MXPA01007747A

MXPA01007747A - Composiciones y metodos para el tratamiento y prevencion de la infeccion bacteriana patogena basada en el papel esencial de metilacion del adn en la virulencia bacteriana.

Info

Publication number: MXPA01007747A
Application number: MXPA01007747A
Authority: MX
Inventors: Michael J Mahan
Original assignee: Univ California
Priority date: 1999-02-02
Filing date: 2000-02-02
Publication date: 2002-07-02
Also published as: WO2000045840A1; NZ512685A; BR0007966A; AU3222100A; AU776864B2; CA2359469A1; EP1150711A1; JP2002536339A; WO2000045840A8

Abstract

La presente invencion esta dirigida a las composiciones de vacuna que contienen las bacterias patogenas tales como la Salmonella que tiene mutaciones geneticas no reversibles las cuales alteran la actividad de la ADN adenina metilasa (Dam) y a los metodos de utilizacion de estas composiciones para producir una respuesta inmune. La invencion tambien proporciona metodos para la preparacion de vacunas asi como metodos de seleccion para identificar los genes que pueden tener una actividad antibacteriana.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN DE LA INFECCIÓN BACTERIANA PATÓGENA BASADA EN EL PAPEL ESENCIAL DE METILACION DEL ADN EN LA VIRULENCIA BACTERIANA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a vacunas útiles para la prevención o modificación de la patogénesis microbiana. En particular, esta invención se refiere a las composiciones in unógenas que comprenden generalmente las bacterias patógenas (por ejemplo, la Salmonella) la cual contiene una mutación que afecta la ADN adenina metilasa (Dam) . La invención también se refiere a los métodos de producción de una respuesta inmune utilizando estas composiciones, así como métodos de investigación o selección.

.ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades llevadas por los alimentos presentan una seria amenaza para la salud, la seguridad del suministro de alimentos de la nación, y para la industria agrícola. Cada año más de 80 millones de americanos padecen envenenamiento con alimentos, a un costo estimado de entre 5,000 y 23,000 millones anualmente en el tratamiento y Ref.131201 *-*- * * salarios perdidos (Snydman, D. R., Food Poisoning. En : Infectious Diseases, segunda edición, Gorbach, S.L., y colaboradores, eds., 768-781 (1998)). Nuestras defensas contra las enfermedades llevadas por los alimentos están cayendo porque han surgido nuevos patógenos que pueden provocar formas más debilitantes de la enfermedad y/o ya no pueden ser controlados por los antibióticos disponibles; los ejemplos incluyen Escherichia coli {E. coli) 0157 :H7, Salmonella enteri tidis (S. enteri tidis) , y S. typhimurium DT104 (Alterkruse, S.F., y colaboradores, Emerging food borne diseases, 3: Julio-Sept. (1997)). La salmonelosis es una de las principales enfermedades llevadas por los alimentos en los Estados Unidos, estimada a entre 1 y 4 millones de casos/año (Shere, K. D., y colaboradores, Salmonella infections . En : Infectious Diseases, segunda edición, Gorbach, S. L., et al., eds., 699-712 (1998)). Esta enfermedad es provocada por la exposición a los productos contaminados con la Salmonella, por ejemplo, los productos animales tales como los huevos, la leche, las aves de corral o la ingestión de productos alimenticios que han sido expuestos a las heces de los animales, incluyendo las frutas y los vegetales. Debido a las prácticas de fabricación y distribución a gran escala, los brotes de salmonelosis han afectado a grandes poblaciones (Tauxe, R. V., y colaboradores, Emerging food borne diseases : an evolving public health challenge. Emerging infectious diseases, 3:0ct-Dic (1997)). La Salmonella es un ejemplo principal de un microorganismo patógeno cuyas varias especies son la causa de un espectro de enfermedades clínicas que incluyen la gastroenteritis aguda y las fiebres entéricas. Las infecciones con Salmonella son adquiridas por la ingestión oral. Los microorganismos después de atravesar el estómago, invaden y se replican en las células de la mucosa intestinal. Véase, Hornik, y colaboradores, N. Eng. J. Med. , 283:686 (1970) . Algunas especies, tales como S. typhi, pueden pasar a través de esta barrera de la mucosa y dispersarse por medio de los placas de Peyer a la lámina propia y los nodos linfáticos regionales. La Salmonella typhi , la cual infecta solamente al ser humano, es la causa de la fiebre tifoidea y continua siendo un problema importante para la salud pública para los residentes en el mundo menos desarrollado. Las infecciones del tracto urinario (UTI) están entre las infecciones bacterianas más comunes. Se estima que aproximadamente 20 % de las mujeres experimentarán al menos una UTI durante su tiempo de vida. Aunque las mujeres son el blanco mayor de las UTI, los hombre y los niños también pueden contraer esta enfermedad. Aproximadamente 70% de todas las UTI son provocadas por la Escherichia coli uropatógena. La enfermedad puede estar limitada al tracto urinario ___**,-_.A»._ <_&_1. inferior (cistitis) o puede involucrar la pelvis renal (pielonefritis). Más del 90% del E. coli aislado de las mujeres con pielonefritis contiene el grupo de genes de los píleos asociados a la pielonefritis (pap) (O'Hanley, P.M., y colaboradores, N. Engl . J. Med. , 313:414-447 (1985)). La mayoría de los pacientes con pielonefritis provocada por E. coli presentan una fuerte respuesta inmune a los píleos de Pap. Los píleos de Pap contienen adhesinas en sus puntas que hacen posible que estas bacterias colonicen el tracto urinario, id. La mayoría de los complejos de las adhesinas de los píleos de Pap se unen al receptor del grupo de la sangre P, el cual es expresado sobre las células epiteliales que recubren el intestino, la vej'iga, y los uréteres. A pesar del entendimiento del papel de la adhesión en la patogénesis de UTI, ninguna vacuna está disponible contra UTI. Esto también es verdadero para muchos otros patógenos microbianos importantes que provocan morbididad y mortalidad significativos . Los patógenos microbianos, o los microorganismos que producen la enfermedad, pueden infectar un huésped por uno o varios mecanismos. Los mismos pueden introducirse a través de una ruptura en la piel, pueden ser introducidos por la transmisión de los vectores, o pueden interactuar con una superficie de la mucosa. La enfermedad sobreviene a continuación de la infección del huésped, cuando el potencial ii_¿. _ ._._..__- .___,_ _-_ del patógeno para alterar las funciones del cuerpo normales es expresado totalmente. Cada microorganismo productor de la enfermedad posee una colección de factores de virulencia que mejoran su patogenicidad y les permite invadir los tejidos humanos o del huésped y alteran las funciones del cuerpo normales. Las enfermedades infecciosas han sido exterminadores principales durante los últimos varios miles de años, y aunque las vacunas y los agentes antimicrobianos han desempeñado un papel importante en la reducción dramática en la incidencia de las enfermedades infecciosas, las enfermedades infecciosas son todavía la causa número uno de muertes en todo el mundo. Las condiciones ambientales dentro del huésped son responsables de la regulación de la expresión de la mayoría de los factores de virulencia conocidos (Mekalanos, J. J., J. Bacteriol . , 174:1 (1992)). En el pasado, los científicos pudieron intentos imitar, in vitro, las condiciones ambientales dentro del huésped en un intento para identificar aquellos genes que codifican y que son responsables de la producción de los factores de virulencia. Como resultado, la identificación de muchos factores de virulencia dependió y estuvo limitada por, la capacidad de los investigadores para imitar los factores ambientales del huésped en el laboratorio. Sin embargo, con el advenimiento de la tecnología de expresión in vivo (IVET) descubierta por Mahan, M. J., y colaboradores, y descrita en la Patente U.S. No. 5,434,065, ahora es posible determinar cuales genes son expresados dentro de un huésped y dentro de cuales tejidos del huésped los genes son expresados. En consecuencia, los mecanismos moleculares de los microorganismos patógenos específicos que le permiten evitar el sistema inmune del huésped (por ejemplo, el cuerpo humano) e iniciar los cambios fisiológicos inherentes en el proceso de la enfermedad pueden ser aclarados, permitiendo así el desarrollo de enfoques o métodos de diagnóstico y terapéuticos mejores contra los microbios patógenos. En compañía de la higiene pública del agua, la prevención de las enfermedades infecciosas por la vacunación es el método más eficiente, efectivo en cuanto al costo, y práctico de prevención de la enfermedad. Ninguna otra modalidad, ni aún los antibióticos, ha tenido un efecto principal sobre la reducción de la mortalidad y el crecimiento de la población. El impacto de la vacunación sobre la salud de la gente del mundo es fuerte y exagerado. La vacunación, al menos en algunas partes del mundo, ha controlado las siguientes nueve enfermedades principales: viruela, difteria, tétanos, fiebre amarilla, tos ferina, poliomielitis, sarampión, paperas y rubéola. En el caso de la viruela, la enfermedad ha sido erradicada totalmente del mundo. La efectividad de una vacuna depende de su capacidad para producir una respuesta inmune protegida, la cual será descrita generalmente después. Los medios por los cuales los vertebrados, particularmente las aves y los mamíferos, superan la patogénesis microbiana, son complejos. Los patógenos que invaden un huésped provocan un número de sistemas protectores y altamente versátiles. Si el patógeno microbiano o sus toxinas penetran exitosamente las defensas externas del cuerpo y alcanzan la corriente sanguínea, entonces el tejido linfoide del bazo, el hígado, y la médula ósea removerá y destruirá el material extraño cuando la sangre circula a través de estos órganos. El tejido linfoide está compuesto principalmente de una malla de células y fibras reticulares de interfijación. Adheriéndose a los intersticios de los tejidos están números grandes de leucocitos, más específicamente, las células linfocíticas, y otras células en varias etapas de diferenciación, tales como las células del plasma, los linfoblastos, los macrófagos de los monocitos, los eosinófilos y las células de las glándulas mamarias. Los dos linfocitos principales, las células T y las células B, tienen papeles diferentes y complementarios en la mediación de la respuesta inmune específica para el antígeno. La respuesta inmune es un mecanismo homeostático valioso y sumamente complejo que tiene la capacidad de reconocer los patógenos extraños. La respuesta inicial al patógeno extraño es llamado "inmunidad natural o congénita" y está caracterizada por la migración rápida de las células exterminadoras naturales, los macrófragos, neutrófilos, y otros leucocitos al sitio del patógeno extraño. Estas células pueden ya sea fagocitosar, digerir, lisar o secretar citosinas que lisan el patógeno en un período breve de tiempo. La respuesta inmune natural no es específica para el antígeno y generalmente es considerada como una primera línea de defensa contra los patógenos extraños hasta que la "respuesta inmune adaptable" pueda ser generada. Tanto las células T como las células B participan en la respuesta inmune adaptable. Una variedad de mecanismos están involucrados en la generación de la respuesta inmune adaptable. Una descripción de todos los mecanismos posibles de generación de la respuesta inmune adaptable está más allá del alcance de esta sección, sin embargo, algunos mecanismos los cuales han sido bien caracterizados incluyen el reconocimiento de la célula B del antígeno y la activación subsiguiente par a secretar los anticuerpos específicos del antígeno y la activación de las células T por la unión a las células que presentan el antígeno. Los organismos microbianos pueden tener membranas celulares que son reconocidas como extrañas por el sistema inmune. Además, los organismos microbianos también pueden producir toxinas o proteínas que también son consideradas -__^__ _._ _¿-?__t.c_ . „-»!______. . - .^ .............. _____.-__, __ _____.^._..e.^__.fc___ _..._. -,.._..___»...__._,_.,. .-.__._.- .?t,JÉiBMi__É_ extrañas por el sistema inmune del huésped. El primer mecanismo mencionado anteriormente involucra la unión del antígeno, tal como la pared celular bacteriana o la toxina bacteriana, a los receptores de inmunoglobulina superficiales sobre las células B. La unión del receptor transmite una señal al interior de la célula B. Esto es lo que es referido comúnmente en el arte como la "primera señal". En algunos casos, solamente una señal es necesaria para activar las células B. Estos antígenos que pueden activar la célula B que tienen que estar basados en el auxiliar de la célula T son referidos comúnmente como los antígenos independientes de T (o los antígenos independientes del timo) . En otros casos, una "segunda señal" es requerida y esto es provisto usualmente por las células auxiliadoras T que se unen a la célula B. Cuando el auxiliador de la célula T es requerido para la activación de la célula B a un antígeno particular, el antígeno es referido entonces como el antígeno dependiente de T (o el antígeno dependiente del timo) . Además de unirse a los receptores superficiales sobre las células B, el antígeno también puede ser internalizado por la célula B y luego digerido en fragmentos más pequeños dentro de la célula B y presentados sobre la superficie de las células B en el contexto de las moléculas de la clase II de MHC-péptido antigénico. Estas moléculas de la clase II de MHC-péptido son reconocidas por las células auxiliadoras T que se unen a la célula B para proporcionar la "segunda señal" necesaria para algunos antígeno. Una vez que la célula B ha sido activada, las células B empiezan a secretar anticuerpos al antígeno que conducirá eventualmente a la inactivación del antígeno. Otra manera para que las células B sean activadas es por el contacto con las células dendríticas foliculares (FDCs) dentro de los centros germinales de los nodos linfáticos y el bazo. Las células dendríticas foliculares atrapan los complejos de antígeno-anticuerpo (Ag-Ab) que circulan a través del nodo linfático y el bazo y los FDCs presentan estos a las células B para activarlos. Otro mecanismo bien caracterizado de la respuesta inmune adaptable a los antigenos es la activación de las células T por la unión a las células que presentan el antígeno tales como los macrófagos y las células dendríticas. Los macrófagos y las células dendríticas son células que presentan un antígeno potente. Los macrófagos tienen una variedad de los receptores que reconocen los constituyentes microbianos tales como el receptor de mañosa del macrófago y el receptor emigrante o de limpieza. Estos receptores se unen a los microorganismos y el macrófago los absorbe y degrada los microorganismos en los endosomas y lisosomas. Algunos microorganismos son destruidos directamente de esta manera. Otros microorganismos son diferidos en péptidos pequeños que son presentados a las células T sobre la superficie de los macrófagos en el contacto de los complejos del péptido-clase II de MHC. Las células T que se unen a estos complejos llegan a ser activadas. Las células dendríticas también son antígenos potentes que presentan las células y presentan moléculas de la clase I de MHC-péptido y moléculas de la clase II de MHC-péptido para activar las células T. Usando una célula B que se une a un antígeno el cual nunca ha sido encontrado, la célula padece una ruta de desarrollo llamada "cambio del isotipo". Durante los cambios del desarrollo, las células del plasma cambian de la producción de los anticuerpos del tipo IgM general a la producción de los anticuerpos del tipo IgG altamente específicos. Dentro de esta población de las células, algunas padecen divisiones repetidas en un proceso llamado "expansión clonal". Estas células maduras hasta llegar a ser fábricas de anticuerpos que liberan inmunoglobulinas en la sangre. Cuando las mismas están totalmente maduras, llegan a ser identificadas como células del plasma, las células que son capaces de liberar aproximadamente 2,000 moléculas de anticuerpos idénticas por segundo hasta que mueren, generalmente dentro del transcurso de 2 o 3 días después de alcanzar la madurez. Otras células de este grupo de clones nunca producen anticuerpos pero funcionan como células de la memoria que reconocerán y se unirán a este antígeno particular durante el encuentro con el antígeno. .4 _,l____J___U_S____C.________j___. m__- -J- -*• -eS_ __. _,. __>__ - J -,,.-_•.___..._.._, -i--.. Jt .. .í Como una consecuencia de la estimulación inicial por un antígeno existen ahora muchas más células idénticas a la célula B original o célula paternal, cada una de las cuales responde de la misma manera al antígeno que la célula B original. En consecuencia, si el antígeno aparece una segunda vez, se encontrará con una de las células B correctas más pronto, y puesto que estas células B están programadas para el anticuerpo de IgG específico, la respuesta inmune empezará más pronto, se acelerará más rápido, será más específica y producirá números más grandes de anticuerpos. Este evento es considerado como una respuesta secundaria o anamnéstica. La Figura 1 muestra una comparación de la concentración de los anticuerpos presentes como resultado de las respuestas primaria y secundaria. La inmunidad puede persistir durante años a causa de que las células de la memoria sobreviven durante meses y años y también a causa de que el material extraño es reintroducido algunas veces en dosis pequeñas que son suficientes para desencadenar constantemente respuestas inmune de nivel bajo. De esta manera las células de la memoria son rellenadas periódicamente. A continuación de la primera exposición a un antígeno, la respuesta es frecuentemente lenta para dar los anticuerpos y la cantidad de los anticuerpos producida es pequeña, es decir la respuesta primaria. Durante la estimulación secundaria con el mismo antígeno, la respuesta, es decir, la respuesta secundaria, es más rápida y de mayor magnitud por lo cual se logra un estado inmune igual a la respuesta secundaria acelerada a continuación de la reinfección con un microorganismo patógeno, lo cual es la meta que se desea que sea inducida por las vacunas. En general, las vacunas activas pueden ser divididas en dos clases generales: vacunas subunitarias y vacunas del organismo total. Las vacunas subunitarias son preparadas a partir de los componentes del organismo total y usualmente son desarrolladas para evitar el uso de los organismos vivos que pueden provocar o evitar los componentes tóxicos presentes en las vacunas de organismos completos, como se describe con detalle adicional posteriormente. El uso del material polisacárido capsular purificado del tipo B de H. influenza como una vacuna contra la meningitis provocada por este organismo en los seres humanos, es un ejemplo de una vacuna basada en un componente antígenico. Véase Parks, y colaboradores, J. Inf. Dis . , 136 (Suppl.).551 (1977), Anderson, y colaboradores, J. Inf. Dis . , 136 (Suppl. ) :563 (1977); y Mákela, y colaboradores, J. Inf. Dis. , 136 (Suppl. ):543 (1977). Clásicamente, las vacunas subunitarias han sido preparadas por la inactivación química de las toxinas purificadas parcialmente, y por consiguiente han sido £._ __ , i .é 4.1 llamadas toxoides. El formaldehído o el glutaraldehído han sido las substancias químicas de elección para destoxificar las toxinas bacterianas. Tanto las toxinas de la difteria como del tétanos han sido inactivadas exitosamente con el formaldehído conduciendo a una vacuna toxoide segura y efectiva la cual ha sido utilizada durante 40 años para controlar la difteria y el tétanos. Véase, Pappenheimer, A. M. , Diphtheria. En: Bacterial Vaccines (R. Germanier, ed.), Academic Press, Orlando, FL, pp. 1-36 (1984); Bizzini, B., Tetanus. Id. en 37-68. Los toxoides químicos, sin embargo, no dejan de tener propiedades indeseables. En efecto, este tipo de vacuna puede ser más difícil de desarrollar puesto que los antígenos protectores deben ser identificados primero y luego se pueden desarrollar procedimientos para aislar de manera eficiente los antígenos. Además, en algunos casos, las vacunas subunitarias no producen una respuesta inmune tan fuerte como lo hacen las vacunas de organismos completos debido a la falta de materiales extraños tales como las membranas o las endotoxinas que pueden ser más inmunógenas debido a la remoción de los materiales que podrían de otra manera enmascarar los antígenos protectores o que son inmunodominantes . Las vacunas de los organismos completos, por otra parte, hacen uso del organismo completo para la vacunación. El organismo puede ser exterminado o estar vivo (usualmente .--¿ ¿ atenuado) dependiendo de los requerimientos para producir la inmunidad protectora. La vacuna contra la tos ferina, por ejemplo es una vacuna de células completas preparada por el tratamiento de las células de Bordetella pertussis con formaldehído. La bacteria B. pertussis coloniza el recubrimiento epitelial del tracto respiratorio conduciendo a una enfermedad respiratoria altamente contagiosa en los seres humanos, la tos ferina o tos convulsiva, con tasas de morbididad y mortalidad más elevadas para los infantes y los niños pequeños. La colonización conduce además a un daño del tejido local y a efectos sistémicos provocados en gran parte por las toxinas producidas por B. pertussis . Véase, Manclarck, y colaboradores, Pertussis, Id. en 64-106. Estas toxinas incluyen la endotoxina o el lipopolisacárido, un fragmento de peptidoglicano llamado citotoxina traqueal, una toxina de la proteína dermonecrotizante lábil con el calor, una toxina de ciclasa adenilasa, y la toxina de la tos ferina de la exotoxina de la proteína. La vacunación es el método más efectivo para el control de la tos ferina, y las vacunas de células completas exterminadas administradas con los toxoides de la difteria y el tétanos (vacuna DPT) han sido efectivas en el control de la enfermedad en muchos países. Véase, Fine, y colaboradores, Reflections on the Efficacy of Pertussis Vaccines, Rev. Infecí . Dis . , 9:866-883 (1987). Desafortunadamente, debido a las grandes cantidades de los productos endógenos, descritos anteriormente, contenidos en la vacuna contra la tos ferina, muchos niños experimentan reacciones adversas durante la inyección. La endotoxina, la cual es un componente integral de la membrana externa del organismo gram-negativo (así como todos los otros organismos gram-negativos) , puede inducir una amplia gama de efectos laterales suaves a severos que incluyen la fiebre, el choque, la leucocitosis, y el aborto. Aunque los efectos laterales asociados con la vacuna contra la tos ferina usualmente son suaves, pueden ser muy severos. Los componentes tóxicos presentes en las vacunas del virus de la influenza, sin embargo, pueden inducir una respuesta pirogénica fuerte y han sido responsables de la producción del síndrome de Guillain-Barré. Puesto que las vacunas contra la influenza son preparadas por el crecimiento del virus en los embriones del pollo, es probable que los componentes de los embriones o los huevos contribuyan a su toxicidad. El uso de las vacunas exterminadas también ha sido descrito por Switzer y colaboradores, Patente U.S. No. 4,016,253, quien aplicó tal método en la preparación de una vacuna contra la infección provocada por Bordetella bronchi s ptica en los cerdos. En un artículo técnico por Brown, y colaboradores, Br. Med. J. , 1 :263 (1959), el uso de células completas exterminadas se describe para la preparación de una vacuna contra la bronquitis crónica provocada por la Haemophilus influenzae. El uso de las células exterminadas, sin embargo, está acompañado usualmente por una pérdida concurrente de potencial inmunogénico, puesto que el proceso de exterminio usualmente destruye o altera muchas de las determinantes antigénicas superficiales necesarias para la inducción de los anticuerpos específicos en el huésped. Las vacunas exterminadas son inefectivas o son efectuadas marginalmente por un número de bacterias patógenas que incluyen Salmonella spp. y V. cholerae. La vacuna de las células completas exterminadas paternales ahora en uso para la Salmonella typhi es solo moderadamente efectiva, y provoca reacciones adversas locales y sistémicas marcadas a una frecuencia inaceptablemente elevada. En el caso de los patógenos intracelulares, tales como la Salmonella, generalmente se está de acuerdo en que las vacunas basadas en microorganismos vivos pero atenuados (vacunas vivas) induce un tipo altamente efectivo de respuesta inmune. Las vacunas atenuadas vivas están comprendidas de organismos vivientes que son benignos pero típicamente se replican en los tejidos del huésped y presumiblemente expresan muchos imunógenos de blanco natural que son procesados y presentados al sistema inmune de manera similar a una infección natural. Esta interacción produce una respuesta protectora como si el individuo inmunizado hubiera sido expuesto previamente a la enfermedad. La mayoría del ' -_.-&.-_-._.•__.-• trabajo que define las mutaciones atenuantes para la construcción de las vacunas bacterianas vivas ha sido efectuado en S. spp. puesto que las mismas establecen una infección por la interacción directa con el tejido linfoide asociado con el intestino (GALT), conduciendo a una respuesta inmune humoral fuerte. Las mismas también invaden las células huésped y por consiguiente con capaces de producir una respuesta fuerte mediada por las células. Eisenstein (1999) Intracellular Bacterial Vaccine Vectors (Paterson, ed., Wiley-Liss, Inc.) pp. 51-109; Hone y colaboradores (1999) Intracellular Bacterial Vaccine Vectors (Paterson, ed., Wiley-Liss, Inc.) pp. 171-221; Sirard y colaboradores (1999) Immun . Rev. 171:5-6. Idealmente, estos microorganismos atenuados que mantienen la integridad total de los constituyentes de la superficie de la célula necesarios para la inducción de los anticuerpos específicos todavía son incapaces de provocar la enfermedad, a causa por ejemplo, de que los mismos fallan en producir factores de virulencia, crecen demasiado lentamente, o no crecen en su totalidad en el huésped. Adicionalmente estas cepas atenuadas deben tener substancialmente ninguna probabilidad de revertirse a una cepa del tipo silvestre virulenta. Tradicionalmente, las vacunas vivas han sido obtenidas ya sea por el aislamiento de un virus relacionado antigénicamente de otras especies, seleccionando la atenuación a través del paso y la adaptación ti._-__.XX_ ________________ . . JL'á-, - _1 en una especie no ubicada como blanco o en los cultivos de los tejidos, o por la selección de las variantes sensibles a la temperatura. El primer enfoque fue aquel utilizado por Edward Jenner quien utilizó un poxvirus de bovino para vacunar a los seres humanos contra la viruela. La selección de la atenuación a través de pasadas en serie en una especie no ubicada como blanco es el segundo enfoque que ha sido exitoso ampliamente en la obtención de las vacunas vivas. Por ejemplo, Parkman, y colaboradores, N. Engl . J. Med. , 275:569-574 (1966), desarrolló una vacuna contra la rubéola atenuada después de la multiplicación en serie en las células del riñon del mono verde. Una vacuna contra el sarampión ha sido preparada haciendo pasar el virus en fibroblastos de embrión de pollo. Las vacunas contra la polio, hepatitis A, encefalitis Japonesa B, dengue, y citomegalovirus han sido preparadas todas siguiendo procedimientos similares. Aunque los modelos de animales, y especialmente los monos, son útiles en el desarrollo de vacunas vivas por pasadas en serie y selección, subsiste una gran incertidumbre en cuanto a si una vacuna es verdaderamente no patógena hasta que los seres humanos han sido inoculados. Por ejemplo, la cepa Daker de la fiebre amarilla producida a partir de los cerebros del ratón lactante infectado, indujeron la encefalitis en 1% de las vacunas. Otro problema crucial es la posible contaminación de la vacuna por los virus exógenos durante las pasadas en los cultivos de las células o en los animales, especialmente en los monos. A la luz del conocimiento más reciente del peligro potencial de los virus que pueden ser transmitidos desde los animales hasta los seres humanos, esta elección de desarrollo de las vacunas vivas es altamente cuestionable. En contraste con los enfoques o métodos algo casuales de la selección de las vacunas vivas, descritos anteriormente, los enfoques de desarrollo modernos introducen mutaciones específicas en el gemona del patógeno el cual afecta la capacidad de que el patógeno induzca la enfermedad. La manipulación genética definida es el enfoque o método presente que es tomado en un intento de desarrollar vacunas vivas para varias enfermedades provocadas por los microorganismos patógenos. En un esfuerzo por desarrollar vacunas vivas las cuales sean más seguras y produzcan una respuesta inmunológica más elevada, los investigadores han enfocado sus esfuerzos al desarrollo de vacunas vivas que tienen mutaciones genéticas específicas. Curtiss, en la Patente U.S. No. 5,294,441, describe que el S. typhi puede ser atenuado por la construcción de las deleciones (?) en cualquier o ambos de los genes cya (adenilato ciclasa) y crp (proteína receptora de 3' , 58-AMP [cAMP] ) . El cAMP y la proteína receptora de cAMP; los productos de los genes pleitrópicos cya y crp, respectivamente, funcionan en combinación entre sí para formar un complejo regulador que afecta la transcripción de un gran número de los genes y los operones . En consecuencia, la mutación de cualquiera de estos genes conduce a un microorganismo atenuado. Además, los microorganismos que tienen mutaciones únicas en cualquiera de los genes cya o crp no pueden suplementar su deficiencia por la emigración o depuración de estos productos del gen desde un huésped que va a ser vacunado. El producto del gen de crp no está disponible en los tejidos de los mamíferos, y aunque el metabolito producido por el producto del gen de cya, el cAMP, está presente en las células de los mamíferos, las concentraciones presentes en las células las cuales invaden el S. typhi están abajo de las concentraciones necesarias para permitir que los mutantes de cya exhiban un fenotipo del tipo silvestre. Véase, Curtiss, y colaboradores, Infect . Immun . , 55:3035-3042 (1987). Puesto que el cAMP está presente en los tejidos del huésped a algún nivel, Curtiss y colaboradores estabilizaron los microorganismos de A(&cya por la introducción de una mutación en el gen crp. Tacket, y colaboradores, Infect . Immun . , 60 (2) : 563-541 (1992), condujo a un estudio con voluntarios internados adultos sanos el cual reveló que el S. typhi atenuado que tiene deleciones en los genes cya o crp tienen propensión a producir fiebre y bacteremia (bacterias en la sangre) . Un enfoque similar en el intento de desarrollar vacunas vivas ha sido tomado por el Dr. B.A.D. Sotcker. Los genes mutados por Stocker producen productos los cuales tampoco están disponibles en los tejidos huésped. Stocker, en la Patente U.S. No. 5,210,035, describe la construcción de las cepas de vacunas a partir de los microorganismos patógenos hechos no virulentos por la introducción de los bloques mutacionales completos y no reversibles en las rutas de la biosíntesis, provocando un requerimiento de metabolitos no disponibles en los tejidos huésped. Específicamente, Stocker enseña que S . typhi puede ser atenuado interrumpiendo la ruta para la biosíntesis de los metabolitos aromáticos { aro) los cuales hacen a la Salmonella auxotrófica (es decir, nutricionalmente dependiente) para el ácido p-aminobenzóico (PABA) y el 2, 3-dihidroxibenzoato, substancias no disponibles para las bacterias en el tejido del mamífero. Estos aro-mutantes sin incapaces de sintetizar el ácido corísmico (un precursor de los compuestos aromáticos PABA y 2,3-dihidroxibenzoato) , y ninguna otra de las rutas o vías de acceso en la Salmonella existe la cual pueda superar esta deficiencia. Como consecuencia de esta auxotrofía, las bacterias aro-delecionadas no son capaces de la proliferación dentro del huésped; sin embargo las mismas radican y crecen intracelularmente lo suficientemente largas para estimular las respuestas inmune protectoras. En el artículo técnico del autor Tackert y colaboradores, descrito anteriormente, las cepas atenuadas de 5. typhi también fueron construidas para su uso como vacunas por la introducción de las deleciones en los genes aroC y aroD, de acuerdo con Stocker. Sin embargo, estas cepas atenuadas administradas a los voluntarios internados sanos tienen la predisposición a producir fiebre y bacteremia. (Hone y colaboradores (1987), Hormaeche y colaboradores (1996) Vaccine 14:251-259; Hassan y Curtiss (1997) Avian Dis . 41:783-791; y Miller y colaboradores (1990) Res . Microbiol . 141:817-821). Los estudios comparativos entre estas vacunas no han sido probados rigurosamente y por consiguiente la eficacia de estas cepas comunes las unas con respecto a las otras permanece sin aclarar. Además, la toxicidad (por ejemplo, los síntomas tales como la diarrea) de los candidatos de la vacuna bacteriana viva actual y la realidad de que muchos individuos dentro de la población humana están inmunocomprometidos, garantiza claramente la búsqueda de vacunas adicionales que ofrecezcan una mejor protección, que sean de duración más prologada, y que tienen menos toxicidad. Otro problema significativo con el desarrollo de las vacunas es el hecho de que muchas especies patógenas están comprendidas de serotipos múltiples que pueden provocar una enfermedad en los huéspedes animales vacunados contra una cepa patógena similar. Los intentos previos en el desarrollo de una vacuna contra la Salmonella de protección cruzada a largo plazo frecuentemente han sido problemáticos. Por ejemplo, las cepas de Salmonella aroA atenuadas, vivas, se ha mostrado que producen una respuesta protectora cruzada contra los serotipos heterólogos (por ejemplo, el grupo B { typhimurium) y el Grupo D { enteri tidis y dublin) , pero la capacidad protectora cruzada es eliminada virtualmente después que la vacuna es despejada de los animales inmunizados. Hormaeche y colaboradores (1996) . De manera semejantes a muchas macromoléculas celulares, el ADN es sometido s una "modificación" sintética posterior por la adición de porciones químicas pequeñas al polímero intacto. En una variedad de organismos esto involucra la adición enzimática de los grupos de metilo (-CH3) al ADN, ya sea en la posición C5 de la citosina o en la posición N6 de la adenosina, mostrada en la Figura 2. Las enzimas responsables de la adición de los grupos metilo al ADN son conocidas como ADN metiltransferasas o ADN metilasas.

