ES2926543T3 - Atenuación de la virulencia bacteriana mediante la atenuación del transporte de folato bacteriano - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a infecciones bacterianas, vacunas dirigidas contra esas infecciones y vacunas bacterianas. Más particularmente, la invención se refiere a vacunas dirigidas contra infecciones por Streptococcus en cerdos. Se proporciona un mutante ΔFolT de una bacteria que tiene una capacidad reducida para transportar folato, en el que la capacidad se ha reducido eliminando funcionalmente la función del transportador de folato (FolT). También se proporciona un método para reducir la virulencia de una bacteria que comprende reducir la capacidad de la bacteria para transportar folato. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Atenuación de la virulencia bacteriana mediante la atenuación del transporte de folato bacteriano

Campo técnico

La invención se refiere a cepas bacterianas, fármacos dirigidos contra infecciones bacterianas y vacunas bacterianas. Más particularmente, la invención se refiere a vacunas dirigidas contra infecciones por Streptococcus en cerdos.

Antecedentes

Las plantas, los hongos, ciertos protistas y la mayoría de las bacterias producen folato (vitamina B9) de novo, a partir de GTP y corismato, pero los animales superiores carecen de las enzimas clave de la ruta de síntesis y, por lo tanto, necesitan folato en la dieta. Los folatos son cruciales para la salud, y los fármacos antifolato se usan ampliamente en la quimioterapia contra el cáncer y como antimicrobianos. Por estas razones, las rutas de síntesis y de recuperación de folato se han caracterizado ampliamente en organismos modelo, y se ha modificado por ingeniería genética la ruta de síntesis de folato tanto en bacterias como en plantas con intención de aumentar el contenido de folato en los alimentos. El tetrahidrofolato es un cofactor esencial para muchas enzimas biosintéticas. Actúa como transportador de unidades de un carbono en las síntesis de metabolitos críticos como la metionina, purinas, glicina, pantotenato y timidilato. Por ejemplo, la enzima cetopantoato hidroximetil transferasa, codificada por el gen PanB, requiere un cofactor de tetrahidrofolato para sintetizar precursores de pantotenato. Como el tetrahidrofolato se sintetiza de novo en bacterias, la inhibición de su síntesis mata a las células. De hecho, dos antibióticos muy eficaces, sulfonamida y trimetoprima, matan a las células bacterianas bloqueando la producción de tetrahidrofolato. Estos dos antibióticos, que a menudo se utilizan combinados entre sí, se prescriben normalmente para el tratamiento de infecciones del tracto urinario, infecciones entéricas tales como la shigelosis e infecciones del tracto respiratorio. El éxito de estos fármacos es indicativo de la vulnerabilidad de muchas bacterias patógenas a inhibidores de la síntesis de tetrahidrofolato. Las bacterias tienen una ruta de múltiples pasos para la síntesis del cofactor de tetrahidrofolato. En una ramificación de la ruta, los metabolitos corismato y glutamina son sustratos de la aminodesoxicorismato sintasa, codificada por los genes de B. subtilis, pabA y pabB, que produce 4-amino 4-desoxicorismato. La aminodesoxicorismato liasa, codificada por el gen pabC de B. subtilis, después convierte el 4-amino 4-desoxicorismato en ácido para-aminobenzoico (PABA), un precursor importante. En otra ramificación, varias enzimas, entre las que se incluyen las codificadas por los genes mtrA, folA y folK de B. subtilis, producen el precursor 2-amino-4-hidroxi-6-hidroximetil-7,8-dihidropteridina difosfato. Este precursor y PABA son sustratos para la dihidropteroato sintetasa, codificada por el gen sul de B. subtilis (homólogo a los genes dhps y foIP de E. coli), que produce dihidropteroato. Las sulfonamidas, tales como el sulfametoxazol, son inhibidores competitivos de la dihidropteroato sintasa. El dihidropteroato se modifica por la enzima bifuncional codificada por folC de B. subtilis para producir dihidrofolato. Finalmente, la DHFR (dihidrofolato reductasa), codificada por dfrA de B. subtilis, modifica este dihidrofolato para generar el producto final tetrahidrofolato. La trimetoprima es un inhibidor competitivo de las DHFR bacterianas. Esta selectividad es crítica, ya que las DHFR eucarióticas no se ven afectadas por el antibiótico. Es muy probable que el folato sea esencial para todas las bacterias secuenciadas, excepto M. hyopneumoniae. Sin embargo, no todas las bacterias sintetizan folato de novo sino que dependen de un suministro externo. Para predecir la ausencia de la ruta de síntesis de novo, se utilizan las proteínas HPPK (FoIK) y DHPS (FoIP) como proteínas distintivas. Muchas bacterias carecen de homólogos de estos dos genes y, por lo tanto, casi con certeza dependen de la reducción y glutamilación de folatos intactos captados del entorno. Se trata principalmente de bacterias asociadas al hospedador tales como Mycoplasma o Treponema u organismos que viven en entornos ricos en folato tales como lactobacilos.

Las especies de estreptococos, de las que una gran variedad causan infecciones en los animales domésticos y en el ser humano, a menudo se agrupan de acuerdo con los grupos de Lancefield. La tipificación según Lancefield se realiza basándose en determinantes serológicos o antígenos que están presentes, entre otros, en la cápsula de la bacteria y solo permite una determinación aproximada, ya que con frecuencia las bacterias de un grupo diferente muestran reactividad cruzada entre sí, mientras que a otros estreptococos no se les puede asignar un determinante de grupo en absoluto. Dentro de los grupos, a menudo es posible una mayor diferenciación basándose en la serotipificación; estos serotipos contribuyen aún más a la gran variabilidad antigénica de los estreptococos, un hecho que crea una serie de dificultades en el diagnóstico y la vacunación contra las infecciones estreptocócicas. Los estreptococos del grupo A de Lancefield (GAS, Streptococcus pyogenes), son comunes en los niños, produciendo infecciones nasofaríngeas y complicaciones de las mismas. Los estreptococos del grupo B (GBS) constituyen una causa importante de sepsis bacteriana y meningitis entre los recién nacidos humanos y están emergiendo como patógenos neonatales significativos en los países en desarrollo. El estreptococo del grupo B de Lancefield (GBS) también se encuentra asociado con las vacas, causando mastitis. Las infecciones por el grupo C de Lancefield, tales como las producidas por S. equi, S. zooepidemicus, S. dysgalactiae y otros se ven principalmente en caballos, vacas y cerdos. Las infecciones producidas por el grupo D de Lancefield (S. bovis) se encuentran en todos los mamíferos y en algunas aves, produciendo en algunas ocasiones endocarditis o septicemia. Los grupos E, G, L, P, U y V (S. porcino, S. canis, S. dysgalactiae) se encuentran en diversos hospedadores, causando infecciones en recién nacidos, infecciones nasofaríngeas o mastitis. Dentro de los grupos R, S y T de Lancefield, (y con tipos no agrupados) se encuentra S. suis, una causa importante de meningitis, septicemia, artritis y muerte súbita en cerdos jóvenes. Por otro lado, también puede producir meningitis en el ser humano. Existen otras especies de estreptococos no agrupadas, tales como S.

mutans, que produce caries en seres humanos, S. uberis, que produce mastitis en vacas y S. pneumonía, que produce enfermedades invasivas, tales como neumonía, bacteriemia y meningitis.

Streptococcus suis es un patógeno zoonótico que está omnipresente entre las poblaciones porcinas en la industria porcina. Hasta la fecha se han descrito treinta y tres serotipos capsulares [1], de los cuales los serotipos 1, 2, 7, 9 y 14 se aíslan con frecuencia a partir de cerdos enfermos en Europa [2]. La virulencia de las cepas difiere entre y dentro de los serotipos: dentro del serotipo 2, se han aislado aislados virulentos, avirulentos y débilmente virulentos que se pueden discriminar en función de la expresión de marcadores de virulencia, proteína liberada de muramidasa (MRP) y factor extracelular (EF) [3] y suilisina [4,5]. La presencia nasofaríngea de S. suis en cerdos adultos es asintomática, mientras que en lechones jóvenes aumenta la susceptibilidad a la enfermedad invasiva producida por S. suis, que conduce a meningitis, artritis y serositis, y altas tasas de mortalidad. En los países occidentales, los seres humanos expuestos ocupacionalmente a cerdos o carne de cerdo cruda también pueden infectarse por S. suis aunque la incidencia es muy baja. La infección invasiva por S. suis de seres humanos produce signos clínicos similares a los de los cerdos; los pacientes a menudo sufren una sordera residual después de la recuperación [6]. En el sudeste asiático, S. suis, en particular del serotipo 2, se considera un patógeno emergente para los seres humanos y se reconoce como la principal causa de meningitis bacteriana [7-10]. En el sudeste asiático, se ha notificado que los signos clínicos de infecciones humanas por S. suis son más graves en comparación con otras partes del mundo, desarrollando algunos pacientes un síndrome similar al choque tóxico, sepsis y meningitis. Se sabe poco sobre la patogenia de la enfermedad causada por S. suis. Varios componentes bacterianos, tales como proteínas extracelulares y asociadas a la membrana celular, desempeñan un papel en la patogenia. Además, se ha demostrado que la cápsula es un importante factor de virulencia al permitir que estos microorganismos resistan a la fagocitosis. Smith et al. (Infection and Immunity 2001 (69):1961-1966) desvelan transformantes patógenos que se introdujeron en dos cepas débilmente patógenas de S. suis para aumentar la virulencia de estas cepas. En el documento WO 00/05378 a 2, se desvela un grupo de genes de S. suis, particularmente el grupo de genes de biosíntesis de polisacáridos capsulares cps, y vacunas relacionadas que comprenden S. suis con un grupo de genes capsulares modificados. En el documento CN 106085936 A se desvela la cepa LSM110D10, que es una cepa atenuada del aislado SC virulento de S. suis, generadas por tecnología de recombinación homóloga. Las estrategias actuales para prevenir las infecciones por S. suis en cerdos incluyen el tratamiento con antibiótico de cerdos enfermos, combinado con estrategias de vacunación con autovacunas [11]. Aunque la autovacunación con vacunas de bacterina contra el serotipo 2 ha demostrado ser capaz de reducir los brotes clínicos en granjas, no ocurre lo mismo con el serotipo 9, donde la autovacunación no parece proteger de manera eficaz [12,13]. Además del hecho de que las vacunas de bacterina son menos eficaces contra las infecciones del serotipo 9, solo pueden proteger contra el serotipo presente en la vacuna. Sin embargo, como se mencionó antes, varios serotipos pueden causar enfermedad, por lo que las autovacunas son una solución temporal a un brote clínico. Para una solución a largo plazo contra infecciones por S. suis, se requieren vacunas que protejan ampliamente contra todos los serotipos (patógenos). Se ha investigado mucho para encontrar candidatos a vacunas adecuados, sin embargo, aún no se dispone de una vacuna de protección cruzada.

La invención

La invención se define por las reivindicaciones y cualquier otro aspecto, consideración, configuración o realización expuesta en el presente documento que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones únicamente tiene fines informativos.

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

La invención proporciona un método para seleccionar una bacteria Streptococcus suis, preferentemente para su uso en una vacuna, preferentemente para uso en una vacuna para generar protección contra una infección bacteriana, que comprende seleccionar una cepa bacteriana progenitora generalmente capaz de transportar folato y de sintetizar folato y seleccionar una bacteria de esa cepa progenitora que tenga una modificación tal como una mutación, deleción o inserción en la región del ADN que codifica la proteína de unión al sustrato de folato (conocida en Streptococcus suis como el gen folT) de dicha bacteria y seleccionar dicha bacteria por la capacidad de crecer a tasas similares a las de dicha cepa progenitora in vitro pero crecer a tasas reducidas en comparación con dicha cepa progenitora in vivo. La invención también proporciona un método para producir una bacteria Streptococcus suis, preferentemente para su uso en una vacuna, preferentemente una vacuna para usar para generar protección contra una infección bacteriana, que comprende seleccionar una cepa bacteriana progenitora generalmente capaz de transportar folato y de sintetizar folato y transformar, preferentemente por medios recombinantes, una bacteria procedente de esa cepa progenitora proporcionándole una modificación, tal como una mutación, deleción o inserción en la región del ADN que codifica la proteína de unión al sustrato de folato (conocida en Streptococcus suis como el gen folT) de dicha bacteria y seleccionar dicha bacteria por la capacidad de crecer a tasas similares a las de dicha cepa progenitora in vitro pero crecer a tasas reducidas en comparación con dicha cepa progenitora in vivo. La invención también proporciona una bacteria, un cultivo bacteriano obtenible u obtenido con un método de selección o transformación de acuerdo con la invención. Dicha bacteria, tal como se proporciona en el presente documento, se puede clasificar como Streptococcus suis. La invención también proporciona una composición que comprende una bacteria o un cultivo de una bacteria capaz de crecer a tasas similares a las de dicha cepa progenitora in vitro pero creciendo a tasas reducidas en comparación con dicha cepa progenitora in vivo. También se proporciona el uso de dicha composición para la producción de una vacuna. Preferiblemente, dicha vacuna comprende una bacteria o un cultivo de una bacteria capaz de crecer a tasas similares a las de dicha cepa progenitora in vitro pero que crece a tasas reducidas en comparación con dicha cepa progenitora in vivo.

