CN1220700A - 抗真菌多肽和控制植物致病性真菌的方法 - Google Patents

抗真菌多肽和控制植物致病性真菌的方法 Download PDF

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Abstract

提供了一种可控制真菌对植物的损害的抗真菌多肽,AlyAFP。编码此多肽的DNA可被克隆入用于转化植物定居微生物或植物的载体,由此提供一种抑制植物上真菌生长的方法。此多肽可配制成能用于控制植物上不希望的真菌的组合物和其它。

Description

抗真菌多肽和控制植物致病性真菌的方法
发明背景发明领域
本发明涉及一种从Alyssum属植物的花中获得的抗真菌多肽，AlyAFP，和用此抗真菌多肽控制病原真菌的方法。本抗真菌多肽可直接施用于植物，以产生该多肽的微生物形式施用于植物，或遗传修饰植物本身以产生该多肽。本发明还涉及方法中用到的DNA序列，微生物，植物，和组合物。相关领域描述
分离了显示针对多种已分离的病原真菌的抗真菌活性的若干植物多肽或蛋白(Bowles(1990)生物化学年鉴59:873-907；Brears等(1994)Agro-Food-Industry Hi-Tech.10-13)。这些抗真菌多肽和蛋白包括几类包括壳多糖酶，富含半胱氨酸壳多糖结合蛋白，β-1,3-葡聚糖酶，permatins(包括zeamatins)，硫堇，核蛋白体灭活蛋白，和非特异转脂蛋白，被认为在植物抵御真菌感染中扮演重要角色。
最近，发现另一组植物蛋白在对抗植物病原感染时可起防御物功能(PCT国际专利公布WO93/05153)。两种分离自小萝卜radish种子的富含半胱氨酸多肽，Rs-AFP1和RsAFP2，被发现当纯蛋白加入体外抗真菌测定培养基中时可抑制许多病原真菌的生长。发现含有编码Rs-AFP2蛋白基因的转基因烟草比非转基因植物更能对抗真菌攻击。
已从许多其它植物种子中分离得到小萝卜种子Rs-AFP2类似蛋白(PCT国际专利公布WO93/05153；Broekaret等(1995)植物生理。108:1353-1358)。本组蛋白都具有相似的氨基酸序列，但针对不同的真菌有不同抗真菌活性，特别是当更接近植物细胞生理条件，测定基质中含不同的单价或二价盐时：一些抗真菌多肽的抗真菌活性在1mMCaCl2和50mMKCl存在时会显著降低(Terras等(19920生物化学杂志267:15301-15309)。由于金属离子如K+,Na+,Ca2+和Mg2+是正常生理功能必需且在植物细胞中丰富存在，抗真菌活性对盐浓度的敏感度可极大影响抗真菌多肽用于抗病遗传工程植物。
已显示用天然蛋白产物控制植物病原，例如在欧洲专利申请0 392225中。
发明概述
本发明者发现了一种新多肽，AlyAFP，具有针对植物病原或其它真菌的广谱抗真菌活性。一方面，本发明提供了一种分离的含有如序列号2所示氨基酸序列的抗真菌多肽和其生物学功能等同物。
AlyAFP，或生物学功能相应物，可从植物分离，或用本领域熟知的合适方法产生或合成，包括直接化学合成，或在异种生物系统中合成如微生物，植物，和动物系统，组织培养，细胞培养，或体外翻译系统。
本发明也提供分离的编码本发明抗真菌多肽的DNA序列，和将此DNA序列插入宿主细胞以产生其编码多肽的基因构建物及其方法。
本发明也提供了用编码本发明抗真菌多肽的DNA核苷酸序列转染的微生物和植物。
本发明提供表达本发明抗真菌多肽的转染的植物，及与此抗真菌多肽共表达其它蛋白的植物，这些蛋白包括抗真菌，抗细菌，或抗病毒病原-相关肽，多肽或蛋白；杀昆虫蛋白，如苏云金(B.t.)蛋白；和涉及改善植物产品质量或农艺学表现的蛋白。在植物中同时共表达多个抗真菌多肽其优点是能启动多个抗真菌损害模式。这能使耐药真菌株的发展可能性最小，拓宽抗性范围，可能产生种群抗真菌结果，由此增强耐受水平。例如WO92/17591即是这样。
转染表达B.t.基因的植物实例在欧洲专利公布0 385 962，相应与美国序列号07/476,661,1990年2月12日提交，Fischhoff等，中展示。
能与编码本发明多肽的DNAs共表达的非限制性例举的DNAs包括1)编码酶的DNAs如：葡萄糖氧化酶(将葡萄糖转变为葡糖酸，伴随产生过氧化氢，能对广谱的植物病原提供抗性)；丙酮酸氧化酶；oxylate氧化酶；胆固醇氧化酶；氨基酸氧化酶；和其它氧化酶用分子氧做初级或二级底物产生过氧化物，包括过氧化氢；2)发病机理相关蛋白如SAR8.2a和SAR8.2b蛋白；烟草PR-1a,PR-1b,PR-1c,PR-1’,PR-2,PR-3,PR-4,PR-5,PR-N,PR-O,PR-O’,PR-P,PR-Q,PR-R,PR-S蛋白的酸性或碱性形式；壳多糖酶如烟草碱性壳多糖酶和黄瓜壳多糖酶/溶菌酶；过氧化物酶如黄瓜碱性过氧化物酶，葡聚糖酶如烟草碱性葡聚糖酶；渗透蛋白样蛋白；3)病毒外壳蛋白和植物病毒复制酶；4)植物R-基因(抗性基因)，如拟南芥RPS2(Bent等(1994)科学265:1856-1860)，拟南芥RPM1(Grent等(1995)科学269；843-846)。烟草N基因和N’基因(Whitham等(1994)细胞78:1101-1115)，西红柿Cf-9(Jones等(1994)科学266:789-793)；亚麻L6(Ellis等(1995)美国国家科学院院刊92:4185)，水稻Xa21(Song等(1995)科学270:1804-1806)。这些基因可用基本启动子，组织特异启动子，或可被真菌病原或其它生物或化学诱导剂诱导的启动子来表达；5)病原Avr基因，如Cladosporium fulvum Avr9(Van DenAckerveken等(1992)植物杂志2:359)，可用病原或化学可诱导启动子表达；和6)唾液酸生物合成中涉及的基因，如苯甲酸2-羟化酶(Leon等(1995)美国国家科学院院刊92:10413-10417)。
若干文献已讨论了用植物和细菌葡聚糖酶，壳多糖酶和溶菌酶以产生具有对不同微生物如真菌增强抗性的转基因植物。这些包括EP0292 435.EP 0290 123.WO 88/00976.U.S.专利4,940,840,WO90/07001,EP 0392 225,EP 0307 841,EP 0332,104,EP 0 440 304,EP 0418 695,EP 0448 511，和WO91/06312.渗透蛋白-样蛋白之利用在WO91/18984中讨论。
为完成上述目的在此同时提供本发明的各个方面：
含有序列号2所示的氨基酸序列的分离的多肽。
编码分离的多肽的分离的DNA分子。分离的DNA分子可以是含有序列号12所示的核苷酸序列的cDNA分子。或者，此cDNA分子含有序列号12所示的核苷酸序列的116-269核苷酸。
含有5’到3’有效连接的重组双链DNA分子：
a)在植物细胞中起作用引起RNA序列的产生的启动子；
b)编码含有序列号2所示的氨基酸序列的多肽的结构编码序列；且
c)在植物细胞中起作用引起转录终止和在所述RNA序列3’末端加入聚腺苷酸的3’非翻译区。
上述DNA分子的结构编码区可以是含有序列号12所示的核苷酸序列的cDNA分子，或序列号12所示的核苷酸序列中116到269的核苷酸。类似的重组双链DNA分子，含有适当的启动子和其它调节区，可引入动物，真菌和细菌细胞以获得表达结构编码序列的转染细胞。
前述DNA分子的启动子可以是FMV35S启动子，CaMV35S启动子，ssRUBISCO启动子，eIF-4A启动子，LTP启动子，肌动蛋白启动子，或泛素启动子。
控制真菌对植物的损害的方法，包括向所述植物部位提供分离的含有序列号2所示氨基酸序列的多肽或基本含有序列号2所示氨基酸序列构成的多肽。真菌损害可由含有以下的组中选出的真菌引起。交链孢霉属(Alternaria)；壳单隔孢属(Ascochyta)；葡萄孢属(Botrytis)；尾孢菌属(Cercospora)；刺盘孢属(Colletotrichum)；壳色单隔孢属(Diplodia)；白粉菌属(Erysiphe)；镰刀菌属(Fusarium)；顶囊壳属(Gaeumanomyces)；长蠕孢属(Helminthosporium)；亚大茎点菌属(Macrophomina)；从赤壳属(Nectria)；霜霉属(Peronospora)；茎点孢属(Phoma)；瘤梗单孢霉属(Phymatotrichum)；疫霉属(Phytophthora)；葡萄霜霉属(Plasmopara)；白叉丝单囊属(Podosphaera)；柄锈属(Puccinia)；Puthium；核腔菌属(Pyrenophora)；梨孢霉属(Pyricularia)；腐霉属(Pythium)；丝核菌属(Rhizoctonia)；小菌核菌属(Scerotium)；核盘菌属(Sclerotinia)；壳针孢属(Septoria)；根串珠霉属(Thielaviopsis)；卷丝多囊属(Uncinula)；黑星菌属(Venturia)和轮枝孢属(Verticillium)。在本方法中，通过产生抗真菌多肽的定居于植物的微生物，通过施用含有分离多肽的组合物或通过编码多肽的DNA在植物细胞中的表达提供植物部位所述多肽。
控制真菌对植物损害的方法，包括步骤：
a)在植物细胞基因组中插入重组双链DNA分子包括；
(ⅰ)引起RNA序列产生的在植物细胞中起作用的启动子；
(ⅱ)编码含有序列号2所示的氨基酸序列的多肽的结构编码序列；
(ⅲ)在植物细胞中起作用引起转录终止和在所述RNA序列3’末端加入聚腺苷酸的3’非翻译区。
b)获得转染植物细胞；且
c)从所述转染植物细胞产生遗传稳定转染植物，其细胞表达有效量的所述多肽。
在前述方法中，结构编码序列可以含有序列号12所述核苷酸序列，或序列号12所述序列中116到269核苷酸。启动子可以是FMV35S启动子，CaMV35S启动子，ssRUBISCO启动子，EIF-4A启动子，LTP启动子，肌动蛋白启动子，或泛素启动子。
一种植物，其细胞含有包括序列号2所示的氨基酸序列的抗真菌有效量多肽。
前述植物可通过含有如下步骤的方法产生：
a)在植物细胞基因组中插入重组双链DNA分子包括；
(ⅰ)引起RNA序列产生的植物细胞中起作用的启动子；
(ⅱ)编码含有序列号2所示的氨基酸序列的多肽的结构编码序列；
(ⅲ)在植物细胞中起作用引起转录终止和在所述RNA序列3’末端加入聚腺苷酸的3’非翻译区。
b)获得转染植物细胞；且
c)从所述转染植物细胞产生遗传稳定转染植物，其细胞表达有效量的所述多肽。
前述方法中的结构编码序列可以含有序列号12所述核苷酸序列，或序列号12所述序列中116到269核苷酸。
进一步，植物基因组可包括一个或多个另外的编码抗真菌肽，多肽或蛋白的DNA分子，其中表达所述一个或多个另外的DNA分子并产生有效抗真菌量的由其编码的所述肽，多肽，或蛋白。另外的DNA分子可以含有编码B.t.内毒素的DNA，其中所述DNA表达并产生有效抗昆虫量的B.t.内毒素。此植物可从含下列的组中选出：苹果，大麦，甘蓝，卷心菜，canola，胡萝卜，柠檬，玉米，棉花，大蒜，燕麦，洋葱，观赏植物，豌豆，花生，胡椒，马铃薯，稻米，黑麦，高粱，大豆，草莓，甜菜，甘蔗，西红柿，葡萄，小麦。本发明也包括该植物产生的马铃薯种块。
一种对付不希望见到的真菌的方法，包括使不希望见到的真菌和分离的有效量含有序列号2所示的氨基酸序列抗真菌多肽接触。
