CZ20001683A3 - Gen kódující thanatin, vektor obsahující tento gen, způsob přípravy transgenních rostlin a transgenní rostliny odolné vůči chorobám - Google Patents

Abstract

Sekvence DNA kódující thanatin, vektor obsahující tento gen pro transformaci hostitelského organismu a způsob transformace rostlinných buněk a rostlin. Thanatin tvořený v transformovaných rostlinách poskytuje těmto rostlinám odolnost k chorobám, zejména k chorobám houbového původu.

Description

Gen kódující thanatin, vektor obsahující tento gen, způsob přípravy transgenních rostlin a transgenní rostliny odolné vůči chorobám

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká sekvence DNA kódující thanatin, vektoru obsahujícího tuto sekvenci vhodného pro transformaci hostitelského organismu, a dále se týká způsobu transformace takového organismu.

Vynález se zvláště týká transformace rostlinných buněk, kdy thanatin produkovaný transformovanými rostlinami poskytuje těmto rostlinám rezistenci k chorobám, zejména k chorobám houbového původu.

Dosavadní stav techniky

V současné době je pociťována potřeba získat rostliny, které by byly rezistentní proti chorobám, zejména houbovým chorobám, aby se z důvodu ochrany životního prostředí zmenšilo či případně zcela odstranilo používání fungicidních prostředků. Způsob, jak zvýšit rezistenci proti chorobám, spočívá v transformaci rostlin tak, aby tvořily látku, která je schopna zajistit jejich obranu proti těmto chorobám.

Jsou známy různé látky přírodního původu, zejména peptidy, které mají baktericidní nebo fungicidní vlastnosti, a zvláště působí proti houbám zodpovědným za choroby rostlin. Tudíž problém spočívá v tom, aby se mezi těmito látkami nalezla taková látka, která nejenže se bude vytvářet v transformovaných rostlinách, ale navíc si uchová své baktericidní nebo fungicidní vlastnosti, které poskytne

uvedeným rostlinám. Ve smyslu předkládaného vynálezu se baktericidními nebo fungicidními vlastnostmi rozumí jak baktericidní a fungicidní vlastnosti v pravém smyslu slova tak i vlastnosti bakteriostatické a fungistatické.

Thanatin je peptid produkovaný bakteriemi rodu Psodius sp., výhodně druhu maculiventrís. Příprava tohoto peptidu indukcí bakterií v patentové přihlášce FR 2 733 237, která také uvádí jeho protihoubové a antibakteriální vlastnosti in vitro.

V současnosti byly identifikovány geny kódující thanatin, které byly upraveny tak, že jsou schopny vložení do hostitelského organismu, zejména do rostliny, kde exprimuj! thanatin. Hostitelský organismus díky expresi thanatinu získá rezistenci k chorobám bakteriálního a houbového původu, což je zvláště výhodné řešení výše uvedených problémů.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je fragment nukleové kyseliny, která kóduje thanatin, chimérický gen obsahující tento fragment kódující thanatin a také heterologní regulační prvky v pozicích 5' a 3' schopné funkce v hostitelském organismu, zejména v rostlině. Dalším předmětem vynálezu je vektor pro transformaci hostitelského organismu obsahující chimérický gen a dále transformovaný hostitelský organismus. Vynález se také týká transformované rostlinné buňky, která obsahuje alespoň jeden fragment nukleové kyseliny kódující thanatin a také rostliny rezistentní proti chorobám, která obsahuje tuto buňku, a zvláště rostliny, která byla regenerována z takové buňky. Dále se vynález týká způsobu transformace rostlin, aby získali rezistenci k chorobám, kdy se pomocí vhodného vektoru vloží gen kódující thanatin.

• φφφφ φ · φ φ ·· ·· • · · φφφ · · · · • · · · φ φ φ φφφφ φ φφφ φφ φφφ φφ φ

Thanatin podle předkládaného vynálezu označuje peptid, který obsahuje nezbytně peptidovou sekvenci 11 aminokyselin, která byla popsána v patentové přihlášce FR 2 733 237, nebo homologní ekvivalentní sekvenci, kde některé aminokyseliny jsou nahrazeny odlišnými, ale ekvivalentními aminokyselinami, takže tyto změny nezpůsobují podstatné změny v antibakteriální nebo protihoubové aktivitě této homologní sekvence. Peptidovou sekvencí obsahující v podstatě peptidovou sekvenci popsanou v patentové přihlášce FR 2 733 237 není míněna jen samotná sekvence identifikačního čísla 1 (id. č. 1), ale také ekvivalent této sekvence obsahující, a to na jednom nebo druhém svém konci nebo na obou koncích, peptidové sekvence nezbytné pro expresi a zacílení produktu v hostitelském organismu, zejména rostlinné buňce.

Thanatin je peptid podle následujícího vzorce (I):

Xaa-Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly Lys Cys-Xab (I) kde

Xaa představuje NH₂ nebo zbytek různých sekvencí obsahující 1 až 10 aminokyselin,

Xab představuje OH nebo zbytek různých sekvencí obsahující 1 až 5 aminokyselin.

Ve výhodném provedení Xaa obsahuje alespoň jednu aminokyselinu vybranou z 20 základních aminokyselin, zvláště výhodně ze skupiny aminokyselin obsahující Gly, Ser, Lys, Pro a Val. Výhodně Xab obsahuje alespoň jednu aminokyselinu vybranou z 20 základních aminokyselin, zvláště výhodně ze skupiny aminokyselin obsahující Gin, Arg a Met.

