DE69936514T2 - Heliomycin-kodierendes gen und seine verwendung - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung hat zur Aufgabe ein neues Peptid, genannt Heliomycin, das reich an Cysteinen ist, seine Verwendung als Medikament und Zusammensetzungen, die es enthalten, eine DNA-Sequenz, die dieses Peptid kodiert, einen Vektor zur Transformation eines Wirtsorganismus, der sie enthält, und das Verfahren zur Transformation des besagten Organismus.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere die Transformation von pflanzlichen Zellen und von Pflanzen, wobei das Heliomycin, das durch die transformierten Pflanzen hergestellt wird, ihnen eine Resistenz gegenüber Krankheiten, insbesondere von Pilz-Ursprung, verleiht.
  • Heutzutage besteht ein wachsender Bedarf daran, Pflanzen gegen Krankheiten, besonders Pilzkrankheiten, resistent zu machen, um das Zu-Hilfe-Nehmen von Behandlungen mit Erzeugnissen zum Schutz gegen Pilze zu verringern, ja sogar zu vermeiden, im Hinblick auf den Umweltschutz. Ein Mittel, um diese Resistenz gegenüber Krankheiten zu steigern besteht im Transformieren der Pflanzen in einer Weise, dass sie Substanzen herstellen, um selbst ihre Verteidigung gegen diese Krankheiten sicherzustellen.
  • Auf dem Gebiet der menschlichen Gesundheit existieren opportunistische Pilzinfektionen, für die derzeit keine wirklich wirksame Behandlung zur Verfügung steht. Insbesondere ist dies der Fall bei bestimmten schweren invasiven Mykosen, die hospitalisierte Patienten angreifen, bei denen das Immunsystem in Folge einer Transplantation, einer Chemotherapie oder einer HIV-Infektion geschwächt ist. Im Vergleich zum Arsenal an antibakteriellen Mitteln ist das derzeitige Arsenal an Anti-Pilzmitteln sehr beschränkt. Daher besteht ein wirklicher Bedarf, neue Klassen von Anti-Pilzsubstanzen zu charakterisieren und zu entwickeln.
  • Man kennt verschiedene Substanzen natürlichen Ursprungs, insbesondere Peptide, die bakterizide oder fungizide Eigenschaften aufweisen, besonders gegen die Pilze, die verantwortlich für die Krankheiten von Pflanzen sind. Jedoch besteht ein erstes Problem darin, solche Substanzen zu finden, die nicht nur durch transformierte Pflanzen hergestellt werden können, sondern auch ihre bakteriziden oder fungiziden Eigenschaften beibehalten, und sie den besagten Pflanzen verleihen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter bakterizid oder fungizid bakterizide oder fungizide Eigenschaften im engeren Sinne sowie bakteriostatische oder fungistatische Eigenschaften.
  • Es sind gleichermaßen Peptide bekannt, die reich an Cysteinen sind, welche bakterizide oder bakteriostatische Aktivitäten aufweisen, aber die keine fungizide oder fungistatische Aktivität aufweisen. Ein anderes Problem besteht darin, ein Peptid zu finden, das reich an Cysteinen ist, das eine starke fungizide oder fungistatische Aktivität im Vergleich mit Peptiden des Stands der Technik aufweist.
  • FR2695392 zeigt das Vorhandensein von Defensinen, isoliert aus Insektenlarven, mit antibakterieller Aktivität. Es wird keine Anti-Pilz-Aktivität gezeigt, noch wird sie in der Beschreibung in Betracht gezogen.
  • WO 90/11770 beschreibt Defensine isoliert aus Säugern, mit Anti-Pilz- und antibakterieller Aktivität. Diese Defensine sind daher strukturell deutlich verschieden von den erfindungsgemäßen Molekülen.
  • In der Tat ist Hoffmann et al. (Immunol. Today, 1992, 13, 10, 411-5) ein Übersichtsartikel, der eine Bilanz des Standes der Technik zieht, und klar angibt, dass die Defensine von Insekten anti-bakterielle Aktivitäten im Wesentlichen gegen Gram-positive Bakterien, zu einem geringeren Grad gegen Gram-negative, besitzen, wobei sie sich stark von den Säugerdefensinen unterscheiden, insbesondere unter dem Gesichtspunkt der Struktur, gemeinsamer Vorfahren oder Lokalisation. Dieses Dokument zeigt gleichermaßen, dass es nicht möglich war, eine Anti-Pilzaktivität für Defensine aus Insekten nachzuweisen, im Gegensatz zu Säugerdefensinen.
  • Das Heliomycin ist ein Peptid, das ausgehend von der Hämolymphe der Lepidoptere Heliothis virescens, das eine fungizide Aktivität gegen die Pilze aufweist, die für Pflanzenkrankheiten verantwortlich sind, und gegen die Pilze, die für Menschen und Tiere pathologisch sind. Nachdem zunächst das Gen von Heliomycin synthetisiert worden war, wurde gleichermaßen gefunden, dass es in einen Wirtsorganismus, wie eine Hefe oder eine Pflanze, insertiert werden konnte, um Heliomycin zu exprimieren und sowohl Heliomycin gereinigt oder nicht herzustellen, als auch dem besagten Wirtsorganismus Eigenschaften von Resistenz gegenüber Pilzkrankheiten zu verleihen, was eine besonders vorteilhafte Lösung der vorstehend aufgezählten Probleme bringt.
  • Die Erfindung hat somit zunächst Heliomycin zur Aufgabe, seine Verwendung als Medikament oder in der Agrochemie zum Schutz von Pflanzen, Zusammensetzungen, die es umfassen, ein Nukleinsäurefragment, das Heliomycin kodiert, ein chimäres Gen, dass das besagte Fragment umfasst, das Heliomycin kodiert, sowie heterologe Regulationselemente in 5' und 3' Position, die in einem Wirtsorganismus, insbesondere in Hefen oder Pflanzen, funktionieren können, und ein Vektor zur Transformation von Wirtsorganismen, die dieses chimäre Gen enthalten, und der transformierte Wirtsorganismus. Sie betrifft auch eine pflanzliche transformierte Zelle, die mindestens ein Nukleinsäurefragment enthält, das Heliomycin kodiert, und eine gegenüber Krankheiten resistente Pflanze, die die besagte Zelle enthält, insbesondere aus dieser Zelle regeneriert wurde. Sie betrifft schließlich ein Verfahren zur Transformation von Pflanzen, um sie gegenüber Krankheiten resistent zu machen, indem ein Gen, das Heliomycin kodiert, mittels eines geeigneten Vektors insertiert wird. Sie betrifft schließlich ein Verfahren zur Herstellung von Heliomycin durch transformierte Wirtsorganismen.
  • Unter Heliomycin wird erfindungsgemäß jedes Peptid verstanden, das im Wesentlichen die Peptidsequenz der nachstehenden Formel (I) umfasst, Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag (I)in der:
    Xaa ist -NA2 oder ein Peptidrest umfassend 1 bis 10 Aminosäuren, bevorzugt 1 bis 6 Aminosäuren, umfassend mindestens eine basische Aminosäure, der die nachstehende Peptidsequenz Xaa'-Gly-Xaa''- darstellt, in der Xaa' NH2 oder einen Peptidrest umfassend 1 bis 9 Aminosäuren, bevorzugt 1 bis 5 Aminosäuren darstellt, und Xaa'' einen Peptidrest umfassend mindestens eine Aminosäure, bevorzugt ausgewählt aus Leu, Ile, Val, Pro, Ser oder Thr darstellt.
    Xab ist ein Peptidrest, umfassend 1 bis 10 Aminosäuren, bevorzugt 10,
    Xac ist ein Peptidrest von 3 Aminosäuren, umfassend mindestens eine saure Aminosäure,
    Xad die nachstehende Peptidsequenz -Lys-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Gly-His- darstellt,
    Xae die nachstehende Peptidsequenz -Gly-Xae'-Asn- darstellt, in der Xae' einen Peptidrest umfassend 5 Aminosäuren darstellt,
    Xaf ein Tryptophan ist, und
    Xag-OH oder ein Peptidrest umfassend von 1 bis 2 Aminosäuren ist.
  • Unter basischen Aminosäuren versteht man erfindungsgemäß insbesondere die Aminosäuren ausgewählt aus Lysin, Arginin oder Homoarginin.
  • Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, umfasst Xac exakt eine Aminosäure.
  • Vorteilhafterweise stellt Xac die nachstehende Peptidsequenz -Asn-Xac'-Xac''- dar, in der Xac' einen Peptidrest von einer Aminosäure darstellt, und Xac" einen Peptidrest von einer Aminosäure darstellt. Unter saurer Aminosäure versteht man erfindungsgemäß jede Aminosäure, die an einer Seitenkette eine saure organische Funktion umfasst, insbesondere Carbonsäure, vorzugsweise ausgewählt aus Glutaminsäure (Glu) oder Asparaginsäure (Asp).
  • In einer bevorzugten Weise stellt Xac die nachstehende Peptidsequenz -Asn-Gly-Glu- oder -Ala-Ala-Glu- dar.
  • In vorteilhafter Weise
    stellt Xaa die nachstehende Peptidsequenz Xaa'-Gly-Xaa'' dar, in der Xaa' NH2 oder einen Peptidrest umfassend 1 bis 9 Aminosäuren, bevorzugt 1 bis 5 Aminosäuren darstellt und Xaa'' einen Peptidrest umfassend mindestens eine Aminosäure, vorzugsweise ausgewählt aus Leu, Ile, Val, Pro, Ser oder Thr darstellt, und/oder
    Xab die nachstehende Peptidsequenz -Val-Xab'-Asp- darstellt, in der Xab' einen Peptidrest umfassend von 0 bis 8 Aminosäuren, bevorzugt 8, darstellt und/oder
    Xae die nachstehende Peptidsequenz -Gly-Xae'-Asn- darstellt, in der Xae' einen Peptidrest umfassend 5 Aminosäuren darstellt, und/oder
    Xaf ein Tryptophan ist und/oder
    Xag die nachstehende Peptidsequenz -Glu-Xag' darstellt, in der Xag' OH oder einen Rest umfassend eine Aminosäure darstellt.
  • Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt Xaa die nachstehende Peptidsequenz NH2-Asp-Lys-Leu-Ile-Gly-Ser- oder NH2-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ser- dar, und/oder Xab stellt die nachstehende Peptidsequenz -Val-Trp-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Thr-Ser-Asp- dar, und/oder Xae stellt die nachstehende Peptidsequenz -Gly-Ser-Phe-Ala-Asn-Val-Asn- dar, und/oder Xaf stellt die nachstehende Aminosäure -Trp- dar, und/oder Xag stellt die nachstehende Peptidsequenz -Glu-Thr-OH oder Arg-Thr-OH dar.
  • Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Heliomycin das Peptid, das mit seiner kodierenden Sequenz durch den Identifikator der Sequenz Nr. 2 (SEQ ID NO 2) dargestellt wird. Dieselbe Sequenz wird entsprechend den Aminosäuren 6 bis 59 des Identifikators der Sequenz Nr. 1 (SEQ ID NO 1) mit einer davon verschiedenen kodierenden Sequenz beschrieben.
  • Der terminale Rest NH2 kann eine posttranslationale Modifikation aufweisen, z.B. eine Acetylierung, genauso wie der C-terminale Rest eine posttranslationale Modifikation aufweisen kann, z.B. eine Amidierung.
  • Unter einer Peptidsequenz umfassend im Wesentlichen die Peptidsequenz der allgemeinen Formel (I) werden nicht nur die vorstehend definierten Sequenzen verstanden, sondern gleichermaßen solche Sequenzen, die an einem oder anderen, oder an beiden ihrer Enden Peptidreste umfassen, die notwendig zu ihrer Expression und zum Screenen in einem Wirtsorganismus sind. Unter Wirtsorganismus wird jeder Organismus verstanden, der mindestens eine Zelle umfasst, wobei es sich um Mikroorganismen, insbesondere eine Hefe oder eine Bakterie, oder außerdem um pflanzliche Zellen oder außerdem um höhere Organismen wie Pflanzen handeln kann.
  • Insbesondere handelt es sich um ein Fusionspeptid „Peptid-Heliomycin", bei dem das Abspalten durch die enzymatischen Systeme des Wirtsorganismus die Freisetzung des Heliomycins erlaubt, wobei das Heliomycin vorstehend definiert ist. Das an das Heliomycin fusionierte Peptid kann ein Signalpeptid oder ein Transitpeptid sein, das es erlaubt, die Herstellung des Heliomycins in einer speziellen Weise in einem Teil des Wirtsorganismus zu kontrollieren und auszurichten, wie z.B. dem Cytoplasma, der Zellmembran, oder im Fall von Pflanzen in einer speziellen Art von zellulären Kompartimenten oder von Geweben, oder in der extrazellulären Matrix.
  • Gemäß einer Ausführungsform kann das Transitpeptid ein Signal für die Adressierung in Chloroplasten oder Mitochondrien sein, welches anschließend in den Chloroplasten oder Mitochondrien gespalten wird.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Signalpeptid ein N-terminales Signal oder „Präpeptid" sein, möglicherweise in Verbindung mit einem Signal, das für das Zurückhalten des Proteins im endoplasmatischen Retikulum verantwortlich ist, oder ein Peptid zum Adressieren in die Vakuole oder „Propeptid". Das endoplasmatische Retikulum ist der Ort, wo Vorgänge zur Reifung des hergestellten Proteins durch die „zelluläre Maschinerie" übernommen werden, wie z.B. die Spaltung des Signalpeptids.
  • Die Transitpeptide können entweder einfach oder doppelt sein, und in diesem Fall möglicherweise getrennt durch eine intermediäre Sequenz, d.h. sie umfassen, in der Richtung der Transkription, eine Sequenz, die ein Transitpeptid eines pflanzlichen Gens kodiert, welches ein Enzym zur Lokalisation in die Plastiden kodiert, einen Teil der Sequenz des reifen N-terminalen Teils eines pflanzlichen Gens, das ein Enzym zur Lokalisation in die Plastiden kodiert, und weiter eine Sequenz, die ein zweites Transitpeptid eines pflanzlichen Gens kodiert, das ein Enzym zur Lokalisation in die Plastiden kodiert, wie in der Anmeldung EP 508 909 beschrieben.
  • Als nützliches erfindungsgemäßes Transitpeptid wird insbesondere das Signalpeptid des Gens PR-1α aus Tabak zitiert, beschrieben durch Cornelissen & Kollegen, gezeigt mit seiner kodierenden Sequenz durch den Identifikator der Sequenz Nr. 2, insbesondere wenn das Heliomycin durch pflanzliche Zellen oder Pflanzen hergestellt wird, oder der Vorläufer des Faktors Mat α1, wenn das Heliomycin durch Hefen hergestellt wird.
  • Das Fusionspeptid „MFα1/Heliomycin" mit den fünf Resten des Propeptids des Faktors MFα1 (Ser-Leu-Asp-Lys-Arg), die in einer N-terminalen Position gelegen sind, und seine kodierende Sequenz sind ein Teil der vorliegenden Erfindung, insbesondere beschrieben durch den Identifikator der Sequenz Nr. 1 (SEQ ID NO 1), entsprechend den Aminosäuren 1 bis 49.
  • Das Fusionspeptid „Signalpeptid PR-1α-Heliomycin" und seine kodierende Sequenz sind gleichermaßen ein Teil der vorliegenden Erfindung, insbesondere beschrieben durch den Identifikator der Sequenz Nr. 3 (SEQ ID NO 3).
