PT1196579E - Inibidor da triptase - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "INIBIDOR DA TRIPTASE" A presente invenção refere-se a novas proteínas que foram identificadas em carraças. Estas proteínas podem ser utilizadas como componentes de vacinas, como inibidores da triptase de mastócitos (daqui em diante referidas como MCT), na detecção de mastócitos e no isolamento e purificação de MCT. A invenção também se refere ao controlo de doenças e danos causados pelos parasitas em animais e humanos e à utilização das proteínas da invenção no tratamento de doenças e alergias. A MCT humana é uma endoprotease que está alojada nos grânulos de secreção dos mastócitos e, após activação, é libertada a partir dos mastócitos como um tetrâmero que está estabilizado pela heparina. A remoção da heparina conduz à dissociação do complexo da triptase em monómeros inactivos enzimaticamente (Schwartz, 1994). A triptase é o principal componente mediador proteico dos grânulos dos mastócitos humanos, registando mais de 20% da proteína celular total (Schwartz, 1994) . A MCT é um marcador específico dos mastócitos, permitindo a sua diferenciação a partir de basófilos.

Os mastócitos são encontrados em muitos tecidos mas estão presentes em grande número ao longo das paredes epiteliais do corpo, tal como a pele, tracto respiratório e tracto gastrointestinal. Os mastócitos estão localizados frequentemente 1 na proximidade de vasos sanguíneos pequenos. Estes estão envolvidos numa variedade de estados fisiológicos e patofisiológicos, incluindo inflamação aguda, hipersensibilidade imediata, hipersensibilidade retardada, regulação do crescimento celular, defesa contra neoplasia e a sensação de dor e prurido (Liang et al., 1998). Os mastócitos estão também implicados em estados inflamatórios crónicos e estão envolvidos em interacções neuroimunes (Leon et al., 1994). A triptase dos mastócitos é um importante mediador da resposta inflamatória. As experiências (realizadas essencialmente in vitro) sugerem que desempenha papéis importantes em doenças tais como asma, psoríase, doença pulmonar intersticial, artrite reumatóide, gengivite e periodontite. A triptase dos mastócitos foi também implicada na tumorigénese e angiogénese, devido ao seu potencial para activar pró-urocinase e a matriz de metaloproteinase pró-estromelisina. Os enzimas do tipo triptase também foram descritos tomar parte na activação e internalização de vírus patogénicos, tais como o vírus influenza, vírus Sendai e o vírus da imunodeficiência humana (Pohlig et al., 1996). A triptase humana é inibida pela tripstatina (Katunuma et al., 1990, Adv. Enz. Reg., 30: 377) . A triptase humana é inibida por substâncias de baixo peso molecular (e.g. leupeptina e fluorofosfato de di-isopropilo). Os catiões divalentes, tais como o cálcio, e a benzamidina e seus derivados são inibidores competitivos da triptase dos mastócitos humanos (Schwartz, 1994) . Contudo, a triptase humana, ao contrário da maioria de outras esterases de serina, não é inibida por inibidores clássicos das proteases de serina, tais como aprotinina e inibidor da tripsina de soja. Não foram ainda referidos os 2 inibidores endógenos que identificam os sitios catalíticos da triptase de mastócitos. A actividade da triptase humana é inibida pela lactoferrina e mieloperoxidase (ambas derivadas de neutrófilos) e por antitrombina-III, todas as quais antagonizam os glicosaminoglicanos (heparina e sulfato de condroitina) que estabilizam o tetrâmero MCT (Alter et al., 1990; Cregar et al., 1999; Elrod et al., 1997). Foi também identificado como um inibidor da triptase o inibidor da protease de leucócitos secretores (SLPI) (documento WO 96/08275).

Foi previamente descrito um inibidor da triptase humana derivado da sanguessuga (LPDI) . Foi verificado que uma forma recombinante desta proteina do tipo Kazal inibe eficientemente 2 dos 4 sitios catalíticos da triptase tetramérica (Stubbs et al., 1997; Auerswald et al., 1994; Muhlhahn et al., 1994; Sommerhoff et al., 1994, documento WO95/03333).

Devido à importância conhecida da MCT na doença em mamíferos e na reposta alérgica, existe uma clara necessidade de inibidores altamente específicos e eficazes desta proteina. Uma nova proteina foi agora descoberta numa espécie de carraça que é capaz de inibir a actividade da triptase de mastócitos humanos.

Sumário da Invenção

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção é proporcionada uma proteina recombinante que exibe homologia significativa da sequência com a sequência da proteina inibidora protease derivada da carraça (TdPI) apresentada na Figura 1, um fragmento activo da referida proteina ou um equivalente funcional da referida proteina. 3

Como aqui utilizado, o termo "homologia significativa da sequência" pretende incluir todas as proteínas que partilham uma função comum com TdPI e que exibem homologia comum da sequência ou homologia entre dois motivos que estão presentes nas sequências polipeptidicas. A homologia total "significativa" refere-se a 50% ou mais dos aminoácidos na sequência sendo completamente conservados como resíduos idênticos se a proteína homóloga está alinhada com a sequência de TdPI. De um modo preferido, os alinhamentos são obtidos utilizando o comando bestfit do GCG (penalização por criação de um intervalo = 2,5; penalização por extensão de um intervalo = 0,5) (Genetics-

Computer-Group, 1994).

