CN1305526A

CN1305526A - 编码海利霉素的基因及其用途

Info

Publication number: CN1305526A
Application number: CN99807258A
Authority: CN
Inventors: M·朗贝蒂; P·布利特; G·L·布克哈特; J·霍夫曼
Original assignee: Rhone Poulenc Agro SA
Current assignee: Bayer CropScience SA
Priority date: 1998-04-15
Filing date: 1999-04-12
Publication date: 2001-07-25
Also published as: ATE366811T1; TR200002989T2; AR019066A1; CA2325658A1; HU225803B1; CZ297645B6; AU754856B2; EP1071767B1; NO20005173L; ZA200006567B; CZ20003785A3; FR2777568A1; PL345243A1; BR9909745A; EP1071767A1; WO1999053053A1; AU3152599A; DE69936514T2; DE69936514D1; PT1071767E

Abstract

本发明涉及海利霉素(heliomicine),编码海利霉素的DNA序列,用于转化宿主生物体的含有该DNA序列的载体和转化方法。本发明涉及作为药物的海利霉素,特别是用于治疗真菌感染的药物。更具体的是它涉及植物细胞和植物的转化,转化植物产生的海利霉素保证其对疾病,特别是真菌源性疾病的抵抗力。

Description

编码海利霉素的基因及其用途

本发明主题是一种新颖的富含半胱氨酸、称为海利霉素(Heliomicine)的肽，其作为药物的用途和含有它的组合物，一种编码该肽的DNA序列，一种含有它、用来转化宿主生物体的载体和转化所述生物体的方法。

本发明更具体的涉及植物细胞和植物的转化，受转化植物产生的，赋予植物对疾病、特别是真菌源性疾病抵抗力的海利霉素。

目前使植物产生对疾病，特别是对真菌疾病抵抗力需求在增长，来减少或甚至避免不得不使用抗真菌保护产品处理植物，以保护环境。提高对疾病这种抵抗力的一种方法是转化植物，使它们产生能抵抗这些疾病提供防卫能力的物质。

在人类健康领域，存在机会性真菌感染，对于它现在还没有真正有效的治疗手段。具体说，某些严重感染霉菌病的情况发生在移植、化疗或HIV感染后免疫系统受到抑制的住院病人中。和抗菌剂武库相比较，目前的抗真菌剂范围非常有限。因此确实存在特性鉴定和开发新类型抗真菌物质的需要。

已知道不同天然来源的物质，具体是肽显示了杀菌或杀真菌性能，具体是针对引起植物疾病的真菌。然而，第一个问题在于不断寻找不仅能由转化的植物产生，而且仍能保存其杀菌或杀真菌性能并将这些性能赋予所述植物的物质。对于本发明的目的，应理解杀菌或杀真菌是指实际的杀菌或杀真菌性能和抑菌或抑真菌性能。

还已知富含半胱氨酸的肽显示了杀菌或抑菌活性，但不显示杀真菌或抑真菌活性。另一个问题存在于寻找一种与本领域陈述的肽相比，显示高杀真菌或抑真菌活性的富含半胱氨酸的肽。

海利霉素是从鳞翅目烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的血淋巴中分离的一种肽，它显示了针对引起植物疾病的真菌和引起人或动物病理过程的真菌的杀真菌活性。在首次合成了海利霉素的基因后，还发现可将它插入一种宿主生物体，如酵母或植物，从而表达海利霉素并产生纯化或非纯化的海利霉素，或赋予所述宿主生物体对真菌疾病的抵抗力，因而提供了对上述问题特别优良的解决方法。

因此，本发明的主题首先是海利霉素，它作为药剂或在植物保护的农用化学中的用途，含有它的组合物，编码海利霉素的核酸片段，含有所述编码海利霉素的片段以及能在宿主生物体中(具体在酵母或植物中)起作用的5′和3′位异源调控元件的嵌合基因，和含有该嵌合基因、用于转化宿主生物体的载体，和转化的宿主生物体。还涉及含有至少一条编码海利霉素的核酸片段的转化的植物细胞，和含有所述细胞对疾病有抵抗力的植物，具体是从该细胞再生的植物。最后，涉及转化植物使它们对疾病有抵抗力(通过插入一个合适的载体到编码海利霉素的基因中)的方法。最后，还涉及用转化的宿主生物体制备海利霉素的方法。

可理解本发明的海利霉素是指任何基本含下式(Ⅰ)肽序列的肽：Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag (Ⅰ)

其中：

Xaa是-NH₂，或含有1到10个氨基酸，优选1到6个氨基酸的肽残基，

Xab是含有1到10个氨基酸，优选10个氨基酸的肽残基，

Xac是3个氨基酸的肽残基，

Xad是含有1到9个氨基酸，优选9个氨基酸的肽残基，

Xae是含有1到7个氨基酸，优选7个氨基酸的肽残基，

Xaf是1个氨基酸的肽残基，和

Xag是-OH，或含有1到5个氨基酸，优选1或2个氨基酸的肽残基。

根据本发明的一个优选例，Xaa含有至少一个碱性氨基酸，和/或Xad含有至少一个碱性氨基酸。有利的，Xad含有1、2、3或4个碱性氨基酸。

有利的，Xad代表下列肽序列-Lys-Xad′-Xad″-Gly-His-，其中Xad′代表1个碱性氨基酸的肽残基而Xad″代表含有0到5个氨基酸，优选5个氨基酸的肽残基。

可理解本发明的碱性氨基酸更具体指选自赖氨酸、精氨酸或高精氨酸的氨基酸。

优选的，Xad代表下列肽序列-Lys-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Gly-His-或Leu-Leu-Arg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Gly-His-。

根据本发明的另一个优选例，Xac含有至少一个酸性氨基酸，优选一个酸性氨基酸。

优选的，Xac代表下列肽序列-Asn-Xac′-Xac″，其中Xac′代表1个氨基酸的肽残基，而Xac″代表1个酸性氨基酸的肽残基。

可理解本发明的酸性氨基酸是任何在侧链上含有有机酸功能的氨基酸，更具体是优选自谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)的羧酸氨基酸。

优选的，Xac代表下列肽序列-Asn-Gly-Glu-或Ala-Ala-Glu-。

有利的，Xaa代表下列肽序列Xaa′-Gly-Xaa″，其中Xaa′代表NH2或含有1到9个氨基酸，优选1到5个氨基酸的肽残基，而Xaa″代表含有至少一个氨基酸，优选自Leu、Ile、Val、Pro、Ser或Thr的肽残基，和/或

Xab代表下列肽序列-Val-Xab′-Asp-，其中Xab′代表含有0到8个氨基酸，优选8个氨基酸的肽残基，和/或

Xae代表下列肽序列-Gly-Xae′-Asn-，其中Xae′代表含有0到5个氨基酸，优选5个氨基酸的肽残基，和/或

Xaf代表下列氨基酸之一：-Trp-、Phe、Leu、Ile或Val和/或

Xag代表下列肽序列-Glu-Xag′，其中Xag′代表OH或具有含1到4个氨基酸，优选1个氨基酸的序列的可变残基。

根据本发明的一个更优选例，Xaa代表下列肽序列NH2-Asp-Lys-Leu-Ile-Gly-Ser-或NH2-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ser-，和/或Xab代表下列肽序列-Val-Trp-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Thr-Ser-Asp-，和/或Xae代表下列肽序列-Gly-Ser-Phe-Ala-Asn-Val-Asn-，和/或Xaf代表下列氨基酸-Trp-和/或Xag代表下列肽序列-Glu-Thr-OH或-Arg-Thr-OH。

根据本发明的更优选例，海利霉素是由SEQ ID NO:2(SEQ ID NO 2)编码序列代表的肽。描述了对应于SEQ ID NO:1(SEQ ID NO 1)的氨基酸6到49的具有不同编码序列的相同序列。

NH₂-末端残基可显示翻译后修饰，例如乙酰基化，同样C-末端残基可显示翻译后修饰，如酰胺化。

可理解含有通式(Ⅰ)的基本肽序列的肽序列不仅指上文限定的序列，还指在其两个末端的一端，或两端含有其在宿主生物体中表达和靶向所必需的肽残基的序列。可理解宿主生物体是指任何含有至少一个细胞的生物体，不论是微生物，具体说酵母或细菌，还是可另选的植物细胞或可另选的更高等生物体如植物。

这可以具体是“肽-海利霉素”融合肽，它可被宿主生物体的酶系统切断，使海利霉素释放，海利霉素如上定义。与海利霉素融合的多肽可以是信号肽或转运肽，使得在宿主生物体的某部分中(如细胞质、细胞膜或就植物而言在特定类型的细胞区室中或组织中或胞外基质中)以特定方式控制或定向海利霉素的产生。

根据一个实施例，转运肽可以是叶绿体或线粒体寻靶的信号，然后在叶绿体或线粒体中被切下。

根据本发明的另一个实施例，信号肽可以是N-末端信号或“前肽(prepeptide)”，可任选的和将蛋白保留在内质网中的信号联合，或是一种液泡寻靶的肽或“预肽(propeptide)”。内质网是通过“细胞机制”对所产生的蛋白进行加工操作，如信号肽的切开的部位。

转运肽可以是单个或两个，而且就该情况而言，可任选的由一中间序列分开，即在转录方向含有编码一质体定位酶的植物编码基因的转运肽的编码序列，编码质体定位酶的植物基因的N-末端成熟部分的一部分序列，然后是编码质体定位酶的植物基因的第二转运肽的编码序列，如在专利申请EP 0 508 909中所述。

作为本发明使用的转运肽，可能具体提到Cornelissen等描述的烟草PR-1α基因的信号肽，由SEQ ID NO:2的其编码序列代表(具体的，当由植物细胞或植物产生海利霉素时)或因子Matα1的前体(当海利霉素在酵母中产生时)。

具有位于因子MFα1预肽N末端位置的5个残基(Ser-Leu-Asp-Lys-Arg)的融合肽“MFα1/海利霉素”及其编码序列是本发明的一部分，具体由SEQ ID NO:1(SEQ ID NO 1)描述，对应于氨基酸1到49。

“PR-1α信号肽-海利霉素”融合肽及其编码序列也是本发明的一部分，具体描述于SEQ ID NO:3(SEQ ID NO 3)。

含有与海利霉素融合的玉米聚半乳糖苷酶PG1基因信号肽的融合蛋白“PG1信号肽/海利霉素”，由序列识别号18和20(SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 20)的编码序列代表。

根据本发明的一个优选例，式(Ⅰ)肽的半胱氨酸残基形成至少一个分子内二硫键，优选三个二硫键。根据本发明的一个优选例，在半胱氨酸残基1和4、2和5、以及3和6之间形成了二硫键。

海利霉素是对抗真菌和酵母菌特别活跃的一种肽，而且可用于预防性或治疗性保护各种生物体抵抗真菌侵袭。因此本发明涉及作为药剂的海利霉素。还涉及海利霉素对植物抗真菌侵袭的治疗用途，即直接将海利霉素施用于所述植物。

