MXPA00009354A - Bacterias atenuadas por una mutacion no reversible en cada uno de los genes aroc, ompf y ompc, utiles como vacunas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una bacteria atenuada por una mutación no reversible en cada uno del gen de aroC, el gen de ompF y el gen de ompC. La bacteria esútil como una vacuna. La bacteria puede ser, por ejemplo, una cepa atenuada de la E.Coliútil en la vacunación contra la diarrea.

Description

BACTERIAS ATENUADAS POR UNA MUTACIÓN NO REVERSIBLE EN CADA UNO DE LOS GENES AROC, QMPF Y OMPC, ÚTILES COMO VACUNAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a bacterias atenuadas útiles en vacunas.

Antecedentes de la Invención El principio de apoyo de la vacunación es inducir una respuesta inmune en el huésped, proporcionando así protección contra la estimulación subsiguiente con un patógeno. Esto puede ser logrado por la inoculación con una cepa atenuada viva del patógeno, es decir una cepa que tiene virulencia reducida de tal modo que la misma no provoque la enfermedad provocada por el patógeno virulento. Clásicamente, las cepas de vacunas atenuadas vivas de las bacterias y los virus han sido seleccionadas utilizando una de dos metodologías diferentes. Los mutantes han sido creados ya sea por el tratamiento del organismo utilizando compuestos químicos mutagénicos o por el paso repetido del organismo in vitro. Sin embargo, el uso de cualquier método ocasiona cepas atenuadas en las cuales el modo de atenuación es poco claro. Estas cepas son Ref .123489 particularmente difíciles de caracterizar en términos de la inversión posible a la cepa del tipo silvestre porque la atenuación puede reflejar eventos de mutación únicos (reversible fácilmente) o múltiples. Además, es difícil obtener tales cepas que tienen propiedades inmunogénicas a causa de los eventos de mutación múltiple, y las cepas múltiples puede ser necesario que se utilicen para proporcionar protección contra el patógeno. Utilizando técnicas genéticas modernas, ahora es posible construir genéticamente cepas bacterianas atenuadas definidas en las cuales se pueden crear deleciones de atenuación estable. Un número de mutantes dirigidos al sitio de la Salmonella han sido creados utilizando este tipo de tecnología (2, 4, 5, 9, 12, 16, 17, 18). 'Las mutaciones en un gran número de genes se ha reportado que van a ser atenuantes, incluyendo los 'genes aro (por ejemplo aroA, aroC, aroD y aroE) , pur, htrA, ompR, ompF, ompC, galE, cya, crp y phoP. Los mutantes de aroA de la Salmonella ahora han sido bien caracterizados y se ha mostrado que van a ser vacunas vivas excelentes contra la salmonelosis en varias especies de animales. Además, para reducir las probabilidades de una inversión de la virulencia por un evento recombinante, se han introducido mutaciones en dos genes independientes tales aroA/purA y aroA/aroC. Las mutaciones idénticas en las cepas adaptadas del huésped de Salmonella tales como S.typhi (hombre) y S.dublin (ganado vacuno) también han conducido a la creación de un número de vacunas de dosificación única candidatas, las cuales han tenido un éxito probado en los ensayos clínicos (8, 11) y los ensayos en el campo (10) . Una cepa de Salmonella typhimurium que colecta mutaciones estables tanto en ompC como opmF se describe en Chatfield y colaboradores (1991, ref. 21) . Cuando se administra oralmente a los ratones de BALB/c la cepa fue atenuada, con la dosis letal al 50% (LD50) reducida en aproximadamente 1,000 veces. Sin embargo, la LD50 intravenosa se redujo solamente en aproximadamente 10 veces, demostrando la importancia de las porinas que confieren a las bacterias la capacidad de infección por la ruta oral. La expresión de los genes de ompC y ompF es regulada por o pR. Pickard y colaboradores (1994, ref. 13) describe la clonación del operón de ompB, que comprende los genes de ompR y envZ, de un banco de cósmidos Ty2 de Salmonella typhi y la caracterización por el análisis de la secuencia del ADN. Los datos de la secuencia del ADN se utilizaron para identificar los sitios de restricción apropiados para la generación de una deleción definida de 517 pb dentro del marco de lectura abierta del gen de ompR.

Esta deleción se introdujo por la recombinación homologa en los cromosomas de las dos cepas de S.typhi las cuales ya colectaron las deleciones definidas en los genes tanto de aroC como de aroD. Los mutantes de opmR de S.typhi exhibieron una reducción marcada en la expresión de la porina de ompC y ompF como se demostró por el examen de las preparaciones de la membrana externa. También se mostró que el sistema regulador de dos componentes de opmR-envZ desempeña un papel importante en la regulación de la síntesis de los polisacáridos de Vi en S.typhi. En los estudios de animales, el S. typhimurium atenuado ha sido utilizado como un vehículo para el suministro de los antígenos heterólogos al sistema inmune (3, 6, 15) . Esto eleva el potencial de desarrollo de las vacunas multivalentes para su uso en el ser humano (7) .

Breve Descripción de la Invención La invención proporciona una bacteria atenuada por una mutación no reversible en cada uno del gen de aroC, el gen de ompF y el gen de ompC. La invención también proporciona una vacuna que contiene la bacteria. Se cree que la combinación de aroC/ompF/ompC de las mutaciones da una vacuna que tiene propiedades superiores. Por ejemplo, se cree que la combinación de aroC/ompF/ompC puede ser superior a una combinación de aroC/ompR por dos razones: 1. La mutación de ompR puede provocar niveles más elevados de atenuación que la combinación de ompF/ompC de las mutaciones a causa de que el ompR puede regular un número de genes diferentes del ompF y el ompC los cuales son importantes para la supervivencia de la bacteria in vivo. Por consiguiente, la combinación de ompF/ompC puede permitir que las bacterias sobrevivan en el huésped vacunado durante un intervalo de tiempo más prolongado y a niveles más elevados, conduciendo a una mejor protección. 2. La mutación de opmR puede provocar una inmunogenicidad reducida comparado con la combinación de ompF/opmC de las mutaciones a causa de que el ompR puede regular la expresión de los antígenos importantes para la inmunogenicidad.

Descripción Detallada de la Invención Bacterias útiles en la Invención Las bacterias que son utilizadas para fabricar las vacunas de la invención son generalmente aquellas que provocan la infección por la vía oral. Las bacterias pueden ser aquellas que invaden y crecen dentro de las células eucarióticas y/o colonizan las superficies mucosales. Las bacterias son generalmente Gram-negativas . Las bacterias pueden ser del género de Escherichia, Salmonella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella o Brucella. Los ejemplos de tales bacterias son Escherichia coli - una causa de diarrea en los seres humanos; Salmonella typhimurium - la causa de la salmonelosis en varias especies de animales; Salmonella typhi - la causa de la fiebre tifoidea humana; Salmonella enteritidis - una causa del envenenamiento por los alimentos en los seres humanos, Salmonella choleraesuis -una causa de la salmonelosis en lbs cerdos; Salmonella dublin - una causa de la enfermedad tanto sistémica cono diarréica en el ganado vacuno, especialmente de los terneros recién nacidos; Haemophilus influenza - una causa de meningitis; Neisserie gonorrhoeae - una causa de la gonorrea; Yersinia enterocolitica - la causa de un espectro de enfermedades en los seres humanos que varía desde la gastroenteritis hasta la enfermedad septicémica fatal; Bordetella pertussis - la causa de la tos ferina; y Brucella abortus - una causa del aborto y la infertilidad en el ganado vacuno y una condición conocida como fiebre de Malta en los seres humanos. Las cepas de E.coli y Salmonella son particularmente útiles en la invención. Así como son vacunas por derecho propio contra la infección por Salmonella, la Salmonella atenuada puede ser utilizada como un portador de antígenos heterólogos desde otros organismos hasta el sistema inmune por medio de la ruta oral. La Salmonella es un inmunógeno potente y es capaz de estimular las respuestas celulares y de los anticuerpos tanto locales como sistémicas. Los sistemas para impulsar la expresión de los antígenos heterólogos en la Salmonella in vivo ya son conocidos; por ejemplo los promotores de nirB y htrA se sabe que van a ser impulsores efectivos de la expresión de los antígenos in vivo. La invención puede ser ' aplicada al E.coli enterotoxigénico ("ETEC"). El ETEC es una clase de E.coli que provoca la diarrea. Las mismas colonizan el intestino delgado próximo. Una cepa de ETEC estándar es ATCC H10407. Las infecciones del ETEC son la causa única más frecuente de la diarrea de los viajeros, provocando 3-9 millones de casos por año entre los visitantes a los países en desarrollo. En las áreas endémicas, las infecciones por ETEC son una causa importante de diarrea deshidratante en infantes y niños pequeños, conduciendo a 800,000 muertes en un año en los cinco continentes. En los países en desarrollo, la incidencia de infecciones por ETEC que conducen a enfermedades clínicas se reduce con la edad, indicando que la inmunidad a la infección por ETEC puede ser adquirida. En contraste, los adultos nativos de los países industrializados que visitan las áreas endémicas son altamente susceptibles a las infecciones provocadas por ETEC. Sin embargo, con las visitas prolongadas o repetidas a las áreas endémicas, la susceptibilidad a las infecciones provocadas por ETEC disminuye, sugiriendo que un enfoque atenuado viviente para la vacunación contra ETEC puede probar ser exitoso. Los inventores eligieron trabajar sobre una cepa no toxigénica del ETEC llamada E1392/75/2A. La E1392/75/2A surgió espontáneamente de un mutante tóxico por deleción de los genes de toxina. En los estudios 'humanos, la vacunación oral con la E1392/75/2A viva dio 75% de protección contra la estimulación con la ETEC que expresa la toxina de un serotipo diferente. Sin embargo, aproximadamente 15% de los vacunados experimentaron diarrea como un efecto lateral de la vacuna. La cepa necesita atenuación adicional para reducir los efectos laterales antes de que la misma pueda ser considerada como una vacuna potencial y la invención proporciona un medio de lograr tal atenuación.

La Sec. Id No. 1 muestra la secuencia del gen aroC 'de E. coli, la Sec Id No. 3 muestra la secuencia del gen de ompC de E.coli y la Sec. Id. No. 5 muestra la secuencia del gen omp de E.coli.

