CZ200067A3 - Chimérický gen kódující drosomicin, vektor obsahující tento gen a způsob přípravy transgenních rostlin rezistentních k chorobám - Google Patents

Abstract

Popisuje se chimérický gen, kletý obsahuje sekvenci DNA kódující drosomicin, vektor obsahující chimérický gen, a dále způsob transformace rostlin a takto připravených transformovaných rostlin. Drosomicin tvořený v transformovaných rostlinách poskytuje těmto rostlinám rezistenci k chorobám, zejména k chorobám způsobeným houbami.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká sekvence DNA kódující drosomicin, chimérického genu obsahujícího takovou sekvenci, vektoru obsahujícího chimérický gen, a dále se týká způsobu transformace rostlin a transformovaných rostlin rezistentních k chorobám.

Dosavadní stav techniky

V současné době je pociťována velká potřeba získat rostliny, které by byly rezistentní proti chorobám, zejména houbovým chorobám,. aby se zmenšilo, případně úplně odstranilo, používání ochranných fungicidních prostředků z důvodu ochrany životního prostředí. Způsob, jak zvýšit rezistenci proti chorobám, spočívá v transformaci rostlin tak, aby tvořily látku, která je schopna zajistit jejich obranu proti těmto chorobám.

Jsou známy různé látky přírodního původu, zejména peptidy, které mají baktericidní nebo fungicidní vlastnosti, a zvláště působí proti houbám způsobujícím choroby rostlin. Tudíž problém spočívá v tom, najít mezi těmito látkami takovou, která nejenže se bude tvořit v transformovaných rostlinách, ale navíc si Uchová své baktericidní nebo fungicidní vlastnosti, které tak získají uvedené rostliny. Ve smyslu předkládaného vynálezu se baktericidními nebo ·· ···· byl již popsán č. 2 725 992, kde fungicidními vlastnostmi rozumí jak baktericidní a fungicidní vlastnosti v pravém smyslu slova tak i vlastnosti bakteriostatické a fungistatické.

Drosomiciny jsou peptidy, které tvoří larvy nebo dospělí jedinci octomilky (Drosophila) jako následek septického poranění nebo injekce malé dávky bakterií. Jeden peptid, vykazující jisté účinky proti bakteriím a houbám in vitro, ve francouzské patentové přihlášce byl získán po indukci z octomilky a purifikován. Gen kódující tentýž peptid byl také popsán v publikaci Fehlbaum et al. (1994). Avšak možnost vložit tento gen do rostliny tak, aby rostlina získala rezistenci proti chorobám houbového nebo bakteriálního původu, nebyla dosud popsána.

Byly nově nalezeny geny pro drosomiciny, které jsou schopny vložení do rostlin, čímž rostliny získají rezistenci k chorobám bakteriálního a houbového původu. Vynález tak poskytuje výhodné řešení-výše zmíněných problémů.

Podstata vynálezu

Prvním předmětem vynálezu je chimérický gen, který obsahuje fragment nukleové kyseliny, která kóduje drosomicin jakož i heterologní regulační prvky v pozicích 5'a 3' schopné funkce v rostlinách, a dalším předmětem vynálezu je vektor pro transformaci rostlin obsahující tento chimérický gen. Dále je předmětem vynálezu transformovaná rostlinná buňka, která obsahuje alespoň jeden fragment nukleové kyseliny kódující drosomicin a také rostlina rezistentní proti chorobám obsahující tuto buňku. Dále se vynález týká způsobu transformace rostlin, aby získaly rezistenci proti chorobám,

9 • · *

9 9

9 9 9

9

9 9

9 9 ·

který spočívá v tom, že se do rostliny vloží gen kódující drosomicin.

Drosomicin podle předkládaného vynálezu označuje peptid získaný z larev nebo dospělců drosofily vyvolaný následkem septického poranění nebo injekcí malé dávky bakterií, přičemž tento peptid obsahuje alespoň 44 aminokyselin a 8 cysteinových zbytků tvořících disulřidické můstky.

Ve výhodném provedení obsahuje drosomicin v podstatě peptidovou sekvenci podle následujícího vzorce (I):

Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag-Cys-XahCys (I), kde

Xaa. představuje peptidový zbytek obsahující nejméně jednu aminokyselinu,

Xab představuje peptidový zbytek obsahující 8 aminokyselin,

Xac představuje peptidový zbytek obsahující 7 aminokyselin,

Xad představuje peptidový zbytek' obsahující 3 aminokyseliny,

Xae představuje peptidový zbytek obsahující 9 aminokyselin,

Xaf představuje peptidový zbytek obsahující 5 aminokyselin,

Xag představuje peptidový zbytek obsahující jednu aminokyselinu a

Xah představuje peptidový zbytek obsahující 2 aminokyseliny.

Ve výhodném provedení zbytky Xab a/nebo Xad a/nebo Xac obsahují alespoň jednu bazickou aminokyselinu. Výhodněji Xab obsahuje alespoň 2 bazické aminokyseliny, výhodněji právě dvě, a/nebo Xad a/nebo Xaf obsahují alespoň 1 bazickou aminokyselinu, výhodněji právě 1. K bazickým aminokyselinám ve smyslu předkládaného vynálezu patří aminokyseliny vybrané ze skupiny obsahující lysin, arginin a homoarginin.

• · « · ; ♦ . ·· · ···· ·· · 9· ··· ·· ·-* .

Ve výhodném provedení

Xaa představuje peptidovou sekvenci Xaa'-Asp-, kde Xaa' je skupina NH₂ nebo peptidový zbytek obsahující nejméně · 1 aminokyselinu a/nebo

Xab představuje peptidovou sekvenci -Leu-Xab'-Pro-, kde

Xab'je peptidový zbytek ze 6 aminokyselin a/nebo

Xac představuje peptidovou sekvenci -Ala-Xac'-Thr-, kde

Xac'je peptidový zbytek z 5 aminokyselin a/nebo

Xad představuje peptidovou sekvenci -Arg-Xad'-Val, kde Xaďje peptidový zbytek obsahující jednu aminokyselinu a/nebo

Xae představuje peptidovou sekvenci -Lys-Xae'-His-, kde

Xae'je peptidový zbytek ze 7 aminokyselin a/nebo

Xaf představuje peptidovou sekvenci -Ser-Xaf'-Lys-, kde

Xaďje peptidový zbytek ze 3 aminokyselin a/nebo

Xag představuje Trp a/nebo

Xah představuje peptidový zbytek Glu-Gly.

V ještě výhodnějším provedení

Xab' představuje peptidovou sekvenci Ser-Gly-Arg-Tyr-Lys-Gly a/nebo

Xac' představuje peptidovou sekvenci Val-Trp-Asp-.Asn-Glu a/nebo

Xad' představuje Arg a/nebo

Xae' představuje peptidovou sekvenci Glu-Glu-Gly-Arg-Ser-SerGly a/nebo

Xaf' představuje peptidovou sekvenci Pro-Ser-Leu.

Podle ještě výhodnějšího provedení vynálezu . má arosomicin peptidovou sekvenci představovanou sekvencí uvedenou zde. jako sekvence identifikačního čísla 4 (id. č. 4) nebo homologními peptidovými sekvencemi.

Termínem homologní peptidová sekvence se podle předkládaného vynálezu rozumí taková sekvence, která je z 65 % homologní se sekvencí id. č. 4, přičemž 8 cysteinových zbytků a počet aminokyselin, které je oddělují, zůstává identický, a některé aminokyseliny jsou nahrazeny odlišnými, ale ekvivalentními aminokyselinami v místech, která nezpůsobují podstatné změny v protihoubové nebo antibakteriální aktivitě dané homologické sekvence. Výhodně homologní sekvence obsahuje nejméně 75% homologii, výhodněji 85% a nejvýhodněji je homologní z 90 %.

Zbytek na NH₂-konci může být posttranslačně modifikován, např. acetylován, a stejně tak může být posttranslačně modifikován zbytek C-konce, např. amidován.