本发明还涉及含有海利霉素和合适载体的组合物。合适载体的首要质量是在组合物中基本不降解海利霉素，而且不降低海利霉素的杀菌性能和杀真菌性能。该组合物可以是化妆品组合物，就该情况而言，合适的载体是化妆品业可接受的(对皮肤或外骨骼施用是合适的)；或是用于治疗用途的药物组合物，就该情况而言，合适的载体是药物学可接受的载体，对口服或注射等局部途径给予海利霉素是合适的；或是另一种农用化学组合物，就该情况而言，合适的载体是农用化学可接受的，适合施用于植物或植物周围而不损伤它们。

本发明还涉及核酸片段，具体是天然或合成的、编码上文定义的海利霉素，包括上文定义的“肽-海利霉素”融合肽的DNA。根据本发明，它可以是合成或分离自鳞翅目夜蛾的片段，或是另一种衍生片段，适合于在表达该肽的宿主系统中表达海利霉素。按照标准的分离和纯化方法可获得该核酸片段，或者另外可按照合成寡核苷酸的连续杂交的习惯方法合成。Ausubel等具体描述了这些技术。

根据本发明，可理解核酸片段是指DNA或RNA类型的核苷酸序列，优选DNA类型，特别是双链。

根据本发明的一个实施例，编码海利霉素的核酸片段含有序列识别号：1(SEQ ID 1)的碱基16到147所述的DNA序列或序列识别号：2(SEQ ID NO 2)，具体是该序列对应于碱基1到132的编码部分，所述序列的同源序列或互补序列。

根据本发明的另一个实施例，编码“肽-海利霉素”融合肽的核酸片段含有SEQ ID NO:1(SEQ ID NO 1)描述的DNA序列或SEQ ID NO:3(SEQ ID NO 3)描述的序列，具体是对应于碱基3到224的编码部分，或SEQ ID NO:18(SEQ IDNO 18)所述的序列，具体是对应于碱基7到205的编码部分，所述序列的同源序列或互补序列。

可理解本发明的“同系物”是指与SEQ ID NO:1、2或3所述的核苷酸序列相比较，显示有一或多个序列修饰并编码海利霉素或“肽-海利霉素”融合蛋白的核酸片段。可根据常规突变技术，或者另外通过杂交选择用于制备所述序列的合成寡核苷酸来获得这些修饰。根据可导致相同氨基酸表达的核酸多种组合，由SEQ ID NO:1、2或3所述的参照序列之间的差异和其对应的同系物可以是实质性的，所有这些都是因为涉及能由化学合成产生的小分子DNA片段。有利的，和参照序列比较，同源性将是至少为70％，更优选的至少80％，更优选的至少90％。这些修饰通常是中性的，即不影响得到的海利霉素或融合肽的一级序列。

本发明还涉及含有编码序列和能在宿主生物体，具体是植物细胞和植物中起作用的5′和3′位置的异源调控元件的嵌合基因(或表达盒)，该编码序列含有至少一条编码海利霉素或上文定义的“肽-海利霉素”融合肽的DNA片段。

可理解宿主生物体是指任何低等或高等、单细胞或多细胞生物体，在其中可引入本发明的嵌合基因来产生海利霉素。它具体包含细菌，如大肠杆菌，酵母，具体是酿酒酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)，真菌，具体是曲霉属(Aspergillus)，杆状病毒，或优选植物细胞或植物。

可理解本发明的“植物细胞”是指衍生自植物并构成未分化组织(如胼胝体)，分化组织(如胚胎)，植物部分，植物或种子的任何细胞。

可理解本发明的“植物”是任何能进行光合作用的分化的多细胞生物体，具体是单子叶或双子叶植物，更具体是作为动物或人食物的作物，如玉米、小麦、油菜、大豆、稻、甘蔗、甜菜、烟草、棉花等。

编码海利霉素的DNA片段表达必需的调控元件按照宿主生物，对于本领域技术人员是已知的。它们具体包含启动子序列、转录激活物、末端序列、包含起始和终止密码子。用于鉴别和选择调控元件的工具和方法是本领域技术人员熟知的。

用于转化酵母或细菌等微生物的调控元件对本领域技术人员是熟知的，具体包含启动子序列、转录激活物、转运肽、终止序列和起始和终止密码子。

为了指导肽在酵母培养基中的表达和分泌，将编码海利霉素的DNA片段整合到含下列元件的穿梭载体中，该载体包含下列元件：

一使选择转化子成为可能的标记。优选的，对酵母用ura-3基因，对大肠杆菌用能赋予氨苄青霉素抗性的基因，

一使质粒能在酵母中复制的核酸序列(复制起始点)。优选的，使用酵母2i质粒的复制起始点，

一使质粒能在大肠杆菌中复制的核酸序列(复制起始点)，

一表达盒，包括：

(1)启动子调控序列。可用天然存在于酵母中的某基因的任何启动子序列。优选的，用酿酒酵母Mfα1基因的启动子。

(2)编码与寻靶肽(或前肽)联合的信号肽(或预肽)的序列。这些区域对该肽的正确分泌是重要的。优选的，采用编码因子Mfα1前体的前-预肽的序列。

(3)聚腺苷酸或终止子调控序列。优选的，采用酿酒酵母磷酸甘油激酶(PGK)的终止子。在表达盒中，将编码海利霉素的序列插入到前-预肽序列的下游和PGK终止子的上游。

已在几个出版物，包含Reichhart等，1992,Invert.Reprod.Dev.,21,pp15-24和Michaut等，1996,FEBS Letters,395,pp6-10中描述了这些元件。

优选的，通过醋酸锂法(Ito等，1993,J.Bacteriol,153,pp163-168)用该表达质粒转化酿酒酵母种属的酵母菌。用不含尿嘧啶的选择性琼脂培养基选择转化的酵母菌。通过在选择性培养液中培养24到48小时来进行转化酵母的大量生产。

微生物的转化使大量生产海利霉素成为可能。因此，本发明还涉及制备海利霉素的方法，包含步骤：将含有编码上述海利霉素编码基因的转化微生物在合适的培养基中培养；然后抽提获得全部或部分纯化的海利霉素。

优选的，在抽提酵母产生的海利霉素的过程中，离心除去酵母并将培养上清液和无机或有机酸溶液，如盐酸或醋酸等酸性溶液接触。然后将得到的抽提物在低温下以4000到10,000rpm的速度4℃离心30到60分钟。

可以在纯化海利霉素前先组分抽提步骤后得到的上清液。优选的，在组分步骤中，反向沉淀抽提物，来得到固相抽提物。用稀酸溶液对可溶于水的分子进行洗涤，用合适的洗脱液洗脱疏水分子。用三氟乙酸洗涤，和含有稀酸溶液配的递增量乙腈的洗脱液获得了良好的结果。

优选的，可分两步进行海利霉素的纯化：阳离子交换HPLC，然后是反向HPLC，使用与前一步不同或相同的合适洗脱液。用抑制培养液中真菌生长的试验来监测纯化的各个步骤。优选的，用真菌粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)进行该试验。

用Edman降解测序法和质谱法分析了转化酵母产生的海利霉素的序列。直接对产生的肽，对还原/烷化修饰的肽，以及该肽片段进行了结构特征分析。将产生的海利霉素的肽序列和分子量与从烟芽夜蛾的血淋巴提取的天然海利霉素作了比较。结果显示，两种分子具有相同的一级结构。二硫键位置的确定表明两种肽，天然肽和转化微生物产生的肽中，二硫键的排列是相同的。

本发明更具体的涉及植物的转化。作为植物启动子调控序列，可以用在植物中自然表达的某基因的任何启动子序列，具体是细菌、病毒或植物起源的启动子，如编码核酮糖-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亚基的基因的启动子，或植物病毒基因如花椰菜花叶病毒(19s或35sCAMV)的启动子，或能由病原体如烟草PR-1α诱导的启动子，也可使用任何已知的合适启动子。优选的，使用能组成性启动编码基因过表达或由病原体侵袭诱导的启动子调控序列，如含有至少一个专利申请EP 0,507,698中描述的组蛋白启动子。

根据本发明，还可以将置于启动子和编码序列之间的其它调控序列，如转录激活物(增强子)与启动调控序列联合使用，如专利申请WO 87/07644中描述的烟草花叶病毒(TMV)，或Carrington&Freed描述的烟草蚀刻病毒(TEV)的转录激活物。

作为聚腺苷酸化信号或终止子调控序列，可用任何细菌起源的相应序列，如根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)nos终止子，或另外的植物起源的序列，如专利申请EP 0,633,317中描述的组蛋白终止子。

根据本发明，该嵌合基因还可以和适合于宿主生物体的选择性标记联合。这样的选择性标记对本领域技术人员是熟知的。它们可以包含抗生素抗性基因，或另选的使植物对除草剂耐受的基因。

本发明还涉及用于转化含有至少一个上述嵌合基因的宿主生物体的克隆载体或表达载体。除了上述嵌合基因外，该载体还包含至少一个复制起始点。该载体可由质粒、粘粒、噬菌体或病毒组成，通过导入本发明嵌合基因而转化。根据要转化的宿主生物体，这种转化载体是本领域技术人员熟知的，而且在文献中有广泛描述。

对于植物细胞或植物的转化，可具体包含用于转化已发育植物的病毒和还含有其复制和表达自身元件的病毒。优选的，转化本发明植物细胞或植物的载体是质粒。

本发明的主题还有转化宿主生物体的方法，具体是植物细胞，通过整合上述至少一条核酸片段或嵌合基因，其转化可以通过在特定文献中广泛描述的任何合适的已知方法来获得，具体的是本申请中引用的文献，更具体的是使用本发明的载体。

一种系列方法在于用结合DNA序列的颗粒轰击细胞、原生质体或组织。另一系列方法在于用，如转移入植物的方法，嵌合基因插入根癌土壤杆菌Ti或发根土壤杆菌Ri质粒中。

可使用其它方法，如显微注射或电穿孔法，或可另选用PEG法直接沉淀。

本领域技术人员能根据宿主生物体，特别是植物细胞或植物的性质选择合适的方法。

本发明的主题还有宿主生物体，具体是植物细胞或植物，转化的或含有包含上述海利霉素编码序列的有效量的嵌合基因。

本发明的主题还涉及含有转化细胞的植物，具体是由转化细胞再生的植物。通过由物种性质而定的任何合适方法获得再生物，如上文参考中的实施例所述。

对于转化植物细胞或再生细胞的方法，具体在下面的专利和专利申请中提到：US 4,459,355,US 4,536,475,US 5,464,763,US 5,177,010,US 5,187,073,EP 267,159,EP 604,662,EP 672,752,US 4,945,050,US 5,036,006,US5,100,792,US 5,371,014,US 5,478,744,US 5,179,022,US 5,565,346,US5,484,956,US 5,508,468,US 5,538,877,US 5,554,798,US 5,489,520,US5,510,318,US 5,204,253,US 5,405,765,EP 442,174,EP 486,233,EP 486,234,EP 539,563,EP 674,725,WO 91/02701和WO 95/06128。