Mutaciones adicionales Una o más mutaciones adicionales pueden ser introducidas en las bacterias de la invención para generar cepas que contienen mutaciones además de aquellas en aroC, ompC y ompF. Tal mutación adicional puede ser (i) una mutación de atenuación en un gen diferente de aroC, ompC y ompF, (ii) una mutación para proporcionar la selección in vivo para las células que mantienen un plásmido (por ejemplo un plásmido que expresa un antígeno heterólogo) , o (iii) una mutación para prevenir la expresión de un gen de toxina. La mutación con atenuación adicional puede ser una mutación que ya se sabe que va a ser atenuante. Tales mutaciones incluyen las mutaciones en los genes aro (por ejemplo aroA, aroD y aroE) , pur, htrA, ompR, galE, cya, crp, phoP y surA (véanse por ejemplo las referencias 2, 4, 5, 9, 12, 13, 16, 17 y 18) . Una mutación para proporcionar la selección para el mantenimiento de un plásmido se puede hacer mutando un gen que es esencial para que sobreviva la bacteria. Un plásmido que lleva el gen esencial es introducido entonces en la bacteria de modo que solamente las células que llevan el plásmido puedan sobrevivir. Esto puede ser útil en donde el plásmido contiene, por ejemplo, un antígeno heterólogo que va a ser expresado por la bacteria. Una mutación para prevenir la expresión de un gen de toxina se puede hacer para reducir cualesquiera efectos laterales provocados por la vacunación con la bacteria. Por ejemplo, en el caso de la vacunación con las cepas de E.coli tales como ETEC, puede ser deseable mutar los genes de la toxina lábil en caliente (LT) o de la toxina estable en caliente (ST) de modo que los mismos son sean expresados.

La naturaleza de las mutaciones Las mutaciones introducidas en la vacuna bacteriana generalmente dejan fuera de combate la función del gen completamente. Esto puede ser logrado ya sea aboliendo la síntesis de cualquier polipéptido en su totalidad desde el gen o haciendo una mutación que conduzca a la síntesis del polipéptido no funcional. Para abolir la síntesis del polipéptido, ya sea el gen completo o su extremo 5' pueden ser delecionados. Una deleción o inserción dentro de la secuencia de codificación de un gen puede ser utilizada para crear un gen que sintetiza solamente el polipéptido no funcional (por ejemplo el polipéptido que contiene solamente la secuencia N-terminal de la proteína del tipo silvestre) . Las mutaciones son mutaciones no reversibles. Estas mutaciones que esencialmente no muestran inversión, regresan al tipo silvestre cuando la bacteria es utilizada como una vacuna. Tales mutaciones incluyen inserciones y deleciones. Las inserciones y deleciones son preferentemente grandes, típicamente de al menos 10 nucleótidos de longitud, por ejemplo desde 10 hasta 600 nucleótidos. Preferentemente, la secuencia de codificación total es delecionada. La bacteria utilizada en la vacuna contiene preferentemente solo mutaciones definidas, es decir mutaciones las cuales están caracterizadas. Es claramente indeseable utilizar una bacteria la cual tenga mutaciones no caracterizadas en su genoma como una vacuna, a causa de que podría existir un riesgo de que las mutaciones no caracterizadas pueden conferir propiedades sobre la bacteria que provoquen efectos laterales indeseables. Las mutaciones de atenuación pueden ser introducidas por métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (véase la ref. 14). Los métodos apropiados incluyen la clonación de la secuencia de ADN del gen del tipo silvestre en un vector, por ejemplo un plásmido, y la inserción en un marcador seleccionable en la secuencia de ADN clonada o la deleción de una parte de la secuencia de ADN, conduciendo a su inactivación. Una deleción puede ser introducida, por ejemplo, por el corte de la secuencia de ADN utilizando las enzimas de restricción que realizan el corte en dos puntos o justo fuera de la secuencia de codificación y ligando o uniendo conjuntamente los dos extremos en la secuencia remanente. Un plásmido que lleva la secuencia de ADN inactivada puede ser transformado en la bacteria por técnicas bien conocidas tales como electroporación y conjugación. Entonces es posible por una selección adecuada, identificar un mutante en donde la secuencia de ADN inactivada se ha recombinado en el cromosoma de la bacteria y la secuencia de ADN del tipo silvestre se ha vuelto no funcional por recombinación homologa.

Expresión de antígenos heterólogos La bacteria atenuada de la invención puede ser diseñada genéticamente para expresar un antígeno que no es expresado por la bacteria natural o silvestre (un "antígeno heterólogo") , de modo que la bacteria atenuada actúa como un portador del antígeno heterólogo. El antígeno puede ser de otro organismo, de modo que la vacuna proporcione protección contra el otro organismo. Una vacuna multivalente puede ser producida, la cual no solamente proporciona inmunidad contra el origen virulento de la bacteria atenuada sino también proporciona inmunidad contra el otro organismo. Además, la bacteria atenuada puede ser diseñada para expresar más de un antígeno heterólogo, en tal caso los antígenos heterólogos pueden ser de los mismos organismos o de diferentes organismos. El antígeno heterólogo puede ser una proteína completa o una parte de una proteína que contiene un epítope. El antígeno puede ser de otra bacteria, un virus, una levadura o un hongo. Más especialmente, la secuencia antigénica puede ser de E.coli (por ejemplo ETEC), tétanos, virus de la hepatitis A, B o C, rinóvirus humano tal como del tipo 2 o del tipo 14, virus del herpes simplex, poliovirus del tipo 2 o 3, virus de la enfermedad aftosa, virus de la influenza, virus de Coxsackie o Chlamydia trachomatis. Los antígenos útiles incluyen componentes no tóxicos de la toxina lábil en caliente de E.coli, antígenos K88 de E.coli, antígenos del factor de colonización de ETEC, la proteína P.69 de B. pertussis y el fragmento C de la toxina del tétanos.

Los factores de colonización de ETEC y los componentes del mismo son candidatos principales para la expresión como antígenos heterólogos. Para inducir la enfermedad diarréica, las cepas patógenas de ETEC deben ser capaces de colonizar el intestino y elaborar enterotoxinas . La mayoría de las cepas de los factores de colonización de ETEC (CF) que son requeridas para la adhesión a la mucosa intestinal han sido identificadas. En casi todos los casos los CFs son expresados como fimbrillas o franjas sobre la superficie externa de la bacteria. Un gran número de CFs ha sido identificado, los más prevalecientes son CFAI, CRAII (incluye CS1, CS2, CS3) y CFAIV (incluye CS4, CS5, CS6) . Una vacuna para ETEC idealmente proporcionará protección contra una gama de antígenos del factor de colonización para asegurar que se obtenga la protección contra las diferentes cepas. Para lograr esto, podría ser posible expresar varios factores de colonización en una cepa. Alternativamente, las mismas atenuaciones se podrían hacer en una gama de diferentes cepas de ETEC, cada una con un factor de colonización diferente. Esto podría involucrar la deleción de las toxinas de tales cepas. El ADN que codifica el antígeno heterólogo es expresado desde un promotor que es activo in vivo. Dos promotores que se ha mostrado que trabajan bien en la Salmonella son el promotor de nirB (19, 20) y el promotor de htrA (20) . Para la expresión de los antígenos del factor de colonización de ETEC, se podrían utilizar promotores del tipo silvestre. Una construcción de ADN que comprende el promotor enlazado operativamente al ADN que codifica el antígeno heterólogo se puede fabricar y transformar en la bacteria atenuada utilizando técnicas convencionales. Los agentes de transformación que contienen la construcción de ADN pueden ser seleccionados, por ejemplo eligiendo un marcador seleccionable sobre la construcción. Las bacterias que contienen la construcción se pueden hacer crecer in vitro antes de ser formulada para la administración al huésped para propósitos de vacunación.

Formulación de la vacuna La vacuna puede ser formulada utilizando técnicas conocidas para la formulación de vacunas bacterianas atenuadas. La vacuna es presentada ventajosamente para la administración oral, por ejemplo en una forma encapsulada liofilizada. Tales cápsulas pueden ser provistas con un recubrimiento entérico que comprende, por ejemplo, Eudragate "S" (Marca Registrada) , Eudragate "L" (Marca Registrada), acetato de celulosa, ftalato de celulosa o hidroxipropilmetil celulosa. Estas cápsulas pueden ser utilizadas como tales, o alternativamente, el material liofilizado puede ser reconstituido previo a la administración, por ejemplo como una suspensión. La reconstitución es efectuada ventajosamente en una solución amortiguadora a un pH adecuado para asegurar la viabilidad o factibilidad de la bacteria. Para proteger la bacteria atenuada y la vacuna de la acidez gástrica, una preparación de bicarbonato de sodio es administrada ventajosamente antes de cada administración de la vacuna. Alternativamente, la vacuna puede ser preparada para administración parenteral, administración intranasal o administración intramuscular. La vacuna puede ser utilizada en la vacunación de un huésped de mamífero, particularmente un huésped humano pero también un huésped de animal. Una infección provocada por un microorganismo, especialmente 'un patógeno, puede ser prevenida por lo tanto por la administración de una dosis efectiva de una vacuna preparada de acuerdo con la invención. La dosificación empleada será por último a discreción del médico que proporciona la atención, pero dependerá de varios factores que incluyen el tamaño y el peso del huésped y el tipo de vacuna formulada. Sin embargo, una dosificación que comprende la administración oral desde 107 hasta 1011 bacterias por dosis puede ser conveniente para un huésped humano adulto de 70 kg.

