３、図１４および図１５参照）は、野生型菌株１０および菌株１０ΔｆｏｌＴを接種した動物の間で大幅に異なった。剖検で得た関節および腹膜における肉眼的所見による病変の頻度はまた、野生型と１０ΔｆｏｌＴ変異単離株との間で大幅に異なった。
仔ブタにおける感染実験の結果に基づいて、同系ノックアウト変異株１０ΔｆｏｌＴは、野生型菌株と比較して強力に減弱したことが結論付けられた。これは、葉酸輸送体が、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下の細菌の生存に必要であることを示す。両試験からの結果をまとめると、このような実験により、ΔｆｏｌＴ単離株が、ゼロに近い致死率、最小臨床徴候、ならびに親菌株と比較して関節炎および腹膜炎の頻度の減少をもたらしたことが明白に示される。したがって、ΔｆｏｌＴ菌株は、高度に弱毒化され、安全であることが結論付けられ得る。

概要結果
細菌の葉酸基質結合タンパク質をコードするＤＮＡ領域において変異、欠失または挿入等の修飾を施した細菌（ΔｆｏｌＴ単離株）を含むワクチンは、修飾されていない細菌の毒性単離株による曝露から宿主を防御する。
葉酸輸送および葉酸合成が一般に可能である親細菌株を選定するステップと、細菌の葉酸基質結合タンパク質をコードするＤＮＡ領域（ブタ連鎖球菌ではｆｏｌＴ遺伝子として知られる）において変異、欠失または挿入等の修飾を施すためにこの親菌株から細菌を選定するステップと、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは親菌株と同様の割合まで増殖するがｉｎ ｖｉｖｏでは親菌株と比較して低い割合まで増殖する能力を有する細菌を選定するステップとを含む、好ましくはワクチンにおける使用のため、好ましくは細菌感染からの防御をもたらすワクチンにおける使用のための細菌を生成する方法を提供する。葉酸輸送および葉酸合成が一般に可能である親細菌株を選定するステップと、好ましくは組換手段により、細菌の葉酸基質結合タンパク質をコードするＤＮＡ領域（ブタ連鎖球菌ではｆｏｌＴ遺伝子として知られる）において変異、欠失または挿入等の修飾を施すことにより、この親菌株由来の細菌を形質転換するステップと、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは親菌株と同様の割合まで増殖するがｉｎ ｖｉｖｏでは親菌株と比較して低い割合まで増殖する能力を有する細菌を選定するステップとを含む、好ましくはワクチンにおける使用のため、好ましくは細菌感染からの防御をもたらすワクチンにおける使用のための細菌を生成する方法をさらに提供する。このような細菌は、本明細書において提供する場合、その新規葉酸合成経路を適用することにより、それ自体の使用のための葉酸を生成する能力を依然として有する。このような合成経路をインタクトのままとすると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（培地中）では増殖するその能力が影響されないままとなるが、驚いたことに、宿主（ｉｎ ｖｉｖｏ）におけるその増殖および毒性が強力に低下したことが示される。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでは良好に増殖するがｉｎ ｖｉｖｏではその親菌株ほど増殖せず、ｉｎ ｖｉｖｏでの毒性の強力な低下と関連する、このような細菌株は、ワクチン株として非常に有用である。本発明により提供するこのような菌株または変異株では、一方では、葉酸合成において本質的に影響されず、したがって高力価まで増殖可能であり、そのため生成が比較的容易かつ安価であるが、他方では、親菌株と比較して宿主における増殖が低下し毒性が低下するため、このような菌株または変異株は、ｉｎ ｖｉｖｏでの適用後に比較的無害であり、細菌感染症に対するワクチンとして極めて有用となる。
本明細書における実験の第１のシリーズでは、ブタ連鎖球菌に対してワクチン接種されておらず、薬物混入飼料を一度も与えていない約３週齢の仔ブタ（市販の交配種）を有効性試験に使用した。動物は、登録時、ブタ連鎖球菌血清型２についてＰＣＲにより扁桃腺スワブ陰性であり、ＰＲＲＳＶ陰性群に由来した。２つの処置群を試験施設で別々に飼育した。