Peptidovou sekvencí obsahující v podstatě peptidovou sekvenci podle vzorce (I) se rozumí nejen sekvence zde definované, ale sekvence obsahující na jednom nebo na druhém konci, nebo na obou, peptidové zbytky, zejména takové zbytky, které jsou nutné pro její. expresi a zacílení v rostlinných... buňkách nebo v rostlinách.

Zejména se jedná o úplný drosomicin (full length), uvedený zde jako sekvence id. č. 2.

A zvláště se jedná o fúzní peptid peptid-drosomicin nebo drosomicin-peptid, výhodně peptid-drosomicin, ze kterého vystřižení enzymatickým systémem rostlinné buňky umožní uvolnění drosomicinu, jak zde byl definován. Fúzní peptid s drosomicinem může obsahovat signální peptid nebo tranzitní peptid, které umožňují směrovat vytvářený drosomicin specifickým způsobem do určité části rostlinné buňky nebo rostliny, např. do cytoplazmy, buněčné membrány, a nebo v případě rostlin do určitého buněčného kompartmentu nebo tkání nebo do apoplastu, extracelulárního prostoru.'

V jednom provedení vynálezu může tranzitní peptid obsahovat signál pro chloroplastovou nebo mitochondriální • · · *

lokalizaci, čímž je zajištěno rozštěpení v chloroplastu nebo mitochodnrii.

Podle dalšího povedení vynálezu může signální peptid obsahovat N-koncový signál neboli pre-peptid; případně spojený se signálem zodpovědným za udržení proteinu v endoplazmatickém retikulu, nebo peptid pro zaměření do vakuoly neboli pro-peptid. Endoplazmatické retikulum je místo, které je v rámci buněčné mašinérie zodpovědné za procesy jako je maturace (zrání) proteinových produktů, např. odštěpení signálního peptidu.

Tranzitní peptid je buďto jeden nebo mohou být dva, a v takovém případě jsou odděleny intermediátní sekvenci, takže, ve směru transkripce, jedna sekvence kóduje tranzitní peptid rostlinného genu kódujícího enzym s plastidovou lokalizací, pak část sekvence části maturovaného N-konce rostlinného genu kódujícího enzym s plastidovou lokalizací, a pak sekvenci kódující druhý tranzitní peptid z rostlinného genu kódujícího enzym s plastidovou lokalizací, jak bylo již popsáno v EP 0 508 909.

Jako vhodný tranzitní peptid pro fúzi s drosomicinem podle vynálezu může být uveden zvláště signální peptid genu PR-Ια tabáku (WO 95/19443) nebo ubichitin, jehož sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č. 6.

Fúzní peptid ubichitin-drosomicin a sekvence kódující tento fúzní peptid, uvedená jako sekvence id. č. 5, jsou také předmětem předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález se tedy týká chimérického genu, který obsahuje sekvenci kódující drosomicin s heterologními regulačními prvky na jeho 5'a 3'konci zajišťujícími funkci v rostlinách, přičemž kódující sekvence obsahuje přinejmenším jednu sekvenci DNA kódující drosomicin, jak je zde definován.

·· ···· • · · • ♦ · • ·

Sekvence DNA může být získána standardními metodami izolace a purifikace z octomilky, kromě toho může být syntetizována metodami užívajícími postupné hybridizace syntetických oligonukleotidů. Tyto postupy jsou známy a jsou popsány v publikaci Ausubel et al.

V jednom provedení vynálezu sekvence DNA kódující drosomicin obsahuje sekvenci DNA obsahující nukleotidy 21 až 152 ze sekvence uvedené zde jako sekvence id. č. 3, homologickou sekvenci nebo komplementární sekvenci k této sekvenci.

Podle dalšího provedení vynálezu sekvence DNA kódující úplný (full length) drosomicin obsahuje sekvenci DNA obsahující nukleotidy 101 až 310 ze sekvence id. č. 1, homologní sekvenci nebo komplementární sekvenci k této sekvenci.

Podle ještě dalšího provedení vynálezu sekvence'. DNA kódující fúzní peptid peptid-heliomicin obsahuje sekvenci baží 15 až 221 ze sekvence id. č. 5, homologní sekvenci nebo komplementární sekvenci k této sekvenci.

Termínem homologní sekvence se rozumí podle předkládaného vynálezu sekvence DNA, ve které je jedna nebo několik modifikací vzhledem k sekvencím id. č. 1, 3 a 5, kódujícím drosomicin, úplný (full length) drosomicin nebo fúzní peptid peptid-drosomicin. Takové získat obvyklými mutačním metodami, a syntetickým oligonukleotidů použitých sekvence hybridizací. Vzhledem k mnoha kombinacím nukleové kyseliny, které kódují expresi téže aminokyseliny, rozdíly v sekvencích id. č. 1, 3 nebo 5 a odpovídajících homologních sekvencích nejsou tak důležité, a tím spíše to platí pro fragmenty DNA získané chemickou syntézou. Výhodně je míra homologie s uvedenými sekvencemi (id. č. 1, 3a 5) nejméně modifikace lze kromě toho výběrem k přípravě uvedené

0 %, výhodněji nejméně 8 0 % a nej výhodně ji alespoň 90 %.

Obecně však jsou modifikace neutrální, tudíž neovlivňují primární sekvenci drosomicinu nebo výsledného fúzního peptidů.

Rostlinná, buňka znamená ve smyslu vynálezu buňku tvořící rostlinou tkáň, ať už tvoří nediferencovanou tkáň jako je kalus nebo tvoří diferencované tkáně jako embryo, části rostliny, rostlinu nebo semena.

Rostlina ve smyslu předkládaného vynálezu znamená celý mnohobuněčný diferencovaný organismus,' schopný fotosyntézy, přičemž je to rostlina jednoděložná nebo a zvláště se pak jedná o rostliny kulturní, člověka nebo zvířat, kam patří např. kukuřice, pšenice, řepka, sója, rýže, cukrová .třtina, řepa, tabák, bavlna a další.

dvcuděložná, pro výživu

Regulační prvky, funkční v rostlinách, nezbytné pro expresi sekvence DNA kódující drosomicin, jsou odborníkovi známy. K těmto prvkům patří zejména promotorové sekvence, aktivátory transkripce, terminační sekvence, včetně start a stop kodonů. Prostředky a metody pro identifikaci a výběr regulačních prvků jsou také odborníkovi známy. Jako promotorovou sekvenci v rostlině je možné užít jakýkoliv promotor rostlinného genu, který je přirozeně exprimován v rostlině, a. zejména promotor bakteriálního, virového nebo rostlinného původu, jako je např. gen pro malou podjednotku ribulózobisfosfátkarboxylázy/oxygenázy (RuBisCO), nebo gen rostlinného viru jako je např. virus mozaiky květáku (CAMV, 19S nebo 35 S), nebo promotor indukovatelný patogenem jako je např. PR-Ια z tabáku, který je také možné výhodně použít. Výhodné je užití regulační promotorové sekvence, která vede ke konstitutivní expresi kódované sekvence nebo k expresi indukované po napadení patogenem, jako je např. histonový promotor popsaný v patentové přihlášce EP 0 50%7 698.

Podle vynálezu je také možné užít ve spojení s promotorovou sekvencí další regulační sekvence, které jsou situovány mezi promotorem a kódující sekvencí, jako jsou např. aktivátory transkripce (enhacery, zesilovače), např. aktivátor transkripce, enhnacer,· viru mozaiky tabáku (TMV) popsaný v patentové přihlášce’ WO 87/07644 nebo enhancer z viru skvrnitosti tabáku (TEV), který popsali Carrington a Freed.

Jako sekvence řídící terminaci nebo polyadenylaci je možné užít odpovídající sekvence bakteriálního původu, jako např. terminátor nos z Agrobacterium tumefaciens_r nebo rostlinného původu, jako např. histonový terminátor, jaký byl popsán v patentové přihlášce EP 0 633 317.

Předkládaný vynález se také týká integračního vektoru pro transformaci rostlin, který obsahuje alespoň jeden chimérický gen podle vynálezu.

