ES2291021T3 - Gen codificando para la heliomicina y su utilizacion. - Google Patents
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Abstract
Péptido comprendiendo la secuencia peptídica de fórmula (I), Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag (I) en la cual: Xaa es -NH2 o un resto peptídico comprendiendo de 1 a 10 aminoácidos, de preferencia de 1 a 6 aminoácidos, comprendiendo al menos un aminoácido básico, representando la secuencia peptídica siguiente Xaa¿-Gly-Xaa¿- en la cual Xaa¿ representa NH2 o un resto peptídico comprendiendo 1 a 9 aminoácidos, y Xaa¿ representa un resto peptídico comprendiendo un aminoácido, elegido entre Leu, Ile; Val; Pro, Ser o Thr, Xab es un resto peptidico comprendiendo 10 aminoácidos, Xac es un resto peptídico comprendiendo 3 aminoácidos, comprendiendo al menos un aminoácido ácido, Xad representa la secuencia peptídica siguiente -Lys-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Gly-His-Xae representa la secuencia peptídica siguiente -Gly-Xae¿-Asn-, en la cual Xae¿ representa un resto peptídico comprendiendo 5 aminoácidos, Xaf es un triptófano, y Xag es -OH o un resto peptídico comprendiendo de 1 a 2 aminoácidos.
Description
Gen codificando para la heliomicina y su
utilización.
La presente invención tiene como objeto un nuevo
péptido rico en cisteínas llamado heliomicina, su utilización en
calidad de medicamento y las composiciones que comprende, una
secuencia de ADN codificando para este péptido, un vector
conteniéndolo para la transformación de un organismo huésped y el
procedimiento de transformación de dicho organismo.
La invención se refiere de una forma más
particular a la transformación de las células vegetales y de las
plantas, la heliomicina producida por las plantas transformadas
confiriéndoles una resistencia a las enfermedades, en particular de
origen fúngico.
Existe hoy una necesidad creciente de volver
resistentes a las plantas contra las enfermedades particularmente
fúngicas con el fin de disminuir, incluso de evitar, de tener que
recurrir a los tratamientos con productos de protección
antifúngicos, con el fin de proteger el medio ambiente. Un medio
para aumentar esta resistencia a las enfermedades consiste en
transformar las plantas de manera que éstas produzcan las
sustancias llegando incluso a asegurar su defensa contra estas
enfermedades.
En el ámbito de la salud humana, existen
infecciones fúngicas oportunistas para las cuales no hay disponible
actualmente ningún tratamiento realmente eficaz. En particular, es
el caso de ciertas micosis invasivas graves que afectan a los
pacientes hospitalizados cuyo sistema inmunitario queda debilitado
a consecuencia de un transplante, de una quimioterapia o de la
infección por el VIH. En comparación con el arsenal de los agentes
antibacterianos, la panoplia actual de los agentes antifúngicos es
muy limitada. Existe por lo tanto una necesidad real de
caracterizar y de desarrollar nuevas clases de sustancias
antifúngicas.
Se conocen diferentes sustancias de origen
natural, en particular péptidos, que presentan las propiedades
bactericidas o fungicidas, particularmente contra los hongos
responsables de las enfermedades de las plantas. Sin embargo, un
primer problema consiste en hallar tales sustancias que podrán no
sólo ser producidas a través de plantas transformadas, sino que
también podrán conservar sus propiedades bactericidas o fungicidas y
conferirlas a dichas plantas. En cuanto al sentido de la presente
invención, se entiende por bactericida o fungicida tanto las
propiedades bactericidas o fungicidas propiamente dichas como las
propiedades bacteriostáticas o fungistáticas.
Se conocen igualmente los péptidos ricos en
cisteínas que presentan actividades bactericidas o
bacteriostáticas, pero que no presentan actividad fungicida o
fungistática. Otro problema consiste en hallar un péptido rico en
cisteínas que presente una fuerte actividad fungicida o fungistática
con respecto a los péptidos del estado de la técnica. FR 2695392
enseña la existencia de defensinas aisladas de larvas de insectos,
con actividad antibacteriana. Ninguna actividad antifúngica está
demostrada, ni tampoco prevista en la descripción.
WO 90/11770 describe las defensinas aisladas de
mamíferos, con actividad antifúngica y antibacteriana. Estas
defensinas son de este modo claramente diferentes estructuralmente
de las moléculas según la invención. De hecho, Hoffmann et
al (Immunol. Today; 1992, 13, 10, 411-5) es una
revista que evalúa el estado de la técnica, e indica claramente que
las defensinas de insectos poseen las actividades antibacterianas,
esencialmente contra las bacterias Gram-positivas,
en menor grado Gram-negativas, diferenciándose
fuertemente de las defensinas de mamíferos, en particular desde un
punto de vista estructural, antepasado común, o localización. Este
documento indica igualmente que no ha sido posible detectar ninguna
actividad antifúngica para las defensinas de insectos,
contrariamente a las defensinas de mamíferos.
La heliomicina es un péptido aislado a partir de
la hemolinfa del lepidóptero Heliothis virescens que
presenta una actividad fungicida contra los hongos responsables de
las enfermedades de las plantas y los hongos de la patología humana
y animal. Después de haber sintetizado antes de todo el gen de la
heliomicina, se ha hallado igualmente que podía ser insertado en un
organismo huésped, como una levadura o una planta, para expresar la
heliomicina y sea producir la heliomicina purificada o no, o sea
conferir a dicho organismo huésped propiedades de resistencia a las
enfermedades fúngicas, aportando una solución particularmente
ventajosa a los problemas enunciados arriba.
La invención por lo tanto antes de todo tiene
como objetivo la heliomicina, su utilización en calidad de
medicamento o en agroquímica para la protección de las plantas, las
composiciones que comprende, un fragmento de ácido nucleico que
codifica para la heliomicina, un gen quimérico que incluye dicho
fragmento que codifica para la heliomicina así como elementos
heterólogos de regulación en la posición 5' y 3' que pueden
funcionar en un organismo huésped, en particular en las levaduras o
las plantas y un vector para la transformación de los organismos
huéspedes que contienen este gen quimérico, y el organismo huésped
transformado. Se refiere a también una célula vegetal transformada
que contiene al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica
para la heliomicina y una planta resistente a las enfermedades
conteniendo dicha célula, en particular regenerada a partir de esta
célula. Ésta se refiere finalmente a un procedimiento de
transformación de las plantas para volverlas resistentes a las
enfermedades, en el cual se inserta un gen que codifica para la
heliomicina a través de un vector apropiado. Ésta se refiere
finalmente a un procedimiento de preparación de la heliomicina a
través de organismos huéspedes transformados.
\newpage
Por heliomicina, se entiende según la invención
todo péptido que incluye esencialmente la secuencia peptídica de la
fórmula (I) más abajo,
(I)Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag
en la
cual:
Xaa es -NH_{2} o un resto peptídico
comprendiendo de 1 a 10 aminoácidos, de preferencia de 1 a 6
aminoácidos, comprendiendo al menos un aminoácido básico,
representando la secuencia peptídica siguiente
Xaa'-Gly-Xaa''- en la cual Xaa'
representa NH_{2} o un resto peptídico que incluye 1 a 9
aminoácidos, de preferencia 1 a 5 aminoácidos, y Xaa'' representa
un resto peptídico que incluye al menos un aminoácido, elegido de
preferencia entre Leu, Ile, Val, Pro, Ser o Thr
Xab es un resto peptídico comprendiendo de 1 a
10 aminoácidos, de preferencia 10,
Xac es un resto peptídico de 3 aminoácidos que
incluye al menos un aminoácido ácido,
Xad representa la secuencia peptídica siguiente
-Lys-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Gly-His-
Xae representa la secuencia peptídica siguiente
-Gly-Xae'-Asn-, en la cual Xae'
representa un resto peptídico comprendiendo 5 aminoácidos,
Xaf es un triptófano, y
Xag es -OH o un resto peptídico que incluye de 1
a 2 aminoácidos.
Por aminoácidos básicos, se entiende de una
forma más particular según la invención los aminoácidos elegidos
entre la lisina, la arginina o la homoarginina.
Según otro modo preferencial de realización de
la invención, Xac incluye exactamente un aminoácido ácido.
De manera ventajosa, Xac representa la secuencia
peptidica siguiente
-Asn-Xac'-Xac''-, en la cual Xac'
representa un resto peptídico de 1 aminoácido, y Xac'' representa
un resto peptídico de 1 aminoácido ácido.
Por aminoácido ácido se entiende según la
invención todo aminoácido comprendiendo sobre una cadena lateral
una función ácido orgánico, de una forma más particular ácido
carboxílico, de preferencia elegido entre el ácido glutámico (Glu)
o el ácido aspártico (Asp).
De manera preferencial, Xac representa la
secuencia peptídica siguiente
-Asn-Gly-Glu- o
-Ala-Ala-Glu-.
De manera ventajosa,
Xaa representa la secuencia peptídica siguiente
Xaa'-Gly-Xaa''- en la cual Xaa'
representa NH_{2} o un resto peptídico comprendiendo 1 a 9
aminoácidos, de preferencia 1 a 5 aminoácidos, y Xaa'' representa
un resto peptídico comprendiendo al menos un aminoácido, elegido de
preferencia entre Leu, Ile, Val, Pro, Ser o Thr, y/o
Xab representa la secuencia peptidica siguiente
-Val-Xab'-Asp-, en la cual Xab'
representa un resto peptídico comprendiendo de 0 a 8 aminoácidos, de
preferencia 8, y/o
Xae representa la secuencia peptídica siguiente
-Gly-Xae'-Asn-, en la cual Xae'
representa un resto peptídico comprendiendo 5 aminoácidos, y/o
Xaf es un triptófano y/o
Xag representa la secuencia peptídica siguiente
-Glu-Xag' en la cual Xag' representa OH o un resto
comprendiendo 1 aminoácido.
Según un modo de realización más preferencial de
la invención, Xaa representa la secuencia peptídica siguiente
NH_{2}-Asp-Lys-Leu-lle-Gly-Ser-
o
NH_{2}-Ala-Ala-Ala-AIa-GIy-Ser-,
y/o Xab representa la secuencia peptídica siguiente
-Val-Trp-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Thr-Ser-Asp-,
y/o Xae representa la secuencia peptidica siguiente
-Gly-Ser-Phc-Ala-Asn-Val-Asn-,
y/o Xaf representa el aminoácido siguiente -Trp-, y/o Xag representa
la secuencia peptídica siguiente
Glu-Thr-OH o
Arg-Thr-OH.
Según un modo de realización más preferencial de
la invención, la heliomicina es el péptido representado con su
secuencia codificante por el identificador de secuencia nº 2 (SEC
ID NO 2). La misma secuencia se describe, correspondiente a los
aminoácidos 6 a 49 del identificador de secuencia nº 1 (SEC ID NO
1) con una secuencia codificante diferente.
El residuo NH_{2} terminal puede presentar una
modificación post- traduccional, por ejemplo una acetilación, al
igual que el residuo C-terminal puede presentar una
modificación post-traduccional, por ejemplo una
amidación.
Por secuencia peptídica comprendiendo
esencialmente la secuencia peptídica de fórmula general (I), se
entiende no sólo las secuencias definidas arriba, sino también las
secuencias que comprenden en una o en la otra de sus extremidades,
o en ambas, los residuos peptídicos necesarios para su expresión y
reconocimiento en un organismo huésped. Por organismo huésped se
entiende todo organismo comprendiendo al menos una célula, que
consista en microorganismos, en particular una levadura o una
bacteria, o incluso células vegetales o incluso organismos
superiores como las plantas.
Se trata en particular de un péptido de fusión
péptido-heliomicina, cuyo corte por los sistemas
enzimáticos del organismo huésped permite la liberación de la
heliomicina, la heliomicina estando definida arriba. El péptido
fusionado a la heliomicina puede ser un péptido señal o un péptido
de tránsito que permite controlar y orientar la producción de la
heliomicina de manera específica en una parte del organismo
huésped, como por ejemplo el citoplasma, la membrana celular, o en
el caso de las plantas en un tipo particular de compartimientos
celulares o de tejidos o en la matriz extracelular.
Según un modo de realización, el péptido de
tránsito puede ser una señal de direccionamiento cloroplástico o
mitocondrial, el cual se divide a continuación en los cloroplastos
o las mitocondrias.
Según otro modo de realización de la invención,
el péptido señal puede ser una señal N-terminal o
"prepéptido", eventualmente en asociación con una señal
responsable de la retención de la proteína en el retículo
endoplasmático, o un péptido de direccionamiento vacuolar o
"propéptido D". El retículo endoplasmático es el lugar en el
que la "maquinaria celular" toma a su cargo las operaciones de
maduración de la proteína producida, como por ejemplo la división
del péptido señal.
