CZ20003785A3 - Peptid heliomicin, přípravek obsahující tento peptid, nukleová kyselina kódující heliomicin, transformovaný hostitelský organismus a způsob transformace - Google Patents

Description

Peptid heliomicin, přípravek obsahující nukleová kyselina kódující heliomicin, hostitelský organismus a způsob transformace tento peptid, transformovaný >

• Oblast techniky i

Předkládaný vynález se týká nového peptidu bohatého na cysteinové zbytky nazvaného heliomicin, použití tohoto peptidu jakožto léčiva. Dále se vynález týká přípravku, který obsahuje sekvenci DNA kódující tento peptid, vektoru obsahujícího tuto sekvenci vhodného pro transformaci hostitelského organismu a způsobu transformace takového organismu.

Vynález se zejména týká transformace rostlinných buněk a rostlin, kdy heliomicin produkovaný transformovanými rostlinami poskytuje těmto rostlinám rezistenci k chorobám, zejména k chorobám houbového původu.

Dosavadní stav techniky , V současné době je pociťována potřeba získat rostliny, které jsou rezistentní proti chorobám, zejména houbovým, chorobám, aby se z důvodu ochrany životního prostředí zmenšilo či případně zcela odstranilo používání fungicidnícn prostředků. Způsob, jak zvýšit rezistenci proti chorobám, spočívá v transformaci rostlin tak, aby tvořily látku, která je schopna jim zajistit ochranu proti těmto chorobám.

Pokud jde o oblast lidského zdraví, existují oportunní houbové infekce, proti kterým v současnosti není k dispozici účinná léčba. Konkrétně se jedná o určité těžké invazivní mykózy, které napadají pacienty s oslabeným imunitním • « produkována uchová své systémem např. Z důvodu transplantace, chemoterapie nebo infekce HIV. Ve srovnání s antibakteriálnimi činidly je arzenál protihoubových přípravků velmi omezený. Existuje proto stále potřeba vyvinout nové třídy látek s protihoubovým účinkem.

Jsou známy různé látky přírodního původu, zejména peptidy, které mají baktericidní nebo fungicidní vlastnosti, které působí zvláště proti houbám zodpovědným za choroby rostlin. Tudíž problém spočívá v tom, aby se mezi těmito látkami nalezla taková látka, která bude v transformovaných rostlinách, a navíc si baktericidní nebo fungicidní vlastnosti, které tím poskytne uvedeným rostlinám. Ve smyslu předkládaného vynálezu se baktericidními nebo fungicidními vlastnostmi rozumí jak baktericidní a fungicidní vlastnosti v pravém smyslu slova tak i vlastnosti bakteriostatické a fungistatické.

Je známo, že peptidy bohaté na cystein mají baktericidní nebo bakteriostatické vlastnosti, ale neprojevují fungicidní nebo fungistatickou aktivitu. Problémem je, na základě stavu techniky, tedy najít peptidy bohaté na cysteinové zbytky se silnou fungicidní nebo fungistatickou aktivitou.

Heliomicin je peptid, který byl izolován z hemolymfy motýla druhu Hsliothis virescens, a která vykazuje fungicidní aktivitu působící proti houbám, působícím nemoci rostlin, lidí i zvířat.

Zvláště výhodné řešení výše uvedených problémů představuje syntéze genu kódujícího heliomicin, které se upraví tak, že se mohou vložit do hostitelského organismu, zejména do rostliny, kde exprimují heliomicin, ať již v čisté formě nebo jinak, a hostitelský organismus díky expresi heliomicinu získá rezistenci k chorobám houbového původu.

·· · ·· ·· • · * · · · ·· • · · · · · · • ··♦··» ··· · · · ·· · · · ·

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je heliomicin, jeho použití jakožto léčiva nebo agrochemického přípravku i k ochraně rostlin, přípravek obsahující heliomicin, fragment nukleové kyseliny, která kóduje heliomicin, chimérický gen

I obsahující tento fragment kódující heliomicin a heterologní * regulační prvky v pozicích 5' a 3' funkční v hostitelském organismu, zejména v kvasinkách nebo rostlinách, a dále vektor pro transformaci hostitelského organismu obsahující chimérický gen a nakonec také transformovaný hostitelský organismus. Vynález se také týká transformované rostlinné buňky, která obsahuje přinejmenším jeden fragment nukleové kyseliny kódující heliomicin, a také rostliny rezistentní proti chorobám, která obsahuje tuto buňku, a zvláště rostliny, která byla regenerována z takové buňky. Dále se vynález týká způsobu transformace rostlin, kterou získají rezistenci k chorobám, když se do rostliny pomocí vhodného vektoru vnese gen kódující heliomicin. vynález se také týká způsobu přípravy heliomicinu z hostitelského organismu.

Heliomicin podle předkládaného vynálezu je peptid, který obsahuje výslovně peptidovou sekvenci podle následujícího . vzorce (I) :

Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag (I) ’ kde

Xaa představuje skupinu NH₂ nebo peptidový zbytek obsahující 1 až 10 aminokyselin,

Xab představuje peptidový zbytek obsahující 1 až 10 aminokyselin, výhodně 10 aminokyselin,

Xac představuje peptidový zbytek obsahující 3 aminokyseliny,

Xad představuje peptidový zbytek obsahující 1 až 9 »« aminokyselin, výhodně 9 aminokyselin,

Xae představuje peptidový zbytek obsahující 1 až 7 aminokyselin, výhodně 7 aminokyselin,

Xaf představuje peptidový zbytek obsahující 1 aminokyselinu, a

Xag je skupina -OH nebo peptidový zbytek obsahující 1 až 5 aminokyselin, výhodně 1 až 2 aminokyseliny.

Ve výhodném provedení vynálezu Xaa obsahuje alespoň jednu bazickou aminokyselinu a/nebo Xad obsahuje alespoň jednu bazickou aminokyselinu. Výhodněji obsahuje Xad 1, 2, 3 nebo 4 bazické aminokyseliny.

Výhodně Xad představuje peptidovou sekvenci -Lys-Xad'Xad-Gly-His-, kde Xad' představuje peptidový zbytek 1 bazické aminokyseliny a Xad představuje peptidový zbytek obsahující 0 až 5 aminokyselin, výhodně 5 aminokyselin.

K bazickým aminokyselinám ve smyslu předkládaného vynálezu patří aminokyseliny vybrané ze skupiny obsahující lysin, arginin a a homoarginin.

Výhodněji Xad představuje peptidovou sekvenci -Lys-ArgArg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Gly-His nebo -Leu-Leu-Arg-Gly-Tyr-LysGly-Gly-His.

V dalším výhodném provedení Xac obsahuje alespoň jednu kyselou aminokyselinu, výhodně právě jednu.

Výhodně Xac představuje peptidovou sekvenci -Asn-Xac'Xac-, kde Xac' představuje peptidový zbytek s 1 aminokyselinou a Xac představuje peptidový zbytek s 1 kyselou aminokyselinou.

Kyselé aminokyseliny ve smyslu předkládaného vynálezu jsou aminokyseliny obsahující na postranním řetězci funkční skupinu organické kyseliny, zvláště karboxylové kyseliny, a výhodně jsou vybrané ze skupiny obsahující kyselinou glutamovou (Glu) a asparagovou (Asp). -

Výhodně Xac představuje peptidovou sekvenci -Asn-Gly-Glu nebo -Ala-Ala-Glu.

Ve výhodném provedení vynálezu

Xaa představuje peptidovou sekvenci Xaa'-Gly-Xaa-, kde Xaa' je skupina NH₂ nebo peptidový zbytek obsahující 1 až 9 aminokyselin, výhodně 1 až 5 aminokyselin, a Xaa představuje peptidový zbytek obsahující nejméně 1 aminokyselinu vybranou z aminokyselin Leu, Ile, val, pro, Ser nebo Thr, a/nebo Xab představuje peptidovou sekvenci -Val-Xab'-Asp-, kde Xab' je peptidový zbytek obsahující 0 až 8 aminokyselin, výhodně 8 aminokyselin a/nebo

Xae představuje peptidovou sekvenci -Gly-Xae'-Asn, kde Xae' představuje peptidový zbytek obsahující 0 až 5 aminokyselin, výhodně 5 aminokyselin, a/nebo

Xař představuje jednu z následujících aminokyselin -Trp-, Phe, leu, Ile nebo Val,· a/nebo

Xag představuje peptidovou sekvenci -Glu-Xag', kde Xag' představuje skupinou OH nebo zbytek sekvence obsahující 1 až 4 aminokyseliny, výhodně 1 aminokyselinu.

Ve výhodném provedení vynálezu představuje Xaa peptidovou sekvenci NH2-Asp-Lys-Leu-Ile-Gly-Ser nebo NH2-AlaAla-Ala-Ala-Glv-Ser- a/nebo Xab představuje peptidovou sekvenci -Val-Trp-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Thr-Ser-Asp- a/nebo Xae představuje peptidovou sekvenci -Gly-Ser-Phe-Ala-Asn-ValAsn- a/nebo Xaf představuje aminokyselinu -Trp- a/nebo Xag představuje peptidovou sekvenci -Glu-Thr-OH nebo Arg-Thr-OH.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je heliomicin peptid kódovaný sekvencí identifikačního čísla 2 (id. č. 2) . Stejná sekvence, pokud jde o aminokyseliny 6 až 49 v sekvenci id. č. 1 je popsána jinou kódující sekvencí.

Zbytek na NH₂-konci heliomicinu může být posttranslačně modifikován, např. acetylací, a stejně tak může být posttranslačně modifikován zbytek na C-konci, např. amidací.

• ·

Peptidovou sekvencí obsahující v podstatě peptidovou sekvenci podle vzorce (I) se rozumí nejen sekvence zde definované, ale sekvence obsahující na jednom nebo na druhém konci, nebo na obou, peptidové zbytky, zejména takové zbytky, které jsou nezbytné pro její expresi a směrování v hostitelském organismu. Hostitelským organismem se myslí organismus obsahující alespoň jednu buňku, jako jsou mikroorganismy, zejména kvasinky nebo bakterie, nebo také rostlinné buňky a také vyšší organismy jako např. rostliny.

Dále se jedná zejména o fúzní peptid peptid-heliomicin ze kterého se může vystřižením pomocí enzymatického systému rostlinné buňky uvolnit heliomicin, jak byl definován v předkládané přihlášce. Fúzní peptid s heliomicinem dále může obsahovat signální peptid nebo tranzitní peptid, které umožňují řídit a směrovat vytvářený heliomicin specifickým způsobem do určité části hostitelského organismu, zejména rostlinné buňky nebo rostliny, např. do cytoplazmy nebo na buněčnou membránu, a nebo v případě rostlin do určitého buněčného kompartmentu nebo určitých pletiv nebo do extracelulárního prostoru.

V jednom provedení vynálezu tranzitní peptid obsahuje signál pro chloroplastovou nebo mitochondriální lokalizaci, čímž je zajištěno štěpení v chloroplastu nebo mitochondrii.

V dalším povedení vynálezu může signální peptid obsahovat N-koncový signál neboli spojený se signálem zodpovědným v endoplazmatickém retikulu, nebo peptid pro zaměření vakuoly neboli propeptid. Endoplazmatické retikulum je místo, které je v rámci buněčného mechanismu zodpovědné za procesy zrání proteinových produktů, jako je např. odštěpení signálního peptidu.

Tranzitní peptid je buďto jeden nebo mohou být dva, a v takovém případě 'jsou odděleny vmezeřenou intermediární prepeptid, případně za zadržení proteinu do • · sekvencí, takže ve směru transkripce, jedna sekvence kóduje tranzitní peptid rostlinného genu kódujícího enzym s plastidovou lokalizací, pak následuje část zralé sekvence N-konce rostlinného genu kódujícího enzym s plastidovou lokalizací, a pak sekvence kódující druhý tranzitní peptid rostlinného genu kódujícího enzym s plastidovou lokalizací, jak to bylo již popsáno v patentové přihlášce EP 0 503 909.

Vhodným tranzitním peptidem podle vynálezu lze uvést zejména signální peptid genu PR-Ια tabáku (popsaný v Cornelissen et al.), který je zde uveden s kódující sekvencí id. č. 2, když je heliomicin produkován rostlinnou buňkou nebo rostlinou, nebo prekurzor faktoru Mátal, když je heliomicin produkován kvasinkovou buňkou.

Fúzní peptid MFal/heliomicin s pěti aminokyselinovými zbytky propeptidu faktoru MFal (Ser-Leu-Asp-Lys-Arg) situovanými na N-konci kódující sekvence podle vynálezu, je zde popsán v sekvenci id. č. 1, aminokyseliny 1 až 49.

signální peptid PR-la/heliomicin podle vynálezu je

Fúzní a kódující sekvence id.

Fúzní zde uveden j ako peptid genu PG1 peptid sekvence

č. 3.

peptid obsahující signální polygalkturonázy z kukuřice fúzovaný s heliomicinem, tedy signální peptid PGl/heliomicin s kódující sekvencí je zde uveden jako sekvence id. č. 13 a 20.

Ve výhodném provedení vynálezu cysteinové vzorce (I) vytvářejí alespoň disulfidický můstek, výhodněji v peptidu podle intrámolekulární zbytky j eden tři disulfidické můstky. Ve výhodném provedení vynálezu disulfidické můstky spojují cysteinové zbytky 1 a a 3 a 6.

Heliomicin je peptid účinný zejména proti houbám a kvasinkám, a tudíž může být využit jako preventivní nebo

léčebný prostředek k ochraně různých organismů proti napadení houbami. Tudíž se předkládaný vynález týká také heliomicinu jakožto léčiva. Také se týká použití heliomicinu k ošetřené rostlin proti napadení houbami formou přímé aplikace heliomicinu na tyto rostliny.

Předkládaný vynález se dále týká přípravku, který obsahuje heliomicin a vhodné vehikulum. Vhodné vehikulum je prvotřídní kvality, takže nedegraduje podstatně heliomicin v přípravku ani nezhoršuje jeho baktericidní a fungicidní vlastnosti. Jedná se buďto o kosmetický přípravek, pak je vehikulum kosmeticky přijatelné (vhodné pro aplikaci na kůži nebo případně zuby, nehty či vlasy), nebo o farmaceutický přípravek určený k- léčebnému použití, pak je vehikulum farmaceuticky přijatelné pro topické podávání heliomicinu, nebo pro podávání per os (ústy) nebo formou injekce. A nebo se jedná o agrochemický přípravek, pak je vehikulum agrochemicky přijatelné vhodné pro aplikaci na rostliny nebo do okolí rostlin, aniž by došlo k degradaci heliomicinu.

Předkládaný vynález se dále týká fragmentu nukleové kyseliny, zejména DNA, přírodní nebo syntetické, kódující heliomicin definovaný výše, včetně fúzního peptidu peptidheliomicin.