Las ADN metilasas pueden ser divididas en dos clases: (1) aquellas que metilan la citosina (ADN citosina metilasas); y (2) aquellas que metilan la adenina (ADN adenina metilasas) . La metilación en los residuos de adenina por la ADN adenina metilasa (Dam) controla la temporización y la ubicación como blanco de los procesos biológicos importantes tales como la replicación del ADN, la reparación de las desigualdades dirigidas al metilo, y la transposición (Marinus, E. coli and Salmonella : Celular and Molecular Biology, 2nd ed. , 782-791 (1996)). Además, en E. coli , Dam regula la expresión de los operones tales como los píleos asociados a la pielonefritis (pap) los cuales son una determinante de virulencia importante en las infecciones del tracto urinario superior (Roberts, y colaboradores, J. Urol . , 133:1068-1075 (1985)); van der Woude, y colaboradores, Trends Microbiol . , 4:5-9 (1996). Este último mecanismo regulador involucra la formación de configuraciones de metilación del ADN heredables, las cuales controlan la expresión de los genes de control por la modulación de la unión de las proteínas reguladoras. Subsiste una necesidad seria de vacunas que sean preparadas a partir de microorganismos patógenos, vivos, las cuales sean seguras y cuando sean administradas a un huésped inducirán un tipo efectivo de respuesta inmune en un huésped. También es muy deseable desarrollar una cepa de vacuna única que sea capaz de estimular una respuesta inmune contra una cepa diferente (es decir, los serotipos o especies heterólogas) . También existe una necesidad adicional de fármacos antimicrobianos seguros y efectivos que puedan ser utilizados para tratar a los pacientes afligidos por la enfermedad provocada por los microorganismos patógenos. Todas las referencias y solicitudes de patente citadas dentro de esta solicitud son incorporadas aquí para referencia en su totalidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención está basada en los descubrimientos de que la ADN adenina metilasa (Dam) es esencial para la patogénesis de las Salmonellas y que las Dam" Salmonellas son efectivas como vacunas atenuadas vivas contra la fiebre tifoidea del murino y producen una respuesta inmune contra una segunda especie de Salmonella . Puesto que las ADN adenina metilasas son conservadas altamente en muchas bacterias patógenas que provocan una morbididad y mortalidad significativas, los derivados de Dam de estos patógenos pueden ser efectivos como vacunas atenuadas vivas. Además, puesto que la metilación de los residuos de la adenina del ADN son esenciales para la virulencia bacteriana, los fármacos que alteran la expresión de, o que inhiben la actividad de las ADN adenina metilasas es probable que tengan una acción antimicrobiana amplia y por consiguiente los genes que codifican las ADN adenina metilasas y sus productos son blancos promisorios para el desarrollo de fármacos antimicrobianos. De acuerdo con esto, es un objeto de esta invención proporcionar vacunas vivas para vacunar un huésped contra un microorganismo patógeno o un espectro de microorganismos patógenos similares. Es un objeto adicional de esta invención proporcionar vacunas vivas las cuales sirvan como portadores para los antígenos, preferentemente los inmunógenos de otros patógenos, particularmente los microorganismos, incluyendo los virus, los procariotas, y los eucariotas. Todavía es otro objeto de esta invención proporcionar fármacos antimicrobianos que inhiben específicamente las ADN adenina metilasas y los genes responsables de la producción de las ADN adenina metilasas. Además, las composiciones de la presente invención comprenden moléculas naturales y sintéticas que tienen efectos inhibidores sobre (i) las actividades enzimáticas de la ADN adenina metilasa, (ii) la expresión de las ADN adenina metilasas, (iii) los activadores de la ADN adenina metilasa, (iv) la activación de los compuestos para los represores de la ADN adenina metilasa (v) los factores de virulencia que son regulados por las ADN adenina metilasas. En consecuencia, en un aspecto la invención proporciona composiciones inmunógenas que comprenden las •» H ....,_-.,_ J.A..»._.__ bacterias patógenas atenuadas vivas en un excipiente aceptable farmacéuticamente, las bacterias patógenas contienen una mutación la cual altera la actividad de la ADN adenina metilasa (Dam) de tal modo que las bacterias patógenas son atenuadas. En otro aspecto, la invención proporciona composiciones inmunógenas que comprenden bacterias patógenas exterminadas en un excipiente aceptable farmacéuticamente, las bacterias patógenas contienen una mutación la cual altera la actividad de la ADN adenina metilasa (Dam) . En otro aspecto, la invención proporciona cepas atenuadas de las bacterias patógenas, las bacterias contienen una mutación la cual altera 'la actividad de Dam de tal modo que las bacterias son atenuadas. En otro aspecto, la invención proporciona métodos de producción de una respuesta inmune en un individuo que comprenden la administración, el cual abarca la administración de cualquiera de las composiciones descritas aquí al individuo en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune. En otro aspecto, la invención proporciona métodos de prevención de la infección por las bacterias patógenas en un individuo, que comprenden la administración de cualquiera de las composiciones inmunógenas descritas aquí al individuo en una cantidad suficiente para reducir un síntoma asociado con la infección por las bacterias patógenas durante la infección por las bacterias patógenas. En otro aspecto, la invención proporciona métodos de tratamiento de una infección bacteriana patógena en un individuo, que comprende la administración de cualquiera de las composiciones inmunógenas descritas aquí a los individuos en una cantidad suficiente para reducir un síntoma asociado con la infección por las bacterias patógenas en el individuo. En otro aspecto, la invención proporciona métodos de tratamiento de un individuo infectado con una bacteria patógena, que comprenden la administración al individuo de una composición que comprende un agente el cual altera la actividad de Dam. En otro aspecto, la invención proporciona métodos de producción de una respuesta inmune contra una segunda especie de Salmonella en una individuo, que comprenden la administración al individuo de una composición inmunógena que comprende una primera especie atenuada de Salmonella, las primeras especies que contienen una mutación la cual altera la actividad de Dam de tal modo que la Salmonella sea atenuada. En otro aspecto, la invención también proporciona métodos de selección. La invención incluye los métodos de identificación de un agente el cual puede tener actividad antibacteriana, que comprenden el uso de un sistema de transcripción in vitro para detectar un agente el cual altera el nivel de transcripción de un gen de dam cuando el agente es agregado al sistema de transcripción in vitro, en donde un agente es identificado por su capacidad para alterar el nivel de la transcripción del gen de dam cuando se compara con el nivel de la transcripción cuando ningún agente es agregado. En otro aspecto, la invención proporciona los métodos de identificación de un agente el cual puede tener la actividad antibacteriana que comprende la utilización de un sistema de traducción in vitro para detectar un agente el cual altera el nivel de traducción desde un transcrito del ADN que codifica el Dam cuando el agente es agregado al sistema de transcripción in vitro, en donde un agente es identificado por su capacidad para alterar el nivel de traducción desde el transcrito del ARN que codifica el Dam cuando se compara con el nivel de traducción cuando ningún agente es agregado. En otro aspecto, la invención proporciona métodos de identificación de un agente los cuales pueden tener una actividad antibacteriana, que comprenden la determinación de si el agente se une a Dam, en donde un agente es identificado por su capacidad para unirse a Dam. En otro aspecto, la invención proporciona métodos de identificación de un agente el cual puede tener una actividad antibacteriana, que comprenden los pasos de: (a) incubar los oligonucleótidos no metilados que comprenden un sitio de unión de Dam con Dam, S-adenosilametionina, y un agente, en donde el oligonucleótido no metilado comprende además una señal; (b) digerir todos los sitios de blanco no metilados, por lo cual se liberan los oligonucleótidos no metilados; y (c) detectar la inhibición de la ADN adenina metilasa como un incremento en la señal debido a la digestión de los sitios de blanco no metilados, en donde un agente es identificado por su capacidad para provocar un incremento en la señal comparado con los pasos de conducción (a) , (b) , y (c) en ausencia del agente. En otro aspecto, la invención proporciona métodos de identificación de un agente los cuales pueden tener una actividad antibacteriana, que comprenden los pasos de: (a) poner en contacto un agente que va a ser probado con una célula huésped adecuada que tiene la función de Dam; y (b) analizar al menos una característica la cual esté asociada con la alteración de la función de Dam, en donde un agente es identificado por su capacidad para producir al menos dicha característica. La invención también proporciona métodos de preparación de las vacunas y las cepas descritas aquí. En un aspecto, la invención proporciona métodos de preparación de las composiciones inmunógenas descritas aquí, que comprende la combinación de un excipiente farmacéutico con bacterias patógenas que contienen una mutación la cual altera la actividad de la ADN adenina metilasa (Dam) de tal modo que las bacterias patógenas sean atenuadas. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para preparar las bacterias atenuadas capaces de producir una respuesta inmunológica por un huésped susceptible a la enfermedad provocada por el microorganismo patógeno similar o correspondiente, que comprenden la construcción de al menos una mutación en las bacterias patógenas en donde una primera mutación conduce a una función de Dam alterada. Otro objeto de esta invención es proporcionar un método por el cual una vacuna pueda ser producida alterando la expresión de un regulador global de los genes de la virulencia y, más específicamente, alterando la expresión de las ADN adenina metilasas. Otro objeto de esta invención es proporcionar un método por el cual una vacuna puede ser producida alterando la expresión de los genes regulados por las ADN adenina metilasas. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para la preparación de una vacuna viva a partir de una bacteria patógena virulenta, tal como la Salmonella , que comprenden alterar la expresión de las ADN adenina metilasas y/o la expresión de los genes que son regulados por las ADN adenina metilasas en una cepa virulenta de una bacteria __iri___É_ _______ patógena que es, o que es similar a, el microorganismo contra el cual se desea la vacunación. Es todavía un objeto adicional de esta invención proporcionar un método de tratamiento de un huésped, tal como un vertebrado infectado con un patógeno por la administración al vertebrado de un compuesto o compuestos que alteren la expresión de o la inhibición de la actividad de las ADN adenina metilasas. Los objetos, ventajas y características novedosas adicionales de esta invención serán descritas en parte en la descripción que sigue, y en parte llegarán a ser evidentes por aquellos expertos en el arte durante el examen de la siguiente especificación o pueden ser aprendidos por la práctica de la invención. Los objetos y ventajas de la invención pueden ser realizados y logrados por medio de las instrumentalidades, las combinaciones, las composiciones, y los métodos puntualizados particularmente en las reivindicaciones anexas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los dibujos que se anexan, los cuales son incorporados aquí y forman una parte de la especificación, ayudan a la ilustración de la presente invención y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención. Los dibujos que se anexan no están dibujados a escala. La Figura 1 es una representación gráfica de los niveles de los anticuerpos presentes a continuación de las 5 respuestas inmune primaria y secundaria. La Figura 2 es una representación esquemática de los sitios de la metilación que ocurren o están presentes sobre la citosina y la adenina. La Figura 3 es una representación gráfica que ilustra que la Dam regula los genes inducidos in vivo. La expresión de la ß-galactosidasa a partir de las fusiones de S. typhimurium ivi en las cepas Dam+ y Dam", creció en LB. El eje vertical muestra las actividades de la ß-galactosidasa (µmoles de o-nitrofenol (ONP) formadas por minuto por unidad de A6oo por mililitro de la suspensión celular x 103) . La Figura 4 es una representación gráfica que ilustra que la Dam reprime los genes activados con PhoP. La expresión de la ß-galactosidasa a partir de las fusiones de S. typhimurium ivi , crecieron en el medio mínimo. El eje vertical muestra las actividades de la ß-galactosidasa (µ- moles de o-nitrofenol (ONP) formadas por minuto por unidad de A6oo por mililitro de la suspensión celular x 103) . El genotipo de dam es mostrado abajo del eje horizontal, y el genotipo de phoP es mostrado como las cajas negra (PhoP+) y gris ( PhoP" ) .

La Figura 5 muestra que el PhoP afecta la formación de las configuraciones de metilación del ADN de la Salmonella. Las configuraciones de metilación del ADN formadas en la cepas de PhoP" y PhoP", crecen en un medio mínimo. Las flechas muestran los fragmentos de ADN que están presentes en la PhoP" Salmonella pero que están ausentes en la PhoP+ Salmonella. La Figura 6 son gráficos que muestran la cantidad y la distribución del tejido de Salmonella en los ratones inmunizados con los mutantes de Dam" (cajas sólidas) o no inmunizados (cajas abiertas) el día 1 y el día 5. PP, placas de Peyer; MLN nodos linfáticos mesentéricos; CFU, unidades formadoras de la colonia. La Figura 7 son gráficos que muestran la cantidad y la distribución del tejido de la Salmonella en los ratones inmunizados con los mutantes de Dam" (cajas sólidas) o no inmunizados (cajas abiertas) en los días 1, 5, 14 y 28. PP, placas de Peyer; MLN nodos linfáticos mesentéricos; CFU, unidades formadoras de la colonia. Las Figuras 8A-8C son reproducciones de tono medio de la electrofóresis con gel 2D de los extractos de proteína de células completas de S . typhimuri um que muestran las proteínas producidas en la cepa Dam" (deleción no polar dam, MT2188; (A)); la cepa Dam+ (tipo silvestre, ATCC 14028 (B) ) ; y la cepa DarrX+ (sobreproductora, MT2128) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA Se ha descubierto que el gen dam y su producto la enzima ADN adenina metilasa (Dam) son requeridas para la virulencia bacteriana. A pesar de los esfuerzos de investigación previos dirigidos a las funciones de Dam, el papel crítico de Dam en la virulencia bacteriana, las implicaciones inventivas de este papel, así como la capacidad de una vacuna mutante Dam" para producir una respuesta inmune protectora, no han sido reportadas. Previamente, todos las mutaciones dam reportadas de otros laboratorios utilizaron la cepa LT2 de Salmonella la cual es al menos 1000 veces menos virulenta que aquella del tipo silvestre cuando se suministra intraperitonealmente. Equipada con el conocimiento de este descubrimiento, la presente invención está dirigida hacia (a) las vacunas que tienen mutaciones genéticas no reversibles en ya sea (i) los genes que podrían alterar una función, tal como la expresión, de las ADN adenina metilasas y/o (ii) los genes que son regulados por las ADN adenina metilasas; (b) una clase de inhibidores que son moléculas naturales o sintéticas que tienen una especificidad de unión hacia (i) las ADN adenina metilasas y/o los genes que codifican las ADN adenina metilasas, (ii) los activadores de las ADN adenina metilasas y/o los compuestos de activación para los represores de las ADN adenina metilasas, y (iii) los factores ?AÚMJ Í -_*.»__ ___j_l_á¡_ _„__- ,____»_»_,_ .__. ¿,. ....-.-- - ... ............y.,»....,....*,.....v »..».- .......»-..._ . de virulencia que son regulados por Dam; (c) los métodos para preparar las vacunas y los inhibidores con base en el conocimiento de que la ADN adenina metilasa es esencial para la patogénesis bacteriana; (d) los métodos de producción de una respuesta inmune utilizando las composiciones inmunógenas descritas aquí; (e) los métodos de tratamiento de los vertebrados con (i) las vacunas de la presente invención previo a que lleguen a ser infectadas o (ii) los inhibidores de la presente invención después de que lleguen a ser infectados con un microorganismo patógeno; (f) los métodos de prevención de la infección utilizando las composiciones inmunógenas descritas aquí; y (g) métodos de selección para identificar los compuestos los cuales pueden ser útiles como agentes terapéuticos. Como se describió en los Ejemplos, la dosis letal oral de un mutante Dam" (creado por una inserción en el gen dam (Mud-Cm) ) en S. typhimurium requerida para exterminar 50% de los animales (LD50) se incrementó arriba de 10,000 veces y la LD50 intraperitoneal fue incrementada arriba de 1,000 veces comparado con el tipo silvestre (Ejemplo 1; Tabla 1). Además, los mutantes de Dam" altamente atenuados se encontró que confieren una respuesta inmune protectora en un modelo aceptado en el arte de la fiebre tifoidea de murino (Ejemplo 2; Tabla 2) . Todos los 17 ratones inmunizados con una cepa de inserción de Dam" de S. typhimurium sobrevivieron a una -*••*-• - * -.>«.M .Jet,„A,>- *"*- <»* ^ estimulación del tipo silvestre de 10+4 arriba de la LD50, mientras que todos los 12 ratones no inmunizados murieron a continuación de la estimulación. Los estudios de sobrevivencia que comparan Dam+ con Dam" Salmonella mostraron que las bacterias Dam" fueron totalmente expertas en la colonización de un sitio de la mucosa (placas de Peyer) pero mostraron defectos severos en la colonización de los sitios del tejido más profundos (Ejemplo 2; Figura 6) . Sin que se desee que esté limitado por la teoría, los inventores notaron que una explicación posible de porqué la Dam" produce la respuesta inmune protectora es a causa de que el crecimiento de las bacterias mutantes en la mucosa intestinal es lo suficientemente grande para producir una respuesta inmune pero son incapaces de invadir y/o colonizar un tejido más profundo. Aún más sorprendente, especialmente en vista del principio retenido ampliamente en el arte de que una vacuna que contiene una especie de Salmonella podría no producir una respuesta inmune contra una segunda especie de Salmonella, o al menos una respuesta inmune posterior, significativa, contra una segunda cepa, especialmente si las especies son atenuadas debido a la mutación en un solo gen, los datos de la invención muestran tal protección cruzada. Los ratones inmunizados con Dam" S. typhimurium (serogrupo B) fueron protegidos contra una estimulación heteróloga (100 a 1000 LD5o) con inmunización posterior de once semanas con S. enteri tidis y S. dublin (serogrupo D) (Ejemplo 3; Tabla 3) . Esta protección persistió más de seis semanas después que la cepa de la vacuna fue despejada de los animales inmunizados (es decir, más de seis semanas después de que los organismos Dam" no pudieron ser detectados en los placas de Peyer, los nodos linfáticos mesentéricos, el hígado y el bazo) . En contraste con la protección cruzada de la Salmonella, ninguna protección fue observada contra ersinia pseudotuberculosis cinco semanas después de la inmunización. De manera similar, la inmunización con Dam" S. enteri tidis confirió una protección cruzada contra S. typhimurium y S. dublin . Aunque las cepas de Salmonella atenuadas se ha mostrado que producen una protección cruzada entre las cepas del grupo B { typhimurium) y del grupo D { enteri tidis y dublin) (atribuidas a una determinante antigénica LPS común compartida) , la respuesta protectora cruzada es de vida muy corta, y es eliminada virtualmente diez a doce semanas después de la inmunización. Hormaeche y colaboradores (1996) Vaccine 251-259. La expresión ectópica en los Derivados de Dam (es decir, la expresión de las proteínas que son reprimidas normalmente) como se describió en los Ejemplos 1 y 3 tiene aplicaciones amplias para el desarrollo de las vacunas. La expresión ectópica en los derivados de Dam de muchos patógenos puede dar respuestas protectora y/o protectora cruzada a los organismos virulentos paternales. Los derivados de la Salmonella Dam pueden tener utilidad como una plataforma para expresar los antígenos virales y bacterianos pasajeros que producen respuestas inmune protectoras fuertes contra el patógeno semejante. Puesto que los ratones inmunizados con Dam" pueden despejar una carga bacteriana letal de los organismos de Salmonella totalmente virulentos, las vacunas de Dam" pueden tener una utilidad terapéutica para tratar de manera efectiva una infección preexistente. Puesto que los derivados de Dam" expresan tópicamente proteínas múltiples, esto abre la posibilidad de que las vacunas pudieran ser construidas en cepas que son menos perjudiciales para los seres humanos, lo cual podría explotar los beneficios de los niveles elevados de protección producidos por las vacunas vivas mientras que se reduce el riesgo de infección para los individuos inmunocomprometidos. El hecho de que la ADN adenina metilasa sea esencial para la patogénesis bacteriana en, por ejemplo, la Salmonella también es de importancia extrema, las implicaciones de las cuales son muchas. En primer lugar, el gen dam es conservado altamente en las bacterias patógenas, es decir, la secuencia de genes de dam en un microorganismo comparte la identidad de la secuencia con el gen dam en otro microorganismo no solamente dentro de las mismas especies _ÜÉ__ i _.i.____e. _-_.,: sino también a través de los géneros bacterianos; y en segundo lugar, el gen dam regula muchos de los genes involucrados en la virulencia. Puesto que las ADN adenina metilasas son altamente conservadas en muchas bacterias patógenas que provocan la morbididad y mortalidad significativas, tales como Vijrio cholerae (Bandyopadhyay y Das, Gene, 104:67-71 (1994), Salmonella typhi (1999-3, Sange Centre) , E. coli patógeno (Blattner, y colaboradores, Science, 277:1453-1474 (1997), Yersinia pestis (1999-3, Sanger Centre), Haemophilus influenzae (Fleischmann, y colaboradores, Science, 269:496-512 (1995), y Treponema pallidum (Fraser, y colaboradores, Science, 281:375-388 (1998)), los derivados de Dam de estos patógenos pueden ser efectivos como vacunas atenuadas vivas. Además, puesto que Dam es esencial para la virulencia bacteriana, los inhibidores de Dam es probable que tengan una acción antimicrobiana amplia y por consiguiente Dam o cualquier gen que altere la expresión de Dam es un blanco promisorio para el desarrollo de los fármacos antimicrobianos. Las implicaciones de esto son como sigue: (1) ahora es posible desarrollar racionalmente una clase de inhibidores que son moléculas naturales y/o sintéticas que tienen una especificidad de la unión para (i) las ADN adenina metilasas y/o el gen de dam, (ii) los activadores de Dam y/o los compuestos de activación para los represores de Dam, y (iii) los factores de virulencia que son regulados por Dam; y (2) ahora es posible producir vacunas que tienen mutaciones genéticas no reversibles en ya sea (i) los genes que podrían alterar la expresión de las ADN adenina metilasas y/o (ii) los genes de la virulencia que son regulados por las ADN adenina metilasas. A causa de que el Dam es un regulador global de la expresión de los genes y muchos de estos genes regulados son conservados en varias especies y géneros, es altamente probable que los inhibidores y las vacunas sobre la ADN adenina metilasa darán un protección cruzada. Por consiguiente, como se describió anteriormente, un inhibidor o una vacuna contra una cepa, especies, serotipo y/o grupo de patógenos podrían proporcionar protección contra una cepa diferente del patógeno. Las composiciones descritas aquí pueden ser utilizadas para la administración a los individuos. Ellos pueden ser administrados, por ejemplo, para propósitos experimentales, o para obtener una fuente de anticuerpos anti-bacterias, tales como el anticuerpo de Salmonella . Los mismos también pueden ser administrados para producir una respuesta inmune en un individuo así como para proteger a un individuo de la infección o para tratar a un individuo infectado con una bacteria virulenta, tal como Salmonella . a.AA_fc_&eS¿___iÍa&li.... JJtjljÉj. , . »»•»"*-- " --i-e > * »-_.jy » «MU_»_...»»» .«,_..- ....-.A--.. ,,!_«._, .s _ Técnicas generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, las técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo las técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, los cuales están dentro de la experiencia del arte. Tales técnicas son explicadas totalmente en la literatura, tales como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual , segunda edición (Sambrook y colaboradores, 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984), Animal Cell Cul ture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Wei & C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel y colaboradores, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullís y colaboradores, eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan y colaboradores, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley & Sons, 1999) .

