PT1071767E - Gene que codifica a heliomicina e a sua utilização - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

GENE QUE CODIFICA A HELIOMICINA E A SUA UTILIZAÇÃO A presente invenção tem como objecto um novo peptídeo rico em cisteinas denominado heliomicina, a sua utilização como medicamento e as composições que ele compreende, uma sequência de adn que codifica este peptídeo, um vector que o contém para a transformação de um organismo hospedeiro e o método de transformação do dito organismo. A invenção mais particularmente refere-se à transformação das células vegetais e das plantas, a heliomicina produzida pelas plantas transformadas conferindo-lhes uma resistência às doenças, em particular as de origem fúngica.

Actualmente há uma necessidade crescente de fazer com que as plantas sejam resistentes contra as doenças particularmente fúngicas com o fim de diminuir, ou até de evitar, de ter de recorrer a tratamentos com produtos de protecção antifúngicos, com o fim de proteger o meio ambiente. Um meio para aumentar esta resistência às doenças consiste em transformar as plantas de forma a que estas produzam as substâncias ou mesmo de assegurar a sua defesa contra estas doenças.

No âmbito da saúde humana, existem infecções fúngicas oportunistas para as quais actualmente ainda não há nenhum tratamento realmente eficaz. Em particular, é o caso de certas micoses invasivas graves que afectam os pacientes hospitalizados cujo sistema imunitário fica debilitado devido a um transplante, à quimioterapia ou a uma infecção pelo VIH. Em comparação com o arsenal dos agentes antibacterianos, a panóplia actual dos agentes antifúngicos é muito limitada. Assim, há uma necessidade real de caracterizar e de desenvolver novas classes de substâncias antifúngicas. 1

Diferentes substâncias de origem natural são conhecidas, em particular os peptideos, que apresentam propriedades bactericidas ou fungicidas, particularmente contra os fungos responsáveis das doenças das plantas. No entanto, um primeiro problema consiste em encontrar estas substâncias que poderão não só ser produzidas pelas plantas transformadas, mas ainda conservar as suas propriedades bactericidas ou fungicidas e conferir às ditas plantas todas estas propriedades. Na presente invenção, entender-se-á por bactericida ou fungicida as propriedades bactericidas ou fungicidas propriamente ditas assim como as propriedades bacteriostáticas ou fungistáticas. São igualmente conhecidos os peptideos ricos em cisteinas que apresentam actividades bactericidas ou bacteriostáticas, mas que não apresentam actividade fungicida ou fungistática. Outro problema consiste em encontrar um peptideo rico em cisteinas que apresente uma forte actividade fungicida ou fungistática relativamente aos peptideos do estado da técnica. 0 Pedido de Patente francesa FR 2695392 ensina a existência de defensinas isoladas de larvas de insectos, com actividade antibacteriana. Nenhuma actividade antifúngica está demonstrada, e tão-pouco prevista na descrição. 0 Pedido de Patente WO 90/11770 descreve as defensinas isoladas de mamíferos, com actividade antifúngica e antibacteriana. Estas defensinas são deste modo, quanto à sua estrutura, claramente diferentes das moléculas de acordo com a invenção.

De facto, Hoffmann et al. (Immunol. Today, 1992, 13, 10, 411-5) descrevem numa revista que avalia o estado da técnica, e indicam claramente que as defensinas dos insectos possuem actividades antibacterianas, essencialmente contra as bactérias Gram- positivas, em menor escala contra as Gram-negativas, diferenciando-as fortemente das defensinas de mamíferos, em particular desde um ponto de vista estrutural, ancestral comum, ou localização. Este documento indica igualmente que não foi 2 possível detectar qualquer actividade antifúngica para as defensinas dos insectos, contrariamente às defensinas dos mamíferos. A heliomicina é um peptídeo isolado a partir da hemolinfa do lepidóptero Heliothis virescens que apresenta uma actividade fungicida contra os fungos responsáveis das doenças das plantas e contra os fungos da patologia humana e animal. Depois de ter sido primeiramente sintetizado o gene da heliomicina, descobrimos também que este podia ser inserido num organismo hospedeiro, como uma levedura ou uma planta, para expressar a heliomicina e para produzir a heliomicina purificada ou não, ou para conferir ao dito organismo hospedeiro propriedades de resistência às doenças fúngicas, contribuindo de maneira particularmente vantajosa à solução dos problemas acima enunciados.

Assim, a invenção tem como principal objectivo a heliomicina, a sua utilização como um medicamento ou a sua utilização na Agroquímica para a protecção das plantas, as composições compreendem, um fragmento de ácido nucleico que codifica a heliomicina, um gene quimérico que inclui o dito fragmento que codifica a heliomicina assim como os elementos indicadores da posição 5' e 3' heterólogos que podem funcionar num organismo hospedeiro, em particular nas leveduras ou nas plantas e um vector para a transformação dos organismos hospedeiros que contêm este gene quimérico, e o organismo hospedeiro transformado. A invenção refere-se também a uma célula vegetal transformada que contém pelo menos um fragmento do ácido nucleico que codifica a heliomicina e uma planta resistente às doenças contendo a dita célula, em particular regenerada a partir desta célula. Por último a invenção refere-se a um método de transformação das plantas para as tornar resistentes às doenças, nos quais um gene que codifica a heliomicina é inserido através do vector apropriado. Esta refere-se finalmente a um 3 método para a preparação da heliomicina com os organismos hospedeiros transformados.

Por heliomicina, de acordo com a invenção, entender-se-á qualquer peptideo que compreenda essencialmente a sequência peptidica da fórmula (I) abaixo indicada,

Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag (I) na qual:

Xaa é -NH2 ou um resto peptidico que comprende de 1 a 10 aminoácidos, de preferência de 1 a 6 aminoácidos, compreendendo pelo menos um aminoácido básico, representando a seguinte sequência peptidica Xaa'-Gly-Xaa"- na qual Xaa' representa NH2 ou um resto peptidico que compreende 1 a 9 aminoácidos, de preferência de 1 a 5 aminoácidos, e Xaa" representa um resto peptidico que pelo menos compreende um aminoácido, preferencialmente escolhido entre Leu, Ilc, Vai, Pro, Ser ou Thr,

Xab é um resto peptidico que compreende de 1 a 10 aminoácidos, de preferência 10,

Xac é um resto peptidico de 3 aminoácidos que compreende pelo menos um aminoácido ácido, Xad representa a sequência peptidica seguinte -Lys-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Gly-His-

Xae representa a sequência peptidica seguinte -Gly-Xae'-Asn-, na qual Xae' representa um resto peptidico que compreende 5 aminoácidos,

Xaf é um triptofano, e

Xag é -OH ou um resto peptidico que compreende de 1 a 2 aminoácidos. 4

De acordo com a invenção, por aminoácidos básicos, entender-se-á de uma forma mais particular os aminoácidos escolhidos entre a lisina, a arginina ou a homoarginina.

De acordo com outra forma preferida de realizar a invenção, Xac compreende exactamente um aminoácido ácido.

De maneira vantajosa, Xac representa a sequência peptidica seguinte -Asn-Xac'-Xac"-, na qual Xac' representa um resto peptidico de 1 aminoácido, e Xac" representa um resto peptidico de 1 aminoácido ácido.

De acordo com a invenção por aminoácido ácido entender-se-á qualquer aminoácido sobre uma cadeia lateral compreende uma função ácida orgânico, mais particularmente ácido carboxilico, de preferência escolhido entre o ácido glutâmico (Glu) ou o ácido aspártico (Asp).

De maneira preferencial, Xac representa a sequência peptidica seguinte -Asn-Gly-Glu- ou -Ala-Ala-Glu-.

De maneira vantajosa,

Xaa representa a sequência peptidica seguinte Xaa'-Gly-Xaa"- na qual Xaa' representa NH2 ou um resto peptidico que compreende de 1 a 9 aminoácidos, de preferência de 1 a 5 aminoácidos, e Xaa" representa um resto peptidico que compreende pelo menos um aminoácido, escolhido de preferência entre Leu, lie, Vai, Pro, Ser ou Thr, e/ou

Xab representa a sequência peptidica seguinte -Val-Xab'-Asp-, na qual Xab' representa um resto peptidico que compreende de 0 a 8 aminoácidos, de preferência 8, e/ou 5

Xae representa a sequência peptídica seguinte -Gly-Xae'-Asn-, na qual Xae' representa um resto peptídico que compreende 5 aminoácidos, e/ou

Xaf é um triptófano e/ou

Xag representa a sequência peptídica seguinte -Glu-Xag' na qual Xag' representa OH ou um resto que compreende 1 aminoácido.

De acordo com uma forma mais preferida de realizar a invenção, Xaa representa a sequência peptídica seguinte NH2-Asp-Lys-Leu-Ile-Gly-Ser- ou NH2-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ser-, e/ou Xab representa a sequência peptídica seguinte -Val-Trp-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Thr-Ser-Asp-, e/ou Xae representa a sequência peptídica seguinte -Gly-Ser-Phc-Ala-Asn-Val-Asn-, e/ou Xaf representa o aminoácido seguinte -Trp-, e/ou Xag representa a sequência peptídica seguinte Glu-Thr-OH ou Arg-Thr-OH.

De acordo com uma forma ainda mais preferida de realizar a invenção, a heliomicina é o peptídeo representado com a sua sequência codificante pelo identificador de sequência n° 2 (SEQ ID NO 2) . A mesma sequência é descrita, correspondente aos aminoácidos 6 a 49 do identificador de sequência n° 1 (SEQ ID NO 1) com uma sequência codificante diferente. O resíduo NH2 terminal pode apresentar uma modificação pós-traducional, por exemplo uma acetilação, enquanto que o resíduo C-terminal pode apresentar uma modificação pós-traducional, por exemplo uma amidação.

Por sequência peptídica compreendendo essencialmente a sequência peptídica da fórmula geral (I), entender-se-á não só as sequências acima definidas, mas também as sequências que compreendem numa ou noutra das suas extremidades, ou nas duas, os resíduos peptídicos necessários para a sua expressão e para o seu reconhecimento num organismo hospedeiro. Por organismo 6 hospedeiro entender-se-á qualquer organismo que pelo menos compreenda uma célula, que consista em microrganismos, em particular uma levedura ou uma bactéria, ou ainda células vegetais ou ainda organismos superiores como por exemplo as plantas.

Trata-se particularmente de um peptideo de fusão "peptideo-heliomicina", cujo corte pelos sistemas enzimáticos do organismo hospedeiro permite a libertação da heliomicina, estando a heliomicina acima definida. 0 peptideo fundido com a heliomicina pode ser um peptideo sinal ou um peptideo de trânsito que permita controlar e orientar a produção da heliomicina de maneira especifica numa parte do organismo hospedeiro, como por exemplo o citoplasma, a membrana celular, ou no caso das plantas num tipo particular de compartimentos celulares ou nos tecidos ou na matriz extracelular.

De acordo com uma forma de realização, o peptideo de trânsito pode ser um sinal de endereçamento cloroplástico ou mitocondrial, o qual é seguidamente clivado nos cloroplastos ou nas mitocôndrias.

De acordo com outra forma de realizar a invenção, o peptideo sinal pode ser um sinal N-terminal ou "pré-peptideo", eventualmente em associação com um sinal responsável da retenção da proteína no reticulo endoplasmático, ou um peptideo de endereçamento vacuolar ou "propeptídeo". 0 reticulo endoplasmático é o lugar onde a "maquinaria celular" toma a seu cargo as operações de maturação da proteína produzida, como por exemplo a clivagem do peptideo sinal.

Os peptídeos de trânsito podem ser simples ou duplos, e neste caso eventualmente separados por uma sequência intermédia, isto é que compreende no sentido da transcrição, uma sequência que codifica um peptideo de trânsito de um gene vegetal que codifica uma enzima com localização plastidial, uma parte da sequência da 7 parte madura N-terminal de um gene vegetal que codifica uma enzima com localização plastidial, logo uma sequência que codifica um segundo peptideo de trânsito de um gene vegetal que codifica uma enzima com localização plastidial, tal e como está descrito no Pedido de Patente europeia ep 0 508 909.

Como o peptideo de trânsito útil de acordo com a invenção, poder-se-á citar particularmente o peptideo sinal do gene PR-la do tabaco descrito por Comelissen & coll., representado com a sua sequência codificante pelo identificador de sequência n° 2, em particular quando a heliomicina é produzida pelas células vegetais ou das plantas, ou do precursor do factor Matai quando a heliomicina é produzida em leveduras. O peptideo de fusão "MFal/heliomicina" juntamente com os cinco resíduos do propeptídeo do factor MFal (Ser-Leu-Asp-Lys-Arg), situados na posição N-terminal e a sua sequência codificante formam parte da presente invenção, em particular descritos pelo identificador de sequência n° 1 (SEQ ID NO 1), correspondentes aos aminoácidos de 1 a 49. O peptideo de fusão "peptideo sinal PR-la-heliomicina» e a sua sequência codificante são igualmente parte da presente invenção, em particular descritos pelo identificador de sequência n° 3 (SEQ ID NO 3). O peptideo de fusão que compreende o peptideo sinal do gene PG1 da poligalacturonase do milho fundido com a heliomicina "peptideo sinal PGl/heliomicina" está representado com a sua sequência codificante pelos identificadores de sequências n° 18 e 20 (SEQ ID NO 18 e SEQ ID NO 20) .

De acordo com uma forma preferencial de realizar a invenção, os resíduos cisteínas do peptideo da fórmula (I) formam pelo menos uma ponte dissulfureto intramolecular, de preferência três pontes dissulfureto. De acordo com uma forma preferencial de realizar a invenção as pontes dissulfureto são estabelecidas entre os residuos de cisteina 1 e 4, 2e5e3e6. A heliomicina é um peptídeo particularmente activo contra os fungos e as leveduras, e por esse motivo pode ser empregue a como preventivo ou curativo para proteger diferentes organismos contra as agressões fúngicas. Assim, a presente invenção refere-se à heliomicina como um medicamento. Esta refere-se igualmente à utilização da heliomicina para o tratamento das plantas contra as agressões fúngicas, aplicando directamente a heliomicina nas ditas plantas. A presente invenção refere-se igualmente a uma composição que compreende a heliomicina e um veiculo apropriado. 0 veiculo apropriado tem como primeira qualidade o facto de não se degradar substancialmente a heliomicina na composição e de não diminuir as propriedades bactericidas e fungicidas da heliomicina. Esta composição pode ser uma composição cosmética e neste caso o veiculo apropriado é aceite na Indústria Cosmética (adaptado também para uma aplicação sobre a pele ou sobre as faneras), ou uma composição farmacêutica para uma utilização terapêutica e neste caso o veiculo apropriado é aceite na industria Farmacêutica e apropriado para uma administração da heliomicina por via tópica, via oral ou por injecção, ou ainda uma composição agroquimica e neste caso o veiculo apropriado é aceite na Indústria Agroquimica, apropriado para uma aplicação sobre as plantas ou na proximidade das plantas, sem as degradar. A presente invenção refere-se igualmente a um fragmento do ácido nucleico, em particular de ADN, natural ou sintético, que codifica a heliomicina acima definida, e compreendido pelo peptideo de fusão "peptideo-heliomicina" acima definido. Pode de acordo com a invenção tratar-se de um fragmento sintetizado ou isolado do lepidóptero Heliothis, ou ainda de um fragmento derivado, adaptado para a expressão da heliomicina no organismo 9 hospedeiro onde o peptídeo será expresso. O fragmento do ácido nucleico pode ser obtido de acordo com os métodos standards de isolamento e de purificação, ou ainda por sintese de acordo com as técnicas habituais de hibridações sucessivas dos oligonucleotideos sintéticos. Estas técnicas são particularmente descritas por Ausubel et al.

De acordo com a presente invenção, entender-se-á por "fragmento do ácido nucleico" uma sequência nucleotidea que pode ser do tipo ADN ou ARN, de preferência do tipo ADN, particularmente bicatenário.

De acordo com uma forma de realizar a invenção, o fragmento do ácido nucleico que codifica a heliomicina compreende a sequência de ADN descrita pelas bases 16 a 147 do identificador da sequência n° 1 (SEQ ID NO 1), ou pelo identificador da sequência n° 2 (SEQ ID NO 2), em particular a parte codificante desta sequência correspondente às bases 1 a 132, uma sequência homóloga ou uma sequência complementar da dita sequência.

De acordo com outra forma de realizar a invenção, o fragmento do ácido nucleico que codifica o peptídeo de fusão "peptídeo-heliomicina" compreende a sequência de ADN descrita pelo identificador da sequência n°l (SEQ ID NO 1) ou aquela descrita pelo identificador da sequência n° 3 (SEQ ID NO 3), em particular a parte codificante correspondente às bases 3 a 224, ou aquela descrita pelo identificador da sequência n° 18 (SEQ ID NO 18), em particular a parte codificante correspondente às bases 7 a 205, uma sequência homóloga ou uma sequência complementar das ditas sequências.