Ve výhodném provedení vynálezu dva cysteinové zbytky ve vzorci (I) vytvářejí intramolekulámí disulfidický můstek.

Předkládaný vynález se týká fragmentu nukleové kyseliny, zejména DNA, kódující thanatin definovaný výše. Podle vynálezu jde výhodně o fragment izolovaný z Psodius sp., výhodně druhu maculiventris, nebo z něho získaný fragment, upravený pro expresi thanatinu v hostitelském organismu,který pak bude exprimovat thanatin. Fragment nukleové kyseliny lze izolovat a purifikovat standardními způsoby nebo syntetizovat známým způsobem postupné hybridizace syntetických oligonukleotidů. Tyto způsoby jsou popsány např. v příručce Ausubel et al.

V předkládaném vynálezu se termínem fragment nukleové kyseliny myslí nukleotidová sekvence typu DNA nebo RNA, výhodně DNA, zvláště cDNA a zejména dvouřetězcová cDNA.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu fragment nukleové kyseliny obsahuje sekvenci DNA popsanou zde jako sekvence id. č, 2, nebo sekvenci s ní homologní a nebo sekvenci k ní komplementární.

Termínem homologní se v předkládané přihlášce vynálezu rozumí fragment nukleové kyseliny obsahující jednu nebo několik modifikací sekvence id. č. 1 nebo id. č. 2 kódujících thanatin. Takové modifikace lze získat obvyklými mutačními technikami nebo výběrem vhodných syntetických oligonukleotidů pro přípravu takové sekvence hybridizaci. Pokud jde o četné kombinace nukleových kyselin, které kódují expresi stejné aminokyseliny, rozdíly mezi referenční sekvencí id. č. 1 nebo id. č. 2 a homologními sekvencemi jsou důležité, pokud jde o fragment DNA velikosti do přibližně 100 nukleotidů realizovatelný syntézou.

Výhodně je míra homologie sekvence nejméně 70% s referenční sekvencí, výhodněji 80% a nejvýhodněji je homologie 90%. Tyto modifikace jsou obecně neutrální, to znamená že neovlivňují primární sekvenci výsledného thanatinu.

Předkládaný vynález se také týká chimérického genu (nebo expresní kazety) obsahujícího jak kódující sekvenci tak i heterologní regulační prvky, lokalizované na 5'- a 3'-konci, funkční v hostitelském organismu, zejména rostlinné buňce nebo rostlině, přičemž kódující sekvence obsahuje alespoň jeden fragment DNA kódující thanatin jak je zde definován.

vynálezu pro tvorbu o bakterie E. colí,

Hostitelským organismem je míněn organismus jednobuněčný nebo mnohobuněčný, nižší nebo vyšší, do kterého je vložen chimérický gen podle předkládaného thanatinu. Konkrétně se jedná např.

kvasinky rodu Saccharomyces nebo Kluyveromyces, Pichia, houby rodu Aspergillus, bakuloviry, nebo výhodně rostlinné buňky.

Rostlinná buňka znamená ve smyslu předkládaného vynálezu buňku tvořící rostlinou tkáň, ať už tvoří nediferencovanou tkáň jako je kalus nebo tvoří diferencované tkáně jako embryo, části rostliny, rostlinu nebo semena.

Rostlina ve smyslu předkládaného vynálezu znamená celý mnohobuněčný diferencovaný organismus schopný fotosyntézy, je to rostlina jednoděložná nebo dvouděložná, a zvláště se pak jedná o rostliny kulturní určené pro výživu člověka nebo zvířat, kam patří např. kukuřice, pšenice, řepka, sója, rýže, cukrová třtina, řepa, tabák, bavlník a další.

Regulační prvky nezbytné pro expresi fragmentu DNA kódujícího thanatin, funkční v hostitelském organismu, jsou odborníkovi známy. K těmto prvkům patří zejména promotorové sekvence, aktivátory transkripce, tranzitní peptidy, a stop kodonů. výběr regulačních terminační sekvence včetně start

Prostředky a metody pro identifikaci a prvků jsou také odborníkovi známy.

Fragment nukleové kyseliny podle vynálezu obsahuje sekvenci nukleové kyseliny fúzovanou na 5'a/nebo 3'-konci kódující sekvence thanatinu, a to tak. že se získá fúzní protein protein-thanatin nebo thanatin-protein, výhodně protein-thanatin, ze kterého se může vystřižením pomocí enzymatického systému rostlinné buňky uvolnit thanatin, jak zde byl definován. Fúzní peptid s thanatinem dále může obsahovat signální peptid nebo tranzitní peptid, které umožňují řídit a směrovat vytvářený thanatin specifickým způsobem do určité části hostitelského organismu, zejména rostlinné buňky nebo rostliny, např. do cytoplazmy, buněčné membrány, a nebo v případě rostlin do určitého buněčného kompartmentu nebo tkání nebo do extracelulárního prostoru.

V jednom provedení vynálezu může tranzitní peptid obsahovat signál pro chloroplastovou nebo mitochondriální lokalizaci, čímž je zajištěno štěpení v chloroplastu nebo mitochondrii.

V dalším povedení vynálezu může signální peptid obsahovat N-koncový signál neboli prepeptid, případně spojený se signálem, zodpovědným za zadržení proteinu v endoplazmatickém retikulu, nebo peptid pro zaměření do vakuoly neboli propeptid. Endoplazmatické retikulum je místo, které je v rámci buněčného mechanismu zodpovědné za procesy maturace (zrání) proteinových produktů, jako je např. odštěpení signálního peptidu.