Dalším předmětem vynálezu je způsob transformace rostlinných buněk tím, že. .se. integruje alespoň jeden chimérický gen podle vynálezu, přičemž transformace lze dosáhnout vhodnými prostředky odborníkovi známými, které jsou popsány v odborné literatuře, zejména v publikacích uvedených na konci této přihlášky.

\ Jednou z těchto metod je bombardování buněk nebo protoplastů částicemi, na které je·navázaná sekvence DNA.

další metoda spočívá v tom, že se jako prostředek k přenosu do rostliny využije Ti plazmid z Agrobacterium tumefaciens nebo Ri plazmid z Agrobacterium rhizogenes, do kterého se integruje chimérický gen.

Dalšími metodami, které lze užít, je mikroinjekce nebo elektroporace.

·· ····

Odborník zvolí vhodnou metodu přenosu genu do rostliny v závislosti na povaze rostliny, zejména podle toho, zda se jedná o jednoděložnou nebo dvouděložnou rostlinu.

Postupy transformace ,rostlinných buněk a regenerace rostlin . byly popsány, lze např. uvést patentové spisy

US 4 459 335, US 4 536 475, US 5 464 763, US 5 177 010,

US 5 187 073, EP 267 159, EP 604 662, EP 672 752, US 4 945 050, US 5 036 006, US 5 100 792, US 5 371 014,

US 5 478 744, US 5 179 022, US 5 565 346, US 5 484 956,

US 5 538 877, US 5 554 798, US 5 489 520, US 5 510 318,

US 5 204 253, US 5 405 765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 a WO95/06128.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou rostlinné buňky, jednoděložných nebo dvouděložných rostlin, zejména kulturních, které jsou transformované a obsahují ve svém genomu účinné množství genu, obsahujícího sekvenci kódující drosomicin, jak je definován v této přihlášce.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou rostliny, které obsahují transformované buňky, zvláště rostliny regenerované z transformovaných buněk. Regeneraci lze provést jakýmkoliv vhodným způsobem odborníkovi známým v závislosti na druhu rostliny, např. způsobem popsaným v příkladech v této přihlášce.

Dále jsou předmětem vynálezu také transformované rostliny získané kultivací a/nebo křížením regenerovaných rostlin podle vynálezu, a taktéž semena transformovaných rostlin.

Transformované rostliny podle předkládaného vynálezu jsou rezistentní k některým chorobám, zvláště k některým houbovým chorobám. Rezistence proti těmto chorobám je způsobena tím, že, je do rostlin integrována sekvence DNA kódující drosomicin podle vynálezu. Drosomicin je účinný

·· ····

• · · • · ·

Fusarium vynálezu proti houbovým chorobám, které způsobují houby rodu Botrytis, zejména Botrytis cinerea (mycélium nebo spory), rodu Cercospora, zejména Cercospora beticola, rodu Septoria, zejména Septoria tritici, nebo rodu Fusarium,· zejména Fusarium culmorum (mycélium nebo spory) nebo graminearum.

Chimérický gen podle výhodného provedení obsahuje také alespoň jeden selekční markér a také jeden nebo několik genů tolerance k herbicidům.

Sekvence DNA kódující drosomicin může obsahovat další geny, jako je např. sekvence markéru pro selekci transformovaných rostlin, případně s dalšími sekvencemi kódujícími další požadované proteiny nebo peptidy, jako jsou např. geny tolerance k herbicidům.

Takové geny tolerance k herbicidům jsou odborníkovi známy a byly popsány např. v patentových přihláškách EP 115 673, WO. ' 87/04181, EP 337 899, WO 96/38567 nebo WO 97/04103.

Samozřejmě transformované buňky a rostliny podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat kromě sekvence kódující drosomicin další heterologní sekvence kódující požadované proteiny jako např. peptidy, které poskytují rostlinám rezistenci k dalším nemocem bakteriálního nebo houbového původu a/nebo další sekvence kódující proteiny zajišťující toleranci k herbicidům a/nebo další sekvence kódující proteiny zajišťující toleranci k hmyzím škůdcům, jako např. protein Bt.

Další sekvence, které se mohou integrovat prostřednictvím vektoru, jsou takové sekvence, které obsahují první sekvenci kódující drosomicin a alespoň jednu další sekvenci kódující další požadovaný peptid nebo protein.

Je také možné integrovat další vektor obsahující alespoň jednu další sekvenci, a to způsobem v oboru známým, jak bude dále popsáno.

Rostliny podle vynálezu je také možné získat křížením rodičovských rostlin, kdy jeden z rodičů nese gen podle vynálezu kódující drosomicin a druhý z rodičů nese geny kódující alespoň jeden další požadovaný peptid nebo protein.

Předkládaný vynález se nakonec také týká způsobu pěstování transformovaných rostlin podle vynálezu. Tento způsob spočívá v tom, že se semena těchto transformovaných rostlin vysejí na pole vhodné pro pěstování takových rostlin, na povrch pole se pak aplikuje agrochemický prostředek, aniž by podstatně ovlivnil tato transformovaná semena nebo rostliny, pak se pěstované rostliny sklidí jakmile dosáhnou zralosti a případně se oddělí semena ze sklizených rostlin.

Agrochemickým prostředkem se ve smyslu vynálezu rozumí agrochemický prostředek obsahující' účinné látky vykazující herbicidní, řungicidní, baktericidní, virucidní nebo insekticidní aktivitu.

Ve výhodném provedení způsobu pěstování podle vynálezu agrochemický prostředek obsahuje alespoň jednu účinnou látkou s řungicidní a/nebo baktericidní aktivitou, výhodněji s aktivitou doplňující aktivitu drosomicinu transformovaných rostlin podle vynálezu.

Produktem s aktivitou doplňující aktivitu drosomicinu se ve smyslu vynálezu míní produkt projevující řadu doplňujících aktivit, jako je např. produkt účinně působící proti napadení škůdci (houbami, bakteriemi, viry), kteří nejsou citliví k drosomicinu, plně nebo částečně, přičemž aplikační dávka tohoto produktu se podstatně sníží díky přítomnosti drosomicinu produkovaného transformovanými rostlinami.

·· ·♦·· fe

Příklady dále uvedené slouží k ilustraci vynálezu, ukazují přípravu chimérického genu, integračního vektoru transformovaných rostlin, a také demonstrují jejich rezistenci k různým houbovým chorobám. Připojené obráz.ky 1 až 7 schematicky znázorňují strukturu některých plazmidů připravených pro konstrukci chimérických genů. V obrázcích jsou kurzívou označena restrikční místa.'

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce chimérických genů

Všechny zde použité laboratorní postupy jsou standardní postupy odborníkovi známé. Podrobné popisy těchto postupů lze najít např. v publikaci Asubel et al.

pRPA-RD-180

Klonovaný cDNA inzert kódující drosomicin popsaný v publikaci Fehlbaum et al. (sekvence id. č. 1) byl vložen do plazmidů pCR-1000 (Invitrogen) jako fragment EcoRI-HindlII.

pRPA-RD-182: Příprava úseku kódujícího úplný drosomicin plné délky (odpovídající pre-pro peptidu) tím, že se odstranil netranskribovaný úsek na 5'-konci a první ATG kodon

Plazmid pRPA-RD-180 byl naštěpen restrikčními enzymy Seal a EcoRI a vzniklý velký fragment DNA byl purifikován. Syntetický dvojvláknový oligonukleotid Oligo 1 (sekvence je uvedena dále) byl připojen k sekvenci DNA získané z plazmidů pRPA-RD-180.

Oligo 1: 5'-	AATTCCCGAAGACGACATGCAGATCAAGT -3' GGGCTTCTGCTGTACGTCTAGTTCA
pRPA-RD-183:	Příprava sekvence kódující maturovaný (zralý)
drosomicin,	která . neobsahuje netránskribovaný úsek na
3'-konci

Dva syntetické oligonukleotidy s komplemetárními sekvencemi Oligo 2 a Oligo 3 (uvedenými dále) byly hybridizovány v 65 °C po 5 minut a pak pomalým snižováním teploty na 30 °C během 30 minut.