  • Das Fusionspeptid, das das Signalpeptid des PG1-Gens der Polygalakturonase aus Mais, fusioniert an das Heliomycin, umfasst, „Signalpeptid PG1/Heliomycin", wird mit seiner kodierenden Sequenz durch die Identifikatoren der Sequenzen Nr. 18 und 20 (SEQ ID NO 18 und SEQ ID NO 20) dargestellt.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bilden die Cysteinreste des Peptids der Formel (I) mindestens eine intramolekulare Disulfidbrücke, bevorzugt drei Disulfidbrücken. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Disulfidbrücken zwischen Cysteinresten 1 und 4, 2 und 5, und 3 und 6 gebildet.
  • Das Heliomycin ist ein besonders wirksames Peptid gegen Pilze und gegen Hefen, und kann in dieser Eigenschaft zur Vorsorge oder zum Heilen verwendet werden, um verschiedene Organismen gegen Pilzbefall zu schützen. Die vorliegende Erfindung betrifft daher Heliomycin als Medikament. Sie betrifft gleichermaßen die Verwendung von Heliomycin zum Behandeln von Pflanzen gegen Pilzbefall, indem das Heliomycin direkt auf den besagten Pflanzen angewendet wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen eine Zusammensetzung umfassend Heliomycin und ein geeignetes Vehikel. Das geeignete Vehikel besitzt die erste Eigenschaft, Heliomycin in der Zusammensetzung in keiner wesentlichen Weise abzubauen, und die bakteriziden und fungiziden Eigenschaften des Heliomycins nicht zu verringern. Diese Zusammensetzung kann eine kosmetische Zusammensetzung sein, und in diesem Fall ist das geeignete Vehikel kosmetisch verträglich (darüber hinaus für eine Anwendung auf der Haut oder Hautabkömmlingen („phanères") angepasst), oder eine pharmazeutische Zusammensetzung für eine therapeutische Verwendung, und in diesem Fall ist das geeignete Vehikel pharmazeutisch verträglich, geeignet für eine Verabreichung des Heliomycins auf dem topischem Weg, durch Einnahme oder durch Injektion, oder weiter eine agrochemische Zusammensetzung, und in diesem Fall ist das geeignete Vehikel agrochemisch verträglich, geeignet für eine Anwendung auf den Pflanzen oder in der Nähe der Pflanzen, ohne sie zu beschädigen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen ein natürliches oder synthetisches Nukleinsäurefragment, insbesondere aus DNA, welches das vorstehende definierte Heliomycin, darin eingeschlossen das vorstehend definierte Fusionspeptid „Peptid-Heliomycin", kodiert. Es kann sich erfindungsgemäß um ein synthetisiertes oder ein aus der Lepidoptere Heliothis isoliertes Fragment handeln, oder weiter um ein abgeleitetes Fragment, das für die Expression des Heliomycins im Wirtsorganismus, wo das Peptid exprimiert wird, angepasst ist. Das Nukleinsäurefragment kann gemäß Standardverfahren der Isolierung und Reinigung erhalten werden, oder weiter durch Synthese gemäß üblicher Techniken aufeinander folgender Hybridisierungen von synthetischen Oligonukleotiden. Diese Techniken sind insbesondere durch Ausubel et al. beschrieben.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird unter „Nukleinsäurefragment" eine Nukleotidsequenz verstanden, die vom DNA- oder RNA-Typ sein kann, bevorzugt vom DNA-Typ, insbesondere doppelsträngig.
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Nukleinsäurefragment, das Heliomycin kodiert, die DNA-Sequenz beschrieben durch die Basen 16 bis 147 des Identifikators der Sequenz Nr. 1 (SEQ ID NO 1) oder durch den Identifikator des Sequenz Nr. 2 (SEQ ID NO 2), insbesondere den kodierenden Teil dieser Sequenz, der den Basen 1 bis 132, einer homologen Sequenz, oder einer komplementären Sequenz der besagten Sequenz entspricht.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das Nukleinsäurefragment, das das Fusionspeptid „Peptid-Heliomycin" kodiert, die DNA-Sequenz, die durch den Identifikator der Sequenz Nr. 1 (SEQ ID NO 1) beschrieben wird, oder die, die durch den Identifikator der Sequenz Nr. 3 (SEQ ID NO 3) beschrieben wird, insbesondere der kodierende Teil, der den Basen 3 bis 224 entspricht, oder der, der durch den Identifikator der Sequenz Nr. 18 (SEQ ID NO 18) beschrieben wird, insbesondere der kodierende Teil, der den Basen 7 bis 205 entspricht, einer homologen Sequenz, oder einer komplementären Sequenz zu den besagten Sequenzen sind.
  • Unter „homolog" versteht man erfindungsgemäß ein Nukleinsäurefragment, das eine oder mehrere Modifikationen der Sequenz im Vergleich zur Nukleotidsequenz, die durch die Identifikatoren der Sequenzen Nr. 1, 2 oder 3 beschrieben wird, und die Heliomycin oder das Fusionspeptid „Peptid-Heliomycin" kodiert, aufweist. Diese Modifikationen können gemäß üblicher Mutationstechniken erhalten werden, oder weiter indem die synthetischen Oligonukleotide, die in der Herstellung der besagten Sequenz durch Hybridisierung verwendet werden, ausgewählt werden. Im Hinblick auf die vielfachen Kombinationen von Nukleinsäuren, die zur Expression derselben Aminosäure führen können, können die Unterschiede zwischen der Referenzsequenz, die durch die Identifikatoren der Sequenzen Nr. 1, 2 und 3 beschrieben wird, und dem entsprechenden Homologen bedeutsam sein, umso mehr, wenn es sich um DNA-Fragmente von geringer Größe handelt, die durch chemische Synthese darstellbar sind. Vorteilhafterweise wird der Grad an Homologie mindestens 70 % im Vergleich mit der Referenzsequenz, bevorzugt mindestens 80 %, weiter bevorzugt mindestens 90 % betragen. Diese Modifikationen sind im Allgemeinen neutral, d.h., sie betreffen nicht die Primärsequenz des resultierenden Heliomycins oder des Fusionspeptids.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen ein chimäres Gen (oder Expressionskassette), umfassend eine kodierende Sequenz sowie heterologe Regulationselemente in 5'- und 3'-Position, die in einem Wirtsorganismus funktionieren können, insbesondere in pflanzlichen Zellen oder Pflanzen, wobei die kodierende Sequenz mindestens ein DNA-Fragment umfasst, das Heliomycin oder das Fusionspeptid „Peptid-Heliomycin" wie die vorstehend definierten kodiert.
  • Unter Wirtsorganismus wird jeder ein- oder mehrzellige Organismus verstanden, ein niederer oder höherer, in dem das erfindungsgemäße chimäre Gen zur Herstellung von Heliomycin eingeführt werden kann. Es handelt sich insbesondere um Bakterien, z.B. E. coli, Hefen, insbesondere der Gattungen Saccharomyces oder Kluyveromyces, Pichia, um Pilze, insbesondere Aspergillus, um einen Baculovirus, oder bevorzugt um pflanzliche Zellen und Pflanzen.
  • Unter „pflanzlicher Zelle" wird erfindungsgemäß jede aus einer Pflanze hervorgeganene Zelle verstanden, die undifferenzierte Gewebe wie Kallus, differenzierte Gewebe wie solche der Embryonen, der Teile von Pflanzen, der Pflanzen, oder der Samen darstellen kann.
  • Unter „Pflanze" gemäß der Erfindung wird jeder multizelluläre differenzierte Organismus verstanden, der zur Photosynthese fähig ist, insbesondere Monokotyledonen oder Dikotyledonen, insbesondere Kulturpflanzen, die zur tierischen oder menschlichen Ernährung bestimmt sind oder nicht, wie Mais, Weizen, Raps, Soja, Reis, Zuckerrohr, Rübe, Tabak, Baumwolle etc.
  • Die Regulationselemente, die zur Expression des DNA-Fragments, das Heliomycin kodiert, nötig sind, sind entsprechend dem Wirtsorganismus dem Fachmann gut bekannt. Sie umfassen insbesondere Promotorsequenzen, Transkriptionsaktivatoren, Terminatorsequenzen, darin eingeschlossen Start- und Stopp-Codons. Die Mittel und Verfahren, um die Regulationselemente zu identifizieren und auszuwählen, sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Zur Transformation von Mikroorganismen wie Hefen oder Bakterien sind die Regulationselemente dem Fachmann gut bekannt, und umfassen insbesondere Promotorsequenzen, Transkriptionsaktivatoren, Transitpeptide, Terminatorsequenzen und Start- und Stopp-Codons.
  • Um die Expression und die Sekretion des Peptids in das Kulturmedium der Hefe zu richten, wird ein DNA-Fragment, das Heliomycin kodiert, in einen Übertragungsvektor integriert, der die folgenden Elemente umfasst:
    • – Marker, die es erlauben, die Transformanten auszuwählen. Vorzugsweise wird das Gen ura-3 für Hefe und das Ampicillinresistenzgen für E. coli verwendet,
    • – eine Nukleinsequenz, die die Replikation des Plasmids in der Hefe erlaubt (Replikationsursprung). Vorzugsweise wird der Replikationsursprung des Plasmids 2μ aus Hefe verwendet,
    • – eine Nukleinsequenz, die die Replikation des Plasmids in E. coli erlaubt (Replikationsursprung),
    • – eine Expressionskassette, gebildet aus (1) einer Promotorregulationssequenz. Jede Promotorsequenz eines Gens, das natürlicherweise in der Hefe exprimiert wird, kann verwendet werden. Bevorzugt wird der Promotor des Gens Mfα 1 aus S. cerevisiae verwendet. (2) einer Sequenz, die ein Signalpeptid (Präpeptid) kodiert, in Verbindung mit einem Peptid zur Adressierung (oder Propeptid). Diese Regionen sind wichtig für die korrekte Sekretion des Peptids. Vorzugsweise wird die Sequenz verwendet, die das Prä-Pro-Peptid des Vorläufers des Faktors Mfα 1 kodiert. (3) einer Regulationssequenz eines Terminators oder der Polyadenylierung, Vorzugsweise wird der Terminator der Phosphoglyceratkinase (PGK) aus S. cerevisiae verwendet. In der Expressionskassette wird die für Heliomycin kodierende Sequenz stromabwärts der Prä-Pro-Sequenz und stromaufwärts des Terminators der PGK insertiert.
  • Diese Elemente wurden in mehreren Veröffentlichungen beschrieben, darunter Reichhart et al., 1992, Invert. Reprod. Dev., 21, S. 15-24 und Michaut et al., 1996, FERS Letters, 395, S. 6-10.
  • Bevorzugterweise werden die Hefen der Art S. cerevisiae mit dem Expressionsplasmid durch das Lithiumacetatverfahren (Ito et al., 1993, J. Bacteriol. 153, S. 163-168) transformiert. Die transformierten Hefen werden auf einem Agar-Selektionsmedium, das kein Uracil enthält, selektioniert. Die Massenproduktion von transformierten Hefen wird durch Kultur während 24 h bis 48 h in einem flüssigen Selektionsmedium ausgeführt.
  • Die Transformation der Mikroorganismen erlaubt es, Heliomycin in größerem Maßstab herzustellen. Die vorliegende Erfindung betrifft daher gleichermaßen ein Verfahren zur Herstellung von Heliomycin umfassend die Schritte der Kultur eines transformierten Mikrooganismus, umfassend ein Gen wie vorstehend beschrieben, das Heliomycin kodiert, in einem geeigneten Kulturmedium, anschließend die Extraktion und die vollständige oder teilweise Reinigung des erhaltenen Heliomycins.
  • Bevorzugterweise werden bei der Extraktion des Heliomycins, das durch die Hefen hergestellt wird, die Hefen durch Zentrifugation beseitigt, und der Kulturüberstand wird mit einer sauren Lösung in Kontakt gebracht, die eine Lösung einer Mineralsäure oder organischen Säure wie z.B. Salzsäure oder Essigsäure sein kann. Der erhaltene Extrakt wird anschließend unter Kühlung bei einer Geschwindigkeit von 4.000 bis 10.000 Upm bei 4 °C 30 bis 60 min lang zentrifugiert.
  • Der Reinigung des Heliomycins kann ein Fraktionierungsschritt des im Anschluss an den Extraktionsschritt erhaltenen Überstands vorangehen. Bevorzugterweise wird das Extrakt im Laufe des Fraktionierungsschrittes auf eine inverse Phase aufgetragen, um eine Fest phasenextraktion auszuführen. Das Waschen der wasserlöslichen Moleküle wird mit einer verdünnten Säurelösung, und die Flution der hydrophoben Moleküle mit einem geeigneten Eluenten durchgeführt. Es werden gute Ergebnisse mit Trifluoressigsäure zum Waschen erhalten, und einem Eluenten, der ansteigende Mengen an Acetonitril in einer verdünnten Säurelösung enthält.
  • Bevorzugterweise wird die Reinigung des Heliomycins zweimal ausgeführt: Eine HPLC mit Kationenaustauscher, gefolgt von einer Reverse-Phase HPLC mit einem geeigneten Eluenten, der verschieden zu oder identisch mit dem der vorangehenden Phase sein kann. Die verschiedenen Reinigungsschritte werden von einem Test der Hemmung des Pilzwachstums in flüssigem Medium gefolgt. Vorzugsweise wird der Test mit dem Pilz Neurospora crassa ausgeführt.
  • Die Heliomycinsequenz, die durch die transformierten Hefen hergestellt wird, wird gemäß dem Sequenzierungsverfahren des Edman-Abbaus und durch Massenspektrometrie analysiert. Die strukturelle Charakterisierung wird direkt am hergestellten Peptid, am durch Reduktion/Alkylierung modifizierten Peptid sowie an Peptidfragmenten ausgeführt. Die Peptidsequenz und die molekulare Masse des hergestellten Heliomycins werden mit denen des nativen Heliomycins, das aus der Hämolymphe von H. virescens extrahiert wird, verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass die zwei Moleküle die gleiche Primärstruktur aufweisen. Die Bestimmung der Position der Disulfidbrücken zeigt, dass die Anordnung der Disulfidbrücken in beiden Peptiden, dem nativen und dem durch den transformierten Mikroorganismus hergestellten, identisch ist.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere die Transformation von Pflanzen. Als Promotor/-Regulationssequenz in Pflanzen kann jede Promotorsequenz eines Gens, das natürlicherweise in Pflanzen exprimiert wird, verwendet werden, insbesondere ein Promotor bakteriellen, viralen oder pflanzlichen Ursprungs, wie z.B. der eines Gens der kleinen Untereinheit der Ribulose-Biscarboxylase/Oxigenase (RuBisCO) oder eines Genes eines Pflanzenvirus, wie z.B. der des Blumenkohl-Mosaikvirus (CAMV 19S oder 35S) oder ein Promotor, der durch Pathogene, wie das PR-1a aus Tabak induzierbar ist, wobei jeder geeignete bekannte Promotor verwendet werden kann. Bevorzugt wird eine Promotor-Regulationssequenz zu Hilfe genommen, die die Überexpression der kodierenden Sequenz in einer konstitutiven Weise oder einer durch den Angriff eines Pathogens induzierten Weise begünstigt, wie z.B. eine solche, die mindestens einen Histonpromotor, wie in der Anmeldung EP 0 507 698 beschrieben, umfasst.
  • Erfindungsgemäß können gleichermaßen im Zusammenhang mit der Promotor-Regulationssequenz andere Regulationssequenzen verwendet werden, die zwischen dem Promotor und der kodierenden Sequenz gelegen sind, wie Transkriptionsaktivatoren („Enhancer"), wie z.B. der Translationsaktivator des Tabak-Mosaikvirus (TMV), der in der Anmeldung WO 87/07644 beschrieben wird, oder dem Tabakätzvirus (TEV), beschrieben durch Carrington & Freed.
