CN100413963C - 一种基因重组核多角体病毒杀虫剂的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因重组核多角体病毒杀虫剂及其制备方法的方法，包括构建绿色荧光蛋白供体质粒、将外源基因插入供体质粒、还原多角体蛋白基因、将绿色荧光蛋白及外源基因和多角体蛋白基因转入核多角体病毒、转染昆虫细胞、在虫体扩增病毒、收集和储存病毒等步骤。利用本发明的方法创制的基因重组病毒较野生型病毒对棉铃虫等鳞翅目害虫有更好的控制效果，可用于开发高杀虫活性的生物杀虫剂用于鳞翅目害虫控制。

Description

一种基因重组核多角体病毒杀虫剂的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及生物工程技术领域中的DNA重组技术及应用，具体涉及一种基因重组核多角体病毒杀虫剂的创制方法及应用。

背景技术

中国是一个农业大国，为了保证农业高产，每年使用大量化学农药防治害虫，多数化学农药对环境造成污染，严重威胁着人类健康。进入WTO以后我国农业生产面对日趋激烈的国际竞争，大量使用有毒化学农药致使农药残留超标，严重制约了农产品的出口。因此，减少有毒化学农药的使用势在必行，生物农药是减少化学农药使用量的有效途径之一，其中，杆状病毒杀虫剂有着重要的应用前景。

与传统的化学农药相比，杆状病毒杀虫剂对宿主昆虫具有高度的病原性，对非靶标生物十分安全，能够在环境中长期存活，对人、畜及其它脊椎动物无害，不污染环境，能和其他化学农药混合使用，同时防效时间长，使用方便，所以早在1973年已被联合国粮农组织和世界卫生组织推荐，作为化学农药的理想替代品。到目前为止，已有多种杆状病毒被开发为商品杀虫剂。苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)属于杆状病毒科的核多角体病毒属，与其它杆状病毒相比，该病毒的主要优点是宿主范围较宽，可以感染30多种鳞翅目昆虫，但缺点是杀虫速度慢。

随着分子生物学技术的迅猛发展，现在已经有许多遗传改良的方法来提高它的杀虫活性，如利用AcMNPV的P10位点重组表达编码食虫螨Pyemotes tritici(Tormalski M D，Miller L K，Insect paralysis by baculovirus-mediated expression of a mite neurotoxingene，Nature，1991，352(6330)：82-85)的神经毒素基因和苏云金杆菌Bacillusthuringiensis的毒蛋白CryIA(b)(Sun X，Chen X，Zhang Z，et al.，Bollworm responsesto release of genetically modified Helicoverpa armigera nucleopolyhedroviruses incotton，J Invertebr Pathol，2002，81(2)：63-69)。虽然这些方法在一定程度上改善了野生型AcNPV病毒杀虫集的活性，但是，这些方法中使用的基因是食虫螨的神经毒素基因和苏云金杆菌的毒蛋白基因，对环境的安全性没有得到肯定，人们需要找到更多环境安全的基因来改造野生型杆状病毒杀虫剂，例如，Harrison和Bonning将组织蛋白酶L基因重组到野生型AcMNPV中，改善了AcMNPV的杀虫活性，取得了较好的效果杀虫(Harrison RL，BonningBC.2001.Use of proteases to improve the insecticidal activity of baculoviruses.Biol Control.20：199-209)，但是，开发更多更好的基因重组病毒杀虫剂仍然需要大量工作。

