ES2232007T3 - Peptidos antimicrobianos de crustaceos, denominados penaeidinas. - Google Patents
Peptidos antimicrobianos de crustaceos, denominados penaeidinas.Info
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Abstract
La invención se refiere a péptidos antimicrobianos obtenidos de gambas pneidas, que tienen las siguientes características: la masa molecular es aproximadamente 5 a 7 kDa; el pHi no es menor de 9; la parte N-terminal comprende una región (A) de aproximadamente 15 a 25 aminoácidos ricos en prolina; y la porción C-terminal comprende una región (B) de aproximadamente 20 a 30 aminoácidos, que contienen 6 residuos de cisteína que forman 3 enlaces intramoleculares de bisulfuro. La invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que codifican dichos péptidos, y que hacen posible su producción mediante ingeniería genética.
Description
Péptidos antimicrobianos de crustáceos,
denominados penaeidinas.
La invención se refiere a nuevos péptidos
antimicrobianos producidos por camarones peneidos.
Se producen unos péptidos provistos de
propiedades antimicrobianas por una gran variedad de especies
(animales o vegetales), en las cuales participan en mecanismos no
específicos de defensa contra las infecciones. Estos péptidos son
objeto de un creciente interés, particularmente por el hecho de
poseer generalmente un amplio espectro de acción, y una baja
toxicidad para las células eucarióticas.
Las comparaciones de las secuencias de
aminoácidos, de las estructuras secundarias, y las similitudes
funcionales han permitido definir grupos principales, a los cuales
se puede asociar la mayor parte de los péptidos antimicrobianos
hasta ahora descritos. Para revisión, cf. Por HOFFMAN et al.,
en [Phylogenetic Perspectives in Inmunity; The Insect Host Defense.
Chapitre 4, pp. 43-65 (1994)]:
- 1.
- Un primer grupo comprende péptidos lineales esencialmente constituidos por aminoácidos básicos e hidrófobos; en este grupo se clasifican en particular, las crecropinas de insectos y de mamíferos, y las magaininas de la piel de los batracios.
- 2.
- Un segundo grupo comprende péptidos que comprenden puentes disulfuro intramoleculares; en este grupo, se encuentran en particular, las defensinas de insectos o de mamíferos, las brevininas de la piel de batracios, la tanatina de insecto, que presenta una homología importante de secuencia con las brevininas [FEHLBAUM et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, pp. 1221-1225, (1996)], las taquiplesinas, producidas por artrópodos marinos primitivos, así como diferentes péptidos obtenidos a partir de la hemolinfa de escorpión [EHRET-SABATIER et al., J. Biochem. 271, 47, pp. 29537-29544 (1996)];
- 3.
- El tercer grupo comprende péptidos ricos en prolina, entre los cuales se pueden clasificar las apidaecinas y las abaecinas de los himenópteros, la drosocina y la pirrocoricina, también producidas por insectos, y las bactenecinas de mamíferos. A esta clase pertenece también el único péptido antimicrobiano producido por un crustáceo decápodo que se había caracterizado hasta ahora: se trata de un péptido antibacteriano rico en prolina, similar a la bactenecina-7, y obtenido a partir de los hemocitos del cangrejo Carcinus maenas [SCHNAPP et al., Eur. J. Biochem. 240, pp. 532-539 (1996)].
- 4.
- La cuarta clase comprende péptidos o polipéptidos ricos en glicina, tales como las atacinas, las sarcotoxinas y las diptericinas, todos aislados en insectos.
Los inventores ahora han purificado y
caracterizado nuevos péptidos antimicrobianos a partir de la
hemolinfa de camarones peneidos, y también han obtenido secuencias
de ADN que codifican estos péptidos.
La presente invención tiene por objeto estos
péptidos antimicrobianos, denominados a continuación penaeidinas,
que poseen las siguientes características:
- -
- su masa molecular es de aproximadamente 5 a 7 kDa;
- -
- su pHi es superior o igual a 9;
- -
- su secuencia N-terminal comprende una región (A) de 15 a 25 aminoácidos, ricos en prolina, (al menos 1/8, y preferiblemente entre 1/8 y 1/3 de los aminoácidos de esta región son prolinas), y que comprende la siguiente secuencia (1):
(I)PX_{1}PX_{2}PX_{3}PX_{1}X_{1}X_{2}PX_{4}X_{4}
- en la que P representa una prolina, X_{1} representa un aminoácido neutro no polar, X_{2} representa un aminoácido básico, X_{3} representa una prolina o un enlace peptídico y X_{4} representa un aminoácido neutro no polar o una prolina.
- -
- su porción C-terminal comprende una región (B) de 20 a 30 aminoácidos, que contiene 6 residuos cisteína que forman tres puentes disulfuro intramoleculares.