Definiciones Las "ADN adenina metilasas" (Dam) son definidas como un grupo de enzimas las cuales son capaces de metilar los residuos de adenina en el ADN. Los genes de Dam y los productos de Dam codificados por los genes dam ya son conocidos en el arte, y la definición incluye las enzimas Dam que comparten la similaridad de aminoácidos significativa con respecto a la ADN adenina metilasa de E. coli (gi 118682) y Salmonella (gi 2500157) y que metilan preferentemente la secuencia "GATC" sobre el ADN, metilando la posición N-6 de la adenina. Las secuencias de ADN altamente conservadas, particulares, que codifican una región de Dam son mostradas en las SEC ID NOS: 1-4, como se describió aquí. De acuerdo con las designaciones aceptadas en el arte, "dam" o "gen dam" indica un gen que codifica una ADN adenina metilasa, y "Dam" indica una ADN adenina metilasa (es decir, el polipéptido) . Para los propósitos de la presente invención un gen está definido porque abarca las regiones de codificación y/o las regiones reguladoras. La "actividad" o la "función" de Dam significa cualquier bio-actividad asociada con la expresión o la no expresión de dam . Las actividades de Dam son descritas aquí. Por ejemplo, la no expresión de dam conduce a la represión (o, alternativamente, des-represión) de ciertos genes regulados por Dam; así, la represión (o la des-represión) de cualquiera de estos genes es una actividad de Dam. Como otro ejemplo, la metilación de Adenina en el ADN (por ejemplo, la metilación de GATC) es una actividad asociada con la expresión de dam y el producto de Dam resultante; así, la metilación de la adenina es una actividad de Dam. La "actividad" o "función" de Dam abarca así cualesquiera una o más bio-actividades asociadas con la expresión de dam. Una "alteración" de la actividad de Dam es cualquier cambio en cualquier actividad de Dam, cuando se compara con la función de Dam del tipo silvestre. Una "alteración" puede o no puede ser una pérdida completa de una actividad de Dam, e incluye un incremento o reducción de una actividad de Dam. Las bacterias las cuales contienen una mutación que altera la actividad de Dam son referidas generalmente como "derivados de Dam". La "expresión" incluye la transcripción y/o la traducción, así como cualquier factor o evento el cual afecta la expresión (tal como un evento corriente arriba, tal como un segundo gen el cual afecta la expresión) . Una "vacuna" es una composición farmacéutica para uso humano o animal, particularmente una composición inmunógena la cual es administrada con la intención de conferir al receptor con un grado de reactividad inmunológica específica contra un blanco particular, o grupo de blancos (es decir, produce y/o mejora una respuesta inmune contra un blanco o grupo de blancos particulares) . La reactividad inmunológica, o la respuesta, pueden ser los anticuerpos o las células (particularmente las células B, las células del plasma, las células ayudantes T, y los linfocitos T citotóxicos, y sus precursores) que son inmunológicamente reactivos contra el blanco, o cualquier combinación de los mismos. Para los propósitos de esta invención, el blanco es principalmente una bacteria virulenta, tal como la Salmonella . En los casos en donde una bacteria atenuada es utilizada como un portador, el blanco puede ser otro antígeno como se describió aquí. La reactividad inmunológica puede ser deseada para los propósitos experimentales, para el tratamiento de una condición particular, para la eliminación de una substancia particular, y/o para la profilaxis. Las bacterias "patógenas" son las bacterias que son capaces de provocar la enfermedad. La "virulencia" es un indicador del grado de patogenicidad el cual puede ser expresado numéricamente como la relación del número de casos de sobre infección con respecto al número total de infectados. Se entiende que las bacterias patógenas utilizadas en las vacunas descritas aquí son diferentes de las cepas inofensivas utilizadas comúnmente en los laboratorios, y que se sabe que, y que son capaces de provocar la enfermedad.

Las bacterias "atenuadas" utilizadas en las composiciones descritas aquí son bacterias las cuales exhibieron una virulencia reducida. Como se entiende bien en el arte, y como se describió anteriormente, la virulencia es el grado al cual las bacterias son capaces de provocar la enfermedad en una población dada. Para los propósitos de la invención, las bacterias atenuadas tienen una virulencia reducida a un nivel de seguridad adecuado y aceptable, como es dictado generalmente por las agencias de gobierno apropiadas. El grado de atenuación el cual es aceptable depende, inter alia, del receptor (es decir, el paciente humano o no humano) así como de varias reglas y estándares los cuales son provistos por las agencias reguladoras tales como la U.S. Food and Drug Administration (FDA) . Más preferentemente, es manera especial para uso humano, las bacterias atenuadas son avirulentas, significando que la administración de estos organismos no provoca los síntomas de la enfermedad. Como se entiende bien en el arte, las bacterias atenuadas están vivas, al menos el tiempo de la administración. "Antígeno" significa una substancia que es reconocida y está unida específicamente por un anticuerpo o por un receptor del antígeno de la célula T. Como se sabe bien en el arte, los antígenos pueden incluir los péptidos, proteínas, glicoproteínas, polisacáridos, gangliosidas y lípidos, así como las porciones y/o las combinaciones de los mismos. Los antígenos pueden ser aquellos encontrados en la naturaleza o pueden ser sintéticos. Un "auxiliar o ayudante" es un agente químico o biológico en combinación con las bacterias atenuadas como se describió aquí para mejorar su inmunogenicidad. Como se sabe en el arte, un "auxiliar o ayudante" es una substancia la cual, cuando se agrega a un antígeno, mejora o potencia no específicamente una respuesta inmune al antígeno en el receptor (huésped) . "Estimular", "producir", o "provocar" una respuesta inmune (la cual puede ser una respuesta de la célula B y/o T) significa un incremento en la respuesta, la cual puede surgir de producir y/o mejorar una respuesta. "Heterólogo" significa derivado de y/o diferente de una entidad con la cual está siendo comparado. Por ejemplo, un antígeno "heterólogo" con respecto a una cepa bacteriana es un antígeno el cual no está asociado de manera natural o normal con esta cepa. Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para efectuar un resultado benéfico o deseado que incluye un resultado clínico, y como tal, una "cantidad efectiva" depende del contexto en el cual el mismo está siendo aplicado. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más dosis. Para los propósitos de esta invención, una cantidad efectiva de las bacterias derivadas de Dam (o una composición que contiene las bacterias derivadas de Dam) es una cantidad que induce una respuesta inmune. En términos del tratamiento, una cantidad efectiva es la cantidad que es suficiente para mitigar, mejorar, estabilizar, invertir o hacer lenta la progresión de una enfermedad bacteriana, o para reducir de otra manera las consecuencias patológicas de la enfermedad. En términos de la prevención, una cantidad efectiva es una cantidad suficiente para reducir (o aún eliminar) uno o más síntomas durante la exposición y la infección. "Tratamiento" es un enfoque o método para obtener los resultados clínicos benéficos o deseados. Los resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, pero no están limitados a, el alivio de los síntomas, la reducción del grado de la enfermedad, el estado de estabilidad (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, la prevención de la dispersión de la enfermedad, el retardo o hacer lenta la progresión de la enfermedad, el mejoramiento o el alivio del estado de la enfermedad. "Prevenir" la enfermedad o infección significa una reducción (incluyendo, pero sin estar limitado a, la eliminación) de uno o más síntomas de la infección en un individuo que recibe una composición descrita aquí cuando se compara con las mismas condiciones de otra manera excepto para recibir la(s) composición {es ) . Como se entiende en el arte, "prevención" de la infección puede incluir los síntomas más suaves y no necesariamente significa la eliminación de los síntomas asociados con la infección. Un "individuo", utilizado intercambiablemente con "huésped", es un vertebrado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no están limitados a, los animales de la granja (tales como el ganado), los animales para los deportes, y las mascotas. Un "individuo" también incluye las aves, tales como los pollos. Un "huésped" puede o no puede haber sido infectado con una bacteria. Un "agente" significa un compuesto biológico o químico tal como una molécula orgánica o inorgánica simple o compleja, un polipéptido, un polinucleótido, carbohidrato o lipoproteína. Una vasta red de compuestos puede ser sintetizada, por ejemplo los oligómeros, tales como los oligopéptidos y los oligonucleótidos, y los compuestos orgánicos sintéticos basados en varias estructuras del núcleo, y estas también están incluidas en el término "agente". Además, varias fuentes naturales pueden proporcionar los compuestos para la selección, tales como los extractos de las plantas o los animales, y semejantes. Los compuestos pueden ser probados de manera única o en combinación entre sí.

La "actividad antibacteriana" o el "control de la virulencia" significa que un agente puede afectar negativamente la capacidad de las bacterias para provocar una enfermedad. Para los propósitos de la invención, un agente el cual puede controlar la virulencia es uno el cual altera la actividad de Dam, y puede ser seleccionado por los métodos de selección descritos aquí, y además puede probar, durante un estudio adicional, controlar la virulencia de las bacterias y puede ejercer aún una actividad terapéutica. "Que comprende" y sus términos concomitantes significan "que incluyen". "Un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales, a menos que se indique de otra manera. Por ejemplo, "un" Dam significa cualquiera de una o más de las ADN adenina metilasas.

Composiciones de la invención Las composiciones descritas son útiles para producir una respuesta inmune, y/o para el tratamiento o la prevención de la enfermedad asociada con la infección bacteriana, especialmente la infección provocada por la Salmonella . Las vacunas preparadas a partir de las bacterias patógenas, vivas, son provistas para la inmunización o para el tratamiento de un huésped el cual es susceptible a la enfermedad provocada por las bacterias patógenas correspondientes, por una bacteria patógena similar de la misma cepa, especie, serotipo, y/o grupo, o por diferentes bacterias de una cepa, especie, serotipo, y/o grupo diferentes. Las vacunas vivas producidas aquí también pueden servir como los portadores para los antígenos, tales como los inmunógenos de otros patógenos por lo cuales se produce una respuesta inmunógena múltiple. En consecuencia, en una modalidad, la invención proporciona una composición inmunógena que comprende las bacterias patógenas atenuadas vivas, tales como la Salmonella, y un excipiente aceptable farmacéuticamente, las bacterias patógenas que contienen (que tienen) una mutación la cual altera la actividad de la ADN adenina metilasa (Dam) de tal modo que las bacterias patógenas sean atenuadas. En algunas modalidades, la mutación es en un gen que codifica la ADN adenina metilasa (Dam), en donde la mutación altera la actividad de la ADN adenina metilasa. La actividad de Dam puede ser incrementada o reducida, y la actividad de Dam puede ser alterada a cualquier nivel, incluyendo la transcripción y/o la traducción. Con respecto a la traducción, por ejemplo, la actividad puede ser alterada de cualquier número de formas, incluyendo la cantidad de la proteína producida y/o aquella de la naturaleza (es decir, la estructura) de la proteína producida. Por ejemplo, una mutación podría conducir a incrementar o reducir la cantidad de Dam producida por la célula (debido a la afectación de los eventos transcripcionales y/o postranscripcionales) ; alternativamente, podría surgir una mutación para un Dam alterado con la actividad alterada. La generación de las mutaciones y los mutantes los cuales alteran la actividad de Dam utilizan técnicas bien conocidas en el arte. Como un ejemplo, la producción de Dam podría ser reducida utilizando un promotor el cual se sabe que inicia la transcripción a un nivel inferior. Los ensayos para determinar el nivel de la transcripción de un elemento regulador transcripcional dado tal como un promotor son bien conocidos en el arte. El promotor dam natural podría ser reemplazado con un promotor de actividad transcripcional inferior; alternativamente, un dam' (en el cual el gen de dam negativo ha sido removido) podría ser utilizado como una base para integrar un gen de dam rediseñado que contiene un promotor de actividad inferior para integrarlo en el genoma. Alternativamente, un gen de dam diferente podría ser utilizado tal como un dam T4. Un ejemplo de un sobreproductor de dam, un plásmido pTP166 que produce el Dam de E. coli al nivel del tipo silvestre de 100 veces, podría ser utilizado. Las mutaciones pueden estar dentro del propio gen de Dam (incluyendo loe elementos reguladores transcripcionales y/o translacionales) así como un gen o »__.^... - a».,» .J.IÍ _ i J e genes los cuales afectan la producción y/o la actividad de Dam. Cualquier cepa patógena, preferentemente virulenta, de las bacterias puede ser utilizada en las composiciones inmunógenas descritas aquí. En algunas modalidades, las bacterias patógenas diferentes de E. coli son utilizadas. En otras modalidades, se utiliza el Escherichia patógeno, preferentemente E. coli . A causa de que la sobreexpresión de dam puede conducir a una vacuna útil, el gen de dam puede o no puede ser esencial, es decir, la deleción de dam puede o no puede ser letal. La invención objeto es particularmente aplicable a una amplia variedad de Salmonella, incluyendo cualquiera de los grupos, especies o cepas conocidas, más preferentemente los grupos A, B, o D, los cuales incluyen la mayoría de las especies las cuales son patógenos específicos de los huéspedes vertebrados particulares. Ilustrativos de la enfermedad que provoca la Salmonella para los cuales las vacunas vivas pueden ser producidas son S. typhimurium; S. enteri tidis, S. typhi ; S. abortus-ovi ; S. abortus-equi ; S. dublin; S. gallinarum; S. pullorum; así como otras las cuales son conocidas o se puede descubrir que provocan infecciones en los mamíferos. Otros organismos para los cuales la invención objeto también puede ser empleada incluyen Yersinia spp. , __-__!_ _.,-. _ .__,_£_._ ', particularmente Y. pestis, Vibrio spp. , particularmente V. cholerae, Shigella spp. , particularmente S. flexneri y S. sonnei ; Heamophilus spp. , particularmente H. infl uenzae, más particularmente el tipo b; Bordetella, particularmente B. pertussis; Neisseria, particularmente N. meningi tidis y N. gonorrohoeae; Pasteurella, particularmente P. mul tocida , E. coli patógeno, y Treponema tales como T. Pallidum; así como otras las cuales se sabe o se puede descubrir que provocan infecciones en los mamíferos. En otra modalidad, la invención proporciona vacunas utilizadas para vacunar un huésped que comprenden un excipiente aceptable farmacéuticamente y una forma atenuada de una bacteria patógena, en donde la atenuación se puede atribuir a al menos una mutación, en donde una primera mutación altera ya sea (i) la expresión de o la actividad de una o más ADN adenina metilasas o (ii) la expresión de uno o más genes regulados por una ADN adenina metilasa. La primera mutación es preferiblemente no reversible, y en algunas modalidades está construida en un gen cuyo producto activa una o más de las ADN adenina metilasas. La primera mutación puede ser construida en un gen cuyo producto inactiva o reduce la actividad de una o más de las ADN adenina metilasas. En otras modalidades, la primera mutación está construida en un gen cuyo producto reprime la expresión de las ADN adenina metilasas, y el producto del gen puede reprimir las Dam. La vacuna puede comprender además una segunda mutación independiente de la primera mutación con la segunda mutación que conduce a un microorganismo atenuado. La segunda mutación es preferentemente no reversible. En otra modalidad, la invención proporciona vacunas para provocar una respuesta inmunológica en un huésped que va a ser vacunado, que comprende una célula bacteriana que tiene una mutación, introducida en un gen que inhabilita la capacidad de la célula bacteriana para regular la expresión de una ADN adenina metilasa (Dam) , la cual es expresada por el gen dam. La expresión ectópica de las proteínas múltiples en las vacunas de Dam" sugiere la posibilidad de que los organismos de Dam" exterminados puedan producir respuestas inmune protectoras significativamente más fuertes que los organismos Dam+ exterminados. En consecuencia, en algunas modalidades, la invención proporciona composiciones inmunógenas que comprenden las bacterias patógenas expertas las cuales contienen una mutación la cual altera la actividad de Dam y un excipiente aceptable farmacéuticamente. Preferentemente, la mutación es en el gen dam, y, como se describió aquí, puede conducir a la reducción o el incremento en la actividad de Dam. En otras modalidades, la mutación es atenuante, y las bacterias son exterminadas utilizando los métodos bien conocidos en el arte, tales como el tratamiento con azida de sodio y/o la exposición a la luz UV. En el caso en donde la mutación es letal, las bacterias pueden ser tratadas adicionalmente para la exterminación (por ejemplo, utilizando la azida de sodio y/o la luz UV) . Los ejemplos de las bacterias adecuadas para estas vacunas incluyen, pero no están limitadas a, Salmonella , Vibrio (incluyendo V. cholerae) y Yersinia (incluyendo Y. pseudotuberculosis) . Preferentemente, las composiciones comprenden un excipiente aceptable farmacéuticamente. Un excipiente aceptable farmacéuticamente es una substancia relativamente inerte que facilita la administración de una substancia efectiva farmacológicamente. Por ejemplo, un excipiente pude dar forma o consistencia a la composición de la vacuna, o actúa como un diluyente. Los excipientes adecuados incluyen pero no están limitados a los agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsificantes, sales para hacer variar la osmolaridad, agentes de encapsulamiento, amortiguadores, y mejoradores de la penetración de la piel. Los ejemplos de los excipientes aceptables farmacéuticamente se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (Alfonso R. Gennaro, ed., 19/a. edición, 1995) . La invención también comprende las composiciones inmunógenas que contienen cualquier combinación de las cepas mutantes descritas aquí (ya sea atenuadas o exterminadas), para un género dado, tal como la Salmonella . Puesto que las - vi -.. --,»_ jJj-í.r.iiyíYí. i dos cepas de las vacunas diferentes (tales como una Dam" y un sobreproductor de Dam) pueden producir dos receptores diferentes de los antígenos potencialmente protectores, el uso de ellos en combinación puede producir una respuesta inmune superior. Las bacterias patógenas, de acuerdo con esta invención, se hacen atenuadas, preferentemente avirulentas, como un resultado de una mutación no reversible que es creada en al menos un gen, el cual altera por medio de esto una función de una(s) ADN adenina metilasa (s). Esencialmente, las vacunas vivas provistas, de acuerdo con la modalidad preferida de la presente invención, se originan con una bacteria patógena. Una mutación no reversible es introducida en un gen del patógeno, alterando por consiguiente la expresión de las ADN adenina metilasas. Las mutaciones "no reversibles" generalmente se invierten en menos de aproximadamente 1 en 108, preferentemente en menos de aproximadamente 1 en 1010, o preferentemente menos que aproximadamente 1 en 1015, aún más preferentemente menos de 1 en 1020 divisiones celulares. Preferentemente, la mutación no está agrietada; sin embargo, la regulación de los genes por Dam parece que va a ser sensible exquisitamente a la concentración de Dam. Por lo tanto, la sobreexpresión de Dam así como bajo la expresión de Dam conduce a la atenuación del patógeno. La mutación se hace preferentemente en el propio _a___ ___*.--e4-_ gen dam, sin embargo se contempla en otras modalidades de la presente invención, descritas con detalle adicional posteriormente, que las vacunas de acuerdo con la presente invención pueden ser producidas por la mutación de un gen o genes relacionados ya sea "corriente arriba" o "corriente abajo" del dam cuyo(s) producto (s) activa (n) o reprime (n) el gen dam o, en la alternativa, una mutación es construida en al menos un gen de la virulencia que es regulado por la ADN adenina metilasa. La mutación no es reversible a causa de que el restablecimiento de la función de los genes normales puede ocurrir solamente por la presentación coincidente al azar de más de un evento, cada uno de tales eventos es muy poco frecuente. Por ejemplo, la actividad de la Dam metilasa puede ser regulada descendentemente o detenida por la introducción de las deleciones en el promotor o la región de codificación, la inserción de los transposones o las secuencias de ADN intervinientes en el promotor o las regiones de codificación, el uso de un oligonucleótido antisentido que bloquea la expresión del gen dam o el uso de un ribozima que previene la expresión del gen dam. Alternativamente, la(s) mutación (es) pueden ser una inserción y/o una deleción a un grado suficiente para no provocar ninguna inversión. En el caso de una mutación de deleción, el restablecimiento de la información genética podría requerir muchas inserciones de nucleótidos al azar coincidentes, en -t,tA* *-*-** ** - i ..^__-tL*-^ -.y-- . .... -, 1- », _a_.__ -_.__.. __ ...-___._.....____.,__ ... ... ..._,___..-..._,_..,.._. _. serie, para restablecer la información genética perdida. En el caso de una inserción más la inversión, el restablecimiento de la función genética podría requerir la coincidencia de la deleción precisa de la secuencia insertada y la reinversión precisa de las secuencias invertidas adyacentes, cada uno de estos eventos tiene una frecuencia de presentación, indetectablemente baja, excedentemente pequeña. Así, cada una de las dos clases de mutaciones "no reversibles" tiene una probabilidad substancialmente de cero de inversión a la prototrofía. Otros métodos de construcción de una inserción en el gen Dam podrían ser bien conocidos y obvios para una persona experta en el arte. Aunque una mutación no reversible única proporciona un alto grado de seguridad contra la posible inversión para la virulencia, todavía subsisten eventos los cuales, aunque improbablemente, tengan una probabilidad de ocurrencia finita. Las oportunidades de la inversión existen en donde existen los microorganismos en el huésped el cual puede transferir la conjugación de la capacidad genética al organismo no virulento. Alternativamente, puede existir una ruta alternativa críptica para la producción de las ADN adenina metilasas las cuales por una mutación dada o bajo tensión podrían llegar a ser operativas. En consecuencia, en algunas modalidades, las bacterias atenuadas descritas aquí £ comprenden además una segunda mutación. Las vacunas vivas con dos mutaciones separadas y no relacionadas deben ser viables y vivir un tiempo razonablemente prolongado en el huésped, proporcionar una respuesta inmune fuerte durante la administración al huésped, y pueden servir también como un portador para los antígenos, tales como los antígenos de otros patógenos, para proporcionar una protección inmune a partir de tales patógenos. Los ejemplos de las mutaciones atenuantes de Salmonella typhimurium que pueden servir como las mutaciones secundarias para los candidatos de las vacunas atenuadas vivas son galE (toxicidad inducida por la galactosa) , pur y aro (compuestos aromáticos no disponibles in vivo), crp y cya (los cambios globales en la expresión del gen por medio del control de los catabolitos) , y phoP (cambios globales en la expresión del gen de virulencia) (Hone, y colaboradores (1987), Hormaeche, y colaboradores (1996); Hassan y Curtiss (1997), y Miller, y colaboradores (1990)). Los estudios comparativos entre estas vacunas no han sido probados rigurosamente y por consiguiente la eficacia de estas cepas actuales con respecto a cada una de las otras permanece poco clara. Además, la toxicidad (por ejemplo, los síntomas tales como la diarrea) de los candidatos de las vacunas bacterianas vivas actuales y la realidad de que muchos individuos dentro de la población humana están imunocomprometidos garantiza claramente la investigación de vacunas adicionales que ofrezcan una mejor protección, que sean de duración más prolongada, y que tengan menor toxicidad. Además de las mutaciones descritas anteriormente, es deseable que las bacterias para su uso como una vacuna viva tengan uno o más "caracteres marcadores" genéticos que las hacen distinguibles fácilmente de las otras bacterias de las mismas especies, ya sea las cepas silvestres u otras cepas de vacunas vivas. En consecuencia, se elige una cepa del patógeno el cual deseablemente tiene un marcador para distinguir el mutante de Dam" que va a ser producido a partir de otros miembros de la cepa. Alternativamente, tal marcador puede ser introducido en la cepa de la vacuna. Se pueden emplear varios marcadores, como se describió previamente. El (los) marcador (es) utilizado (s) no deben afectar el carácter inmunogénico de las bacterias, ni deben interferir con el procesamiento de las bacterias para producir la vacuna viva. El marcador solamente alterará el fenotipo, para permitir el reconocimiento de las bacterias objeto. Por ejemplo, los mutantes de Dam son sensibles a la 2-amino purina analógica base (Miller, "Experiments in Molecular Genetics" CSHL 1972) . Puesto que el gen dam está enlazado genéticamente a cysG, se puede utilizar un grupo de inserciones de transposon para transducir un receptor de cysG' a cysG* . Estos protótrofos son seleccionados para la sensibilidad de la 2-amino purina.