De acordo com a invenção, por "homólogo" entender-se-á um fragmento do ácido nucleico que apresenta uma ou várias modificações da sequência em relação à sequência nucleotidea descrita pelos identificadores da sequências n° 1, 2 ou 3 e codificada pela heliomicina ou pelo peptídeo de fusão "peptídeo- 10 heliomicina". Estas modificações podem ser obtidas de acordo com as técnicas habituais de mutação, ou ainda escolhendo os oligonucleotideos sintéticos empregues na preparação da dita sequência por hibridação. Relativamente às múltiplas combinações dos ácidos nucleicos que podem conduzir à expressão de um mesmo aminoácido, podem ser importantes as diferenças entre a sequência de referência descrita pelos identificadores das sequências n° 1, 2 ou 3 e o homólogo correspondente, mais ainda quando se trata de fragmentos de ADN com pouco tamanho realizáveis por sintese química. De maneira vantajosa, em relação à sequência de referência o grau de homologia será de pelo menos 70%, mais preferencialmente de pelo menos 80%, mais preferencialmente de pelo menos 90%. Estas modificações são habitualmente neutras, isto é que não afectam a sequência primária da heliomicina ou do peptídeo de fusão resultante. A presente invenção refere-se igualmente a um gene quimérico (ou cassete de expressão) que compreende uma sequência codificante assim como elementos de regulação na posição 5' e 3' heterólogos que podem funcionar num organismo hospedeiro, em particular as células vegetais ou as plantas, compreendendo a sequência codificante pelo menos um fragmento de ADN que codifica a heliomicina ou um peptídeo de fusão "peptídeo-heliomicina" como o acima definido.

Por organismo hospedeiro, entender-se-á todo o organismo unicelular ou pluricelular, inferior ou superior, no qual o gene quimérico de acordo com a invenção pode ser introduzido, para a produção da heliomicina. Se trata em particular de bactérias, por exemplo E. colí, de leveduras, em particular dos géneros Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, de fungos, em particular Aspergillus, de um baculovirus, ou de preferência as células vegetais e das plantas. 11

De acordo com a invenção, por "célula vegetal", entender-se-á toda a célula proveniente de uma planta e que possa constituir os tecidos indiferenciados como por exemplo os calos, os tecidos diferenciados como por exemplo os embriões, as partes das plantas, as plantas ou as sementes.

De acordo com a invenção, entender-se-á por "planta", todo o organismo multicelular diferenciado capaz da fotossintese, em particular monocotiledónea ou dicotiledónea, de uma forma mais particular as plantas de cultivo destinadas ou não à alimentação animal ou humana, como o milho, o trigo, a colza, a soja, o arroz, a cana-de-açúcar, a beterraba, o tabaco, o algodão, etc.

Os elementos de regulação necessários para a expressão do fragmento de ADN que codifica a heliomicina são bem conhecidos dos técnicos especializados nas funções do organismo hospedeiro. Estes compreendem particularmente as sequências promotoras, activadoras da transcrição, sequências terminadoras, que compreendem os codões start e stop. Os meios e métodos para identificar e seleccionar os elementos de regulação são bem conhecidos dos técnicos especializados.

Para a transformação dos microrganismos como as leveduras ou as bactérias, os elementos de regulação são bem conhecidas dos técnicos especializados, e compreendem particularmente sequências promotoras, activadoras da transcrição, peptideos de trânsito, sequências terminadoras e codões start e stop.

Para dirigir a expressão e a secreção do peptideo no meio de cultivo da levedura, um fragmento de ADN que codifica a heliomicina é integrado num vector transportador que compreende os seguintes elementos: marcadores que permitem seleccionar os transformantes.

Preferencialmente, é utilizado o gene ura-3 para a levedura e o gene que confere a resistência à ampicilina para E. coli. 12 - uma sequência nucleica que permite a replicação (origem de replicação) do plasmídeo na levedura. Preferencialmente é utilizada a origem de replicação do plasmídeo 2μ de levedura, - uma sequência nucleica que permite a replicação (origem de replicação) do plasmídeo em E. coli, - uma cassete de expressão constituída por: (1) por uma sequência de regulação promotora. Podemos utilizar toda a sequência promotora de um gene que se exprima naturalmente na levedura. Preferencialmente, é utilizado o promotor do gene Mfal de S. cerevisiae. (2) por uma sequência que codifica um peptídeo sinal (ou prepeptídeo) em associação com um peptídeo de endereçamento (ou propeptídeo). Estas regiões são importantes para a secreção correcta do peptídeo. Preferencialmente, utilizamos a sequência que codifica o pré-pro-peptídeo do precursor do factor Mfal. (3) por uma sequência de regulação terminadora ou de poliadenilação. Preferencialmente, utilizamos o terminador da fosfoglicerato quinase (PGK) de S. cerevisiae. Na cassete de expressão, a sequência que codifica a heliomicina é inserida a jusante da sequência pre-pro e a montante do terminador da PGK.

Estes elementos têm sido descritos em várias publicações como por exemplo em Reichhart et al., 1992, Invert. Reprod. Dev., 21, pp 15-24 e Michaut et al., 1996, FEBS Letters, 395, pp 6-10.

De maneira preferencial, as leveduras da espécie S. cerevisiae com o plasmídeo de expressão são transformadas pelo método de acetato de litio (Ito et al., 1993, J. Bacteriol, 153, pp 163 — 168) . As leveduras transformadas são seleccionadas sobre um meio de géis de agarose selectivo que não contêm uracil. A produção 13 em massa das leveduras transformadas é realizada por meio de um cultivo entre 24 horas e 48 horas num meio liquido selectivo. A transformação dos microrganismos permite produzir a heliomicina em maior escala. Portanto, a presente invenção refere-se igualmente a um método para a preparação da heliomicina, compreendendo este método as etapas de cultivo de um microrganismo transformado que compreende um gene como o acima definido que codifica a heliomicina num meio de cultivo apropriado, após a extracção e a purificação total ou parcial da heliomicina obtida.

De maneira preferida, no momento da extracção da heliomicina produzida pelas leveduras, estas são eliminada por centrifugação e o sobrenadante do cultivo é posto em contacto com uma solução ácida que pode ser uma solução de um ácido inorgânico ou orgânico como por exemplo o ácido clorídrico ou o ácido acético. 0 extracto obtido é seguidamente centrifugado a frio a uma velocidade de 4000 a 10.000 rpm a 4°C durante 30 a 60 minutos. A purificação da heliomicina pode ser precedida por uma etapa de fraccionamento do sobrenadante obtido depois da etapa de extracção. De maneira preferida, durante a etapa de fraccionamento, o extracto é depositado sobre a fase inversa para realizar uma extracção em fase sólida. A lavagem das moléculas solúveis na água é efectuada com uma solução ácida diluída e a eluição das moléculas hidrófobas com um eluente apropriado. Foram obtidos bons resultados com o ácido trifluoroacético para a lavagem e um eluente contendo quantidades crescentes de acetonitrilo numa solução ácida diluída.

De maneira preferida a purificação da heliomicina foi efectuada

em dois tempos: uma HPLC de troca catiónica seguida de uma HPLC de fase inversa com um eluente aceitável que pode ser diferente ou igual ao da fase anterior. Após as diferentes etapas da 14 purificação foi executado um teste de inibição do crescimento fúngico no meio liquido. Preferencialmente, o teste é efectuado com o fungo Neurospora crassa. A sequência da heliomicina produzida pelas leveduras transformadas é analisada de acordo com o método de sequenciação por degradação de Edman e com a espectrometria de massas. A caracterização estrutural é directamente realizada sobre o peptídeo produzido, sobre o peptídeo modificado por redução/alquilação assim como sobre os fragmentos do peptideo. A sequência peptidica e a massa molecular da heliomicina produzida foram comparadas com as da heliomicina nativa extraída da hemolinfa de H. virescens. Os resultados mostraram que as duas moléculas apresentavam a mesma estrutura primária. A determinação da posição das pontes de dissulfureto indica que a disposição das pontes de dissulfuretios é igual nos dois peptideos, o nativo e o produzido pelo microrganismo transformado.

Mais particularmente, a invenção refere-se à transformação das plantas. Como sequência da regulação promotora nas plantas, pode ser utilizada qualquer sequência promotora de um gene que se expresse de forma natural nas plantas em particular um promotor de origem bacteriano, virai ou vegetal como, por exemplo, o de um gene da sub-unidade pequena de ribulose biscarboxilase/oxigenasa (RuBisCO) ou de um gene de virus de planta como, por exemplo, o do mosaico da couve-flor (CAMV 19S ou 35S), ou um promotor induzivel para os patogénicos como o PR-la do tabaco, pode ser utilizado qualquer promotor apropriado conhecido. Preferencialmente recorrer-se-á a uma sequência de regulação promotora que favoreça a sobreexpressão da sequência codificante de maneira constitutiva ou induzida pelo ataque de um patógeno, como por exemplo, aquela que inclui pelo menos um promotor de histona como o descrito no Pedido de Patente Europeia EP 0 507 698. 15

De acordo com a invenção, poderá ser igualmente utilizada, associada à sequência de regulação promotora, outras sequências de regulação, que estão situadas entre o promotor e a sequência codificante, como os activadores da transcrição ("enhancer"), como por exemplo o activador da translação do virus do mosaico do tabaco (TMV) descrito no Pedido de Patente WO 87/07644, ou do virus etch do tabaco (TEV) descrito por Carrington & Freed.

Como sequência da regulação terminadora ou da poliadenilação, pode ser utilizada qualquer sequência correspondente de origem bacteriana, como por exemplo o terminador nos de Agrobacterium tumefaciens, ou ainda de origem vegetal, como por exemplo um terminador de histona como o descrito no Pedido de Patente europeia EP 0 633 317.

De acordo com a presente invenção, o gene quimérico pode igualmente ser associado a um marcador de selecção adaptado ao organismo hospedeiro transformado. Estes marcadores de selecção são bem conhecidos dos técnicos especializados. Poderá tratar-se de um gene de resistência aos antibióticos, ou ainda de um gene de tolerância aos herbicidas das plantas. A presente invenção refere-se igualmente a um vector de clonagem ou de expressão para a transformação de um organismo hospedeiro que contém pelo menos um gene quimérico como o acima definido. Além do gene quimérico anterior este vector compreende ainda pelo menos uma origem de replicação. Este vector pode estar constituído por um plasmídeo, um cosmídeo, um bacteriófago ou um vírus, transformados pela introdução do gene quimérico de acordo com a invenção. Estes vectores de transformação em função do organismo hospedeiro a transformar são bem conhecidos dos técnicos especializados e estão largamente descritos na bibliografia. 16

Para a transformação das células vegetais ou das plantas, tratar-se-á particularmente um virus que possa ser empregue na transformação das plantas desenvolvidas e que por outro lado contenha os seus próprios elementos de replicação e de expressão. De maneira preferencial, o vector de transformação das células vegetais ou das plantas de acordo com a invenção é um plasmideo. A invenção tem de novo como objectivo um método para a transformação dos organismos hospedeiros, em particular células vegetais por integração de pelo menos um fragmento do ácido nucleico ou um gene quimérico tal e como foi acima definido, a transformação pode ser obtida por qualquer meio conhecido apropriado, largamente descrito na bibliografia especializada e particularmente as referências citadas neste Pedido de Invenção, de uma forma mais particular pelo vector de acordo com a invenção.

Uma série de métodos consiste em bombardear as células, dos protoplastos ou dos tecidos com partículas nas quais as sequências de ADN foram engatadas. Outra série de métodos consiste em utilizar como meio de transferência na planta um gene quimérico inserido num plasmideo Ti de Agrobacterium tumefaciens ou Ri de Agrobacterium rhizogenes.

Podem ser utilizados outros métodos como por exemplo a micro-injecção ou a electroporação, ou ainda a precipitação directa por meio de PEG. 0 técnico especializado escolherá o método adequado em função da natureza do organismo hospedeiro, em particular da célula vegetal ou da planta. A presente invenção tem ainda como objectivo os organismos hospedeiros, em particular as células vegetais ou plantas, transformadas e que contêm uma quantidade eficaz de um gene 17 quimérico que compreende uma sequência codificante da heliomicina acima definida. A presente invenção tem ainda como objectivo as plantas que contêm as células transformadas, em particular as plantas regeneradas a partir das células transformadas. A regeneração é obtida por qualquer método apropriado que dependa da natureza da espécie, como o por exemplo descrito nas referências anteriores.

Para os métodos de transformação das células vegetais e de regeneração das plantas, citaremos particularmente os seguintes Pedidos de Patentes: US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073 , EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4, 945, 050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 e WO 95/06128 • A presente invenção refere-se igualmente às plantas transformadas provenientes do cultivo e/ou do cruzamento das plantas acima regeneradas, assim como às sementes das plantas transformadas, que contêm os ácidos nucleicos e os genes quiméricos de acordo com a invenção.

As plantas transformadas desta forma são resistentes a certas doenças, em particular a certas doenças fúngicas ou bacterianas. E assim, a sequência de ADN que codifica a heliomicina pode ser integrada tendo como objectivo principal a realização de plantas resistentes às ditas doenças, sendo a heliomicina eficaz contra doenças fúngicas como por exemplo aquelas provocadas por Cercospora, em particular Cercospora beticola, Cladosporium em particular Cladosporium herbarum, Fusarium, em particular Fusarium culmorum ou Fusarium graminearum, ou por Phytophthora, em particular Phytophtora cinnamomi . 18 0 gene quimérico poderá compreender igualmente e de maneira vantajosa pelo menos um marcador de selecção, como um ou vários genes de tolerância aos herbicidas. A sequência de adn que codifica a heliomicina pode igualmente ser integrada como marcador da selecção no momento da transformação das plantas com outras sequências que codificam outros peptideos ou proteinas de interesse, como por exemplo os genes de tolerância aos herbicidas.

Estes genes de tolerância aos herbicidas são bem conhecidos do técnico especializado e estão particularmente descritos nos Pedidos de Patente EP 115 673, WO 87/04181, EP 337 899, WO 96/38567 ou WO 97/04103.

Naturalmente, as células e plantas transformadas de acordo com a invenção além da sequência que codifica a heliomicina, podem compreender outras sequências heterólogas que codificam as proteinas de interesse assim como outros peptideos complementares susceptiveis de conferir à planta resistência a outras doenças de origem bacteriano ou fúngico, e/ou outras sequências que codificam as proteinas de tolerância aos herbicidas e/ou outras sequências que codificam as proteínas de resistência aos insectos, como particularmente as proteínas st.

As outras sequências podem ser integradas por meio do mesmo vector que compreende um gene quimérico, o qual compreende uma primeira sequência que codifica a heliomicina e pelo menos outra sequência que codifica outro peptídeo ou proteína de interesse.

Estas podem igualmente ser integradas por meio de outro vector que pelo menos compreenda a dita outra sequência, de acordo com as técnicas habituais acima definidas. 19

As plantas de acordo com a invenção podem ainda ser obtidas pelo cruzamento das originais, uma transportando o gene de acordo com a invenção que codifica a heliomicina, outra transportando um gene que pelo menos codifica outro peptideo ou proteína de interesse.

Entre as sequências que codificam outros peptídeos anti-fúngicos, podem ser citadas aquelas que codificam a drosomicina, descrita no Pedido de Patente francesa FR 2 725 992 e por Fehlbaum & coll. (1994), e no Pedido de Patente francesa FR 97 09115, não publicada, depositada em 24 de Julho de 1997, ou aquela que codifica a androctonina descrita no Pedido de Patente francesa FR 2 745 004 e no Pedido de Patente francesa FR 97 10362, não publicada, depositada em 20 de Agosto de 1997.

Por último, a presente invenção refere-se a um método de cultivo das plantas transformadas de acordo com a invenção, consistindo este método em plantar as sementes das ditas plantas transformadas numa superfície de um campo adequado para o cultivo das ditas plantas, em aplicar sobre a dita superfície do dito campo uma composição agroquímica, sem afectar de maneira substancial as ditas sementes ou as ditas plantas transformadas, seguidamente recolher as plantas cultivadas quando estas atingem a maturidade desejada e eventualmente em separar as sementes das plantas colhidas.

De acordo com a invenção, por composição agroquímica, entender-se-á qualquer composição agroquímica que pelo menos compreenda um produto activo com uma das seguintes actividades: herbicida, fungicida, bactericida, virai ou insecticida.