Vynález se týká fragmentu, který je syntetizován nebo je izolován z motýla rodu Heliothis, nebo odvozeného fragmentu, upraveného tak, aby vedl k expresi heliomicinu v hostitelském organismu nebo umožňoval exprimovat peptid. Fragment nukleové kyseliny může být získán standardními metodami izolace a purifikace nebo může být syntetizován známými metodami užívajícími postupné hybridizace syntetických oligonukleotidů. Tyto postupy jsou odborníkům známy a jsou popsány mapř. v publikaci Ausubel et al.

Ve smyslu předkládaného vynálezu fragment nukleové kyseliny je nukleotidová sekvence typu DNA nebo RNA, výhodně jde o DNA, zejména dvouřetězcového typu.

V jednom provedení vynálezu fragment nukleové kyseliny kódující heliomicin je sekvence DNA uvedená zde jako báze 16 až 147 v sekvenci id. č. 1 nebo sekvence id. č. 2, zejména kódující část této sekvence zahrnující báze 1 až 132, sekvence homologní nebo sekvence komplementární k této sekvenci.

V jiném provedení vynálezu fragment nukleové kyseliny kódující fúzní peptid peptid-heliomicin obsahuje sekvenci DNA uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 nebo sekvence id. č. 3, zejména její kódující část zahrnující báze 3 až 224, nebo jako sekvence id. č. 18, zejména část kódující baze 7 až 205, nebo homologní nebo komplementární sekvenci.

Termínem homologní sekvence se podle předkládaného vynálezu rozumí fragment nukleové kyseliny obsahující jednu nebo několik modifikací vzhledem k nukleotidové sekvenci popsané zde jako sekvence id. č. 1, 2 a 3, kódující heliomicin nebo fúzní peptid peptid-heliomicin. Tyto modifikace lze získat v oboru známými metodami mutageneze, kromě toho také výběrem syntetických oligonukleotidů použitých k přípravě uvedené sekvence pomocí hybridizace. Vzhledem k mnoha kombinacím nukleové kyseliny, které kódují expresi téže aminokyseliny, rozdíly v sekvenci id. č. 1, 2 a 3 a odpovídajících homologních sekvencích mohou být důležité, a tím spíše to platí pro fragmenty DNA získané chemickou syntézou. Výhodně je míra homologie s uvedenou referenční sekvencí nejméně 70 %, výhodněji nejméně 80 % a nej výhodněji alespoň 90 %. Obecně jsou tyto modifikace neutrální, tudíž neovlivňují primární sekvenci heliomicinu nebo výsledného fúzního peptidu.

• · · · • · · ·

Předkládaný vynález se dále týká chimérického genu (nebo expresní kazety) obsahující sekvenci kódující také heterologní regulační prvky v pozicích 5' a 3', které jsou funkční v hostitelském organismu, zejména v rostlinné buňce nebo rostlině, funkčně (operativně) spojené s kódující sekvencí, kterážto kódující sekvence obsahuje alespoň jeden fragment DNA kódující heliomicin nebo fúzní peptid peptidheliomicin popsané výše.

o bakterie E. K1uyveromyces

Hostitelským organismem je podle vynálezu míněn organismus jednobuněčný nebo mnohobuněčný, nižší nebo vyšší, do kterého je vložen chimérický gen podle předkládaného vynálezu pro tvorbu heliomicinu. zejména se jedná např.

coli, kvasinky, zvláště rodu Saccharcmyces, nebo Pichia, houby rodu Aspergillus, bakuloviry, nebo výhodně rostlinné buňky a rostliny.

Rostlinná buňka znamená ve smyslu předkládaného vynálezu buňku tvořící rostlinné pletivo, ať už tvoří nediferencovanou tkáň jako je kalus nebo tvoří diferencované tkáně jako embryo, části rostliny, rostlinu nebo semena.

Rostlina ve smyslu předkládaného vynálezu znamená celý mnohobuněčný diferencovaný organismus, který je schopný fotosyntézy, je to rostlina jednoděložná nebo dvouděložná, a zvláště se pak jedná o rostliny kulturní určené pro výživu člověka nebo zvířat, kam patří např. kukuřice, pšenice, řepka, sója, rýže, cukrová třtina, řepa, tabák, bavlna a další.

Regulační prvky nezbytné pro expresi fragmentu DNA kódujícího heliomicin, funkční v hostitelském organismu, jsou odborníkovi známy. K těmto prvkům patří zejména promotorové sekvence, aktivátory transkripce, terminační sekvence včetně start a stop kodonu. Prostředky a metody pro identifikaci a výběr těchto regulačních prvků jsou odborníkovi známy.

Regulační prvky vhodné pro transformaci mikroorganismů jako jsou kvasinky nebo bakterie jsou odborníkům známy, a patří k nim promotorové sekvence, aktivátory transkripce, tranzitní peptidy a terminační sekvence včetně start a stop kodonu.

Pro řízení exprese v kvasinkách a sekreci peptidu do kultivačního média je fragment DNA kódující heliomicin integrován do kyvadlového vektoru, kterýžto vektor obsahuje následující prvky:

- markéry umožňující selekci transformant, výhodně se užije gen ura-3 pro kvasinky a gen rezistence k ampicilinu pro E. coli, nukleotidovou sekvenci umožňující replikaci počátek) plazmidu v kvasinkách, výhodně replikační počátek kvasinkového plazmidu 2u, nukleotidovou sekvenci umožňující replikaci počátek) plazmidu v E. coli, expresní kazetu, která obsahuje

1) regulační promotorovou sekvenci, výhodně promotorova sekvence genu, který je přirozeně exprimován v kvasinkách, výhodně promotor genu Mfal ze S. cerevisiae,

2) sekvenci kódující signální peptid (nebo prepeptid) ve spojení se zaměřovacím peptidem (nebo propeptidem), přičemž tyto úseky jsou důležité pro správnou sekreci peptidu, a výhodně se užije sekvence kódující pre-pro-peptid prekurzoru faktoru Mfal,

3) sekvenci regulující terminaci nebo polyadenylaci, výhodně se užije terminátor fosfoglycerátkinázy (PGK) ze S. cerevisiae.

V expresní kazetě se sekvence kódující heliomicin vloží za pre-pro sekvenci a před sekvenci terminátoru PGK.

(replikační se užije (replikační se užije • · · · · · · ··· · · ·· ··

Tyto prvky byly popsány v mnoha publikacích jako např. Reichhart et al., 1992, Invert. Reprod. Dev. 21, 15-24, a Michaut et al., 1996, FEBS Letters 395, 6-10.

Ve výhodném provedení se kvasinky druhu S. cerevisiae transformují expresním plazmidem metodou, která užívá lithiumacetát (Ito et al., 1993, J. Bacteriol. 153, 163-168). Transformované kvasinky se pak selektují na gelových plotnách neobsahujících uráčil. Produkce transformovaných kvasinek ve velkém měřítku se provádí v kultuře obsahující kapalné selektivní médium po dobu 24 až 48 hodin.

Transformované mikroorganismy umožňují produkovat heliomicin ve velkém měřítku. Předkládaný vynález se proto také týká způsobu přípravy heliomicinu, který obsahuje kroky, kdy se kultivuje transformovaný mikroorganismus, který obsahuje gen kódující heliomicin definovaný výše, ve vhodném kultivačním médiu a krok, kdy se získaný heliomicin extrahuje a úplně nebo částečně purifikuje.

Ve výhodném provedeni vynálezu se při extrakci heliomicinu v kvasinkách tyto kvasinky odstraní centrifugací a supernatant se smíchá s kyselým roztokem jako je např. roztok anorganické nebo organické kyseliny, např. kyseliny chlorovodíkové nebo kyseliny octové. Získaný extrakt se pak centrifuguje při 4000 až 10000 rpm ve 4 °C po dobu 30 až 60 minut.

Purifikaci heliomicinu předchází ještě fáze frakcionace supernatantu získaného ve fázi extrakce. ve výhodném provedení vynálezu se v průběhu frakcionace se extrakt nanese ne reverzní fázi vhodnou pro extrakci na pevné fázi. Vymytí molekul rozpustných ve vodě ze sloupce se provede roztokem kyseliny a eluce hydrofóbních molekul se provede vhodným elučním roztokem. Dobré výsledky se získají užitím trifluoroctové kyseliny pro vymytí kolony a s elučním

roztokem obsahujícím zvyšující se množství acetonitrilu v roztoku kyseliny.

Ve výhodném provedení se purifikace heliomicinu provádí ve dvou fázích: pomocí kationtové výměnné HPLC následované HPLC s inverzní fází s elučním roztokem, který je odlišný nebo shodný s předchozí fází. jednotlivé etapy purifikace jsou následovány inhibičním testem houby v kapalném médiu. Výhodně se test provádí s houbou Neurospora crasa.

Sekvence heliomicinu produkovaného transformovanými kvasinkami se analyzuje známými metodami sekvencování Edmanovou degradací a hmotovou spektroskopií. Strukturní charakterizace se provádí přímo na peptidovém produktu, na peptidu modifikovaném redukcí/alkylaci jakož i na peptidových fragmentech. Peptidová sekvence a molekulová hmotnost se pak porovnají s hodnotami získanými pro nativní heliomicin izolovaný z hemolymfy H. virescsns. Tyto výsledky umožní porovnat dvě srovnávané molekuly z hlediska primární struktury. Stanovení poloh disulfidických můstků pak ukáže, zda je jejich uspořádání shodné u obou srovnávaných peptidů, tj . nativního peptidu a produktu transformovaného mikroorganismu.

Předkládaný vynález se dále týká zvláště transformace rostlin. Jako regulační promotorovou sekvenci v rostlině je možné užít promotor genu, který je přirozeně exprimován v rostlině, a zejména promotor bakteriálního, virového nebo rostlinného původu, jako je např. gen pro malou podjednotku ribulózobisfosfát-karboxylázy/oxygenázy (RuBisCO), nebo gen rostlinného viru jako je např. virus mozaiky květáku (CAMV, 19S nebo 35S promotor), nebo promotor indukovatelný patogenem jako je např. PR-Ια z tabáku, který je také výhodný pro použití dle vynálezu. Výhodné je užití regulační promotorové sekvence, která umožňuje konstitutivní expresi kódované • · · » 4 • · .

sekvence nebo expresi indukovanou po napadení patogenem, jako je např. histonový promotor popsaný v patentové přihlášce EP 0 507 698.

Podle předkládaného vynálezu je také možné užít ve spojení s promotorovou sekvencí další regulační sekvence, které jsou situovány mezi promotorem a kódující sekvencí, jako jsou např. aktivátory transkripce (enhacery, zesilovače), např. aktivátor transkripce z viru mozaiky tabáku (TMV) popsaný v patentové přihlášce WO 87/07644, nebo z viru skvrnitosti tabáku (TEV), který popsali Carrington a Freed.

Jako sekvence řídící terminaci nebo polyadenylaci je možné užít odpovídající sekvence bakteriálního původu, jako např. terminátor nos z Agrobacterium tumefaciens, nebo také rostlinného původu, jako např. terminátor histonového genu, jaký byl popsán v patentové přihlášce EP 0 633 317.

Chimérický gen podle předkládaného vynálezu je spojen se selekčním markérem vhodným pro hostitelský organismus. Takové selekční markéry jsou odborníkovi dobře· známy, jedná se především o geny rezistence k antibiotikům a také o geny poskytující rostlinám toleranci k herbicidům.

Předkládaný vynález se také týká klonovacího nebo expresního vektoru pro transformaci hostitelského organismu, který obsahuje alespoň jeden chimérický gen podle vynálezu definovaný výše. Tento vektor obsahuje kromě již zmíněného chimérického genu nejméně jeden replikační počátek. Tento vektor je představován plazmidem, kozmidem, bakteriofágem nebo virem, do kterých byl vložen chimérický gen podle předkládaného vynálezu. Takové transformační vektory vhodné pro transformaci hostitelského organismu jsou v oboru známy a jsou popsány v odborné literatuře.

Pro transformaci rostlinných buněk nebo rostlin jde zejména o virus, který lze využít k transformaci vyvíjejících se rostlin, a který obsahuje také vlastní prvky pro replikaci a expresi. Ve výhodném provedení je transformačním vektorem pro rostlinné buňky nebo rostliny podle vynálezu plazmid.

je způsob transformace

Dalším předmětem vynálezu hostitelského organismu, zejména rostlinných buněk, a to tím, že se do nich vloží alespoň jeden fragment nukleové kyseliny nebo chimérický gen, jak byly definovány výše podle vynálezu, přičemž transformace se provede vhodnými prostředky odborníkovi známými, které jsou popsány v odborné literatuře, zejména v publikacích citovaných v literárních odkazech v této přihlášce. Zejména se jedná o transformaci vektorem podle předkládaného vynálezu.

Jednou z řady metod pro transformaci je bombardování buněk nebo protoplastů částicemi, na které je navázaná sekvence DNA. Další metoda spočívá v tom, že se jako prostředek k přenosu do rostliny využije Ti plazmid z Agrobacterium tumefacians nebo Ri plazmid z Agrobacterium rhizogenes, do kterého se vloží chimérický gen.

Dalšími metodami, které lze užít, je mikroinjekce nebo elektroporace, a také přímá precipitace prostřednictvím PEG.

Odborník zvolí vhodnou metodu v závislosti na povaze hostitelského organismu, zejména rostlinné buňky nebo rostliny.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou hostitelské organismy, zvláště rostlinné buňky nebo rostliny, které jsou transformované a obsahují ve svém genomu účinné množství chimérického genu obsahujícího sekvenci kódující heliomicin, jak je definován výše v této přihlášce.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou rostliny, které obsahují transformované buňky, zvláště rostliny získané regenerací z transformovaných buněk. Regeneraci lze provést • · • ·

- 16 jakýmkoliv vhodným způsobem odborníkovi známým, který závisí na druhu rostliny, např. způsobem popsaným v odborné literatuře uvedené v odkazech k této přihlášce.

Postupy transformace rostlinných buněk a regenerace rostlin byly popsány např. v následujících patentových dokumentech: US 4 459 355, US 4 536 475, US 5 464 763, US 5 177 010, US 5 187 073, EP 267 159, EP 604 662, EP 672 752, US 4 945 050, US 5 036 006, US 5 100 792, US 5 371 014, 744, US 5 179 022, US 5 565 346, US 5 484 956,

554 798, US 5 489 520,

US 5 478 US 5 538 US 5 204 253, EP 486 234, a WO 95/06128.

US 5 510 313, EP 486 233, WO 91/02071

877,

US

US 5 405 765, EP 539 563,

EP 442 174, EP 674 725,

Dále jsou předmětem předkládaného vynálezu také transformované rostliny získané kultivací a/nebo křížením regenerovaných rostlin podle vynálezu, a taktéž semena transformovaných rostlin.

