DE60030724T2

DE60030724T2 - Tryptaseninhibitor

Info

Publication number: DE60030724T2
Application number: DE60030724T
Authority: DE
Inventors: Patricia Anne Nuttall; Christiaan Guido Jericho PAESEN
Original assignee: EVOLUTEC Ltd READING; Evolutec Ltd
Current assignee: EVOLUTEC Ltd READING; Evolutec Ltd
Priority date: 1999-07-19
Filing date: 2000-07-19
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2020-07-20
Also published as: GB9916913D0; DK1196579T3; JP2003509014A; EP1196579B1; WO2001005823A2; CN1474871A; AU781498B2; BR0012589A; CN100510073C; HK1042519B; EP1196579A2; PT1196579E; CA2379627A1; ES2272301T3; HK1042519A1; AU6004000A; MXPA02000677A; NZ516809A; ATE339502T1; US6987168B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteine, die in Zecken identifiziert wurden. Diese Proteine können als Bestandteile von Impfstoffen, als Inhibitoren bzw. Hemmstoffe von Mastzell-Tryptase (nachfolgend als MCT bezeichnet), zum Nachweis von Mastzellen und bei der Isolation und Reinigung von MCT verwendet werden. Die Erfindung betrifft außerdem die Kontrolle von durch Parasiten bedingten Krankheiten und Verletzungen bei Tieren und Menschen, und sie betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine in der Behandlung von Krankheiten und Allergien.
Menschliche bzw. humane MCT ist eine Endoprotease, die in den sekretorischen Granula der Mastzellen gelagert wird, und die bei Aktivierung von den Mastzellen als ein Tetramer, das durch Heparin stabilisiert wird, freigesetzt wird. Eine Entfernung des Heparins führt zur Dissoziation des Tryptase-Komplexes in enzymatisch inaktive Monomere (Schwartz, 1994).
Tryptase ist der hauptsächliche Proteinmediatoren-Bestandteil humaner Mastzell-Granula, der mehr als 20% des gesamten zellulären Proteins ausmacht (Schwartz, 1994). MCT ist ein spezifischer Marker der Mastzellen, der ihre Differenzierung von Basophilen erlaubt.
Mastzellen werden in vielen Geweben gefunden, sie sind aber in größerer Anzahl entlang der epithelialen Auskleidungen des Körpers, wie der Haut, des Atemtrakts und des Verdauungstraktes, anwesend. Mastzellen befinden sich häufig in der Nähe kleiner Blutgefäße. Sie sind an einer Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Zustände beteiligt, die akute Entzündungen, plötzliche Hypersensitivität, Hypersensitivität des verzögerten Typus, Zellwachstumsregulation, Neoplasie-Abwehr und die Wahrnehmung von Schmerz und Juckreiz einschließen (Liang et al., 1998). Mastzellen sind außerdem an chronischen Entzündungszuständen beteiligt, und sie sind bei Neuroimmun-Interaktionen beteiligt (Leon et al., 1994).
Mastzell-Tryptase ist ein bedeutender Mediator der Entzündungsantwort. Experimente (vorwiegend in vitro durchgeführt) weisen darauf hin, dass sie eine bedeutende Rolle bei Krankheiten wie Asthma, Schuppenflechte, interstitiellen Lungenerkrankungen, rheumatoider Arthritis, Gingivitis und Periodontitis spielt. Mastzell-Tryptase ist außerdem aufgrund ihres Potenzials, Pro-Urokinase und die Matrix-Metallproteinase Pro-Stromelysin zu aktivieren, an Tumorgenese und Angiogenese beteiligt. Von Tryptase ähnlichen Enzymen wurde auch beschrieben, dass sie an der Aktivierung und Internalisation von pathogenen Viren, wie dem Influenza-Virus, dem Sendai-Virus und dem AIDS-Virus teilhaben (Pohlig et al., 1996).
Humane Tryptase wird durch Trypstatin inhibiert (Katunuma et al., 1990, Adv. Enz. Reg., 30: 377). Humane Tryptase wird durch Substanzen mit geringem molekularen Gewicht inhibiert (z.B. Leupeptin und Diisopropylfluorophosphat). Divalente Kationen, wie Calcium und Benzamidin und seine Derivate sind kompetitive Inhibitoren humaner Mastzell-Tryptase (Schwartz, 1994). Jedoch wird humane Tryptase, anders als die meisten anderen Serin-Esterasen, nicht durch klassische Inhibitioren von Serin-Proteasen, wie Aprotinin und dem Sojabohnen-Trypsininhibitor inhibiert. Endogene Inhibitoren, die auf die katalytische Stelle der Mastzell-Tryptase abzielen, müssen noch beschrieben werden. Humane Tryptase-Aktivität wird durch Lactoferrin und Myeloperoxidase (beide von Neutrophilen abgeleitet) und durch Antithrombin-III, alles Gegenspieler der Glykosaminoglykane (Heparin oder Chondroitinsulfat), die den MCT-Tetramer stabilisieren, inhibiert (Alter et al., 1990; Cregar et al., 1999; Elrod et al., 1997). Sekretorischer Leukozyten-Proteaseinhibitor (SLPI) wurde ebenfalls als Tryptaseinhibitor identifiziert (WO 96/08275).
Ein von Egeln abgeleiteter Inhibitor humaner Tryptase (LDPI für engl.: leechderived inhibitor of human tryptase) wurde kürzlich beschrieben. Von einer rekombinanten Form dieses Kazal-Typ Proteins wurde gefunden, dass es 2 der 4 kataly tischen Stellen der tetrameren Tryptase wirksam inhibiert (Stubbs et al., 1997; Auerswald et al., 1994; Mühlhahn et al., 1994; Sommerhoff of al., 1994; WO 95/03333).
Aufgrund der bekannten Bedeutung von MCT bei Säugetiererkrankungen und bei der allergischen Antwort, besteht ein deutlicher Bedarf für hochspezifische und wirksame Inhibitoren dieses Proteins. In einer Zeckenart wurde nun ein neues Protein entdeckt, das in der Lage ist, die Aktivität von humaner Mastzell-Tryptase zu inhibieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß eines ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes Protein bereitgestellt, welches signifikante Sequenz-Homologie mit der in 1 gegebenen, von Zecken abgeleiteten Proteaseinhibitor-Protein (TdPI)-Sequenz aufweist, welches ein aktives Fragment des Proteins ist oder welches ein funktionelles Äquivalent des Proteins ist.
So wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "signifikante Sequenz-Homologie", dass alle Proteine, die eine allgemeine Funktion mit TdPI teilen, und die eine allgemeine Sequenz-Homologie oder Homologie zwischen Motiven, die in der Polypeptid-Sequenz vorhanden sind, aufweisen, eingeschlossen sind. "Signifikante" Gesamthomologie bezeichnet, dass 50% oder mehr der Aminosäuren der Sequenz vollständig als identische Reste konserviert sind, wenn das homologe Protein an der Sequenz des TdPI ausgerichtet ist. Vorzugsweise werden die Ausrichtungen (engl.: alignments) durch die Verwendung des GCG Bestfit-Befehls erhalten (gap creation penalty = 2,5; gap extension penalty = 0,5) (Genetics-Computer-Group, 1994).
Vorzugsweise beträgt der Homologiegrad über die Gesamtlänge des Proteins mindestens 60%. Weiter bevorzugt, beträgt der Homologiegrad mindestens 70%, noch weiter bevorzugt 75%, am meisten bevorzugt 80% oder mehr.
Eingeschlossen in diesen Aspekt der Erfindung, wird ein Protein bereitgestellt, welches die Sequenz, die hier als von Zecken abgeleitetes Proteaseinhibitor-Protein (TdPI) identifiziert wurde, ein aktives Fragment davon oder ein funktionelles Äquivalent davon, umfasst. Die Sequenz ist in der beigefügten 1 angegeben. Dieses Protein wurde identifiziert, von einer cDNA aus einer Zecken-Speicheldrüsen-Bank kodiert zu werden. Das Protein hat ein Molekulargewicht von ungefähr 13,5 kDa und scheint zur Familie der Kunitz-Typ Proteaseinhibitoren zu gehören. Die Sequenzähnlichkeit mit anderen Mitgliedern dieser Familie, wie Aprotinin und dem Inter-Alpha-Trypsininhibitor, ist gering, aber das vermeintliche reaktive Zentrum und die Position der Cysteine sind zu einem gewissen Grad konserviert.
Der Begriff "funktionelles Äquivalent" wird hier verwendet, um Proteine zu beschreiben, die eine analoge Funktion zum TdPI-Protein haben, entweder durch Inhibition der Tryptase oder durch den Besitz einer oder mehrerer Epitope, die bei der Entwicklung von Impfstoffen, die auf Proteine abzielen, die signifikante Sequenz-Homologie mit TdPI aufweisen, verwendet werden können. Der Begriff "funktionelles Äquivalent" bezeichnet außerdem Moleküle, die strukturell ähnlich zum TdPI-Protein, welches hier identifiziert wurde, sind, oder die eine ähnliche oder identische Tertiärstruktur aufweisen. Dieser Begriff schließt auch Proteinfragmente, die die Fähigkeit behalten haben, Tryptase, vorzugsweise humane Mastzell-Tryptase, zu inhibieren, ein.
Die analoge Funktion der Tryptase-Inhibition ist vorzugsweise gegen die katalytische Aktivität der Tryptase, vorzugsweise der Mastzell-Tryptase, weiter bevorzugt der humanen Mastzell-Tryptase gerichtet und wird durch einen Ki von weniger als 1 μM, weiter bevorzugt 100 nM, noch weiter bevorzugt 20 nM, noch weiter bevorzugt weniger als 10 nM, am meisten bevorzugt weniger als 1 nM charakterisiert, der durch die Verwendung jedes Standard Tryptaseinhibitions-Assays berechnet wird, wie jener, der hier beschrieben wird (siehe den Abschnitt mit der Überschrift "Proteaseinhibitions-Assays" in den nachfolgenden Beispielen).
Alternativ oder zusätzlich zum Besitz der Inhibitionsaktvität gegen Tryptase wird "funktionelles Äquivalent" hier verwendet, um Proteine zu beschreiben, die Epitope enthalten, die bei der Entwicklung von Impfstoffen gegen die erfindungsgemäßen Proteine verwendet werden können. Solche funktionellen Äquivalente und auch Fragmente, die geeignete Epitope enthalten, können verwendet werden, um gegen blutsaugende Parasiten gerichtete Impfstoffe zu entwickeln, die auf Mitglieder der TdPI-Protein-Familie abzielen. Funktionelle Äquivalente können natürlich mehr oder weniger immunogen gemacht werden als das korrespondierende Wild-typ-Protein oder Proteinfragment, um für die gewünschte Applikation geeignet zu sein. "Wildtyp" bedeutet der natürlich vorkommende Genotyp, der für die meisten Mitglieder einer Art charakteristisch ist. Wenn die Proteine in einem Impfplan verwendet werden, um Wirtsresistenz gegen Parasitenproteine zu induzieren, können die Moleküle so modifiziert werden, dass ihre Immunogenität verstärkt wird. So wird es wahrscheinlicher, dass sie eine Immunantwort in dem geimpften Wirt auslösen.
Funktionelle Äquivalente der erfindungsgemäßen Proteine schließen eine einzelne oder mehrfache Aminosäure-Substitution(en), -Addition(en), -Insertion(en) und/oder -Deletion(en) von der Wildtyp-Proteinsequenz und Substitutionen von chemisch modifizierten Aminosäuren, die die Funktion oder Aktivität des Proteins nicht in einer ungünstigen Art und Weise beeinflussen, ein. Dieser Begriff soll ebenfalls natürliche biologische Varianten (z.B. Allelvarianten oder geographische Variationen innerhalb all der verschiedenen Arten, von denen die Wildtyp-Proteine abgeleitet werden), einschließen.
"Aktive" Fragmente sind jene, die entweder Tryptase inhibieren, vorzugsweise humane Mastzell-Tryptase und/oder ein oder mehrere Epitope enthalten, die bei der Entwicklung von Impfstoffen gegen die erfindungsgemäßen Proteine verwendet werden können. Diese biologischen Eigenschaften werden oben beschrieben.
Vorzugsweise werden die Proteine gemäß dieses Aspekts der Erfindung von blutsaugenden Ektoparasiten, wie Mücken oder Egeln, oder von giftigen Tieren wie Spinnen, Skorpionen oder Schlangen abgeleitet. Weiter bevorzugt werden die Proteine von Zecken, am meisten bevorzugt von Ixodiden Zecken wie Rhipicephalus appendiculatus abgeleitet.
Derivate der Proteine gemäß der oben beschriebenen Aspekte der Erfindung werden als Ausführungsformen der Erfindung eingeschlossen. Solche Derivate können ein zusätzliches Protein oder Polypeptid einschließen, welches mit seinem Amino- oder Carboxyterminus fusioniert ist oder intern angefügt ist. Der Zweck des zusätzlichen Polypeptids kann es sein, bei der Bestimmung, Expression, Trennung oder Reinigung des Proteins zu helfen, oder dem Protein zusätzliche, gewünschte Eigenschaften zu verleihen. Beispiele für potenzielle Fusionspartner schließen β-Galactosidase, Glutathion-S-Transferase, Luciferase, einen Polyhistidin-Anhang, ein T7-Polymerase-Fragment und ein Sekretionssignal-Peptid ein.