Předkládaný vynález se týká zvláště transformace rostlin. Jako regulační promotorovou sekvenci v rostlině je možné užít jakýkoliv promotor rostlinného genu, který je přirozeně exprimován v rostlině, a zejména promotor bakteriálního, virového nebo rostlinného původu, jako je např. gen pro malou podjednotku ribulózobisfosfátkarboxylázy/oxygenázy (RuBisCO) , nebo gen rostlinného viru jako je např. virus mozaiky květáku (CAMV, 19S nebo 35S promotor), nebo promotor indukovatelný patogenem jako je • 9 9 9 9 ·· · · · · ·9

9 9 9 · 9 · » · · · 9 9 999 9 9 9 9 · · · · 9 · 9 9 9 9 · ·· · 9 9 9 · 9 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 · · ·· 9 9 např. PR-Ία z tabáku, který je také výhodný pro použití dle vynálezu. Výhodné je užití regulační promotorové sekvence, která vede ke konstitutivní expresi kódované sekvence nebo k expresi indukované po napadení patogenem, jako je např. histonový promotor popsaný v patentové přihlášce EP 0 507 698.

Podle předkládaného vynálezu je také možné užít ve spojení s promotorovou sekvencí další regulační sekvence, které jsou situovány mezi promotorem a kódující sekvencí, jako jsou např. aktivátory transkripce (enhacery, zesilovače), např. aktivátor transkripce viru mozaiky tabáku (TMV) popsaný v patentové přihlášce WO 87/07644, nebo z viru skvrnitosti tabáku (TEV), který popsali Carrington a Freed, nebo tranzitní peptidy, ať jeden nebo dva, a v takovém případě jsou odděleny vmezeřenou intermediátní sekvencí, takže, ve směru transkripce, jedna sekvence kóduje tranzitní peptid rostlinného genu kódujícího enzym s plastidovou lokalizací, pak následuje část sekvence části maturovaného N-konce rostlinného genu kódujícího enzym s plastidovou lokalizací, a pak sekvence kódující druhý tranzitní peptid z rostlinného genu kódujícího enzym s plastidovou lokalizací, jak bylo již popsáno v patentové přihlášce EP 0 508 909. Jako vhodný tranzitní peptid pro fúzi podle vynálezu může být uveden zvláště signální peptid genu PR-lot tabáku, který popsali Cornelissen et al. a jehož kódující sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č. 3

Sekvence kódující fúzní protein signálního peptidu a thanatinu PR-lot thanatin a tento fúzní protein jsou rovněž části předkládaného vynálezu. Tato sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č. 5, zejména její kódující část odpovídající bažím v pozici 12 až 164.

Jako sekvence řídící terminaci nebo polyadenylaci je možné užít odpovídající sekvence bakteriálního původu, jako • · 44 4 4 4 ·· • 4 9 4 4 4 • · · 4 4 4 4

944 99 49 94 4· 44 např. terminátor nos z Agrobacterium tumefaciens, nebo také rostlinného původu, jako např. terminátor histonového genu, jaký byl popsán v patentové přihlášce EP 0 633 317.

Chimérický gen podle předkládaného vynálezu je asociován se selekčním markérem adaptovaným pro hostitelský organismus. Takové selekční markéry jsou odborníkovi dobře známy, jedná se o geny rezistence k antibiotikům a také o geny tolerance k herbicidům.

Předkládaný vynález se také týká klonovacího nebo expresního vektoru pro transformaci hostitelského organismu, který obsahuje alespoň jeden chimérický gen podle vynálezu definovaný výše. Tento vektor obsahuje kromě již zmíněného chimérického genu nejméně jeden replikační počátek a v případě potřeby také vhodný selekční markér. Tento vektor je tvořen plazmidem, kozmidem, bakteriofágem nebo virem, do kterých byl vložen chimérický gen podle předkládaného vynálezu. Takové transformační vektory vhodné pro transformaci hostitelského organismu jsou odborníkovi známy a byly podrobně popsány v odborné literatuře.

Pro transformaci rostlinných buněk nebo rostlin jde zejména o virus, který lze využít k transformaci vyvíjejících se rostlina obsahující vlastní prvky pro replikaci a expresi. Ve výhodném provedení je transformačním vektorem pro rostlinné buňky nebo rostliny podle vynálezu plazmid.

Dalším předmětem vynálezu je způsob transformace hostitelského organismu, zejména rostlinných buněk, a to tím, že se integruje alespoň jeden fragment nukleové kyseliny nebo chimérický gen, jak byly definovány výše podle vynálezu, přičemž transformace lze dosáhnout vhodnými prostředky odborníkovi známými, které jsou popsány v odborné literatuře, zejména v publikacích citovaných v této přihlášce. Zvláště jde o transformaci vektorem podle předkládaného vynálezu.

Jednou z celé řady známých metod transformace je ostřelování buněk nebo protoplastů částicemi, na které je navázaná sekvence DNA. Další metoda spočívá v tom, že se jako prostředek k přenosu do rostliny využije Ti plazmid z Agrobacterium tumefaciens nebo Ri plazmid z Agrobacterium rhizogenes, do kterého se integruje chimérický gen.

Jednou z dalších metodám, které lze užít, je mikroinjekce nebo elektroporace, a také přímá precipitace prostřednictvím PEG.