Transformované rostliny podle předkládaného vynálezu jsou rezistentní k některým chorobám, zvláště k některým chorobám způsobených houbami nebo bakteriemi. Rezistence rostlin proti těmto chorobám je vytvořena tím způsobem, že je do rostlin integrována sekvence DNA kódující heliomicin podle vynálezu, přičemž heliomicin je účinný proti houbovým chorobám, které způsobují houby rodu Cercospora, zejména Cercospora beticola, rodu Cladosporium, zejména Cladosporium herbarum, rodu Fusarium, zejména Fusarium culmorum nebo Fusarium graminearum, a Phytophthora, zejména Phytophthora cinnamoni.

Ve výhodném provedení vynálezu je chimérický gen spojen s alespoň jedním selekčním markérem, kterým může být jeden nebo několik genů tolerance k herbicidům.

Sekvence DNA kódující heliomicin může být také spojena s takovým markérem pro selekci transformovaných rostlin a ještě s dalšími sekvencemi kódujícími jiné požadované peptidy nebo proteiny, např. s geny tolerance k herbicidům.

Takové geny tolerance k herbicidům jsou odborníkovi známy a byly popsány např. v patentových přihláškách EP 115 673, WO 87/04181, EP 337 899, WO 96/38567 nebo WO 97/04103.

Samozřejmě také transformované buňky a rostliny podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat kromě sekvence kódující heliomicin další heterologní sekvence kódující požadované proteiny jako např. jiné peptidy, které poskytují rostlinám rezistenci k dalším nemocem bakteriálního nebo houbového původu a/nebo další sekvence kódující proteiny zajišťující toleranci k herbicidům a/nebo další sekvence kódující proteiny zajišťující toleranci k hmyzím škůdcům, jako je např. protein Bt.

Další sekvence, které se mohou vložit prostřednictvím vektoru obsahujícího chimérický gen podle vynálezu, jsou takové sekvence, které obsahují první sekvenci kódující heliomicin a alespoň jednu další sekvenci kódující další požadovaný peptid nebo protein.

Je také možné vložit nejméně jeden další vektor obsahující alespoň jednu další sekvenci, a to způsobem v oboru známým, jak bylo již popsáno.

Rostliny podle vynálezu je také možné získat křížením rodičovských rostlin, kdy jedna z rodičovských rostlin nese gen podle vynálezu kódující heliomicin a druhá z rodičovských rostlin nese gen kódující alespoň jeden další požadovaný peptid nebo protein.

K sekvencím kódujícím další peptidy s protihoubovým účinkem patří např. sekvence kódující drosomicin, která byla popsána v patentu FR 2 725 992, v publikaci Fehlbaum et al.

• ·

1994 a v nepublikované patentové přihlášce FR 97 09115 podané 24 července 1997, nebo sekvence kódující androctonin popsaná v patentu FR 2 745 004 a v nepublikované patentové přihlášce FR 97 10362 podané 20. srpna 1997.

Předkládaný vynález se nakonec také týká způsobu pěstování rostlin transformovaných podle vynálezu, který spočívá v tom, že semena těchto transformovaných rostlin se vysejí na povrch pole vhodného pro pěstování takových rostlin, a na povrch tohoto pole se pak aplikuje agrochemický prostředek, aniž by podstatně ovlivnil tato semena nebo transformované rostliny, pak jakmile dosáhnou zralosti se pěstované rostliny sklidí a případně se oddělí semena ze sklizených rostlin.

Agrochemickým prostředkem se ve smyslu vynálezu rozumí agrochemický prostředek obsahující alespoň jednu účinnou látku vykazující jeden z následujících účinků: herbicidní, fungicidní, baktericidní, virocidní a insekticidní.

Ve výhodném provedení způsobu pěstování podle vynálezu agrochemický prostředek obsahuje alespoň jednu účinnou látkou s fungicidní a/nebo baktericidní aktivitou, výhodněji s aktivitou doplňující aktivitu heliomicinu tvořeného v rostlinách transformovaných podle vynálezu.

Produktem s aktivitou doplňující aktivitu heliomicinu se podle předkládaného vynálezu míní produkt vykazující řadu doplňujících aktivit, jako je např. produkt účinně působící proti napadení škůdci (houbami, bakteriemi, viry), necitlivými k heliomicinu, nebo produkt, jehož spektrum účinnosti se plně nebo částečně překrývá s heliomicinem, a jehož aplikační dávka se podstatně sníží díky přítomnosti heliomicinu tvořeného transformovanými rostlinami.

Dále uvedené příklady slouží k ilustraci vynálezu, aniž by ho jakkoliv omezovaly.

• ·

- 19 Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace a charakterizace heliomicinu získaného z hemolymfy imunizovaných larev motýla H. virescens

1.1. Izolace

1-1. Indukce biosyntézy látky s protihoubovým účinkem v hemolymfě H. virescens

Zralé larvy 5. stádia motýla H. virescens byly imunizovány pomocí injekční jehly (velikost 30) předtím ponořené do peletu Gram-pozitivních bakterií (M. luteus) a Gram-negativních bakterií (£. coli 1106) získaných z kultur pěstovaných v médiu Luria-Bertani po 12 hodin ve 37 °C. Po infekci byly larvy umístěny jednotlivě ve zkumavce obsahující agarové živné médium na 24 hodin při 20 až 23 °C. Před odběrem hemolymfy byly larvy ochlazeny na ledu.

1-2. Příprava plazmy

Hemolymfa (přibližně 30 μΐ z jedné larvy) byla odebírána naříznutím břišního výběžku a jímáním do l,5ml polypropylénové mikrocentirfugační zkumavky na ledu, která obsahovala aprotinin jakožto inhibitor proteáz (20 μg/ml výsledná koncentrace) a fenylthiomočovinu jakožto inhibitor melanizace (výsledná koncentrace 20 μΜ) . Hemolymfa (2 ml) takto odebraná z imunizovaných larev byla centrifugována při 14000 g po 1 minutu ve 4 °C, aby se odstranily hemocyty..

Hemolymfa zbavená krevních buněk byla uchována při -20 °C až do použití.

• ·

1-3.Acidifkace plazmy

Po rychlém rozmražení byla plazma z H.virescens okyselena na pH 3 užitím 1% roztoku kyseliny trifluoctové. Kyselá extrakce peptidu probíhala 30 minut za třepání na ledové lázni. Získaný extrakt byl centrifugován 30 minut při 10000 g ve 4 °C.

1-3. Purifikace peptiaů

a) Prepurifikace extrakcí pevné fáze

Množství extraktu odpovídající 2 ml hemolymfy bylo naneseno na nosič s pevnou inverzní fází, jaký je komerčně dostupný ve formě předem naplněných kolonek (např. Sep-Pak™ C18, Waters Associates), a ekvilibrováno s vodným roztokem kyseliny (0,05% TFA) . hydrofilní molekuly byly eliminovány jednoduchým propláchnutím kyselým vodným roztokem. Eluce peptidu byla provedena 40% roztokem acetonitrilu v 0,05% TFA. Frakce eluovaná 40% roztokem acetonitrilu byla vysušena pod vakuem, a aby se před první fází purifikace odstranily stopy acetonitrilu a TFA, byla rozpuštěna ve sterilní ultračisté vodě.

b) Purifkace pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). na koloně s inverzní fází

První fáze: Frakce obsahující peptid byla analyzována chromatografii s inverzní fází na semipreparativní koloně Aquapore RP-300 C8 (Brownlee^, 220 x 70 mm, 300 Á) , eluce byla provedena lineárním gradientem acetonitrilu od 2% do 60% v 0,05% TFA po dobu 120 minut s konstantním průtokem 1,5 ml/min. Frakce byly sbírány ručně podle změn absorbance ve 225 a 254 nm. Odebrané frakce byly vysušeny pod vakuem a rekonstituovány v ultračisté vodě a pak analyzovány na fungicidní účinek testem popsaným v další části.

• ·

Druhá fáze: Frakce s protihoubovým účinkem odpovídající peptidu byla analyzována pomocí analytické kolony s inverzní fází (Brownlee™, 220 x 4,6 mm, 300 Á) užitím lineární dvoufázového gradientu acetonitrilu 2 až 22 % v 0,05% TFA po 10 minut a 22 až 32 % po dalších 50 minut se stálým průtokem 0,8 ml/min. Frakce byly sbírány ručně podle změn absorbance ve 225 a 254 nm. Odebrané frakce byly vysušeny pod vakuem a rekonstituovány v ultračisté vodě a pak anylyzovány na fungicidní účinek.

Třetí fáze: Frakce s protihoubovým účinkem obsahující peptid byla purifikována do homogenity pomocí kolony s inverzní fází Narrowbore Delta-Pak™ HPIC18 (Waters Associates, 150 x 2,2 mm, 300 Á) užitím lineární dvofázového gradientu acetonitrilu 2 až 24 % v 0,05% TFA po 10 minut a 24 až 44 % po dalších 100 minut se stálým, průtokem 0,25 ml/min při kontrolované teplotě 30 °C. Frakce byly sbírány ručně podle změn absorbance ve 225 nm. Odebrané frakce byly vysušeny pod vakuem a rekonstituovány ve vodě čištěné ultrafiltrací a pak analyzovány na fungicidní účinek.

1.2 Strukturní charakteristiky peptidu

2-1. Ověření čistoty kapilární zonální elektroforézou

Čistota peptidu s protihoubovým účinkem byla ověřena užitím zařízení pro kapilární zonální elektroforézu 270-HT (PE Applied Biosystems, division Perkin Elmer) . 1 ni 50 μΜ roztoku purifikovaného peptidu byl injekční jehlou vstříknut do skleněné kapiláry (72cm x 50 pm) a analyzován v 20 pM citrátovém pufru s pH 2,5. Elektroforéza probíhala 20 minut při 20 kV ve 30 °C. Migrace byla registrována po 200 nm.

2-2. Stanovení počtu cysteinových zbytků: redukce a S-pyridyletylace

Počet cysteinových zbytků byl stanoven na nativním peptidu redukcí a S-pyridyletylací. 100 pmol nativního peptidu se redukovalo ve 40 μΐ pufru 0,5M Tris/Hcl, pH 7,5 obsahujícího 2 mM EDTA a 6M guanidiniumchlorid, s přídavkem 2 μΐ 2,2 M dithiotreitolu. reakční směs byla umístěna do dusíkové atmosféry. Po 60 minutové inkubaci ve tmě, 2 μΐ čerstvě destilovaného 4-vinylpyridinu bylo- přidáno do reakce a ta byla dále inkubována 10 minut ve 45 °C ve tmě v dusíkové atmosféře. Z reakční směsi byl chromatografií a inverzní fází separován pyridyletylpeptid užitím lineárního gradientu acetonitrilu v 0,05 % TFA.

2-3. Stanovení hmotnosti nativní hopeptidu,

S-pyridyletylpeptidu a proteolytických fragmentů užitím hmotové spektrometrie MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption ionization-time of light)

Měření hmotnosti bylo provedeno na hmotovém spektrometru MALDI-TOF (Bruker Biflex, Brémy, ' Německo) v lineárním pozitivním modu. Hmotová spektra byla kalibrovány pomocí směsi standardů peptidů v rozmezí 2199,5 Da až 4890, 5 Da. Analyzované produkty byly vloženy na slabou vrstvu krystalů kyseliny a-kyano-4-hydroxyskořicové získanou rychlým odpařením nasyceného acetonového roztoku. Po osušení ve vakuu byly vzorky opláchnuty kapkou 0,1% kyseliny trifluoroctové před tím, než byly vloženy do spektrometru.

2-4. Sekvencování peptidu Edmanovou degradací

Automatické sekvencování Edmanovou degradací nativního peptidu, S-pyridyletylpeptidu a různých fragmentů, získaných proteolytickým štěpením a detekce fenylthiohydantoinových derivátů byly prováděny pomocí automatické sekvencovacího • ·

zařízení ΑΒΙ 473 A (PE Applied Biosystems, Division Perkin Elmer).

2-5. Proteolytické štěpení

Potvrzení peptidové sekvence C-koncového úseku

200 pmol redukovaného peptidu a S-pyridyletyl byly inkubovány v přítomnosti 5 pmol endoproteinázy Lys-C (proteáza I z Acromobacter, štěpí specificky lysinové zbytky v blízkosti C-konce, Takara, Otsu) v reakční směsi podle doporučení výrobce (lOmM Tris-Cl, pH 9, 0,01% Tween 20) . Po zastavení reakce 1% TFA byly peptidové fragmenty separovány pomocí HPLC s inverzní fází na koloně Narrowbore Delta-Pak™ HPIC18 (Waters Associates, 150 x 2 mm, 300 Á) užitím lineární gradientu acetonitrilu 2 až 60 % v 0,05% TFA po 80 minut se sráiým průtokem 0,2 mi/min při konstantní teplotě 37 °C.

Získané fragmenty byly analyzovány pomocí hmotového spektrometru MALDI-TOF a peptidy odpovídajíc C-konci byly sekvencovánv Edmanovou degradací.

Stanovení uspořádaní disulfidických můstků proteolýzcu thermolysinem μρ nativního peptidu bylo inkubováno 1 hodinu se 4 μg thermolysinu (Boehringer Mannheim, thermolysin/peptid = 1/2 hmot.) ve 37 °C v pufru 0, 1M MES (N-etylmorfolin) s pH 7,0 a 2mM CaCl₂. Reakce byla zastavena přídavkem kyseliny mravenčí a reakční produkt byl bezprostředně separován pomocí HPLC s inverní fází na koloně Narrowbore Delta-Pak™ HPIC18 (Waters Associates, 150 x 2,2 mm) užitím lineární gradientu acetonitrilu 2 až 50 % v 0,05% TFA po 100 minut se stálým průtokem 0,2 ml/min při ' konstantní teplotě 30 °C s předcházející isokratickou fází 2 % acetonitrilu po 10 minut. Získané fragmenty byly analyzovány pomocí hmotového

spektrometru MALDI-TOF a peptidy odpovídajíc C-konci byly sekvencovány Edmanovou degradací.

Příklad 2 i Exprese heliomicinu v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae

V příkladu byly užity standardní postupy odborníkovi známé. Detailní protokoly lze najít např. v publikaci Ausubel et al.

2-1. Konstrukce syntetického genu

Syntéza byla provedena pomocí 6 syntetických oligonukleotidů kódujících 44 aminokyselin heliomicinu, kterým předchází 5 aminokyselin C-konce prepropeptidu faktoru al (Mfal) kvasinek. Oligonukleotídy uvedené na obr. 1 byly vybrány tak, aby obsahovaly kodony přednostně užívané v S. cerevisiae.