一种抗真菌组合物，包括分离的有效量含有序列号2所示的氨基酸序列抗真菌多肽，和可用载体。抗真菌组合物可用于抑制生长或杀死病原真菌。这些组合物可用下述的常规方法制得，例如，Winnaker-Kuchler(1986)化学技术，4版，7卷，Hanser Verlag,Munich；vanFalkenberg(1972-1973)杀虫制剂，第2版，Marcel Dekker，纽约；和K.Martens(1979)喷雾干燥手册。第三版，G.Goodwin，公司，伦敦。需要的辅助制剂，如载体，惰性材料，表面活性剂，溶剂和其它附加剂也是本领域熟知的，且在例如Watkins，杀虫尘稀释剂和载体手册，第二版。Darland Books,Caldwell,N.J.，和Winnaker-Kuchler(1986)化学技术，4版，7卷，Hanser Verlag,Munich.用这些方法，以最终公式或罐装混合物的形式，也可能制备本抗真菌多肽和其它杀虫活性物质，肥料，和/或生长调节剂，等的混合物。
此处阐述的抗真菌组合物也包括能产生本抗真菌多肽的宿主细胞形式，例如细菌和真菌细胞，它们能定居在植物的根和/或叶上。可以这种方式应用的细菌细胞例子包括杆菌属(Agrobacterium)，节杆菌属(Arthrobacter)；Azospyrillum,Clavibacter，埃希菌属(Escherichia)，假单胞菌属(Pseudomonas)，根瘤菌(Rhizobacterium)等此类菌株。
本抗真菌多肽可以结合的一些常规的真菌抗生素和化学杀真菌剂是本领域知道的，并在Worthington和Walker(1983)杀虫手册，第7版，英国谷物保护协会，中描述。这包括例如，多氧菌素，尼可霉素，羧基酰胺，芳香糖类，carboxyine，吗啉，固醇生物合成的抑制剂，有机膦化合物。其它能制成和本发明抗真菌多肽结合形式的活性成分包括，例如，杀虫剂，吸引剂，消毒剂，杀螨剂，杀线虫剂，和除草剂。美国专利5,421,839包括许多活性试剂的综合简介，如本发明抗真菌多肽可以和其一起配制。
无论是单独还是和其它活性试剂结合，本发明抗真菌多肽应从0.1μg/ml至约100mg/ml，优选5μg/ml至5mg/ml，的浓度范围内，pH在3.0至约9.0范围内。这样的化合物可以用作缓冲，例如，1mM至1M间的磷酸缓冲液，优选10mM至100mM，更优选15mM至50mM。在低缓冲浓度时可以加入盐以增强离子强度，优选1mM至约1M的NaCl，更优选10mM至约100mM。
本发明的进一步应用范围可通过下面的详细描述和图变的明朗。然而，应当理解详细描述和特例，指本发明的优选实施方案，是仅从本发明的实质和范围内的不同变化和修饰举例给出，对本领域技术熟练人员通过此详细描述应变的明朗。
附图简述
本发明的上述对象，特点，优点将通过和附图联系的详细描述被进一步理解，所有这些仅以例证给出并不限定本发明。
此处质粒图谱中共有的DNA片段是：AMP：氨苄抗性；ori-pUC:pUC质粒来源的复制起点；LAC:LacZ基因的部分序列；p-e35S：启动子e35S；HSP70内含子：玉米来源的热休克蛋白70的内含子；NOS3’:Agrobacterium Ti质粒的胭脂氨酸合酶(nos)的3’非翻译区；ori-M13:M13噬菌体复制起始点；Spc/Str：细菌壮观霉素/链霉素抗性基因；p-FMV:figwort花叶病毒35S启动子；EPSPS/CTP2：来自拟南芥5-enopyruvyl-3-蟒草素磷酸酯合成酶基因(EPSPS)；CP4syn：glyphosate抗性CP4 5-enopyruvyl-3-蟒草素磷酸酯合酶基因(EPSPS)；E93’：豌豆ssRUBISCO E9基因的3’非翻译区；PetHSP70-Leader:5’矮牵牛热休克蛋白70基因的5’非翻译引导区：ori-322:pUC322复制起点。
图1显示AlyAFP的cDNA序列和推导的氨基酸序列。三角代表成熟的AlyAFP多肽的起点。下划线氨基酸序列代表信号肽。双下划线序列代表潜在聚A信号序列。星号表示终止密码子。
图2是AlyAFP,Rs-AFP1,Rs-AFP2的堆积比较(pileup comparison)三角代表成熟的AlyAFP和Rs-AFP1多肽的起点。下划线氨基酸序列代表信号肽(Rs-AFP2信号肽序列还未确定)，星号表示三种多肽的区别。
图3是pMON23317的物理图谱。
图4是pMON22652的物理图谱。
图5是pMON22575的物理图谱。
图6是pMON22655的物理图谱。
图7是pMON17227的物理图谱。
图8是pMON22657的物理图谱。
图9是pMON22634的物理图谱。
图10是pMON22635的物理图谱。
图11是条图，相应与表3的数据，表示对于表达AlyAFPcDNA转基因马铃薯植物Verticilluim wilt病的试验结果。
图12是条图，相应与表4的数据，表示对于表达Rs-AFP1和Rs-AFP2合成DNA转基因马铃薯植物Verticilluim wilt病的试验结果。
本发明的详细描述
提供本发明以下的详细描述是为了帮助本领域技术熟练人员实施本发明。尽管如此，以下详细描述不能解释为对本发明的不适当的限制，如此处实施方案讨论的修改和变化可由本领域熟练人员实现而不背离本发现的范围和精神。
在此详述中讨论的每一参考的内容，包括其中引用的参考文献，在此全文引入作为参考。
定义
如这里所用，“抗真菌多肽”指具有抗真菌特点的多肽，例如它抑制真菌细胞的生长，或杀死真菌细胞，或破坏或阻止真菌生活周期如孢子萌发，孢子产生，和接合。
“对抗和控制真菌破坏”在农业中是指减少庄稼被真菌病原感染后的破坏。更一般的，这个词指在任何特定部位不希望见到真菌的存在引起的有害结果的减少。
“结构编码序列”是指编码细胞产生的肽，多肽，或蛋白的DNA序列，其中肽、多肽、或蛋白通过如下步骤产生：结构编码序列转录为信使RNA(mRNA)后，然后mRNA翻译为目的肽，多肽，蛋白产物。
本发明的方法可以不同方式实施。本抗真菌多肽，通过上述任何方法制备，可和载体或其它附加物包括其它抗真菌剂以混合物形式直接施用于植物，如本领域所知。另外，多肽可由施用于植物的细菌或酵母细胞表达。植物细胞可用适当的方法转染以含有编码抗真菌多肽的DNA。这些可以以组织特异的方式组成型表达，或当或依据植物暴露于真菌病原时表达。
在一特殊方面，本发明含有具有序列号2所示序列的多肽的应用，该多肽有针对多种植物病原真菌的强抗真菌活性。
本抗真菌多肽的氨基酸序列通过直接测序和克隆cDNA的翻译确定。尽管和其它植物防御物部分同源，即具有部分序列相同，此抗真菌多肽彼此之间以及和其它植物防御物之间有超过10％氨基酸序列的不同。此外，此多肽的抗真菌活性比联系最近的植物防御物(Rs-AFP1和Rs-AFP2)明显强，特别是有生理浓度的无机阳离子存在时。比较AlyAFP和Rs-AFP1,Rs-AFP2的氨基酸序列的图集在图2显示。
本发明也包括用任一DNA序列或此处所示其生物活性等同物产生重组质粒，转染微生物，探针，和用于识别相关使植物细胞具有直接抗性的DNA序列的引物，并产生抵抗此真菌病原的转基因植物，
本发明也包括通过使用此处所示的DNA序列和其生物功能等同物使植物和植物细胞具有抗真菌抗性的方法。
如上述，本发明的抗真菌多肽，可以和其它抗真菌剂，包括其它具有抗真菌活性的肽，多肽和蛋白，结合使用，以提供广谱活性，即，控制额外病原，和/或通过多种作用方式控制相同真菌病原。这样的抗真菌剂的例子包括壳多糖酶，富含半胱氨酸的壳多糖结合蛋白，β-1,3-葡糖酸酶，permatins(包括zeamatins)，硫堇，核糖体-失活蛋白，和非特异脂质转移蛋白。
这些抗真菌多肽和蛋白的来源包括植物，如拟南芥，大麦，甘蓝，卷心菜，canola，胡萝卜，玉米，大蒜，洋葱，豌豆，花生，胡椒，马铃薯，稻米，大豆，甜菜，烟草，西红柿，小麦；微生物曲霉属，青霉属，链霉属，交链孢属(Alternaria brassicola；Alternaria solani)；壳二孢属(Ascochytapisi)；葡萄孢属(灰绿葡萄孢)；尾孢霉属(Cercosporakikuchii；Cercospora zaea-maydis)；毛盘孢属(Colletotrichumlindemuthianum)Diplodia(Diplodia maydis)；白粉菌属(Erysiphegraminis f.sp.graminis；Erysiphe graminis f.sp.hordei)；镰孢属(雪腐病镰孢；尖孢镰孢；禾谷镰孢；大刀镰孢；茄病镰孢；串珠镰孢；玫瑰色镰孢)；Gaeumanomyces(Gaeumanomyces graminis f.sp.tritici)；长蠕孢属(玉蜀黍大斑病长蠕孢；Helminthosporiumcarbonum；玉蜀黍小斑病长蠕孢)；大茎点属(Macrophomina phaseolina；Maganaporthe grisea)；从赤壳属(Nectria peamatococca)；霜霉菌属(东北大豆霜霉菌；Peronospora tabacina)；茎点霉属(甜菜蛇眼病茎点属)；瘤梗孢菌属(Phymatotrichum omnivorum)；疫霉属(Phytophthora cinnamomi；苹果疫霉；菜豆疫霉；蓖麻疫霉；柑桔褐腐菌疫霉；Phytophthora megasperma f.sp.sojae；Phytophthorainfestans)；单轴霉属(Plasmopara viticola)；足球霉属(白丝足球霉)；双孢锈菌属(高梁锈菌；Puccinia striiformis；Pucciniagraminis f.Sp.Tritici；Puccinia asnaragi；Puccinia recondita；Puccinia arachidis)；Puthium(Puthium aphanidermatum)；核腔菌属(偃麦草核腔菌)；Pyricularia(Pyricularia oryzae)；腐霉属(Pythium ultimum)；丝核菌属(Rhizoctonia solani；Rhizoctoniacerealis)Scerotium(Scerotium rolfsii)；核盘霉属(苹果褐腐病核盘霉)；壳针孢属(番茄壳针孢；大豆壳针孢；Septorianodorum；Septoria tritici)；Thielaviopsis(Thielaviopsisbasicola)；钩丝壳霉属(葡萄白粉病钩丝壳霉)；黑星菌属(苹果黑星病菌)和轮枝孢菌属(Verticillium dahiliae；Verticilliumalbo-atrum)；和其它非植物生物。
从以下的阐明的非限定实施例可对本发明有更好理解。
实施例1
AlyAFP的分子量
凝胶电泳
AlyAFP的分子量通过Laemmli((1970)自然227:680-685)的方法电泳测定。多肽溶于含450mMTris-HCl,pH8.45,12％甘油，4％SDS,0.06％考马斯亮篮和0.0025％酚红(Novex,San Diego,CA)变性上样缓冲液中，煮10分钟，在16％甘氨酸胶(Novex,San Diego,CA)含100mMTris,100mM甘氨酸，1％SDS,125V稳压电泳两小时。银染(Intrgrated Separation Systems Natick,MA)发现一条约6kDa分子量的带。