Odborník zvolí vhodnou metodu v závislosti na povaze hostitelského organismu, zejména rostlinné buňky nebo rostliny.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou hostitelské organismy, zvláště rostlinné buňky nebo rostliny, které jsou transformované a obsahují ve svém genomu účinné množství chimérického genu obsahujícího sekvenci kódující thanatin, jak je definován výše v této přihlášce.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou rostliny, které obsahují transformované buňky, zvláště rostliny regenerované z transformovaných buněk. Regeneraci lze provést jakýmkoliv vhodným způsobem odborníkovi známým, který závisí na druhu rostliny, např. způsobem popsaným např. v odborné literatuře zde citované.

Postupy transformace rostlinných buněk a regenerace rostlin byly popsány např. v následujících dokumenetch: US 4 459 355, US

US 5 177 010, US 5 187 073, EP EP 672 752, US 4 945 050, US 5 036 US 5 371 014, US 5 478 744, US 5

US 5 484 956, US 5 538 877, US

US 5 510 318, US 5 204 253, US patentových

536 475, US	5 464	763
267 159, EP	604	662
006, US 5	100	792
179 022, US 5	565	346
5 554 798, US	5 489	520
5 405 765, EP 442	174

00 ► 0 0 » 0 0 · 0

0 00

00

EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 a WO 95/06128.

Dále jsou předmětem předkládaného vynálezu také transformované rostliny získané kultivací a/nebo křížením regenerovaných rostlin podle vynálezu, a taktéž semena transformovaných rostlin.

Transformované rostliny podle předkládaného vynálezu jsou rezistentní k některým chorobám, zvláště k některým chorobám způsobených houbami nebo bakteriemi. Rezistence rostlin proti těmto chorobám je vytvořena tím způsobem, že je do rostlin integrována sekvence DNA kódující thanatin podle vynálezu, přičemž thanatin je účinný proti houbovým chorobám, které způsobují houby rodu Cercospora, zejména Cercospora betícola, rodu Cladosporium, zejména Cladosporium herbarum, rodu Fusarium, zejména Fusarium culmorum nebo Fusarium graminearum, a Phytophthora, zejména Phytophthora cinnamoni.

Ve výhodném provedení je chimérický gen spojen s alespoň jedním selekčním markérem, kterým může být jeden nebo několik genů tolerance k herbicidům.

Sekvence DNA kódující thanatin může být také spojena s takovým markérem pro selekci transformovaných rostlin a ještě s dalšími sekvencemi kódujícími jiné požadované peptidy nebo proteiny, např. s geny tolerance k herbicidům.

Takové geny tolerance k herbicidům jsou odborníkovi známy a byly popsány např. v patentových přihláškách EP 115 673, WO 87/04181, EP 337 899, WO 96/38567 nebo WO 97/04103.

Je zřejmé, že transformované buňky a rostliny podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat kromě sekvence kódující thanatin další heterologní sekvence kódující požadované proteiny jako např. jiné peptidy, které poskytují rostlinám rezistenci k dalším nemocem bakteriálního nebo φ Φφφφ ♦ * φφ φφ φφ φ φ φ φ φφ φφφφ • φ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φφφ φφ φφφ φφ φ φφφ φφφφ φφφφ φφφ φφ φφφφ φφ φφ houbového původu .

Další sekvence, které se mohou integrovat prostřednictvím vektoru obsahujícího chimérický gen podle vynálezu, jsou takové sekvence, které obsahují první sekvenci kódující thanatin a alespoň jeden další gen kódující další požadovaný peptid nebo protein.

Je také možné integrovat nejméně jeden další vektor obsahující alespoň jednu další sekvenci, a to způsobem v oboru známým, jak bylo již popsáno.

Rostliny podle vynálezu je také možné získat křížením rodičovských rostlin, kdy jeden z rodičů nese gen podle vynálezu kódující thanatin a druhý z rodičů nese geny kódující alespoň jeden další požadovaný peptid nebo protein.

K sekvencím kódujícím další peptidy s protihoubovým účinkem patří např. sekvence kódující drosomycin, která byla popsána v patentu FR 2 725 992, v publikaci Fehlbaum et al. (1994) a v nepublikované patentové přihlášce FR 97 09115 podané 24 července 1997, a také buňky kódující androctonin popsané v patentu FR 2 745 004 a v nepublikované přihlášce FR 97 10362, které byly deponovány 20. srpna 1997.

Příklady dále uvedené slouží k ilustraci vynálezu, ukazují přípravu sekvence kódující thanatin, chimérického genu, integračního vektoru a transformovaných rostlin. Připojené obrázky 1 až 5 schematicky znázorňují strukturu některých plazmidů použitých pro konstrukci chimérických genů. V obrázcích jsou kurzívou označena restrikční místa.

• ··♦·	• to to·	·· ··
• « ·	« · to	to ·· ·
• ·	to to · · ·	• toto t
··· toto
• to *·	•« ··

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce chimérických genů

Všechny zde použité laboratorní postupy jsou standardní postupy odborníkovi známé. Podrobné popisy těchto postupů lze najít např. v publikaci Ausubel et al.

pRPA-MD-P: příprava plazmidu obsahujícího signální peptid genu PR-la z tabáku

Dva syntetické oligonukleotidy s komplemetárními sekvencemi Oligo 1 a Oligo 2, popsanými dále, byly hybridizovány v 65 °C po 5 minut a pak pomalým snižováním teploty na 30 °C během 30 minut.