Die erfindungsgemäßen Proteine können unter Verwendung bekannter Techniken der Molekularbiologie und der Proteinchemie hergestellt werden. Für die Verwendung als Immunogene können Proteinfragmente durch chemische Synthese, einer Technik, die insbesondere für die Herstellung kurzer Peptide geeignet ist, die von der vollständigen Proteinsequenz abgeleitet wurden, hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Proteine können in rekombinanter Form durch Expression in einer Wirtszelle hergestellt werden. Solche Expressionsverfahren sind dem Fachmann gut bekannt, und viele werden detailliert von Sambrook et al., 1989 und Fernandez & Hoeffler, 1998, beschrieben.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt für die Verwendung der Proteine, Proteinfragmente und funktionelle Äquivalente der Erfindung bereit, um eine Tryptase, wie die Mastzell-Tryptase, in Säugetieren zu inhibieren, um dadurch ihre Aktivität zu regulieren und ihre pathologischen Wirkungen zu kontrollieren. Solche Molekü le können auch verwendet werden, um Trypsin, Plasmin und, zu einem geringeren Grad, Gewebe-Kallikrein zu inhibieren.
Die Erfindung schließt auch die Verwendung der oben beschriebenen Proteine, Proteinfragmente und funktionellen Äquivalente als Antientzündungsagenzien ein. Vorzugsweise werden diese Moleküle als eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die einen inerten Träger enthält. Das Protein, Proteinfragment oder funktionelle Äquivalent kann den einzigen aktiven Bestandteil der Zusammensetzung darstellen, oder es kann Teil eines therapeutischen Pakets bilden, wie einen Bestandteil einer Creme für die äußerliche Verabreichung bei Insekten-, Schlangen- oder Skorpionsbissen, oder bei durch Dermatitis angegriffener Haut. Es kann auch als Träger-Molekül für Tryptase und Tryptase verwandte Verbindungen in Cremes, Ölen, Pudern oder Tabletten verwendet werden, um eine langsame Freisetzung der gebundenen Bestandteile zu ermöglichen.
Die Erfindung umfasst außerdem die Verwendung der Proteine, Proteinfragmente und funktionellen Äquivalente der Erfindung für die Quantifizierung von Tryptase-Spiegeln, vorzugsweise von humanen Mastzell-Tryptase-Spiegeln, zum Beispiel in Blut, Nasenspülungsflüssigkeit, Geweben oder Nahrungsmitteln. Dies kann als Teil eines Kits sein, das ein oder mehrere Proteine, Proteinfragmente oder funktionelle Äquivalente der Erfindung zusammen mit Nachweismitteln (zum Beispiel radioaktiv markierter Tryptase, Antikörpern, Enzymen wie alkalischen Phosphatasen, Peroxidasen und Luciferasen), die eine akkurate Quantifizierung der Tryptase in der zu testenden Probe erlauben, umfasst. Solche Kits können Radioimmun-Assays oder ELISA-Kits ähneln, wobei die erfindungsgemäßen Proteine eher als Bindungsmoleküle, als als Antikörper, die gegen Tryptase oder Tryptase verwandte Moleküle gerichtet sind, agieren. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst solche Kits, die die erfindungsgemäßen Moleküle einschließen.
Die Proteine, Proteinfragmente und funktionellen Äquivalente der Erfindung können auch für den Nachweis von Tryptase tragenden Zellen, und im Besonderen für den Nachweis von Mastzellen verwendet werden. Jede bekannte Technik des Standes der Technik kann in einem solchen Nachweisverfahren verwendet werden und kann immunzytochemische und histologische Techniken, in denen das Protein, Proteinfragment oder funktionelle Äquivalent in Kombination mit Antiseren (wie anti-TdPI Antiseren) verwendet wird, oder in denen das Molekül direkt an eine Markierung oder einen Farbstoff wie FITC gekoppelt ist, umfassen. Um ein Substrat nachzuweisen, kann ein gesamtes Protein oder einfach ein aktives Bindungsfragment verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann das Wildtyp-Protein entweder genetisch oder synthetisch mit einem anderen Protein, wie einer alkalischen Phosphatase, Luciferase oder Peroxidase, fusioniert werden, um seinen Nachweis zu erleichtern. Andere Verfahren zum Nachweis Tryptase enthaltener Zellen oder Proben können Blotting-Techniken (Towbin et al., 1979), Gelretention, Affinitätschromatographie, oder jedes der anderen, geeigneten Verfahren, die im Stand der Technik verwendet werden, einbeziehen.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung der Proteine, Proteinfragmente und funktionellen Äquivalente der vorliegenden Erfindung, die an ein Hilfsmittel gebunden sind, um Tryptase beispielsweise aus Körpergeweben, Blut oder Nahrungsmitteln zu entfernen, zu reinigen, zu isolieren oder zu extrahieren. Das Hilfsmittel kann jedes geeignete inerte Material umfassen und schließt Gele, magnetische und andere Kügelchen, Mikrosphären, Bindungssäulen und Harze ein.
Die vorliegende Erfindung schließt auch die Verwendung der Proteine, Proteinfragmente und funktionellen Äquivalente der Erfindung als Werkzeuge bei der Untersuchung von Entzündungen, entzündungsverwandten Vorgängen oder bei anderen physiologischen Vorgängen, an denen Tryptase beteiligt ist, ein. Diese Moleküle können auch als Werkzeuge verwendet werden, um weitere Merkmale und Funktionen der MCT selber zu untersuchen. Die Moleküle können zum Beispiel zur Tryptaseinhibition oder -verarmung in Zellkulturen oder in entzündeten Tiergeweben verwendet werden, um die Bedeutung der Tryptase in diesen Systemen zu untersuchen.