De acordo com um modo preferencial de realizar o método de cultivo de acordo com a invenção, a composição agroquímica pelo menos compreenderá um produto activo com pelo menos uma actividade fungicida e/ou bactericida, apresentando mais 20 preferencialmente uma actividade complementar à da heliomicina produzida pelas plantas transformadas de acordo com a invenção.

De acordo com a invenção, por produto que apresenta uma actividade complementar à da heliomicina, entender-se-á um produto com um espectro de actividade complementar, isto é um produto que será activo contra os ataques de contaminantes (fungos, bactérias ou virus) insensíveis à heliomicina, ou ainda um produto cujo espectro de actividade se sobreponha ao da heliomicina, total ou parcialmente, e cuja dose de aplicação será diminuída de maneira substancial devido à presença da heliomicina produzida pelas plantas transformadas.

Os exemplos à continuação permitem ilustrar a presente invenção, sem no entanto a limitar.

Exemplo I: isolamento e caracterização da heliomicina a partir da hemolinfa retirada das larvas imunizadas do lepidóptero H. virescens

Exemplo I.1: isolamento 1-1 Indução da síntese biológica de uma substância antifúngica na hemolinfa de H. virescens

As larvas maduras de 5o nível do lepidóptero H. virescens foram imunizadas com a ajuda de uma agulha (30 ga) previamente mergulhada num concentrado de bactérias Gram positivas (M. luteus) e Gram negativas (E. coli 1106) preparadas a partir de culturas realizadas num meio de Luria-Bertani durante 12 horas a 37 °C. Os animais infectados deste modo foram conservados individualmente em tubos contendo um meio nutritivo à base de agar durante 24 horas entre 20°C e 23°C. Antes da extracção da hemolinfa as larvas foram arrefecidas sobre gelo. 21 1-2 Preparação do plasma A hemolinfa (aproximadamente 30 μΐ por larva) foi recolhida por excisão de um apêndice abdominal e recolhida em tubos de microcentrifugação em polipropileno de 1,5 ml arrefecidos em gelo e contendo aprotinina como inibidor das proteases (20μρ/πι1 em concentração final) e a feniltiouréia como inibidor da melanização (concentração final de 20μΜ. A hemolinfa (2 ml) colhida deste modo a partir das larvas imunizadas foram centrifugadas a 14000 g durante 1 minuto a 4°C com o fim de retirar os hemócitos. A hemolinfa que não está provida com as células sanguíneas foi conservada a -20°C até a sua utilização. 1-3 Acedificação do plasma

Após uma descongelação rápida, o plasma de H. virescens foi acedificado até pH 3 com uma solução de ácido trifluoroacético a 1%. A extracção com a condição ácida do peptídeo foi realizada durante 30 minutos sob agitação ligeira num banho de água gelada. O extracto obtido foi seguidamente centrifugado a 4°C durante 30 minutos a 10 000 g. 1-4 purificação dos peptídeos a) Pré-purificação por extracção na fase sólida

Uma quantidade de extracto equivalente a 2ml de hemolinfa foi depositada num suporte de fase invertida, como a comercializada sob a forma de cartucho (Sep-Pak™ C18, Waters Associates), equilibrada com água acedificada (TFA 0,05%). As moléculas hidrófilas foram eliminadas com uma simples lavagem com água acedificada. A eluição do peptídeo foi realizada por uma solução de acetonitrilo a 40% preparada em TF A 0,05%. A fracção eluída a 40% de acetonitrilo foi seca em vácuo com o objectivo de eliminar o acetonitrilo e o tfa, após o qual foi reconstituída 22 em água ultrapura estéril antes de ser submetida à primeira etapa de purificação. b) purificação por cromatografia liquida de alta resolução (HPLC) sobre coluna de fase invertida - primeira etapa: a fracção contendo o peptídeo foi analisada por cromatografia de fase invertida sobre uma coluna semipreparativa Aquapore RP-300 C8 (Brownlee™, 220 X 70 mm, 300 Â), a eluição foi realizada por um gradiente linear de acetonitrilo de 2 a 60% no TF A 0.05% durante 120 minutos a um débito constante de 1,5ml/minuto. As fracções foram colhidas manualmente de acordo com a variação da absorbância a 225 nm e 254 nm. As fracções colhidas foram secas em vácuo, reconstituídas com água ultrapura e analisadas para sua actividade antifúngica utilizando o teste acima descrito. segunda etapa: a fracção antifúngica correspondente ao peptídeo foi analisada sobre uma coluna analítica de fase invertida Aquapore RP-300 C8 (Brownlee™, 220 x 4,6 mm; 300 Á), utilizando um gradiente linear difásico de acetonitrilo de 2% a 22% em 10 minutos e de 22 a 32% em 50 minutos em TFA 0,05% com um débito constante de 0,8 ml/minuto. As fracções foram colhidas manualmente de acordo com a variação da absorbância a 225 nm e 254 nm. As fracções colhidas foram secas em vácuo, reconstituídas com água ultrapura e analisadas para a sua actividade antifúngica nas condições acima descritas. - terceira etapa: a fracção antifúngica contendo o peptídeo foi purificada até à sua homogeneidade numa coluna de fase invertida Narrowbore Delta-Pak™ HPICi8 (Wafers Associates, 150 x 2,2 mm) utilizando um gradiente linear difásico de acetonitrilo de 2% a 24% em 10 minutos e de 24% a 44% em 100 minutos em TFA 0,05% com um débito constante de 0,25 ml/minutos a uma temperatura controlada de 30°C. As fracções foram colhidas manualmente de 23 acordo com a variação da absorbância a 225 nm. As fracções colhidas foram secas em vácuo, reconstituídas com água ultrapura filtrada e analisadas para a sua actividade antifúngica.

Exemplo 1.2: caracterização estrutural do peptídeo 2-1 Verificação da pureza por electrofórese capilar de zona A pureza do peptídeo antifúngico foi verificada por electrofórese capilar de zona num modelo 270-HT (PfiApplied Biosystems division de Perkin Elmer). lnl de uma solução a 50μΜ de peptídeo purificado foi injectada sob assistência em vácuo num capilar de sílica (72 cm x 50 μηι) e a análise foi realizada em tampão citrato 20 mM a pH 2,5. A electrofórese foi realizada a 20 kv do ânodo ao cátodo durante 20 minutos a 30°C. A migração foi registada a 200 nm. 2-2 Determinação do número de cisteínas: redução e S-piridiletilação O número de resíduos cisteína foi determinado sobre o peptídeo nativo por redução e S-piridiletilação. 100 pmoles de peptídeo nativo foram reduzidos em 40 μΐ de tampão Tris/HCl 0,5 M, pH 7,5 contendo 2 mM JFDTA e 6 M de cloreto de guanidina em presença de 2 μΐ de ditiotreitol 2.2 Μ o meio reactivo foi colocado sob uma atmosfera de nitrogénio. Após 60 minutos de incubação às escuras, 2 μΐ de 4-vinilpiridina destilada no momento foram adicionadas à reacção que foi seguidamente incubada durante 10 minutos a 45°C às escuras e sob uma atmosfera de nitrogénio. O peptídeo piridiletilado foi seguidamente separado dos componentes do meio reactivo por cromatografia de fase invertida utilizando um gradiente linear de acetonitrilo em presença de TFA 0,05%. 24 2-3 Determinação da massa do peptídeo nativo, do peptideo S-piridiletilado e dos fragmentos de protólise por espectrometria de massas MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight)

As medidas de massas foram efectuadas num espectrómetro de massas MALDI-TOF Bruker Biflex (Bremem, Alemanha) num modo linear positivo. Os espectros de massas foram calibrados de maneira externa com uma mistura Standard de peptideos de m/z conhecidas, respectivamente 2199.5 Da, 3046.4 Da e 4890.5 Da. Os diferentes produtos para analisar foram depositados sobre uma camada fina de cristais de ácido oc-eyano-4-hidroxicinâmico obtida por uma evaporação rápida de uma solução saturada na acetona. Depois da secagem sob um ligeiro vácuo, as amostras foram lavadas por uma gota de ácido trifluoroacético a 0,1% antes de serem introduzidas no espectrómetro de massas. 2-4 Sequenciação por degradação de Edman A sequenciação automática por degradação de Edman do peptídeo inicial, do peptideo S-piridiletilado e dos diferentes fragmentos obtidos depois das diferentes clivagens proteoliticas e da detecção, os derivados fenil-tio-hidantoinas foram realizados num sequenciador ABI473A (PFApplied Biosystems divison de Perkin Helmer). 2-5 Clivagens proteoliticas - Confirmação da sequência peptídica na região C-terminal 200 pmoles de peptideo reduzido e S-piridiletilado foram incubados na presença de 5 pmoles de endoproteinase-Lys-C (Achromobacter protease 1, clivagem especifica dos residuos lisina do lado C-terminal, Takara. Otsu) de acordo com as condições recomendadas pelo provedor (Tris HC1 10 mM pH 9 na 25 presença de Tweem 20 a 0,01%). Depois de parar a reacçao com tfa 1%, os fragmentos peptídicos foram separados por HPLC em fase invertida sobre uma coluna do tipo Narrowbore Delta-Pak™ HPICis (Waters Associates, 150 x 2 mm) num gradiente linear de acetonitrilo de 2 a 60% em 80 minutos em TFA 0,05% com um débito de 0,2 ml/minuto e a uma temperatura constante de 37 °C. Os fragmentos obtidos foram analisados por espectrometria de massas MALDI-TOF e o peptideo correspondente ao fragmento C-terminal foi sequenciado por degradação de Edman. - Determinação da disposição das pontes dissulfureto por proteólise na termolisina O peptideo nativo (8 μg) foi incubado durante 1 hora na presença de 4 μρ de termolisina (Boehringer Manheim, rácio termolisina/peptideo, 1/2 em peso:peso) a 37°C no tampão MES (N-etilmorfolina) 0,1 M a pH 7 na presença de 2 mM de CaC12. A reacção foi detida com a adição de ácido fórmico e os produtos da reacção foram imediatamente separados por cromatografia de fase invertida sobre uma coluna Narrowbore Delta-Pak™ HPICis (Waters Associates; 150 x 2,2 mm) num gradiente linear de acetonitrilo de 2 a 50% em 100 minutos no caso da TFA 0,05% com um débito de 0,2 ml/minutos a 30°C precedida por uma etapa isocrática a 2 % de acetonitrilo durante 10 minutos. Os fragmentos obtidos foram analisados por espectrometria de massas MALDI-TOF e sequenciados por degradação de Edman.

Exemplo II: expressão da heliomicina na levedura Saccharomyces cerevisiae

Todas as técnicas utilizadas à continuação são as técnicas Standard de laboratório. Os protocolos detalhados destas técnicas foram particularmente descritos por Ausubel et al.

Exemplo Il-l Ligação do gene sintético 26 A ligação foi realizada a partir de 6 oligonucleotídeos sintéticos que codificam os 44 aminoácidos da heliomicina precedidos pelos 5 aminoácidos C-terminais da pré-pró-sequência do factor a (Mfal) da levedura. Os oligonucleotídeos representados na figura 1 foram escolhidos, tendo em consideração os codões preferenciais utilizados por S. cerevisiae. A ligação foi desenvolvida em várias etapas: os oligonucleotídeos 2 a 5 foram fosforilados nas suas extremidades 5' por acção do polinucleotídeo quinase (New England Biolabs); - os oligonucleotídeos 1 a 6 foram misturados, aquecidos a 100°C e hibridizados por diminuição lenta da temperatura a 25°C durante 3 horas; os oligonucleotídeos hibridizados foram submetidos a um tratamento pela ligase do bacteriófago T4 (New England Biolabs) durante 15 horas a 15°C; - o bloco de ADN resultante da hibridação dos oligonucleotídeos está representado na figura 1, delimitado pelos sítios de restrição HinDIII e BglII, foi inserido no plasmídeo pBluescript SK+ (Stratagène) digerido pelas enzimas HinDIII e BamHI (BglII e BamHl são compatíveis). A mistura da ligação foi seguidamente utilizada para transformar as células competentes de E. coli DH50C. (Stratagène) . Vários clones foram analisados e sequenciados. Um destes clones que apresentava a sequência buscada foi denominado pSEAl.

Exemplo II-2: Construção do vector pSEA2 que permite a secreção da heliomicina sintetizada 27 0 fragmento de ADN HinDIII-SalI do vector pSEAl, que transporta a sequência que codifica a heliomicina assim como o fragmento Sphl-HinDIII do vector M13JM132 (Michaut et al., 1985, FEBS Letters, 395, pp 6-10) foram inseridos entre os sítios Sphl e Sall do plasmídeo pTG4812 (Michaut et al., 1996, FEBS Letters, 395, pp 6-10). O fragmento Sphl-HinDIII do vector M13JM132 contém a sequência do promotor do gene MFal da levedura assim como a sequência que codifica a região pré-pró do factor MFal. No plasmídeo resultante, pSEA2, o gene sintético da heliomicina está portanto inserido nas sequências pré-pró do factor Mfal e no terminador de transcrição; esta construção deve portanto assegurar a maduração e a secreção da heliomicina.

Exemplo II-3: transformação de uma estirpe de 5. cerevisiae pelo ADN do plasmídeo pSEA2 e análise dos transformantes A estirpe de levedura TGY 48.1 (MATa, ura3-D5,his,pral,prbl, prcl, cpsl; Reichhart et al., 1992; Invert. Reprod. Dev. 21, pp 15-24) foi transformada pelo plasmídeo pSEA2. Os transformantes foram seleccionados a 29°C sobre um meio selectivo YNBG (0,67% yeast nitrogen base, 2% glicose), completado com 0,5% de casamino ácidos e que não contém uracil. Após a transformação, vários clones de leveduras, seleccionadas para o carácter ura+, foram postos em culturas durante 48 horas a 29°C em 50 ml de meio selectivo. Depois da centrifugação (4000 g, 30 minutos, 4°C), o sobrenadante foi acedificado até pH 3,5 com o ácido acético, antes de ser depositado sobre um cartucho Sep-Pak™ Ci8, (Waters Associates) equilibrado com água acedificada (TFA 0,05%). As diferentes proteínas fixadas sobre o cartucho foram eluídas pelas soluções de TFA 0, 05% contendo percentagens crescentes de acetonitrilo. A fracção 40%, que apresentava uma actividade antifúngica, foi analisada em HPLC sobre uma coluna analítica de fase invertida Aquapore RP-300 C8 (Brownlee™. 220 x 4.6 mm, 300 À), utilizando 28 um gradiente linear de acetonitrilo de 2% a 40% em 80 minutos no TFA 0,05% com um débito constante de 0,8 ml/minuto. As fracções foram colhidas manualmente de acordo com a variação da absorbância a 225 nm e 254 nm. As fracções colhidas foram secas em vácuo, reconstituídas com água ultrapura e analisadas para sua actividade antifúngica nas condições descritas no exemplo III. A caracterização estrutural do peptideo foi realizada como a descrita no exemplo 1.2.

Exemplo II-4: Produção de heliomicina recombinante à escala semi-preparativa

Um dos clones da levedura transformada que expressa a heliomicina foi cultivado a 29°C durante 24 horas em 100 ml de meio selectivo. Esta pré-cultura foi seguidamente utilizada para inocular 4 1 de meio selectivo e o cultivo foi realizado durante 48 horas a 29°C. As leveduras foram eliminadas por centrifugação (4000 g, 30 minutos 4°C). O sobrenadante foi acedificado até pH 3,5 com ácido acético, submetido a uma segunda centrifugação (4000 g, 30 minutos, 4°C) antes de ser depositado sobre uma coluna aberta de fase invertida preparativa Cie (Waters Associates); 125 Â, 6 g de fase para 500 ml de sobrenadante) equilibrado com água acedificada (TFA 0,05%). As moléculas hidrófilas foram eliminadas com uma lavagem com água acedificada seguida de uma lavagem com uma solução de acetonitrilo a 15% preparada em TFA 0,05%. A eluição do peptideo foi realizada por uma solução de acetonitrilo a 40% preparada em TFA 0,05%. A fracção eluida a 40% de acetonitrilo foi liofilizada e seguidamente reconstituída em água ultrapura estéril antes de ser submetida à primeira etapa de purificação. - primeira etapa de purificação por HPLC: a fracção pré-purificada que continha a heliomicina foi reconstituída numa solução de acetato de amónio a 25 mM, pH 3,4. Esta amostra foi injectada sobre uma coluna preparativa de troca catiónica 29

Aquapore Cation Exchange (Brownlee™, 250 x 10 mm) , utilizando um gradiente linear de NaCl de 0% a 100% em 90 minutos em acetato de amónio 25 mM, pH 3,4 com um débito constante de 2 ml/minutos. As fracções colhidas foram secas em vácuo, reconstituídas com água ultrapura e analisadas para sua actividade antifúngica nas condições abaixo descritas. - segunda etapa de purificação por HPLC: a heliomicina foi purificada até à homogeneidade por cromatografia sobre uma coluna de fase invertida semipreparativa Aquapore RP-300 C8 (Brownlee™, 220 x 7 mm, 300 Â), utilizando um gradiente linear de acetonitrilo de 2% a 40% em 80 minutos no TF A 0,05% com um débito constante de 2 ml/minuto.