Según una realización preferida de la presente
invención, la región (A) comprende la siguiente secuencia (II):
(II)PX_{1}PX_{2}PX_{3}PX_{1}X_{1}X_{2}PX_{1}PX_{1}X_{1}PX_{1}X_{1}P
en la que P, X_{1}, X_{2} y
X_{3} son tales como se han definido
anteriormente.
\newpage
Según otra realización preferida de la presente
invención, los 6 residuos cisteína de la región (B) están dispuestos
según la siguiente secuencia (III)
(III)CS_{1}CS_{2}CCS_{3}CC
en la que C representa una
cisteína, S_{1} representa un aminoácido o una secuencia peptídica
de 2 ó 3 aminoácidos, S_{2} representa una secuencia peptídica de
10 aminoácidos, S_{3} representa una secuencia peptídica de 5
aminoácidos.
Según una realización preferida de un péptido
conforme a la invención, su extremo N-terminal está
bloqueado por un residuo de ácido piroglutámico, y/o su extremo
C-terminal está amidado.
A título ilustrativo del objeto de la presente
invención, las características de 3 penaeidinas aisladas a partir de
la hemolinfa del camarón Penaeus vannamei, denominadas a
continuación penaeidina 1, penaeidina 2 y penaeidina 3, se indican
más específicamente a continuación.
Las secuencias de estos 3 péptidos (código 1
letra) se representan en las figuras 1a (penaeidina 1), 1b
(penaeidina 2) y 1c (penaeidina 3); el alineamiento de las 3
secuencias se representa en la figura 1d: las secuencias conservadas
están enmarcadas- La figura 2 representa una secuencia de ADNc de la
penaeidina 2 y la secuencia peptídica (código 3 letras)
correspondiente; la figura 3A representa una secuencia de ADNc de
la penaeidina 3 y la secuencia peptídica (código 3 letras)
correspondiente; la figura 3B representa las secuencias peptídicas
(código 1 letra) de otras isoformas de la penaeidina 3: las
variaciones de secuencia están enmarcadas.
Las secuencias de ADNc de la penaeidina 2 y de la
penaeidina 3 se representan respectivamente en la lista de
secuencias anexada con los números SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, y
las secuencias de sus productos de traducción están respectivamente
representadas en lista de secuencias anexada con los números SEQ ID
NO: 2 y SEQ ID NO: 4.
Las secuencias peptídicas de las formas maduras
de las penaeidinas 1, 2 y 3 se representan respectivamente en la
lista de secuencias anexada con los números SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:
6 y SEQ ID NO: 7.
Estas penaeidinas no presentan ninguna homología
significativa con los péptidos antimicrobianos conocidos en la
técnica anterior, y definen un nuevo grupo de péptidos
antimicrobianos.
Las penaeidinas 1 y 2 comprenden 50 aminoácidos,
y tienen una masa molecular de aproximadamente 5,5 kDa; la
penaeidina 3 comprende 62 aminoácidos y su masa molecular es de
aproximadamente 6,6 kDa.
Son péptidos catiónicos, que poseen una carga
neta positiva de 7 para las penaeidinas 1 y 2, y de 8 para la
penaeidina 3; sus puntos isoeléctricos calculados varían de 9,34
para las penaeidinas 1 y 2, a 9,84 para la penaeidina 3.
Los 3 péptidos tienen un dominio
N-terminal rico en prolina, y un dominio
C-terminal que comprende 6 residuos cisteína que
forman tres puentes disulfuro intramoleculares, y en los que los 4
residuos cisteína más cercanos del extremo
C-terminal se organizan en 2 dobletes separados por
5 residuos.
Las cisteínas más centrales están respectivamente
separados por uno, dos o tres residuos en las penaeidinas 1, 2 y
3.
El extremo N-terminal de la
penaeidina 3 se bloquea mediante un residuo de ácido piroglutámico.
El bloqueo por residuos similares ya se ha observado en otros
péptidos antimicrobianos.
El extremo C-terminal de las
penaeidinas 2 y 3 está amidado. Tal amidación
C-terminal ya se ha observado por algunos péptidos
antimicrobianos de otros invertebrados marinos (taquiplesinas de
limulo), así como para las cecropinas de insectos y las magaininas
de anfibios. Tal modificación refuerza la estabilidad de la
molécula, y parece que aumenta la actividad antimicrobiana.
Las penaeidinas poseen una estabilidad elevada,
y son particularmente muy resistentes a la proteólisis. Son
esencialmente activos contra las bacterias Gram positivo, y
presentan también una actividad contra las bacterias Gram negativo;
poseen además propiedades funguicidas.
Las penaeidinas y sus fragmentos, tales como se
han definido anteriormente, se pueden obtener por ejemplo por
extracción a partir de los animales que las producen, y también por
síntesis peptídica, o ventajosamente, por ingeniería genética,
expresando al menos una secuencia de ácido nucleica que codifica una
penaeidina o un fragmento de ésta, en una célula huésped
apropiada.