Metazoen-Parasiten, insbesondere Arthropoden und Helminthen, sind ebenfalls Quellen infektiöser Erkrankungen und anderer schädlicher Wirkungen, die große Auswirkungen auf die Human- und Veterinärmedizin haben. Die Kontrolle der Arthropoden- und Helminthen-Parasiten ist zur Zeit in erster Linie auf die Verwendung von Chemikalien wie Akariziden und antihelmintischen Mitteln angewiesen. Es wurden Versuche unternommen, immunologische Kontrollmittel durch die Verwendung der Impfstofftechnologie zu verwenden. Es gab einigen Erfolg bei der Identifizierung bestimmter, schützender Antigene als potenzielle Impfstoff-Kandidaten, aber nur einige wenige waren bis jetzt kommerziell erfolgreich, vor allem die gegen den Rinderlungenwurm Dictyocaulus viviparous und gegen die Rinderzecke Boophilus microplus. Trotz dieser Entwicklungen besteht ein fortgesetzter Bedarf an Impfstoffen gegen Metazoen-Parasiten und insbesondere an einem Impfstoff, der über einen weiten Bereich von Arthropoden und/oder Helminthen Gattungen verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt daher auch die Verwendung der Proteine, Proteinfragmente und funktionellen Äquivalente der Erfindung als Immunogene für die Verwendung als Metazoen-Parasiten-Impfstoffe und insbesondere als schützende Immunogene bei der Kontrolle von Krankheiten, die durch Arthropoden- und andere Metazoen-Parasiten hervorgerufen werden, bereit. Geeignete Kandidaten für Impfungen schließen Haustiere wie Rinder, Ziegen, Schafe, Hunde, Katzen und andere Tiere, die Schutz gegen Metazoen-Parasiten, insbesondere Zecken, benötigen, ein. Der Impfstoff kann bestimmte Verbindungen für die Verwendung als Hilfsstoff einschließen. Geeignete Hilfsmittel sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen Öl-in-Wasser Emulsionsformulierungen, Saponin-Hilfsmittel, vollständiges Freund'sches Adjuvans (CFA) und unvollständiges Freund'sches Adjuvans (IFA), Cytokine und andere Substanzen, die als immunstimulierende Agenzien wirken, um die Wirksamkeit der Zusammensetzung zu erhöhen, ein.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung, wird die Verwendung eines Proteins, Proteinfragments oder funktionellen Äquivalents gemäß der oben beschriebenen Aspekte der Erfindung, dessen Expression mit einer Krankheit oder einem Zustand assoziiert ist, für die Herstellung eines Impfstoffes für die Impfung des Säugetiers gegen die genannte Krankheit oder den Zustand, bereitgestellt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung eines Proteins, Proteinfragments oder funktionellen Äquivalents gemäß des oben beschriebenen Aspekts der Erfindung in einer therapeutisch wirksamen Menge, wahlweise in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Säugetiers, das an einer Krankheit oder einem Zustand wie Asthma, Schuppenflechte, einer interstitiellen Lungenerkrankung, rheumatoider Arthritis, Gingivitis, Peridontitis, einer allergischen Reaktion, Krebs oder jedem anderen Tryptase vermittelten Zustand leidet, bereit.
Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung, wird eine immunogene Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Protein, Proteinfragment oder funktionelles Äquivalent der oben beschriebenen Aspekte der Erfindung in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Pharmazeutisch verträgliche Träger schließen jeden Träger ein, der nicht selbst die Bildung von Antikörpern induziert, die dem Individuum, welches die Zusammensetzung erhält, schädlich sein können. Geeignete Träger sind typischerweise große Makromoleküle, die langsam metabolisiert werden, wie Proteine, Polysaccharide, polylaktische Säuren, polyglykolische Säuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Kopolymere, Lipidaggregate (wie Öltropfen oder Liposomen) und inaktive Viruspartikel. Solche Träger sind dem Fachmann gut bekannt. Die Zusammensetzung kann als Impfstoff verwendet werden und kann daher wahlweise ein immunstimulierendes Agens (einen Hilfsstoff), beispielsweise einen Hilfsstoff, der oben genannt wurde, umfassen. Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren für die Formulierung einer Impfstoff-Zusammensetzung, die ein Protein, Proteinfragment oder funktionelles Äquivalent gemäß der oben beschriebenen Aspekte der Erfindung, in Assoziation mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wahlweise mit einem Hilfsstoff, bringt, bereitgestellt.
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, welches eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Protein, Proteinfragment oder funktionelles Äquivalent gemäß der oben beschriebenen Aspekte der Erfindung kodiert. Solche Moleküle schließen einzel- oder doppelsträngige DNA, cDNA und RNA sowie synthetische Nukleinsäurearten ein. Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäuresequenz DNA.
Eine TdPI kodierende cDNA wird hier durch ein Beispiel offenbart, und ihre Sequenz und die von ihr kodierte Aminosäuresequenz werden in 1 gezeigt (Nukleotide und Aminosäuren werden in ihrer Standard Einbuchstaben-Abkürzung dargestellt).
Ein bevorzugtes, erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül umfasst eine Nukleotidsequenz, die identisch oder komplementär zu der in 1 gezeigten Sequenz ist, oder eine Sequenz, die degeneriert oder substanziell homolog dazu ist, oder die mit dieser Sequenz unter nicht stringenten Bedingungen hybridisiert, beispielsweise 6 × SSC/50% Formamid bei Raumtemperatur, und bei niedrig stringenten Bedingungen gewaschen, beispielsweise 2 × SSC bei Raumtemperatur oder 2 × SSC, 42°C oder weiter bevorzugt, Bindung bei Bedingungen höherer Stringenz, z.B. 2 × SSC, 65°C. (SSC = 0,15 M, NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH-Wert 7,2).
Vorzugsweise zeigen die Nukleinsäuresequenzen mindestens 60% Identität mit der TdPI kodierenden cDNA oder DNA-Sequenzen, deren Translationsprodukt (entweder ein Teilstück oder das gesamte Translationsprodukt) mindestens 60% oder mehr Identität mit der TdPI-Sequenz zeigt, wenn sie an dieser ausgerichtet wurden, vorzugsweise unter Verwendung des GCG Bestfit-Kommandos (gap creation penalty = 2,5; gap extension penalty = 0,5) (Genetics Computer Group, 1994).
Die Erfindung schließt außerdem Klonierungs- und Expressionsvektoren ein, die DNA-Sequenzen dieses Aspekts der Erfindung enthalten. Solche Expressionsvektoren können die angemessenen Transkriptions- und Translationskontroll-Sequenzen, zum Beispiel Verstärkerelemente, Promotor-Operatorregionen, Terminations-Stopp-Sequenzen, mRNA-Stabilitäts-Sequenzen, Start- und Stoppkodons oder ribosomale Bindungsstellen, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen innerhalb des Leserasters verbunden sind, einschließen.
Zusätzlich kann es zweckmäßig sein, dass das rekombinante Protein von bestimmten Wirten freigesetzt wird. Dementsprechend können weitere Bestandteile solcher Vektoren Nukleinsäuresequenzen enthalten, die für Sekretionssignal- und Verarbeitungs-Sequenzen kodieren.
Erfindungsgemäße Vektoren schließen Plasmide und Viren (sowohl Bakteriophagen als auch eukaryotische Viren einschließend), genauso wie andere lineare oder zirkuläre DNA-Träger ein, wie jene, die transposierbare Elemente oder homologe Rekombinationstechnologie einsetzen. Viele solche Vektoren und Expressionssysteme sind im Stand der Technik gut bekannt und dokumentiert (Fernandez & Hoeffler, 1998). Besonders geeignete virale Vektoren schließen Vektoren ein, die auf Baculovirus-, Adenovirus- und Vaccinia-Virus basieren.