Los péptidos de tránsito pueden ser sea
sencillos, sea dobles, y en tal caso eventualmente separados por
una secuencia intermedia, es decir comprendiendo, en el sentido de
la transcripción, una secuencia que codifica para un péptido de
tránsito de un gen vegetal codificando para una enzima con
localización plastidial, una parte de la secuencia de la parte
madura N-terminal de un gen vegetal codificando
para una enzima con localización plastidial, luego una secuencia
codificando para un segundo péptido de tránsito de un gen vegetal
codificando para una enzima con localización plastidial, tal y como
está descrito en la solicitud EP 0 508 909.
Como péptido de tránsito útil según la
invención, se puede citar en particular el péptido señal del gen
PR-1\alpha del tabaco descrito por Comelissen
& coll., representado con su secuencia codificante por el
identificador de secuencia nº 2, en particular cuando la
heliomicina es producida a través de las células vegetales o de las
plantas, o del precursor del factor Matal cuando la heliomicina es
producida en levaduras.
El péptido de fusión
"MF\alpha1/heliomicina" junto con los cinco residuos del
propéptido del factor MF\alpha1
(Ser-Leu-Asp-Lys-Arg),
situados en la posición N-terminal y su secuencia
codificante forman parte de la presente invención, en particular
descritos por el identificador de secuencia nº 1 (SEC ID NO 1),
correspondientes a los aminoácidos 1 a 49.
El péptido de fusión "péptido señal
PR-1\alpha-heliomicina" y su
secuencia codificante forman parte igualmente de la presente
invención, en particular descritos por el identificador de
secuencia nº 3 (SEC ID NO 3).
El péptido de fusión que incluye el péptido
señal del gen PG1 de poligalacturonasa de maíz fusionado a la
heliomicina "péptido señal PG1/heliomicina" está representado
con su secuencia codificante por los identificadores de secuencias
nº 18 y 20 (SEC ID NO 18 y SEC ID NO 20).
Según un modo preferencial de realización de la
invención, los residuos cisteínas del péptido de fórmula (I) forman
al menos un puente disulfuro intramolecular, de preferencia tres
puentes disulfuro. Según un modo preferencial de realización de la
invención los puentes disulfuro se establecen entre los residuos de
cisteína 1 y 4, 2 y 5 y 3 y 6.
La heliomicina es un péptido particularmente
activo contra los hongos y las levaduras, y de este modo puede ser
empleado a modo preventivo o curativo para proteger diferentes
organismos contra las agresiones fúngicas. La presente invención se
refiere por lo tanto a la heliomicina en calidad de medicamento.
Ésta se refiere igualmente a la utilización de la heliomicina para
el tratamiento de las plantas contra las agresiones fúngicas,
aplicando la heliomicina directamente sobre dichas plantas.
La presente invención se refiere igualmente a
una composición comprendiendo la heliomicina y un vehículo
apropiado. El vehículo apropiado tiene como primera calidad el
hecho de no degradar de manera sustancial la heliomicina en la
composición, y de no disminuir las propiedades bactericidas y
fungicidas de la heliomicina. Esta composición puede ser una
composición cosmética y en tal caso el vehículo apropiado es
cosméticamente aceptable (adaptado además para una aplicación sobre
la piel o las faneras), o una composición farmacéutica para un uso
terapéutico y en tal caso el vehículo apropiado es
farmacéuticamente aceptable y apropiado para una administración de
la heliomicina por vía tópica, por vía oral o por inyección, o
incluso una composición agroquímica y en tal caso el vehículo
apropiado es agroquímicamente aceptable, apropiado para una
aplicación sobre las plantas o en la proximidad de las plantas, sin
degradarlas.
La presente invención se refiere igualmente a un
fragmento de ácido nucleico, en particular de ADN. natural o
sintético, que codifica para la heliomicina definida arriba,
comprendido el péptido de fusión
"péptido-héliomicina" definido arriba. Puede
tratarse según la invención de un fragmento sintetizado o aislado
del lepidóptero Heliothis, o incluso de un fragmento
derivado, adaptado para la expresión de la heliomicina en el
organismo huésped en el que el péptido será expresado. El fragmento
de ácido nucleico puede ser obtenido según los métodos estándares
de aislamiento y de purificación, o incluso por síntesis según las
técnicas usuales de hibridaciones sucesivas de oligonucleótidos
sintéticos. Estas técnicas están particularmente descritas por
Ausubel et al.
Según la presente invención, se entiende por
"fragmento de ácido nucleico" una secuencia nucleótida que
puede ser de tipo ADN o ARN, de preferencia de tipo ADN,
particularmente bicatenario.
Según un modo de realización de la invención, el
fragmento de ácido nucleico que codifica para la heliomicina
incluye la secuencia de ADN descrita por las bases 16 a 147 del
identificador de secuencia nº 1 (SEC ID NO 1), o por el
identificador de secuencia nº 2 (SEC ID NO 2), en particular la
parte codificante de esta secuencia correspondiente a las bases 1 a
132, una secuencia homóloga o una secuencia complementaria de dicha
secuencia.
Según otro modo de realización de la invención,
el fragmento de ácido nucleico codificando para el péptido de
fusión "péptido-heliomicina" incluye la
secuencia de ADN descrita por el identificador de secuencia nº1 (SEC
ID NO 1) o aquella descrita por el identificador de secuencia nº 3
(SEC ID NO 3), en particular la parte codificante correspondiente a
las bases 3 a 224, o aquella descrita por el identificador de
secuencia nº 18 (SEC ID NO 18), en particular la parte codificante
correspondiente a las bases 7 a 205, una secuencia homóloga o una
secuencia complementaria de dichas secuencias.
Por "homólogo", se entiende según la
invención un fragmento de ácido nucleico que presenta una o varias
modificaciones de secuencia en relación a la secuencia nucleótida
descrita por los identificadores de secuencias nº 1, 2 o 3 y que
codifica para la heliomicina o el péptido de fusión
"péptido-heliomicina". Estas modificaciones
pueden ser obtenidas según las técnicas usuales de mutación, o
incluso eligiendo los oligonucleótidos sintéticos empleados en la
preparación de dicha secuencia por hibridación. Con respecto a las
múltiples combinaciones de ácidos nucleicos que pueden conducir a la
expresión de un mismo aminoácido, las diferencias entre la
secuencia de referencia descrita por los identificadores de
secuencias nº 1, 2 o 3 y el homólogo correspondiente pueden ser
importantes, más aún cuando se trata de fragmentos de ADN de poco
tamaño realizables por síntesis química. De manera ventajosa, el
grado de homología será de al menos un 70% con respecto a la
secuencia de referencia, más preferiblemente de al menos un 80%,
más preferiblemente de al menos un 90%. Estas modificaciones son
habitualmente neutras, es decir que no afectan a la secuencia
primaria de la heliomicina o del péptido de fusión resultantes.
La presente invención se refiere igualmente a un
gen quimérico (o casete de expresión) que incluye una secuencia
codificante así como unos elementos de regulación en posición 5' y
3' heterólogos que pueden funcionar en un organismo huésped, en
particular las células vegetales o las plantas, la secuencia
codificante comprendiendo al menos un fragmento de ADN que codifica
para la heliomicina o el péptido de fusión
"péptido-heliomicina" como se ha definido
arriba.
Por organismo huésped, se entiende todo
organismo uni o pluricelular, inferior o superior, en el cual el
gen quimérico según la invención puede ser introducido, para la
producción de heliomicina. Se trata en particular de bacterias, por
ejemplo E. coli, de levaduras, en particular de los géneros
Saccharomyces o Kluyveromyces, Pichia, de hongos, en
particular Aspergillus, de un baculovirus, o de preferencia
las células vegetales y de las plantas.
Por "célula vegetal", se entiende según la
invención toda célula proveniente de una planta y que puede
constituir los tejidos indiferenciados tales como los callos, los
tejidos diferenciados tales como los embriones, las partes de
plantas, las plantas o las semillas.
Se entiende por "planta" según la
invención, todo organismo multicelular diferenciado capaz de
fotosíntesis, en particular monocotiledones o dicotelidones, de una
forma más particular las plantas de cultivo destinadas o no a la
alimentación animal o humana, como el maíz, el trigo, la colza, la
soja, el arroz, la caña de azúcar, la remolacha, el tabaco, el
algodón, etcétera.
Los elementos de regulación necesarios para la
expresión del fragmento de ADN que codifica para la heliomicina son
bien conocidos por el experto en la materia en función del
organismo huésped. Estos comprenden particularmente las secuencias
promotoras, activadores de la transcripción, secuencias
terminadoras, comprendidos los codones start y stop. Los medios y
métodos para identificar y seleccionar los elementos de regulación
son bien conocidos por el experto en la materia.
Para la transformación de los microorganismos
como las levaduras o las bacterias, los elementos de regulación son
bien conocidos por el experto en la materia, y comprenden
particularmente secuencias promotoras, activadores de la
transcripción, péptidos de tránsito, secuencias terminadoras y
codones start y stop.
\newpage
Para dirigir la expresión y la secreción del
péptido en el medio de cultivo de la levadura, un fragmento de ADN
que codifica la heliomicina es integrado en un vector transportador
que comprende los elementos siguientes:
- marcadores que permiten seleccionar los
transformantes. De preferencia, se utiliza el gen
ura-3 para la levadura y el gen que confiere la
resistencia a la ampicilina para E. coli.
- una secuencia nucleica que permite la
replicación (origen de replicación) del plásmido en la levadura. De
preferencia se utiliza el origen de replicación del plásmido 2
\mu de levadura,
- una secuencia nucleica que permite la
replicación (origen de replicación) del plásmido en E.
coli,
- un casete de expresión constituido
- (1)
- por una secuencia de regulación promotora. Se puede utilizar toda secuencia promotora de un gen expresándose naturalmente en la levadura. De preferencia, se utiliza el promotor del gen Mf\alpha1 de S. cerevisiae.
- (2)
- por una secuencia que codifica para un péptido señal (o prepéptido) en asociación con un péptido de direccionamiento (o propéptido). Estas regiones son importantes para la secreción correcta del péptido. De preferencia, se utiliza la secuencia codificando el pre-pro-péptido del precursor del factor Mf\alpha1.
- (3)
- por una secuencia de regulación terminadora o de poliadenilación. De preferencia, se utiliza el terminador de la fosfoglicerato quinasa (PGK) de S. cerevisiae. En el casete de expresión, la secuencia que codifica la heliomicina es insertado en sentido descendente de la secuencia pre-pro y en sentido ascendente del terminador de la PGK.
Estos elementos han sido descritos en varias
publicaciones como Reichhart et al.; 1992; Invert. Reprod.
Dev.; 21; págs 15-24 y Michaut et al.; 1996;
FEBS Letters; 395; págs. 6-10.
De manera preferencial, se transforman las
levaduras de la especie S. cerevisiae con el plásmido de
expresión por el método al acetato de litio (Ito y al.; 1993; J.
Bacteriol; 153; pp 163-168). Las levaduras
transformadas son seleccionadas sobre un medio gelificado selectivo
que no contiene uracilo. La producción en masa de las levaduras
transformadas se realiza mediante cultivo durante 24h a 48 h en un
medio líquido selectivo.
La transformación de microorganismos permite
producir heliomicina a mayor escala. La presente invención se
refiere por lo tanto igualmente a un procedimiento de la
preparación de heliomicina, comprendiendo las etapas de cultivo de
un microorganismo transformado comprendiendo un gen que codifica
para la heliomicina como se ha definido arriba en un medio de
cultivo apropiado, luego la extracción y la purificación total o
parcial de la heliomicina obtenida.
De manera preferida, en el momento de la
extracción de la heliomicina producida por las levaduras, se
eliminan las levaduras por centrifugación y se pone en contacto el
sobrenadante de cultivo con una solución ácida que puede ser una
solución de un ácido mineral u orgánico como por ejemplo el ácido
clorhídrico o el ácido acético. El extracto obtenido es a
continuación centrifugado en frío a una velocidad de 4000 a 10.000
rpm a 4ºC, durante 30 a 60 min.
La purificación de la heliomicina puede ser
precedida por una etapa de fraccionamiento del sobrenadante
obtenido después de la etapa de extracción. De manera preferida,
durante la etapa de fraccionamiento, el extracto es depositado
sobre la fase inversa para realizar una extracción en fase sólida.
El lavado de las moléculas solubles en el agua se efectúa con una
solución ácida diluida y la elución de las moléculas hidrófobas con
un eluyente apropiado. Se obtienen buenos resultados con el ácido
trifluoroacético para el lavado y un eluyente conteniendo las
cantidades crecientes de acetonitrilo en solución ácida
diluida.
De manera preferida la purificación de la
heliomicina se efectúa en dos tiempos: una HPLC en intercambio de
cationes seguida por una HPLC en fase inversa con un eluyente
aceptable que puede ser diferente o idéntico al de la fase
precedente. Las diferentes etapas de la purificación son seguidas
por una prueba de inhibición del crecimiento fúngico en medio
líquido. De preferencia, la prueba se efectúa con el hongo
Neurospora crassa.