Syntéza byla provedena v několika fázích:

oligonukleotídy 2 až 5 byly fosforylovány na 5'koncích působením polynukleotidylkinázy (New England Biolabs), oligonukleotídy 1 až 6 byly smíchány, zahřátý na 100 °C

- a hybridizovány postupným snižováním teploty během 3 hodin na 25 °C, ’ - hybridizované oligonukleotídy pak byly spojeny působením ligázy bakteriofága T4 (New England Biolabs) 15 hodin v 15 °C,

- úsek DNA vzniklý hybridizací oligonukleotidů uvedených na obr. 1, opatřený restrikčními místy HindlII a BglII byl vložen do plazmidu pBluescript SK+ (Stratagene) naštěpného enzymy HindlII a BamHI (BglII a BamHI jsou kompatibilní). Ligační směs pak byla užita pro transformaci kompetentních • · • ·

- 25 buněk E. coli DH5a (Stratagene) . Několik klonů bylo analyzováno sekvencováním. Klon obsahující požadovanou sekvenci byl nazván pSEAl.

2-2. Konstrukce vektoru pSEA2, který umožňuje sekreci syntetického heliomicinu

Fragment DNA HindlII-SalI z vektoru pSEAl obsahující sekvenci kódující heliomicin jakož i fragment SphI-HindlII vektoru M13JM132 (Michaut et al., 1985, FEBS Letters 395: 610) byl vložen do míst Sphl a sáli plazmidu pTG4812 (Michaut et al., 1935, FEBS Letters 395: 6-10). Fragment SphI-HindlII vektoru M13JM132 obsahuje promotorovou sekvenci genu MFal z kvasinek a také sekvenci kódující pre-pro úsek faktoru MFal. Ve výsledném plazmidu pSEA2 je syntetický gen pro heliomicin mezi pre-pro sekvenci faktoru MFal a terminátor transkripce, takže tento konstrukt zajišťuje maturaci a sekreci heliomicinu.

2-3. Transformace kmenu S. cerevisiae DNA plazmidu pSEA2 a analýza transformant

Kvasinkový kmen S. cerevisiae TGY 48.1 (MATa, ura3-D5, his, pral, prbl, prcl, cpsl, Reichhart et al, 1992, Invert. Reprod. Dev. 21: 15-24) byl transformován plazmidem pSEA2. Transformanty byly selektovány ve 29 °C v selektivním médiu YNBG (0,67% kvasinková dusíkatá báze, 2% glukóza) doplněném 0,5% kaseinovými aminokyselinami, které neobsahovalo uráčil. Po transformaci bylo několik klonů selektovaných na znak ura+ pěstováno 48 hodin v 50 ml selektivního média 48 hodin ve 29 °C. Po centrifugaci (4000 g, 30 minut, 4°C) byla supernatant okyselen na kyselinou octovou na ph 3,5 a pak nanesen na kolonku Sep-Pak™ C16 (Waters Associates) ekvilibrovanou 0,05% roztokem TFA ve vodě. Proteiny zachycené na koloně byly eluovány 0,05% TFA se zvyšujícím se podílem acetonitrilu.

• ·

40% frakce obsahující protihoubovou aktivitu byla analyzována pomocí HPLC s analytickou kolonou s inverzní fází Aquapore RP-300 C8 (Brownlee™, 220 x 4,6 mm, 300 Á) , eluce byla provedena lineárním gradientem acetonitrilu od 2% do 40% v 0,05% TFA po dobu 80 minut s konstantním průtokem 0,8 ml/min. Frakce byly sbírány ručně podle změn absorbance ve 225 a 254 nm. Odebrané frakce byly vysušeny pod vakuem a rekonstituovány v ultračisté vodě a pak analyzovány na fungicidní účinek testem popsaným v příkladu 3. Strukturní charakteristiky peptidu byly určeny jak je popsáno v příkladu

1.2.

cyly kul· LxVovčin

2-4. Produkce rekombinantního heliomicinu v semi-preparativním měřítku

Transformované kvasinkové klony exprimující heliomicin

C Vc

.... /)

z. i média. Tato předkultura byla použita pro inokulaci 4 1 selektivního média, které pak bylo kultivováno 48 hodin ve 29 °C. Kvasinky pak byly eliminovány centrifugací (4000 g, 30 minut, 4°C). Supernatant byl okyselen na kyselinou octovou na pH 3,5, znovu centrifugován (4000 g, 30 minut, 4°C) a pak nanesen na preparativní kolonku s inverzní fází C18 (Waters Associates, 125 Á, 6 g fáze na 500 ml supernatantu) ekvilibrovanou 0,05% roztokem TFA ve vodě. hydrofilní molkeuly byly odstraněny propláchnutím vodným roztokem kyseliny a pak 15% roztokem acetonitrilu v 0,05% TFA. Peptid zachycený na koloně byl eluován 40% roztokem acetonitrilu v 0,05% TFA, pak byl lyofilizován a rozpuštěn v ultračisté vodě, než byla zahájena první fáze purifikace.

První fáze purifikace pomocí HPLC: Frakce předběžně purifikovaná obsahující heliomicin byla rozpuštěna v 25mM roztoku octanu amonného, pH 3,4. tento vzorek byl injkecí nanesena na preparativní kationotovu výměnnou kolonu

	• • - 27 -	• · · · * • · · • · · · • · · ····· ··· ·	• · • · • · · * · • · ·
Aquapore Cation	Exchange (Brownlee™, 250 x	10	mm), eluce	byla
provedena lineárním gradientem NaCl	od	0% do	100%
v 25mM roztoku	octanu amonného, pH 3,4,	po	dobu 90	minut
s konstantním	průtokem 2 ml/min. Frakce	byly odebrány
a vysušeny pod	vakuem a rekonstituovány	v	ultračisté	vodě

a pak analyzovány na fungicidní účinek testem popsaným v další části.

Druhá fáze purifikace pomocí HPLC: Heliomicin byl purifikován do homogenity pomocí kolony semipreparativní s inverzní fází (Brownlee™, 220 x 7 mm, 300 Á) užitím lineární gradientu acetonitrilu 2 až 40 % v 0,05% TFA po dobu 80 minut se stálým průtokem 2 ml/min.

Příklad 3

Test in vitro aktivity: měření protihoubové aktivity mikrospetrofotometrií

Tuto metodu lze použít k důkazu molekul s protihoubovým účinkem, v průběhu jednotlivých etap purifikace, pro stanovení spektra aktivity peptidu a pro stanovení minimální inhibující koncentrace (CMI) peptidu, při které je aktivní. CMI je vyjádřena jako interval koncentrací [a] - [b], kde [a] je minimální koncentrace, kdy se pozoruje počátek zvyšování účinku a [b] je koncentrace, od které už se žádné zvyšování nepozoruje. Příklady specifické aktivity heliomicinu podle vynálezu vůči vláknitým houbám a kvasinkám jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2.

3.1. Test aktivity proti vláknitým houbám

Protihoubová aktivita byla detekována testem inhibice růstu v tekutém médiu. Spory testovaných hub byly umístěny do

9 9 • 9 • · 9·· 9···

9·· 9999 999 9 9 99 ·9

- 28 suspenze v kultivačním médiu typu brambory-glukóza. Výhodně bylo užito k přípravě média 12 g živného média Potato Dextrose Broth firmy Difco na 1 1 demineralizované vody.

K médiu byla přidána dvě antibiotika: tetracvklin (výsledná koncentrace 10 pg/ml) a cefotaxim (výsledná koncentrace , 100 gg/ml). 10 μΐ frakce se naneslo do jamky na mikrodestičce

I s 90 μΐ média obsahujícího spory hub (ve výsledné koncentraci

10⁴ spór/ml). Inkubace probíhala ve zvlhčované komůrce po 48 hodin při 30 °C. Růst hub byl pozorován světelným mikroskopem po 24 hodinách a kvantifikována po 48 hodinách měřením absorbance v 600 nm pomocí spektrofotometrického čtecího zařízení pro mikrotitrační destičky.

Testované vláknité houby byly následující: Aspergillus fumigatus (dar Dr. H. Koeniga, Veřejná nemocnic Strasbourg) , Nectria haematococca, Fusarium culmorum, Trichoderma viridae (sbírka hub Katolické University v Leuvenu, Belgie), Neurospora crassa, Fusarium oxysporům (sbírka hub Societe Clause, Paříž).

Výsledky testování účinku heliomicinu proti uvedeným vláknitým houbám jsou shrnuty v následující tabulce 1.

Tabulka 1

Aktivita heliomicinu proti vláknitým houbám

Houba	CMI heliomicinu (μΜ)
Neurospora crassa	0,1 - 0,2
Fusarium culmorum	0,2-0,4
Fusarium oxysporům	1,5 - 3
Nectria haematococca	0,4 - 0,8
Trichoderma viridae	1,5 - 3
Aspergillus fumigatus	6 - 12,5

• · · · ·

- 29 nm pomoci mikrotítrační

3-2. Test aktivity proti kvasinkám

Různé kmeny kvasinek byly inkubovány v kultivačním médiu typu Sabouraud po 24 hodin ve 30 °C při pomalém třepání, testované vzorky (10 μΐ) se nanesly do jamky na mikrodestičce s 90 μΐ média obsahujícího kvasinky, naředěné tak, že výsledná optická denzita D0_soo = 0,001. Růst kvasinek byl kvantifikována měřením absorbance v 600 spektrofotometrického čtecího zařízení pro destičky.

kmeny kvasinek byly následující: Candida glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. Cryptococcus neoformans, Cryp. albidus, ceravisiae (dar Dr. H. Koeniga, Veřejná nemocnic Strasbourg).

Výsledky testování účinku heliomicinu proti uvedeným kvasinkám jsou shrnuty v následující tabulce 2.

Testované albicans, C. inconspicua,

Sachharomyces

Tabulka 2 .Aktivita heliomicinu proti kvasinkám

Kvasinka	CMI heliomicinu (μΜ)
Candida albicans	2,5 - 5
Candida tropicalis	2,5 - 5
Candida krusei	10 - 20
Candida inconspicua	5-10
Cryptococcus neoformans	2,5 - 5
Cryptccoccus albidus	5-10

Tyto výsledky dokazují vynikající protihoubovou aktivitu peptidu podle předkládaného vynálezu.

*· ·· * · · ·

Příklad 4

Příprava transformované rostliny obsahující gen kódující heliomicin

Tento příklad popisuje přípravu sekvence kódující heliomicin, která je exprimována v rostlinné buňce, chimérického genu, integračního vektoru a transformovaných rostlin. Připojené obrázky 2 až 6 popisují schematicky strukturu některých plazmidů připravených kvůli konstrukci chimérického genu. Na obrázcích jsou kurzívou vyznačena restrikční místa.

Všechny použité odborníkovi známé a v publikaci Ausubei et metody jsou standardní podrobnější protokoly lze metody naj ít

4-1. Konstrukce chimérického genu pro transformaci rostlin pRPA-MD-P: Příprava plazmidů obsahujícího signální peptid genu PR-la z tabáku

Dva syntetické oligonukleotidy s komplemetárními sekvencemi Oligo 7 a Oligo 8, popsanými dále, byly hybridizovány tak, že byly 5 minut v 65 °C a pak pomalým snižováním teploty na 30 °C během 30 minut.

Oligo 7: 5 ' GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC

ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3 ¹

Oligo 8: 5 ' TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA

GAAGAGTAGA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3 '

Po hybridizaci Oligo 7 s Oligo 8 sloužil jednovláknový zbytek DNA jako matrice pro Klenowův fragment DNÁ • »*

- 31 polymerázy 1 z E. coli (za standardních podmínek doporučených výrobcem (New England Biolabs)) pro vytvoření dvojitého vlákna na 3'-koncích oligonukleotidů. Získaný dvouvláknový oligonukleotid byl pak naštěpen restrikčními enzymy SacII a Nad a klonován do plazmidu pBS II SK(-) (Stratagene), který byl předtím naštěpen stejnými restrikčními enzymy. Byl tak získán klon obsahující kódující úsek signálního peptidu genu PR-lct z tabáku (sekvence id. č. 4).

pRPA-PS-PRla-helio: Příprava sekvence kódující heliomicin fúzovaný se signálním peptidem PR-lct bez nepřepisovaného úseku 3'-konce

Dva syntetické oligonukleotidy s komplementárními sekvencemi Oligo 9 a Oligo 10 byly hybridizovány ve stejných podmínkách jak byla uvedeny výše pro pRPA-MD-P.

Oligo 9: 5 ’ GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTGTGGGGT GCTGTGAACT

ACACTTCCGA TTGCAACGGT GAGTGCAAGA GGAGGGGTTA 3 ’

Oligo 10: 5' CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCTCAAGT

CTCGCACCAG CAGTTCACGT TAGCGAAGGA ACCC-CAGTGA

CCACCCTTGT AACCCCTCCT CTTGCACTC 3'

Po hybridizaci Oligo 9 s Oligo 10 sloužil jednovláknový zbytek DNA jako matrice pro Klenowův fragment DNA polymerázy 1 z E. coli (ve standardních podmínkách doporučených výrobcem (New England Biolabs)) pro vytvoření dvojitého vlákna na 3'-koncích oligonukleotidů. Získaný dvouvláknový oligonukleotid obsahující část kódující heliomicin (sekvence id. č. 2) byl pak přímo klonován do plazmidu pRPA-MD-P, který byl předtím naštěpen restrikčním enzymem Nad. Správnost orientace v získaném klonu byla ověřena sekvencováním. Byl tak získán klon obsahující úsek • ·

- 32 kódující fúzní protein PR-la-heliomicin ležící mezi restrikčními místy Ncol na N-konci a místy Sací, Sadí a BamHI na C-konci (sekvence id. č. 3).

pRPA-RD-239: Konstrukce expresního vektoru pro transformaci rostlin, který obsahuje sekvenci kódující fúzní protein Pl-la-heliomicin

Plazmid pRTL-2GUS odvozený z plazmidu pUC-19 poskytl laskavě Dr. Jim Carrington (Texas A&M University, nebyl dosud publikován). Tento plazmid, jehož struktura je schematicky znázorněna na obr. 2, obsahuje dvojitý 35S CaMV promotor izolovaný z viru mozaiky květáku (promotor CaMV 2 x 35S, Oděli et al, 1985), který řídí expresi RNA obsahující netranslatovanou sekvenci 5'-konce viru skvrnitosti tabáku (TEV 5' UTR, Carrington a Freed, 1990), gen pro β-glukuronidázu z E. coli (GUS, Jefferson et al., 1937), po kterých následuje místo polyadenylace RNA z 35S CaM¹/ (CaMV polyA, Oděli et al., 1985).