Para asegurar que la inserción es en el gen dam, la inserción es clonada y la región de flanqueo es secuenciada. El marcador puede ser también de algunos otros requerimientos nutricionales. Tales marcadores son útiles para distinguir la cepa de la vacuna de las cepas del tipo silvestre. Las bacterias objeto son procesadas entonces para proporcionar una o más mutaciones no reversibles. La primera mutación alterará una función de Dam, tal como la expresión, preferentemente, pero no necesariamente, por la mutación del gen dam. Si una segunda mutación es deseada, un gen, la pérdida del cual se sabe que conduce a la atenuación, es mutado adicionalmente. Las mutaciones pueden ser deleciones, inserciones, o inversiones, o combinaciones de las mismas. Varias técnicas pueden ser empleadas para introducir las deleciones o la inserción de las inversiones, para lograr una bacteria que tiene la mutación no reversible "no agrietada" deseada que conduce a una expresión alterada de la dam. La presencia de dos mutaciones completamente independientes, cada una de las cuales tiene una probabilidad extremadamente baja de inversión, proporcionan un aseguramiento casi absoluto de que la cepa de la vacuna no puede llegar a ser virulenta. Existen un número de técnicas bien conocidas las cuales pueden ser empleadas para inhabilitar o hacer mutar los genes, tales como el empleo de las técnicas de PCR, los elementos translocalizables, los agentes mutagénicos, los fagos de la transducción, y la transformación mediada por el ADN, y/o la conjugación. Otros métodos también son conocidos para una persona con experiencia ordinaria en el arte de tal modo que la tecnología del ADN recombinante también puede ser empleada para introducir sucesivamente uno o más genes mutados en una sola cepa huésped que va a ser utilizada como una vacuna. Después de la manipulación de las bacterias para introducir una o más mutaciones no reversibles en algunos miembros de la población, las bacterias se hacen crecer bajo condiciones que facilitan el aislamiento de los mutantes deseados, ya sea bajo las condiciones bajo las cuales tales mutantes tienen una ventaja selectiva sobre las bacterias paternales o bajo las condiciones que permiten su fácil reconocimiento a partir de las bacterias no alteradas o los mutantes de otros tipos. Los mutantes autotróficos aislados son entonces clonados, seleccionados para la virulencia, su incapacidad para invertirse, y su capacidad para proteger al huésped de una cepa patógena virulenta. Las vacunas pueden ser utilizadas con una amplia variedad de animales domésticos, así como los seres humanos. Incluidos entre los animales domésticos los cuales son tratados por las vacunas de hoy o que podrían ser tratados, si son susceptibles a las enfermedades bacterianas, están los pollos, vacas, cerdos, caballos, cabras, y ovejas, por nombrar solo a los animales domésticos más importantes. De acuerdo con la invención objeto, las vacunas son producidas por la introducción de una mutación no reversible en al menos un gen, en donde cada mutación es de un número suficiente de bases en serie para asegurar una probabilidad de la inversión de substancialmente cero. Preferentemente, la(s) mutación (es) ocasionan la no expresión de cada gen mutado, en el sentido de su incapacidad total para determinar la producción de una proteína activa, aunque, como se describió aquí, los sobreproductores de Dam también se pueden hacer. Además, el gen elegido estará involucrado en la expresión de una DNA adenina metilasa y preferentemente el gen será el dam. La cepa resultante será una vacuna viva avirulenta que tenga la inmunogenicidad deseada, porque la mutación no afecta la producción de los antígenos los cuales desencadenan la respuesta inmune natural del huésped. Típicamente, cuando un patógeno del tipo silvestre alcanza un tejido específico dentro del huésped, un factor de virulencia específica o conjunto de factores de virulencia son expresados como resultado del medio ambiente específico al cual está expuesto el patógeno. Se cree que los mutantes de Dam" expresan constitutivamente muchos factores de virulencia todos al mismo tiempo y no dentro de los tejidos específicos. Puesto que el efecto fisiológico de muchos factores de virulencia son específicos en cuanto al tejido, los factores de virulencia que son expresados constitutivamente en los tejidos erróneos no inician los cambios fisiológicos inherentes en el proceso de la enfermedad. Estos factores de virulencia, sin embargo, producen una respuesta inmune desde el huésped. El sistema inmune encuentra así estos factores en un medio ambiente en donde los factores no son capaces de iniciar los cambios fisiológicos necesarios en el huésped para provocar la enfermedad y el huésped es incapaz de montar una respuesta inmune. En otra modalidad de la presente invención, las vacunas son producidas por la introducción de mutaciones no reversibles en al menos dos genes, en donde cada mutación es lo suficientemente grande para asegurar una probabilidad de inversión substancíalmente de cero y para asegurar la no expresión de cada gen mutado. El primer gen elegido estará involucrado directa o indirectamente en la expresión de una ADN adenina metilasa. El segundo gen o genes elegidos también conducirá a la atenuación sin importar el efecto atenuante de la primera mutación del gen; sin embargo, la segunda mutación no puede afectar los efectos protectores de la primera mutación. Las mutaciones en el primer y segundo gen pueden ser efectuadas como se describió previamente. __s¿ ____ti £_-j_ En consecuencia, la invención proporciona un vacuna para provocar (producir) una respuesta inmunológica en un huésped que va a ser vacunado, que comprende: una bacteria que tiene una primera mutación en un primer gen que altera la expresión de una ADN adenina metilasa; y una segunda mutación en las bacterias que vuelve a los microorganismos atenuados independientemente de la primera mutación. En otra modalidad, la invención proporciona vacunas vivas las cuales pueden ser utilizadas como los vectores o los portadores para un antígeno. El antígeno puede ser cualquier antígeno, incluyendo un antígeno del género bacteriano o las especies diferentes que las bacterias utilizadas en las vacunas patógenas no virulentas. El antígeno puede ser agregado como una mezcla, fijado o asociado con las bacterias, o uno o más genes estructurales que codifican los antígeno (s) deseado (s) pueden ser introducidos en la vacuna patógena no virulenta como un cásete de expresión. En consecuencia, cualquiera de las bacterias mutantes descritas para su uso en las vacunas descritas aquí puede comprender además un cásete de expresión que tiene uno o más genes estructurales que codifican un antígeno deseado. El cásete de expresión comprende un gen o genes estructurales de interés bajo el control regulatorio de las regiones de inicio y terminación transcripcional y traduccional las cuales limitan de manera natural el gen -_,.AA_t,__>_,,-_.-___ .»__._..__J estructural de interés o los cuales son heterólogos con respecto al gen estructural. En donde los genes estructurales bacterianos o del bacteriófago estén involucrados, las regiones reguladoras naturales o del tipo silvestre usualmente, pero no siempre, serán suficientes. Puede ser necesario unir las regiones reguladoras reconocidas por el patógeno no virulento a los genes estructurales para los antígenos aislados de los eucariotas y ocasionalmente los procariotas. Los antígenos incluyen, pero no están limitados a, el Fragmento C de la toxina del tétanos, la subunidad B de la toxina del cólera, el antígeno superficial de la hepatitis B, los antígenos LPS, VIH de Víjbrio cholerae y/o LPS de Shigella soneii . El cásete de expresión puede ser una construcción recombinante o puede ser, o formar parte de, un plásmido que está presente de manera natural. Si el cásete de expresión es una construcción recombinante, el mismo puede ser unido a un sistema de replicación para el mantenimiento episómico o puede ser introducido en las bacterias patógenas no virulentas bajo las condiciones para la recombinación y la integración en el ADN cromosómico del patógeno no virulento. Los genes estructurales para los antígenos de interés pueden codificar las proteínas bacterianas tales como las subunidades de las toxinas, las proteínas virales tales como las capsidas, o las rutas o vías de acceso de las enzimas tales como aquellas involucradas en la síntesis de los antígenos de los carbohidratos tales como los lipopolisacáridos (LPS) . Por ejemplo, entre los antígenos expresados en otras vacunas de Salmonella atenuadas vivas están el Fragmento C de la toxina del tétanos, la subunidad B de la toxina del cólera, el antígeno superficial de la hepatitis B, y el LPS de Vibrio cholerae. Adicionalmente, los antígenos GP120 y GAG del VIH han sido expresados en el BCG de Mycobacterium bovis atenuado y el LPS de Shigella soneii ha sido expresado en el Vibrio cholerae atenuado. La construcción o el vector puede ser introducido en la cepa huésped a través de un número de métodos bien conocidos tales como, la transducción, conjugación, transformación, electroporación, la transfección, etc. En otra modalidad, las vacunas vivas preparadas de acuerdo con la presente invención son preparadas teniendo mutaciones no reversibles en los genes que son regulados por una(s) ADN adenina metilasa(s), preferentemente por la ADN adenina metilasa (Dam) . Estas mutaciones no reversibles pueden ser preparadas como se describió previamente. En otra modalidad, una vacuna es provista, en donde la bacteria tiene una mutación la cual conduce a la sobreproducción de Dam, preferentemente por la sobreproducción de la ADN adenina metilasa (Dam) . Los métodos de producción para la sobreproducción de los genes bacterianos son descritos aquí y son conocidos en el arte e incluyen, pero no están limitados a, además de un plásmido (el cual puede o no puede integrarse) el cual lleva un gen de dam adicional; la alteración de un promotor el cual controla la transcripción de dam; la alteración del gen dam lo cual conduce a una capacidad de respuesta reducida para la inhibición de la retroalimentación. Las composiciones inmunógenas descritas aquí pueden ser utilizadas con un ayudante o auxiliar el cual mejora la respuesta inmune contra las bacterias patógenas tales como la Salmonella . Los ayudantes o auxiliares son especialmente adecuados para las vacunas exterminadas, pero no necesitan estar limitadas a este uso. Los auxiliares o ayudantes adecuados ya son conocidos en el arte e incluyen el hidróxido de aluminio, el alumbre, el QS-21 (Patente U.S. No. 5,057,540), DHEA (Patentes U.S. Nos. 5,407,684 y 5,077,284) y sus derivados o precursores, por ejemplo, DHEA-S, beta-2 microglobulina (WO 91/16924), dipéptidos de muramilo, tripéptidos de muramilo (Patente U.S. No. 5,171,568) y monofosforil lípido A (Patente U.S. No. 4,436,728; WO 92/16231) y sus derivados, por ejemplo, DETOX™, y BCG (Patente U.S. No. 4,726,947). Otros ayudantes o auxiliares adecuados incluyen, pero no están limitados a, las sales de aluminio, las mezclas de escualeno (SAF-1), el péptido de muramilo, los derivados de saponina, las preparaciones de la -_____i.,__á_j-__Há__fat___L. _c__ ___-.. >. ....,-_ .» -_ _ •. , .i,....-..---, . _j -, , yyy<. ,. , -- - ,:.... .... , - ._-pared de micobacteria, los derivados del ácido micólico, los agentes tensioactivos de copolímeros de bloque no iónicos, Quil A, la subunidad de la toxina B del cólera, el polifosfazeno y los derivados, y los complejos inmunoestimulantes (ISCOMs) tales como aquellos descritos por Takahashi y colaboradores (1990) Nature 344:873-875. Para uso veterinario y para la producción de los anticuerpos en los animales, se pueden utilizar los componentes mitogénicos del auxiliar o ayudante de Freund. La elección de un ayudante o auxiliar dependerá en parte de la estabilidad de la vacuna en la presencia de un auxiliar o ayudante, la ruta de administración, y la aceptabilidad reguladora del ayudante, particularmente cuando está propuesto para uso humano. Por ejemplo, el alumbre es aprobado por la United States Food and Drug Administration (FDA) para su uso como un ayudante en los seres humanos. En algunas modalidades, la composición inmunógena también puede comprender una molécula portadora (con o sin un ayudante) . Los portadores ya son conocidos en el arte. Pltokin, Vaccines 3/a. Ed. Philadelphia, WB Suanders Co. (1999) . Los portadores bacterianos (es decir, los portadores derivados de las bacterias) incluyen, pero no están limitados a, la subunidad de la toxina B del cólera (CTB) ; el mutante de la toxina de la difteria (CRM197); el toxoide de la difteria; la proteína alfa C del estreptococo del grupo B; la _:_fc___&.,_ ____ j_¿___ proteína de la membrana externa meningocóccica (OMPC) ; el toxoide del tétanos; la proteína de la membrana externa de la Haemophilus influenzae no tipificable (tal como P6); la porina de la clase 3 recombinante (rPorBP) de los meningococos del grupo B; los abortos de Bucella exterminados con calor, la monocitogénesis de la Listeria exterminados con calor; y la exoproteína A recombinante de Pseudomonas aeruginosa. Otro portador es la hemocianina de lapa con forma de cerradura (KLH) . Las vacunas de la presente invención son adecuadas para la administración sistémica a los individuos en las formas de dosificación unitaria, las soluciones o suspensiones parenterales estériles, las soluciones no parenterales estériles o las suspensiones o soluciones orales, las emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite y semejantes. Las formulaciones o el suministro de los fármacos parenterales o no parenterales ya son conocidos en el arte y se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19/a. Edición, Mack Publishing (1995) . Las vacunas pueden ser administradas parenteralmente, por inyección por ejemplo, ya sea subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intradérmicamente. La administración también puede ser oral, intranasal, intrapulmonar (es decir, por aerosol), e intravenosa. Las formulaciones adicionales las cuales son adecuadas para otros modos de administración incluyen los ____í_ supositorios y, en algunos casos, las formulaciones orales. La ruta de administración dependerá de la condición del individuo y del efecto clínico deseado. Para la administración a los animales de una granja, tales como los pollos, la administración preferida es las formulaciones orales. Las formulaciones para las vacunas vivas se pueden hacer variar ampliamente, deseablemente la formulación proporciona una respuesta inmunógena mejorada. Las vacunas objeto y los fármacos antimicrobianos pueden ser utilizados en una amplia variedad de vertebrados. Las vacunas objetos y los fármacos antimicrobianos encontrarán un uso particular con los mamíferos, tales como el hombre, y los animales domésticos. Los animales domésticos incluyen los bovinos, ovinos, porcinos, equinos, caprinos, aves domésticas, Lepóridos por ejemplo, conejos, u otros animales los cuales puedan ser mantenidos en captura o puedan ser un vector para una enfermedad que afecta a los vertebrados domésticos. Los individuos adecuados para la administración incluyen aquellos que son, o se sospecha que están, en riesgo o exposición a las bacterias, tales como la Salmonella { S. spp. ) , así como aquellos que han sido expuestos y/o infectados. La manera de la aplicación de la vacuna o el fármaco antimicrobiano se puede hacer variar ampliamente, cualquiera de los métodos convencionales para la administración son aplicables. Estos incluyen la aplicación oral, sobre una base aceptable fisiológicamente, sólida o en una dispersión aceptable fisiológicamente, parenteralmente o por inyección, o semejante. La dosificación de la vacuna o fármaco antimicrobiano dependerá inter alia de la ruta de administración y variará de acuerdo con las especies que van a ser protegidas. Una o más administraciones adicionales pueden ser provistas como dosis reforzadoras, usualmente a intervalos convenientes, tales como dos a tres semanas. Puesto que las ADN adenina metilasas no están presentes en los vertebrados, es probable que los inhibidores de las ADN adenina metilasas cuando se administran a un vertebrado exhibirán una toxicidad baja o de cero. Además, puesto que las ADN adenina metilasas son enzimas, las mismas estarán presentes en concentraciones bajas dentro de la célula; requiriendo así la administración de niveles más bajos de inhibidores y el incremento de la probabilidad de que la totalidad de las ADN adenina metilasas sean inhibidas.

Juegos o conjuntos y cepas La invención también proporciona las cepas atenuadas como se describió aquí. Las cepas preferidas son las cepas de Salmonella las cuales contienen una o más mutaciones las cuales alteran la actividad de Dam. Las cepas similares son descritas aquí. En consecuencia, en una -.^ <» i. & * ÍÍ I modalidad, la invención proporciona cepas atenuadas de las bacterias patógenas que contienen una mutación la cual altera la actividad de Dam de tal modo que las bacterias sean atenuadas. La mutación puede ser cualquiera de aquellas descritas aquí. Preferentemente, la cepa es una cepa de Salmonella . La presente invención también abarca los juegos o conjuntos que contienen cualquiera de una o más de las cepas y/o las formulaciones de la vacuna descritas aquí en un empaque o envase adecuado. El juego o conjunto puede proporcionar opcionalmente instrucciones, tales como para la administración. En algunas modalidades, las instrucciones son para la administración a un animal diferente de ser humano, tales como el pollo u otro animal de la granja. En otras modalidades, las instrucciones son para la administración a un ser humano.

Métodos de la invención La invención también proporciona métodos que utilizan las composiciones inmunógenas descritas aquí, los métodos de selección para identificar los agentes potencialmente útiles los cuales alteran la actividad de Dam, así como los métodos para preparar las composiciones inmunógenas descritas aquí.

Con respecto a cualesquiera métodos que involucran la administración de cualquiera de las composiciones descritas aquí, se entiende que cualquiera o más de las composiciones pueden ser administradas, es decir, las composiciones pueden ser administradas solas o en combinación entre sí. Además, las composiciones pueden ser utilizadas solas o en conjunción con otras modalidades (es decir, la intervención clínica), para el propósito de la prevención y/o el tratamiento.

Uso de las composiciones inmunógenas para producir una respuesta inmune, la prevención y el tratamiento de la enfermedad En algunas modalidades, la invención proporciona métodos que utilizan las composiciones inmunógenas descritas aquí para producir una respuesta inmune en un individuo. En general, estos métodos comprenden administrar cualquiera de una o más de las composiciones inmunógenas descritas aquí a un individuo en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune. La respuesta inmune puede ser contra las especies particulares y/o la cepa de las bacterias en la composición, o, en otras modalidades, puede ser contra una segunda especie y/o cepa.

La respuesta inmune puede ser una respuesta de la célula B y/o de la célula T. Preferentemente, la respuesta es específica para el antígeno, es decir, la respuesta es contra las bacterias utilizadas en la composición inmunógena (es decir, una respuesta contra un antígeno asociado con las bacterias utilizadas es detectada) . Preferentemente, la respuesta inmune persiste en la ausencia de los componentes de la vacuna. En consecuencia, en algunas modalidades, la respuesta inmune persiste durante aproximadamente cualquiera de los siguientes casos después de la administración de una composición inmunógena descrita aquí (si se dan como administraciones múltiples, preferentemente después de la administración más reciente) : cuatro semanas, seis semanas, ocho semanas, tres meses, cuatro meses, seis meses, un año. Para determinar el efecto de la administración de una composición inmunógena descrita aquí, el individuo puede ser verificado o vigilado para observar una respuesta inmune ya sea celular o del anticuerpo (humoral) contra las bacterias, o una combinación de las mismas, utilizando las técnicas estándares en el arte. Alternativamente, si una composición inmunógena ya se probó que produce tal respuesta, la verificación o vigilancia puede ser innecesaria. Con el propósito de realzar una respuesta inmune, las composiciones inmunógenas descritas aquí pueden ser administradas en una forma no modificada. Algunas veces puede ___._._!:_t A _lfa_.cEtA_.i_ ._Actufctüaá_-t«,__ « .fe..' - ?it - * ser preferible modificar las bacterias para mejorar la inmunogenicidad. Cuando se utilicen aquí, y como se sabe bien en el arte, "inmunogenicidad" se refiere a una capacidad de producir una respuesta inmune del anticuerpo específico (célula B) o celular (célula T) , o ambas. Los métodos para mejorar la inmunogenicidad incluyen, inter alia, la reticulación con agentes tales como el glutaraldehído o los acopladores bifuncionales, o la fijación a una molécula de plataforma polivalente. La inmunogenicidad también puede ser mejorada por el acoplamiento a un portador de la proteína, particularmente uno que comprende los epítopes de la célula T y/o B. Los individuos adecuados para recibir las composiciones han sido descritos anteriormente y se aplican de manera semejante estos métodos. Generalmente, tales individuos son susceptibles a la exposición a, han sido expuestos a, y/o exhiben un síntoma y/o estado de enfermedad asociado con la infección. El individuo puede o no puede haber sido expuesto a la Salmonella en el instante de la administración, y en consecuencia puede o no puede haber sido infectado por la Salmonella en el tiempo de la administración. Preferentemente, el individuo no ha sido expuesto a la Salmonella . En algunas modalidades, la invención proporciona los métodos de producción de una respuesta inmune a una .. t , ., ,y£-^ segunda especie, cepa, serotipo, y/o grupo de Salmonella, en un individuo, que comprende administrar al individuo cualquiera de las composiciones inmunógenas descritas aquí en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a la segunda especie, cepa, serotipo, y/o grupo de Salmonella . El individuo puede o no puede haber sido expuesto previamente a la segunda especie, cepa, serotipo, y/o grupo de Salmonella . En algunas modalidades, la segunda Salmonella contra la cual una respuesta inmune es producida es de un segundo grupo, tal como el Grupo A, B, o D (cuando se compara con el primer serotipo administrado) . En otras modalidades, la segunda Salmonella contra la cual una respuesta inmune es producida es de un segundo serotipo (cuando se compara con el primer serotipo administrado) . Un primera y una segunda especies pueden ser cualesquiera especies de Salmonella, algunas de las cuales han sido descritas anteriormente. En algunas modalidades, la primera especie es de S. typhimurium y la segunda especie es de S. enteri tidis . En algunas modalidades, la primera especie es de S. typhimurium y la segunda especie es de S. dublin . En otras modalidades, la primera especie es de S. enteri tidis y la segunda especie es de S. typhimurium. En todavía otras modalidades, la primera especie es de S. enteri tidis y la segunda especie es de S. dublin . De manera similar, el primer grupo puede ser cualquiera de los grupos conocidos de ,Í__Í-ii_J_tt___Í____^-lJ. _ ¡_J_t^,.. ...... J_H_HI_....__. ».- ___. - -^^_.-_J__..e.C^..^CiC*.._J_fc.J,.-J......J^. .- - i.t t Salmonella, tales como el Grupo A, B, o D. El segundo grupo puede ser cualquiera conocido, tal como el Grupo A, B, o D (siempre que el segundo grupo sea diferente del primer grupo) . En otras modalidades, el primer serotipo es diferente del segundo serotipo. Los serotipos de Salmonella ya son conocidos en el arte. Se sobreentiende que una respuesta inmune puede ser producida contra uno o más antígenos adicionales (es decir, una o más de las cepas, grupos, serotipos, y/o especies de Salmonella adicionales) . Por consiguiente, la invención abarca los métodos por los cuales una respuesta inmune es producida contra las tercera, cuarta, quinta, etc., cepas, grupos, serotipos, y/o especies de Salmonella . La invención también abarca los métodos de producción de una respuesta inmune a la segunda especie, cepa, serotipo y/o grupo de una bacteria patógena en un individuo que comprende la administración al individuo de una composición inmunógena que comprende una bacteria atenuada la cual es un derivado de Dam en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a una segunda especie, cepa, serotipo y/o grupo de las bacterias patógenas. La invención también proporciona métodos de tratamiento de una infección bacteriana, preferentemente, tal como una infección provocada por Salmonella, en un individuo. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos de supresión de un síntoma de la enfermedad asociados con la infección de una bacteria virulenta, tal como la Salmonella. Los métodos comprenden la administración de una cualquiera o más de las composiciones descritas aquí en una cantidad suficiente para suprimir un síntoma de la enfermedad asociado con la infección. Preferentemente, la infección se debe a la Salmonella . En otras modalidades, la infección se debe a la Escherichia, preferentemente, E. coli . En otras modalidades, estos métodos comprenden la administración de una cualquiera o más de las composiciones descritas aquí en una cantidad para reducir la cantidad de las bacterias patógenas, tales como la Salmonella , en un individuo (cuando se compara con ninguna administración) . Las vacunas son administradas de un manera compatible con la formulación de la dosificación, y en una cantidad tal que será efectiva terapéuticamente. La cantidad que va a ser administrada depende del individuo que va a ser tratado, la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar los anticuerpos, la ruta de administración, y el grado de protección deseado. Las cantidades precisas del ingrediente activo que se requiere que sean administradas pueden depender del juicio del médico a cargo del tratamiento y puede ser peculiar para el individuo. En una modalidad, la invención proporciona métodos de tratamiento de un individuo infectado con una bacteria patógena, que comprenden la administración al individuo de una composición que comprende un agente el cual altera la actividad de Dam. En otras modalidades, la invención proporciona métodos de tratamiento de un huésped infectado 5 con un microorganismo patógeno (bacteria) que comprende (a) la administración de un compuesto al huésped, en donde el compuesto altera la expresión de, o la actividad de, una o más de las ADN adenina metilasas. El (los) compuesto (s) puede (n) unirse a una o más ADN adenina metilasas por lo cual se altera la actividad de dichas ADN adenina metilasas; (b) unirse a uno o más genes que expresan una ADN adenina metilasa, por lo cual alteran la expresión de dichas ADN adenina metilasa(s). Las expresión (es) de dicha(s) ADN adenina metilasa (s) es/son demasiado activas.