La secuencia de la heliomicina producida por las
levaduras transformadas es analizada según el método de
secuenciación por degradación de Edman y por espectrometría de
masas. La caracterización estructural se realiza directamente sobre
el péptido producido, sobre el péptido modificado por
reducción/alquilación así como sobre los fragmentos del péptido. La
secuencia peptídica y la masa molecular de la heliomicina producida
han sido comparadas con aquellas de la heliomicina nativa extraída
de la hemolinfa de H. virescens. Los resultados muestran que
las dos moléculas presentan la misma estructura primaria. La
determinación de la posición de los puentes disulfuro indica que la
disposición de los puentes disulfuros es idéntica en los dos
péptidos, el nativo y el producido por el microorganismo
transformado.
La invención se refiere de una forma más
particular a la transformación de las plantas. Como secuencia de la
regulación promotora en las plantas, se puede utilizar toda la
secuencia promotora de un gen que se expresa de forma natural en
las plantas en particular un promotor de origen bacteriano, vírico o
vegetal como, por ejemplo, el de un gen de la pequeña subunidad de
ribulosa- biscarboxilasa/oxigenasa (RuBisCO) o de un gen de virus de
planta como, por ejemplo, el del mosaico de la coliflor (CAMV 19S o
35S), o un promotor inducible por los patógenos como el
PR-la del tabaco, todo promotor aceptable conocido
puede ser utilizado. De preferencia se recurre a una secuencia de
regulación promotora que favorece la sobreexpresión de la secuencia
codificante de manera constitutiva o inducida por el ataque de un
patógeno, como por ejemplo, aquella que incluye al menos un
promotor de histona como se describe en la solicitud EP 0 507
698.
Según la invención, se puede utilizar
igualmente, en asociación con la secuencia de regulación promotora,
otras secuencias de regulación, que están situadas entre el
promotor y la secuencia codificante, tales como los activadores de
la transcripción ("potenciadores"), como por ejemplo el
activador de la translación del virus del mosaico del tabaco (TMV)
descrito en la solicitud WO 87/07644, o del virus etch del tabaco
(TEV) descrita por Carrington & Freed.
Como secuencia de regulación terminadora o de
poliadenilación, se puede utilizar toda la secuencia
correspondiente de origen bacteriano, como por ejemplo el
terminador nos de Agrobacterium tumefaciens, o incluso de
origen vegetal, como por ejemplo un terminador de histona como se
describe en la solicitud EP 0 633 317.
Según la presente invención, el gen quimérico
puede igualmente ser asociado a un marcador de selección adaptado
al organismo huésped transformado. Tales marcadores de selección
son bien conocidos por el experto en la materia. Podrá tratarse de
un gen de resistencia a los antibióticos, o incluso de un gen de
tolerancia a los herbicidas para las plantas.
La presente invención se refiere igualmente a un
vector de clonación o de expresión para la transformación de un
organismo huésped que contiene al menos un gen quimérico como se ha
definido arriba. Este vector incluye además del gen quimérico
anterior, al menos un origen de replicación. Este vector puede
estar constituido por un plásmido, un cósmido, un bacteriófago o un
virus, transformados por la introducción del gen quimérico según la
invención. Tales vectores de transformación en función del organismo
huésped para transformar son bien conocidos por el experto en la
materia y están ampliamente descritos en la bibliografía.
Para la transformación de las células vegetales
o de las plantas, se tratará particularmente de un virus que puede
ser utilizado para la transformación de las plantas desarrolladas y
que contiene además sus propios elementos de replicación y de
expresión. De manera preferencial, el vector de transformación de
las células vegetales o de las plantas según la invención es un
plásmido.
La invención tiene de nuevo como objetivo un
procedimiento de transformación de los organismos huéspedes, en
particular células vegetales por integración de al menos un
fragmento de ácido nucleico o un gen quimérico tal y como se ha
definido anteriormente, la transformación puede ser obtenida por
todo medio conocido apropiado ampliamente descrito en la
bibliografía especializada y particularmente las referencias
citadas en la presente solicitud, de una forma más particular por
el vector según la invención.
Una serie de métodos consiste en bombardear las
células, de los protoplastos o de los tejidos con partículas a las
que se han enganchado las secuencias de ADN. Otra serie de métodos
consiste en utilizar como medio de transferencia en la planta un
gen quimérico insertado en un plásmido Ti de Agrobacterium
tumefaciens o Ri de Agrobacterium rhizogenes.
Se pueden utilizar otros métodos tales como la
microinyección o la électroporación, o incluso la precipitación
directa mediante PEG.
El experto en la materia hará la elección del
método apropiado en función de la naturaleza del organismo huésped,
en particular de la célula vegetal o de la planta.
La presente invención tiene incluso como
objetivo los organismos huéspedes, en particular las células
vegetales o plantas, transformados y conteniendo una cantidad
eficaz de un gen quimérico comprendiendo una secuencia codificante
para la heliomicina definida arriba.
La presente invención tiene incluso como
objetivo las plantas conteniendo las células transformadas, en
particular las plantas regeneradas a partir de las células
transformadas. La regeneración se obtiene por todo procedimiento
apropiado que dependa de la naturaleza de la especie, como se
describe por ejemplo en las referencias anteriores.
Para los procedimientos de transformación de las
células vegetales y de regeneración de las plantas, se citará
particularmente las patentes y solicitudes de patente siguientes:
US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US
5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US
5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022,
US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US
5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765,
EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO
91/02071 y WO 95/06128.
La presente invención se refiere igualmente a
las plantas transformadas provenientes del cultivo y/o del cruce de
las plantas regeneradas arriba, así como a las semillas de plantas
transformadas, conteniendo los ácidos nucléicos y genes quiméricos
según la invención.
Las plantas transformadas de este modo son
resistentes a ciertas enfermedades, en particular a ciertas
enfermedades fúngicas o bacterianas. Y así, la secuencia de ADN que
codifica para la heliomicina puede ser integrada teniendo como
objetivo principal la realización de plantas resistentes a dichas
enfermedades, la heliomicina siendo eficaz contra enfermedades
fúngicas tales como aquellas causadas por Cercospora, en
particular Cercospora beticola, Cladosporium en particular
Cladosporium herbarum, Fusarium, en particular Fusarium
culmorum o Fusarium graminearum, o por
Phytophthora, en particular Phytophtora
cinnamomi.
El gen quimérico podrá comprender igualmente y
de manera ventajosa al menos un marcador de selección, como uno o
varios genes de tolerancia a los herbicidas.
La secuencia de ADN que codifica para la
heliomicina puede igualmente ser integrada como marcador de la
selección en el momento de la transformación de plantas con otras
secuencias que codifican para otros péptidos o proteínas de
interés, como por ejemplo los genes de tolerancia a los
herbicidas.
Tales genes de tolerancia a los herbicidas son
bien conocidos por el experto en la materia y están particularmente
descritos en las solicitudes de patente EP 115 673, WO 87/04181, EP
337 899, WO 96/38567 o WO 97/04103.
Por supuesto, las células y plantas
transformadas según la invención pueden comprender además de la
secuencia que codifica para la heliomicina, otras secuencias
heterólogas que codifican para unas proteínas de interés como otros
péptidos complementarios susceptibles de conferir a la planta
resistencias a otras enfermedades de origen bacteriano o fúngico,
y/u otras secuencias que codifican para unas proteínas de
tolerancia a los herbicidas y/u otras secuencias que codifican para
unas proteínas de resistencia a los insectos, como las proteínas
Bt particularmente.
Las otras secuencias pueden ser integradas por
medio del mismo vector comprendiendo un gen quimérico, el cual
incluye una primera secuencia que codifica para la heliomicina y al
menos otra secuencia que codifica para otro péptido o proteína de
interés.
Éstas pueden igualmente ser integradas a través
de otro vector comprendiendo al menos dicha otra secuencia, según
las técnicas usuales definidas arriba.
Las plantas según la invención pueden incluso de
ser obtenidas por el cruce de los progenitores, uno llevando el gen
según la invención que codifica para la heliomicina, el otro
llevando un gen que codifica para al menos otro péptido o proteína
de interés.
Entre las secuencias que codifican para otros
péptidos antifúngicos, se pueden citar aquellas que codifican para
la drosomicina, descrita en la solicitud de la patente FR 2 725 992
y por Fehlbaum & coll. (1994), y en la solicitud de la patente
no publicada FR 97 09115 depositada el 24 julio 1997, o aquella que
codifica para la androctonina descrita en la solicitud de la patente
FR 2 745 004 y en la solicitud de la patente no publicada FR 97
10362 depositada el 20 agosto 1997.
La presente invención se refiere finalmente a un
procedimiento de cultivo de las plantas transformadas según la
invención, el procedimiento consistiendo en plantar las semillas de
dichas plantas transformadas en una superficie de un campo
apropiado para el cultivo de dichas plantas, en aplicar sobre dicha
superficie de dicho campo una composición agroquímica, sin afectar
de manera sustancial a dichas semillas o a dichas plantas
transformadas, luego en recoger las plantas cultivadas cuando éstas
llegan a la madurez deseada y eventualmente en separar las semillas
de las plantas cosechadas.
Por composición agroquímica, se entiende según
la invención toda composición agroquímica comprendiendo al menos un
producto activo teniendo una de las actividades siguientes,
herbicida, fungicida, bactericida, virucida o insecticida.
Según un modo preferencial de realización del
procedimiento de cultivo según la invención, la composición
agroquímica incluye al menos un producto activo teniendo al menos
una actividad fungicida y/o bactericida, presentando más
preferiblemente una actividad complementaria a aquella de la
heliomicina producida por las plantas transformadas según la
invención.
Por producto que presenta una actividad
complementaria a la de la heliomicina, se entiende según la
invención un producto presentando un espectro de actividad
complementaria, es decir un producto que será activo contra los
ataques de contaminantes (hongos, bacterias o virus) insensibles a
la heliomicina, o incluso un producto cuyo espectro de actividad
recubre el de la heliomicina, totalmente o en parte, y cuya dosis
de aplicación será disminuida de manera sustancial debido a la
presencia de la heliomicina producida por la planta
transformada.
Los ejemplos a continuación permiten ilustrar la
presente invención, sin embargo sin limitar la invención.
\newpage
Ejemplo
I.1
Las larvas maduras de 5º nivel del lepidóptero
H. virescens han sido inmunizadas con la ayuda de una aguja
(30 ga) previamente zambullida en un concentrado de bacterias Gram
positivas (M. luteus) y Gram negativas (E. coli 1106)
preparadas a partir de cultivos realizados en un medio de
Luria-Bertani durante 12 horas a 37ºC. Los animales
infectados de este modo han sido conservados individualmente en
tubos conteniendo un medio nutritivo a base de agar durante 24
horas entre 20ºC y 23ºC. Antes de la extracción de la hemolinfa las
larvas han sido enfriadas sobre hielo.
La hemolinfa (aproximadamente 30 \mul por
larva) ha sido recogida por excisión de un apéndice abdominal y
recogida en tubos de microcentrifugación en polipropileno de 1,5 ml
enfriados en hielo y conteniendo aprotinina como inhibidor de las
proteasas (20 \mug/ml en concentración final) y la feniltiourea
como inhibidor de la melanización (concentración final de 20
\muM). La hemolinfa (2 ml) cosechada de este modo a partir de
larvas inmunizadas ha sido centrifugada a 14000 G durante 1 min a
4ºC con el fin de retirar los hemocitos. La hemolinfa desprovista
de las células sanguíneas ha sido conservada a -20ºC hasta su
utilización.
Después de una descongelación rápida, el plasma
de H. virescens ha sido acidificado hasta pH 3 con una
solución de ácido trifluoroacético al 1%. La extracción en
condición ácida del péptido ha sido realizada durante 30 min bajo
agitación ligera en un baño de agua helado. El extracto obtenido ha
sido a continuación centrifugado a 4ºC durante 30 min a 10 000
g.
Una cantidad de extracto equivalente a 2 ml de
hemolinfa ha sido depositada en un soporte de fase inversa, según
se ha comercializado bajo la forma de cartucho
(Sep-Pak^{TM} C18; Waters Associates), equilibrada
con agua acidificada (TFA 0,05%). Las moléculas hidrófilas han sido
eliminadas por un sencillo lavado con agua acidificado. La elución
del péptido ha sido realizada por una solución de acetonitrilo al
40% preparada en TFA 0,05%. La fracción eluida al 40% de
acetonitrilo ha sido secada al vacío con el objetivo de eliminar el
acetonitrilo y el TFA, después ha sido reconstituida en agua
ultrapura estéril antes de ser sometida a la primera etapa de
purificación.