本发明还涉及衍生自上述再生植物的培养和/或杂交的转化植物，以及转化植物的种子。

如此转化的植物对某些疾病具有抵抗力，具体对某些真菌或细菌疾病具有抵抗力。作为结果，编码海利霉素的DNA序列可以和产生对所述疾病抵抗力的植物的主要目标相结合，海利霉素对真菌疾病，如由尾孢菌Cercospora，具体是甜菜尾孢菌(Cercospora beticola)，枝孢菌Cladosporium，具体是草本枝孢菌(Cladosporium herbarum)，镰孢菌Fusarium，具体是黄色镰孢菌(Fusarium culmorum)或禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)，疫霉菌Phytophthora，具体是樟疫霉菌(Phytophthora cinnamomi)引起的真菌疾病有效。

该嵌合基因还可以包含，优选的，至少一个可选择标记，如一或多个对除草剂耐受的基因。还可以整合编码海利霉素的DNA序列作为在用编码感兴趣的其它肽或蛋白质的其它序列(如对除草剂耐受的基因)转化植物时的可选择标记。

这些对除草剂耐受的基因是本领域技术人员熟知的，具体在专利申请EP115,673,WO87/04181,EP 337,899,WO96/38567或WO97/04103中有描述。

当然，本发明的转化细胞和植物除了包含编码海利霉素的基因以外，可包含编码感兴趣的蛋白质，如能赋予植物对其它细菌或真菌起源疾病抵抗力的额外肽的异源序列，和/或编码耐受除草剂的蛋白质的其它序列和/或编码抵抗昆虫的蛋白质(具体如Bt蛋白质)的其它序列。

可用含有包含编码海利霉素的第一序列和编码其它感兴趣的肽或蛋白的至少一个序列的嵌合基因的同一载体来整合上述其它序列。

还可以用含有至少一条所述其它序列的另一个载体，根据上述常规方法来整合它们。

本发明的植物，可通过杂交亲本而获得，一个亲本携带本发明编码海利霉素的基因，另一个亲本携带编码至少一种其它感兴趣的肽或蛋白质的基因。

在编码其它抗真菌肽的序列中，可能提到编码果蝇霉素(drosomycin)的序列，它在专利申请FR 2,725,992和Fehlbaum等(1994)，和在1997年7月24日提交的未公布的专利申请FR 97 09115中有描述，或编码androctonin的序列，它在专利申请FR 2,745,004中和在1997年8月20日提交的未公布专利申请FR 97 10362中有描述。

最后，本发明涉及本发明培养转化植物的方法，该方法包含：将所述转化植物的种子种到适合培养该植物的田块中，向所述田的所述小块土地施用农用化学组合物，而基本不影响所述种子或所述转化植物，然后当所述植物达到所需成熟度时，收获培养的植物并可任选的从收获的植物分离出种子。

可理解本发明的农用化学组合物是指任何含有至少一种下列活性的活性产物的农用化学组合物：除草、杀真菌、杀菌、杀病毒或杀虫。

根据本发明培养方法的一优选例，该农用化学组合物包含至少具有一种杀真菌和/或杀菌活性，更优选是显示出能补充本发明转化植物产生的海利霉素活性的活性产物。

可理解本发明的显示出能补充海利霉素活性的活性产物，是指显示出补充活性谱的产物，即具有抵抗对海利霉素不敏感的污染物(真菌、细菌或病毒)攻击活性的产物，或另外的，其活性范围覆盖海利霉素活性范围的全部或部分，而且其施用剂量将因为转化植物产生的海利霉素的存在而大大减少的产物。

下列实施例使得阐明本发明成为可能，然而不限制其范围。

实施例Ⅰ：从免疫的鳞翅目烟芽夜蛾幼虫中收集的血淋巴的海利霉素的分离和特征确定

实施例1.1：分离

1-1烟芽夜蛾血淋巴中抗真菌物质生物学合成的诱导

用针(30ga)帮助免疫鳞翅目烟芽夜蛾的五龄成熟幼虫。该针先曾刺入在Lauria-Bertani培养基上37℃培养12小时的培养物制备的革兰阳性菌(藤黄微球菌M.luteus)和革兰阴性菌(大肠杆菌1106)沉淀物中。将如此感染的幼虫单个关在含有基于琼脂糖的营养培养基的试管中20℃和23℃之间24小时。在收集血淋巴前，将幼虫在冰上冷却。

1-2血浆的制备

切开一条腹部附肢收集血淋巴(每幼虫大约30il)，并收集在冰上冷却的含有作为蛋白酶抑制剂(最终浓度为20μg/ml)的抑蛋白酶肽和作为黑化作用抑制剂的苯硫脲(最终浓度是20μM)的1.5ml聚丙烯微量离心管中。从而，将从免疫的幼虫中收集的血淋巴(2毫升)4℃14,000g离心1分钟来除去血细胞。将无血细胞的血淋巴储藏在-20℃直到使用。

1-3血浆的酸化

在迅速解冻后，将血浆用1％三氟乙酸溶液酸化到pH3。在酸性条件下温和搅动，在冰浴上抽提肽30分钟。然后将获得的抽提物4℃10,000g离心30分钟。

1-4肽纯化

a)固相抽提的预纯化

将与2毫升血淋巴相等的一定量抽提物放在以柱体(Sep-Pak^TMC18,WatersAssociates)形式购得的，用酸化水(0.05％TFA)平衡的反向载体上。用酸化水洗涤一次除去亲水分子。用以0.05％TFA配制的40％乙腈溶液进行肽洗脱。为了除去乙腈和TFA，真空干燥40％乙腈洗脱的组分，然后在进行第一纯化步骤前将其以无菌超纯水中重新溶解。

b)通过反向柱上的高效液相层析(HPLC)纯化

-第一步：用反向层析在Aquapore RP-300C₈半制备性柱(Brownlee^TM,220×70mm,300)上分析含有肽的组分，用溶于0.05％TFA的2％到60％的乙腈线性梯度以1.5ml/min的稳定流速进行120分钟洗脱。手工收集组分，监测225nm和254nm处吸光度的变化。将收集的组分真空干燥，用超纯水重新溶解，并用下述试验分析它们的抗真菌活性。

-第二步：在Auapore RP-300 C₈反向分析柱(Brownlee^TM,220×4.6mm,300)上，以稳定流速0.8ml/min，使用溶于0.05％TFA中的2％到22％的乙腈双相线性梯度洗脱10分钟，然后用22％到32％洗脱50分钟。手工收集组分，监测225nm和254nm处吸光度的变化。将收集的组分真空干燥，用超纯水重新溶解，并用下述试验分析它们的抗真菌活性。

-第三步：将含有肽的抗真菌组分在Narrowbore Delta-Pak^TM HPLC₁₈反相柱(Waters Associates,150×2.2mm)上，以稳定流速0.25ml/min在30℃控温下，用2％-24％(经10分钟)和24％-44％(经100分钟)溶于0.05％TFA的乙腈线性梯度纯化到均一。手工收集组分，监测225nm处吸光度的变化。将收集的组分真空干燥，用过滤超纯水重新溶解，并用下述试验分析它们的抗真菌活性。

实施例Ⅰ.2：肽的结构特征

2-1用区带毛细管电泳对纯度验证。

使用区带毛细管电泳，在270-HT型(PEApplied Biosystems division ofPerkin Elmer)上验证了抗真菌肽的纯度。将1nl 50μM纯化肽溶液在真空下注射到硅毛细管(72cm×50μm)中，在20mM pH 2.5的柠檬酸缓冲液中进行分析。在20kV,30℃从阴极到阳极电泳20分钟。记录200nm处的迁移。

2-2半胱氨酸数目的确定：

还原和S-吡啶乙基化

通过还原和S-吡啶乙基化测定了天然肽上的半胱氨酸残基数。将100pmol天然肽在存在2微升2.2M二硫苏糖醇的条件下，在40微升含有2mMEDTA和6M氯化胍的0.5M pH7.5的Tris-HCl缓冲液中还原。将反应介质放在氮气中。暗处培育60分钟后，将2微升新鲜蒸馏的4-乙烯基嘧啶加到反应物中，然后在暗处氮气中45℃培育10分钟。然后将吡啶乙基化的肽用反相层析，在0.05％TFA存在下以线性梯度的乙腈从反应介质组成物中分离出来。

2-3用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸飞行(Flight)电离时间)质谱测定天然肽、S-吡啶乙基化肽和蛋白水解片段的质量

在Bruker Biflex MALDI-TOF质谱仪(Bremen,Germany)上以正线性模式进行质量测定。将质谱用已知m/z，分别为2199.5Da,3046.4Da，和4890.5Da的肽标准混合物外校准。将待分析的各种产物置于通过快速蒸发乙醇饱和溶液获得的α-氰基-4-羟基苯基肉桂酸晶体薄层上。在中等真空度下干燥后，用1滴0.1％三氟乙酸洗涤样品，然后引入质谱仪。

2-4Edman降解法测序

在ABI473A测序仪(PEApplied Biosystems division of Perkin Elmer)上通过Edman降解法对天然肽、S-吡啶乙基化肽和用不同蛋白水解切割后获得的各种片段来自动测序，并检测苯基乙内酰硫脲衍生物。

2-5蛋白水解切割

-C-末端区的肽序列确定

将200pmol还原和S-吡啶乙基化的肽在5pmol内切蛋白酶-Lys-C(无色杆菌Acromobacter蛋白酶I，特异性切开赖氨酸残基的C-末端侧，Takara,Otsu)存在下，根据提供者的推荐(10mM Tris-HCL,pH9,0.01％Tween 20存在下)培育。用1％TFA终止反应后，将肽片段用反相HPLC在NarrowboreDelta-Pak^TM HPIC₁₈型柱(Waters Associates 150×2mm)上以0.2ml/min流速和37℃恒温用溶于0.05％TFA的2-60％(经80分钟)的乙腈线性梯度来分离。用MALDI-TOF质谱分析获得的片段，并用Edman降解法对对应于C末端片段的肽进行测序。

-用嗜热菌蛋白酶蛋白水解来对二硫键的排列进行确定

将天然肽(8微克)在4微克嗜热菌蛋白酶(Boehringer Mannheim，嗜热菌蛋白酶/肽比率：1/2重量：重量)存在下，在0.1M pH7的MES(N-乙基吗啉)缓冲液中，在2mM CaCl₂存在下37℃培育1小时。加入甲酸终止反应，立即用反相层析在Narrowbore Delta-Pak^TM HPIC₁₈柱(Water Associates,150×2.2mm)上先经过2％乙腈(经10分钟)的恒定步骤，然后以0.2ml/min流速，在30℃以溶于0.05％TFA的2-50％(经100分钟)乙腈线性梯度分离反应产物。用MALDI-TOF质谱分析获得的片段并用Edman降解法测序。