La presente invención engloba también ácidos
nucleicos que comprenden un segmento del gen de una penaeidina.
Unos ácidos nucleicos conformes a la invención, y
en particular unos ADNc de penaeidina, o porciones de éstos se
pueden obtener por cribado de bancos de ácido nucleico con la ayuda
de oligonucleótidos derivado de las secuencias representadas en las
figuras 1, 2 ó 3, o de sus secuencias complementarias.
Unos ácidos nucleicos conformes a la invención
engloban también módulos de expresión, que comprenden al menos una
secuencia de ácido nucleico que codifica una penaeidina o un
fragmento de ésta, bajo control transcripcional ce un promotor
apropiado.
Por "promotor apropiado" se entiende
cualquier promotor funcional en la célula huésped destinada a alojar
el módulo de expresión.
Un módulo de expresión conforme a la invención
también puede comprender además una o varias secuencias de ácido
nucleico que permiten mejorar la secreción de la penaeidina o de su
fragmento por la célula huésped, por ejemplo una secuencia que
codifica un péptido señal. La secuencia de ácido nucleico que
codifica el péptido señal se coloca en el extremo 5' de la secuencia
de ácido nucleico que codifica la penaeidina o su fragmento.
La secuencia de ácido nucleico que codifica el
péptido señal puede ser una secuencia que codifica un péptido señal
de penaeidina, o una secuencia que codifica un péptido señal
heterólogo. Se seleccionará una secuencia que comprende en el
extremo C-terminal un sitio de proteólisis capaz de
ser reconocido por una señal-peptidasa de la célula
huésped destinada a alojar el módulo de expresión.
La invención tiene también por objeto:
- -
- vectores recombinantes caracterizados porque comprenden al menos un ácido nucleico conforme a la invención, y en particular vectores que comprenden un módulo de expresión tal como el definido anteriormente.
- -
- Células procariotas o eucariotas transformadas por un módulo de expresión según la invención. Puede tratarse de células mantenidas en cultivo, o células que forman parte de un organismo pluricelular, animal o vegetal. El módulo de expresión presente en la célula transformada se puede, o bien incorporar al ADN cromosómico de dicha célula, o ser llevado por un vector extracromosómico.
La invención también tiene por objeto un
procedimiento de producción de una penaeidina o de un fragmento de
ésta, caracterizado porque comprende la expresión de dicha
penaeidina o de dicho fragmento, en al menos una célula transformada
conforme a la invención.
Los péptidos conformes a la invención se pueden
expresar en cultivos de células transformadas utilizando técnicas
similares a las utilizadas para péptidos antimicrobianos de la
técnica anterior, por ejemplo en células de insecto, como se
describe en HELLERS et al., [Eur. J. Biochem. 199, pp.
435-439, (1991)] para las cecropinas, o en la
levadura, como se describe en REICHHART et al.,[Invertebrate
Reproduction and Development, 21 pp. 15-24,
(1992)].
También se pueden expresar en animales o
vegetales transgénicos, para aumentar la resistencia de estos a las
infecciones, como se describe por ejemplo en JAYNES et al.,
[Plant Science, 89, pp. 43-53 (1993)] en el caso de
péptidos análogos de la cecropina B, expresados en plantas de
tabaco transgénico que expresan el gen de la
atacina-E.
Los péptidos conformes a la invención se pueden
utilizar en particular para la obtención de productos y en
particular de medicamentos antiinfecciosos, por ejemplo
antibacterianos o funguicidas.
Tales productos encuentran su aplicación para la
prevención y el tratamiento de diferentes enfermedades microbianas,
en sectores muy variados, particularmente en los campos de la salud
y de la agricultura, y en el de la acuicultura, para limitar el
desarrollo de enfermedades infecciosas en las ganaderías.
La presente invención se entenderá mejor con la
ayuda del siguiente complemento de descripción, que se refiere a
ejemplos de purificación de los péptidos antimicrobianos conformes a
la invención, y de su caracterización.
Se han obtenido 225 ml de hemolinfa a partir de
500 camarones, por toma a partir del seno central situado en la base
del primer segmento abdominal. La toma se efectúa en presencia de
tampón anticoagulante (citrato de sodio al 10% pH 7, con 200
\mug/ml de aprotinina. La hemolinfa se ha centrifugado a 700g
durante 15 minutos a 4ºC para eliminar las células sanguíneas. El
plasma y los hemocitos se conservan por separado a -70ºC hasta su
utilización.
El plasma se diluye con agua desmineralizada (1
volumen de plasma para 1 volumen de agua), y a esta mezcla se añade
un 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético. El pH se ha llevado a 3,9
con la ayuda de HCl 1M en un baño enfriado con hielo, con agitación
suave durante 1 hora. Se han efectuado dos centrifugaciones
sucesivas a 8000g y a 4ºC para clarificar el sobrenadante que se
conserva en el hielo a 4ºC hasta su utilización.