- primera etapa: la fracción conteniendo el
péptido ha sido analizada por cromatografía de fase inversa sobre
una columna semipreparativa Aquapore RP-300 C_{8}
(Brownlee^{TM}; 220 X 70 mm; 300 A), la elución ha sido realizada
por un gradiente lineal de acetonitrilo del 2 al 60% en el TFA
0.05% durante 120 minutos a una cantidad constante de 1,5 ml/min.
Las fracciones han sido recolectadas manualmente según la variación
de la absorbancia a 225 nm y 254 nm. Las fracciones recogidas han
sido secadas al vacío, reconstituidas con agua ultrapura y
analizadas para su actividad antifúngica utilizando la prueba
descrita más abajo.
- segunda etapa: la fracción antifúngica
correspondiente al péptido ha sido analizada sobre una columna
analítica de fase inversa Aquapore RP-300 C_{8}
(Brownlee^{TM}; 220 X 4,6 mm; 300 A), utilizando un gradiente
lineal difásico de acetonitrilo del 2% al 22% en 10 min y del 22 al
32% en 50 min en TFA 0,05% con una cantidad constante de 0,8
ml/min. Las fracciones han sido cosechadas manualmente según la
variación de la absorbancia a 225 nm y 254 nm. Las fracciones
recogidas han sido secadas al vacío, reconstituidas con agua
ultrapura y analizadas para su actividad antifúngica en las
condiciones descritas más abajo.
- tercera etapa: la fracción antifúngica
conteniendo el péptido ha sido purificada hasta su homogeneidad en
una columna de fase inversa Narrowbore
Delta-Pak^{TM} HPlC_{18} (Waters Associates; 150
X 2,2 mm) utilizando un gradiente lineal difásico de acetonitrilo
del 2% al 24% en 10 min y del 24 al 44% en 100 min en TFA 0,05% con
una cantidad constante de 0,25 ml/min a una temperatura controlada
de 30ºC. Las fracciones han sido cosechadas manualmente- según la
variación de la absorbancia a 225 nm. Las fracciones recogidas han
sido secadas al vacío, reconstituidas con agua ultrapura filtrada y
analizadas para su actividad antifúngica.
\newpage
Ejemplo
I.2
La pureza del péptido antifúngico ha sido
verificada por electrofóresis capilar de zona en un modelo
270-HT (PEApplied Biosystems división de Perkin
Elmer). 1 nl de una solución a 50 \muM de péptido purificado ha
sido inyectada bajo asistencia al vacío en un capilar de sílice (72
cm X 50 pm) y el análisis ha sido realizado en tampón citrato 20 mM
a pH 2,5. La electrofóresis ha sido realizada a 20 kV del ánodo al
cátodo durante 20 min a 30ºC. La migración ha sido registrada a 200
nm.
[0084] El número de residuos cisteína ha sido
determinado sobre el péptido nativo por reducción y
S-piridiletilación. 100 pmoles de péptido nativo han
sido reducidos en 40 \mul de tampón Tris/HCl 0,5 m, pH 7, 5
conteniendo 2 mM JFDTA y 6 M de cloruro de guanidinio en presencia
de 2 \mul de ditiotreitol 2.2 M el medio reactivo ha sido
colocado bajo atmósfera de nitrógeno. Después de 60 min de
incubación a oscuras; 2 \mul de 4-vinilpiridina
frescamente destilada han sido agregados a la reacción que ha sido
entonces incubada durante 10 min a 45ºC a oscuras y bajo atmósfera
de nitrógeno. El péptido piridiletilado ha sido a continuación
separado de los componentes del medio reactivo por cromatografía de
fase inversa utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo en
presencia de TFA 0,05%.
Las medidas de masas han sido efectuadas en un
espectrómetro de masas MALDI-TOF Bruker Biflex
(Bremen, Alemania) en modo lineal positivo. Los espectros de masas
han sido calibrados de manera externa con una mezcla estándar de
péptidos de m/z conocidas, respectivamente 2199.5 Da; 3046.4 Da y
4890.5 Da. Los diferentes productos para analizar han sido
depositados sobre una capa fina de cristales de ácido
\alpha-eyano-4-hidroxicinámico
obtenida por una evaporación rápida de una solución saturada en la
acetona. Después del secado bajo un ligero vacío, las muestras han
sido lavadas por una gota de ácido trifluoroacético al 0,1% antes de
ser introducidas en el espectrómetro de masas.
La secuenciación automática por degradación de
Edman del péptido nativo, del péptido
S-piridiletilado y de los diferentes fragmentos
obtenidos después de las diferentes divisiones proteoliticas y de
la detección, se han realizado derivados feniltiohidantoínas en un
secuenciador ABI473A (PEApplied Biosystems división de Perkin
Helmer).
200 pmoles de péptido reducido y
S-piridiletilado han sido incubadas en presencia de
5 pmoles de endoproteinasa-Lys-C
(Achromobacter protease 1, división específica de los
residuos lisina del lado C-terminal, Takara. Otsu)
según las condiciones provistas por el proveedor (Tris HCl 10 mM pH
9 en presencia de Tween 20 al 0,01%). Después de la interrupción de
la reacción con TFA 1%, los fragmentos peptídicos han sido
separados por HPLC en fase inversa sobre una columna de tipo
Narrowbore Delta-Pak^{TM} HPlC_{18} (Waters
Associates; 150 X 2 mm) en un gradiente lineal de acetonitrilo del 2
al 60% en 80 min en TFA 0,05% con una cantidad de 0,2 ml/min y una
temperatura constante de 37ºC. Los fragmentos obtenidos han sido
analizados por espectrometría de masas MALDI-TOF y
el péptido correspondiente al fragmento C-terminal
ha sido secuenciado por degradación de Edman.
El péptido nativo (8 pg) ha sido incubado
durante 1 hora en presencia de 4 pg de termolisina (Boehringer
Manheim, relación termolisina/péptido; 1/2 en peso : peso) a 37ºC
en el tampón MES (N-etilmorfolina) 0,1 M a pH 7 en
presencia de 2 mM de CaCl2. La reacción ha sido detenida mediante la
adición de ácido fórmico y los productos de la reacción han sido
inmediatamente separados por cromatografía de fase inversa sobre
una columna Narrowbore Delta-Pak^{TM} HPlC18
(Waters Associates; 150 X 2,2 mm) en un gradiente lineal de
acetonitrilo del 2 al 50% en 100 min en el caso del TFA 0,05% hasta
la cantidad de 0,2 ml/min a 30ºC precedida por una etapa isocrática
al 2% de acetonitrilo durante 10 min. Los fragmentos obtenidos han
sido analizados por espectrometria de masas
MALDI-TOF y secuenciados por degradación de
Edman.
Todas las técnicas utilizadas a continuación son
las técnicas estándares de laboratorio. Los protocolos detallados
de estas técnicas han sido particularmente descritos en Ausubel
et al.
Ejemplo
II-1
El ensamblaje ha sido realizado a partir de 6
oligonucleótidos sintéticos codificando para los 44 aminoácidos de
la heliomicina precedidos por los 5 aminoácidos
C-terminales de la preprosecuencia del factor a
(Mf\alpha1) de la levadura. Los oligonucleótidos representados en
la figura 1 han sido elegidos teniendo en cuenta los codones
preferenciales utilizados por S. cerevisiae.
El ensamblaje se ha desarrollado en varias
etapas:
- los oligonucleótidos 2 a 5 han sido
fosforiladados en sus extremidades 5' por acción de la
polinucléotido quinasa (New England Biolabs);
- los oligonucleótidos 1 a 6 han sido mezclados,
calentados a 100ºC e hibridizados por disminución lenta de la
temperatura a 25ºC durante 3 horas;
- los oligonucleótidos hibridizados han sido
sometidos a un tratamiento por la ligasa del bacteriófago T4 (New
England Biolabs) durante 15 horas a 15ºC;
- el bloque de ADN resultante de la hibridación
de los oligonucleótidos se representa en la figura 1, cerrado por
los sitios de restricción HinDIII y BglII, ha sido insertado en el
plásmido pBluescript SK+ (Stratagéne) digerido por las enzimas
HinDIII y BamHI (BglII y BamHI son compatibles). La mezcla de
ligación a continuación ha sido utilizada para transformar las
células compétentes de E. coli DH5\alpha. (Stratagéne).
Varios clones han sido analizados y secuenciados. Uno de estos
clones que presentaba la secuencia buscada ha sido denominado
pSEA1.
Ejemplo
II-2
El fragmento de ADN HinDIII-SaII
del vector pSEA1; que lleva la secuencia que codifica la
heliomicina así como el fragmento SphI-HinDIII del
vector M13JM132 (Michaut et al.; 1985; FEBS Letters; 395; pp
6-10) han sido insertados entre los sitios SphI y
SaII del plásmido pTG4812 (Michaut et al.; 1996; FEBS
Letters; 395; pp 6-10). El fragmento
SphI-HinDIII del vector M13JM132 contiene la
secuencia del promotor del gen MF\alpha1 de la levadura así como
la secuencia que codifica la región pre-pro del
factor MF\alpha1. En el plásmido resultante, pSEA2, el gen
sintético de la heliomicina se encuentra por lo tanto insertado en
las secuencias pre-pro del factor Mf\alpha1 y el
terminador de transcripción; esta construcción debe por lo tanto
asegurar la maduración y la secreción de la heliomicina.
Ejemplo
II-3
La cepa de levadura TGY 48.1 (MATa,
ura3-D5,his, pral, prbl, prc1, cps1; Reichhart
et al.; 1992; Invert. Reprod. Dev. 21, pp
15-24) ha sido transformada por el plásmido pSEA2.
Los transformantes han sido seleccionados a 29ºC sobre un medio
selectivo YNBG (0,67% yeast nitrogen base; 2% glucosa),
suplementado con 0,5% de casamino ácidos y que no contiene uracilo.
Después de la transformación, varios clones de levaduras,
seleccionados para el carácter ura+, han sido puestos en cultivo
durante 48 h a 29ºC en 50 ml de medio selectivo. Después de la
centrifugación (4000 g; 30 min; 4ºC), el sobrenadante ha sido
acidificado hasta pH 3,5 con del ácido acético, antes de ser
depositado sobre un cartucho Sep-Pak^{TM}
C_{18}, (Waters Associates) equilibrado con agua acidificada (TFA
0,05%). Las diferentes proteínas fijadas sobre el cartucho han sido
eluídas a través de soluciones de TFA 0, 05% conteniendo los
porcentajes crecientes de acetonitrilo.
La fracción 40%, presentando una actividad
antifúngica, ha sido analizada en HPLC sobre una columna analítica
de fase inversa Aquapore RP-300 C_{8}
(Brownlee^{TM}. 220 X 4.6 mm; 300 \ring{A}), utilizando un
gradiente lineal de acetonitrilo del 2% al 40% en 80 min en el TFA
0,05% con una cantidad constante de 0,8 ml/min. Las fracciones han
sido cosechadas manualmente según la variación de la absorbancia a
225 nm y 254 nm. Las fracciones recogidas han sido secadas al
vacío, reconstituidas con agua ultrapura y analizadas para su
actividad antifúngica en las condiciones descritas en el ejemplo
III. La caracterización estructural del péptido ha sido realizada
como se describe en el ejemplo 1.2.
Ejemplo
II-4
Uno de los clones de levadura transformado
expresando la heliomicina ha sido cultivado a 29ºC durante 24 h en
100 ml de medio selectivo. Este precultivo a continuación ha sido
utilizado para inocular 4 1 de medio selectivo y el cultivo ha sido
realizado durante 48 h a 29ºC. Las levaduras han sido eliminadas
por centrifugación (4000 G; 30 min; 4ºC). El sobrenadante ha sido
acidificado hasta pH 3,5 con ácido acético, sometido a una segunda
centrifugación (4000 g; 30 min; 4ºC) antes de ser depositado sobre
una columna abierta de fase inversa preparativa C_{18} (Waters
Associates); 125 \ring{A}; 6 g de fase para 500 ml de
sobrenadante) equilibrada con agua acidificada (TFA 0,05%). Las
moléculas hidrófilas han sido eliminadas por un lavado con del agua
acidificado seguido de un lavado con una solución de acetonitrilo al
15% preparada en TFA 0,05%. La elución del péptido ha sido
realizada por una solución de acetonitrilo al 40% preparada en TFA
0,05%. La fracción eluída al 40% de acetonitrilo ha sido
liofilizada luego reconstituida en agua ultrapura estéril antes de
ser sometida a la primera etapa de purificación.
