KR20130109543A

KR20130109543A - 황다랑어 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20130109543A
Application number: KR1020120031338A
Authority: KR
Inventors: 박남규; 서정길; 이민정; 고혜진; 박태현
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2012-03-27
Filing date: 2012-03-27
Publication date: 2013-10-08
Also published as: KR101384577B1

Abstract

본 발명은 항미생물성 펩타이드에 관한 것으로서, 어류 병원성 미생물에 대하여 효율적인 항미생물 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 인간 및 어류의 적혈구에 대한 용혈활성은 거의 없기 때문에, 양식어류에 대한 사료첨가제로 사용되거나, 항생제 대체제로 사용되더라도 어류 및 인체의 건강에 대한 위협요소를 제공하지 않는다.

Description

황다랑어 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 이의 용도{Novel antimicrobial peptide from the Yellowfin tuna，Thunnus albacares，and uses thereof}

본 발명은 항미생물성 펩타이드에 관한 것으로서, 더 상세하게는 황다랑어 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

항미생물성 펩타이드는 생물체의 선천성 면역체계(innate immune system)의 최전방 생체 방어인자이다. 항미생물성 펩타이드는 특정 미생물이나 항원에 반응하는 후천면역과는 달리 미생물의 종류에 크게 상관없이 작용하며 반응시간도 바로 혹은 몇 시간 내로 매우 빠르다. 내성균의 문제를 항상 내포하고 있는 기존의 항생제와 구분되어 내성의 문제 또는 면역문제나 거부반응의 문제없이 광범위한 생물계에서 미생물로부터 숙주를 보호하기 위해 자연적으로 생성되었기에 이들 항미생물성 펩타이드들은 천연 항생제라고 불린다.

항생제는 인간 질병을 조절하기 위해 사용되거나 식량으로 제공되는 동물의 사료첨가제로 사용되고 있다. 항생제의 사용은 병원성 세균의 감염을 회피하는데 도움을 줄 수 있지만, 세심한 주의와 조절을 필요로 한다. 이는 항생제의 사용이 항생제 내성 세균을 유도할 수 있고 특정 균주의 독성을 증가시킬 수 있으며, 이를 통해 결국 병리학적 환경을 급격하게 바꿀 수 있기 때문이다(Ervik et al., Disease of Aquatic Organisms, 18: 45-51, 1994). 덧붙여, 시중에 유통되는 육류 에 잔류하는 항생제의 존재는 소비자의 건강에 악영향을 미칠 수 있다(Chinabut and Puttinaowarat, Dev. Biol. (Basel), 373(121): 255~261, 2005).

근래에는 어류 또는 어류의 가공시 버려지는 폐기물이나 부산물로부터 항미생물성 펩타이드를 분리하는 기술이 보고되고 있다. 어류의 경우, 감염을 방어하기 위한 주요 보호 장벽인 피부, 점액, 및 내장 점액 등으로부터 항미생물 펩타이드가 분리되었으며, 팔닥신(pardaxin) (Oren and Shai, Eur. J. Biochem., 237, 304~310, 1996), 플로시딘(pleurocidin)(Cole et al., J. Biol. Chem., 272, 12008~12013, 1997), 피사이딘(Piscidin)(Silphaduang and Noga, Nature, 414, 268~269, 2001), 미스구린(misgurin)(Park et al., FEBS Lett., 411, 173~178, 1997), 농어 헵사이딘(bass hepcidin)(Bao et al., Dev. Comp. Immunol., 29, 939~950, 2005), 및 믹시니딘(myxinidin)(Subramanian et al., Mar. Biotechnol., 11, 748~757, 2009) 등이 알려져 있다. 또한, 생물학적 자원의 한계와 환경 문제에 대한 관심으로 해양산물의 가공 과정에서 버려지는 폐기물로부터 항미생물 펩타이드와 같은 항균활성 물질 개발에 대한 연구가 증가하고 있다(Klomklao et al., Food Chem., 115, 155~162, 2009). 그러나, 어류 머리, 내장 및 껍질과 같은 어류 가공시 버려지는 폐기물 및 부산물로부터 분리된 생리활성 물질에 대하여 알려진 바가 매우 적다(Ferraro et al., Food Res. Int., 43, 2221~2233, 2010).

아직 황다랑어 껍질로부터 분리된 항미생물성 펩타이드에 대하여 보고된 바는 없는 실정이다. 또한 추출물로부터 단일 성분을 분리하는 과정은 분리시 소요되는 시간이 길며, 획들율이 낮으며, 천연물이 가지는 잠재적 독성 등의 요인들로 균일한 효과 및 규격화를 기대하기 어렵다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 황다랑어 껍질로부터 분리된 항미생물성 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항생제 또는 사료첨가제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 항미생물 활성을 나타내고, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 변이체가 제공된다.

상기 펩타이드 또는 이의 변이체는 황다랑어(Thunnus albacares)로부터 유래될 수 있으며, 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항미생물 활성을 나타낼 수 있다.

상기 그람 양성균은 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 마이크로코코스 루테우스(Micrococcus luteus), 스트렙토코코스 이니에(Streptococcus iniae), 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)일 수 있으며, 상기 그람 음성균은 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 및 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)일 수 있다.

상기 펩타이드 또는 이의 변이체는 사람과 어류의 적혈구 세포를 파괴하지 않을 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 또는 이의 변이체를 암호화하는 유전자가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자를 포함하는 발현벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 숙주세포에 형질 전환시킨 형질 전환체가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제가 제공된다.

상기 항생제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 또는 이의 변이체는 황다랑어(Thunnus albacares)로부터 유래될 수 있으며, 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항미생물 활성을 나타낼 수 있다.