Geeignete Wirte für die rekombinante Expression schließen allgemein verwendete prokaryotische Arten, wie E. coli oder eukaryotische Hefen ein, die dazu gebracht werden können, große Mengen rekombinanten Proteins zu exprimieren, und die einfach in großen Mengen kultiviert werden können. In vitro kultivierte Säugetierzelllinien sind ebenfalls geeignet, insbesondere wenn durch Viren angetriebene Expressionssysteme verwendet werden. Ein anderes geeignetes Expressionssystem ist das Baculovirus-Expressionssystem, das die Verwendung von Insektenzellen als Wirte einschließt. Ein Expressionssystem kann auch Wirtszellen einsetzen, die die kodierende DNA in ihrem Genom eingeschlossen haben. Proteine oder Proteinfragmente können auch in vivo exprimiert werden, zum Beispiel in Insektenlarven oder in Säugetiergeweben.
Eine Vielzahl von Techniken ist bekannt und kann verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Vektoren in prokaryotische oder eukaryotische Zellen zu bringen. Geeignete Transformations- oder Transfektions-Techniken sind in der Literatur gut beschrieben (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1991; Spector, Goldman & Leinwald, 1998). In eukaryotischen Zellen können die Expressionssysteme gemäß den Bedürfnissen des Systems entweder transient (z.B. episomal) oder permanent (chromosomale Integration) sein.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle können auch verwendet werden, um nicht humane transgene Tiere, vor allem Nagetiere, zu erzeugen. Dies kann lokal durch Modifikation von somatischen Zellen, oder durch Keimbahntherapie zur Einbringung vererbbarer Modifikationen durchgeführt werden.
Die Erfindung schließt auch transformierte oder transfizierte prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen oder transgene Organismen ein, die ein wie oben definiertes Nukleinsäuremolekül enthalten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, Proteinfragments oder funktionellen Äquivalents der Erfindung, wie oben definiert, bereit, welches die Kultivierung einer Wirtszelle, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül enthält, unter Bedingungen umfasst, bei denen das Protein exprimiert wird und das Protein gewonnen und somit hergestellt wird.
Verschiedene Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun durch Beispiele, mit besonderem Bezug auf ein Protein, welches aus der Zecke Rhipicephalus appendiculatus isoliert wurde, detaillierter beschrieben.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die cDNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz des TdPI-kodierenden Klons 76-3.
2 zeigt ein 15%iges SDS-Polyacrylamidgel, das rTdPI zeigt, welches mit Hilfe von Metallaffinitäts-Chromatographie und Kationenaustausch aufgereinigt wurde.
3 zeigt eine Ausrichtung bzw. ein Alignment von TdPI mit Kunitz-Domänen des bovinen bzw. Rinder-Colostrum-Trypsin-Inhibitors (BovCol; Cechova, 1976), des (bovinen) Aprotinins (Creighton & Charles, 1987) und des Rattengewebefaktor-Weg-Inhibitors (engl.: rat tissue factor pathway inhibitor; TFPI-2; nur die zweite, Faktor Xa-inhibierende Domäne ist gezeigt; Enjyoji et al., 1992).
4 zeigt ein Diagramm, welches die relativ schwache Inhibitionsaktivität des rTdPI auf Gewebe-Kallikrein zeigt.
5 zeigt die Aktivitäten von Plasmin (oben) und Trypsin (unten) in der Anwesenheit von steigenden rTdPI-Mengen, wie sie durch die Messung der Peptidfreisetzung aus Resorufin markiertem Kasein, bestimmt wurden.
6 zeigt die Inhibition der rekombinanten humanen Tryptase (Promega) mit TdPI.
7 zeigt ein 1,5%iges Agarosegel, das die RT-PCR-Produkte zeigt, die aus Ganzkörperextrakten von Larven (L) und Nymphen (N) und mit Speicheldrüsen-Extrakten von adulten R. appendiculatus Männchen und Weibchen erhalten wurden.
BEISPIELE Zecken
Die Zecken wurden nach Jones et al., 1988 gezüchtet. Alle drei Entwicklungsstadien von R. appendiculatus wurden an Dunkin Hartley Meerschweinchen gefüttert.
Außerhalb der Fütterung wurden alle Zecken bei 21 bis 26°C und 85% relativer Luftfeuchtigkeit gehalten.
cDNA
Klon 76, der die TdPI cDNA enthält, war einer von mehreren Klonen, die zufällig aus einer R. appendiculatus Speicheldrüsen-Expressions-Bank in Lambda Zap II (Stratagene), die mit mRNA von Zecken konstruiert wurde, die für 2 Tage an Dunkin Hartley Meerschweinchen gefressen hatten (Paesen & Nuttall, 1996), ausgewählt wurden. Das Phagemid wurde in vivo herausgeschnitten und zur Herstellung eines doppelsträngigen pBluescript SK(–)-Plasmids in XL1-Blue Zellen verwendet (Short et al., 1988). Das Plasmid wurde aus Übernachtkulturen aufgereinigt (Goode & Feinstein, 1992) und vor der Sequenzierung nach Sanger & Coulson, 1975 alkalidenaturiert (Mierendorf & Pfeffer, 1987).
Die vollständigen Sequenzen sowohl des Plus- als auch des Minusstrangs des 76-3 Inserts wurden bestimmt. Der vorwärts gerichtete Primer (Forward Primer) (S1→) (übereinstimmend mit den Nukleotiden 209 bis 224), der rückwärts gerichtete Primer (Reverse Primer) (←S2) (bindet an die Nukleotide 255 bis 271) und die Plasmid spezifischen Primer T3 (T3→) und T7 (←T7) (Insert spezifische Primer-Sequenzen oder ihre Bindungs-Stellen sind unterstrichen) sind in 1 gezeigt. P1→ und P2← kennzeichnen die Primerstellen, die im RT-PCR Versuch verwendet wurden.
Die Sequenz, die durch N-terminale Sequenzierung des rTdPI-Proteins erhalten wurde, ist in 1 in fetten, kursiven Ziffern dargestellt. Der unterschlängelte Bereich kennzeichnet eine Heparin bindende Konsensus-Sequenz. Der doppelt unterstrichene Bereich bezeichnet eine mögliche Glykosylierungsstelle. Das Polyadenylierungs-Signal und der PolyA-Schwanz sind in fetten Ziffern gezeigt. Das durch einen Stern markierte Leucin ist in den Klonen 76, 76-1 und 76-2 ein Methionin.
Die Sequenzdaten wurden unter Verwendung der GCG-Sequenzanalyse-Software analysiert [Genetics-Computer-Group. 1994 #14]. Das Durchsuchen von Protein Datenbanken wurden am Nationalen Zentrum für Biotechnologische Information (engl.: National Centre for Biotechnology Information, NCBI) unter Verwendung des BLAST Netzwerk Service (Altschul et al., 1990) durchgeführt.