Exemplo III: prova de actividade in vitro: medida da actividade antifúngica por microespectrofotometria

Esta metodologia foi utilizada para evidenciar as moléculas antifúngicas no decorrer das diferentes etapas de purificação, para a determinação do espectro da actividade do peptídeo e para a determinação da concentração mínima inibitória (CMI) com o qual o peptídeo estava activo. A CMI foi expressa como um intervalo de concentração [a]- [b] onde [a] era a concentração mínima em que foi observada o início de crescimento e [b ] a concentração para a qual não foi observado qualquer crescimento. Exemplos da actividade específica da heliomicina, relativamente aos fungos filamentosos e às leveduras, são dados nos quadros 1 e 2.

Exemplo III-l: Teste da detecção da actividade contra os fungos filamentosos A actividade antifúngica foi detectada por um teste de inibição do crescimento no meio líquido. As esporas dos fungos a testar foram colocadas em suspensão num meio de cultivo do tipo 30 batata-glicose". Preferencialmente, foi utilizado 12 g de meio de cultivo batata dextrose (Difco) para 11 de água desmineralizada. Dois antibióticos foram adicionados no meio da cultura: a tetraciclina (concentração final de 10 μg/ml) e a cefotaxima (100 μg/ml) . Depositamos 10 μΐ de cada fracção para analisar em placas de microtitulação na presença de 90 μΐ de meio de cultura que continha as esporas (a uma concentração final de 104 esporas/ml) . A incubação foi realizada num compartimento húmido a 30°C durante 48 horas. O crescimento fúngico foi observado ao microscópio fotónico após 24 horas e quantificado após 48 horas por medida da absorbância a 600 nm com a ajuda de um leitor espectrofotométrico de placas de microtitulação. - Testes de fungos filamentosos: Aspergillus fumigatus (doados pelo Dr. H. Koenig, Hospital Civil, Estrasburgo); Nectria haematococca, Fusarium culmorum, Trichoderma viride (Micoteca da Universidade Católica de Leuven, Bélgica); Neurospora crassa, Fusarium oxysporum, (Micoteca da Société Clause, Paris).

Seguidamente, os resultados do teste da actividade da heliomicina relativamente aos fungos filamentosos estão descritos no quadro 1.

Quadro 1: actividade da heliomicina relativamente aos fungos filamentosos

Fungos CMI da heliomicina (μΜ) 0,1-0,2 0,2-0,4 1, 5-3 0,4-0,8 1,5-3 6-12,5

Neurospora crassa Fusarium culmorum

Fusarium oxysporum Nectria haematococca

Trichoderma viride

Aspergillus fumigatus 31

Exemplo III-2: Teste da detecção da actividade relativamente às leveduras

As diferentes estirpes da levedura foram postas a incubar num meio de cultura do tipo "Sabouraud" e incubadas a 30' C durante 24 horas sob agitação lenta. A amostra a testar (10 μΐ) foi depositada nos poços de uma placa de microtitulação nos quais foram adicionados 90 μΐ de uma cultura diluída de levedura cuja densidade foi ajustada a DO 600 = 0, 001. O crescimento foi avaliado pela medida da absorbância a 600 nm com a ajuda de um leitor espectrofotométrico de placas de microtitulação. leveduras testadas: Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. inconspicua, Cryptococcus neoformans, Cryp. albidus, Saccharomyces cerevisiae (doadas pelo Dr. H. Koenig, Hospital Civil, Estrasburgo)

Seguidamente, os resultados do teste da actividade da heliomicina relativamente às das leveduras estão descritos no quadro 2.

Quadro 2: actividade da heliomicina relativamente às leveduras Leveduras CMI da heliomicina (μΜ)

Candida albicans 2,5-5 Candida tropicalis 2,5-5 Candida krusei 10-20 Candida inconspicua 5-10 Cryptococcus neoformans 2, 5-5 Cryptococcus albidus 5-10

Estes resultados mostram a excelente actividade antifúngica do peptideo de acordo com a invenção. 32

Exemplo IV: Preparação de uma planta transformada que compreende um gene que codifica a heliomicina

Este exemplo descreve a preparação da sequência que codifica a heliomicina para a sua expressão numa célula vegetal, do gene quimérico, do vector de integração e das plantas transformadas. As figuras de 2 a 6 em anexo descrevem as estruturas esquemáticas de certos plasmideos preparados para a construção dos genes quiméricos. Nestas figuras, os diferentes sítios de restrição estão marcados em itálico.

Todas as técnicas utilizadas à continuação são as técnicas Standard de laboratório. Os protocolos detalhados destas técnicas são particularmente descritos por Ausubel & coll.

Exemplo IV-1: Construção dos genes quiméricos para a transformação das plantas pRPA-MD-P: Criação de um plasmideo que contém o peptídeo sinal do gene PR-loc do tabaco

Os dois oligonucleotídeos sintéticos complementares Oligo 7 e Oligo 8 seguintes, são hibridizados a 65°C durante 5 minutos seguida da diminuição lenta da temperatura até 30°C durante 30'.

Oligo 7; 5 ' gcgtcgaogc gatgggtttc ctgcttttct ctcagcttcc ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3'

Oligo 8: 5 1 TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAftGAA GAAdAGTAOA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3 '

Depois da hibridação entre o Oligo 7 e o Oligo 8, o ADN que se manteve monocatenário serve de matriz para o fragmento klenow da polimerase 1 de E. coli (nas condições Standard recomendadas pelo fabricante (New England Biolabs)) para a criação do oligonucléotido bicatenário a partir da extremidade 3' de cada Oligo. O oligonucleotídeo bicatenário obtido é seguidamente 33 digerido pelas enzimas de restrição Sacii e Nael e clonado no plasmídeo pBS II SK(-) (Stratagene) digerido para as mesmas enzimas de restrição. Assim, é obtido um clone compreendendo a região que codifica o peptideo sinal do gene PR-Ία do tabaco (SEQ ID NO 4) . pRPA-PS-PRlOt-hélio: Criação de uma sequência que codifica a heliomicina fundida no peptideo sinal PR-Ία sem região não transcrita em 3'

Os dois oligonucleotideos sintéticos complementares das sequências Oligo 9 e Oligo 10 de acordo com as condições operativas descritas para pRPA-MD-P.

Oligo 9: 5 f GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTGTGGGGT GCTGTGAACT AÇACTTCCGA TTGCAACGGT GAGTGCAAGA GGAGGGGTTA 3'

OJigo 10: S ‘ ccggaíccgt CGACACGfTC gcctcsccga gctctcaagt CTCGCACCAG CAGTTCACGT TAGCGAAGGA ACCGCAGTGA CCACCCTTGT MCCCCTCCT CTTGCACTC 3'

Depois da hibridação entre o Oligo 9 e o Oligo 10, o ADN que se manteve monocatenário serve de matriz ao fragmento klenow da polimerase 1 de E. coli (nas condições Standard recomendadas pelo fabricante (New England Biolabs)) para a criação do oligonucléotido bicatenário a partir da extremidade 3' de cada Oligo. Este oligonucleotideo bicatenário que contém a parte codificante da heliomicina (SEQ ID NO 2) é seguidamente clonado directamente no plasmídeo pRPA-MD-P que foi digerido com a enzima de restrição Nael. A orientação correcta do clone obtido é verificada pela sequenciação. É assim obtido um clone que compreende a região que codifica a proteína de fusão PR-la-heliomicina situada entre os sítios de restrição Ncol na 34 extremidade N-terminal e Seal, Sacii e BamHi na extremidade exterminai (SEQ ID NO 3). pRPA-RD-239: Criação de um vector de expressão nas plantas que compreendem a sequência que codifica a proteína de fusão PR-la-heliomicina 0 plasmídeo pRTL-2 GUS, derivado do plasmideo pUC-19, foi obtido pelo Dr. Jim Carrington (Texas A&M University, não descrito). Este plasmídeo cuja estrutura esquemática está representada na figura 2, contém o promotor COCMV 35S duplicado isolado do vírus do mosaico da couve-flor (Promotor CaMV 2x35S; Odell & coll., 1985) que dirige a expressão de um ARN que contém a sequência não traduzida em 5' do vírus etch do tabaco (TEV 5' UTR; Carrington & Freed, 1990), o gene da β-glucuronidase de E. coli (GUS Jefferson & coll., 1987) seguido do sitio de poliadenilação do ARN 35S de COMV (COCMV polyA; Odell & coll.; 1985). O plasmídeo pRTL-2 GUS é digerido com as enzimas de restrição Ncol e BamHI e o fragmento grande de ADN é purificado. O plasmídeo pRPA-PS-PRla-hélio é digerido com as enzimas de restrição Ncol e BamHI e o pequeno fragmento de ADN que contém a região que codifica a proteína de fusão PR-la-heliomicina é purificada. Os dois fragmentos de ADN purificados são seguidamente ligados entre si numa cassete de expressão nas plantas que sintetizam uma proteína de fusão PR-la-heliomicina. A estrutura esquemática desta cassete de expressão está representada na figura 3. "PR-la-heliomicina" representa a região que codifica a proteína de fusão PR-la-heliomicina de pRPA-RD-239. A heliomicina é transportada para a matriz extracelular da planta pela acção do peptídeo sinal PR-la. pRPA-RD-195: Criação de um plasmídeo que contém um sítio de clonagem múltipla modificada 35 0 plasmídeo pRPA-RD-195 é um plasmídeo derivado do pUC-19 que contém um sítio de clonagem múltipla modificada. Os oligonucleotídeos sintéticos complementares Oligo 11 e Oligo 12 seguintes, são hibridizados e convertidos em bicatenários de acordo com o método descrito para pRPA-MD-P.

Oligo 3!; 5’ ÃGGGCCCCCT AGOGTTTMA COÇCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCSSTA CCOSQQQWTC CTCTAGAGTC GACCTOCAGO C8T&C 3 ’

Oligo 12: 5' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTOC AGGTCGACTC TAGAGG 3' 0 oligonucleotídeo bicatenário obtido é seguidamente ligado em pUC-19 que tinha sido digerido previamente com as enzimas de restrição EcoRI e HindiII e convertido em extremos redondos utilizando o fragmento klenow da ADN polimerase 1 de E. coli. Foi obtido um vector que contém sítios de clonagem múltipla para facilitar a introdução das cassetes de expressão num vector plasmídeo de Agrobacterium tumefadens. A estrutura esquemática deste espaço de clonagem múltipla está representada na figura 4. nRPA-RD-240: Introdução da cassete de expressão de PR-la- heliomicina de pRPA-RD-239 em pRPA-RD-195 0 plasmídeo pRPA-RD-239 é digerido com a enzima de restrição PstII. 0 fragmento de ADN que contém a cassete de expressão de PR-la-heliomicina é purificado. 0 fragmento purificado é seguidamente ligado em pRPA-RP-195 que tinha sido previamente digerido com a enzima de restrição PstII e desfosforilado com a fosfatase intestinal de vitela. pRPA-RD-174: plasmídeo derivado de pRPA-BL-150A (ep 0 508 909) que contém o gene de tolerância ao bromoxinil de pRPA-BL-237 (EP 0 508 909) O gene de tolerância ao bromoxinil é isolado de pRPA-BL-237 para uma amplificação genética por PCR. O fragmento obtido tem 36 extremidades arredondadas e está clonado no sítio EcoRl de pRPA-BL-150A que tinha sido convertido em extremidades arredondadas pela acção da polimerase klenow em condições Standard. É obtido um vector de Agrobacterium tumefaciens que contém o gene de tolerância ao bromoxinil na proximidade da sua extremidade direita, um gene de tolerância à canamicina na proximidade da sua extremidade esquerda e um sítio de clonagem múltipla entre estes dois genes.

A estrutura esquemática de pRPA-RD-174 está representada na figura 5. Nesta figura, "nos" representa o sítio de poliadenilação da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll, 1983), "NOS pro" representa o promotor da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983), "NPT II" representa o gene da neomicina fosfotransferase do transposão Tn5 de E. coli (Rothstein & coll., 1981), "35S pro" representa o promotor 35S isolado do vírus do mosaico da couve-flor (Odell & coll., 1985), "BRX" representa o gene da nitrilase isolado de K. ozaenae (Stalker & coll., 1988), "RB" e "LB" representam respectivamente as extremidades direita e esquerda da sequência de um plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. pRPA-RD-184: Adição de um novo sítio de restrição, único, em pRPA-RD-174

Os oligonucleotídeos sintéticos complementares Oligo 13 e Oligo 14 seguintes, foram hibridizados e convertidos em bicatenários de acordo com o método descrito para pRPA-MD-P.

Oligo 13; 5' CCfiÇCCAGTC AGGÇCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG 3' 37

Oligo 14: 5' CCGGCCTGAA CMA33TACTC AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTACGCC '.hCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTCGCCTGAC ΤΊ3 31 0 oligonucleotídeo bicatenário hibridizado (95 pares de bases) é purificado depois da separação sobre um gel de agarose (3% Nusieve, FMC). 0 plasmídeo pRPA-RD-174 é digerido com a enzima de restrição Xmal e o fragmento grande de ADN é purificado. Os dois fragmentos de adn obtidos são seguidamente ligados.

Foi obtido um plasmideo derivado de pRPA-RD-174 que compreende outros sítios de restrição entre o gene de tolerância ao bromoxinil e o gene da canamicina marcador da selecção. A estrutura esquemática do plasmídeo pRPA-RD-184 está representado na figura 6 onde os termos "nos". "NPT II". "NOS pro", "35S pro", "BRX gene", "RB" e "LB" têm o mesmo significado que os da figura 5. pRPA-RD-241: Criação de um vector de Agrobacterium tumefaciens que contém a construção do gene que codifica a heliomicina dirigida pela matriz extracelular. 0 plasmídeo pRPA-RD-240 é digerido com as enzimas de restrição Sfill e Asei e o fragmento de ADN que contém o gene de PR-loc-heliomicina é purificado. 0 plasmídeo pRPA-RD-184 é digerido com as mesmas enzimas de restrição. 0 fragmento de ADN que contém a cassete de expressão de PR-la-heliomicina é seguidamente ligada em pRPA-RD-184. Deste modo foi obtido um vector de Agrobacterium tumefaciens que contém a sequência que codifica a proteína de fusão PR-la-heliomicina que conduz à expressão da heliomicina na matriz extracelular da planta. 38

Exemplo IV - 2 Criação de uma cassete de expressão promotor CsVMV - peptídeo sinal PG1 -heliomicina - terminador Nos pRPA - NP4: Criação de um plasmideo que contém o peptídeo sinal do gene PG1 de poligalacturonase de milho (Genbank, acesso na X57627)

Os dois oligonucleotídeos sintéticos parcialmente complementares Oligo 13 e Oligo 14 seguidamente foram hibridizados a 65°C durante 5 minutos seguida pela diminuição lenta da temperatura a 30°C durante 30 minutos.