Plazmid pRTL2-2GUS byl štěpen restrikčními enzymy Ncol a BamHI a takto vzniklý velký fragment byl purifikován. Plazmid pRPA-PS-PRla-than byl štěpen také restrikčními enzymy Ncol a BamHI a vzniklý malý fragment DNA obsahující úsek kódující fúzní protein PRla-heliomicin byl pak purifikován. Oba purifikované fragmenty DNA byly spojeny do expresní kazety pro transformaci rostlin, které pak syntetizují fúzní protein PRla-heliomicin. Struktura této expresní kazety je schematicky znázorněna na obr představuje úsek kódující fúzní z pRPA-RD-239. Heliomicin je tedy přenášen do mezibuněčných prostorů v rostlině v důsledku působení signálního peptidu PRlct.

3. PRla-heliomicin protein PRla-heliomicin • · · · · · · · · • ··· ···· • · · · ···· ··· · · · ·· ·· ·· pRPA-RD-195: Konstrukce plazmidů obsahujícího modifikované vícečetné klonovací místo

Plazmid pRPA-RD-195 je plazmid odvozený z plazmidů pUC-19, který obsahuje modifikované vícečetné klonovací místo. Komplementární syntetické oligonukleotidy Oligo 11 a Oligo 12 uvedené dále byly hybridizovány a vytvořily dvouvláknovou molekulu stejně jak bylo popsáno pro přípravu pRPA-MD-P.

Oligo 11: 5' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC

GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3¹

Oligo 12: 5' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3¹

Získaný dvouvláknový oligonukleotid byl vložen do pUC-19, který byl předtím naštěpen restrikčními enzymy EcoRI a HindlII a pak byl užit k doplnění Klenowův fragment DNA polymerázy 1 z E. coli. Získaný vektor obsahoval vícečetné klonovací místo umožňující vložení expresní kazety z plazmidového vektoru z Agrobacterium tumefaciens. Struktura vícečetného klonovacího místa je schematicky znázorněna na obr. 4.

pRPA-RD-240: Vložení expresní kazety pro PRloc-heliomicin z pRPA.-RD-23 9 do pRPA-RD-195

Plazmid pRPA.-RD-239 byl naštěpen restrikčním enzymem PstlI a fragment DNA obsahující expresní kazetu pro PRlaheliomicin byl purifikován. Purifikovaný fragment byl vložen do plazmidů pRPA-RD-195, který byl předtím naštěpen restrikčním enzymem PstlI a defosforylován telecí intestinální fosfatázou.

pRPA-RD-174: Plazmid odvozený z pRPA-BL-150A (EP 0 508 909) obsahující gen tolerance k bromoxynilu z pRPA-BL-237 (EP 0 508 909)

Gen tolerance k bromoxynilu byl izolován z pRPA-BL-237 pomocí genové amplifikace polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Získaný fragment s tupými konci byl klonován do | EcoRI místa plazmidu pRPA-RD-150A, které bylo zarovnáno působení Klenowova fragmentu polymerázy za standardních podmínek. Byl tak získán vektor vhodný pro Agrobacterium tumefaciens, který obsahuje gen tolerance k bromoxynilu v blízkosti své pravé hranice a gen tolerance ke kanamycinu v blízkosti levé hranice a vícečetné klonovací místo ležící mezi těmito geny.

Schéma struktury pRPA-RD-174 je uvedeno na obr. 5. Na tomto obrázku nos označuje pclyadenylační signál z genu pro nopal ins vnt á zu z Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al... 1983) . NOS pro označuje promotor z genu pro nopalinsyntázu z Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983), NPTII představuje gen pro neomycinfosfotransferázu z transpozonu Tn5 z E. coli (Rothstein et al., 1981), 35S pro označuje promotor 35S izolovaný z viru mozaiky květáku (Oděli et al., 1985), BRX představuje gen pro nitrilázu izolovaný z K. ozaenae (Stalker et al., 1988) a RB a LB označují » pravou a levou hranici sekvence Ti plazmidu z Agrobacterium tumefaciens.

pRPA-RD-184: Přidání nového jedinečného restrikčního místa do pRPA-RD-174

Komplementární syntetické oligonukleotidy Oligo 13 a Oligo 14, uvedené dále, byly hybridizovány a vytvořily dvouvláknovou molekulu stejně jak bylo popsáno pro plazmid pRPA-MD-P.

• · • ·· · · · *· ··· · ··· · · · · • · · · · ··· • · · · ···· ··· ··· ·· ·· · ·

Olieo 13:	5 '	CCGGCCAGTC CCCGGCGCGC TACCTGGTTC	AGGCCACACT CTAGGTGTGT AGG 3 ’	TAATTAAGTT GCTCGAGGGC	TAAACGCGGC CCAACCTCAG
Oligo 14:	5 1	CCGGCCTGAA	CCAGGTACTG	AGGTTGGGCC	CTCGAGGACA
		CACCTAGGCG	CGCCGGGGCC	GCGTTTAAAC	TTAATTAAGT
		GTGGCCTC-AC	TGG 3 1

Dvouvláknový oligonukleotidový hybrid (95 párů baží) byl purifikován po separaci na agarózovém gelu (3% NuSieve agaróza, EMC) . Plazmid pRPA-RD-174 byl štěpen restrikčním enzymem Xmal a vzniklý velký fragment DNA byl purifikován. Oba izolované fragmenty pak byly spojeny.

Získaný plazmid odvozený z plazmidu pRPA-RD-174 obsahoval další restrikční místo mezi genem tolerance k bromoxynilu a selekčním markérem kanamycínové rezistence.

Schematické znázornění struktury plazmidu pRPA-RD-184 je. uvedeno na obr. 6, kde označení nos, NPTII, NOSpro”, 35Spro, gen BRX, RB a LB mají stejný význam jaký byl vysvětlen u obr. 5.

pRPA-RD-241: Příprava vektoru pro Agrobacterium tumefaciens obsahujícího genový konstrukt kódující heliomicin směrovaný do mezibuněčného prostoru

Plazmid pRPA-RD-240 byl štěpen restrikčními enzymy Sfill a AscI a fragment DNA obsahující gen PR-la-heliomicin byl purifikován. Plazmid pRPA.-RD-184 byl naštěpen stejnými restrikčními enzymy. Fragment DNA obsahující expresní kazetu PR-la-heliomicin byl vložen do plazmidu pRPA-RD-184. Byl tím získán vektor pro Agrobacterium tumefaciens, který obsahuje sekvenci kódující fúzní protein PR-la-heliomicin a který umožňuje expresi heliomicinu v extracelulárním prostoru rostliny.

• ·

4-2. Konstrukce expresní kazety promotor CsVMV - signální peptid PGl - heliomicin -terminátor Nos pRPA-NP4: Konstrukce plazmidu obsahující signální peptid genu PGl polygalakturínázy kukuřice (Genbank, přístup, č. X57627)

Dva syntetické oligonukleotidy s částečně komplemetárními sekvencemi Oligo 15 a Oligo 16, popsanými dále, byly hybridizovány tak, že byly 5 minut v 65 °C a pak pomalým snižováním teploty na 30 °C během 30 minut.

Oligo 15:

Oligo 16 :

5' GGTCTAGAAT GGCCTGCACC AACAACGCCA TGAGGGCCCT

CTTCCTCCTC 3'

5' CCGAATTCGG CGCCGTGCAC GATGCAGAAG AGCACGAGGA

GGAAGAGGGC 3' ťo nycriaizac:

Oligr s Oligo slouží jednovláknový zbytek DNA jako matrice pro Klenowův fragment DNA polymerázy 1 z E. coli (za standardních podmínek doporučených výrobcem (New England Biolabs)) pro vytvoření dvojitého vlákna na . 3'-koncích oligonukleotidů. Získaný dvouvláknový oligonukleotid byl pak naštěpen restrikčními enzymy Xnal a EcoRI a klonován do plazmidu pBS II SK(-) (Stratagene) , který byl předtím naštěpen stejnými restrikčními enzymy. Byl tak získán klon obsahující kódující úsek 22 aminokyselin signálního peptidu genu PGl, který může být fúzován ve shodném čtecím rámci s dalším proteinem prostřednictvím místa Sfol (sekvence id. č. 15) .

pRPA-NP5: Konstrukce sekvence kódující heliomicin fúzovaný se signálním peptidem genu PGl

Úsek kódující heliomicin byl amplifikován užitím PCR z klonu pRPA-PS-PRla-helio (sekvence id. č. 3) termostabilním enzymem Pfu (Stratagene) za standardních podmínek • · · · · · • · · · · · · • · ··· · · · • · · · · · · • ·· · · ·· ·· doporučených výrobcem, syntetické oligonukleotídy použité pro tuto amplifikaci byly nálsedující:

Oligo 17: Oligo 18 :

5' GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTG 3'

5' GGCTCGAGTC AAGTCTCGCA CCAGCAGTTC AC 3'

Produkt PCR byl naštěpen restrikčním enzymem Xhol a klonován do vektoru pRPA-NP4 naštěpeného restrikčními enzymy Sfol a Xhol. Výsledný klon obsahoval signální peptid genu PG1 fúzovaný ve shodném čtecím rámci s heliomicinem (sekvence id. č. 18).

pRPA-NP6: Konstrukce expresní kazety heliomicinu v transformačním vektoru

Expresní a transformační vektor pILTAB 357 byl odvozen omarnino vektoru oBin.19.

Obsahuj e oromotor

CsVMV (Verdaguer et al., Plant. Mol. Biol. 31: 1129-1139, 1996) s vícenásobným klonovacím místem a terminátorem transkripce

Sekvence tohoto

19.

byl získán inzercí z vektoru pRPA-NP5 restrikčního obsahuj ícího

Nos z nopalinsvntázového genu (obr. 2). fragmentu je zde uvedena jako sekvence id. č Expresní vektor heliomicinu fragmentu Xbal-KpnI fúzi signálního peptidu PGl-heliomicin do vektoru pILTAB 357 naštěpeného stejnými restrikčními enzymy. Výsledný klon tedy obsahoval expresní kazetu promotor CsVMV signální peptid PGl - heliomicin - terminátor Nos (sekvence id. č. 20).

4-3. Příprava transformovaných rostlin tabáku

3.1. Transformace

Vektor pRPA-RD-241 nebo pRPA-NP6 byl vnesen do buněk kmenu Agrobacterium tumefaciens EHA101 nebo EHA105 (Hood et • ··· · · · · • · · ··· · · ·· ·· al., 1987) nesoucích kosmid pTVK291 (Komáři et al., 1986). Transformační metoda byla založena na postupu, který popsali Horsch et al. (1985).

3.2. Regenerace

Regenerace tabáku PBD6 (pocházejícího ze SEITA, Francie) z listových explantátu probíhala na základním médiu dle Murashige a Skoog (MS médium) obsahujícím 30 g/1 sacharózy a 200 gg/ml kanamycinu. Listové explantáty byly odebrány z rostlin pěstovaných ve skleníku nebo in vitro a byly transformovány metodou listových disků (Horsch et al., 1985) ve třech postupných etapách: první etapa spočívala v indukci výhonků na médiu s přídavkem 30 g/1 sacharózy obsahujícím ještě 0,05 mg/1 nařtyloctové kyseliny (ANA) a 2 mg/1 benzylaminopurinu (BAP) po dobu 15 hodin. Výhonky vytvořené v této etapě byly pak ponechány 10 hodin na MS médiu s přídavkem 30 g/1 sacharózy, ale bez hormonů. Pak byly výhonky odebrány a přemístěny na médium MS s poloviční koncentrací solí, vitamínů a sacharózy, ale neobsahující hormony. Přibližně po 15 dnech byly zakořeňující výhonky přeneseny do půdy,

3.3. Analýza exprese heliomicinu v transgenním tabáku

a) Tvorba specifických polyklonálních protilátek

Polyklonální protilátky byly získány imunizací králíků nativním heliomicinem postupem obvyklým v Centru biologických experimentů VALBEX (IUT A - Lyon I) . Získané sérum (15 ml) bylo purifikováno na koloně se Sepharose 4B (Pharmacia) s navázaným heliomicinem, čímž byly selektovány protilátky specificky rozpoznávající tento peptid. Nakonec byly specifické protilátky eluovány 6 ml Glycinového roztoku (200mM, pH 3) neutralizovaného 1M Tris pH 9,5 a dialyzovány ·

- 39 s 0,5xPBS a až do použití byly uloženy v -20 °C.

b) Imunodetekce heliomicinu v transgenním tabáku

Analýza exprese heliomicinu byla provedena s 8 rostlinami transgenního tabáku transformovanými konstruktem pRPA-NP6 a nebo s kontrolami. Plně vyvinuté listy tabáku byly zmrazený v kapalném dusíku a rozdrceny a proteiny byly extrahovány 1 hodinu při 4 °C pufrem obsahujícím 50mM TrisHCl, 1% PVP25, 0,05% Triton X100, pK 7,5, přičemž byly užity 4 ml pufru na 1 gram čerstvé hmotnosti pletiva. Po centrifugaci byla stanovena koncentrace proteinu v supernatantu Bradfordovou metodou.

μg proteinu z každého z 9 extraktů bylo naneseno na nitrocelulózovou membránu ve formátu slot-blot a také 50 ng čistého heliomicinu jako pozitivní kontrola. Membrána byla inkubována 1 hodinu v 1% blokovacím roztoku (Boehringer, katalog, č. 1 921 673) v TBS, pak inkubována přes noc ve 4 °C s imunopurifikovanými protilátkami namířenými proti heliomicinu v řední 1/2000 v pufru TBS s 0,05% Tween 20. Po opláchnutí (TBS, 0,1% Tween a 0,5% blokovací pufr) byla membrána 1 hodinu inkubována při teplotě místnosti (TBS s 0,5% blokovacím pufrem) s kozí protilátkou (v ředění 1/50000) specificky namířenou proti králičím imunoglobulinům konjugovanou s alkalickou fosfatázou (SIGMA katalog, č. A3687). Po opláchnutí (TBS, 0,1% Tween 20) se provedla detekce pomocí substrátu fosfatázy (BioRad, katalog, č. 170-5012) a luminiscence produktu byla detekována radiografleky na filmu Amersham (ECL).

Výsledky tohoto pokusu ukázaly, že 4 rostliny transgenního tabáku exprimovaly heliomicin. Signál u ostatních rostlin byl slabý a nebyl dostatečně průkazný. Signál pozorovaný u průkazně pozitivních rostlin byl na srovnatelné hladině s pozitivní kontrolou (50 ng

heliomicinu), což ukazuje, že u těchto rostlin heliomicin představoval přibližně 1 % celkového proteinu.