我们在前期研究中克隆到了棉铃虫蜕皮调节转录因子激素接受子3(HHR3)(基因全序列已经提交GenBank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受号：AF271059；)和棉铃虫组织蛋白酶B基因(HCB)(基因全序列已经提交Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受号：AF222788)。棉铃虫HHR3基因属于甾醇类激素受体超家族和核受体超家族，该基因在蜕皮期间有短暂表达，在蜕皮激素诱导的信号级联反应中发挥重要的作用(Zhao X F，Jang X J，XuY P，et al.，Recombinant expression and purification of inclusion bodies of themolt-regulating transcription factor-HHR3 from Helicoverpa armigera，Acta EntomolSenica，2004，47(3)：281-286)。棉铃虫组织蛋白酶B基因在成虫脂肪体降解和卵黄蛋白降解中发挥功能(Zhao X F，Wang J X，Xu X L，et al.，Molecular cloning and expressionpatterns of molt-regulating transcription factor-HHR3 from Helicoverpa armigera，Insect Mole Biol，2004，13(4)：407-412)。本发明的思路是：将棉铃虫的蜕皮激素接受子3基因和棉铃虫组织蛋白酶B基因重组到野生型AcMNPV病毒中，用这些昆虫来源的功能基因通过调控害虫的生长发育来增加野生型AcMNPV病毒的杀虫能力，达到既提高病毒活力又对环境安全的目的；同时将绿色荧光蛋白基因(EGFP，Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受号：DQ005470)重组到野生型AcMNPV病毒中，作为基因重组病毒的标记，以便在田间使用时跟踪检测病毒的分布和对天敌的影响；此外还将棉铃虫核多角体病毒的基因(HaPolh)(Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受号：AF303045)重组到野生型AcMNPV病毒中，使该基因重组病毒杀虫剂可以抵抗田间的紫外光和其它恶劣的自然环境，从而可以作为杀虫剂在田间使用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种杀虫效果好、可以在田间使用并可以被跟踪的基因重组AcNPV病毒及其制备方法。

本发明将绿色荧光蛋白基因、昆虫功能基因和多角体蛋白基因重组到缺失多角体蛋白基因的AcNPV上，创制具有绿色荧光蛋白标记的、有昆虫功能基因插入的、具有多角体蛋白基因的AcNPV杀虫剂。利用本发明可以创制各种基因重组病毒杀虫剂，用于鳞翅目害虫防治。

本发明提供一种基因重组核多角体病毒杀虫剂，其特征是，将绿色荧光蛋白基因、昆虫功能基因和多角体蛋白基因重组到缺失多角体蛋白基因的AcNPV上。

优选的，所述绿色荧光蛋白基因为EGFP(Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受号：DQ005470)；所述昆虫功能基因为棉铃虫蜕皮调节转录因子激素接受子3(HHR3，http://www.ncbi.nlm.nih，接受号：AF271059)和棉铃虫组织蛋白酶B基因(HCB，基因全序列已经提交Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受号：AF222788)或其它有调控昆虫生长发育的昆虫功能基因，如棉铃虫几丁质酶基因(http://www.ncbi.nlm.nih，接受号：AF515667)，所述多角体蛋白基因为棉铃虫核多角体病毒的核多角体蛋白基因(HaPolh，Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受号：AF303045)或其它多角体病毒的多角体蛋白基因，如AcNPV核多角体蛋白基因(AcPolh，Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受号：K02700)，以及在上述基因的基础上进行修饰或碱基突变产生的基因。

本发明还提供一种基因重组核多角体病毒杀虫剂的制备方法，包括如下步骤：

[1]针对插入AcNPV中的绿色荧光蛋白基因、有杀虫活性的功能基因和核多角体病毒多角体蛋白基因，根据基因序列分别设计带酶切位点的引物，用PCR方法分别扩增绿色荧光蛋白基因、功能基因和核多角体病毒多角体蛋白基因，

[2]在大肠杆菌中扩增并提取供体质粒pFASTBAC；

[3]用限制性内切酶SmaI和KpnI分别切开绿色荧光蛋白基因PCR产物和pFASTBAC质粒，将绿色荧光蛋白基因与质粒连接，形成带有绿色荧光蛋白基因的pFASTBAC重组质粒；

[4]用EcoRI和NotI切开功能基因和带有绿色荧光蛋白基因的pFASTBAC质粒，将两者连接起来；

[5]用NotI切开核多角体蛋白基因和带有绿色荧光蛋白基因和功能基因的pFASTBAC质粒，将二者连接起来，从而构建成功具有上述3种基因的重组pFASTBAC质粒；

[6]将含有3种基因插入的重组pFASTBAC质粒转入大肠杆菌DH10BAC菌株，将3种基因转位到杆粒上，形成基因重组杆粒，用传统的质粒提取方法纯化基因重组杆粒；

[7]将杆粒转染昆虫细胞(如Sf21，Sf9，或其它昆虫细胞)，形成基因重组AcNPV病毒粒子；

[8]用含有基因重组AcNPV病毒粒子的细胞培养液注射棉铃虫幼虫，产生基因重组AcNPV病毒；

其中，步骤[2]中所述的供体质粒是pFASTBAC质粒。

其中，步骤[1]中所述功能基因为任何有杀虫功能的基因，优选棉铃虫激素接受子3基因(GenBank，accession number AF337637)。

其中，步骤[1]中所述绿色荧光蛋白是EGFP(GenBank，accession number DQ005470)

