PL198979B1 - Peptyd, peptyd fuzyjny, lek, kompozycja, fragment kwasu nukleinowego, gen chimerowy, wektor, transformowany organizm gospodarza, transformowana komórka roślinna, transformowana roślina, sposób transformacji, sposób uprawy oraz sposób wytwarzania heliomycyny - Google Patents

Abstract

7. Peptyd wed lug jednego z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, ze Xaa oznacza nast epuj ac a se- kwencj e peptydow a NH 2 -Asp-Lys-Leu-Ile-Gly-Ser i/lub Xab oznacza nast epuj ac a sekwencj e peptydo- w a -Val-Trp-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Thr-Ser-Asp-, i/lub Xae oznacza nast epuj ac a sekwencj e peptydow a - Gly-Ser-Phe-Ala-Asn-Val-Asn-, i/lub Xag oznacza nast epuj ac a sekwencj e peptydow a -Glu-Thr-OH. PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest peptyd, peptyd fuzyjny, lek, kompozycja, fragment kwasu nukleinowego, gen chimerowy, wektor, transformowany organizm gospodarza, transformowana komórka roślinna, transformowana roślina, sposób transformacji, sposób uprawy oraz sposób wytwarzania heliomycyny.

Istnieje rosnąca potrzeba wytwarzania roślin odpornych na choroby, szczególnie choroby powodowane przez grzyby w celu zmniejszenia lub uniknięcia konieczności stosowania ochronnych środków przeciwgrzybiczych również aby chronić środowisko. Jeden ze sposobów zwiększenia odporności na choroby polega na transformacji roślin w tak, aby produkowały one substancje zapewniające ochronę przed tymi chorobami.

W dziedzinie ochrony zdrowia ludzkiego istnieją zakażenia grzybami oportunistycznymi, dla których obecnie nie ma żadnego skutecznego leczenia. Jest tak szczególnie dla pewnych inwazyjnych grzybic, na które chorują pacjenci hospitalizowani, których układ odpornościowy jest upośledzony w efekcie transplantacji, chemioterapii lub infekcji HIV. W porównaniu z szerokim zakresem ś rodków przeciwbakteryjnych, zakres obecnych środków przeciwgrzybowych jest bardzo ograniczony. Istnieje, więc realna potrzeba opracowania nowych klas substancji przeciwgrzybowych.

Znane są różne związki pochodzenia naturalnego, a w szczególności peptydy, wykazujące właściwości bakteriobójcze lub grzybobójcze, w szczególności w stosunku do grzybów odpowiedzialnych za choroby roślin. Jednak trudne jest znalezienie takich związków, które nie tylko będą mogły być wytworzone przez rośliny transformowane, ale także zachowają swoje właściwości bakteriobójcze lub grzybobójcze i nadadzą je wymienionym roślinom. W opisie niniejszego wynalazku przez środek bakteriobójczy lub grzybobójczy rozumie się zarówno właściwą aktywność bakteriobójczą lub grzybobójczą jak i właściwości bakteriostatyczne lub fungistatyczne.

Znane są też peptydy bogate w cysteinę prezentujące aktywności bakteriobójcze lub bakteriostatyczne, ale które nie mają aktywności grzybobójczej lub fungistatycznej. Problemem jest to, że znane w obecnym stanie techniki peptydy mają zwykle jedynie bakteriobójcze lub grzybobójcze. Heliomycyna jest peptydem izolowanym z hemolimfy motyla Heliothis virescens, która wykazuje aktywności grzybobójczą przeciw grzybom odpowiedzialnym za choroby roślin i grzybom patogennym dla ludzi i zwierząt. Po zsyntetyzowaniu genu heliomycyny okazało się, że możliwe jest jego wstawienie do organizmu-gospodarza, takiego jak drożdże lub rośliny w celu wyrażania heliomycyny, i/lub wytwarzania heliomycyny oczyszczonej lub nieoczyszczonej lub nadaniu temu organizmowi właściwości odporności na choroby grzybowe. Rozwiązanie to okazało się szczególnie korzystne zwłaszcza w ś wietle przedstawionych powyżej problemów.

Wynalazek dotyczy peptydu obejmującego sekwencję o wzorze (I): Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag (I), w której:

Xaa oznacza -NH2 lub resztę peptydową obejmującą od 1 do 10 aminokwasów, korzystnie 1 do 6 aminokwasów, obejmują cych co najmniej jeden aminokwas zasadowy, odpowiadając ą sekwencji peptydowej Xaa'-Gly-Xaa- w której Xaa' oznacza NH2 lub resztę peptydową obejmującą 1 do 9 aminokwasów, i Xaa'' oznacza resztę peptydową obejmującą jeden aminokwas wybrany z Leu, Ile, Val, Pro, Ser lub Thr,

Xab oznacza resztę peptydową obejmującą 10 aminokwasów, Xac oznacza resztę peptydową 3 aminokwasów obejmujących co najmniej jedną kwaśną resztę aminokwasową,

Xad oznacza sekwencję peptydową -Lys-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Gly-His,

Xae oznacza sekwencję peptydową -Gly-Xae'-Asn-, w której Xae' oznacza resztę peptydową obejmującą 5 aminokwasów,

Xaf oznacza tryptofan, i

Xag oznacza -OH lub resztę peptydową złożoną z 1 do 2 aminokwasów.

Przez peptyd według wynalazku należy rozumieć każdy peptyd, który obejmuje peptyd określony powyżej, dla którego używa się tu również nazwy heliomycyna.

W korzystnym peptydzie aminokwasy zasadowe są wybrane spoś ród lizyny, argininy lub homoargininy.

Xac korzystnie oznacza następującą sekwencję peptydową: -Asn-Xac'-Xac- w której Xac' oznacza resztę peptydu z 1 aminokwasem, a Xac oznacza resztę peptydu z 1 kwaśnym aminokwasem.

W korzystnym peptydzie aminokwasy kwa ś ne są wybrane spoś ród kwasu glutaminowego (Glu) i kwasu asparaginowego (Asp).

PL 198 979 B1

Xac korzystnie oznacza następującą sekwencję peptydową -Asn-Gly-Glu-.

Xab korzystnie oznacza następującą sekwencję peptydową -Val-Xab'-Asp-, w której Xab' oznacza resztę peptydową obejmującą 8 aminokwasów, i/lub Xag oznacza następującą sekwencję peptydową -Glu-Xag', w której Xag' oznacza OH lub zmienną resztę o sekwencji obejmującej 1 aminokwas.

Xaa korzystnie oznacza następującą sekwencję peptydową NH2-Asp-Lys-Leu-Ile-Gly-Ser i/lub Xab oznacza następującą sekwencję peptydową -Val-Trp-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Thr-Ser-Asp-, i/lub Xae oznacza następującą sekwencję peptydową -Gly-Ser-Phe-Ala-Asn-Val-Asn-, i/lub Xag oznacza następującą sekwencję peptydową - Glu-Thr-OH.

W korzystnym wykonaniu peptydu jest on o sekwencji przedstawionej na Identyfikatorze sekwencji Nr 2 (SEK NR ID 2).

Korzystny peptyd obejmuje na jednym lub drugim lub na obu końcach reszty peptydowe potrzebne dla jego ekspresji i docelowego kierowania w organizmie gospodarza.

Korzystnie reszty peptydowe peptydu o wzorze (I) tworzą przynajmniej jeden wewnątrzcząsteczkowy mostek disiarczkowy.

Korzystny peptyd obejmuje 3 mostki disiarczkowe utworzone między resztami cysteinowymi 1 i 4, 2 i 5, i 3 i 6.

Wynalazek również dotyczy peptydu fuzyjnego „peptyd-heliomycyna, który obejmuje peptyd według wynalazku i resztę peptydową, która może zostać odcięta przez system enzymatyczny komórki gospodarza, umożliwiając uwolnienie heliomycyny. Korzystnie peptyd fuzyjny połączony z heliomycyną jest peptydem sygnałowym lub peptydem tranzytowym.

Korzystnie peptyd tranzytowy jest peptydem sygnałowym genu PR-Ια tytoniu lub prekursorem czynnika Mat alfa 1 lub peptydem sygnałowym genu PG1 poligalakturonazy kukurydzy, korzystnie jest przedstawiony przez sekwencję w Identyfikatorze Sekwencji Nr 1 (SEK NR ID 1), w Identyfikatorze Sekwencji Nr 3 (SEK NR ID 3) lub w Identyfikatorze sekwencji Nr 18 (SEK NR ID 18).

Przez aminokwas kwaśny należy rozumieć każdy aminokwas zawierający na bocznym łańcuchu funkcję kwasu organicznego, w szczególności kwasu karboksylowego, korzystnie jest on wybrany z kwasu glutaminowego (Glu) lub kwasu asparaginowego (Asp).

Heliomycyna jest peptydem opisanym przez swoją sekwencję kodującą pod identyfikatorem sekwencji Nr 2 (SEK NR ID 2) i jako odpowiadające homologiczne sekwencje peptydowe. Ta sama sekwencja jest sekwencją odpowiadającą aminokwasom 6 do 49 identyfikatora sekwencji Nr 1 (SEK NR ID 1) lub jako połączona z inną sekwencją kodującą.

Reszta N-końcowa może mieć modyfikację posttranslacyjną, na przykład acetylację jak i reszta C-końcowa może mieć modyfikację posttranslacyjną, na przykład amidację.

Przez sekwencję peptydową zawierającą zasadniczo sekwencję peptydową o ogólnym wzorze (1) rozumie się nie tylko sekwencje zdefiniowane powyżej ale także takie sekwencje zawierające na jednym lub drugim ze swoich końców, lub obu, reszty peptydowe niezbędne do ich ekspresji i lokalizacji w organizmie gospodarza. Przez organizm gospodarza należy rozumieć każdy organizm zawierający przynajmniej jedną komórkę przykładowo takie jak mikroorganizmy, w szczególności drożdże lub bakterie lub komórki roślinne lub organizmy wyższe takie jak rośliny.

Konstrukt peptydu fuzyjnego „peptyd-heliomycyna, pozwala na cięcie tego konstruktu przez układy enzymatyczne organizmu gospodarza co prowadzi do uwolnienia heliomycyny zdefiniowanej powyżej. Peptyd połączony z heliomycyną może być peptydem sygnałowym lub peptydem tranzytowym, który pozwala na kontrolowanie i kierowanie wytwarzaniem heliomycyny w sposób specyficzny od części komórki gospodarza, jak na przykład cytoplazmy, błony komórkowej, lub w przypadku roślin do konkretnego typu przedziału komórkowego lub tkanki lub do macierzy zewnątrzkomórkowej.

Peptyd tranzytowy może być sygnałem adresowania do chloroplastów lub mitochondriów, który jest następnie odcinany w chloroplastach lub mitochondriach. Peptyd sygnałowy może być sygnałem N-końcowym lub „prepeptydem, ewentualnie w połączeniu z sygnałem odpowiedzialnym za zatrzymanie białka w reticulum endoplazmatycznym lub peptydem adresowania do wakuoli lub „propeptydem. Reticulum endoplazmatyczne jest miejscem, w którym przez maszynerię komórkową przeprowadzane są operacje dojrzewania tworzonego białka, jak na przykład odcinanie peptydu sygnałowego.

Peptydy tranzytowe mogą być albo proste albo podwójne, i w tym przypadku ewentualnie rozdzielone przez sekwencję pośrednią, to znaczy zawierającą w kierunku transkrypcji, sekwencję kodującą peptyd tranzytowy genu roślinnego kodującego enzym o lokalizacji plastydowej, część sekwencji dojrzałej N-końcowej genu roślinnego kodującego enzym o lokalizacji plastydowej, a następnie se4

PL 198 979 B1 kwencję kodującą drugi peptyd tranzytowy genu roślinnego kodującego enzym o lokalizacji plastydowej, takie jak opisano w publikacji EP 0 508 909.

Jako peptyd tranzytowy użyteczny w rozwiązaniach według wynalazku można zastosować w szczególnoś ci peptyd sygnał owy genu PR-1 α tytoniu opisany przez Corenelissen i wsp. przedstawiony wraz ze swoją sekwencją kodującą na identyfikatorze sekwencji Nr 2. Jest on korzystny w szczególności gdy heliomycyna jest produkowana przez komórki roś linne lub rośliny lub przez prekursor czynnika Mat α1 (Mat alfa 1) gdy heliomycyna jest produkowana w drożdżach.

Peptyd fuzyjny „MF αΐ/heliomycyna z pięcioma resztami propeptydu czynnika MF α1 (Ser-LeuAsp-Lys-Arg) umieszczonymi w pozycji N-końcowej i jego sekwencja kodująca są częścią niniejszego wynalazku w szczególności opisane na identyfikatorze sekwencji Nr 1 (SEK ID NR 1) i odpowiadający aminokwasom 1 do 49.

Peptyd fuzyjny „peptyd sygnałowy PR-1a-heliomycyna i jego sekwencja kodująca są też częścią niniejszego wynalazku, w szczególności opisane na identyfikatorze sekwencji Nr 3 (SEK ID NR 3).

Peptyd fuzyjny zawierający peptyd sygnałowy genu PG1 poligalakturanazy kukurydzy w postaci fuzji z heliomycyną „Peptyd sygnałowy PG1/heliomycyna jest reprezentowany wraz z jego sekwencją kodującą przez identyfikatory sekwencji Nr 18 i 20 (SEK ID NR 18 i SEK ID NR 20).

Korzystne jest gdy reszty cysteinowe peptydu o wzorze (I) tworzą przynajmniej jeden wewnątrzkomórkowy mostek disiarczkowy, korzystnie trzy mostki disiarczkowe, które korzystnie wytworzone są między resztami cysteiny 1 i 4, 2 i 5 i 3 i 6.

Heliomycyna jest peptydem szczególnie aktywnym w stosunku do grzybów i drożdży i może być z tego powodu stosowana do zapobiegania lub leczenia grzybic u różnych organizmów. Stąd heliomycyna znajdzie swoje zastosowanie w medycynie jak również można ją stosować do traktowania roślin przeciw atakom grzybów przez bezpośrednie stosowanie na rośliny.

Wynalazek dotyczy leku będącego peptydem według wynalazku.

Wynalazek ponadto dotyczy kompozycji, która obejmuje peptyd według wynalazku i odpowiedni nośnik.

Odpowiednim nośnikiem jest ten, który nie degraduje w znaczący sposób heliomycyny w kompozycji i nie zmniejsza właściwości grzybobójczych heliomycyny. Ta kompozycja może być kompozycją kosmetyczną i w tym przypadku nośnik jest kosmetycznie dopuszczalny (przystosowany do stosowania na skórze lub naskórku, włosach itp.) lub kompozycją farmaceutyczną, która ma zastosowanie terapeutyczne i wówczas odpowiedni nośnik jest farmaceutycznie dopuszczalny i odpowiedni do stosowania heliomycyny miejscowo, doustnie lub w formie iniekcji. Kompozycja może być stosowana w agrochemii i w tym przypadku stosowany jest odpowiedni nośnik dopuszczalny w agrochemii, odpowiedni do stosowania na roślinach lub w pobliżu roślin bez jego degradacji.

Wynalazek dotyczy również fragmentu kwasu nukleinowego, który obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego kodującą peptyd według wynalazku.

Korzystnie sekwencja nukleotydowa jest typu DNA, korzystnie obejmuje ona sekwencję DNA opisaną przez zasady od 16 do 147 Identyfikatora Sekwencji Nr 1 (SEK NR ID 1), Identyfikatora Sekwencji Nr 2 (SEK NR ID 2), przez zasady 3 do 224 Identyfikatora Sekwencji Nr 3 (SEK NR ID 3) lub przez zasady 7 do 205 Identyfikatora Sekwencji Nr 18 (SEK NR ID 18), sekwencję homologiczną lub sekwencję komplementarną do tej sekwencji.