Oligo 15: 5' GGTCTAGAAT GGCCTgCACC aacaacgcca tgagggccct CTTCCTCCTC 3'

Oligo 16 : 5' CCGAATTCGG CGCCGTGCAC GATGCAGAAG AGCACGAGGA GGAAGAGGGC 3'

Depois da hibridação entre o Oligo 13 e o Oligo 14, o ADN que se manteve monocatenário serviu de matriz ao fragmento Klenow da polimerase 1 de E. coli (nas condições Standard recomendadas pelo fabricante (New England Biolabs) para a criação do oligonucleotideo bicatenário a partir da extremidade 3' de cada Oligo. O oligonucleotideo bicatenário obtido é seguidamente digerido pelas enzimas de restrição Xbal e EcoRI, depois clonado no plasmideo pBS II SK(-) (Stratagene) digerido pelas mesmas enzimas de restrição. Assim foi obtido um clone que continha a região que codifica os 22 aminoácidos do peptídeo sinal do gene PG1, e que pode ser fundido no quadro de leitura de outras proteínas a nível do sítio Sfoi (SEQ ID NO 15). pRPA - NP5: Criação de uma sequência que codifica a heliomicina fundida com o peptídeo sinal do gene PG1 A região que codifica a heliomicina foi amplificada por PCR a partir do clone pRPA - PS - PRla - hélio (SEQ ID NO 3) com a 39 enzima termoestável Pfu (Stratagene) de acordo com as condições Standard recomendadas pelo fabricante. Os oligonucleotídeos sintéticos utilizados para esta amplificação são:

Oligo 17: 5' GATAAGCHA TCGGTTCCTG CGTG 3'

Oligol?: y G5CTCGAGTC AAGTCTCGCA CCAGCAGTTC AC 3' O produto da PCR foi digerida pela enzima de restrição Xhol e clonado no vector pRPA - NP4 digerida pelas enzimas de restrição Sfol e Xhol. Assim, o clone resultante compreende a região que codifica o peptideo sinal do gene PG1 fundido no mesmo quadro de leitura com a sequência que codifica a heliomicina (SEQ ID NO 18) . pRPA - NP6: Criação de uma cassete de expressão da heliomicina num vector de transformação 0 vector de expressão e de transformação plLTAB 357 é derivado do vector binário pBinl9. Ele contém o promotor CsVMV (Verdaguer et al. 1996, Plant Mol. Biol. 31, 1129-1139) seguido de um sitio múltiplo de clonagem e do terminador de transcrição Nos da nopalina sintase (figura X+l). A sequência deste fragmento está indicada (SEQ ID NO 19). O vector de expressão da heliomicina foi obtido pela inserção do fragmento de restrição Xbal-Kpnl do vector pRPA - NP5 que contém a fusão do peptideo sinal PG1 - heliomicina no vector plLTAB 357 digerido por estas mesmas enzimas. Assim, o clone resultante compreende a cassete de expressão promotor CsVMV - peptideo sinal PG 1 - heliomicina - terminador Nos (SEQ ID NO 20).

Exemplo IV-3: Preparação de tabacos transformados 3.1- Transformação 40

Os vectores pRPA-RD-241 ou pRPA-ΝΡβ são introduzidos na estirpe de Agrobacterium tumefaciens EHA101 ou EHA105 (Hood & coll., 1987) portadora do cosmideo pTVK291 (Komari & coll., 1986). A técnica de transformação está baseada no método de Horsh & coll. (1985) . 3.2- Regeneração A regeneração do tabaco PBD6 (procedência SEITA França) a partir das explantas foliares foi realizada sobre um meio básico Murashige e Skoog (MS) que compreende 30 g/1 de sacarose assim como 200 μρ/ηιΐ de canamicina. As explantas foliares foram retiradas das plantas cultivadas em estufa ou in vitro e regeneradas de acordo com a técnica dos discos foliares (Horsh & coll., 1985) em três etapas sucessivas: a primeira etapa compreendeu a indução dos rebentos sobre um meio adicionado de 30 g/1 de sacarose que continha 0,05 mg/1 de ácido naftilacético (ANA) e 2 mg/1 de benzilaminopurina (BAP) durante 15 dias. Os rebentos formados durante esta etapa foram seguidamente desenvolvidos durante 10 dias por cultura num meio MS adicionado de 30 g/1 de sacarose mas que não continham hormonas.

Seguidamente os rebentos desenvolvidos foram retirados e foram cultivados num meio de enraizamento MS com teor médio em sais, vitaminas e açúcar e que não continha hormonas. Ao fim de 15 dias aproximadamente os rebentos com raízes foram colocados na terra. 3.3- Análise da expressão da heliomicina no tabaco transgénico a) Produção de anticorpos policlonais específicos

Os anticorpos policlonais foram obtidos por imunização de um coelho com heliomicina nativa de acordo com os métodos habituais do Centro de Bioexperimentação VALBEX (IUT A - Lyon I) . O soro obtido (15 ml) foi seguidamente imunopurificado numa coluna de 41

Sepharose 4B (Pharmacia; Ref 17-0430-01) acoplada à heliomicina para seleccionar especificamente as imunoglobulinas que reconhecem este peptídeo. Estes anticorpos foram finalmente eluidos em 6 ml de glicina (200mM; pH3), neutralizados com IM Tris pH 9,5, dializados com 0,5 x PBS, e conservados congelados a -20°C até à sua utilização. b) imunodetecção da heliomicina no tabaco transgénico A análise da expressão da heliomicina foi conduzida em 8 plantas transgénicas para a construção de pRPA-NP6, assim como sobre um controlo selvagem. Algumas folhas de tabaco que se desenvolveram bem na estufa foram trituradas muito finas à temperatura do nitrogénio liquido, e as proteínas foram extraídas durante lhora a 4°C no tampão Tris-HCl 50mM, PVP25 1%, 0,05% Triton x 100, pH 7,5 com um rácio de 4ml de tampão por grama de peso em fresco. Depois da centrifugação, a concentração das proteínas do sobrenadante foi determinada pelo método de Bradford.

Cinco microgramos de proteínas de cada um dos 9 extractos foram depositados sobre a membrana de nitrocelulose sobre um formato "slot-blot", assim como uma quantidade de 50 ng de heliomicina pura que serve de controlo positivo. A membrana foi incubada durante lhora num tampão de bloqueio a 1% (Boehringer; Ref 1 921 673) em TBS, incubada seguidamente durante a noite a 4°C com os anticorpos imunopurifiçados dirigidos contra a heliomicina diluídos em 1/2000 no tampão TBS com 0,05% Tween20. Depois da lavagem (TBS, 0,1 Tween20 e 0,5% de tampão de bloqueio), a membrana foi incubada durante lhora à temperatura ambiente (TBS com 0,5% tampão de bloqueio) com um anticorpo de cabra (diluído a 1/50000) dirigido especificamente contra as imunoglobulinas de coelho e acoplada à fosfatase alcalina (SIGMA A-3687) . Depois da lavagem (TBS, 0,1% Tween20), a detecção foi efectuada adicionando um substrato da fosfatase (BioRad; Ref 170-5012), e a revelação foi obtida por radiografia do produto fluorescente sobre uma película Amersham (ECL). 42 0 resultado desta experiência mostra que 4 plantas de tabaco transgénico expressam fortemente a heliomicina. 0 sinal nas outras plantas transgénicas é fraco ou não significativo em relação ao testemunho selvagem. 0 sinal observado para a melhor planta é do nivel do controlo positivo (50 ng de heliomicina), o que indica que nesta planta a heliomicina representa de forma ponderada aproximadamente 1% das proteínas totais.

Exemplo V-l: concentrados emulsionáveis

Exemplo CE 1: - matéria activa 400 g/1 - dodecil benzeno sulfonato alcalino 24 g/1 - nonilfenol oxietilado a 10 moléculas de óxido de etileno 16 g/i - ciclohexanona 200 g/1 - solvente aromático q.b. 1 litro

Exemplo CE 2: - matéria activa 250 g - óleo vegetal epoxidado 25 g - mistura de sulfonato de alquilo e de éter de poliglicol e de álcoois gordos 100 g - diAndilformamida 50 g - xileno 575 g

Exemplo v-2: suspensão concentrada

Exemplo SC 1: - matéria activa 500 g - fosfato de tristirilfenol polietoxilado 50 g - alquilfenol polietoxilado 50 g - policarboxilato de sódio 20 g 43 - etileno glicol 50 g - óleo organopolisiloxano (antiespuma) lg - polissacarídeo l,5g - água 316,5 g

Exemplo V-3: pó molhável (ou pó a pulverizar):

Exemplo PM 1: - matéria activa 50% - álcool gordo etoxilado (agente molhante) 2,5% - feniletilfenol etoxilado (agente dispersante) 5% - carbonato de cálcio (suporte inerte) 42,5% - feniletilfenol etoxilado (agente dispersante) 5%

Exemplo PM 2: - matéria activa 10% - álcool sintético oxo do tipo ramificado, em C13 etoxilado por 8 a 10 óxido de etileno (agente molhante) 0,75% - lignosulfonato de cálcio neutro (agente dispersante) 12% - carboneto de cálcio (carga inerte) q. b. 100%

Exemplo PM 3: - matéria activa 75% - agente molhante 1,50% - agente dispersante 8% - carboneto de cálcio (carga inerte) q.b. 100% Exemplo PM 4: - matéria activa 90% - álcool gordo etoxilado (agente molhante) 4% - feniletilfenol etoxilado (agente dispersante) 6% 44

Exemplo PM 5: - matéria activa 50% - mistura de tensioactivos aniónicos e não iónicos (agente molhante) 2,5% - lignosulfonato de sódio (agente dispersante) 5% - argila caulinitica (suporte inerte) 42,5%

Exemplo V-4: granulados dispersíveis

Exemplo GD 1:

Num misturador, foi misturado 90% em peso de matéria activa e 10% de uréia em pérolas. A mistura foi seguidamente triturada num triturador duplo. Foi obtido um pó que foi humedecido com aproximadamente 8% em peso de água. O pó húmido foi extrudido numa extrusora de cilindro perfurado. Foi obtido um granulado que foi seco, seguidamente triturado e peneirado, de forma a que guarde respectivamente só os granulados com um tamanho compreendido entre 150 e 2000 microns.

Exemplo GD2:

Num misturador, foram misturados os seguintes componentes: - matéria activa 75% - agente molhante (alquilnaftaleno sulfonato de sódio) 2% - agente dispersante (polinaftaleno sulfonato de sódio) 8% - carga inerte insolúvel na água (caulino) 15%

Esta mistura é granulada em leito fluidificado, na presença de água, seguidamente seca, triturada e peneirada para obter granulados com um tamanho compreendido entre 0,15 e 0,80 mm. 45

Exemplo V-5: composições farmacêuticas

Exemplo A: comprimidos

De acordo com a técnica habitual, os comprimidos foram preparados com doses de 50 mg de peptideo activo tendo a composição seguinte: - peptideo heliomicina Ml 50 mg - amido 60 mg - lactose 50 mg - estearato de magnésio 2 mg

Exemplo B: solução injectável

Foi preparada uma solução injectável que contém 20 mg de peptideo activo tendo a composição seguinte: - peptideo heliomicina M2 22,4 mg - água destilada q.b. 2 cm3

Exemplo VI. Estabilidade da actividade da heliomicina A estabilidade de um peptideo antimicrobiano de proteases de plantas é um factor essencial para a obtenção de um bom nível de expressão e portanto de resistência aos fitopatogénicos nas plantas transgénicas. Esta estabilidade é por exemplo um ponto fundamental para um peptideo antimicrobiano de insecto como a cecropina B (Owens & Heutte, 1997. MPMl vol 10. n°4, pp 525- 528). Examinados a estabilidade da heliomicina e da sua actividade sobre um teste fitopatogénico (Botrytis cinerea) após a incubação com extractos brutos de 8 plantas cultivadas maiores (milho, trigo, cevada, colza, soja, girassol, tomate e tabaco).

As folhas destas 8 espécies foram trituradas a temperatura baixa (nitrogénio líquido) num almofariz, seguidamente o pó foi ressuspendido no mesmo volume de água. Depois da centrifugação (lOOOOg durante 30 minutos), o sobrenadante foi recuperado, e determinada a concentração na proteína. Esta concentração foi ajustada para os 8 extractos a lmg/ml por diluição com água, seguidamente estes extractos foram filtrados de maneira estéril (0,2 microns). Cem microlitros de cada extracto (assim como um controlo com apenas água) foram seguidamente adicionados a 50 microlitros de uma solução de heliomicina (que contém 15 microgramas, assim como um controlo sem peptideo) em água. Estas misturas foram incubadas a 30°C, uma aliquota de 20 microlitros retirada depois de 0 h, lh, 2h, 4h e 20h, imediatamente congelada até à realização do teste. 0 teste da actividade antifúngica foi realizado a 25°C em microplacas adicionando cada aliquota a 80 microlitros de uma suspensão fresca de esporas de Botrytis cinerea (10000 esporas/ml numa solução de caldo de batata dextrose (Difco, 12g/l) . A leitura visual dos resultados passadas 12h e 24h mostraram que não houve nenhuma perda significativa da actividade antifúngica da heliomicina, mesmo para a amostra incubada durante 20h a 30°C, ligado à exposição a um extracto bruto de milho, trigo, cevada, colza, soja, girassol, tomate ou tabaco. Este resultado indica uma estabilidade muito forte da heliomicina relativamente às proteases das plantas, e que a actividade antifúngica testada sobre Botrytis cinerea não está afectada pela presença de extractos brutos vegetais.

Exemplo VII: realização de diferentes mutantes da heliomicina: mutantes simples, duplos, triplos e quádruplos

Os mutantes seguintes são preparados de acordo com o método descrito no exemplo 11 substituindo alguns dos oligonucleotídeos 1 a 6 por outros oligonucleotídeos escolhidos para introduzir as mutilações. 47 - heliomicina R48: substituição do aminoácido Glu4 8 da sequência ID NO: 1 por um aminoácido básico, em particular uma arginina (Arg48). Por analogia com a sequência que codifica a heliomicina da sequência: SEQ ID NO: 1, o codão GAA que codifica a Glu é substituído pelo codão aga que codifica a Arg. Os oligonucleotídeos 19 e 20 são utilizados na substituição dos oligonucleotídeos 5 e 6 do exemplo II.

Oligo 19: 5' GATCCTTCGC TAACGT7AAC TGTTGGTGTA GAACCTGATA GG 3'

Oligo 20: 5' TCGACCTATC AGGTTCTACA CCAACAGTTA ACGTrAGCGA AG 31 - heliomicina L28L29: substituição dos dois aminoácidos básicos Lys e Arg na posição 28 e 29 da sequência ID NO: 1 por dois aminoácidos hidrófobos, em particular dois aminoácidos leucinas (Leu28 e 29). Por analogia com a sequência que codifica a heliomicina da sequência: SEQ ID NO: 1, a parte AAG-CGC que codifica o resto peptidico Lys-Arg é substituído pela sequência TTG-TTG que codifica o resto peptidico Leu-Leu. Os oligonucleotídeos 21 e 22 são utilizados na substituição dos oligonucleotídeos 3 e 4 do exemplo II.

Oligo 2): 5' CTAGTGACTG CAACGGCGAG TGCTTGTTGC GC 3'

Oligo 22; 5' GCAACAAGCA CTCGCCGTTG CAGTCA 3' heliomicina L28L29R48: substituição dos dois aminoácidos básicos Lys e Arg na posição 28 e 29 da sequência ID NO: 1 por dois resíduos aminoácidos leucinas e substituição do aminoácido Glu48 da sequência ID NO: 1 pelo aminoácido arginina (Arg48). Os oligonucleotídeos 19 a 22 são empregues na substituição dos oligonucleotídeos 3 a 6 de acordo com o exemplo II. 48 - heliomicina A24A25: substituição dos dois aminoácidos Asn24 e Gly25 da sequência ID NO: 1 dois aminoácidos alanina (Ala24 e Ala25). Por analogia com a sequência que codifica a heliomicina da sequência ID NO: 1, a parte AAC-GGC que codifica o resto peptidico Asn-Gly é substituído pela sequência GCT-GCT que codifica a Ala-Ala. Os oligonucleotídeos 23 e 24 são utilizados na substituição dos oligonucleotídeos 3 e 4 do exemplo II. Oíigo 23: 5' CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TCCAAGCGGC GC 3'

Oligo 24; 5' GCCGCTTGCA CTCAGCAGCG CAGTCA 3' - heliomicina A6A7A8A9: substituição dos aminoácidos Asp6-Lys7-Leu8-Ile9 da sequência ID NO: 1 por 4 aminoácidos alanina (Ala). Por analogia com a sequência que codifica a heliomicina da sequência ID NO: 1, a parte GAC-AAG-TTG-ATT que codifica o resto peptidico Asp-Lys-Leu-IIe é substituído pela sequência GCT-GCT-GCT-GCT que codifica o resto peptidico Ala-Ala-Ala-Ala. Os oligonucleotídeos 25 e 26 são utilizados em substituição do oligonucleotídeo 1 do exemplo II e os oligonucleotídeos 27 e 28 em substituição do oligonucleotídeo 2.

Oligo25; 5' AGCTTGGATA AAAGAGCTGC TGCTGCTGGT AGCTGTGTTT 3f digo2fi: 5' GGGGCGCCG TCAACTACA 31

Oligo 27: 5’ CTAGTGTAGT TGACGGCCCC CC 2 '

Oligo 28; y AAACACAGCT ACCAGCAGCA GCAGCTCTTT TATCCA 3’ - heliomicina A24A25L28L29: dois oligonucleotídeos (sentido e antisentido) foram necessários para paliar a ausência de um sítio de restrição entre a sequência que codifica o resto peptidico constituído pelos dois aminoácidos Asn24-Gly25 e a sequência que codifica o resto peptidico constituído pelos dois aminoácidos Lys28-Arg29 da heliomicina da sequência ID NO: 1. As duas sequências oligonucleotídeas 29 e 30 substituem 49 respectivamente as duas sequências oligonucleotídeas 3 e 4 do exemplo II.