Nachdem Klon 76 sequenziert war, wurde die Bank erneut nach weiteren Klonen mit DNA-Hybridisierung der Plaque-Lifts gescreent (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989). Die verwendete Sonde wurde aus der Original cDNA (herausgeschnitten mit EcoRI und Eco0109I aus aufgereinigtem Plasmid) durch Zufallsprimer-Markierung mit Digoxygenin (Boehringer Mannheim) konstruiert. Drei positive Klone wurden isoliert und sequenziert.
Expression des rekombinanten Proteins
Rekombinantes TdPI (rTdPI) wurde als ein Histidin markiertes Protein in Ovar-Zellen von Spodoptera frugiperda (Sf21; Invitrogen) exprimiert. Die kodierende Region der TdPI cDNA wurde mit Polymerase Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung des Forward Primers
5'-GCAGGAGCTCGGCACGAG
und des Reverse Primers
5'-TATGGATCCCAGGTCCAGGCTCTGTTCCG,
amplifiziert, wobei eine SacI-Stelle stromaufwärts des Start-Kodons hinzugefügt wurde und das Stopp-Kodon durch eine BamHI-Stelle ersetzt wurde. Die PCR bestand aus 20 Zyklen mit einem 30 Sekunden Schmelz-Schritt (95°C), einem 30 Sekunden Primer-Anlagerungs-Schritt (50°C) und einem 30 Sekunden Extensions-Schritt (72°C). Das PCR-Produkt wurde zwischen die SacI- und BamHI-Stellen des pAC129.1 Transfervektors (Livingstone & Jones, 1989) ligiert, der so modifiziert war, dass dem exprimierten Protein eine carboxyterminale Gly-Ile-(His)₆-Markierung hinzugefügt wurde. Ko-Transfektion der Sf21-Zellen mit dem Transfervektor und Baculovirus (BacPak6) und die Amplifikation des rekombinanten Virus wurde wie in Kitts & Possee, 1993 beschrieben, durchgeführt. rTdPI wurde in TC100-Medium (Gibco BRL), welches 10% fötales Rinderserum (Sigma) enthielt, exprimiert.
Reinigung des rekombinanten Proteins
Sechzig Stunden nach Infektion der Sf21-Zellen wurde das Kulturmedium gesammelt, und rTdPI wurde durch Hinzufügen von (NH₄)₂SO₄ (30 g pro 100 ml Medium) präzipitiert. Das Pellet wurde in 50 mM Natriumphosphat-Puffer (pH-Wert 8), der 300 mM NaCl und 10% Glycerin enthielt, gelöst. rTdPI wurde unter Verwendung einer Ni-NTA Agarose (Qiagen) Säule, vorwiegend nach Janknecht et al., 1991, gereinigt. Um die Säule zu waschen, wurden 50 mM Natriumphosphat-Puffer (pH-Wert 6,5), der 300 mM NaCl und 10% Glycerin enthielt, verwendet. Das Histidin markierte Protein wurde mit 200 mM Imidazol in 75 mM NaH₂PO eluiert. Eine weitere Reinigung wurde durch Niedrigdruck-Chromatographie unter Verwendung des BioLogic-Systems (Bio-Rad) mit einer HiTrap SP Kationenaustausch-Säule (Pharmacia Biotech) erreicht. Der Laufpuffer bestand aus 50 mM Hepes, pH-Wert 8, mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 250 mM über 1 Stunde; die Durchflussgeschwindigkeit betrug 1 ml/Min. Centricon 3 Konzentratoren (Amicon) wurden zur Konzentrierung der Eluate und zum Pufferaustausch verwendet. Das gereinigte Protein wurde bis zur Verwendung bei –20°C in PBS gelagert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Bio-Rad Protein Assay und dem Micro BCA Protein Assay (Pierce) gemessen.
Protein-Elektrophorese
Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) wurde nach Laemmli, 1970 durchgeführt.
2 zeigt ein 15%iges SDS-Polyacrylamidgel, das rTdPI zeigt, welches durch Metallaffinitätschromatographie und Kationenaustausch aufgereinigt wurde. Das Protein in Spur A wurde vor der Elektrophorese mit PNGase F (das ∼ 35 kDa Protein auf dem Gel) behandelt. Spur B enthält unbehandeltes rTdPI. Die Molekulargewichte sind in kDa angegeben. Spur C enthält nicht reduziertes rTdPI (kein reduzierendes Agens im Probenpuffer). Das höhere Molekulargewicht, bei dem nicht reduziertes rTdPI läuft, würde normalerweise eine Dimer-Bildung durch intermolekulare Disulfidbrücken vermuten lassen, aber eine Massenspektrometrie hat ein Molekulargewicht von ungefähr 13.500 Da ergeben, welches der Bildung von Dimeren widerspricht.
Die Asparagin gekoppelte Glykosylierung wurde durch die Behandlung von rTdPI mit N-Glykosidase F (PNGase F; New England BioLabs) untersucht, gefolgt von einer SDS-PAGE. PNGase F hydrolysiert alle bekannten Typen der Asn-Glykan-Ketten von Glykoproteinen (Maley et al., 1989).
3 zeigt eine Ausrichtung des TdPI mit Kunitz-Domänen des bovinen Colostrum-Trypsin-Inhibitors (BovCol; Cechova, 1976), (bovinem) Aprotinin (Creighton & Charles, 1987) und mit dem Rattengewebefaktor-Weg-Inhibitor (TFPI-2; nur die zweite, Faktor Xa-inhibierende Domäne ist gezeigt; Enjyoji et al., 1992). Die Kunitz-Domänen des Zecken-Antikoagulans-Peptids TAP (Waxman et al., 1990) und die zwei Domänen in Ornithodorin (Ornith1 und Ornith2; Van de Locht et al., 1996) sind ebenfalls enthalten. Die Ausrichtung des TdPI mit den Wirbeltier-Kunitz-Domänen wurde unter Verwendung der GCG "pileup" und "prettyplot" Befehle und unter Auswahl relativ niedriger Gap- und Längen-Gewichtungen (1 bzw. 0,03) erstellt. Die Ausrichtung wurde anschließend, vorwiegend durch die Einführung von extra Gaps, so modifiziert, dass die TAP- und Ornithodorin-Domänen eingeschlossen werden konnten. Die Modifikation basierte größtenteils auf der Ausrichtung der letztgenannten Domänen mit Aprotinin, wie durch Van de Locht et al., 1996 berichtet. Der Pfeil markiert den P1-Rest der Aprotinin-Bindungs-Schleife. Die Sterne weisen die Cysteine aus, die in traditionellen Kunitz-Domänen an der Disulfidbrücken-Bildung beteiligt sind.
N-terminale Sequenzierung
Die amino-terminale Sequenz des rTdPI wurde in der MRC Immunchemie Einheit der Abteilung für Biochemie der Universität von Oxford nach Matsudaira, 1987 bestimmt. Die elektrogeblotteten Proben wurden auf einem Applied Biosystems 494A "Procise" Protein-Sequenzgerät (Perkin-Elmer) unter Verwendung einer Applied Biosystems "Mini-Blott" Kartusche sequenziert.