Wynalazek również dotyczy genu chimerowego, który obejmuje sekwencję kodującą jak i heterologiczne elementy regulatorowe w pozycjach 5' i 3' zdolne do funkcjonowania w organizmie gospodarza, w szczególności roślinach, przy czym sekwencja kodująca obejmuje przynajmniej jeden fragment DNA według wynalazku.

Korzystnie organizm gospodarza jest mikroorganizmem.

Korzystnie organizm gospodarza jest wybrany spośród komórek roślinnych i roślin. Fragment kwasu nukleinowego w szczególności DNA, naturalnego lub syntetycznego kodującego heliomycynę zdefiniowaną powyżej, jak również zdefiniowano peptyd fuzyjny „peptyd-heliomycyna. Fragmentem tym może być fragment zsyntetyzowany lub wyizolowany z motyla Heliothis, lub fragment pochodny przystosowany do ekspresji heliomycyny w organizmie gospodarza, w którym peptyd będzie wyrażany. Fragment kwasu nukleinowego może być uzyskany za pomocą standardowych metod izolowania i oczyszczania lub też przez syntezę za pomocą zwykłych technik hybrydyzacji kolejnych oligonukleotydów. Techniki te szczegółowo opisane są w Ausubel i wsp.

Według niniejszego wynalazku przez „fragment kwasu nukleinowego rozumie się sekwencję nukleotydów mogącą być typu DNA lub RNA, korzystnie typu DNA, w szczególności cDNA, szczególnie dwuniciowy.

PL 198 979 B1

Fragment kwasu nukleinowego kodujący heliomycynę jest sekwencją DNA opisaną przez zasady 16 do 147 identyfikatora sekwencji Nr 1 (SEK NR ID 1), lub przez identyfikator sekwencji Nr 2 (SEK

ID NR 2), szczególnie jest tym fragmentem część kodującą odpowiadającą zasadom 1 do 32, sekwencja homologiczna lub komplementarna do wymienionej sekwencji.

Przez „sekwencję homologiczną należy rozumieć każdą sekwencję DNA przedstawiającą jedną lub więcej modyfikacji sekwencji w stosunku do sekwencji nukleotydów opisanych przez identyfikatory sekwencji Nr 1, 2 lub 3 i kodującą heliomycynę lub peptyd fuzyjny „peptyd-heliomycyna. Te modyfikacje mogą być uzyskane za pomocą zwykłych technik mutacji, lub też wybierając oligonukleotydy stosowane w przygotowaniu wymienionej sekwencji za pomocą hybrydyzacji. Ze względu na liczne kombinacje kwasów nukleinowych mogące prowadzić do ekspresji tego samego aminokwasu, różnice pomiędzy sekwencją referencyjną opisaną przez identyfikatory sekwencji Nr 1, 2 i 3 i odpowiednim homologiem mogą być znaczne, tym bardziej, że chodzi o niewielki fragment DNA o wielkości mniejszej od 100 kwasów nukleinowych, który można uzyskać za pomocą syntezy chemicznej. Korzystnie, stopień homologii będzie wynosił przynajmniej 70% w stosunku do sekwencji referencyjnej, korzystnie przynajmniej 80%, bardziej korzystnie przynajmniej 90%. Te modyfikacje są na ogół neutralne, to znaczy nie wpływają na pierwszorzędową sekwencję heliomycyny lub powstałych peptydów fuzyjnych.

Gen chimerowy (gen hybrydowy) lub kasety ekspresyjnej opisane w wynalazku mogą zawierać sekwencję kodującą jak i elementy regulacyjne heterologiczne w pozycjach 5' i 3' mogące działać w organizmie gospodarza, w szczególności komórkach roślinnych lub roślinach. Sekwencja kodująca zawiera przynajmniej fragment DNA kodujący heliomycynę lub peptyd fuzyjny „peptyd-heliomycyna taki jak zdefiniowano powyżej.

Przez organizm-gospodarza należy rozumieć każdy niższy lub wyższy organizm jedno lub wielokomórkowy, do którego może być wprowadzony gen chimerowy według wynalazku w celu wytwarzania heliomycyny. W szczególności będą to bakterie na przykład E. coli, drożdże, w szczególności rodzaje Saccharomyces lub Kluyveromyces, Pichia, grzyby, w szczególności Aspergillus, bakulowirus, lub korzystnie komórki roślinne i rośliny.

Przez „komórkę roślinną należy rozumieć w wynalazku każdą komórkę pochodzącą z rośliny i mogącą tworzyć niezróżnicowane tkanki takie jak kalus, tkanki zróżnicowanie takie jak zarodki, części roślin, rośliny lub nasiona.

Przez „roślinę rozumie się każdy wielokomórkowy zróżnicowany organizm zdolny do fotosyntezy w szczególności rośliny jednoliścienne lub dwuliścienne, a w szczególności rośliny hodowlane przeznaczone do spożycia lub nie przez zwierzęta lub ludzi takie jak kukurydza, pszenica, soja, ryż, trzcina cukrowa, burak, tytoń, bawełna itp.

Elementy regulatorowe potrzebne do wyrażania sekwencji DNA kodującej heliomycynę są dobrze znane specjalistom w dziedzinie i zależą one od organizmu gospodarza. Elementy takie obejmują na przykład sekwencje promotorów, aktywatory transkrypcji, peptydy tranzytowe, sekwencje terminatorowe, w tym kodony start i stop. Sposoby i metody identyfikacji i selekcji elementów regulacyjnych są dobrze znane specjalistom w dziedzinie.

Szczególnie znane są elementy stosowane przy transformacji mikroorganizmów takich jak drożdże i bakterie, elementy regulacyjne, które obejmują w szczególności sekwencje promotorów, aktywatory transkrypcji, peptydy tranzytowe, sekwencje terminatorowe i kodony start i stop.

Aby sterować ekspresją i sekrecją peptydu w podłożu hodowlanym drożdży, fragment DNA kodujący heliomycynę wintegrowuje się do wektora wahadłowego, który zawiera następujące elementy:

- markery pozwalają ce na selekcję transformantów. Korzystnie stosuje się gen ura-3 dla droż dży i geny, które nadają oporność na ampicylinę dla E. coli,

- sekwencję nukleotydów pozwalają cą na replikację (początek replikacji) plazmidu w droż dż ach. Korzystnie stosuje się początek replikacji plazmidu 2μ drożdży.

- sekwencję nukleotydów pozwalającą na replikację (początek replikacji) plazmidu w E. coli,

- kasetę ekspresyjną zł o ż oną z:

(1) sekwencji regulatorowej promotora. Można stosować każdą sekwencję promotorową genu ulegającego naturalnej ekspresji u drożdży. Korzystnie stosuje się promotor genu Mfal S. cerevisiae.

(2) sekwencji kodującej peptyd sygnałowy (lub prepeptyd) połączony z peptydem adresującym (lub propeptydem). Te obszary są ważne dla prawidłowej sekrecji peptydu. Korzystnie stosuje się sekwencję kodującą prepropeptyd prekursora czynnika Mfa1.

PL 198 979 B1 (3) sekwencji regulacyjnej terminatora lub poliadenylacji. Korzystnie stosuje się terminator kinazy glicerofosforanowej (PGK) S. cerevisiae. W kasecie ekspresyjnej sekwencja kodująca heliomycynę jest wstawiona przed sekwencją pre-pro i za terminatorem PGK.

Elementy te zostały opisane w kilku publikacjach w tym Reichhart i wsp., 1992, Invert. Reprod.

Dev. 21, str. 15-24 i Michaut i wsp., 1996, FEBS Letters, 395, str. 6-10.

Korzystnie drożdże z gatunku S. cerevisiae transformuje się plazmidem ekspresyjnym metodą transformacji z octanem litu (Ito i wsp., 1993, J. Bacteriol. 153, str. 163-168).

Transformowane drożdże selekcjonuje się na żelowanej pożywce selekcyjnej, który nie zawiera uracylu. Masowe wytwarzanie drożdży transformowanych przeprowadzane jest przez hodowlę prowadzoną przez 24 do 48 godz. w płynnej pożywce selekcyjnej. Wynalazek również dotyczy transformowanego organizmu gospodarza, który zawiera fragment kwasu nukleinowego lub gen chimerowy według wynalazku.

Korzystny transformowany organizm gospodarza obejmuje mikroorganizmy, komórki roślinne lub rośliny.

Korzystnie transformowany organizm jest rośliną obejmującą transformowane komórki, korzystnie roślina jest regenerowana z komórek transformowanych.

Korzystnie mikroorganizm jest wybrany z bakterii, w szczególności E. coli, drożdży, a zwłaszcza gatunków Saccharomyces lub Kluyveromyces, Pichia, grzybów, w szczególności Aspergillus lub bakulowirusów.

Korzystnie transformowana komórka roślinna obejmuje fragment kwasu nukleinowego lub gen chimerowy według wynalazku.

Wynalazek dotyczy również transformowanej rośliny, która obejmuje co najmniej jedną transformowaną komórkę roślinną według wynalazku.

Korzystna transformowana roślina jest odporna na choroby powodowane przez Cercospora, w szczególności Cercospora beticola, Cladosporium, w szczególności Cladosporium herbarum, Fusarium, a zwłaszcza Fusarium culmorum lub Fusarium graminearum, lub przez Phytophthora, w szczególności Phytophtora cinnamomi.

Wynalazek ponadto dotyczy transformowanej rośliny, która pochodzi z hodowli i/lub krzyżowania rośliny według wynalazku i zawiera fragment kwasu nukleinowego lub gen chimerowy według wynalazku.

Wynalazek dotyczy nasion z transformowanej rośliny według wynalazku zawierającej fragment kwasu nukleinowego lub gen chimerowy według wynalazku.

Zakresem wynalazku jest również objęty sposób wytwarzania peptydu - heliomycyny według wynalazku, który obejmuje etapy hodowli transformowanego organizmu według wynalazku w odpowiednim podłożu hodowlanym, a następnie ekstrakcję i całkowite lub częściowe oczyszczenie otrzymanej heliomycyny.

Transformacja mikroorganizmów pozwala na wytwarzanie heliomycyny na większą skalę. Procedury wytwarzania heliomycyny obejmują etapy hodowli mikroorganizmu transformowanego zawierającego gen kodujący heliomycynę taki jak zdefiniowano powyżej w odpowiednim podłożu hodowlanym, a następnie ekstrakcję i oczyszczenie całkowite lub częściowe otrzymanej heliomycyny.

Korzystnie, podczas ekstrakcji heliomycyny produkowanej przez drożdże eliminuje się drożdże za pomocą wirowania i umieszcza się supernatant hodowli w kontakcie z roztworem kwasu mineralnego lub organicznego jak na przykład kwas solny lub kwas octowy. Uzyskany wyciąg następnie wiruje się z prędkością 4000 do 10000 obr/min w 4°C podczas 30 do 60 min.

Oczyszczanie heliomycyny może być poprzedzone etapem frakcjonowania supernatantu uzyskanego w wyniku etapu ekstrakcji. Korzystnie w czasie etapu frakcjonowania, ekstrakt nakłada się na fazę odwróconą, aby wykonać ekstrakcję w fazie stałej. Płukanie cząsteczek rozpuszczalnych w wodzie przeprowadza się rozcieńczonym roztworem kwaśnym, a elucję cząsteczek hydrofobowych odpowiednim eluantem. Uzyskuje się dobre wyniki z kwasem trifluorooctowym do płukania i eluantem zawierającym wzrastające ilości acetonitrylu w roztworze rozcieńczonego kwasu.

Korzystnie oczyszczanie heliomycyny przeprowadza się w dwóch etapach: HPLC z wymianą kationów a następnie HPLC z fazą odwróconą z odpowiednim eluantem, który może być różny lub identyczny z tym z poprzedniej fazy. Po różnych etapach oczyszczania następuje test inhibicji wzrostu grzybów w pożywce płynnej. Korzystnie test jest przeprowadzany z grzybem Neurospora crassa.

Sekwencję heliomycyny wytwarzanej przez transformowane drożdże analizowano za pomocą metody sekwencjonowania przez degradację Edmana i spektrometrię masową. Charakterystykę strukturalną przeprowadzano bezpośrednio na wyprodukowanym peptydzie, na peptydzie modyfikowanym

PL 198 979 B1 przez redukcję/alkilowanie jak i na fragmentach peptydu. Sekwencję peptydu i masę cząsteczkową wyprodukowanej heliomycyny porównano z natywną heliomycyną wyekstrahowaną z hemolimfy

H. virescens. Wyniki wskazują, że te dwie cząsteczki mają tę samą strukturę pierwszorzędową. Określenie lokalizacji mostków disiarczkowych wskazuje, że ułożenie mostków disiarczkowych jest identyczne w dwóch peptydach, natywnym i produkowanym przez transformowany mikroorganizm.

Jako sekwencję regulacyjną promotora w roślinach można stosować każdą sekwencję promotorową genu wyrażanego naturalnie w roślinach, w szczególności promotora pochodzenia bakteryjnego, wirusowego lub roślinnego taki jak na przykład genu małej podjednostki karboksylazy oksygenazy rybulozo-1,5-bisfosforanu,(karboksydysmutazy) (RuBisCO) lub genu wirusa roślinnego takiego jak na przykład wirusa mozaiki kalafiora (19S lub 35S CAMV) lub promotora indukowalnego przez patogeny takiego jak PR-1a tytoniu. Może być wykorzystany dowolny odpowiedni znany promotor. Korzystnie wykorzystuje się sekwencję regulacyjną promotora, która powoduje nadekspresję sekwencji kodującej w sposób konstytutywny lub indukowany przez atak patogenu. Przykładowo można wykorzystać sekwencję zawierającą przynajmniej jeden promotor histonu taki jak opisano w publikacji EP 0 507 698.

Można też stosować w połączeniu z sekwencją regulacyjną promotora inne sekwencje regulacyjne, które są umieszczone między promotorem i sekwencją kodującą takie jak aktywatory transkrypcji („enhancer) jak na przykład aktywator translacji wirusa mozaiki tytoniu (TMV) opisany w publikacji WO 87/07644 lub wirusa „etch tytoniu (TEV), który opisali Carrington i Freed.

Jako sekwencję regulacyjną terminatorową lub poliadenylacji można stosować każdą odpowiednią sekwencję pochodzenia bakteryjnego jak na przykład terminator Agrobacterium tumefaciens lub też pochodzenia roślinnego taki jak na przykład terminator histonu opisany w publikacji EP 0 633 317.

Gen chimerowy według wynalazku może być też połączony z markerem selekcji dostosowanym do transformowanego organizmu-gospodarza. Takie markery selekcyjne są dobrze znane specjaliście w dziedzinie. Może nim być gen odporności na antybiotyki lub też gen tolerancji na herbicydy przez rośliny. Wynalazek dotyczy wektora do klonowania lub ekspresji przeznaczonego do transformacji organizmu gospodarza, który obejmuje przynajmniej jeden początek replikacji i przynajmniej jeden gen chimerowy według wynalazku.

Wektor ten może być złożony z plazmidu, kosmidu, bakteriofaga lub wirusa, transformowanych przez wprowadzenie genu chimerowego według wynalazku. Takie wektory do transformacji w zależności od organizmu gospodarza, który ma być transformowany są dobrze znane specjalistom w dziedzinie i szeroko opisane w literaturze.