  • Als Terminator- oder Polyadenylierungs-Regulationssequenz kann jede Sequenz, die einem bakteriellem Ursprung entspricht, verwendet werden, wie z.B: der Terminator nos aus Agrobacterium tumefaciens, oder weiter pflanzlichen Ursprungs, wie z.B. ein Histonterminator wie in der Anmeldung EP 0 633 317 beschrieben.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das chimäre Gen gleichermaßen mit einem Selektionsmarker verbunden sein, der an den transformierten Wirtsorganismus angepasst ist. Solche Selektionsmarker sind dem Fachmann gut bekannt. Es kann sich um ein Resistenzgen gegenüber Antibiotika handeln, oder weiter um ein Gen für Toleranz gegenüber Herbiziden für Pflanzen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen einen Klonierungs- oder Expressionsvektor für die Transformation eines Wirtsorganimus, enthaltend mindestens ein chimäres Gen wie vorstehend definiert. Dieser Vektor umfasst außer dem vorstehenden chimären Gen mindestens einen Replikationsursprung. Dieser Vektor kann aus einem Plasmid, einem Cosmid, einem Bakteriophagen oder einem Virus bestehen, transformiert durch das Einführen des erfindungsgemäßen chimären Gens. Solche Transformationsvektoren im Zusammenhang mit dem zu transformierenden Wirtsorganismus sind dem Fachmann gut bekannt und weitreichend in der Literatur beschrieben.
  • Zur Transformation von pflanzlichen Zellen oder Pflanzen wird es sich besonders um einen Virus handeln, der zur Transformation von entwickelten Pflanzen eingesetzt werden kann, und der außerdem seine eigenen Replikations- und Expressionselemente enthält. Bevorzugterweise ist der erfindungsgemäße Transformationsvektor der pflanzlichen Zellen oder Pflanzen ein Plasmid.
  • Die Erfindung hat auch zur Aufgabe ein Verfahren zur Transformation von Wirtsorganismen, insbesondere von pflanzlichen Zellen, durch Integration mindestens eines Nukleinsäurefragments oder eines chimären Gens, wie die vorstehend beschriebenen, durch Transformation, die durch jegliches geeignete bekannte Mittel, weitreichend in der Spezialliteratur und besonders in den in der vorliegenden Anmeldung zitierten Referenzen beschrieben, erhalten werden kann, insbesondere durch den erfindungsgemäßen Vektor.
  • Eine Reihe von Verfahren besteht aus dem Beschießen von Zellen, von Protoplasten oder Geweben mit Partikeln, an die DNA-Sequenzen gekoppelt sind. Eine andere Reihe von Verfahren besteht im Verwenden eines chimären Gens, das in ein Ti-Plasmid aus Agrobacterium tumefaciens oder ein Ri-Plasmid aus Agrobacterium rhizogenes insertiert ist, als Mittel zum Transfer in die Pflanze.
  • Andere Verfahren können verwendet werden, wie die Mikroinjektion oder die Elektroporation, oder weiter die direkte Fällung mittels PEG.
  • Der Fachmann wird das geeignete Verfahren entsprechend der Natur des Wirtsorganismus, insbesondere der pflanzlichen Zelle oder der Pflanze, auswählen.
  • Die vorliegende Erfindung hat weiter zur Aufgabe Wirtsorganismen, insbesondere pflanzliche Zellen oder Pflanzen, die transformiert sind und ein wirksame Menge eines chimären Gens enthalten, das eine für das vorstehend definierte Heliomycin kodierende Sequenz umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung hat auch Pflanzen zur Aufgabe, die transformierte Zellen enthalten, insbesondere Pflanzen, die aus transformierten Zellen regeneriert werden. Die Regeneration wird durch jedes geeignete Verfahren erhalten, das von der Natur der Art abhängt, wie z.B. in den vorstehenden Referenzen beschrieben.
  • Für Verfahren zur Transformation von pflanzlichen Zellen und zur Regeneration der Pflanzen werden insbesondere die folgenden Patente und Patentanmeldungen zitiert: US 4,459,355 , US 4,536,475 , US 5,464,763 , US 5,177,010 , US 5,187,073 , EP 267 159 , EP 604 662 , EP672 752 , US 4,945,050 , US 5,036,006 , US 5,100,792 , US 5,371,014 , US 5,478,744 , US 5,179,022 , US 5,565,346 , US 5,484,956 , US 5,508,468 , US 5,538,877 , US 5,554,798 , US 5,489,520 , US 5,510,318 , US 5,204,253 , US 5,405,765 , EP 442 174 , EP 486 233 , EP 486 234 , EP 539 563 , EP 674 725 , WO 91/02071 und WO 95/06128 .
  • Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen transformierte Pflanzen, die aus der Kultivierung und/oder der Kreuzung der vorstehenden regenerierten Pflanzen abgeleitet sind sowie die Samen der transformierten Pflanzen, enthaltend die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und chimären Gene.
  • Die so transformierten Pflanzen sind bestimmten Krankheiten gegenüber widerstandsfähig, insbesondere gegenüber bestimmten Pilz- oder bakteriellen Krankheiten. Durch diese Tatsache kann die DNA-Sequenz, die Heliomycin kodiert, integriert werden, um zum Hauptziel die Ausführung von Pflanzen zu haben, die gegenüber den besagten Krankheiten resistent sind, wobei das Heliomycin wirksam gegen pilzliche Krankheiten, wie die verursacht durch Cercospora, insbesondere Cercospora beticola, Cladosporium, insbesondere Cladosporum herbarum, Fusarium, insbesondere Fusarium culmorum oder Fusarium graminearum, oder durch Phytophtora, insbesondere Phytophtora cinnamomi ist.
  • Das chimäre Gen kann gleichermaßen und vorteilhafterweise mindestens einen Selektionsmarker umfassen, wie ein oder mehrere Gene für eine Toleranz gegenüber Herbiziden.
  • Die Heliomycin kodierende DNA-Sequenz kann gleichermaßen als Selektionsmarker bei der Transformation der Pflanzen mit anderen Sequenzen integriert werden, die andere Peptide oder Proteine von Interesse kodieren, wie z.B. Gene für eine Toleranz gegenüber Herbiziden.
  • Solche Toleranzgene gegenüber Herbiziden sind dem Fachmann gut bekannt und insbesondere in den Patentanmeldungen EP 115 673 , WO 87/04181 , EP 337 899 , WO 96/38567 oder WO 97/04103 beschrieben.
  • Es wird verstanden, dass die erfindungsgemäßen transformierten Zellen und Pflanzen außer der das Heliomycin kodierenden Sequenz andere heterologe Sequenzen umfassen können, die Proteine von Interesse kodieren, wie andere komplementäre Peptide, die geeignet sind, der Pflanze Resistenzen gegenüber anderen Krankheiten von bakteriellem oder Pilz-Ursprung zu übertragen, und/oder andere Sequenzen, die Proteine für eine Toleranz gegenüber Herbiziden kodieren, und/oder andere Sequenzen, die Proteine für eine Resistenz gegenüber Insekten, wie insbesondere die Bt-Proteine, kodieren.
  • Die anderen Sequenzen können mittels desselben Vektors integriert werden, der ein chimäres Gen umfasst, welches eine erste Sequenz, die Heliomycin kodiert, und mindestens eine andere Sequenz, die ein anderes Peptid oder Protein von Interesse kodiert, umfasst.
  • Sie können gleichermaßen mittels eine anderen Vektors integriert werden, der mindestens die besagte andere Sequenz umfasst, gemäß gebräuchlicher vorstehend definierter Techniken.
  • Die erfindungsgemäßen Pflanzen können weiter durch Kreuzung der Eltern erhalten werden, wobei einer das erfindungsgemäße Gen, das Heliomycin kodiert, trägt, und wobei der andere ein Gen, das mindestens ein anderes Peptid oder Protein von Interesse kodiert, trägt.
  • Unter den Sequenzen, die andere Anti-Pilzpeptide kodieren, wird die zitiert, die Drosomycin kodiert, beschrieben in der Patentanmeldung FR 2 725 992 und durch Fehlbaum & Kollegen (1994) und in der nicht publizierten Patentanmeldung FR 97 09115 , eingereicht am 24 Juli 1997, oder die, die Androctonin kodiert, beschrieben in der Patentanmeldung FR 2 745 004 und in der nicht publizierten Patentanmeldung FR 97 10362 , eingereicht am 20. August 1997.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zum Kultivieren von erfindungsgemäßen transformierten Pflanzen, wobei das Verfahren aus dem Pflanzen der Samen der besagten transformierten Pflanzen in die Oberfläche eines geeigneten Feldes zur Kultivierung der besagten Pflanzen, aus dem Anwenden einer agro-chemischen Zusammensetzung auf die Oberfläche des besagten Feldes, ohne die besagten Samen oder die besagten transformierten Pflanzen in einer wesentlichen Weise zu beeinflussen, dann aus dem Gewinnen der kultivierten Pflanzen, sobald sie die gewünschte Reife erreicht haben, und gegebenenfalls aus dem Abtrennen der Samen von den gewonnen Pflanzen besteht.
  • Unter agro-chemischer Zusammensetzung wird erfindungsgemäß jede agro-chemische Zusammensetzung verstanden, die mindestens ein wirksames Erzeugnis mit einer der folgenden Aktivitäten umfasst: herbizid, fungizid, bakterizid, virizid oder insektizid.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahrens umfasst die agro-chemische Zusammensetzung mindestens ein wirksames Erzeugnis, das mindestens eine fungizide und/oder bakterizide Aktivität besitzt, das weiter bevorzugt eine zu der des Heliomycins, das durch die erfindungsgemäßen transformierten Pflanzen hergestellt wird, komplementäre Aktivität aufweist.
  • Unter Erzeugnis, das eine zu der des Heliomycins komplementäre Aktivität aufweist, wird gemäß der Erfindung ein Erzeugnis verstanden, das ein Spektrum an komplementärer Aktivität aufweist, d.h. ein Erzeugnis, das wirksam gegen Befall mit Kontaminationsstoffen ist (Pilze, Bakterien oder Viren), die gegenüber Heliomycin unempfindlich sind, oder weiter ein Erzeugnis, dessen Aktivitätsspektrum das des Heliomycins ganz oder teilweise wieder herstellt, und dessen Anwendungsdosis in wesentlicher Weise durch die Tatsache der Gegenwart des durch die transformierte Pflanze hergestellten Heliomycins verringert wird.
  • Die nachstehenden Beispiele erlauben es, die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, ohne jedoch ihren Schutzbereich zu limitieren.
  • Beispiel I: Isolierung und Charakterisierung von Heliomycin aus Hämolymphe, gewonnen aus immunisierten Larven der Lepidoptere H. virescens
  • Beispiel I.1: Isolierung
  • 1-1 Induktion der biologischen Synthese einer Anti-Pilzs-Sbstanz in der Hämolymphe von H. virescens
  • Reife Larven des fünften Stadiums der Lepidoptere H. virescens wurden mit Hilfe einer Nadel (30 ga) immunisiert, die vorher in ein Pellet von Gram-positiven Bakterien (M. luteus) und Gram-negativen (E. coli 1106) Bakterien getaucht wurde, zubereitet aus Kulturen, die in Luria-Bertani-Medium während 12 Sunden bei 37 °C durchgeführt wurden. Die so infizierten Tiere wurden individuell in Probengefäßen, die ein Nährmedium auf Agarbasis enthielten, 24 Stunden lang zwischen 20 °C und 23 °C aufbewahrt. Vor dem Gewinnen der Hämolymphe wurden die Larven auf Eis eingefroren.
  • 1-2 Präparation von Plasma
  • Die Hämolymphe (ungefähr 30 μl pro Larve) wurde durch Ausschneiden eines Bauchsegments gesammelt und in eisgekühlten 1,5 ml-Mikrozentrifugationsröhrchen aus Polypropylen gesammelt, die Aprotinin als Proteaseinhibitor (20 μg/ml Endkonzentration) und Phenylthioharnstoff als Inhibitor der Melanisierung (Endkonzentration 20 μM) enthielten. Die so aus den immunisierten Larven gesammelte Hämolymphe (2 ml) wurde bei 1400 g während 1 min bei 4 °C zentrifugiert, um die Hämozyten abzutrennen. Die Hämolymphe ohne die Blutzellen wurde bei –20 °C bis zu ihrer Verwendung konserviert.
  • 1-3 Ansäuern des Plasmas
  • Nach schnellem Auftauen wurde das Plasma von H. virescens mit einer 1 %igen Lösung von Trifluoressigsäure auf pH 3 angesäuert. Die Extraktion und saure Behandlung des Peptids wurde während 30 min unter leichtem Schütteln in einem Eiswasserbad ausgeführt. Das erhaltene Extrakt wurde anschließend bei 4 °C während 30 min bei 10.000 g zentrifugiert.
  • 1-4 Reinigung der Peptide
  • a) Vorreinigung durch Extraktion auf Festphase
  • Eine Menge an Hämolymphe-Extrakt äquivalent zu 2 ml wurde auf einen Träger mit inverser Phase aufgetragen, wie sie in Form von Kartuschen im Handel erhältlich ist (Sep-PakTM C18, Waters Associates), equillibriert mit angesäuertem Wasser (TFA 0,05 %). Die hydrophilen Moleküle wurden durch einfaches Waschen mit angesäuertem Wasser beseitigt. Die Flution des Peptids wurde mit einer 40 %igen Acetonitrillösung, zubereitet in 0,05 %igem TFA, durchgeführt. Die mit 40 %igem Acetonitril eluierte Fraktion wurde unter Vakuum getrocknet, mit dem Ziel, dass Acetonitril und die TFA zu beseitigen, dann wurde sie in ultrareinem sterilem Wasser rekonstituiert, bevor sei dem ersten Reinigungsschritt unterzogen wurde.
  • b) Reinigung durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) auf einer Säule mit inverser Phase.
  • – Erster Schritt:
  • Die das Peptid enthaltene Fraktion wurde durch Inverse-Phase-Chromatographie auf einer semi-präparativen Aquapor-RP-300-C8-Säule analysiert (BrownleeTM, 220 × 70 mm, 300 Å), die Flution wurde durch einen linearen Acetonitril-Gradienten von 2 bis 60 % in 0,05 % TFA während 20 min bei einer konstanten Flussrate von 1,5 ml pro min durchgeführt. Die Fraktionen wurden per Hand im Anschluss an Änderungen der Absorption bei 250 nm und 254 nm gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden unter Vakuum getrocknet, mit ultrareinem Wasser rekonstituiert und auf ihre Anti-Pilzaktivität unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Tests analysiert.
  • – Zweiter Schritt:
  • Die Anti-Pilz-Fraktion, die dem Peptid entspricht, wurde auf einer analytischen Aquapore RP-300C8-Säule mit inverser Phase (BrownleeTM, 220 × 4,6 mm, 300 Å) analysiert, unter Verwendung eines linearen biphasischen Acetonitril-Gradienten von 2 % bis 22 % für 10 min und von 22 bis 32 % für 50 min in 0,05 % TFA mit einer konstanten Flussrate von 0,8 ml/min Die Fraktionen wurden im Anschluss an eine Änderung der Absorption bei 225 nm und 254 nm von Hand gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden unter Vakuum getrocknet, mit ultrareinem Wasser rekonstituiert und auf ihre Anti-Pilzaktivität unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen analysiert.