实施例Ⅱ：海利霉素在酿酒酵母中的表达

下文所用的所有技术都是标准试验技术。这些技术的详细方案已具体在Ausubel等中有所描述。

实施例Ⅱ-1：合成基因的装配

用编码酵母菌因子α1(Mfα1)前一预序列的5个C-末端氨基酸和随后的海利霉素的44个氨基酸的6个合成寡核苷酸进行装配。考虑酿酒酵母使用的偏爱密码子，选择了图1中显示的寡核苷酸。

装配分几步发生：

-通过多核苷酸激酶(New England Biolabs)的作用在寡核苷酸2到5的5′末端磷酸化；

-将寡核苷酸1到6混合，加热到100℃，并通过缓慢将温度降低到25℃(经3小时)杂交。

-用T4噬菌体连接酶(New England Biolabs)在15℃处理杂交的寡核苷酸15小时；

-将图1显示的寡核苷酸杂交的得到的DNA单元侧接HinDⅢ和BglⅡ限制性位点，插入用HinDⅢ和BamHⅠ酶(BalⅡ和BamHⅠ是兼容的)消化的质粒pBluescript SK+(Stratagene)中。然后用该连接混合物转化感受态大肠杆菌DH5α细胞(Stratagene)。对几个克隆分析并测序。这些克隆之一具有所要的序列，称为pSEA1。

实施例Ⅱ-2：使合成的海利霉素分泌成为可能的载体pSEA2的构建

将携带编码海利霉素的序列以及载体M13JM132(Michaut等，1985,FEBS书信，395,pp 6-10)的SphⅠ-HinDⅢ片段的载体pSEA1的HinDⅢ-SalⅠDNA片段，插到质粒pTG4812(Michaut等，1996,FEBS书信，395,pp 6-10)的SphⅠ和SalⅠ位点之间。载体M13JM132的SphⅠ-HinDⅢ片段含有酵母MFα1基因的启动子序列以及编码因子MFα1前一预区的序列。从而在得到的质粒pSEA2中，发现海利霉素的合成基因本身被插入因子MFα1的前一预序列和转录终止子之间；因此该构建物应确保海利霉素的成熟和分泌。

实施例Ⅱ-3：用质粒pSEA2的DNA转化酿酒酵母菌株并分析转化物

用质粒pSEA2转化酵母菌株TGY 48.1(MATα,ura3-D5,his,pra1,prb1,prc1,cps1；Reichhart等，1992,Invert.Reprod.Dev.21,pp15-24)。29℃在选择性YNBG培养基(0.67％酵母含氮碱基，2％葡萄糖，补充0.5％酪蛋白水解物，不含尿嘧啶)上选择转化物。转化后，将选出的ura+特性的几个酵母在50ml选择性培养液中29℃培养48小时。离心(4000g,30min,4℃)后，将上清液用醋酸酸化到pH3.5，然后放在用酸化水(0.05％TFA)平衡的Sep-Pak^TM C₁₈柱体(Waters Associates)上。用含有递增百分比的乙腈的0.05％TFA溶液来洗脱与柱体结合的不同蛋白质。

用HPLC在Aquapore RP-300 C₈反相分析柱(Brownlee^TM,220×4.6mm,300)上，以0.8ml/mil稳定流速用溶于0.05％TFA的2％-40％(经80分钟)乙腈线性梯度分析了显示抗真菌活性的40％组分。通过监视225nm和254nm处吸光度变化手工收集诸组分。真空干燥收集的组分，用超纯水重新溶解，并在实施例Ⅲ描述的条件下分析它们的抗真菌活性。如实施例Ⅰ.2中所述进行肽的结构特征分析。

实施例Ⅱ-4：以半制备规模生产重组海利霉素

将表达海利霉素的转化酵母克隆之一在100毫升选择性培养基中29℃培养24小时。然后用该程序接种到4升选择性培养液中，29℃培养48小时。离心(4000g,30min,4℃)除去酵母。用醋酸将上清液酸化到pH3.5，进行第二次离心(4000g,30min,4℃)，然后放在用酸化水(0.05％TFA)平衡的C₁₈制备型反相开放柱(Waters Associates,125，每500毫升上清液6克相)上。用酸化水洗涤，然后用以0.05％TFA配的15％乙腈溶液洗涤，除去亲水分子。用以0.05％TFA配的40％乙腈溶液洗脱肽。冻干用40％乙腈洗脱的组分，重溶于无菌超纯水，然后进行第一步纯化。

一用HPLC纯化的第一步：将含有海利霉素的纯化组分重新溶解在25mMpH3.4的醋酸铵溶液中。将该样品注入Aquapore阳离子交换制备型阳离子交换柱(Brownlee^TM,250×10mm)中，以2ml/min的稳定流速使用溶于pH3.4的25mM醋酸铵的0％到100％(经90分钟)NaCl线性梯度。真空干燥收集的组分，用超纯水重溶解并在下述条件下分析它们的抗真菌活性。

一HPLC纯化的第二步：在Aquapore RP-300 C₈半制备型反相柱(Brownlee^TM,220×7mm,300)上层析将海利霉素纯化到均一，以2ml/min的稳定流速使用溶于0.05％TFA的2％到40％(经80分钟)乙腈线性梯度。

实施例Ⅲ：体外活性试验：通过显微分光光度计测量抗真菌活性

用该方法在不同纯化步骤中测试了抗真菌分子，来确定该肽的活性谱和确定该肽保持活性的最小抑制浓度(MIC)。将MIC表达成浓度范围[a]-[b]，其中[a]是观察到生长开始的最小浓度而[b]是观察不到生长的浓度。在表1和2中给出了海利霉素抗丝状真菌和酵母的比活性例子。

实施例Ⅲ-1：检测针对丝状真菌的活性的试验

通过试验检测了抑制培养液中真菌生长的抗真菌活性。将要试验的真菌孢子悬浮在“马铃薯-葡萄糖”型培养液中。优选的，每1升去离子水中用12克马铃薯葡萄糖肉汤培养基(Difco)。在培养基中加入两种抗生素：四环素(最终浓度10μg/ml)和头孢噻肟霉素(100μg/ml)。将10微升要分析的各组分放在含有孢子(最终浓度为每毫升104个孢子)的90微升培养液的微量滴定板中。在湿箱中30℃培养48小时。24小时后，在光学显微镜下观察真菌生长，48小时后在分光光度微量滴定板阅读仪的帮助下测量600nm处的吸光度来定量。

一测试的丝状真菌：烟曲霉Aspergillus fumigatus(Dr H.Koenig赠，Hospital civil,Strasbourg)；红烟草赤壳菌Nectria haemotobacca，黄色镰孢菌Fusarium culmorum，绿色木霉Trichoderma viride(UniversityCatholique of Leuven的真菌培养收集中心，Belgium)；粗糙脉孢菌Neorosporacrassa，尖脉孢菌Fusarium oxysporum(Societe Clause的真菌培养收集中心，Paris)。

在下面表1中显示了海利霉素抗丝状真菌活性的试验结果。

表1：海利霉素抗丝状真菌活性

真菌海利霉素(μM)的MIC

粗糙脉孢菌 0.1-0.2

黄色镰孢菌 0.2-0.4

尖脉孢菌 1.5-3

红烟草赤壳菌 0.4-0.8

绿色木霉 1.5-3

烟曲霉 6-12.5

实施例Ⅲ-2：检测抗酵母活性的试验

将不同酵母菌株在“Sabouraud”型培养基中培养，并30℃温和振荡培养24小时。将试验样品(10μl)放在加了90微升密度调节到OD600=0.001的稀释酵母培养物的微量滴定板孔中。通过分光光度微量滴定板阅读仪的帮助下测量600nm处的吸光度来评估生长。

-试验的酵母：白色念珠菌Candida albicans,C.glabrata，热带假丝酵母C.tropicalis，克鲁斯假丝酵母C.krusei,C.inconspicua，新型隐球菌Cryptococcus neoformans，浅白隐球菌Cryp.albidus，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae(Dr H.Koenig赠，Hospital civil,Strasbourg)。

在下面表2中显示了海利霉素抗丝状真菌活性的试验结果。

表2：海利霉素抗酵母活性

酵母	海利霉素MIC(μM)
酵母	海利霉素MIC(μM)	白色念珠菌	2.5-5
热带假丝酵母	2.5-5	白色念珠菌	2.5-5
热带假丝酵母	2.5-5	克鲁斯假丝酵母	10-20
C.inconspicua	5-10	克鲁斯假丝酵母	10-20
C.inconspicua	5-10	新型隐球菌	2.5-5
浅白隐球菌	5-10	新型隐球菌	2.5-5

这些结果显示了本发明肽的杰出抗真菌活性。

实施例Ⅳ：含有编码海利霉素基因的转化植物的制备

该实施例描述了制备编码海利霉素的序列使其在植物细胞中表达，以及嵌合基因、整合载体和转化植物的制备。在附件中的图2到6描述了为构建嵌合基因而制备的一些质粒的示意性结构。在这些图中，各种限制性位点用斜体标出。

下文用的所有技术是标准实验技术。Ausubel等具体描述了这些技术的详细方案。

实施例Ⅳ-1：用于植物转化的嵌合基因的构建

pRPA-MD-P：含有烟草PR-1α基因信号肽的质粒的构建

将下面的两种互补性合成寡核苷酸Oligo 7和Oligo 8在65℃杂交5分钟，然后缓慢将温度降低到30℃(经30分钟)。

Oligo 7:5′GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC ATCTTTCCTTCTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3′

Oligo 8:5′TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA GAAGAGTAGACACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3′

Oligo 7和Oligo 8之间杂交后，将仍保持单链的DNA作为大肠杆菌聚合酶ⅠKlenow片段的模板(在制造商(New England Biolabs)推荐的标准条件下)来产生从各Oligo的3′末端开始的双链寡核苷酸。然后用限制性酶SacⅡ和NaeⅠ消化获得的双链寡核苷酸并将其克隆入用相同限制性酶消化的质粒pBSⅡSK(-)(Stratagene)中。然后获得含有编码烟草PR-1α基因(SEQ ID NO 4)信号肽区域的一个克隆。

pRPA-PS-PR1a-helio：编码海利霉素与PR-1α信号肽融合的无3′非转录区的序列的建立

按照pRPA-MD-P描述的操作条件，两种合成寡核苷酸与Oligo 9和Oligo10序列互补。

Oligo 9: 5′ GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTGTGGGGT GCTGTGAACTACACTTCCGA TTGCAACGGT GAGTGCAAGA GGAGGGGTTA 3′