Do transformacji komórek roślinnych lub roślin będzie można w szczególności wykorzystać wirus, który może być stosowany do transformacji roślin rozwiniętych, który zawiera poza tym własne elementy replikacji i ekspresji. Korzystnie wektor do transformacji komórek roślinnych lub roślin jest plazmidem.

Wynalazek również dotyczy sposobu transformacji organizmu gospodarza w szczególności komórek roślinnych lub roślin, w którym do organizmu gospodarza wstawiony jest co najmniej jeden fragment kwasu nukleinowego lub gen chimerowy według wynalazku.

Korzystnie organizmem gospodarza jest komórka roślinna lub roślina, korzystnie roślina jest regenerowana z komórki roślinnej lub z transformowanej rośliny.

Rozwiązania według wynalazku pozwalają na prowadzenie procesu transformacji organizmu gospodarza w szczególności komórek roślinnych przez integrację przynajmniej jednego fragmentu kwasu nukleinowego lub genu chimerowego takich jak określono powyżej. Transformacja może być przeprowadzona dowolnym znanym sposobem opisanym w literaturze specjalistycznej, a w szczególności w zgłoszeniach wymienionych w niniejszym zgłoszeniu, stosując wektor według wynalazku.

Metody transformacji przykładowo polegają na bombardowaniu komórek, protoplastów lub tkanek cząsteczkami, do których są przyczepione sekwencje DNA. Inna seria metod polega na stosowaniu jako sposobu przeniesienia do rośliny genu chimerowego wstawionego do plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens lub Ri Agrobacterium rhizogenes.

Mogą być stosowane inne metody takie jak mikroiniekcja lub elektroporacja, lub też bezpośrednia transformacja za pomocą PEG.

Specjalista wybierze odpowiednią metodę w zależności od organizmu-gospodarza, w szczególności komórki roślinnej lub rośliny.

Regenerację roślin zawierających komórki transformowane, w szczególności roślin regenerowanych z komórek transformowanych uzyskuje się za pomocą dowolnej odpowiedniej procedury, która zależy od natury gatunku. Przykłady procedur regeneracji opisane są w cytowanych odnośnikach.

PL 198 979 B1

Dla procedury transformacji komórek roślinnych i regeneracji roślin będą cytowane niniejszym są w szczególności następujące opisy patentów i zgłoszeń patentowych: US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 i WO 95/06128.

Transformowane rośliny uzyskane według wynalazku są oporne na pewne choroby, a w szczególności choroby grzybowe. Tak, więc sekwencja DNA kodująca heliomycynę może być wintegrowana w celu uzyskania roś lin opornych na wymienione choroby heliomycyna jest skuteczna przeciw chorobom grzybowym takim jak choroby powodowane przez Cercospora, w szczególności Cercospora beticola, Cladosporium, w szczególności Cladosporium herbarum, Fusarium, w szczególności Fusarium culmorum lub Fusarium graminearum, lub przez Phythophtora, w szczególności Phytophtora cinnamomi.

Gen chimerowy może również być połączony w korzystny sposób z przynajmniej jednym markerem selekcyjnym takim jak jeden lub więcej genów tolerancji herbicydów.

Sekwencja DNA kodująca heliomycynę może też być wintegrowana jako marker selekcyjny w czasie transformacji roś lin z innymi sekwencjami kodującymi inne interesujące peptydy lub białka jak na przykład geny tolerancji herbicydów.

Takie geny tolerancji herbicydów są dobrze znane specjalistom w dziedzinie i przykładowo opisane są w zgłoszeniach patentowych EP 115 673, WO 87/04181, EP 337 899, WO 96/38567 lub WO 97/04103.

Oczywiście transformowane komórki i rośliny według wynalazku mogą dodatkowo zawierać oprócz sekwencji kodującej heliomycynę inne sekwencje heterologiczne kodujące interesujące białka jak inne peptydy komplementarne mogące nadać roślinie oporność na inne choroby pochodzenia bakteryjnego lub grzybowego i/lub inne sekwencje kodujące białka tolerancji herbicydów i/lub inne sekwencje kodujące białka oporności na owady, a w szczególności białka Bt.

Inne sekwencje mogą być wintegrowane za pomocą tego samego wektora zawierającego gen chimerowy według wynalazku, który zawiera sekwencję kodującą heliomycynę i zawiera, co najmniej jeden inny gen zawierający inną sekwencję kodującą inny interesujący peptyd lub białko.

Mogą być one też wintegrowane za pomocą innego wektora zawierającego przynajmniej wymienioną inną sekwencję według standardowych technik opisanych powyżej.

Rośliny według wynalazku mogą być też uzyskane przez krzyżowanie rodziców, jeden z nich niesie gen według wynalazku kodujący heliomycynę, drugi niesie gen kodujący przynajmniej jeden inny interesujący peptyd lub białko.

Wśród sekwencji kodujących inne peptydy przeciwgrzybowe można wymieć sekwencję kodującą drozomycynę wymienioną w zgłoszeniu patentowym FR 2 725 992 i przez Fehlbauma i wsp. (1994) i w nieopublikowanym zgłoszeniu patentowym FR 97 09115 złożonym 24 lipca 1997, lub sekwencje kodującą androktoninę opisaną w zgłoszeniu patentowym FR 2 745 004 i w nieopublikowanym zgłoszeniu patentowym FR 97 10362 złożonym 20 sierpnia 1997.

Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobu uprawy transformowanej rośliny według wynalazku, który polega na wysianiu nasion transformowanych roślin na wydzielonej części pola odpowiedniego do ich uprawy, zastosowaniu na wydzieloną część pola kompozycji agrochemicznej nie wpływając w zasadniczy sposób na nasiona lub transformowane rośliny, a następnie zebranie wyhodowanych roślin, gdy uzyskają pożądaną dojrzałość i ewentualnie oddzielenie nasion od zebranych roślin.

Korzystnie kompozycja agrochemiczna obejmuje co najmniej jeden aktywny produkt posiadający przynajmniej jedną aktywność grzybobójczą i/lub bakteriobójczą, korzystnie aktywny produkt wykazuje aktywność komplementarną do aktywności peptydu według wynalazku.

Przez kompozycję agrochemiczną rozumie się według wynalazku każdą kompozycję agrochemiczną zawierającą przynajmniej jeden produkt aktywny mający jedną z następujących aktywności herbicyd, fungicyd, związek bakteriobójczy, wirusobójczy lub owadobójczy.

Przez produkt mający aktywność komplementarną do aktywności heliomycyny rozumie się produkt o podobnej aktywności, to znaczy produkt, który będzie aktywny w stosunku do ataków drobnoustrojów (grzybów, bakterii lub wirusów) niewrażliwych na heliomycynę lub też produkt, którego zakres aktywności całkowicie lub częściowo obejmuje spektrum heliomycyny, i którego stosowana dawka będzie zmniejszona w sposób znaczący ze względu na obecność heliomycyny produkowanej przez transformowaną roślinę.

PL 198 979 B1

Podane poniżej przykłady mają na celu jedynie zilustrowanie wynalazku bez ograniczania jego zakresu.

P r z y k ł a d I: Izolacja i charakterystyka heliomycyny z hemolimfy pobranej z immunizowanych larw H. virescens

P r z y k ł a d 1.1: Izolacja

1-1. Indukcja syntezy substancji przeciwgrzybowej w hemolimfie H. virescens

Dojrzałe larwy z 5 stadium błonkówki H. virescens immunizowano za pomocą igły (30 ga) uprzednio zanurzonej w próbce bakterii Gram-dodatnich (M. luteus) i Gram-ujemnych (E. coli 1106) przygotowanych z hodowli prowadzonych w bulionie Luria-Bertani podczas 12 godzin w 37°C. Tak zakażone zwierzęta trzymano indywidualnie w probówkach zawierających podłoże odżywcze na bazie agaru przez 24 godziny w temp. około 20-23°C. Przed pobraniem hemolimfy larwy schładzano na lodzie.

1-2 Przygotowanie plazmy

Hemolimfa (około 30 μΐ na larwę) zbierano przez wycięcie wyrostka brzusznego i zbierano w 1,5 ml probówkach do mikrowirowania z propylenu schłodzonych w lodzie i zawierających aprotyninę jako inhibitor proteaz (20 μg/ml stężenie końcowe) i fenylotiomocznik jako inhibitor melanizacji (stężenie końcowe 20 μM). Tak zebraną z immunizowanych larw hemolimfę (2 ml) wirowano przy 14000 g przez 1 minutę w 4°C, aby usunąć hemocyty. Hemolimfę pozbawioną tych komórek krwi przechowywano w -20°C aż do jej wykorzystania.

1-3 Zakwaszenie osocza

Po szybkim rozmrożeniu osocze H. virescens zakwaszono aż do pH 3 1% roztworem kwasu trifluorooctowego. Ekstrakcja peptydu w stanie kwaśnym była prowadzona przez 30 min z lekkim wstrząsaniem w łaźni wodnej z lodem. Uzyskany ekstrakt następnie wirowano w 4°C przez 30 min. przy 10000 g.

1- 4 Oczyszczane peptydów

a) Wstępne oczyszczanie przez ekstrakcję w fazie stałej

Ilość ekstraktu odpowiadająca 2 ml hemolimfy została zdeponowana na nośniku fazy odwróconej sprzedawanego handlowo w postaci naboju (Sep-Pak™ C18, Waters Associates) zrównoważonego zakwaszoną wodą (TFA 0,05%). Cząsteczki hydrofilowe eliminowano za pomocą prostego płukania zakwaszoną wodą. Elucję peptydu przeprowadzono roztworem 40% acetonitrylu przygotowanego w 0,05% TFA. Frakcję eluowaną przy 40% acetonitrylu suszono pod próżnią w celu eliminacji acetonitrylu i TFA a następnie rekonstytuowano w ultraczystej sterylnej wodzie przed poddaniem pierwszemu etapowi oczyszczania.

b) Oczyszczanie przez chromatografię cieczową o wysokiej rozdzielczości na kolumnie fazy odwróconej.

- pierwszy etap - frakcja zawierająca peptyd była analizowana za pomocą chromatografii fazy odwróconej na kolumnie półpreparatywnej Aquapore RP-300 C8, (Brownlee™, 220 x 70 mm, 300 A). Elucję przeprowadzano za pomocą liniowego gradientu acetonitrylu 2 do 60% w 0,05% TFA przez 120 minut przy przepływie ciągłym 1,5 ml/min. Frakcje zbierano ręcznie śledząc absorpcję przy 225 nm i 254 nm. Zebrane frakcje suszono pod próżnią, rekonstytuowano ultraczystą wodą i analizowano ich aktywność przeciwgrzybową stosując poniżej podane testy.

- drugi etap: frakcję przeciwgrzybową odpowiadającą peptydowi analizowano na kolumnie analitycznej fazy odwróconej Aquapore RP-300 C8 (Brownlee™, 220 x 4,6 mm, 300 A) stosując liniowy gradient dwufazowy acetonitrylu od 2% do 22% w 10 min i od 22% do 32% w 50 min w 0,05% TFA przy przepływie ciągłym 0,8 ml/min. Frakcje zbierano ręcznie badając zmiany absorpcji przy 225 nm i 254 nm, suszono pod próżnią, rekonstytuowano ultraczystą wodą i analizowano ich aktywność przeciwgrzybową stosując poniższe testy.

- trzeci etap: frakcję przeciwgrzybową zawierającą peptyd oczyszczano do homogenności na kolumnie fazy odwróconej Narrowbore Delta Pak™ HPIC14 (Waters Associates, 150 x 22 mm) stosując gradient dwufazowy acetonitrylu 2% do 24% w 10 min i od 24 do 44% w 0,05% TFA przy przepływie ciągłym 0,25 ml/min i w kontrolowanej temperaturze 30°C. Frakcje zbierano ręcznie śledząc zmiany absorpcji w 225 nm. Zebrane frakcje suszono pod próżnią, rekonstytuowano filtrowaną ultraczystą wodą i analizowano ich aktywność przeciwgrzybową stosując poniższe testy.

P r z y k ł a d I.2 charakterystyka strukturalna peptydu

2- 1 Sprawdzenie czystości przez strefową elektroforezę kapilarną

Czystość peptydu przeciwgrzybowego sprawdzano przez strefową elektroforezę kapilarną na modelu 270-HT (PEApplied Biosystems oddział Perkin Elmer). 1 ml roztworu z 50 μM oczyszczonego peptydu wstrzykiwano pod próżnią w kapilarce z krzemionki (72 cm x 50 μm) i analizę przeprowadzo10

PL 198 979 B1 no w 20 mM buforze cytrynianowym w pH 2,5. Elektroforezę przeprowadzono przy 20 kV od anody do katody podczas 20 min w 30°C. Migrację zarejestrowano przy 200 nm.

2-2 Określenie liczby cystein: redukcja i S-pirydyloetylacja

Liczbę reszt cystein określono w natywnym peptydzie przez redukcję i 5-pirydyloetylację. 10 pmoli tego natywnego peptydu, który redukowano w 40 μΐ buforu Tris/HCl 0,5 M pH 7,5 zawierającego 2 mM EDTA i 6 M chlorek guanidyny w obecności 2 μl 2,2 M ditiotreitolu. Środowisko reakcji umieszczono pod atmosferą azotu. Po 60 min inkubacji w ciemności dodano 2 μl świeżo destylowanej 4-winylopirydyny do reakcji, którą następnie inkubowano przez 10 min w 45°C w ciemności pod atmosferą azotu. Następnie pirydyloetylowany peptyd oddzielano od składników w środowisku reakcyjnym przez chromatografię fazy odwróconej stosując liniowy gradient acetonitrylu w obecności 0,25% TFA.

2-3 Określenie masy natywnego peptydu, peptydu S-pirydyloetylowanego i fragmentów proteolizy spektrometrem masowym MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption lonization-Time of Flight - Wspomagana przez macierz desorpcja laserowa jonizacja - czas przelotu)

Pomiary masy przeprowadzono na spektrometrze masowym MALDI-TOF Bruker Biflex (Brema, Niemcy) w sposób liniowy dodatni. Widma masy kalibrowano zewnętrznie mieszaniną standardową peptydów o znanej masie, odpowiednio 2199,5 Da, 3046,4 Da i 4890,5 Da. Różne produkty do analizy deponowano na cienkiej warstwie kryształów kwasu a-cyjano-4-hydroksycynamonowego uzyskanej przez szybkie odparowanie roztworu nasyconego w acetonie. Po wysuszeniu pod lekką próżnią próbki płukano kroplą 0,1% kwasu trifluorooctowego przed wprowadzeniem do spektrometru masowego.

2-4 Sekwencjonowanie przez degradację Edmana

Sekwencjonowanie automatyczne przez degradację Edmana peptydu natywnego, peptydu S-pirydyloetylowanego i różnych fragmentów uzyskanych po różnych cięciach proteolitycznych i detekcję pochodnych fenylotiohydantoinowych przeprowadzono na sekwenatorze ABI473A (PEApplied Biosystems oddział Perkin Elmer).

2-5 Cięcie proteolityczne

- Potwierdzenie sekwencji peptydowej w regionie C-końcowym

200 pmoli peptydu redukowanego i S-pirydyloetylowanego inkubowano w obecności 5 pmoli endoproteinazy Lys-C (proteaza I Acromobacter, cięcie specyficzne reszt lizyny od C-końca, Takara, Otsu) według warunków określonych przez dostawcę (10 mM Tris HCl pH 9 w obecności 0.01% Tween20). Po zastopowaniu reakcji 1% TFA fragmenty peptydowe dzielono za pomocą HPLC fazy odwróconej na kolumnie typu Narrowbore Delta Pak™ HPIC14 (Waters Associates, 150 x 2 mm) w gradiencie liniowym acetonitrylu od 2 do 60% przez 80 min w 0,05% TFA z przepływem 0,2 ml/min w stałej temperaturze 37°C. Uzyskane fragmenty analizowano za pomocą spektrometrii masowej MALDI-TOF i peptyd odpowiadający C-końcowemu fragmentowi sekwencjonowano za pomocą degradacji Edmana.