Ejemplos Los Ejemplos descritos en esta sección sirven para ilustrar la invención.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra un sistema para la construcción de deleciones definidas en los genes de blanco u objetivo utilizando el empalme por mutagénesis de PCR de extensión superpuesta. La Figura 2 muestra las secuencias esperadas de los genes de blanco u objetivo después de la recombinación y selección para las deleciones. La Figura 3 muestra la clonación de los casetes de deleción en el plásmido pCVD442. La Figura 4 muestra un análisis de SDS-PAGE de las membranas externas preparadas a partir de las cepas de ETEC bajo las condiciones de osmolaridad baja (caldo sin la sal L) y elevada (caldo sin la sal L + 15% de sucrosa) . M = marcadores; Muestra 1 = PTL010; Muestra 2 = PTL002; Muestra 3 = PTL003; Muestra 4 = ?aroC?ompC; Muestra 5 = ?o pF. La Figura 5 muestra la expresión de CS1 y CS3 en las cepas de deleción después del crecimiento sobre el agar de CFA. Números iguales de las células de cada cepa fueron cargados sobre un gel de SDS-PAGE al 15% y manchado de Western con anticuerpos policlonales de anti-CSl o anti-CS3 monoespecíficos . Los controles para la especificidad del anticuerpo fueron lisados de células enteras de células TG1 que expresan la proteína de pilina principal de CS1, o la proteína de pilina principal purificada de CS3. La franja M, los marcadores de masa molecular baja de arcoiris; franja 1, células de TG1 inducidas que colectan la pKK223; franja 2, células de TGI inducidas que colectan la PKKcsl; franja 3, cepa de CS1-ETEC; franja 4, PTL010; franja 5, PTL001; franja 6, PTL002; franja 7, PTL003; franja 8, proteína de pilina principal de CS3 purificada. La Figura 6 muestra un manchado de Southern del sitio mutante. El ADN cromosómico fue extraído del ETEC del tipo silvestre (E1392/75-2A) , PTL001 (htrA aroC) , PTL002 (aroC ompR) y PTL003 (aroC ompC ompF) como se indicó, digerido con la endonucleasa de restricción EcoRV, y el campo pulsado sometido a electrofóresis por medio de agarosa al 1%. El ADN fue transferido desde el gel sobre membranas de Hybond N+ nilón (Amersham) y se hibridizó con las sondas de ADN derivadas de los sitios de aroC, htrA, ompR, ompC, u ompF como es mostrado. Las configuraciones de las bandas o franjas son consistentes con el sitio mutante que son las deleciones.

La Figura 7 muestra las respuestas de IgA en voluntarios administrados con una vacuna de acuerdo con la invención.

EJEMPLO 1: CONSTRUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA CEPA DE ACUERDO CON LA INVENCIÓN Diseño de las deieciones y construcción de los plásmidos pCVD?AroC, pCVD?O pC y pCVD?OmpF Las deleciones fueron diseñadas para remover el marco de lectura abierta completo del gen de blanco u objetivo. Utilizando la secuencia del genoma de E. coli como un molde, los cebadores de PCR fueron diseñados para amplificar los fragmentos de 500-600 pares base que flanquean el marco de lectura abierta de blanco u objetivo (véase la Tabla 1 para las secuencias del cebador) . El empalme por la extensión superpuesta utilizando la PCR se utilizó para fusionar las dos secuencias de flanqueo, creando un producto de PCR con el gen completo delecionado (Figura 1) . Las secuencias del tipo silvestre alrededor del sitio de deleción y las secuencias predichas después de la deleción son mostradas en la Figura 2. Para cada gen dos sitios de restricción diferentes fueron introducidos en la región de empalme (véase la Tabla 2 posterior) . Estos fueron utilizados para la identificación de los clones para la deleción. Los cebadores de PCR en cualquier extremo del fragmento de PCR introdujeron sitios de restricción única que son utilizados para clonar el fragmento en el sitio de clonación múltiple del pCVD442 (Figura 3) . Los productos de PCR fueron purificados por gelificación utilizando un juego o conjunto de extracción con gel y se digirió con las enzimas de restricción relevantes previo al ligamiento o unión al plásmido suicida pCVD442(22) digerido con la misma enzima y tratado con la fosfatasa alcalina para prevenir el autoligamiento del vector (Figura 3) . La mezcla de ligamiento se transformó en SY327?pir y se colocó en placas sobre placas de L-Ampicilina (100 µg/ml) . Los plásmidos de los transformantes resistentes a la Ampicilina fueron elegidos para verificar la presencia de los casetes de deleción por la digestión de restricción. Se generaron los siguientes plásmidos: pCVD?AroC pCVD?OmpC pCVD?OmpF El plásmido suicida pCVD442 solamente puede replicarse en las células que colectan el gen pir. Durante la introducción en las cepas diferentes de pir, el pCVD442 es incapaz de replicarse, y la resistencia a la Ampicilina conferida por el plásmido solamente puede ser mantenida si el plásmido es integrado en el cromosoma por un evento recombinante homólogo único. El plásmido también tiene un gen de sacB, que codifica la sucrasa de levan, la cual es tóxica para las bacterias gram negativas en la presencia de la sucrosa. Este puede ser utilizado para seleccionar clones que han padecido un segundo evento recombinante, en el cual el plásmido es escindido. Tales células serán resistentes a la sucrosa, pero sensibles a la Ampicilina.

Construcción ¿7 caracterización de la cepa de ?AroC?OmpC?OmpF Esta sección describe la cronología de la construcción y la historia de una cepa de ?AroC?OmpC?OmpF. En la sección, "ETEC" se refiere específicamente a la cepa E1392/75/2A o sus derivados. las deleciones de ?AroC?OmpC?OmpF fueron introducidas en E1392/75/2A en el siguiente orden: ?AroC-»?AroC?0mpC??AroC?0mpC?0mpF Construcción de ETEC?AroC 1) el E1392/75/2A del material en almacenamiento en microbancos, original, se colocó en placas sobre L-Agar. 2) Las células competentes por electroporación fueron preparadas a partir de estas células. Se congelaron alícuotas de 100 µl. 3) el pCVDAroC se purificó a partir de las células de SY327pir utilizando un midiprep. de Qiagen Qiafilter (Nombre Registrado) . El plásmido se concentró aproximadamente 10 veces por precipitación con etanol. La construcción de pCVDAroC es como se describió anteriormente . 4) 5 µl del plásmido concentrado se mezclaron con 100 µl de las células descongeladas y se sometieron a electroporación. La transformación ' completa se colocó en placas sobre una placa de L-Ampicilina (50 µg/ml) y se incubó toda la noche a 37 °C. 5) Creció una sola colonia resistente a la Ampicilina. 6) La colonia se marcó con rayas sobre una plana de L- Ampicilina (100 µg/ml) y se hizo crecer toda la noche a 37 °C ("placa merodiploide") . 7) La PCR utilizando los cebadores TT19 y TT20 (específicos para el gen de aroC) y una colonia recuperada de las dos bandas amplificadas de la placa merodiploide, con tamaños que corresponden a aquellos del tipo silvestre y los genes de ?aroC. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 1 que se da posteriormente. 8) Una colonia de la placa merodiploide se hizo crecer durante 7 horas en a) caldo de L-Ampicilina (100 µg/ml) y b) Caldo L. La colonia que se hizo crecer sobre L- Ampicilina se colocó un microbancos o microcubetas. 9) Las diluciones en serie de los cultivos del caldo L fueron establecidos sobre: a) agar-L L sin sal b) agar-L sin sal + 5% de sucrosa. Las placas fueron incubadas toda la noche a 30 °C. 10) Los conteos de la colonia mostraron que 104 colonias más crecieron sobre L-agar que sobre L-agar + 5% de sucrosa, que muestra la selección de sucrosa trabajada. 1) Las colonias resistentes a la sucrosa fueron elegidas para verificar la presencia del gen ?aroC por PCR. Las colonias elegidas para la selección fueron recuperadas o colocadas sobre una placa de agar-L y se hicieron crecer toda la noche a 37 °C. Esta placa se almacenó a 4 °C, mientras que se llevan a cabo pruebas adicionales. 12) 50% de las 90 colonias probadas tuvieron el ?aroC solamente. 13) Las colonias fueron probadas para verificar su crecimiento sobre: a) placas del medio mínimo M-9 b) placas del medio mínimo M-9 + Aro ix c) L-amp (100 µg/ml) las colonias de ?aroC no deben crecer sobre el medio mínimo de M-9 sin Aromix o sobre L-Amp. Aromix es una mezcla de los compuestos aromáticos como sigue: Estos compuestos están hechos en bacterias del tipo silvestre, pero la mutación de aro previene su síntesis . 14) Las 13/14 colonias de ?AroC supuestas requirieron Aromix para el crecimiento sobre un medio mínimo de M-9 y fueron susceptibles a la Ampicilina. ) 3 colonias (Nos. 1,2,3) fueron probadas para verificar la presencia del gen de la proteína pilina principal mayor de CS1 por PCR utilizando los cebadores MGR169 y MGR170. Todas las tres colonias dieron los productos de PCR del tamaño esperado (700 pb) . Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 1. ) Las colonias 1, 2 y 3 de la selección de la placa maestra se colocaron en forma de rayas sobre L-Agar y se hicieron crecer toda la noche a 37 °C. Las células de estas placas se utilizaron para inocular los tubos de los microbancos . ) La colonia 1, almacenada en un microbanco, se utilizó para trabajo adicional. ) Para almacenamiento permanente, una perla de la bandeja del microbanco se inoculó en 1 ml del caldo-L, se hizo crecer durante 4 horas con agitación a 37 °C y se utilizó para hacer declives de agar los cuales se utilizaron para fabricar materiales en almacenamiento secos congelados. Los materiales secos congelados de E1392/75/2A?AroC se designaron PTL004. 20 ml del caldo L se agregaron al resto del 1 ml del cultivo y el cultivo se incubó toda la noche a 30 °C. 1 ml del cultivo de toda la noche se transfirió a cada una de las tres crioarnpolletas y se almacenó en nitrógeno líquido.