Después de la descongelación, los hemocitos se
homogeneizan con la ayuda de un aparato DOUNCE (máximo 152 \mu.
Mínimo 76 \mu) en un tampón Tris 50 mM pH 8,7, que contiene 50 mM
de NaCl. Después de la centrifugación (8000g 20 mn 4ºC), el
sobrenadante (fracción citosol) se acidifica a un pH de 3,6 por
adición de 1 M HCl y se conserva a 4ºC.
El resto de transferencia que contiene los
organelos celulares se extrae por sonificación (3 x 30 s) a potencia
media en ácido acético 2M. Se eliminan los residuos por
centrifugación (8000g, 20 mn, 4ºC) y el extracto ácido se conserva a
4ºC hasta su utilización.
La fracción plasmática y los extractos citosol y
organelos se han depositado por separado en cartuchos
SEP-PAK C_{18} VAC de 35 cm^{3} (10 g WATERS
ASOCIATES), equilibrados con agua acidificada (ácido
trifluoroacético al 0,05%).
Después del lavado con agua acidificada, se
efectúan 3 eluciones utilizando sucesivamente soluciones al 5%, 40%
y 80% de acetonitrilo en agua acidificada. Las diferentes fracciones
obtenidas se liofilizan, y se reconstituyen con agua microfiltrada
previamente a la purificación por HPLC de fase inversa.
Las fracciones eluidas al 5% y 40% de la columna
SEP-PAK han sido sometidas a una cromatografía de
fase inversa en una columna AQUAPORE RP300 C_{8} (4,6 X 2020 MM,
BROWNLEE^{TM}), equilibrada en agua acidificada (TFA al 0,05%). La
separación de la fracción 5%, se efectúa SEP-PAK con
la ayuda de un gradiente lineal del 0 al 5% de acetonitrilo en agua
acidificada, con un caudal de 1 ml/mn durante 80 mn.
Para la fracción 40%, se utiliza un gradiente
lineal del 2 al 60% de acetonitrilo en las mismas condiciones. Las
fracciones se recogen, se secan a vacío, se reconstituyen con la
ayuda de agua ultrafiltrada, y se ensaya su actividad
antimicrobiana.
Las fracciones obtenidas procedentes de la
cromatografía de fase inversa que presentan una actividad
antimicrobiana se purifican por cromatografía de exclusión,
utilizando 2 columnas HPLC conectadas en serie (columna
ULTRASPHEROGEL SEC 3000 y columna ULTRASPHEROGEL SEC 2000, 7,5 X 300
MM, BECKMAN) protegidas por una precolumna (ULTRASPHEROGEL SEC 7,5 x
40 mm, BECKMAN).
La elución se efectúa en condiciones isocráticas
en presencia del 30% de acetonitrilo en agua acidificada, con un
caudal de 0,5 ml/mn. Las fracciones se recogen y ensayadas para su
actividad antimicrobiana.
Los péptidos se han purificado mediante una
cromatografía de fase inversa en la misma columna que en la etapa 1
a una temperatura controlada de 35ºC.
Los péptidos 1 y 2 se han purificado con un
gradiente bifásico lineal: del 2 al 21% de acetonitrilo en agua
acidificada (TFA al 0,05%) durante 10 mn, y a continuación del 21 al
35% de acetonitrilo durante 50 mn con un caudal de 0,25 ml/mn.
El péptido 3 se ha purificado con la ayuda de un
gradiente bifásico lineal: del 2 al 23% de acetonitrilo en agua
acidificada durante 10 mn, y a continuación del 23 al 37% de
acetonitrilo durante 50 mn con un caudal de 0,25 ml/mn a 35ºC.
Las últimas etapas de purificación de los
péptidos se han efectuado en columnas de fase inversa DELTAPAK HPI
C_{18}, 2 x 150 mm, WATERS ASSOCIATES, a una temperatura de 40ºC
con un caudal de 0,25 ml/mn utilizando los gradientes bifásicos
descritos anteriormente.
La elución se controla por absorción en el
ultravioleta a 225 nm. Las fracciones se recogen en tubos de
polipropileno, se concentran a vacío y se reconstituyen con agua
esterilizada por filtración previamente a la medición de la
actividad antimicrobiana.
Las cepas microbianas utilizadas para determinar
las actividades antimicrobianas son las siguientes:
- Micrococcus luteus (cepa Gram
positivo);
- Escherichia coli (cepa Gran
negativo);
- Neurospora crassa (hongo
filamentoso);
Las bacterias se cultivan con una densidad óptica
de partida A_{600} = 0,001 en medio nutritivo
"Poor-Broth" (bactotriptona al 1%, NaCl al 0,5%
p/v).
Las fracciones se han ensayado por inhibición del
crecimiento en fase líquida.