  • – Dritter Schritt:
  • Die das Peptid enthaltende Anti-Pilzfraktion wurde bis zur Homogenität auf einer Narrowbore-Delta-PakTM-HPIC18-Säule mit inverser Phase (Waters Associates, 150 × 2,2 mm) gereinigt unter Verwendung eines linearen biphasischen Acetonitril-Gradienten von von 2 % bis 24 % während 10 min und von 24 bis 44 % während 100 min in 0,05 % TFA mit einer konstanten Flussrate von 0,25 ml/min bei einer kontrollierten Temperatur von 30 °C. Die Fraktionen wurden im Anschluss an eine Änderung der Absorption bei 225 nm von Hand gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden unter Vakuum getrocknet, mit ultrareinem gefiltertem Wasser rekonstituiert und auf ihre Anti-Pilzaktivität analysiert.
  • Beispiel I.2: Strukturelle Charakterisierung des Peptids
  • 2-1 Überprüfung der Reinheit durch Kapillarzonen-Elektrophorese
  • Die Reinheit des Anti-Pilz-Peptids wurde durch Kapillarzonen-Elektrophorese auf einem 270 HT-Modell überprüft (PEApplied Biosystems-Abteilung von Perkin Elmer). 1 nl einer Lösung mit 50 μM des gereinigten Peptids wurde mit Hilfe von Vakuum in eine Kieselsäure-Kapillare injiziert (72 cm × 50 μm) und die Analyse wurde in 20 mM Citratpuffer bei pH 2,5 durchgeführt. Die Elektrophorese wurde bei 20 kV von der Anode bis zur Kathode während 20 min bei 30 °C durchgeführt. Die Wanderung wurde bei 200 nm aufgezeichnet.
  • 2-2 Bestimmung der Anzahl von Cysteinen: Reduktion und S-Pyridylethylierung
  • Die Anzahl der Cysteinreste wurde mit dem nativen Peptid durch Reduktion und S-Pyridylethylierung bestimmt. 100 pMol des nativen Peptids wurden in 40 μl eines 0,5 M Tris/HCl-Puffers, pH 7,5, der 2 mM EDTA und 6 M Guanidiniumchlorid in Gegenwart von 2 μl Dithiotreitol 2,2 M reduziert. Das Reaktionsmedium wurde unter Stickstoffatmosphäre platziert. Nach 60 min Inkubation im Dunkeln wurden 2 μl von frisch destilliertem 4-Vinylpyridin zur Reaktion hinzugefügt, die anschließend während 10 min bei 45 °C im Dunkeln unter Stickstoffatmosphäre inkubiert wurde. Das pyridylethylierte Peptid wurde anschließend durch inverse Phase-Chromatographie unter Verwendung eines linearen Acetonitril-Gradienten in Gegenwart von 0,05 % TFA von den Bestandteilen des Reaktionsmediums getrennt.
  • 2-3 Bestimmung der Masse des nativen Peptids, des S-pyridylethylierten Peptids und der Proteolysefragmente durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight)
  • Die Messungen der Massen wurden mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometer Bruker Biflex (Bremen, Deutschland) im positiven Linear-Modus ausgeführt. Die Massenspektren wurden auf externe Weise mit einem Standardgemisch aus Peptiden mit bekannten m/z kalibriert, jeweils 2199,5 Da, 3046,4 Da und 4890,5 Da. Die verschiedenen zu analysierenden Produkte wurden auf eine feine Schicht aus Kristallen α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure abgelagert, die durch schnelle Evaporation einer gesättigten Lösung in Aceton erhalten wurde. Nach Trocknen unter leichtem Vakuum wurden die Proben mit einem Tropfen 0,1 % Trifluoressigsäure gewaschen, bevor sie in das Massenspektrometer eingeführt wurden.
  • 2-4 Sequenzierung durch Edman-Abbau
  • Eine automatische Sequenzierung durch Edman-Abbau des nativen Peptids, des S-pyridylethylierten Peptids und der verschiedenen Fragmente, die nach den verschiedenen protolytischen Spaltungen erhalten wurden, und der Nachweis der Phenylthiohydantoinderivate wurden auf einem ABI473A-Sequenziergerät (PEApplied Biosystems-Abteilung von Perkin Elmer) durchgeführt.
  • 2-5 Proteolytische Spaltungen
  • – Bestätigung der Peptidsequenz in der C-terminalen Region.
  • 200 pMol des reduzierten und S-pyridylethylierten Peptids werden in Gegenwart von 5 pMol Endoproteinase-Lys-C (Acromobacter-Protease I, spezifische Spaltung der Lysinreste der C-terminalen Seite, Takara, Otsu) gemäß den empfohlenen Bedingungen des Herstellers inkubiert (Tris HCL 10 mM pH 9 in Gegenwart von 0,01 % Tween 20). Nach Stoppen der Reaktion mit 1 % TFA wurden die Peptidfragmente durch Inverse-Phase-HPLC auf einer Säule vom Nanowbore-Delta-PakTM-HPLC18-Typ (Waters Associates, 150 × 2 mm) in einem linearen Acetonitril-Gradienten von 2 bis 60 % während 80 min in 0,05 % TFA mit einer Flussrate von 0,2 ml/min und einer konstanten Temperatur von 37 °C aufgetrennt. Die erhaltenen Fragmente wurden mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert, und das Peptid, das dem C-terminalen Fragment entspricht, wurde durch Edman-Abbau sequenziert.
  • – Bestimmung der Anordnung der Disulfidbrücken durch Proteolyse mit Thermolysin
  • Das native Peptid (8 μg) wurde während einer Stunde in Gegenwart von 4 μg Thermolysin (Boehringer Mannheim, Verhältnis Thermolysin/Peptid 1/2 an Gewicht: Gewicht) bei 37 °C in 0,1 M MES-Puffer (N-Ethylmorpholin) bei pH 7 in Gegenwart von 2 mM CaCl2 inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Ameisensäure gestoppt und die Reaktionsprodukte wurden sofort durch Inverse-Phase-Chromatographie auf einer Narrowbore-Delta-PakTM-HPLC18-Säule (Waters Associates, 150 × 2,2 mm) in einem linearen Acetonitrilgradienten von 2 bis 50 % während 100 min in 0,05 % TFA bei einer Durchflussrate von 0,2 ml/min bei 30 °C aufgetrennt, vorangegangen von einem isokratischen Schritt bei 2 % Acetonitril während 10 min. Die erhaltenen Fragmente wurden durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert und durch Edman-Abbau sequenziert.
  • Beispiel II: Expression von Heliomycin in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
  • Alle nachstehend benutzten Techniken sind Standardlabortechniken. Die ausführlichen Protokolle dieser Techniken wurden besonders in Ausubel et al. beschrieben.
  • Beispiel II-1 Zusammensetzen des synthetischen Gens
  • Das Zusammensetzen wurde ausgehend von 6 synthetischen Oligonukleotiden, die die 44 Aminosäuren des Heliomycins kodieren, vorangegangen von den 5 C-terminalen Aminosäuren der Prä-Pro-Sequenz des Faktors al (Mfa1) der Hefe, ausgeführt. Die in 1 dargestellten Oligonukleotide wurden ausgewählt, wobei auf bevorzugte durch S. cerevisiae verwendete Codons geachtet wurde.
  • Das Zusammensetzen lief in mehreren Schritten ab:
    • – Die Oligonukleotide 2 bis 5 wurden an ihren 5'-Enden durch Einwirken der Polynukleotidkinase (New England Biolabs) phosphoryliert;
    • – die Oligonukleotide 1 bis 6 wurden gemischt, auf 100 °C erhitzt und durch langsame Verminderung der Temperatur auf 25 °C während 3 Stunden hybridisiert;
    • – die hybridisierten Oligonukleotide wurden einer Behandlung durch Ligase des Bakteriophagen T4 (New England Biolabs) während 15 Stunden bei 15 °C unterzogen;
    • – Die DNA-Einheit, die aus der Hybridisierung der Oligonukleotide resultierte, gezeigt in 1, begrenzt durch die Restriktionsschnittstellen HinDIII und BglII, wurde in das Plasmid pBluescript SK+ (Stratagene), das mit den Enzymen HinDIII und BamHI verdaut wurde (BglII und BamHI sind kompatibel) insertiert.
  • Die Ligationsmischung wurde anschließend verwendet, um kompetente E. -coli-DH5α-Zellen (Stratagene) zu transformieren. Mehrere Klone wurden analysiert und sequenziert. Einer dieser Klone, der die gesuchte Sequenz aufwies, wurde pSEA1 genannt.
  • Beispiel II-2: Konstruktion des Vektors pSEA2, der die Sekretion des synthetisierten Heliomycins erlaubt.
  • Das DNA-Fragment HinDIII-SalI des Vektors pSEA1, das die Sequenz, die das Heliomycin kodiert sowie das Fragment Sphl-HinDIII des Vektors M13JM132 trägt (Michaut et al., 1996, FERS Letters, 395, S. 6-10) wurde zwischen die Restriktionsschnittstellen SphI und SalI des Plasmids pTG4812 (Michaud et al., 1996, FERS Letters, 395, S. 6-10) insertiert. Das Fragment SphI-HinDIII des Vektors M13JM132 enthält die Sequenz des Promotors des Gens MFα1 der Hefe sowie die Sequenz, die die Prä-Pro-Region des Faktors MFα1 kodiert. Im resultierenden Plasmid pSEA2 findet sich das synthetische Gen des Heliomycins daher insertiert zwischen die Prä-Pro-Sequenzen des Faktors MFα1 und den Transkriptionsterminator; diese Konstruktion muss daher das Reifen und die Sekretion des Heliomycins sicherstellen.
  • Beispiel II-3: Transformation eines Stamms von S. cerevisiae durch die DNA des Plasmids pSEA2 und Analyse der Transformanten.
  • Der Hefestamm TGY 481 (MATa, ura3-D5, his, pra1, prb1, prc1, cps1; Reichhart et al., 1992, Invert. Reprod. Dev. 21, S. 15-24) wurde durch das Plasmid pSEA2 transformiert. Die Transformanten wurden bei 29 °C auf einem YNBG-Selektionsmedium (0,67 % yeast nitrogen base, 2 % Glukose) ergänzt mit 0,5 % Kasaminosäuren, welches kein Uracil enthält, selektioniert. Nach der Transformation wurden mehrere Klone der Hefe, ausgewählt auf die Eigenschaft ura+, während 48 h bei 29 °C in 50 ml Selektionsmedium kultiviert. Nach Zentrifugation (4000 g, 30 min, 4 °C) wurde der Überstand bis pH 3,5 mit Essigsäure angesäuert, bevor er auf eine Sep-PakTM-C18-Kartusche (Waters Associates), äquilibriert mit angesäuertem Wasser (0,05 % TFA) aufgetragen wurde. Die verschiedenen auf der Kartusche zurückgehaltenen Proteine wurden durch Lösungen von 0,05 % TFA, die steigende Prozentzahlen an Acetonitril enthielten, eluiert.
  • Die Fraktion bei 40 %, die eine Anti-Pilzaktivität aufwies, wurde auf HPLC auf einer analytischen Aquapore RP-300 C8 – Inverse-Phase-Säule (BrownleeTM, 220 × 4,6 mm, 300 Å) unter Verwendung eines linearen Acetonitrilgradienten von 2 % bis 40 % während 80 min in 0,05 % TFA mit einer konstanten Flussrate von 0,8 ml/min analysiert. Die Fraktionen wurden im Anschluss an eine Veränderung der Absorption bei 225 nm und 254 nm per Hand gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden unter Vakuum getrocknet, mit ultrareinem Wasser rekonstituiert und auf ihre Anti-Pilzaktivität unter den Bedingungen in Beispiel III analysiert. Die strukturelle Charakterisierung des Peptids wurde wie in Beispiel 1.2 beschrieben ausgeführt.
  • Beispiel II-4: Herstellung von rekombinantem Heliomycin im semi-präparativen Maßstab.
  • Einer der transformierten Hefeklone, der Heliomycin exprimiert, wurde bei 29 °C während 24 h in 100 ml Selektionsmedium kultiviert. Diese Vorkultur wurde anschließend verwendet, um 41 Selektionsmedium zu inokulieren, und die Kultivierung wurde während 48 h bei 49 °C ausgeführt. Die Hefen wurden durch Zentrifugation (4000 g, 30 Min, 4 °C) beseitigt. Der Überstand wurde bis pH 3,5 mit Essigsäure angesäuert, einer zweiten Zentrifugation unterzogen (4000 g, 30 min, 4 °C), bevor er auf eine offene präparative Inverse-Phase-C18-Säule (Waters Associates, 125 Å, 6 g Phase für 500 ml Überstand), äquilibriert mit angesäuertem Wasser (0,05 %TFA), aufgetragen wurde. Die hydrophilen Moleküle wurden durch Waschen mit angesäuertem Wasser, gefolgt durch Waschen mit einer 15 %igen Acetonitrillösung zubereitet in 0,05 % TFA, beseitigt. Die Flution des Peptids wurde durch eine 40 %ige Acetonitrillösung, zubereitet in 0,05 % TFA, ausgeführt. Die Fraktion, die bei 40 % Acetonitril eluierte, wurde lyophilisiert, dann in ultrareinem sterilem Wasser rekonstituiert, bevor sie dem ersten Reinigungsschritt unterzogen wurde.
    • – Erster Reinigungsschritt durch HPLC: Die vorgereinigte Fraktion, die Heliomycin enthielt, wurde in einer Lösung von 25 mM Ammoniumacetat pH 3,4, rekonstituiert. Diese Probe wurde auf eine präparative Kationenaustauschersäule, Aquapore Cation Exchange (BrownleeTM, 250 × 10 mm), unter Verwendung eines linearen NaCl-Gradienten von 0 % bis 100 % während 90 min in 25 mM Ammoniumacetat pH 3,4, mit einer konstanten Flussrate von 2 ml/min injiziert. Die gesammelten Fraktionen wurden unter Vakuum getrocknet, mit ultrareinem Wasser rekonstituiert und auf ihre Anti-Pilzaktivität unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen analysiert.
    • – Zweiter Reinigungsschritt durch HPLC: Das Heliomycin wurde bis zur Homogenität durch Chromatographie auf einer semi-präparativen Aquapore RP-300 C8 – Inverse-Phase-Säule (BrownleeTM, 220 × 7 mm, 300 Å) unter Verwendung eines linearen Acetonitrilgradienten von 2 % bis 40 % während 80 min in 0,05 % TFA mit einer konstanten Flussrate von 2 ml/min gereinigt.
  • Beispiel III: In-vitro-Aktivitätstest: Messung der Anti-Pilzaktivität durch Mikrospektrophotometrie.
  • Diese Verfahrensweise wurde verwendet, um Anti-Pilzmoleküle im Laufe der verschiedenen Reinigungsschritte nachzuweisen, zur Bestimmung des Aktivitätsspektrums des Peptids und zur Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration (concentration minimale inhibitrice, CMI), bei der das Peptid aktiv war. Die CMI wurde als ein Konzentrationsintervall [a]-[b] ausgedrückt, wobei [a] die minimale Konzentration war, bei der man einen Wachstumsbeginn beobachtet und [b] die Konzentration war, bei der kein Wachstum beobachtet wurde. Beispiele für die spezifische Aktivität von Heliomycin im Hinblick auf filamentöse Pilze und Hefen werden in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.