Oligo 10: 5′ CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCTCAAGTCTCGCACCAG CAGTTCACGT TAGCGAAGGA ACCGCAGTGA CCACCCTTGT AACCCCTCCTCTTGCACTC 3′

在Oligo 9和Oligo 10杂交后，将仍保持单链的DNA作为大肠杆菌聚合酶ⅠKlenow片段的模板(在制造商(New England Biolabs)推荐的标准条件下)来产生从各Oligo 3′末端开始的双链寡核苷酸。然后将含有海利霉素编码部分(SEQ ID NO 2)的该双链寡核苷酸直接克隆入用限制性酶NaeⅠ消化过的质粒pRPA-MD-P。用测序检查获得的克隆的正确方向。然后获得含有编码PR-1α-海利霉素融合蛋白域的一个克隆。该区域位于N-末端的NcoⅠ限制性位点和C-末端的ScaⅠ、SacⅡ和BamHⅠ限制性位点之间。(SEQ ID NO 3)

pRPA-RD-239：用于在植物中表达、含有编码PR-1α-海利霉素融合蛋白的序列的载体的建立

从Dr Jim Carrington(Texas A&M University，未描述)处获得了衍生自质粒pUC-19的质粒pRTL-2 GUS。其示意结构表示于图2的该质粒含有从花椰菜花叶病毒(CaMV2×35S启动子；Odell等，1985)分离到的复制CaMV35s启动子，其指导含有烟草蚀刻病毒5′非翻译序列(TEV 5′UTR；Carrington&Freed,1990)、大肠杆菌α-葡糖苷酸酶基因(GUS Jefferson等，1987)、然后是CaMV 35S RNA聚腺苷酸化位点(CaMV polyA；Odell等，1985)的RNA表达。

用限制性酶NcoⅠ和BamHⅠ消化质粒pRTL-2 GUS，并纯化大DNA片段。用限制性酶NcoⅠ和BamHⅠ消化质粒pRPA-PS-PR1α-helio，并纯化含有编码PR-1α-海利霉素融合蛋白区域的小DNA片段。然后将两种纯化的DNA片段一起连接入合成PR-1α-海利霉素融合蛋白的植物内的表达盒中。图3中显示了该表达盒的示意性结构。“PR-1α-海利霉素”代表pRPA-RD-239的PR-1α-海利霉素融合蛋白的编码区。通过PR-1α信号肽的作用将海利霉素传输到植物胞外基质中。

pRPA-RD-195：含有修饰的多克隆位点的质粒的建立

质粒pRPA-RD-195是衍生自含有修饰的多克隆位点的pUC-19的质粒。将下列互补性合成寡核苷酸Oligo 11和Oligo 12杂交并按照制备pRPA-MD-P所述的方案使其双链化。

Oligo 11:5′AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTACCCGGGGATC CTCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3′

Oligo 12:5′CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGCAGGTCGACTC TAGAGG 3′

然后将获得的双链寡核苷酸连接入已用限制性酶EcoRⅠ和HindⅢ消化的pUC-19中，并用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段补成平端。获得了含有多克隆位点的一个载体，来促进在根瘤土壤杆菌载体质粒中引入表达盒。在图4中显示了该多克隆位点的示意性结构。

pRPA-RD-240：将用于PR-1α-海利霉素的表达盒从pRPA-RD-239引入pRPA-RD-195

用限制性酶PstⅡ消化质粒pRPA-RD-239。纯化含有表达PR-1α-海利霉素表达盒的DNA片段。然后将纯化片段连接入已用限制性酶PstⅡ消化并用牛小肠磷酸酶去磷酸的pRPA-RP-195。

pRPA-RD-174：衍生自pRPA-BL-150A(EP 0,508,909)，含有耐受溴苯腈的pRPA-BL-237(EP 0,508,909)的基因的质粒

通过PCR基因扩增从pRPA-BL-237中分离出对溴苯腈(bromoxynil)耐受的基因。获得的片段是平端的，将其克隆入在标准条件下通过Klenow聚合酶的作用已变成平端的pRPA-BL-150A的EcoRⅠ位点中。获得了在右边界附近含有耐受溴苯腈的基因，在左边界含有耐受卡那霉素的基因和在这两个基因之间含有多克隆位点的根瘤土壤杆菌载体。

图5显示了pRPA-RD-174的示意性结构。在该图中，“nos”代表根瘤土壤杆菌胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化位点(Bevan等，1983),“NOS pro”代表根瘤土壤杆菌胭脂氨酸合成酶启动子(Bevan等，1983),“NPTⅡ”代表大肠杆菌Tn5转座子新霉素磷酸转移酶基因(Rothstein等，1981),“35Spro”代表从烟草花叶病毒(Odell等，1985)中分离到的35S启动子，“BRX”代表从肺炎克雷伯菌臭鼻亚种K.ozaene中分离的硝基酶(nitralase)基因(Stalker等，1988),“RB”和“LB”分别代表根瘤土壤杆菌Ti质粒序列的右和左边界。

pRPA-RD-184：将新的独特限制性位点加入pRPA-RD-174中

杂交下面的互补性合成寡核苷酸Oligo 13和Oligo 14并按照制备pRPA-MD-P所述方案使其变平端。

Oligo 13 : 5′CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGCCCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG 3′

Oligo 14:5′CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCGCGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG 3′

在琼脂糖凝胶(3％Nusieve,FMC)上分离后，纯化杂交的双链寡核苷酸(95个碱基对)。用限制性酶XmaⅠ消化质粒pRPA-RD-174并纯化大DNA片段。然后连接获得的两种DNA片段。

获得了衍生自pRPA-RD-174、在耐受溴苯腈的基因和可选择标记卡那霉素基因之间含有其它限制性位点的质粒。

图6中显示了质粒pRPA-RD-184的示意性结构，其中术语“nos”,“NPT-Ⅱ”,“NOS pro”,“35S pro”,“BRX基因”，“RB”和“LB”和图5中意义相同。

pRPA-RD-241：含有编码直接指向胞外基质的海利霉素的基因构建物的根瘤土壤杆菌载体的建立

用限制性酶SfiⅡ和AscⅠ消化质粒pRPA-RD-240并纯化含有PR-1α-海利霉素基因的DNA片段。用相同的限制性酶消化了质粒pRPA-RD-184。然后将含有PR-1α-海利霉素的表达盒的DNA片段连接到pRPA-RD-184中。从而获得了含有编码导致海利霉素在植物胞外基质中表达的PR-1α-海利霉素融合蛋白的序列的一个根瘤土壤杆菌载体。

实施例Ⅳ-2：表达盒CsVMV启动子-PG1信号肽-海利霉素-Nos-终止子的建立

pRPA-NP4：含有玉米聚半乳糖醛酶PG1基因(Genbank，登录号X57627)信号肽的质粒的建立

将下文两种部分互补性合成寡核苷酸Oligo 13和Oligo 14 65℃杂交5分钟，然后经30分钟缓慢降低温度到30℃。

Oligo 15:5′GGTCTAGAAT GGCCTGCACC AACAACGCCA TGAGGGC CCTCTTCCTCCTC 3′

Oligo 16:5′CCGAATTCGG CGCCGTGCAC GATGCAGAAG AGCACGAGGAGGAAGAGGGC 3′

在Oligo 13和Oligo 14杂交后，将仍保持单链的DNA作为大肠杆菌聚合酶Ⅰ的Klenow片段的模板(在制造商(New England Biolabs)推荐的标准条件下)来产生从各Oligo 3′末端开始的双链寡核苷酸。用限制性酶XbaⅠ和EcoRⅠ消化获得的双链寡核苷酸，然后将其克隆入用相同的限制性酶消化的质粒pBSⅡSK(-)(Stratagene)中。获得了含有编码PG1基因信号肽的22个氨基酸区域(它可能和其它蛋白质的阅读框在SfoⅠ位点水平上融合)的一个克隆(SEQ ID NO 15)。

pRPA-NP5：编码与PG1基因信号肽融合的海利霉素的序列的建立

用PCR从克隆pRPA-PS-PR1α-helio(SEQ ID NO 3)中用热稳定Pfu酶(Stratagene)按厂商推荐的标准条件扩增了编码海利霉素的区域。该扩增中使用的合成寡核苷酸是：

Oligo17:5′GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTG 3′

Oligo18:5′GGCTCGAGTC AAGTCTCGCA CCAGCAGTTC AC 3′

用限制性酶XhoⅠ消化PCR产物并将其克隆入用限制性酶SfoⅠ和XhoⅠ消化的载体pRPA-NP4中。得到的克隆含与编码海利霉素的序列在同一阅读框中融合的编码PG1基因信号肽的区域(SEQ ID NO 18)。

pRPA-NP6：在转化载体中海利霉素的表达盒的建立

表达和转化载体pILTAB 357衍生自二分载体pBin19。它含有后随一个多克隆位点和胭脂氨酸合成酶Nos转录终止子(图X+1)的CsVMV启动子(Verdaguer等，1996,Plant Mol.Biol.31,1129-1139)。表明了该片段的序列(SEQ ID NO 19)。

通过将含有PG1信号肽-海利霉素融合物的载体pRPA-NP5的XbaⅠ-KpnⅠ限制性片段插入用这些相同的酶消化的载体pILTAB 357中获得了海利霉素表达载体。从而得到的克隆含有表达盒CsVMV启动子-PG1信号肽-海利霉素-Nos终止子(SEQ ID NO 20)。

实施例Ⅳ-3：转化烟草的制备

3.1-转化

将载体pRPA-RD-241和pRPA-NP6引入携带粘粒pTVK291(Komari等，1986)的根瘤土壤杆菌EHA101或EHA105菌株(Hood等，1987)中。转化技术根据Horsh等(1985)的程序。

3.2-再生

在含有30g/l蔗糖和200μg/ml卡那霉素的Murashige and Skoog(MS)基本培养基上从叶外植体再生PBD6烟草(源自SEITA France)。收集温室栽培的或野外植物的叶外植体，按照连续三阶段的叶盘技术再生(Horsh等，1985)：第一阶段包括在补充有30g/l蔗糖，含0.05mg/l萘乙酸(ANA)和2mg/l苄胺嘌呤(BAP)的培养基上诱导出芽15天。然后将该阶段形成的芽栽培在补充了30g/l蔗糖但不含激素的MS培养基上发育10天。下一阶段，收集发育的芽，将它们栽培在含有一半盐、维生素和糖，而且不含激素的MS生根培养基上。约15天后，将长出根的芽移植到土中。