- Określenie ułożenia mostków disiarczkowych przez proteolizę termolizyną.

Natywny peptyd (8 μg) inkubowano przez 1 godzinę w obecności 4 μg termolizyny (Boehringer Mannheim, stosunek termolizyna/peptyd 1/2 wagowo:wagowo) w 37°C w buforze MES 0,1M (etylomorfina) pH 7 w obecności 2 mM CaCl2. Reakcję zastopowano przez dodanie kwasu mrówkowego i produkty reakcji natychmiast rozdzielono za pomocą chromatografii fazy odwróconej na kolumnie typu Narrowbore Delta Pak™ HPIC18 (Waters Associates, 150 x 2 mm) w gradiencie liniowym acetonitrylu od 2 do 50% przez 100 min w 0,05% TFA z przepływem 0,2 ml/min w 30°C poprzedzonej przez etap izokratyczny z 2% acetonitrylu przez 10 minut. Uzyskane fragmenty analizowano za pomocą spektrometrii masowej MALDI-TOF i sekwencjonowano przez degradację Edmana.

P r z y k ł a d II. Ekspresja heliomycyny w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Wszystkie techniki stosowane poniżej są technikami standardowymi w dziedzinie w pracy laboratoryjnej. Protokoły szczegółowe tych technik są dokładnie opisane w Ausubel i wsp.

Przykład II-1. Złożenie syntetycznego genu

Gen złożono z 6 syntetycznych oligonukleotydów kodujących 44 aminokwasów heliomycyny poprzedzonych przez 5 aminokwasów C-końcowych preprosekwencji czynnika α1 (Mfa1) drożdży. Oligonukleotydy reprezentowane na Figurze 1 wybrano biorąc pod uwagę preferencje wykorzystania kodonów S. cerevisiae.

Składanie przebiegało w kilku etapach:

- oligonukleotydy 2 do 5 fosforylowano na ich 5' końcu przez działanie kinazy polinukleotydowej (New England Biolabs);

PL 198 979 B1

- oligonukleotydy 1 do 6 mieszano, ogrzewano do 100°C i hybrydyzowano przez powolne obniżanie temperatury do 25°C przez 3 godziny;

- na oligonukleotydy po hybrydyzacji dział ano ligazą bakteriofaga T4 (New England Biolabs) przez 15 godzin w 15°C;

- blok DNA wynikający z hybrydyzacji oligonukleotydów przedstawiony jest na Figurze 1 i ograniczony jest przez miejsca restrykcyjne HinDIII i Bglll, które wykorzystano do wstawienia do plazmidu pBluescript SK+ (Stratagene) strawionego uprzednio enzymami HinDIII i BamHI (Bglll i BamHI dają te same lepkie końce). Mieszaninę ligacyjną następnie zastosowano do transformacji kompetentnych komórek E. coli (Stratagene). Analizowano kilka klonów i sekwencji. Jeden z klonów, który zawierał poszukiwaną sekwencję nazwano pSEAl.

Przykład II-2. Konstrukcja wektora pSEA2, który pozwala na wydzielanie syntetyzowanej heliomycyny.

Fragment DNA HinDIII-Sall wektora pSEA1, niosący sekwencję kodującą heliomycynę jak i fragment Sphl-HinDIII wektora M13JM132 (Michaut i wsp., 1985, FEBS Letters, 395, str. 6-10) zostały wstawione do miejsc Sphl i Sall plazmidu pTG4812 (Michaut i wsp., 1985, FEBS Letters, 395, str. 610). Fragment Sphl-Hindlll wektora M13JM132 zawiera sekwencję promotora genu MFal drożdży jak i sekwencję kodującą regionu prepro czynnika MFa1. W powstałym plazmidzie pSEA2 syntetyczny gen heliomycyny jest więc wstawiony między sekwencjami prepro czynnika MFa1 i terminatorem transkrypcji. Konstrukt taki zapewnia dojrzewanie i wydzielanie heliomycyny.

P r z y k ł a d II-3. Transformacja szczepu S. cerevisiae DNA plazmidu pSEA2 i analiza transformantów.

Szczep drożdży TGY 48.1 (MATa, ura3-D5, his, pro1, cps1: Reichhart i wsp., 1982, Invert. Reprod. Dev. 21, str. 15-24) transformowano plazmidem pSEA2. Transformanty selekcjonowano w 29°C na pożywce selekcyjnej YNBG (0,67% yeast nitrogen base, 2% glukoza) uzupełnionej 0,5% kazaminokwasami i niezawierającej uracylu. Po transformacji kilka klonów drożdży, wybranych jako ura+, hodowano przez 48 godz. w 29°C w 50 ml pożywki selekcyjnej. Po wirowaniu (4000 g, 30 min, 4°C) supernatant zakwaszono do pH 3,5 kwasem octowym przed nałożeniem na nabój Sep-Pak™ C18 (Waters Associates) zrównoważony zakwaszoną wodą (0,05% TFA). Różne białka związane na naboju eluowano roztworami 0,05% TFA zawierającym wzrastające procenty acetonitrylu.

Frakcja 40% o aktywności przeciwgrzybowej była analizowana na HPLC na kolumnie analitycznej fazy odwróconej Aquapore RP-300 C8 (Brownlee™, 220 x 4,6 mm, 300 A) stosując liniowy gradient acetonitrylu od 2% do 40% i 80 min w 0,05% TFA z ciągłym przepływem 0,8 ml/min. Frakcje zbierano ręcznie śledząc zmienność absorpcji przy 225 nm i 254 nm. Zebrane frakcje suszono pod próżnią, rekonstytuowano ultraczystą wodą i analizowano pod kątem ich aktywności przeciwgrzybowej w warunkach opisanych w przykładzie III. Charakterystykę strukturalną peptydu przeprowadzono jak opisano w Przykładzie I.2.

P r z y k ł a d II-4. Wytwarzanie zrekombinowanej heliomycyny na skalę półpreparatywną

Jeden z transformowanych klonów drożdży wyrażających heliomycynę hodowano w 29°C w 100 ml pożywki selekcyjnej. Tę hodowlę wstępną następnie użyto do zaszczepienia 4 l pożywki selekcyjnej i hodowlę prowadzono przez 48 godz. w 29°C. Drożdże usuwano przez wirowanie (4000 g, 30 min., 4°C). Supernatant zakwaszono do pH 3,5 kwasem octowym, poddano drugiemu wirowaniu (400 g, 30 min, 4°C) przed nałożeniem na preparatywną otwartą kolumnę fazy odwróconej C18 (Waters Associates), 125 A, 6 g fazy na 500 ml supernatantu) zrównoważoną zakwaszoną wodą (0,05% TFA). Cząsteczki hydrofilowe usunięto przez płukanie zakwaszoną wodą a następnie 15% acetonitrylem przygotowanym w 0,05% TFA. Frakcję eluowaną przy 40% acetonitrylu liofilizowano a następnie rekonstytuowano w sterylnej ultraczystej wodzie, przed poddaniem pierwszemu etapowi oczyszczania.

- pierwszy etap oczyszczania za pomocą HPLC: wstępnie oczyszczona frakcja zawierająca heliomycynę była rekonstytuowana w roztworze octanu amonu 25 mM, pH 3,4. Tę próbkę wstrzykiwano na kolumnę preparatywną wymiany kationów Aquapore Cation Exchange (Brownlee™, 250 x 10 mm) stosując liniowy gradient NaCl od 0% do 100% przez 90 min w 25 mM octanie amonu, pH 3,4 z przepływem ciągłym 2 ml/min. Zebrane frakcje suszono pod próżnią, rekonstytuowano wodą ultraczystą i analizowano w warunkach opisanych poniżej.

- drugi etap oczyszczania za pomocą HPLC; heliomycynę oczyszczano do homogenności za pomocą chromatografii na kolumnie fazy odwróconej półpreparatywnej Aquapore RP-30 C8 (Brownlee™, 220 x 7 mm, 300A) stosując liniowy gradient acetonitrylu od 2% do 40% w 80 min w 0,05% TFA z przepływem ciągłym 2 ml/min.

PL 198 979 B1

P r z y k ł a d III - Test aktywności in vitro: pomiar aktywności przeciwgrzybowej za pomocą mikrospektrofotometrii

Metodologia ta była używana do wykazania aktywności przeciwgrzybowej cząsteczek w trakcie różnych etapów oczyszczania, do określenia spektrum aktywności peptydu i do określenia minimalnego stężenia hamującego (CMI), przy którym peptyd jest czynny. CMI wyrażano jako przedział stężeń [a] - [b] gdzie [a] jest stężeniem minimalnym, przy którym obserwuje się początek wzrostu, a [b] stężeniem, dla którego w ogóle nie zaobserwowano wzrostu. Przykłady aktywności specyficznej heliomycyny w stosunku do grzybów nitkowatych i drożdży podano w Tabelach 1 i 2.

P r z y k ł a d III-1: Test detekcji aktywności w stosunku do grzybów nitkowatych

Aktywność przeciwgrzybową wykrywano stosując test inhibicji wzrostu w pożywce płynnej. Spory badanych grzybów umieszczono w zawiesinie w podłożu hodowlanym typu „ziemniak-glukoza. Korzystnie stosuje się 12 g podłoża Potato Dextrose Broth (Difco) na 1 l wody demineralizowanej. Do pożywki dodano dwa antybiotyki: tetracyklinę (stężenie końcowe 10 μg/ml) i cefatoksym (stężenie końcowe 100 μg/ml). Nakłada się 10 μl każdej analizowanej frakcji na płytkach mikrotitracyjnych w obecności 90 μl pożywki zawierającej spory (w końcowym stężeniu 104 spor/ml). Inkubację przeprowadzono w wilgotnej komorze w 30°C przez 48 godzin. Wzrost grzybów obserwowano pod mikroskopem fotonowym po 24 godz. i określano ilościowo po 48 godzinach przez pomiar absorpcji przy 600 nm stosując spektrofotometr z czytnikiem płytek mikrotitracyjnych.

- badane grzyby nitkowate: Aspergillus fumigatus (dar dr H. Koenig, szpital cywilny, Strasburg), Nectria haematococca, Fusarium culmorum, Trichoderma viride (mykoteka Uniwersytetu Katolickiego Leuven, Belgia); Neurospora crassa, Fusarium oxysporium (mykoteka Towarzystwa Clause, Paryż).

Wynik testu aktywności heliomycyny w stosunku do grzybów nitkowatych podano w Tabeli 1 poniżej:

T a b e l a 1

Aktywność heliomycyny w stosunku do grzybów nitkowatych

Grzyby	CMI heliomycyny ^M)
Neurospora crassa	0,1-0,2
Fusarium culmorum	0,2-0,4
Fusarium oxysporium	1,5-3
Nectria haematococca	0,4-0,8
Trichoderma viride	1,5-3
Aspergillus fumigatus	6-12,5

P r z y k ł a d III-2: Test detekcji aktywności w stosunku do drożdży

Różne szczepy drożdży inkubowano w podłożu typu „Sabouraud i inkubowano w 30°C przez 24 godz. z powolnym mieszaniem. Badaną próbkę (10 μθ deponowano w studzience płytki mikrotitracyjnej do której dodano 90 μl rozcieńczonej hodowli drożdży, której gęstość doprowadzono do OD 600 = 0,001. Wzrost oceniano przez pomiar absorpcji przy 600 nm za pomocą spektrofotometru z czytnikiem płytek mikrotitracyjnych.

- badane drożdże: Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. inconspicua, Cryptococcus neoformans, Cryp. albidus, Saccharomyces cerevisiae (dar dr H. Koenig, szpital cywilny, Strasburg).

Wyniki testu aktywności heliomycyny na wzrost drożdży podane są w Tabeli 2, poniżej.

T a b e l a 2

Aktywność heliomycyny w stosunku do drożdży

Drożdże	CMI heliomycyny ^M)
Candida albicans	2,5-5
Candida tropicalis	2,5-5
Candida krusei	10-20
Candida inconspicua	5-10
Cryptococcus neoformans	2,5-5
Cryptococcus albidus	5-10

Wyniki te wykazują znakomitą aktywność przeciwgrzybową peptydu według wynalazku.

PL 198 979 B1

P r z y k ł a d IV. Wytwarzanie transformowanej rośliny obejmującej gen kodujący heliomycynę

Przykład ten opisuje przygotowanie sekwencji kodującej heliomycynę do jej ekspresji w komórce roślinnej, gen chimerowy, wektor integracyjny i rośliny transformowane. Figury 2 do 6 w załączniku opisują schematyczne struktury pewnych plazmidów przygotowanych do konstrukcji genów chimerowych. W tych figurach różne miejsca restrykcyjne zaznaczono kursywą.

Wszystkie techniki stosowane poniżej są standardowymi technikami laboratoryjnymi. Szczegółowe protokoły tych metod są dokładnie opisane w Ausubel i wsp.

P r z y k ł a d IV-1: Konstrukcja genów chimerowych do transformacji roślin. pRPA-MD-P: Stworzenie plazmidu zawierającego peptyd sygnałowy genu PR-1a tytoniu.

Dwa syntetyczne oligonukleotydy komplementarne Oligo 7 i Oligo 8 podane poniżej hybrydyzowano w 65°C przez 5 minut a następnie przez wolne obniżenie temperatury w 30°C przez 30 minut.

Oligo 7: 5' GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3'

Oligo 8: 5' TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGA AGAAGAGTAGA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3'

Po hybrydyzacji między Oligo 7 i Oligo 8, DNA, który pozostaje jednoniciowy służy jako matryca dla fragmentu Klenowa polimerazy I E. coli (w warunkach standardowych określonych przez producenta (New England Biolabs)) dla stworzenia dwuniciowego oligonukleotydu począwszy od końca 3' każdego oligo. Uzyskany oligonukleotyd dwuniciowy następnie strawiono enzymami restrykcyjnymi SacII i Nael i sklonowano w plazmidzie pBS II SK(-) (Stratagene) strawionego tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Uzyskano wówczas klon zawierający region kodujący polipeptyd sygnałowy genu PR-1a tytoniu (SEK NR ID 4).

pRPA-PS-PR1 a-helio. Wytwarzanie sekwencji kodującej heliomycynę w postaci fuzji z peptydem sygnałowym PR-1a bez obszaru nietranskrybowanego 3'.

Dwa komplementarne syntetyczne oligonukleotydy o sekwencjach Oligo 9 i Oligo 10 poddano czynnościom podanym poniżej w warunkach opisanych dla pRPA-MD-P.