상기 항생제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 추가로 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드와 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있으나, 상기 유효성분의 함량을 초과하지 않는 것이 바람직하다.

상기 항생제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 유효 투여량은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여될 수 있다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.

상기 항생제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여 시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 또는 이의 변이체를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제가 제공된다.

상기 사료첨가제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 또는 이의 변이체는 황다랑어(Thunnus albacares)로부터 유래될 수 있으며, 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항미생물 활성을 나타낼 수 있다.

상기 사료첨가제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 추가로 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드와 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있으나, 상기 유효성분의 함량을 초과하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 어류가 양식되고 있는 수조의 물에 직접 살포하는 것도 가능하다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 황다랑어 껍질 산추출물로부터 정제된 펩타이드는 항미생물 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 적혈구 세포에 대하여 용혈반응을 거의 나타내지 않기 때문에, 양식어류에 대한 사료첨가제로 사용되거나, 사람에게 적용할 수 있는 항생제 대체제로 사용되더라도 어류 및 인체의 건강에 대한 위협요소를 제공하지 않는다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 황다랑어 껍질 추출물로부터 활성 성분을 정제하기 위한 CAU-PAGE 후의 항균활성 결과를 나타내는 그래프(A), 및 상기 CAU-PAGE 분획물의 순도를 확인하는 AU-PAGE(Acid-urea-PAGE) 결과 사진(B)이다.
도 2는 상기 도 1의 CAU-PAGE 24~26 분획물의 RP-HPLC(reversed-phase HPLC) 결과(A)와 도 2A의 가장 큰 활성 피크값을 나타내는 분획물을 한 번 더 RP-HPLC 분석한 결과(B)이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 황다랑어 껍질 산추출물에 단백질 가수분해 효소 처리 유무에 따른 항미생물 활성을 URDA 방법으로 확인한 사진이다.
도 4는 CAU-PAGE 및 RP-HPLC 방법을 통하여 정제된 펩타이드의 분자량을 확인한 ESI-MS(electrospray ionization mass spectroscopy) 결과(A), 및 서열을 확인한 Edman 분해 결과(B)이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 정제된 펩타이드의 N 말단 서열과 상동성을 나타내는 서열을 비교한 그림이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 또는 자유 카르복실 말단(COOH)을 갖는 상기 펩타이드의 동일성을 RP-HPLC로 확인한 그래프이다:
N (Native): YFGAP 펩타이드;
S (Synthetic): YFGAP-OH 펩타이드; 및
N+S: YFGAP 펩타이드 + YFGAP-OH 펩타이드.
도 7은 본 발명의 일 실시예를 통하여 정제된 펩타이드와 토끼 근육 GAPDH N-말단 서열과 정렬한 결과(A), SWISS-MODEL 서버를 이용하여 확인된 YFGAP의 구조(B), 및 YFGAP의 2차 구조를 구성하는 아미노산 서열을 나타내는 그림(C)이다.

본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.

본 문서에서 사용되는 용어 "GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)"는 일반적인 당분해 효소로서, 동일한 37kDa 서브유닛으로 구성된 4량체 아이소폼(isoform)의 형태로 존재한다고 알려져 있다(Tristan et al., Cellular Signal, 23, 317~323, 2011). 다양한 연구에서 GAPDH가 다양한 기능을 수행한다는 것이 알려져 있으며, 예를 들어 GAPDH의 다양한 특성은 중합체 반응(oligomerization)에 의해서 조절되고 당분해 작용이 비활성화되는 단량체 형태로 분해되면서 다양한 기능을 수행할 수 있다는 연구결과가 발표된 바 있다(Tristan et al., Cellular Signal, 23, 317~323, 2011). 비록 GAPDH의 다양한 기능이 알려져 있으나, 본 발명을 통해서 GAPDH로부터 항미생물성 펩타이드(antimicrobial peptide, AMP)가 최초로 규명된 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "변이체"는 하나 또는 둘 이상의 염기가 돌연변이 예를 들면 치환, 결실, 부가, 삽입 등에 의해 변화되었으나, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 생물학적 성질을 유지하는 펩타이드를 의미하며, 변이체는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열의 C 말단이 아미드화(amidation) 또는 자유 카르복실 말단(COOH)을 갖는 형태일 수 있다.

이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하면 다음과 같다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 도면에 도시된 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 도면에 도시된 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 또한 설명의 편의를 위하여 도면에서는 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다.

도 1은 황다랑어 껍질 추출물로부터 활성 성분을 정제하기 위한 CAU-PAGE 결과를 나타내는 그래프(A), 및 상기 CAU-PAGE 분획물의 순도를 확인하는 AU-PAGE(Acid-urea-PAGE) 결과 사진(B)이다. CAU-PAGE 분석을 통해서 본 발명의 일 실시예에 따른 황다랑어 껍질 산성 추출물로부터 활성물질을 분리하였으며, 가장 큰 활성을 나타내는 분획 24~26번(SMZ 구간)을 수득하였다. 그리고 상기 분획물의 순도를 AU-PAGE(Acid-urea PAGE) 방법을 이용하여 확인하였으며, 상기 분획물을 로딩한 겔을 쿠마씨 염색한 결과, 상기 분획물은 아프로티닌(aprotinin) 및 피사이딘(piscidin 1)에 비하여 넓고 느린 밴드가 관찰되었다. 도 1B의 1번 레인은 분자량 마커로 3 ㎍의 인간 히스톤 H1(~21 kDa), 1.0 ㎍ 아프로티닌(aprotinin)(~6.5 kDa) 및 0.5 ㎍ 피사이딘 1(piscidin 1)(~2.5 kDa)이 로딩되었으며, 2번 레인은 황다랑어 껍질 산추출물 20㎕이, 레인 3~10에는 상기 도 1에서 확인된 분획물 23~30이 각각 20 ㎕씩 로딩되었다.