Oligo 1: 5 ' GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC

ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3'

Oligo 2: 5 ¹ TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA

GAAGAGTAGA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3 '

Po hybridizaci Oligo 1 s Oligo 2 sloužil jednovláknový jako matrice z E. coli zbytek DNA □olymerázy 1 pro Klenowův fragment DNA (ve standardních podmínkách doporučených výrobcem New England Biolabs) pro vytvoření Ivouvláknového oligonukleotidů na 3'-koncích oligonukleotidů. lískaný dvouvláknový oligonukleotid byl pak naštěpen restrikčními enzymy SacII a Nael a klonován do plazmidu dBS II SK(-) (Stratagene), který byl předtím naštěpen stejnými restrikčními enzymy. Byl tak získán klon obsahující

•	··*·		00	00 0 0
• ·	•	Φ ♦	*	• *0 ·
•	•	'» ·	0 00	• 0 · *
• · ·	• 0	00	00	«0 ··

kódující úsek signálního peptidu genu PR-la (sekvence id. č. 3).

z tabáku pRPA-PS-PRla-than: Příprava sekvence kódující thanatin fúzovaný se signálním peptidem PR-la bez nepřepisovaného úseku 3'-konce

Dva syntetické oligonukleotidy s komplementárními sekvencemi Oligo 3 a Oligo 4 byly hybridizovány v podmínkách uvedených pro pRPA-MD-P.

Oligo 3: 5' GGTTCCAAGA AGCCAGTGCC AATCATCTAC TGCAACAGGA

CG 3'

Oligo 4; 5 ¹ CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCACATCC

TCTGGCACTT ACCAGTCCTC CTGTTGCAGT AGATGATTGG CACTGGC 3'

Po hybridizaci Oligo 3 s Oligo 4 sloužil jednovláknový zbytek DNA polymerázy 1 jako matrice pro Klenowův fragment DNA

E. coli (ve standardních podmínkách doporučených výrobcem New England Biolabs) pro vytvoření dvouvláknového oligonukleotidu na 3'-koncích oligonukleotidů. Získaný dvouvláknový oligonukleotid obsahující část kódující thanatin (sekvence id. č. 1) byl pak přímo klonován do plazmidu pRPA-MD-P který byl naštěpen restrikčním enzymem Nael. Správnost orientace v získaném klonu byla ověřena sekvencováním. Byl tak získán klon obsahující úsek kódující fúzní protein PR-la-thanatin ležící mezi restrikčními místy Ncol na N-konci a Sací, SacII a BamHI na C-konci (sekvence id. č. 4).

♦ 444

44 • 4 · · * · 4 4 • 4 4 444 4444

444 44 444 44 ·

4 4444 4444

444 44 4 4 44 4 · pRPA-RD-239: Příprava expresního vektoru, obsahujícího sekvenci kódující fúzní protein Pl-la-thanatin, vhodného pro transformaci rostlin

Plazmid pRTL-2GUS odvozený z plazmidu pUC-19 poskytl laskavě Dr. Jim Carrington (Texas A&M University, nebyl dosud publikován). Tento plazmid, jehož struktura je schematicky znázorněna na obr. 1, obsahuje dvojitý 35S CaMV promotor izolovaný z viru mozaiky květáku (promotor CaMV 2 x 35S, Oděli et al, 1985), který řídí expresi RNA obsahující netranslatovanou sekvenci 5'-konce viru skvrnitosti tabáku (TEV 5' UTR, Carrington a Freed, 1990), gen pro β-glukuronidázu z E. coli (GUS, Jefferson et al., 1987), po kterých následuje místo polyadenylace RNA z 35S CaMV (CaMV polyA, Oděli et al., 1985).

Plazmid pRTL2-2GUS byl štěpen restrikčními enzymy Ncol a BamHI a takto vzniklý velký fragment byl purifikován. Plazmid pRPA-PS-PRla-than byl štěpen také restrikčními enzymy Ncol a BamHI a vzniklý malý fragment DNA obsahující úsek kódující fúzní protein PRla-thanatin byl pak purifikován. Oba purifikované fragmenty DNA byly spojeny do expresní kazety pro transformaci rostlin, které pak syntetizují fúzní protein PRla-thanatin. Struktura této expresní kazety je schematicky znázorněna na obr. 2. PRla-thanatin představuje úsek kódující fúzní protein PRla-thanatin z pRPA-RD-230. Thanatin je tedy přenášen do mezibuněčných prostorů v rostlině v důsledku působení signálního peptidu PRla.

pRPA-RD-195: Příprava plazmidu obsahujícího modifikované vícečetné klonovací místo

Plazmid pRPA-RD-195 je plazmid odvozený z plazmidu pUC-19, který obsahuje modifikované vícečetné klonovací místo. Komplementární syntetické oligonukleotidy Oligo 5 a Oligo 6 uvedené dále byly hybridizovány a vytvořily φ

φ φ

• φφφφ φ « φφ • φ · φφφ φ φ · φ «φφ φφφ φφ φφ φ· dvouvláknovou molekulu stejně jak bylo popsáno pro přípravu pRPA-MD-P.