Construcción de ETEC?AroC?Ompr 1) Preparación del ADN del plásmido de pCVD?Ompc para la electroporación: Una colonia del SY327?pir que colecta el pCVD?Ompc se hizo crecer toda la noche a 37 °C en 100 ml del caldo de Ampicilina-L (100 µg/ml) . El ADN del plásmido se purificó utilizando 2 midipreps de Qiagen Qiafilter (Nombre Registrado) . El ADN se concentró adicionalmente por precipitación con etanol. La construcción del pCVD?Ompc se describió anteriormente. 2) Preparación de las células electrocompetentes: Las células de ETEC?AroC de la bandeja de microbancos producida en el paso 17 de la sección precedente se colocaron como fajas o bandas sobre L-agar, se hicieron crecer a 37 °C toda la noche y luego se almacenaron a 4 °C durante no más de 1 semana antes de ser utilizadas para inocular cultivos para la preparación de células electrocompetentes. 3) Las células de ETEC?AroC se sometieron a electroporación con 5 µl de ADN de pCVD?Ompc concentrado, y cada transformación se colocó en placas sobre una placa de L- Ampicilina única (50 µg/ml) y se hizo crecer toda la noche a 37 °C. 4) 17 colonias resistentes a la ampicilina (merodiploides de ETEC?AroC/pCVD?Omp supuestos) fueron obtenidas. 5) Estas colonias se tranfirieron co o puntos sobre una placa de L-Ampicilina maestra (100 µg/ml) y se utilizaron como moldes para PCR con los cebadores TT7/TT8. La placa maestra se hizo crecer a temperatura ambiente el fin de semana. Las secuencias de los cebadores se dan en la Tabla 1 posterior. 6) Una sola colonia (No. 7) tuvo el gen de ?ompC. 7) La colonia se hizo crecer durante 5 horas en el caldo L. 8) Las diluciones en serie del cultivo del caldo L se establecieron sobre: a) agar-L sin sal b) agar-L sin sal + 5% de sucrosa Las placas se incubaron toda la noche a 30 °C. 9) Los conteos de las colonias mostraron que 104 más colonias crecieron sobre el L-agar que sobre L-agar + 5% de sucrosa, mostrando que la selección de sucrosa trabajó. 10) 45 colonias resistentes a la sucrosa fueron seleccionadas para ?ompC por PCR utilizando los cebadores TT7 y TT8. 9 colonias tuvieron el gen de ?ompC, pero la mayoría tuvieron trazas del gen de ompC de w.t. Las secuencias de los cebadores son provistas en la Tabla 1 posterior. 11) Para caracterizar adicionalmente las colonias de ETEC?AroC?OmpC, las mismas se hicieron crecer en 1 ml de Caldo-L durante 5 horas y se colocaron en placas sobre: a) L-Agar + 100 µg/ml de Ampicilina b) L-Agar c) L-Agar + 5% de sucrosa las colonias de ?OmpC deben ser resistentes a la sucrosa y sensibles a la Ampicilina. 12) solamente 1 colonia (No. 1) fue sensible a la Ampicilina y resistente a la sucrosa. 13) La colonia 1 se verificó para detectar la presencia de los genes de ?aroC, ?ompC y CS1 por PCR con los cebadores TT19/TT20, TT7/TT8 y MGR169 y 170. Las secuencias de los cebadores se dan en la Tabla 1 posteriormente. 14) La colonia 1 dio productos de PCR sencillos del tamaño esperado para los genes de ?aroC, ?'ompC y CS1. 15) La colonia fue colocada en microbancos. 16) Para el almacenamiento permanente, una perla del microbanco se inoculó en 1 ml del caldo-L, se hizo crecer durante 4 horas con agitación a 37 °C y se utilizó para hacer declives de agar los cuales son secados por congelamiento o deshidratados por aspersión. Los materiales deshidratados por aspersión de E1392/75/2A?AroC?OmpcC se designaron PTL008. 20 ml del caldo-L se agregaron al resto del 1 ml del cultivo y el .cultivo se incubó toda la noche a 30 °C. 1 ml del cultivo toda la noche se transfirió a cada una de las tres crioampolletas y se almacenó en nitrógeno líquido.

Construcción de ETEC?AroC?OmpC?OrapF Se utilizó la conjugación para introducir el pCVD?OmpF en el E1392/75/2A?AroC??mpC. 1) Las células donadoras SMIO?pir de conjugación se transformaron con pCVD?OmpF. La construcción del pCVD?OmpF del plásmido es como se describió anteriormente . 2) Las células de ETEC?AroC?OmpC se conjugaron con las células SMIO?pir/pCVD?OmpF. El plásmido pCVD442 incluye un origen de transferencia el cual permite que el plásmido sea transferido desde uña cepa donadora que contiene los genes de transferencia RP4 (por ejemplo SMIO?pir) a una cepa receptora (por ejemplo ETEC) . Las células de ETEC?AroC?OmpC y la cepa SMIO?pir del E.coli que colecta la Pcvd?ompF recombinante fueron colocadas como rayas cruzadas sobre las placas de L-agar para cubrir un área de aproximadamente 10 cm2. Las placas fueron incubadas a 37 °C durante 20 h, luego el material que creció se retiró por lavado utilizando 4 ml del caldo L y la suspensión se colocó en placas sobre agar de McConkey (Difco) que contiene la estreptomicina a 20 µg ml-1 y la ampicilina a 300 µg ml-1. Las placas fueron incubadas toda la noche a 37 °C y las colonias resultantes fueron verificadas para merodiploidía por PCR utilizando los oligonucleótidos apropiados como cebadores . ) Los materiales transconjugantes de ETEC supuestos fueron seleccionados. 10 colonias fueron retiradas de las placas de agar de MacConkey y se hicieron crecer toda la noche sobre L-Ampicilina (100 µg/ml) agar. La presencia del gen de ?ompF se verificó por PCR con los cebadores TT1/TT2. Las secuencias de los cebadores se dan en la Tabla 1 posterior. ) Las colonias se hicieron crecer durante 5 horas en el caldo-L. ) Las diluciones en serie del cultivo del caldo-L se establecieron sobre: a) agar-L sin sal b) agar-L sin sal + 5% de sucrosa Las placas se incubaron toda la noche a 30 °C. ) Los conteos de la colonia mostraron 105 más colonias que crecieron sobre L-agar que sobre L-agar + 5% de sucrosa, que muestra la selección de la sucrosa trabajada. ) Las colonias resistentes a la sucrosa fueron seleccionadas para el gen ?ompF por PCR con los cebadores de TT1/TT2. Las secuencias de los cebadores se dan en la Tabla 1 posterior. Las colonias seleccionadas se hicieron crecer toda la noche sobre L-Agar. 3 Colonias de 47 tuvieron el gen de ?ompF sin evidencia del gen de ompF del tipo silvestre. ) Para caracterizar adicionalmente las colonias de ETEC?AroC?OmpC?OmpF supuestas, las mismas se colocaron sobre: a) L-Agar + 100 µg/ml de Ampicilina b) L-Agar c) L-Agar + 5% de sucrosa las colonias de ?ompF deben ser resistentes a la sucrosa y sensibles a la Ampicilina. ) Todas las tres colonias de ?ompF fueron sensibles a la Ampicilina y resistentes a la sucrosa. 0) Las colonias fueron colocadas 'en microbancos y una colonia se eligió como una materia prima maestra. 1) Para el almacenamiento permanente, una perla de la materia prima maestra se inoculó en 1 m del caldo L, se hizo crecer durante 4 horas con agitación a 37 °C y se utilizó para fabricar pendientes o declives de agar los cuales son utilizados para fabricar materiales deshidratados por aspersión. Los materiales deshidratados por aspersión de E1392/75/2A ?AroC?OmpC?OmpF se designaron PTL003. 20 ml del caldo L se agregaron al resto del 1 ml de cultivo y el cultivo se incubó toda la noche a 30 °C. 1 ml del cultivo de toda la noche se transfirió a cada una de las tres crioampolletas y se almacenó en nitrógeno líquido.

Caracterización del E1392/75/2A?AroC?0mpC?0mpF 1) Requerimientos del crecimiento: Las células tomadas de la materia prima maestra producida en el paso 10 de la sección precedente se colocaron como rayas sobre la placa de agar-L. Al mismo tiempo se inocularon 8 ml del caldo L para una preparación de ADN cromosómico para los manchados de Southern. Tanto el cultivo de la placa como el cultivo líquido se hicieron crecer toda la noche a 37 °C. Las células de la placa de crecimiento se colocaron en forma de rayas sobre el siguiente medio y se hicieron crecer toda la noche a 37 °C.

Medio Crecimiento L-Amp No Medio mínimo de M9 No M9 mínimo + Aromix Si M9 + sulfatiazol (100 µg/ml; No M9 + sulfatizol (100 µg/ml) + Aromix Si L-Agar + 50 µg/ml de estreptomicina Si L-Agar + 5% de sucrosa Si Como se esperaba, las células fueron sensibles a Amp. Las células fueron resistentes a la sucrosa, estreptomicina y sulfatiazol, pero requirieron Aromix para el crecimiento sobre el medio mínimo. ) análisis de LPS de PTL003: a) Un ampolleta deshidratada por aspersión de PTL003 se abre rompiéndola. El cultivo se vuelve a suspender en Caldo-L y se coloca en placas sobre L- agar para el crecimiento. Algunas células fueron retiradas por raspado y almacenadas en microbancos. b) Más células fueron retiradas por raspado y se analizó el perfil de LPS. No existió diferencia visible entre el perfil de LPS de PTL003 y la cepa E1392/75/2A original. ) Confirmación de las deleciones por PCR: a) un raspado de las células se tomó de la placa hecha en 2a y se colocó en forma de rayas sobre L-Agar y se hizo crecer toda la noche. b) Las células que han crecido recientemente se utilizaron para PCR con los cebadores que flanquean los siguientes genes: aroC, htrA, ompC, ompF y ompR. c) El PTL003 se mostró que tiene deleciones en los genes de aroC, ompC y ompF, pero no en htrA u ompR. ) Análisis del perfil de proteína de la membrana externa de PTL003: Las fracciones de la proteína de la membrana externa se prepararon a partir de las cepas PTL010 (E1392/75/2A) y las cepas de deleción PTL002 ' y PTL003. Una cepa con una deleción de ompF única y una cepa con las deleciones tanto de aroC como de ompC también fueron analizadas. Las cepas se hicieron crecer bajo condiciones de osmolaridad baja (caldo-L sin sal) y osmolaridad elevada (caldo-L sin sal + 15% de sucrosa) . El producto de la proteína de OmpF es expresado normalmente a osmolaridad baja mientras que el producto de OmpC es expresado a una osmolaridad elevada. Las proteínas de OmpC y OmpF tienen movilidades electroporéticas similares. A osmolaridades tanto elevadas como bajas, la cepa PTL003 carece de proteínas en la región de OmpC/OmpF cuando se compara con la cepa de E1392/75/2A del tipo silvestre o con las cepas de deleción de ?AroC?OmpC o ?OmpF. Los resultados se muestran en la Figura 4. presión de pilus de CSl y CS3 sobre CFA agar: La expresión de los pilus de CSl y CS3 en las de deleción fue examinada. Números iguales (2 unidades de eoonm) de las cepas PTL010, PTLOOl, PTL002 y PTL003 de las bacterias que se hicieron crecer toda la noche a 37 °C sobre agar CFA se sometieron a CDS PAGE y se analizaron por manchado de Western con anticuerpos monoclonales monoespecíficos contra CSl o CS3. Los pilus de CSl y CS3 fueron expresados igualmente bien en cuatro cepas (Figura 5) .