通过阳离子电喷射质谱质量分析
按Scoble等((1993)蛋白和多肽微测序纯化操作指南，P.Matsudaira编，AcademicPress,Inc.,San Diego,125-153页)描述通过阳离子电喷射质谱进行AlyAFP质量分析。
天然蛋白观察到的分子量是5657道尔顿。
胰蛋白酶片段分析
用Stone和Williames((1993)蛋白和多肽微测序纯化操作指南，P.Matsudaira编，AcademicPress,Inc.,San Diego,43-69页)的方法，抗真菌多肽被还原，羧甲基化，胰蛋白酶消化。
胰蛋白酶消化物通过毛细管液体层析/质谱以测定胰蛋白酶解片段的分子量以帮助测定蛋白的氨基酸序列。
多肽的一个胰蛋白酶片段同PCT公布WO93/05153所示Rs-AFP1的C-末端胰蛋白酶片段有相同的分子量和保留时间，提示两个多肽有相同的C-末端。其它多肽胰蛋白酶解片段的分子量和Rs-AFP1的都不相同，提示本多肽与Rs-AFP1不同。图2即为此考虑。
实施例2
AlyAFP的氨基酸序列
为测定AlyAFP的氨基酸序列，纯化的多肽(质谱数据纯度大于98％)在含8mM二硫苏糖醇的8M尿素中变性。半胱氨酸残基通过Stone等((1993)蛋白和多肽微测序纯化操作指南，P.Matsudaira编，AcademicPress,Inc.,San Diego,55-56页)描述的S-羧甲基化修饰。用去除分子量为1000的膜对纯水透析去除试剂。在AppliedBiosystems 470 A型蛋白测序仪(Applied Biosystems,Norwalk,CT)上进行自动Edman降解。各个PTH-氨基酸产物用Applied Biosystems120型PTH分析仪通过连机方式反向分析确定。
多肽N-末端测序测定了如序列号1所示49个氨基酸，在位置10,44,45和46有双关结果。胰蛋白酶解片段的质谱分析(实施例1)得来的信息表明这些未确定的氨基酸是位置10色氨酸，位置44-45-46半胱-异亮-半胱，位置50和最后为半胱氨酸。
AlyAFP多肽的完整氨基酸序列在序列号2表示。
实施例3
AlyAFP的生物效力
AlyAFP的抗真菌活性可在引起真菌菌丝生长50％抑制(IC50)所需的μg/ml浓度表现。真菌菌丝生长抑制的百分数定义为受试样品培养基中平均菌丝长度除以加入缓冲液替代多肽样品的对照培养基中平均菌丝长度×100。
AlyAFP的抗真菌活性通过倒置显微镜下测量一些不同真菌在此多肽存在情况下真菌菌丝长度的抑制来测定。真菌孢子(2×104孢子/ml)在50μl双强度试验培养基中根据试验真菌的不同萌发5至15小时。最终单强度试验培养基含有：K2HPO4(2.5mM),MgSO4(50μM),CaCl2(50μM),FeSO4(5μN),CoCl2(0.1μM),CuSO4(0.1μM),Na2MoO4(2μM),H2BO3(0.5μM),KI(0.1μM),ZnSO4(0.5μM),MnSO4(0.1μM)葡萄糖(10g/l),天冬酰胺(1g/l)，蛋氨酸(20mg/l)，肌醇(2mg/l)，生物素(0.2mg/l)，硫胺素-HCl(1mg/l)，吡哆醇-HCl(0.2mg/l)。为测定阳离子的拮抗效果，CaCl2和KCl分别以1mM和50mM加入。此补充盐培养基称作高盐培养基且原先的培养基称作低盐培养基。孢子萌发后，50μl过滤除菌的多肽灭菌水溶液加入含萌发孢子的试验孔中，混合物在24℃孵育15-24小时。AlyAFP以0-80μg/ml的浓度范围试验测定IC50值。多肽浓度用Pierce(Rockford,IL)的BCA蛋白测定试剂盒测定。
表1显示AlyAFP对Fusarium culmorum，小麦头结痂的诱发剂，和Verticillium dahliae，马铃薯早死的诱发剂，的抗真菌活性。
表1AlyAFP抗真菌活性
         IC50(μg/ml)真菌           低盐          高盐F.culmorum      ＜2          ＜10V.dahliae       ＜1          ＜5
表1的数据显示AlyAFP对Fusarium和Verticillium具有有力的抗真菌活性，它们可以引起许多庄稼植物疾病，包括大麦，玉米，棉花，燕麦，马铃薯，大豆，西红柿和小麦。此多肽的抗真菌活性比PCT国际公布WO93/05153所示其它抗真菌多肽在试验培养基中盐存在的拮抗效果更不敏感。引起50％真菌菌丝生长抑制(IC50)所需μg/ml浓度可以在编码AlyAFP DNA转染植物中实际达到。这些IC50值落入许多商业可用杀真菌剂的范围内，且反映用此抗真菌多肽在植物感染部位的实用性。
表2的数据比较了本发明多肽和PCT国际公布WO93/051553所示的Rs-AFP1和Rs-AFP2的抗真菌活性。
表2AlyAFP Rs-AFP1和Rs-AFP2抗真菌活性比较
                   IC50(μg/ml)真菌        多肽
                  低盐            高盐F.culmorum
        AlyAFP     ＜2            ＜10
        Rs-AFP1     5              70
        Rs-AFP2     2              5V.dahliae
        AlyAFP    ＜1            ＜5
        Rs-AFP1    5             ＞100
        Rs-AFP2    1.5             50
这些数据显示AlyAFP对F.culmorum在低盐和高盐浓度时的活性和Rs-AFP1,Rs-AFP2相似。然而，此多肽的对V.dahliae活性在高盐浓度时比Rs-AFP1,Rs-AFP2显著高。
AlyAFP和生物功能等同物可用于控制选自以下种类的真菌：曲霉属，青霉属，链霉属，交链孢属(Alternaria brassicola；Alternariasolani)；壳二孢属(Ascochyta pisi)；葡萄孢属(灰绿葡萄孢)；属孢霉属(Cercospora kikuchii；Cercospora zaea-maydis)；毛盘孢属(Colletotrichum lindemuthianum)Diplodia(Diplodiamaydis)；白粉菌属(Erysiphe graminis f.sp.graminis；Erysiphegraminis f.sp.hordei)；镰孢属(雪腐病镰孢；尖孢镰孢；禾谷镰孢；大刀镰孢；茄病镰孢；串珠镰孢；玫瑰色镰孢)；Gaeumanomyces(Gaeumanomyces graminis f.sp.tritici)；长蠕孢属(玉蜀黍大斑病长蠕孢；Helminthosporium carbonum；玉蜀黍小斑病长蠕孢)；大茎点属(Macrophomina phaseolina；Maganaporthe grisea)；从赤壳属(Nectria peamatococca)；霜霉菌属(东北大豆霜霉菌；Peronospora tabacina)；茎点霉属(甜菜蛇眼病茎点属)；瘤梗孢菌属(Phymatotrichum omnivorum)；疫霉属(Phytophthoracinnamomi；苹果疫霉；菜豆疫霉；蓖麻疫霉；柑桔褐腐菌疫霉；Phytophthora megasperma f.sp.sojae；Phytophthora infestans)；单轴霉属(Plasmopara viticola)；足球霉属(白丝足球霉)；双孢锈菌属(高梁锈菌；Puccinia striiformis；Puccinia graminis f.Sp.Tritici；Puccinia asnaragi；Puccinia recondita；Pucciniaarachidis)；Puthium(Puthium aphanidermatum)；核腔菌属(偃麦草核腔菌)；Pyricularia(Pyricularia oryzae)；腐霉属(Pythiumultimum)；丝核菌属(Rhizoctonia solani；Rhizoctonia cerealis)Scerotium(Scerotium rolfsii)；核盘霉属(苹果褐腐病核盘霉)；壳针孢属(番茄壳针孢；大豆壳针孢；Septoria nodorum；Septoriatritici)；Thielaviopsis(Thielaviopsis basicola)；钩丝壳霉属(葡萄白粉病钩丝壳霉)；黑星菌属(苹果黑星病菌)和轮枝孢菌属(Verticillium dahiliae；Verticillium albo-atrum)；和其它非植物生物。
实施例4
编码AlyAFPcDNA的克隆mRNA分离
从购自本地苗圃的Alyssum植物的花中制备总RNA，用Bio 101Inc(La Jolla,CA)的Rnaide Plus Kit按照制造商的方法。聚腺苷酸RNA用寡聚(dt)纤维素(GIBCO BRL/Life Technologies,Gaithersburg,MD)按Celano等(1993)生物技术15:27-28描述分离。cDNA克隆
多肽cDNA的5’区用5’RACE试剂盒(GIBCO BRL/LifeTechnologies Gaithersburg,MD)克隆。第一链cDNA从聚腺苷酸RNA通过寡聚T引物逆转录产生。RNase H1消化去除mRNA链和自旋柱分离后，用末端脱氧核苷酸转移酶在制造商推荐条件下在单链cDNA上加入聚-C尾巴。多肽cDNA的5’区用GeneAmp DNA Amplification ReagentKit(Perkin Elmer Cetus)按制造商推荐反应条件通过PCR扩增。用于扩增的两个引物是：1)针对反义反向的多肽序列的C-末端的氨基酸的35聚混合寡核苷酸(克隆位点14个核苷酸，基因特异21个核苷酸，简并24个，序列号3)和；2)和cDNA的聚C尾巴退火的寡聚dT引物(序列号4)。通过凝胶电泳分析PCR产物，约250碱基对的单一带在完全反应混合物中而不在只含一条引物的对照反应混合物中出现。从凝胶中切出此带用Ultrafree-MC离心过滤装置(Millipore,Bedfold,MA)分离DNA.DNA片段用BamHⅠ消化，克隆入载体pGEM11Zf(+)(Promega,Madison,WI)，并在来自Applied Biosystems的373DNA Sequencer Stretch Model用PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle SequencingKit(Applied Biosystems)插入测序。序列在序列号5表示。