其中，步骤[1]中所述多角体蛋白基因是任何核多角体病毒的多角体蛋白基因，优选棉铃虫核多角体病毒多角体蛋白基因(GenBank，accession number AF303045)。

其中，步骤[6]所述的杆粒是在AcNPV病毒的多角体基因处加入了转位位点(mini-attTn7)的AcNPV病毒。

其中，步骤[7]中所述的昆虫细胞是任何一种昆虫细胞，优选Sf21细胞

所述的一种基因重组核多角体病毒杀虫剂的及应用，其特征是：所述的基因重组AcNPV病毒可以被生产并用于生产中害虫防治。优选的，所述的基因重组AcNPV病毒可以用于生产中鳞翅目害虫防治。

利用本发明的方法创制的基因重组AcNPV病毒，可以干扰棉铃虫等鳞翅目害虫的正常生长，降低害虫生长速度，降低害虫半数存活时间，具有多角体蛋白基因，较野生型AcNPV病毒有更好的杀虫效果。

发明的方法创制的基因重组AcNPV病毒，可以干扰棉铃虫的正常生长，降低棉铃虫和其他害虫的生长速度，降低棉铃虫半数存活时间，具有多角体蛋白基因，较野生型AcNPV病毒有更好的杀虫效果。

我们利用AcNPV做基因重组病毒杀虫剂创制的亲本病毒，插入棉铃虫HHR3和HCB基因，恢复多角体蛋白基因，同时用绿色荧光蛋白标记基因重组病毒，由此方法创制的基因重组AcNPV病毒对棉铃虫等鳞翅目害虫有更好的杀虫效果。因为许多农业和林业害虫都属于鳞翅目昆虫，如菜青虫、棉铃虫、烟夜蛾、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、小地老虎、玉米螟、水稻螟、松毛虫等，因此，该基因重组病毒可以广泛应用于鳞翅目害虫控制。

该发明所使用的构建基因重组病毒的思路、HHR3基因和HCB基因及构建方法都是首次报道。

具体实施方式

下面结合实验，对利用本发明的方法得到的基因重组病毒杀虫剂的作用作进一步的说明。

方法(1)：针对绿色荧光蛋白基因、昆虫功能基因(如HHR3基因、HCB基因或其它基因如棉铃虫几丁质酶基因)和多角体蛋白基因3种插入基因，分别设计带酶切位点的引物，用PCR方法分别扩增绿色荧光蛋白基因、棉铃虫激素接受子3基因和棉铃虫核多角体病毒多角体蛋白基因；在大肠杆菌中扩增并提取pFASTBAC质粒；用限制性内切酶SmaI和KpnI分别切开绿色荧光蛋白基因的PCR产物和pFASTBAC质粒，将绿色荧光蛋白基因与质粒连接，形成带有绿色荧光蛋白基因的pFASTBAC质粒；在此基础上，再以相同的方法，用EcoRI和NotI切开棉铃虫激素接受子3基因和带有绿色荧光蛋白基因的pFASTBAC质粒，将两者连接起来；再以相同的方法，用NotI切开核多角体蛋白基因和带有绿色荧光蛋白基因和棉铃虫激素接受子3基因的pFASTBAC质粒，将二者连接起来，从而构建成功具有上述3种基因的供体pFASTBAC质粒。

方法(2)：将方法(1)中得到的含有3种基因插入的供体质粒转入大肠杆菌DH10BAC菌株，将上述3种基因转位到杆粒上，形成基因重组杆粒，用传统的质粒提取方法纯化基因重组杆粒，将杆粒转染Sf21细胞，形成基因重组AcNPV病毒粒子，将含有病毒的细胞培养液注射棉铃虫幼虫，产生基因重组AcNPV病毒。

基因重组AcNPV病毒的杀虫活性检测

用兰色食用色素标记基因重组AcNPV病毒多角体，饲喂棉铃虫3龄幼虫，病毒包含体浓度为5×10⁷PV/ml，每40头一组，设3个重复。每天记录幼虫的体重，观察记录幼虫的形态变化，检测虫体中绿色荧光蛋白的表达情况，用野生型AcNPV病毒做对照，对实验结果进行统计分析，计算幼虫的半数存活时间和死亡率。结果显示，基因重组AcNPV病毒较野生型病毒有更好的杀虫效果，表现为不正常蜕皮，体重下降，半数存活时间降低。