- -
- primera etapa de purificación por HPLC: la fracción prepurificada conteniendo la heliomicina ha sido reconstituida en una solución de acetato amónico a 25 mM, pH 3,4. Esta muestra ha sido inyectada sobre una columna preparativa de intercambio de cationes Aquapore Cation Exchange (Brownlee^{TM}; 250 X 10 mm), utilizando un gradiente lineal de NaCl del 0% al 100% en 90 min en acetato amónico 25 mM, pH 3,4 con una velocidad constante de 2 ml/min. Las fracciones recogidas han sido secadas al vacío, reconstituidas con agua ultrapura y analizadas para su actividad antifúngica en las condiciones descritas más abajo.
- -
- segunda etapa de purificación por HPLC: la heliomicina ha sido purificada hasta la homogeneidad por cromatografía sobre una columna de fase inversa semipreparativa Aquapore RP-300 C8 (Brownlee^{TM}; 220 X 7 mm; 300 \ring{A}), utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo del 2% al 40% en 80 min en el TFA 0,05% con una velocidad constante de 2 ml/min.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta metodología ha sido utilizada para destacar
las moléculas antifúngicas en el transcurso de las diferentes
etapas de purificación, para la determinación del espectro de la
actividad del péptido y para la determinación de la concentración
mínima inhibitoria (CMI) a la cual el péptido ha estado activo. La
CMI ha sido expresada como un intervalo de concentración [a] - [b]
donde [a] ha sido la concentración mínima en la que se observa un
inicio del crecimiento y [b] la concentración para la cual ningún
crecimiento ha sido observado. Ejemplos de la actividad específica
de la heliomicina, frente a los hongos filamentosos y a las
levaduras, están dados en las tablas 1 y 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
III-1
La actividad antifúngica ha sido detectada por
una prueba de inhibición del crecimiento en medio líquido. Las
esporas de los hongos para testar han sido puestas en suspensión en
un medio de cultivo de tipo "patata-glucosa".
De preferencia, se utilizan 12 g de medio de cultivo patata dextrosa
(Difco) para 1 1 de agua desmineralizada. Dos antibióticos han sido
añadidos en medio de cultivo: la tetraciclina (concentración final
de 10 \mug/ml) y la cefotaxima (100 \mug/ml). Se depositan 10
\mul de cada fracción para analizar en placas de microtitulación
en presencia de 90 \mul de medio de cultivo conteniendo las
esporas (a una concentración final de 104 esporas/ml). La incubación
ha sido realizada en compartimento húmedo a 30ºC durante 48 horas.
El crecimiento fúngico ha sido observado al microscopio fotónico
después de 24 h y cuantificado después 48 horas por medida de la
absorbancia a 600 nm con la ayuda de un lector espectrofotométrico
de placas de microtitración.
- -
- tests de hongos filamentosos: Aspergillus fumigatus (donado por Dr H. Koenig, hospital civil, Estrasburgo); Nectria haematococca, Fusarium culmorum, Trichoderma viride (micoteca de la universidad Católica de Leuven, Bélgica); Neurospora crassa, Fusarium oxysporum, (micoteca de la Société Clause, Paris).
Los resultados del test de actividad de la
heliomicina contra los hongos filamentosos están reportados en la
Tabla 1 a continuación.
Ejemplo
III-2
Las diferentes cepas de levadura han sido
puestas en incubación en un medio de cultivo de tipo
"Sabouraud" e incubadas a 30ºC durante 24 h bajo agitación
lenta. La muestra para testar (10 \mul) ha sido depositada en los
pocillos de una placa de microtitración en los cuales han sido
agregados 90 \mu de un cultivo diluido de levadura cuya densidad
ha sido ajustada a DO 600 = 0,001. Se evalúa el crecimiento por la
medida de la absorbancia a 600 nm con la ayuda de un lector
espectrofotométrico de placas de microtitración.
- -
- levaduras testadas: Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. inconspicua, Cryptococcus neoformans, Cryp. albidus, Saccharomyces cerevisiae (donadas por Dr H. Koenig, hospital civil, Estrasburgo).
Los resultados de la prueba de actividad de la
heliomicina contra las levaduras están reportados en la Tabla 2 a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran la excelente actividad
antifúngica del péptido según la invención.
Este ejemplo describe la preparación de la
secuencia que codifica para la heliomicina para su expresión en una
célula vegetal, del gen quimérico, del vector de integración y de
las plantas transformadas. Las figuras 2 a 6 en anexo describen las
estructuras esquemáticas de ciertos plásmidos preparados para la
construcción de los genes quiméricos. En estas figuras, los
diferentes sitios de restricción están marcados en
cursiva.
Todas las técnicas utilizadas a continuación son
las técnicas estándar de laboratorio. Los protocolos detallados de
estas técnicas están particularmente descritos en Ausubel &
coll.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
IV-1
Los dos oligonucleótidos sintéticos
complementarios Oligo 7 y Oligo 8 a continuación, son hibridizados
a 65ºC durante 5 minutos luego por disminución lenta de la
temperatura a 30ºC durante 30'. 1
Después de la hibridación entre el Oligo 7 y el
Oligo 8, el ADN que ha quedado monocatenario sirve de matriz para
el fragmento klenow de la polimerasa 1 de E. coli (en las
condiciones estándar recomendadas por el fabricante (New England
Biolabs)) para la creación del oligonucléotido bicatenario a partir
de la extremidad 3' de cada oligo. El oligonucleótido bicatenario
obtenido es a continuación digerido por las enzimas de restricción
SacII y NaeI y clonado en el plásmido pBS II SK(-)
(Stratagene) digerido por las mismas enzimas de restricción. Se
obtiene entonces un clon comprendiendo la región que codifica para
el péptido señal del gen PR-1\alpha del tabaco
(SEC ID NO 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Los dos oligonucleótidos sintéticos
complementarios de las secuencias Oligo 9 y Oligo 10 según las
condiciones operativas descritas para
pRPA-MD-P.
Después de la hibridación entre el Oligo 9 y el
Oligo 10, el ADN que ha quedado monocatenario sirve de matriz al
fragmento klenow de la polimerasa 1 de E. coli (en las
condiciones estándar recomendadas por el fabricante (New England
Biolabs)) para la creación del oligonucléotido bicatenario a partir
de la extremidad 3' de cada oligo. Este oligonucléotido bicatenario
conteniendo la parte codificante de la heliomicina (SEC ID NO 2) es
a continuación clonado directamente en el plásmido
pRPA-MD-P que ha sido digerido con
la enzima de restricción NaeI. La orientación correcta del
clon obtenido es verificada por secuenciación. Se obtiene entonces
un clon comprendiendo la región que codifica para la proteína de
fusión PR-la-heliomicina situada
entre los sitios de restricción NcoI en la extremidad
N-terminal y ScaI, SacII y
BamHI en la extremidad C-terminal (SEC ID NO
3).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pRTL-2 GUS, derivado
del plásmido pUC-19, ha sido obtenido por parte del
Dr. Jim Carrington (Texas A&M University, no descrito). Este
plásmido cuya estructura esquemática está representada en la figura
2; contiene el promotor C\alphaMV 35S duplicado aislado del virus
del mosaico de la coliflor (Promotor C\alphaMV 2x35S; Odell &
coll.; 1985) que dirige la expresión de un ARN que contiene la
secuencia no traducida en 5' del virus etch del tabaco (TEV 5' UTR;
Carrington & Freed; 1990), el gen de la
\beta-glucuronidasa de E. coli (GUS
Jefferson & coll.; 1987) seguido del sito de poliadenilación del
ARN 35S de CaMV (CaMV polyA; Odell & coll.; 1985).
El plásmido pRTL-2 GUS es
digerido con las enzimas de restricción NcoI y BamHI y el fragmento
grande de ADN es purificado. El plásmido
pRPA-PS-PR1\alpha-helio
es digerido con las enzimas de restricción NcoI y BamHI y el
pequeño fragmento de ADN conteniendo la región que codifica para la
proteína de fusión
PR-1\alpha-heliomicina es
purificado. Los dos fragmentos de ADN purificados son a
continuación ligados entre sí en un casete de expresión en las
plantas que sintetiza una proteína de fusión
PR-1\alpha-heliomicina. La
estructura esquemática de este casete de expresión está representada
en la figura 3.
"PR-1\alpha-heliomicina"
representa la región codificante para la proteína de fusión
PR-1\alpha-heliomicina de
pRPA-RD- 239. La heliomicina es transportada hacia
la matriz extracelular de la planta por la acción del péptido señal
PR-1\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido
pRPA-RD-195 es un plásmido derivado
del pUC-19 que contiene un sito de clonación
múltiple modificado. Los oligonucieótidos sintéticos
complementarios Oligo 11 y Oligo 12 a continuación, son hibridizados
y convertidos en bicatenarios según el procedimiento descrito para
pRPA-MD-P.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El oligonucléotido bicatenario obtenido es a
continuación ligado en pUC-19 que ha sido
previamente digerido con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII
y convertido en extremos romos empleando el fragmento klenow de la
ADN polimerasa 1 de E. coli. Se obtiene un vector conteniendo
sitios de clonación múltiples para facilitar la introducción de los
casetes de expresión en un vector plásmido de Agrobacterium
tumefaciens. La estructura esquemática de este sito de
clonación múltiple está representada en la figura 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido
pRPA-RD-239 es digerido con la
enzima de restricción PstII. El fragmento de ADN conteniendo el
casete de expresión de
PR-la-heliomicina es purificado. El
fragmento purificado es a continuación ligado en
pRPA-RP-195 que ha sido previamente
digerido con la enzima de restricción PstII y desfosforilado con la
fosfatasa intestinal de ternero.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen de tolerancia al bromoxinilo es aislado
de pRPA-BL-237 por una
amplificación genética por PCR. El fragmento obtenido tiene extremos
romos y está clonado en el sito EcoRI de
pRPA-BL-150A que ha sido convertido
en extremos romos por la acción de la polimerasa klenow en
condiciones estándar. Se obtiene un vector de Agrobacterium
tumefaciens que contiene el gen de tolerancia al bromoxinilo en
la proximidad de su extremo derecho, un gen de tolerancia a la
canamicina en la proximidad de su extremo izquierdo y un sito de
clonación múltiple entre estos dos genes.
La estructura esquemática de
pRPA-RD-174 está representada en la
figura 5. Sobre esta figura, "nos" representa el sito de
poliadenilación de la nopalina sintasa de Agrobacterium
tumefaciens (Bevan & coll.; 1983), "NOS pro"
representa el promotor de la nopalina sintasa de Agrobacterium
tumefaciens (Bevan & coll.; 1983), "NPT II" representa
el gen de la neomicina fosfotransferasa del transposon Tn5 de E.
coli (Rothstein & coll.; 1981), "35S pro" representa
el promotor 35S aislado del virus del mosaico de la coliflor (Odell
& coll.; 1985), "BRX" representa el gen de la nitrilasa
aislada de K. ozaenae (Stalker & coll.; 1988), "RB"
y "LB" representan respectivamente los extremos derecho e
izquierdo de la secuencia de un plásmido Ti de Agrobacterium
tumefaciens.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos sintéticos complementarios
Oligo 13 y Oligo 14 a continuación, son hibridizados y convertidos
en bicatenarios según el procedimiento descrito para
pRPA-MD-P.
El oligonucleótido bicatenario hibridizado (95
pares de bases) es purificado después de la separación sobre un gel
de agarosa (3% Nusieve, FMC). El plásmido
pRPA-RD-174 es digerido con la
enzima de restricción XmaI y el fragmento grande de ADN es
purificado. Los dos fragmentos de ADN obtenidos son a continuación
ligados
Se obtiene un plásmido derivado de
pRPA-RD-174 comprendiendo otros
sitios de restricción entre el gen de tolerancia al bromoxinilo y el
gen de la canamicina marcador de la selección.
La estructura esquemática del plásmido
pRPA-RD-184 está representada en la
figura 6 donde los términos "nos". "NPT II". "NOS
pro", "35S pro", "BRX gen", "RB" y "LB"
tienen el mismo significado que para la figura 5.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido
pRPA-RD-240 es digerido con las
enzimas de restricción SfiII y AscI y el fragmento de ADN
conteniendo el gen de
PR-1a-heliomicina es purificado. El
plásmido pRPA-RD-184 es digerido con
las mismas enzimas de restricción. El fragmento de ADN conteniendo
el casete de expresión de
PR-1a-heliomicina es a continuación
ligado en pRPA-RD-184. Se obtiene de
este modo un vector de Agrobacterium tumefaciens conteniendo la
secuencia que codifica para la proteína de fusión
PR-1\alpha-heliomicina que conduce
a la expresión de la heliomicina en la matriz extracelular de la
planta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
IV-2
Los dos oligonucleótidos sintéticos parcialmente
complementarios Oligo 13 y Oligo 14 a continuación son hibridizados
a 65ºC durante 5 minutos luego por disminución lenta de la
temperatura a 30ºC durante 30 minutos.