도 2는 상기 도 1의 CAU-PAGE 24~26 분획물의 RP-HPLC(reversed-phase HPLC) 결과(A)와 도 2A의 가장 큰 피크값을 나타내는 분획물을 한 번 더 RP-HPLC 분석한 결과(B)이다. 본 발명자는 황다랑어 껍질 산추출물로부터 활성 성분을 분리하기 위하여, CAU-PAGE에서 가장 큰 활성을 나타낸 분획물을 CapCell-Pak C₁₈컬럼에 적용하여 단일 물질을 정제하였다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 황다랑어 껍질 산추출물에 단백질 가수분해 효소 처리 유무에 따른 항미생물 활성을 URDA 방법으로 확인한 사진이다. 본 발명자는 황다랑어 껍질 산추출물의 항미생물 활성을 확인하면서, 동시에 상기 활성 성분이 단백질 가수분해 효소에 영향을 받는지 트립신 처리 유무에 따른 항미생물 활성을 관찰하였다. 그 결과, 본 발명의 일 실시예에 따른 황다랑어 껍질 산추출물은 그람 양성균인 B. subtilis와 그람 음성균인 E. coli D31에 대하여 모두 항미생물 활성을 나타냈으며, 이러한 활성이 트립신 처리에 의해서 현저하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 황다랑어 껍질 산추출물에 항미생물 활성 물질이 포함되어 있으며, 상기 물질이 단백질 성분임을 입증하는 것이다.

도 4는 CAU-PAGE 및 RP-HPLC 방법을 통하여 정제된 펩타이드의 분자량을 확인한 ESI-MS(electrospray ionization mass spectroscopy) 결과(A), 및 서열을 확인한 Edman 분해 결과(B)이다. 본 발명의 일 실시예를 통하여 황다랑어 껍질 산추출물로부터 정제된 펩타이드의 분자량 및 서열을 분석하였으며, 양이온 모드에서 ESI-MS를 이용하여 분자량을 측정한 결과 약 3422.74 Da을 나타냈다. 이러한 수치는 Edman 분해를 통해서 확인된 아미노산 서열의 분자량인 3422.04 Da와 거의 유사하였다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 정제된 펩타이드의 N 말단 서열과 상동성을 나타내는 서열을 비교한 그림이다. 본 발명의 일 실시예를 통하여 정제된 펩타이드와 상동성을 나타내는 서열은 BLASTP 2.2.10과 TBLASTN을 이용하여 검색하였으며, 상기 검색된 서열을 ClustalX 프로그램을 이용하여 정렬하였다. 그 결과, 다른 어류 종의 GAPDH N-말단과 81 내지 91%의 상동성을 나타내고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과에 근거하여, 본 발명자는 상기 정제된 펩타이드를 황다랑어 GAPDH-유래 항미생물성 펩타이드(Yellowfin GAPDH-derived antimicrobial peptide, YFGAP)라 명명하였다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 또는 자유 카르복실 말단(COOH)을 갖는 상기 펩타이드의 HPLC 특성을 비교한 그래프이다. 본 발명자는 YFGAP의 일차구조 및 C-말단의 변형을 확인하기 위하여, 자유 카르복실 말단을 갖는 YFGAP(YFGAP-OH)와 실시예 2의 YFGAP 펩타이드의 RP-HPLC의 보유시간(retention time)을 비교하였다. N과 S로 표시된 YFGAP-OH와 YFGAP는 동일한 보유시간을 나타냈으며, 상기 펩타이드를 동량으로 혼합하였을 때에도(N+S) 단일 피크가 관찰되었다(도 6). 이러한 결과는 YFGAP의 C-말단이 자유 카르복실기(carboxyl group)을 보유하고 있으며, 상기 Edman 분해 및 ESI-MS를 통해서 분석한 아미노산 서열이 정확하다는 것을 의미한다.

도 7은 본 발명의 일 실시예를 통하여 정제된 펩타이드와 토기 근육 GAPDH N-말단 서열을 정렬한 결과(A), SWISS-MODEL 서버를 이용하여 확인된 YFGAP의 구조를 나타내는 그림(B), 및 YFGAP의 2차 구조를 구성하는 아미노산 서열을 나타내는 그림(C)이다. 정제된 펩타이드의 구조를 파악하기 위하여, 본 발명자는 YFGAP를 자동화된 단백질 구조 상동성-모델링 서버인 SWISS-MODEL에 적용시켰다. YFGAP와 약 88%의 근접한 상동성을 갖는 토끼 근육 GAPDH(PDB accession no. 1jOxR)(서열번호 2: VKVGVNGFGRIGRLVTRAAFNSGKVDVVAIND)의 X-레이로 확인된 구조를 템플릿(template)으로 비교한 결과, YFGAP C-말단의 4개의 잔기가 토끼 근육 GAPDH와 상이하였다(도 7A). 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 YFGAP의 구조를 PyMOL을 이용하여 확인한 결과, 2개의 루프(loop) 구역으로 분리된 알파-헬릭스(α-helix)와 2개의 평행 베타-가닥(β-strands)과 같은 3개의 구조로 구성되어 있었다(도 7B).