Olígo29; 5' CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCTTGTTGC GC 3'

OlígO30: 5' GCAACAAGCA CTCAGCAGCG CAGTCA 3'

Produção da heliomicina mutada à escala semipreparativa

Os diferentes mutantes da heliomicina foram preparados e purificados da seguinte maneira. Um dos clones da levedura transformada que expressa a heliomicina mutada foi cultivado a 29°C durante 48 horas em 50 ml de meio selectivo. Esta pré-cultura foi seguidamente utilizada para inocular 2 1 de meio selectivo e o cultivo foi realizado durante 48 horas a 29°C. As leveduras foram eliminadas por centrifugação (4000 g, 30 minutos, 4°C). O sobrenadante foi acedificado até pH 3,5 com ácido acético, submetido a uma segunda centrifugação (4000 g, 30 minutos, 4°C) antes de uma primeira etapa de extracção em fase sólida. - primeira etapa de extracção em fase sólida sobre um gel de fase invertida: o sobrenadante acedificado foi depositado sobre um cartucho Sep-Pak Vac 35cc de fase invertida C18 (Waters Associates, 10 g de fase) equilibrado com água acedificada (TFA 0,05%). As moléculas hidrófilas foram eliminadas por uma lavagem com água acedificada seguida de uma lavagem com uma solução de acetonitrilo a 15% preparada em TFA 0,05%. A eluição do peptideo foi realizada por uma solução de acetonitrilo a 60% preparado no TFA 0,05%. A fracção eluida a 60% de acetonitrilo foi liofilizada e seguidamente reconstituída em água ultrapura estéril antes de ser submetida à primeira etapa de purificação. - segunda etapa de extracção em fase sólida sobre um gel de troca catiónica: a fracção previamente purificada a 60% contendo a heliomicina mutada foi reconstituída numa solução de acetato 50 de amónio a 25 mM, pH 3,4. Esta amostra foi depositada sobre um cartucho Sep-Pak Vac 35cc CM de troca catiónica (Waters Associates, 10 g de fase) equilibrada com acetato de amónio a 25 mM, pH 3,4. A heliomicina mutada foi eluida utilizando uma solução a 1 M de cloreto de sódio (NaCl) preparado no acetato de amónio a 25 mM, pH 3.4. A fracção 1 M de NaCl contendo a heliomicina mutada é recolhida, seca em vácuo, reconstituída com 20 ml de água ultrapura acedificada (TFA 1%) . A heliomicina mutada foi seguidamente purificada por HPLC de fase invertida. - última etapa de purificação por HPLC: a heliomicina mutada foi purificada até à homogeneidade por cromatografia sobre uma coluna de fase invertida preparativa Aquapo re RP-300 C8 (Brownlee™, 220 x 10 mm, 300 À), utilizando um gradiente linear bifásico de acetonitrilo de 2% a 23% em 10 minutos e de 23% a 33% em 80 minutos no TFA 0,05% com um débito constante de 2,5 ml/minuto. A fracção recolhida é seca em vácuo, reconstituída com água ultrapura e analisada por espectroscopia de massa MALDI para verificar a sua pureza e a sua identidade. As diferentes heliomicinas mutadas foram analisadas quanto à sua actividade antifúngica nas condições descritas para a heliomicina de referência contra as seguintes estirpes: Neurospora crassa, Fusarium culmorum e Nectria haematococca. A actividade dos mutantes da heliomicina foi igualmente analisada contra as bactérias. As condições experimentais utilizadas são abaixo descritas.

Teste da actividade in vitro: medida da actividade antibacteriana e antifúngica por microespectrofotometria

Esta metodologia foi utilizada para determinar o espectro da actividade do peptídeo e da concentração mínima inibitória (CMI) à qual o peptídeo mutado está activo. A CMI foi expressa como um intervalo de concentração [a] - [b] onde [a] foi a concentração mínima onde foi observado um início de crescimento e [b ] a 51 concentração na qual não foi observada qualquer crescimento.

Exemplos da actividade especifica da heliomicina mutada, relativamente às bactérias e fungos filamentosos são dados no quadro 3. A actividade antibacteriana foi detectada por um teste de inibição do crescimento em meio liquido. As bactérias a testar foram postas em suspensão num meio nutritivo do tipo "Poor Broth". Preferencialmente, deve ser utilizada uma solução de bacto-triptona a 1% adicionada a NaCl a 1% volume em peso preparada em água desmineralizada. Foram depositados 10 μΐ de cada fracção para analisar em placas de microtitulação na presença de 90 μΐ de meio de cultura contendo as bactérias (a uma concentração final equivalente a lmDO a 600 nm). A incubação foi realizada a 25°C durante 12 a 24 horas. O crescimento bacteriano foi medido seguido da absorbância a 600 nm com a ajuda de um leitor espectrofotométrico de placas de microtitulação. - bactérias testadas: Bacillus megaterium (colecção do instituto Pasteur). Micrococcus luteus (colecção do Instituto Pasteur). Staphylococcus aureus (H. Monteil, Instituto de Bacteriologia, Estrasburgo), Aerococcus viridans (H. Monteil, Instituto de bacteriologia, Estrasburgo), e Escherichia coli D22 (P. L. Boquet, centro de Estudos Nucleares, Saclay).

Quadro 3: actividade de certas heliomicinas mutadas em relação com os fungos filamentosos e com as bactérias

Microorganismos CMI dos mutantes de heliomicina (μΜ) L28L29 R48 L28L29R48 A6A7A8A9 Hélio Fungos Neurospora crassa 0,8-1,6 0,4-0,8 0,8-1,6 1,6-3,1 0,1-0,2 Fusarium culmorum 3,1-6,2 0,4-0,8 0,8-1,6 3,1-6,2 0,2-0,4 Nectria haematococca 3,1-6,2 0,4-0,8 0,8-1,6 ND 0,4-0,8 52

Bactérias

Bacillus megaterium 50-100 ND ND 6,2-12,5 ND Micrococcus luteus 12,5-25 25-50 ND ND ND Staphyloccoccus aureus ND ND ND ND ND Aerococcus viridans ND ND ND 12,5-25 ND Escherichia coli d22 ND ND ND ND ND ND: nenhuma actividade detectada.

Exemplo VIII: estudo da toxicidade aguda

Grupos de 4 ratos fêmeas foram tratados por injecção intravenosa de soluções de heliomicina (SEQ ID NO: 2) em solução salina com doses de 1 e 10 mg/kg. Soluções correspondentes de aprotinina como controlo negativo (sem efeitos para as duas doses) e de melitina como controlo positivo (100% de mortalidade em 5 dias com 10 mg, efeitos significativos em 5 dias a lmg) . Não foi evidenciada qualquer toxicidade nas soluções de heliomicina nas duas doses injectadas.

REFERÊNCIAS

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Bevan. M. & coll. (1983). Nuc. Acids Res. 11:369-385.

Carrington and Freed (1990). J. Virol. 64:1590-1597.

Ehret-Sabatier & coll. (1996) The Journal of Biological Chemistry, 271, 47, 29537-29544. Horsch & coll. (1985). Science 227:1229-1231.

Jefferson & coll. (1987). EMBO J. 6:3901-3907.

Komari & coll. (1986). J. Bacteriol. 166:88-94. 53

Rothstein & coll. (1981). Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 45:99-105.

Stalker & coll. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314.

Ode11, J.T. & coll. (1985). Nature 313:810-812. LISTA DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÕES GERAIS: (1) DEPOSITANTE:

(A) NOME: RHONE-POULENC AGROCHIMIE

(B) RUA: 14-20 Rue Pierre BAIZET

(C) CIDADE: LYON (E) PAÍS: França (F) CÓDIGO POSTAL: 69009 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Gene que codifica a heliomicina, proteína obtida, vector que a contém, organismos transformados obtidos e método de preparação (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 38 (iv) FORMA DECIFRÁVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE SUPORTE: disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERACIONAL: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patent In Release #1.0, versão #1.30 (OEB) (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 1: 54 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) comprimento: 147 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) COLOCAÇÃO: 1.147 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: WJC TTG GAT AAA AGA GAC AAff TTG AT? ~,ZC AGC TfiT GTT T®3 GOC GCC 43

Ser teu Aep L/S Arg Aep Lye Leu i:-i Ity Ser Cyfi VaL Trp Gly Ala 1 £ 10 15 QTC AAC TAE ACT AOT GAC TBC AAC Zl~ ”«.1 TGC AAG CSC CGC QGT TAC 9$

Vai Am Tyr Thr Ser Aap Cys Asn Gly r-j Cv* Lys Arg Arg GLy Tyr 29 ti 30 AM GGT GGC CAT TGT GGA TCC TTC C?T ,ViT GTT AAC T<JT TCO TGT GAA 144

Lys (Jly Gly HiS Cys Sly Ser Phe Ale Aan VaL ΑΑΠ Cys Trp Cys Glu 35 40 4& ftCC H7

Thr 41 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 169 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) CARACTERÍSTICA: 55 4&

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) COLOCAÇÃP: 1..132

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: OAT Afia CTT ATC GOT TCC TGC GTG TGC CGT GCT GTG AaC íac act tcc Asp Uya Leu Ilo Gly Ser Cye Vai Trp Gly Ala Vai As» Tyr Thr Ser 1 $ 10 15 GAT TOC AAC GGT GAG TGC AAG AGG AGG CGT TAC AAG GGT GGT CAC TGC Asp Cys Mti Giy Gíu cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lye Gly Gly Hia Cys 10 25 30 GGT TCC TTC CCT AAC GTC AAC TGC ICO TGC GAÇ ACT TGAGAflCTCC Gly Ser Phe Ala Asn Vai Asn Cys Trp Cyí Glu Thr 15 40 GCQAGGCGAA CGTGTCGACG GATCCGG se 142 169 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 261 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 3..224 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: 56 47 CC ATG CGT TTC GTG CTT TTC TCT CAG CTT CCA TCT TTC CTT CTT OTG Met Gly phe vai Leu Phe Ser Gin Leu Pro Ser Phe Leu Leu vai 15 10 is

TCT ftCT CTT CTT CTT TTC CTT CTp ATÇ TCT CAC TCT TBC CGT CCC GAT

Ser Thr LSU Leu Leu phe Leu Vai Ile Ser His Ser Cys Arg Ala Asp 2D 25 20 95 143

ΑΛΟ CTT ATC BGT TCC TGC GTG TBG CGT QCT GTG AAC TAC ACT TCC GAT Lys Leu He Gly Ser cys vai Trp Gly Ala vai Asn Tyr Thr Ser Asp 3 9 40 45 TGC AAC GGT GAQ TGC ΑΑ3 AGG AGG GGT TAC AAG GGT GGT CAC TGC GGT cys Asn Gly Glu Cys Lys Ara Ar? Gly Tyr Lys Gly Gly Hls Cy* Gly 50 35 60 TCC TTC GCT AAC GTG AAC TGC KG TGC GAG ACT tcagagctcg gcgaggcoaa Ser Plie Ala Asn Vai Aan Cys Trp cys GlU Thr «5 70 - CGTGTCSACG GATCCGG 261 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 120 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO:12..101 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: 57 taCOTCOftCGC G A7G GGT TTC CTG CTT TTC TCT CM CTT CCA TCT TTC CTT 90

Mat Gly Phe vai Leu Phe Ear Gin Léu Pro fiar phe Leu 1 5 10 CTT CTG TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC TCT TGC CGT 98

Lau Vai Saç Thr Lau Leu Leu Phe Lau Vai Ils Ser Hls ier Cys Arg 15 30 25 &CT GCAGACGCSA ATTCACACA 139

Ala }0 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 75 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleotideo sintético 7" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: GOGTCGACGC 5ATGGGTTTC GTCCmTCT CTCAGCTTOO ATCTTTCCTT CITGTCTCTA Ê0 CTCTTCTTCT TTTCC 15 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 72 pares de bases (B) TIPO: nucleotideo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico 58 (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleótido sintético 8" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: TCGCCGGCAC aaCAAâAGTA AGAGATtACA MGAAAAGAA GAAGAGTAGA CACAAOAAGG ¢0 SAAI5ATGGAA GC 73 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 7: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 80 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleótido sintético 9" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: CATAAaCTTA TCGGTTCrre CGTGTGGGGT GCTGTHAACT ACACTTCCGA TTSCAACOOt ¢0

GAGTGCAAGA GOAGGGGTTA BQ (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 109 pares de bases (B) TIPO: nucleotideo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico 59 (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleótido sintético 10 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

' CWCATCCCT CGACACfiíTC SCCTCGCCOA CCTCTCAAGT CTCGCACCAG CACrrCACGT 5 D tascgaaíía accocastga ccacccttqt aacccçtcct cirscwrc íos (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 9: (1) Caracteristicas da sequência: (A) COMPRIMENTO: 85 pares de bases (B) TIPO: nucleotideo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleotídeo sintético 11" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: ASGGCCCCCT AGCGrTTAAA COGCCAGTÇA CGCCCAATTC GAOCTCGGTA CCCOfiCGAtC 60 ;TCTAC-AGTC SACCTGCAGG CATGC hs (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 66 pares de bases (B) TIPO: nucleotideo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico 60 (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleotídeo sintético 12 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:

CCCTGAACCA GGCTCO&G5G CSCCCCTTAA TTAAAAOCTT SCAT6CCTGC AG5TC0ACTC 60 TAGAGG (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 93 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleotídeo sintético 13" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: CC8GCCAGTC AGGCCACACT TAATIAAGTT TMACCCCGC CCCGGCGCGC ΐΤΑΟβΤΟΤβΤ 60 WTCQAGGGC CCAACCTGAG TACCTQQTTC AGG 99 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 93 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear 61 (ii) tipo de Molécula: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleotídeo sintético 14" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO: 12: CCG5CCTSAA CCAGGTACTG AGGTTGQGCC CTCCACCACA CACCTAGGCG OQCCCQQQCC 60 GCGTTTAAAC TfAATTWfiT GTsdCCTGAC TGG 93 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 13: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 50 pares de bases (B) TIPO: nucleotideo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = " oligonucleotídeo sintético 15" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: GGTCTAGAAT GGCCTGCACC AACAACGCCA TGAGGGCCCT CTTCCTCCTC 50 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 50 pares de bases (B) TIPO: nucleotideo (C) NÚMERO de cadeias: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear 62 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleotídeo sintético 16" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: CCGAATTCGG CGCCGTGCAC GATGCAGAAG AGCACGAGGA GGAAGAGGGC 50 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 15: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 81 pares de bases (B) TIPO: nucleotideo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) nome/chave: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 7 ...73 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA SEQ ID NO:15: tctaga mg acc toí acc aac aac acc mg açg gcc ctc ttc ctc ctc 48 riet Ala Cys Thr Aan Aíh Ala Hat Ar? Ala Leu Phe cys n* 1 S 10 CTG CTC TTC TCC ATC GTG CAC GGC GCCGAATTC 81

Vai Leu Phe Cya Ile Vai Hle Gly 15 20 (2) Informações para a SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases 63 (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleotideo sintético 17" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTG 24 (2) INFORMAÇÕES PARA a SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = " oligonucleotideo sintético 18" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17: GGCTCGAGTC AAGTCTCGCA CCAGCAGTTC AC 32 2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 213 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO de cadeias: simples 64 (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 7 ...205 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18: TCTAOA ATS GCC TGC ACC AAC AAC CCC ATC ™G GCC CTC TTC CTC CTC 48

Mtt Ala Cys Thr Asn Ass Ala Hat Arj Ala Leu Phe Cys Ile 1.3 19 çTG CTC TTC TGC ATC ατά CAC MC GAT AAG CTT ATC QCT TCC TGC GTG vsl Lau Fft* Cys Ila vai HÍS Gly ASp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Vai 15 20 25 30 TflG GGT GCT GTG AAC TAC ACT TCC SAT TGC AAC GGT GAG TGC AA3 AGO TEp Gly Ala Vai Asn ryr Thr Ser Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg 35 40 45 AG 2 GST TAC MO GOT OGT CAC TGC OGT TCC TTC GCT AAC GTG AAC TGC Atg Gly Tyr Lys Gly flly Hli Cys Oly 9cr Phe Ala AbiL Vai Asn Cys 5D 55 50 36 144 192 213

¥03 TGC SAG ACT TGACTCGAO Trp Cys Glu Thr ÍS (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 838 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) CARACTERÍSTICA: 65

(A) NOME/CHAVE: promotor CsVMV (B) LOCALIZAÇÃO: 7..532 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: sítio de clonagem múltipla (B) LOCALIZAÇÃO: 533..568 (ix) Característica: (A) NOME/CHAVE: terminador (B) LOCALIZAÇÃO: 569..832 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19: AAGCTTÇCAC AAQQTAATTA TCCaaGATGT AQCATCWiA ATCCAATSTt ÍAOWOAAAA 60 ACTATGGAftO TATTATSTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA WATGCGSCA CATATGCAAC 120