Se incuban alícuotas de 10 \mul de cada
fracción que se va a ensayar en placas de microtitración con 100
\mul de una suspensión de bacterias en medio de fase
logarítmica.
El crecimiento bacteriano se mide determinando la
densidad óptica A_{600} después de la incubación de 24 horas a
30ºC.
Se ha utilizado un procedimiento idéntico para
determinar la concentración mínima inhibidora (CMI) de las moléculas
en estas cepas bacterianas. Los valores de la CMI corresponden a un
intervalo a-b de concentraciones en péptido, en el
que a representa la concentración más elevada a la que se observa un
crecimiento bacteriano, y b es la menor concentración que causa el
100% de inhibición de crecimiento.
Se ha incubado un cultivo de Micrococcus
luteus en medio de fase logarítmica, en el medio
"Poor-Broth" definido anteriormente a 30ºC en
presencia del péptido o (a título de testigo) de agua. La
concentración final de las moléculas ensayadas es 8 veces superior a
la CMI. Se toman alícuotas de 20 \mul a diversos intervalos de
tiempo y se cultivan en placa de agar nutritivo. El número de
colonias formadas (UFC) se determina después de 24 horas de
incubación a 37ºC.
La actividad antifúngica se ha determinado contra
Neurospora crassa y Fusarium oxysporum mediante un
ensayo de inhibición de crecimiento en fase líquida.
Se suspenden 80 \mul de esporas de hongos
(concentración final: 10^{4} esporas/ml) en ½ Potato Dextrose
Broth (DIFCO) suplementado con tetraciclina (10 \mug/ml) y
cefotaxima (100 \mug/ml). A esta suspensión se han añadido 10
\mul de la fracción que se va a ensayar en placas de
microtitración. El volumen final se lleva a 100 \mul por adición
de 10 \mul de agua. La inhibición del crecimiento se puede
observar al microscopio después de 24 horas de incubación a 25ºC en
la oscuridad, y se mide por la variación de densidad óptica a 600 nm
al cabo de 48 horas.
No se ha obtenido ninguna actividad para las
fracciones obtenidas a partir de HC40. Por el contrario, como lo
muestran respectivamente las figuras 4 y 5, algunas de las
fracciones obtenidas a partir de P40 y de HO40 presentan una
actividad antimicrobiana, y poseen una zona activa común, que
corresponde a las fracciones eluidas entre 47 y 60 mn (del 26 al 29%
de acetonitrilo), donde se observa una actividad contra las 2 cepas
bacterianas y el hongo.
El tiempo de elución en mn se indica en la
abscisa. La absorbancia a 225 nm se representa en la ordenada. La
actividad antimicrobiana contra Escherichia coli D31
(rectángulo rayado), Micrococcus luteus (rectángulo negro) y
N. Crassa (rectángulo gris) se indica para las fracciones en
cuestión. Las regiones de la curva correspondiente a las fracciones
que presentan una actividad antimicrobiana se indican con las letras
A, B y C. Las fracciones a partir de las cuales se han purificado
las penaeidinas 1, 2 y 3 se indican con las flechas 1, 2 y 3.
Se han obtenido dos regiones que presentan
también una actividad antimicrobiana después de la cromatografía de
fase inversa de la fracción plasmática. Las fracciones P40B, que se
eluyen hacia 40 mn (el 21-22% de acetonitrilo),
contienen moléculas activas contra los tres microorganismos
ensayados, y P04C, que corresponden a moléculas eluidas a
aproximadamente 75 mn, el 38-39% de acetonitrilo,
son activas únicamente contra Micrococcus luteus. Ninguna de
estas dos zonas está presente en el cromatograma de HO40, en el que
otras fracciones eluidas a aproximadamente 90 nm (el
45-46% de acetonitrilo) son activas únicamente
contra Micrococcus luteus.
Los tres péptidos purificados como se indica en
el ejemplo 1 anterior se han caracterizado por técnicas sucesivas de
bioquímica y de biología molecular.
Su masa molecular se ha determinado mediante
espectrometría de masa; esta masa molecular es respectivamente de
5484,8 Da y 5520,0 Da para los péptidos P1 y P2, y de 6617,4 Da para
el péptido P3.
- \bullet
- Se ha podido obtener la secuencia de aminoácidos de P1 por secuenciación directa por degradación de Edman.
- P1 es un péptido de 50 residuos, que contiene el 14% de prolina entre los 19 residuos N-terminales, y 6 cisteínas que forman tres puntos disulfuro intramoleculares en el dominio C-terminal, P1 es rico en aminoácidos básicos.
- \bullet
- En lo que respecta al péptido P2, la secuenciación directa no ha permitido obtener más que una secuencia parcial de 21 residuos N-terminales. Esta secuencia no difiere de la de la penaeidina 1 más que por la sustitución de la leucina en posición 20 en P1 por una fenilalanina en P2.