Un derivado negativo de CFAII de E1392/75/2A se construyó para su uso como un control. Esto se hizo por el curado específico del CS que codifica los plásmidos de la cepa E1392/75/2A de ETEC. Un fragmento corto del ADN se amplificó a partir del gen cooB utilizando PCR con los oligonucleóti os CSA01 y CSA02 como los cebadores y se ligaron en el vector del plásmido pGEM-T Easy (Nombre Registrado, Promega) diseñados para la clonación de los productos de PCR. El fragmento se subclonó en pCVD442 en virtud de los sitios de la enzima de restricción de Salí y Sphl. El derivado de pCVD442-cooB se introdujo en la cepa E1392/75/2A de ETEC por la conjugación desde SMIO?pir. Los materiales transconjugantes resistentes a la ampicilina es muy probable que sean el resultado de la fusión del derivado de pCVD442-cooB con el plásmido que lleva el cooB. Tales materiales transconjugados se hicieron crecer entonces sobre L-agar suplementado con sucrosa al 5% para seleccionar la pérdida del gen sacB de pCVD442. Las colonias resultantes fueron probadas para verificar la sensibilidad de la ampicilina, y por PCR utilizando CSA01 y CSA02 como los cebadores. Tres colonias de E1392/75/2A fueron incluidas como controles positivos entre estos PCRs. Dos colonias resistentes a la sucrosa que no dieron el producto con la PCR fueron colocados en forma de rayas sobre L-agar fresco suplementado con 5% de sucrosa para obtener cultivos puros. Estos se hicieron crecer en el caldo L a 37 °C durante aproximadamente 16 h' y se colocaron en microbancos a -70 °C. La pérdida del CSl que codifica el plásmido se confirmó por análisis de los perfiles del plásmido de los derivados utilizando la electrofóresis del gel de agarosa. Dos derivados fueron confirmados como negativos de CSl, pero fueron todavía CS3+. chado de Southern de PTL003: Estructura de las mutaciones por deleción. El ADN total se extrajo de los cultivos de los tres mutantes de deleción que se hicieron crecer a partir de los materiales colocados en microbancos, se digirieron con la endonucleasa de restricción EcoRV, y el ADN digerido se sometió a electrofóresis de gel de agarosa de campo pulsante. El ADN se transfirió como manchas desde los geles sobre membranas de nilón Hybond N+ (Nombre Registrado) y se hibridizó con las sondas de ADN apropiadas de acuerdo con los procedimientos estándares. Los resultados (Figura 6) muestran que la hibridación de los fragmentos del ADN cromosómico de los mutantes son más cortos que los del tipo silvestre, consistente con las mutaciones que son deleciones.

Confirmación de la ausencia de los genes de la toxina Estable con Calentamiento (ST) y Lábil con Calentamiento (LT) en la cepa E1392/75/2A de E.coli. Para esto los genes de ST y LT-AB fueron utilizados como las sondas de ADN contra el ADN total a partir de E1392/75/2A. El ADN total de la cepa E1393/75 de ETEC positiva para la toxina estuvo incluido como un control positivo, mientras que aquel de la cepa JM109 de E.coli de laboratorio estuvo incluido como un control negativo. Las membranas hibridizadas fueron dejadas bajo Hyperfilm-ECL (Nombre Registrado) durante 1 h para obtener la cantidad máxima de la señal. Las sondas fueron preparadas utilizando PCR con el ADN del plásmido extraído de E1392/75/2A como molde y ESTOl y EST02 de los oligonucleótidos como los cebadores para ST, o LT-R1 y LT-03 para LT-AB. No existió hibridación significativa con el ADN total utilizando la sonda ya sea de LT-AB o de ST, a pesar de obtener una señal muy intensa desde el ADN total del control positivo. Confirmación de la ausencia de las secuencias de pCVD442 del cromosoma de los mutantes de deleción. El pCVD442 del plásmido se etiquetó y se hibridizó hasta el ADN total de los mutantes de deleción PTLOOl, PTL002 y PTL003 digeridos con ÉcoRV. El ADN total de la cepa E1392/75/2A de ETEC se incluyó como un control. Una configuración compleja de la hibridación de los fragmentos de ADN fue obtenida. Pero, no existió diferencia significativa entre la configuración obtenida para el tipo silvestre y aquella para los mutantes, indicando que probablemente la secuencia de nucleótidos de pCVD442 no residual fue dejada en los genomas de los mutantes. La configuración compleja de los fragmentos de hibridación fue más probablemente debido a la sonda de pCVD442 que se hibridiza con los componentes de ADN del plásmido de la cepa de E1392/75/2A y los derivados mutantes.

Tabla 1 - Cebadores para PCR i Nombre Blanco Uso Secuencia ( 5 ' - 3 ' ) TT 1 ompF Cebador A para clonación ATC TGT TTG TTG AGC TCA GCA ATC TAT TTG CAÁ CC TT2 ompF Cebador B para clona jj&n TTT TTT GCC AGC ATG CCG GCA GCC ACG CGT AGT G TT3 ompF Cebador C paxa clonación CTC GAG GCT TAG CTC TAT TTA TTA CCC TCA TGG TT4 ompF Cebador D para clonación GAG CTA AGC CTC GAG TAA TAG CAC ACC TCT TTG TT7 ompC Cebadar A para clonación TTG CTG GAA AGT CGA CGG ATG TTA ATT ATT TGT G TT8 ompC Cebador B para clonación GGC CAÁ AGC CGA GCT CAT TCA CCA GCG GCC CGA CG TT 9 ompC Cebador C para clonación GCT AAG CCT CGA GTA ATC TCG ATT GAT ATC CG TT10 ompC Cebador D para clonación CTC GAG GCT TAG CGT TAT TAA CCC TCT GTT A Tabla 2 EJEMPLO 2: SEGURIDAD E INMUNOGENICIDAD DE LA CEPA DE LA VACUNA ATENUADA DE E. COLI ENTEROTOXIGENICA (?AroC/?OmpC/?OmpF) EN VOLUNTARIOS HUMANOS El estudio se diseñó para evaluar una cepa de la vacuna atenuada viva candidata del E. coli enterotoxigénica, especialmente el PTL003 de ?AroC/?OmpC/?OmpF descrito anteriormente.

Preparación de los lotes de siembra de la vacuna La cepa bacteriana se colocó en chapas sobre agar de MacConkey para verificar la pureza y para la confirmación de la identidad, y 5 colonias se utilizaron para inocular un recipiente que contiene 200 ml de caldo de luria. Después de 8 horas de incubación a +37 °C, se agregan 30 ml de glicerol estéril al cultivo del caldo y se prepararon alícuotas (1 ml por ampolleta). Un ciento de tales ampolletas fueron congeladas a -70 °C. Estas ampolletas constituyeron el lote de siembra para la cepa de la vacuna. La pureza del lote de siembra se aseguró seleccionando diez ampolletas al azar, y probándolas para verificar la pureza bacteriana y la libertad o exención de los hongos. Unas tres ampolletas adicionales fueron probadas para determinar el número de las bacterias en las ampolletas utilizando métodos de conteo estándares de la placa con diluciones en serie del caldo de cultivo.

Preparación de la vacuna La vacuna se preparó recientemente previo a cada vacunación y todos los pasos en la preparación del inoculo se llevaron a cabo en un gabinete de seguridad. El día previo a la vacunación, 0.2 ml se difunden o dispersan en la superficie de las placas de agar de luria utilizando torundas de algodón estéril para preparar el pasto de las bacterias. El mismo caldo de cultivo se colocó en forma de rayas sobre las placas de agar de MacConkey y luria para verificar la pureza. Las placas de agar se incubaron a 37 °C durante 18 horas en un recipiente sellado con una tapa indicadora resistente al uso indebido para asegurar que las placas no fueran utilizadas indebidamente durante la incubación. Después de la incubación, el pasto de las bacterias se colectó con 5 ml de solución salada amortiguada con fosfato, estéril (PBS) , y la densidad óptica de la suspensión se midió. El volumen apropiado de esta suspensión, que corresponde a la dosis deseada, fue colocada entonces en botellas de dosificación unitaria con 30 ml de solución amortiguadora de bicarbonato y se administraron a los voluntarios. Una dosis extra de la vacuna se preparó y se dejó en el laboratorio, e inmediatamente después que los voluntarios han sido vacunados el número real de bacteri s en cada dosis de la vacuna se legitimó utilizando procedimientos de conteo de las colonias estándares con diluciones de diez veces para la vacuna. El procedimiento para diluir las bacterias se estableció durante los estudios preliminares utilizando los cultivos del pasto o césped preparados y se incubaron exactamente como se hizo para las preparaciones de vacuna administradas a los voluntarios. Las suspensiones se hicieron y el número de bacterias disponibles se enumeró por los conteos de colonias de las diluciones en serie y se relacionó con la densidad óptica determinada. Con base en estos estudios preliminares, se desarrolló un procedimiento estándar para preparar y validar las diluciones correctas de las bacterias para dar las dosis establecidas.

Preparación de la solución amortiguadora Una solución amortiguadora que consiste de bicarbonato de sodio en agua fue utilizada. Para cada dosis de la vacuna se prepararon 150 ml del agua desionizada que contiene 2 gramos de bicarbonato de sodio y el filtro se esterilizó. 30 ml de la solución amortiguadora se colocaron en ampolletas estériles de 50 ml y la dosis de las bacterias de la vacuna se agregó a estas ampolletas. Los restantes 120 ml de la solución amortiguadora se colocaron en botellas estériles separadas. En el tiempo de la vacunación, los voluntarios fueron administrados primero con 120 ml de la solución amortiguadora, luego un minuto más tarde, 30 ml de la solución amortiguadora que contiene la vacuna.