多肽cDNA的3’区如下克隆。为5’RACE制得的cDNA第一链用作多肽3’部分扩增模板，用GeneAmp DNA Amplification ReagentKit(Perkin Elmer Cetus)按制造商推荐反应条件通过PCR扩增。用于扩增的两个引物是：1)针对多肽序列的13到19氨基酸的34聚混合寡核苷酸(克隆位点14个核苷酸，基因特异20个核苷酸，简并16个，序列号6)和；2)和cDNA的聚(A+)尾退火的寡聚dT引物(序列号7)。通过凝胶电泳分析PCR产物，约300碱基对的单一带在完全反应混合物中而不在只含一条引物的对照反应混合物中出现。从凝胶中切出此带用Ultrafree-MC离心过滤装置(Millipore,Bedfold,MA)分离DNA.DNA片段用BamHⅠ消化，克隆入载体pGEM11Zf(+)(Promega,Madison,WI)，并在来自Applied Biosystems的373DNA Sequencer Stretch Model用PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle SequencingKit(Applied Biosystems)插入测序。序列在序列号8表示。
多肽cDNA的5’和3’区有114核苷酸重叠，这两区的结合提供了多肽cDNA的全长(序列号9)。
如图1所示，抗真菌多肽cDNA编码一52碱基对的5’引导区，一240碱基对开放读码框架编码79氨基酸的多肽，和一170碱基对至聚(A+)尾巴的3’非翻译区。推断的多肽(图1)包括假定的29氨基酸的信号肽(图1中下划线)和50氨基酸的成熟多肽，与质谱分析和直接氨基酸测序测定的序列一致(参见实施例1和2)。预测信号肽剪切位点附加的氨基酸序列和Rs-AFP1的类似(参见图2)，实际剪切发生在丙氨酸和精氨酸之间，即图1的箭头处。所得的未封闭的N-末端对观察到的本发明多肽比Rs-AFP1的抗真菌活性高起作用。
为方便克隆，限制性切点通过PCR接入含多肽cDNA编码区的cDNA片段的末端。含嵌套的Eco RⅠ和Bam HⅠ限制酶切点本多肽起始密码子(ATG)上游14碱基对的5’基因特异引物(序列和10)和含嵌套的Eco RⅠ和BamHⅠ限制酶切点的终止密码子(TAA)后的3’基因特异引物(序列和11)，用于从上述mRNA逆转录得来的cDNA扩增cDNA片段。PCR扩增片段在序列和12中显示。
PCR产物作为264碱基对的BamHⅠ片段亚克隆入原先构建的含E35S启动子和maizeHsp70内含子的大肠杆菌空载体pMON23317(图3)构建pMON22652(图4)。nos基因3’非翻译聚腺苷酸序列提供终止子。载体内含子和终止子序列间还含有多聚接头位点。启动子和终止子前后的NotⅠ位点，和氨苄抗性基因。插入pMON22652中的cDNA片段用针对BamHⅠ位点上游50碱基对的HSP70内含子的引物(序列号13)测序。此cDNA插入序列表示为序列号14，它具有正确转录方向其推测的氨基酸序列(序列号15)与直接氨基酸测序分析获得的多肽(比较序列号2)匹配的。
编码AlyAFP的基因，包括天然发生的突变蛋白和变体，可能存在于多种植物的基因组中。这些基因可用常规的分子生物学方法从这些植物的染色体DNA中分离。例如，染色体DNA文库可用本领域熟知的方法(Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港出版社，冷泉港，纽约)构建入如细菌噬菌体载体λEMBL3和λgt10，柯斯质粒，或质粒中。编码和AlyAFP具有相同或类似抗真菌活性多肽的基因可由染色体DNA或染色体DNA文库进行PCR分离，或通过探针杂交基因组DNA文库。PCR引物和杂交筛选探针可基于序列号12所示的多肽cDNA核苷酸序列。引物不应有自身互补序列和3’末端互补序列以免产生引物二聚物。引物可含有限制性位点。引物同DNA退火并进行足够轮的PCR循环以产生凝胶电泳和染色易见的产物。引物一般至少16个核苷酸长，典型至少20个核苷酸长，优选至少24个核苷酸长，更优选至少28个核苷酸长。这样的引物应能特异的引发编码同AlyAFP有相同或相似抗真菌活性的抗真菌多肽基因。扩增片段可纯化并插入适合载体，并用本领域所知的方法繁殖。
实施例5
与AlyAFP生物功能等同物肽，多肽和蛋白
本发明不仅包括具有序列号2所示氨基酸序列的多肽，可以酸性或碱性盐形式存在，或以天然形式，还包括生物功能等同物肽，多肽和蛋白。生物功能等同物肽，多肽和蛋白是指这样的肽，多肽和蛋白，它们含有与AlyAFP相似的序列或序列部分，和具有和此处所示多肽相同或相似的抗真菌活性。在基础多肽序列中含有保守氨基酸变化的肽，多肽和蛋白
与AlyAFP生物功能等同物肽，多肽和蛋白包括含有序列号2所示基础序列中保守氨基酸变化的氨基酸序列。在此氨基酸序列中，基础序列中一个或多个氨基酸被其它氨基酸取代，其电荷和极性与原有氨基酸相似，即，保守氨基酸取代，导致沉默改变。
基础氨基酸序列内氨基酸的取代物可从天然发生的氨基酸所属的类群中选取。氨基酸可分为四组(：1)酸性氨基酸；(2)碱性氨基酸；(3)中性极性氨基酸；(4)中性非极性氨基酸。这些组中各个氨基酸包括，但不限于此：(1)酸性(带负电)氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电)氨基酸如精氨酸，赖氨酸，组氨酸；(3)中性极性氨基酸如谷氨酸，丝氨酸。苏氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；(4)中性非极性(疏水)氨基酸如丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和蛋氨酸。
基础多肽序列中保守氨基酸变化可通过将这些组中的一个氨基酸取代为同一组的另一氨基酸来实现。AlyAFP生物功能等同物可有10个或更少的保守氨基酸改变，更优选有7个或更少的保守氨基酸改变，最优选有5个或更少的保守氨基酸改变。编码核苷酸序列(基因，质粒DNA,cDNA，或合成DNA)将有相应的碱基取代，允许其编码AlyAFP的生物功能等同物形式。
此处阐述的生物功能等同物肽。多肽，和蛋白与基础AlyAFP氨基酸序列，或其中相应部分相比，应具有约70％或更多序列相似性，优选约80％或更多序列相似性，最优选约90％或更多序列相似性。AlyAFP的片段和变异体
尽管本发明的抗真菌多肽优选含有序列号2疏水氨基酸序列，本发明也包括具有与此抗真菌多肽相同或相似抗真菌活性的此序列的片段和变异体。AlyAFP的片段
AlyAFP的片段可以是截短形式，其中一个或多个氨基酸从多肽的N-末端，C-末端，中间删除，或以上各种形式之组合。这些片段可以是天然发生的AlyAFP或其合成突变体，且应保留AlyAFP的抗真菌活性。AlyAFP的变异体
AlyAFP的变异体包括其中一个或多个氨基酸插入天然序列中的形式。这些变异体可以是天然发生的AlyAFP或其合成突变体，且应保留AlyAFP的抗真菌活性。
以上形式之组合，即含有氨基酸缺失或插入的抗真菌多肽形式也都包括在本发明内。氨基酸取代也在其中。
本发明包括的AlyAFP的片段或变异体，与具有序列号2所示氨基酸序列的天然发生的AlyAFP的相应区相比，应优选含有约70％或更多序列相似性，更优选约80％或更多序列相似性，最优选约90％或更多序列相似性。和针对AlyAFP的抗体反应的肽。多肽。和蛋白
AlyAFP的生物功能等同物形式也包括和针对AlyAFP的抗体反应，即特异结合，并与此多肽显示相同或相似抗真菌活性的肽。多肽，和蛋白。此抗体可是单克隆或多克隆抗体。AlyAFP的其它生物功能等同物形式
本发明中有用的AlyAFP的其它生物功能等同物形式包括将此多肽，或上述生物功能等同物，与其它肽。多肽，或蛋白形成的与具有序列号2所示氨基酸序列的AlyAFP相比具有相同，相似，或更高抗真菌活性的缀合物。这样的肽，多肽，和蛋白已在上述发明概述中讨论。
实施例6
编码AlyAFP cDNA序列的生物学功能相同的核苷酸序列
本发明不仅包括序列号12所示cDNA序列，还包括生物学功能相同的序列。所述“生物学功能相同核酸序列”表示DNA和RNA，包括基因组DNA，质粒DNA,cDNA，合成DNA，和mRNA核苷酸序列，编码具有和AlyAFP相同或类似抗真菌活性肽，多肽，和蛋白，即，当以可操纵的方式转入宿主细胞中以便表达时，它们能产生足以使这些细胞抵抗真菌病原抗真菌活性的肽，多肽，或蛋白。AlyAFP中编码保守氨基酸改变的核苷酸序列
本发明的生物学功能相同核酸序列包括在AlyAFP基本氨基酸序列中编码保守氨基酸改变的核苷酸序列，其中产生沉默改变。这样的核苷酸序列与编码野生型AlyAFP核酸序列相比含相应碱基取代。含有碱基取代，插入，或缺失的核酸序列
除了在AlyAFP基本氨基酸序列中编码保守氨基酸改变的核苷酸序列，本发明的生物学功能相同核酸序列还包括含有其他碱基取代，插入，或缺失的核酸序列。这包括含有相同固有遗传信息的核酸如序列号12cDNA中含有的，并编码如同或类似于AlyAFP使宿主细胞和植物具有真菌抗性的肽，多肽，或蛋白。这样的核苷酸序列可称为序列号12所示cDNA的“遗传等价修饰形式”，且可被此处描述的方法识别。
cDNA，质粒DNA，基因组DNA，合成DNA或其他编码AlyAFP的核酸中的突变优选保留编码序列的读码框架。进一步，这些突变优选不产生互补区，互补区能杂交产生二级mRNA结构，如环或发夹，这将极大影响mRNA翻译。
尽管可预先决定突变位点，并不需要预先决定突变的本质。例如，为了选择给定位点突变物的最优特性，可在靶密码子引入随机突变。
或者，通过合成含有突变序列的寡核苷酸在特定座位引入突变，其侧翼加入限制性位点以使可连入天然AlyAFP cDNA序列片段。连入后，所得构建寡核苷酸序列编码含有期望氨基酸插入，取代，或缺失的AlyAFP的衍生物。
其他时侯，表达的突变物可以通过例如实施例3中所述的方法筛选期望的抗真菌活性。
有用的序列号12 cDNA的遗传等价修饰形式的特例包括具有高度同源性的核苷酸序列的DNA，即，同序列号12的cDNA序列一致。可以是同序列号12的cDNA或相应部分70％或更多序列一致，更优选80％或更多序列一致，最优选90％或更多序列一致。
这样的遗传等价修饰形式可用方便的DNA-DNA或DNA-RNA杂交技术(Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)稳定分离或通过用聚合酶链反应(PCR)方法放大。当用方便的转化技术导入一般对病原敏感的植物细胞中后，这些形式能使其具有对真菌病原的抗性。编码AlyAFP片段或变异体的核苷酸序列
实施例5中讨论的AlyAFP片段或变异体可由cNDA，质粒DNA，基因组DNA，合成DNA，或mRNA编码。这些核酸应是含有同编码AlyAFPde序列号12所示核苷酸序列的cDNA的相应部分或相应mRNA有70％或更多序列一致，更优选80％或更多序列一致，最优选90％或更多序列一致。
本发明中与具有序列号12所示核苷酸序列的AlyAFP的cDNA生物学功能相同物核酸包括：
(1)具有通过天然或人工突变如部分核苷酸缺失，插入，添加，或类似改变长度的DNAs，当完整长度的序列号12作为100％，生物功能等同物序列具有序列号12的大约60-120％长度，优选80-110％；或
(2)含有部分(通常全长的20％或更少，优选10％或更少，更优选5％或更少)天然或人工突变的核苷酸序列这样的核苷酸编码不同的氨基酸，其中所得多肽保持AlyAFP抗真菌活性。以此种方式得到的突变DNA通常编码有70％或更多，优选80％或更多，更优选90％或更多，与序列号12的核苷酸序列编码的AlyAFP(序列号2)的氨基酸序列一致的多肽。