- \bullet
- En lo que respecta al péptido P3, no se ha podido establecer su secuencia N-terminal por la técnica de degradación de Edman, lo que sugiere un bloqueo en su extremo N-terminal.
La S-piridiletilación seguida del
análisis en espectrometría de masa, y la detección de la variación
de masa inducida por la S-piridiletilación, muestra
la presencia de 6 residuos cisteína. Después de la escisión
enzimática del péptido S-piridiletilado, los
fragmentos obtenidos se han purificado, se han analizado por
espectrometría de masa, y por degradación de Edman. LA secuencia
del extremo NH_{2}-terminal se ha determinado por
nano-ES-MS
(nano-Electrospray Mass Spectrometry). De este modo
se ha podido determinar que el residuo
NH_{2}-terminal de este péptido estaba ciclizado
en ácido piroglutámico.
Se ha preparado una sonda constituida por
oligonucleótidos degenerados que corresponden a los residuos 38.-44
del péptido P3, y que presenta la siguiente secuencia:
5'(GGIAT(A/T/C)(A/T)(G/C)ITT(C/T)(A/T)(G/C)ICA(A/G)GC)3'
Esta sonda ha permitido obtener por transcripción
inversa seguida de amplificación en cadena por polimerasa (PCR) a
partir de los ARN poli(A)^{+} totales de hemocitos
de camarones adultos, recogidos 6 y 12 horas después de un reto
bacteriano, un producto de amplificación constituido por un
fragmento de 497 pares de bases. Después de la secuenciación, se ha
identificado este fragmento como un fragmento del ADNc de P3,
constituido por el extremo del marco de lectura abierto y la región
3' no traducida. Un subfragmento de 440 pares de bases, obtenido por
digestión enzimática Bsal a partir de este fragmento de 497 pares de
bases, y constituido principalmente por la región 3' no traducida,
se ha clonado en un vector pBluescript (STRATAGENE, La Jolla, CA).
Se ha marcado este fragmento por cebado aleatorio utilizando el kit
de marcado de ADN READY-TO-GO
(PHARMACIA BIOTECH Uppsala, Sweden), y utilizado para cribar un
banco de ADNc obtenidos a partir de los ARN
poli(A)\pm de camarones adultos, en el vector
ZAP-EXPRESS (STRATAGENE, La Jolla, CA):
Se han efectuado hibridaciones con estringencia
elevada durante una noche a 65ºC en una solución de Denhardt 5X, 5X
SSPE SDS al 0,1%, en presencia de 100 \mug/\mul de ADN de
esperma de salmón.
Se ha obtenido 161 clones. Entre estos clones, se
han secuenciado 4. Uno de ellos contenía un cuadro de lectura
abierta que codifica una secuencia de 81 aminoácidos (P3a) que
empieza por un codón metionina y que termina por un codón
parada.
La secuencia de aminoácidos deducida de este
cuadro de lectura abierta empieza por un péptido señal de 19
residuos rico en residuos hidrófobos. El sitio de escisión de la
señal-peptidasa se ha localizado después del residuo
glicina que precede a la glutamina en posición 1.
Este péptido señal está directamente seguido, en
su extremo C-terminal, por un péptido de 63
aminoácidos, que empieza por un residuo glutamina. La secuencia de
aminoácidos deducida de este péptido maduro confirma claramente las
secuencias parciales de la penaeidina 3 obtenidas por secuenciación
directa.
Partiendo de la hipótesis de que la penaeidina 3
en forma madura empieza por un ácido piroglutámico que resulta de
la ciclización del residuo glutamina (observada por enfoque
bioquímico), la masa calculada a partir de la secuencia de
aminoácidos deducida es superior en 56,4 Da a la masa medida. Esto
sugiere que la penaeidina 3 está amidada en su extremo
C-terminal por eliminación de un residuo glicina (57
Da).
Entre los otros tres clones secuencias, se han
identificado dos secuencias deducidas de aminoácidos ligeramente
diferentes (P3b y P3c). P3b difiere de P3a en la sustitución de una
isoleucina en la posición 30 en P3a en una valina en P3b, mientras
que P3c está desprovisto, en posición 33, de una prolina que está
presente en P3a y P3b. Finalmente, la leucina en posición 40 en P3a
y P3b se sustituye por una valina en P3c.
Para aislar los ADNc de las otras penaeidinas, se
ha utilizado una sonda correspondiente a una porción de la secuencia
codificante de la penaeidina 3 cuya secuencia del producto de
traducción está considerablemente conservada entre los tres péptidos
purificados.
Esta sonda se ha obtenido por amplificación en
cadena por polimerasa sobre un clón de ADNc de P3, utilizando los
siguientes cebadors:
Cebo corriente arriba:
5'GTGTACAAGGGCGGTTACACG3'(SEQ ID NO: 8).