  • Beispiel III-1: Test des Nachweises von Aktivität gegen filamentöse Pike
  • Die Anti-Pilzaktivität wurde durch einen Test der Inhibition des Wachstums in flüssigem Medium nachgewiesen. Die zu testenden Pilzsporen wurden in Kulturmedium vom Typ „Kartoffelglukose" suspendiert. Vorzugsweise wurden 12 g des Potato-Dextrose-Broth-Mediums (Difco) auf 11 demineralisiertes Wasser verwendet. Zwei Antibiotika wurden dem Kulturmedium hinzugegeben: Tetracyclin (Endkonzentration 10 μg/ml) und Cefotaxim (100 μg/ml). 10 μl jeder zu analysierenden Fraktion wurden auf Mikrotitrationsplatten in Gegenwart von 90 μl von Kulturmedium, das die Sporen enthält (bei einer Endkonzentration von 104 Sporen/ml) aufgetragen. Die Inkubation wurde in einer feuchten Kammer bei 30 °C während 48 Stunden durchgeführt. Das Pilzwachstum wurde im Lichtmikroskop nach 24 h beobachtet und nach 48 Stunden durch Messung der Absorption bei 600 nm mit Hilfe eines spektrophotometrischen Lesegeräts für Mikrotitrationsplatten quantifiziert.
    • – Getestete filamentöse Pilze: Aspergillus fumigatus (ein Geschenk von Dr. H. Koenig, Hôpital civil, Straßburg); Nectria haematococca, Fusarium culmorum, Trichoderma viride (Pilzsammlung der Université Catholique de Leuven, Belgien); Neurospora crassa, Fusarium oxysporum (Pilzsammlung der Société Clause, Paris).
  • Die Ergebnisse des Aktivitätstests von Heliomycin gegen filamentöse Pilze sind in der nachstehenden Tabelle 1 berichtet. Tabelle 1: Aktivität von Heliomycin gegen filamentöse Pilze
    Pilz CMI von Heliomycin (μM)
    Neurospora crassa 0,1-0,2
    Fusarium culmorum 0,2-0,4
    Fusarium oxysporum 1,5-3
    Nectria haematococca 0,4-0,8
    Trichoderma viride 1,5-3
    Aspergillus fumigatus 6-12,5
  • Beispiel III-2: Nachweistest von Aktivität gegen Hefen
  • Verschiedene Hefestämme wurden in Kulturmedium vom Typ «Sabouraud» inkubiert und bei 30 °C während 24 Std. unter leichtem Schütteln inkubiert. Die zu testende Probe (10 μl) wurde in Vertiefungen von Mikrotitrationsplatten, in die 90 μl einer verdünnten Hefekultur zugefügt wurde, deren Dichte auf OD 600 = 0,001 angepasst worden war, aufgetragen. Das Wachstum wurde durch Messen der Absorption bei 600 nm mit Hilfe eines spektrophotometrischen Lesegeräts für Mikrotitrationsplatten ausgewertet.
    • -getestete Hefen: Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. inconspicua, Cryptococcus neoformans, Cryp. albidus, Saccharomyces cerevisiae (Geschenk von Dr H. Koenig, Hôpital civil, Straßburg) Die Ergebnisse des Aktivitätstests von Heliomycin gegen Hefen sind in der nachstehenden Tabelle 2 berichtet.
    Tabelle 2: Aktivität von Heliomycin gegen Hefen
    Hefen CMI von Heliomycin (μM)
    Candida albicans 2,5-5
    Candida tropicalis 2,5-5
    Candida krusei 10-20
    Candida inconspicua 5-10
    Cryptococcus neoformans 2,5-5
    Cryptococcus albidus 5-10
  • Diese Ergebnisse zeigen die exzellente Anti-Pilzaktivität des erfindungsgemäßen Peptids.
  • Beispiel IV: Herstellung einer transformierten Pflanze, die ein Gen umfasst, das Heliomycin kodiert
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung der Heliomycin-kodierenden Sequenz für ihre Expression in einer pflanzlichen Zelle, des chimären Gens, des Integrationsvektors, und transformierter Pflanzen. Die angefügten 2 bis 6 beschreiben die schematischen Strukturen bestimmter Plasmide, die zur Konstruktion der chimären Gene hergestellt wurden. In diesen Figuren sind die verschiedenen Restriktionsschnittstellen durch kursive Schrift markiert.
  • Sämtliche nachstehend benutzte Techniken sind Standardlabortechniken. Die ausführlichen Protokolle dieser Techniken sind insbesondere beschrieben in Ausubel & Koll.
  • Beispiel IV-1: Konstruktion chimärer Gene zur Transformation von Pflanzen
  • pRPA-MD-P: Herstellung eines Plasmids, das das Signalpeptid des Gens PR-1α aus Tabak enthält.
  • Die zwei nachstehenden synthetischen komplementären Oligonukleotide Oligo 7 und Oligo 8 werden bei 65 °C während 5 Minuten, dann durch langsame Verringerung der Temperatur auf 30 °C während 30 hybridisiert.
    • Oligo 7: 5' GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3'
    • Oligo 8: 5' TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA GAAGAGTAGA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3'
  • Nach Hybridisierung zwischen dem Oligo 7 und dem Oligo 8 dient die verbliebene einzelsträngige DNA als Matrize für das Klenow-Fragment der Polymerase 1 aus E. coli (unter den vom Hersteller empfohlenen Standardbedingungen (New England Biolabs)) zum Herstellen des doppelsträngigen Oligonukleotids ausgehend vom 3'-Ende jedes Oligos. Das erhaltene doppelsträngige Oligonukleotid wird anschließend durch die Restriktionsenzyme SacII und NaeI verdaut und in das Plasmid pBS II SK(-) (Stratagene) kloniert, das durch dieselben Restriktionsenzyme verdaut wurde. Es wird also ein Klon erhalten, der die kodierende Region für das Signalpeptid des Gens PR-1α aus Tabak umfasst (SEQ ID Nr. 4).
  • pRPA-PS-PR1a-Helio: Herstellung einer Sequenz, die Heliomycin fusioniert an das Signalpeptid PR-1α ohne die nicht-transkribierte 3'-Region kodiert.
  • Die zwei synthetischen komplementären Oligonukleotide der Sequenzen Oligo 9 und Oligo 10 gemäß den für pRPA-MD-P beschriebenen Verfahrensbedingungen.
    • Oligo 9: 5' GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTGTGGGGT GCTGTGAACT ACACTTCCGA TTGCAACGGT GAGTGCAAGA GGAGGGGTTA 3'
    • Oligo 10: 5' CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCTCAAGT CTCGCACCAG CAGTTCACGT TAGCGAAGGA ACCGCAGTGA CCACCCTTGT AACCCCTCCT CTTGCACTC 3'
  • Nach der Hybridisierung zwischen dem Oligo 9 und dem Oligo 10 dient die verbleibende einzelsträngige DNA als Matrize für das Klenow-Fragment der Polymerase 1 aus E. coli (unter den vom Hersteller empfohlenen Standardbedingungen (New England Biolabs)) zur Herstellung eines doppelsträngigen Oligonukleotids ausgehend vom 3'-Ende jedes Oligos. Dieses doppelsträngige Oligonukleotid, das den kodierenden Teil des Heliomycins (SEQ ID Nr. 2) enthält, wird anschließend direkt in das Plasmid pRPA-MD-P kloniert, das mit dem Restriktionsenzym NaeI verdaut wurde. Die korrekte Orientierung des erhaltenen Klons wird durch Sequenzierung überprüft. Es wird also ein Klon erhalten, der die für das Fusionsprotein PR-1α-Heliomycin kodierende Region, die zwischen den Restriktionsschnittstellen NcoI am N-terminalen Ende und ScaI, SacII und BamHI am C-terminalen Ende gelegen ist, umfasst (SEQ ID Nr. 3).
  • pRPA-RD-239: Herstellung eines Expressionsvektors in Pflanzen, der die Sequenz umfasst, die das Fusionsprotein PR-1a-Heliomycin kodiert.
  • Das Plasmid pRTL-2 GUS, abgeleitet aus dem Plasmid pUC-19, wurde bei Dr. Jim Carrington (Texas A&M University, nicht beschrieben) erhalten. Dieses Plasmid, dessen schematische Struktur in der 2 dargestellt ist, enthält den duplizierten Promotor CαMV 35S, isoliert aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus (Promotor CaMV 2 × 35S; Odell & Koll., 1985), der die Expression einer RNA steuert, die die nichttranslatierte Sequenz am 5'-Ende des Tabak-Ätz-Virus (TEV 5' UTRM; Carrington & Freed, 1990), das Gen der ß-Glucuronidase aus E. coli (GUS Jefferson & Koll., 1987), gefolgt von der Polyadenylierungsstelle der RNA 35S aus CaMV (CaMV polyA; Odell & Koll., 1985) enthält.
  • Das Plasmid pRTL-2 GUS wird mit den Restriktionsenzymen NcoI und BamHI verdaut, und das große DNA-Fragment wird gereinigt. Das Plasmid pRPA-PS-PR1α-Helio wird mit den Restriktionsenzymen NcoI und BamHI verdaut und das kleine DNA-Fragment, das die kodierende Region für das Fusionsprotein PR-1α-Heliomycin enthält, wird gereinigt. Die zwei gereinigten DNA-Fragmente werden anschließend zusammen in einer Kassette zur Expression in Pflanzen, die ein Fusionsprotein PR-1α-Heliomycin synthetisiert, ligiert. Die schematische Struktur dieser Expressionskassette wird in 3 dargestellt. «PR-1α-Heliomycin» stellt die Region dar, die das Fusionsprotein PR-1α-Heliomycin des pRPA-RD-239 kodiert. Das Heliomycin wird in die extrazelluläre Matrix der Pflanze durch die Wirkung des Signalpeptids PR-1α transportiert.
  • pRPA-RD-195: Herstellung eines Plasmids, das eine modifizierte multiple Klonierungsstelle enthält.
  • Das Plasmid pRPA-RD-195 ist ein aus pUC-19 abgeleitetes Plasmid, das eine modifizierte multiple Klonierungsstelle enthält. Die nachstehenden synthetischen komplementären Oligonukleotide Oligo 11 und Oligo 12 wurden hybridisiert und gemäß des für pRPA-MD-P beschriebenen Verfahrens doppelsträngig gemacht.
    • Oligo 11: 5' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3'
    • Oligo 12: 5' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3'
  • Das erhaltene doppelsträngige Oligonukleotid wurde anschließend in pUC-19, der vorher mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII verdaut worden war, ligiert, und die Enden stumpf gemacht unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase-1 aus E. coli. Es wird ein Vektor erhalten, der multiple Klonierungsstellen enthält, die das Einführen von Expressionskassetten in einen Plasmidvektor aus Agrobacterium tumefaciens erleichtern. Die schematische Struktur dieser multiplen Klonierungsstelle wird in 4 dargestellt.
  • pRPA-RD-240: Einführen der Expressionskassette von PR-1α-Heliomycin aus pRPA-RD-239 in pRPA-RD-195.
  • Das Plasmid pRPA-RD-239 wird mit dem Restriktionsenzym PstII verdaut. Das DNA-Fragment, das die Expressionskassette von PR-1a-Heliomycin enthält, wird gereinigt. Das gereinigte Fragment wird anschließend in pRPA-RD-195 ligiert, das vorher mit dem Restriktionsenzym PstII verdaut worden und mit intestinaler Kalbs-Phosphatase dephosphoryliert worden war.
  • pRPA-RD-174: Plasmid abgeleitet aus pRPA-BL-150A ( EP 0 508 909 ), das das Gen für Toleranz gegenüber Bromoxynil aus pRPA-BL-237 ( EP 0 508 909 ) enthält.
  • Das Gen für Toleranz gegenüber Bromoxynil wird aus pRPA-BL-237 durch eine Genamplifikations-PCR isoliert. Das erhaltene Fragment besitzt stumpfe Enden und wird in die EcoRI-Schnittstelle des pRPA-BL-150A kloniert, deren Enden durch Einwirken der Klenow-Polymerase unter Standardbedingungen stumpf gemacht worden waren. Man erhält einen Vektor von Agrobacterium tumefaciens, der das Gen für Toleranz gegenüber Bromoxynil in der Nähe seines rechten Randes, ein Gen für Toleranz gegenüber Kanamycin in der Nähe seines linken Randes, und eine multiple Klonierungsstelle zwischen diesen zwei Genen enthält.
  • Die schematische Struktur von pRPA-RD-174 wird in 5 gezeigt. In dieser Figur stellt „nos" die Polyadenylierungsstelle der Nopalin-Synthase aus Agrobacterium tumefaciens dar (Bevan & Koll., 1983), „NOS pro" stellt den Promotor der Nopalin-Synthase aus Agrobacterium tumefaciens dar (Bevan & Koll., 1983), „NPT II" stellt das Gen der Neomycin-Phosphotransferase des Transposons Tn5 aus E. coli dar (Rothstein & Koll., 1981), „35S pro" stellt den 35S-Promotor isoliert aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus dar (Odell & Koll., 1985), „BRX" stellt das Gen der Nitrilase, isoliert aus K. ozaenae dar (Stalker & Koll., 1988), „RB" und „LB" stellen jeweils die rechten und linken Ränder der Sequenz eines Ti-Plasmids aus Agrobacterium tumefaciens dar.
  • pRPA-RD-184: Hinzufügen einer neuen einzigartigen Restriktionsschnittstelle in pRPA-RD-174.
  • Die nachstehenden synthetischen komplementären Oligonukleotide Oligo 13 und Oligo 14 werden hybridisiert und gemäß des für pRPA-MD-P beschriebenen Verfahrens doppelsträngig gemacht.
    • Oligo 13: 5' CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG 3'
    • Oligo 14: 5' CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG 3'
  • Das hybridisierte doppelsträngige Oligonukleotid (95 Basenpaare) wird nach Auftrennen auf einem Agarosegel gereinigt (3 % Nusieve, FMC). Das Plasmid pRPA-RD-174 wird mit dem Restriktionsenzym XmaI verdaut, und das große DNA-Fragment wird gereinigt. Die zwei erhaltenen DNA-Fragmente werden anschließend ligiert.
  • Man erhält ein Plasmid abgeleitet aus pRPA-RD-174, das andere Restriktionsschnittstellen zwischen dem Gen für die Toleranz gegenüber Bromoxynil und dem Gen des Kanamycin-Selektionsmarkers umfasst.
  • Die schematische Struktur des Plasmids pRPA-RD-184 wird in 6 dargestellt, wo die Begriffe „nos", „NPT II", „NOS pro", „35S pro", „BRX-Gen", „RB" und „LB" die gleiche Bedeutung wie in der 5 haben.
  • pRPA-RD-241: Herstellung eines Vektors aus Agrobacterium tumefaciens, der die Konstruktion des Gens enthält, das Heliomycin kodiert, das in die extrazelluläre Matrix gerichtet wird.
  • Das Plasmid pRPA-RD-240 wird mit den Restriktionsenzymen SfiII und AscI verdaut, und das DNA-Fragment, das das Gen des PR-1a-Heliomycins enthält, wird gereinigt. Das Plasmid pRPA-RD-184 wird mit denselben Restriktionsenzymen verdaut. Das DNA-Fragment, das die Expressionskassette von PR-1a-Heliomycin enthält, wird anschließend in pRPA-RD-184 ligiert. Man erhält so einen Vektor aus Agrobacterium tumefaciens, der die Sequenz enthält, die das Fusionsprotein PR-1α-Heliomycin kodiert, die zur Expression des Heliomycins in der extrazellulären Matrix der Pflanze führt.