本发明中，并不限定产生人工突变所用得方法，可用本领域任何方便的方法产生突变。
例如，AlyAFP的cDNA或基因可用适当的限制性内切酶处理以插入或删除适当的DNA片段以便保留正确的氨基酸读码框架。限制性内切酶处理后，处理消化的DNA填补突出端，重新连接DNA。
用含有连有限制性位点侧翼以便连接AlyAFPcDNA或基因组序列片段的合成寡核苷酸以引入具体座位突变。连接后，所得构建序列编码具有期望氨基酸插入，取代，或缺失的衍生物。
另外，寡核苷酸指导的位点特异或片段特异突变过程可用来产生按照期望的取代，缺失，和插入改变的具体密码子改变的cDNA或基因组DNA序列。
实行上述改变的方法例子由以下揭示：Ausubel等(1995)当代分子生物学方法，John Wiley&Sons，公司；Bauer等(1985)基因37∶73；Craik(1985)生物技术3:12-19；Frits Eckstein等(1982)核酸研究10:6487-6497；Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Smith等(1981)基因工程：原理和方法，Setlow等编，Plenum出版社，纽约，pp1-32；Osuna等(1994)微生物学综述，20:107-116；和Walder等(1986)基因42∶133。用其中任一方法产生的与此cDNA序列生物功能等同物可用实施例3所述技术测定其编码的肽，多肽，或蛋白。编码与针对AlyAFP抗体反应的肽，多肽，和蛋白的核苷酸序列
编码AlyAFP的cDNA的生物功能等同形式包括编码与针对AlyAFP抗体反应，即特异结合的肽，多肽，和蛋白的核苷酸序列，且具有与该多肽相似或相同抗真菌活性。此抗体可是单克隆或多克隆抗体。遗传简并核苷酸序列
由于遗传密码的简并性，即，天然发生蛋白中的多数氨基酸具有不只一个密码子存在，其它含有与本发明cDNA基本相同的遗传信息的DNA(和RNA)，且与序列号12核苷酸序列编码相同的氨基酸序列，可用于实施本发明。此原则同样适用于此处讨论的任何其它核苷酸序列。为特殊宿主细胞中增强表达设计的合成DNA序列
本发明cDNA的生物功能等同形式也包括为特殊宿主细胞中增强表达设计的合成DNA序列。宿主细胞经常显示密码子使用的优选方式(Murry等(1989)核酸研究17:477-498)。为特殊宿主细胞中增强表达设计的合成DNA应反映宿主细胞中密码子使用方式。
本发明中，序列类似或一致可用序列分析软件包BestFit或Gap程序测定，遗传计算组，公司，华盛顿大学生物计算中心，Madison,WI53711。编码AlyAFP融合形式的核苷酸序列
本发明中有用的序列号12 cDNA的其他生物功能等同物形式包括修饰的列举如发明概述中以及实施例中谈论的其他肽多肽或蛋白，编码融合蛋白产物。通过杂交测得的AlyAFP cDNA的生物功能等同物形式
编码AlyAFP的核苷酸序列的一个实施方案在序列号12中显示，应该理解本发明还包括与序列号12的核苷酸及互补序列杂交的，编码表达的肽，多肽，蛋白具有与AlyAFP或相似的抗真菌功能的核苷酸序列。这样的核苷酸序列优选在温和至高度严格条件下与序列号12或其互补序列杂交。(参见Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)举例条件包括6×SSC,5×Denhard’s溶液，100μg/ml鱼精DNA,0.1％SDS中开始杂交，55℃足够时间以利于杂交(如几小时至过夜)，以2×SSC,0.1％SDS室温每次15分钟洗两遍，以0.5-1×SSC,0.1％SDS,55℃每次15分钟洗两遍，接着放射自显影。一般当杂交混合物在0.1×SSC55℃至少洗一遍，优选60℃，更优选65℃时核酸分子能够杂交。
本发明也包括与序列号12的cDNA在盐和温度与上述条件一样时杂交，编码表达与此处描述的AlyAFP的抗真菌活性相同或相似的肽，多肽，和蛋白的核酸序列。
若编码与AlyAFP具有大约±25％或更小差异的抗真菌效果的肽，多肽，或蛋白，上述核苷酸序列被认为是含有编码AlyAFP序列号12的cDNA的生物功能等同物。基因组探针和PCR引物
基因组探针
另一方面，本发明提供用于筛选基因组或其他核酸库中编码与AlyAFP相同或相似的抗真菌活性肽，多肽，蛋白的DNA序列的寡核苷酸探针，探针可根据此处提供的序列设计。这样的探针可以是16或18核苷酸长，一般16个核苷酸长，典型20个核苷酸长，优选24个核苷酸长，更优选28个核苷酸长。优选的，探针特异与基因组或其他编码与AlyAFP相同或相似的抗真菌活性肽，多肽，蛋白的DNA序列杂交。这样的寡核苷酸可通过自动合成仪合成，可方便的在5’末端以报告分子如放射性元素如32P，或生物素标记。根据所用载体，库可铺成克隆或噬菌体平板，重组体DNA可转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜。变性，中和，固定DNA于膜上后，膜用标记探针杂交。然后洗膜，检测报告分子。分离并繁殖含有杂交DNA的克隆或噬菌体。候选克隆或PCR扩增片段可通过多种方法验证含有编码AlyAFP或具有与AlyAFP相同或相似的抗真菌活性的肽，多肽，蛋白的DNA。例如，候选克隆可用第二，非重叠探针杂交，或进行DNA序列分析。编码的肽，多肽，蛋白的抗真菌活性可通过克隆并在合适的宿主如酵母或大肠杆菌中表达，然后分离肽，多肽，或蛋白，用上述实施例3描述的方法测定抗真菌活性。通过这些方法，用于控制未预期的真菌并保护植物对抗真菌病原，编码AlyAFP或生物功能等同物的植物核酸可被分离。
PCR引物
生物功能等同物基因组DNAs和cDNAs可从包括高等植物的生物中用基于AlyAFP氨基酸序列(序列号2)的简并寡核苷酸引物分离(T.Compton(1990)In Innis等，PCR方法，方法和应用指南，Academic,San Diego,39-45页)。这样的简并寡核苷酸引物可和利用逆转录酶PCR技术共同用于扩增生物功能等同物cDNA(E.S.Kawasaki(1990)In Innis等，PCR方法，方法和应用指南，Academic,San Diego，拆1-27页)。这些cDNA可很容易的克隆入合适的转化/表达载体并转入单子叶和双子叶植物，表达载体中DNA的转染植物可用以下讨论的已建立的方法分离。
简并寡核苷酸可直接用于筛选基因组库，分离的编码序列可转入作物的转染/表达载体。
另外，简并寡核苷酸还可用于筛来自植物的cDNA文库，例如，λ噬菌体载体如λZapⅡ(Stratagene,La Jolla,CA)。用此法分离的cDNA可转入合适的转染/表达载体以如下文描述转入单子叶和双子叶植物。
实施例6
在转基因植物中表达AlyAFP的DNA构建物
如上述，本发明提供利于此处讨论的DNA序列载高等植物和不同微生物中表达的构建物或表达载体。如这里所用，载体构建物或表达载体指DNA片段以功能方式连接可操作以指导此处讨论的，或其他任何感兴趣的基因或序列，DNA片段的表达的装配。
以双链DNA形式存在的植物结构编码序列(基因，cDNA，合成DNA，或其他DNA)的表达涉及信使RNA(mRNA)从DNA的一链由RNA聚合酶转录并在核内接着对初始转录mRNA进行加工。此加工涉及在mRNA3’末端加入聚腺苷酸的3’非翻译区。
DNA转录为mRNA是由DNA所谓的启动子调节的。启动子区含有碱基序列发出信号使RNA聚合酶和DNA发生联系并用一条DNA链作为模板开始转录mRNA形成相应RNA链。
本发明的有用载体包括连接感兴趣的编码序列的启动子元件，还包括5’非翻译引导序列，3’非翻译区，一个或多个选择标记。多种这样的标记是本领域熟知的。
启动子
编码AlyAFP的DNA在植物细胞中的表达可置于天然发生的同源启动子，或多种异源启动子控制下。一些在植物细胞中有活性的启动子异在文献中描述。包括，例如，胭脂氨酸合酶(nos),mannopine合酶(mas)，和章鱼碱合酶(ocs)启动子，存在于Agrobacterium tumefaciens的肿瘤诱导质粒中；花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子；增强CaMV35S启动子；Figwort花叶病毒(FMV)35S启动子；来自核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基的光诱导启动子(ssRUBISCO)；烟草EIF-4A启动子(Mandel等(1995)植物分子生物学29:995-1004)；拟南芥属壳多糖启动子(Samac等(1991)植物细胞3:1063-1072)；甘蓝LPT(脂质转移蛋白)启动子(Pyee等(1995)植物杂志7:49-59)；玉米泛素启动子(Christensen等(1992)植物分子生物学18:675-689)；稻米肌动蛋白启动子(McElory等(1990)植物细胞2:163-171)。这些启动子已用于产生多种DNA构建物并在植物中表达。参见PCT国际公布WO 84/02913。
用于本发明双链DNA构建物的启动子可根据其对真菌感染的反应引起编码序列特定表达的能力来选择。真菌病原感染植物引发多种蛋白的诱导，称为防御相关或病理相关(PR)蛋白(Bowles(1990)生物化学年鉴59:873-907；Bol等(1990)植物病理年鉴28:113-138；Linthorst(1991)植物科学综述10:123-150)。这些防御相关或PR基因可编码涉及phenylpropanoid代谢的酶(例如，苯丙氨酸解氨酶，苯基苯乙烯酮合成酶)修饰植物细胞壁的酶(例如，富含羟脯氨酸的糖蛋白，富含甘氨酸丰富蛋白，过氧化物酶)，降解真菌细胞壁的酶(例如，壳多糖酶，葡聚糖酶)，thaumatin样蛋白，和未知功能蛋白。防御相关或PR基因已被从一些植物株中分离定性。这些基因的启动子可用于受到真菌病原挑战的转基因植物中使AlyAFP和其生物功能等同物表达。例如，已从马铃薯植物中分离的防御相关或PR基因中得到这样的启动子(Fritzemeier等植物生理85:34-41；Cuypers等(1988)Mol.Plant-Microbe Interact.1:157-160；Logemann等(1989)植物细胞1:151-158；Matton等(1989)Mol.Plant-MicrobeInteract.2:325-331；Schroder等(1992)植物杂志2:161-172)。另外，从烟草得到的病原诱导启动子如PRP1启动子(Martini等(1995)遗传学年鉴29:19-39)也可用。
用于本发明双链DNA构建物的启动子可根据其在AlyAFP蛋白最有效的组织中，如植物的花部分(Weigel(1995)遗传学年鉴29:19-39)中进行特异表达的能力来选择。
任何时候，选择的驱动AlyAFP在转基因植物中表达的特殊启动子应该能引起足够的此种编码多肽序列的表达以导致在植物组织中有效抗真菌量的AlyAFP产生。能进行这样的表达的启动子的例子是e35S,FMV35S，稻米肌动蛋白，玉米泛素，和eIF-4A启动子。
用于本发明的DNA构建物的启动子可以修饰，若期望，以影响其控制特点。例如，CaMv35S启动子可连于阻遏ssRUBISCO在无光时表达的ssRUBISCO基因部分，产生在叶中而不在根中活化的启动子。为本发明的目的，术语“CaMV35S”启动子包括CaMV35S启动子的变种，例如，通过连于操纵子区，随机或控制突变等方法产生的启动子。进一步，用于本发明的启动子可改变为具有多个增强子序列以帮助提高基因表达水平。这样的增强子序列例子已由Kay等(1987)科学236:1299报告。