試験施設到着時、血液および扁桃腺のスワブをすべての動物から採取した。適切な馴化期間の後、試験０日目に、１つの群の動物に菌株１０ΔＦｏｌＴをワクチン接種した。別の群の動物は、ワクチン接種せずにおいた。２１日目にワクチン接種した動物の首の右側に同じ用量の変異単離株をそれぞれ再ワクチン接種した。各ワクチン接種の後、局所および全身反応について動物を観察した。３５日目に、両群の動物に曝露株ＡＴＣＣ７００７９４を曝露する前に、血液および扁桃腺のスワブをすべての動物から採取した。曝露後７日間、ブタ連鎖球菌関連疾患の徴候（例えば、体温の上昇、跛行、異常行動、ＣＮＳ徴候）について動物を観察した。致死していた動物または動物福祉のためオフテスト前に安楽死させる必要があった動物を剖検した。剖検の間、ブタ連鎖球菌疾患と典型的に関連する肉眼的徴候（例えば、ＣＮＳ、関節、胸腔の炎症）について動物を評価した。さらに、曝露単離株の回収のためにＣＮＳスワブを採取した。４２日目に、上記のように、すべての残存動物を安楽死させ、剖検し、試料を採取した。ワクチン接種した動物は、曝露後、極めて小さなブタ連鎖球菌疾患の徴候を示した。

実験の第２のシリーズを市販の交配ブタにおいて行った。第１のワクチン接種日時点でブタは２１±７日齢であった。動物は、ブタ連鎖球菌に対してワクチン接種されたことがなく、ブタ連鎖球菌血清型２であり、血清学的検査によりＰＲＲＳＶ陰性について扁桃腺スワブ陰性であり、ブタ連鎖球菌血清型２について扁桃腺スワブ陰性であった雌のブタに由来した。試験施設到着時、血液および扁桃腺のスワブをすべての動物から採取した。適切な馴化期間の後、試験０日目に、１つの群の動物の首の左側に菌株ΔＦｏｌＴ２をワクチン接種した。別の群の動物は、ワクチン接種せずにおいた。２１日目にワクチン接種した動物の首の右側に同じ用量の変異単離株をそれぞれ再ワクチン接種した。各ワクチン接種の後、局所および全身反応について動物を観察した。３４日目に、血液および扁桃腺のスワブをすべての動物から採取し、次いで、厳格対照動物は別の区域に移し、一方、他のすべての群は混合した。３５日目に、毒性ブタ連鎖球菌血清型２単離株を腹腔内（ｉｐ）投与により動物に曝露した。

曝露後７日間、ブタ連鎖球菌と関連する疾患の徴候について動物を観察した。致死していた動物または動物福祉のためオフテスト前に安楽死させる必要があった動物を剖検した。剖検の間、ブタ連鎖球菌疾患と典型的に関連する肉眼的徴候について動物を評価し、ＣＮＳ（すなわち脳）および関節のスワブを採取した。オフテストでは、すべての残存動物を安楽死させ、剖検し、試料を採取した。ΔｆｏｌＴ変異株のワクチン接種により、致死した動物または曝露後観察期間に動物福祉のため安楽死させる必要があった動物の数が減少した。剖検の間、フィブリンおよび／または髄液の存在により示される脳における炎症の徴候は、ΔｆｏｌＴ２ワクチン接種動物において、陰性対照と比較して少ない頻度で見られた。ΔｆｏｌＴ２菌株をワクチン接種した動物より剖検で採取された脳および関節のスワブから、ブタ連鎖球菌曝露単離株は、陰性対照と比較して少ない頻度で回収された。

参照文献

表1. プライマー配列

表2. 無菌仔ブタにおける相補ブタ連鎖球菌株の毒性;すべての菌株は、挿入断片を有するか、または有しないプラスミド(pCOM1)を含んでいた。V[10]/V[S735]:ライブラリから選択された菌株10または菌株S735由来のオリジナルの3kb断片; orf2[10]:V[10]由来のorf2; folC[10]:ジヒドロ葉酸シンターゼをコードするV[10]由来のorf3。
^a 感染のため致死した、または動物福祉のため犠死させる必要があったブタの割合
^b 特異的症状を有するブタの割合
^c 特異的症状（運動失調、少なくとも１つの関節の跛行および／または静止）が見られた実験群の観察結果の割合
^d 非特異的症状（食欲不振および／または鬱）が見られた実験群の観察結果の割合
^e ＞40℃の体温の実験群の観察結果の割合
^f 過去の実験（Smith et al., 2001）を再分析して、実験間の統計学的比較を可能とした。この再分析は、材料と方法に記載のように特異的および非特異的症状の新規の厳格な定義を必要とした。
^* p ≦ 0.05 S735-pCOM1と比較
^** p ≦ 0.01 S735-pCOM1と比較
^g 漿膜は、腹膜、心膜または胸膜として定義する。