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 황다랑어 껍질 조직 추출물의 제조

냉동상태의 황다랑어(Thunnus albacares)는 동원 F&B Co., Ltd(Changwon, Korea)로부터 제공받았으며, 제공받은 황다랑어의 껍질을 모았다. 상기 껍질은 드라이 아이스를 이용하여 냉동시켜 실험실로 옮겼으며, 실험실에서 상기 황다랑어 껍질의 4배되는 부피의 미리 데워놓은 1% 아세트산(HAc)(v/v)을 첨가한 후, 단백질 가수분해 활성을 제거하기 위하여 100℃에서 5분 동안 가열하였다. 상기 가열된 조직을 아이스 위에서 5분 동안 균질화하였으며, 이때 Polytron PT1200 C 균질기를 사용하였다(Speed #3, Polytron PT1200 C homogenizer; Kinematica AG, Lucerne, Switzerland). 상기 균질화물을 4℃, 15,000 X g의 속도로 5분간 원심분리한 후, 상층액을 실험에 사용하기 전까지 -70℃에 보관하였다.

실시예 2. 항미생물 활성 펩타이드의 정제

상기 실시예 1의 황다랑어 껍질의 산성 추출물로부터 활성 물질을 분리하기 위하여, 지속 AU-PAGE 방법과 역상 HPLC 방법을 이용하였다.

2-1: CAU-PAGE(Continuous Acid Ureapolyacrylamide gel electrophoresis)

황다랑어 껍질 산성 추출물은 우선 Bio-Rad Prep Cell 491(Bio-Rad, Laboratories, Richmond, CA)을 이용한 CAU-PAGE 방법에 의해서 정제되었다(Seo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 338, 1998~2004, 2005).

구체적으로, 6.8 ㎝ 높이의 분리겔(separating gel)은 12% 아크릴아마이드(acrylamide), 37.5/1(w/w) 아크릴아마이드/비스(acrylamide/bis) 용액, 5% HAc, 4.8M 요소(urea)을 이용하여 제조하였으며, 12~16시간 동안 Prep Cell apparatus의 28 mm 직경 튜브에서 중합반응을 수행하였다. 촉매제인 TEMED와 APS는 각각 0.48%(v/v)와 0.22%(w/v)의 농도로 이용하였다. 상기 겔은 역극성(하부 챔버-양극)으로 40 mA에서 90분 동안 5% HAc 용액으로 미리 전개하였다. 상부와 하부 챔버는 모두 5% HAc 용액으로 채웠으며, 상술한 바와 같이 미리 전개된 후 상부 챔버에 5% HAc를 더 채워 넣었다. 10 ㎖의 황다랑어 껍질 산성 추출물은 5 ㎖의 샘플 용액[3.0M 요소(urea), 5% HAc]과 혼합한 후 로딩을 하고, 4℃, 30 mA 조건에서 5% HAc 용액을 이용하여 전기영동 하였다. 그 후, 상기 샘플을 0.8 ㎖/분의 유속으로 용출하였으며, 분획물 당 12 ㎖씩 수득되었으며, 6시간 동안 전체 135 ㎖이 수득되었다.

CAU-PAGE 방법을 이용하여 분석한 결과, 활성을 나타내는 분획물을 빠른 구간(분획 10~12), 중간 구간(분획 15), 및 느린 구간(분획 22~30)으로 구분하였다(도 1). 항미생물 활성 물질을 정제하기 위하여, 느린 구간(slow migrating zones, SMZ)내에서 가장 활성이 크게 나타난 분획물(분획 24~26)을 선택하였다.

이어, 본 발명자는 CAU-PAGE를 통해서 수득된 상기 SMZ 구간의 분획물들의 순도를 확인하기 위하여 AU-PAGE(Acid-urea polyacrylamide gel electrophoresis) 분석을 수행하였다(Seo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 338, 1998~2004, 2005). 12% 아크릴아마이드(acrylamide) 겔을 100 mm 가로 x 75 mm 세로 x 1.0 mm 두께로 제조하였으며, 구체적으로 37.5/1(w/w) 아크릴아마이드/비스(acrylamide/bis) 용액, 4.8M 요소(urea), 5% HAc, 0.48%(v/v) TEMED(N,N,N,N-tetra methyl ethylene diamine), 및 0.22%(w/v) APS(ammonium persulfate)을 이용하여 제조하였다. 상기 겔은 상온에서 12~16시간 동안 중합되었으며, Mini PROTEAN II Electrophoresis Cell(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA)을 이용하여 역극성(하부 챔버-양극)으로 150V에서 60분 동안 5% HAc 용액으로 미리 전개하여 APS와 TEMED를 제거하였다. 스테킹 젤(stacking gel)은 만들지 않았다. 상기 SMZ 구간의 분획물은 샘플 용액[메틸 그린과 3.0M 요소를 포함하는 5% HAc 용액]에 1:1의 비율로 혼합한 후, 상온에서 50분 동안 150V에서 5% HAc 용액을 이용하여 전기영동 하였다. 전기영동 후, 상기 젤은 쿠마씨 블루 용액(Coomassie brilliant blue R-250)을 이용하여 염색하고, MeOH:HAc:H2O(4:1:5) 용액으로 적절히 염색을 제거하였다. 그 결과, 상기 SMZ는 아프로티닌(aprotinin) 및 피사이딘(piscidin 1)에 비하여 넓고 느린 밴드가 관찰되었다(도 1B).

2-2: 역상 HPLC(Reversed-phase HPLC)

CAU-PAGE를 통해서 항미생물 활성을 나타낸 SMZ 구간의 분획물(분획 24~26)을 CapCell-Pak C₁₈ 역상 컬럼(5 μm, 300Å, 4.6 X 250mm, Shiseido,Japan)에 로딩하였다. 그 후, 상기 샘플에 0.1% TFA를 포함하는 아세토나이트릴(CH₃CN, ACN)용액을 1 ㎖/분의 유속으로 60분 동안 5~65%까지 선형 농도구배를 처리하였으며 수득된 용출액의 흡광도는 220 nm 파장에서 관찰하였다. 38% 아세토나이트릴의 농도에서 용출된 피크에서 가장 강한 활성을 나타내었다(도 2A).