Oligo 9: 5' GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTGTGGGGT GCTGTGAACT ACACTTCCGA TTGCAACGGT GAGTGCAAGA GGAGGGGTTA 3'

Oligo 10: 5' CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCTCAAGT CTCGCACCAG CAGTTCACGT TAGCGAAGGA ACCGCAGTGA CCACCCTTGT AACCCCTCCT CTTGCACTC 3'

Po hybrydyzacji między Oligo 9 i Oligo 10 DNA, ten który pozostaje jednoniciowy służy jako matryca dla fragmentu Klenowa polimerazy I E. coli (w warunkach standardowych określonych przez producenta (New England Biolabs)) dla stworzenia dwuniciowego oligonukleotydu począwszy od końca 3' każdego oligo. Ten oligonukleotyd dwuniciowy zawierający część kodującą heliomycyny (SEK NR ID 2) następnie bezpośrednio sklonowano do plazmidu pRPA-MD-P strawionego enzymem restrykcyjnym Nael. Prawidłową orientację uzyskanego klonu sprawdzono za pomocą sekwencjonowania. Uzyskano wówczas klon zawierający białko fuzyjne PR-1a-heliomycyna umieszczone między miejscami restrykcyjnymi Ncol na N-końcu i Scal, SacII i BamHI na C-końcu (SEK NR ID 3).

pRPA-RD-239: Wytworzenie roślinnego wektora ekspresyjnego zawierającego białko fuzyjne PR-1 a-heliomycyna.

Plazmid pRTL2 GUS pochodzący od pUC-19 został uzyskany od Dr Jima Carringtona (Texas A&M University, nieopisany). Ten plazmid, którego budowa jest schematycznie podana na Figurze 2 zawiera podwójny promotor 35S CaMV izolowany z wirusa mozaiki kalafiora (Promotor 2 x 35S, Odell i wsp., 1985), który steruje ekspresją RNA zawierającego nieulegającą translacji sekwencję 5' wirusa etch tytoniu (TEV 5' UTR; Carrington i Freed, 1990), gen β-glukuronidazy E. coli (GUS, Jefferson i wsp., 1987), a następnie miejsce poliadenylacji RNA 35S CaMV (CaMV polyA; Odell i wsp., 1985).

Plazmid pRTL-2 GUS strawiono enzymami restrykcyjnymi Ncol i BamHI i oczyszczono duży fragment DNA. Plazmid pRPA-PS-PR1a-helio strawiono enzymami restrykcyjnymi Ncol i BamHI i oczyszczono mały fragment DNA kodujący białko fuzyjne PR-1a-heliomycyna. Dwa oczyszczone fragmenty DNA następnie zligowano razem w kasecie ekspresji w roślinach, która syntetyzuje białko fuzyjne PR-1a-heliomycyna. Schematyczna budowa tej kasety ekspresyjnej jest przedstawiona na Figurze 3. „PR-1a-heliomycyna przedstawia region kodujący białko fuzyjne PR-1a-heliomycyna pRPA-RD-239. Heliomycyna jest transportowana do macierzy zewnątrzkomórkowej rośliny przez działanie peptydu sygnałowego PR-1a.

pRPA-RD-195: Wytworzenie plazmidu zawierającego zmodyfikowane wielokrotne miejsce klonowania

PL 198 979 B1

Plazmid pRPA-RD-195 jest plazmidem pochodzącym od pUC-19, który zawiera zmodyfikowane wielokrotne miejsce klonowania. Komplementarne syntetyczne oligonukleotydy Oligo 11 i Oligo 12 podane poniżej hybrydyzowano tak aby wytworzyły formę dwuniciową według procedury opisanej dla pRPA-MD-P.

Oligo 11: 5' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3'

Oligo 12: 5' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3'

Uzyskany dwuniciowy oligonukleotyd ligowano następnie z pUC-19 uprzednio strawionym enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Hindlll i z końcami stępionymi za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy I DNA E. coli. Uzyskano wektor zawierający wielokrotne miejsca klonowania, aby ułatwić wprowadzenie kaset ekspresyjnych w plazmidzie wektorowym Agrobacterium tumefaciens. Schematycznie budowa tego wielokrotnego miejsca klonowania jest przedstawiona na Figurze 4. pRPA-RD-240:

Wprowadzenie kasety ekspresyjnej PR-Ια heliomycyny z pRPA-RD-239 do pRPA-RD-195.

Plazmid pRPA-RD-239 strawiono enzymem restrykcyjnym Pstll i oczyszczono fragment DNA zawierający kasetę ekspresyjną PR-1a-heliomycyna. Oczyszczony fragment następnie wligowano do pRPA-RP-195, który uprzednio strawiono enzymem restrykcyjnym Pstll i defosforylowano fosfatazą z jelita cieląt. pRPA-RD-174: Plazmid pochodzący od pRPA-BL-150A (EP 0 508 909) zawiera gen tolerancji bromoksynilu pRPA-BL-237 (EP 0 508 909)

Gen tolerancji bromoksynilu izolowano z pRPA-BL-237 przez amplifikację genu za pomocą PCR. Uzyskany fragment miał tępe końce i został sklonowany w miejscu EcoRI pRPA-BL-150A, którego końce zostały stępione przez działanie polimerazy Klenowa w standardowych warunkach. Uzyskano wektor Agrobacterium tumefaciens, który zawiera gen tolerancji bromoksynilu blisko swojego prawego końca, gen tolerancji kanamycyny blisko swego lewego końca i wielokrotne miejsce klonowania między tymi dwoma genami.

Schematyczna budowa pRPA-RD-174 jest przedstawiona na Figurze 5. Na tej figurze „nos przedstawia miejsce poliadenylacji syntazy nopaliny Agrobacterium tumefaciens (Bevan i wsp., 1983), „NOS pro przedstawia promotor syntazy nopaliny Agrobacterium tumefaciens (Bevan i wsp., 1983), „NPT II przedstawia gen fosfotransferazy neomycyny transpozonu Tn5 E. coli (Rothstein i wsp., 1981), „35S pro przedstawia promotor 35S izolowany z wirusa mozaiki kalafiora (Odell i wsp., 1985), „BRX przedstawia gen nitrylazy izolowany z K. ozaenae (Stalker i wsp., 1988), „RB i „LB przedstawiają odpowiednio prawą i lewą granicę sekwencji plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens.

pRPA-RD-184: Dodanie nowego unikalnego miejsca restrykcyjnego do pRPA-RD-174

Komplementarne oligonukleotydy syntetyczne Oligo 13 i Oligo 14 podane poniżej hybrydyzowano i przekształcano w formę dwuniciową według procedury opisanej dla pRPA-MD-P

Oligo 13: 5' CGGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG 3'

Oligo 14: 5' CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG 3'

Hybrydyzowany oligonukleotyd (95 par zasad) oczyszczono po rozdzieleniu w żelu agarozowym (3%, Nusieve, FMC). Plazmid pRPA-RD-174 strawiono enzymem restrykcyjnym Xmal i oczyszczono duży fragment DNA. Dwa uzyskane fragmenty DNA następnie zligowano.

Uzyskano plazmid pochodny pRPA-RD-174 zawiera inne miejsca restrykcyjne między genem tolerancji bromoksynilu i genem kanamycyny - markerem selekcyjnym.

Schematyczną budowę plazmidu pRPA-RD-184 przedstawiono na Figurze 6 gdzie określenia „nos, „NPT II, „NOS pro, „35S pro, „gen BRX, „RB i „LB mają takie samo znaczenie jak dla Figury 5.

pRPA-RD-241: Wytwarzanie wektora Agrobacterium tumefaciens zawierającego konstrukt genu kodującego heliomycynę adresującego do macierzy zewnątrzkomorkowej

Plazmid pRPA-RD-240 strawiono enzymami restrykcyjnymi Sfill i AscI i oczyszczono fragment DNA zawierający gen PR-1a-heliomycyna. Plazmid pRPA-RD-184 strawiono tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Fragment DNA zawierający kasetę ekspresyjną PR-1a-heliomycyna następnie wligowano do pRPA-RD-184. Uzyskano w ten sposób wektor Agrobacterium tumefaciens zawierający sekwencję kodującą białko fuzyjne PR-1a-heliomycyna, która prowadzi do ekspresji heliomycyny w macierzy zewnątrzkomórkowej rośliny.

PL 198 979 B1

P r z y k ł a d IV-2 Wytworzenie kasety ekspresyjnej promotor CsVMV-peptyd sygnałowy PG1 heliomycyna - terminator Nos pRPA -NP4 Wytworzenie plazmidu zawierającego peptyd sygnałowy genu PG1 poligalakturanazy kukurydzy (Genbank, numer dostępu X57627).

Dwa nukleotydy syntetyczne częściowo komplementarne Oligo 13 i Oligo 14 podane poniżej hybrydyzowano w 65°C przez 5 minut a następnie wolno obniżano temperaturę do 30°C przez 30 minut.

Oligo 15: 5' GGTCTAGAAT GGCCTGCACC AACAACGCCA TGAGGGCCCT CTTCCTCCTC 3'

Oligo 16: 5' CCGAATTCGG CGCCGTGCAC GATGCAGAAG AGCACGAGGA GGAAGAGGGC 3'

Po hybrydyzacji między Oligo 13 i Oligo 14 DNA, który pozostaje jednoniciowy i służy jako matryca dla fragmentu Klenowa polimerazy I E. coli (w warunkach standardowych określonych przez producenta (New England Biolabs)) dla stworzenia dwuniciowego oligonukleotydu począwszy od końca 3' każdego oligo. Ten oligonukleotyd dwuniciowy następnie trawiono enzymami restrykcyjnymi Xbal i EcoRI, a następnie klonowano w plazmidzie pSBS II SK (-) (Stratagene) strawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Uzyskano wówczas klon zawierający region kodujący 22 aminokwasy peptydu sygnałowego genu PG1 i który może być połączony w postaci fuzji z innymi białkami na poziomie miejsca Sfol (SEK ID NR 15).

pRPA-NP5: Wytworzenie sekwencji kodującej heliomycynę w postaci fuzji z peptydem sygnałowym genu PG1

Region kodujący heliomycynę amplifikowano stosując PCR. Wyjściowo korzystano z klonu pRPA - PS - PR1 α - helio (SEK NR ID 3) stosując termostabilny enzym Pfu (Stratagene) według warunków podanych przez producenta. Syntetyczne oligonukleotydy stosowane do tej amplifikacji to:

Oligo 17: 5' GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTG 3'

Oligo 18: 5' GGCTCGGAGTC AAGTCTCGCA CCAGCAGTTC AC 3'

Produkt PCR strawiono enzymem restrykcyjnym Xhol i sklonowano w wektorze pRPA-NP4 strawionym enzymami restrykcyjnymi Sfol i Xhol. Powstały klon zawiera, więc region kodujący peptyd sygnałowy genu PG1 w postaci fuzji w tej samej ramce odczytu z sekwencjami kodującymi heliomycynę (SEK NR ID 18).

pRPA-NP6: wytworzenie kasety ekspresyjnej heliomycyny w wektorze do transformacji

Wektor ekspresyjny do transformacji pILTAB 357 pochodzi od wektora binarnego pBin19. Zawiera promotor CsVMV (Verdaguer i wsp. 1986, Plant Mol. Biol. 31, 1129-1139), po którym następuje wielokrotne miejsce klonowania i terminator transkrypcji Nos syntazy nopaliny (Figura X + 1). Sekwencja tych fragmentów jest pokazana jako (SEK NR ID 19).

Wektor ekspresyjny heliomycyny uzyskano przez wstawienie fragmentu restrykcyjnego XbaIKpnI do wektora pRPA - NP5 zawierającego fuzję peptyd sygnałowy PG1 - heliomycyna w wektorze pILTAB 357 strawionym tymi samymi enzymami. Powstały klon zawiera, więc kasetę ekspresyjną promotor CsVMV - peptyd sygnałowy PG1 - heliomycyna - terminator Nos (SEK NR ID 20).

Przykład IV-3. Wytworzenie transformowanego tytoniu

3.1- Transformacja

Wektory pRPA-RD-241 i pRPA-RD-NP6 wprowadzono do szczepu Agrobacterium tumefaciens EHA101 lub EHA105 (Hood i wsp., 1987) niosącego kosmid pTVK291 (Komari i wsp., 1986). Technika transformacji jest oparta na procedurze Horsch i wsp. (1985).

3.2- Regeneracja

Regenerację tytoniu PBD6 (pochodzącego od SEITA, Francja) z eksplantów liści przeprowadzano w pożywce Murashige i Skoog (MS) zawierającej 30 g/l sacharozy jak i 200 μg/ml kanamycyny. Eksplanty liściowe pobierano z roślin hodowanych w szklarni lub in vitro i transformowano za pomocą techniki krążków liściowych (Horsch i wsp., 1985) w trzech kolejnych etapach: pierwszy obejmuje indukcję kiełków na pożywce uzupełnionej 30 g/l sacharozy zawierającej 0,05 mg/l kwasu naftylooctowego (ANA) i 2 mg/l benzyloaminopuryny (BAP) podczas 15 dni. Kiełki wytworzone w czasie tego etapu następnie rozwijano przez 10 dni za pomocą hodowli na pożywce MS z dodatkiem 30 g/l sacharozy, ale bez hormonu. Następnie pobrano rozwinięte kiełki i hodowano je w pożywce ukorzeniającej MS z zawartością połowy soli, witamin i cukrów i niezawierającej hormonu. Po około 15 dni ukorzenione siewki przenoszono do gleby.

3.3.-Analiza ekspresji heliomycyny w tytoniu transgenicznym

a) Wytwarzanie specyficznych przeciwciał poliklonalnych

Przeciwciała poliklonalne uzyskano przez immunizację królika natywną heliomycyną według zwykłych procedur Centrum Bioeksperymentów VALBEX (IUT A - Lyon I). Uzyskaną surowicę (15 ml) immunologicznie oczyszczono na kolumnie z Sefarozy 4B (Pharmacia odnośnik 17-0430-01). Złoże

PL 198 979 B1 sprzęgnięte było z heliomycyną tak by specyficznie wyselekcjonować immunoglobuliny rozpoznające te peptydy. Zebrane przeciwciała rozcieńczono końcowo w 6 ml glicyny (200 mM; pH 3), zobojętniono

M Tris pH 9,5, dializowano wobec 0,5 x PBS i przechowywano zamrożone w -20°C aż do użycia.

b) Immunodetekcja heliomycyny w transgenicznym tytoniu

Analizę ekspresji heliomycyny przeprowadzono na 8 roślinach transgenicznych dla konstruktu pRPA-NP6 jak również na dzikiej kontroli. Dobrze rozwinięte liście wysianego tytoniu rozdrabniano w temperaturze ciekłego azotu i ekstrahowano białka przez 1 godz. w 4°C w buforze 50 mM Tris-HCl, 1% PVP25, 0,05% Tritonx100, pH 7,5 używając 4 ml buforu na gram świeżej masy. Po wirowaniu stężenie białek w supernatancie oznaczono metodą Bradford.

Pięć mikrogramów białka z każdego z 9 ekstraktów deponowano na błonie nitrocelulozy w formacie „slot-blot jak i ilość 50 ng czystej heliomycyny, które służą jako kontrola dodatnia. Błonę inkubowano podczas 1 godz. w 1% buforze blokującym (Boehringer, odnośnik 1 921 673) w TBS, następnie inkubowano przez noc w 4°C z immunooczyszczonymi przeciwciałami skierowanymi przeciw heliomycynie rozcieńczonymi 1/2000 w buforze TBS z 0,05% Tween20. Po płukaniu (TBS, 0,1 Tween20 i 0,5% bufor blokujący), błonę inkubowano przez 1 godz., w temperaturze pokojowej (TBS z 0,5% buforem blokującym) z przeciwciałem kozy (rozcieńczonym 1/50000) skierowanym specyficznie przeciw immunoglobulinom królika i sprzęgniętym z fosfatazą alkaliczną (SIGMA A-3687). Po płukaniu (TBS, 0,1% Tween20) prowadzono detekcję przez dodanie substratu fosfatazy (BioRad, odnośnik 170-5012) i uzyskano detekcję przez radiografię luminescencyjnego produktu na kliszy Amersham (ECL).