Programa de vacunación Los grupos de voluntarios fueron estudiados en de una manera escalada en cuanto a la dosis. El primer grupo de voluntarios recibió una dosis de aproximadamente 5x107 bacterias, el segundo una dosis de aproximadamente 5x1O9 y el tercer grupo una dosis de aproximadamente 5x1O8. A los voluntarios se les proporcionó Ciprofloxacina 500 mg BID durante tres días empezando en el día 4. Los mismos fueron descargados en el día 6, habiendo tenido una selección de hematología y química por razones de seguridad. El suero fue guardado para la medición de anticuerpos. En los días 9 y 14 los voluntarios regresaron para continuar con visitas de pacientes externos, tiempo en el cual se hizo una historia interna y se obtuvo una muestra de sangre para los ensayos serológicos. En total, la sangre (40 ml) se colectó para serología tres veces, previo a la vacunación y el día 9 y el día 14 después de la vacunación.

Procedimientos de Ensayo de Laboratorio Hasta dos especímenes fecales fueron cultivados cada día mientras que los voluntarios estuvieron en el hospital. Para cultivos cualitativos, una torunda fecal se colocó en el medio de transporte de Cary Blair y se tomó para el laboratorio en donde los mismos se inocularon directamente sobre agar de MacConkey y sobre agar de MacConkey que contiene antibióticos selectivos para la cepa de la vacuna. Hasta cinco colonias se mostró que van a estar aglutinadas utilizando antisueros específicos para la cepa de la vacuna. Para el cultivo cuantitativo (primer espécimen de cada día solamente) los especímenes fecales fueron pesados y diluidos en PBS, con diluciones de 10 veces en serie hasta 10~4, y luego 100 µl de cada dilución se rociaron o dispersaron sobre agar de MacConkey con los antibióticos. Las colonias sospechosas fueron confirmadas por aglutinación con suero anti-O. El suero se colectó y se guardó para el ensayo subsiguiente para verificar la presencia de los anticuerpos contra los antígenos de CFA II por ELISA y los anticuerpos bactericidas contra la cepa de la vacuna. Las células mononucleares de la sangre periféricas fueron separadas de la sangre entera colectada en el citrato y se lavaron. Estas células fueron cultivadas a una densidad de 107 células por ml en el medio de cultivo del tejido de RPMI a 37 °C durante 48 horas. Después de 48 horas el sobrenadante se transfirió a una crioampolleta y se congeló a -20 °C hasta que el mismo pudiera ser evaluado para verificar la presencia de los anticuerpos de IgG e IgA para CFA II por ELISA. Tabla 3 - Resumen de los procedimientos del protocolo Resultados No se observó ningún síntoma en todas las dosis reales de 6.8 x 107 y 3.7 x 108 cfu. A la dosis más elevada de 4.7 x 109 1/6 de los voluntarios experimentó diarrea y 2/6 tuvieron calambres abdominales suaves. El esparcimiento bacteriano fue observado en todos los voluntarios al nivel de la dosis de 5xl09 cfu desde el día 1 posvacunación, hasta que, como por el protocolo, la ciprofloxacina se empezó el día 4 después de la vacunación. Esto indica la colonización intestinal buena, lo cual es indicativo del potencial para inducir una buena respuesta inmune. A las dos dosis más bajas, la cepa de la vacuna se recuperó de todos los voluntarios sobre al menos un punto del tiempo a continuación de la vacunación pero la duración de la excreción se redujo comparado con aquella observada a la dosis más elevada. En el instante de la presentación de la solicitud, el análisis de las respuestas inmune generadas por la vacuna estuvo incompleto. Sin embargo, las respuestas de anti-CFA II de IgA en los sobrenadantes del cultivo del PBMNC purificados a partir de la sangre de los pacientes o receptores de la dosis más elevada de la vacuna en el día 0 (antes de la vacunación) y los días 7 y 10 posvacunación han sido analizados (véase la Figura 7) . Los sobrenadantes fueron analizados por ELISA sobre las placas de ensayo recubiertas con el antígeno de CFA II purificado. Los valores de OL observados de las muestras del día 7 y el día 10 fueron significativamente más elevados que aquellos de las muestras de prevacunación, demostrando la inducción de una respuesta de IgG específica en estos puntos del tiempo. Como se esperaba, las respuestas muestran un pico en el día 7 y son reducidas en el día 10, consistente con la guía del IgA cebado que secreta las células B desde la sangre hasta los sitios efectores mucosales del Tejido Linfoide Asociado con el Intestino.

Conclusiones La cepa viva atenuada de ETEC (?AroC/?OmpC/?OmpF) se ha mostrado que va a ser bien tolerada en voluntarios adultos sanos y que- coloniza el intestino de una manera consistente con su utilidad como una vacuna oral para la protección contra la diarrea de los viajeros. También se ha demostrado la producción de una respuesta inmune mucosal específica.