5’非翻译引导序列
本发明的DNA构建物产生的RNA应优选含有5’非翻译引导序列。此序列可来自选择表达基因的启动子，可特殊修饰以增强mRNA的翻译。5’非翻译区也可从病毒RNAs，适合的真核基因，或合成基因序列中得到。然而，本发明不限定于构建物，其中5’非翻译区来自伴随启动子序列的5’非翻译序列。而且，非翻译引导序列可来自不相关的启动子或编码序列。例如，牵牛热休克蛋白70(Hsp70)含有这样的引导区(Winter(1988)分子遗传221:315-319)。
3’非翻译区
如上述，本发明的嵌合构建物的3’非翻译区应含有转录终止子，或相同功能的元件，和植物中起作用的聚腺苷酸信号以在mRNA的3’末端加入腺苷酸。这样的3区的例子包括含有Agrobacterium肿瘤诱导(Ti)质粒基因聚腺苷酸信号的3’转录，非翻译区，如胭脂氨酸合酶(nos)基因，和植物基因如大豆7s储存蛋白基因和豌豆ssRUBISCO E9基因(Fischoff等，欧洲专利公布0 385 962)。
所有以下元件结合产生重组，双链DNA分子，包括5’至3’方向的连接：
a)植物细胞中起作用引起RNA序列产生的启动子；
b)编码AlyAFPde DNA编码区；和
c)植物细胞中起作用引起所述RNA序列转录终止和3’末端加入聚腺苷酸的3’非翻译区。
AlyAFP DNA编码区可包括序列号12所示的完整核苷酸序列，或包括序列号12所示的116-269核苷酸序列。前一种情况，AlyAFP将转运到细胞外；后一种情况，将在植物细胞中累积。两种情况，AlyAFP都将有效控制真菌损伤。
实施例7
表达AlyAFP的转基因马铃著植物产生和Verticillium野生型对
照的疾病试验结果
此处描述的研究确认了能使植物对真菌病原产生抗性的cDNA和其他核酸。农业的，园艺的，观赏的，和其他经济或商业用途植物可通过引入这些DNA产生对真菌病原的抗性，用可操纵的方式以便在这些植物中以有效抗真菌水平表达。
表达抗真菌有效量的AlyAFP和生物功能等同物的转基因植物可通过以下产生：
(a)用含有5’至3’方向有效连接序列的重组DNA分子植入植物细胞：
(ⅰ)指导植物中基因的转录的启动子区；
(ⅱ)编码编码AlyAFP或具有与AlyAFP相同或相似的抗真菌活性的生物功能等同物的RNA序列的DNA编码序列；和
(ⅲ)编码在植物细胞中引起转录终止并在所述RNA序列3’末端加入聚腺苷酸的聚腺苷酸化信号的3’非翻译区；
(b)选择转染的植物细胞；
(c)繁殖转染的植物细胞以产生变化的植物；且
(d)选择转染的植物，其细胞表达所述的DNA编码序列并产生抗真菌有效量的AlyAFP或所述生物功能等同物。
Alyssum,AlyAFP最初从中分离，是双子叶植物。如Campbell等((1990)植物生理92:1-11)讨论，当单子叶和双子叶在密码子使用上有明显区别时，已知单子叶表达与双子叶中发现相似的基因。基于此观察，双子叶基因中密码子使用似乎不会对双子叶基因在单子叶中表达产生巨大障碍。任何时候，本领域技术人员熟悉控制密码子使用的原则以适合宿主植物(参见Murray等(1989)核酸研究17:477-498)，DNA构建物的表达在本领域是常规的。
下面是报道转基因单子叶和双子叶植物的产生的文献的概述。单子叶植物转染
在单子叶植物中产生转基因植物的方法目前已可用。成功的转染和植物繁殖已在以下植物中获得，芦笋(Asparagusofficihalis；Betebier等(1987)美国国家科学院院刊84:5345)；大麦(Hordeum vulgare；Wan和Lemaux(1994)植物生理104:37)；玉米(Zea mays；Rhodes等(1988)科学240:204；Gordon-Kamm等(1990)植物细胞2:603Fromm等(1990)生物/技术8:833；Koziel等(1993)生物/技术11:194)；燕麦(Auena sativa Somers等(1992)生物/技术10:1589)；orchardgrass(Datylis glomerata；Horn等(1988)植物细胞7:469)；稻米(Oryza sativa；包括indica和japonica变种；Toriyama等(1988)生物/技术6:10；Zhang等(1988)植物细胞7:379；Luo和wu(1988)植物分子生物6:165；Zhang和Wu(1988)遗传理论应用76:835；Christou等(1991)生物/技术9:957)；黑麦(Secale cereale；De la Pena等(1987)自然325:274)；高梁(Sorghum bicolor；Cassas等(1993)美国国家科学院院刊90:11212)；甘蔗(Saccharum spp；Bower和Birch(1992)植物杂志2:409)；高羊茅(Festuca Arundinacea；Wang等(1992)生物/技术10:691)；turgrass(Agrostis palustris；Zhong等(193)植物细胞13:1)；小麦(Triticum asetivum；Vasil等(1992)生物/技术10:667；Troy Weeks等植物生理102:1077；Becke等(1994)植物杂志5:299)。
此处讨论的编码AlyAFP或生物功能等同物的DNA可以引入这些植物任一种以产生表达抗真菌有效量的AlyAFP的转基因植物。双子叶转染
转染广泛的不同双子叶植物并获得转基因植物的方法在文献中说明(参见Casser和Fraley(1989)科学244:1293；Fisk和Dandekar(1993)Scientia Horticulture 55:5-36；Christou(1994)Agro Food Industry Hi Tech(3/4 1994)17页，和其所引文献)。
此处讨论的编码AlyAFP或生物功能等同物的DNA可以引入这些植物任一种以产生表达抗真菌有效量的AlyAFP的转基因植物。
通过非限定实施例，编码AlyAFP的cDNA已在马铃薯植物中表达，如以下详述，使具有真菌抗性。马铃薯转染的质粒
编码AlyAFP的290 bp Bam HⅠ/Eco RⅠ片段从质粒pMON22652(图4)克隆入预先构建的大肠杆菌盒式载体pMON22575(图5)，取代其中的p46基因。所得质粒，标为pMON22655(图6)，用NotⅠ切割以分离含有多肽编码cDNA的NotⅠ片段。此NotⅠ片段接着插入pMON17227(图7)，一种双界植物转染载体，的NotⅠ位点。所得质粒标为PMON22657(图8)，含有以下DNA片段：细菌壮观霉素/链霉素抗性基因(Spc/Str)(Fling等(1985)核酸研究13:7095-7106)，接着是T-DNA的右界。接着右界是合成细菌glyphosate抗性CP4 5-enopyruvyl-3-蟒草素磷酸酯合成酶基因(EPSPS)由FMV启动子驱动(参见PCT公布WO92/04449)。CP4基因是转染株具有glyphosate抗性，和用glyphosate作为选择转染株的方法。来自Arabidopsis 5-enopyruvyl-3-蟒草素磷酸酯合成酶基因(EPSPS)的叶绿体转移多肽融合于CP4基因以定靶CP4-EPSPS蛋白于叶绿体。CP4基因的3’末端是E93’末端以提供转录终止位点和聚腺苷酸信号序列。接着的嵌合片段含有FMV启动子，抗真菌多肽cDNA，和nos3’末端。然后接T-DNA的左边界，和复制起始点(ori-322)(Stalker等(1991)分子基因遗传181:8-12)。
为比较植物中AlyAFP和Rs-AFP1,Rs-AFP2的抗真菌活性的目的，Rs-AFP1,Rs-AFP2合成DNA也转入马铃薯植物。Rs-AFP1,Rs-AFP2合成DNA是由Modland Certified(Midland,TX)作为273碱基对的BamHI/Eco RⅠ片段(序列号分别是16,17)化学合成，并克隆入预先构建的大肠杆菌空载体pMON22575(图5)，取代其中的p46基因。用克隆AlyAFPcDNA同样的方法将含有Rs-AFP1,Rs-AFP2DNA的NotⅠ片段分别插入植物转染载体pMON17227(图7)，所得质粒标为pMON22634(Rs-AFP1)(图9)和pMON22635(Rs-AFP2)(图10)。三亲本接合方法
转染前，含有pMON22657,pMON22634,pMON22635的大肠杆菌分别和Agrobacterium ABI通过三亲本接合方法与含有辅助质粒pRK2013(Ditta等(1980)美国国家科学院院刊77:7347)的大肠杆菌接合。ABI是携带去除pTiC58质粒pMP90RK(Koncz等(1986)分子基因遗传204:383-396)的A208Agrobacterium tumefaciens株。去除Ti质粒提供pMON载体和ABI株接合后自主复制所需的trfA基因功能。当植物组织和ABI::pMON接合培养时，载体通过由disarmed pMP90RKTi质粒编码的vir功能转入植物细胞。
Agrobacterium在含25μg/ml氯霉素和50mg/ml卡那霉素LB培养基中30℃长30小时(10g胰蛋白胨，5g酵母抽提物5gNaCl每升)。含pRK2013的大肠杆菌在含50μg/ml卡那霉素LB培养基生长过夜。含有pMON22657,pMON22634,pMON22635的大肠杆菌在含75μg/ml壮观霉素的LB中生长。所有的培养物长好后，在含有AgrobacteriumABI，大肠杆菌/pRK2013，大肠杆菌/pMON各100μl的试管中加入4mlLB培养基。混合物在微量离心机中离心1分钟，转移上清液。沉淀部分用剩余的液体重悬(约100μl)，一等份(约25μl)吸到LB琼脂(1.5％)平皿的中央。30℃过夜生长后，一部分此平皿上的细胞划线至一含75μg/ml壮观霉素，50μg/ml卡那霉素，和25μg/ml氯霉素的LB琼脂平皿。
30℃24-48小时后，含pMON质粒大肠杆菌，含pRK2013质粒大肠杆菌，和Agrobacterium ABI三亲本接合所得的细胞划线的平皿有克隆出现，而含pMON质粒大肠杆菌，Agrobacterium ABI(无含pRK2013质粒大肠杆菌，质粒运动所需)接合所得的细胞划线的平皿无克隆出现。三亲本接合后，从前述平皿上选4个克隆，分别在含75μg/ml壮观霉素，50μg/ml卡那霉素，和25μg/ml氯霉素的LB液体培养基中30℃生长。编码不同的抗真菌单体的DNA的存在通过限制性内切酶分析分离自Agrobacterium细胞的质粒DNA确证。含有编码AlyAFP,Rs-AFP1,Rs-AFP2的DNA的培养物分别用于转染马铃薯植物。马铃薯植物的转染
分别含有pMON22657,pMON22634,pMON22635的Agrobacterium在2ml含75μg/ml壮观霉素，50μg/ml卡那霉素，和25μg/ml氯霉素，pH7.0的LB培养基中生长过夜。第二天，细菌用1升中含4.4gMS盐(Sigma Chemcal Co.,St.Louis,MO),30g蔗糖，2ml维生素B5(Sigmacatalog#G1019)的MSO培养基1∶10稀释，pH5.7，和直至获得600nm光密度读数为0.2-0.33。