Wynik tego doświadczenia pokazuje, że 4 rośliny tytoniu transgenicznego silnie wyrażają heliomycynę. Sygnał w innych roślinach transgenicznych dla najlepszej rośliny jest na poziomie kontroli dodatniej (50 ng heliomycyny), co wskazuje, że w tej roślinie heliomycyna stanowi wagowo 1% całkowitych białek.

P r z y k ł a d V-1: emulgowalne koncentraty

Przykład CE1:

- składnik czynny 400 g/l

- zasadowy sulfonian dodecylobenzenu 24 g/l

- nonylofenol oksyloetylowany z 10 cząsteczkami tlenku etylenu 16 g/l

- cykloheksanon 200 g/l

- rozpuszczalnik aromatyczny q.s.p. 1 litr

P r z y k ł a d CE2

- składnik czynny 250 g

- epoksydowany olej roślinny 25 g

- mieszanina sulfonianiu alkoiloarylu i eteru poliglikolu i alkoholi tłuszczowych 100 g

- dianhydroformamid 50 g

- ksylen 575 g

P r z y k ł a d V-2: stężona zawiesina

Przykład SC1

- składnik czynny 500 g

- fosforan polietoksylowanego tristyrofenolu 50 g

- alkilofenol polietoksylowany 50 g

- polikarboksylan sodu 20 g

- glikol etylenu 50 g

- olej organopolisiloksanowy (przeciw pienieniu) 1 g

- polisacharyd 1,5 g

- woda 316,5 g

P r z y k ł a d V-3: proszki zwilżalne (lub proszki do rozpylania) P r z y k ł a d PM1:

- składnik czynny 50%

- alkohol tłuszczowy etoksylowany 2,5%

- fenyloetylofenol etoksylowany (czynnik dyspergujący) 5%

- kreda (obojętny nośnik) 42,5%

PL 198 979 B1

P r z y k ł a d PM2:

- składnik czynny 10%

- alkohol syntetyczny oksy typu rozgałęzionego etoksylowany C13 od 8 do 10 tlenkami etylenu (czynnik zwilżający) 0,75%

- lignosulfonian obojętnego wapnia (czynnik dyspergujący) 12%

- węglan wapnia (wypełniacz obojętny) q.s.p. 100%

P r z y k ł a d PM3:

- składnik czynny 75%

- czynnik zwilżający 1,50%

- czynnik dyspergujący 8%

- węglan wapnia (wypełniacz obojętny) q.s.p. 100%

P r z y k ł a d PM4:

- składnik czynny 90%

- alkohol tłuszczowy etoksylowany (czynnik zwilżający) 4%

- fenyloetylofenol etoksylowany (czynnik dyspergujący) 6%

P r z y k ł a d PM5:

- składnik czynny 50%

- mieszanina składników powierzchniowo czynnych anionowych i niejonowych (czynnik zwilżający) 2,5%

- lignosulfonian sodu (czynnik dyspergujący) 5%

- glinka kaolinowa (obojętny nośnik) 42,5%

P r z y k ł a d V-4: dyspergowalne granulki

P r z y k ł a d GD1

W mikserze miesza się 90% wagowo składnika czynnego i 10% mocznika w perełkach. Mieszaninę następnie rozdrabniano w młynie do mieszania. Uzyskano proszek, który zwilżano około 8% wagowo wodą. Wilgotny proszek wyciskano wyciskarką z dziurkowanym walcem. Uzyskano granulat, który suszono, następnie rozbijano i przesiewano, tak by zatrzymać tylko granulki o wielkości między 150 i 2000 mikronów.

P r z y k ł a d GD2

W mikserze miesza się następujące składniki:

- składnik czynny 75%

- czynnik zwilżający (sulfonian alkilonaftalenu sodu) 2%

- czynnik dyspergujący (sulfonian polinaftalenu sodu) 8%

- obojętny ładunek nierozpuszczalny w wodzie (kaolin) 15%

Mieszankę tę granulowano w płynnym podłożu w obecności wody, następnie suszono, rozbijano i przesiewano, tak by zatrzymać tylko granulki o wielkości między 0,15 i 0,80 mm.

P r z y k ł a d V-5: kompozycje farmaceutyczne

P r z y k ł a d A: drażetki

Przygotowuje się za pomocą zwykłych technik drażetki o dawkach od 50 mg aktywnego peptydu o następującym składzie:

- peptyd heliomycyny M1 50 mg

- skrobia 60 mg

- laktoza 50 mg

- stearynian magnezu 2 mg

P r z y k ł a d B: roztwór do iniekcji

Przygotowuje się roztwór do iniekcji zawierający 20 mg peptydu czynnego mający następujący skład:

- peptyd heliomycyny M2 22,4 mg

- woda destylowana

q.s.p. 2 cm³

PL 198 979 B1

P r z y k ł a d VI. Stabilność aktywności heliomycyny

Stabilność aktywności przeciw mikroorganizmom czynnego peptydu w odniesieniu do proteaz roślin jest niezbędnym czynnikiem do uzyskania dobrego poziomu ekspresji, a więc odporności na fitopatogeny u roślin transgenicznych. Ta stabilność jest na przykład krytycznym punktem dla peptydu z owada, takiego jak cekropina B działającego przeciw mikroorganizmom (Owens i Heutte, 1997, MPMI tom 10, nr 4, str. 525-528). Badaliśmy stabilność heliomycyny i jej aktywność u testowego patogenu (Botrytis cinerea) po inkubacji z surowymi wyciągami 8 głównych roślin uprawnych (kukurydza, pszenica, żyto, rzepak, soja, słonecznik, pomidor i tytoń).

Liście tych 8 gatunków rozdrobniono w niskiej temperaturze (ciekły azot) w moździerzu, a następnie proszek zawieszono w tej samej objętości wody. Po wirowaniu (10000 g przez 30 minut) odzyskano supernatant i określono stężenie białka. To stężenie doprowadzono dla 8 wyciągów do 1 mg/ml przez rozcieńczenie wodą, następnie wyciągi przesączono sterylnie (0,2 mikrony). Sto mikrolitrów każdego wyciągu (jak i kontrolę z samą wodą) następnie dodano do 50 mikrolitrów roztworu heliomycyny (zawierającego 15 mikrogramów, jak i kontrolę bez peptydu) w wodzie. Mieszaniny te inkubowano w 30°C, pobierając próbki po 20 mikrolitrów po 0 godz., 1 godz., 2 godz., 4 godz. i 20 godz., natychmiast zamrażając je do momentu przeprowadzenia testu.

Test aktywności przeciwgrzybowej przeprowadzono w 25°C w mikropłytkach dodając każdą próbkę do 80 mikrolitrów świeżej zawiesiny spór Botrytis cinerea (10000 spor/ml w roztworze Potato Dextrose Broth (Difco, 12 g/l). Wizualny odczyt wyników po 12 godz. i 24 godz. wykazuje, że nie ma żadnej znaczącej straty aktywności przeciwgrzybowej heliomycyny, nawet dla próbki inkubowanej przez 20 godz. w 30°C, które to zmiana aktywności związana by była z ekspozycją na surowy wyciąg z kukurydzy, pszenicy, żyta, rzepaku, soi, słonecznika, pomidora lub tytoniu. Ten wynik wskazuje na bardzo dużą stabilność heliomycyny w stosunku do proteaz roślin, i że na aktywność przeciwgrzybową testowaną na Botrytis cinerea nie wpływa obecność surowych wyciągów roślin.

P r z y k ł a d VII: Uzyskanie różnych mutantów heliomycyny: mutantów pojedynczych, podwójnych, potrójnych i poczwórnych

Mutanty podane poniżej przygotowano za pomocą sposobu opisanego w przykładzie II zastępując pewne z oligonukleotydów 1 do 6 przez inne oligonukleotydy wybrane tak by wprowadzić mutacje.

- heliomycyna R48: zastąpienie aminokwasu Glu48 sekwencji NR ID: 1 przez zasadowy aminokwas, w szczególności arginine (Arg48). Przez analogię z sekwencją kodującą heliomycynę sekwencji SEK NR ID: 1, kodon GAA kodujący Glu jest zastąpiony przez kodon AGA kodujący Arg. Oligonukleotydy 19 i 20 są używane do zastąpienia oligonukleotydów 5 i 6 przykładu II.

Oligo 19: 5'GATCCTTCGC TAACGTTAAC TGTTGGTGTA GAACCTGATA GG 3'

Oligo 20: 5'TCGACCTATC AGGTTCTACA CCAACAGTTA ACGTTAGCGA AG 3'

- heliomycyna L28L29: zastąpienie dwóch zasadowych aminokwasów Lys i Arg w pozycji 28 i 29 sekwencji NR ID: 1 przez dwa aminokwasy hydrofobowe, w szczególności dwa aminokwasy leucyny (Leu 28 i 29). Przez analogie z sekwencją kodującą heliomycynę sekwencji SEK NR ID: 1, część AAG-CGC kodująca resztę peptydową Lys-Arg jest zastąpiona przez sekwencję TTG-TTG kodującą resztę peptydową Leu-Leu. Oligonukleotydy 21 i 22 są stosowane, aby zastąpić Oligonukleotydy 3 i 3 przykładu II.

Oligo 21: 5' CTAGTGACTG CAACGGCGAG TGCTTGTTGC GC 3'

Oligo 22: 5' GCAACAAGCA CTCGCCGTTG CAGTCA 3'

- heliomycyna L28L29R48: zastąpienie dwóch zasadowych aminokwasów Lys i Arg w pozycji 28 i 29 sekwencji NR ID: 1 przez dwie reszty aminokwasów hydrofobowych, w szczególności dwie reszty aminokwasowe leucyny (Leu 28 i 29) i zastąpienie aminokwasu Glu48 sekwencji NR ID: 1 przez aminokwas argininę (Arg48). Oligonukleotydy 19 do 22 stosowano, aby zastąpić Oligonukleotydy 3 i 6 przykładu II.

- heliomycyna A24A25: zastąpienie dwóch aminokwasów Asn24 i Gly25 sekwencji NR ID: 1 przez dwa aminokwasy alaniny (Ala 24 i 25). Przez analogię z sekwencją kodującą heliomycynę sekwencji NR ID: 1, część AAC-GGC kodująca resztę peptydową Asn-Gly jest zastąpiona przez sekwencję GCT-GCT kodującą Ala-Ala. Oligonukleotydy 23 i 23 stosowano, aby zastąpić oligonukleotydy 3 i 4 przykładu II.

Oligo 23: 5' CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCAAGCGGC GC 3'

Oligo 24: 5' GCCGCTTGCA CTCAGCAGCG CAGTCA 3'

- heliomycyna A6A7A8A9: zastąpienie aminokwasów Asp6-Lys7-Leu8-Ile9 sekwencji NR ID: 1 przez cztery aminokwasy alaniny (Ala). Przez analogię z sekwencją kodującą heliomycynę sekwencji

PL 198 979 B1

NR ID: 1, część GAC-AAG-TTG-ATT kodująca resztę peptydową Asp-Lys-Leu-Ile jest zastąpiona przez sekwencję GCT-GCT-GCT-GCT kodującą resztę peptydową Ala-Ala-Ala-Ala. Oligonukleotydy i 26 stosowano, aby zastąpić oligonukleotyd 1 przykładu II i oligonukleotydy 27 i 28 aby zastąpić oligonukleotyd 2.

Oligo 25: 5' AGCTTGGATA AAAGAGCTGC TGCTGCTGGT AGCTGTGTTT 3'

Oligo 26: 5' GGGGGCGCCG TCAACTACA 3'

Oligo 27: 5' CTAGTGTAGT TGACGGCGCC CC 3'

Oligo 28: 5' AAACACAGCT ACCAGCAGCA GCAGCTCTTT TATCCA 3'

- heliomycyna A24A25L28L29: Potrzebne były dwa oligonukleotydy (sensowny i antysensowny) by obejść brak miejsca restrykcyjnego w sekwencji kodującej, między sekwencją kodującą resztę peptydową złożoną z dwóch aminokwasów Asn24-Gly25 i sekwencją kodującą resztę peptydową złożoną z dwóch aminokwasów Lys28- Arg29 heliomycyny sekwencji NR ID: 1. Dwie sekwencje oligonukleotydów 29 i 30 zastępują odpowiednio dwie sekwencje oligonukleotydów 3 i 4 przykładu II.

Oligo 29: 5' CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCTTGTTGC GC 3'

Oligo 30: 5' GCAACAAGCA CTCAGCAGCG CAGTCA 3'

Wytwarzanie zmutowanej heliomycyny na skalę półpreparatywną

Różne mutanty heliomycyny przygotowywano i oczyszczano w następujący sposób. Jeden z klonów drożdży transformowanych wyrażających zmutowaną heliomycynę hodowano w 29°C przez 48 godz. w 50 ml pożywki selekcyjnej. Tę hodowlę wstępną następnie użyto do zaszczepienia 2 l pożywki selekcyjnej i dalszą hodowlę prowadzono przez 48 godz. w 29°C. Drożdże usuwano przez wirowanie (4000 g, 30 min., 4°C). Supernatant zakwaszono do pH 3,5 kwasem octowym, poddano drugiemu wirowaniu (4000 g, 30 min, 4°C) przed pierwszym etapem ekstrakcji w fazie stałej.

- pierwszy etap ekstrakcji w fazie stałej na żelu fazy odwróconej: zakwaszony supernatant nakładano na nabój Sep-Pak Vac 35cc fazy odwróconej C 18 (Waters Associates) zrównoważony zakwaszoną wodą (0,05% TFA). Cząsteczki hydrofilowe usunięto przez płukanie zakwaszoną wodą a następnie 15% acetonitrylem przygotowanym w 0,05% TFA. Elucję peptydu przeprowadzono roztworem 60% acetonitrylu przygotowanego w 0,05% TFA. Frakcję eluowaną w 60% acetonitrylu liofilizowano a następnie rekonstytuowano w sterylnej ultraczystej wodzie przed poddaniem pierwszemu etapowi oczyszczania.

- drugi etap oczyszczania w fazie stałej na żelu - wymieniaczu kationów: frakcję 60% wstępnie oczyszczoną zawierającą zmutowaną heliomycynę rekonstytuowano w 25 mM roztworze octanu amonu pH 3,4. Tę próbkę nanoszono na nabój Sep-Pak Vac 35 cc CM wymieniacza kationów (Waters Associates, 10 g fazy) zrównoważony 25 mM octanem amonu, pH 3,4. Heliomycyna zmutowana, była eluowana stosując roztwór 1 M chlorku sodu (NaCl) przygotowany w 25 mM octanie amonu pH 3,4. Zbierano frakcję 1 M NaCl zawierającą zmutowaną heliomycynę, suszono pod próżnią, rekonstytuowano w 20 ml ultraczystej zakwaszonej wody (1% TFA). Heliomycynę następnie czyszczono za pomocą HPLC fazy odwróconej.

- ostatni etap oczyszczania za pomocą HPLC: zmutowaną heliomycynę oczyszczono do homogenności za pomocą preparatywnej chromatografii na kolumnie fazy odwróconej Aquapore RP-30 C8 (Brownlee™, 220 x 10 mm, 300A) stosując liniowy gradient acetonitrylu dwufazowy od 2% do 23% w 10 min i od 23% do 33% w 80 min w 0,05% TFA z przepływem ciągłym 2,5 ml/min. Zebraną frakcję suszono pod próżnią, rekonstytuowano ultraczystą wodą i analizowano spektrometrią masową MALDI, aby potwierdzić czystość i tożsamość. Różne zmutowane heliomycyny analizowano pod kątem ich aktywności przeciwgrzybowej w warunkach opisanych dla referencyjnej heliomycyny przeciw następującym szczepom: Neurospora crassa, Fusarium culmorum, i Nectria haematococca. Aktywność mutantów heliomycyny mierzono także przeciw bakteriom. Warunki eksperymentalne są opisane poniżej.