Cebo corriente abajo: 5'CAACAGGTTGTCAAGCGAGGT3'
(SEQ ID NO: 9).
La hibridación se efectúa en las mismas
condiciones que las descritas anteriormente, pero a una temperatura
de hibridación más baja (50ºC), para garantizar una estringencia
menos elevada.
Los clones obtenidos en estas condiciones se han
analizado sobre la base de su perfil de restricción. Para uno de
estos clones, este perfil era diferente del observado para P3a. Este
clón se ha secuenciado. La secuencia de aminoácidos deducida de la
secuencia de ADN posee un porcentaje de identidad muy elevado con la
penaeidina 1, particularmente un dominio
COOH-terminal totalmente idéntico al establecido por
secuenciación directa de la penaeidina 1. Sin embargo, la presencia
de un residuo fenilalanina en posición 20 en el péptido maduro, así
como el valor de la masa molecular, está a favor del ADNc de la
penaeidina 2. La secuencia de aminoácidos deducida comprende un
aminoácido suplementario (glicina en el extremo
C-terminal, respecto de la obtenida por
secuenciación directa, lo que sugiere que este residuo glicina se
puede eliminar por amidación. Esto se ha confirmado mediante el
cálculo de la masa (5575,6 Da) que es superior en 55,6 Da a la masa
medida para la penaeidina 2, mientras que la masa calculada del
péptido amidado corresponde a la de la penaeidina 2 medida por
espectrometría de masa.
Parece además que la penaeidina 2 procede de una
molécula precursor que pose una región "pre" de 21 residuos,
idéntica a la del péptido señal de la penaeidina 3, con dos residuos
suplementarios (GLP-Ala) que preceden inmediatamente
el sitio de escisión observado. Se ha localizado otro sitio de
escisión potencial en la posición -3 corriente arriba del residuo
Tyr-1. Este otro sitio corresponde al observado en
la maduración de la penaeidina 3.
La actividad de la penaeidina 3 purificada se ha
ensayado como se describe en el ejemplo 2, contra Micrococcus
luteus, Escherichia coli D31, Neurospora crassa, y
también contra Fusarium oxysporum que es un hongo patógeno de
los camarones peneidos.
Este péptido tiene una actividad marcada contra
Micrococcus luteus (CMI = 0,6 a 2,5 \muM) y una actividad
moderada sobre Escherichia coli(CMI>5 \muM). La
penaeidina 3 también es activa contra los dos hongos ensayados
(CMI>5 M).
Cuando se procede a la incubación de la
penaeidina 3 con Micrococcus luteus a una concentración de 18
\muM, es decir 8 veces superior a la CMI, no se observa ningún
crecimiento bacteriano después de una incubación de 24 horas.
Además, el número de colonias formadas permanece constante a lo
largo de las diferentes tomas, lo que sugiere que esta molécula
tiene un efecto bacteriostático. Estos resultados se muestran en la
siguiente Tabla 2.
Se han obtenido fragmentos de ADN que codifican
las penaeidinas-2 o -3 flanqueadas en su extremo
amino-terminal por PCR utilizando los siguientes
cebadors, que permiten insertar, corriente arriba de la secuencia
que codifica la penaeidina, una secuencia que codifica los cinco
últimos residuos de la proregión del factor sexual MF\alpha1 de
levadura y un sitio Hindi, y corriente arriba de la secuencia que
codifica la penaeidina, un sitio BamHI.
Cebadors utilizados para la
penaeidina-2.
Estos dos cebadors se representan respectivamente
en la lista de secuencias con los números SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO:
11.
Cebadors utilizados para la
penaeidina-3.
Estos dos cebadors se representan
respectivamente en la lista de secuencias con los números SEQ ID NO:
12 y SEQ ID NO: 13.
La enzima utilizada para la PCR es la Vent
polimerasa (NEW ENGLAND BIOLABS) que genera extremos francos. Los
fragmentos obtenidos se han clonado entre los sitios Hindi y BamHI
del ligador multisitio del plásmido pCRT-SCRIPT
(STRATAGENE).
Los insertos de los plásmidos así obtenidos se
han excisado por BamHI y Hindi, y se han subclonado en el módulo de
expresión de levadura del vector pJV1. El vector pJV ha sido
proporcionado por el laboratorio del Profesor HOFFMANN en
Estrasburgo: se trata de un plásmido derivado de pBLUESCRIPT II en
el cual se han introducido el promotor del factor sexual MF\alpha1
de levadura y la preprosecuencia de este mismo factor, en la cual se
ha creado por mutación silenciosa un sitio de restricción Hindi que
permite la fusión en fase de las secuencias codificantes.
Los módulos completos (aproximadamente 1,4 kb) se
han excisado de pJV1 por doble digestión Sphl-BamHI
(digestión Sphl parcial para la penaeidina-2) y se
han subclonado en el vector lanzadera pTG4812 [MICHAUD et
al., FEBS Lett. 395: 6-10 (1996)].