Alternativamente las expresión (es) de la(s) ADN adenina metilasa (s) es/son reprimidas. En algunas modalidades, el compuesto es un oligonucleótido de antisentido que tiene una secuencia complementaria con una o más secuencias del gen de la ADN adenina metilasa. 20 La invención también proporciona métodos de tratamiento de un huésped infectado con un microorganismo patógeno (bacterias) que comprenden la administración de un compuesto al huésped, en donde el compuesto se une a uno o más factores de virulencia que son regulados por las ADN adenina metilasas. **-£.££- s.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos de prevención de la infección bacteriana, tales como la infección por Salmonella . En estas modalidades, una respuesta inmune producida por la(s) composición (es) inmunógena (s) es protectora en el sentido de que un receptor de la composición inmunógena exhibe uno o más síntomas reducidos de la infección cuando se compara con un individuo que no recibe la composición. En otras modalidades, una protección es conferida por la reducción de la cantidad de las bacterias, tales como la Salmonella, en el individuo que recibe la composición cuando se compara con no recibir la composición. En algunas modalidades, la invención proporciona métodos de supresión de un síntoma asociado con la infección bacteriana en un individuo (o, alternativamente, métodos de tratamiento de una infección bacteriana) que comprende administrar al individuo una composición que comprende un agente el cual altera la actividad de Dam. Una bacteria puede ser cualquiera de aquellas descritas aquí, particularmente la Salmonella. En otra modalidad, un fármaco antimicrobiano de acuerdo con la presente invención es preparado, el cual inhibe una(s) ADN adenina metilasa (s), preferentemente la ADN adenina metilasa (Dam) . Aunque la siguiente descripción se dirige específicamente al gen dam y su producto, Dam, se va ____i_¡ -_- 8 __._fc_____ _.-U.J¡:e-5 „ YJ.r.J,, a entender que esta especificidad es solamente con el propósito de simplicidad y claridad. Se contempla que los métodos y composiciones descritos posteriormente son aplicables hacia (i) cualquier gen que expresa una ADN adenina metilasa, (ii) cualquier gen o producto del gen que regula un gen de ADN adenina metilasa, (iii) cualquier gen que sea regulado por una ADN adenina metilasa, y/o (iv) las ADN metilasas. En consecuencia, aunque un gen y un producto del gen específico, que es dam y Dam, se describen posteriormente, se contempla que otros genes de ADN adenina metilasa y ADN adenina metilasas son equivalentes de dam y Dam, respectivamente, y por consiguiente son intercambiables con respecto a la descripción que sigue. La inhibición de Dam podría ser llevada a cabo por un número de enfoques que incluyen el uso de oligonucléotidos antisentido para inhibir la traducción del gen dam, inhibidores directos de la actividad enzimática de Dam, la reducción de los niveles de Dam por el aislamiento de los compuestos inhibidores para los activadores de Dam y/o los compuestos de activación para los represores de Dam, y la ubicación como blanco de los factores de la virulencia que son regulados por Dam. El enfoque o método antisentido ha sido utilizado previamente para inhibir la citosina metiltransferasa (MeTase) de las células de mamíferos (MacLeod, A. R. y Szyf, M., <J. Biol . Chem. , 7:8037-8043 !,_________>.* «-..--.V -> r,....... . .. y.. ,- .- .......... __._...._________.__.._. _V__U_. ____ __ _______ .i _____ (1995)). La transfección de un ácido nucleico antisentido en las células adrenocorticales condujo a la desmetilación del ADN y a una capacidad de formación de tumores reducida asociada con la actividad de MeTase. En otra modalidad, el fármaco antimicrobiano activa la Dam. Tal compuesto podría efectuar tal activación, por ejemplo, estimulando el promotor de dam, inactivando los represores, y/o extender la vida media de Dam.

Ensayos de Selección La presente invención también abarca los métodos de identificación de los agentes que pueden tener una actividad antibacteriana (y por consiguiente pueden controlar la virulencia) con base en su capacidad para alterar la actividad de Dam. Estos métodos pueden ser practicados en una variedad de modalidades. Se ha observado que la pérdida o aún el incremento de la función de Dam conduce a una infectividad significativamente inferior de la Salmonella en un modelo de ratón aceptado en el arte. Esto sugiere que la modulación de la función de Dam puede conducir al control de la patogénesis de varias bacterias, incluyendo, pero sin estar limitado a, la Salmonella, mientras que no afecta las células huésped. Esto es especialmente verdadero puesto que los seres humanos no tienen un homólogo para los genes de dam. Se ha encontrado ic -. «fea, -i-._.:.-__acá.>¿ . afc« ,y**?»*«..A «. .. *. -¿.~*~ *. y. - n_ ....su,... t »- además que dam es un gen esencial en Vi rio cholerae y Yersinia pseudotuberculosis (Ejemplo 7), lo cual indica que Dam es un blanco del fármaco excelente en estos organismos patógenos. Por consiguiente, un agente identificado por los métodos de la presente invención puede ser útil en el tratamiento de la infección bacteriana, especialmente LA infección provocada por Escherichia , Salmonella , Vibrio, y/o Yersinia . Los métodos descritos aquí son ensayos de selección basados en las células e m vitro. En las modalidades in vitro, un agente es probado para verificar su capacidad para modular la función de Dam. En las modalidades basadas en las células, las células vivientes que tienen una función de Dam son utilizadas para probar los agentes. Para los propósitos de esta invención, un agente puede ser identificado con base en cualquier alteración de la función de Dam, aunque las características asociadas con la pérdida total de la función de Dam pueden ser preferibles. En la totalidad de estos métodos, la alteración de la función de Dam puede ocurrir a cualquier nivel que afecte la función de Dam, ya sea positiva o negativamente. Un agente puede alterar la función de Dam reduciendo o previniendo la transcripción de Dam. Un ejemplo de tal agente es uno que se une a la región de control corriente arriba, incluyendo una secuencia de polinucleótidos o polipéptido. Un agente puede alterar la función de Dam incrementando la transcripción del ARN de Dam. Un agente puede alterar la función de Dam reduciendo o previniendo la traducción del ADN de Dam. Un ejemplo de tal agente es uno que se une al ARN, tal como un polinucléotido antisentido, o un agente el cual degrada selectivamente el ARN. Los enfoques o métodos antisentido para inhibir el Dam han sido descritos anteriormente. Un agente puede alterar la función de Dam incrementando la traducción del ARN de Dam. Un agente puede comprometer la función de Dam por la unión a Dam. Un ejemplo de tal agente es un polipéptido o un quelador. Una gente puede comprometer la función de Dam afectando la expresión del gen de un gen que es regulado por Dam. Un ejemplo de tal agente es uno que altera la expresión de un gen regulado por Dam sobre cualquiera de los niveles descritos anteriormente. Los métodos de selección se describieron como aplicables a cualquier bacteria patógena que tiene un gen Dam.

Métodos de selección in vitro En los ensayos in vitro de esta invención, un agente es seleccionado en un sistema in vitro, el cual puede ser cualquiera de los siguientes: (1) un ensayo que determina si un agente está inhibiendo o incrementando la transcripción de dam; (2) un ensayo para un agente el cual interfiere con la traducción del ARN de Dam o un polinucleótido que codifica Dam, o alternativamente, un agente el cual incrementa específicamente la traducción de dam; (3) un ensayo para un agente que se una a Dam. Para un ensayo que determina si un agente inhibe o incrementa la transcripción de dam, un sistema de transcripción o transcripción/traducción in vitro puede ser utilizado. Estos sistemas están disponibles comercialmente, y generalmente contienen una secuencia de codificación como un control preferentemente interno, positivo. Un polinucléotido que codifica Dam es introducido y la transcripción se permite que ocurra. La comparación de los productos de la transcripción entre un sistema de expresión in vitro que no contiene ningún agente (control negativo) con un sistema de expresión in vitro que no contiene el agente indica si un agente está afectando la transcripción dam. La comparación de los productos de la transcripción entre el control y Dam indica si el agente, si está actuando a este nivel, esta afectando selectivamente la transcripción de dam (como lo opuesto a afectar la transcripción de un modo específico o no selectivo, general) . Para cualquier ensayo que determina si un agente inhibe o incrementa la traducción del ARN de dam o un polinucleótido que codifica Dam, un ensayo de ____L_ -A-iLj"i-lhJ transcripción/traducción in vitro como se describió anteriormente puede ser utilizado, excepto que los productos de la traducción son comparados. La comparación de los productos de la traducción entre un sistema de expresión in vitro que no contiene ningún agente (control negativo) con un sistema de expresión in vitro que no contiene el agente indica si un agente está afectando la traducción de dam . La comparación de los productos de la traducción entre el control y dam indica si el agente, si está actuando a este nivel, está afectando selectivamente la traducción de dam (como lo opuesto a afectar la traducción de un modo específico o no selectivo, general) . Para un ensayo para un agente que se une a Dam, Dam es expresado primero recombinantemente en un sistema de expresión procariótico o eucariótico como una proteína natural o como una proteína de fusión en la cual Dam es conjugado con un epítope o proteína bien caracterizado. El Dam recombinante es purificado entonces, por ejemplo, por la inmunoprecipitación utilizando los anticuerpos anti-Dam o los anticuerpos de anti-epítope, o por la unión al ligando inmovilizado del conjugado. Una columna de afinidad hecha de Dam o la proteína de fusión de Dam es utilizada entonces para seleccionar una mezcla de los compuestos la cual ha sido etiquetada apropiadamente. Las etiquetas adecuadas incluyen, pero no están limitadas, los fluorocromos, los radioisótopos, a__J_cA_ «__l..fe-_to_í„___ J_J_ _J__-.V. -J .J*-e- _ .»e^_ las enzimas y los compuestos quimioluminiscentes. Los compuestos unidos y no unidos pueden ser separados por lavados utilizando varias condiciones (por ejemplo, detergente, condiciones elevadas de una sal) que son empleadas rutinariamente por aquellos expertos en el arte. La unión no específica a la columna de afinidad puede ser minimizada predespejando el mezcla de compuestos utilizando una columna de afinidad que contiene solamente el conjugado o el epítope. Un método similar puede ser utilizado para seleccionar los agentes que competen para la unión a Dam. Además de la cromatografía de afinidad, existen otras técnicas tales como la medición del cambio de la temperatura de la fusión o la anisotropía de fluorescencia de una proteína la cual cambiará durante la unión a otra molécula. Por ejemplo, en ensayo BIAcore que utiliza un microcircuito sensor (suministrado por Pharmacia Biosensor, Sttit y colaboradores (1995) Cell 80:661-670) que está acoplado covalentemente al Dam natural o las proteínas de fusión de Dam, puede ser efectuado para determinar la actividad de unión de Dam de diferentes agentes. Con respecto a Dam de unión, se sobreentiende que los fragmentos adecuados de Dam también podrían ser utilizados. Por ejemplo, si se sabe que una región particular de Dam es importante para la unión al ADN, entonces este ju. '*¿<-&É í. t i. &*.- ^*& *&* _-* £ jia»,. ,__&a__- _<-____. r _y ._•__,_>«____»_.-_. ._, .*»* _». ¿&-.¡_i__.i & fragmento que contiene o que aún consiste de esta región podría ser utilizado. En otra modalidad, un ensayo de selección in vitro detecta los agentes que competen con otra substancia muy probablemente un polinucleótido que se une a Dam. Por ejemplo, ya se sabe que Dam se une a cierta porción del ADN, especialmente GATC, el cual es un sitio de blanco de Dam. Un ensayo podría ser llevado a cabo de tal modo que un agente sea probado para verificar su capacidad para competir con la unión a esta(s) porción(es). Los ensayos de unión competitiva ya son conocidos en el arte y no necesitan ser descritos con detalle aquí. Brevemente, tal ensayo abarca la medición de la cantidad del complejo de Dam formado en la presencia de las cantidades crecientes del competidor supuesto. Para estos ensayos, uno de los reactivos es etiquetado utilizando, por ejemplo, 32P. Uno de tales ensayos, también abarcado por esta invención, se describe con mayor detalle posteriormente. El aislamiento de los inhibidores o activadores de Dam se podría llevar a cabo, por ejemplo, por selección química (Neustadt, y colaboradores, Bioorg. Med. Chem. Lett . , 8:2395-2398 (1998)) o bibliotecas del péptido (Lam, K.S., Anticancer Drug. Res. , 12:145-167 (1997)) utilizando un ensayo de alto rendimiento, rápido, para Dam. Tales bibliotecas del inhibidor ya se ha demostrado que van a ser efectivas en el bloqueo de la actividad de varias enzimas (Carroll, C.D., Bioorg. Med. Chem . Lett . , 8:3203-3206 (1998)). Esta ensayo de Dam consiste de un oligonucleótido de doble hebra que contiene sitios de blanco de Dam (secuencias de GATC) con un grupo de atadura sobre un extremo (por ejemplo la biotina) y una señal en el otro extremo. Esta señal podría ser un compuesto radioactivo tal como fósforo-32, una molécula fluorescente tal como la fluoresceína, o un antígeno. El oligonucleótido no metilado que contiene los sitios de blanco de Dam, es unido o atado a una superficie sólida tal como las placas de microtitulación de 96 cavidades que contienen avidina. La enzima Dam (predeterminada que contiene solo la actividad suficiente para metilar la totalidad de los sitios GACT del oligonucleótido de blanco) es preincubada con las bibliotecas del inhibidor y luego agregadas a cada cavidad en la presencia de la S-adenosilmetionina (SAM) . A continuación de un período de incubación, las cavidades de las muestras son enjuagadas en una solución amortiguadora y la enzima de restricción Mbol es agregada para digerir todos los sitios de GATC no metilados dentro del oligonucleótido, liberando así el extremo de la señal de la molécula. Las cavidades de la placa son contadas entonces (señal radioactiva), exploradas para verificar la fluorescencia (señal fluorescente), o incubadas con el conjugado del anticuerpo secundario a una enzima tal como la peroxidasa del rábano picante, seguido por un substrato no radioactivo de la enzima. La inhibición de Dam podría ser detectada como una reducción en la señal dentro de una cavidad de la muestra debido a la liberación de los sitios de GATC no metilados. Este ensayo podría ser utilizado para seleccionar rápidamente las bibliotecas químicas y de los péptidos para la actividad inhibidora. La factibilidad de tales estudios ha sido mostrada por el aislamiento de sinefungin, un inhibidor de la actividad de MeTase. El sinefungin es un análogo de la S-adenosil-L-metionina (SAM), y actúa como un inhibidor competitivo de la metilación del ADN. Sin embargo, a causa de que el sinefungin podría bloquear todas las ADN metilasas que incluye la citosina metilasa del mamífero que requiere el SAM como el donador del metilo, este fármaco podría no ser útil como un agente quimioterapéutico contra las bacterias. Para aislar los activadores de Dam, el Dam (predeterminado para que contenga suficiente actividad para metilar un porcentaje bajo de sitios de blanco, tales como los sitios GATC, del oligonuceótido de blanco, por ejemplo, el 20%) es preincubado con uno o más agentes (incluyendo las bibliotecas del activador) y luego agregados a cada cavidad en la presencia de SAM. La activación de Dam podría ser detectada como un incremento en la señal dentro de la cavidad de la muestra debido a la metilación de los sitios de blanco **te . ja.j-i.j-_j- -. (tales como GATC) y por consiguiente la prevención de la reacción de restricción de Mbol. En consecuencia, en algunas modalidades, la invención proporciona métodos de identificación de un agente los cuales alteran o modulan (es decir, un agente el cual altera la función de Dam, preferentemente inhibe la función de Dam) , que comprende los pasos de (a) atar o unir un oligonucleótido no metilado que contiene el sitio de blanco de ADN adenina metilasa a una superficie sólida en donde el oligonucleótido no metilado tiene un grupo de unión o atadura sobre un primer extremo y una señal sobre un segundo extremo; (b) incubar una ADN adenina metilasa que tiene suficiente actividad para metilar los sitios de blanco, preferentemente la totalidad de los sitios de blanco, sobre el oligonucleótido no metilado con un agente; bibliotecas del inhibidor; (c) agregar la ADN adenina metilasa incubada al oligonucleótido no metilado atado o unido en la presencia déla S-adenosilmetionina; (d) digerir la totalidad de los sitios de blanco no metilados, por lo cual se libera los oligonucleótidos no metilados atados o unidos; y (e) detectar la inhibición de la ADN adenina metilasa como un incremento en dicha señal debido a la digestión de los sitios de blanco no metilados. Preferentemente, el sitio de blanco es una secuencia de GATC. El grupo de unión o atadura puede ser cualquier porción conocida en el arte, tal como la biotina. .*__lÉMt«_ c La señal puede ser debida a la fluorescencia, la radioactividad, o un antígeno. En algunas modalidades, la superficie sólida es una placa de microtitulación que contiene avidina. Una enzima de restricción, tal como Mbol, puede ser utilizada para digerir los sitios de blanco no metilados. Si una biblioteca del inhibidor es utilizada como una fuente de los agentes que van a ser probados, la biblioteca puede comprender biomoléculas, tales como péptidos, o puede comprender compuestos orgánicos o compuestos inorgánicos. También se entiende que los métodos de selección in vitro de esta invención incluyen el diseño del fármaco, estructural o racional, en el cual la secuencia de aminoácidos, la estructura atómica tridimensional u otra propiedad (o propiedades) de Dam proporciona una base para diseñar un agente el cual se espera que se una a Dam. En general, el diseño y/o la selección de los agentes en este contexto es gobernado por parámetros severos, tales como la función percibida del blanco de Dam (aquí, la unión del ADN es una de tales funciones), su estructura tridimensional (si se conoce o es supuesta) , y otros aspectos de diseño del fármaco racionales. Las técnicas de la química combinatoria también pueden ser utilizados para generar numerosas permutaciones de los agentes candidatos. Para los propósitos de esta invención, un agente diseñado y/o obtenido por el fármaco racional designado también puede ser probado en los ensayos a base de las células descritos posteriormente.

Métodos de selección a base de células En los ensayos de selección a base de células, una célula viviente, preferentemente una bacteria que contiene un gen dam funcional, o una célula viviente, preferentemente una bacteria que contiene una construcción de polinucleótidos que comprende una secuencia de codificación de Dam, son expuestos a un agente. En contraste, loe ensayos de selección del fármaco in vitro convencionales (como se describieron anteriormente) han medido típicamente el efecto de un agente de prueba sobre un componente aislado, tal como una enzima u otra proteína funcional. Los ensayos de selección a base de una célula descritos aquí tienen varias ventajas sobre los ensayos de selección del fármaco convencionales: 1) si un agente debe introducirse a la célula para lograr un efecto terapéutico deseado, un ensayo a base de una célula puede dar una indicación en cuanto a si el agente puede introducirse a una célula; 2) un ensayo de selección a base de células puede identificar los agentes que, en el estado en el cual los mismos son agregados al sistema de ensayo son ineficaces para alterar la función de Dam, pero que son modificados por los componentes celulares una vez dentro de una célula de una manera tal que los mismos lleguen a ser agentes efectivos; 3) de manera más importante, un sistema de ensayo a base de una célula permite la identificación de los agentes que afectan cualquier componente de una ruta o vía de acceso que conducirá por último a las características que están asociadas con la alteración de la función Dam. En una modalidad, un agente es identificado por su capacidad para producir una característica asociada con una alteración de Dam en una célula huésped adecuada. Una célula huésped adecuada en este contexto es cualquier célula huésped en la cual una función de Dam puede ser observada. Preferentemente, la célula huésped es una célula bacteriana. Las células huésped incluyen, pero no están limitadas a, Salmonella, Escherichia , Vibrio, Yersinia , y cualesquiera otros genes y especies de bacterias que contienen un gen Dam. Un ejemplo de un ensayo utiliza el sistema de operación de los píleos en E. coli , en el cual el nivel de la expresión de un reportero es determinada. Cualquier sistema de operon bacteriano el cual es responsable de la metilación podría ser adecuado para los ensayos basados en las bacterias, utilizando cualquier número de sistemas reporteros conocidos en el arte. Los niveles de la transcripción y/o la traducción a partir de tales sistemas en la presencia del (de los) Í?^ts í é?JMá^iñ?^yM ?ÁSmíy ' .__» .«. . «. * a _ .. *. * . -»--. t> «.«. «.ata, an,^...^ . . . ^J__ -. .í^ i.k agentes podría indicar si un agente estuvo afectando la actividad de Dam. En una modalidad, la invención proporciona métodos para identificar un agente que puede controlar la virulencia, que comprenden los siguientes pasos: (a) poner en contacto al menos un agente que va a ser probado con una célula huésped adecuada que tiene una función Dam; y (b) analizar al menos una característica la cual está asociada con la alteración de la función Dam (la cual puede incrementar, reducir, o perder la función Dam) , en dicha célula huésped, en donde un agente es identificado por su capacidad para producir al menos una de tales características. Para estos métodos, la célula huésped puede ser cualquier célula en la cual la función Dam ha sido demostrada. Para los genes que son des-reprimidos durante la pérdida de la función de Dam, la pérdida de la función de Dam puede ser medida utilizando un sistema reportero, en el cual la secuencia de los genes reporteros está enlazada operativamente al gen reprimido de Dam de interés. Tales genes reprimidos son descritos aquí, incluyendo los ejemplos. Cuando se utilice aquí, el término "gen reportero" significa un gen que codifica un producto del gen que puede ser identificado (es decir, una proteína reportera) . Los genes reporteros incluyen, pero no están limitados a, la fosfatasa alcalina, la cloranfenicol acetil transferasa, la ß- galactosidasa, la luciferasa y la proteína fluorescente verde. Los métodos de identificación para los productos de los genes reporteros incluyen, pero no están limitados a, los ensayos enzimáticos y los ensayos fluorométricos. Los genes reporteros y los ensayos para detectar sus productos son bien conocidos en el arte y se describen, por ejemplo en Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y colaboradores, Greene Publishing y Wiley-Interscience: New York (1987) y las actualizaciones periódicas, así como los Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999) . Los genes reporteros, los ensayos de los genes reporteros y los juegos o conjuntos de los reactivos también están disponibles fácilmente de las fuentes comerciales (Stratagene, Invitrogen y etc. ) . En otra modalidad, estos métodos comprenden los siguientes pasos: (a) introducir un polinucleótido que codifica Dam (o un fragmento funcional del mismo) en una célula huésped adecuada que de otra manera carece de una función Dam, en donde la función Dam es restablecida en dicha célula huésped; (b) poner en contacto la célula del paso (a) con al menos un agente que va a ser probado; (c) analizar al menos una característica la cual está asociada con la pérdida de la función de Dam, en donde un agente es identificado por su capacidad para producir al menos una de dichas características.