表3. 種々のブタ連鎖球菌単離株および血清型¹間のorf2/folCプロモーターの-35領域の配列解析
¹ ブタ連鎖球菌単離株はde Greeff et al.[23]に記載されていた。
² *はＭＲＰの高分子量形態を示し、sはＭＲＰの低分子量形態を示す。
³ *はＥＦの高分子量形態を示す。
⁴ 比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)[23]を使用してすべての単離株の遺伝子型を同定した。
⁵ この単離株はクローン複合体1に属する。
⁶ 解析された単離株の数/それぞれの-35プロモーター配列を有する単離株の数

表4. ブタ連鎖球菌を感染させたブタの臨床パラメータ、実験1
^* p ≦ 0.05 １０と比較
^** p ≦ 0.01 １０と比較
^# p ≦ 0.1 １０と比較

表5. 関節炎および腹膜炎を示す肉眼的病変:野生型菌株10および10ΔFolT変異単離株を曝露した動物における陽性観察結果の%、実験2

表6.試験計画(CBS143192使用試験用)

表7. ワクチンおよびプラセボの調製(CBS143192使用試験用)

表8: 曝露物の調製(CBS143192使用試験用)

表9. 曝露後、致死した動物または安楽死させた動物の割合(致死率)(CBS143192使用試験用)

表10. 曝露後、重度の跛行を示す動物の割合(CBS143192使用試験用)

表11. 曝露後、アパシーを示す動物の割合(CBS143192使用試験用)

表12. 剖検において脳の炎症の徴候を示す動物の割合(CBS143192使用試験用)

表13. 剖検で採取した脳スワブからブタ連鎖球菌を回収した動物の割合(CBS143192使用試験用)

表14. 剖検で採取した関節スワブからブタ連鎖球菌を回収した動物の割合(CBS143192使用試験用)

表15. ワクチン接種曝露試験概要(CBS140425使用試験用)

表16. ワクチンの調製(CBS140425使用試験用)

表17. 曝露物の調製(CBS140425使用試験用)

表18. 曝露後、跛行を示す動物の割合(CBS140425)

表19: 曝露後、異常行動を示す動物の割合(CBS140425)

表20: 曝露後、致死した動物または安楽死させた動物の割合(致死率)(CBS140425)

表21: 剖検時、脳における異常所見を有する動物の割合(CBS140425)

表22: 剖検時、胸腔における異常所見を有する動物の割合(CBS140425)

表23: 脳スワブからブタ連鎖球菌を回収した動物の割合(CBS140425)

Claims (38)