La invención también proporciona un método para reducir (atenuar) la virulencia de una bacteria, siendo dicha bacteria preferentemente capaz de realizar la síntesis de novo de folato, que comprende reducir la capacidad de dicha bacteria para transportar folato. Los inventores proporcionan una bacteria, denominada generalmente en el presente documento mutante AFolT, en particular, en el presente documento se proporciona una cepa de Streptococcus suis, en donde dicha capacidad se ha reducido fuertemente mediante la deleción funcional de la función del transportador de folato (FolT). Esta bacteria, como se proporciona en el presente documento, sigue teniendo la capacidad de producir folato para su propio uso mediante la aplicación de sus rutas de síntesis de folato de novo. Al tener intactas estas rutas de síntesis, queda sin afectar su capacidad para el crecimiento in vitro (en cultivo), sin embargo, se demostró que, sorprendentemente, se había reducido mucho su crecimiento y su virulencia en el hospedador (in vivo). Esta cepa bacteriana que crece bien in vitro pero crece menos in vivo que su cepa progenitora y tiene asociada una virulencia fuertemente reducida in vivo es muy útil como cepa vacunal. Dicha cepa o mutante proporcionado por la invención, por un lado, esencialmente no se ve afectado en la síntesis de folato y, por lo tanto, es capaz de crecer a títulos altos y, de este modo, es relativamente fácil y económico de producir, mientras que, por otro lado, debido a su crecimiento reducido y virulencia reducida en su hospedador en comparación con su cepa progenitora, es relativamente inocuo después de su aplicación in vivo, lo que hace que sea extremadamente útil como vacuna dirigida contra una infección bacteriana.

Un prototipo de cepa mutante AFolT provista de una modificación en la región del ADN que codifica la proteína de unión al sustrato de folato (en Streptococcus suis conocida como gen folT) y que tiene un crecimiento en cultivo (in vitro) similar al de su cepa progenitora pero con un crecimiento reducido in vivo a diferencia de su cepa progenitora, se ha depositado como "mutante AFolT de Streptococcus suis CBS 140425" en el Centraalbureau voor Schimmelcultures a efectos del procedimiento de patente en virtud del Reglamento del Tratado de Budapest el 19 de agosto de 2015. Otro prototipo de cepa mutante AFolT provista de una modificación en la región del ADN que codifica la proteína de unión al sustrato de folato (en Streptococcus suis conocida como gen folT) y que tiene un crecimiento en cultivo (in vitro) similar al de su cepa progenitora pero con un crecimiento reducido in vivo a diferencia de su cepa progenitora, se ha depositado como "mutante AFolT2 de Streptococcus suis CBS 143192" en el Westerdijk Fungal Biodiversity Institute el 25 de agosto de 2017.

La capacidad de síntesis de folato de novo de una bacteria se puede probar fácilmente mediante métodos conocidos en la técnica, tales como mediante el ensayo de crecimiento de la bacteria en medios de cultivo sin folato, en comparación con medios de cultivo proporcionados con folato u otros métodos revisados en BMC Genomics 2007, 8:245 (doi:10.1186/1471-2164-8-245,).

La mayoría de las bacterias tienen al menos dos rutas independientes para adquirir tetrahidrofolato: una que sigue la ruta clásica de síntesis de folato y un método rápido que usa el transportador de folato para importar folato. Esto ocurre in vitro, según el presente documento, siempre que haya suficientes nutrientes y energía disponibles para utilizar la ruta de síntesis clásica. Sin desear quedar limitado por la teoría, pero ofreciendo una posible explicación de los efectos encontrados por los inventores, in vivo, cuando puede haber falta de nutrientes y, por lo tanto, de energía, puede ser mucho más difícil emplear la producción de THF siguiendo la ruta clásica. En este caso aparentemente se elige la alternativa de importar folato. Basándose en experimentos en curso, los presentes inventores postulan que la expresión de folT es una carga para la bacteria, probablemente debido a su alta hidrofobia. In vitro, una mayor expresión de folT disminuye la tasa de crecimiento. Esta es probablemente la razón por la cual la expresión de folT está tan estrictamente regulada por la presencia de su ribointerruptor. Solo debe expresarse cuando exista absoluta necesidad. En conclusión, parece haber un equilibrio entre la disponibilidad de nutrientes y la necesidad de THF frente a la carga de la expresión de la proteína. Los inventores han encontrado ahora en el presente documento que este equilibrio se desplaza in vitro hacia un lado, mayor síntesis de novo de folato e, in vivo, se desplaza hacia el otro lado, mayor transporte de folato. Sorprendentemente, la atenuación (reducción) del transporte de folato en la ruta in vivo, preferentemente mediante la desactivación del transporte de folato en la ruta in vivo por deleción funcional de la función del transportador de folato, reduce la virulencia bacteriana en el hospedador y no en el cultivo. La invención proporciona un mutante AFolT de una bacteria que tiene capacidad reducida para transportar folato, en donde dicha capacidad se ha reducido mediante la deleción funcional de la función del transportador de folato (FolT). En particular, los inventores del presente documento proporcionan un método para atenuar (reducir) la expresión y/o función de la proteína de unión al sustrato de folato (FolT) de dicha bacteria, en particular proporcionando una mutación, deleción o inserción en el gen folT de dicha bacteria o en el promotor de dicho gen. Tal mutación, deleción o inserción pueden detectarse mediante PCR y/o análisis de secuencias, como se conoce en la técnica. En una realización particular de la invención, se proporciona un método para desactivar el gen folT, atenuando una bacteria, tal como S. suis, considerablemente, y haciendo que sea adecuada para su uso in vivo como una cepa vacunal que aún se puede cultivar fácilmente in vitro. En otra realización, la invención proporciona un método en donde dicha virulencia se atenúa proporcionando una mutación, deleción o inserción en el ADN de dicha bacteria que codifica una región transmembrana de la proteína de unión al sustrato de folato FolT, preferentemente dejando prácticamente intacta la inmunogenicidad de FolT, aún más preferentemente dejando prácticamente intactos los dominios de proteína hidrófila de FolT. La invención proporciona además un método en donde dicha virulencia se atenúa proporcionando una mutación, deleción o inserción en la región de ADN que codifica FolT de dicha bacteria, que codifica una región crucial para la unión al sustrato, estando caracterizada dicha región en S. suis por un dominio peptídico que tiene un tramo de aminoácidos FYRKP. Se prefiere mutar al menos la arginina (R) en el tramo FYRKP para suprimir la unión de folato. De acuerdo con la invención, la bacteria es clasificable como Streptococcus suis. Se prefiere que un mutante AFolT de acuerdo con la invención tenga la capacidad de sintetizar folato; al tener intactas estas rutas de síntesis, queda sin afectar su capacidad de crecimiento in vitro (en cultivo), sin embargo, se reduce fuertemente su virulencia en un hospedador (in vivo), lo que hace que sea muy adecuado para uso en vacunas. El mutante AFolT de acuerdo con la invención tiene atenuada (reducida o impedida) la expresión de FolT, por ejemplo, caracterizada por una expresión reducida de FolT per se o por la expresión de una proteína variante de FolT con peso molecular reducido, tal como, por ejemplo, se puede probar ensayando constructos de nucleótidos específicos de FolT de dicho mutante en estudios de transcripción/traducción in vitro como se describe en la sección experimental del presente documento. En una realización particular preferida, la invención proporciona un mutante AFolT de acuerdo con la invención depositado como "mutante AFolT de Streptococcus suis CBS 140425 " en el Centraalbureau voor Schimmelcultures el 19 de agosto de 2015. En otra realización preferida particular, la invención proporciona un mutante AFolT de acuerdo con la invención depositado como "mutante AFoIT2 de Streptococcus suis CBS 143192" en el Westerdijk Fungal Biodiversity Institute el 25 de agosto de 2017.