Příklad 5

Přípravky

5.1. Emulgovatelné koncentráty

Příklad CE1:

účinná látka 400 g/1 alkalický dodecylbenzensulfonát 24 g/1 oxyetylnonylfenol v 10 molekulách etylenoxidu 16 g/1 cyklohexanon 200 g/1 aromatické rozpouštědlo do 1 1

Příklad CE2

- účinná látka 400 g/1 epoxidovaný rostlinný olej 25 g směs alkylarylsulfonátu a polyglykoléteru v mastném alkoholu 100 g dialkylformamid 50 g xylén 575 g

5-2. Koncentrované suspenze

Příklad SCI:

- účinná látka 500 g

- polyetoxytristyrylfenolfosfát 50 g

- polyetoxylalkylfenol 50 g

- polykarboxylát sodný 20 g etylénglykol 50 g

- 41 organopolysiloxanový olej (jako protipěnivý prostředek)

- polysacharid voda *

ig

1,5 g 316, 5 g

5-3. Smáčitelné prášky (nebo prášky pro postřik)

Příklad PM1:

- účinná látka mastný etoxyalkohol (smáčedlo) etoxyřenyletylfenol (diperzní činidlo) křída (inertní nosič) % 2,5 % 5 %

42,5 %

Příklad PM2: účinná látka syntetický oxoalkohcl rozvětveného typu, etoxyiová skupina s 13 uhlíky na 8 až 10 etylénoxidových skupin (smáčedlo)

- neutrální lignosulřonát vápenatý (disperzní činidlo)

- uhličitan vápenatý (inertní nosič) %

0,75 % %

do 100 %

Příklad PM3:

účinná látka smáčedlo

- disperzní činidlo

- uhličitan vápenatý (inertní nosič) % 1,50% 8 % do 100 %

Příklad PM4:

% %

účinná látka mastný etoxyalkohol (smáčedlo) etoxylfenyletylfenol (disperzní, činidlo)

Příklad PM5 : účinná látka směs aniontových a neionogennich povrchově aktivních látek (smáčedlo) neutrální lignosulřonát vápenatý (disperzní činidlo) kaolin (inertní nosič) %

2, 5 % 42, 5

5-4. Dispergovatelné granuláty

Příklad GDI:

V mísícím zařízení se smíchá 90 % (hmot.) účinné látky a 10 % močoviny v perličkách. Směs se rozmělní v kuželovém drtiči. Získá se tak prášek, který se může zvlhčit přibližně 8 % (hmot.) vody. Vlhký prášek se extruduje pomocí válcového extrudéru. ' Získaný granulát se suší a pak se jemně drtí a prosívá, takže částice bez ohledu na tvar jsou velikosti 150 až 2000 pm.

Příklad GD2

V mísiči se smíchají následující složky: účinná látka 75 % smáčedlo (alkylnaftalénsulfonát sodný) 2 % disperzní činidlo (polynaftalénsulřonát sodný) 8 % inertní nosič nerozpustný ve vodě (kaolin) 15 %

Tato směs se granuluje postupem na fluidním loži v přítomnosti vody, suší, drtí a prosívá, čímž se získá granulát velikosti zrn 0,15 až 0,80 mm.

5-5. Farmaceutické přípravky

Příklad A: tablety

V oboru známým způsobem se připraví tablety obsahující dávku 50 mg účinného peptidu s následujícím složením:

peptid heliomicin Ml	50	mg
amidon	60	mg
laktóza	50	mg
stearan horečnatý	2	mg

Příklad B: Roztok pro injekci

Roztok pro injekci obsahující dávku 20 mg účinného peptidu má následující složení: peptid heliomicin Ml 22,4 mg destilovaná voda doplnit do 2 cm³

Příklad 6

Stálost aktivity heliomicinu

Stabilita antimikrobiálního peptidu vůči rostlinnými proteázám je podstatným faktorem pro získání dobré hladiny exprese a tudíž rezistence transgenní rostliny proti fytopatogenu. Tato stabilita je kritickým bodem např. antimikrobiálního peptidu hmyzu cecropinu B (Owens a Huette, 1997, MPMI, 10 (4) : 525-528) . Stabilita a aktivita heliomicinu byla testována ve fytopatologickém testu (Botrytis cinerea) inkubací s hrubým extraktem z 8 hlavních plodin (kukuřice, pšenice, ječmen, řepka, sója, slunečnice, rajče a tabák).

Listy všech 8 druhů rostliny byly rozdrceny při nízké teplotě (teplota kapalného dusíku) v třecí misce na prášek a ten byl resuspendován ve stejném objemu vody. Pó

centrifugaci (10000 g, 30 minut) byl odebrán supernatant a stanovena koncentrace proteinu. Koncentrace všech extraktů pak byla pomocí vody upravena na 1 mg/ml a extrakty bvly sterilizovány filtrací (0,2 μκι). 100 μΐ extraktu (také kontroly s vodou) bylo smícháno s 50 μΐ roztoku heliomicinu (obsahujícího 15 pg peptidu, jakož i kontrola bez peptidu). Tato směs se inkubovala ve 30 °C a alikvotní části po 20 μΐ byly odebrány v čase 0, 1, 2, 4 a 20 hodin a až do testu uchovány na ledu.

Test protihoubové aktivity byl proveden ve 25 °C na mikrodestičkách s alikvotem 80 μΐ čerstvé suspenze spór

Botrytis cinerea (10000 spór/ml v roztoku Potato Dextrose Broth, . Difco, 12 g/1) . Vizuální vyhodnocení po 12 a 24 hodinách neukázalo žádný pokles v protihoubové aktivitě heliomicinu ani u vzorků po 20hodinové inkubaci ve 30 °C s extrakty z kukuřice, pšenice, ječmene, řepky, sóji, slunečnice, rajčete a tabáku. Tyto výsledky prokázaly velmi dobrou stabilitu heliomicinu vůči rostlinnýmproteázám, neboť protihoubová aktivita testovaná na Botrytis cinerea nebyla snížena přítomnosti hrubých rostlinných extraktů.

Příklad 7

Příprava různých mutant heliomicinu: jednoduchých, dvojnásobných, trojnásobných a čtyřnásobných mutant

Mutanty uvedené v tomto příkladu byly připraveny postupem popsaným v příkladu 2 tak, že některé z oligonukleotidů 1 až 5 byly nahrazeny jiným oligonukleotidem zvoleným pro vnesení mutace.

Heliomicin R48: Náhrada aminokyseliny Glu48 v sekvenci • ·

id. č. 1 bazickou aminokyselinou,' zejména argininem (Arg48). Podle sekvence kódující heliomicin, sekvence id. č. 1, byl kodon GAA kódující Glu nahrazen kodonem AGA kódujícím Arg. Oligonukleotidy 19 a 20 byly užity k nahrazení oligonukleotidů 5 a 6 z příkladu 2.

Oligo 19: 5' GATCCTTCGC TAACGTTAAC TGTTGGTGTA GAACCTGATA C-G 3'

Olico 20: 5' TCGACCTATC AGGTTCTACA CCAACAGTTA ACGTTAGCGA AG

Heliomicin L28L29: Náhrada dvou bazických aminokyselin Lys a Arg v polohách 28 a 29 v sekvenci id. č. 1 dvěma hydrořóbními aminokyselinami, zejména leucinem (Leu28 a Leu29). Podle sekvence kódující heliomicin, sekvence id. č. 1, byl úsek AAG-CGC kódující peptidové zbytky Lys-Arg nahrazen sekvencí TTG-TTG kódující peptidový zbytek Leu-Leu. Oligonukleotidy 21 a 22 byly užity k nahrazení oligonukleotidů 3 a 4 z příkladu 2.

Oligo 21: 5' CTAGTGACTG CAACGGCGAG TGCTTGTTGC GC 3'

Oiigo 22: 5' GCAACAAGCA CTCGCCGTTG CAGTCA 3'

Heliomicin L28L29R48: Náhrada dvou bazických aminokyselin Lys a Arg v polohách 28 a 29 v sekvenci id. č. 1 aminokyselinovými zbytky leucinu a náhrada aminokyseliny Glu48 v sekvenci id. č. 1 bazickou aminokyselinou, zejména argininem (Arg48). Oligonukleotidy 19 a 22 byly užity k nahrazení oligonukleotidů 3 a 6 z příkladu 2.

Heliomicin A24A25: Náhrada dvou kyselých aminokyselin Asn24 a Gly25 v sekvenci id. č. 1 dvěma alaniny (Ala24 a Ala25). Podle sekvence kódující heliomicin, sekvence id. č. 1, byl úsek AAC-GGC kódující peptidový zbytek Asn-Gly nahrazen sekvencí GCT-GCT kódující peptidový zbytek Ala-Ala·.

• · • · · · · · · · » • · ······· * ·· ········ ·· ··· ···· ··· ···· ··· ·· ·· ··

- 46 Oligonukleotidy 23 a 24 byly užity k nahrazeni oligonukleotidů 3 a 4 z příkladu 2.

Oligo 23: 5' CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCAAGCGGC GC 3' ‘ Oligo 24: 5' GCCGCTTGCA CTCAGCAGCG CAGTCA 3' < Heliomicin A6A7A8A9: Náhrada čtyř aminokyselin Asp6Lys7-Leu8-Ile9 v sekvenci id. č. 1 čtyřmi alaninovými zbytky (Ala). Podle sekvence kódující heliomicin, sekvence id. č. 1, byl úsek GAC-AAG-TTG-ATT kódující peptidový zbytek Asp6-Lys7.Leu8-Ile9 nahrazen sekvencí GCT-GCT-GCT-GCT kódující peptidový zbytek Ala-Ala-Ala-Ala. Oligonukleotidy 25 a 26 byly užity k nahrazení oligonukleotidu 1 z příkladu 2 a oligonukleotidy 27 a 28 oligonukleotidu 2.

Oligo25: 5' AGCTTGGATA AAAGAGCTGC TGCTGCTGGT AGCTGTGTTT 3'

Oligo 26: 5' GGGGCGCCG TCAACTACA 3'

Oligo 27: 5' CTAGTGTAGT TGACGGCGOC CC 3 '

Oligo 28: 5' AAACACAGCT ACCAGCAGCA GCAGCTCTTT TATCCA 3’

Heliomicin A24A25L28L29: Dva oligonukleotidy (sense a antisense) byly potřebné pro překonání absence restrikčního místa před sekvencí kódující peptidový zbytek A.sn24-Gly25 a sekvencí kódující peptidový zbytek Lys28-Arg29 heliomicinu podle sekvence id. č. 1. Oligonukleotidy 29 a 30 byly užity k nahrazení oligonukleotidu 3 a 4 z příkladu 2.

Oligo 29: 5' CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCTTGTTC-C GC 3'

Oligo 30: 5' GCAACAAC-CA CTCAGCAGCG CAGTCA 3'

Příprava mutant heliomicinu v semipreparativním měřítku

Různé mutanty heliomicinu byly připraveny následujícím způsobem.

Transformované kvasinkové klony transformované mutovaným • · • · · ·

- 47 genem heliomicinu byly kultivovány 24 hodin ve 29 °C v 50 ml selektivního média. Tato předkultura byla použita pro inokulaci 2 1 selektivního média, které pak bylo kultivováno 48 hodin ve 29 °C. Kvasinky pak byly eliminovány centrifugací (4000 g, 30 minut, 4°C). Supernatant byl okyselen na kyselinou octovou na pH 3,5, podruhé centrifugován (4000 g, 30 minut, 4°C) a pak pokračovala extrakce na pevné fázi.

První etapa extrakce na pevné fázi s gelovou inverní fází: okyselený supenatant , byl nanesen na kolonku Sep-Pak™ C18 (Waters Associates, 10 g fáze), a ekvilibrováno s vodným roztokem kyseliny (0,05% TFA). Hydrofilní molekuly byly eliminovány jednoduchým propláchnutím kyselým vodným roztokem po kterém následovalo propláchnutí 15% roztokem acetonitrílu v 0,05% TFA. Eluce peptidu byla provedena 60% roztokem acetonitrílu v 0,05% TFA. Frakce eluovaná 60% roztokem acetonitrílu byla vysušena pod vakuem byla rozpuštěna ve sterilní ultračisté vodě.

Druhá fáze extrakce na pevné s gelovým kationtomšničem: prepurifikovaná 60% frakce obsahující mutovaný heliomicin byla rozpuštěna v 25mM octanu amonném, pH 3,4. tento vzorek byl nanesen na kolonku Sep-Pak™ Vac 35cc CM s kationtovým měničem (Waters Associates, 10 g fáze), a ekvilibrováno s 25mM octanem amonným, pH 3,4. Eluce mutovaného heliomicinu byla provedena 1M roztokem chloridu sodného (NaCl) v 25mM octanu amonném, pH 3,4. Frakce eluovaná 1M NaCl obsahující mutantu heliomicinu byla vysušena pod vakuem, rozpuštěna ve 20 ml sterilního roztoku kyseliny (1% TFA). Mutanta heliomicinu byla dále purifikována pomocí HPLC.

Poslední fáze purifikace užitím HPLC: mutanta purifikována až preparativní koloně

Aquapore RP-300 C8 (Brownlee™, 220 x 10 mm, 300 Á) užitím lineární dvoufázového gradientu acetonitrílu 2 až 23 ·% do homogenity s inverzní fází heliomicinu byla chromatograficky na * · 9 ·9 · · ·· • · · · · · ···· v 0,05% TFA po 10 minut a 23 až 33 % po dalších 80 minut’ se stálým průtokem 2,5 ml/min. Frakce byly odebrány, vysušeny pod vakuem a rekonstituovány v ultračisté vodě a pak analyzovány na spektrofotometru MALDI pro ověření čistoty a identity vzorku. Mutanty heliomicinu pak byly testovány na protihoubový účinek, jak bylo již popsáno pro heliomicin, proti Neurospora crassa, Fusarium culmorum a Nectria heamatocccca. Byla také vyhodnocena aktivita mutant heliomicinu proti bakteriím. Užité experimentální podmínky jsou popsány dále.

Test aktivity in vitro: měření protihoubové aktivity mikrospetrofotometrii

Tato metoda byla užita pro stanovení spektra aktivity peptidu a pro stanovení minimální inhibující koncentrace (CMI) peptidu, při které je aktivní. CMI je vyjádřena jako interval koncentrací [a] - [b], kde [a] je minimální koncentrace, kdy se pozoruje počátek zvyšování účinku a [b] je koncentrace, od které už se žádné zvyšování nepozoruje. Příklady specifické aktivity mutant heliomicinu podle vynálezu vůči vláknitým houbám jsou uvedeny v tabulce 3.