以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明并不局限于此。

实施例1：

针对绿色荧光蛋白基因、昆虫功能基因(如HHR3基因、HCB基因或其它基因)和多角体蛋白基因3种插入基因，根据基因序列分别设计和合成带酶切位点的引物，用PCR方法分别扩增绿色荧光蛋白基因、棉铃虫激素接受子3基因和棉铃虫核多角体病毒多角体蛋白基因；在大肠杆菌中扩增并提取pFASTBAC质粒；用限制性内切酶SmaI和KpnI分别切开绿色荧光蛋白基因PCR产物和pFASTBAC质粒，将绿色荧光蛋白基因与质粒连接，形成带有绿色荧光蛋白基因的pFASTBAC重组质粒；在此基础上，再以相同的方法，用EcoRI和NotI切开棉铃虫激素接受子3基因和带有绿色荧光蛋白基因的pFASTBAC质粒，将两者连接起来；再以相同的方法，用NotI切开核多角体蛋白基因和带有绿色荧光蛋白基因和棉铃虫激素接受子3基因pFASTBAC质粒，将二者连接起来，从而构建成功具有上述3种基因的重组pFASTBAC质粒。

将含有上述3种基因插入的重组pFASTBAC质粒转入大肠杆菌DH10BAC菌株，将3种基因转位到杆粒上，形成基因重组杆粒，用传统的质粒提取方法纯化基因重组杆粒，将杆粒转染Sf21细胞，形成基因重组AcNPV病毒粒子，将含有病毒的细胞培养液注射棉铃虫幼虫，产生基因重组AcNPV病毒。

用兰色食用色素标记基因重组AcNPV病毒多角体，饲喂棉铃虫3龄幼虫，病毒包含体浓度为5×10⁷PV/ml，每40头一组，设3个重复。每天记录幼虫的体重，观察记录幼虫的形态变化，检测虫体中绿色荧光蛋白的表达情况，用野生型AcNPV病毒做对照，对实验结果进行统计分析，计算幼虫的半数存活时间和死亡率。结果显示，基因重组AcNPV病毒较野生型病毒有更好的杀虫效果，表现为不正常蜕皮，体重下降，半数存活时间降低。用该基因重组AcNPV病毒开发杀虫剂。

表1用HCH基因构建的基因重组AcNPV病毒对棉铃虫半数存活时间的影响

使用的病毒浓度为每毫升生理盐中3×10⁷个病毒包含体。表中a和b表示野生型病毒和基因重组病毒的杀虫效果有显著差异，野生型AcMNPV病毒的半数存活时间是112小时，基因重组病毒AcMNPV-GFP-HCB-Polh的半数存活时间是96小时。

实施例2：

将实施例1中的棉铃虫激素接受子3基因换成其它功能基因如棉铃虫几丁质酶基因(http://www.ncbi.nlm.nih，接受号：AF515667)，针对不同的插入基因，分别设计带酶切位点的引物，用PCR方法分别扩增绿色荧光蛋白基因、其它基因和棉铃虫核多角体病毒多角体蛋白基因；在大肠杆菌中扩增并提取pFASTBAC质粒；用限制性内切酶SmaI和KpnI分别切开绿色荧光蛋白基因PCR产物和pFASTBAC质粒，将绿色荧光蛋白基因与质粒连接，形成带有绿色荧光蛋白基因的pFASTBAC重组质粒；在此基础上，再以相同的方法，用EcoRI和NotI切开其它功能基因和带有绿色荧光蛋白基因的pFASTBAC质粒，将两者连接起来；再以相同的方法，用NotI切开核多角体蛋白基因和带有绿色荧光蛋白基因和其它功能基因的pFASTBAC质粒，将二者连接起来，从而构建成功具有上述基因的重组pFASTBAC质粒。

将含有基因插入的重组pFASTBAC质粒转入大肠杆菌DH10BAC菌株，将基因转位到杆粒上，形成基因重组杆粒，用传统的质粒提取方法纯化基因重组杆粒，将杆粒转染Sf21细胞，形成基因重组AcNPV病毒粒子，将含有病毒的细胞培养液注射棉铃虫幼虫，产生基因重组AcNPV病毒。