En otra realización preferida particular, la invención proporciona una cepa mutante AFolT de acuerdo con la invención. Cualquiera de estos depósitos también se puede utilizar para proporcionar constructos de nucleótidos de mutantes de AFolT como constructos de control en estudios de expresión con mutantes A FolT bacterianos adicionales para estudiar la expresión del gen variante de FolT o la expresión de la proteína variante de FolT. Cualquiera de estos depósitos también se puede utilizar para proporcionar un cultivo bacteriano del mutante AFolT, o una composición que comprende el cultivo bacteriano del mutante AFolT de acuerdo con la invención. La presente invención también proporciona una bacteria con virulencia atenuada que puede obtenerse o se ha obtenido con un método proporcionado en el presente documento, y un cultivo de dicha bacteria. También se proporciona una composición que comprende una bacteria mutante AFolT o un cultivo del mutante AFolT de acuerdo con la invención, y el uso de dicha composición para la producción de una vacuna. La invención también proporciona una vacuna que comprende una bacteria mutante AFolT o un cultivo del mutante AFolT como se proporciona en el presente documento. En una realización preferida, se proporciona una cepa vacunal o vacuna de Streptococcus, que incluye un mutante AFolT capaz de expresar una proteína que no es de Streptococcus. Tal vector de cepa vacunal mutante AFolT de Streptococcus permite, cuando se usa en una vacuna, una protección contra patógenos distintos de Streptococcus. Debido a su carácter avirulento, una cepa vacunal de Streptococcus o mutante AFolT como se proporciona en el presente documento es muy adecuada para generar respuestas inmunitarias específicas y de larga duración, no solo contra antígenos estreptocócicos, sino también contra otros antígenos expresados por la cepa. Específicamente, los antígenos derivados de otro patógeno ahora se expresan sin los efectos perjudiciales del antígeno o patógeno, que de otro modo sería perjudicial para el hospedador. Un ejemplo de dicho vector es una cepa vacunal de Streptococcus o mutante AFolT en donde el antígeno procede de un patógeno, tal como Actinobacillus pleuropneumonia, Bordetella, Pasteurella, E. coli, Salmonella, Campylobacter, Serpulina y otros. También se proporciona una vacuna que incluye una cepa vacunal de Streptococcus o mutante AFolT y un vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o adyuvantes son bien conocidos en la técnica; son ejemplos de estos solución salina tamponada con fosfato, solución salina fisiológica, (dobles) emulsiones de aceite en agua, hidróxido de aluminio, Specol, polímeros de bloque o copolímeros, y otros. Una vacuna puede incluir una cepa vacunal en forma muerta o viva. Por ejemplo, una vacuna muerta que incluye una cepa que tiene (sobre)expresión de un antígeno estreptocócico o heterólogo o un factor de virulencia es muy adecuada para provocar una respuesta inmunitaria. Además, se proporciona una vacuna en donde la cepa está viva, debido a su carácter avirulento; una cepa vacunal de Streptococcus basada en un mutante AFolT, como se proporciona en el presente documento, es muy adecuada para generar respuestas inmunitarias específicas y de larga duración. También se proporciona un método para controlar o erradicar una enfermedad estreptocócica en una población, comprendiendo el método vacunar a los sujetos de la población con una vacuna de mutante AFolT de acuerdo con la invención. En el presente documento se dispuso que S. suis tiene un operón que tiene un papel importante en la patogénesis y/o virulencia de S. suis. El operón codifica dos genes implicados en la adquisición y el procesamiento de folato para producir tetrahidrofolato. El folato es un término general para un grupo de vitaminas B hidrosolubles, donde folato se refiere a varios derivados de tetrahidrofolato. Estos derivados pueden entrar en el ciclo metabólico principal del folato, ya sea directamente o después de la reducción inicial y la metilación para dar tetrahidrofolato. El folato es esencial para todos los organismos vivos, tanto procariotas como eucariotas, lo que hace del metabolismo del folato un proceso crucial. El operón folT-folC parece formar una ruta de escape para adquirir folato en condiciones de restricción de folato, como por ejemplo in vivo donde el hospedador secuestra folato para su propio uso. En estas condiciones, la expresión del operón folT-folC se induce por el ribointerruptor. Cuando los niveles de folato bajan, se liberará tetrahidrofolato del ribointerruptor, permitiendo que se despliegue. Esto permite el inicio de la traducción mediante la liberación del sitio de unión al ribosoma. La expresión de folT-folC permite que S. suis importe folato directamente por el complejo transportador de folato y posteriormente se procese el folato en tetrahidrofolato por folC. Dado que el folato es crítico para la síntesis de nucleótidos, la adquisición de folato tiene un efecto directo sobre la tasa de crecimiento de S. suis. La disminución de las tasas de crecimiento in vivo conduce a una disminución de la virulencia. Debido a la demostración de que los mutantes de inactivación (knockout) isogénicos de folT tales como un mutante depositado como CBS 140425 o como CBS 143192 están fuertemente atenuados y son útiles como vacuna, este hallazgo fue respaldado aún más. De hecho, el operón está involucrado en la patogénesis in vivo. La presente invención ahora proporciona dichos mutantes y cultivos y composiciones y vacunas que comprenden dicha cepa mutante de inactivación de FolT que tiene virulencia reducida. La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende una bacteria que tiene dicha virulencia reducida, y el uso de dicha composición para la producción de una vacuna, Adicionalmente, en el presente documento se proporciona una vacuna que comprende un mutante bacteriano AFolT, tal como un mutante depositado como CBS 140425 o como CBS 143192, o un cultivo o una composición del mismo. La invención también proporciona un kit para vacunar a un animal, preferentemente a un cerdo, contra una enfermedad asociada a una infección por Streptococcus suis, que comprende: un dispensador para administrar una vacuna a un animal, preferentemente a un cerdo; y una cepa mutante AFolT, tal como un mutante depositado como CBS 140425 o como CBS 143192, de acuerdo con la invención, o cultivo y opcionalmente un folleto de instrucciones. Para concluir, la invención proporciona un método general para reducir la virulencia de una bacteria que comprende reducir la capacidad de dicha bacteria para transportar folato, siendo el método aplicable en particular cuando dicha bacteria es capaz de realizar la síntesis de folato de novo. El método de la invención, tal como se proporciona en el presente documento, comprende seleccionar una bacteria que tiene una proteína de unión al sustrato de folato funcional y posteriormente atenuar la expresión y/o función de la proteína de unión al sustrato de folato (FolT) de dicha bacteria, en particular en donde dicha virulencia se atenúa proporcionando una mutación, deleción o inserción en el gen folT de dicha bacteria, por ejemplo, proporcionando una mutación, deleción o inserción en el ADN de dicha bacteria que codifica el promotor del gen folT. En ciertas realizaciones de la invención se prefiere atenuar dicha virulencia proporcionando una mutación, deleción o inserción en el ADN de dicha bacteria que codifica una región transmembrana de la proteína de unión al sustrato de folato FolT. En otra realización particular, dicha virulencia se atenúa proporcionando una mutación, deleción o inserción en la región de ADN que codifica FolT de dicha bacteria que codifica una región crucial para la unión al sustrato. Asimismo, en el presente documento se proporciona un método para obtener una composición inmunogénica o vacuna que es aplicable a una bacteria, en donde dicha bacteria es Firmicutes, preferentemente Streptococcus, más preferentemente Streptococcus suis, más preferentemente un mutante AFolT depositado como "mutante AFolT de Streptococcus suis CBS 140425" en el Centraal bureau voor Schimmelcultures el 19 de agosto de 2015, aún más preferentemente un mutante AFolT depositado como "mutante AFoIT2 de Streptococcus suis CBS 143192" en el Westerdijk Fungal Biodiversity Institute el 25 de agosto de 2017. La invención también proporciona una bacteria con virulencia atenuada que puede obtenerse u obtenida con un método para atenuar la virulencia mediante la atenuación de la expresión de FolT de acuerdo con la invención, y proporciona un cultivo de dicha bacteria, y una composición que comprende dicha bacteria que tiene virulencia reducida o un cultivo de dicha bacteria que tiene virulencia reducida, y una composición inmunogénica que comprende una bacteria que tiene virulencia reducida o un cultivo de una bacteria que tiene virulencia reducida, y proporciona el uso de un cultivo de dicha bacteria que tiene atenuada la expresión de FolT o una composición de un cultivo bacteriano que tiene atenuada la expresión de FolT para la producción de una vacuna. La invención también proporciona una vacuna que comprende una bacteria que tiene atenuada la expresión de FolT o un cultivo de una bacteria que tiene atenuada la expresión de FolT o que comprende una composición de un cultivo de una bacteria que tiene atenuada la expresión de FolT. La invención también proporciona un kit para vacunar a un animal, contra una enfermedad asociada con una infección por una bacteria particular que tiene expresión de FolT que comprende a) un dispensador para administrar una vacuna a un animal, y b) una cepa de inactivación isogénica (mutante) de dicha bacteria particular que tiene atenuada la expresión de FolT, o un cultivo de una cepa de inactivación isogénica de dicha bacteria particular que tiene atenuada la expresión de FolT, o una composición que comprende un cultivo de una cepa de inactivación isogénica de dicha bacteria particular que tiene atenuada la expresión de FolT, y c) opcionalmente un folleto de instrucciones. Dicha bacteria particular, de acuerdo con la invención, que tiene atenuada la expresión de FolT y que tiene una capacidad reducida para transportar folato, en donde dicha capacidad se ha reducido mediante la deleción funcional de la función del transportador de folato (FolT), en general tienen buenas características de crecimiento en medios de cultivo, en particular cuando se usa un mutante AFolT de acuerdo con la invención que tiene la capacidad de sintetizar folato; al tener intactas estas rutas de síntesis, queda sin afectar su capacidad de crecimiento in vitro (en cultivo), sin embargo, se reduce fuertemente su virulencia en un hospedador (in vivo), lo que hace que sea muy adecuado para uso en vacunas.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS

Figura 1.

V[10] representa el clon que se identificó usando una estrategia de complementación que contiene dos ORF incompletos (flechas de color azul grisáceo) y un operón putativo (de color morado) que contiene orf2[10] y folC[10] precedidos por el promotor putativo del operón (para mayor claridad, solo se representa en el diagrama la secuencia de la región -35 (TGGACA) del promotor putativo). Se prepararon constructos que contenían orf2[10] o folC[10] (color morado) precedidos por la región -35 putativa de la región promotora putativa del operón (color morado). Se preparó un constructo que contenía orf2 a partir de la cepa S735 (color verde) con la región -35 del promotor S735 putativo (TGGTCA) (color verde). El mismo constructo fue mutagenizado para que contuviera la región -35 de la secuencia promotora putativa de la cepa 10 (TGGACA) (color morado) produciendo orf2[S735] [t488a].

Figura 2. Transcripción/traducción in vitro de FolC y ORF2/FoIT. Traducción y transcripción in vitro del constructo de control pCOM1 (carril 1) y de los constructos pCOM1-V[10] (carril 2) y pCOM1-folc[10] (carril 3). El marcador de peso molecular está indicado en kDa a la derecha. La expresión de FolC se detectó con el peso esperado de 46,8 kDa (punta de flecha negra), mientras que la expresión de OR2/FolT se detectó a un peso molecular más bajo, de 14 kDa, de lo esperado (20,5 kDa) (punta de flecha blanca).

Figura 3. Ribointerruptor predicho para tetrahidrofolato usando Rfam. La estructuración tridimensional del ARN sugirió un ribointerruptor en el que dos sitios putativos de unión al ribosoma (flechas azules) son inaccesibles para los ribosomas debido al plegamiento.

Figura 4. Alineamiento Clustal W de diferentes secuencias de FoIT. * indica aminoácidos idénticos; : indica conservación entre grupos de propiedades muy similares; . indica conservación entre grupos de propiedades poco similares. CB = Clostridium bolteae (SEQ ID N^o :17); CP = Clostridium phytofermentans (SEQ ID NO:18); A ^m = Alkaliphilus metalliredigens (SEQ ID NO:19); TT = Thermoanaerobacter tengcongensis (SEQ ID NO:20);; EFM = Enterococcus faecium (SEQ ID NO:21); EFS = Enterococcus faecalis (SEQ ID NO:22); LB = Lactobacillus brevis (SEQ ID NO:23); SM = Streptococcus mutans (SEQ ID NO:24); SG = Streptococcus gallolyticus (SEQ ID NO:25); SUB = Streptococcus uberis (SEQ ID NO:26); S^s U = Streptococcus suis P1/7 (SEQ ID NO:27).

El color rojo indica los aminoácidos pequeños e hidrófobos (incluido el aminoácido aromático -Tyr); el color azul indica aminoácidos ácidos; el color magenta indica aminoácidos básicos y el color verde indica hidroxilo, sulfhidrilo, amina y Gly.

Figura 5. Metabolismo del folato en Streptococcus suis.

Presentación esquemática del metabolismo del folato putativo de S. suis.

Figura 6. Niveles de expresión de orf2 y folC en aislados de tipo silvestre y mutantes de S. suis.

Nivel de expresión de orf2 y folC en aislados de tipo silvestre de S. suis de la cepa 10 (barras negras) y S735 (barras blancas) cultivados exponencialmente en Todd Hewitt (panel A); y en la cepa S735 complementada con plásmido de control vacío pCOM1 (barras negras), con orf2[10] (barras blancas) o con orf2[S735] (barras sombreadas) cultivadas exponencialmente en Todd Hewitt (panel B). Nivel de expresión de orf2 en S735 complementado con orf2[10], orf2[S735] y orf2[S735] [t488a] después del crecimiento en Todd Hewitt hasta la fase exponencial temprana (EEP) (barras blancas), fase exponencial (EP) (barras sombreadas pequeñas), fase exponencial tardía (LEP) (barras sombreadas grandes) y fase estacionaria (SP) (barras negras) (panel C). Los niveles de expresión se determinaron usando qPCR y se expresaron como expresión relativa al gen constitutivo recA. Todos los experimentos se realizaron por triplicado; las barras de error indican el error típico de la media. El significado se determinó mediante pruebas t pareadas. * p < 0,05; ** p < 0,01.

Figura 7. Estructura tridimensional predicha para la proteína FoIT de S. suis.

Figura 8. Temperatura corporal de lechones después de la infección por S. suis, experimento 1. Se representan las temperaturas corporales promedio de lechones (n = 5) infectados con la cepa de tipo silvestre 10 (color rosa) o con la cepa 10AfolT (CBS 140425). Las barras de error indican el error típico de la media.

Figura 9. Bacteriemia de lechones después de la infección por S. suis, experimento 1. Se representa la bacteriemia promedio de lechones (n = 5) infectados con la cepa de tipo silvestre 10 (color rosa) o con la cepa 10AfolT (CBS 140425) (color azul). Las barras de error indican el error típico de la media.

Figura 10. Curvas de supervivencia de cerdos infectados con S. suis, experimento 1. Los cerdos se infectaron con la cepa 10 de tipo silvestre o con la cepa 10AfolT (CBS 140425). Los cerdos fueron sacrificados cuando alcanzaron criterios de valoración humanitarios predeterminados por razones éticas. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba Log-rank (Mantel-Cox).

Figura 11. Examen bacteriológico de lechones infectados con S. suis, experimento 1. Los cerdos se infectaron con la cepa 10 de tipo silvestre o con la cepa 10AfolT (CBS 140425) Las bacterias se enumeraron por dilución en serie y cultivo en placas. Los recuentos bacterianos se calcularon como UFC/ml. Diferentes colores indicaron diferentes lechones individuales.

Figura 12. Curvas de supervivencia de lechones infectados con S. suis, experimento 2. Se infectaron lechones (n=10) con la cepa 10 de tipo silvestre o con la cepa 10AfolT (CBS 140425) Los cerdos fueron sacrificados cuando alcanzaron criterios de valoración humanitarios predeterminados por razones éticas.

Figura 13. Temperatura corporal de los lechones después de la infección por S. suis, experimento 2. Se representan las temperaturas corporales promedio de lechones (n = 10) infectados con la cepa de tipo silvestre 10 (color azul) o con la cepa 10AfolT (CBS 140425) (color verde).

Figura 14. Locomoción de lechones después de la infección por S. suis, experimento 2. Se muestra el porcentaje de observaciones positivas en lechones infectados con la cepa de tipo silvestre 10 (color azul) o con la cepa 10AfolT (CBS 140425). Gravedad en locomoción 1: cojera leve; 2: cojera moderada o reticencia a levantarse; 3: cojera severa (que sirve como criterio de valoración humanitario)

Figura 15. Conciencia de los lechones después de la infección por S. suis, experimento 2. El porcentaje de observaciones positivas en lechones infectados con la cepa de tipo silvestre 10 (color azul) o con la cepa 10AfolT (CBS 140425). Gravedad en Conciencia: 1: depresión; 2: apatía; 3: coma

Figura 16. Vacunación de cerdos con la cepa AFolT 2 (CBS 143192) y protección después de la exposición a S. suis de tipo 2. Los cerdos se vacunaron los días 1 y 21 con la cepa AFoIT2 (CBS 143192). El día 35, los animales se expusieron por vía intraperitoneal (ip) a aproximadamente 2x109UFC de un aislado virulento de S. suis de tipo 2. Durante los siete días posteriores a la exposición, los animales fueron observados en busca de signos de enfermedad asociados con S. suis. Los animales encontrados muertos o que tuvieron que ser sacrificados antes del punto de observación del ensayo por razones de bienestar animal se sometieron a necropsia. La figura muestra el porcentaje de animales que murieron o fueron sacrificados después de la exposición (mortalidad).