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(1991) Infection and Immunity 59, 4310-4317 LISTADO DE LAS SECUENCIAS (1 INFORMACIÓN GENERAL: (1) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: PEPTIDE THERAPEUTICS LIMITED (B) CALLE: 100 Fulbourn Road (C) CIUDAD: Cambridge (D) ESTADO: no disponible (E) PAÍS: Reino Unido (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : CB1 9PT (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: BACTERIAS ATENUADAS ÚTILES EN VACUNAS (iii) NUMERO DE LAS SECUENCIAS: (iv) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible (B) COMPUTADORA: compatible con IBM PC (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (v) DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD: NUMERO DE LA SOLICITUD: (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1690 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN ( genómico ) (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: aroC de E.coli (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 492..1562 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1: GTCGACGCGG TGGATATCTC TCCAGACGCG CTGGCGGTTG CTGAACAGAA CATCGAAGAA 60 CACGGTCTGA TCCACAACGT CATTCCGATT CGTTCCGATC TGTTCCGCGA CTTGCCGAAA 120 GTGCAGTACG ACCTGATTGT CACTAACCCG CCGTATGTCG ATGCGAAGAT ATGTCCGACC 180 TGCCAAACAA TACCGCCACG AGCCGGMCT GGGCCTGGCA TCTGGCACTG ACGGCCTGAA 240 ACTGACGCGT CGCATTCTCG GTAACGCGGC AGATTACCTT GCTGATGATG GCGTGTTGAT 300 TTGTGAAGTC GGCAACAGCA TGGTACATCT TATGGAACAA TATCCGGATG TTCCGTTCAC 360 CTGGCTGGAG TTTGATAACG GCGGCGATGG TGTGTTTATG CTCACCAAAG AGCAGCTTAT 420 TGCCGCACGA GAACATTTCG CGATTTATAA AGATTAAGTA AACACGCAAA CACAACAATA 480 ACGGAGCCGT G ATG GCT GGA AAC ACÁ ATT GGA CAÁ CTC TTT CGC GTA ACC 530 Met Ala Gly Asn Thr He Gly Gln Leu Phe Arg Val Thr 1 5 10 ACC pC GGC GAA TCG CAC GGG CTG GCG CTC GGC TGC ATC GTC GAT GGT 578 Thr Phe Gly Glu Ser His Gly Leu Ala Leu Gly Cys He Val Asp Gly 15 20 25 GTT CCG CCA GGC ATT CCG CTG ACG GAA GCG GAC CTG CAÁ CAT GAC CTC 626 Val Pro Pro Gly lie Pro Leu Thr Glu Ala Asp Leu Gln His Asp Leu 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Phe Gln 255 260 265 AGC AAC CAT GCG GGC GGC ATT CTC GGC GGT ATC AGC AGC GGG CAG CAÁ 1346 Ser Asn His Ala Gly Gly H e Leu Gly Gly He Ser Ser Gly Gl n Gl n 270 275 280 285 ATC AH GCC CAT ATG GCG CTG AAA CCG ACC TCC AGC A ACC GTG CCG 1394 He He Ala His Met Ala Leu Lys Pro Thr Ser Ser He Thr Val Pro 290 295 300 GGT CGT ACC Ap AAC CGC Tp GGC GAA GAA Gp GAG ATG ATC ACC AAA 1442 Gly Arg Thr He Asn Arg Phe Gly Glu Glu Val Glu Met He Thr Lys 305 310 315 GGC CGT CAC GAT CCC TGT GTC GGG ATC CGC GCA GTG CCG ATC GCA GAA 1490 Gly Arg His Asp Pro Cys Val Gly-Ile Arg Ala Val Pro He Ala Glu 320 325 330 GCG AAT GCT GGC GAT CGT Tp AAT GGA TCA CCT Gp ACG GCA ACG GGC 1538 Ala Asn Ala Gly Asp Arg Phe Asn Gly Ser Pro Val Thr Ala Thr Gly 335 340 345 GCA AAA TGC CGA TGT GAA GAC TGA TApCCACGC TGGTAAAAAA TGAATAAAAC 1592 Ala Lys Cys Arg Cys Glu Asp * 350 355 CGCGApGCG CTGCTGGCTC TGCpGCCAG TAGCGCCAGC CTGGCAGCGA CGCCGTGGCA 1652 AAAAATAACC CAACCTGTGC CGGGTAGCGC CAAATCGA 1690 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 356 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2: Met Ala Gly Asn Thr He Gly Gln Leu Phe Arg Val Thr Thr Phe Gly 1 5 10 15 Glu Ser His Gly Leu Al a Leu Gly Cys He Val Asp Gly Val Pro Pro 20 25 30 Gly He Pro Leu Thr Glu Ala Asp Leu Gln His Asp Leu Asp Arg Arg 35 40 45 Arg Pro Gly Thr Ser Arg Tyr Thr Thr Gln Arg Arg Glu Pro Asp Gln 50 55 60 Val Lys He Leu Ser Gly Val Phe-Glu Gly Val Thr Thr Gly Thr Ser 65 70 75 80 He Gly Leu Leu He Glu Asn Thr Asp Gln Arg Ser Gln Asp Tyr Ser 85 90 95 Ala He Lys Asp Val Phe Arg Pro Gly His Ala Asp Tyr Thr Tyr Glu 100 105 110 Gln Lys Tyr Gly Leu Arg Asp Tyr Arg Gly Gly Gly Arg Ser Ser Ala 115 120 125 Arg Glu Thr Ala Met Arg Val Ala Ala Gly Ala He Ala Lys Lys Tyr 130 135 140 Leu Ala Glu Lys Phe Gly He Glu He Arg Gly Cys Leu Thr Gln Met 145 150 155 160 Gly Asp He Pro Leu Asp He Lys Asp Trp Ser Gln Val Glu Gln Asn 165 170 175 Pro Phe Phe Cys Pro Asp Pro Asp Lys He Asp Ala Leu Asp Glu Leu 180 185 190 Met Arg Ala Leu Lys Lys Glu Gly Asp Ser He Gly Ala Lys Val Thr 195 200 205 Val Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Gly Leu Gly Gl" Pro Val Phe Asp 210 215 220 Arg Leu Asp Ala Asp He Ala His Ala Leu Met Ser He Asn Ala Val 225 230 235 240 Lys Gly Val Glu He Gly Asp Gly Phe Asp Val Val Ala Leu Arg Gly 245 - 250 255 Ser Gln Asn Arg Asp Glu He Thr Lys Asp Gly Phe Gln Ser Asn His 260 265 270 Ala Gly Gly He Leu Gly Gly He Ser Ser Gly Gln Gln He He Ala 275 280 285 His Met Ala Leu Lys Pro Thr Ser Ser He Thr Val Pro Gly Arg Thr 290 295 300 He Asp Arg Phe Gly Glu Glu Val Glu Met He Thr Lys Gly Arg His 305 310 315 320 Asp Pro Cys Val Gly He Arg Al a Val Pro He Ala Glu Ala Asn Ala 325 330 335 Gly Asp Arg Phe Asn Gly Ser Pro Val Thr Al a Thr Gly Ala Lys Cys 340 345 350 Arg Cys Glu Asp * 355 FORMACIÓN PARA LA SEC ID NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1713 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico; (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: ompC de E.coli (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 491..1594 (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO : 3 GpAACAAGC GpATAGTp pCTGTGGTA GCACAGAATA ATGAAAAGTG TGTAAAGAAG 60 GGTAAAAAAA ACCGAATGCG AGGCATCCGG pGAAATAGG GGTAAACAGA CApCAGAAA 120 TGAATGACGG TAATAAATAA AGpAATGAT GATAGCGGGA GpApCTAG pGCGAGTGA 180 AGGTpTGp pGACApCA GTGCTGTCAA ATACpAAGA ATAAGpAp GAppAACC 240 pGAApAp ApGCpGAT GpAGGTGCT TATpCGCCA pCCGCAATA ATCpAAAAA 300 GpCCCpGC ApTACATp TGAAACATCT ATAGCGATAA ATGAAACATC pAAAAGpT 360 TAGTATCATA pCGTGpGG ApApCTGC ATTpTGGGG AGAATGGACT TGCCGACTGA 420 pAATGAGGG pAATCAGTA TGCAGTGGCA TAAAAAAGCA AATAAAGGCA TATAACAGAG 480 GGpAATAAC ATG AAA Gp AAA GTA CTG TCC CTC CTG GTC CCA GCT CTG 529 Met Lys Val Lys Val Leu Ser Leu Leu Val Pro Ala Leu 360 365 370 CTG GTA GCA GGC GCA GCA AAC GCT GCT GAA Gp TAC AAC AAA GAC GGC 577 Leu Val Ala Gly Ala Ala Asn Ala Ala Glu Val Tyr Asn Lys Asp Gly 375 380 385 AAC AAA pA GAT CTG TAC GGT AAA GTA GAC GGC CTG CAC TAT pC TCT 625 Asn Lys Leu Asp Leu Tyr Gly Lys Val Asp Gly Leu His Tyr Phe Ser 390 395 400 GAC AAC AAA GAT GTA GAT GGC GAC CAG ACC TAC ATG CGT Cp GGC pC 673 Asp Asp Lys Asp Val Asp Gly Asp Gln Thr Tyr Met Arg Leu Gly Phe 405 410 415 AAA GGT GAA ACT CAG Gp ACT GAC CAG CTG ACC GGT TAC GGC CAG TGG 721 Lys Gly Glu Thr Gln Val Thr Asp Gln Leu Thr Gly Tyr Gly Gln Trp 420 425 - 430 GAA TAT CAG ATC CAG GGC AAC AGC GCT GAA AAC GAA AAC AAC TCC TGG 769 Glu Tyr Gln He Gln Gly Asn Ser Ala Glu Asn Glu Asn Asn Ser Trp 435 440 445 450 ACC CGT GTG GCA pC GCA GGT CTG AAA pC CAG GAT GTG GGT TCT pC 817 Thr Arg Val Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gln Asp Val Gly Ser Phe 455 460 465 GAC TAC GGT CGT AAC TAC GGC Gp Gp TAT GAC GTA ACT TCC TGG ACC 865 Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp Thr 470 475 480 GAC GTA CTG CCA GAA pC GGT GGT GAC ACC TAC GGT TCT GAC AAC pC 913 Asp Val Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Phe 485 490 495 ATG CAG CAG CGT GGT AAC GGC pC GCG ACC TAC CGT AAC ACT GAC pC 961 Met Gln Gln Arg Gly Asn Gly Phe Ala Thr Tyr Arg Asn Thr Asp Phe 500 505 510 pC GGT CTG Gp GAC GGC CTG AAC Tp GCT Gp CAG TAC CAG GGT AAA 1009 Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gln Tyr Gln Gly Lys 515 520 525 530 AAC GGC AAC CCA TCT GGT GAA GGC Tp ACT AGT GGC GTA ACT AAC AAC 1057 Asn Gly Asn Pro Ser Gly Glu Gly Phe Thr Ser Gly Val Thr Asp Asn 535 540 545 GGT CGT GAC GCA CTG CGT CAÁ AAC GGC GAC GGC GTC GGC GGT TCT ATC 1105 Gly Arg Asp Ala Leu Arg Gln Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser He 550 555 560 ACT TAT GAT TAC GAA GGT pC GGT ATC GGT GGT GCG ATC TCC AGC TCC 1153 Thr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Gly He Gly Gly Al a He Ser Ser Ser 565 570 575 AAA CGT ACT GAT GCT CAG AAC ACC GCT GCT TAC ATC GGT AAC GGC GAC 1201 Lys Arg Thr Asp Ala Gln Asn Thr Ala Ala Tyr He Gly Asn Gly Asp 580 585 590 CGT GCT GAA ACC TAC ACT GGT GGT CTG AAA TAC GAC GCT AAC AAC ATC 1249 Arg Ala Glu Thr Tyr Thr Gly Gly Leu Lys 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He Val Ala Leu Gly Leu Val Tyr 710 715 720 CAG pC TAA TCTCGApGA TATCGAAC?A GGGCCTGCGG GCCCT" 1634 Gln Phe * 725 CApGppC AGCGTACAAA CTCAGTITp TGGTGTACTC pGCGACCGT TCGCATGAGG 1694 ATAATCACGT ACGGAAATA 1713 INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO : 4 X) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 367 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína [xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4 Met Lys Val Lys Val Leu Ser Leu Leu Val Pro Ala Leu Leu Val Ala 1 5 10 15 Gly Ala Ala Asn Ala Ala Glu Val Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Leu 20 25 30 Asp Leu Tyr Gly Lys Val Asp Gly Leu His Tyr Phe Ser Asp Asn Lys 35 40 45 Asp Val Asp Gly Asp Gln Thr Tyr Met Arg Leu Gly Phe Lys Gly Gl" 50 55 60 10 Thr Gln Val Thr Asp Gln Leu Thr Gly Tyr Gly Gln Trp Glu Tyr Gln 65 70 75 80 He Gln Gly Asn Ser Ala Glu Asn Glu Asn Asn Ser Trp Thr Arg Val 85 90 95 Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gln-Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly 100 105 110 Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp Thr Asp Val Leu 115 120 125 Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Phe Met Gln Gln 130 135 140 Arg Gly Asp Gly Phe Ala Thr Tyr Arg Asn Thr Asp Phe Phe Gly Leu 145 150 155 160 Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gln Tyr Gln Gly Lys Asp Gly Asn 165 170 175 Pro Ser Gly Glu Gly Phe Thr Ser Gly Val Thr Asn Asn Gly Arg Asp 180 185 190 Ala Leu Arg Gln Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser He Thr Tyr Asp 195 200 205 Tyr Glu Gly Phe Gly He Gly Gly Al a He Ser Ser Ser Lys Arg Thr 210 215 220 Asp Ala Gln Asn Thr Ala Ala Tyr He Gly Asn Gly Asp Arg Ala Glu 225 230 235 240 Thr Tyr Thr Gly Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn He Tyr Leu Ala 245 250 255 Ala Gln Tyr Thr Gln Thr Tyr Asn Ala Thr Arg Val Gly Ser Leu Gly 260 265 270 Trp Ala Asn Lys Ala Gln Asn Phe Glu Ala Val Ala Gln Tyr Gln Phe 275 280 285 Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Leu Ala Tyr Leu Gln Ser Lys Gly Lys 290 295 300 Asn Leu Gly Arg Gly Tyr Asp Asp Glu Asp He Leu Lys Tyr Val Asp 305 310 315 320 Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp 325 330 335 Tyr Lys He Asn Leu Leu Asp Asp Asn Gln Phe Thr Arg Asp Ala Gly 340 345 350 25 He Asn Thr Asp Asn He Val Ala Leu Gly Leu Val Tyr Gln Phe * 355 360 365 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1808 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: ompF de E.coli (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALLZACION: 457..1545 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5: AAAACTAATC CGCApcpA pGCGGApA Gl lili ICTT AGCTAATAGC ACAATpTCA 60 TACTATpp TGGCApCTG GATGTCTGAA AGAAGATpT GTGCCAGGTC GATAAAGTp 120 CCATCAGAAA CAAAATpCC GpTAGpAA ?TAAATATA AGGAAATCAT ATAAATAGAT 180 TAAAApGCT GTAAATATCA TCACGTCTCT ATGGAAATAT GACGGTGpC ACAAAGpCC 240 pAAAppA cppGGpA CATAppp cpprGAAA ccAAATcpr ATcpTGTAG 300 CACTpCACG GTAGCGAAAC GpAGpTGA ATGGAAAGAT GCCTGCAGAC ACATAAAGAC 360 ACCAAACTCT CATCAATAGT TCCGTAAAp pTApGACA GAACpApG ACGGCAGTGG 420 CAGGTGTCAT AAAAAAAACC ATGAGGGTAA TAAATA ATG ATG AAG CGC AAT Ap 474 Met Met Lys Arg Asn He 1 5 CTG GCA GTG ATC GTC CCT GCT CTG pA GTA GCA GGT ACT GCA AAC GCT 522 Leu Ala Val He Val Pro Ala Leu Leu Val Ala Gly Thr Ala Asn Ala 10 15 20 GCA GAA ATC TAT AAC AAA GAT GGC AAC AAA GTA GAT CTG TAC GGT AAA 570 Ala Glu He Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Val Asp Leu Tyr Gly Lys 25 30 35 GCT Gp GGT CTG CAT TAT Tp TCC AAG GGT AAC GGT GAA AAC AGT TAC 618 Ala Val Gly Leu His Tyr Phe Ser Lys Gly Asn Gly Glu Asn Ser Tyr 40 45 50 GGT GGC AAT GGC GAC ATG ACC TAT GCC CGT Cp GGT Tp AAA GGG GAA 666 Gly Gly Asn Gly Asp Met Thr Tyr Ala Arg Leu Gly Phe Lys Gly Glu 55 60 65 70 ACT CAÁ ATC AAT TCC GAT CTG ACC GGT TAT GGT CAG TGG GAA TAT AAC 714 Thr Gln He Asn Ser Asp Leu Thr Gly Tyr Gly Gln Trp Glu Tyr Asn 75 80 85 pC CAG GGT AAC AAC TCT GAA GGC GCT GAC GCT CAÁ ACT GGT AAC AAA 762 Phe Gln Gly Asn Asn Ser Glu Gly Ala Asp Ala Gln Thr Gly Asn Lys 90 95 100 ACG CGT CTG GCA TTC GCG GGT Cp AAA TAC GCT GAC Gp GGT TCT pC 810 Thr Arg Leu Ala Phe Ala Gly Leu Lys Tyr Ala Asp Val Gly Ser Phe 105 110 115 GAT TAC GGC CGT AAC TAC GGT GTG Gp TAT GAT GCA CTG GGT TAC ACC 858 Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Ala Leu Gly Tyr Thr 120 125 130 GAT ATG CTG CCA GAA Tp GGT GGT GAT ACT GCA TAC AGC GAT GAC pC 906 Asp Met Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Asp Asp Phe 135 140 145 150 pc Gp GGT CGT Gp GGC GGC Gp GCT ACC TAT CGT AAC TCC AAC pc 954 Phe Val Gly Arg Val Gly Gly Val Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Asn Phe 155 160 165 Tp GGT CTG Gp GAT GGC CTG AAC pC GCT Gp CAG TAC CTG GGT AAA 1002 Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gln Tyr Leu Gly Lys 170 175 180 AAC GAG CGT GAC ACT GCA CGC CGT TCT AAC GGC GAC GGT Gp GGC GGT 1050 Asn Glu Arg Asp Thr Ala Arg Arg Ser Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly 185 190 195 TCT ATC AGC TAC GAA TAC GAA GGC Tp GGT ATC Gp GGT GCT TAT GGT 1098 Ser He Ser Tyr Glu Tyr Glu Gly Phe Gly He Val Gly Ala Tyr Gly 200 205 210 GCA GCT GAC CGT ACC AAC CTG CAÁ GAA GCT CAÁ CCT Cp GGC AAC GGT 1146 Ala Ala Asp Arg Thr Asn Leu Gln Glu Ala Gln Pro Leu Gly Asn Gly 215 220 225 230 AAA AAA GCT GAA CAG TGG GCT ACT GGT CTG AAG TAC GAC GCG AAC AAC 1194 Lys Lys Ala Glu Gln Trp Ala Thr Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn . 235 240 245 ATC TAC CTG GCA GCG AAC TAC GGT -CAÁ ACC CGT AAC GCT ACG CCG ATC 1242 He Tyr Leu Ala Ala Asn Tyr Gly Glu Thr Arg Asn Ala Thr Pro He 250 . 255 260 8081 9333193W91V93391931119131V933991339991311V S9ZI 9333V933913313933933 V1LV3W9V9 U191V3193133W991W 1V33W1913 SZ SOZI LL3331L3V9939V1V91333V119333131VW191H1 W99119V1V V19V31V311 9fr9I 119391339V 3VWW391L 3193V3131V V39V9V33.il 33V1VJJLLLL 1119133199 09e « 3ifd UL9 J/l L ? 03 S8ST 1LL3V99V3V WWV93391 WV1191113133V3V39V1 Wl 3119V33V1119 sse oge g*e 3LI ¿19 LB? BLV LB? J"l dsv dsv 3S ¿L9 L<?? ¿L9 nsi S i usv dsy oegi 31V 19991913911933V 3V93V9 V31199 V19399913 VW 3W 3V9 o? see oee SI jas dsv 3LI "L9 "SV 3113LI ^i dsv L ? ^i JU. J3S ^H us s i ZSH 1311V931V 9V33W 31V 31V 3V13V91191V133V 33191V 3W WV 2e oze 5ie usy 3Md J^l J^l M1 LV L9 LB? "L9 U,d J 1 usv LB? "31 dsv LB? i 3W 3113V13V133V V39399919 W9 LLL 3V13W 9199131V9119 01 ote 9oe ooe S62 dsv ¿L93LI ¿L9 nL9 B? dsv s?i BLV s-? jas sC? JUJ. J ? BLV 3LI 98et 1V919931V 199 W9 V193V9 WV 939 WV 131 VW 33V 0V113931V 06Z S82 °82 jas O ßJV "31 ¿L93Md s 3U.d UL9 J¿1 UL9 BLV LB? "31 "31 L ? 8ee? 3319331939131993111V93JLL 9V33V1 W3939119 Vil 913119 ¿2 0¿2 992 dsv "L9 J 1 s i "sv BL 3".d ¿19 ^ ^ l us JM13".d s¿l usv JM1 0621 3V9 W393V VW 3W 3393J139939V 33V 3W V3V 111 VW 1W 13V (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 362 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6: Met Met Lys Arg Asn He Leu Ala Val He Val Pro Ala Leu Leu Val 1 5 10 15 Ala Gly Thr Ala Asn Ala Ala Glu He Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys 20 25 30 Val Asp Leu Tyr Gly Lys Al a Val Gly Leu His Tyr Phe Ser Lys Gly 35 40 45 .