用兰色食用色素标记基因重组AcNPV病毒多角体，饲喂棉铃虫3龄幼虫，病毒包含体浓度为5×10⁷PV/ml，每40头一组，设3个重复。每天记录幼虫的体重，观察记录幼虫的形态变化，检测虫体中绿色荧光蛋白的表达情况，用野生型AcNPV病毒做对照，对实验结果进行统计分析，计算幼虫的半数存活时间和死亡率。结果显示，基因重组AcNPV病毒较野生型病毒有更好的杀虫效果，表现为不正常蜕皮，体重下降，半数存活时间降低。用该基因重组AcNPV病毒开发杀虫剂。杀虫效果与表1接近。

实施例3：

将实施例1和2中的棉铃虫核多角体病毒多角体蛋白基因换成其它多角体病毒的核多角体蛋白基因，如AcPolh(Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih，接受号：K02700)或BmPolh，针对插入基因，分别设计带酶切位点的引物，用PCR方法分别扩增绿色荧光蛋白基因、其它功能基因和其它核多角体病毒多角体蛋白基因；在大肠杆菌中扩增并提取pFASTBAC质粒；用限制性内切酶SmaI和KpnI分别切开绿色荧光蛋白基因PCR产物和pFASTBAC质粒，将绿色荧光蛋白基因与质粒连接，形成带有绿色荧光蛋白基因的pFASTBAC重组质粒；在此基础上，再以相同的方法，用EcoRI和NotI切开其它基因和带有绿色荧光蛋白基因的pFASTBAC质粒，将两者连接起来；再以相同的方法，用NotI切开核多角体蛋白基因和带有绿色荧光蛋白基因和其它功能基因的pFASTBAC质粒，将二者连接起来，从而构建成功具有上述基因的重组pFASTBAC质粒。

将含有基因插入的重组pFASTBAC质粒转入大肠杆菌DH10BAC菌株，将基因转位到杆粒上，形成基因重组杆粒，用传统的质粒提取方法纯化基因重组杆粒，将杆粒转染Sf21细胞，形成基因重组AcNPV病毒粒子，将含有病毒的细胞培养液注射棉铃虫幼虫，产生基因重组AcNPV病毒。

用兰色食用色素标记基因重组AcNPV病毒多角体，饲喂棉铃虫3龄幼虫，病毒包含体浓度为5×10⁷PV/ml，每40头一组，设3个重复。每天记录幼虫的体重，观察记录幼虫的形态变化，检测虫体中绿色荧光蛋白的表达情况，用野生型AcNPV病毒做对照，对实验结果进行统计分析，计算幼虫的半数存活时间和死亡率。结果显示，基因重组AcNPV病毒较野生型病毒有更好的杀虫效果，表现为不正常蜕皮，体重下降，半数存活时间降低。用该基因重组AcNPV病毒开发杀虫剂。杀虫效果与表1接近。

实施例4：

在实施例1、2和3中，不插入绿色荧光蛋白基因，针对其它功能基因和其它核多角体蛋白基因，分别设计带酶切位点的引物，用PCR方法分别扩增其它功能基因和其它核多角体病毒多角体蛋白基因；在大肠杆菌中扩增并提取pFASTBAC质粒；用限制性内切酶EcoRI和NotI切开其它功能基因和pFASTBAC质粒，将两者连接起来；再以相同的方法，用NotI切开其它核多角体蛋白基因和带有其它功能基因的pFASTBAC质粒，将二者连接起来，从而构建成功具有2种插入基因的重组pFASTBAC质粒。

将含有2种基因插入的重组pFASTBAC质粒转入大肠杆菌DH10BAC菌株，将2种基因转位到杆粒上，形成基因重组杆粒，用传统的质粒提取方法纯化基因重组杆粒，将杆粒转染Sf21细胞，形成基因重组AcNPV病毒粒子，将含有病毒的细胞培养液注射棉铃虫幼虫，产生基因重组AcNPV病毒。

用兰色食用色素标记基因重组AcNPV病毒多角体，饲喂棉铃虫3龄幼虫，病毒包含体浓度为5×10⁷PV/ml，每40头一组，设3个重复。每天记录幼虫的体重，观察记录幼虫的形态变化，用野生型AcNPV病毒做对照，对实验结果进行统计分析，计算幼虫的半数存活时间和死亡率。结果显示，基因重组AcNPV病毒较野生型病毒有更好的杀虫效果，表现为不正常蜕皮，体重下降，半数存活时间降低。用该基因重组AcNPV病毒开发杀虫剂。杀虫效果与表1接近。