Después de la hibridación entre el Oligo 13 y el
Oligo 14, el ADN que ha quedado monocatenario sirve de matriz al
fragmento Klenow de la polimerasa 1 de E. coli (en las
condiciones estándar recomendadas por el fabricante (New England
Biolabs) para la creación del oligonucleótido bicatenario a partir
de la extremidad 3' de cada oligo. El oligonucleótido bicatenario
obtenido es a continuación digerido por las enzimas de restricción
XbaI y EcoRI, luego clonado en el plásmido pBS II SK(-)
(Stratagene) digerido por las mismas enzimas de restricción. Se
obtiene entonces un clon conteniendo la región que codifica para
los 22 aminoácidos del péptido señal del gen PG1. y que puede ser
fusionado al marco de lectura de otras proteínas a nivel del sito
SfoI (SEC ID NO 15).
\vskip1.000000\baselineskip
La región que codifica para la heliomicina ha
sido amplificada por PCR a partir del clon pRPA - PS - PRIa - helio
(SEC ID NO 3) con la enzima termoestable Pfu (Stratagene) según las
condiciones estándar recomendadas por el fabricante. Los
oligonucleótidos sintéticos utilizados para esta amplificación
son:
El producto de IIa PCR ha sido digerido por la
enzima de restricción XhoI y clonado en el vector pRPA - NP4
digerido por las enzimas de restricción SfoI y XhoI. El clon
resultante incluye por lo tanto la región que codifica para el
péptido señal del gen PG1 fusionado en el mismo marco de lectura con
la secuencia que codifica para la heliomicina (SEC ID NO 18).
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de expresión y de transformación
pILTAB 357 es derivado del vector binario pBin19. Contiene el
promotor CsVMV (Verdaguer et al. 1996, Plant Mol. Biol. 31,
1129-1139) seguido de un sito múltiple de clonación
y del terminador de transcripción nos de la nopalina sintasa
(figura X+1). La secuencia de este fragmento está indicada (SEC ID
NO 19).
El vector de expresión de la heliomicina ha sido
obtenido por inserción del fragmento de restricción
XbaI-KpnI del vector pRPA - NP5 conteniendo la
fusión del péptido señal PG1 - heliomicina en el vector pILTAB 357
digerido por estas mismas enzimas. El clon resultante incluye por
lo tanto el casete de expresión promotor CsVMV - péptido señal PG 1
- heliomicina - terminador Nos (SEC ID NO 20).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
IV-3
Los vectores
pRPA-RD-241 o
pRPA-NP6 son introducidos en la cepa de
Agrobacterium tumefaciens EHA101 o EHA105 (Hood & coll.;
1987) portadora del cósmido pTVK291 (Komari & coll.; 1986). La
técnica de transformación está basada en el procedimiento de Horsh
& coll. (1985).
\vskip1.000000\baselineskip
La regeneración del tabaco PBD6 (procedencia
SEITA Francia) a partir de explantes foliares se realiza sobre un
medio básico Murashige y Skoog (MS) que incluye 30 g/l de sacarosa
así como 200 \mug/ml de canamicina. Los explantes foliares se
toman de las plantas cultivadas en invernadero o in vitro y
regeneradas según la técnica de los discos foliares (Horsh &
coll.; 1985) en tres etapas sucesivas: la primera incluye la
inducción de los brotes sobre un medio adicionado de 30 g/l de
sacarosa que contiene 0,05 mg/L de ácido naftilacético (ANA) y 2
mg/L de bencilaminopurina (BAP) durante 15 días. Los brotes
formados durante esta etapa son a continuación desarrollados durante
10 días por cultivo en un medio MS adicionado de 30 g/l de sacarosa
pero que no contiene ninguna hormona. Luego se toman los brotes
desarrollados y se cultivan en un medio de enraizamiento MS con
contenido medio en sales, vitaminas y azúcar y que no contiene
ninguna hormona. Al cabo de aproximadamente 15 días, los brotes
enraizados son pasados por barro.
\vskip1.000000\baselineskip
Anticuerpos policlonales han sido obtenidos por
inmunización de un conejo con heliomicina nativa según los
procedimientos habituales del Centro de Bioexperimentación VALBEX
OUT A - Lyon I). El suero obtenido (15 ml) ha sido entonces
inmunopurificado en una columna de Sepharose 4B (Pharmacia; Ref
17-0430-01) acoplada a heliomicina
para seleccionar específicamente las inmunoglobulinas que reconocen
este péptido. Estos anticuerpos han sido finalmente eluidos en 6 ml
de glicina (200 mM; pH3), neutralizados con IM Tris pH9,5;
dializados con 0,5x PBS, y conservados en congelación a -20ºC hasta
su utilización.
El análisis de la expresión de la heliomicina ha
sido conducido en 8 plantas transgénicas para la construcción
pRPA-NP6, así como en un control salvaje. Algunas
hojas de tabaco bien desarrolladas en invernadero han sido
trituradas finamente a la temperatura del nitrógeno líquido, y las
proteínas extraídas durante 1 h a 4ºC en el tampón
Tris-HCl 50 mM, PVP25 1%; 0,05% TritonX100; pH7,5 a
razón de 4 ml de tampón por gramo de peso en fresco. Después de la
centrifugación, la concentración de proteínas del sobrenadante ha
sido determinada por el método de Bradford.
Cinco microgramos de proteínas de cada uno de
los 9 extractos han sido depositados sobre la membrana de
nitrocelulosa bajo un formato "slot-blot", al
igual que una cantidad de 50 ng de heliomicina pura que sirve como
control positivo. La membrana ha sido incubada durante 1 h en un
tampón de bloqueo al 1% (Boehringer; Ref 1 921 673) en TBS, luego
incubada durante la noche a 4ºC con los anticuerpos
inmunopurificados dirigidos contra la heliomicina diluidos al
1/2000 en el tampón TBS con 0,05% Tween20. Después del lavado (TBS;
0,1 Tween20 y 0,5% de tampón de bloqueo), la membrana ha sido
incubada durante 1h a temperatura ambiente (TBS con 0,5% tampón de
bloqueo) con un anticuerpo de cabra (diluido al 1/50000) dirigido
específicamente contra las inmunoglobulinas de conejo y acoplado a
la fosfatasa alcalina (SIGMA A-3687). Después del
lavado (TBS; 0,1% Tween20), la detección se hache añadiendo un
substrato de la fosfatasa (BioRad; Ref 170-5012), y
la revelación se obtiene por radiografía del producto luminiscente
sobre una película Amersham (ECL).
El resultado de esta experiencia muestra que 4
plantas de tabaco transgénico expresan fuertemente la heliomicina.
La señal en las otras plantas transgénicas es débil o no
significativa con respecto al testigo salvaje. La señal observada
para la mejor planta es del nivel del control positivo (50 ng de
heliomicina), lo que indica que en esta planta la heliomicina
representa de forma ponderada aproximadamente un 1% de las
proteínas totales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo CE 1:
| - | materia activa | 400 g/l |
| - | dodecilbenceno sulfonato alcalino | 24 g/L |
| - | nonilfenol oxietilado a 10 moléculas de óxido de etileno | 16 g/L |
| - | ciclohexanona | 200 g/L |
| - | solvente aromático | q.s.p. 1 litro |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo CE 2:
| - | materia activa | 250 g |
| - | aceite vegetal epoxidado | 25 g |
| - | mezcla de sulfonato de alcoilarilo y de éter de poliglicol y de alcoholes grasos | 100 g |
| - | diAndilformamida | 50 g |
| - | xileno | 575 g |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo SC 1:
| - | materia activa | 500 g |
| - | fosfato de tristirilfenol polietoxilado | 50 g |
| - | alquilfenol polietoxilado | 50 g |
| - | policarboxilato de sodio | 20 g |
| - | etilenglicol | 50 g |
| - | aceite organopolisiloxánico (antiespuma) | 1 g |
| - | polisacárido | 1,5 g |
| - | agua | 316,5 g |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo PM 1:
| - | materia activa | 50% |
| - | alcohol graso etoxilado (agente humidificante) | 2,5% |
| - | feniletilfenol etoxilado (agente dispersante) | 5% |
| - | tiza (soporte inerte) | 42,5% |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo PM 2:
| - | materia activa | 10% |
| - | alcohol sintético oxo de tipo ramificado, en C13 etoxilado por 8 a 10 | |
| óxido de etileno (agente humidificante) | 0,75% | |
| - | lignosulfonato de calcio neutro (agente dispersante) | 12% |
| - | carbonato de calcio (carga inerte) | q.s.p. 100% |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo PM 3:
| - | materia activa | 75% |
| - | agente humidificante | 1,50% |
| - | agente dispersante | 8% |
| - | carbonato de calcio (carga inerte) | q.s.p. 100% |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo PM 4:
| - | materia activa | 90% |
| - | alcohol graso etoxilado (agente humidificante) | 4% |
| - | feniletilfenol etoxilado (agente dispersante) | 6% |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo PM 5:
| - | materia activa | 50% |
| - | mezcla de tensioactivos aniónicos y no iónicos (agente humidificante) | 2,5% |
| - | lignosulfonato de sodio (agente dispersante) | 5% |
| - | arcilla caolínica (soporte inerte) | 42,5% |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo GD 1:
En un mezclador, se mezcla el 90% en peso de
materia activa y el 10% de urea en perlas. La mezcla es a
continuación triturada en un triturador de husillos. Se obtiene un
polvo que se humedece con aproximadamente el 8 en peso de agua. El
polvo húmedo es extrudido en una extrusora de rodillo perforado. Se
obtiene un granulado que es secado, luego machacado y tamizado, de
manera que guarda respectivamente sólo los granulados de una
dimensión comprendida entre 150 y 2000 micrones.
\newpage
Ejemplo GD2:
En un mezclador, se mezclan los componentes
siguientes:
| - | materia activa | 75% |
| - | agente humidificante (alquilnaftaleno sulfonato de sodio) | 2% |
| - | agente dispersante (polinaftaleno sulfonato de sodio) | 8% |
| - | carga inerte insoluble en agua (caolín) | 15% |
Esta mezcla es granulada en lecho fluidificado,
en presencia de agua, luego secada, triturada y tamizada para
obtener granulados de dimensión comprendida entre 0,15 y 0,80
mm.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo A: comprimidos
Según la técnica habitual, se preparan tabletas
dosificadas a 50 mg de péptido activo teniendo la composición
siguiente:
| - | péptido heliomicina M1 | 50 mg |
| - | almidón | 60 mg |
| - | lactosa | 50 mg |
| - | estearato de magnesio | 2 mg |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo B: solución inyectable
Se prepara una solución inyectable que contiene
20 mg de péptido activo teniendo la composición siguiente:
| - | péptido heliomicina M2 | 22,4 mg |
| - | agua destilada | q.s.p. 2 cm^{3} |
\vskip1.000000\baselineskip
La estabilidad de un péptido antimicrobiano de
proteasas de plantas es un factor esencial para la obtención de un
buen nivel de expresión y por lo tanto de resistencia a los
fitopatogenes en plantas transgénicas. Esta estabilidad es por
ejemplo un punto fundamental para un péptido antimicrobiano de
insecto como la cecropina B (Owens y Heutte; 1997. MPM1 vol. 10.
nº4, pp 525-528). Hemos examinado la estabilidad de
la heliomicina y de su actividad sobre una prueba fitopatógena
(Botrytis cinerea) después de la incubación con extractos
brutos de 8 plantas cultivadas mayores (maíz, trigo, cebada, colza,
soja, girasol, tomate y tabaco).
Las hojas de estas 8 especies han sido
trituradas a temperatura baja (nitrógeno líquido) en un mortero,
luego el polvo ha sido resuspendido en el mismo volumen de agua.
Después de la centrifugación (10000 g durante 30 minutos), el
sobrenadante ha sido recuperado, y la concentración en la proteína
determinada. Esta concentración ha sido ajustada para los 8
extractos a 1 mg/ml por dilución con agua, luego estos extractos
han sido filtrados de manera estéril (0,2 micrones). Cien
microlitros de cada extracto (así como un control con solamente
agua) ha sido entonces agregado a 50 microlitros de una solución de
heliomicina (que contiene 15 microgramos, así como un control sin
péptido) en agua. Estas mezclas han sido incubadas a 30ºC, una
alícuota de 20 microlitros tomada después de 0 h; 1 h; 2 h; 4 h y
20 h, inmediatamente congelada hasta la realización de la
prueba.
La prueba de actividad antifúngica ha sido
realizada a 25ºC en microplacas añadiendo cada alícuota a 80
microlitros de una suspensión fresca de esporas de Botrytis
cinerea (10000 esporas/ml en una solución de caldo de patata
dextrosa (Difco; 12 g/l). La lectura visual de los resultados
después 12h y 24h muestra que no hay ninguna pérdida significativa
de actividad antifúngica de la heliomicina, incluso para la muestra
incubada durante 20h a 30ºC, ligada a la exposición a un extracto
bruto de maíz, trigo, cebada, colza, soja, girasol, tomate o
tabaco. Este resultado indica una muy fuerte estabilidad de la
heliomicina frente a proteasas de plantas, y que la actividad
antifúngica testada sobre Botrytis cinerea no está afectada
por la presencia de extractos brutos vegetales.