Oligo 5:

Oligo 6:

5' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3'

5' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAÁGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3'

Získaný dvouvláknový oligonukleotid byl vložen do pUC-19, který byl předtím naštěpen restrikčními enzymy EcoRI a HindlII a pak byl užit k doplnění Klenowův fragment DNA polymerázy 1 z E. coli. Získaný vektor obsahoval vícečetné klonovací místo umožňující vložení expresní kazety z plazmidového vektoru z Agrobacterium tumefaciens. Struktura vícečetného klonovacího místa je schematicky znázorněna na obr. 3.

pRPA-RD-232: Vložení expresní kazety pro PRla-thanatin z pRPA-RD-229 do pRPA-RD-195

Plazmid pRPA-RD-230 byl naštěpen restrikčním enzymem HindlII a fragment DNA obsahující expresní kazetu pro PRlathanatin byl purifikován. Purifikovaný fragment byl vložen do plazmidů pRPA-RD-195, který byl předtím naštěpen restrikčním enzymem HindlII a defosforylován telecí intestinální fosfatázou.

pRPA-RD-174: Plazmid odvozený z pRPA-BL-150A (EP 0 508 909) obsahující gen tolerance k bromoxynilu z pRPA-BL-237 (EP 0 508 909)

Gen tolerance k bromoxynilu byl izolován z pRPA-BL-237 pomocí genové amplifikace polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) . Získaný fragment s tupými konci byl klonován do

9··· • 9 ·9 ·· *9 · 9 · · 9 9 > 9

9 99*99 999«

999 9« 99* 9 9 9 * 99 9999 9 999

999 99 99 99 9 · *9

EcoRI místa plazmidu pRPA-RD-150A, které bylo zarovnáno působení Klenowova fragmentu polymerázy za standardních podmínek. Byl tak získán vektor pro Agrobacterium tumefaciens, který obsahuje gen tolerance k bromoxynilu v blízkosti své pravé hranice a gen tolerance ke kanamycinu v blízkosti levé hranice a vícečetné klonovací místo ležící mezi těmito geny. j

Schéma struktury pRPA-RD-174 je uvedeno na obr. 4. Na tomto obrázku nos označuje polyadenylační signál z genu pro nopalinsyntázu z Agrobacterium tumefaciens . (Bevan et al., 1983). NOS pro označuje promotor z genu pro nopalinsyntázu z Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al. , 1983) , NPTII představuje gen pro neomycinfosfotransferázu z transpozonu Tn5 z E. coli (Rothstein et al., 1981), 35S pro označuje promotor 35S izolovaný z viru mozaiky květáku (Oděli et al., 1985), BRX představuje gen pro nitrilázu izolovaný z K. ozaenae (Stalker et al. , 1988) a RB a LB označují pravou a levou hranici sekvence Ti plazmidu z Agrobacterium tumefaciens.

pRPA-RD-184: Přidání nového jedinečného restrikčního místa do pRPA-RD-174

Komplementární syntetické oligonukleotidy Oligo 7 a Oligo 8, uvedené dále, byly hybridizovány a vytvořily dvouvláknovou molekulu stejně jak bylo popsáno pro plazmid pRPA-MD-P.

Oligo 7: 5 ' CCGGCCAGTC AGGCCAGACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC

CCCGGCGCGC CTAGG7GTG7 GCTCGAGGGC CCAACC7CAG TACCTGGTTC AGG 3'

Oligo 8 : 5 ' CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA

CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG 3'

• ··«·	• ft	ftft	ftft	• ft
ftft ft	ft »	•	ft 9	• «
• ft	• »	• ftft	• ·	ft ·
ftftft ftft	ftft	ftft	• ·	wft

Dvouvláknový oligonukleotidový hybrid (95 párů baží) byl purifikován po separaci na agarózovém gelu (3% NuSieve agaróza, FMC) . Plazmid pRPA-RD-174 byl štěpen restrikčním enzymem Xmal a vzniklý velký fragment DNA byl purifikován. Oba izolované fragmenty pak byly spojeny.

Získaný plazmid odvozený z plazmidu pRPA-RD-174 obsahoval další restrikční místo mezi genem tolerance k bromoxynilu a selekčním markérem kanamycinové rezistence.

Schematické znázornění struktury plazmidu pRPA-RD-184 je uvedeno na obr. 5, kde označení nos, NPTII, NOSpro, 35Spro, gen BRX, RB a LB mají stejný význam jaký byl vysvětlen u obr. 4.

pRPA-RD-235: Příprava vektoru pro Agrobacterium tumefaciens obsahujícího genový konstrukt kódující thanatin směrovaný do mezibuněčného prostoru

Plazmid pRPA-RD-232 byl štěpen restrikčními enzymy Pmel a AscI a fragment DNa obsahující gen PR-la-thanatin byl purifikován. Plazmid pRPA-RD-184 byl naštěpen stejnými restrikčními enzymy. Fragment DNA obsahující expresní kazetu PR-la-thanatin byl vložen do plazmidu pRPA-RD-184. Byl tím získán vektor pro Agrobacterium tumefaciens, který obsahuje sekvenci kódující fúzní protein PR-la-thanatin, který umožňuje expresi thanatinu v extracelulárním prostoru rostliny.

• ···· ·« «» ·· ·· ·· « · · · ··»· • · · · ··· · · · « • · · · ·· ··· « · * • · » · · · · ···· ··« »· ·· ►· ·· *·

Příklad 2

Tolerance transformovaných rostlin tabáku k herbicidům

2.1. Transformace

Vektor pRPA-RD-235 byl vnesen do buněk kmenu Agrobacterium tumefaciens EHA101 (Hood et al., 1987) nesoucích kosmid pTVK291 (Komáři et al., 1986). Technika transformace byla založena na postupu, který popsali Horsch et al. (1985) .