이어, 본 발명자는 가장 큰 활성을 나타내는 분획물을 한 번 더 RP-HPLC로 분류하였다. 1 ㎖/분의 속도로 0.1% TFA(Trifluoroacetic acid)를 포함하는 아세토나이트릴 용액(CH₃CN, ACN)을 60분 동안 20~40%까지 1 ㎖/분의 유속으로 선형 농도구배를 처리하여 분석한 후 220 nm에서 흡광도를 관찰하였다. 그 결과, 약 34분대, 약 32% ACN 농도에서 단일 물질이 정제되었다(도 2B).

실시예 3: 펩타이드의 합성

본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드(서열번호 1)를 Milligen 9050 Pepsynthesizer에서 9-Fmoc(flurorenylmethoxycarbonyl)-폴리펩타이드 활성 에스터 화학을 이용하는 고상 합성 방법(solid-phase synthesis)에 의하여 아미드화(NH₂) 또는 자유 카르복실 말단(COOH)을 갖는 2가지 형태의 펩타이드를 Fmoc-NH-SAL 수지 또는 Fmoc-수지를 이용하여 합성하였다. 상기 합성 펩타이드를 CapCell-Pak C₁₈ 역상 HPLC 컬럽(5 μm, 300 Å, 10 x 250 mm)을 통해서 정제하였다.

실험예 1. 황다랑어 껍질 추출물의 항미생물 활성

상기 실시예 1 추출물의 B. subtilis KCTC1021와 Escherichia coli D31에 대한 항미생물 활성을 URDA(ultrasensitive radial diffusion assay) 방법으로 측정하였다(Seo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 338, 1998~2004, 2005). 또한, 동시에 상기 실시예 1 추출물에 포함된 활성물질이 가수분해 작용에 영향을 받는지의 여부를 상기 실시예 1 추출물에 단백질 분해 효소를 처리하여 확인하였다. 상기 E. coli D31은 E.J. Noga 교수(NCSU, Raleigh, NC, USA)로부터 제공받았다. 단백질 분해 효소로 250 ㎍/㎖ 크리스탈 트립신(Fisher Scientific, Fairlawn, NJ, USA)을 이용하였으며, 실시예 1의 추출물에 첨가하여 37℃에서 60분 동안 처리하였다.

세균과 C. albicans은 25℃ 또는 37℃에서 18시간 동안 TSB(Trypticase soy broth) 또는 SDB(Sabouraud's dextrose broth)에서 배양한 후, 상기 배양액을 McFarland 표준혼탁도 0.5 (Vitek Colorimeter #52-1210; Hach, Loveland, CO, USA)가 되도록 각각 희석하였다. 상기 희석액은 약 ~10⁸ CFU/㎖ (세균) 또는 ~10⁶ CFU/㎖ (C. albicans)에 해당하는 양이다.상기 희석액은 각각 0.5 ㎖을 9.5 ㎖의 깔개 겔(underlay gel)[10 mM 인산 완충액(pH 6.57), 0.03% TSB(tryptic soy broth) 또는 0.03% SDB(Sabouraud's dextrose broth), 및 1% I형 한천(low EEO)]에 혼합하여 5 X 10⁶ CFU/㎖ 또는 5 × 10⁴ CFU/㎖로 조정한 후 직경 10 cm, 높이 1.5 cm 평판 접시에 도포하였으며, 그 결과 1 mm 높이의 겔이 형성되었다. 그 후, 상기 평판 접시 내에 형성된 겔에 직경 2.5 mm 크기로 구멍을 뚫어 웰(well)을 만들었다. 상술한 바와 같이 트립신을 처리한 실시예 1의 추출물과 처리하지 않은 추출물을 각각 5 ㎕ HAc(0.01% HAc)에 2배 순차희석한 후, 각각의 희석액을 1 mm 두께의 깔개 겔 내에 형성된 직경 2.5 mm의 웰에 첨가한 후, 25℃ 또는 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양된 현탁액 위에 10 mM 인산완충용액(pH 6.57)에 6% TSB 또는 6% SDB, 및 1% 한천을 포함하는 강도 두 배의 덮개 젤 10 ㎖을 덮은 후, 25℃ 또는 37℃에서 16 내지 18시간 동안 배양하였다. 다음 날 웰 주위에 형성된 투명 지역(clear zone)의 직경을 측정함으로서 활성을 확인 하였다. 웰의 투명 지역(clear zone)의 직경에서 웰의 직경을 제한 값을 유니트(U)로 표현하였는데 0.1 mm을 1U로 환산하였고 합성 펩타이드의 최소 효과 농도(Minimal effective concentration, MEC)(㎍/㎖)는 펩타이드 농도의 로그값에 대한 유니트의 곡선의 X-intercept로 계산하였다(Zhao et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45: 2695-2702, 2001).

그 결과, 그람-양성(B. subtilis)과 그람-음성(E. coli D31) 박테리아에 대해서 모두 항미생물 활성이 관찰되었으며, 트립신을 처리한 추출물의 경우 B. subtilis와 E. coli D31에 대해서 모든 항미생물 활성이 사라졌으며, 이러한 결과는 상기 추출물이 단백질 항생물질을 포함하고 있다는 것을 의미한다(도 3).

실험예 2: 정제된 펩타이드의 분자량 및 서열 분석

ESI-MS(Electrospray ionization mass spectrometry) 데이터는 상기 실시예 2의 정제된 펩타이드의 Q-TOF Micro(quadrupole time-of-flight) 질량분석계(Waters, Milford, MA, USA)를 이용하여 얻을 수 있었다. 분석에 앞서, 실시예 2의 정제된 펩타이드 소량을 용액[1% 포름산(formic acid), 50% ACN, 물]에 50 pmol/㎕의 농도로 희석한 후, 피코팁 이미터(PicoTip Emitter)(#BG10-78-4-CE20, New Objectives, Woburn, MA, USA)를 이용하여 질량 분석기에 투입하였다. 상기 질량 스펙트라 데이터는 양성 모드에서 수득하였으며, MaxEnt 알고리즘을 이용하여 평균 분자량으로 환산하였다. 그 결과, 실시예 2의 정제된 펩타이드가 평균적인 동위원소질량인 3422.74 Da을 나타냄을 확인하였다(도 4A).