Los mutantes a continuación son preparados según
el método descrito en ejemplo 11 reemplazando algunos de los
oligonucleótidos 1 a 6 por otros oligonucleótidos elegidos para
introducir las mutaciones.
- -
- heliomicina R48: sustitución del aminoácido GIu48 de la secuencia ID NO: 1 por un aminoácido básico, en particular una arginina (Arg48). Por analogía con la secuencia que codifica para la heliomicina de la secuencia: SEC ID NO:1, el codon GAA que codifica para Glu es sustituido por el codon AGA que codifica para Arg. Los oligonucleótidos 19 y 20 son utilizados en la sustitución de los oligonucleótidos 5 y 6 del ejemplo II.
\hskip0.5cm
- -
- heliomicina L28L29: sustitución de dos aminoácidos básicos Lys y Arg en posición 28 y 29 de la secuencia ID NO: 1 por dos aminoácidos hidrófobos, en particular dos aminoácidos leucinas (Leu28 y 29). Por analogía con la secuencia que codifica para la heliomicina de la secuencia: SEC ID NO:1, la parte AAG-CGC que codifica el resto peptídico Lys-Arg es sustituida por la secuencia TTG-TTG que codifica para el resto peptídico Leu-Leu. Los oligonucleótidos 21 y 22 son utilizados en la sustitución de los oligonucleótidos 3 y 4 del ejemplo II.
\hskip0.5cm
- -
- heliomicina L28L29R48: sustitución de los dos aminoácidos básicos Lys y Arg en posición 28 y 29 de la secuencia ID NO: 1 por dos residuos aminoácidos leucinas y sustitución del aminoácido Glu48 de la secuencia ID NO: 1 por el aminoácido arginina (Arg48). Los oligonucleótidos 19 a 22 son empleados en la sustitución de los oligonucleótidos 3 a 6 según el ejemplo II.
- -
- heliomicina A24A25: sustitución de los dos aminoácidos Asn24 y GIy25 de la secuencia ID NO: 1 dos aminoácidos alanina (A1a24 y Ala25). Por analogía con la secuencia que codifica para la heliomicina de la secuencia ID NO:1, la parte AAC-GGC que codifica el resto peptídico Asn-Gly es sustituida por la secuencia GCT-GCT que codifica para Ala-Ala. Los oligonucleótidos 23 y 24 son utilizados en la sustitución de los oligonucleótidos 3 y 4 del ejemplo II.
\hskip0.5cm
- -
- heliomicina A6A7A8A9: sustitución de los aminoácidos Asp6-Lys7-Leu8-Ile9 de la secuencia ID NO: 1 por 4 aminoácidos alanina (Ala). Por analogía con la secuencia que codifica para la heliomicina de la secuencia ID NO:1, la parte GAC-AAG-TTG-ATT que codifica el resto peptídico Asp-Lys-Leu-Ile es sustituida por la secuencia GCT-GCT-GCT-GCT que codifica para el resto peptídico Ala-Ala-Ala-Ala. Los oligonucleótidos 25 y 26 son utilizados en sustitución del oligonucleótido 1 del ejemplo II y los oligonucleótidos 27 y 28 en sustitución del oligonucleótido 2.
\hskip0.5cm
- -
- heliomicina A24A25L28L29: dos oligonucleótidos (sentido y antisentido) han sido necesarios como soporte en ausencia de un sito de restricción entre la secuencia que codifica para el resto peptídico constituido por los dos aminoácidos Asn24-Gly25 y la secuencia que codifica para el resto peptídico constituido por los dos aminoácidos Lys28-Arg29 de la heliomicina de la secuencia ID NO: 1. Las dos secuencias oligonucléotidas 29 y 30 sustituyen respectivamente las dos secuencias oligonucléotidas 3 y 4 del ejemplo II.
\hskip0.5cm
Los diferentes mutantes de heliomicina son
preparados y purificados de la manera siguiente. Uno de los clones
de levadura transformada expresando la heliomicina mutada ha sido
cultivado a 29ºC durante 48 h en 50 ml de medio selectivo. Este
precultivo ha sido utilizado a continuación para inocular 2 1 de
medio selectivo y el cultivo ha sido realizado durante 48 h a 29ºC.
Las levaduras han sido eliminadas por centrifugación (4000 g; 30
min; 4ºC). El sobrenadante ha sido acidificado hasta pH 3,5 con
ácido acético, sometido a una segunda centrifugación (4000 g; 30
min; 4ºC) antes de una primera etapa de extracción en fase
sólida.
- -
- primera etapa de extracción en fase sólida sobre un gel de fase inversa: el sobrenadante acidificado es depositado sobre un cartucho Sep-Pak Vac 35cc de fase inversa C18 (Waters Associates; 10 G de fase) equilibrado con agua acidificada (TFA 0,05%). Las moléculas hidrófilas han sido eliminadas por un lavado con agua acidificado seguido de un lavado con una solución de acetonitrilo al 15% preparada en el TFA 0,05%. La elución del péptido ha sido realizada por una solución de acetonitrilo al 60% preparada en el TFA 0,05%. La fracción eluida al 60% de acetonitrilo ha sido liofilizada y luego reconstituida en agua ultrapura estéril antes de ser sometida a la primera etapa de purificación.
- -
- segunda etapa de extracción en fase sólida sobre un gel intercambiador de cationes: la fracción prepurificada al 60% conteniendo la heliomicina mutada ha sido reconstituida en una solución de acetato amónico a 25 mM, pH 3,4. Esta muestra ha sido depositada sobre un cartucho Sep-Pak Vac 35cc CM intercambiadora de cationes (Waters Associates; 10 g de fase) equilibrada con acetato amónico a 25 mM, pH 3,4. La heliomicina mutada es eluida utilizando una solución a 1 M de cloruro de sodio (NaCl) preparada en el acetato amónico a 25 mM, pH 3.4. La fracción 1 M de NaCl conteniendo la heliomicina mutada es recogida, secada al vacío, reconstituida con 20 ml de agua ultrapura acidificada (TFA 1%). La heliomicina mutada es entonces purificada por HPLC de fase inversa.
- -
- última etapa de purificación por HPLC: la heliomicina mutada ha sido purificada hasta homogeneidad por cromatografía sobre una columna de fase inversa preparativa Agua por RP-300 C8 (Brownlee^{TM}; 220 X 10 mm; 300 \ring{A}), utilizando un gradiente lineal difásico de acetonitrilo del 2% al 23% en 10 min y del 23% al 33% en 80 min en el TFA 0,05% a la velocidad constante de 2,5 ml/min. La fracción recogida es secada al vacío, reconstituida con agua ultrapura y analizada por espectrometría de masa MALDI para verificar su pureza y su identidad. Las diferentes heliomicinas mutadas han sido analizadas por su actividad antifúngica en las condiciones descritas para la heliomicina de referencia contra las cepas siguientes: Neurospora crassa, Fusarium culmorum y Nectria haematococca. La actividad de los mutantes de heliomicina ha sido evaluada igualmente contra bacterias. Las condiciones experimentales utilizadas están descritas más abajo.
Esta metodología ha sido utilizada para la
determinación del espectro de actividad del péptido y de la
concentración mínima inhibitoria (CMI) a la cual el péptido mutado
está activo. La CMI ha sido expresada como un intervalo de
concentración [a] - [b] donde [a] ha sido la concentración mínima
donde se observa un inicio del crecimiento y [b] la concentración
para la cual ningún crecimiento ha sido observado. Ejemplos de la
actividad específica de la heliomicina mutada, frente a las
bacterias y hongos filamentosos están dados en la tabla 3.
La actividad antibacteriana ha sido detectada
por una prueba de inhibición del crecimiento en medio líquido. Las
bacterias para testar han sido puestas en suspensión en un medio
nutritivo de tipo "Poor Broth". De preferencia, se utiliza una
solución de bactotriptona al 1% adicionada de NaCl a un volumen del
1% en peso preparado en agua desmineralizado. Se depositan 10 \mu
de cada fracción para analizar en placas de microtitración en
presencia de 90 \mu de medio de cultivo conteniendo las bacterias
(a una concentración final equivalente a 1 mDO a 600 nm). La
incubación ha sido realizada a 25ºC durante 12 a 24 horas. El
crecimiento bacteriano ha sido medido continuando la absorbancia a
600 nm con la ayuda de un lector espectrofotométrico de placas de
microtitración.
- bacterias testadas: Bacillus megaterium
(colección de Institut Pasteur). Micrococcus luteus
(colección del Institut Pasteur). Staphylococcus aureus (H.
Monteil, Instituto de bacteriología, Estrasburgo), Aerococcus
viridans (H. Monteil, Instituto de bacteriología, Estrasburgo),
y Escherichia coli D22 (P. L. Boquet, Centro de Estudios
Nucleares, Saclay).
\vskip1.000000\baselineskip
Grupos de 4 ratones hembras han sido tratados
por inyección intravenosa de soluciones de heliomicina (SEC ID NO
2) en solución salina en dosis de 1 y 10 mg/kg. Soluciones
correspondientes de aprotinina como control negativo (sin efectos
para las dos dosis) y de melitina como control positivo (100% de
mortalidad a 5 días a 10 mg, efectos significativos a 5 días a 1
mg), Ninguna toxicidad ha sido destacada para las soluciones de
heliomicina a las dos dosis inyectadas.
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\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante tiene como único objetivo ayudar a/ lector y no forma
parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido el
máximo cuidado en su elaboración, no se pueden excluir errores u
omisiones y la EPO renuncia a toda responsabilidad en este
sentido.