2.2. Regenerace

Regenerace tabáku PBD6 (pocházejícího ze SEITA, Francie) z listových explantátů probíhala na základním médiu dle Murashige a Skoog (MS médium) obsahujícím 30 g/l sacharózy a 200 pig/ml kanamycinu. Listové explantáty byly odebrány z rostlin pěstovaných ve skleníku nebo in vitro a byly transformovány metodou listových disků (Horsch et al., 1985) ve třech postupných etapách: první etapa spočívala v indukci výhonků na médiu s přídavkem 30 g/l sacharózy obsahujícím ještě 0,05 mg/1 naftyloctové kyseliny (ANA) a 2 mg/1 benzylaminopurinu (BAP) po dobu 15 hodin. Výhonky vytvořené v této etapě byly pak ponechány 10 hodin na MS médiu s přídavkem 30 g/l sacharózy, ale bez hormonů. Pak byly výhonky odebrány a přemístěny na médium MS s poloviční koncentrací solí, vitamínů a sacharózy, ale neobsahující hormony. Přibližně po 15 dnech byly zakořeňující výhonky přeneseny do půdy.

2.3. Tolerance k bromoxynilu rostlin transformovaných konstruktem pRPA-RD-235 a regenerovaných bylo umístěno do skleníku. Rostliny byly ve skleníku do stadia 5 listů ošetřovány vodnou suspenzí prostředku Pardner v množství odpovídajícím dávce účinné látky bromoxynilu 0,2 kg/ha.

Všechny rostliny jevící úplnou toleranci k bromoxynilu byly pak použity v pokusu, ve kterém byl testován vliv exprese thanatinu na toleranci , transformovaných rostlin k napadení houbami.

Citovaná literatura:

Ausubel. F. A. & coll. (eds. Greene). Curent Protocols in Molecular Biology. Publ. Wiley & Sons.

Bevan. M. & coll. (1983). Nuc. Acids Res. 11:369-385.

Carrington and Freed (1990). J. Virol. 64:1590-1597.

Ehret-Sabatier & coll. (1996) The Journal of Biological Chemistry, 271. 47. 29537-29544. Horsch & coll. (1985). Science 227:1229-1231.

Jefferson & coll. (1987). EMBO J. 6:3901-3907.

Komáři & coll. (1986). J. Bacteriol. 166:88-94.

Rothstein &. coll. (1981). Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 45: 99-105.

Stalker & coll. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314.

Oděli. J.T. & coll. (1985). Nátuře 313:810-812.

···· · · ·· · · · · • · · 4 · · · • · 4 · · · 4 44

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA; 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1...33 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 1:

ATC ATC TAC TGC AAC AGG AGG ACT GGT AAG TGC Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly Lys Cys (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 63 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..63 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 2:

GGT TCC AAG AAG CCA GTG CCA ATC ATC TAC TGC AAC AGG AGG ACT GGT 48

Gly Ser Lys Lys Pro Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly

5 10 15

AAG TGC CAG AGG ATG Lys Cys Gin Arg Met • · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 98 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..98 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 3:

GGT TCC AAG AAG CCA GTG CCA ATC ATC TAC TGC AAC AGG AGG ACT GGT 48

Glv Ser Lys Lys Pro Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly

10 ¹⁵

AAG TGC CAG AGG ATG TGAGCTCGGC GAGGCGAACG TGTCGACGGA TCCGG 98

Lys Cys Gin Arg Met (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 106párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 12..101 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 4:

GCGTCGACGC C ATG GGT TTC GTG CTT TTC TCT CAG CTT CCA TCT TTC CTT 50

Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gin Leu Pro Ser Phe Leu

1-5 10

CTT GTG TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC TCT TGC CGT 98

Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg

20 25

GCC GGCGA Ala

106 • ···· · · ·· ·· · · • · · ··» ···· • · · · to · to to to · · • · · · · · · · · ·· · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 197 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 12..164 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 5:

GCGTCGACGC C ATG GGT TTC GTG CTT TTC TCT CAG CTT CCA TCT TTC CTT SO

Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gin Leu Pro Ser Phe Leu

5 10

CTT Leu

GTG TCT ACT

CTT CTT Leu Leu

CTT TTC

CTT GTG ATC TCT CAC TCT

TGC CGT

98

Val 15

Ser Thr

Leu 20

Phe

Leu Val

Ile

Ser 25

His

Ser

Cys

Arg

GCC

GGT

TCC

AAG

AAG

CCA

GTG

CCA

ATC

ATC

TAC

TGC

AAC

AGG

AGG

ACT

146

Ala

Gly

Ser

Lys

Lys

Pro

Val

Pro

Xle

Ile

Tyr

Cys

Asn

Arg

Arg

Thr

30

35

40

45

GGT AAG TGC CAG AGG ATG TGAGCTCGGC GAGGCGAACG TGTCGACGGA TCC 197

Gly Lys Cys Gin Arg Met (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 75 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 6:

GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA

CTCTTCTTCT TTTCC • 00 00 0 0 00 0 0 0 0 0 0 00 • 0 0 00 0 0 0 0

000 00 000 00 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 72 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 7:

TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA GAAGAGTAGA CACAAGAAGG 6 0

AAAGATGGAA GC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 8:

GGTTCCAAGA AGCCAGTGCC AATCATCTAC TGCAACAGGA CG 42 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 97 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 9:

CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCACATCC TCTGGCACTT ACCAGTCCTC 60

CTGTTGCAGT AGATGATTGG CACTGGC • «4·· 44 44 44 44

4 4 44 4444 ·· 444 4 44 ·

444 44 4 · 4 44 4 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 85 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 5 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 10:

AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC 60

CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 85 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 66 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 11:

CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC 60

TAGAGG ⁶⁶ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 93 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 7 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 12:

CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT

GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 93 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 8 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 13 :

CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC 60

GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG

• 4 4 4

4* ·· ·· 44

4 4 44·· • 44·· · · · · • 44 4·· 44 4 • 44 4 4 44 ·

44 44 44

Τ>(/ϊΰτι -téís

Claims (27)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Fragment nukleové kyseliny, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující thanatin.
2. 2. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 1, kde se jedná o nukleotidovou sekvenci DNA.
3. 3. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 2, kde nukleotidová sekvence DNA obsahuje sekvenci id. č. 1 nebo sekvenci s ní homologní nebo sekvenci k ní komplementární.
4. 4. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 3, kde nukleotidová sekvence DNA obsahuje sekvenci id. č. 2 nebo sekvenci s ní homologní nebo sekvenci k ní komplementární.
5. 5. Fragment nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny fúzovanou na 5'- a/nebo 3'-konci k sekvenci kódující thanatin, takže je získán fúzní protein „protein-thanatin.

   6. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 5, kde fúzovaný protein j e buď signální peptid nebo tranzitní peptid. 7 . Fragment nukleové kyseliny podle nároku 6, kde signální peptid je signální peptid genu PR-la z tabáku. 8 . Fragment nukleové kyseliny podle nároku 7, kde nukleotidová sekvence DNA obsahuje , sekvenci id. č. 5 nebo

   sekvenci s ní homologní nebo sekvenci k ní komplementární.

   4444
6. 9. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 8, který obsahuje část nukleotidová sekvence DNA id. č. 5, odpovídající bažím v pozici 12 až 164.

   94 44 44 44

   9 9 9 4 9 4 4 4 4 4

   4 9 4 4 449 4 4 4 9

   4 4 9 9 4 4 9 9 4 9 9

   444 44 49 99 94 44
7. 10. Fúzní protein „protein-thanatin, kde protein je signální peptid nebo tranzitní peptid.

   fúzovaný
8. 11. Fúzní protein podle nároku 10, kde signální peptid je signální peptid genu PR-Ία z tabáku.
9. 12. Fúzní protein podle nároku 11, který je popsán sekvencí id. č. 5.
10. 13. Chimérický gen, který obsahuje kódující sekvenci a heterologní regulační prvky v polohách 5' a 3”, které jsou schopné funkce v hostitelském organismu, zejména v rostlinné buňce nebo v rostlině, přičemž kódující sekvence obsahuje alespoň jeden fragment DNA kódující thanatin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9.
11. 14. Chimérický gen podle nároku 13, kde hostitelský organismem jsou rostlinné buňky nebo rostliny.
12. 15. Chimérický gen podle nároku 13 nebo 14, který obsahuje taktéž selekční markér.
13. 16. Klonovací nebo expresní vektor pro transformaci hostitelského organismu, který obsahuje přinejmenším jeden replikační počátek a přinejmenším jeden chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 13 až 15.

    • · · · · ftft · • ftft ft ft · ft • ft ftft • ftft » • · • • ftftft • ftft « • ft · · · • · • · • ft ftft
14. 17. Vektor podle nároku 16, kterým je virus pro transformaci vyvíjejících se rostlin, a který dále obsahuje své vlastní prvky pro replikaci a expresi.
15. 18. Vektor podle nároku 16, kterým je plazmid.
16. 19. Transformovaný hostitelský organismus, který obsahuje účinné množství chimérického genu podle kteréhokoliv z nároků 13 až 15.
17. 20. Transformovaný hostitelský organismus podle nároku

    19, kterým je rostlinná buňka nebo rostlina.
18. 21. Transformovaný hostitelský organismus podle nároku

    20, kterým jsou rostliny obsahující transformované buňky.
19. 22. Hostitelský organismus podle nároku 21, kterým je rostlina regenerovaná z transformované rostlinné buňky.
20. 23. Transformovaná rostlinná buňka, která obsahuje fragment nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 nebo chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 13 až 15.
21. 24. Transformovaná rostlina odolná proti chorobám, která obsahuje alespoň jednu transformovanou buňku podle nároku 23.
22. 25. Transformovaná rostlina podle nároku 24, která je odolná proti houbovým chorobám, které způsobují houby rodu Cercospora, zejména Cercospora beticola, rodu Cladosporium, zejména Cladosporium herbarum, rodu Fusarium, zejména Fusarium culmorum nebo Fusarium graminearum, a Phytophthora, zejména Phytophthora cinnamoni.

    • ·

    49 · · • · · • · ···
23. 26. Transformovaná rostlina odolná proti chorobám, která byla získána pěstováním a/nebo křížením rostlin podle nároku 24 nebo 25.
24. 27. Semena transformovaných rostlin podle kteréhokoliv z nároků 24 až 26.
25. 28. Způsob transformace hostitelského organismu, zejména rostlinné buňky nebo rostliny, vyznačující se tím, že se do hostitelského organismu vnese alespoň jeden fragment nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 nebo jeden chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 13 až 15.
26. 29. Způsob transformace rostlin, který učiní rostliny odolnými proti houbovým nebo bakteriálním chorobám, vyznačující se tím, že se do rostliny vloží alespoň jeden fragment nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 nebo jeden chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 13 až 15.
27. 30. Způsob podle nároku 28 nebo 29, kde chimérický gen je vložen pomocí vektoru podle kteréhokoliv z nároků 16 až 18 .

    • 4494 • * 9· 44 49 • 4 4 4 · • 4 4 4 9 • « • · ·«· • 4 • 9 4 9 < * >4 · 44 44 »4 49 94