Oligo 2: 5 1	GAGAGATCCC CCGCGGTGGT GACTGCCTGT CCGGAAGATA » CAAGGGTCCC TGTGCCGTCT GGGACAACGA GACCTGTCGT CGTGTGTGCA AGGAGGAGGG 31
Oligo 3: 5 '	GCGCGCGGAT CCTTAGCATC CTTCGCACCA GCACTTCAGA

CTGGGGCTGC AGTGGCCACT GGAGCGT£CC TCCTCCTTGC ACACACGACG 3'

Po hybridizaci Oligo 2 s Oligo 3 sloužil jednovláknový

zbytek DNA	jako matrice pro Klenowův fragment DNA
polymerázy I	z E. coli (ve standardních podmínkách
doporučených	výrobcem, New England Biolabs) pro vytvoření

dvouvláknového - oligonukleotidu. Tento dvouvláknový oligonukleotid byl pak naštěpen restrikčními enzymy SacII a EcoRI a klonován do plazmidu pBS II SK(-) (Stratagene), který byl předtím naštěpen stejnými enzymy. Byl tak získán klon obsahující kódující úsek pro maturovaná drosomicin mezi restrikčními místy SacII a BamHI (sekvence id. č. 3).

99

9 9 9 • 9 9 9

9 9 9

9 9 ·

99 • 9 9*9 9

9 9

9 9

9 9

9 9

9

9·

9 9 • ' 9

9

9 • 9 9 pRPA-RD-186: Odstranění netranskribovaného úseku ze 3'-konce úseku kódujícího drosomicin plné délky v pRPA-RD-182

Plazmid pRPA-RD-182 byl štěpem restrikčními enzymy BspEI a KpnI a vzniklý velký fragment byl .purifikován. Plazmid pRPA-RD-183 byl pak naštěpen restrikčními enzymy BspEI a KpnI a vzniklý malý fragment DNA byl purifikován. Oba purifikované fragmenty byly spojeny a tím byl získán plazmid obsahující kóující úsek pre-propeptidu drosomicinu, v němž jsou první ATG kodon a oba nekódující úseky na 5'a 3'konci odstraněny (sekvence id. č. 5).

pRPA-RD-187: Příprava rostlinného expresního vektoru obsahujícího sekvenci kódující maturovanou formu drosomicinu

Plazmid pUGUS(118) odvozený z plazmidu pUC-19 poskytl laskavě Dr. Richard Vierstra, z Wisconsinské university (plazmid nebyl publikován). Tento plazmid, jehož struktura je, schematicky znázorněna na obr. 1, obsahuje 35S CAMV promotor, který řídí expresi RNA obsahující netranslatovanou sekvenci 5-konce viru mozaiky vojtěšky (AMV 5'UTR, viz Brederode' et al., 1980), N-koncový úsek genu pro ubichitin ubqll z Arabidopsis thaliana až po místo, kde štěpí ubichitinhydroláza (ubqll N-term, viz Callis et al., 1993), který je fúzován ve shodném čtecím rámci s genem pro β-glukuronidázu z E. coli (GUS, viz Jefferson et al., 1987), následované polyadenalačním místem z genu pro nopalinsyntázu z Agrobacterivm tvmefaciens (NOS polyA, viz Bevan et al, 1983).

Plazmid pUGUS(118) byl štěpen restrikčními enzymy SacII a BamHI a vzniklý velký fragment byl purifikován. Plazmid pRPA-RD-183 byl štěpen také restrikčními enzymy SacII a BamHI a vzniklý malý fragment DNA obsahující úsek kódující maturovanou formu drosomicinu byl pak purifikován. Oba ·» ·*·· • 49

9 9

9 9 9 · · • · · · · · • '· · · · • · · · · · • · · · · ·· · ·· · purifikované fragmenty DNA byly spojeny do rostlinné expresní kazety, která umožňuje syntézu fúzního proteinu ubichitindrosomicin v cytoplazmě rostlinné buňky. Schematická struktura této kazety je uvedena na obr. 2. Působením ubichitinhydrolázy na tento fúzní protein . se maturovaný drosomicin uvolní do cytoplazmy rostlinné buňky.

pRPA-RD-188: Příprava rostlinného expresního vektoru obsahujícího sekvenci plné délky kódující drosomicin (prepro)

Plazmid pRTL-2GUS odvozený z plazmidu pUC-19 poskytl laskavě Dr. Jim Carrington (Texasská A&M Univerzita, nebyl publikován). Tento plazmid, jehož struktura je schematicky znázorněna na obr. 3, obsahuje dvojitý 35S CaMV promotor izolovaný z viru mozaiky květáku (promotor CaMV 2 x3 5, Oděli et al, 1985), který řídí expresi RNA obsahující netranslatovanou sekvenci 5-konce viru skvrnitosti tabáku (TEV 5'UTR, vizCarrington a· .Freed, 1990), gen pro β-glukuronidázu z E. coli (GUS, viz Jefferson et al., 1987), následované místem polyadenylace RNA z 35S CaMV (CaMV polyA, Oděli et al., 1985) .

Plazmid pRTL2-2GUS byl štěpen restrikčními enzymy Ncol a BamHI a vzniklý velký fragment byl purifikován. Plazmid pRPA-RD-186 byl štěpen také restrikčními enzymy SacII a Ncol a vzniklý malý fragment DNA obsahující úsek kódující pre-pro formu drosomicinu byl pak purifikován. Oba purifikované fragmenty DNA byly spojeny do expresní kazety,která umožňuje syntetizovat pre-pro formu drosomicinu. Schematická struktura této expresní kazety je znázorněna na obr. 4. Pre-prodrosomicin představuje úsek kódující drosomicin z pRPA-RD186. Drosomicin je transportován do mezibuněčných prostorů • *

- 9 • o

v rostlině v důsledku přítomnosti signálního peptidu (prePro) .

pRPA-RD-195: Příprava plazmidu obsahujícího modifikované vícečetné klonovací místo

Plazmid pRPA-RD-195 je plazmid odvozený z plazmidu pUC-19, který obsahuje modifikované vícečetné klonovací místo. Komplementární syntetické oligonukleotidy (uvedené dále) byly hybridizovýány a vytvořily dvouvláknovou molekulu stejně jak bylo popsáno pro přípravu pRPA-RD-183.

Oíigo 4; 5'

Oíigo 5: 5 ’

AGGGCCCCCT

GAGCTCGGTA CATGC 3'

CCCTGAACCA

GCATGCCTGC

AGGGTTTAAA

CCCGGGGATC

GGCTCGAGGG

AGGTCGACTC

CGGCCAGTCA

CTCTAGAGTC

CGCGCCTTAA

TAGAGG 3¹

GGČCGAATTC

GACCTGCAGG

TTAAAAGCTT

Získaný dvouvláknový oligonukleotid byl vložen do pUC-19, který byl předtím naštěpen restrikčními enzymy EcoRI a HindlII a pak byl užit k doplnění Klenowův fragment DNA polymerázy I z E. coli. Získaný vektor obsahoval vícečetné klonovací místo umožňující vložení expresní kazety z plazmidového' vektoru z Agrobacterium tumefaciens. Struktura vícečteného klonovacího místa je schematicky znázorněna na obr. 5.

pRPA-RD-190: Vložení expresní kazety pro drosomicin z pRPARD-187 do pRPA-RD-195

Plazmid pRPA-RD-187 byl naštěpen restrikčními enzymy KpnI a Sáli a .fragment DNA obsahující expresní kazetu pro • ·

drosomicin byl purifikován. Purifikovaný fragment byl vložen do plazmidu pRPA-RD-195, který byl předtím naštěpen stejnými restrikčními enzymy.