  • Beispiel IV-2 Herstellung einer Expressionskassette CsVMV-Promotor – PG1-Signalpeptid – Heliomycin – Nos-Terminator
  • pRPA-NP4: Herstellung eines Plasmids, das das Signalpeptid des PG1-Gens der Polygalacturonase aus Mais enthält (Genbank, Zugangsnummer X57627).
  • Die zwei nachstehenden synthetischen, teilweise komplementären Oligonukleotide Oligo 13 und Oligo 14 werden bei 65 °C während 5 Minuten, dann durch langsame Verringerung der Temperatur auf 30 °C während 30 Minuten hybridisiert.
    • Oligo 15: 5' GGTCTAGAAT GGCCTGCACC AACAACGCCA TGAGGGCCCT CTTCCTCCTC 3'
    • Oligo 16: 5' CCGAATTCGG CGCCGTGCAC GATGCAGAAG AGCACGAGGA GGAAGAGGGC 3'
  • Nach der Hybridisierung zwischen dem Oligo 13 und dem Oligo 14 dient die verbleibende einzelsträngige DNA als Matrize für das Klenow-Fragment der Polymerase 1 aus E. coli (unter den vom Hersteller empfohlenen Standardbedingungen (New England Biolabs)), zur Herstellung eines doppelsträngigen Oligonukleotids ausgehend vom 3'-Ende jedes Oligos. Das erhaltene doppelsträngige Oligonukleotid wird anschließend durch die Restriktionsenzyme XbaI und EcoRI verdaut, dann in das Plasmid pBS II SK (-) (Stratagene) kloniert, das durch dieselben Restriktionsenzyme verdaut worden war. Man erhält also einen Klon, der die Region enthält, die die 22 Aminosäuren des Signalpeptids des PG1-Gens enthält, und die im Leserahmen an andere Proteine auf der Höhe der SfoI-Schnittstelle fusioniert werden kann (SEQ ID Nr. 15).
  • pRPA-NP5: Herstellung einer Sequenz, die Heliomycin kodiert, fusioniert an das Signalpeptid des Gens PG1
  • Die Region, die Heliomycin kodiert, war durch PCR ausgehend vom Klon pRPA-PS-PR1a-Helio (SEQ ID Nr. 3) mit dem thermostabilen Enzym Pfu (Stratagene) gemäß den durch den Hersteller empfohlenen Standardbedingungen amplifiziert worden. Die synthetischen Oligonukleotide, die für diese Amplifikation verwendet werden, sind:
    • Oligo 17: 5' GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTG 3'
    • Oligo 18 : 5' GGCTCGAGTC AAGTCTCGCA CCAGCAGTTC AC 3'
  • Das PCR-Produkt wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI verdaut und in den Vektor pRPA-NP4, verdaut durch die Restriktionsenzyme SfoI und XhoI, kloniert. Der resultierende Klon umfasst daher die Region, die das Signalpeptid des Gens PG1 kodiert, fusioniert im selben Leserahmen mit der Sequenz, die Heliomycin kodiert (SEQ ID Nr. 18).
  • pRPA-NP6: Herstellung einer Expressionskassette von Heliomycin in einem Transformationsvektor
  • Der Expressions- und Transformationsvektor pILTAB 357 ist abgeleitet aus dem binären Vektor pBin19. Er enthält den CsVMV-Promotor (Verdaguer et al. 1996, Plant Mol. Biol. 31, 1129-1139), gefolgt von einer multiplen Klonierungsstelle und des Transkriptionsterminators Nos der Nopalin-Synthase (X + 1). Die Sequenz dieses Fragments ist angezeigt (SEQ ID Nr. 19).
  • Der Expressionsvektor des Heliomycins wurde durch Insertion des Restriktionsfragments XbaI-KpnI des Vektors pRPA-NP5, der die Fusion PG1-Signalpeptid – Heliomycin enthält, in den Vektor pILTAB 357, verdaut durch dieselben Enzyme, erhalten. Der resultierende Klon beinhaltet daher die Expressionskassette CsVMV-Promotor – PG1-Signalpeptid – Heliomycin – Nos-Terminator (SEQ ID Nr. 20).
  • Beispiel IV-3: Herstellung von transformierten Tabakpflanzen
  • 3.1-Transformation
  • Die Vektoren pRPA-RD-241 oder pRPA-NP6 werden in den Stamm Agrobacterium tumefaciens EHA 101 oder EHA 105 (Hood & Koll., 1987) eingeführt, der Träger des Cosmids pTVK291 ist (Koran & Koll., 1986). Die Transformationstechnik basiert auf dem Verfahren von Horsh & Koll. (1985).
  • 3.2-Regeneration
  • Die Regeneration des PBD6-Tabaks (Herkunft SEITA, Frankreich) ausgehend von Blatt-Explantaten wurde in einem Murashige-Skoog (MS) Basismedium, das 30 g/l Saccharose sowie 200 μg/ml Kanamycin umfasst, ausgeführt. Die Blatt-Explantate werden von im Gewächshaus oder in vitro kultivierten Pflanzen entnommen und gemäß der „leaf disk"-Technik (Horsh & Koll., 1985) in drei aufeinanderfolgenden Schritten regeneriert: Der erste umfasst die Induktion von Sprossen in einem Medium, dem 30 g/l Saccharose enthaltend 0,05 mg/l Naphtylessigsäure (ANA) und 2 mg/l Benzylaminopurin (BAP) zugefügt worden waren, während 15 Tage. Die im Laufe dieses Schrittes gebildeten Sprossen werden anschließend während 10 Tage in Kultur in einem MS-Medium, dem 30 g/l Saccharose zugefügt werden, das aber keine Hormone enthält, entwickelt. Dann werden die entwickelten Sprossen gewonnen, und man kultiviert sie in einem MS-Medium zur Wurzelbildung mit halbem Gehalt an Salzen, Vitaminen und Zucker, welches kein Hormon enthält. Nach ungefähr 15 Tagen werden die angewurzelten Sprossen in die Erde gesetzt.
  • 3.3-Analyse der Expression von Heliomycin in transgenem Tabak
  • a) Herstellung von spezifischen polyklonalen Antikörpern
  • Polyklonale Antikörper wurden durch Immunisierung eines Hasen mit nativem Heliomycin gemäß gewöhnlicher Verfahren des Centre de Bioexpérimentation VALBEX (IUT A – Lyon I) erhalten. Das erhaltene Serum (15 ml) wurde anschließend auf einer Sepharose 4B-Säule (Pharmacia; Ref. 17-0430-01), gekoppelt an Heliomycin in einer Weise, um spezifisch die Immunglobuline auszuwählen, die dieses Peptid erkennen, immunogereinigt. Diese Antikörper wurden schließlich in 6 ml Glycin (200 mM; pH 3) eluiert, mit 1 M Tris pH 9,5 neutralisiert, mit 0,5x PBS dialysiert, und gefroren bei –20 °C bis zur Verwendung konserviert.
  • b) Immunnachweis von Heliomycin in transgenem Tabak
  • Die Analyse der Expression des Heliomycins wurde bei 8 transgenen Pflanzen für das Konstrukt pRPA-NP6 sowie bei einer Wildtypkontrolle durchgeführt. Gut entwickelte Tabakblätter aus dem Gewächshaus wurden bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff fein zermahlen, und die Proteine während 1 Std. bei 4 °C in 50 mM Tris-HCl- Puffer, 1 % PVP25, 0,05 % TritonX100, pH 7,5, im Verhältnis von 4 ml Puffer pro Gramm Frischgewicht extrahiert. Nach Zentrifugation wurde die Proteinkonzentration des Überstands mit dem Bradford-Verfahren bestimmt.
  • Fünf Mikrogramm Proteine von jedem der 9 Extrakte wurden auf eine Nitrocellulosemembran im «Slot-Blot» Format aufgetragen, sowie eine Menge von 50 ng reinem Heliomycin, das als Positivkontrolle dient. Die Membran wurde während 1 Std. in einem 1 % Blockierungspuffer (Boehringer; Ref. 1 921 673) in TBS inkubiert, dann über Nacht bei 4 °C mit immungereinigten Antikörpern gerichtet gegen Heliomycin, 1/2000 verdünnt in TBS-Puffer mit 0,05 % Tween20 inkubiert. Nach Waschen (TBS, 0,1 Tween 20 und 0,5 % Blockierungspuffer) wurde die Membran 1 Std. lang bei Raumtemperatur (TBS mit 0,5 % Blockierungspuffer) mit einem Ziegen-Antikörper (verdünnt auf 1/50000), spezifisch gegen Hasen-Immunglobuline gerichtet und an alkalische Phosphatase gekoppelt (SIGMA A-3687), inkubiert. Nach Waschen (TBS, 0,1 % Tween20) wurde der Nachweis durch Zufügen eines Phosphatasesubstrats gemacht (BioRad; Ref. 170-5012), und die Entwicklung wird durch Radiographie des lumnieszenten Produkts auf einem Amersham-Film (ECL) erhalten.
  • Das Ergebnis dieses Experiments zeigt, dass 4 transgene Tabakpflanzen stark Heliomycin exprimieren. Das Signal in den anderen transgenen Pflanzen ist schwach oder gegenüber der Wildtypkontrolle nicht signifikant. Das beobachtete Signal für die beste Pflanze ist auf dem Niveau der Positivkontrolle (50 ng Heliomycin), was anzeigt, dass das Heliomycin in dieser Pflanze ungefähr 1 Gewichtsprozent der gesamten Proteine darstellt.
  • Beispiel V-1: Emulgierbare Konzentrate
  • Beispiel CE 1:
    - Wirkstoff 400 g/l
    - alkalisches Dodecylbenzolsulfonat 24 g/l
    - Nonylphenol-Oxyethyl mit 10 Molekülen Ethylenoxid 16 g/l
    - Cyclohexanon 200 g/l
    - aromatisches Lösungsmittel genügende Menge für 1 Liter
  • Beispiel CE 2
    - Wirkstoff 250 g
    - epoxidiertes pflanzliches Öl 25 g
    - Mischung aus Alkylarylsulfonat und Polyglycolether und Alkanolen 100 g
    - Di-Andhylformamid 50 g
    - Xylen 575 g
  • Beispiel V-2: Konzentrierte Suspension
  • Beispiel SC 1:
    - Wirkstoff 500 g
    - polyethoxyliertes Tristyrylphenolphosphat 50 g
    - polyethoxyliertes Alkylphenol 50 g
    - Natrium-Polycarboxylat 20 g
    - Ethylenglykol 50 g
    - Organopolysiloxan-Öl (Antischaummittel) 1 g
    - Polysaccharid 1,5 g
    - Wasser 316,5 g
  • Beispiel V-3: Benetzbare Pulver (oder zu versprühende Pulver):
  • Beispiel PM 1
    - Wirkstoff 50 %
    - ethoxyliertes Alkanol (Benetzungsmittel) 2,5 g
    - ethoxyliertes Phenylethylphenol (Dispersionsmittel) 5 %
    - Kreide (inerter Trägerstoff) 42,5 %
  • Beispiel PM 2:
    - Wirkstoff 10 %
    - synthetischer Oxoalkohol vom verzweigtkettigen Typ, an C13 ethoxyliert durch 8 bis 10 Ethylenoxide (Benetzungsmittel) 0,75 %
    - neutrales Calcium-Lignosulfonat (Dispersionsmittel) 12 %
    - Calciumkarbonat (inerter Füllstoff) genügende Menge für 100 %
  • Beispiel PM 3:
    - Wirkstoff 75 %
    - Benetzungsmittel 1,50 %
    - Dispersionsmittel 8 %
    - Calciumkarbonat (inerter Füllstoff) genügende Menge für 100 %
  • Beispiel PM 4:
    - Wirkstoff 90 %
    - ethoxylierter Fettalkohol (Benetzungsmittel) 4 %
    - ethoxyliertes Phenylethylphenol (Dispersionsmittel) 6 %
  • Beispiel PM 5:
    - Wirkstoff 50 %
    - Mischung aus anionischen und nicht-ioinischen die Oberflächenspannung verändernden Mittel (Benetzungsmittel) 2,5 %
    - Natriumlignosulfonat (Dispersionsmittel) 5 %
    - Kaolin-Ton (inerter Trägerstoff) 42,5 %
  • Beispiel V-4: Dispersible Körnchen
  • Beispiel GD1
  • In einer Mischmaschine werden 90 Gewichtsprozent an Wirkstoff und 10 % Harnstoffperlen gemischt. Die Mischung wird anschließend in einer Kegelmühle („broyeur à broches") gemahlen. Man erhält ein Pulver, das mit ungefähr 8 Gewichtsprozent Wasser angefeuchtet wird. Das feuchte Pulver wird in einem Extruder mit perforierter Rolle („extrudeuse rouleau perforé") extrudiert. Man erhält ein Granulat, das getrocknet, anschließend zerstoßen und gesiebt wird, damit jeweils nur Körner einer Größe einschließlich zwischen 150 und 2000 Mikrometer zurückgehalten werden.
  • Beispiel GD2
  • In einer Mischmaschine werden die folgenden Bestandteile gemischt:
    - Wirkstoff 75 %
    - Benetzungsmittel (Natrium-Alkylnaphatalinsulfonat) 2 %
    - Dispersionsmittel (Natriumpolynaphtalin-Sulfonat) 8 %
    - wasserunlöslicher inerter Füllstoff (Kaolin) 15 %
  • Dieses Gemisch wird im Flüssigbett in Gegenwart von Wasser granuliert, anschließend getrocknet, zermahlen und gesiebt, um Körner einer Größe einschließlich zwischen 0,15 und 0,80 mm zu erhalten.
  • Beispiel V-5: Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Beispiel A: Tabletten
  • Es werden gemäß üblicher Technik Tabletten zubereitet, die mit 50 mg aktivem Peptid dosiert sind, wobei sie die folgende Zusammensetzung haben:
    - Heliomycin-Peptid M 1 50 mg
    - Stärke 60 mg
    - Laktose 50 mg
    - Magnesiumstearat 2 mg
  • Beispiel B: Injizierbare Lösung
  • Es wird eine injizierbare Lösung zubereitet, die 20 mg wirksames Peptid mit der folgenden Zusammensetzung enthält:
    - Heliomycin-Peptid M 2 22,4 mg
    - Destilliertes Wasser genügende Menge für 2 cm3
  • Beispiel VI. Stabilität der Aktivität des Heliomycins
  • Die Stabilität eines antimikrobiellen Peptids gegenüber Pflanzenproteasen ist ein notwendiger Faktor zum Erhalt eines guten Expressionsniveaus, und daher des Widerstands gegenüber Phytopathogenen in transgenen Pflanzen. Diese Stabilität ist zum Beispiel ein kritischer Punkt für ein antimikrobielles Peptid aus Insekten wie das Cecropin B (Owens und Heutte, 1997, MPM1, Band 10, Nr. 4, S. 525-528). Wir haben die Stabilität des Heliomycins und die seiner Aktivität in einem Phythopathogen-Test (Botrytis cinerea) nach Inkubation mit Rohextrakten aus 8 bedeutsamen Kulturpflanzen (Mais, Weizen, Gerste, Raps, Soja, Sonnenblume, Tomate und Tabak) untersucht. Die Blätter dieser 8 Arten wurden bei tiefer Temperatur (flüssiger Stickstoff) in einem Mörser zerstoßen, anschließend wurde das Pulver im gleichen Volumen Wasser resuspendiert. Nach Zentrifugation (10000 g während 30 Minuten) wurde der Überstand gewonnen und die Proteinkonzentration bestimmt. Diese Konzentration wurde bei den 8 Extrakten auf 1 mg/ml durch Verdünnung mit Wasser eingestellt, dann wurden diese Extrakte steril filtriert (0,2 Mikrometer). Hundert Mikroliter jeden Extraktes (sowie einer Kontrolle mit nur Wasser) wurden anschließend zu 50 Mikroliter einer Heliomycinlösung (enthaltend 15 Mikrogramm sowie eine Kontrolle ohne Peptid) in Wasser zugefügt. Diese Gemische wurden bei 30°C inkubiert, ein Aliquot von 20 Mikrolitern nach 0 h, 1 h, 2 h, 4 h und 20 h entnommen, und sofort bis zum Test eingefroren.