이어, 상기 실시예 2의 정제된 펩타이드의 N 말단 아미노산 서열을 펄스 리퀴드 자동 서열분석기(pulse liquid automatic sequencer)(model 473A; Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA)에서 자동화된 Edman 분해 방법을 이용하여 분석하였다. Edman 분해를 통하여, 상기 정제된 펩타이드가 2개의 산성 잔기(아스파라긴산(Aspartic acid, Asp) 및 글루탐산(Glutamic acid, Glu)), 7개의 염기성 잔기[3개의 라이신(Lysine, Lys), 3개의 아르기닌(Arginine, Arg) 및 1개의 히스티딘(Histidine, His)]를 포함하는 32개의 아미노산 잔기로 구성되어 있음을 확인하였다(도 4B). 상기 확인된 아미노산 서열의 질량을 계산한 수치(3422.04 Da)는 ESI-MS 분석 결과 나온 평균 동위원소질량(3422.74 Da)와 거의 일치하였다. 또한, 상기 정제된 펩타이드의 등전점(isoelectric point, pI)을 계산한 수치는 11.0이었다. 이러한 결과는 상기 정제된 펩타이드가 변형된 펩타이드를 포함하고 있지 않다는 것과 강한 염기성을 띄고 있다는 것을 의미한다.

실험예 3: 정제된 펩타이드의 상동성 분석

상기 실시예 2의 정제된 펩타이드의 상동성 분석은 Genome Net(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 사이트의 BLASTP 2.2.10과 TBLASTN 2.2.10을 이용하여 수행되었다. 등전점과 분자량은 ExPASy(http://web.expasy.org/peptide_mass/) 사이트를 통해서 이론적으로 계산하였다. 서열 정렬은 ClustalX 프로그램을 이용하여 수행하였다(Thompson et al., Nucl. Acids Res. 25, 4876~4882, 1997).

그 결과, 본 발명의 상기 실시예 2의 펩타이드는 다른 어류 종의 GAPDH N-말단과 81 내지 91%의 상동성을 나타내고 있었으며, 이러한 어류 종에는 흑연어(Rachycentron canadum)(91%, gb|ACZ34179.1), 주황색 점박이 그루퍼(Epinephelus bruneus) (88%, gb|AEG78378.1), 채널메기(Ictalurus punctatus)(88%, gb|AAO25765.1), 뱀장어(Anguilla japonica)(84%, dbj|BAC06416.1), 점넙치(Paralichthys olivaceus)(84%, dbj|BAA88638.1), 유럽농어(Dicentrarchus labrax) (84%, gb|AAW56452.1), 유럽넙치(Platichthys flesus)(84%, emb|CAI77670.1), 제브라피시(Danio rerio)(84%, gb|AAI15132.1), 대서양 연어(Salmo salar) (84%, gb|ACI66269.1), 무지개 송어(Oncorhynchus mykiss)(82%, gb|AAK49985.1), 브라운 송어(Salmo trutta)(82%, gb|ABN54436.1), 및 대서양대구(Gadus morhua)(81%, gb|AAL05892.1)등이 있었다(도 5). 이러한 결과에 근거하여, 본 발명자는 본 발명의 일 실시예를 통해서 정제된 펩타이드를 황다랑어 GAPDH-유래 항미생물성 펩타이드(Yellowfin GAPDH-derived amtimicrobial peptide, YFGAP)라 명명하였다(도 5).

실험예 4: 정제된 펩타이드의 구조 분석

YFGAP의 일차구조 및 C-말단의 변형을 확인하기 위하여, 본 발명자는 상기 실시예 3에서 합성한 자유 카르복실 말단을 갖는 YFGAP(YFGAP-OH)와 실시예 2의 YFGAP 펩타이드의 RP-HPLC의 보유시간(retention time)을 비교하였다.

그 결과, 도 6의 그래프에 N과 S로 표시된 YFGAP와 YFGAP-OH는 동일한 보유시간을 나타냈으며, 상기 펩타이드를 동량으로 혼합하였을 때에도(N+S) 단일 피크가 관찰되었다(도 6). 이러한 결과는 YFGAP의 C-말단이 자유 카르복실기(carboxyl group)를 보유하고 있으며, 상기 실험예 2에서 분석한 아미노산 서열이 정확하다는 것을 의미한다.

이어, 상기 정제된 펩타이드의 구조를 파악하기 위하여, 본 발명자는 YFGAP를 자동화된 단백질 구조 상동성-모델링 서버인 SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)에 적용시켰다. YFGAP와 약 88%로 근접한 상동성을 갖는 토끼 근육 GAPDH(PDB accession no. 1jOxR)(서열번호 2: VKVGVNGFGRIGRLVTRAAFNSGKVDVVAIND)의 X-레이로 확인된 구조를 템플릿(template)으로 이용하였다. 본 발명의 일 실시예에 따른 YFGAP와 서열 정렬(alignment)을 통해서 서열을 비교한 결과, YFGAP C-말단의 4개의 잔기가 토끼 근육 GAPDH와 상이하였다(도 7A).