3.3-海利霉素在转基因烟草中表达的分析

a)特异性多克隆抗体的产生

按照Centre de Bioexperimentation VALBEX(IUT A-LyonⅠ)通用程序用天然海利霉素免疫家兔获得了多克隆抗体。然后将获得的血清(15ml)在与海利霉素偶联的Sepharose 4B柱(Pharmacia；ref 17-0430-01)上免疫纯化，来特异性选择能识别该肽的免疫球蛋白。最后将这些抗体用6ml甘氨酸(200mM；pH3)洗脱，用1M Tris pH9.5中和，用0.5×PBS透析，-20℃冰冻储藏直到使用时。

b)转基因烟草中海利霉素的免疫检测

对8株构建物pRPA-NP6的转基因植物和野生型对照分析了海利霉素的表达。将温室中长成的发育良好的烟草叶子置于液氮温度下细细磨碎，在50mM Tris-HCl缓冲液，1％PVP25,0.05％Triton X100,pH7.5中以每克鲜重4毫升缓冲液量4℃抽提蛋白质1小时。离心后，用Bradford法测定上清液中的蛋白浓度。

将9个抽提物各5毫克蛋白和作为阳性对照的50ng纯海利霉素以“狭线印迹”形式放在硝化纤维膜上。将膜在以TBS配的1％封闭缓冲液(Boehringer；ref 1 921 673)中培育1小时，然后与免疫纯化的针对海利霉素的抗体(以含0.5％Tween 20的TBS稀释1/2000)4℃培育过夜。洗涤后(TBS,0.1％Tween20和0.5％封闭缓冲液)，将膜与特异性针对家兔免疫球蛋白并与碱性磷酸酶(SIGMA A-3687)偶联的山羊抗体(1/50000稀释)在室温下培育1小时(TBS和0.5％封闭缓冲液)。洗涤(TBS,0.1％Tween 20)后，加入磷酸酶底物(BioRad；ref 170-5012)进行检测，在Amersham胶卷(ECL)上通过发光产物的放射显影获得结果。该实验的结果显示4个转基因烟草植物强表达海利霉素。其它转基因植物中的信号弱或与野生型对照比较无显著性。最好的植物中观察到的信号是阳性对照的水平(50ng海利霉素)，这表明在该植物中，用重量表示的海利霉素占总蛋白1％。

实施例V-1：可乳化的浓缩物

实施例可乳化浓缩物1：

-活性物质 400g/l

-碱金属十二烷基苯磺酸盐 24g/l

-含有10分子环氧乙烷的氧乙烯壬基酚 16g/l

-环己酮 200g/l

-芳族溶剂适量1升

实施例可乳化浓缩物2：

-活性物质 250克

-环氧化植物油 25克

-芳烷基磺酸酯和聚乙二醇醚和脂肪醇的混合物 100克

-二甲基甲酰胺 50克

-二甲苯 575克

实施例V-2：可流动物

实施例可流动物1：

-活性物质 500克

-聚乙氧基化三苯乙烯基磷酸酯 50g/l

-聚乙氧基化烷基苯 50克

-碳酸钠 20克

-乙二醇 50克

-有机多分子硅醚油(抗泡沫剂) 1克

-多糖 1.5g

-水 316.5g

实施例V-3：可湿性粉末(或喷洒粉末)

实施例可湿性粉末1

-活性物质 50％

-乙氧基化脂肪醇(湿润剂) 2.5％

-乙氧基化苯乙基苯(分散剂) 5％

-白垩(惰性载体) 42.5％

实施例可湿性粉末2：

-活性物质 10％

-C13，分支型羰基合成醇，用8到1环氧乙烷乙氧基化(湿润 0.75％剂)

-中性木素磺酸钙(分散剂) 12％

-碳酸钙(惰性填充剂) 适量100％

实施例可湿性粉末3：

-活性物质 75％

-湿润剂 1.50％

-分散剂 8％

-碳酸钙(惰性填充剂) 适量100％

实施例可湿性粉末4：

-活性物质 90％

-乙氧基化脂肪醇(湿润剂) 4％

-乙氧基化苯乙基苯(分散剂) 6％

实施例可湿性粉末5：

-活性物质 50％

-阴离子和非离子表面活性剂的混合物(湿润 2.5％剂)

-木素磺酸钠(分散剂) 5％

-高岭土(惰性载体) 42.5％

实施例V-4：可分散颗粒

实施例可分散颗粒1：

在混合器中混合重量90％的活性物质和10％珠脲。然后将混合物置于锯齿形滚筒研磨机中研磨。获得水重量大约8％的润湿粉末。将湿粉在多孔滚筒挤压机中挤压。获得干燥颗粒，然后将其压碎并筛分，从而只留下大小在150和2000微米之间的颗粒。

实施例可分散颗粒2：

将下列成分在混合器中混合：-活性物质 75％-湿润剂(烷基萘磺酸钠) 2％-分散剂(聚萘基磺酸钠) 8％-不溶于水的惰性载体(高岭土) 15％

在流化床上存在水，使该混合物颗粒化，然后干燥，压碎并筛分从而获得大小在0.15和0.80mm之间的颗粒。

实施例V-5：药物组合物

实施例A：片剂

含有50mg剂量活性肽、具有下列组合物的片剂根据常用技术如下制备：-肽海利霉素M1 50毫克-淀粉 60毫克-乳糖 50毫克-硬脂酸钠 2毫克

实施例B：可注射溶液

制备具有以下组合物，含有20毫克活性肽的可注射溶液：-肽海利霉素M2 22.4毫克-蒸馏水约2cm³

实施例Ⅵ海利霉素活性的稳定性

抗微生物肽对植物蛋白酶的稳定性对于在转基因植物中获得良好表达水平，因此获得对植物病原体的抵抗力是必要因素。例如该稳定性是昆虫抗微生物肽如天蚕抗菌肽B(Owens和Heutte,1997,MPMI vol 10,No.4,pp525-528)的关键点。我们将试验植物病原体灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)，与8种主要种植物(玉米、小麦、大麦、油菜、大豆、向日葵、番茄和烟草)的粗提取物一起培养，然后测试了海利霉素及其活性的稳定性。

将这8种作物的叶子放在低温(液氮)的臼中研磨，然后将粉末重悬浮在同体积水中。离心(10,000g,30分钟)后，收集上清液，测定蛋白质浓度。将8个抽提物的浓度用水稀释到1mg/ml，然后将这些抽提物无菌过滤(0.2微米)。将各100微升抽提物(以及只用水的对照)加到50微升海利霉素水溶液中(含有15微克，以及没有肽的对照)。将这些混合物30℃培育，Oh,1h,2h,4h和20h后收集每份20微升，并立即冰冻用于试验。

将各部分加到80微升的新鲜的灰葡萄孢菌孢子悬浮液(马铃薯-葡聚糖肉汤(Difco,12g/l)10,000个孢子/ml)中，在微孔板中25℃进行抗真菌活性的测试。12小时和24小时后目测结果显示，即使对于30℃培养了20小时，并暴露于玉米、小麦、大麦、油菜、大豆、向日葵、番茄和烟草的粗抽提物的样品，海利霉素的抗真菌活性也没有显著丧失。该结果表明海利霉素对蛋白酶有很高的稳定性，而且在灰葡萄孢菌上测得的抗真菌活性不受植物粗提物存在的影响。

实施例Ⅶ：不同海利霉素突变体的产生：单体、双体、三体和四体突变体

根据实施例Ⅱ中描述的方法，用选择用于引入突变的其它寡核苷酸替换了寡核苷酸1到6中的一些，来制备了下列突变体。

-海利霉素R48：用碱性氨基酸，具体是精氨酸(Arg48)替换了SEQ IDNO:1的氨基酸Glu48。用具有序列：SEQ ID NO:1的编码海利霉素的序列类推，编码Glu的密码子GAA以编码Arg的密码子AGA替换。将寡核苷酸19和20用来替换实施例Ⅱ的寡核苷酸5和6。

寡核苷酸19:5′GATCCTTCGC TAACGTTAAC TGTTGGTGTA GAACCTGATA GG 3′

寡核苷酸20:5′TCGACCTATC AGGTTCTACA CCAACAGTTA ACGTTAGCGA AG 3′

-海利霉素L28L29：用两个疏水氨基酸，具体是两个亮氨酸(Leu28和Leu29)替换SEQ ID NO:1位置28和29的两个碱性氨基酸Lys和Arg。用具有序列：SEQ ID NO:1的编码海利霉素的序列类推，用编码肽残基Leu-Leu的序列TTG-TTG替换编码肽残基Lys-Arg的AAG-CGC部分。将寡核苷酸21和22用来替换实施例Ⅱ的寡核苷酸3和4。

寡核苷酸21:5′CTAGTGACTG CAACGGCGAG TGCTTGTTGC GC 3′

寡核苷酸22:5′GCAACAAGCA CTCGCCGTTG CAGTCA 3′

-海利霉素L28L29R48：用两个亮氨酸残基置换序列识别号：1的28和29位的两个碱性氨基酸Lys和Arg，并用精氨酸(Arg48)置换序列识别号：1的氨基酸Glu48。用寡核苷酸19-22替代实施例Ⅱ的寡核苷酸3-6。

-海利霉素A24A25：用两个丙氨酸(Ala24和Ala25)置换序列识别号：1的两个氨基酸Asu24和Gly25。用序列SEQ ID NO:1的海利霉素编码序列类推，用编码Ala-Ala的序列GCT-GCT替换编码采集Asn-Gly的AAC-GGC部分。用寡核苷酸23和24替换实施例Ⅱ中的寡核苷酸3和4。

寡核苷酸23:5′CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCAAGCGGC GC 3′

寡核苷酸24:5′GCCGCTTGCA CTCAGCAGCG CAGTCA 3′

-海利霉素A6A7A8A9：用4个丙氨酸(Ala)替换SEQ ID NO:1的氨基酸Asp6-Lys-7-Leu-8-Ile9。用具有序列：SEQ ID NO:1的编码海利霉素的序列类推，用编码肽残基Ala-Ala-Ala-Ala的序列GCT-GCT-GCT-GCT替换了编码肽残基Asp-Lys-Leu-Ile的GAC-AAG-TTG-ATT部分。用寡核苷酸25和26来替换实施例Ⅱ的寡核苷酸1，而用寡核苷酸27和28来替换寡核苷酸2。

寡核苷酸25:5′AGCTTGGATA AAAGAGCTGC TGCTGCTGGT AGCTGTGTTT 3′

寡核苷酸26:5′GGGGCGCCG TCAACTACA 3′

寡核苷酸27:5′CTAGTGTAGT TGACGGCGCC CC 3′

寡核苷酸28:5′AAACACAGCT ACCAGCAGCA GCAGCTCTTT TATCCA 3′

-海利霉素A24A25L28L29：需要两条寡核苷酸(有义和反义)来补偿SEQID NO:1的海利霉素中，在编码由两个氨基酸Asn24-Gly25构成的肽残基的序列和编码由两个氨基酸Lys28-Arg29构成的肽残基的序列之间限制性位点的缺失。两条寡核苷酸序列29和30分别替换实施例Ⅱ的两条寡核苷酸序列3和4。