Test aktywności in vitro: pomiar aktywności przeciwgrzybowej za pomocą mikrospektrofotometrii

Metodologia ta była używana do określenia spektrum aktywności peptydu i do określania minimalnego stężenia hamującego (CMI), przy którym peptyd jest czynny. CMI wyrażano jako przedział stężeń [a] - [b] gdzie [a] jest stężeniem minimalnym, przy którym obserwuje się początek wzrostu a [b] stężeniem, dla którego w ogóle nie zaobserwowano wzrostu.

Przykłady aktywności specyficznej zmutowanej heliomycyny w stosunku do grzybów nitkowatych podano w Tabeli 3.

Aktywność przeciwbakteryjną wykrywano stosując test inhibicji wzrostu w pożywce płynnej.

Bakterie do badania umieszczano w zawiesinie w podłożu hodowlanym typu „Poor broth. Korzystnie stosuje się roztwór 1% baktotryptonu z dodatkiem 1% (masa/objętość) NaCl przygotowanego w wo20

PL 198 979 B1 dzie demineralizowanej. Nakłada się 10 μl każdej analizowanej frakcji na płytkach mikrotitracyjnych w obecności 90 μl pożywki zawierającej bakterie (w końcowym stężeniu odpowiadającym 1mOD przy

600 nm). Inkubację przeprowadzono w 25°C przez 12 do 24 godzin. Wzrost bakterii mierzono śledząc absorpcję w 600 nm stosując spektrofotometr z czytnikiem płytek mikrotitracyjnych.

- badane bakterie: Bacillus megatherium (kolekcja Instytutu Pasteura), Micrococcus luteus (kolekcja Instytutu Pasteura), Staphylococcus aureus (H. Monteil, Instytut Bakteriologii, Strasburg), Aerococcus viridians (H. Monteil, Instytut Bakteriologii, Strasburg) i Escherichia coli D22 (P.L. Bouguet, Centrum Badań Jądrowych, Saclay).

T a b e l a 3 aktywność pewnych zmutowanych heliomycyn przeciw grzybom nitkowatym i bakteriom

	L28L29	R48	L28L29R48	A6A7A8A9	Helio
Grzyby
Neurospora crassa	0,8-1,6	0,4-0,8	0,8-1,6	1,6-3,1	0,1=0,2
Fusarium culmorum	3,1-6,2	0,4-0,8	0,8-1,6	3,1-6,2	0,2-0,4
Nectria haematococca	3,1-6,2	0,4-0,8	0,8-1,6	ND	0,4-0,8
Bakterie
Bacillus megaterium	50-100	ND	ND	6,2-12,5	ND
Micrococcus luteus	12,5-25	25-50	ND	ND	ND
Staphylococcus aureus	ND	ND	ND	ND	ND
Aerococcus viridans	ND	ND	ND	12,5-25	ND
Escherichia coli D22	ND	ND	ND	ND	ND

ND: nie wykryto aktywności

P r z y k ł a d VIII: Badanie toksyczności ostrej

Grupie czterech samic myszy podawani dożylne iniekcje roztworów heliomycyny (SEK NR ID 2) w roztworze soli fizjologicznej w dawkach 1 i 10 mg/kg. Roztwory odpowiadające aprotyninie stosowano jako kontrole negatywne (bez efektów dla dwóch dawek), a melityny jako kontrole pozytywne (100% śmiertelności po 5 dniach przy 10 mg, efekty znaczące po 5 dniach przy 1 mg). Dla roztworów heliomycyny przy dwóch wstrzykiwanych dawkach nie wykazano żadnej toksyczności.

Literatura

Ausubel, F.A. i wsp. (red. Greene). Current Protocols in Molecular Biology. Publ. Wiley & Sons.

Bevan, M. i wsp. (1983) Nucl. Acids Res. 11:369-385.

Carrington i Freed (1990) J. Virol. 64:1590-1597.

Ehret-Sabatier i wsp. (1996) The Journal of Biological Chemistry, 271, 47, 29537-29544.

Horsch i wsp. (1985) Science 227:1229-1231.

Jefferson i wsp. (1987) EMBO J. 6:3901-3907.

Komari i wsp. (1986) J. Bacteriol. 166: 88-94.

Rothstein i wsp. (1981) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol, 45: 99-105.

Stalker i wsp.(1988) J. Biol. Chem. 263:6310-6314.

Odell, J.T. i wsp.(1985) Nature 313:810-812.

PL 198 979 B1

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i.) ZGŁASZAJĄCY: Rhone-Poulenc Agrochemie (A) ADRESAT: Rhone-Poulenc Agrochemie (B) ULICA: 14-20 Rue Pierre Baizet (C) MIASTO: Lyon (D) KRAJ: Francja (F) KOD POCZTOWY: 69009 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Gen kodujący hel iomycynę i jego zastosowanie (iii) LICZBA SEKWENCJI: 38 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patent Release #1.0, Wersja #1.30 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 147 zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWĄ/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..147 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1:

AGC TTG GAT AAA

AGA GAC AAG TTG ATT GGC AGC TGT GTT TGG GGC GCC

49

Ser 1

Leu Asp Lys

Arg 5

Asp Lys

Leu Ile

Gly 10

Ser

Cys

Val

Trp

Gly 15

Ala

GTC

AAC

TAC

ACT

AGT

GAC

TGC

AAC

GGC

GAG

TGC

AAG

CGC

CGC

GGT

TAC

96

Val

Asn

Tyr

Thr

Ser

Asp

Cys

Asn

Gly

Glu

Cys

Lys

Arg

Arg

Gly

Tyr

20

25

30

AAG

GGT

GGC

CAT

TGT

GGA

TCC

TTC

GCT

AAC

GTT

AAC

TGT

TGG

TGT

GAA

144

Lys

Gly

Gly

His

Cys

Gly

Ser

Phe

Ala

Asn

Val

Asn

Cys

Trp

Cys

Glu'

35

40

45

ACC 147

Thr (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 2 :

PL 198 979 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 169 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..132 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2

GAT AAG Asp Lys 1

CTT ATC GGT Leu Ile Gly 5

TCC Ser

TGC GTG TGG Cys Val Trp

GGT GCT GTG AAC TAC ACT TCC

48

Gly 10

Ala

Val

Asn

Tyr

Thr 15

Ser

GAT

TGC

AAC

GGT

GAG

TGC

AAG

AGG

AGG

GGT

TAC

AAG

GGT

GGT

CAC

TGC

96

Asp

Cys

Asn

Gly

Glu

Cys

Lys

Arg

Arg

Gly

Tyr

Lys

Gly

Gly

His

Cys

30

GGT TCC TTC GCT AAC GTG AAC TGC TGG TGC GAG ACT TGAGAGCTCG 142

Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr

40

GCGAGGCGAA CGTGTCGACG GATCCGG 169 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 3 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 261 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 3..224 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3

CC ATG GGT TTC GTG CTT TTC TCT CAG CTT CCA TCT TTC CTT CTT GTG 47

Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gin Leu Pro Ser Phe Leu Leu Val ¹⁵ 10 15

TCT ACT CTT CTT Ser Thr Leu Leu

CTT Leu 20

TTC CTT Phe Leu

GTG ATC TCT CAC

TCT TGC CGT GCC GAT

95

Val

Ile

Ser 25

His

Ser

Cys

Arg Ala 30

Asp

AAG

CTT

ATC

GGT

TCC

TGC

GTG

TGG

GGT

GCT

GTG

AAC

TAC

ACT

TCC

GAT

143

Lys

Leu

Ile

Gly

Ser

Cys

Val

Trp

Gly

Ala

Val

Asn

Tyr

Thr

Ser

Asp

35

40

45

PL 198 979 B1

TGC	AAC	GGT	GAG	TGC	AAG	AGG	AGG	GGT	TAC	AAG
Cys	Asn	Gly 50	Glu	Cys	Lys	Arg	Arg 55	Gly	Tyr	Lys
TCC	TTC	GCT	AAC	GTG	AAC	TGC	TGG	TGC	GAG	ACT
Ser	Phe 65	Ala	Asn	Val	Asn	Cys 70	Trp	Cys	Glu	Thr

CGTGTCGACG GATCCGG

GGT GGT CAC TGC GGT 191

Gly Gly His Cys Gly

TGAGAGCTCG GCGAGGCGAA 244 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 4 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 120 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 12..101 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4 :

GCGTCGACGC G ATG GGT TTC GTG CTT TTC TCT CAG CTT CCA TCT TTC CTT Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gin Leu Pro Ser Phe Leu

5 10

CTT GTG TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His 15 20 25

GCT GGAGACGCGA ATTCACACA Ala

TCT TGC CGT 98

Ser Cys Arg

129 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 5 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 75 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 7 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5 :

GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA 6 0

CTCTTCTTCT TTTCC 75

PL 198 979 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 6 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 72 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 8 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6 TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA GAAGAGTAGA CACAAGAAGG 60

AAAGATGGAA GC ₇₂ (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 7 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 80 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 9 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7 :

GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTGTGGGGT GCTGTGAACT ACACTTCCGA TTGCAACGGT 60

GAGTGCAAGA GGAGGGGTTA gg (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 8 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 109 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 10” (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8 :

CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCTCAAGT CTCGCACCAG CAGTTCAC^T 6 0

TAGCGAAGGA ACCGCAGTGA CCACCCTTGT AACCCCTCCT CTTGCACTC 109 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 9 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 85 par zasad

PL 198 979 B1 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /deso =oligonukleotyd syntetyczny 11 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 9 :

AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 10 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 66 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 12 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 10 :

CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC 60

TAGAGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 11 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 93 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 13 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 11 :

CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 12 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 93 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

PL 198 979 B1 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 14 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 12 :

CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC

GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 13 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 50 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy . (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 15 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 13 :

GGTCTAGAAT GGCCTGCACC AACAACGCCA TGAGGGCCCT CTTCCTCCTC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 14 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 50 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 16 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 14 :

CCGAATTCGG CGCCGTGCAC GATGCAGAAG AGCACGAGGA GGAAGAGGGC 50 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 15 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 81 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 1..73 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 15

PL 198 979 B1

TCTAGA ATG GCC TGC ACC AAC AAC GCC ATG AGG GCC CTC TTC CTC CTC Met Ala Cys Thr Asn Asn Ala Met Arg Ala Leu Phe Cys Ile

CTG CTC TTC TGC ATC GTG CAC GGC GCCGAATTC Val Leu Phe Cys Ile Val His Gly (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 16 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 17 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 16 :

GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTG 24 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 17 ;

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 18 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 17 :

GGCTCGAGTC AAGTCTCGCA CCAGCAGTTC AC 32 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 18 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 213 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 7..205 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 18 :

TCTAGA ATG GCC TGC ACC AAC AAC GCC ATG AGG GCC CTC TTC CTC CTC 48

PL 198 979 B1

Met Ala Cys Thr Asn Asn Ala Met Arg Ala Leu Phe Cys Ile ¹⁵ 10

CTG CTC TTC TGC ATC GTG CAC GGC GAT AAG CTT ATC GGT TCC TGC GTG

Leu Phe Cys Ile Val His Gly Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val ^{15 20} 25 ₃₀

Trn ^{TAC ACT TCC GAT TGC GGT GAG TGC} AAG AGG

Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg ³⁵ 40 4s

AGG GGT TAC AAG GGT GGT CAC TGC GGT TCC TTC GCT AAC GTG AAC TGC rg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys ⁵⁰ SS ₆₀

TGG TGC GAG ACT TGACTCGAG

Trp Cys Glu Thr 65 (ii) (ix)

INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 19 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 838 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójne (D) TOPOLOGIA: liniowa RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: promotory CsVMV (B) POŁOŻENIE: 7..532 CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: miejsce klonowania (B) POŁOŻENIE: 533..568 / 4 .r \ /~<τπ\ mwmr^rwr η V ΧΛ ) υπΛΛΛΐ\ιΐΰΓ\ιοι ir\n, (A) NAZWA/KLUCZ: terminator (B) POŁOŻENIE: 569..832 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 19 (ix)

AAGCTTCCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAAGATA AGGTCGGTGA ACACATGTAA GGTGGAAAAT GTAAGGGCGG AAAGTAACCT CCCCACTACT TATCCTTTTA TATTTTTCCG TGTCATTTTT

ATCCAATGTT

ATATGCGGCA

TACTGCCAGA

AGAATCTTGA

TTGTGAAAGA

TATCACAAAG

GCCCTTGAGT

TACGGGAAAA

CATATGCAAC

ATACGAAGAA

AGACGTAAGC

GACATAGAGG

GAATCTTATC

TTTCCTATAT

120

180

240

300

360

420

PL 198 979 B1

AAGGAACCAA GTTCGGCATT TGTGAAAACA AGAAAAAATT TGGTGTAAGC TATTTTCTTT 480

GAAGTACTGA GGATACAACT TCAGAGAAAT TTGTAAGTTT GTAGATCTCG ATTCTAGAAG 540

GCCTGAATTC GAGCTCGGTA CCGGATCCAA TTCCCGATCG TTCAAACATT TGGCAATAAA 600

GTTTCTTAAG ATTGAATCCT GTTGCCGGTC TTGCGATGAT TATCATATAA TTTCTGTTGA 660

ATTACGTTAA GCATGTAATA ATTAACATGT AATGCATGAC GTTATTTATG AGATGGGTTT 720

TTATGATTAG AGTCCCGCAA TTATACATTT AATACGCGAT AGAAAACAAA ATATAGCGCG 780

CAAACTAGGA TAAATTATCG CGCGCGGTGT CATCTATGTT ACTAGATCGG GGATCGAT 838 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 20 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1036 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: promotory CsVMV (B) POŁOŻENIE: 7..532 (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: miejsce klonowania (B) POŁOŻENIE: 539..736 (ix) CHARAKTERYSTYKA:

(A) NAZWA/KLUCZ: terminator (B) POŁOŻENIE: 767..1030 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 20 :

AAGCTTCCAG	AAGGTAATTA	TCCAAGATGT	AGCATCAAGA	ATCCAATGTT	TACGGGAAAA	60
ACTATGGAAG	TATTATGTGA	GCTCAGCAAG	AAGCAGATCA	ATATGCGGCA	CATATGCAAC	120
CTATGTTCAA	AAATGAAGAA	TGTACAGATA	CAAGATCCTA	TACTGCCAGA	ATACGAAGAA	180
GAATACGTAG	AAATTGAAAA	AGAAGAACCA	GGCGAAGAAA	AGAATCTTGA	AGACGTAAGC	240
ACTGACGACA	ACAATGAAAA	GAAGAAGATA	AGGTCGGTGA	TTGTGAAAGA	GACATAGAGG	300
ACACATGTAA	GGTGGAAAAT	GTAAGGGCGG	AAAGTAACCT	TATCACAAAG	GAATCTTATC	360
CCCCACTACT	TATCCTTTTA	TATTTTTCCG	TGTCATTTTT	GCCCTTGAGT	TTTCCTATAT	420
AAGGAACCAA	GTTCGGCATT	TGTGAAAACA	AGAAAAAATT	TGGTGTAAGC	TATTTTCTTT	480
GAAGTACTGA	GGATACAACT	TCAGAGAAAT	TTGTAAGTTT	GTAGATCTCG	ATTCTAGA	538

PL 198 979 B1

ATG

GCC

TGC

ACC

AAC

AAC

GCC

ATG

AGG

GCC

CTC

TTC

CTC

CTC

GTG

CTC

Met 1

Ala

Cys

Thr

Asn 5

Asn

Ala

Met

Arg

Ala 10

Leu

Phe

Leu

Leu

Val 15

Leu

TTC

TGC

ATC

GTG

CAC

GGC

GAT

AAG

CTT

ATC

GGT

TCC

TGC

GTG

TGG

GGT

Phe

Cys

Ile

Val 20

His

Gly

Asp

Lys

Leu 25

Ile

Gly

Ser

Cys

val 30

Trp

Gly

GCT

GTG

AAC

TAC

ACT

TCC

GAT

TGC

AAC

GGT

GAG

TGC

AAG

AGG

AGG

GGT

Ala

Val

Asn 35

Tyr

Thr

Ser

Asp

Cys 40

Asn

Gly

Glu

Cys

Lys 45

Arg

Arg

Gly

TAC

AAG

GGT

GGT

CAC

TGC

GGT

TCC

TTC

GCT

AAC

GTG

AAC

TGC

TGG

TGC

Tyr

Lys 50

Gly

Gly

His

Cys

Gly 55

Ser

Phe

Ala

Asn

Val 60

Asn

Cys

Trp

Cys

GAG ACT TGACTCGAGG GGGGGCCCGG TACCGGATCC AATTCCCGAT CGTTCAAACA Glu Thr

TTTGGCAATA AAGTTTCTTA AGATTGAATC CTGTTGCCGG TCTTGCGATG ATTATCATAT AATTTCTGTT GAATTACGTT AAGCATGTAA TAATTAACAT GTAATGCATG ACGTTATTTA TGAGATGGGT TTTTATGATT AGAGTCCCGC AATTATACAT TTAATACGCG ATAGAAAACA AAATATAGCG CGCAAACTAG GATAAATTAT CGCGCGCGGT GTCATCTATG TTACTAGATC GGGGATCGAT

846

906

966

1025

1036 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 21 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 52 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa ( 7 7 ) Ϊ3Γ$Π7 Δ 7 . 2____ , - - .