Figura 17. Vacunación de cerdos con la cepa AFolT (CSB140425) y protección después de la exposición a S. suis de tipo 2.

Los cerdos se vacunaron los días 1 y 21 con la cepa AFolT (CBS 140425). El día 36, los animales se expusieron por vía intraperitoneal a aproximadamente 2x109UFC de un aislado virulento de S. suis de tipo 2. Después de la exposición, los animales fueron observados en busca de signos de enfermedad asociados con S. suis durante siete días. Los animales encontrados muertos o que tuvieron que ser sacrificados antes del punto de observación del ensayo por razones de bienestar animal se sometieron a necropsia. La figura muestra el porcentaje de animales que murieron o fueron sacrificados después de la exposición (mortalidad).

Descripción detallada

Introducción

Anteriormente, los presentes inventores utilizaban una estrategia de complementación para identificar nuevos factores de virulencia, que podrían servir como candidatos a vacuna. Utilizando esta estrategia, se generó un aislado hipervirulento de S. suis (S735-pCOM1-V[10]) que causa un síndrome similar al choque tóxico grave en lechones después de la infección, ocasionando la muerte en las 24 h posteriores a la infección [14]. S735-pCOM1-V[10] se seleccionó de una biblioteca de clones generados en un aislado de serotipo 2 débilmente virulento (S735), después de la transformación con ADN plasmídico aislado de aproximadamente 30.000 clones agrupados que contenían fragmentos de ADN genómico clonados aleatoriamente procedentes de un aislado de serotipo 2 virulento (cepa 10). Los aislados con mayor virulencia se seleccionaron infectando a los lechones con la cepa S735 que contenía la biblioteca de plásmidos de fragmentos genómicos de la cepa 10. Un clon prevalente aislado de los lechones infectados contenía un fragmento genómico de 3 kb de la cepa 10 denominado V[10] y se demostró que era hipervirulento en experimentos con animales posteriores. V[10] contenía un marco de lectura abierto (ORF) incompleto, seguido de dos genes (orf2 y folC) en una estructura de operón así como un segundo ORF incompleto. Suponiendo que solo los ORF completos podrían contribuir a la hipervirulencia de este aislado, se caracterizó adicionalmente el orf2-foIC-operón. Del primer ORF en el operón no se tenía información y se denominó orf2, el segundo ORF en el operón mostró homología con el gen que codifica la polifolilpoliglutamato sintasa (FolC). Este operón estaba presente en todos los serotipos de S. suis, incluyendo la cepa progenitora S735. La cepa S735 con baja virulencia, contenía varios polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en orf2-folC y las regiones no codificantes en comparación con la cepa 10. Los dos genes del operón que aumentaban la virulencia pueden ser factores de virulencia putativos y, si es así, podrían ser posibles candidatos a vacunas. Aquí, los presentes inventores investigaron 1) si la hipervirulencia del orf2-foIC-operón está causada por orf2 o por folC o por ambos y 2) el efecto de un polimorfismo de un solo nucleótido en la región promotora del orf2-foIC-operón sobre la virulencia.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas y plásmidos

Se cultivaron aislados de S. suis en caldo Todd-Hewitt (Oxoid, Londres, Reino Unido) y se sembraron en placas de agar Columbia con base de sangre (Oxoid) que contenían un 6 % (vol/vol) de sangre de caballo. Se cultivó Escherichia coli en caldo Luria y se sembraron en placas con caldo Luria que contenían un 1,5 % (peso/vol) de agar. Cuando fue necesario, se añadió eritomicina a 1 |jg ml-1 en el caso de S. suis y a 200 |jg ml-1 en el caso de E. coli. La cepa S735 de S. suis complementada con un plásmido que contenía un fragmento genómico de 3 kb derivado de la cepa 10 (S735-pCOM1-V[10]) y las otras cepas de S. suis utilizadas en este estudio se han descrito previamente [14] (Figura 1).

Ejemplo 1 Complementación de cepa S735 de S. suis

S735 se complementó con el plásmido pCOM1 que contenía uno de los dos ORF en el operón V[10] (es decir, orf2[10] o folC[10]) precedido por la región promotora putativa del operón de la cepa 10 o con el plásmido pCOM1 que contenía orf2 y el promotor cadena arriba afín de la cepa S735 (orf2[S735]) (Figura 1). Para construir estos plásmidos, se diseñaron cebadores con sitios de restricción para amplificar orf2[10] u orf2[S735] (comE1 - comE2), folC[10] (comE4 - comE6) o la región promotora del operón (comE1 - comE3) (Tabla 1). Los productos de PCR resultantes orf2[10] y of2[S735] se digirieron utilizando las enzimas de restricción Sacl y BamHI, se cloraron en pKUN19 [15], se digirieron con las mismas enzimas de restricción y posteriormente se clonaron en pCOM1, produciendo pCOM1-of2[10] y pCOM1-orf2[S735], respectivamente. El amplicón de PCR de folC[10] se digirió usando las enzimas de restricción Smal y BamHI y se clonó en pKUN19 escindido con las mismas enzimas de restricción. El producto de PCR que comprendía la región promotora de V[10] se clonó frente a folC[10] utilizando las enzimas de restricción Sacl y Smal. Posteriormente, el fragmento completo del promotor V[10] - folC[10] se digirió a partir de pKUN19 usando Sacl y BamHI y se clonó en pCOM1 digerido con las mismas enzimas de restricción, produciendo pCOM1-folC[10]. Para confirmar que el producto de fusión del promotor - folC[10] se había transcrito, se realizó una transcripción/traducción in vitro utilizando 35S-metionina. Se detectó una banda clara del peso molecular de FolC (46,8 kDa), lo que demuestra que el producto de fusión se podía expresar y traducir (Figura 2). Todos los plásmidos se introdujeron en la cepa S735 de S. suis mediante electroporación. Adicionalmente, se introdujo pCOM1-V[10] en la cepa avirulenta de serotipo 2 T15 mediante electroporación para producir T15-pCOM1-V[10].

Ejemplo 2 Infección experimental con aislados complementados

Se realizó la infección experimental de lechones libres de gérmenes nacidos por cesárea como se ha descrito anteriormente [14]. Antes de la infección, el estado libre de gérmenes de los lechones se confirmó sembrando frotis de amígdala en placas de agar Columbia que contenían un 6 % de sangre de caballo. En resumen, se infectaron por vía intravenosa 4 o 5 cerdos libres de gérmenes de una semana de edad con 106 unidades formadoras de colonias (UFC) de S. suis e inmediatamente después se administraron por vía oral 40 mg kg_1 de peso corporal de eritomicina (eritomicina-estearato, Abbott B.V., Amstelveen, Países Bajos) dos veces al día para mantener la presión selectiva sobre los aislados de S. suis que albergaban los plásmidos pCOM. Los cerdos infectados se supervisaron dos veces al día en busca de signos clínicos y se recogieron frotis de amígdala para el análisis bacteriológico. Los cerdos fueron sacrificados cuando se observaron signos clínicos de artritis, meningitis o sepsis después de la infección con S. suis. Durante la necropsia se recogieron muestras de tejido del SNC, membranas serosas y articulaciones, se homogeneizaron y los recuentos de células bacterianas se determinaron sembrando diluciones seriadas en placas con agar Columbia que contenían un 6 % de sangre de caballo y 1 |jg ml-1 de eritomicina. Para poder comparar los resultados de diferentes experimentos con animales incluidos en el presente documento, se aplicó una puntuación uniforme de síntomas no específicos y específicos a todos los experimentos con animales. Los síntomas no específicos incluyeron falta de apetito y depresión, que se calificaron como 0 (ninguno), 0,5 (falta de apetito/depresión leve) o 1 (falta de apetito/depresión grave). Los síntomas específicos incluyeron cojera, síntomas del sistema nervioso central (SNC) (trastornos del aparato locomotor dar vueltas o caminar en círculos; opistótonos; nistagmo), así como pelos de punta, espalda arqueada (cifosis) y temblores, ya que todos estos son síntomas de sepsis o serositis. Basándose en estas observaciones, se calcularon los índices clínicos dividiendo el número de observaciones en las que se observaron síntomas específicos o no específicos por el número total de observaciones para este parámetro. Esto representa un porcentaje de observaciones en las que se observaron síntomas específicos o no específicos. Se adoptó un enfoque similar para el "Índice de Fiebre". La fiebre se definió como una temperatura corporal > 40 °C. Como parámetro de supervivencia se utilizó el "número medio de días hasta la muerte". Aunque los animales fueron sacrificados después de alcanzar los criterios de valoración humanitarios (HEP), el tiempo entre la inoculación y el alcance de los HEP sigue siendo indicativo de la gravedad de la infección. Se calcula promediando la supervivencia en días desde la inoculación hasta la muerte.

Los experimentos con animales con la cepa CBS 140425 se realizaron en las instalaciones del Instituto Veterinario Central de Wageningen UR, Lelystad, Países Bajos (ahora llamado Wageningen Bioveterinary Research (WBVR)) y fueron aprobados por el comité ético del Instituto Veterinario Central de Wageningen UR, Lelystad, Países Bajos, de acuerdo con la ley holandesa sobre experimentos con animales (#809.47126.04/00/01 y #870.47126.04/01/01). También se realizaron experimentos con animales con las cepas CBS 140425 y 143192 de acuerdo con la ley estadounidense sobre experimentos con animales.

Se realizaron análisis estadísticos sobre los índices clínicos de los grupos (índice de fiebre, síntomas específicos y síntomas no específicos) utilizando una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, ya que no hubo homogeneidad de varianza entre los grupos. En análisis posteriores, todos los grupos se compararon por parejas con el grupo de control (S735-pCOM1) en los tres parámetros, utilizando las pruebas U de Mann-Whitney. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a un valor de p < 0,05. Los cálculos se realizaron con SPSS 19 (IBM, Nueva York, Estados Unidos).

Ejemplo 3 Infección experimental con la cepa 10AfolT (CBS 140425), experimento 1

Diez lechones de 4 semanas de edad se alojaron en las instalaciones para animales de CVI en dos grupos de cinco animales. Los lechones tenían acceso ad libitum a pienso y a agua dulce. Una luz proporcionaba calor a los animales y durante todo el experimento dispusieron de material para jugar. Antes de iniciar el experimento, se examinaron frotis de amígdala por PCR tras la colonización de S. suis de serotipo 2. Solo se incluyeron en el experimento lechones que dieron un resultado negativo en la PCR. Después de diez días, los animales se infectaron por vía intravenosa con 1,1.106 UFC de la cepa de tipo silvestre 10 o con 9,2.105 CFU de la cepa mutante 10AfolT en la vena yugular. Antes de la infección, las temperaturas basales de los lechones se supervisaron diariamente durante un período de tres días. Se recogió sangre con EDTA antes de la infección para obtener muestras de plasma previas a la infección, así como los niveles basales de glóbulos blancos (WBC). Los cerdos infectados se supervisaron tres veces al día a las 8 pm, 3 am y 9 am en busca de signos clínicos. Los síntomas no específicos incluían falta de apetito y depresión, mientras que, los síntomas específicos incluían cojera, síntomas del sistema nervioso central (SNC) (trastornos del aparato locomotor dar vueltas o caminar en círculos; opistótonos; nistagmo), así como pelos de punta, espalda arqueada (cifosis) y temblores, todos los cuales son síntomas de sepsis o serositis. Se recogieron frotis de amígdala y heces diariamente para su análisis bacteriológico. Se recogió sangre diariamente para su análisis bacteriológico, recuento de glóbulos blancos y recolección de plasma. Los cerdos fueron sacrificados cuando se observaron signos clínicos de artritis, meningitis o sepsis después de la infección con S. suis. En la necropsia, se examinaron bacteriológicamente los órganos internos (riñón, hígado, bazo, peritoneo y pericardio) para S. suis mediante siembra en placas con agar Columbia que contenían un 6 % de sangre de caballo. Los órganos macroscópicamente afectados por S. suis, como articulaciones con artritis purulenta, pericarditis o peritonitis se sembraron en diluciones seriadas para determinar la carga bacteriana. Las muestras de tejido de estos órganos se fijaron en formalina para el examen histológico. El experimento con animales fue aprobado por el comité ético del Instituto Veterinario Central de Wageningen UR, Lelystad, Países Bajos, de acuerdo con la ley holandesa sobre experimentos con animales (#2014011).