CTATGTTCAA AAATCAAGAA TGTACAOATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATAEGAAGAA ISO GAATAC9TAG AAATJtJAnM MAASAACCA CCCfihASAAA AGAATCTTÇA AãACQTA&CC 04 0 ACtQACGACA ACAATGAAAA ÚAAGAAGATA ABGTCGGTGA TTOTGAAAGA GACATASAGO 300 ACACATBTAA GGT06AAAAT dXAAOCSCSG AAAGTAACCT TATCACAAAG SAATCTTATC J«0 ccccactact tatcctttca tatttttcco tgtcattttt gcccttçagí ittcctatat *20 AAGGAACCAA GTTCGGCATT TOTGAAAACA AOAAAAAATT TGGTSTAAGC TATTTTCTTT 480 GAAGTACTCA SCATACAACT TCAGAQAAAT TXGTAAGTTT GTAGATCTCG ATTCTAOAAQ 540 CCCT5AATTC GAGCTCQOTA CCCGATCCAA TTCCCGATCG TTCAAACATT 7GSCAATAAA soo oTTTCTtAAâ ATTGAATcer OTWíeeoarc ttgcgatoat tatcaíataa tttctgttoa seo ATTACSTTAA GCATOTAATA ATTAACATOI AATGCATOAC βΤΤΑΤΤΤΑΤβ AGATGGQTTT 720 TTATGATTAO AGTCCCOCAA TTATACATTT AATACOCUAT AGAAAACAAA ATATAGCGCa 780 CAAACTMOA TAAATTATCO CGCGC0GTGT CATCTATOTT ACTAGATCGG GOATCGAT 838 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1036 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo 66 (C) NUMERO DE CADEIAS: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: promotor CsVMV (B) LOCALIZAÇÃO: 7..532 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 539..736 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: terminador nos (B) LOCALIZAÇÃO:767..1030 (xi) descrição da sequência: SEQ ID NO: 20:

AftKTTCCftS AAGÚTAA1TA TCCAKATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGHAAJ* 60 ACTAfGGAAQ TATTATGTGA cctcagcaag aagcaoatca atatgdgqca CATATQCAAC 120 CTATGTTCAA MATGAAGAA. TI3TACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAQA ATACGAAGAA lâd GAATAC5TAG AAATTGAAAA AGAACAACCA GQCOaAOAM AOAATCTTOih AOAC5TAACC 240 ACT9ACGACA ACAATQAAAA aAAOAAaATA AGCTCGCTGA TTGTGAAAGA GACATAGAGG 300 ACACATCTAA OGTGGAAAAT GTAAGQGCGG AAAGTAACCT TATCACAAAG SftArcTTATC 160 CCCCACTACT TATCCTTTTA TATTITTCCG Τΰ·ΜΑΤΤΤΓΤ GCCCTTGAGT TTTCCTATAT 420 flTTCGGCATT TGTGAAAACA ASAAAAAATT TGGTCTAAflC ΤΑΤΤΤΤΚ3ΤΓ 400 GAAGTACTCA, ÇGATACAACT TCAGAGAAAT TTOTAAGTTT GTAGATCTCfl ATTCTAGA 538 67 586 ATS BK TGÇ AÇC AAC AAC OCC ATC AGG GCC CTC TTC CTC CTC GTQ CTC Ala Cys Thr A*n Asn Ala Mae Arg Ala Leu Pha Leu Leu VAl Leu 1 5 10 IS TFC TGC ATC ΰτΰ CAC CGC GAT AAG CTT ATC GGT TCC TGC GTG TCB GGT Fhe Cys Ile val His Gly Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly 10 33 20 GCT OTO AAC TAC ACT TCC OAT TGÇ AAC CGT GAG TCC AAC AGG A8G GGT Me Vai Asn Tyr Thr Ser ASp Cye Asn Cly Glu Cys Lya Arg Ar? Gly 35 40 45 TAC AAO GGT CGT CAC TCC CGT TCC TTC oct AAC OTO AAC TGC TGC TGC Tyr tya Qiy Gly His Cys flly ser Phs Ala Aon Val Asn Cys Trp Cys. SO 5S 60 6)4 662 730 766 GAG AÇT TOACTOGAGG «KOOCCCM TACÇGGATCC AATTCCCfiAT CGTTCAAACA Clu Thr S3 TTTOGCAATA fcAOTTPCTTA AGATTGAATC CTGTTGCC*} TCTTGCGATG ATTATCATAT 646 AATTTCTGTT OAATTACBTT AAGCATGTAA. TAATTAACAT GTAATGCATG ACCTTATTTA 906 TOAGATCOBT ΤΤΤΤλΤΟΑΤΤ AGAGTCCCGC AATTATACAT TTAATACâCG ATAOAAAACA 966 AAATATAGCG CGCAAACTAO GATAAATTAT CGCGCGCGGT CTCATCTATG TtACTAGATC 1026 1036

GGSQATCOAT (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 52 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleotídeo sintético 1" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 21: AGCTTGGATA AAAGAGACAA GTTGATTGGC AGCTGTGTTT GGGGCGCCGT CA 52 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 68 (A) COMPRIMENTO: 56 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleotideo sintético 2" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 22: AGTGTAGTTG ACGGCGCCCC AAACACAGCT GCCAATCAAC TTGTCTCTTT TATCCA 56 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 23: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 52 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = " oligonucleotideo sintético 3" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 23: ACTACACTAG TGACTGCAAC GGCGAGTGCA AGCGCCGCGG TTACAAGGGT GG 52 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 52 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo 69 (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = " oligonucleotídeo sintético 4" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 24: CACAATGGCC ACCCTTGTAA CCGCGGCGCT TGCACTCGCC GTTGCAGTCA CT 52 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 25: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 56 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleotídeo sintético 5" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 25: CCATTGTGGA TCCTTCGCTA ACGTTAACTG TTGGTGTGAA ACCTGATAGG TCGACA 56 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 26:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 52 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear 70 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleotídeo sintético 6" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 26: GATCTGTCGA CCTATCAGGT TTCACACCAA CAGTTAACGT TAGCGAAGGA TC 52 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 27: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: nucleotideo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = " oligonucleotídeo sintético 19" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 27: GATCCTTCGC TAACGTTAAC TGTTGGTGTA GAACCTGATA GG 42 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: nucleotideo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico 71 (A) DESCRIÇÃO: /desc = oligonucleotídeo sintético 20 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 28: TCGACCTATC AGGTTCTACA CCAACAGTTA ACGTTAGCGA AG 42 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 29: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = " oligonucleotídeo sintético 21 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 29: CTAGTGACTG CAACGGCGAG TGCTTGTTGC GC 32 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleotídeo sintético 22" 72 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 30: GCAACAAGCA CTCGCCGTTG CAGTCA 26 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 31: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO de cadeias: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleotideo sintético 23" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 31: CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCAAGCGGC GC 32 (2) Informações para a SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: nucleotideo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = " oligonucleotideo sintético 24" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 32: 73 GCCGCTTGCA CTCAGCAGCG CAGTCA 2 6 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 33: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = " oligonucleotideo sintético 25" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 33: AGCTTGGATA AAAGAGCTGC TGCTGCTGGT AGCTGTGTTT 40 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: nucleotideo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = " oligonucleotideo sintético 26" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 34: GGGGCGCCGT CAACTACA 18 74 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 35: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = " oligonucleotídeo sintético 27 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 35: CTAGTGTAGT TGACGGCGCC CC 22 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 36: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = " oligonucleotídeo sintético 28 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 36: AAACACAGCT ACCAGCAGCA GCAGCTCTTT TATCCA 36 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 37: 75 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = " oligonucleotideo sintético 29" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 37: CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCTTGTTGC GC 32 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "oligonucleotideo sintético 30" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 38: GCAACAAGCA CTCAGCAGCG CAGTCA 26 76

LISTA DAS SEQUÊNCIAS <110> RHONE-POULENC AGRO <120> Gene que codifica a heliomicina, proteína obtida, vector que o contém, organismos transformados obtidos e processo de Preparação <14 0> PCT/FR99/00843 <141> 1999- 04-12 < 15 0 > FR 98 04933 <151> 1998- 04-15 < 16 0 > 38 <17 0> Patentin Ver. 2.1 <210 > 1 <211> 147 <212> ADN <213> constructo sintético <22 0> <221> CDS <2 2 2 > (D · · (147) <4 0 0> 1 age ttg gat aaa age gac aag ttg att ggc age tgt gtt tgg ggs gee 4S ser teu Asp Lys Arg Aep Lys Leu Ila Gly Ser Cys Vai Trp siy Ala 1 5 10 15 gtc ÍBC tac act agt gac tgc eac gge gag tgc aag ego ege ggt tac se vai Aan Tyr Thr Sar Asp Cys Aen Gly Glu Cya LyS Asg Arg Gly Tyr 30 25 30 aag ggt gge cat fcgt gga tcc ttc gct aao gtt aac tgt tgg tgt gaa 144 Lys flly Gly His Cys Gly sar Phe Ala Asn Vai Agn Cys Trp Cys Glu 55 40 45 acc

Thr 77 147

<210> 2 <211> 169 <212> ADN <213> constructo sintético <22 0>

<221> CDS <222> (1)..(132) <400> 2 gat aag ctt ate ggt tcc tgc gtg tgg ggt gct gtg aac tac act tcc 48

Asp Lys Leu Ue Gly Ser Cys Vai Trp Gly Ala vai Asn lyr Thx Ser 15 10 15 gat tgc aae ggt gag tgc aag agg agg ggt tae aag ggt ggt esc tgc 96 ήβρ Cys Asn Gly Glu Cys Ay» Axg Arg Gly Tyr lys Gly Gly Hie Cya 20 35 30 ggt tcc ttc gct aac gtg aac tgc tgg tgc gag act tgagagctcg 142

Gly Sar Fhe ÁlA Asn Vai Asn Cys Trp Cys Glu Thr 35 10 1S9 gcgaggcgaa cgtgtcgacg gatccgg

<210> 3 <211> 261 <212> ADN <213> constructo sintético <22 0>

<221> CDS <222> (3) .. (224) <400> 3 78 cc atg ggt tte gtg ctt ttc tct cag ett cca tct ttc ctt ctt gtg 47 íjet Gly Phe Vai Leu Phe Ser Gin Leu Pro Ser Phe Leu Leu Vai 15 10 15 tct act ctt ett ctt ttc ctt gtg ate tct cac tct tgc cgt gee gat 95

Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Vai Ile Ser Kis Ser Cya Arg Ala Asp 20 25 30 aag ctt ate ggt tcc tgc gtg tgg ggt get gtg aac tac act tec gat 143

Lys Leu Ile Gly Ser Cys Vai Trp Gly Ala Vai Asn Tyr Thr Ser Asp 35 «0 45 tgc aac ggt gag tgc aag agg agg ggt tac aag ggt ggt cac tgc ggt 191

Cys Aan Sly Glu Cya Lys Arg Arg Sly Tyr Lys Sly Gly Hís Cys Gly 50 55 60 tcc ttc gct aac gtg aec tgc tgg tgc gag act tgagagctçg gcgaggcgaa 244

Ser Phe Ala Aan vai Asn Cys Trp Cys Glu Thr 65 70 cgtgtcgacg gatçcgg 261 <210> 4 <211> 120 <212> ADN <213> constructo sintético <220> <221> CDS <2 2 2 > (12) . . (101) <4 0 0> 4 gcgtcgacgc g atg ggt ttc gtg ett ttc tct cag ctt cca tct ttc ctt 50 Met Gly Phe Vai Leu Phe Ser Gin Leu Pro Ser Phe Leu 15 10 ctt gtg tct act ctt ctt ctt ttc ctt gtg ate tct cac tct tgc cgt 38

Leu Vai Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Vai Ile Ser His Ser Cys Arg 15 20 25 130 gct ggagacgega attcacaca Ala 30

<210> 5 <211> 75 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 5 79 75 gcgtcgacgc gatgggttfcc gtgcttttct cteagcttcc atetttcctt cttgtgtcta £0 ctcttcttet tttcc

<210> 6 <211> 72 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 6 tcgçcggeac ggeaagagfca agagatcaea aggaaaagaa gaagagtaga cacaagaagg 60 aaagatggaa gc 72 <210> 7 <211> 80

<212> ADN <213> constructo sintético < 4 0 0 > 7 gataagctta tcççttcctg cgtgtggggt gctgtgaact acaettccga ttgcaacggt ¢0 gagtgeaaga ggaggggtta 80

<210> 8 <211> 109 <212> ADN <213> constructo sintético < 4 0 0 > 8 ccggatccgt cgacacgttc gcctegccga gcteteasgt etegcaccag cagtteaegt 60 tagcgaagga accgcagtga ccacccttgt aacccctcct cttgcactc 109 <210> 9 <211> 85 80

<212> ADN <213> constructo sintético <400> 9 agggccccct agggtttaaa cggccagtce ggccgaattc gagctcggta cccggggatc 60 etctagagtc gacctgcagg eatgc 65

<210 > 10 <211> 66 <212> ADN <213> constructo sintético <4 0 0> 10 ccctgaacca ggctcgaggg dgúgfiCttes ttaaaagctt gcatgcctgc sggtcg&ctd 50 tagagç 66

<210> 11 <211> 93 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 11 ccggccagtc aggecacect taattaagtt taaacgcggc ccoçgegcgc ctaggtgtgt 60 getcgagggc ceaaccteag taectggttc agg 93

<210> 12 <211> 93 <212> ADN <213> constructo sintético <4 0 0> 12 ccggcCtgaa ccjççttctg çigç:;gçgcc ctegagcaca cacctaçgcg cgccggggcc ¢0 gcgtttsaac ttaattaagt gtggcctgac tgg 93

<210> 13 <211> 50 <212> ADN 81 <213> constructo sintético <400> 13 aet ggccfcgeaee aaeaacgcca ígagggccct cttcctcctc

<210> 14 <211> 50 <212> ADN <213> constructo sintético <4 0 0> 14 ccgaattcgg cgccgtgcse gatgcagaag agcacgagga ggaagagggc 50

<210> 15 <211> 81 <212> ADN <213> constructo sintético <22 0> <221> CDS <222> (7)..(72) <400> 15 tctaga atg gcc tgc acc ο·ΐ gcc atg agg gcc cfcc ttc ctc ctc 4Θ

Met Ala Cys Thr Asn Αβη Ala Met Axg Ala Leu Phs Leu Leu 15 10 □tg etc ttc tgc ate gtg esc ggc gecgaatte 81

Leu Leu Phe Cya Ile Vai flls Giy 15 20

<210> 16 <211> 24 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 16 24 82 gataagctta tcggttcctg cgtg 24

<210> 17 <211> 32 <212> ADN <213> constructo sintético <4 0 0> 17 ggctcgagtc aagtctcgca ccagcagttc ac 32 <210> 18 <211> 213 <212> ADN <213> constructo sintético <22 0> <221> CDS <2 2 2 > (7) .. (204) <400> 18 40 96 144 192 213 tctaga atg gco tgc acc aac aac gcc atg agg gcc etc ttc etc etc Mçt Ala Cys Thr Asn Asn Ala Hat Arg Ala Leu Phe Leu Leu 15 10 ctg etc tte tgc ate gtg cae ggc gat aag ctt ate qgt tcc tgç gtg

Leu Leu Phe Cys Ile Vai Hís Gly Aap Lys Leu Ile Gly Ser Cys Vai 15 20 25 30 tgg ggt gct gtg aac tac act tcc gat tgc aac ggt gag tgc aag agg

Tep Gly Ala Vai Asn Tyr Thr Ser Asp Cye Asn Gly Glu Cys Lys Atg 35 40 45 agg ggt tac aag ggt ggt eac tgc ggt tcc ttc gct aac gtg aac tgc