Massenspektrometrie
ESI-MS wurde mit einem VG BioQ triple quadropole Luftdruck-Massenspektrometer durchgeführt, welches mit einer im positiven Ionenmodus betriebenen Elektrospray-Schnittstelle ausgestattet ist. Das Instrument wurde mit Pferdeherzmyoglobin kalibriert (7 pmol/μl; durchschnittliches Molekulargewicht 16951,48 Da).
Proteaseinhibitions-Assays
Elastase (Typ I, aus Schweinepankreas), α-Chymotrypsin, Trypsin, Thrombin, Plasmin, Gewebe-Kallikrein, Plasma-Kallikrein, Urokinase, Aprotinin, n-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid, Gly-Arg-p-Nitroanilid, n-α-Benzoyl-DL-Arg-nitroanilid und n-Benzoyl-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilid wurden von Sigma bezogen. Faktor Xa und rekombinante humane Tryptase stammten von Promega, und Resorufin markiertes Kasein, Sojabohnen-Trypsininhibitor, Chromozym TH und Chromozym X wurden von Boehringer Mannheim bezogen.
Die Tryptase-Aktivität wurde in 96 Vertiefungsmikroplatten unter Verwendung von n-α-Benzoyl-DL-Arg-p-nitroanilid als chromogenem Substrat und 50 mM HEPES, pH-Wert 7,6, welches 120 mM NaCl enthielt, als Reaktionspuffer, gemessen. 50 μl Puffer, der 1 μl der Tryptase Stammlösung (200 μg/ml) enthielt, wurde mit 50 μl Inhibitorlösung (unterschiedliche Konzentrationen) gemischt. Nach einer 45- minütigen Inkubationszeit bei 37°C wurden 50 μl der 3 mM Substratlösung hinzugegeben, und der Anstieg der Absorption bei 405 nm wurde mit einem Titertek Multiskan Plus MKII Plattenlesegerät (ICN) gemessen.
Andere Proteasen wurden mit unterschiedlichen Mengen des Proteaseibhibitors in einem Gesamtvolumen von 100 μl Protease-Puffer vorinkubiert (20 Minuten, 37°C). Die restliche Protease-Aktivität wurde durch das Hinzufügen eines geeigneten Substrats (in 900 μl Protease-Puffer) und das Messen des Abbaugrades bestimmt. Trypsin-, α-Chymotrypsin- und Elastase-Aktivitäten wurden in Protease-Puffer A (0,1 M Tris-HCl, 10% Glycerin, 10 mM CaCl₂, pH-Wert 8), Plasmin-, Urokinase-, Kallikrein-, α-Thrombin- und Faktor Xa-Aktivitäten wurden in Protease-Puffer B (50 mM Tris-HCl, 0,1 mg/ml bovines Serumalbumin, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, pH-Wert 8) bestimmt, wie bei Nakamura et al., 1987 beschrieben. Resorufin markiertes Kasein wurde als Substrat für Trypsin, α-Chymotrypsin und Plasmin verwendet, und die Menge freigesetzten Peptids wurde gemessen, um die Protease-Aktivität zu bestimmen (Twining, 1984). p-Nitroanilid (pNA)-Substrate wurden für Elastase-, Kallikrein-, Urokinase-, α-Thrombin- und Faktor Xa-Aktivitäten verwendet (entsprechend n-Succinyl-Ala-Ala-Ala-pNA, n-Benzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA, Gly-Arg-pNA, Chromozym TH und Chromozym X); die Protease-Aktivität wurde durch die Bestimmung des Anstiegs der Absorption bei 410 nm gemessen.
Das Diagramm in 4 zeigt die relativ schwache Inhibitionsaktivität des rTdPI auf Gewebe-Kallikrein. Es wird die Absorption bei 410 nm zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zugabe von 30 μg Substrat (n-Benzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA) zu den Kallikrein/Antiprotease Proben gezeigt. 0,5 μ/ml Gewebe-Kallikrein wurde pro Probe verwendet (1 ml Endvolumen). Die durchgezogene Linie (♦-♦) kennzeichnet die Kallikrein-Aktivität in Abwesenheit eines Proteaseinhibitors. Bei einer Konzentration von 0,75 μM inhibiert Aprotinin die Kallikrein-Aktivität vollständig (•---•). Eine zehnfach höhere Konzentration von rTdPI [75 μM (O---O)] inhibiert gerade 50% der Kallikrein-Aktivität. Andere, im Experiment verwendete rTdPI-Konzentrationen betrugen 3,75 μM (Δ---Δ) und 0,75 μM (☐---☐).
5 zeigt die Plasmin-(oben) und Trypsin-(unten) Aktivitäten in der Anwesenheit von steigenden rTdPI Mengen, wie durch die Messung der Peptidfreisetzung aus Resorufin markiertem Kasein bestimmt wurde. Die Peptidfreisetzung in Abwesenheit eines Inhibitors wurde auf 100% gesetzt, die Hydrolyse in Abwesenheit von Protease entspricht 0% Aktivität. Die rTdPI Messwerte sind durch offene Kreise markiert. Um die mikromolare Konzentration der rTdPI Monomere aus den im Protein-Assay erhaltenen mg/ml Daten zu berechnen, wurde sowohl das berechnete Molekulargewicht von 12 kDa (O---O; unter der Annahme, dass kein Coomassie Blau an die Kohlenhydrat-Fraktion des Glykoproteins bindet), als auch das (durchschnittliche) Molekulargewicht, das durch die Massenspektrometrie bestimmt wurde (13,5 kDa; O-O), verwendet. Die Konzentrationen, die einer 50%igen Plasmininhibition entsprechen, betragen 0,097 μM für Aprotinin (Δ-Δ), 0,23 μM für Sojabohnen-Trypsininhibitor (∅-∎), 0,32 μM (O-O) und 0,43 μM (O---O) für rTdPI Monomere. Die Messwerte für 50%ige Trypsininhibition betragen 0,024 μM (Δ Δ), 0,026 μM (∎-∎), 0,033 μM (O-O) und 0,044 μM (O---O).
6 zeigt die Inhibition von rekombinanter humaner Tryptase (Promega) durch TdPI. Eine Präinkubation der rekombinanten humanen Tryptase mit steigenden rTdPI-Mengen reduziert die katalytische Aktivität schnell auf ungefähr 33% der Aktivität, die in Abwesenheit eines Inhibitors vorhanden ist (V₀: die Geschwindigkeit des Substratdurchsatzes, gemessen bei Tryptase-Abwesenheit; Vi: die Geschwindigkeit mit hinzugefügtem Inhibitor).
Reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)
Speicheldrüsen wurden aus ungefütterten, adulten Zecken und aus adulten Zecken, die für 2, 4 und 6 Tage an Meerschweinchen gefüttert wurden, herausgeschnitten. Jede Gewebeprobe bestand aus 15 Drüsenpaaren. Die Gesamt-RNA wurde aus diesen Drüsen unter Verwendung des RNAce Total Pure Extraktionskits (Bioline Ltd.) isoliert, und 1/30 der erhaltenen Menge (das Äquivalent einer Drüse) wurde als eine Matrize für die RT-PCR (35 Zyklen) mit dem Titan One Tube RT-PCR System (Boehringer Mannheim) eingesetzt. Eine RT-PCR wurde au ßerdem mit gepoolter RNA aus Darm, Gonaden, akzessorischen Keimdrüsen und malpigischen Gefäßen von 2 Tage gefütterten, adulten Zecken durchgeführt. Ganzkörper-Homogenate von 3 Tage gefütterten Larven und 3 Tage gefütterten Nymphen wurden dem selben Verfahren unterzogen; die RNA-Menge, die pro PCR-Reaktion eingesetzt wurde, entsprach dem Extrakt einer Nymphe oder von 2 Larven. Die Primer-Sequenzen (P1 und P2) sind in 1 unterstrichen. Um zu überprüfen, ob die RT-PCR-Produkte spezifisch von TdPI-mRNA abgeleitet waren, wurde ihre Größe mit der Größe eines Markers verglichen, der durch PCR-Amplifikation der ursprünglichen Plasmid-DNA, unter Verwendung derselben Primer, erhalten wurde.
7 zeigt ein 1,5%iges Agarosegel, welches die RT-PCR-Produkte zeigt, die mit Ganzkörper-Extrakten der Larven (L) und Nymphen (N), und mit Speicheldrüsenextrakten von adulten R. appendiculatus Männchen und Weibchen, erhalten wurden. Die Nummern entsprechen den verschiedenen Zeitpunkten des Fütterungszustands der Adulten; 0 kennzeichnet Proben von ungefütterten Zecken, 2, 4 und 6 markieren entsprechend 2, 4 und 6 Tage gefütterte Zecken. Spur M zeigt das PCR-Produkt, welches mit demselben Primerset (1), aber mit TdPI-cDNA anstelle von RNA als Matrize erhalten wurde, als Marker für das Molekulargewicht.
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Claims

Rekombinantes Protein, welches i) signifikante Sequenz-Homologie mit der in 1 gegebenen, von Zecken abgeleiteten Proteasehemmstoff-Protein (TdPI)-Sequenz aufweist, oder ii) ein aktives Fragment der in 1 gegebenen TdPI-Sequenz ist, wobei die Sequenz-Homologie definiert ist, dass 50% oder mehr der Aminosäuren in der Sequenz vollständig als identische Reste über die gesamte Länge des Proteins konserviert sind, wenn das Protein an der Sequenz aus 1 ausgerichtet ist, und wobei das rekombinante Protein oder aktive Fragment Tryptase hemmt oder ein oder mehrere Epitope besitzt, die in der Entwicklung von Impfstoffen verwendet werden können, welche auf die in 1 gegebene TdPI-Sequenz abzielen.
Rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach Anspruch 1, welches als ein Hemmstoff von Tryptase, vorzugsweise von humaner Mastzellen-Tryptase, dient.
Rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach einem der Ansprüche 1 oder 2, welches ein oder mehrere Epitope enthält, die in der Entwicklung von Impfstoffen verwendet werden können, welche auf das TdPI-Protein mit der Sequenz aus 1 abzielen.
Rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach Anspruch 1, wobei die Sequenz-Homologie 60% oder mehr beträgt.
Rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach Anspruch 4, wobei die Sequenz-Homologie 75% oder mehr beträgt.
Rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend die in 1 gegebene TdPI-Sequenz.
Rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 6, welches Tryptase mit einem Ki von weniger als 1 × 10^–6 M, vorzugsweise weniger als 1 × 10^–7 M, mehr bevorzugt weniger als 2 × 10^–8 M, am meisten bevorzugt weniger als 1 × 10^–9 M hemmt.
Rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 7, welches katalytische Tryptase-Aktivität hemmt.
Rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8, welches Mastzell-Tryptase, vorzugsweise humane Mastzell-Tryptase hemmt.
Rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches von einer Zecke abgeleitet ist.
Rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach Anspruch 10, welches von der Zecke Rhipicephalus appendiculatus abgeleitet ist.
Rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches genetisch oder chemisch mit einem oder mehreren Peptiden oder Polypeptiden verschmolzen worden ist.
Rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches an einen Träger, beispielsweise ein Harz, gebunden ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 13, in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Impfstoff-Zusammensetzung, umfassend ein rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 11, gegebenenfalls in Verbindung mit einem Hilfsmittel.
Verfahren zur Formulierung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 15, umfassend das Inverbindungbringen eines rekombinanten Proteins oder Proteinfragments nach einem der Ansprüche 1 bis 11 mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Verwendung als ein Arzneimittel.
Nukleinsäuremolekül, welches ein rekombinantes Protein oder Proteinfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 12 kodiert.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 18, welches die in 1 gegebene Nukleotidsequenz aufweist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 18, welches mit einem Nukleinsäuremolekül mit der Sequenz aus 1 unter strengen Hybridisierungsbedingungen von 2 × SSC, 65°C, hybridisiert, wobei SSC 0,15 M NaCl, 0,015 M Natrium-Zitrat, pH 7,2, aufweist.
Vektor umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 18 bis 20 oder Anspruch 19.
Vektor nach Anspruch 21, welcher auf einem Virus basiert.
Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit dem Vektor nach Anspruch 21 oder Anspruch 22.
Nicht-humanes transgenes Tier, welches mit einem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 18 bis 20 transformiert worden ist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins oder Proteinfragments nach einem der Ansprüche 1 bis 12, umfassend das Exprimieren eines Vektors nach Anspruch 21 oder Anspruch 22 in einer Wirtszelle und das Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, bei denen das rekombinante Protein oder Proteinfragment exprimiert wird, und das Gewinnen des so hergestellten rekombinanten Proteins oder Proteinfragments.
Verwendung eines rekombinanten Proteins oder Proteinfragments nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Detektion oder Quantifizierung von Tryptase in vitro, zur Erschöpfung oder Entfernung von Tryptase in/aus einem Nahrungsmittelprodukt oder in/aus einer Zellkultur, oder zur in vitro-Verwendung als Anti-Tryptase-Mittel.
Verwendung eines rekombinanten Proteins oder Proteinfragments nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Entzündung in Menschen oder Tieren.
Verwendung eines rekombinanten Proteins oder Proteinfragments nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in der Herstellung eines Impfstoffs zum Schutz gegen Krankheiten, welche durch Arthropoden- oder Metazoon-Parasiten hervorgerufen sind.