Ejemplo 4 Infección experimental con cepa 10AfolT (CBS 140425), experimento 2

En un segundo experimento, se utilizaron lechones de aproximadamente 3 semanas de edad (cruce comercial). Los lechones no habían sido vacunados contra S. suis, procedían de una piara negativa para PRRSV, nunca habían recibido pienso medicado y el frotis de amígdala era negativo para S. suis de serotipo 2 por PCR en el momento de la inscripción. Los grupos de tratamiento (de 10 lechones cada uno) se alojaron por separado. En los animales se inocularon por vía intravenosa 3,48E+07 UFC de la cepa 10 de tipo silvestre o 1,45^e +07 de la cepa mutante 10AfolT. Los animales fueron observados una vez al día en busca de signos clínicos de enfermedad asociada a S. suis (por ejemplo, aumento de la temperatura corporal, cojera y cambios en el comportamiento) durante 7 días. Todos los animales que mostraban signos clínicos que alcanzaron criterios de valoración (p. ej., signos del SNC, cojera debilitante) se sacrificaron para minimizar el sufrimiento. Los animales sacrificados fueron sometidos a necropsia para identificar lesiones típicamente asociadas con la enfermedad producida por S. suis enfermedad. Los animales que sobrevivieron hasta el final del período de observación también fueron sacrificados y sometidos a necropsia.

Ejemplo 5a Vacunación de cerdos con la cepa AFolT2 (CBS 143192) y protección después de la exposición a S. suis de tipo 2. El estudio se realizó en cerdos cruzados comerciales; el día de la primera vacunación, los cerdos tenían 21 ± 7 días de edad. Los animales no habían sido vacunados contra S. suis, el frotis de amígdala era negativo para S. suis de tipo 2 por PCR, eran negativos para PRRSV por serología y procedían de cerdas que dieron un resultado negativo en el frotis de amígdala para S. suis de tipo 2 por PCR. Los grupos de estudio, la vía de vacunación y la dosis, los días de vacunación y el día y vía de exposición se presentan en la Tabla 6. Los medios utilizados se describen en la Tabla 7.

El día 34, se recogieron frotis de sangre y amígdala de todos los animales y posteriormente los animales de control estricto se trasladaron a un espacio separado mientras todos los demás grupos se mezclaron. El día 35, los animales se expusieron por vía intraperitoneal (ip) a aproximadamente 2x109UFC de un aislado virulento de S. suis de tipo 2.

Durante los siete días posteriores a la exposición, los animales fueron observados en busca de signos de enfermedad asociados con S. suis. Los animales encontrados muertos o que tuvieron que ser sacrificados antes del punto de observación del ensayo por razones de bienestar animal se sometieron a necropsia. Durante la necropsia, los animales fueron evaluados en busca de signos macroscópicos típicamente asociados con la enfermedad producida por S. suis y se recogieron frotis del SNC (es decir, del cerebro) y de las articulaciones. En el punto de observación del ensayo, todos los animales restantes se sacrificaron, se sometieron a necropsia y se recogieron muestras.

La preparación de las vacunas y el placebo se presentan en la Tabla 7.

La preparación del material de exposición se presenta en la Tabla 8.

La vacunación con el mutante AFolT de S. suis redujo el número de animales que murieron o tuvieron que ser sacrificados por razones de bienestar animal durante el período de observación posterior a la exposición (véase la Tabla 9 y la Figura 16). Adicionalmente, la vacunación con AFolT redujo los hallazgos de cojera grave (es decir, el número de animales que no pueden levantarse o son reacios a levantarse), así como hallazgos de apatía en los que los animales mostraban un interés muy limitado o nulo por el entorno (véanse las Tablas 10 y 11).

Durante la necropsia, en los animales vacunados con AfolT se observaron signos de inflamación en el cerebro, indicado por la presencia de fibrina y/o líquido, con menor frecuencia que en los controles negativos (véase la Tabla 12).

En los animales vacunados con la cepa AfolT, el aislado de exposición de S. suis se recuperó con menos frecuencia del cerebro y los frotis de articulaciones recogidos en la necropsia que en los controles negativos (véanse las Tablas 13 y 14).

Ejemplo 5b Vacunación de cerdos con la cepa 10Afo/T (CBS 140425) y protección después de la exposición a S. suis de tipo 2

El estudio se realizó en cerdos cruzados comerciales, 21 /-5 días al día de la primera vacunación. Los animales no habían sido vacunados contra S. suis, el frotis de amígdala era negativo para S. suis de tipo 2 por PCR, eran negativos para PRRSV por serología y procedían de cerdas que dieron un resultado negativo en el frotis de amígdala para S. suis de tipo 2 por PCR. Los grupos de estudio, el número de animales/grupo en el momento del inicio del estudio, la dosis de vacunación, los días de vacunación, la vía de vacunación, el día de la exposición y la vía de exposición se presentan en la Tabla 15. El día 35, se recogieron frotis de sangre y amígdala de todos los animales y se sacrificó a los animales de control estricto. El día 36, los animales se expusieron por vía intraperitoneal a aproximadamente 2x109UFC de un aislado virulento de S. suis de tipo 2.

Después de la exposición, los animales fueron observados en busca de signos de enfermedad asociados con S. suis durante siete días. Los animales encontrados muertos o que tuvieron que ser sacrificados antes del punto de observación del ensayo por razones de bienestar animal se sometieron a necropsia. Durante la necropsia, los animales fueron evaluados en busca de signos macroscópicos típicamente asociados con la enfermedad producida por S. suis y se recogieron frotis del SNC. En el punto de observación del ensayo, todos los animales restantes se sacrificaron, se sometieron a necropsia y se recogieron muestras.

La preparación de la vacuna y el placebo se presentan en la Tabla 16. La preparación del material de exposición se presenta en la Tabla 17.

El mutante FolT de S. suis redujo el número de animales que mostraban cojera después de la exposición, el número de animales que mostraron un comportamiento anormal (es decir, depresión, coma) después de la exposición, así como el número de animales que murieron o tuvieron que ser sacrificados por razones de bienestar animal durante el período de observación posterior a la exposición (véase la Tabla 18, 19 y 20 y la figura 17).

En el punto de observación del ensayo (es decir, en el día 7 después de la exposición o tras retirarlos del estudio debido a muerte o eutanasia), se observaron los animales en busca de hallazgos anormales en el cerebro (es decir, fibrina, líquido), así como en la cavidad torácica (es decir, fibrina, líquido, congestión pulmonar, neumonía). Adicionalmente, se recogieron muestras del cerebro para la recuperación de S. suis. Los resultados se presentan en las Tablas 21, 22 y 23.

Ejemplo 6 Síntesis de ADNc y PCR cuantitativa

RT-PCR

Se utilizaron 200 ng de ARN para sintetizar ADNc en una reacción que contenía 25 ng pl-1 de cebadores aleatorios (Promega, Madison, WI, Estados Unidos), dNTP 10 mM (Promega), DTT 10 mM (Invitrogen), 40 U de RNAsin (Promega) y transcriptasa inversa SuperScriptll (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.

qPCR

El ADNc se diluyó 20 veces para el análisis de qPCR. Se diseñaron cebadores utilizando el software PrimerExpress (Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos) (Tabla 1). Cada reacción contenía 12,5 pmol de cebador directo, 12,5 pmol de cebador inverso y mezcla maestra de PCR POWR SYBR Green (Applied Biosystems) según las instrucciones del fabricante. La qPCR se realizó utilizando un AB17500 (Applied Biosystems). Se usó el software GeNorm (GeNorm) para determinar los genes de referencia expresados de manera más estable. Para S. suis, recA fue el menos variable en la expresión de los 6 genes de referencia potenciales (fosfogelicerato deshidrogenasa (pgd), acetil-coA acetiltransferasa (aca), mutS, glutamato deshidrogenasa (gdh) ensayados. Genorm combina datos de expresión en un número que representa la estabilidad de la expresión, donde 1 representa el gen más estable. Los números de estabilidad para S. suis variaban de 1,667 para gdh a 1,217 para recA. El nivel de expresión de estos genes de referencia se midió para controlar la variación en el rendimiento de ARN y las condiciones de reacción de RT. En cada ciclo de qPCR se incorporó una curva patrón que consistía en un vector que contenía un producto de PCR clonado del gen diana de esa reacción. La curva patrón consistía en siete diluciones de 10 veces del vector de control. De esta forma, tanto el nivel de expresión del gen diana como los niveles de expresión de los genes de referencia externos podrían calcularse a partir de una curva patrón. Para cada reacción, se incluyó agua en lugar de ADNc o molde como control negativo. El análisis se realizó utilizando el software AB17500 (Applied Biosystems).

Análisis de secuencia

Las reacciones de secuencia y el análisis se realizaron por Baseclear (Leiden, Países Bajos).

Ejemplo 7 Mutagénesis dirigida

La mutagénesis dirigida se consiguió utilizando el kit de mutagénesis dirigida Quick-change II (Agilent Technologies, La Jolla, CA, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores de PCR se diseñaron con el software adjunto (Agilent Technologies) (Tabla 1). Utilizando los cebadores t448a y t488a_antisense, se amplificó el plásmido pCOM-orf2[S735], introduciendo la mutación deseada que cambiaba la región -35 de la región promotora putativa del orf2-foIC-operón de S735 de 5'-TGGTCA-3' a 5'-TGGACA-3' (Figura 1). La mezcla de reacción se digirió usando Dpnl para inactivar el vector molde original y posteriormente se utilizó para transformar células competentes XL-1-blue (Invitrogen). Para excluir la posibilidad de introducir errores de PCR en la cadena principal del vector, el inserto del plásmido (orf2[S735]) se aisló del vector molde después de la digestión con las enzimas de restricción BamHI y Sacl y se clonó en pCOM1 digerido con las mismas enzimas de restricción. El plásmido resultante se introdujo en el aislado S735 de S. suis por electroporación y los transformantes fueron seleccionados en agar Columbia que contenía 1 |jg ml-1 de eritomicina, produciendo S735-pCOM1- orf2[S735][t488a]. Se utilizó la secuenciación para excluir la presencia de errores de PCR en el constructo final.

Ejemplo 8 Construcción de mutante de inactivación (knock-out) de la proteína de unión al sustrato de folato (folT) de S. suis

Se construyó un mutante de inactivación de folT isogénico en la cepa 10 mediante la interrupción de folT con un casete de resistencia a la espectinomicina. Se digirió pCOM1-V[10] [14] con BamHI y se ligó en el plásmido pKUN digerido con BamHI, produciendo pKUN-V[10]. Para eliminar la parte 3' de V[10], pKUN-V[10] se digirió con Sphl, después de lo cual el fragmento del vector se purificó y ligó, produciendo pKUN-V[10]*. pKUN-V[10]* se digirió parcialmente con Xmnl, el fragmento del vector lineal se purificó y se ligó con el casete de resistencia a la espectinomicina de extremos romos, produciendo pKUN-V[10]*-SpecR. Para la construcción del mutante, V[10]*-SpecR se amplificó por PCR usando V735-dir y M13-inv. El producto de PCR se purificó utilizando el kit de purificación de PCR (Qiagen). El producto de PCR purificado se usó para transformar la cepa 10 de S. suis usando ComS como inductor de competencia como se describe por Zaccaria et al. [16] para inducir la recombinación homóloga. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar Columbia que contenían un 6 % (vol/vol) de sangre de caballo y 100 jg ml-1 espectinomicina. Los cruces dobles se comprobaron mediante PCR y se confirmaron mediante transferencia de Southern. Para excluir la posibilidad de introducción de mutaciones puntuales, se aisló el ADN cromosómico del mutante de inactivación isogénico y se utilizó para transformar la cepa 10. De nuevo, los mutantes se seleccionaron en placas de agar Columbia que contenían un 6 % (vol/vol) de sangre de caballo y 100 jg ml-1 de espectinomicina, y se examinaron por PCR, produciendo la cepa 10AfolT. Este prototipo de cepa mutante AFolT recombinante se ha depositado como "mutante AFolT de Streptococcus suis c Bs 140425" en el Centraalbureau voor Schimmelcultures a efectos del procedimiento de patente en virtud del Reglamento del Tratado de Budapest el 19 de agosto de 2015.

Ejemplo 9 Mutantes de deleción de AfolT que no contienen el gen de resistencia a la espectinomicina

También se construyó un mutante de deleción AfolT que no contenía el gen de resistencia a la espectinomicina. Para ello, se utilizó el vector lanzadera termosensible pSET5s (Takamatsu, D., Osaki, M. y Sekizaki, T. 2001. Plasmids 46: 140-148). El plásmido pSET5s contiene un origen de replicación sensible a la temperatura y se puede propagar a 37 °C en E. coli, pero la replicación del plásmido se bloquea por encima de 37 °C en S. suis (Takamatsu et al.). pSET5s contiene un gen de resistencia al cloranfenicol (Cm) que se puede utilizar para la selección de transformantes en E. coli así como en S. suis. Un prototipo de cepa mutante AFolT recombinante que no contiene el gen de resistencia a la espectinomicina se ha depositado como "mutante AFoIT2 de Streptococcus suis CBS 143192 " en el Westerdijk Fungal Biodiversity Institute a efectos del procedimiento de patente en virtud del Reglamento del Tratado de Budapest el 25 de agosto de 2017.