  • Der Test der Anti-Pilz-Aktivität wurde bei 25°C auf Mikroplatten durch Zufügen jedes Aliquots zu 80 Mikrolitern einer frischen Suspension von Sporen von Botrytis cinerea (10000 Sporen/ml in einer Lösung von Potato Dextrose Broth (Difco, 12 g/l)) durchgeführt. Das visuelle Ablesen der Ergebnisse nach 12 h und 24 h zeigt, dass kein signifikanter Verlust der Anti-Pilz-Aktivität des Heliomycins entsteht, selbst für die Probe, die während 20 h bei 30°C inkubiert wurde, verbunden mit der Exposition gegenüber einem Rohextrakt von Mais, Weizen, Gerste, Raps, Soja, Sonnenblume, Tomate oder Tabak. Dieses Ergebnis zeigt eine sehr starke Stabilität des Heliomycins gegenüber Pflanzenproteasen, und dass die Anti-Pilz-Aktivität getestet mit Botrytis cinerea nicht durch die Gegenwart von pflanzlichen Rohextrakten beeinflusst wird.
  • Beispiel VII: Durchführung verschiedener Heliomycin-Mutanten: einfache, doppelte, dreifache und vierfache Mutanten.
  • Die nachstehenden Mutanten werden gemäß den in Beispiel II beschriebenen Verfahren durch Ersetzen bestimmter der Oligonukleotide 1 bis 6 durch andere Oligonukleotide, ausgewählt, um die Mutationen einzuführen, zubereitet.
  • – Heliomycin R48:
  • Ersetzen der Aminosäure Glu48 der Sequenz ID NO: 1 durch eine basische Aminosäure, insbesondere ein Arginin (Arg48). In Analogie mit der Sequenz, die Heliomycin der Sequenz: SEQ ID NO: 1 kodiert, wird das Codon GAA, das Glu kodiert, durch das Codon AGA, das Arg kodiert, ersetzt. Die Oligonukleotide 19 und 20 werden zum Ersetzen der Oligonukleotide 5 und 6 des Beispiels II verwendet.
    • Oligo 19: 5' GATCCTTCGC TAACGTTAAC TGTTGGTGTA GAACCTGATA GG 3'
    • Oligo 20: 5' TCGACCTATC AGGTTCTACA CCAACAGTTA ACGTTAGCGA AG 3'
  • – Heliomycin L28L29:
  • Ersetzen von zwei basischen Aminosäuren Lys und Arg in Position 28 und 29 der Sequenz ID NO: 1 durch zwei hydrophobe Aminosäuren, insbesondere zwei Aminosäuren Leucin (Leu28 und 29). In Analogie zur Sequenz, die Heliomycin mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 kodiert, wird der Teil AAG-CGC, der den Peptidrest Lys-Arg kodiert, durch die Sequenz TTG-TTG ersetzt, die den Peptidrest Leu-Leu kodiert. Die Oligonukleotide 21 und 22 werden zum Ersetzen der Oligonukleotide 3 und 4 des Beispiels II verwendet.
    • Oligo 21: 5' CTAGTGACTG CAACGGCGAG TGCTTGTTGC GC 3'
    • Oligo 22: 5' GCAACAAGCA CTCGCCGTTG CAGTCA 3'
  • – Heliomycin L28L29R48:
  • Ersetzen von zwei basischen Aminosäuren Lys und Arg in Position 28 und 29 der Sequenz ID NO: 1 durch zwei Aminosäurereste Leucin und Ersetzen der Aminosäure Glu48 der Sequenz ID NO: 1 durch die Aminosäure Arginin (Arg48). Die Oligonukleotide 19 bis 22 werden zum Ersetzen der Oligonukleotide 3 bis 6 gemäß Beispiel II verwendet.
  • – Heliomycin A24A25:
  • Ersetzen der zwei Aminosäuren Asn24 und Gly25 der Sequenz ID NO: 1 durch zwei Aminosäuren Alanin (Ala24 und Ala25). In Analogie zur Sequenz, die Heliomycin der Sequenz ID NO: 1 kodiert, wird der Teil AAC-GGC, der den Peptidrest Asn-Gly kodiert, durch die Sequenz GCT-GCT, die Ala-Ala kodiert, ersetzt. Die Oligonukleotide 23 und 24 werden zum Ersetzen der Oligonukleotide 3 und 4 von Beispiel II verwendet.
    • Oligo 23: 5' CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCAAGCGGC GC 3'
    • Oligo 24: 5' GCCGCTTGCA CTCAGCAGCG CAGTCA 3'
  • – Heliomycin A6A7A8A9:
  • Ersetzen der Aminosäuren Asp6-Lys7-Leu8-Ile9 der Sequenz ID NO: 1 durch 4 Aminosäuren Alanin (Ala). In Analogie zur Sequenz, die Heliomycin der Sequenz ID NO: 1 kodiert, wird der Teil GAC-AAG-TTG-ATT, der den Peptidrest Asp-Lys-Leu-Ile kodiert, durch die Sequenz GCT-GCT-GCT-GCT, die den Peptidrest Ala-Ala-Ala-Ala kodiert, ersetzt. Die Oligonukleotide 25 und 26 werden zum Ersetzen des Oligonukleotids 1 von Beispiel II und die Oligonukleotide 27 und 28 zum Ersetzen des Oligonukleotids 2 verwendet.
    • Oligo 25: 5' AGCTTGGATA AAAGAGCTGC TGCTGCTGGT AGCTGTGTTT 3'
    • Oligo 26: 5' GGGGCGCCG TCAACTACA 3'
    • Oligo 27: 5' CTAGTGTAGT TGACGGCGCC CC 3'
    • Oligo 28: 5' AAACACAGCT ACCAGCAGCA GCAGCTCTTT TATCCA 3'
  • – Heliomycin A24A25L28L29:
  • Zwei Oligonukleotide (Sense und Antisense) waren nötig, um der Abwesenheit einer Restriktionsschnittstelle zwischen der Sequenz, die den Peptidrest bestehend aus zwei Aminosäuren Asn24-Gly25 und der Sequenz, die den Peptidrest bestehend aus den zwei Aminosäuren Lys28-Arg29 des Heliomycins der Sequenz ID NO: 1 abzuhelfen. Die zwei Oligonukleotidsequenzen 29 und 30 ersetzen jeweils die zwei Oligonukleotidsequenzen 3 und 4 des Beispiels II.
    • Oligo 29: 5' CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCTTGTTGC GC 3'
    • Oligo 30: 5' GCAACAAGCA CTCAGCAGCG CAGTCA 3'
  • Herstellung von mutiertem Heliomycin in semipräparativem Maßstab.
  • Die verschiedenen Heliomycin-Mutanten werden in folgender Weise hergestellt und gereinigt.
  • Einer der transformierten Hefeklone, der mutiertes Heliomycin exprimiert, wurde bei 29°C während 48 h in 50 ml Selektionsmedium kultiviert. Diese Vorkultur wurde anschließend verwendet, um 2 1 Selektionsmedium zu inokulieren, und die Kultur wurde währen 48 h bei 29°C durchgeführt. Die Hefen wurden durch Zentrifugation beseitigt (4000 g, 30 Min., 4°C). Der Überstand wurde bis zu einem pH 3,5 mit Essigsäure angesäuert, einer zweiten Zentrifugation (4000 g, 30 Min., 4°C) vor einem ersten Extraktionsschritt auf Festphase unterzogen.
    • – Erster Extraktionsschritt auf Festphase auf einem Gel mit inverser Phase: Der angesäuerte Überstand wurde auf eine Sep-Pak Vac 35cc-Säule mit inverser Phase C18-Säule (Waters Associates, 10 g Phase), äquilibriert mit angesäuertem Wasser (0,05 % TFA) aufgetragen. Die hydrophilen Moleküle wurden durch Waschen mit angesäuertem Wasser, gefolgt von Waschen mit einer 15 %-igen Acetonitrillösung, zubereitet in 0,05 % TFA, beseitigt. Die Flution des Peptids wurde mit einer 60 %-igen Acetonitrillösung, zubereitet im 0,05 %igen TFA, ausgeführt. Die Fraktion, die bei 60 % Acetonitrillösung eluiert, wurde lyophilisiert, dann in ultrareinem sterilen Wasser rekonstituiert, bevor sie dem ersten Reinigungsschritt unterzogen wurde.
    • – Zweiter Extraktionsschritt auf Festphase auf einem Kationen-Austauscher-Gel: Die vorgereinigte 60 %-Fraktion, die das mutierte Heliomycin enthält, wurde in einer 25 mM, Ammoniumacetatlösung pH 3,4 rekonstituiert. Diese Probe wurde auf einer Sep-Pak Vac 35cc CM Kationenaustauscher-Säule (Waters Associates, 10 g Phase), äquilibriert mit 25 mM Ammoniumacetat pH 3,4 aufgetragen. Das mutierte Heliomycin wird unter Verwendung einer 1 M Natriumchloridlösung (NaCl), hergestellt in 25 mM Ammoniumacetat pH 3,4, eluiert. Die 1 M NaCl-Fraktion, die das mutierte Heliomycin enthält, wird gesammelt, unter Vakuum getrocknet, mit 20 ml ultrareinem angesäuerten Wasser (1 % TFA) rekonstituiert. Das mutierte Heliomycin wird anschließend durch Inverse-Phase-HPLC gereinigt.
    • – Letzter Schritt der Reinigung durch HPLC: Das mutierte Heliomycin wurde bis zur Homogenität durch Chromatographie auf einer präparativen Aquapore RP-300 C8 – Inverse-Phase-Säule (BrownleeTM, 220 × 10 mm, 300 Å) unter Verwendung eines linearen biphasischen Acetonitrilgradienten von 2 % bis 23 % während 10 Min. und von 23 % bis 33 % während 80 Min. in 0,05 % TFA bei einer konstanten Flussrate von 2,5 ml/Min. gereinigt. Die gesammelte Fraktion wurde unter Vakuum getrocknet, mit ultrareinem Wasser rekonstituiert und durch MALDI-Massenspektrometrie analysiert, um die Reinheit und die Identität zu überprüfen. Die verschiedenen mutierten Heliomycine wurden auf ihre Anti-Pilz-Aktivität unter den Bedingungen, die für das Referenz-Heliomycin beschrieben wurde, gegenüber den folgenden Stämmen analysiert: Neurospora crassa, Fusarium culmorum und Nectria haematococca. Die Aktivität der Mutanten von Heliomycin wurde gleichermaßen gegenüber Bakterien ausgewertet. Die verwendeten experimentellen Bedingungen sind nachstehend beschrieben.
  • In vitro-Aktivitätstest: Messung der antibakteriellen und Anti-Pilz-Aktivität durch Mikrospektrophotometrie.
  • Diese Verfahrensweise wurde zur Bestimmung des Aktivitätsspektrums des Peptids und der minimalen inhibitorischen Konzentration (concentration minimale inhibitrice CMI), bei der das mutierte Peptid wirksam ist, verwendet. Die CMI wurde als ein Konzentrationsintervall [a]-[b] ausgedrückt, wobei [a] die minimale Konzentration war, bei der ein Wachstumsbeginn beobachtet und [b] die Konzentration war, bei der kein Wachstum beobachtet wurde. Zwei Beispiele der spezifischen Aktivität des mutierten Heliomycins gegenüber Bakterien und filamentösen Pilzen sind in Tabelle 3 wiedergegeben.
  • Die antibakterielle Aktivität wurde durch einen Test der Wachstumsinhibition in flüssigem Medium bestimmt. Die zu testenden Bakterien wurden in einem Nährmedium vom Typ „Poor Broth" in Suspension gegeben. Bevorzugt verwendet man eine Lösung von 1 % Bactotrypton, mit Zugabe von 1 % NaCl an Volumengewicht, zubereitet in entmineralisiertem Wasser. Man trägt 10 μl jeder zu analysierenden Fraktion auf Mikrotitrationsplatten in Gegenwart von 90 μl Kulturmedium auf, das die Bakterien enthält (bei einer Endkonzentration äquivalent zu 1mOD bei 600 nm). Die Inkubation wurde bei 25°C während 12 bis 24 Stunden durchgeführt. Das bakterielle Wachstum wurde durch Verfolgen der Absorption bei 600 nm mit Hilfe eines spektrophotometrischen Lesegeräts für Mikrotitrationsplatten gemessen.
    • – Getestete Bakterien: Bacillus megaterium (Sammlung des Institut Pasteur), Micrococcus luteus (Sammlung des Institut Pasteur), Staphylococcus aureus (H. Monteil, Institut de bactériologie, Straßburg), Aerococcus viridans (H. Monteil, Institut de bactériologie, Straßburg), und Escherichia coli D22 (P. L. Boquet, Centre d'Etudes Nucléaires, Saclay).
    Tabelle 3: Aktivität bestimmter mutierter Heliomycine gegen filamentöse Pike und Bakterien
    Mikroorganismen CMI der Heliomycin-Mutanten (μM)
    L28L29 R48 L28L29R48 A6A7A8A9 Helio
    Pilze
    Neurospora crassa 0,8-1,6 0,4-0,8 0,8-1,6 1,6-3,1 0,1-0,2
    Fusarium culmorum 3,1-6,2 0,4-0,8 0,8-1,6 3,1-6,2 0,2-0,4
    Nectria haematococca 3,1-6,2 0,4-0,8 0,8-1,6 ND 0,4-0,8
    Bakterien
    Bacillus megaterium 50-100 ND ND 6,2-12,5 ND
    Micrococcus luteus 12,5-25 25-50 ND ND ND
    Staphyloccoccus aureus ND ND ND ND ND
    Aerococcus viridans ND ND ND 12,5-25 ND
    Escherichia coli D22 ND ND ND ND ND
    • ND: keine Aktivität gemessen.
  • Beispiel VIII: Studium der höchsten Toxizität
  • Gruppen von 4 weiblichen Mäusen wurden durch intravenöse Injektion von Heliomycinlösungen (SEQ ID NO 2) in Salzlösung zu Dosen von 1 und 10 mg/kg behandelt. Entsprechende Lösungen von Aprotinin als Negativkontrolle (keine Wirkungen bei den zwei Dosierungen) und von Mellitin als Positivkontrolle (100 % Mortalität bei 5 Tagen zu 10 mg, signifikante Wirkungen bei 5 Tagen zu 1 mg). Keine Toxizität wurde nachgewiesen für die Heliomycinlösungen der zwei injizierten Dosierungen.
  • REFERENZEN
    • Ausubel, F. A. & Koll. (Hrsg.. Greene). Current Protocols in Molecular Biology. Publ. Wiley & Sons.
    • Bevan, M. & Koll. (1983). Nuc. Acids Res. 11:369-385.
    • Carrington und Freed (1990). J. Virol. 64:1590-1597.
    • Ehret-Sabatier & Koll. (1996) The Journal of Biological Chemistry, 271, 47, 29537-29544.
    • Horsch & Koll. (1985). Science 227:1229-1231.
    • Jefferson & Koll. (1987). EMBO J. 6:3901-3907.