La célula huésped utilizada para estos métodos carece inicialmente de la función Dam (es decir, carece de la función Dam antes de la introducción del polinucleótido que codifica la Dam) . La falta de la función Dam puede ser parcial a total. La planeación de las células huésped que carecen de la función Dam puede ser lograda en una variedad de maneras, que incluyen, pero no están limitadas a, la manipulación genética tal como la mutagénesis de deleción, la substitución recombinante de una porción funcional del gen, las mutaciones de desplazamiento del marco, las técnicas genéticas clásicas o convencionales que pertenecen al aislamiento del mutante, o las alteraciones de los dominios reguladores. Para las células en las cuales la pérdida de la función de Dam (o su homólogo) es letal, un plásmido que contiene una copia del tipo silvestre de Dam está en la célula durante el proceso de ruptura, o de mutagénesis. Si las células no pueden sobrevivir sin el plásmido que contiene el gen del tipo silvestre, entonces se supone que la pérdida de la función Dam es letal. El ejemplo 7 describe un ensayo para determinar si un gen de Dam es esencial. La introducción de los polinucléotidos que codifican Dam o un fragmento funcional del mismo depende de la célula huésped particular utilizada y puede ser cualquiera de los muchos métodos conocidos en el arte, tales como la conversión en esferoplastos, la electroporación, la y.í.. . i i. precipitación con CaCl2, el tratamiento con acetato de litio, y el tratamiento con lipofectamina. Los polinucleótidos introducidos en una(s) célula (s) huésped adecuada (s) son construcciones de polinucleótidos que comprenden un polinucléotido que codifica Dam o un fragmento funcional del mismo. Estas construcciones contienen elementos (es decir, secuencias funcionales), las cuales, durante la introducción de la construcción, permiten la expresión (es decir, la transcripción, traducción, y modificaciones postransduccionales, si es que existen algunas) de la secuencia de aminoácidos de Dam en la célula huésped. La composición de estos elementos, tales como los en la presencia de Dam en la Salmonella han sido descritos anteriormente. Los métodos dados bien conocidos en el arte de la fabricación de las construcciones reporteras (véase anteriormente), cualquiera de estos genes podría ser alterado para adaptarse a un sistema reportero. Los ejemplos de los sistemas reporteros adecuados han sido descritos anteriormente . En algunas modalidades, el Dam que codifica el polinucleótido está enlazado operativamente a un promotor inducible. El uso de un promotor inducible proporciona un medio para determinar si el agente está actuando por medio de una ruta o vía de acceso de Dam. Si un agente que provoca una característica indicativa dé pérdida de la función de Dam aparece en una célula en la cual el promotor inducible es activado, una observación de que el agente falla para producir el mismo resultado en una célula en la cual el promotor inducible no es activado, indica que el agente está afectando al menos un paso o aspecto de la función de Dam. Por el contrario, si la característica que indica la pérdida de la función Dam también es observada en una célula en la cual el promotor inducible no es activado, entonces se puede suponer que el agente no necesariamente está actuando solamente por la ruta o vía de acceso funcional de Dam. Los ensayos de selección a base de las células de la presente invención pueden ser diseñados, por ejemplo, por __ _b__-__Al___ 1-1 - : ^ * ^ la construcción de las líneas celulares en las cuales la expresión de una proteína reportera, es decir, una proteína que se puede ensayar o probar fácilmente, tal como la ß- galactosidasa, la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT); la 5 proteína fluorescente verde (GFP) o luciferasa, es dependiente de la función de Dam. Por ejemplo, un gen bajo el control de Dam puede tener secuencias reporteras insertadas dentro de la región de codificación como se describió en el Ejemplo 1. La célula es expuesta a un agente de prueba, y después de un tiempo suficiente para efectuar la expresión de ß-galactosidasa y suficiente para permitir el agotamiento de la ß-galactosidasa expresada previamente, las células fueron evaluadas para la producción de la ß-galactosidasa bajo las condiciones de evaluación estándares. 15 Los métodos de ensayo requieren generalmente la comparación con una muestra de control a la cual ningún agente es agregado. Adicionalmente, puede ser deseable utilizar una célula que carece parcial o completamente de la función de Dam como un control. Por ejemplo, si un agente estuviera actuando a lo largo de una ruta o vía de acceso de Dam, se podría esperar observar el mismo fenotipo que las células de dam' tratadas con los agentes. Si un agente no estuviera actuando a lo largo de una ruta o vía de acceso de Dam, se podría esperar observar otras características que **» a_M___É__tK__l__H____^____ ....4l,i -eJÍ-i?JlaiÍAü a»_, ... _3_e.i_c.rt..»..*»...a»*...».- 4_m..t ..tananc ?Mk . . „ . „,__ __»«_ a A»_._. ,_ .. están presentes en las células de dam~ cuando se tratan con el agente. Los métodos de selección descritos anteriormente representan selecciones primarias, diseñadas para detectar cualquier agente que pueda exhibir la actividad antibacteriana. El artesano experto reconocerá que las pruebas secundarias probablemente serán necesarias para evaluar un agente adicional. Por ejemplo, una selección secundaria puede comprender probar el (los) agente (s) en las bacterias de interés si la selección inicial ha sido efectuada en una célula huésped diferente de estas bacterias. Una sección adicional es efectuar un ensayo de infectabilidad utilizando las células que han sido tratadas con el (los) agente (s). Un ensayo de infectabilidad utilizando los ratones que se describieron en el ejemplo 1, y otros modelos de animales (tales como la rata) ya son conocidos en el arte. Además, un ensayo de citotoxicidad podría ser efectuado como una corroboración adicional de que un agente el cual probó que va a ser positivo en una selección primaria pudiera ser adecuado para su uso en organismos vivientes. Un ensayo para la citotoxicidad podría ser adecuado para este propósito, incluyendo, por ejemplo el ensayo de MTT (Promega) .

Preparación de las vacunas y las bacterias atenuadas La invención también proporciona métodos de preparación, o fabricación, de las vacunas descritas aquí así 5 como los métodos de fabricación de las cepas mutantes (es decir, los derivados de Dam) descritos aquí. La preparación de las vacunas ha sido descrita anteriormente y como tales, estos métodos son incluidos en la invención. Se entiende que cualquiera de las mutaciones descritas aquí (incluyendo aquellas las cuales incrementan, reducen, o eliminan la actividad de Dam, incluyendo la expresión de Dam) pueden ser utilizadas en los métodos de preparación de la invención, y generalmente no son repetidos en esta sección. En una modalidad, la invención proporciona métodos para la preparación de una composición inmunógena que comprende las bacterias atenuadas con la función de Dam alterada, que comprende la combinación de cualquiera de los mutantes y/o de las cepas mutantes descritas aquí (es decir, los derivados de Dam) con un excipiente aceptable farmacéuticamente. Las modalidades preferidas incluyen las cepas de Salmonella tales como aquellas descritas aquí. Son preferidas particularmente las cepas de Salmonella las cuales tienen mutaciones que han eliminado la actividad de Dam, tales como aquellos mutantes de deleción descritos aquí.

En una modalidad, la invención proporciona métodos de preparación de una bacteria patógena atenuada, preferentemente la Salmonella, capaz de producir una respuesta inmunológica por un individuo susceptible a la enfermedad provocada por las bacterias patógenas correspondientes o similares que comprenden la construcción de al menos una mutación en las bacterias patógenas en donde una primera mutación conduce a la alteración de la función de Dam, preferentemente la expresión alterada de un Dam. Preferentemente, la primera mutación es introducida en un primer gen que expresa Dam. En algunas modalidades, la primera mutación es introducida en un primer gen, la expresión del cual reprime o sobreactiva la expresión de un gen que expresa una enzima de ADN adenina metilasa. En algunas modalidades, la primera mutación es introducida en un primer gen la expresión el cual es regulada por una ADN adenina metilasa. En otras modalidades, una segunda mutación es creada en un gen que es independiente de la primera mutación, la segunda mutación provoca la atenuación de las bacterias. En otra modalidad, la invención proporciona métodos de preparación de una bacteria atenuada capaz de producir una respuesta inmunológica por un huésped susceptible a la enfermedad provocada por las bacterias virulentas correspondientes que comprenden (a) la construcción de al ..-. J--_i i.l ! menos una mutación en el gen de dam de una cepa virulenta de las bacterias patógenas. En algunas modalidades, una segunda mutación es introducida en un segundo gen el cual conduce a la atenuación de las bacterias independientemente de dicha primera mutación. En otra modalidad, la invención proporciona métodos para la preparación de una bacteria atenuada capaz de producir una respuesta inmunológica por un huésped susceptible a la enfermedad provocada por las bacterias patógenas correspondientes o similares que comprenden (a) la construcción de una primera mutación no reversible en las bacterias patógenas en donde la primera mutación no reversible altera la expresión de o la actividad de una o más de las ADN adenina metilasas, y (b) la construcción de una segunda mutación no reversible en dicha bacteria patógena en donde la segunda mutación no reversible es independiente de la primera mutación no reversible y es atenuante. En algunas modalidades, la primera mutación no reversible está construida en un gen cuyo producto activa una o más de las ADN adenina metilasas. En algunas modalidades, la primera mutación no reversible está construida en un gen cuyo producto reprime la expresión de las ADN adenina metilasas. En algunas modalidades, el producto del gen reprime la ADN adenina metilasa. En otras modalidades, la primera mutación no reversible está construida en un gen cuyo producto inactiva o reduce la actividad de una o más de dichas ADN adenina metilasas por la unión directamente a una o más de las ADN adenina metilasas. En algunas modalidades, una de dichas ADN adenina metilasas es la ADN adenina metilasa. En algunas modalidades, la bacteria patógena es una cepa de Salmonella, preferentemente Salmonella es S. typhimurium, S. typhi , S. bortus-ovi , S. abortus-equi , S. dublin, S. gallinarum, S. pullorum. En otras modalidades, las bacterias patógenas son cualquiera de las siguientes: Yersinia , Vibrio, Shigella , Haemophilus, Bordetella , Neisseria , Pasteurella , pa thogenic Escherichia , Treponema . El huésped puede ser un vertebrado, tal como un mamífero, preferentemente un ser humano o un animal doméstico. En algunas modalidades, el vertebrado es un pollo. En algunas modalidades, los métodos de preparación comprenden la adición de un antígeno. Por ejemplo, el antígeno puede ser agregado simplemente a la bacteria en la vacuna, o, alternativamente, el cásete de expresión que comprende uno o más genes estructurales que codifican un antígeno deseado pueden ser insertados en las bacterias atenuadas. Los antígenos incluyen, pero no están limitados a, el Fragmento C de la toxina del tétanos, la subunidad B de la toxina del cólera, el antígeno superficial de la hepatitis B, los antígenos LPS, VIH de Vibrio cholerae y/o Shigella soneii LPS. En otra modalidad, la invención proporciona métodos para la preparación de un microorganismo atenuado capaz de 5 producir una respuesta inmune por un huésped susceptible a la enfermedad provocada por el microorganismo patógeno correspondiente o similar que comprende los pasos de (a) construir una primera mutación no reversible en el microorganismo patógeno en donde la primera mutación no 0 reversible altera la expresión de o la actividad de uno o más genes que son regulados por las ADN metilasas; y (b) la construcción de una segunda mutación no reversible en dicho microorganismo patógeno en donde la segunda mutación no reversible es independiente de la primera no reversible y es atenuante. La descripción anterior describe generalmente la presente invención. Se puede obtener un entendimiento más completo por la referencia a los siguientes ejemplos específicos los cuales son provistos aquí para los propósitos 0 de ilustración solamente y no están propuestos para ser limitativos. *--" , l__,_í «?«_ .-___j__ .,_ y, -i.BÁil -i.. ..

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no limitativos proporcionas vacunas preparadas a partir de las bacterias patógenas, vivas 5 y los sitios de blanco para los fármacos antimicrobianos de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, y son ofrecidos a manera de ilustración y no a manera de limitación. Todos los términos técnicos y científicos tienen los significados como se entienden por una persona con experiencia ordinaria en el arte. Las técnicas del ADN recombinante ahora son suficientemente bien conocidos y de amplia difusión para que sean considerados rutinarios. En términos muy amplios y generales, estas técnicas abarcan la transferencia del material genético de un organismo hacia un segundo organismo de modo que el material genético transferido llegue a ser parte del material genético del organismo al cual el mismo es transferido. Esto consiste típicamente primero en la obtención de una pieza de ADN del primer organismo ya sea de un plásmido o del ADN cromosómico.

La pieza de ADN puede ser de cualquier tamaño y frecuentemente es obtenida por medio del uso de las enzimas de la endonucleasa de restricción la cual reconoce y corta el ADN en los sitios de los pares base específicos. A continuación del aislamiento de una pieza particular del ADN, el ADN puede ser insertado o clonado en los vectores del ITffi i ipi ÜiÉrifftiffiíi r \áA? *AA***.M* *. plásmido, el fago o el cósmido para formar moléculas recombinantes que pueden ser transferidas subsiguientemente en una célula huésped por varios medios tales como la transformación, transducción, transfección, y conjugación. La transformación involucra la absorción del ADN puro del medio ambiente externo, el cual puede ser inducido artificialmente por la presencia de varios agentes químicos tales como los iones de calcio, o por electroporación. La transducción involucra el empaque del ADN recombinante dentro de un fago, tal como un fago de transducción o los vectores de los cósmidos. Una vez que el ADN recombinante es introducido en el huésped microbiano, el mismo puede continuar existiendo como una pieza separada o puede ser insertado o integrado en el cromosoma de la célula huésped y puede ser reproducido con el cromosoma durante la división celular. La conjugación involucra las técnicas de apareamiento microbiano clásicas.

Ejemplo 1. Los derivados de Salmonella Dam son avirulentos Construcción de la Cepa Todas las cepas typhimurium de Salmonella utilizadas fueron isogénicas con la cepa 14028 del American Tissue Culture Collection (ATCC) , una cepa virulenta suave de **.«&_ & » &? S. typhimurium referida como del "tipo silvestre". Previamente, todas las mutaciones de dam reportadas de otros laboratorios utilizaron la cepa LT2 de Salmonella la cual es al menos 1000 veces menos virulenta que la del tipo silvestre cuando se suministra i.p. Véanse los datos en la Tabla 1. Todas las enzimas de restricción y de pBR322 fueron compradas, y pueden ser compradas, de las fuentes comerciales, tales como Stratagene, 11099 North Torrey Pines Rd., La Jolla, California 92037. La electroporación se llevó a cabo con un aparato BioRad Gene Pulser Modelo No. 1652098. Las células de S. typhimurium fueron preparadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las alícuotas de las células competentes fueron mezcladas con una alícuota del plásmido deseado y colocadas sobre hielo durante 1 minuto. La mezcla fue transferida en un electrodo-probeta (0.2 cm) y se sometió a impulsos una vez en un intensidad del campo de 2.5 KV/cm de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 1. Construcción del mutante de dam No polar Para la construcción del mutante de dam no polar, el ADN genómico de S. typhimurium fue utilizado como el molde para la PCR utilizando la Pfu polimerasa (Stratagene) .

Un fragmento del ADN de 350 pb que contiene los primeros 100 codones de dam fue amplificado por PCR utilizando el siguiente par de oligonucleótidos; 5'- GATTTCTAGAGTAGTCTGCGGAGCTTTC-3' (SEC. ID NO. 1) (que contiene el sitio Xbal en el extremo 5') y 5'- G TTCTCGAGGGTGTTGAACTCCTCGCG-3, (SEC ID NO. 2) (que contiene un sitio Xohl en el extremo 5' ) . La PCR fue llevada a cabo en una solución amortiguadora que contiene 2.0 mM de Mg2+ durante 30 ciclos de 45 segundos a 92 °C, 1 minuto a 42 °C y 1 minuto 30 segundos a 72 °C. Este procedimiento se llevó a cabo en una Máquina Recicladora Térmica del ADN #N801-0150 (Perkin-Elmer Cetus) . El producto de PCR fue digerido entonces doblemente con Xbal y XohI. En una segunda amplificación por PCR, un fragmento del ADN de 300 pb que contiene los últimos 79 codones de dam fue sintetizado utilizando el siguiente par de oligonucléotidos: 5'- GATTCTCGAGTTTAGCCTGACGCAACAAG-3' (SEC ID NO. 3) (que contiene un sitio Xohl en el extremo 5') y 5'- GATTGCATGCTCCTTCACCCAGGCGAG-3' (SEC ID NO. 4) (que contiene un sitio Sphl en el extremo 5' ) . Este producto de PCR fue digerido doblemente entonces con Xohl y Sphl. El vector suicida pCVD442 (Donnenberg, M. S., y colaboradores, Infect . Immun . , 59:4310-4317 (1991)), fue digerido doblemente con Xohl y Sphl, purificado en la banda, y ligado o unido en una sola reacción con los dos productos de PCR cortados de la manera acostumbrada. Una deleción en el marco de 100 aminoácidos internos de Dam fue creada, dejando un sitio de Xohl único en el punto de unión de la deleción. El DH5alfa lambda pir de E. coli fue transformado entonces seleccionando la resistencia a la ampicilina. El ADN de la construcción resistente a la ampicilina apropiada (confirmada por la digestión de la restricción) fue utilizada entonces para transformar el S. typhimurium 14028. La construcción que contiene pCVD442 integrado fue segregada entonces sobre placas sin sal/sucrosa al 5 % LB. Los segregantes fueron confirmados como sensibles a la ampicilina por la impresión y Dam" por el marcado de rayas sobre las placas de LB que contienen la 2-aminopurina (0.6 mg/ml) (los mutantes de Dam son sensibles a 2-AP) . Adicionalmente, la PCR fue utilizada para confirmar la deleción por tamaño en comparación con las secuencias del tipo silvestre. Por último, la región delecionada fue clonada en pGP704 y la secuencia próxima en el punto de unión de la deleción (incluyendo el sitio Xohl) fue obtenida para confirmar que la deleción en efecto fue en el marco. La mutación provocada por la inserción de dam 102 { dam 102 : :Mud-Cm descrito anteriormente) se movió por la transducción mediada por P22 hacia la cepa de Salmonella virulenta, 14028 para construir la cepa 2. 2. Ensayos virulentos en el ratón Las propiedades virulentas de todas las diversas cepas de S. typhimurium construidas, como se describió anteriormente, fueron probadas por las inoculaciones intraperitoneal u oral de los ratones de BALB/c hembras y los resultados son presentados en la Tabla 1 posterior. Los ratones BALB/c hembras fueron comprados de Charles River Breeding Laboratories, Inc., (Wilmington, Mass.) y fueron de 6 a 8 semanas de edad en el estímulo inicial. Las cepas de S. typhimurium se hicieron crecer toda la noche a 37 °C hasta la fase estacionaria en el Caldo Luria (LB) . Las bacterias fueron lavadas una vez con PBS, luego diluidas en PBS hasta la dilución apropiada aproximada (las muestras fueron colocadas en placas para las unidades formadoras de las colonias (CFUs) sobre LB para dar un conteo bacteriano exacto) . Los ratones fueron estimulados con 200 µl de las diluciones bacterianas apropiadas ya sea intraperitoneal o peroralmente. Para las inoculaciones perorales, las bacterias fueron lavadas y concentradas por centrifugación, las bacterias fueron resuspendidas entonces en Na2HP04 a pH 8, para neutralizar el ácido del estómago, y administradas como un bolo de 0.2 ml a los animales bajo anestesia con éter. Para todas las determinaciones de LD50, 5 * . y .* *«frj» ««rifc L*Í Jt ratones fueron inoculados cada uno por dilución. Los ratones de control recibieron el PBS solamente. Todas las cepas bacterianas utilizadas en este estudio fueron derivadas de S. typhimurium 14028 (cepa 1). Las cepas mutantes fueron isogénicas con respecto al tipo silvestre y fueron obtenidas o construidas como se describió (los alelos 102::Mud-Cm y mutS121 : :TnlO de dam están en LT2 (cepa 7)), una cepa altamente atenuada (virtualmente no patógena) como se muestra en la Tabla 2, fueron obtenidas del Dr. John Roth (University of Utah) y del Dr. Tom Cebula (The Food and Drug Administration) , respectivamente; estos alelos (y los alelos adicionales posteriores) fueron transducidos en la cepa virulenta, 14028, construyendo las cepas 2 y 5, respectivamente. dam?232 (cepa 3) fue construido utilizando los oligonucleótidos internos que sirven como los cebadores de PCR diseñados para construir una deleción de 300 pb en el marco de la secuencia de dam definida. Dcml : : Km fue construido de acuerdo con (Julio, S. M., y colaboradores, Molec. Gen . Genet . , 258: 178-181 (1998)); la determinante de la resistencia Km está asociada con una deleción interna de > 600 pb de la secuencia de dcm . La Irp31 ;;Km es una inserción nula en el gen Jrp (cepa 6) . La cepa sobreproductora de Dam (cepa 4) contiene E. coli dam sobre un plásmido recombinante (pTP166) en un fondo del tipo silvestre (Marinus, y colaboradores, Gene, 28:123-125 (1984). ÍÍÍJL? Ú Í..-k. Ád .-Í.? cc.Al.__ _ ., ..

Para los estudios de competición in vivo, las bacterias fueron tratadas como se describió anteriormente, luego las células mutantes fueron mezcladas con las células del tipo silvestre a una proporción de 1:1 (las bacterias de entrada aproximadas fueron 500 mutantes + 500 del tipo silvestre) . Las proporciones actuales fueron determinadas colocando primero las bacterias de entrada sobre LB, luego marcando o evaluando cien colonias para verificar la resistencia al (a los) antibiótico (s) apropiado (s) . Las bacterias fueron inyectadas intraperitonealmente en al menos cinco ratones BALB/C (con una relación de uno a uno del tipo mutante con respecto al silvestre como se describió (Conner, C. P., y colaboradores, Proc. Na tl . Acad. Sci . USA, 14:4641-4645 (1998)), luego después de 4-5 días, cuando los ratones parecen moribundos, fueron sacrificados y sus bazos aislados, homogeneizados, diluidos y colocados en placas. Nuevamente, la relación del tipo mutante con respecto al silvestre fue determinado evaluando cien colonias para verificar el fenotipo mutante. El índice competitivo es la relación de las bacterias del tipo mutante con respecto al silvestre recuperadas y refleja esencialmente como el ajuste de la cepa mutante es comparado con la cepa del tipo silvestre. Así, estas cepas que exhiben un índice competitivo de menos de 0.0001 reflejan el hecho de que ninguna de las cepas mutantes ... »5_ fueron recuperadas de los bazos. En consecuencia, los ratones murieron como un resultado de las cepas del tipo silvestre. La ventaja del ensayo de LD50 es que cuantifica defectos de virulencia grandes. La desventaja es que el mismo carece de sensibilidad y por consiguiente se pierden frecuentemente contribuciones de la virulencia sutiles pero importantes. El índice competitivo es la relación de las bacterias del tipo mutante con respecto al silvestre recuperadas de los tejidos infectados después de la coinoculación. El índice competitivo es muy sensible permitiendo que sean detectadas las contribuciones de la virulencia sutiles. Sin embargo, a causa de su sensibilidad, la cuantificación de las diferencias en la virulencia entre dos mutantes que confieren grandes defectos es problemática. Así, el uso de la LD50 y los ensayos del índice competitivo de manera cooperativa son un medio efectivo para cuantificar los defectos de la virulencia tanto grandes como sutiles. El índice competitivo es un indicador adicional de como se ajustan las cepas mutantes comparado con las del tipo silvestre, pero no necesariamente se correlaciona directamente con la virulencia total. Los resultados son mostrados en la Tabla 1. La LD50 es la dosis requerida para exterminar el 50% de los animales infectados (LD50) evaluados para cada una de estas cepas, comparado con aquella del tipo silvestre (cepa 1; (ND, No determinado) ) . La LD5o peroral por medio de la gastrointubación para todos los derivados fue determinada infectando al menos doce ratones BALB/c; la LD50 intraperitoneal (i.p.) fue determinada infectando al menos seis ratones.

TABLA 1 Puesto que la inserción de dam podría reducir la expresión de los genes corriente abajo (efectos polares), una deleción de dam no polar, en el marco, fue construida, y se mostró que tiene la misma virulencia reducida que la _,-ca_-á_. + ..-- _-;_W. ^ ,.&_<£ i i jfa inserción de dam. Así, la atenuación fue específicamente debido a la falta de Dam. Además, la inoculación intraperitoneal de los ratones con iguales números de Dam+ y Dam" Salmonella mostró que los mutantes de Dam" fueron eliminados completamente durante el crecimiento en el ratón (ensayo del índice competitivo) . Se obtuvieron resultados similares con la cepa 4 (Tabla 1) que sobreproduce Dam a partir del plásmido recombinante, sugiriendo que los niveles precisos de la Dam metilasa son requeridos para la virulencia total. Estos resultados mostraron por primera vez que la Dam metilasa es esencial para la patogénesis bacteriana. El Dam podría afectar la virulencia de la Salmonella por medio de un incremento en la velocidad de la mutación provocada por la abrogación de la reparación de la omisión dirigida al metilo (MDMR) . Puesto que el MutS desempeña un papel esencial en MDMR, se determinó si la mutS Salmonella fue atenuada durante la virulencia. Los datos en la Tabla 1, anterior, muestran que en los ensayos tanto de la LD50 oral como de la virulencia del índice competitivo, las MutS Salmonella fueron idénticas al tipo silvestre, indicando que la Dam no afecta la patogénesis por medio de la ruta o vía de acceso de MDMR. Puesto que las cepas MutS+ muestran niveles más elevados de intercambio del ADN entre las especies que las cepas de MutS+, las mismas adquieren más fácilmente nuevos determinantes de la virulencia (Marinus, E . coii and Salmonella : Cellular and Molecular Biology, 2/a . ed. , 782-791 (1996)). El hecho de que las cepas MutS" sean totalmente virulentas podría explicar la frecuencia elevada a la cual los mutantes de mutS E. coli y Salmonella son encontrados entre las substancias aisladas clínicas (LeClerc, et al, Science, 274:1208-1211 (1996)). La Dam y la Lrp regulan directamente la expresión de los píleos de Pap, los cuales son esenciales para la virulencia de E. coli uropatógeno (O'Hanley y colaboradores, J. CJin. Invest . , 75:347-360 (1985); y Roberts, y colaboradores, J. Urol., 133:1068-1075 (1985)). Para determinar si Dam afecta la virulencia de la Salmonella a través de una ruta o vía de acceso mediada por Lrp, la Salmonella Lrp" fue analizada (Tabla 1) . La Salmonella que carece de Lrp fue totalmente virulenta con base en los ensayos de LD50 y del índice competitivo. Estos datos muestran que la Salmonella Lrp no es un factor de virulencia en los ratones. Los resultados descritos anteriormente muestran que la metilación de la adenina es crítica para la patogénesis de la Salmonella. La metilación del ADN de los residuos de citosina parece que va a ser importante para la regulación de los procesos biológicos tanto en las plantas como los animales. Aunque la Salmonella contiene una ADN citosina metilasa (Dcm) , el papel de la metilación de la citosina en ít :i __,. . a j t.Jfcái_--i;je -..- a_ ; este organismo no es claro. El mutante dcm' { dcml : ;Km) fue virulento en los ensayos de LD50 y del índice competitivo, datos no mostrados. Estos resultados demuestran que la metilación de los residuos de adenina pero no de citosina es requerida para la patogénesis de Salmonella. La metilación de la adenina del ADN se ha mostrado que controla directamente la expresión del gen de virulencia en E. coli (Braaten, y colaboradores, Cell , 76:577-588 (1994)). Por lo tanto, se determinó si la Dam regula los genes de Salmonella que son expresados preferentemente en el ratón, designados como los genes inducidos in vivo { ivi ) . Véase, Conner, C. P., y colaboradores, Proc. Na tl . Acad. Sci . USA, 14:4641-4645 (1998); Heithoff, D. M., y colaboradores, Proc. Natl . Acad. Sci . USA. , 94:934-939 (1997); Mahan, M. J., y colaboradores, Science, 259:666-668 (1993); Mahan, M. J., y colaboradores, Proc. Na tl . Acad. Sci . USA, 92:669-673 (1995); y Patente U.S. No. 5,434,065, la totalidad de las cuales se incorporan aquí para referencia. Dam reprimió significativamente la expresión de arriba de 20 genes ivi (2 a 18 veces) cuando crecen en un medio rico, ocho de los cuales fueron exhibidos en la Figura 3. Cuatro de las ocho fusiones son en los genes conocidos, la totalidad de los cuales se ha mostrado que van a estar involucrados, o implicados, en la virulencia; el spvB radica en el plásmido de virulencia de la Salmonella y funciona para facilitar el __-í.._ei _,,a crecimiento en los sitios sistémicos de la infección (Gulig, y colaboradores, Mol . Microbiol . , 7:825-830 (1993); el pmrB está involucrado en la resistencia a los péptidos antibacterianos llamados defensinas (Roland, y colaboradores, J. Bacteriol . , 75:4154-4164 (1993); mgtA y entF están involucrados en el transporte del magnesio y el hierro, respectivamente (Earhart, Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, 2na edi tion, 1075-1090 (1996); y Vescovi, G., y colaboradores, Ce22, 84:165-174 (1996)). Los genes ivi adicionales de la función desconocida también fueron regulados por Dam. Estos resultados indican que Dam es un regulador global de la expresión del gen de la Salmonella. La patogénesis de la Salmonella se sabe que va a ser controlada por PhoP, una proteína de unión del ADN que actúa tanto como un inductor como un represor de los genes de la virulencia específicos (revisado en Groisman y Heffron Two-component signal transduction, 319-332 (1995)). Para determinar si las rutas reguladoras de Dam y PhoP comparten genes comunes, el efecto de Dam fue probado sobre siete genes ivi activados con PhoP, incluyendo spvB, pmrB, y mgtA. La Figura 4 muestra que Dam reprimió la expresión de estos tres genes en 2 a 19 veces, y esta represión no fue dependiente de la proteína de PhoP. Dam no afectó significativamente la expresión de los restantes cuatro genes activados con PhoP" .jai ÚiMááAi?i &iA*, (datos no mostrados) . Estos resultados indican que Dam y PhoP constituyen una red reguladora global superpuesta que controla la virulencia de la Salmonella . La unión de las proteínas reguladoras al ADN puede formar configuraciones de metilación del ADN por el bloqueo de la metilación de los sitios de blanco de Dam específicos (secuencias GATC (van der Woude, y colaboradores, J. Bacteriol . , 180:5913-5920 (1998)). Por lo tanto, la investigación adicional de las interacciones entre Dam y PhoP se llevó a cabo por la determinación de que si la unión de PhoP (o una proteína regulada por PhoP) a los sitios del ADN específicos bloquea la metilación de estos sitios por Dam, conduciendo a una alteración en la configuración de la metilación del ADN. El análisis de PhoP+ y PhoP" Salmonella mostró diferencias distintivas en las configuraciones de metilación del ADN. La digestión del ADN genómico a partir de las bacterias de PhoP" con Mbol (el cual se segmenta solamente en los sitios GATC no metilados) condujo a la aparición de los fragmentos de ADN que no estuvieron presentes en el ADN de las bacterias de PhoP+ (Figura 5, véanse las flechas) . Estos resultados indican que la proteína de PhoP (o un producto del gen regulado por PhoP) bloquea la metilación del Dam en los sitios que contienen GATC específicos en el genoma de la Salmonella. Alternativamente, las cepas PhoP+ y PhoP" pueden tener diferentes niveles de actividad de Dam lo cual, a su vez, puede afectar las configuraciones de metilación del ADN. Sin embargo, esta regulación no ocurre al nivel transcripcional puesto que Dam no altera la expresión de PhoP, ni el PhoP altera la expresión de Dam (D. M. Heithoff y M. J. Mahan, material no publicado) . Un análisis adicional determinará si estos sitios protegidos con PhoP están dentro de las regiones reguladoras de los genes de virulencia, y si la metilación del ADN afecta directamente la regulación de PhoP alterando las interacciones del ADN-PhoP.