Para construir un aislado del mutante AfolT, se generó un producto de PCR que contenía las secuencias flanqueantes 5' y 3' del gen folT. Este fragmento se clonó en pSET5s y los transformantes resistentes a Cm se seleccionaron a 37 °C en E. coli. Posteriormente aisló el plásmido de E. coli y se introdujo en la cepa 10 de S. suis. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar Columbia a 30 °C que contenía Cm. Se usó una colonia transformada para inocular 1 ml de caldo Todd Hewitt (THB) que contenía Cm y el cultivo se dejó crecer durante la noche a 30 °C. El cultivo de toda la noche se diluyó 100 veces en el mismo medio y se incubó como se ha indicado anteriormente hasta que se alcanzó una densidad óptica a 600 nm de 0,2-0,3, a la que el cultivo se transfirió a 38 °C. A esta temperatura, el plásmido no puede replicarse. Esta etapa selecciona cepas en las que el plásmido se ha integrado en el cromosoma a través de un solo evento de recombinación. Se sembraron diluciones en serie de este cultivo en placas con agar Columbia con sangre de caballo que contenían Cm. Las placas se incubaron durante la noche a 38 °C. Se recogió una colonia que contenía el plásmido recombinante integrado en el cromosoma y se inoculó en 1 ml de caldo Todd Hewitt (THB) con Cm para su incubación durante la noche a 38 °C. El cultivo se diluyó 100 veces con THB sin Cm y se cultivó a 28 °C durante cinco pases posteriores. A esta temperatura, el plásmido es capaz de replicarse y se escinde del cromosoma a través de un segundo evento de recombinación sobre la secuencia del gen diana duplicado. La escisión del plásmido puede producir el genotipo de tipo silvestre o puede dar como resultado un mutante de deleción folT. Se sembraron diluciones en serie del cultivo en placas con agar Columbia con sangre de caballo (sin Cm) y se incubaron durante la noche a 38 °C. A continuación, se sembraron réplicas de colonias individuales en placas con agar Columbia con sangre de caballo y con y sin Cm. Las colonias sensibles a Cm se examinaron mediante PCR para identificar los aislados del mutante AfolT que no contenían el gen de resistencia a la espectinomicina.

Estudios de hibridación

Se aisló ADN cromosómico de cultivos en crecimiento estacionario de S. suis. Se pusieron 200 nanogramos de ADN purificado en Genescreen-Plus (Perkin Elmer, Estados Unidos). El marcaje de las sondas con 32P, la hibridación y el lavado se realizaron como se ha descrito anteriormente [17]. Como sonda se utilizaron productos de PCR de folT y folC, mientras que como control positivo se utilizó una sonda de ARNr 16S.

La sobreexpresión de folT es suficiente para inducir hipervirulencia en la cepa S735

La introducción de un fragmento genómico de 3 kb de la cepa 10 del serotipo 2 virulento, V[10], aumentó la virulencia de la cepa S735 de serotipo 2 débilmente virulenta [14], creando un aislado hipervirulento (S735-pCOM1-V[10]). Todos los cerdos infectados con S735-pCOM1-V[10] murieron en el plazo de 1 día después de la infección (p.i.) y un alto porcentaje de cerdos mostró signos clínicos graves de enfermedad (Tabla 2), mientras que casi todos los cerdos infectados con la cepa de control S735- pCOM1 sobrevivieron durante todo el experimento. Los índices clínicos difirieron significativamente (p < 0,01) entre cerdos infectados con S735-pCOM1-V[10] y S735-pCOM1 (Tabla 2). Como control, también se ensayó la virulencia de S735 transformado con un plásmido que contenía el fragmento homólogo de 3 kb de la cepa S735 (S735-pCOM1-V[S735]). Un alto porcentaje de los cerdos infectados con S735-pCOM1-V[S735] sobrevivieron a lo largo del experimento. Por el contrario, los cerdos infectados con S735-pCOM1-V[S735] mostraron signos clínicos significativamente más específicos (p < 0,01) que los cerdos infectados con S735-pCOM1 (Tabla 2), aunque las diferencias en los índices clínicos de fiebre y síntomas no específicos no fueron significativamente diferentes entre los grupos (p = 0,06). Por tanto, el aumento del número de copias de V[S735] en S735, debido a la introducción del plásmido pCOM1-V[S735] aumentó los signos clínicos específicos de S. suis. No obstante, los signos clínicos específicos y no específicos debidos a la infección porcina con S735-pCOM1-V[10] (p < 0,01) aumentaron significativamente en comparación con los cerdos infectados con S735-pCOM1-V[S735], demostrando que la introducción de V[10] en la cepa S735 aumentaba la virulencia más que la introducción de V[S735]. Este resultado indicó que la hipervirulencia de la cepa S735 pCOM-1-V[10] podría deberse a los diferentes polimorfismos de nucleótidos en V[10] en comparación con V[S735].

Para determinar si se requieren tanto el gen orf2 como el gen folC para el aumento observado en la virulencia, los dos genes del operón obtenido de la cepa 10 precedidos por su secuencia promotora afín se introdujeron por separado en la cepa S735 para generar las cepas S735-pCOM1-orf2[10] y S135-pCOM1-FoIC[10]. La virulencia de estos aislados se determinó en una infección experimental en lechones, usando S735-pCOM1-V[10] y S735-pCOM1 como controles. La Tabla 2 muestra que los cerdos infectados con S735-pCOM1-V[10] o con S735-pCOM1-orf2[10] morían dentro de un día p.i. con signos clínicos graves. Los cerdos infectados desarrollaron un síndrome similar al choque tóxico que no se observó usando la cepa 10 de tipo silvestre en infecciones experimentales, lo que implica que el fragmento V[10] y orf2[10] aumentaban la virulencia de S735 produciendo aislados más virulentos que la cepa 10 [3]. Aumentaron significativamente (p < 0,01) tanto los síntomas específicos como los no específicos en cerdos infectados con S735-pCOM1-V[10] o con 5735-pCoM1-orf2[10] en comparación con S735-pCoM1 (Tabla 2).

El examen bacteriológico mostró que el SNC, las membranas serosas y las articulaciones se habían colonizado por altas UFC de S. suis. Por el contrario, los cerdos infectados con S135-pCOM1-FoIC[10] o S735-pCOM1 vivieron durante todo el experimento (11 días p.i.) mostrando síntomas leves de infección, como fiebre. No se observaron diferencias significativas en el resultado clínico entre cerdos infectados con S735-pCOM1-foIC[10] y con S735-pCOM1. Esto demuestra claramente que la introducción de folC[10] no aumenta la virulencia de la cepa S735, mientras que la introducción de V[10] y orf2[10] aumentaba la virulencia de la cepa S735. Por lo tanto, los presentes inventores llegaron a la conclusión de que el aumento de la virulencia observado de S735-pCOM1-V[10] en comparación con S735-pCOM1 se atribuía a la introducción de orf2[10].

En conclusión, tanto el número de copias de V[10] como los antecedentes genéticos del operón orf2-foIC parecen ser determinantes en la virulencia de un aislado dado.

Los datos del procesamiento de datos in silico demuestran que ORF2 es una proteína de unión al sustrato que facilita el transporte de folato

Ahora que el aumento de la virulencia se había atribuido a la introducción de múltiples copias de orf2[10], se buscó la supuesta función de orf2. El análisis in silico de la región intergénica 5' que precedía al operón orf2-foIC reveló la presencia de una estructura secundaria predicha, que mostró una fuerte homología con un ribointerruptor de tetrahidrofolato (Figura 3). Los ribointerruptores de tetrahidrofolato son una clase de ARN homólogos en ciertas bacterias que se unen al tetrahidrofolato (THF) [18]. Se localiza casi exclusivamente en las probables regiones 5' no traducidas de genes que codifican proteínas, y se sabe que la mayoría de estos genes codifican transportadores de folato o enzimas involucradas en el metabolismo del folato. Por estas razones, se dedujo que los ARN funcionan como ribointerruptores. Los ribointerruptores de THF se encuentran en una diversidad de Firmicutes, específicamente los órdenes Clostridiales y Lactobacillales y, más raramente, en otros linajes de bacterias. El ribointerruptor de THF fue una de las muchas estructuras de ARN conservadas encontradas en un proyecto basado en genómica comparativa [19]. La relación con el metabolismo del folato se confirmó por Eudes et al., demostrando que en S. suis, el gen cadena arriba de FoIC codificaba un transportador de folato, FolT [20]. Esta anotación también se aplicó a la nueva secuencia del genoma de S. suis, SC070731, donde se anotó que el gen homólogo de ssu0135 codificaba FolT (GenBank AGG63648.1). Se determinó una estructura tridimensional para el transporte del factor de acoplamiento de energía de folato de Lactobacillus brevis [21], lo que condujo a la propuesta de un modelo multiproteico del transportador de folato. En este modelo, ORF2/FolT funciona como la proteína transmembrana de unión específica al sustrato. Junto con una proteína transmembrana más genérica y dos proteínas de unión a nucleótidos que forman el módulo de acoplamiento de energía, este complejo facilita el transporte transmembrana de folato. Solo la proteína de unión al sustrato (FoIT) es específica para el folato, los demás componentes también se utilizan para el transporte de otros sustratos como la tiamina o la riboflavina. Cuando la secuencia proteica de FolT de S. suis se comparó con secuencias putativas de FolT de otros organismos, estaba claro que los aminoácidos conservados también se conservaban en S. suis [21] (Figura 4). Curiosamente, la Figura 4 también muestra que la arginina que estaba extremadamente conservada en el transportador de folato humano, así como en transportadores de tetraciclina de Escherichia coli, también se conservaba en folT de S. suis (Arg99), lo que sugiere que este resto es importante para transportadores que van desde el ser humano hasta las bacterias [22]. En conjunto, estos datos sugieren firmemente que la proteína conservada de función desconocida, ORF2, identificada mediante una estrategia de complementación, codifica una proteína de unión al sustrato que facilita el transporte de folato.

El folato se transporta en Streptococcus suis

El análisis de secuencia de P1/7 (que es altamente homólogo al genoma de la cepa 10) indica que S. suis codifica todas las enzimas necesarias para sintetizar tetrahidrofolato (THF) a través de la ruta clásica de biosíntesis de folato (Figura 5). Basándose en datos disponibles en la base de datos KEGG (www.kegg.jp). el metabolismo del folato en S. suis hace uso de las rutas clásicas del folato usando FolE, folQ, folB, folK, folC, folA y los sustratos GTP, paminobenzoato (PABA) y glutamilo (GLU) como se muestra en el esquema. Sin embargo, con los genes adicionales presentes en el operón V[10], S. suis parece también capaz de inducir la expresión de folT para importar directamente folato, y usando la expresión inducida simultánea de la copia adicional de folC, el folato se puede procesar inmediatamente hasta el producto final tetrahidrofolato (THF). De esta manera, la combinación de folT y folC forma un "atajo" adicional que permite la producción de THF. La presencia del ribointerruptor de THF cadena arriba del operón folT-folC sugiere una regulación estricta de este operón de dos genes que podría implicar que el operón folT folC solo se expresa en condiciones específicas, por ejemplo, condiciones de baja concentración de folato. Basándose en los resultados de los experimentos en animales descritos anteriormente, se sugiere que el operón folT folC se expresa al menos en condiciones in vivo.

Presencia y expresión de folT en Streptococcus suis

Se demostró la presencia del gen folT en todos los serotipos de S. suis ensayados con excepción de los serotipos 32 y 34. Sin embargo, los serotipos 32 y 34 fueron reasignados para pertenecer al género de Streptococcus orisratti, en vez de S. suis [1]. Por tanto, en conclusión, se considera que todos los serotipos de S. suis tienen los genes que codifican FolT y FolC.

El análisis de secuencia del promotor putativo de orf2 reveló una diferencia en una posición de nucleótido en la región -35 del promotor putativo en la cepa 10 (TGGACA) en comparación con la cepa S735 (TGGTCA) [14]. El efecto de este SNP en los niveles de expresión de orf2 y folC en las cepas 10 y S735 se determinó mediante análisis por qPCR. Se observaron niveles significativamente más altos de expresión de orf2 así como de folC en la cepa 10 en comparación con la cepa S735 (Figura 6A). Esto indica claramente que el SNP en la región -35 del promotor putativo afecta a la transcripción de orf2 y folC. De este modo, se demuestra que el SNP identificado estaba efectivamente ubicado en la región promotora cotranscribiendo orf2 y folC en un operón. Además, la introducción de pCOM1-orf2[10] en S735 aumentó la expresión de orf2 31 veces en comparación con la introducción de pCOM1, mientras que la introducción de pCOM1-orf2 [S735] aumentó la expresión de orf2 solo 5 veces (Figura 6B). Como se esperaba, los niveles de expresión de folC fueron similares para las dos cepas recombinantes (Fig. 6B). Para confirmar que el SNP identificado en la región -35 del promotor es responsable de las diferencias en la transcripción de orf2 en las cepas S735 y 10, la secuencia TGGTCA de orf2[S735] se mutó a TGGACA como se encuentra en el promotor de orf2[10] (produciendo la cepa S735-pCOM1- o /2[S735][t488a]. Se demostró que los niveles de transcripción de orf2 en S735-pCOM1-orf2[S735][t488a] eran similares a los de la cepa S735-pCOM1-orf2[10] y cuatro veces mayores que los de la cepa 5735-pCOM1-orf2[5735] en diferentes fases de crecimiento (Figura 6C). Ambos promotores son más activos al principio de la fase de crecimiento de S. suis se cultivan en caldo Todd Hewitt (Figura 6C). En conjunto, estos resultados demuestran claramente que, en la cepa 10, el promotor cadena arriba de orf2-folC-operón es más fuerte que el promotor cadena arriba de este operón en la cepa S735, debido a un SNP en la región -35.