实施例5：

在实施例1、2、3和4的基础上，用兰色食用色素标记基因重组AcNPV病毒多角体，饲喂其它鳞翅目幼虫，如甜菜夜蛾、菜青虫、烟夜蛾、斜纹夜蛾、小地老虎、玉米螟、水稻螟、松毛虫等，病毒包含体浓度为5×10⁷PV/ml，每40头一组，设3个重复。每天记录幼虫的体重，观察记录幼虫的形态变化，用野生型AcNPV病毒做对照，对实验结果进行统计分析，计算幼虫的半数存活时间和死亡率。结果显示，基因重组AcNPV病毒较野生型病毒有更好的杀虫效果，表现为不正常蜕皮，体重下降，半数存活时间降低。用该基因重组AcNPV病毒开发杀虫剂。

表2用HCH基因构建的基因重组AcNPV病毒对甜菜夜蛾的半数存活时间的影响

使用的病毒浓度为每毫升生理盐中3×10⁷个病毒包含体。表中a和b表示野生型病毒和基因重组病毒的杀虫效果有显著差异，野生型AcMNPV病毒的半数存活时间是112小时，基因重组病毒AcMNPV-GFP-HCB-Polh的半数存活时间是96小时。

Claims (5)

1. 一种基因重组核多角体病毒杀虫剂，其特征是，绿色荧光蛋白基因、昆虫功能基因和多角体蛋白基因重组到缺失多角体蛋白基因的AcNPV上；所述绿色荧光蛋白基因为EGFP；所述昆虫功能基因为棉铃虫蜕皮调节转录因子激素接受子3、棉铃虫组织蛋白酶B基因或棉铃虫几丁质酶基因；所述多角体蛋白基因为棉铃虫核多角体病毒的核多角体蛋白基因或AcNPV核多角体蛋白基因。

2. 一种如权利要求1所述的基因重组核多角体病毒杀虫剂的制备方法，包括下述步骤：

[1]针对插入AcNPV中的绿色荧光蛋白基因、有杀虫活性的功能基因和核多角体病毒多角体蛋白基因，根据基因序列分别设计带酶切位点的引物，用PCR方法分别扩增绿色荧光蛋白基因、功能基因和核多角体病毒多角体蛋白基因；所述有杀虫活性的功能基因为棉铃虫激素接受子3基因；所述绿色荧光蛋白是EGFP；所述的多角体蛋白基因是棉铃虫核多角体病毒多角体蛋白基因；

[2]在大肠杆菌中扩增并提取供体质粒pFASTBAC；

[3]用限制性内切酶SmaI和KpnI分别切开绿色荧光蛋白基因PCR产物和pFASTBAC质粒，将绿色荧光蛋白基因与质粒连接，形成带有绿色荧光蛋白基因的pFASTBAC重组质粒；

[4]用EcoRI和NotI切开功能基因和带有绿色荧光蛋白基因的pFASTBAC质粒，将两者连接起来；

[5]用NotI切开核多角体蛋白基因和带有绿色荧光蛋白基因和功能基因的pFASTBAC质粒，将二者连接起来，从而构建成功具有上述3种基因的重组pFASTBAC质粒；

[6]将含有3种基因插入的重组pFASTBAC质粒转入大肠杆菌DH10BAC菌株，将3种基因转位到杆粒上，形成基因重组杆粒，用传统的质粒提取方法纯化基因重组杆粒；

[7]将杆粒转染昆虫细胞，形成基因重组AcNPV病毒粒子；所述昆虫细胞为Sf21或Sf9；

[8]用含有基因重组AcNPV病毒粒子的细胞培养液注射棉铃虫幼虫，产生基因重组AcNPV病毒。

3. 如权利要求2所述的一种基因重组核多角体病毒杀虫剂的制备方法，其特征是：步骤[7]中所述昆虫细胞是Sf21细胞。

4. 如权利要求1所述的一种基因重组核多角体病毒杀虫剂的应用，其特征是：所述的基因重组AcNPV病毒被生产并用于生产中害虫防治。

5. 如权利要求1所述的一种基因重组核多角体病毒杀虫剂的应用，其特征是，所述的基因重组AcNPV病毒用于生产中鳞翅目害虫防治。