pRPA-RD-191: Vložení expresní kazety pro drosomicin z pRPARD-188 do pRPA-RD-195

Plazmid pRPA-RD-188 byl naštěpen restrikčním enzymem HindlII a defosforylován pomocí telecí intestinální fosfatázy. Fragment DNA obsahující expresní kazetu pro drosomicin byl purifikován. Purifikovaný fragment byl vložen do plazmidu pRPA-RD-195, který byl předtím naštěpen také restrikčním enzymem HindlII.

pRPA-RD-174: Plazmid odvozený z pRPA-BL-150A (EP 0 508 909) obsahující gen tolerance k bromoxynilu z pRPA-BL-237 (EP 0 508 909)

Gen tolerance k bromoxynilu byl izólován z pRPA-BL-237 pomocí genové amplifikace v polymerázové řetězové reakci (PCR). Získaný fragment s přímými konci byl klonován do EcoRI místa plazmidu pRPA-RD-150A, které bylo zarovnáno působení Klenowova fragmentu polymerázy za standardních podmínek. Byl tak získán vektor pro Agrobacterium tumefaciens, který obsahuje gen tolerance k bromoxynilu v blízkosti své pravé hranice a gen tolerance ke kanamycinu v blízkosti levé hranice a vícečetné klonovací místo z pUC-19 ležící mezi těmito geny. '

Schéma struktury pRPA-RD-174 je uvedeno na obr. 6. Na tomto obrázku nos označuje polyadenylační signál z genu pro nopalinsyntázu z Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983) . NOS pro označuje promotor z genu pro nopalinsyntázu z Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983). NPTII představuje gen pro neomycinfosfotransferázu z transpozonu

9

Tn5 z Ε. coli (Rothstein et al., 1981) a 35S pro označuje promotor 35S izolovaný z viru mpozaiky květáku (Oděli et al., 1985). BRX představuje gen pro nitrilázu izolovaný z K. ozaenae (Stalker et al., 1988). RB a LB označují pravou a levou hraniční sekvenci Ti plazmidu z Agrobacterium tumefaciens.

pRPA-RD-184: Přidání nového jedinečného restrikčního místa do pRPA-RD-174

Komplementární syntetické oligonukleotidy Oligo 6 a Oligo 7 (uvedené dále) byly hybridizovány a vytvořily dvouvláknovou molekulu stejně jak bylo popsáno pro plazmid pRPA-RD-183.

Oligo 6: 5 ¹

CGGGCCAGTC

CCCGGCGCGC

TACCTGGTTC

CCGGCCTGAA

CACCTAGGCG

GTGGCCTGAC

AGGCCACACT

CTAGGTGTGT AGG 3 '

CCAGGTACTG

CGCCGGGGCC TGG 3 '

TAATTAAGTT

GCTCGAGGGC.

AGGTTGGGCC

GCGTTTAAAC

TAAACGCC-GC

CCAACCTCAG

CTCGAGCACA

TTAATTAAGT

Dvouvláknový oligonukleotidový hybrid (95 párů baží), byl purifikován po separaci na agarózovém gelu (3% Nusieve, EMC). Plazmid pRPA-RD-174 byl štěpen, restrikčním enzymem Xmal a vzniklý velký fragment DNA byl purifikován. Oba izolované fragmenty pak byly spojeny.

Získaný plazmid odvozený z plazmidu pRPA-RD-174 obsahoval další restrikční místo mezi genem, tolerance k bromoxynilu a selekčním markérem kanamycinové rezistence.

Schematické znázornění struktury plazmidu pRPA-RD-184 je uvedeno na obr. 7, kde označení nos, NPTII, NOS pro, • 4 • · • · « 4 4 4* 9

9 9 ·44 ·

4 9 4 4 9 4 49 9

4 * 44 494 «4 44

35S pro, BRX, RB a LB mají stejný význam jaký byl vysvětlen u obr. 6.

pRPA-RD-192: Příprava vektoru pro Agrobacterium tumefaciens obsahujícího· genový konstrukt kódující drosomicin směrovaný do cytosolu buňky

Plazmid pRPA-RD-190 byl štěpen restrikčními enzymy Apal a AscI a fragment DNA obsahující expresní kazetu drosomicinu byl purifikován. Purifikovaný fragment DNA obsahující expresní kazetu drosomicinu byl vložen do plazmidu pRPA-RD184, který byl předtím naštěpen stejnými restrikčními enzymy. Takto byl získán vektor pro Agrobacterium tumefaciens, který obsahuje sekvenci kódující fúzní protein drosomicinubichitin, který umožňuje expresi drosomicinu do cytosolu rostlinné buňky.

pRPA-RD-193: Příprava vektoru pro Agrobacterium tumefaciens obsahujícího genový konstrukt kódující drosomicin směrovaný do mezibuněčného prostoru

Byl užit stejný postup jako byl uveden výše s tím, že plazmid pRPA-RD-190 a restrikčními enzymy Apal a AscI byly nahrazeny plazmidem pRPA-RD-191 a restrikčními enzymy Pmel a AscI. Byl tak získán vektor pro Agrobacterium tumefaciens, který obsahuje sekvenci kódující pre-pro protein drosomicinu, který umožňuje expresi drosomicinu v extracelulárním prostoru v rostlině.

• · fe fe fe • ť · · · · • · · · · • ® · · · · • · · · fe • fefe fefe ··

Příklad 2

Tolerance transformovaného tabáku k herbicidům

2.1. Transformace

Vektory pRPA-RD-192 a pRPA-RD-193 byly vneseny do buněk Agrobacterium tumefaciens kmene AHA101 (Hood et al., 1987) nesoucích kosmid pTVK291 (Komáři et al., 1986).. Postup transformace byl,založen na postupu, který popsali Horsch et al. (1985) .

2.2. Regenerace

Regenerace tabáku PBD6 (pocházejícího z SEITA, Francie) z listových explantétů probíhala na základním médiu dle Murashige a Skoog (MS médium) obsahujícím 30 g/1 sacharózy a 200 μg/ml kanamycinu. Listové explantáty byly odebrány z rostlin pěstovaných ve skleníku nebo in vitro a byly transformovány metodou listových disků (Horsch et al., 1985) ve třech postupných etapách: první etapa spočívala v indukci výhonků na médiu s přídavkem 30 g/1 sacharózy obsahujícím ještě 0,05 mg/1 naftyloctové kyseliny (NAA) a 2 mg/1 benzylaminopurinu (BAP) po dobu 15 hodin. Výhonky vytvořené v této etapě byly pak ponechány 10 hodin na MS médiu s přídavkem 30 g/1 sacharózy ale bez hormonů. Pak byly výhonky odebrány a přemístěny na médium MS s poloviční koncentrací solí, vitamínů a sacharózy, ale neobsahující hormony. Přibližně po 15 dnech byly zakořeňující výhonky přeneseny do půdy.

2.3. Tolerance k bromoxynilu

Pro .každý konstrukt pRPA-RD-192 a pRPA-RD-193 bylo 20 transformovaných a regenerovaných rostlin umístěno do • · · · · 6 • ·

skleníku. Rostliny byly ve skleníku do stadia 5 listů ošetřovány vodnou suspenzí prostředku Pardner v množství odpovídajícím dávce 0,2 kg/ha účinné látky bromoxynilu.

Všechny rostliny jevící úplnou toleranci k bromoxynilu byly pak použity v pokusu, ve kterém se testoval vliv exprese drosomicinu na toleranci transformovaných rostlin k napadení houbami.

Příklad 3

Detekce drosomicinu v transgenním tabáku

Pro detekci drosomicinu v transgenním tabáku bylo užito metody imunopřenosu, kterou popsali Colligan et al., při které se .používala protilátka z králíka proti syntetickému drosomicinu, který byl jakožto antigen navázán na nosič KLH.

Listové proteiny byly extrahovány po rozdrcení tkáně zmražené na -180 °C přidáním extrakčního pufru (8M močovina, 50mM Tris HC1, pH 6,8, 2% SDS, 5% β-merkaptoetanol, 10% sacharoza, 2 mM EDTA a lOmM dithotreitol) . Bylo pak změřeno množství celkového extrahovaného proteinu. 100 pg extrahovaného proteinu pak bylo naneseno na SDS-PAGE gel (20% akrylamid) pro analýzu imunopřenosem (podle Colligan et al.) .