寡核苷酸29:5′CTAGTGACTG CGCTGCTGAG TGCTTGTTGC GC 3′

寡核苷酸30:5′GCAACAAGCA CTCAGCAGCG CAGTCA 3′

半制备规模产生突变海利霉素

以下列方式制备和纯化了海利霉素的各种突变体。将一种表达突变海利霉素的转化酵母克隆在50毫升选择性培养液中29℃培养48小时。然后用该预培养物接种2升选择性培养液，29℃培养48小时。离心(4000g,30分钟，4℃)除去酵母。将上清液用醋酸酸化到pH3.5，进行第二次离心(4000g,30min,4℃)，然后进行第一次固相抽提步骤。

-反相凝胶上的第一次固相抽提步骤：将酸化上清液放在用酸性水(0.05％TFA)平衡的C18反相Sep-Pak Vac 35cc柱体上(Water Associates,10g/相)。用酸化水洗涤，然后用0.05％TFA配的15％乙腈溶液洗涤除去亲水分子。用0.05％TFA配的60℃乙腈溶液洗脱肽。将用60％乙腈洗脱的组分冻干，然后重新溶于无菌超纯水中，再进行第一次纯化步骤。

-阳离子交换凝胶上的第二次固相抽提步骤：将60％预纯化、含有突变海利霉素的组分，重新溶解于25mM醋酸铵溶液，pH3.4。将该样品放在用25mM醋酸铵，pH3.4平衡的CM阳离子交换Sep-Pak Vac 35cc柱体(WaterAssociates,10g相)上。用25mM醋酸铵，pH3.4配的1M氯化钠(NaCl)洗脱突变的海利霉素。回收含有突变的海利霉素的1M NaCl组分，真空干燥，用20ml酸化超纯水(1％TFA)重溶解。然后用反相HPLC纯化突变的海利霉素。

-用HPLC的最后纯化步骤：在制备性反相柱Aquapo re RP-300C8(Brownlee^TM,220×10nm,300)上，使用2％到23％(10分钟)和23％到33％(80分钟)的0.05％TFA配的乙腈双相线性梯度，以稳定流速2.5ml/min将突变海利霉素纯化到均一。真空干燥收集的组分，用超纯水重溶解，并用MALDI质谱分析来验证纯度和一致性。在用于参考海利霉素所述的条件下，分析不同突变海利霉素对下列菌株的抗真菌活性：粗糙脉孢菌、黄色镰孢菌、红烟草赤壳菌。也评估了海利霉素突变体对细菌的活性。所用实验条件如下所述。

体外活性试验：用显微分光光度法测量抗细菌和抗真菌活性

该方法学用来测定肽活性谱和突变肽仍有活性的最小抑制浓度(MIC)。MIC用浓度范围[a]-[b]表示，其中[a]是观察到出现生长的最小浓度，而[b]是观察不到生长的浓度。在表3中给出了对于细菌和丝状真菌突变海利霉素的比活力。

通过抑制培养液中(细菌)生长的试验检测了抗菌活性。将要试验的细菌悬浮在“Poor Broth”型营养培养液中。优选的，用去离子水配的，补充1％(w/v)NaCl的1％细菌胰化蛋白胨。将待分析的10微升各组分放在含有细菌(最终浓度等价于600nm处1mOD)的90微升培养液的微量滴定板上。25℃培育12到24小时。用微量滴定板阅读分光光度计，通过监测600nm处吸光度测量细菌生长。

-测试细菌：巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium(收集自InstitutPasteur)，藤黄微球菌Micrococcus luteus(收集自Institut Pasteur)，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(H.Monteil,Institut ofbacteriology,Strasbourg)，浅绿气球菌Aerococcus viridans(H.Monteil,Institut of bacteriology,Strasbourg)，大肠杆菌D22(P.L.Boquet,Centerfor nuclear studies,Saclay)。

表3：一些突变海利霉素对丝状真菌和细菌的活性

微生物海利霉素突变体的MIC(μm)

	L28L29	R48	L28L29R48	A6A7A8A9	海利霉素
	L28L29	R48	L28L29R48	A6A7A8A9	海利霉素	真菌
粗糙脉孢菌黄色镰孢菌红烟草赤壳菌	0.8-1.63.1-6.23.1-6.2	0.4-0.80.4-0.80.4-0.8	0.8-1.60.8-1.60.8-1.6	1.6-3.13.1-6.2ND	0.1-0.20.2-0.40.4-0.8	真菌
粗糙脉孢菌黄色镰孢菌红烟草赤壳菌	0.8-1.63.1-6.23.1-6.2	0.4-0.80.4-0.80.4-0.8	0.8-1.60.8-1.60.8-1.6	1.6-3.13.1-6.2ND	0.1-0.20.2-0.40.4-0.8	细菌
巨大芽胞杆菌藤黄微球菌金黄色葡萄球菌浅绿气球菌大肠杆菌D22	50-10012.5-25NDNDND	ND25-50NDNDND	NDNDNDNDND	6.2-12.5NDND12.5-25ND	NDNDNDNDND	细菌

ND：未检测到活性。

实施例Ⅷ：急性毒性的研究

通过静脉注射溶于盐水溶液剂量为1和10mg/kg的海利霉素(SEQ ID NO:2)溶液治疗4只一组的雌性小鼠。抑蛋白酶肽的相应溶液作为阴性对照(两剂无效果)而蜂毒肽作为阳性对照(10毫克5日内100％死亡，1毫克5日内显著效果)。注射了两剂海利霉素溶液未显示毒性。

参考文献

Ausubel,F.A.等。(Greene编辑)。分子生物学现有方案，Publ.Wiley&Sons。

Bevan,M.等(1983)，核酸研究，11:369-385。

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Ehret-Sabatier等，(1996)，生物化学杂志，271,47,29537-29544。

Horsch等，(1985)，科学，227:1229-1231。

Jefferson等，(1987)，胚胎学杂志，6:3901-3907。

Komari等，(1986)，细菌学杂志，166:88-94。

Rothstein等，(1981),Cold Spring Harb.Sym.Quant.Biol.45:99-105。

Stalker等，(1988)，生物化学杂志，263:6310-6314。

Odell,J.T.等(1985)，自然，313:810-812。

序列表(1)一般信息：(ⅰ)申请人：

(A)姓名：RHONE-POULENC AGROCHIMIE

(B)街道：14-20 Rue Pierre BAIZET

(C)城市：里昂

(E)国家：法国

(F)邮政编码：69009(ⅱ)发明名称：编码海利霉素的基因及其用途(ⅲ)序列数目：38(ⅳ)计算机可读形式：

(A)记录介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容型

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：147碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(ⅸ)特征：

(A)姓名/关键：CDS

(B)位置：1..147(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:AGC TTG GAT AAA AGA GAC AAG TTG ATT GGC AGC TGT GTT TGG GGC GCC 48ser Leu Asp Lys Arg Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala1 5 10 15GTC AAC TAC ACT AGT GAC TGC AAC GGC GAG TGC AAG CGC CGC GGT TAC 96Val Asn Tyr Thr Ser Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr

20 25 30AAG GGT GGC CAT TGT GGA TCC TTC GCT AAC GTT AAC TGT TGG TGT GAA 144Lys Gly Gly His Cys Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu

35 40 45ACC 147Thr49(2)SEQ ID NO:2的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：169碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(ⅸ)特征：

(A)姓名/关键：CDS

(B)位置：1..132(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:GAT AAG CTT ATC GGT TCC TGC GTG TGG GGT GCT GTG AAC TAC ACT TCC 48Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15GAT TGC AAC GGT GAG TGC AAG AGG AGG GGT TAC AAG GGT GGT CAC TGC 96Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys

20 25 30GGT TCC TTC GCT AAC GTG AAC TGC TGG TGC GAG ACT TGAGAGCTCG 142Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr

35 40GCGAGGCGAA CGTGTCGACG GATCCGG 169(2)SEQ ID NO:3的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：261碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

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(A)姓名/关键：CDS

(B)位置：3..224(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:CC ATG GGT TTC GTG CTT TTC TCT CAG CTT CCA TCT TTC CTT CTT GTG 47Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu Leu Val

1 5 10 15TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC TCT TGC CGT GCC GAT 95Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg Ala Asp

20 25 30AAG CTT ATC GGT TCC TGC GTG TGG GGT GCT GTG AAC TAC ACT TCC GAT 143Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser Asp

35 40 45(2)SEQ ID NO:4的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：120碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(ⅸ)特征：

(A)姓名/关键：CDS

(B)位置：12..101(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:GCGTCGACGC G ATG GGT TTC GTG CTT TTC TCT CAG CTT CCA TCT TTC CTT 50

Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu

1 5 10CTT GTG TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC TCT CAC TCT TGC CGT 98Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg

15 20 25GCT GGAGACGCGA ATTCACACA 129Ala30(2)SEQ ID NO:5的信息：

(ⅰ)序列特征：

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(A)描述：/描述=“合成寡核苷酸7”(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA 60CTCTTCTTCT TTTCC 75(2)SEQ ID NO:6的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：72碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸

(A)描述：/描述=“合成寡核苷酸8”(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA GAAGAGTAGA CACAAGAAGG 60AAAGATGGAA GC 72(2)SEQ ID NO:7的信息：(ⅰ)序列特征：

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(B)类型：核苷酸

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(B)类型：核苷酸

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(A)描述：/描述=“合成寡核苷酸10”(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCTCAAGT CTCGCACCAG CAGTTCACGT 60TAGCGAAGGA ACCGCAGTGA CCACCCTTGT AACCCCTCCT CTTGCACTC 109(2)SEQ ID NO:9的信息：(ⅰ)序列特征：

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(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

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(A)描述：/描述=“合成寡核苷酸11”(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC 60CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 85(2)SEQ ID NO:10的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：66碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

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(A)描述：/描述=“合成寡核苷酸12”(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC 60TAGAGG 66(2)SEQ ID NO:11的信息：(ⅰ)序列特征：

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(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

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(A)描述：/描述=“合成寡核苷酸13”(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT 60GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG 93(2)SEQ ID NO:12的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：93碱基对

(B)类型：核苷酸

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(A)描述：/描述=“合成寡核苷酸14”(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC 60GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG 93(2)SEQ ID NO:13的信息：(ⅰ)序列特征：

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(B)类型：核苷酸

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(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

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(A)姓名/关键：CDS

(B)位置：7..73(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15:TCTAGA ATG GCC TGC ACC AAC AAC GCC ATG AGG GCC CTC TTC CTC CTC 48

Met Ala Cys Thr Asn Asn Ala Met Arg Ala Leu Phe Cys Ile

1 5 10CTG CTC TTC TGC ATC GTG CAC GGC GCCGAATTC 81Val Leu Phe Cys Ile Val His Gly15 20(2)SEQ ID NO:16的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：24碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸

(A)描述：/描述=“合成寡核苷酸17”(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16:GATAAGCTTA TCGGTTCCTG CGTG 24(2)SEQ ID NO:17的信息：(ⅰ)序列特征：

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(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸

(A)描述：/描述=“合成寡核苷酸18”(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17:GGCTCGAGTC AAGTCTCGCA CCAGCAGTTC AC 32(2)SEQ ID NO:18的信息：(ⅰ)序列特征：

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(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(ⅸ)特征：

(A)姓名/关键：CDS

(B)位置：7..205(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18:TCTAGA ATG GCC TGC ACC AAC AAC GCC ATG AGG GCC CTC TTC CTC CTC 46

Met Ala Cys Thr Asn Asn Ala Met Arg Ala Leu Phe Cys Ile

1 5 10CTG CTC TTC TGC ATC GTG CAC GGC GAT AAG CTT ATC GGT TCC TGC GTG 96Val Leu Phe Cye Ile Val His Gly Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val15 20 25 30TGG GGT GCT GTG AAC TAC ACT TCC GAT TGC AAC GGT GAG TGC AAG AGG 144Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg

35 40 45AGG GGT TAC AAG GGT GGT CAC TGC GGT TCC TTC GCT AAC GTG AAC TGC 192Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys

50 55 60TGG TGC GAG ACT TGACTCGAG 213Trp Cys Glu Thr

65(2)SEQ ID NO:19的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：838碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：双链

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(A)姓名/关键：终止子

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(A)长度：1036碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：双链

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(A)姓名/关键：nos终止子

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20 25 30GCT GTG AAC TAC ACT TCC GAT TGC AAC GGT GAG TGC AAG AGG AGG GGT 682Ala Val Asn Tyr Thr Ser Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly

35 40 45TAC AAG GGT GGT CAC TGC GGT TCC TTC GCT AAC GTG AAC TGC TGG TGC 730Tyr Lys Gly Gly His Cys Gly Ser phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys

50 55 60GAG ACT TGACTCGAGG GGGGGCCCGG TACCGGATCC AATTCCCGAT CGTTCAAACA 786Glu Thr65TTTGGCAATA AAGTTTCTTA AGATTGAATC CTGTTGCCGG TCTTGCGATG ATTATCATAT 846AATTTCTGTT GAATTACGTT AAGCATGTAA TAATTAACAT GTAATGCATG ACGTTATTTA 906TGAGATGGGT TTTTATGATT AGAGTCCCGC AATTATACAT TTAATACGCG ATAGAAAACA 966AAATATAGCG CGCAAACTAG GATAAATTAT CGCGCGCGGT GTCATCTATG TTACTAGATC 1026GGGGATCGAT 1036(2)SEQ ID NO:21的信息：(ⅰ)序列特征：

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(B)类型：核苷酸

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(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸

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(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

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(C)链型：单链

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(A)长度：26碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸

(A)描述：/描述=“合成寡核苷酸30”(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:38:GCAACAAGCA CTCAGCAGCG CAGTCA 26

Claims

1．基本含有式(Ⅰ)肽序列的肽：

Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag(Ⅰ)

其中：

Xab是含有1到10个氨基酸，优选10个氨基酸的肽残基，

Xac是3个氨基酸的肽残基，

Xad是含有1到9个氨基酸，优选9个氨基酸的肽残基，

Xae是含有1到7个氨基酸，优选7个氨基酸的肽残基，

Xaf是1个氨基酸的肽残基，和

Xag是-OH，或含有1到5个氨基酸，优选1或2个氨基酸的肽残基。

2．如权利要求1所述的肽，其特征在于：

Xaa含有至少一个碱性氨基酸，和/或Xad含有至少一个碱性氨基酸。

3．如权利要求2所述的肽，其特征在于，Xad含有1、2、3或4个碱性氨基酸。

4．如权利要求2或3任一所述的肽，其特征在于，碱性氨基酸选自赖氨酸、精氨酸或高精氨酸。

5．如权利要求1到4任一所述的肽，其特征在于，Xad代表下列肽序列-Lys-Xad′-Xad″-Gly-His-，其中Xad′代表1个碱性氨基酸的肽残基而Xad″代表含有0到5个氨基酸，优选5个氨基酸的肽残基。

6．如权利要求1到5任一所述的肽，其特征在于，Xad代表下列肽序列-Lys-Arg-Arg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Gly-His-。

7．如权利要求1到6任一所述的肽，其特征在于，Xac含有至少一个酸性氨基酸，优选一个酸性氨基酸。

8．如权利要求1到7任一所述的肽，其特征在于，Xac代表下列肽序列-Asn-Xac′-Xac″，其中Xac′代表1个氨基酸的肽残基，而Xac″代表1个酸性氨基酸的肽残基。

9．如权利要求7或8任一所述的肽，其特征在于，酸性氨基酸选自谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)。

10．如权利要求1到10所述的肽，其特征在于，Xac代表下列肽序列-Asn-Gly-Glu-。

11．如权利要求1到10任一所述的肽，其特征在于：

Xaa代表下列肽序列Xaa′-Gly-Xaa″，其中Xaa′代表NH₂或含有1到9个氨基酸，优选1到5个氨基酸的肽残基，而Xaa″代表含有至少一个氨基酸，优选自Leu、Ile、Val、Pro、Ser或Thr的肽残基，和/或

Xaf代表下列氨基酸之一：Trp、Phe、Leu、Ile或Val和/或

12．如权利要求1到11任一所述的肽，其特征在于，Xaa代表下列肽序列NH₂-Asp-Lys-Leu-Ile-Gly-Ser-，和/或

Xab代表下列肽序列-Val-Trp-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Thr-Ser-Asp-，和/或

Xae代表下列肽序列-Gly-Ser-Phe-Ala-Asn-Val-Asn-，和/或

Xaf代表下列氨基酸-Trp-，和/或

Xag代表下列肽序列-Glu-Thr-OH。

13．如权利要求1到12任一所述的肽，其特征在于，该肽用SEQ ID NO:2代表。

14．如权利要求1到13任一所述的肽，其特征在于，该肽在两个末端的一端，或两端含有其在宿主生物体中表达和靶向所必需的肽残基。

15．如权利要求1到14任一所述的肽，其特征在于，式(Ⅰ)肽的半胱氨酸残基形成至少一个分子内二硫键。

16．如权利要求15所述的肽，其特征在于，该肽含有在半胱氨酸残基1和4、2和5、以及3和6之间形成的三个二硫键。

17．“肽-海利霉素″融合肽，其特征在于，海利霉素是根据权利要求1到16任一项所确定的肽。

18．如权利要求17所述的融合肽，其特征在于，与海利霉素融合的肽是信号肽或转运肽。

19．如权利要求18所述的融合肽，其特征在于，该转运肽是烟草PR-1α基因的信号肽，或因子Matα1的前体，或玉米聚半乳糖醛酶PG1基因的信号肽。

20．如权利要求19所述的融合肽，其特征在于，该肽由SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、或由SEQ ID NO:18代表。

21．如权利要求1到20任一所述的作为药剂的肽。

22．一种组合物，其特征在于，该组合物包含权利要求1到20任一所述的肽和合适的载体。

23．一种核酸片段，其特征在于，该核酸片段包含编码如权利要求1到20任一所述的肽的核酸序列。

24．如权利要求23所述的核酸片段，其特征在于，该核酸片段是DNA型核苷酸序列。

25．如权利要求24所述的核酸片段，其特征在于，该DNA型核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的碱基16-147、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的碱基3到224、或SEQ ID NO:18的碱基7到205所述的DNA序列，所述序列的同源序列或互补序列。

26．一种嵌合基因，它包含编码序列以及能在宿主生物体，具体是植物中起作用的在5′和3′位置的异源调控序列，其特征在于，所述编码序列包含至少一条如权利要求23到25中确定的DNA片段。

27．如权利要求26所述的嵌合基因，其特征在于，该宿主生物体是微生物。

28．如权利要求26所述的嵌合基因，其特征在于，该宿主生物体选自植物细胞和植物。

29．用来转化宿主生物体的克隆或表达载体，其特征在于，该载体包含至少一个复制起始点和至少一个如权利要求26到28确定的嵌合基因。

30．转化的宿主生物体，其特征在于，该生物体含有如权利要求23-25所述的核酸片段，或如权利要求26到28所述的嵌合基因。

31．如权利要求30所述的转化的宿主生物体，其特征在于，该转化的宿主生物体包括微生物、植物细胞或植物。

32．如权利要求30所述的转化的宿主生物体，其特征在于，该转化的宿主生物体是含有转化细胞的植物。

33．如权利要求32所述的转化的宿主生物体，其特征在于，该植物是从转化细胞中再生的。

34．如权利要求30所述的转化的宿主生物体，其特征在于，该微生物选自细菌，具体是大肠杆菌；酵母，具体是酿酒酵母、克鲁维酵母、毕赤酵母；真菌，具体是曲霉；或杆状病毒。

35．转化的植物细胞，其特征在于，该细胞含有如权利要求23到25所述的核酸片段，或如权利要求26到28所述的嵌合基因。

36．转化的植物细胞，其特征在于，该细胞包含至少一种如权利要求35所述的转化植物细胞。

37．如权利要求36所述的转化植物，其特征在于，它对由尾孢菌，具体是甜菜尾孢；枝孢菌，具体是草本枝孢；镰孢菌，具体是黄色镰孢或禾谷镰孢；疫霉菌，具体是樟疫霉引起的疾病具有抵抗力。

38．转化的植物，其特征在于，该植物衍生自培养/杂交如权利要求36和37任一所述的植物。

39．如权利要求36到38任一所述的转化植物的种子。

40．转化宿主生物体，具体是植物细胞或植物的方法，其特征在于，将至少一条如权利要求23到25所述的核酸片段或如权利要求26到28所述的嵌合基因引入所述宿主生物体。

41．如权利要求40所述的方法，其特征在于，宿主生物体是植物细胞或植物。

42．如权利要求41所述的方法，其特征在于，该植物从植物细胞或从转化植物再生。

43．一种培养如权利要求36到38任一所述的转化的植物的方法，其特征在于，该方法包含：将所述转化植物的种子种到适合培养该植物的田块中，在所述田的所述小块中施用农用化学组合物，而基本不影响所述种子或所述转化植物，然后当所述植物达到需要的成熟度时，收集培养的植物并可任选的从收集的植物中分离种子。

44．如权利要求33所述的培养方法，其特征在于，该农用化学组合物包含至少一种活性产物，所述产物具至少一种杀真菌和/或杀菌活性。

45．如权利要求44所述的培养方法，其特征在于，所述活性产物显示的活性和权利要求1到20任一所述的肽的活性互补。

46．制备如权利要求1到20任一所确定的海利霉素的方法，其特征在于，该方法包含：在合适的培养基中培养权利要求30到34任一所述的转化生物体，然后抽提，获得全部或部分纯化的海利霉素。