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 YFGAP의 구조를 PyMOL을 이용하여 확인하였다(www.pymol.org). 상기 획득된 YFGAP의 모델링 구조는 2개의 루프(loop) 구역으로 분리된 알파-헬릭스(α-helix)와 2개의 평행 베타-가닥(β-strands)과 같은 3개의 구조로 구성되어 있었다(도 7B). 구체적으로 알파-헬릭스 부분은 ¹⁰RIGRLVTRAAFH²¹ 서열로 구성되었으며, 2개의 평행 베타-선은 각각 ²KVGIN⁶ 과 ²⁹AIN³¹ 서열로, 2개의 루프 영역은 각각 ⁷GFG⁹ 와 ²²GKKVEVV²⁸ 서열로 구성되어 있었다(도 7C 및 표 1).

	서열
YFGAP	VKVGINGFGRIGRLVTRAAFHGKKVEVVAIND (서열번호 1)
알파-헬릭스 (α-helical region)	¹⁰RIGRLVTRAAFH²¹ (서열번호 3)
베타-가닥 1 (β-strand 1)	²KVGIN⁶ (서열번호 4)
베타-가닥 2 (β-strand 2)	²⁹AIN³¹
루프 영역 1 (loops region 1)	⁷GFG⁹
루프 영역 2 (loops region 2)	²²GKKVEVV²⁸ (서열번호 5)

실험예 5: 정제된 펩타이드의 항미생물 활성

본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 항미생물 활성을 URDA(ultrasensitive radial diffusion assay) 방법으로 측정하여 비교하였다(Seo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 338, 1998~2004, 2005). 구체적으로, 그람-양성균(Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Streptococcus iniae, 및 Staphylococcus aureus)과 그람-음성균(Aeromonas hydrophila, E. coli, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Shigella flexneri, 및 Vibrio parahaemolyticus) 및 효모(Candida albicans)에 대하여 항미생물 활성을 측정하였으며, 실험 방법은 상기 실험예 1에 기재된 바와 동일하다. 이때, 실시예 3에서 합성된 아미드화 또는 자유 카르복실 말단(COOH)을 갖는 펩타이드를 이용하였다. A. hydrophila, S. iniae 및 V. parahemolyticus의 경우 25℃에서 배양하였으며, 그 외의 균 및 효모는 37℃에서 배양하였다. 또한, 양성 대조군으로는 교잡종 줄무늬 베스(hybrid striped bass, Morone saxatilis x M. chrysops)로부터 분리된 α-나선형의 항미생물성 펩타이드인 피사이딘(Piscidin) 1을 사용하였다(Silphaduang and Noga, Nature, 414(6861): 268-269, 2001).

그 결과, YFGAP-OH와 YFGAP-NH2의 항미생물 활성은 piscidin 1에 비하여 유사하거나 약간 더 강한 것을 확인할 수 있었다(표 2). YFGAP-OH와 YFGAP-NH2는 모두 그람 양성균과 그람 음성균에 대하여 모두 강한 활성을 나타냈으며, 구체적으로 E. coli D31, P. aeruginosa, S. enterica, 및 S. flexneri을 포함하는 그람 음성균에 대해서 최소효과농도(Minimal Effective Concentration, MEC)가 0.9~12.0 ㎍/㎖으로 나타났으며, B. subtilis 및 M. luteus을 포함하는 그람 양성균에서는 MEC가 0.7~13.0 ㎍/㎖으로 나타났다. 그러나 S. aureus와 C. albicans에 대해서는 항미생물 활성이 크게 나타나지 않았다. 흥미로운 점은 YFGAP-OH와 YFGAP-NH2 펩타이드는 A. hydrophila, S. iniae 및 V. parahemolyticus와 같은 어류 병원균에 대하여 강한 항미생물 활성을 나타냈다(MECs: 0.9~17.0 ㎍/㎖). 본 발명의 일 실시예에 따른 YFGAP의 3 종류의 어류 병원성 균에 대한 항미생물 활성은 황다랑어 피부의 선천성 면역 작용에 YFGAP가 중요한 역할을 한다는 것을 입증하는 것이다. 상대적으로 YFGAP-NH2는 YFGAP-OH에 비하여 좀 더 강한 활성을 나타냈으며, 이러한 결과는 C-말단의 아미드화(amidation)가 상기 펩타이드와 음이온성을 띠는 박테리아 막 표면과의 결합을 촉진시킴으로써, 항미생물 활성을 더욱 증가시켰다는 것을 의미한다(Jia et al., Appl. Environ. Microbiol. 66, 1928-1932, 2000; Dennison and Phoenix, Biochemistry 50, 1514~1523, 2011).

		Gram	MEC (㎍/㎖)
		Gram	YFGAP-OH	YFGAP-NH2	Piscidin 1
미생물	B. subtilis KCTC1021	+	13.0	5.4	7.5
	B. subtilis RM125	+	1.2	0.7	4.5
	M. luteus ATCC9341	+	6.5	6.0	8.0
	S. aureus RM4220	+	125.0	34.0	4.4
	E. coli D31	-	6.2	1.9	3.8
	E. coli KCTC1116	-	5.0	3.3	7.0
	Enterobacter cloacae KCTC1685	-	12.0	3.5	6.0
	P. aeruginosa KCTC2004	-	3.7	1.7	8.0
	S. enterica KCTC2514	-	3.1	0.9	7.0
	Shigella flexneri KCTC2517	-	5.0	2.0	8.0
어류 병원균	S. iniae FP5229	+	17.0	6.3	6.5
	A. hydrophila KCTC2358	-	8.0	3.6	10.0
	V. parahemolyticus KCCM41664	-	3.2	0.9	3.0
효모	C. albicans KCTC7965	Yeast	> 125.0	125.0	> 125.0