Pro rostliny transformované plazmidem pRPA-RD-193 (prepro-drosomicin) bylo zjištěno 160 ng. drosomicinu ve 100 ug celkového protein extrahovaného z listů.

Pro rostliny transformované plazmidem pRPA-RD-192 (maturovaný drosomicin) bylo zjištěno 50 ng drosomicinu ve 100 pg celkového protein extrahovaného z listů.

• · ·*···· ·· · · · • · 1 1 · «» *·<· • · · ·· · ···· ·······<··· · ······«»·* »· 9 »» m » · «·

Syntetický drosomicin a drosomicin izolovaný z rostlin transformovaných plazmidy pRPA-RD-193 a pRPA-RD-192 migroval v gelu stejně jako drosomicin izolovaný z octomilky. Tyto výsledky ukázaly, že jak drosomicin směrovaný do cytoplazmy. (pRPA-RD-192) tak i drosomicin směrovaný do extracelulárního prostoru (pRPA-RD-193) představují maturovaný drosomicin. Použitý systém pro gelovou elektroforézu (20% akrylamidový gel) umožnil odlišit drosomicin přibližně velikosti 10 kD z obou konstruktů, který neprodělal úpravy (ubichitindrosomicin a pre-pro drosomicin), od maturovaného drosomicinu velikosti 5 kD.

Příklad 4

Rezistence transformovaného tabáku proti Botrytis cinerea

15/20 rostlin pocházejících z rostlin získaných v příkladu 2.3 bylo pěstováno ve skleníku po přesazení do nádob s průměrem 1 cm v následujících podmínkách:

teplota:. 16 °C v noci, 19 °C ve dne fotoperioda: 14 hodin noc, 10 hodin den

- vlhkost vzduchu: 90 (14.00)

Dva listy každé rostliny byly inokulovány na 6 místech, tak, že byly naneseny skvrny o průměru 6 mm ze supsenze Botrytis cinerea (100 -000 spór/ml). Vývoj infekce byl pozorován 7 dnů po inokulaci tak, že se sledovalo zvětšování průměru každé skvrny.

V podstatě u všech rostlin transformovaných plazmidem pRPA-RD-192 (maturovaný protein v cytoplazmě) nebo plazmidem pRPA-RD-193 (extracelulární drosomicin) bylo pozorováno, že skvrny se nezvětšovaly, resp. zvětšovaly velmi málo, což ··««·· · * » · · · · « · · · ·«· » · · · « · · · · · » > · · • · » ·· · · · · · * · ··· · · * · · · ♦ indikuje silnou rezistenci proti infekci způsobené Botrytis cinerea.

Příklad 5

Rezistence transformovaného tabáku proti Chalara elegens

Byl užit stejný postup jako v předchozím příkladu s následujícími podmínkami:

teplota: 18 °C v noci, 22 °C ve dne fotoperioda: 14 hodin noc, 10 hodin den

Inokulace byla provedena 18 dnů po vysetí pomocí 1 ml suspenze obsahující endokonidie (10^s konidií/1 ml). Hodnocení infekce se provádělo 21 dnů po inokulaci pozorováním kořenů rostlin po opláchnutí čistou vodou. Rozvoj choroby byl hodnocen stupnicí 0 až 11, kdy hodnocení 0 odpovídalo zdravé rostlině (nepřítomnosti infekce). Rostliny transformované plazmidem pRPA-RD-192 (maturovaný protein v cytoplazmě) nebo transformované plazmidem pRPA-RD-193 (extracelulární drosomicin) byly hodnoceny stupněm 4, což odpovídá velmi silné rezistenci proti Chalara elegans.

Výsledky získané in vivo uvedené v příkladech 4 a 5 ukazují, že transformace chimérickým genem podle vynálezu vnáší do transformovaných rostlin novou vlastnost, a sice rezistenci proti houbám, díky tomu, že drosomicin produkovaný v transformovaných rostlinách podle vynálezu si uchovává své fungicidní vlastnosti.

• Φ ···· • · · · · »· · · · · • · · · · · · « · · φφφ φφφ φφφφφφ

ΦΦΦ · · 9 9 4 9 9 » « · «β «·Φ «Φ ·* ²⁵

Citovaná literatura:.

Ausubel. F. A. & coli. (eds. Greene). Current Protocols in Molecular Biology. Publ. Wiley&Sons.

Bevan. M. & coli. (1983). Nuc. Acids Res. 11:369-385.

Brederode. F.T.M. & co//. (1980). Nuc. Acids Res. 8:2213-2223.

Callis & coli. (1993). Planí Mol. Biol. 21:895-906.

Carrington and Freed (1990). J. Virol. 64:1590-1597.

Coligan. J.E. & coli. (ed. V.B. Chanda). Current Protocols in Protein Science. Publ. Wiley & Sons.

Fehlbaum & coli. (1994). J. Biol. Chem 269: 331459-33163.

Horsch&coli. (1985). Science 227:1229-1231.

Jefferson & coli. (1987). EMBO J. 6:3901-3907.

Komari & coli. (1986). J. Bacteriol. 166:88-94.

Rothstein & coli. (1981). Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 45: 99-105.

Stalker & coli. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314.

Oděli. J.T. & coli. (1985). Nátuře 313:810-812.

99999» ·* 9 ·· 9 9 • · « · · · 9 » · » a ··· 9 9 9 * · 9 *

9 9 9« 9 9 9 4 9 9 9 • 99 9* 9 9999

4 9« 999 «9 9 9

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8012 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iv) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Drosophila Melanogaster (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:

(A) KLON: pRPA-RD-180 (ix) DALŠÍ ZNAKY:' (A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) · POZICE: 101...310 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 1:

GAATTCGAGC TCGGTACCCC TCGAGACCAT GGTCGACCCC ACGCGTCCGG ATAATTCTTT 60

CAGAAATCAT TTACCAAGCT CCGTGAGAAC CTTTTCCAAT ATG ATG CAG ATC AAG 115

Met Met Gin Xle Lys

5

TAC TTG TTC GCC CTC TTC GCT GTC CTG ATG CTG GTG GTG CTG GGA GCC

163

Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val Leu Met

Leu

Val

Val

Leu

Gly 20

Ala

10

15

AAC

GAG

..GCC

GAT

GCC

GAď TGC

CTG

TCC

GGA

AGA

TAC

AAG

GGT

CCC

TGT

211

Asn

Glu

Ala

Asp

Ala

Asp

Cys

Leu

Ser

Gly

Arg

Tyr

Lys

Gly

Pro

Cys

25

30

35

GCC

GTC

TGG

GAC

AAC

GAG

ACC

TGT

CGT

CGT

GTG

TGC

AAG

GAG

GAG

GGA

259

Ala

Val

Trp

Asp

Asn

Glu

Thr

Cys

Arg

Arg

Val

Cys

Lys

Glu

Glu

Gly

40

45

50

CGC

TCC

AGT

GGC

CAC

TGC

AGC

CCC

AGT

CTG

AAG

TGC

TGG

TGC

GAA

GGA

307

Arg

Ser

Ser

Gly

His

cys

Ser

Pro

Ser

Leu

Lys

Cys

Trp

Cys ^Glu Gly

55

60

65

TGC TAAATCCATG AGCAATTAGC ATGAACGTTC TGAAAAGCGC GTTTAGCTCT 360

Cys

CCACTACTTA CGACATATTC TATGCTGCAA TATTGAAAAT CTAATAAACA AAACTAATGT 420

ACATTAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAGGG CGGCCGCGAC CTGCAGGCAT 480

GCAAGCTT

488 • 4 4 9 9 · * 4 • 4 94 • 4 · 9

9 4 4

9 V 4

4 9.9

4 9 9 *

»94

9 9 • 4 «9 9 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 70 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S- ID. Č. 2:

Met 1

Met

'Gin

Xle

Lys 5

Tyr

Leu

Phe

Ala

Leu 10

Phe

Ala

Val

Leu

Met 15

Leu

Val

Val

Leu

Gly 20

Ala

Asn

Glu

Ala

Asp 25

Ala

Asp

Cys

Leu

Ser 30

Gly

Arg

Tyr

Lys

Gly 35

Pro

Cys

Ala

Val

Trp 40

Asp

Asn

Glu

Thr

Cys 45

Arg

Arg

Val

Cys

Lys 50

Glu

Glu

Gly Arg

Ser 55

Ser

Gly

His

Cys

Ser 60

Pro

Ser

Leu

Lys

Cys Trp Cys Glu Gly Cys fiS 70 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 167 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iv) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Syntetická (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:

(A) KLON: pRPA-RD-183 (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 21...152 (xi) POPI? SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 3:

GAGAGATCCC CCGCGGTGGT GAC TGC CTG TCC GGA AGA TAC AAG GGT CCC Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro

5 10 • » · » » ·

W w — — ^W • · 9 99«· 999·

999 99 9 999·

9 9 *

9 · 9 9 9 9

9 9 9 9 99 · ·

TGT GCC GTC TGG GAC AAC GAG ACC Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr 15

GGA CGC TCC AGT GGC CAC TGC AGC Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser 30

GGA TGC TAAGGATCCG CGCGC

Gly Cys (2) INFORMACE PRO SEKVENCI (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (D) TOPOLOGIE: lineární

TGT	CGT	CGT	GTG	TGC	AAG	GAG	GAG	98
Cys	Arg	Arg	Val	Cys	Lys	Glu	Glu
	20					,25
CCC	AGT	CTG	AAG	TGC	TGG	TGC	GAA	146
Pro	Ser	Leu	Lys	Cys	Trp	Cys	Glu
35					40

167

S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4 (ii) TYP MOLEKULY: peptid

(X.

i) POPI

S SEKV]

ENCE: 5

;ekv

ENC!

E S

ID.

Č.

4 :

Asp

Cys

Leu

Ser

Gly Arg

Tyr

Lys

Gly

Pro

Cys

Ala

Val

Trp

Asp

Asn

1

5

10

15

Glu

Thr

Cys

Arg

Arg Val

Cys

Lys

Glu

Glu

Gly

Arg

Ser

Ser

Gly

His

20

25

30

Cys

Ser

Pro

Ser

Leu Lys

Cys

Trp

Cys

Glu

Gly

Cys

35

40

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 236 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iv) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Syntetická (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:

(A) KLON: pRPA-RD-186 (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 15...221 *· »·»· • 9 · ·

9 9 · ·9· ·

9 β 9 9 9 9 *9 9-9 9 · • ««99

9 » «9 9

9 9 9 9

9* «· · · (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. C. 5:

GAATTGAAGA CGCC ATG Met

CAG Gin

ATC AAG Ile Lys

TAC Tyr 5

TTG TTC GCC CTC TTC GCT GTC

50

Leu

Phe

Ala

Leu

Phe 10

Ala

Val

1

CTG

ATG CTG GTG GTG

CTG

GGA GCC

AAC

GAG

GCC

GAT

GCC

GAC

TGC

CTG

98

Leu

Met Leu Val Val

Leu

Gly Ala

Asn

Glu

Ala

Asp

Ala

Asp

Cys

Leu

15

20

25

TCC

GGA AGA TAC AAG

GGT

CCC TGT

GCC

GTC

TGG

GAC

AAC

GAG

ACC

TGT

146

Ser

Gly Arg Tyr Lys

Gly

Pro Cys

Ala

Val

Trp

Asp

Asn

Glu

Thr

Cys

30

35

40

CGT

CGT GTG TGC AAG

GAG

GAG GGA

CGC

TCC

AGT

GGC

CAC

TGC

AGC

CCC

194

Arg

Arg Val Cys Lys

Glu

Glu Gly

Arg

Ser

Ser

Gly

His

Cys

Ser

Pro

45

50

55

60

AGT

CTG AAG TGC TGG

TGC

GAA GGA

TGC

TAAGGATCCG' CGCGC

236

Ser

Leu Lys Cys Trp

Cys

Glu Gly

Cys

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 69 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 6:

Met 1

Gin

Ile

Lys

Tyr 5

Leu

Phe

Ala

Leu

Phe 10

Ala

Val

Leu

Met Leu 15

Val

Val

Leu

Gly

Ala 20

Asn

Glu

Ala

Asp

Ala 25

Asp

Cys

Leu

Ser

Gly Arg 30

Tyr

Lys

Gly

Pro 35

Cys

Ala

Val

Trp

Asp 40

Asn

Glu

Thr

Cys

Arg 4 5

Arg Val

Cys

Lys

Glu

Glu

Gly

Arg

Ser

Ser

Gly

His

Cys

Ser

Pro

Ser

Leu Lys

Cys

Trp Cys Glu Gly Cys 65

55 60 ·· 9999 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA syntetický oligonukleotid 1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 7:

AATTCCCGAA GACGACATGC AGATCAAGT 29 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA syntetický oligonukleotid 1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 8:

GGGCTTCTGC TGTACGTCTA GTTCA 25 (2) INFORMACE PRO·SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 100 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA syntetický oligonukleotid 2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 9:

GAGAGATCCC CCGCGGTGGT GACTGCCTGT CCGGAAGATA CAAGGGTCCC TGTGCCGTCT 60

GGGACAACGA GACCTGTCGT CGTGTGTGCA AGGAGGAGGG 100 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 100 párů baží

4 4 44 4 4 4 · 4 4··

4 4 4 4 44 4 44 4

4 44 4 4444 • 4 4 44 4 4444

4 *4 444 44 44 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA syntetický oligonukleotid 3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 10:

GCGCGCGGAT CCTTAGCATC CTTCGCACCA GCACTTCAGA CTGGGGCTGC AGTGGCCACT 60

GGAGCGTČCC TCCTCCTTGC ACACACGACG 100 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 85 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA syntetický oligonukleotid 4 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 11:

AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC 60

CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 85 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) ·. CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 66 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) .TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA syntetický oligonukleotid 5 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 12:

CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC 60

TAGAGG ·· 4449

4 4 9 4 9 9 4 9 4 9

4 9 9 9 9 4 9 9 9

9 4 4 4 4 4 9 4 4 4 9

4 9 · · · 9 4 9 «

9 94 994 4 4 49 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 93 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA syntetický oligonukleotid 6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 13:

CGGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT 60

GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG 93 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 93 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA syntetický oligonukleotid 7 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 14:

CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC 60

GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG

Claims (2)

píZ LtrD~6 / PATENTOVÉ NÁROKY

1/2

Ϊ __ ρ-ή ubq11 N-t

Sacll

BamHI

Sall term GUS NÓSpoiyA

Místo, kde štěpí ubichitinhydroláza

Obr. 2

Obr. 4

1. Chimérický gen, který obsahuje kódující sekvenci a heterologní regulační prvky v polohách 5' a 3', které jsou schopné funkce v rostlině, přičemž kódující sekvence obsahuje alespoň jednu sekvenci kódující drosomicin.

2. Chimérický gen podle nároku 1, kde drosomicin obsahuje v podstatě peptidovou sekvenci podle vzorce (I):

Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag-CysXah-Cys (I), kde

Xaa představuje peptidový zbytek obsahující nejméně jednu aminokyselinu,

Xab představuje peptidový zbytek obsahující 8 aminokyselin, Xac představuje peptidový zbytek obsahující 7 aminokyselin, Xad představuje peptidový zbytek obsahující 3 aminokyseliny, Xae představuje peptidový zbytek obsahující 9 aminokyselin,

Xaf představuje peptidový zbytek obsahující 5 aminokyselin,

Xag představuje peptidový zbytek obsahující jednu aminokyselinu a

Xah představuje peptidový zbytek obsahující 2 aminokyseliny.