Antibakteriální aktivita byla detekována testem inhibice růstu v tekutém médiu. Testované bakterie byly namíchány do suspenze v kultivačním médiu typu Poor-Broth. Výhodně bylo užito k přípravě média 1% (hmot.) bactotryptonu a 1% (hmot.) NaCl na 1 1 demineralizované vody. 10 μΐ testované frakce se naneslo do jamky na mikrodestičce s 90 μΐ média obsahujícího bakterie (ve výsledné koncentraci odpovídající 1 mOD při 600 nm) . Inkubace probíhala při 25 °C 12 až 24 hodin. Růst bakterií byl kvantifikován měřením absorbance v 600 nm pomocí spektrofotometrického čtecího zařízení pro mikrotitrační destičky.

Byly použity následující bakterie: Bacillus megaterium

9

(sbírka Pasteurova ústavu), Micrococcus luteus (sbírka

Pasteurova ústavu), Staphylococcus aureus (H.Monteil, Bakteriologický Institut Strasbourg), Aerococcus viridans (H.Monteil, Bakteriologický Institut Strasbourg) a E. coli D22 (P.L.Boquet, Centrum jaderného výzkumu, Saclay).

Tabulka 3

Aktivita některých mutant heliomicinu proti vláknitým houbám a bakteriím.

Mikroorganismus	CMI heliomicinu (μΜ) mutanty
L28L29	R4 8	L28L29R48	A6A7A8A9	helio
HOUBY Neurospora crassa	0,8-1,6	0,4-0,8	0,8-1,6	1,6-3, 1	0,1-0,2
Fusarium culmorum	3, 1-6,2	0,4-0,8	0, 8-1, 6	3, 1-6, 2	0,2-0, 4
Nectria haematococca	3,1-6,2	0,4-0,8	0,8-1,6	ND	0,4-0, 8
BAKTERIE Bacillus megaterium	50-100	ND	ND	6, 2- 12,5	ND
Micrococcus luteus	12,5-25	25-50	ND	ND	ND
Staphylococcus aureus	ND	ND	ND	ND	ND
Aerococcus viridans	ND	ND	ND	12,5-25	ND
E. coli D22	ND	ND	ND	ND	ND

ND: aktivita nebyla detekována

Příklad 7

Test toxicity injekcí

Skupiny 4 myších samic byly ošetřena intravenózní injekcí roztoku heliomicinu (sekvence id. č. 2) ve fyziologickém roztoku v dávkách 1 a 10 mg/kg. negativní kontrolou byl roztok aprotininu (při dvou dávkách žádný,'

• · 9 9 • · · · • · · · • · · 9 • 9 9 9 účinek) a pozitivní kontrola byl mellitin (100% mortalita po 5 dnech při 10 mg, významný účinek po 5 dnech při 1 mg) . V tomto testu nebyl žádný důkaz toxicity po injikování dvou dávek roztoku heliomicinu.

Citovaná literatura:

Ausubei. F. A. & coll. (eds. Greene). Current Protocols in Molecular Biology. Publ. Wilev & Sons.

Bevan. M. & coll. (1983). Nuc. Acids Res. 11:369-385.

Carrington and Freed (1990). J. Virol. 64:1590-1597.

Ehret-Sabatier & coll. (1996) The Journal of Biological Chemistry, 271, 47, 29537-29544. Horsch & coll. (1985). Science 227:1229-1231.

Jefferson & coll. (1987). EMBO J. 6:3901-3907.

Komáři & coll. (1986). J. Bacteriol. 166:88-94.

Rothstein & coll. (1981). Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 45: 99-105.

Stalker & coll. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314.

Oděli, J.T. & coll. (1985). Nátuře 313:810-812.

·· 9·

SEZNAM SEKVENCI \2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 147 párů baží TYP: nukleová kyselina
TYP VLAKNA TOPOLOGIE:	: jednoduché lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY:	cDNA
(ix)	ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENI: CDS (B) POZICE: 1...147

	(xi)	POPIS	SEKVENCE:	SEKVENCE ID.	C.	1 :
AGC	TTG GA7	AAA. AGA	GAC AAG TTG	ATT GGC AGC TGT	GTT	TGG	GGC	GCC
Ser	Leu Asp	Lys Arg	Asp Lys Leu	Ile Gly Ser Cys	Val	Trp	Gly	Ala
T_		5		10			15
GTC	AAC TAC	ACT AGT	GAC TGC'AAC	GGC GAG TGC AAG	CGC	CGC	GGT	TAC
Val	Asn Tyr	Thr Ser	Asp Cys Asn	Gly Glu Cys Lys	Arg	Arg	Gly	Tyr
		20		25		30
AAG	GGT GGC	CAT TGT	GGA TCC TTC	GCT AAC GTT AAC	TGT	TGG	TGT	GAA
Lys	Gly Gly	His Cys	Gly Ser Fhe	Ala Asn Val Asn	Cys	Trp	Cys	Glu
	35		40		45

ACC

Thr

144

147

INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 169 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..132

- 52 ··

I · ♦ * (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. C. 2:

GAT

AAG

CTT

ATC

GGT

TGC

TGC

GTG

TGG

GGT

GCT

GTG

AAC

TAC ACT

TCC

48

Asp

Lys

Lsu

Ile

Glv

Ser

Cys

Val·

Trp

Gly

Ala

Val

Asn

Tyi? Thr

Ser

1

5

10

15

GAT

TGC

“ c

GGT

GAG

TGC

AAG

j-.GG

AGG

GGT

TAC

AAG

GGT

GGT CAC

TGC

96

Asp

Cys

Asn

Glv

C-lu

Cys

Lys

Arg

Arg

Gly

Tyr

Lys

Gly

Gly His

CVS

20

2 5

30

GGT

TCO

TTC

GCT

AAC

GTG

AAC

TGC

TGG

TGC

GAG

ACT

TC-AGAGCTCG

142

Glv

Ser

Phe

Ala

Asn

Val

Asn

Cys

Trp

Cys

Glu

Thr

40

GCGAGGCGAA CGTGTCGACG GATCCGG 169 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 261 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 3..224 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 3:

CC ATG GGT TTC GTG CTT TTC TCT CAG CTT CCA TCT TTC CTT CTT GTG Met Gly Phe Val Leu Fhe Ser Gin Leu Pro Ser Phe Leu Leu Val

1

5

10

15

TCT

ACT

CTT

CTT

CTT

TTC

CTT

GTG

ATC

TCT

CAC

TCT

TGC

CGT

GCC

GAT

95

Ser

Thr

Leu

Leu

Leu

Phe

Leu

Val

Ile

Ser

His

Ser

Cys

Arg

Ala

Asp

20

25

30

AAG

CTT

ATC

GGT

TCC

TGC

GTG

TGG

GGT

GCT

GTG

AAC

TAC

ACT

TCC

GAT

143

Lys

Leu

Ile

Gly

Ser

Cys

Val

Trp

Gly

Ala

Val

Asn

Tyr

Thr

Ser

Asp

35

40

45

TGC

AAC

GG i

GAG

TGC

AAG

AGG

AGG GGT

TAC AAG GGT

GGT

CAC

TGC

GGT

151

Cys

Asn

Gly

Glu

Cys

Lys

Arg

Arg Gly

Tyr Lys Gly

Gly

His

Cys

Gly

50

55

60

• ·

TCC TTC GCT AAC GTG AAC TGC TGG	TGC C-AG ACT TGAGAGCTCG GCGAGGCGAA	244
Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp	Cys Glu Thr
65 70
CGTGTCGACG GATCCGG		2S1
2) INFORMACE PRO SEKVENCI	S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 120 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENí: ODS (B) POZICE: 12..101

(xi) POPIS	SEKVENCE:	SEKVENCE	ID.	Č.	4:
GCGTCGACGC G ATG	GGT TTC GTG	CTT TTC TCT	CAG	CTT	CCA	TCT	TTC CTT	50
Met	Gly Phe Val	Leu Phe Ser	Gin	Leu	?ro	Ser	Phe Leu
1		5			10

CTT GTG TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC TCT TGC CGT S3

Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg

20 25

GCT GGAGACGCGA ATTCACACA 129

Ala (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 75 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 7 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 5:

gcgtcgacgc GATGGGTTTC gtgcttttct ctcagcttcc atctttcctt cttgtgtcta

CTCTTCTTCT TTTCC

- 54 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 72 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 8 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 6:

TCGCCGGCAC GGCAAGAG7A AGAGA7CACA AGGAAAAGAA GAAGAG7AGA CACAAGAAGG

AAAGA7GGAA GC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 80 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 9 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 7:

GATAAGCTTA 7CGGTTCC7G CG7G7GGGG7 GCTGTGAACT ACACTTCCGA TTGCAACGGT

GAGTGCAAGA GGAGGC-G77A (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 109 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 10 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 8:

CCGGATCCG7 CGACACGT7C GCCTCGCCGA GCTCTCAAGT CTCGCACCAG CAGTTCACGT 'AGCGAAGGA ACCGCAGTGA CCACCCTTGT AACCCCTCCT CTTGCACTC

109 • ·

- 55 • · · · · · · ··· «· · · ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 85 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 9:

AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC

CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 66 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA.: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oiigonukleotid 12 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 10:

CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CC-CGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC

TAGAGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 93 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 13 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 11:

CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT 60

GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG

- 56 • · · '· · ··«···· ··· ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 93 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 14 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 12:

CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC 60

GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG 93 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 15 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 13:

GGTCTAGAAT GGCCTGCACC AACAACGCCA TGAGGC-CCCT CTTCCTCCTC 50 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 16 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 14:

CCGAATTCGG CGCCGTGCAC GATGCAGAAG AGCACGAGGA GGAAGAGGGC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15.:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 81 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 7..73 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 15:

TCTAGA AŤG GCC TGC ACC AAC AAC GCC ATG AGG GCC CTC TTC CTC CTC 4 3

Mez Ala Cys Thr Asn Asn Ala Hec Arg Ala Leu Phe Cvs Xle 15 10

CTG CTC TTC TGC ATC GTG CAC GGC GCCC-AATTC 81

Val Leu ?he Cys Ile Val His Gly 15 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 17 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 16:

GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

$ ♦ (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 18 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 17:

GGCTCGAGTC AAGTCTCGCA CCAGCAGTTC AC • ·

- 58 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 213 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 7..205 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 18:

TCTAGA ATG GCC TGC ACC AAC AAC GCC ATG AGG GCC CTC TTC CTC CTC 48

y.sz Ala Cys Thr Asn Asn Ala Mec Arg Ala Leu Phe Cys Ile i 5 10

CTG Val 15

CTC Leu

TTC ?he

TGC Cys

ATC Tle

GTG Val 20

CAC His

Gly

GAT Asp

AAG Lys

CTT Leu 25

ATC Ile

GGT Gly

TCC Ser

TGC Cys

GTG Val 30

96

TGG

GGT

GCT

GTG

AAC

TAC

-

TCC

GAT

TGC

AAC

GGT

GAG

TGC

Λ Λ runo

AGG

144

Orp

Glv

Ala

Val

Asn

Tvr

Thr

Ser

Asp

Cys

Asn

Gly

Glu

Cvs

Lvs

Arg

35

40

45

AGG

GGT

TAC

AAG

GGT

GGT

CAC

TGC

GGT

TCC

TTC

GCT

AAC

GTG

AAC

TGC

192

Arg

Gly

Tyr

Lys

Gly

Gly

His

Cys

Gly

Ser

Phe

Ala

Asn

Val

Asn

Cys

50

55

60

TGG

TGC

GAG

ACT

TGACTCGAG

213

Trp

Cys

Glu

Thr

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 838 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor CsVMV (B) POZICE: 7..532 (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: vícečetné klonovací místo (B) POZICE: 533..568 (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: terminátor (B) POZICE: 569..832 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 19:

AAGCTTCCAG AAGGTAA7TA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA ' 6 0

ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC 120

CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TAC7GCCAGA A7ACGAAGAA ISO

GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC 240

ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAAGATA AGGTCGGTGA TTGTGAAAGA GACATAGAGG 3 00

ACACATGTAA GGTGGAAAA7- GTAAGGGCGG AAAGTAACCT TATCACAAAG GAATCTTA7C 3 60

CCCCACTAC7 TATCCTTTTA TATTTTTCCG TGTCATTTTT GCCCTTGAGT TTTCCTATAT 420

AAGGAACCAA GTTCGGCATT TGTGAAAACA AGAAAAAA77 7GG7G7AAGC 7A7777CT77 480

GAAG7AC7GA GGATACAACT 7CAGAGAAAT TTGTAAGTTT GTAGATCTCG ATTCTAGAAG 540

GCCTGAATTC GAGC7CGG7A CCGGATCCAA TTCCCGATCG 77CAAACA7T 7GGCAA7AAA 600

GTTTCTTAAG ATTGAATCCT GTTGCCGGTC TTGCGATGAT TATCATATAA 777C7G77GA 660

A77ACG77AA GCA7G7AA7A A77AACA7G7 AA7GCA7GAC G77A777A7G AGATGGGTTT 720

77A7GA7TAG AG7CCCGCAA 77ATACA777 AATACGCGAT AGAAAACAAA A7A7AGCGCG 780

CAAAC7AGGA 7AAA77ATCG CGCGCGGTGT CA7C7A7G77 ACTAGATCGG GGATCGAT 838 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1036 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor CsVMV (B) POZICE: 7..532 (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 539..736 • · * · ·· • · ♦ » · * • » · · · *

(ix) (xi) AAGCTTCCAG	DALŠÍ ZNAKY: (B) JMÉNO/OZNAČENÍ: terminátor (B) POZICE: 767..1030 POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 20:
AAGGTAATTA	TCCAAGATGT	AGCATCAAGA	ATCCAATGTT	TACGGGAAAA	60
ACTATGGAAG	TATTATGTGA	GCTCAGCAAG	AA.GCAGATCA	ATATGCGGCA	CATATGCAAC	120
CTATGTTCAA	AAATGAAGAA	TGTACAGATA	CAAGATCCTA	TACTGCCAGA	ATACGAAGAA	ISO
GAATACGTAG	AAATTGAAAA	AGAAGAACCA	GGCGAAGAAA	AGAATCTTGA	AGACGTAAGC	240
ACTGACGACA	ACAATGAAAA	GAAGAAGATA	AGGTCGGTGA	TTGTGAAAGA	GACATAGAGG	300
ACACATGTAA	GGTGGAAAAT	GTAAGGGCGG	AAAGTAACCT	TATCACAAAG	GAATCTTATC	360
CCCCACTACT	TATCCTTTTA	TA.TTTTTCCG	TGTCATTTTT	GCCCTTGAGT	TTTCCTATAT	420
AAGGAACCAA	GTTCGGCATT	TGTGAAAACA	AGAAAAAATT	TGGTGTAAGC	TATTTTCTTT	480
GAAGTACTGA	GGATACAACT	TCAGAGAAAT	TTGTAAGTTT	GTAGATCTCG	ATTCTAGA	538

ATG Met 1

GCC Ala

TGC Cys

ACC Thr

AAC Asn 5

ΑΛ G Asn

GCC Ala

ATG Met

AGG Arg

GCC Ala 10

CTC T, a U

TTC Phe

CTC Leu

CTC Leu

GTG val 15

CTC Leu

525

TTC

TGC

ATC

GTG

CAC

GGC

GAT

AAG

CTT

ATC

GGT

TCC

TGC

GTG

TGG

GGT

634

Phe

Cys

Ile

Val

His

Gly

As?