1. 葉酸を輸送する能力が低下した細菌のΔＦｏｌＴ変異株であって、前記能力が、葉酸輸送体（ＦｏｌＴ）機能を機能的に欠失させることにより低下している、ΔＦｏｌＴ変異株。
2. 連鎖球菌として、好ましくはブタ連鎖球菌として分類可能である、請求項１に記載のΔＦｏｌＴ変異株。
3. 葉酸を合成する能力を有する、請求項１または請求項２に記載のΔＦｏｌＴ変異株。
4. ＦｏｌＴの発現が減少した、請求項１から３のいずれか１項に記載のΔＦｏｌＴ変異株。
5. ペプチドドメインＦＹＲＫＰの変異もしくは欠失、またはペプチドドメインＦＹＲＫＰにおける変異もしくは欠失、またはペプチドドメインＦＹＲＫＰにおける挿入を有する、好ましくはペプチドドメインＦＹＲＫＰにおけるＲの変異を有する、請求項１から４のいずれか１項に記載のΔＦｏｌＴ変異株。
6. 「ＣＢＳ１４０４２５ブタ連鎖球菌ΔＦｏｌＴ変異株」としてＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおいて２０１５年８月１９日に寄託された、請求項１から５のいずれか１項に記載のΔＦｏｌＴ変異株。
7. 「ＣＢＳ１４３１９２ブタ連鎖球菌ΔＦｏｌＴ２変異株」としてＷｅｓｔｅｒｄｉｊｋ Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて２０１７年８月２５日に寄託された、請求項１から５のいずれか１項に記載のΔＦｏｌＴ変異株。
8. 請求項１から７のいずれか１項に記載の細菌の培養物。
9. 請求項１から７のいずれか１項に記載の細菌または請求項８に記載の培養物を含む組成物。
10. 請求項１から７のいずれか１項に記載の細菌または請求項８に記載の培養物を含む免疫原性組成物。
11. ワクチンの生成のための、請求項９または請求項１０に記載の組成物の使用。
12. 請求項１から７のいずれか１項に記載の細菌、請求項８に記載の培養物、または請求項９もしくは請求項１０に記載の組成物を含むワクチン。
13. ａ．動物、好ましくはブタにワクチンを投与するためのディスペンサーと、
    ｂ．請求項１から７のいずれか１項に記載のΔＦｏｌＴ変異株または請求項８に記載の培養物、請求項９もしくは１０に記載の組成物と、
    ｃ．任意選択で使用説明書と
    を含む、ブタ連鎖球菌感染と関連する疾患に対して動物、好ましくはブタにワクチン接種するためのキット。
14. 「ＣＢＳ１４０４２５ブタ連鎖球菌ΔＦｏｌＴ変異株」としてＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおいて２０１５年８月１９日に寄託された、細菌またはその培養物。
15. 「ＣＢＳ１４３１９２ブタ連鎖球菌ΔＦｏｌＴ２変異株」としてＷｅｓｔｅｒｄｉｊｋ Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて２０１７年８月２５日に寄託された、細菌またはその培養物。
16. 葉酸を輸送する細菌の能力を低下させるステップを含む、細菌の毒性を低下させる方法。
17. 細菌が、新規葉酸合成の能力を有する、請求項１６に記載の方法。
18. 細菌の葉酸基質結合タンパク質（ＦｏｌＴ）の発現および／または機能を減弱させるステップを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
19. 細菌のｆｏｌｔＴ遺伝子において変異、欠失または挿入を施すことにより毒性を減弱させる、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法。
20. ｆｏｌＴ遺伝子のプロモーターをコードする細菌のＤＮＡにおいて変異、欠失または挿入を施すことにより毒性を減弱させる、請求項１９に記載の方法。
21. 葉酸基質結合タンパク質ＦｏｌＴの膜貫通領域をコードする細菌のＤＮＡにおいて変異、欠失または挿入を施すことにより毒性を減弱させる、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
22. 基質結合に重要な領域をコードする細菌のＤＮＡ領域をコードするＦｏｌＴにおいて変異、欠失または挿入を施すことにより毒性を減弱させる、請求項１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 細菌が、ファーミキューテス、好ましくは連鎖球菌、より好ましくはブタ連鎖球菌、より好ましくは「ＣＢＳ１４０４２５ブタ連鎖球菌ΔＦｏｌＴ変異株」としてＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおいて２０１５年８月１９日に寄託されたΔＦｏｌＴ変異株、最も好ましくは「ＣＢＳ１４３１９２ブタ連鎖球菌ΔＦｏｌＴ２変異株」としてＷｅｓｔｅｒｄｉｊｋ Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて２０１７年８月２５日に寄託されたΔＦｏｌＴ変異株である、請求項１６から２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 請求項１６から２３のいずれか１項に記載の方法で得ることができる、または得られた、毒性を減弱させた細菌。
25. 請求項２４に記載の細菌の培養物。
26. 請求項２４に記載の細菌または請求項２５に記載の培養物を含む組成物。
27. 請求項２４に記載の細菌または請求項２５に記載の培養物を含む免疫原性組成物。
28. ワクチンの生成のための請求項２５に記載の培養物または請求項２６もしくは２７に記載の組成物の使用。
29. 請求項２４に記載の細菌または請求項２５に記載の培養物、請求項２６もしくは２７に記載の組成物を含むワクチン。
30. 葉酸輸送および葉酸合成が一般に可能である親細菌株を選定するステップと、細菌の葉酸基質結合タンパク質をコードするＤＮＡにおいて変異、欠失または挿入を施すために前記親菌株から細菌を選定するステップと、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは親菌株と同様の割合まで増殖するがｉｎ ｖｉｖｏでは親菌株と比較して低い割合まで増殖する能力を有する細菌を選定するステップとを含む、細菌を生成する方法。
31. 葉酸輸送および葉酸合成が一般に可能である親細菌株を選定するステップと、細菌の葉酸基質結合タンパク質をコードするＤＮＡにおいて変異、欠失または挿入を施すことにより前記親菌株由来の細菌を形質転換するステップと、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは親菌株と同様の割合まで増殖するがｉｎ ｖｉｖｏでは親菌株と比較して低い割合まで増殖する能力を有する細菌を選定するステップとを含む細菌を生成する方法。
32. 請求項３０または３１に記載の方法で得ることができる、または得られた細菌。
33. ファーミキューテス、好ましくは連鎖球菌、より好ましくはブタ連鎖球菌として分類可能である、請求項３２に記載の細菌。
34. 請求項３２または３３に記載の細菌の培養物。
35. 請求項３２もしくは３３に記載の細菌または請求項３４に記載の培養物を含む組成物。
36. 請求項３２もしくは３３に記載の細菌または請求項３４に記載の培養物を含む免疫原性組成物。
37. ワクチンの生成のための請求項３５または３６に記載の組成物の使用。
38. 請求項３２もしくは３３に記載の細菌または請求項３４に記載の培養物あるいは請求項３５もしくは３６に記載の組成物を含むワクチン。