Para determinar si el SNP asociado a una mayor expresión de orf2-folC operón se asoció con tipos clonales particulares o serotipos de S. suis, se secuenciaron las regiones promotoras de una gran colección de aislados (Tabla 3). Todos los aislados utilizados se caracterizaron y tipificaron recientemente mediante CGH y MLST [23]. Basándose en los datos de secuencia obtenidos, los aislados podrían dividirse en dos grupos principales (Tabla 3). La región promotora -35 fuerte se encontró exclusivamente en aislados de serotipo 1 y 2 que pertenecían al grupo A de CGH y al complejo clonal 1 de MLST y que expresaban la proteína EF. El SNP asociado a menor actividad promotora se encontró en los aislados de serotipo 7 y 9 pertenecientes al grupo B de CGH (excepto dos), que son todos negativos para la expresión de EF, así como en aislados débilmente virulentos del serotipo 2 pertenecientes al grupo A de CGH/Complejo Clonal 1 (CC1) que resultaron positivos para la expresión de la forma de mayor tamaño de la proteína EF (EF*). Hubo dos excepciones; el aislado de serotipo 7 (C126), que pertenece a CC1 pero que no expresa la proteína EF contenía el SNP unido a un promotor más fuerte y el aislado de serotipo 7 (7711) que tenía una secuencia promotora de -35 diferente (TTGTCA) para la cual no se ha determinado la fuerza del promotor. En conclusión, solo los aislados de CC1 que expresan la proteína EF (y 1 aislado de serotipo 7) contienen el SNP asociado a una fuerte actividad promotora. Como los aislados de esta combinación de fenotipo y genotipo están fuertemente correlacionados con la virulencia [23,24], se puede concluir que un fuerte promotor cadena arriba de orf2-foIC-operón está asociado con aislados virulentos de S. suis. Esta observación, junto con el aumento de la virulencia observado después de la introducción de copias adicionales de foIT[10] sugiere que una mayor expresión de folT, ya sea debido a un mayor número de copias o debido a un promotor más fuerte conduce a una mayor virulencia en S. suis.

Cultivo de Streptococcus suis con copias adicionales de folT o sin folT en cultivo.

No se observaron diferencias significativas en el crecimiento en cultivo de Streptococcus suis con copias adicionales de folT o sin folT funcional en comparación con la cepa progenitora in vitro.

Expresión proteica de FoIT

Basándose en la secuencia proteica de FolT, se predijo que FolT es una proteína muy hidrófoba con al menos 5 dominios transmembrana. Se predijo el modelado de homología (servidor Expacy) utilizando 6 estructuras FolT conocidas entre las que se encuentra la estructura 3D publicada de FolT de Lactobacillus brevis una estructura 3D para FolT de S. suis (Figura 7).

FoIT es importante para la supervivencia in vivo: virulencia de una cepa de inactivación de folT 10AfoIT

Dado que la sobreexpresión de folT en una cepa de S. suis débilmente virulenta condujo a un fuerte aumento de la virulencia, se planteó la hipótesis de que FolT juega un papel importante in vivo. Para comprobar si esta hipótesis es cierta, se construyó un mutante de inactivación isogénico en la cepa 10 de S. suis virulenta mediante la inserción de un casete de resistencia a la espectinomicina en el gen folT. Como Folt y FolC están en una estructura de operón, este mutante de inactivación probablemente también estará inactivado para la copia adicional de folC. Para determinar si el transporte de folato es esencial para la virulencia in vivo, en el experimento 1, diez cerdos se infectaron por vía intravenosa con la cepa 10 de tipo silvestre o la cepa de inactivación 10AfoIT. Todos los cerdos respondieron a la inoculación con un aumento de la temperatura corporal (Figura 8). Sin embargo, los cerdos infectados con la cepa 10 de tipo silvestre mostraron temperaturas más altas durante un período de tiempo más largo, en comparación con los cerdos infectados con la cepa knockout 10AfolT. Esto también se refleja en una diferencia en el índice de fiebre (porcentaje de observaciones en las que los cerdos presentaron fiebre) entre ambos grupos (p = 0,06). Esto sugiere que la cepa 10AfolT es menos piogénica, en comparación con la cepa de tipo silvestre. Esto podría deberse al hecho de que se aislaron significativamente menos bacterias de la sangre de los lechones infectados con la cepa 10AfolT. Solo dos cerdos infectados con la cepa 10AfolT mostraron un período bacteriémico corto, en comparación con 5 cerdos infectados con la cepa 10; los cerdos infectados con la cepa 10 también tenían un número significativamente mayor de bacterias en la sangre durante un período de tiempo más largo (Figura 9). Esto sugiere que la cepa 10AfolT se elimina más eficazmente de la sangre o no puede sobrevivir en la sangre. Los recuentos de glóbulos blancos revelaron que los cerdos infectados con la cepa 10 de tipo silvestre mostraron un mayor aumento de glóbulos blancos durante un período de tiempo más largo. Todos los cerdos infectados con la cepa 10 mostraron un aumento de glóbulos blancos, mientras que solo uno de los cerdos infectados con la cepa WAfolT mostraron un aumento de glóbulos blancos. El índice de glóbulos blancos calculado difiere significativamente entre los grupos (Tabla 5). Las tasas de supervivencia entre los dos grupos difirieron significativamente: los cerdos infectados con la cepa 10 tuvieron una supervivencia promedio de 2,6 días después de la infección, mientras que los cerdos infectados con la cepa 10AfolT sobrevivieron 6,2 días p.i. (Figura 10). Aunque los cerdos fueron sacrificados cuando se alcanzaron los criterios de valoración humanitarios predeterminados, la supervivencia refleja la gravedad de la infección.

Como se muestra en la Figura 10, las curvas de supervivencia difieren significativamente entre los grupos. La patología macroscópica reveló que 4/5 cerdos infectados con la cepa 10 mostraron signos clínicos específicos para una infección por S. suis como artritis, pleuritis, pericarditis o peritonitis, mientras que 3/5 cerdos infectados con la cepa 10AfolT mostraron signos clínicos específicos. El examen bacteriológico de todos los órganos infectados reveló que más órganos fueron colonizados por cargas bacterianas más altas en el caso de la cepa 10 de tipo silvestre en comparación con la cepa 10AfolT (Figura 11).

El segundo experimento con animales (experimento 2) confirmó en general los datos generados en el experimento 1. Como en el primer experimento, las curvas de supervivencia de la cepa 10 de tipo silvestre y el aislado de la cepa 10AfolT difirieron significativamente. En el experimento 2, todos los animales inoculados con la cepa 10AfolT sobrevivieron hasta el final del experimento, mientras que el 60 % de los animales inoculados con la cepa 10 tuvieron que ser sacrificados en el transcurso del experimento (Figura 12). Además, la frecuencia y gravedad de los signos clínicos (por ejemplo, temperatura, locomoción y conciencia; véanse las Figuras 13, 14, 15) diferían considerablemente entre los animales inoculados con la cepa 10 de tipo silvestre y la cepa 10AfolT. La frecuencia de lesiones patológicas macroscópicas en articulaciones y peritoneo obtenidas en la necropsia también difirió considerablemente entre el tipo silvestre y el aislado de mutante 10AfolTaislado. mutante.

Basándose en los resultados de los experimentos de infección en lechones, se concluyó que la cepa mutante de inactivación isogénica 10AfolT estaba fuertemente atenuada en comparación con la cepa de tipo silvestre. Esto demuestra que el transportador de folato es necesario para la supervivencia bacteriana en condiciones in vivo. Considerando conjuntamente el resultado de ambos estudios, estos experimentos muestran claramente que el aislado AfolT no produjo casi mortalidad, produjo signos clínicos mínimos y una frecuencia reducida de inflamación articular y peritonitis en comparación con la cepa progenitora. Por lo tanto, se puede concluir que la cepa AfolT está altamente atenuada y es segura.

Resumen de resultados. Una vacuna que comprende una bacteria provista de una modificación tal como una mutación, deleción o inserción en la región de ADN que codifica la proteína de unión al sustrato de folato (un aislado Afo/T) de dicha bacteria) de una bacteria protege a los hospedadores contra la exposición con un aislado virulento de dicha bacteria que no tiene dicha modificación.

La invención proporciona un método para seleccionar una bacteria Streptococcus suis, preferentemente para su uso en una vacuna, preferentemente para uso en una vacuna para generar protección contra una infección bacteriana, que comprende seleccionar una cepa bacteriana progenitora generalmente capaz de transportar folato y de sintetizar folato y seleccionar una bacteria de esa cepa progenitora que tenga una modificación tal como una mutación, deleción o inserción en la región del ADN que codifica la proteína de unión al sustrato de folato (conocida en Streptococcus suis como el gen folT) de dicha bacteria y seleccionar dicha bacteria por la capacidad de crecer a tasas similares a las de dicha cepa progenitora in vitro pero crecer a tasas reducidas en comparación con dicha cepa progenitora in vivo. La invención también proporciona un método para producir una bacteria Streptococcus suis, preferentemente para su uso en una vacuna, preferentemente una vacuna para usar para generar protección contra una infección bacteriana, que comprende seleccionar una cepa bacteriana progenitora generalmente capaz de transportar folato y de sintetizar folato y transformar, preferentemente por medios recombinantes, una bacteria procedente de esa cepa progenitora proporcionándole una modificación, tal como una mutación, deleción o inserción en la región del ADN que codifica la proteína de unión al sustrato de folato (conocida en Streptococcus suis como el gen folT) de dicha bacteria y seleccionar dicha bacteria por la capacidad de crecer a tasas similares a las de dicha cepa progenitora in vitro pero crecer a tasas reducidas en comparación con dicha cepa progenitora in vivo. Dicha bacteria, como se proporciona en el presente documento, sigue teniendo la capacidad de producir folato para su propio uso mediante la aplicación de sus rutas de síntesis de folato de novo. Al tener intactas estas rutas de síntesis, queda sin afectar su capacidad para el crecimiento in vitro (en cultivo), sin embargo, se demostró aquí que, sorprendentemente, se había reducido mucho su crecimiento y su virulencia en el hospedador (in vivo).

Esta cepa bacteriana que crece bien in vitro pero crece menos in vivo que su cepa progenitora y tiene asociada una virulencia fuertemente reducida in vivo es muy útil como cepa vacunal. Dicha cepa o mutante proporcionado por la invención, por un lado, esencialmente no se ve afectado en la síntesis de folato y, por lo tanto, es capaz de crecer a títulos altos y, de este modo, es relativamente fácil y económico de producir, mientras que, por otro lado, debido a su crecimiento reducido y virulencia reducida en su hospedador en comparación con su cepa progenitora, es relativamente inocuo después de su aplicación in vivo, lo que hace que sea extremadamente útil como vacuna dirigida contra una infección bacteriana.

En una primera serie de experimentos del presente documento, para el estudio de eficacia se utilizaron lechones de aproximadamente tres semanas de edad (cruce comercial) que no se habían vacunado contra S. suis y nunca habían recibido pienso medicado. Los animales dieron un resultado negativo en el frotis de amígdalas para S. suis del serotipo 2 por PCR en el momento de la inscripción y procedían de una piara negativa para PRRSV. Los dos grupos de tratamiento se alojaron por separado en el centro de estudio.