Ejemplo 2A: Eficacia protectora de las cepas atenuadas con Dam" Salmonella Las cepas que demostraron la atenuación como un resultado de la estimulación intraperitoneal u oral de los ratones BALB/c fueron probadas adicionalmente para verificar la inmunidad protectora contra la estimulación subsiguiente por la cepa del tipo silvestre en 105 I.P. o 109 oralmente. Los ratones BALB/c fueron inmunizados peroralmente por medio de gastrointubación con una dosis de 10+9 de PhoP" S. typhimurium. Cinco semanas más tarde, los ratones inmunizados fueron estimulados peroralmente con 10+9 S. typhimurium del tipo silvestre como se describió. Después de cinco semanas, los ratones sobrevivientes fueron estimulados con la cepa !Í.,?r.á¿??.?jí?i-du?MÍr.. _fcH e_*j»i«.-,i_^c-te*c&»g_^ _e _ * * «..t... . „..<«__, ..- t „.,<.-. y.y.y£¡ . -. - __ _t _> _. f ? i 1 t 14028 del tipo silvestre como se señaló en la Tabla 2 posterior. La sobrevivencia durante cuatro semanas después de la estimulación fue considerada una protección total. Estos datos demuestran el uso potencial de la presente invención en el desarrollo de las cepas de las vacunas. Puesto que los mutantes de Dam" fueron altamente atenuados, se determinó si la Dam" Salmonella podría servir como una vacuna atenuada viva. La Tabla 2 muestra que la totalidad (17/17) de los ratones inmunizados con la cepa de inserción de S. typhimurium Dam" sobrevivieron a una estimulación del tipo silvestre de 10+4 arriba de la LD50, mientras que todos los ratones no inmunizados (12/12) murieron a continuación de lá estimulación.

TABLA 2 Virtualmente ningunos efectos visibles de la fiebre tifoidea fueron observados de manera subsiguiente a la inmunización con Dam" Salmonella, ni fueron observados efectos visibles después de la estimulación con el tipo silvestre. Además, a causa de que todos los ratones (8/8) inmunizados con la Salmonella que contienen la deleción de (cepa) dam no polar sobrevivieron a la estimulación, estos datos indican que la protección fue debida específicamente a la ausencia de la Dam metilasa. La atenuación de la virulencia y la efectividad de los mutantes de Dam" como una vacuna (Tablas 1 y 2) se podría deben a la expresión ectópica de los determinantes de la virulencia (Figuras 3 y 4) las cuales probablemente serían perjudiciales para el crecimiento y/o la sobrevivencia de la Salmonella durante la infección. Por consiguiente, la expresión ectópica proporciona una explicación de porqué el mutante Dam que está atenuado totalmente todavía proporciona una protección total como una vacuna atenuada viva.

Estudios de Colonización Las supervivencias de Dam+ y Dam" Salmonella en los tejidos del ratón fueron comparadas. Como se muestra en la Figura 6, las bacterias de Dam" fueron totalmente hábiles en la colonización de un sitio de la mucosa (placas de Peyer) pero mostraron severos defectos en la colonización de los sitios de los tejidos más profundos. Cinco días después de la infección, se observó una reducción de tres órdenes de magnitud en los números de la Dam" Salmonella en los nodos linfáticos mesentéricos (con relación a los números de las Bacterias de Dam+) y una reducción de ocho órdenes de magnitud en los números de la Dam" Salmonella en el hígado y el bazo. Estos datos muestran que la Dam" Salmonella sobrevive en las placas de Peyer del intestino delgado del ratón durante al menos 5 días, proporcionando una oportunidad para la producción de una respuesta inmune del huésped. Las Dam" Salmonellas, sin embargo, fueron incapaces de provocar una enfermedad; las mismas ya sea fueron incapaces de invadir los tejidos sistémicos o fueron capaces de invadir pero podrían no sobrevivir.

Ejemplo 2B: Eficacia protectora de los derivados de Dam exterminados Determinación de si el Dam' viviente o las bacterias sobreproductoras de Dam son requeridas para producir una respuesta protectora total . La expresión ectópica de las proteínas múltiples en las vacunas de Dam" (véase anterior y posteriormente) sugiere la posibilidad de que los organismos de Dam" exterminados puedan producir respuestas inmune protectoras significativamente más fuertes que los organismos de Dam+ exterminados y por consiguiente que puedan ser utilizados como vacunas para las mucosas. Las bacterias Dam" de S. typhimurium que se hicieron crecer in vitro son exterminadas por la exposición a la azida de sodio (0.02 %) y/o a la luz UV, después de lo cual los organismos antimicrobianos son ya sea lavados o dializados separándolos de los organismos exterminados. La eficacia de la preparación de la vacuna exterminada con las células completas es probada con y sin el uso de los ayudantes para las mucosas tales como la toxina del cólera, la toxina lábil de E. coli , o la vitamina D3 (1.25 (OH)2D3) . En consecuencia, las preparaciones de la vacuna que contienen 1010 Dam" Salmonella exterminadas, solas y en combinación con los ayudantes para las mucosas, son utilizados para inmunizar oralmente los ratones BALB/c (como se describió en los Ejemplos) . Como un régimen de dosificación, los ratones son inmunizados por la gastrointubación una vez a la semana durante tres semanas. El S. typhimurium del tipo silvestre exterminado sirve como un control negativo. Los ratones inmunizados son estimulados oralmente con S. typhimurium virulento 2 semanas después de la última inmunización para determinar si una respuesta inmune efectiva es generada. Si es así, los ratones inmunizados con la preparación de la vacuna exterminada son estimulados también con otros serotipos de Salmonella patógenos (por ejemplo, enteri tidis, choleraesuis, dublin) para determinar si la inmunidad producida es protectora de manera cruzada contra las cepas relacionadas como es el caso para la administración oral de las vacunas vivas de Dam" Salmonella. Si los ratones inmunizados con la preparación de la vacuna muerta son protegidos dos semanas después de la inmunización final (o tres), o si la inmunidad producida es a largo plazo, es determinada por la estimulación de los ratones inmunizados 7 semanas después de la última inmunización. Puesto que la sobreproducción de Dam puede conducir a la expresión ectópica de un nuevo repertorio de antígenos protectores potenciales que no son expresados en cualquiera de las cepas de la Vacuna Dam" o del tipo silvestre (Dam+) , los experimentos de las vacunas exterminadas son efectuados con las cepas de sobreproducción de Dam, solas y en combinación con los organismos de Dam" exterminados. Puesto que las dos cepas de vacuna diferentes pueden producir dos repertorios diferentes de antígenos potencialmente protectores, el uso de ellos puede producir una respuesta inmune superior.

Ejemplo 3: Protección cruzada producida por una Dam" Salmonella La inmunización con Dam' Salmonella produce una respuesta protectora cruzada para los serotipos heterólogos. Como se muestra en la Figura 7 y como se describe -í-1Aa _ja_W_j_____ii____,i _?_.-_"^be*^.".•_.»....< ..ji____m__, .-*»_ Jc^-e J- «. <_.. - «..- . ?»___ .»-.»?.? xz _. n_ _£»._» . 14 posteriormente, los mutantes de Dam" expresan ectópicamente los genes múltiples (y presumiblemente las proteínas) que normalmente solo son expresadas durante la infección. Tal expresión ectópica de los antígenos múltiples puede conducir a respuestas inmune protectoras cruzadas contra los serotipos heterólogos. Los ratones BALB/c fueron inmunizados con 1 X 109 Dam" S. typhimuríum (serogrupo B) administrado oralmente (por medio de gastrointubación) y fueron estimulados once semanas después con (100 a 1000 LD50) de S. enteri tidis y S. dublin virulentos (serogrupo D) . Los datos en la Tabla 3 muestran que los ratones fueron protegidos contra una estimulación heteróloga once semanas después de la inmunización. De manera importante, la inmunidad protectora cruzada no fue atribuida a la persistencia de la cepa de la vacuna en los tejidos de murino, puesto que los ratones fueron protegidos contra la estimulación heteróloga más de seis semanas después de que la cepa de la vacuna fue despejada de los animales inmunizados (es decir, después que los organismos Dam" no pudieron ser detectados en los placas de Peyer, los nodos linfáticos mesentéticos, el hígado y el bazo) . La protección cruzada producida es específica para las cepas de Salmonella en que ninguna protección fue producida contra el patógeno sistémico Yersinia pseudotuberculosis cinco semanas después de la inmunización.

TABLA 3 La inmunización con Dam S. typhimurium confiere una inmunidad protectora cruzada De manera similar, la inmunización con Dam- S. enteri tidis (daml02: :Mud-Cm, a continuación de un protocolo experimental descrito anteriormente) confiere una protección cruzada contra la estimulación con 109 S. typhimuri um y 109 S. dublin después de cinco semanas y puede conferir una protección cruzada durante período aún más prolongados. Los derivados de Dam' expresan ectópicamente proteínas múl tiples in vi tro. La expresión ectópica de las proteínas múltiples en las cepas de Dam" puede contribuir a la protección cruzada contra los serotipos heterólogos que íe_______-_áü-._?kaa¿ yí .« .-__ _____J comparten epítopes comunes. Para este fin, se ha mostrado que las cepas dam- expresan ectópicamente un número de genes de Salmonella que normalmente son reprimidos in vitro. La electrofóresis en un gel de proteína bidimensional fue efectuado por el método de O'Farrell (1975) J. Biol . Chem. 250:4007-4021) sobre los extractos de la proteína de células completas de la fase-log de S. typhimurium que crecieron en el caldo Luria. El enfoque o método isoeléctrico utilizando anfolinas de pH 5-7 (BioRad Laboratories, Hercules, CA) se llevó a cabo a 800 V durante 17 h. La segunda dimensión consistió de 12.5 % de geles de rebanadas de poliacrilamida al 12.5% las cuales se hicieron correr durante 5.5 h a 175 V. Las proteínas fueron visualizadas por el teñido con plata (Merril y colaboradores (1984) Methods Enzymol . 104:441-447). Los resultados son mostrados en la Figura 7. Los resultados mostraron que dos análisis de electrofóresis con un gel bidimensionales (análisis 2-D) en las cepas Dam", Dam+ (tipo silvestre) y sobreproductoras de Dam (OP) que se hicieron crecer in vitro condujeron a la detección de varias proteínas que fueron expresadas bajo la condición Dam" que no fueron detectadas bajo ya sea las condiciones de Dam+ (tipo silvestre) o Dam OP (que expresa aproximadamente 100 veces más elevado el Dam que el normal) . Estos datos indican que la Salmonella Dam" expresa ectópicamente las proteínas múltiples in vitro (y presumiblemente in vivo) , sugiriendo que la disrregulación de la expresión de la proteína podría proporcionar blancos de proteína novedosos, múltiples, que van a ser procesados y presentados al sistema inmune. El análisis de la proteína 2-D indica que las cepas sobreproductoras de Dam de la Salmonella { S. typhimuri um ATCC 14028 con el plásmido pTP166 que sobreproduce Dam de E. coli a aproximadamente 100 veces el nivel del tipo silvestre) expresa un número de productos genéticos que no son expresados por el Dam+ (tipo silvestre) o Dam" Salmonella bajo las condiciones de crecimiento en el laboratorio. No se han detectados proteínas que sean producidas por Dam+ que no sean producidas por Dam" o las cepas sobreproductoras de Dam. Tomados junto con la observación de que las cepas sobreproductoras de Dam son atenuadas y producen una inmunidad protectora, estos resultados sugieren que la sobreproducción de Dam puede conducir a la expresión de un repertorio diferente de los antígenos que es producido en las cepas Dam". Así, las vacunas que consisten de las cepas sobreproductoras de Dam en combinación con las cepas Dam" pueden ser altamente protectoras de manera cruzada debido a la expresión ectópica de dos diferentes repertorios de los antígenos potencialmente protectores. La inmunidad producida por las cepas Dam' es mayor que la inmunidad producida después de una infección del tipo silvestre . Una de las propiedades de virulencia más efectivas de un patógeno es la capacidad para evitar las respuestas inmune del huésped. Tal estrategia "clandestina" es lograda por la regulación estrecha de muchas de sus funciones para evitar el reconocimiento inmune del huésped. Así, como un organismo protector bacteriano, es probable que muchos antígenos producidos por los organismos virulentos no sean producidos en cantidades suficientes y/o durante una cantidad de tiempo suficiente para producir una respuesta inmune del huésped. Sin embargo, las bacterias de Dam" pueden expresar ectópicamente antígenos múltiples que son procesados y presentados al sistema inmune, y por consiguiente, los animales inmunizados con las vacunas de Dam" pueden producir respuestas inmunes más fuertes que los animales que sobreviven a la infección natural. La inmunidad producida por las vacunas de Dam" fue comparada con la inmunidad producida después de una infección natural con la cepa del tipo silvestre. Los ratones BALB/c fueron inmunizadas oralmente en la LD50 de la cepa virulenta de S. typhimurium (10+5 organismos) (es decir, una mitad de los ratones sobrevivió a la inmunización con el tipo silvestre) o 105+ organismos Dam". Cinco semanas después de la inmunización, los ratones inmunizados fueron estimulados con las dosis letales de la cepa virulenta. La Tabla 5 muestra que la inmunidad producida por la vacuna Dam" fue al menos 100 veces más grande (3 a 10 ratones sobrevivieron a una estimulación de 10+9) que la inmunidad producida en los ratones que sobrevivieron a una inmunización con la cepa del tipo silvestre (1 de 10 sobrevivieron a una estimulación de Tabla 5. Los ratones inmunizados con las vacunas de Dam" produjeron una protección más grande que los ratones que sobreviven a la infección provocada por el tipo silvestre Inmunización Estimulación oral Estimulación oral Estimulación oral oral con 10+5 con 107 de S. con 10s de 5. con 109 de S. S. typhimurium typhimurium del typhimurium del typhimurium tipo silvestre tipo silvestre Ninguna 10/10 muertos 10/10 muertos 10/10 muertos Dam* (a LD50) 1/10 vivos 10/10 muertos 10/10 muertos dam?232 5/10 vivos 4/10 vivos 3/10 vivos Adicionalmente, la inmunización con los organismos Dam" mostraron niveles relativamente similares de protección sobre un intervalo amplio de dosis de estimulación (10+7 a 10+9) . Esto sugiere que una dosis de inmunización de 10+5 bacterias Dam" está abajo del umbral mínimo de los organismos requeridos para asegurar una respuesta inmune productora en todos los animales inmunizados. Es posible que la inmunidad mejorada producida por las cepas Dam" pueda ser atribuida, en parte, a la expresión ectópica de los antígenos reprimidos con Dam, los cuales no pueden ser producidos en cantidades y/o duración suficiente durante una infección del tipo silvestre. 5 Los animales inmunizados impidieron el crecimiento de las bacterias virulentas en los tejidos sistémicos . La Dam" Salmonella se encontró que va a ser totalmente experta en la colonización de los placas de Peyer del intestino delgado del ratón pero fue severamente deficiente en la colonización de los sitios de los tejidos más profundos (hígado y bazo) (Ejemplo 1). Los mutantes de Dam" de S. typhimurium también son menos citotóxicos en cuanto a las células M, son deficientes en la invasión epitelial, y exhiben defectos en la secreción de las proteínas.

Pucciarelli y colaboradores (1999) Proc. Natl . Acad. Sci . USA 96:11578-11583. Tomados conjuntamente, estos datos proporcionan una explicación posible a porqué los mutantes de Dam" son incapaces de provocar una enfermedad pero son capaces de producir una respuesta inmune totalmente protectora. Puesto que los ratones inmunizados con la Dam" Salmonella no mostraron virtualmente ningún síntoma evidente de la enfermedad después de la estimulación con los organismos virulentos, el destino de la Salmonella del tipo silvestre fue comparado dentro de los ratones inmunizados contra no inmunizados. Los datos en la Figura 8 muestran que ~ y? los ratones inmunizados con Dam" llevan cargas elevadas (10 ) de las bacterias virulentas durante al menos cinco días en los tejidos tanto de las mucosas como sistémicos después de la estimulación del tipo silvestre de 109 organismos. Sin embargo, los ratones inmunizados tienen la capacidad no solamente de inhibir el crecimiento de estos organismos virulentos, los mismos son capaces de despejarlos tanto de los tejidos de las mucosas y sistémicos) (2 de 4 ratones han despejado todos los organismos virulentos de los placas de Peyer, los nodos linfáticos mesentéricos, el hígado y el bazo 28 días después del desafío) . Esta capacidad para despejar 104 organismos virulentos del hígado y el bazo es significativo a la luz del hecho de que la LD50 i.p. es menor que 10 organismos. Por consiguiente, la inmunización con la Dam" Salmonella impide la proliferación de los organismos del tipo silvestre en todos los tejidos probados. La capacidad para despejar una carga letal de la bacteria virulenta de los miembros sistémicos sugiere la posibilidad de que las vacunas Dam" puedan tener una aplicación terapéutica al tratamiento de las infecciones microbianas preexistentes.

Ejemplo 4: Vacunación de los pollos contra la S. enterit±dís Un entendimiento completo de las dinámicas de la infección provocada por S. enteri tidis en las aves de corral es esencial para la formulación de una estrategia efectiva para alterar la transmisión llevada por los huevos de S. enteri tidis desde las gallinas en las que reposan hasta los consumidores humanos. Las Salmonellas provocan la enfermedad 5 colonizando e invadiendo el epitelio intestinal. En algunos casos, la penetración de la Salmonella a través de la mucosa intestinal hasta la corriente sanguínea es seguida por la diseminación amplia y la enfermedad sistémica. La S. enteri tidis es un serotipo invasivo en los pollos pero no exhibió un nivel de patogenicidad para los pollos que sea marcadamente diferente de aquel de otros serotipos de Salmonella paratiroides. Popiel y Turnbull (1985) Infect . Immun . 47 (3) : 786-792. Los pollos pueden ser infectados fácilmente, involucrando tanto la colonización intestinal como la invasión para alcanzar los tejidos internos tales como el hígado, con el S. enteri tidis de la alimentación contaminada. Hilton y colaboradores (1989) Vet . Rec. 124 :223. Las infecciones experimentales de las gallinas adultas con algunas cepas de S. enteri tidis han conducido a la colonización intestinal que persistió durante varios meses, aunque en los estudios con otras cepas de S. enteri tidis la duración de la difusión fecal ha sido considerablemente más corta. (Gast y Beard, 1990), Gast y Beard (1990) Avian Dis . 34:991-993; Shivaprasad y colaboradores (1990) Avian Dis . 34:548-557. En un estudio, los pájaros infectados intravenosamente difundieron el S. enteri tidis durante un período más prolongado que el que lo hicieron los pájaros infectados oralmente. Shivaprasad y colaboradores (1990) . La efectividad de varios métodos de destrucción de S. enteri tidis en los huevos y los productos de los huevos ha llegado a ser un tópico de importancia creciente para las autoridades de saluda pública y la industria de los huevos. Tal información es necesaria vitalmente para proporcionar instrucciones a los consumidores y los usuarios comerciales o institucionales de los huevos con respecto a la preparación segura de los alimentos que contienen huevo. Shivaprasad y colaboradores (1990) observaron que los requerimientos del tiempo/temperatura para destruir el S. enteri tidis en los huevos por varios métodos de cocción no difieren significativamente de los requerimientos similares determinados previamente por S. typhimurium. Baker y colaboradores (1983) Poul t . Sci . 72:1211-1216. Humphrey y colaboradores encontraron que las cepas de los fagos del tipo 4 de S. enteri tidis, S. typhimurium, y S. senftenberg, cuando se inocularon en la yema del huevo, pudieron sobrevivir a las formas de la cocción en las cuales algo de la yema permaneció líquida. Humphrey y colaboradores (1989) Epidemiol . Infect . 103:35-45. Además, cuando los huevos son almacenados a temperatura ambiente durante 2 días después de la Ía-:fc'ÁÁj_. *.fce.--__-_ ,_ _j aaa4.cc inoculación, la población de S. enteri tidis creció a un nivel elevado tal en la yema que ningún método de cocción estándar eliminó completamente la Salmonella . El almacenamiento de los cultivos de S. enteri tidis a las temperaturas del refrigerador eliminaron completamente la Salmonella . El almacenamiento de los cultivos de S. enteri tidis a las temperaturas del refrigerador, por otra parte, se ha encontrado que incrementan su sensibilidad al calor. Humphrey (1990) J. Appl . Bacteriol . 69:493-497. En otro estudio, el tipo 4 del fago de S. enteri tidis en el huevo completo homogeneizado se determinó que va a ser más resistente al calor que los tipos 8 y 13a del fago y S. typhimuri um, pero menor que la cepa 775W de S. senftenberg altamente resistente al calor. Todas las cepas de Salmonella probadas fueron más resistentes al calor en la yema que en el huevo completo o la albúmina. Humphrey y colaboradores (1990) Epidemiol . Infect . 104:237-241. Las vacunas de la presente invención, específicamente la Cepa 3, pueden ser efectiva para eliminar la S. enteri tidis en los huevos y los productos de los huevos. Una vacuna de dam" S. typhimurium es preparada como se describió previamente. La vacuna es introducida en el pollo por medio de la administración oral, es decir, mezclada con las alimentaciones y/o el agua de los pollos. Una vez que la vacuna ha sido administrada, los factores de la virulencia reprimidos típicamente por Dam serán expresados y los pollos producirán una respuesta inmune. Puesto que algunos de los genes regulados por Dam son homólogos con aquellos compartidos por S. enteri tidis, el Dam" S. typhimurium puede producir una protección cruzada contra S. enteri tidis, como lo indican los datos en el Ejemplo 3.

Ejemplo 5: Administración de las vacunas de Salmonella derivadas de Dam al ganado La salmonella es el patógeno bacteriano entérico infeccioso aislado más comúnmente del ganado productor de leche y la enfermedad zoonótica más común asociada con el consumo humano de los productos de la leche y la carne de res. En años recientes ha existido una elevación en la incidencia y la severidad de los casos humanos de la salmonelosis, en parte debido a la emergencia del DT104 de S. typhimurium de resistencia antimicrobiana en las poblaciones del ganado. Los estudios de prevalescencia indican que 16 a 73 % de las granjas productoras de leche de los EUA están infectadas con Salmonella y hasta 50 % de las vacas lecheras escogidas están contaminadas con Salmonella en la matanza. El control de la Salmonella en las granjas es importante para reducir las pérdida de producción y la enfermedad llevada por los alimentos humanos.

En las granjas lecheras comerciales grandes es muy común que el ganado esté expuesto a los serotipos múltiples de la Salmonella y que los terneros lleguen a ser infectados brevemente después del nacimiento. Bajo estas condiciones podría ser deseable tener una vacuna contra la Salmonella capaz de estimular la inmunidad a los serotipos heterólogos de la Salmonella.