Arg Gly Tyr Lya Gly Gly His Cys Gly Ser Phe Ala Asn Vai Asn Cys

50 55 GO tgg tgc gag act tgectcgag Trp Cys Glu The 65

<210> 19 <211> 838 <212> ADN <213> constructo sintético 83 <2 2 Ο > <221 > promotor <222> (7) . . (532) <2 2 0 > <221> misc_estrutura <222> (533). . (568) <220> <221> terminador <222> (569)..(832) < 4 0 0 > 19 aagcttccag Èaggti&tta tccaagatgt agcatcaaga atçcaatgtt tacgggaaaa $0 actatggaag tattatgtga gctcaçcaag aagcagatca atatgcggca eatitgcaac 120 ctatgttcaa aaatgaagaa tgtacagata csagatccta tactgççage atacgaagsa 190 gaafcacgtag aaattgaaas agaagaacca ggcgaagasa agaatettga agacgtaagc 240 aetgacgaca aea&tgaeaa gaagaagata aggtcggtga ttgtgaaaga gacatagagg 300 acaeatgtaa gçtgçasaat gtaagggcgg aaagtaaeet Utcacsí&c gastcttatc 360 csccactact tateetttta tatttttccg tgtcattttt gceettgagt tttcetatat 420 aaggaaccaa gttcggcatt tgtgasaica sgaaaaaatt tggtgtaagc tsttttcttt 480 gaagtactga ggatacaaet tcagagaaat ttgtaagttt gtagatctcg atCctagaag 540 gcctgaattc gagctcggta ccggatecaa ttccogatcg tteaaacatt tggcaataaa 900 gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgogatgat tatcatstaa tttctgttga 660 attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt 720 ttatgattag sgtccegcaa fctatacattt aatacgcgat ag&aaacaaa atatagegcg 780 csaactagga taaattatcg egcgcggtgt catctatgtt actaçatcgg ggatcgat 933 <210> 20 <211> 1036

<212> ADN <213> constructo sintético <2 2 0 > <221 > promotor 84 <222> (7) . . (532) <220>

<221> CDS <222> (539) .. (736) <220> <221> terminador <222> (767) .. (1030) <400> 20 aaggttccag aaggtaatta tccaagstgt agcatcaaga atccaatgtt tacgggaaaa 60 «.ctatggaag tattfttgtga gctcagcaag aageagatca atatgcggca catatgoaac 120

ctatgttcaa aaatgaagaa tgtacagate Caagatccta tactgccaga atacgaagaa ISO gaataogteg aaattgaaaa agaagaacca ggcgaagaaA agaatcttga Bgadgteagc 240 actgacgaca ecaatgaaaa gaagaagata aggtcggtga ttgtgaaaga gacabagsgg 300 acacatgtaa gçtgga&aat gtaagggcgg aaagtaacot tatcacaaag gaatottato 360 íttcactact títcctttta tatttttccg tgtcattttt gceettgagt tttcctatat 420 aaggssccaa gttegçcatt tgtgaaaaca agaaaaaatt tçgtgtaage tattttcttt 480 gaagtaaega ggatacaaet tcagagasat ttgtaegttt gfcsgatetcg attçtaga 533 atg gcc tgc ace esc asc gee atg agg gcc ate ttc ctc ctc gtg ctc 586

Hat Ala Cys Thr Aan Asn Ala Hat ftrg Ala L«u 8ha I>su Leu Vil Leu 15 10 15 ttc tgc ate gtg cao ggc gat aag ttt ate ggt tec tgc qtg tgg ggt 634

Phs Cys lie Vai Hi3 Gly Aap Ly* Lau Ila Gly Ser Cye Vai Trp Gly 20 25 30 qct gtg aac tac a et tcc gat tgc aae ggt gag tgc aag agg agg ggt 692

Ala vai Aan Tyr Thr Ser Asp Cys Asn Sly Glu Cye Lye Arg Arg Gly 35 40 45 tac aag ggt ggt cae tgc ggt tcc ttc gct ssc gtg aac tgc tgg tgc 730

Tyr Lys Gly Gly Hl a Cys Gly Ssr Phe Ãla Asn Vai Asn. Cys Trp Cys 50 55 60 gag act tgactcgagg gggggcccgg taecggattí aattcccgat cgttcaaaca 786 Glu Thr 65 tttggcaat* aagtttctta agsttgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attstcetat 846 aetttctgtt gasetasgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattti 906 tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacíit ttaatacgcg atagaaaaea 966 aa&tatagcg cgctaactag gataaattat cgcgcgcggt çtcatctatg ttactagatc 1026 ggggatcgat 1036 85 <210> 21 <211> 52 <212> ADN <213> constructo sintético <4 0 0> 21 agcttggata aaagagacaa gttgattggc agctgtgttt ggggcgccgt ca 52 <210 > 22 <211> 56 <212> ADN <213 > constructo sintético <400> 22 agtgtagttg acggcgcccc aaacacagct gccaatcaac ttgtctcttt tatcca 56 <210> 23 <211> 52 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 23 actacactag tgactgcaac ggcgagtgca agcgccgcgg ttacaagggt gg 52 <210> 24 <211> 52 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 24 cacaatggcc acccttgtaa ccgcggcgct tgcactcgcc gttgcagtca ct 52 <210> 25 <211> 56 86 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 25 ccattgtgga tccttcgcta acgttaactg ttggtgtgaa acctgatagg tcgaca 56 <210> 26 <211> 52 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 26 gatctgrcga cctatcaggt ttcacaccaa cagttaacgt tagcgaagga tc 52

<210> 27 <211> 42 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 27 gatccttcgc taacgttaac tgttggtgta gaacctgata gg 42

<210> 28 <211> 42 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 28 tcgacctatc aggttctaca ccaacagtta acgttagcga ag 42 <210> 29 <211> 32 87 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 29 ctagtgactg caacggcgag tgcttgttgc gc 32

<210> 30 <211> 26 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 30 gcaacaagca ctcgccgttg cagtca 26

<210> 31 <211> 32 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 31 ctagtgactg cgctgctgag tgcaagcggc gc 32

<210> 32 <211> 26 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 32 gccgcttgca ctcagcagcg cagtca 26 <210> 33 <211> 40 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 33 agcttggata aaagagctgc tgctgctggt agctgtgttt 40

<210> 34 <211> 18 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 34 ggggcgccgt caactaca 18

<210> 35 <211> 22 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 35 ctagtgtagt tgacggcgcc cc 22

<210> 36 <211> 36 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 36 aaacacagct accagcagca gcagctcttt tatcca 36 <210> 37 89

<211> 32 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 37 ctagtgactg cgctgctgag tgcttgttgc gc 32

<210> 38 <211> 26 <212> ADN <213> constructo sintético <400> 38 gcaacaagca ctcagcagcg cagtca 26 Lisboa, 10 de Outubro de 2007. 90

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração foi tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e a EPO nesse aspecto, renúncia a qualquer responsabilidade.

Documentos de patente citados na descrição FR 2695392 [0006] • US 5554798 A [0062] WO 9011770 A [0006] • US 5489520 A [0062] EP 0508909 A [0023] • US 5510318 A [0062] EP 0507698 A [0050] • US 5204253 A [0062] WO 8707644 A [0051] • US 5405765 A [0062] EP 0633317 A [0052] • EP 442174 A [0062] US 4459355 A [0062] • EP 486233 A [0062] US 4536475 A [0062] • EP 486234 A [0062] US 5464763 A [0062] • EP 539563 A [0062] US 5177010 A [0062] • EP 674725 A [0062] US 5187073 A [0062] • WO 9102071 A [0062] EP 267159 A [0062] • WO 9506128 A [0062] EP 604662 A [0062] • EP 115673 A [0067] EP 672752 A [0062] • WO 8704181 A [0067] US 4945050 A [0062] • EP 337899 A [0067] US 5036006 A [0062] • WO 9638567 A [0067] US 5100792 A [0062] • WO 9704103 A [0067] US 5371014 A [0062] • FR 2725992 [0072] US 5478744 A [0062] • FR 9709115 [0072] US 5179022 A [0062] • FR 2745004 [0072] US 5565346 A [0062] • FR 9710362 [0072] US 5484956 A [0062] • FR 9900843 [0155] US 5508468 A [0062] • FR 9804933 [0155] US 5538877 A [0062] 91

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Claims (41)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Peptídeo que compreende a sequência peptídica da fórmula (I), Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag (I) caracterizado por: Xaa ser -NH2 ou um resto peptídico que compreende de 1 a 10 aminoácidos, de preferência de 1 a 6 aminoácidos, compreendendo pelo menos um aminoácido básico, que representa a seguinte sequência peptidica Xaa'-Gly-Xaa"- na qual Xaa' representa NH2 ou um resto peptidico compreendendo de 1 a 9 aminoácidos, e Xaa" representa um resto peptidico compreendendo um aminoácido, escolhido entre Leu, Ile; Vai; Pro, Ser ou Thr, Xab ser um resto peptidico que compreende 10 aminoácidos, Xac ser um resto peptidico que compreende 3 aminoácidos, e pelo menos um aminoácido ácido, Xad representar a seguinte sequência peptidica -Lys-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Gly-His- Xae representar a seguinte sequência peptidica -Gly-Xae'-Asn-, na qual Xae' representa um resto peptidico que compreende 5 aminoácidos, Xaf ser um triptofano, e Xag ser -OH ou um resto peptidico que comprende de 1 a 2 aminoácidos. 1
2. 2. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os aminoácidos básicos serem escolhidos entre a lisina, a arginina ou a homoarginina.
3. 3. Peptideo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por Xac representar a seguinte sequência peptidica -Asn-Xac'-Xac"-, na qual Xac' representa um resto peptidico de 1 aminoácido, e Xac" representa um resto peptidico de 1 aminoácido ácido.
4. 4. Peptideo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por os ditos aminoácidos ácidos serem escolhidos entre o ácido glutámico (Glu) ou o ácido aspártico (Asp).
5. 5. Peptideo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por Xac representar a sequência peptidica seguinte -Asn-Gly-Glu-.
6. 6. Peptideo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado por Xab representar a sequência peptidica seguinte -Val-Xab'-Asp- na qual Xab' representa um resto peptidico que compreende 8 aminoácidos, e/ou Xag representa a sequência peptidica seguinte -Glu-Xag' na qual Xag' representa OH ou um resto variável de sequência que compreende 1 aminoácido.
7. 7. Peptideo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por Xaa representar a sequência peptidica seguinte NH2-Asp-Lys-leu-ile-Gly-Ser-, e/ou Xab representar a sequência peptidica seguinte -Val-Trp-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Thr-Ser-Asp e/ou Xae representar a sequência peptidica seguinte -Gly-Ser-Phe-Ala-Asn-Val-Asn e/ou Xag representar a sequência peptidica seguinte -Glu-Thr-OH. 2
8. 8. Peptídeo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por este estar representado pelo identificador de n° 2 (SEQ ID NO 2).
9. 9. Peptídeo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado por este compreender uma ou outra das suas extremidades, ou as duas, dos resíduos peptídicos necessários para a sua expressão e reconhecimento num organismo hospedeiro.
10. 10. Peptídeo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado por os resíduos cisteínas do peptídeo da fórmula (I) formarem pelo menos uma ponte de dissulfureto intra-molecular.
11. 11. Peptídeo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por este compreender 3 pontes de dissulfureto estabelecidas entre os resíduos cisteína lei, 2e5e3e6.
12. 12. Peptídeo de fusão "peptídeo-heliomicina", caracterizado por um peptídeo heliomicina de acordo com uma das reivindicações de 1 a 11, e um resto peptídico susceptível de ser clivado através de sistemas enzimáticos de um organismo hospedeiro, permitindo a libertação da heliomicina.
13. 13. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o peptídeo fundido com heliomicina ser um peptídeo sinal ou um peptídeo de trânsito.
14. 14. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o peptídeo de trânsito ser o peptídeo sinal do gene PR-Ία do tabaco, o precursor do factor Mat alfa 1 ou o peptídeo sinal do gene PG1 de poligalacturonase de milho. 3
15. 15. Peptideo de fusão de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por este estar representado pelo identificador de sequência n° 1 (SEQ ID NO 1), pelo identificador de sequência n° 3 (SEQ ID NO 3), ou pelo identificador de sequência n° 18 (SEQ ID NO 18) .
16. 16. Na qualidade de medicamento, o peptideo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 15.
17. 17. Composição caracterizada por esta compreender o peptideo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 15 e um veiculo apropriado.
18. 18. Fragmento de ácido nucleico, caracterizado por este compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptideo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 15.
19. 19. Fragmento de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por este se tratar de uma sequência nucleotidea do tipo adn.
20. 20. Fragmento do ácido nucleico de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a sequência nucleotidea de tipo ADN que compreende a sequência de adn descrito para as bases 16 a 147 do identificador de sequência n°l (SEQ ID NO 1), pelo identificador de sequência n°2 (SEQ ID NO 2), para as bases de 3 a 224 do identificador de sequência n°3 (SEQ ID NO 3), ou para as bases de 7 a 205 do identificador de sequência n°18 (SEQ ID NO 18), uma sequência homóloga ou uma sequência complementar da dita sequência.
21. 21. Gene quimérico que compreende uma sequência codificante assim como elementos de regulação na posição 5' e 3' heterólogos que podem funcionar num organismo hospedeiro, em particular as plantas, caracterizado por a sequência codificante compreender 4 pelo menos um fragmento de ADN como está definido nas reivindicações 18 a 20.
22. 22. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o organismo hospedeiro ser um microrganismo.
23. 23. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o organismo hospedeiro ser escolhido entre as células vegetais e as plantas.
24. 24. Vector de clonagem ou de expressão para a transformação de um organismo hospedeiro caracterizado por este compreender pelo menos uma origem de replicação e pelo menos um gene quimérico como o está definido nas reivindicações de 21 a 23.
25. 25. Organismo hospedeiro não humano transformado, caracterizado por este conter um fragmento de ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações de 18 a 20, ou um gene quimérico de acordo com uma das reivindicações de 21 a 23.
26. 26. Organismo hospedeiro transformado de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por se tratar de um microrganismo, de uma célula vegetal ou de uma planta.
27. 27. Organismo hospedeiro transformado de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por se tratar de uma planta que contém as células transformadas.
28. 28. Organismo hospedeiro de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por a planta ser regenerada a partir das células transformadas.
29. 29. Organismo hospedeiro transformado de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por o microrganismo ser escolhido entre as bactérias, em particular E. coli, as leveduras, em particular as do género Saccharomyces ou 5 Kluyveromyces, Pichia, os fungos, em particular Aspergillus, ou os bacilovirus.
30. 30. Célula vegetal transformada, caracterizada por esta conter um fragmento de ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações de 18 a 20 ou um gene quimérico de acordo com uma das reivindicações de 21 a 23.
31. 31. Planta transformada, caracterizada por esta compreender pelo menos uma célula vegetal transformada de acordo com a reivindicação 30.
32. 32. Planta transformada de acordo com a reivindicação 31, caracterizada por esta ser resistente às doenças provocadas por Cercospora, em particular Cercospora beticola, Cladosporium em particular Cladosporium herbarum, Fusarium, em particular Fusarium culmorum ou Fusarium graminearum, ou por Phytophthora, em particular Phytophtora cinnamomi.
33. 33. Planta transformada caracterizada por esta ser oriunda do cultivo e/ou do cruzamento das plantas de acordo com uma das reivindicações de 31 ou 32, e por ela conter um fragmento de ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações de 18 a 20 ou um gene quimérico de acordo com uma das reivindicações 21 a 23.
34. 34. Sementes das plantas transformadas de acordo com uma das reivindicações de 31 a 33, caracterizadas por estas conterem um fragmento do ácido nucleico de acordo com uma das reivindicações de 18 a 20 ou um gene quimérico de acordo com uma das reivindicações de 21 a 23.
35. 35. Método de transformação dos organismos hospedeiros não humanos, em particular das células vegetais ou das plantas, caracterizado por no dito organismo hospedeiro ser insertado pelo menos um fragmento de ácido nucleico de acordo com uma das 6 reivindicações de 18 a 20 ou um gene quimérico de acordo com uma das reivindicações de 21 a 23.
36. 36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por o organismo hospedeiro ser uma célula vegetal ou uma planta.
37. 37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por este regenerar uma planta a partir da célula vegetal ou da planta transformada.
38. 38. Método de cultivo das plantas transformadas de acordo com uma das reivindicações de 31 a 33, caracterizado por este consistir em plantar as sementes das ditas plantas transformadas numa superfície de um campo apropriado para o cultivo das ditas plantas, em aplicar sobre a dita superfície do dito campo uma composição agro-química sem afectar de maneira substancial as ditas sementes ou as ditas plantas transformadas, seguidamente em recolher as plantas cultivadas quando atinjam a maturidade desejada e eventualmente em separar as sementes das plantas colhidas.
39. 39. Método de cultivo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por a composição agro-química compreender pelo menos um produto activo que têm pelo menos uma actividade fungicida e/ou bactericida.
40. 40. Método de cultivo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por o produto activo apresentar uma actividade complementar desse peptídeo de acordo com uma das reivindicações de 1 a 15.
41. 41. Método de preparação da heliomicina definida de acordo com uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado por este compreender as etapas de cultivo de um organismo transformado de acordo com uma das reivindicações de 25 a 2 9, num meio de 7 cultivo apropriado, seguido da extracção e da purificação total ou parcial da heliomicina obtida. Lisboa, 10 de Outubro de 2007. 8