从含节的茎切块无菌条件生长来的马铃著植物(Salanumtuberrosum var.Russet Burbank)的茎上去除叶，包括19℃温度，16小时光照/8小时黑暗循环，光强度100μE/sec/m2，在含4.4gMS盐(SigmaChemcal Co.,St.Louis,MO),30g葡萄糖，0.17gNaH2SO4.H2O,0.4mg硫胺素-HCl,25g维生素C,0.1g肌醇每升，pH6.0,2％Gelrite琼脂，PM培养基上长3周。茎切成3-5mm片。
接种前，30茎片置于共培养平皿上作为未接种对照。共培养平皿含0.9％琼脂固化1/10MS盐(Murashige等(1962)植物生理15:473)和3％葡萄糖，先用2ml6-7天的旧马铃薯悬浮系覆盖琼脂作为饲养层(Farley等(1983)美国国家科学院院刊80:4803)，然后将这些细胞置于8.5cm无菌Whatman滤纸的碟子上。
将要转染的移植片通过将稀释的细菌悬液喷到茎片上且孵育混合物15分钟来孵育。细菌悬液接着从移植片上蒸发，然后铺于共培养平皿上(约每平皿90片)。19℃温度，16小时光照/8小时黑暗循环，光强度100μE/sec/m2，共培养2天后，外植体置于0.9％琼脂固化的含1×MS盐，5.0mg/l玉米素核苷，10mg/lAgNO3,3％葡萄糖，500mg/l羧苄青霉素，0.1mg/l萘乙酸，的愈合组织诱导培养基中16小时光照/8小时黑暗循环培养2天。外植体接着移到含有0.025mM glyphosate的愈合组织诱导培养基上筛选。四周后，外植体置于0.9％琼脂固化含1×MS盐，5.0mg/l玉米素核苷，10mg/lAgNO3,3％葡萄糖，500mg/l羧苄青霉素，0.3mg/lGA3,0.025mM glyphosate的出芽诱导培养基上。8周时芽可见。外植体在12周中每4周转移到新鲜出芽诱导培养基上。芽从愈合组织上切下置于0.2％Gelrite琼脂固化的PM培养基中约2周直至生根并大到可植入土壤。一植入Metro-Mix350(Hummert Seed Co.,St.Louis)，苗在光强600-700μEn/sec/m2，白天温度65-75°F，夜间温度55-65°F，相对湿度60％,14小时光照/8小时黑暗制度下温室中生长2-3月。
转基因马铃薯植物中抗真菌多肽表达的分析
从长至1-2英寸高的转基因植物上取叶标本(20-100mg)。叶标本在含1mMKH2PO4,10mMNa2HPO4,137mMNaCl,2.7mMKCl,pH7.4,0.05％吐温-20的PBST缓冲液中研磨，4℃放置过夜。离心后，100μl上清液用于ELISA试验。抗Rs-AFP1(序列号18)多肽的多克隆抗体用Pocono Rabbit Farm(Pocono,PA)制备。Nunc Maxy-Sorp 96孔板的孔用针对Rs-AFP1多肽的抗体通过加入100μl抗体(1mg IgG/ml),pH9.6,4℃孵育过夜包被，抗体用每升含1.59gNa2CO3和2.93gNaHCO3双蒸水1∶200稀释。然后去除孔中包被液，用PBST洗三遍。100μl叶上清液或适当稀释的PBST中含0.2％BSA，成分V(Sigma,St.Louis)多肽标准加入孔中。转基因植物抽提物中每种多肽的浓度从用不同量的标准纯化多肽制得的标准曲线中确定。AlyAFP,Rs-AFP1,Rs-AFP2在多克隆抗体制备时交叉反应。4℃过夜孵育后，去除孔中溶液，用PBST洗三遍孔。每孔加入100μlPBST中1∶1000稀释的根据Boorsma等((1975)组化和细胞化学杂志23:200-207)制备的0.5mg/mlRs-AFP1抗体/碱性磷酸酶偶连。22℃孵育4小时，孔用PBST洗5遍。100μl新制备的p-磷酸氮苯(1mg/ml)(SigmaChemcals Co.,St.Louis,MO)溶于200mMTris缓冲液，pH9，的溶液加入每孔，22℃孵育1小时。用Thermo-Max微板读数仪(Molecular Devices,Menlo Park,CA)测定405nm光密度。表达不同水平抗真菌多肽的植物用于以下疾病试验。
转基因植物中Verticillium野生株控制
分生孢子和生菌丝的2-3周致病Verticillium dahliae培养物接种PDA(马铃薯，200g/l；Bacto葡萄糖，20g/l；Bacto琼脂，15)Petri平皿。在22℃生长4-5天。通过用无菌双蒸水洗培养皿并用两层干酪包布过滤收获孢子。用血球计测定分身孢子浓度，用无菌双蒸水调整至1×106分生孢子/ml。
转基因和非转基因马铃薯植物从茎片在如上述无菌条件下含50mlPM-琼脂培养基的塑料杯中生长。植物1-2英寸高时，从培养基中取出在孢子悬液中蘸一下(Joaquim等(1991)植物病理81:552-558)。接种植物接着移植到含Metro-Mix350的6英寸罐中。移植后，每株植物在茎基附近土壤表面加5ml孢子悬液。罐置于以下条件的孵箱中：20℃温度，12小时日/12小时夜光循环，光强度320μE/sec/m2，浸水灌溉2次/天，每次浸20分钟。接种4周后，植物对疾病态0-100％范围评价(Horasfall等(1945)植物病理35:655)。为绘制对时间的疾病进程曲线，每周一次至少测8周。
结果
表达AlyAFP马铃薯植物中Verticillium野生株抗性
十株独立的表达AlyAFP转基因马铃薯株进行Verticillium野生株疾病抗性试验。这些株中，5株高表达AlyAFP，含5.2-14.9μg AlyAFP/g新鲜叶组织；3株中等表达，含2.6μg AlyAFP/g新鲜叶组织；2株低表达，含0.9-1.1μg AlyAFP/g新鲜叶组织(表3)。叶中的表达水平时整个植物表达的指示，由于FMV启动子使指导基因表达的各个编码DNA通常在马铃薯植物的所有组织中表达。试验中，3株独立的转基因株也被包括作为对照。这些来自用含质粒pMON17227(质粒对照；土7)Agrobacterium转染植株，不含任何编码抗真菌多肽DNA。试验中其他对照为未转基因马铃薯Russet Burbank，它被作为转染试验的宿主；未转基因马铃薯变种Russet Ranger，它比Russet Burbank更耐受Verticillium野生株；和未转基因马铃薯变种Norchip，它比RussetBurbankVerticillium野生株更敏感。
表3总结了各株的蛋白表达水平，和接种后44天测定的试验各株疾病严重情况。疾病严重率为3套的平均值。为方便，同样的疾病数据也在图11用条图表示。表3(从上到下)和图11(从左到右)中各马铃薯株的表示顺序是相同的。
表3
AlyAFP的表达和转基因马铃薯植物中Verticillium Wilt抗性植物    株#    蛋白表(μg/ 疾病严重性(％) (移 平均
           AFP/g组织)  植后44天)         疾病严重性AlyAFP  17575    14.9        7.5              +植物    17578    12.7        15               +
    17581    9.2         24.3             +
    17587    9.6         6.3              +
    17595    5.2         21               +
    17618    2.6         16.3             +
  17593    2.6    17.3    +
  17592    2.6    11.8    +
  17589    1.1    43.8
  17580    0.9    33.3
                         14.9载体  17227 1   0     31.3    +对照  17227-2   0     45      +
  17227-5   0     41.3    +
                         39.2非转基团Russet          0    16.7Burbank非转基团Russet          0    13.3Ranger非转基团Norchip         0    75
如表3和图11所示，高和中AlyAFP表达的植物的疾病严重性比载体对照低62％。如下计算：[(3载体对照株平均值)-(8株高和中表达平均值)]×100％/(3载体对照株平均值)。最高表达株，如#17575和#17587株，疾病严重性比载体对照低82％。低表达株比载体对照无明显疾病抗性。表3中+表示包括在前述平均疾病严重性计算中的菌株。
这些结果表明表达AlyAFP在和高于2.6μg/g新鲜叶组织的马铃著植物具有Verticillium野生株抗性。疾病抗性和AlyAFP表达水平相关。这些结果还表明明显疾病抗性所需AlyAFP表达水平接近实施例3中的体外抗真菌试验测定的IC50值。尽管未转基因Russet Burbank植物显示相对低的疾病严重率，这些植物比Russet Ranger植物严重生长受阻。这些受阻表型未用于计算疾病严重率。
表达Rs-AFP1和Rs-AFP2马铃薯植物中Verticillium野生株抗性
表达Rs-AFP1和Rs-AFP2转基因马铃薯株用上述AlyAFP表达植物类似的试验检测Verticillium野生株疾病抗性。5株独立的表达Rs-AFP1植物株含5.2-26μg Rs-AFP1/g新鲜叶组织和5株独立的表达Rs-AFP1植物株含10.8-25.2μg Rs-AFP2/g新鲜叶组织在试验中检测，结果在表4中显示。在这些试验中用与上述AlyAFP表达植物相同的对照。
试验中，试验和对照植物疾病症状在约接种49天后出现。疾病进程在接种后49,58和64天纪录。这些时间点Rs-AFP1和Rs-AFP2表达株和对照株之间未观察到区别。疾病严重率是三套试验的平均值。表4总结了各株的蛋白表达水平，和接种后58天测定的试验各株疾病严重情况。为方便，同样的疾病数据也在图12用条图表示。表43(从上到下)和图12(从左到右)中各马铃薯株的表示顺序是相同的。
表4
Rs-AFP1和Rs-AFP2的表达和转基因马铃薯植物中对Verticillium Wilt疾病抗性植物      株#    蛋白表达(μg/ 疾病严重性(％)(移 平均
           AFP/g组织)    植后58天)         疾病严重性Rs-AFP1  15124     26           56.3             +植物     15143     18.3         78.8             +
     15117     9.7          47.5             +
     15120     8.0          50.0             +
     15154     5.2          66.3             +