3. Chimérický gen podle nároku 2, kde Xab. a/nebo Xad a/nebo Xac obsahují alespoň jednu bazickou aminokyselinu.

4. Chimérický gen podle nároku 3, kde Xab obsahuje alespoň 2 bazické aminokyseliny, výhodně právě dvě, a/nebo Xad a/nebo Xaf obsahují alespoň 1 bazickou aminokyselinu, výhodně právě 1.

fe · • fefefe • · • • fe fefe • • fe • • • · fe · • fe • • · • fe fe • fe • • • • • fe • · fe • • fe fe • fefefe • · • · • fe · fe

5. Chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 2 a 3, kde Xaa představuje peptidovou sekvenci Xaa'-Asp-, kde Xaa' je skupina NH₂ nebo peptidový zbytek obsahující' nejméně 1 aminokyselinu a/nebo

Xab představuje peptidovou sekvenci -Leu-Xab'-Pro-, kde

Xab'je peptidový zbytek ze 6 aminokyselin a/nebo

Xac představuje peptidovou sekvenci -Ala-Xac'-Thr-, kde

Xac'je peptidový zbytek z 5 aminokyselin a/nebo

Xad představuje peptidovou sekvenci -Arg-Xad'-Val, kde Xaďje peptidový zbytek obsahující jednu aminokyselinu a/nebo

Xae představuje peptidovou sekvenci -Lys-Xae'-His-, kde

Xae'je peptidový zbytek ze 7 aminokyselin a/nebo

Xaf představuje peptidovou sekvenci -Ser-Xaf'-Lys-, kde

Xaf'je peptidový zbytek ze 3 aminokyselin a/nebo

Xag je Trp a/nebo

Xah je peptidový zbytek Glu-Gly.

6. Chimérický gen podle nároku 5, kde

Xab' představuje peptidovou sekvenci Ser-Gly-Arg-Tyr-Lys-Gly a/nebo

Xac' představuje peptidovou sekvenci Val-Trp-Asp-Asn-Glu a/nebo

Xad' je Arg a/nebo

Xae' představuje peptidovou sekvenci Glu-Glu-Gly-Arg-Ser-SerGly a/nebo

Xaf' představuje peptidovou sekvenci Pro-Ser-Leu.

7. Chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kde drosomicin má peptidovou sekvenci představovanou sekvencí id. č. 4 anebo homologními peptidovými sekvencemi.

0 0 0 0 0 0·

0 000 0 0« 4

0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 00 0 0 4

0 0 0 0 0 0 0

04 ··· 00 40

8. Chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde drosomicin je fúzní peptid peptid-drosomicin, jehož štěpení enzymatickým systémem rostlinné buňky umožní uvolnění drosomicinu.

9. Chimérický gen podle nároku 8, kde fúzní peptid peptid-drosomicin má sekvenci id. č. 6.

10. Fúzní peptid peptid-drosomicin, kde drosomicin je definován kterýmkoliv z nároků 1 až 7.

11. Fúzní peptid podle nároku 10, kde peptid je buďto signální peptid nebo tranzitní peptid.

12. Fúzní peptid podle nároku 11, kde signální peptid je vybrán ze signálního peptidu genu PR-l<x z tabáku nebo ubichitinu.

13. Chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, který obsahuje navíc alespoň jeden gen tolerance k herbicidům. 14. Chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13,

který obsahuje navíc alespoň jednu sekvenci kódující další peptid schopný udělit rostlině rezistenci k dalším chorobám bakteriálního nebo houbového původu.

15. Chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, kde regulační prvky obsahují promotorové sekvence, aktivátory transkripce, tranzitní peptidy a/nebo terminační sekvence.

• · ···· · · · ·· ·· • · · · · · · · · · · • · · · · · · · · · • · · · · · ·····« • · · · · · · · « <

♦· ♦ ·· ··· ♦· ·*

16. Chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, kde regulační promotorové sekvence je vybrána z promotorové sekvence pocházející z bakterie, viru nebo' rostliny.

17. Chimérický gen podle nároku 16, kde regulační promotorové sekvence je vybrána z promotoru genu, pro malou podjednotku ribulózobisfosfátkarboxylázy/oxygénázy (RuBisCO) nebo z viru mozaiky květáku (CAMV, 19S nebo 35 S).

18. Chimérický gen podle nároku 16, kde regulační promotorova sekvence obsahuje alespoň jeden promotor vybraný z promotoru histonu nebo aktinu.

19. Vektor pro transformaci rostlin, který obsahuje alespoň jeden chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 1 až

18.

20. Transformovaná rostlinná buňka, která obsahuje alespoň ’jednu DNA definovanou kterýmkoliv z nároků 1 až 18.

21. Rostlina rezistentní proti chorobám, která obsahuje transformovanou buňku podle nároku 20.

22. Rostlina podle nároku 21, která je získána regenerací z transformované buňky podle nároku. 20.

23. Transformovaná rostlina rezistentní proti chorobám, která byla získána pěstováním a/nebo křížením rostlin podle kteréhokoliv z nároků 21 a 22.

24. Semena transformovaných rostlin podle kteréhokoliv z nároků 21 až 23.

·· φ» * ·· »· • ♦ · φφφφ φφφ» • · φ φφφ φφφφ • ·· · · · · ·φ φ· φ ··· φφφ φφφφ ·· · ·· φφφ φφ ·φ

25. Způsob transformace rostlin pro získání rezistence k chorobám, vyznačujíc í se tím, že se vnese chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18.

26. Způsob transformace rostlin pro získání rezistence k houbovým chorobám, vyznačující se tím, že se vnese chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18.

27. Způsob podle nároku 25 nebo 26 vyznačuj ící se t í m, že se vnesení genu provede pomocí Agrobacteri um tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes.

28. Způsob podle nároku 25 nebo 26 vyznačuj ící se t i m, že se vnesení genu provede vstřelováním částic nesoucích DNA.

29. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25 až 28 vyzná jeden gen čující se t i m, že tolerance k herbicidům. se vnese také alespoň 30. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25 až 29 v y z n a č u j ící se t i m, že se vnese také alespoň

jedna sekvence kódující další peptid schopný udělit rostlině rezistenci k dalším chorobám bakteriálního nebo houbového původu.

31. Způsob pěstování transformovaných rostlin podle kteréhokoliv z nároků 21 až 24 vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se vysejí semena transformovaných rostlin na pole vhodné pro pěstování těchto rostlin, na pole se aplikuje agrochemický prostředek, aniž by ·· »··· ·· · · sa • ♦ · · · aa a a a * •i · ·· ···»» • ·· ·· · · · · · φ φ • · · » · * a a a a ·· · ·· ··· aa ·· se podstatným způsobem ovlivnila transformovaná semena nebo transformované rostliny, po dosažení zralosti se pěstované rostliny sklidí a případně se oddělí ze sklizených rostlin semena.

32. Způsob , pěstování podle nároku 31 vyznačující se t i m, že agrochemický prostředek obsahuje alespoň jednu účinnou látku projevující buďto fungicidní nebo baktericidní aktivitu nebo obě.

33. Způsob pěstování podle nároku 32 vyznačující se tím, že účinná látka projevuje doplňující aktivitu k aktivitě drosomicinu.

AMV 5' UTR

EcoRI, Sací, Kpnl

2/2

Avii Sil Apel ^Pmei

Ifnl >bal

Sací Barrřil

EbaRI Sral J I 1- I I 1

Asc I

FSI Pacl ExNI

Safl Hndlll Xhol

I I I I I I I I pRPA-RD-195 133 párů baží

Jedinečná místa

Obr. 5

-- i\D

35S pro ζ BÉXgen ^nos~1 C~i

Hrdlil, Sphl, ftřf, Sall >bal, BamH, Xnal, KpnI, Sad, EčoR, Xmal

Obr. 6

Hindlll, Sphl, Pstl, Sall, Kbal BamHI, BcoNI, A pal, Xhol, Avrll, Ascii, Pmel, Pad, Sfil

Obr. 7