A. Requerimiento de Dam para la infección del ganado provocada por Salmonella, y efectividad de los derivados de Dam" como las vacunas del bovino vivas Los terneros macho Holstein de 1-3 días de edad son utilizados para todos los experimentos. La medición de la proteína del plasma total es utilizada para evaluar la inmunidad pasiva de los terneros. Solamente los terneros con una proteína del plasma total mayor que o igual a 5.5 son utilizados. El estado de infección con Salmonella de los productos del ganado vacuno fuente es determinado previo a la compra de los terneros por un cultivo fecal y las muestras ambientales de las Salmonellas. El estado negativo de Salmonella de los terneros se confirmará después de la compra por los cultivos de Salmonella fecales del ganado vacuno. Los terneros son alojados y elevados en instalaciones de 2 niveles de .Animal Biosafety. Los terneros son alimentados con 1.9 litros (2 cuartos de galón) de leche - < -áíí . :20 reemplazados dos veces al día y tienen acceso a los granos para ternero frescos y agua fresca 24 horas al día. Cada día en el tiempo de alimentación a todos los terneros se les asigna un valor de apetito y aptitud. El valor del apetito es a una escala de 1 a 4 (1 = consumió 1.9 1 (2 cuartos de galón) de leche, 2 = consumió < 1.9 1 (dos cuartos de galón) pero > 0.95 1 (un cuarto de galón) de leche, 3 = consumió < 1 0.95 1 (1 cuarto de galón) de leche, y 4 = no consumió leche) . El valor de la actitud también es en una escala de 1-4 (1 = estuvo de pie, 2 = se para con estímulos, 3 = se para con ayuda, 4 = no es capaz de pararse) . A continuación de todos los experimentos de estimulación los terneros fueron verificados 3 veces al día y los parámetros vitales fueron registrados dos veces al día. Cualquier ternero que es incapaz de permanecer parado se considera terminal y es eutanizado. Ninguno de los tratamientos antimicrobianos o anti-inflamatorios son administrados a los terneros a continuación de la estimulación con Salmonella para evitar confundir los resultados experimentales. Determinación de la seguridad de las vacunas de Dam' Salmonella vivas en los terneros macho Holstein . La seguridad de Dam" S. typhimurium en los terneros de 1-3 días de edad es determinada como sigue. Dieciocho terneros de 1-3 días de edad son divididos en 3 grupos de 6. El primer grupo de 6 terneros es estimulado oralmente con 109 Dam" ._ki_-,ái__. ¿-i_..__-_«____.

Salmonella, el segundo grupo con 1010 y el tercero con 10 . Para la estimulación siguiente a las 3 semanas cada ternero en el estudio es evaluado dos veces al día para medir el pulso y la velocidad de respiración, la temperatura rectal, el apetito y la actitud. Las muestras fecales fueron colectadas de cada ternero diariamente para el cultivo de la Salmonella. En la estimulación posterior de 3 semanas los terneros fueron inmunizados y los órganos (hígado, bilis, bazo, nodos linfáticos mesentéricos, mucosa del íleo, contenido del intestino delgado, mucosa del intestino ciego y los contenidos del intestino ciego) fueron cultivados para verificar la presencia de la Salmonella. Determinación de si las vacunas a base de Salmonella Dam pueden colonizar los tejidos sistémicos y/o de las mucosas . Las características cinéticas de colonización de los tejidos de los bovinos se determinaron para S. typhimurium tanto Dam" como Dam+ después de la administración oral. La "carga bacteriana" en el contenido del intestino delgado, la mucosa del íleo, los placas de Peyer, la mucosa del intestino ciego, el contenido del intestino ciego, los nodos linfáticos mesentéricos, el hígado, y el bazo, es determinado en los terneros, como una función del tiempo de la posinfección. Los terneros macho de veinticuatro horas fueron estimulados oralmente con 109 de Dam" S. typhimurium. Seis terneros fueron asignados al azar a 4 grupos que van a ser eutanizados a las 24 horas y 5, 14, y 28 días después de la estimulación. Los tejidos son colectados de cada ternero en la necropsia para la verificación cuantitativa del cultivo de la Salmonella. Los terneros macho Holstein de 24 horas estimulados oralmente con 109 Dam+ de S. typhimurium se procesaron idénticamente y sirven como un control positivo para estos experimentos. Para las Dam" Salmonellas que van a ser las vacunas de bovino ideales, las mismas deben colonizar las placas de Peyer, replicarse y persistir dentro de las células M, y presentar antígenos para las células inmunes subyacentes (por ejemplo, los macrófagos, las células B y las células T) que comprenden el folículo linfoide de la placa de Peyer. De manera importante, las mismas no deben colonizar el tejido más profundo tal como el hígado y el bazo, y eventualmente deben ser despejadas de las placas de Peyer. Si se satisfacen estos criterios, es más probable que los mutantes Dam" de la Salmonella podrían servir como la base para una vacuna de bovino efectiva, segura. La eficacia protectora de la vacunación con Dam' S. typhimuri um contra la estimulación del tipo silvestre homologa . Veinte terneros de 1-3 días de edad son divididos al azar en 2 grupos de 10 terneros. El primer grupo es vacunado por la boca con Dam" S. typhimurium a los 1-3 días de edad. Los 10 terneros no vacunados restantes sirven como controles. Todos los terneros fueron estimulados por la boca con 1011 S. typhimurium virulentos a las 5 semanas de edad. Durante las 3 semanas siguientes la estimulación a cada ternero es evaluada tres veces al día y se registran los valores del pulso, la velocidad respiratoria, la temperatura rectal, el apetito, y la actitud dos veces al día. Las muestras fecales son colectadas de cada ternero diariamente para verificar el cultivo de la Salmonella. Todos los terneros que murieron a continuación de la estimulación son sometidos a la necropsia y los órganos (el hígado, glándula biliar, bazo, nodos linfáticos mesentéricos, mucosa del íleo, contenidos del intestino delgado, mucosa del intestino ciego y contenidos del intestino ciego) se cultivaron para verificar la presencia de la Salmonella. Los terneros que sobrevivieron a la estimulación con Salmonella virulenta se eutanizaron 3 semanas después de la estimulación, se les hizo la necropsia, y los órganos se cultivaron para verificar la presencia de la Salmonella (el hígado, glándula biliar, bazo, nodos linfáticos mesentéticos, mucosa del íleo, contenidos del intestino delgado, mucosa del intestino ciego y contenidos del intestino ciego) . Régimen de dosificación mínima requerida para la eficacia en los terneros y persistencia de la vacuna reducida en los tejidos del bovino. Tres importantes características de cualquier régimen de vacunas son i) la dosis de la vacuna, -;___,,-_- -fa__l-_._ ii) la edad del animal, iii) y la persistencia de la vacuna en el animal inmunizado. La dosis mínima requerida para producir la protección total (a 10,000 veces la LD50) y la persistencia reducida en los tejidos del murino tales como las placas de Peyer, los nodos linfáticos mesentéricos, el hígado, y el bazo, es determinada.

B. Los derivados de Dam" producen una protección cruzada contra las cepas patógenas relacionadas (serotipos de la Salmonella heteróloga) Eficacia protectora de la vacunación de Dam' S. typhimurium contra la estimulación del tipo silvestre heteróloga . Tres experimentos de estimulación de Salmonella virulenta similares son efectuados utilizando 3 diferentes organismos de estimulación. Cada experimento involucra la inmunización oral de los terneros con Dam" S. typhimurium a los 1-3 días de edad y la estimulación con la Salmonella virulenta a las 5 semanas de edad. En el primer experimento la S. montevideo (serogrupo Cl) es utilizada como el organismo de estimulación, S. dublin (serogrupo D) en el segundo, S. ana tum (Serogrupo El) en el último. Se utilizaron diferentes terneros para cada experimento. Para cada uno de estos experimentos veinte terneros de 1-3 días de edad son divididos al azar en 2 grupos de 10 terneros. El primer grupo es vacunado por la boca con Dam" S. typhimurium a los 1-3 días de edad. Los 10 terneros no vacunados restantes sirven como controles. Todos los terneros fueron estimulados por la boca con 1011 S. typhimurium virulentos a las 5 semanas de edad. Durante las 3 semanas siguientes cada ternero es evaluado tres veces al día y se registran los valores del pulso, la velocidad respiratoria, la temperatura rectal, el apetito, y la actitud dos veces al día. Las muestras fecales son colectadas de cada ternero diariamente para verificar el cultivo de la Salmonella. Todos los terneros que murieron a continuación de la estimulación son sometidos a la necropsia y los órganos (el hígado, glándula biliar, bazo, nodos linfáticos mesentéticos, mucosa del íleo, contenidos del intestino delgado, mucosa del intestino ciego y contenidos del intestino ciego) se cultivaron para verificar la presencia de la Salmonella. Los terneros que sobrevivieron a la estimulación con Salmonella virulenta se eutanizaron 3 semanas después de la estimulación, se les hizo la necropsia, y los órganos se cultivaron para verificar la presencia de la Salmonella (el hígado, glándula biliar, bazo, nodos linfáticos mesentéricos, mucosa del íleo, contenidos del intestino delgado, mucosa del intestino ciego y contenidos del intestino ciego) .

-~. Jt-.y -A »... - .a. _. _ C. Derivados de Dam Exterminados de la Salmonella Las bacterias de S. typhimurium Dam" que crecieron in vitro son exterminadas por la exposición a azida de sodio (0.02 %) y/o luz UV, después de lo cual las substancias antimicrobianas son ya sea lavadas o dializadas retirándolas de los organismos exterminados. La eficacia de la vacuna exterminada de células completas es probada administrada por la boca (oral y parenteralmente. Para el grupo de vacunas parenterales 106 Salmonellas Dam" exterminadas son mezcladas con hidróxido de aluminio y ayudantes de quill A y son administradas a los terneros por medio de inyección intramuscular. Para el grupo de vacunación por la boca 1010 Salmonellas Dam" exterminadas son administradas por la boca con la Vitamina D3 como un ayudante para la mucosa. Como un régimen de dosificación, los terneros neonatales son inmunizados una vez a la semana durante tres semanas. El S. typhimurium del tipo silvestre exterminado se administró por la misma ruta y con los mismos ayudantes que sirven como un control negativo. Los terneros inmunizados son estimulados con la S. typhimurium virulenta 2 semanas después de la última inmunización utilizando el mismo protocolo que se describió anteriormente para determinar si una respuesta inmune efectiva es generada. Si es así, los terneros inmunizados con la preparación de la vacuna exterminada _»_- —. __,.. kJt también son estimulados con los otros serotipos de la Salmonella patógenos (por ejemplo, montevideo, S. dublin, y S. ana tum) para determinar si la inmunidad producida es protectora de manera cruzada contra las cepas relacionadas. El experimento es repetido utilizando las cepas sobreproductoras de Dam, solas o en combinación con los organismos Dam" exterminados. Puesto que la sobreproducción de Dam puede conducir a la expresión ectópica de un nuevo repertorio de los antígenos protectores potenciales que no son expresados en las cepas de la vacuna ni del tipo silvestre (Dam+) ni de Dam", los experimentos de la vacuna exterminada son repetidos con las cepas de sobreproducción de Dam, solas o en combinación con los organismos de Dam+ exterminados.

Ejemplo 6: Construcción de los mutantes de dam" en Vibrio cholerae A. Construcción de las mutaciones de V. cholerae dam Las mutaciones de V. cholerae dam actualmente no están disponibles. La secuencia de V. cholerae dam conocida es utilizada para diseñar cebadores para amplificar la PCR del gen dam, el cual es utilizado como una sonda para hibridizarse contra un banco del clon lambda de V. cholerae para recuperar el clon V. cholerae dam del tipo silvestre.

Los extremos del ADN de los clones de hibridación son secuenciados para determinar si los mismos contienen la región de V. cholerae dam. La subclonación y el secuenciamiento completo adicional de los extremos del vector de estos subclones identifica el fragmento de restricción de ADN que contiene la secuencia de V. cholerae dam completa.

Las mutaciones de la deleción de dam no reversibles asociadas con un marcador de la resistencia a los antibióticos son construidas de acuerdo con los métodos desarrollados recientemente (Julio, S.M., y colaboradores, Molec. En .

Genet . , 258:178-181 (1998)). El (los) papel (es) de los mutantes de dam en la patogénesis de V. cholerae son probados en dos diferentes ensayos de virulencia para el cólera del murino (modelos de ratón lactante), la LD50 y el índice competitivo, los cuales han sido descritos en el Ejemplo 1.

B. Determinación de la capacidad protectora de los mutantes de dam hacia la meta de construcción de las vacunas atenuadas vivas humanas contra V. cholerae Como se describió con detalle anteriormente, los mutantes de Salmonella Dam" sirven como las vacunas atenuadas vivas en un modelo de ratón para la fiebre tifoidea. La meta de este experimento es discernir si estos efectos deseados son específicos para la metilación de la adenina del ADN de la Salmonella o si los mutantes de Dam" también producen una protección contra V. cholerae, y por consiguiente pueden proporcionar una base o fundamento para una nueva generación de vacunas atenuadas vivas. Las vacunas atenuadas vivas humanas deben ser diseñadas para limitar el riesgo de inversión al tipo silvestre y asegurar que estas cepas no servirán como un depósito para la dispersión de la resistencia a los antibióticos para los patógenos emergentes, Así, el siguiente paso en este análisis será construir un derivado sensible antibiótico, no reversible, apropiado. Las deleciones no polares (sin efecto sobre los genes corriente abajo en el operon) en dam son construido por la remoción de las secuencias internas de estos genes por los enfoques o métodos a base de PCR, ligamiento o unión en un vector suicida, y la recuperación de las cepas de deleción en el marco, resultantes. Las deleciones de cada gen son introducidas individualmente utilizando las estrategias del vector suicida para la selección positiva, estándares (Donnenberg, M. S., y colaboradores, Infect . Immun . , 59:4310-4317 (1991)), conduciendo a la cepa de la vacuna sensible a los antibióticos, atenuada, no reversible, deseada. La eficacia de esta vacuna se vuelve a probar como se describió anteriormente. Las cepas construidas de tal modo que Dam sea modificado (es decir, no delecionado o inhabilitado completamente) son probadas, como lo son las cepas sobreproductoras de Dam.

Ejemplo 7: Esencialidad del gen dam en Vibrio cholerae y yersizxia pseudot?berculosis Una duplicación de dam fue construida integrando un plásmido recombinante que contiene una mutación de Dam en el sitio de Dam del tipo silvestre. La duplicación resultante contuvo dos copias de dam: una copia del mutante y una copia del tipo silvestre. Normalmente, el plásmido recombinante se segrega a una frecuencia dada, y existe una probabilidad bastante idéntica de que los elementos recombinantes (segregantes) contengan el gen ya sea mutante o del tipo silvestre. Si un gen es esencial, todos los elementos segregantes de la duplicación (la cual recombina totalmente el plásmido) son del tipo silvestre; los elementos recombinantes que tienen el gen mutante mueren. Si un plásmido recombinante que contiene el gen está presente, la duplicación puede segregar el tipo ya sea mutante o silvestre. Para Vi rio cholerae y Yersinia pseudotuberculosis, la duplicación del gen dam que contiene un tipo silvestre y un mutante no puede segregar el mutante a ^«.^^iWcS^^^!é í^^A^^j^^^*^^¿^^+s ^^?fi?^^^^^^fcS^^v^ menos que un plásmido recombinante que proporciona un gen dam del tipo silvestre esté presente. La descripción precedente se considera solamente como ilustrativa de los principios de la invención. Además, puesto que al experto en el arte se le ocurrirán modificaciones y cambios numerosos, no se desea limitar la invención a la construcción exacta y los procesos mostrados como se describieron anteriormente. En consecuencia, todas las modificaciones y equivalentes adecuados pueden ser restablecidos para que estén considerados dentro del alcance de la invención como se definió por las reivindicaciones que siguen. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición inmunógena, caracterizada porque comprende bacterias patógenas atenuadas vivas en un excipiente aceptable farmacéuticamente, las bacterias patógenas contienen una mutación la cual altera la actividad de la ADN adenina metilasa (Dam) de tal modo que las bacterias patógenas sean atenuadas.
2. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la mutación reduce la actividad de Dam.
3. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la mutación elimina la actividad de Dam.
4. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la mutación es una deleción del gen dam .
5. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la mutación provoca un incremento en la expresión de Dam.
6. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las bacterias patógenas son de la Salmonella .
7. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque las bacterias patógenas son seleccionadas del grupo que consiste de S. typhimurium, S. enteri tidis, S. typhi , S. abortus-ovi , S. 5 abortus-equi , S. dublin, S. gallinarum, y S. Pullorum.
8. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la mutación elimina la actividad de Dam.
9. La composición inmunógena de conformidad con 10 la reivindicación 8, caracterizada porque la mutación es una deleción del gen dam.
10. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la mutación provoca un incremento en la expresión de Dam. 15
11. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque las bacterias patógenas son de S . typhimurium.
12. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la mutación es la 20 deleción del gen dam.
13. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque las bacterias patógenas son de S. dublin .
14. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la mutación es la deleción de un gen dam .
15. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque las bacterias patógenas son de S. enteri tidis .
16. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la mutación es la deleción del gen dam.
17. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las bacterias patógenas son de Escherichia .
18. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque las bacterias patógenas son de E. coli .
19. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las bacterias patógenas son de Vijrio.
20. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque las bacterias son de V. cholerae.
21. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las bacterias son de Yersinia .
22. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque las bacterias don de Y. seudotuberculosis .
23. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las bacterias son seleccionadas del grupo que consiste de Shigella , Haemophilus, Bordetella, Neisseria, Pasteurella y Treponema .
24. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende un auxiliar o ayudante.
25. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende un antígeno heterólogo.
26. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las bacterias patógenas contienen un cásete de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un antígeno heterólogo.
27. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la mutación no es reversible.
28. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las bacterias contienen una segunda mutación la cual provoca la atenuación de las bacterias. __L___lA_fa______ »_.
29. Un juego o conjunto, caracterizado porque comprende la composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1.
30. La composición inmunógena, caracterizada porque comprende bacterias patógenas exterminadas en un excipiente aceptable farmacéuticamente, las bacterias patógenas contienen una mutación la cual altera la actividad de la ADN adenina metilasa.
31. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la mutación es no letal y vuelve atenuada a la bacteria patógena.
32. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la mutación es letal.
33. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque las bacterias patógenas son de Salmonella .
34. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la mutación deleciona el gen dam.
35. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la mutación provoca la sobreexpresión de Dam.
36. Una cepa atenuada de una bacteria patógena, la bacteria está caracterizada porque contiene una mutación la cual altera la actividad de Dam de tal modo que las bacterias son atenuadas.
37. La cepa atenuada de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la mutación reduce la actividad de Dam.
38. La cepa atenuada de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la mutación elimina la actividad de Dam.
39. La cepa atenuada de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la mutación es una deleción del gen dam.
40. La cepa atenuada de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la mutación provoca un incremento en la expresión de Dam.
41. La cepa atenuada de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque las bacterias son de Salmonella .
42. La cepa atenuada de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque las bacterias son de Salmonella .
43. La cepa atenuada de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque las bacterias son de Salmonella .
44. Un método de producción de una respuesta inmune en un individuo, caracterizado porque comprende administrar la composición inmunógena de la reivindicación 1 al individuo en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune.
45. Un método de producción de una respuesta inmune en un individuo, caracterizado porque comprende administrar la composición inmunógena de la reivindicación 12 al individuo en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune.
46. Un método de producción de una respuesta inmune en un individuo, caracterizado porque comprende administrar la composición inmunógena de la reivindicación 14 al individuo en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune.
47. Un método de producción de una respuesta inmune en un individuo, caracterizado porque comprende administrar la composición inmunógena de la reivindicación 16 al individuo en una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune.
48. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la respuesta inmune persiste más de aproximadamente cuatro semanas después de la administración.
49. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la respuesta inmune persiste más de aproximadamente cuatro semanas después de la administración.
50. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la respuesta inmune persiste más de aproximadamente cuatro semanas después de la administración.
51. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el individuo es un ser humano.
52. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el individuo es un animal doméstico.
53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el animal es un pollo.
54. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el animal es una vaca.
55. Un método de prevención de una infección por las bacterias patógenas en un individuo, caracterizado porque comprende administrar una composición inmunógena de la reivindicación 1 al individuo en una cantidad suficiente para reducir un síntoma asociado con la infección por las bacterias patógenas durante la infección por las bacterias patógenas.
56. Un método de prevención de una infección por las bacterias patógenas en un individuo, caracterizado porque comprende administrar una composición inmunógena de la reivindicación 1 al individuo en una cantidad suficiente para reducir un síntoma asociado con la infección por las bacterias patógenas en el individuo.
57. Un método de prevención de la infección por Salmonella en un individuo, caracterizado porque comprende administrar una composición inmunógena de la reivindicación 6 al individuo en una cantidad suficiente para reducir un síntoma asociado con la infección por Salmonella en el individuo durante la infección por Salmonella .
58. Un método de prevención de la infección por Salmonella en un individuo, caracterizado porque comprende administrar una composición inmunógena de la reivindicación 6 al individuo en una cantidad suficiente para reducir un síntoma asociado con la infección por Salmonella en el individuo.
59. Un método de tratamiento de un individuo infectado con bacterias patógenas, caracterizado porque comprende administrar al individuo una composición que comprende un agente el cual altera la actividad de Dam.
60. Un método de producción de una respuesta inmune contra una segunda especie de Salmonella en un individuo, caracterizado porque comprende administrar al individuo una composición inmunógena que comprende una primera especie atenuada de Salmonella, la primera especie contiene una mutación la cual altera la actividad de Dam de tal modo que la primera especie de Salmonella sea atenuada.
61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque la primera especie de Salmonella es la primera especie de S. typhimurium.
62. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque la primera especie de Salmonella es la S. enteritis.
63. Un método de identificación de un agente el cual puede tener una actividad antibacteriana, caracterizado porque comprende utilizar un sistema de transcripción in vitro para detectar un agente el cual altera el nivel de la transcripción de un gen dam cuando el agente es agregado al sistema de transcripción in vitro, en donde un agente es identificado por su capacidad para alterar el nivel de la transcripción del gen de dam cuando se compara con el nivel de la transcripción cuando ningún agente es agregado.
64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el gen dam es de Salmonella .
65. Un método de identificación de un agente el cual puede tener una actividad antibacteriana, caracterizado porque comprende utilizar un sistema de traducción in vitro para detectar un agente el cual altera el nivel de traducción de un transcrito del ARN que codifica Dam cuando el agente es agregado al sistema de transcripción in vitro, en donde un agente es identificado por su capacidad para alterar el nivel de la traducción del transcrito de ARN que codifica Dam |3i^^y í¿ £jg^^^^^^ cuando se compara con el nivel de traducción cuando no se agrega ningún agente.
66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el Dam es de Salmonella .
67. Un método de identificación de un agente el cual puede tener una actividad antibacteriana, caracterizado porque comprende determinar si el agente se une a Dam, en donde un agente es identificado por su capacidad para unirse a Dam.
68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la Dam es de Salmonella .
69. Un método de identificación de un agente el cual puede tener la actividad antibacteriana, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) incubar los oligonucleótidos no metilados que comprenden un sitio de unión de Dam con Dam, S-adenosilametionina, y un agente, en donde el oligonucléotido no metilado comprende además una señal; (b) digerir la totalidad de los sitios de blanco no metilados, por lo cual se liberan los oligonucléotidos no metilados; y (c) detectar la inhibición de la ADN adenina metilasa como un incremento en la señal debido a la digestión de los sitios de blanco no metilados, en donde un agente es identificado por su capacidad para provocar un incremento en la señal comparado con los pasos de conducción (a), (b) , y (c) en ausencia del agente.
70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque los oligonucleótidos son unidos a una superficie sólida.
71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la superficie sólida es una placa de microtitulación que contiene avidina y el oligonucleótido comprende biotina.
72. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el sitio de unión de Dam es una secuencia de GATC.
73. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque la Dam es de Salmonella . 14 . El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque un agente es seleccionado de una biblioteca inhibidora que consiste del grupo seleccionado de los polipéptidos, los compuestos orgánicos y los compuestos inorgánicos. 75. Un método de identificación de un agente el cual puede tener una actividad antibacteriana, caracterizado porque comprende los pasos de: j^jttB^¿^ ¡ág^^^ (a) poner en contacto un agente que va a ser probado con una célula huésped adecuada que tiene la función Dam, y (b) analizar al menos una característica la cual está asociada con la alteración de la función de Dam, en donde un agente es identificado por su capacidad para producir al menos una de las características. 76. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque la célula huésped es una bacteria. 77. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la bacteria es la Salmonella . 78. Un método de preparación de la composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende combinar un expíente aceptable farmacéuticamente con las bacterias patógenas que contienen una mutación la cual altera la actividad de la ADN adenina metilasa (Dam) de tal modo que las bacterias patógenas son atenuadas. 79. Un método para la preparación de las bacterias atenuadas capaces de producir una respuesta inmunológica por un huésped susceptible a una enfermedad provocada por el microorganismo patógeno similar o correspondiente que comprende la construcción de al menos una mutación en la bacteria patógena en donde una primera mutación conduce a una función de Dam alterada. c-J-*. .a _h .o, a»-» c ^ Jij ^^fjfeiM 80. El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque una primera mutación es introducida en un gen de dam. 81. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque una segunda mutación es creada en un gen que es independiente de la primera mutación, la segunda mutación provoca la atenuación de las bacterias patógenas. 82. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la primera mutación altera la expresión de Dam. 83. El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque la primera mutación elimina la expresión de Dam. 84. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque además comprende la inserción en dicha bacteria atenuada de un cásete de expresión que comprende uno o más genes estructurales que codifican un antígeno deseado. 85. El método de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque el antígeno deseado es del grupo que consiste de: el Fragmento C de la toxina del tétanos, la subunidad B de la toxina del cólera, el antígeno superficial de la hepatitis B, LPS de Vibrio cholerae, antígenos de VIH y LPS de Shigella soneii .