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WO 9011770 A [0006]
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(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: RHONE-POULENC AGROCHIMIE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 14-20 Rue Pierre BAIZET
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: LYON
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAISES: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 69009
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Gen codificando para la heliomicina, proteína obtenida, vector que lo contiene, organismos transformados obtenidos y procedimiento de preparación
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 38
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 147 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:1. 147
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 169 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:1..132
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 261 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:3..224
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:12..101
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 75 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 7"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 8"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 80 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 9"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 109 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 10"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 85 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 11"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 12"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 93 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 13"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 93 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 14"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 15"
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTCTAGAAT GGCCTGCACC AACAACGCCA TGAGGGCCCT CTTCCTCCTC
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 16"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGAATTCGG CGCCGTGCAC GATGCAGAAG AGCACGAGGA GGAAGAGGGC
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 81 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:7 ...73
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 17"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTG
\hfill24
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 18"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTCGAGTC AAGTCTCGCA CCAGCAGTTC AC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 213 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:7 ...205
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 838 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: promotor CsVMV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:7..532
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sito de clonación múltiple
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:533..568
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: terminador
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:569..832
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1036 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: promotor CsVMV
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:7..532
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:539..736
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: terminador nos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN:767..1030
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTTGGATA AAAGAGACAA GTTGATTGGC AGCTGTGTTT GGGGCGCCGT CA
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTGTAGTTG ACGGCGCCCC AAACACAGCT GCCAATCAAC TTGTCTCTTT TATCCA
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 3"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTACACTAG TGACTGCAAC GGCGAGTGCA AGCGCCGCGG TTACAAGGGT GG
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 4"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACAATGGCC ACCCTTGTAA CCGCGGCGCT TGCACTCGCC GTTGCAGTCA CT
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATTGTGGA TCCTTCGCTA ACGTTAACTG TTGGTGTGAA ACCTGATAGG TCGACA
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 6"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCTGTCGA CCTATCAGGT TTCACACCAA CAGTTAACGT TAGCGAAGGA TC
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 19"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCTTCGC TAACGTTAAC TGTTGGTGTA GAACCTGATA GG
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 20"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGACCTATC AGGTTCTACA CCAACAGTTA ACGTTAGCGA AG
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 21"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGTGACTG CAACGGCGAG TGCTTGTTGC GC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 22"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAACAAGCA CTCGCCGTTG CAGTCA
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 23"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCAAGCGGC GC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 24"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCGCTTGCA CTCAGCAGCG CAGTCA
\hfill26
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 25"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTTGGATA AAAGAGCTGC TGCTGCTGGT AGCTGTGTTT
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 26"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGCGCCGT CAACTACA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 27"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGTGTAGT TGACGGCGCC CC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 28"
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAACACAGCT ACCAGCAGCA GCAGCTCTTT TATCCA
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 29"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCTTGTTGC GC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID NO: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético 30"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAACAAGCA CTCAGCAGCG CAGTCA
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> RHONE-POULENC
AGRO
\vskip0.400000\baselineskip
<120> GEN CODIFICANDO PARA LA HELIOMICINA,
PROTEÍNA OBTENIDA, VECTOR QUE LO CONTIENE, ORGANISMOS TRANSFORMADOS
OBTENIDOS Y PROCESO DE PREPARACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/FR99/00843
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-04-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 98 04933
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-04-15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (147)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(132)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 261
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3).. (224)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(101)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtctagaat ggcctgcacc aacaacgcca tgagggccct cttcctcctc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgaattcgg cgccgtgcac gatgcagaag agcacgagga ggaagagggc
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(72)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgataagctta tcggttcctg cgtg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctcgagtc aagtctcgca ccagcagttc ac
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(204)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 838
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(532)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc estructura
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (533)..(568)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (569)..(832)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1036
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(532)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (539)..(736)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (767)..(1030)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcttggata aaagagacaa gttgattggc agctgtgttt ggggcgccgt ca
\hfill52
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtgtagttg acggcgcccc aaacacagct gccaatcaac ttgtctcttt tatcca
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactacactag tgactgcaac ggcgagtgca agcgccgcgg ttacaagggt gg
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacaatggcc acccttgtaa ccgcggcgct tgcactcgcc gttgcagtca ct
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccattgtgga tccttcgcta acgttaactg ttggtgtgaa acctgatagg tcgaca
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatctgrcga cctatcaggt ttcacaccaa cagttaacgt tagcgaagga tc
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccttcgc taacgttaac tgttggtgta gaacctgata gg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgacctatc aggttctaca ccaacagtta acgttagcga ag
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagtgactg caacggcgag tgcttgttgc gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaacaagca ctcgccgttg cagtca
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagtgactg cgctgctgag tgcaagcggc gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccgcttgca ctcagcagcg cagtca
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcttggata aaagagctgc tgctgctggt agctgtgttt
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggcgccgt caactaca
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagtgtagt tgacggcgcc cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaacacagct accagcagca gcagctcttt tatcca
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
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<213> constructo sintético
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<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagtgactg cgctgctgag tgcttgttgc gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaacaagca ctcagcagcg cagtca
\hfill26
Claims (41)
1. Péptido comprendiendo la secuencia peptídica
de fórmula (I),
(I)Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag
en la
cual:
Xaa es -NH_{2} o un resto peptídico
comprendiendo de 1 a 10 aminoácidos, de preferencia de 1 a 6
aminoácidos, comprendiendo al menos un aminoácido básico,
representando la secuencia peptídica siguiente
Xaa'-Gly-Xaa''- en la cual Xaa'
representa NH_{2} o un resto peptídico comprendiendo 1 a 9
aminoácidos, y Xaa'' representa un resto peptídico comprendiendo un
aminoácido, elegido entre Leu, Ile; Val; Pro, Ser o Thr,
Xab es un resto peptidico comprendiendo 10
aminoácidos,
Xac es un resto peptídico comprendiendo 3
aminoácidos, comprendiendo al menos un aminoácido ácido,
Xad representa la secuencia peptídica siguiente
-Lys-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Gly-His-
Xae representa la secuencia peptídica siguiente
-Gly-Xae'-Asn-, en la cual Xae'
representa un resto peptídico comprendiendo 5 aminoácidos,
Xaf es un triptófano, y
Xag es -OH o un resto peptídico comprendiendo de
1 a 2 aminoácidos.
2. Péptido según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que los aminoácidos básicos
son elegidos entre la lisina, la arginina o la homoarginina.
3. Péptido según una de las reivindicaciones 1
o 2, caracterizado por el hecho de que Xac representa la
secuencia peptídica siguiente
-Asn-Xac'-Xac''-, en la cual Xac'
representa un resto peptídico de 1 aminoácido, y Xac'' representa
un resto peptídico de 1 aminoácido ácido.
4. Péptido según una de las reivindicaciones 1
a 3, caracterizado por el hecho de que dichos aminoácidos
ácidos son elegidos entre el ácido glutámico (Glu) o el ácido
aspártico (Asp).
5. Péptido según una de las reivindicaciones 1
a 4, caracterizado por el hecho de que Xac representa la
secuencia peptídica siguiente
-Asn-Gly-Glu-.
6. Péptido según una de las reivindicaciones 1 a
5, caracterizado por el hecho de que Xab representa la
secuencia peptídica siguiente
-Val-Xab'-Asp- en la cual Xab'
representa un resto peptidico comprendiendo 8 aminoácidos, y/o Xag
representa la secuencia peptídica siguiente
-Glu-Xag' en la cual Xag' representa OH o un resto
variable de secuencia comprendiendo 1 aminoácido.
7. Péptido según una de las reivindicaciones 1 a
6, caracterizado por el hecho de que Xaa representa la
secuencia peptídica siguiente NH_{2}
-Asp-Lys-Leu-Ile-Gly-Ser-,
y/o
Xab representa la secuencia peptídica siguiente
-Val-Trp-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Thr-Ser-Asp-
y/o
Xae representa la secuencia peptídica siguiente
-Gly-Ser-Phe-Ala-Asn-Val-Asn-
y/o
Xag representa la secuencia peptídica siguiente
Glu-Thr-OH.
8. Péptido según una de las reivindicaciones 1 a
7, caracterizado por el hecho de que está representado por
el identificador de nº 2 (SEC ID NO 2).
9. Péptido según una de las reivindicaciones 1 a
8, caracterizado por el hecho que comprende a una u otra de
sus extremidades, o las dos, de los residuos peptídicos necesarios
para su expresión y reconocimiento en un organismo huésped.
10. Péptido según una de las reivindicaciones 1
a 9, caracterizado por el hecho de que los residuos
cisteínas del péptido de fórmula (I) forman al menos un puente
disulfuro intramolecular.
11. Péptido según la reivindicación 10;
caracterizado por el hecho que comprende 3 puentes
disulfuros establecidos entre los residuos cisteina 1 y 4, 2 y 5 y
3 y 6.
\newpage
12. Péptido de fusión
"péptido-heliomicina", comprendiendo un péptido
heliomicina según una de las reivindicaciones 1 a 11, y un resto
peptídico susceptible de ser dividido a través de sistemas
enzimáticos de un organismo huésped, permitiendo la liberación de
la heliomicina.
13. Péptido de fusión según la reivindicación
12, caracterizado por el hecho de que el péptido fusionado a
la heliomicina es un péptido señal o un péptido de tránsito.
14. Péptido de fusión según la reivindicación
13, caracterizado por el hecho de que el péptido de tránsito
es el péptido señal del gen PR-1\alpha del
tabaco, el precursor del factor Mat alfa 1 o el péptido señal del
gen PG1 de poligalacturonasa de maíz.
15. Péptido de fusión según la reivindicación
14, caracterizado por el hecho de que está representado por
el identificador de secuencia nº 1 (SEC ID NO 1), por el
identificador de secuencia nº 3 (SEC ID No 3), o por el
identificador de secuencia nº 18 (SEC ID NO 18).
16. En calidad de medicamento, el péptido según
una de las reivindicaciones 1 a 15.
17. Composición caracterizada por el
hecho de que incluye el péptido según una de las reivindicaciones 1
a 15 y un vehículo apropiado.
18. Fragmento de ácido nucleico,
caracterizado por el hecho que comprende una secuencia de
ácido nucleico que codifica para un péptido según una de las
reivindicaciones 1 a 15.
19. Fragmento de ácido nucleico según la
reivindicación 18, caracterizado por el hecho que se trata
de una secuencia nucleótida de tipo ADN
20. Fragmento de ácido nucleico según la
reivindicación 19, caracterizado por el hecho de que la
secuencia nucleótida de tipo ADN incluye la secuencia de ADN
descrita por las bases 16 a 147 del identificador de secuencia nº 1
(SEC ID NO 1), por el identificador de secuencia nº 2 (SEC ID NO
2), por las bases 3 a 224 del identificador se secuencia nº 3 (SEC
ID NO 3), o por las bases 7 a 205 del identificador de secuencia nº
18 (SEC ID NO 18), una secuencia homóloga o una secuencia
complementaria de dicha secuencia.
21. Gen quimérico comprendiendo una secuencia
codificante así como elementos de regulación en posición 5' y 3'
heterólogos que pueden funcionar en un organismo huésped, en
particular las plantas, caracterizado por el hecho de que la
secuencia codificante incluye al menos un fragmento de ADN como
está definido en las reivindicaciones 18 a 20.
22. Gen quimérico según la reivindicación 21,
caracterizado por el hecho de que el organismo huésped es un
microorganismo.
23. Gen quimérico según la reivindicación 21,
caracterizado por el hecho de que el organismo huésped es
elegido entre las células vegetales y las plantas.
24. Vector de clonación o de expresión para la
transformación de un organismo huésped caracterizado por el
hecho que comprende al menos un origen de replicación y al menos un
gen quimérico como está definido en las reivindicaciones 21 a
23.
25. Organismo huésped no humano transformado,
caracterizado por el hecho de que contiene un fragmento de
ácido nucleico según una de las reivindicaciones 18 a 20, o un gen
quimérico según una de las reivindicaciones 21 a 23.
26. Organismo huésped transformado según la
reivindicación 25, caracterizado por el hecho que se trata
de un microorganismo, de una célula vegetal o de una planta.
27. Organismo huésped transformado según la
reivindicación 26, caracterizado por el hecho que se trata
de una planta conteniendo las células transformadas.
28. Organismo huésped según la reivindicación
27, caracterizado por el hecho de que la planta es
regenerada a partir de las células transformadas.
29. Organismo huésped transformado según la
reivindicación 26, caracterizado por el hecho de que el
microorganismo es elegido entre las bacterias, en particular E.
coli, las levaduras, en particular los géneros
Saccharomyces o Kluyveromyces, Pichia, los hongos, en
particular Aspergillus, o los bacilovirus.
30. Célula vegetal transformada, caracterizada
por el hecho de que contiene un fragmento de ácido nucleico según
una de las reivindicaciones 18 a 20 o un gen quimérico según una de
las reivindicaciones 21 a 23.
\newpage
31. Planta transformada, caracterizada por el
hecho de que incluye al menos una célula vegetal transformada según
la reivindicación 30.
32. Planta transformada según la reivindicación
31, caracterizada por el hecho de que es resistente a las
enfermedades causadas por Cercospora, en particular Cercospora
beticola, Cladosporium en particular Cladosporium herbarum,
Fusarium, en particular Fusarium culmorum o Fusarium
graminearum, o por Phytophthora, en particular
Phytophtora cinnamomi.
33. Planta transformada caracterizada
por el hecho de que proviene del cultivo y/o del cruce de las
plantas según una de las reivindicaciones 31 o 32, y de que ella
contiene un fragmento de ácido nucleico según una de las
reivindicaciones 18 a 20 o un gen quimérico según una de las
reivindicaciones 21 a 23.
34. Semillas de plantas transformadas según una
de las reivindicaciones 31 a 33, conteniendo un fragmento de ácido
nucleico según una de las reivindicaciones 18 a 20 o un gen
quimérico según una de las reivindicaciones 21 a 23.
35. Procedimiento de transformación de los
organismos huéspedes no humanos, en particular de células vegetales
o de plantas, caracterizado por el hecho de que se inserta
en dicho organismo huésped al menos un fragmento de ácido nucleico
según una de las reivindicaciones 18 a 20 o un gen quimérico según
una de las reivindicaciones 21 a 23.
36. Procedimiento según la reivindicación 35,
caracterizado por el hecho de que el organismo huésped es
una célula vegetal o una planta.
37. Procedimiento según la reivindicación 36,
caracterizado por el hecho de que se regenera una planta a
partir de la célula vegetal o de la planta transformada.
38. Procedimiento de cultivo de las plantas
transformadas según una de las reivindicaciones 31 a 33,
caracterizado por el hecho que consiste en plantar las
semillas de dichas plantas transformadas en una superficie de un
campo apropiado para el cultivo de dichas plantas, en aplicar sobre
dicha superficie de dicho campo una composición agroquímica sin
afectar de manera sustancial a dichas semillas o a dichas plantas
transformadas, luego en recoger las plantas cultivadas cuando llegan
a la madurez deseada y eventualmente en separar las semillas de las
plantas cosechadas.
39. Procedimiento de cultivo según la
reivindicación 38, caracterizado por el hecho de que la
composición agroquímica incluye al menos un producto activo
teniendo al menos una actividad fungicida y/o bactericida.
40. Procedimiento de cultivo según la
reivindicación 39, caracterizado por el hecho de que el
producto activo presenta una actividad complementaria de aquella
del péptido según una de las reivindicaciones 1 a 15.
41. Procedimiento de preparación de heliomicina
definida según una de las reivindicaciones 1 a 15,
caracterizado por el hecho que comprende las etapas de
cultivo de un organismo transformado según una de las
reivindicaciones 25 a 29, en un medio de cultivo apropiado, luego la
extracción y la purificación total o parcial de la heliomicina
obtenida.
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