Lo dos vectores de expresión así obtenidos se
denominan pen2-pTG4812 y
pen3-pTG4812, y permiten respectivamente la
expresión de la penaeidina 2 y la de la penaeidina 3 en la
levadura.
Para la producción de las penaeidinas
recombinantes, se ha utilizado la cepa de Saccharomyces
Cerevisiae TGY48-1 descrita por REICHHART et
al., [Invert. Reprod. Dev. 21 (1): 15-24 (1992).
Lleva una mutación ura3-\Delta5 que permite
la selección de clones recombinantes en medio selectivo desprovisto
de uracilo.
Esta cepa se ha transformado con los plásmidos
recombinantes pen2-pTG4812 y
pen3-pTG4812 según el procedimiento con acetato de
litio descrito por GIETZ et al., [Nucl. Ac. Res.
20(6): 1425 (1992)]. Los clones de levadura recombinantes se
han seleccionado en medio selectivo
``YNBG-casaminoácido desprovisto de uracilo, y se
ponen en cultivo. Las penaeidinas recombinantes son segregadas en el
medio de cultivo, y se purifican a partir del sobrenadante de
cultivo según un protocolo similar al descrito en el ejemplo 1
anterior.
<110> DESTOUMIEUX, Delphine
BACHERE, Evelyne
BULET, Philippe
IFREMER
CNRS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS DE
CRUSTÁCEOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MJPrm712/5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR9709214
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-07-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Vers. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 658
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penaeus vannamei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (76)..(294)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (139)..(294)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212>PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penaeus vannamei
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 736
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penaeus vannamei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (71)..(319)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (128)..(319)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penaeus vannamei
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penaeus vannamei
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penaeus vannamei
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penaeus vannamei
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penaeus vannamei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgtacaagg gcggttacac g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penaeus vannamei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacaggttg tcaagcgagg t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgcaagc ttggacaaga gatacagggg cggttac
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgcaagc ttggacaaga gacaagtgta caagggc
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
Claims (11)
1. Péptido antimicrobiano, caracterizado
porque se puede obtener a partir de camarones peneidos, y porque
- -
- su masa molecular es de aproximadamente 5 a 7 kDa;
- -
- su pHi es superior o igual a 9;
- -
- su porción N-terminal comprende una región (A) de 15 a 25 aminoácidos, que comprende la siguiente secuencia (1):
(I)PX_{1}PX_{2}PX_{3}PX_{1}X_{1}X_{2}PX_{4}X_{4}
- en la que P representa una prolina, X_{1} representa un aminoácido neutro no polar, X_{2} representa un aminoácido básico, X_{3} representa una prolina o un enlace peptídico y X_{4} representa un aminoácido neutro no polar o una prolina.
- -
- su porción C-terminal comprende una región (B) de 20 a 30 aminoácidos, que contiene 6 residuos cisteína que forman tres puentes disulfuro intramoleculares.
2. Péptido según la reivindicación 1,
caracterizado porque la región (A) comprende la siguiente
secuencia (II):
(II)PX_{1}PX_{2}PX_{3}PX_{1}X_{1}X_{2}PX_{1}PX_{1}X_{1}PX_{1}X_{1}P
en la que P, X_{1}, X_{2} y
X_{3} son tal como se han definido
anteriormente.
3. Péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque los 6 residuos
cisteína de la región (B) están dispuestos según la siguiente
secuencia (III)
(III)CS_{1}CS_{2}CCS_{3}CC
en la que C representa una
cisteína, S_{1} representa un aminoácido o una secuencia peptídica
de 2 ó 3 aminoácidos, S_{2} representa una secuencia peptídica de
10 aminoácidos, S_{3} representa una secuencia peptídica de 5
aminoácidos.
4. Péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 3 elegido en el grupo constituido por:
el péptido de secuencia SEQ ID NO: 5
el péptido de secuencia SEQ ID NO: 6
el péptido de secuencia SEQ ID NO: 7
5. Péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque su extremo
N-terminal está bloqueado por un residuo de ácido
piroglutámico, y/o su extremo C-terminal está
amidado.
6. Ácido nucleico que comprende una secuencia
que codifica un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
5.
7. Módulo de expresión, que comprende al menos
una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 6, bajo el
control transcripcional de un promotor apropiado.
8. Vector recombinante caracterizado
porque comprende al menos un ácido nucleico según la reivindicación
6.
9. Célula procariota o eucariota transformada por
un módulo de expresión según la reivindicación 7.
10. Procedimiento de producción de un péptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado
porque comprende la expresión de un ácido nucleico según la
reivindicación 6, en al menos una célula transformada según la
reivindicación 9.
11. Uso de un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 para la obtención de un medicamento.
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