, —> inny Kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 1' (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 21 :

AGCTTGGATA AAAGAGACAA GTTGATTGGC AGCTGTGTTT GGGGCGCCGT CA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 22 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 56 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 2

PL 198 979 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 22 : agtgtagttg acggcgcgcc aaacacagct gccaatcaac ttgtctcttt taicca (2) informacja dla identyfikatora

SEKWENCJI NR: 23 · charak_TERYst_YKA SEKWENCJI·

B ^{52 ZaSad}

P _λξϊ^Ρ· nukleinowy ( ) NICIOWOŚC: pojedyncza (D) TOPOLOGIA· linieć (ϋ) Rodzaj cząsteczki ? , (A) OPIS: /desc =oi ^nukleinowy (-) OPIS SEKWENCJI: IDENT??^^^^^: ³‘ (i)

ACTACACTAG TGACTGCAAC GGCGAGTGCA AGCGCCGCGG TTACAAGGGT

GG

12) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 24 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 52 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZASTECZWT· )nn„ i (A) ηρτς· /a ' ^lnny )°⁷³³ nukleinowy

W OPIS SEKWENCJn ΪοΕΝ^ΙΜΟρ'3ΕΚ^7|ΓΪ ''

CACAATGGCC ACCCTTGTAA CCGCGGCGCT TGCACTCGCC GTTGCAGTCA CT

NR: 25 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 56 par zasad (B) TYP; kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

Z^ZOPIS^CZA/^SJ^ECZKI; ^lMy nukleinowy ^(xl) opis sekwencji'· ΪεεντΓει^τ^^^^^ΙΓΪ

CCATTGTGGA TCCTTCGCTA ACGTTAACTG TTGGTGTGAA ACCTGATAGG TCGACA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 26 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 56 par zasad (B) TYP; kwas nukleinowy

PL 198 979 B1 (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (11) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS; /desc = oligonukleotyd syntetyczny 6 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 26: GATCTGTCGA CCTATCAGGT TTCACACCAA CAGTTAACGT TAGCGAAGGA TC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 27 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 19 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 27 : GATCCTTCGC TAACGTTAAC TGTTGGTGTA GAACCTGATA GG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 28 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 par zasad (B) TYP; kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 20 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 28 :

TCGACCTATC AGGTTCTACA CCAACAGTTA ACGTTAGCGA AG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 29 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 21 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 29 :

CTAGTGACTG CAACGGCGAG TGCTTGTTGC GC

PL 198 979 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 30 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy , (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 22 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 30 :

GCAACAAGCA CTCGCCGTTG CAGTCA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 31 :

' (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 23 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 31 : CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCAAGCGGC GC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 32 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 24 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 32 :

GCCGCTTGCA CTCAGCAGCG CAGTCA ₂₆ (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 33 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

PL 198 979 B1 (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 25 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 33 :

AGCTTGGATA AAAGAGCTGC TGCTGCTGGT AGCTGTGTTT 40 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 34 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 26 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 34 :

GGGGCGCCGT CAACTACA 11 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 35 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 27 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 35 :

CTAGTGTAGT TGACGGCGCC CC 22

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 37 :

PL 198 979 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 29 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW, NR: 37 :

CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCTTGTTGC GC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 38 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc =oligonukleotyd syntetyczny 30 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 38 :

GCAACAAGCA CTCAGCAGCG CAGTCA 26

Claims (41)

1. Peptyd obejmujący sekwencję o wzorze (I):

Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag (I), w której:

Xaa oznacza -NH2 lub resztę peptydową obejmującą od 1 do 10 aminokwasów, korzystnie 1 do 6 aminokwasów, obejmują cych co najmniej jeden aminokwas zasadowy, odpowiadają c ą sekwencji peptydowej Xaa'-Gly-Xaa- w której Xaa' oznacza NH2 lub resztę peptydową obejmującą 1 do 9 aminokwasów, i Xaa'' oznacza resztę peptydową obejmującą jeden aminokwas wybrany z Leu, Ile, Val, Pro, Ser lub Thr,

Xab oznacza resztę peptydową obejmującą 10 aminokwasów,

Xac oznacza resztę peptydową 3 aminokwasów obejmujących co najmniej jedną kwaśną resztę aminokwasową,

Xad oznacza sekwencję peptydową -Lys-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Gly-His,

Xae oznacza sekwencję peptydową -Gly-Xae'-Asn-, w której Xae' oznacza resztę peptydową obejmującą 5 aminokwasów,

Xaf oznacza tryptofan, i

Xag oznacza -OH lub resztę peptydową złożoną z 1 do 2 aminokwasów.

2. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że aminokwasy zasadowe są wybrane spośród lizyny, argininy lub homoargininy.

3. Peptyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że

Xac oznacza następującą sekwencję peptydową: -Asn-Xac'-Xac- w której Xac' oznacza resztę peptydu z 1 aminokwasem, a Xac oznacza resztę peptydu z 1 kwaśnym aminokwasem.

4. Peptyd według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że aminokwasy kwaśne są wybrane spośród kwasu glutaminowego (Glu) i kwasu asparaginowego (Asp).

5. Peptyd według jednego z zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że Xac oznacza następującą sekwencję peptydową -Asn-Gly-Glu-.

6. Peptyd według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że Xab oznacza następującą sekwencję peptydową -Val-Xab'-Asp-, w której Xab' oznacza resztę peptydową obejmującą 8 aminokwasów, i/lub Xag oznacza następującą sekwencję peptydową -Glu-Xag', w której Xag' oznacza OH lub zmienną resztę o sekwencji obejmującej 1 aminokwas.

7. Peptyd według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że Xaa oznacza następującą sekwencję peptydową NH2-Asp-Lys-Leu-Ile-Gly-Ser i/lub Xab oznacza następującą sekwencję peptydo36

PL 198 979 B1 wą -Val-Trp-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Thr-Ser-Asp-, i/lub Xae oznacza następującą sekwencję peptydową Gly-Ser-Phe-Ala-Asn-Val-Asn-, i/lub Xag oznacza następującą sekwencję peptydową -Glu-Thr-OH.

8. Peptyd według jednego z zastrz. 1 do 7, którego sekwencją jest przedstawiona na Identyfikatorze sekwencji Nr 2 (SEK NR ID 2).

9. Peptyd według jednego z zastrz. 1 do 8, znamienny tym, że obejmuje na jednym lub drugim lub na obu końcach reszty peptydowe potrzebne dla jego ekspresji i docelowego kierowania w organizmie gospodarza.

10. Peptyd według jednego z zastrz. 1 do 9, znamienny tym, że reszty peptydowe peptydu o wzorze (I) tworzą przynajmniej jeden wewnątrzcząsteczkowy mostek disiarczkowy.

11. Peptyd według zastrz. 10, znamienny tym, że obejmuje 3 mostki disiarczkowe utworzone między resztami cysteinowymi 1 i 4, 2 i 5, i 3 i 6.

12. Peptyd fuzyjny „peptyd-heliomycyna, obejmujący peptyd określony w zastrz. 1 i resztę peptydową, która może zostać odcięta przez system enzymatyczny komórki gospodarza, umożliwiając uwolnienie heliomycyny.

13. Peptyd fuzyjny według zastrz. 12, znamienny tym, że peptyd połączony z heliomycyną jest peptydem sygnałowym lub peptydem tranzytowym.

14. Peptyd fuzyjny według zastrz. 13, znamienny tym, że peptyd tranzytowy jest peptydem sygnałowym genu PR-1a tytoniu lub prekursorem czynnika Mat alfa 1 lub peptydem sygnałowym genu PG1 poligalakturonazy kukurydzy.

15. Peptyd fuzyjny według zastrz. 14, znamienny tym, że jest przedstawiony przez sekwencję w Identyfikatorze Sekwencji Nr 1 (SEK NR ID 1), w Identyfikatorze Sekwencji Nr 3 (SEK NR ID 3) lub w Identyfikatorze sekwencji Nr 18 (SEK NR ID 18).

16. Lek będący peptydem określonym w zastrz. 1 albo 12.

17. Kompozycja, znamienna tym, że obejmuje peptyd określony w zastrz. 1 albo 12 i odpowiedni nośnik.

18. Fragment kwasu nukleinowego, znamienny tym, że obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego kodującą peptyd określony w zastrz. 1 albo 12.

19. Fragment kwasu nukleinowego według zastrz. 18, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa jest typu DNA.

20. Fragment kwasu nukleinowego według zastrz. 19, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa typu DNA obejmuje sekwencję DNA opisaną przez zasady od 16 do 147 Identyfikatora Sekwencji Nr 1 (SEK NR ID 1), Identyfikatora Sekwencji Nr 2 (SEK NR ID 2), przez zasady 3 do 224 Identyfikatora Sekwencji Nr 3 (SEK NR ID 3) lub przez zasady 7 do 205 Identyfikatora Sekwencji Nr 18 (SEK NR ID 18), sekwencję homologiczną lub sekwencję komplementarną do tej sekwencji.

21. Gen chimerowy obejmujący sekwencję kodującą jak i heterologiczne elementy regulatorowe w pozycjach 5' i 3' zdolne do funkcjonowania w organizmie gospodarza, w szczególności roślinach, znamienny tym, że sekwencja kodująca obejmuje przynajmniej jeden fragment DNA określonego w zastrz. 18.

22. Gen chimerowy według zastrz. 21, znamienny tym, że organizm gospodarza jest mikroorganizmem.

23. Gen chimerowy według zastrz. 21, znamienny tym, że organizm gospodarza jest wybrany spośród komórek roślinnych i roślin.

24. Wektor do klonowania lub ekspresji przeznaczony do transformacji organizmu gospodarza, znamienny tym, że obejmuje przynajmniej jeden początek replikacji i przynajmniej jeden gen chimerowy określony w zastrz. 21.

25. Transformowany organizm gospodarza, znamienny tym, że zawiera fragment kwasu nukleinowego określony w zastrz. 18 lub gen chimerowy określony w zastrz. 21.

26. Transformowany organizm gospodarza według zastrz. 25, znamienny tym, że obejmuje mikroorganizmy, komórki roślinne lub rośliny.

27. Transformowany organizm gospodarza według zastrz. 25, znamienny tym, że jest rośliną obejmującą transformowane komórki.

28. Transformowany organizm gospodarza według zastrz. 27, znamienny tym, że roślina jest regenerowana z komórek transformowanych.

29. Transformowany organizm gospodarza według zastrz. 25, znamienny tym, że mikroorganizm jest wybrany z bakterii, w szczególności E. coli, drożdży, a zwłaszcza gatunków Saccharomyces lub Kluyveromyces, Pichia, grzybów, w szczególności Aspergillus lub bakulowirusów.

PL 198 979 B1

30. Transformowana komórka roślinna, znamienna tym, że obejmuje fragment kwasu nukleinowego określonego w zastrz. 18 lub gen chimerowy określony w zastrz. 21.

31. Transformowana roślina, znamienna tym, że obejmuje co najmniej jedną transformowaną komórkę roślinną określoną w zastrz. 30.

32. Transformowana roślina według zastrz. 31, znamienna tym, że jest odporna na choroby powodowane przez Cercospora, w szczególności Cercospora beticola, Cladosporium, w szczególności Cladosporium herbarum, Fusarium, a zwłaszcza Fusarium culmorum lub Fusarium graminearum, lub przez Phytophthora, w szczególności Phytophtora cinnamomi.

33. Transformowana roślina, znamienna tym, że pochodzi z hodowli i/lub krzyżowania rośliny określonej w zastrz. 31, i że zawiera fragment kwasu nukleinowego określonego w zastrz. 18 lub gen chimerowy określony w zastrz. 21.

34. Nasiona z transformowanej rośliny określonej w zastrz. 31 albo 33, zawierające fragment kwasu nukleinowego określonego w zastrz. 18 lub gen chimerowy określony w zastrz. 21.

35. Sposób transformacji organizmu gospodarza w szczególności komórek roślinnych lub roślin, znamienny tym, że do organizmu gospodarza wstawiony jest co najmniej jeden fragment kwasu nukleinowego określony w zastrz. 18 lub gen chimerowy określony w zastrz. 21.

36. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że organizmem gospodarza jest komórka roślinna lub roślina.

37. Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że roślina jest regenerowana z komórki roślinnej lub z transformowanej rośliny.

38. Sposób uprawy transformowanej rośliny określonej w zastrz. 31 albo 33, znamienny tym, że polega na wysianiu nasion transformowanych roślin na wydzielonej części pola odpowiedniego do ich uprawy, zastosowaniu na wydzieloną część pola kompozycji agrochemicznej nie wpływając w zasadniczy sposób na nasiona lub transformowane roś liny, a nast ę pnie zebranie wyhodowanych roślin, gdy uzyskają pożądaną dojrzałość i ewentualnie oddzielenie nasion od zebranych roślin.

39. Sposób uprawy według zastrz. 38, znamienny tym, że kompozycja agrochemiczna obejmuje co najmniej jeden aktywny produkt posiadający przynajmniej jedną aktywność grzybobójczą i/lub bakteriobójczą.

40. Sposób uprawy według zastrz. 39, znamienny tym, że aktywny produkt wykazuje aktywność komplementarną do aktywności peptydu określonego w zastrz. 1 albo 12.

41. Sposób wytwarzania peptydu - heliomycyny określonego w zastrz. 1 albo 12, znamienny tym, że obejmuje etapy hodowli transformowanego organizmu określonego w zastrz. 25 w odpowiednim podłożu hodowlanym, a następnie ekstrakcję i całkowite lub częściowe oczyszczenie otrzymanej heliomycyny.