실험예 6: 펩타이드의 용혈반응

본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 용혈활성을 인간과 어류의 적혈구 세포를 이용하여 측정하였다(Park et al., Biochemistry, 50, 3288-3299, 2011). 상기 적혈구 세포는 구연산을 처리된 혈액을 5분 동안 3000 x g에서 원심분리하여 수득한 후, 플라즈마와 버피코트(buffy coat)를 제거하기 위해 150 mM NaCl을 포함하는 10 mM 인산완충액(pH 7.4)으로 세척한 후, 완충액에 현탁하여 3%의 적혈구 용적율(hematocrit)로 조절하였다. 그 결과 상기 현탁액은 약 2x10⁸ cells/㎖ 비율로 적혈구를 포함한다. 상기 3% 적혈구 용적율을 갖는 현탁액에 YFGAP-OH, YFGAP-NH2 또는 Piscidin 1을 첨가한 후, 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. 상기 상층액을 5분 동안 3,000 x g에서 원심분리해서 얻은 상층액을 마이크로타이터 플레이트에 넣은 후 405 nm에서 흡광도를 측정하여 용혈반응을 표현하였다. 100% 용혈반응은 0.1% Triton X-100을 처리한 후, 방출되는 헤모글로빈에 따라 결정되었다. YFGAP-OH, YFGAP-NH2 또는 Piscidin 1에 의한 적혈구 용혈반응은 하기 수학식 1에 의해 계산하였다.

그 결과, 표 3에서 나타난 바와 같이 YFGAP-OH와 YFGAP-NH2는 100 ㎍/㎖의 농도까지는 인간과 어류의 적혈구 세포에 대하여 용혈반응을 나타내지 않은 반면, Piscidin 1은 12.5 ㎍/㎖의 농도에서조차 적혈구의 용혈반응을 나타냈다(표 3). 이러한 결과는 YFGAP-OH와 YFGAP-NH2의 사람에게 적용할 수 있는 항생 대체제 또는 어류질병의 치료 및 예방을 위한 항생제 대용으로 유용하게 적용할 수 있음을 의미하는 것이다.

펩타이드 처리농도 (㎍/㎖)	적혈구 용혈반응(%)
	YFGAP-OH		YFGAP-NH2		Piscidin 1
	인간	어류	인간	어류	인간	어류
3.13	0	0	0	0	1.5	0.9
6.25	0	0	0	0	3.6	5.2
12.5	0	0.3	2.3	0	18.9	22.1
25.0	0.1	0.7	2.5	1.1	51.6	64.0
50.0	0.1	0.9	2.6	1.5	83.7	89.6
100.0	0.4	1.0	2.7	1.9	100.0	100.0

종합하면, 본 발명자는 황다랑어(Thunnus albacares)의 껍질 산성 추출물로부터 정제된 항미생물성 펩타이드를 ESI-MS 및 아미노산 서열분석을 통해서 동정하였다. 상기 동정된 아미노산 서열은 공지된 다양한 종 유래의 GAPDH의 N-말단과 높은상동성을 나타냈다. 이러한 결과에 기반하여, 본 발명자는 상기 펩타이드를 황다랑어 GAPDH-유래 항미생물성 펩타이드(Yellowfin GAPDH-derived antimicrobial peptide, YFGAP)로 명명하였다. YFGAP는 광역항생 효과를 나타냈으며, 흥미롭게도 A. hydrophila, S. iniae, 및 V. parahemolyticus와 같은 어류 병원균에 대하여 강한 항미생물 활성을 나타냈다. 이러한 결과는 YFGAP가 황다랑어 피부에 있어서 선천성 방어 작용에 중요한 역할을 수행한다는 것을 나타내는 결과이다. 상동성 모델에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 알파-헬릭스(α-helix) 및 2개의 평행성 베타-가닥(β-strand)을 포함하는 2차 구조 모티프(motif)로 구성되어 있음을 확인하였다. 이는 다랑어 종으로부터 분리된 최초의 항균 펩타이드이며, GAPDH의 N-말단의 항미생물 활성을 최초로 규명한 결과이다.

본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Novel antimicrobial peptide from the Yellowfin tuna, Thunnus albacares, and uses thereof <130> PD12-0268 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 32 <212> PRT <213> Thunnus albacares <400> 1 Val Lys Val Gly Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Leu Val Thr 1 5 10 15 Arg Ala Ala Phe His Gly Lys Lys Val Glu Val Val Ala Ile Asn Asp 20 25 30 <210> 2 <211> 32 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 2 Val Lys Val Gly Val Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Leu Val Thr 1 5 10 15 Arg Ala Ala Phe Asn Ser Gly Lys Val Asp Val Val Ala Ile Asn Asp 20 25 30 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Thunnus albacares <400> 3 Arg Ile Gly Arg Leu Val Thr Arg Ala Ala Phe His 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Thunnus albacares <400> 4 Lys Val Gly Ile Asn 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Thunnus albacares <400> 5 Gly Lys Lys Val Glu Val Val 1 5

Claims

항미생물 활성을 나타내고, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 변이체.
제1항에 있어서,
황다랑어(Thunnus albacares)로부터 유래한, 펩타이드 또는 이의 변이체.
제 1항에 있어서,
상기 펩타이드 또는 이의 변이체는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항미생물 활성을 갖는, 펩타이드 또는 이의 변이체.
제 1항에 있어서,
상기 펩타이드 또는 이의 변이체는 사람과 어류의 적혈구 세포를 파괴하지 않는, 펩타이드 또는 이의 변이체.
제 1항의 펩타이드 또는 이의 변이체를 암호화하는 유전자.
제 5항의 유전자를 포함하는 발현벡터.
제 6항의 발현 벡터를 숙주세포에 형질 전환시킨 형질 전환체.
제 1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제.
제 1항의 펩타이드 또는 이의 변이체를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제.