                                            59.8Rs-AFP2  13501     25.2         76.3             +植物     13503     25.1         53.8             +
     13532     17.5         35.0             +
     13531     16.2         72.5             +
     13500     10.8         82.5             +
                                             64.0载体    17227-1      0          56.3             +对照    17227-5      0          63.8             +
                                             60.0未转基团Russet               0            85
 Burbank
未转基团
Russet    0    16.3
Ranger
未转基团
Norchip   0    82.5
如表4和图12所示，高表达Rs-AFP1和Rs-AFP2植物的平均疾病严重性分别是59.8％和64.0％。这几乎同载体对照的结果相同(60％)。表4中+表示包括在前述平均疾病严重性计算中的菌株。
概括的，从表达AlyAFP,Rs-AFP1和Rs-AFP2的转基因植物获得的疾病试验结果显示AlyAFP在表达水平低至2.6μg/g新鲜叶组织时使马铃薯植物具有Verticillium野生株抗性，而Rs-AFP1和Rs-AFP2在高达25μg/g新鲜叶组织未提供任何显著水平的马铃薯植物Verticillium野生株抗性。这些结果表明实施例3测定的AlyAFP的IC50值在此多肽用于控制不想见到的真菌引起的损害时，和在构建遗传性疾病抗性植物时可信赖的指示。
本发明如此描述，同样的东西有多方面的变化是明显的。这样的变化并不是背离本发明的精神和范围，对本领域技术熟练人员明显的所有这些修改将被包括在下列权力要求范围内。
                      序列表：(1)一般信息：
(ⅰ)申请者：Liang,Jihong
            Shah,Dilip M.
            Wu,Yonnie S.
            Rosenberger,Cindy A.
(ⅱ)发明题目：抗真菌多肽和控制植物致病性真菌的方法
(ⅲ)序列数目：19
(ⅳ)联系地址：
  (A)收件人：Charles E.Cohen,Monsanto Company,BB4F
  (B)街道：700 Chesterfield Village Parkway North
  (C)城市：St.Louis
  (D)州：Missouri
  (E)国家：USA
  (F)邮政编码：63198
(ⅴ)计算机可读类型：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容机
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release￥1.0,Version#1.30
(ⅵ)目前申请资料：
  (A)申请号：
  (B)签发日期：
  (C)分类：
(ⅷ)律师人/代理人信息：
  (A)姓名：Cohen,Charles E.
  (B)登记号：34,565
  (C)文献/摘要号：38-21(10700)A
(ⅸ)通讯信息
  (A)电话：(314)537-6224
  (B)传真：(314)537-6047(2)SEQ ID NO:1信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：49氨基酸
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  (A)长度：50氨基酸
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(ⅰ)序列特征：
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(ⅰ)序列特征：
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(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:19:Gln Lys Leu Cys Gln Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly1                5                  10                  15Asn Asn Asn Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Arg Leu Glu Lys Ala Arg20                  25                  30His Gly Ser Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr35                   40                  45Phe Pro Cys50

Claims (28)

1．包括序列号2所示的氨基酸序列的分离多肽。
2．编码权利要求1所述多肽的分离DNA分子。
3．权利要求2的DNA分子，其中所述DNA分子是cDNA分子。
4．权利要求3的cDNA分子，包括序列号12所示核苷酸序列。
5．权利要求3的cDNA分子，包括序列号12所示核苷酸序列的116-269位核苷酸。
6．重组双链DNA分子，包括以5’到3’方向有效连接：
a)植物细胞中起作用引起RNA序列产生的启动子；
b)编码权利要求1所述分离多肽的结构编码序列；和
c)植物细胞中起作用引起转录终止和在所述RNA序列3’末端加入聚腺苷酸的3’非翻译区。
7．权利要求6的DNA分子，其中所述结构编码区是cDNA分子。
8．权利要求7的DNA分子，其中所述cDNA分子包括一成员，选自含有序列号12所示核苷酸序列，和序列号12所示核苷酸序列的116到269位核苷酸的组。
9．权利要求6的DNA分子，其中所述启动子选自FMV35S启动子，CaMV35S启动子，ssRUBISCO启动子，EIF-4A启动子，LTP启动子，肌动蛋白启动子，或泛素启动子。
10．控制植物真菌损害的方法，包括向所述植物部位提供所述权利要求1的分离多肽。
11．权利要求10的方法，其中所述真菌损害是由选自交链孢霉属(Alternaria)；壳单隔孢属(Ascochyta)；葡萄孢属(Botrytis)；尾孢菌属(Cercospora)；刺盘孢属(Colletotrichum)；壳色单隔孢属(Diplodia)；白粉菌属(Erysiphe)；镰刀菌属(Fusarium)；顶囊壳属(Gaeumanomyces)；长蠕孢属(Helminthosporium)；亚大茎点菌属(Macrophomina)；从赤壳属(Nectria)；霜霉属(Peronospora)；茎点孢属(Phoma)；瘤梗单孢霉属(Phymatotrichum)；疫霉属(Phytophthora)；葡萄霜霉属(Plasmopara)；白叉丝单囊属(Podosphaera)；柄锈属(Puccinia)；Puthium；核腔菌属(Pyrenophora)；梨孢霉属(Pyricularia)；腐霉属(Pythium)；丝核菌属(Rhizoctonia)；小菌核菌属(Scerotium)；核盘菌属(Sclerotinia)；壳针孢属(Septoria)；根串珠霉属(Thielaviopsis)；卷丝多囊属(Uncinula)；黑星菌属(Venturia)和轮枝孢属(Verticillium)的组的真菌引起。
12．权利要求10的方法，其中所述多肽是通过产生所述抗真菌多肽的植物定居微生物提供给所述植物部位。
13．权利要求10的方法，其中所述多肽是通过用包括所述分离多肽的组合物提供给所述植物部位。
14．权利要求10的方法，其中所述多肽是通过在所述植物细胞内表达编码所述多肽的DNA提供给所述植物部位。
15．权利要求10的方法，其中所述多肽基本包括序列号2所示氨基酸序列。
16．控制植物真菌损害的方法，包括步骤：
a)在植物细胞基因组中插入包括以下的重组，双链DNA分子：
ⅰ)植物细胞中起作用引起RNA序列产生的启动子；
ⅱ)编码权利要求1所述分离多肽的结构编码序列；
ⅲ)所述植物细胞中起作用引起转录终止和在所述RNA序列3’末端加入聚腺苷酸的3’非翻译区。
b)获得转染植物细胞；并
c)从所述转染植物细胞繁殖遗传转染的植物，其细胞表达抗真菌有效量的权利要求1所述多肽。
17．权利要求16的方法，其中所述结构编码序列是一成员，选自序列号12所示核苷酸序列，和序列号12所示核苷酸序列的116到269位核苷酸。
18．权利要求16的DNA分子，其中所述启动子选自含有FMV35S启动子，CaMV35S启动子，ssRUBISCO启动子，EIF-4A启动子，LTP启动子，肌动蛋白启动子，或泛素启动子的组。
19．一植物，其细胞含有抗真菌有效量的权利要求1所述多肽。
20．权利要求19的植物，其中所述植物通过包括以下步骤的方法产生：
a)在植物细胞基因组中插入包括以下的重组，双链DNA分子：
ⅰ)植物细胞中起作用引起RNA序列产生的启动子；
ⅱ)编码含有序列号2所示氨基酸序列的分离多肽的结构编码序列；
ⅲ)所述植物细胞中起作用引起转录终止和在所述RNA序列3’末端加入聚腺苷酸的3’非翻译区。
b)获得转染植物细胞；并
c)从所述转染植物细胞繁殖遗传转染的植物，其细胞表达抗真菌有效量的所述多肽。
21．权利要求20的植物，其中所述结构编码序列是一成员，选自序列号12所示核苷酸序列，和序列号12所示核苷酸序列的116到269位核苷酸。
22．权利要求19的植物，其基因组包括一个或多个附加的编码抗真菌肽，多肽，或蛋白的DNA分子，其中所述一个或多个附加的DNA分子被表达并产生其编码的抗真菌有效量的所述肽。多肽，或蛋白。
23．权利要求19的植物，其基因组包括编码B.t.内毒素的DNA，其中所述DNA被表达并产生抗昆虫有效量的所述B.t.内毒素。
24．权利要求19的植物，其中所述植物，选自苹果，大麦，甘蓝，卷心菜，canola，胡萝卜，柠檬，玉米，棉花，大蒜，燕麦，洋葱，观赏植物，豌豆，花生，胡椒，马铃薯，稻米，黑麦，高粱，大豆，草莓，甜菜，甘蔗，西红柿，葡萄，和小麦的组。
25．权利要求19的植物，其中所述植物是马铃薯植物。
26．由权利要求25所述植物产生的马铃薯种块(seedpiece)。
27．抗真菌组合物，包括抗真菌有效量所述权利要求1的分离多肽，和可接受载体。
28．对抗不希望的真菌的方法，包括使所述不希望的真菌接触抗真菌有效量的所述权利要求1的分离多肽。
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