Lys

Leu

Ile

Gly

Ser

Cys

Val

Tr?

Gly

20

25

30

GCT

GTG

AAC

TAC

ACT

TCC

GAT

TGC

AAC

GGT

GAG

TGC

AAG

AGG

AGG

GGT

632

Ala

Val

Asn

Tyr

Thr

Ser

As?

Cys

Asn

Gly

Glu

Cys

Lys

Arg

Arg

Gly

35

40

45

TAC

AAG

GGT

GGT

CAC

TGC

GGT

TCC

TTC

GCT

AAC

GTG

AAC

TGC

TGG

TGC

730

*

Tyr

Lys

Gly

Gly

His

Cys

Gly

Ser

Phe

Ala

Asn

Val

Asn

Cys

Tr?

Cys

50

55

60

GAG ACT TGACTGGAGG GGGGGCCCGG TACCGGATCC AATTCCCGAT CGTTCAAACA 78 6

Glu Thr

TTTGGCAATA	AAGTTTCTTA	AGATTGAATC	CTGTTGCCGG	TCTTGCGATG	ATTATCATAT	846
AATTTCTGTT	GAATTACGTT	AAGCATGTAA	TAAx TAACaT	GTAATGCATG	ACGTTATTTA	905
TGAGATGGGT	TTTTATGATT	AGAGTCCCGC	AATTATACAT	TTAATACGCG	ATAGAAAACA	966
AAATATAGCG	CGCAAACTAG	GATAAATTAT	CGCGCGCGGT	GTCATCTATG	TTACTAGATC	1026

GGGGATCGAT

1036 • ·

- 61 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 52 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 21:

AGCTTGGATA AAAGAGACAA GTTGATTGGC AGCTG7GTTT GGGGCGCCGT CA 52 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 56 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 22:

AGTGTAGTTG ACGGCGCCCC AAACACAGCT GCCAATCAZC TTGTCTCTTT TA7CCA 55 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A.) DÉLKA: 52 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 23:

ACTACACTAG TGACTGCAAC GGCGAGTGCA AGCGCCGCGG TTACAAGGGT GG 52 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 52 párů baží (B) TYP: nukledvá kyselina

- 62 • >··· ♦ · · · • ··· · · · · • ·· · · · * · ♦ • · · a · · · (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 4 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 24:

CACAATGGCC ACCCTTGTAA CCGCGGCGCT TGCACTCGCC GTTGCAGTCA CT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 56 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché • (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 5 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 25:

CCATTGTGGA TCCTTCGCTA ACGTTAACTG TTGGTGTGAA ACCTGATAGG TCGACA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 52 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 26:

GATCTGTCGA CCTATCAGGT TTCACACCAA CAGTTAACGT TAGCGAAGGA TC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 19 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 27:

GATCCTTCGC TAACGTTAAC TGTTGGTGTA GAACCTGATA GG 42 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 20 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 28:

TCGACCTATC AGGTTCTACA CCAACAGTTA ACGTTAGCGA AG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:

(i) CHARAKTÉŘIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYF: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 29:

CTAGTGACTG CAACGGCGAG TGCTTGTTGC GC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 22 • ·

- 64 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 30:

GCAACAAGCA CTCGCCGTTG CAGTCA 2S (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 23 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 31:

CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCAAGCGGC GC 32 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 24 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 32:

GCCGCTTGCA CTCAGCAGCG CAGTCA l

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

, (A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 25 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 33:

AGCTTGGATA AAAGAGCTGC TGCTGCTGGT AGCTGTGTTT • ·

• · · · • · · ♦ • · · · • · · · • · · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34 (i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 26 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 34:

GGGGCGCCGC CAACTACA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kvselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 27 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 35:

CTAGTGTAGT TGACGGCGCC CC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

. (A) DÉLKA: 36 párů baží * (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 28 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 36:

AAACACAGCT ACCAGCAGCA GCAGCTCTTT TATCCA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 29 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 37:

CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCTTGTTGC GC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A.) POPIS: syntetický oligonukleotid 30 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 38:

GCAACAAGCA CTCAGCAGCG CAGTCA 2Ó

Claims (20)

1. Peptid obsahující výslovně peptidovou sekvenci podle vzorce (I)

Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xař-Cys-Xag (I) kde

Xaa představuje skupinu NH₂ nebo peptidový zbytek obsahující 1 až 10 aminokyselin, výhodně 1 až 6 aminokyselin,

Xab představuje peptidový zbytek obsahující 1 až 10

aminokyselin, výhodně 10 aminokyselin, Xac představuje peptidový zbytek obsahuj ící 3 aminokyseliny, Xad představuje p eptidový zbytek obsahující 1 až 9 aminokyselin, výhodně 9 aminokyselin, Xae představuje peptidový zbytek obsahující 1 až 7 aminokyselin, výhodně 7 aminokyselin, Xaf představuje peptidový zbytek obsahuj ící 1 aminokyselinu, a

Xag je skupina -OH nebo peptidový zbytek obsahující i až 5 aminokyselin, výhodně 1 až 2 aminokyseliny.

2. Peptid podle nároku 1, kde Xaa obsahuje alespoň jednu bazickou aminokyselinu a/nebo Xad obsahuje alespoň jednu bazickou aminokyselinu.

3. Peptid podle nároku 2, kde Xad obsahuje 1, 2, 3 nebo 4 bazické aminokyseliny.

4. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 2 nebo 3, kde bazické aminokyseliny jsou vybrány ze skupiny obsahující lysin, arginin a homoarginin.

5. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde Xad představuje peptidovou sekvenci -Lys-Xad'-Xad-Gly-His-, přičemž Xad' představuje peptidový zbytek 1 bazické aminokyseliny a Xad představuje peptidový zbytek obsahující 0 až 5 aminokyselin, výhodně 5 aminokyselin.

6. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde Xad představuje peptidovou sekvenci -Lys-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-GlyGly-His-.

7. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kde Xac obsahuje alespoň jednu kyselou aminokyselinu, výhodně právě jednu.

8. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 , kde představuje peptidovou sekvenci -A.sn-Xac'-Xac-, přičemž představuje peptidový zbytek s 1 aminokyselinou a představuje peptidový zbytek s 1 kyselou aminokyselinou.

Xac

Xac'

Xac

9 9 9 9 • » · • * · 9 • · · · • · · · • ♦ · · tím, že se do hostitelského organismu vnese alespoň jeden fragment nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 23 až

25 nebo chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 26 až 28 . * 41. Způsob podle nároku 40 vyznačuj í c i s e - tím, že hostitelský organismus je rostlinná buňka nebo • rostlina. 42. Způsob podle nároku 41 vyznačuj í c i s e

tím, že se regeneruje rostlina z transformované rostlinné buňky nebo rostliny.

43. Způsob pěstování transformovaných rostlin podle kteréhokoliv z nároků 36 až 38 vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se vysejí semena transformovaných rostlin na pole vhodné pro pěstování těchto rostlin, na povrch pole se aplikuje agrochemický přípravek, aniž by se podstatným způsobem ovlivnila semena nebo transformované rostliny, po dosažení zralosti se pěstované rostliny sklidí, a případně se oddělí ze sklizených rostlin semena.

f

44. Způsob pěstování podle nároku 43 vyznačující se tím, že agrochemický přípravek obsahuje alespoň jednu účinnou látku projevující fungicidní a/nebo baktericidní aktivitu.

45. Způsob pěstování podle nároku 44 vyznačující se tím, že účinná látka projevuje

doplňující účinky k účinkům peptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20. 46. Způsob přípravy heliomicinu podle kteréhokoliv

- 74 z nároků 1 až obsahuje kroky, podle nároku 30 se extrakce a heliomicinu.

9. Peptid podle nároku 7 nebo 8, kde kyselé aminokyseliny jsou vybrány ze skupiny obsahující kyselinou glutamovou (Glu) a asparagovou (Asp).

• · • · · · · · · • · 9 9 9 · • 99 99 ··

- 68

10. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, kde Xac představuje peptidovou sekvenci -Asn-Gly-Glu-.

11. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, kde Xaa představuje peptidovou sekvenci Xaa'-Gly-Xaa-, přičemž Xaa' je skupina NH? nebo peptidový zbytek obsahující 1 až 9 aminokyselin, výhodně 1 až 5 aminokyselin, a Xaa je peptidový zbytek obsahující nejméně 1 aminokyselinu vybranou výhodně ze skupiny obsahující aminokyseliny Leu, Ile, Val, Pro, Ser nebo Thr, a/nebo • « • · • · ·· ··· ···· ··· ···· ··· ·· ·· ··

- 69 Xab představuje peptidovou sekvenci -Val-Xab'-Asp-, kde Xab' je peptidový zbytek obsahující 0 až 8 aminokyselin, výhodně 8 aminokyselin a/nebo

Xae představuje peptidovou sekvenci -Gly-Xae'-Asn-, kde Xae' je peptidový zbytek obsahující 0 až 5 aminokyselin, výhodně 5 aminokyselin, a/nebo

Xaf představuje jednu z následujících aminokyselin Trp, Phe, Leu, Ile nebo Val, a/nebo

Xag představuje peptidovou sekvenci -Glu-Xag', kde Xag' je skupina OH nebo zbytek sekvence obsahující 1 až 4 aminokyseliny, výhodně 1 aminokyselinu.

12. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kde Xaa představuje peptidovou sekvenci NH₂-Asp-Lys-Leu-Ile-Gly-Sera/nebo

Xab představuje peptidovou sekvenci -Val-Trp-Gly-Ala-Val-AsnTyr-Thr-Ser-Asp- a/nebo

Xae představuje peptidovou sekvenci -Gly-Ser-Phe-Ala-Asn-ValAsn- a/nebo

Xaf představuje aminokyselinu -Trp- a/nebo

Xag představuje peptidovou sekvenci -Glu-Thr-OH.

13. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, který je představován sekvencí identifikačního čísla 2 (sekvence id. č. 2) .

14. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, který obsahuje na jednom ze svých konců nebo na obou koncích peptidové zbytky nezbytné pro expresi a směrování peptidu v hostitelském organismu.

15. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, kde cysteinové zbytky v peptidu podle vzorce (I) tvoří alespoň • · t ·· ·· · · · ·· · • · ··· ···· ··· ···· ··· ·· ·· ··

- 70 jeden intramolekulární disulfidický můstek'.

16. Peptid podle nároku 15, který obsahuje 3 disulfidické můstky spojující cysteinové zbytky 1 a 4, 2 a 5, a 3 a 6.

17. Fúzní peptid peptid-heliomicin, kde heliomicin je peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16.

18. Fúzní peptid podle nároku 17, kde peptid fúzovaný s heliomicinem je signální peptid nebo tranzitní peptid.

19. Fúzní peptid podle nároku 18, kde tranzitní peptid je signální peptid genu PR-Ια tabáku nebo prekurzor faktoru Mat al nebo signální peptid genu PGi poivgalakturonázy kukuřice.

20. Fúzní peptid podle nároku 19, který je představován sekvencí id. č. 1, sekvencí id. č. 3 nebo sekvencí id. č. 18.

21. Použití peptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20 jako léčiva.

22. Přípravek vyznačující se tím, že obsahuje peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20 a vhodné vehikulum.

23. Fragment nukleové kyseliny, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20.

24. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 23, kde se jedná o nukleotidovou sekvenci typu DNA.

25. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 24, kde nukleotidová sekvence DNA obsahuje sekvenci uvedenou jako báze 16 až 147 sekvence id. č. 1, sekvence id. č. 2, báze 3 až 224 sekvence id. č. 3 nebo báze 7 až 205 sekvence id. č. 18, nebo sekvenci homologní nebo sekvenci komplementární k této sekvenci.

26. Chimérický gen, který obsahuje kódující sekvenci nukleové kyseliny fúzovanou na 5'- a 3'-konci s heterologními regulačními prvky, které jsou funkční v hostitelském organismu, zejména rostlině, přičemž kódující sekvence obsahuje alespoň jeden fragment DNA podle nároků 23 až 25.

27. Chimérický gen podle nároku 25, kde hostitelský organismus je mikroorganismus.

28. Chimérický gen podle nároku 26, kde hostitelským organismem jsou rostlinné buňky nebo rostlina.

29. Klonovací nebo expresní vektor pro transformaci hostitelského organismu, který obsahuje alespoň jeden replikační počátek a alespoň jeden chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 26 až 28.

30.

obsahuj e z nároků z nároků

Transformovaný hostitelský organismus, který fragment nukleové kyseliny podle kteréhokoliv 23 až 25 nebo chimérický gen podle kteréhokoliv

26 až 28.

31. Transformovaný hostitelský organismus podle nároku 30, kterým je mikroorganismus, rostlinné buňky nebo rostlina.

• «

- 72

32. Transformovaný hostitelský organismus podle nároku 30, kterým jsou rostliny obsahující transformované buňky.

33. Hostitelský organismus podle nároku 32, kterým je rostlina regenerovaná z transformované rostlinné buňky.

34. Transformovaný hostitelský organismus podle nároku 30, kde mikroorganismus je vybrán z bakterií, zejména E. coli, kvasinek, zejména rodů Saccharomyces, Kluyvaromyces nebo Pichia, hub, zejména rodu Aspergillus, nebo bakulovirů.

35. Transformovaná rostlinná buňka, která obsahuje fragment nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 23 až 25 nebo chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 26 až 28.

36. Transformovaná rostlina, která obsahuje alespoň jednu transformovanou rostlinnou buňku podle nároku 35.

37. Transformovaná rostlina podle nároku 36 odolná proti chorobám, které způsobuje Cercospora, zejména Cercospora betícola, Cladosporium, zejména Cladosporium herbarum, Fusarium, zejména Fusarium culmorum nebo Fusarium gr amine a rum, a Phytophthora, zejména Phytophthora cinnamcni.

38. Transformovaná rostlina, která byla získána pěstováním a/nebo křížením rostlin podle nároku 36 nebo 37.

39. Semena transformovaných rostlin podle kteréhokoliv z nároků 36 až 38.

40. Způsob transformace hostitelského organismu, zejména rostlinné buňky nebo rostliny, vyznačující se

20 vyznačující se kdy se pěstuje transformovaný až 34 ve vhodném kultivačním médiu, celková nebo částečná purifikace tím, že organismus a provede získaného