Asn Gly Glu Asn Ser Tyr Gly Gly Asn Gly Asp Met Thr Tyr Ala Arg 50 55 60 Leu Gly Phe Lys Gly Glu Thr Gln He Asn Ser Asp Leu Thr Gly Tyr 65 70 75 80 Gly Gln Trp Glu Tyr Asn Phe Gl n Gly Asn Asn Ser Gl u Gly Ala Asp 85 90 95 Ala Gln Thr Gly Asn Lys Thr Arg Leu Ala Phe Ala Gly Leu Lys Tyr 100 105 110 Ala Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr 115 120 125 Asp Ala Leu Gly Tyr Thr Asp Met Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr 130 135 140 Ala Tyr Ser Asp Asp Phe Phe Val Gly Arg Val Gly Gly Val Ala Thr 145 150 155 160 Tyr Arg Asn Ser Asn Phe Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala 165 170 175 Val Gln Tyr Leu Gly Lys Asn Glu Arg Asp Thr Ala Arg Arg Ser Asn 180 185 190 Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser He Ser Tyr Glu Tyr Glu Gly Phe Gly 195 200 205 He Val Gly Ala Tyr Gly Ala Ala Asp Arg Thr Asn Leu Gln Glu Ala 210 215 220 Glp Pro Leu Gly Asn Gly Lys Lys Ala Glu Gln Trp Ala Thr Gly Leu 225 230 235 240 Lys Tyr Asp Ala Asn Asn He Tyr Leu Ala Ala Asn Tyr Gly Glu Thr 245 250 255 Arg Asn Ala Thr Pro He Thr Asn Lys Phe Thr Asn Thr Ser Gly Phe 260 265 270 Ala Asn Lys Thr Gln Asp Val Leu Leu Val Ala Gln Tyr Gln Phe Asp 275 280 285 25 Phe Gly Leu Arg Pro Ser He Ala Tyr Thr Lys Ser Lys Ala Lys Asp 290 295 300 Val Glu Gly He Gly Asp Val Asp Leu Val Asn Tyr Phe Glu Val Gly 305 310 315 320 Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn.Met Ser Thr Tyr Val Asp Tyr He 325 330 335 He Asn Gln He Asp Ser Asp Asn Lys Leu Gly Val Gly Ser Asp Asp 340 345 350 Thr Val Ala Val Gly He Val Tyr Gln Phe * 355 360 Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención co o antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (16)

REIVINDIC CIONES

1 . Una bacteria caracterizado porque está atenuada por una mutación no reversible en cada uno del gen aroC, el aen O?IDF V <=•! gen ompC.

2. Una bacteria de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque realiza la infección por la ruta oral.

3. Una bacteria de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es de los géneros Escherichia, Salmonella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria, Yersinia, Bordetella o Brucella.

4. Una bacteria de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque es una cepa de Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Salmonella choleraesuis, Salmonella dublin, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrohoeae, Yersinia enterocolitica, Bordetella pertussis o Brucella abortus .

5. Una bacteria de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque es una cepa de E. coli enterotoxigénica (ETEC) .

6. Una bacteria de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque está atenuada adicionalmente por una mutación en un cuarto gen.

7. Una bacteria de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el cuarto gen es aroA, aroD, aroE, pur, htrA, falE, cya, crp, phoP o surA.

8. Una bacteria de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la mutación en cada gen es una mutación definida.

9. Una bacteria de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la mutación en cada gen es la deleción de la secuencia de codificación completa.

10. La bacteria de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque ha sido diseñada genéticamente para expresar un antígeno heterólogo.

11. Una bacteria de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la expresión del antígeno es impulsada por el promotor de nirB o de htrA.

12. Una vacuna, caracterizada porque comprende una bacteria como se definió en cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un portador o diluyente aceptable farmacéuticamente.

13. Una bacteria como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en un método de vacunación de un ser humano o animal.

14. Una célula de E. coli enterotoxigénica atenuada por una mutación no reversible en cada uno del gen aroC, el gen ompF y el gen ompC, para su uso en el método de vacunación de un ser humano o animal contra la diarrea.

15. El uso de una bacteria como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la fabricación de un medicamento para la vacunación de un ser humano o animal.

16. Un método para elevar una respuesta inmune en un huésped de mamífero, caracterizado porque comprende administrar al huésped una bacteria atenuada por una mutación no reversible en cada uno del gen de aroC, el gen de opmF y el gen de opmC.