    • Koran & Koll. (1986). J. Bacteriol. 166:88-94.
    • Rothstein & Koll. (1981). Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 45: 99-105.
    • Stalker & Koll. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314.
    • Odell, J.T. & Koll. (1985). Nature 313:810-812.
  • Figure 00450001
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  • Sequenzprotokoll
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Claims (41)

  1. Peptid umfassend die Peptidsequenz der Formel (I), Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag (I)in der: Xaa -NH2 oder ein Peptidrest ist, umfassend von 1 bis 10 Aminosäuren, bevorzugt von 1 bis 6 Aminosäuren, umfassend mindestens eine basische Aminosäure, der die nachstehende Peptidsequenz Xaa'-Gly-Xaa''- darstellt, in der Xaa' NH2 oder einen Peptidrest umfassend 1 bis 9 Aminosäuren darstellt, und Xaa" einen Peptidrest umfassend eine Aminosäure ausgewählt aus Leu, Ile, Val, Pro, Ser oder Thr darstellt, Xab ein Peptidrest umfassend 10 Aminosäuren ist, Xac ein Peptidrest umfassend 3 Aminosäuren, umfassend mindestens eine saure Aminosäure ist, Xad die nachstehende Peptidsequenz -Lys-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Gly-His- darstellt, Xae die nachstehende Peptidsequenz -Gly-Xae'-Asn- darstellt, in der Xae' einen Peptidrest umfassend 5 Aminosäuren darstellt, Xaf ein Tryptophan ist, und Xag -OH oder ein Peptidrest umfassend von 1 bis 2 Aminosäuren ist.
  2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die basischen Aminosäuren aus Lysin, Arginin, oder Homoarginin ausgewählt sind.
  3. Peptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Xac die nachstehende Peptidsequenz -Asn-Xac'-Xac''- darstellt, in der Xac' einen Peptidrest aus 1 Aminosäure darstellt und Xac" einen Peptidrest aus 1 Aminosäure darstellt.
  4. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten Aminosäuren aus Glutaminsäure (Glu) oder Asparaginsäure (Asp) ausgewählt sind.
  5. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Xac die nachstehende Peptidsequenz -Asn-Gly-Glu- darstellt.
  6. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Xab die nachstehende Peptidsequenz -Val-Xab'-Asp- darstellt, in der Xab' einen Peptidrest umfassend 8 Aminosäuren darstellt, und/oder Xag die nachstehende Peptidsequenz -Glu-Xag' darstellt, in der Xag' OH oder einen variablen Rest einer Sequenz umfassend 1 Aminosäure darstellt.
  7. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Xaa die nachstehende Peptidsequenz NH2-Asp-Lys-Leu-Ile-Gly-Ser- darstellt, und/oder Xab die nachstehende Peptidsequenz -Val-Trp-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Thr-Ser-Asp- darstellt, und/oder Xae die nachstehende Peptidsequenz -Gly-Ser-Phe-Ala-Asn-Val-Asn- darstellt, und/oder Xag die nachstehende Peptidsequenz -Glu-Thr-OH darstellt.
  8. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es durch den Identifikator Nr. 2 dargestellt ist (SEQ ID Nr. 2).
  9. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es an dem einen oder anderen, oder beiden seiner Enden Peptidreste umfasst, die zu seiner Expression und dem zielgerichteten Transport in einen Wirtsorganismus notwendig sind.
  10. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Cysteinreste des Peptids der Formel (I) mindestens eine intramolekulare Disulfidbrücke bilden.
  11. Peptid nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es drei Disulfidbrücken umfasst, die zwischen den Cysteinresten 1 und 4, 2 und 5, und 3 und 6 ausgebildet sind.
  12. Fusionspeptid „Peptid-Heliomycin", umfassend ein Heliomycinpeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und einen Peptidrest, der die Fähigkeit besitzt, durch die Enzym systeme eines Wirtsorganismus gespalten zu werden, wodurch die Freisetzung des Heliomycins ermöglicht wird.
  13. Fusionspeptid nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das an das Heliomycin fusionierte Peptid ein Signalpeptid oder ein Transitpeptid ist.
  14. Fusionspeptid nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Transitpeptid das Signalpeptid des PR-1α-Gens aus Tabak, der Vorläufer des Faktors Mat-alpha-1, oder das Signalpeptid des Gens PG1 von Polygalacturonase aus Mais ist.
  15. Fusionspeptid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es durch den Identifikator der Sequenz Nr. 1 (SEQ ID Nr. 1), durch den Identifikator der Sequenz Nr. 3 (SEQ ID Nr. 3), oder durch den Identifikator der Sequenz Nr. 18 (SEQ ID Nr. 18) dargestellt wird.
  16. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 15 als Medikament.
  17. Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und ein geeignetes Trägermaterial umfasst.
  18. Nukleinsäurefragment, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 15 kodiert.
  19. Nukleinsäurefragment nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Nukleotidsequenz vom DNA-Typ handelt.
  20. Nukleinsäurefragment nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz vom DNA-Typ die DNA-Sequenz umfasst, die durch die Basen 16 bis 147 des Identifikators der Sequenz Nr. 1 (SEQ ID Nr. 1), durch den Identifikator der Sequenz Nr. 2 (SEQ ID Nr. 2), durch die Basen 3 bis 224 des Identifikators der Sequenz Nr. 3 (SEQ ID Nr. 3) oder durch die Basen 7 bis 205 des Identifikators der Sequenz Nr. 18 (SEQ ID Nr. 18), einer homologen Sequenz oder einer zur besagten Sequenz komplementären Sequenz beschrieben wird.
  21. Chimäres Gen, umfassend eine kodierende Sequenz sowie heterologe Regulationselemente in Position 5' und 3', die in einem Wirtsorganismus funktionsfähig sein können, insbe-sondere in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass die kodierende Sequenz mindestens ein DNA-Fragment wie in den Ansprüchen 18 bis 20 definiert umfasst.
  22. Chimäres Gen nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirtsorganismus ein Mikroorganismus ist.
  23. Chimäres Gen nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirtsorganismus aus pflanzlichen Zellen und Pflanzen ausgewählt ist.
  24. Klonierungs- oder Expressionsvektor zur Transformation eines Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens einen Replikationsursprung und mindestens ein chimäres Gen, wie in den Ansprüchen 21 bis 23 definiert, umfasst.
  25. Transformierter Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Nukleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 18 bis 20, oder ein chimäres Gen nach einem der Ansprüche 21 bis 23 enthält.
  26. Transformierter Wirtsorganismus nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Mikroorganismus, eine pflanzliche Zelle oder eine Pflanze handelt.
  27. Transformierter Wirtsorganismus nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Pflanze, die transformierte Zellen enthält, handelt.
  28. Wirtsorganismus nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze aus transformierten Zellen regeneriert wird.
  29. Transformierter Wirtsorganismus nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus aus Bakterien, insbesondere E. coli, Hefen, insbesondere der Gattungen Saccharomyces oder Kluyveromyces, Pichia, Pilzen, insbesondere Aspergillus, oder Baculoviren ausgewählt ist.
  30. Transformierte pflanzliche Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Nukleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 18 bis 20 oder ein chimäres Gen nach einem der Ansprüche 21 bis 23 enthält.
  31. Transformierte Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine pflanzliche transformierte Zelle nach Anspruch 30 umfasst.
  32. Transformierte Pflanze nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass sie gegenüber Krankheiten verursacht durch Cercospora, insbesondere Cercospora beticola, Cladosporium, insbesondere Cladosporium herbarum, Fusarium, insbesondere Fusarium culmorum oder Fusarium graminearum, oder Phytophthora, insbesondere Phytophthora cinnamomi, resistent ist.
  33. Transformierte Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus der Kultivierung und/oder der Kreuzung von Pflanzen nach einem der Ansprüche 31 oder 32 abgeleitet ist, und dass sie ein Nukleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 18 bis 20 oder ein chimäres Gen nach einem der Ansprüche 21 bis 23 enthält.
  34. Samen von transformierten Pflanzen nach einem der Ansprüche 31 bis 33, enthaltend ein Nukleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 18 bis 20 oder ein chimäres Gen nach einem der Ansprüche 21 bis 23.
  35. Verfahren zur Transformation von Wirtsorganismen, insbesondere von pflanzlichen Zellen oder Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass man in den besagten Wirtsorganismus mindestens ein Nukleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 18 bis 20 oder ein chimäres Gen nach einem der Ansprüche 21 bis 23 einbringt.
  36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirtsorganismus eine pflanzliche Zelle oder eine Pflanze ist.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Pflanze aus der pflanzlichen Zelle oder der transformierten Pflanze regeneriert.
  38. Verfahren zur Kultivierung von transformierten Pflanzen nach einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass es im Pflanzen der Samen der besagten transformierten Pflanzen in die Oberfläche eines geeigneten Feldes zur Kultivierung der besagten Pflanzen, im Anwenden einer agro-chemischen Zusammensetzung auf die besagte Oberfläche des besagten Feldes ohne die besagten Samen oder die besagten transformierten Pflanzen in einer wesentlichen Weise zu beeinflussen, dann im Gewinnen der kultivierten Pflanzen, sobald sie die gewünschte Reife erreicht haben, und gegebenenfalls im Abtrennen der Samen von den gewonnenen Pflanzen besteht.
  39. Verfahren zur Kultivierung nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die agrochemische Zusammensetzung mindestens ein wirksames Erzeugnis mit mindestens einer fungiziden und/oder bakteriziden Aktivität umfasst.
  40. Verfahren zur Kultivierung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass das wirksame Erzeugnis eine zu der des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 15 komplementäre Aktivität zeigt.
  41. Verfahren zur Herstellung von Heliomycin, definiert nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte der Kultivierung eines transformierten Organismus nach einem der Ansprüche 25 bis 29 in einem geeigneten Kulturmedium, danach die Extraktion und die gesamte oder teilweise Reinigung des erhaltenen Heliomycins umfasst.
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2810993B1 (fr) * 2000-06-29 2002-08-23 Rhobio Peptides antimicrobiens de la famille des defensines, polynucleotides codant ces peptides, vecteurs et organismes transformes les contenant
FR2811665B1 (fr) * 2000-07-13 2002-10-18 Entomed S A Peptides antifongiques et/ou antibacteriens, leurs preparations et les compositions les contenant
FR2811666B1 (fr) * 2000-07-13 2005-04-01 Entomed S A Peptides antifongiques et/ou antibacteriens, leurs preparations et les compositions les contenant
US6891085B2 (en) 2001-04-20 2005-05-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleic acid encoding the FUS6 antimicrobial polypeptide of Agrotis ipsilon and its use to enhance disease resistance in a plant
BR0214302A (pt) * 2001-11-20 2004-10-26 Novozymes As Polipeptìdeo que tem atividade antimicrobiana, polinucleotìdeo, construção de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, método para produzir um polipeptìdeo comosição antimicrobiana, método para matar ou inibir o crescimento de células microbianas, composição detergente, uso de um polipeptìdeo antimicrobiano planta transgênica, parte da planta ou célula da planta, aditivo para ração animal, composição de ração animal
FR2844142B1 (fr) 2002-09-11 2007-08-17 Bayer Cropscience Sa Plantes transformees a biosynthese de prenylquinones amelioree
FR2848571A1 (fr) * 2002-12-12 2004-06-18 Bayer Cropscience Sa Cassette d'expression codant pour une hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et plantes contenant un tel gene tolerantes aux herbicides
FR2848570B1 (fr) 2002-12-12 2005-04-01 Bayer Cropscience Sa Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant
EP1814996A2 (de) 2004-11-19 2007-08-08 Novozymes A/S Polypeptide mit antimikrobieller aktivität und diese codierende polynukleotide
US7485619B2 (en) * 2005-01-31 2009-02-03 Yeon Sook KIM Antimicrobial agent
CN101142231A (zh) 2005-03-16 2008-03-12 诺维信公司 在丝状真菌中重组表达防卫素
AR052947A1 (es) 2005-03-18 2007-04-11 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad antimicrobiana y polinucleotidos que codifican para los mismos
US7130534B1 (en) * 2005-04-21 2006-10-31 Agilent Technologies, Inc. Gas chromatograph having a radiant oven for analytical devices
US9057073B2 (en) 2007-01-11 2015-06-16 Bayer Cropscience N.V. Differential expression of subgenome specific alleles in cotton and uses thereof
WO2008101847A1 (en) 2007-02-23 2008-08-28 Novozymes A/S Method for producing an antifungal peptide in a filamentous fungal host cell
AR074941A1 (es) 2009-01-07 2011-02-23 Bayer Cropscience Sa Plantas transplastomicas exentas de marcador de seleccion
AR080105A1 (es) 2010-02-02 2012-03-14 Bayer Cropscience Ag Transformacion de soja usando inhibidores de hidrofenil piruvato dioxigenasa (hppd) como agentes de seleccion
WO2011104284A1 (en) 2010-02-25 2011-09-01 Novozymes A/S Polypeptides having antimicrobial activity
CN103517986B (zh) 2011-01-26 2016-12-07 诺维信公司 具有纤维二糖水解酶活性的多肽及编码该多肽的多核苷酸
WO2013096603A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Novozymes, Inc. Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
AU2018304493B2 (en) 2017-07-17 2022-07-28 Linnane Pharma Ab Peptides with antibiotic potential against Mycobacterium tuberculosis

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU350364A1 (ru) * 1971-03-17 1973-10-19 Институт изысканию новых антибиотиков АМН СССР Продуцент гелиомицина
ZA885916B (en) * 1987-09-15 1989-04-26 Gen Hospital Corp Pathogenesis-related proteins in plants
CA2030779A1 (en) * 1989-04-11 1990-10-12 Huw M. Davies Use of animal-derived anti-microbial peptides for control of plant pathogens
FR2695392B1 (fr) * 1992-09-04 1994-10-14 Centre Nat Rech Scient Peptides possédant notamment des propriétés antibactériennes, leur procédé d'obtention, et leurs applications biologiques.
FR2700338B1 (fr) * 1993-01-11 1995-03-31 Transgene Sa Nouvelle séquence pro permettant la secrétion de protéines hétérologues à partir d'une cellule de levure.
FR2725992A1 (fr) * 1994-10-25 1996-04-26 Rhone Poulenc Agrochimie Peptide antifongique
FR2745004B1 (fr) * 1996-02-16 1998-03-27 Rhone Poulenc Agrochimie Peptide antibacterien et antifongique
FR2766207B1 (fr) * 1997-07-11 2000-12-08 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere codant pour la drosomycine, vecteur le contenant pour la transformation des cellules vegetales et plantes transformees obtenues resistantes aux maladies

Also Published As

Publication number Publication date
KR20010042735A (ko) 2001-05-25
DE69936514D1 (de) 2007-08-23
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CA2325658A1 (fr) 1999-10-21
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AU3152599A (en) 1999-11-01
NO20005173L (no) 2000-12-15
HUP0102302A2 (hu) 2001-09-28
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IL139011A0 (en) 2001-11-25
ZA200006567B (en) 2002-01-14
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JP2002511260A (ja) 2002-04-16
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US6916782B1 (en) 2005-07-12
AR019066A1 (es) 2001-12-26
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CN1305526A (zh) 2001-07-25
NO20005173D0 (no) 2000-10-13
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PL345243A1 (en) 2001-12-03
AU754856B2 (en) 2002-11-28
PT1071767E (pt) 2007-10-23
ES2291021T3 (es) 2008-02-16
WO1999053053A1 (fr) 1999-10-21
PL198979B1 (pl) 2008-08-29

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