Tras la llegada al centro de estudio, se recogieron frotis de sangre y de amígdala de todos los animales. El día 0 del estudio, después de un período de aclimatación adecuado, se vacunó a un grupo de animales con la cepa 10AFoIT. Otro grupo de animales se dejó sin vacunar. Los animales vacunados se volvieron a vacunar el día 21 en el lado derecho del cuello con la misma dosis del aislado mutante, respectivamente. Después de cada vacunación, se observó a los animales para determinar la existencia de reacciones locales y sistémicas. El día 35 del estudio, se recogieron frotis de sangre y amígdala de todos los animales antes de que los animales de los dos grupos fueran expuestos a la cepa de exposición ATCC700794. Se observó a los animales en busca de signos de enfermedad asociada a S. suis (por ejemplo, aumento de la temperatura corporal, cojera, comportamiento anormal, signos en el SNC) durante los 7 días posteriores a la exposición. Los animales encontrados muertos o que tuvieron que ser sacrificados antes del punto de observación del ensayo por razones de bienestar animal se sometieron a necropsia. Durante la necropsia, los animales fueron evaluados en busca de signos macroscópicos típicamente asociados con la enfermedad producida por S. suis (p. ej., inflamación del SNC, articulaciones, cavidad torácica). Adicionalmente, se recogió un frotis del SNC para recuperar el aislado de exposición. El día 42, todos los animales restantes se sacrificaron, se sometieron a necropsia y se recogieron muestras como se ha descrito anteriormente. Los animales vacunados mostraron considerablemente menos signos de enfermedad producida por S. suis después de la exposición.

Se realizó una segunda serie de experimentos en cerdos cruzados comerciales; el día de la primera vacunación, los cerdos tenían 21 ± 7 días de edad. Los animales no habían sido vacunados contra S. suis, el frotis de amígdala dio un resultado negativo para S. suis de tipo 2, tenían serología negativa para PRRSV y procedían de cerdas con frotis de amígdala negativo para S. suis de tipo 2. Tras la llegada al centro de estudio, se recogieron frotis de sangre y de amígdala de todos los animales. El día 0 del estudio, después de un período de aclimatación adecuado, un grupo de animales fue vacunado en el lado izquierdo del cuello con la cepa AFOIT2. Otro grupo de animales se dejó sin vacunar. Los animales vacunados se volvieron a vacunar el día 21 en el lado derecho del cuello con la misma dosis del aislado mutante, respectivamente. Después de cada vacunación, se observó a los animales para determinar la existencia de reacciones locales y sistémicas. El día 34, se recogieron frotis de sangre y amígdala de todos los animales y posteriormente los animales de control estricto se trasladaron a un espacio separado mientras todos los demás grupos se mezclaron. El día 35, los animales se expusieron por vía intraperitoneal (ip) a aproximadamente un aislado virulento de S. suis de tipo 2.

Durante los siete días posteriores a la exposición, los animales fueron observados en busca de signos de enfermedad asociados con S. suis. Los animales encontrados muertos o que tuvieron que ser sacrificados antes del punto de observación del ensayo por razones de bienestar animal se sometieron a necropsia. Durante la necropsia, los animales fueron evaluados en busca de signos macroscópicos típicamente asociados con la enfermedad producida por S. suis y se recogieron frotis del SNC (es decir, del cerebro) y de las articulaciones. En el punto de observación del ensayo, todos los animales restantes se sacrificaron, se sometieron a necropsia y se recogieron muestras. La vacunación con el mutante AfoIT2 redujo el número de animales que murieron o tuvieron que ser sacrificados por razones de bienestar animal durante el periodo de observación posterior a la exposición. Durante la necropsia, en los animales vacunados con AfoIT2, se observaron signos de inflamación en el cerebro, indicado por la presencia de fibrina y/o líquido, con menor frecuencia que en los controles negativos. En los animales vacunados con la cepa AfoIT2, el aislado de exposición de S. suis se recuperó con menos frecuencia del cerebro y los frotis de articulaciones recogidos en la necropsia que en los controles negativos.

REFERENCIAS

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TABLAS

Tabla 1. Secuencias de cebador.

Nombre del cebador Secuencia 5'-3' Diana

comE1 cgagctcggaagaattggttattgcgcgtg (SEQ ID NO:1) orf2[10] - directo - Sacl comE2 cgggatcccgggggatgacctgttgcttg (SEQ ID NO:2) orf2[10] - inverso - BamHI comE3 tcccccgggggagtcgtgtgtattcgacagcgg (SEQ ID NO:3) P-orI2-foIC[10] - inverso - Smal comE4 tcccccgggggacaagcaacaggtcatcccc (SEQ ID NO:4) foIC[10] - directo - Smal comE6 cgggatcccggttgaatgcccggcaagcc (SEQ ID NO:5) foIC[10] - inverso - BomHI Orf2-dir ctacggctggttcttctatcgaa (SEQ ID NO:6) S. suis orf2

Orf2-inv gcaatcggtgtcatgataaagg (SEQ ID NO:7) S. suis orf2

foIC-dir gtttgtccgtccatcggttt (SEQ ID NO: 8) Polifolilpoliglutamato sintasa de S. suis

Folc-inv ctggtcggtcgcatagatga (SEQ ID NO:9) Polifolilpoliglutamato sintasa de S. suis

RecA-dir ggtttgcaggctcgtatgatg (SEQ ID NO:10) Recombinasa A de S. suis RecA-inv accaaacatgacaccgacttttt (SEQ ID NO:11) Recombinasa A de S. suis t488a gaaaggtatagtttttagcaagtggacaaaatatatagtgtgtgatac aat (SEQ Promotor orf2

ID NO:12)

t488a_antisentido attgtatcacacactatatattttgtccacttgctaaaaactatacctttc (SEQ ID Promotor orf2

NO:13)

V735-dir tatgcgcaatgacgtagtagaagg (SEQ ID NO:14) pKUN-V[10]*-SpecR

M13-inv aacagctatgaccatg (SEQ ID NO:15) pKUN-V[10]*-S pecR

 Tabla 3. Análisis de secuencia de la región -35 del promotor orf2/folC entre varios aislados y serotipos de S. suis1 Fenotipo Secuencia promotora -35 (5'- 3') Serotipo MRP2 EF3 Grupo de CGH4 Complejo clonal TGGACA TGGTCA TTGTCA

1Los aislados de S. suis se describieron en de Greeff et al. [23]

2 * indica una forma de MRP de mayor peso molecular; s indica una forma de MRP de menor peso molecular 3 * indica una forma de EF de mayor peso molecular

4 Todos los aislados se genotipificaron mediante hibridación comparativa del genoma (CGH) [23]

5 Este aislado pertenece al complejo clonal 1

6 Número de aislados analizados/número de aislados con la secuencia del promotor -35 respectiva_________

Tabla 4. Parámetros clínicos de cerdos infectados con S. suis., experimento 1 * p < 0,05 en comparación con 10_____________________________________________________

Patología

macroscópica_____________

N.°

N.° medio

de de días Indice Indice de

cerdo Mortalid hasta la de glóbulos

Cepa s Dosis ad (%) muerte fiebre blancos Artritis Pleuritis Pericarditis Peritonitis 1,1 x

10 5 106 100 2,6 47 50 11/20 2/5 2/5 1/5 10Afo¡ 5 9,6 x 20 ^{6 2**} 23# 19* 2/20 1/5 1/5 0/5

T _____________105___________

**p < 0,01 en comparación con 10

# p < 0,1 en comparación con 10

Tabla 5 Lesiones macroscópicas indicativas de artritis y peritonitis: % de observaciones positivas en la cepa 10 de ______________ tipo silvestre y en animales expuestos al aislado mutante 10AFoIT; experimento 2______________ _________________________ 10____________________________ 10AFoIT___________________________________ Articulaciones 100 20

Peritoneo 80 20

Tabla 6. Diseño del estudio ara estudio utilizando CBS 143192

Tabla 7. Pre aración de vacuna lacebo ara estudio usando CBS 143192

Tabla 8: Pre aración de ex osición ara estudio usando CBS 143192

Tabla 9. Porcentaje de animales que murieron o fueron sacrificados después de la exposición (mortalidad) (para estudio usando CBS 143192

Tabla 10. Porcentaje de animales que muestran cojera severa después de la exposición (para estudio usando CBS

143192

T l 11. Pr n niml m rn í l x iin r i n B 1412)

Tabla 12. Porcentaje de animales que muestran signos de inflamación en el cerebro durante la necropsia (para estudio con CBS 143192

Tabla 13. Porcentaje de animales de los que se recuperó S. suis de frotis cerebrales recogidos en la necropsia (para estudio usando CBS 143192

Tabla 14. Porcentaje de animales de los que se recuperó S. suis de frotis articulares recogidos en la necropsia (para estudio usando CBS 143192

Tabla 15. Es uema del estudio de ex osición de vacunación ara estudio usando CBS 140425

Tabla 16. Prearación de la vacuna ara estudio usando CBS 140425

Tabla 17. Pre aración de ex osición ara estudio usando CBS 140425

T l 1: P r n nim l m r n r l x ii n B 1442

Tabla 19: Porcentaje de animales que muestran un comportamiento anormal después de la exposición (CBS

140425

Tabla 20: Porcentae de animales muertos o sacrificados des ués del desafío mortalidad CBS 140425

Tabla 21: Porcentae de animales con hallaz os anormales en el cerebro tras la necro sia CBS 140425

T l 22: P r n nim l n^ h ll z n rm l n l vi r i n l n r i B 1442

T l 2: P r n nim l l r r . i n fr i r r l B 1442

Tabla 16. Pre aración de la vacuna ara estudio usando CBS 140425

Tabla 17. Pre aración de ex osición ara estudio usando CBS 140425

T l 1: P r n nim l m r n r l x ii n B 1442

Tabla 19: Porcentaje de animales que muestran un comportamiento anormal después de la exposición (CBS

140425

Tabla 20: Porcentae de animales muertos o sacrificados des ués del desafío mortalidad CBS 140425

T l 21: P r n nim l n h ll z n rm l n l r r r l n r i B 1442

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un mutante AFolT de una bacteria que tiene capacidad reducida para transportar folato, en donde dicha capacidad se ha reducido mediante la deleción funcional de la función del transportador de folato (FolT),

por lo que dicho mutante AFolT es clasificable como un Streptococcus suis,

por lo que dicho mutante AFolT tiene preferentemente una expresión reducida de FolT,

por lo que dicho mutante AFolT tiene una mutación o deleción de o en el dominio peptídico FYRKP o inserción en el dominio peptídico FYRKP, preferentemente que tiene una mutación de R en el dominio peptídico FYRKP.

2. Una bacteria o un cultivo de la misma depositado como "mutante AFolT de Streptococcus suis CBS 140425" en el Centraalbureau voor Schimmelcultures el 19 de agosto de 2015.

3. Una bacteria o un cultivo de la misma depositado como "mutante AFolT2 de Streptococcus suis CBS 143192" en el Westerdijk Fungal Biodiversity Institute el 25 de agosto de 2017.

4. Una composición, preferentemente una composición inmunogénica, que comprende (i) una bacteria de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o (ii) un cultivo de una bacteria de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Uso de la composición de la reivindicación 4 para la producción de una vacuna.

6. Una vacuna que comprende una composición de la reivindicación 4.

7. Un kit para vacunar a un animal, preferentemente a un cerdo, contra una enfermedad asociada a una infección por Streptococcus suis, que comprende:

a. un dispensador para administrar una vacuna a un animal, preferentemente a un cerdo; y

b. una cepa mutante de AFolT de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un cultivo de una bacteria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y

c. opcionalmente un folleto de instrucciones.

8. Un método para reducir la virulencia de una bacteria Streptococcus suis que comprende reducir la capacidad de dicha bacteria para transportar folato,

en donde dicha bacteria es capaz de realizar la síntesis de novo de folato y

de modo que dicho método comprende atenuar la expresión y/o función de la proteína de unión al sustrato de folato (FolT) de dicha bacteria,

(a) proporcionando una mutación, deleción o inserción en el gen foltT de dicha bacteria, más preferentemente proporcionando una mutación, deleción o inserción en el ADN de dicha bacteria que codifica (i) el promotor del gen folT gen o (ii) una región transmembrana de la proteína de unión al sustrato de folato FolT o

(b) proporcionando una mutación, deleción o inserción en la región de ADN que codifica FolT de dicha bacteria que codifica una región crucial para la unión al sustrato.

9. Un método para seleccionar una bacteria Streptococcus suis que comprende

a. seleccionar una cepa bacteriana progenitora generalmente capaz de transportar folato y de sintetizar folato y b. seleccionar una bacteria de esa cepa progenitora por tener una mutación, deleción o inserción en el ADN que codifica la proteína de unión al sustrato de folato de dicha bacteria y

c. seleccionar dicha bacteria por la capacidad de crecer a tasas similares a las de dicha cepa progenitora in vitro pero crecer a tasas reducidas en comparación con dicha cepa progenitora in vivo.

10. Un método para producir una bacteria Streptococcus suis que comprende

a. seleccionar una cepa bacteriana progenitora generalmente capaz de transportar folato y de sintetizar folato y b. transformar una bacteria procedente de esa cepa progenitora proporcionándole una mutación, deleción o inserción en el ADN que codifica la proteína de unión al sustrato de folato de dicha bacteria y

c. seleccionar dicha bacteria por la capacidad de crecer a tasas similares a las de dicha cepa progenitora in vitro pero crecer a tasas reducidas en comparación con dicha cepa progenitora in vivo.