De um modo preferido, o grau de homologia é pelo menos 60% ao longo do comprimento completo da proteína. De um modo mais preferido, o grau de homologia é pelo menos 70%, de um modo ainda mais preferido 75%, de um modo muito preferido 80% ou superior.

Incluída neste aspecto da invenção é proporcionada uma proteína compreendendo a sequência aqui identificada como uma proteína inibidora derivada da protease da carraça (TdPI), um seu fragmento activo ou um seu equivalente funcional. Esta sequência é apresentada na Figura 1 anexada. Esta proteína foi identificada como sendo codificada por um ADNc de uma biblioteca de glândulas salivares da carraça. A proteína possui um peso molecular de aproximadamente 13,5 kDa e parece pertencer à família de inibidores de proteases do tipo Kunitz. A similaridade da sequência com outros membros desta família, tais como aprotinina e inibidor da inter-alfa-tripsina é baixa, mas o centro reactivo putativo e a posição das cisteínas são até certo ponto, conservados. 4 0 termo "equivalente funcional" é aqui utilizado para descrever proteínas que possuem uma função análoga à proteína TdPI, quer na inibição da triptase ou em possuir um ou mais epitopos que podem ser utilizados no desenvolvimento de vacinas que identificam proteínas que exibem homologia significativa da sequência com TdPI. 0 termo "equivalente funcional" também se refere a moléculas que são estruturalmente similares à proteína TdPI aqui identificada ou que contêm uma estrutura terciária similar ou idêntica. Este termo também inclui fragmentos de proteínas que conservam a capacidade de inibir a triptase, de um modo preferido, triptase de mastócitos humanos. A função análoga na inibição da triptase é, de um modo preferido, direccionada contra a actividade catalítica da triptase, de um modo preferido triptase de mastócitos, de um modo mais preferido triptase de mastócitos humanos, é caracteri zada por um Ki inferior a 1 μΜ, de um modo mais preferido 100 nM, de um modo ainda mais preferido 20 nM, de um modo ainda mais preferido inferior a 10 nM, de um modo muito preferido inferior a 1 nM, como avaliado utilizando qualquer ensaio de inibição da triptase padrão, tal como aquele aqui descrito (ver secção intitulada "Ensaios de inibição das proteases" nos Exemplos seguintes).

Alternativamente, ou adicionalmente a possuir actividade inibitória contra a triptase, o "equivalente funcional" é aqui utilizado para descrever proteínas que contêm epitopos que podem ser utilizados no desenvolvimento de vacinas contra as proteínas da invenção. Tais equivalentes funcionais, e também fragmentos contendo epitopos apropriados, podem ser utilizados para desenvolver vacinas direccionadas contra parasitas que se alimentam de sangue, que identificam membros da família de 5 proteínas TdPI. Os equivalentes funcionais podem certamente ser preparados mais ou menos imunogénicos que a proteína do tipo selvagem correspondente ou fragmento da proteína de modo a se adequarem a uma aplicação desejada. É entendido por "tipo selvagem" o genótipo que ocorre naturalmente que é característico da maioria dos membros de uma espécie. Se as proteínas são para ser utilizadas num regime de vacinação para induzir a resistência ao hospedeiro às proteínas do parasita, então as moléculas podem ser modificadas para aumentar a sua imunogenicidade. Será assim mais provável que estas dêem origem a uma resposta imunitária no hospedeiro vacinado.

Os equivalentes funcionais das proteínas da invenção incluirão substituição (ões) única (s) ou múltipla (s) de aminoácidos, adição (ões), inserção (ões) e/ou delecção (ões) da sequência da proteína de tipo selvagem e substituições de aminoácidos quimicamente modificados que não afectam a função ou actividade da proteína dum modo adverso. Este termo também pretende incluir variantes biológicas naturais (e.g. variantes alélicas ou variações geográficas dentro de todas as espécies diferentes a partir das quais são derivadas as proteínas do tipo selvagem).

Os fragmentos "activos" são aqueles que inibem quer a triptase, de um modo preferido, triptase de mastócitos humanos, e/ou contêm um ou mais epitopos que podem ser utilizados no desenvolvimento de vacinas contra as proteínas da presente invenção. Estas propriedades biológicas estão anteriormente descritas.

De um modo preferido, as proteínas deste aspecto da invenção são derivadas de ectoparasitas que se alimentam de 6 sangue, tais como mosquitos ou sanguessugas, ou de animais venenosos, tais como aranhas, escorpiões ou cobras. De um modo mais preferido, as proteinas são derivadas de carraças, de um modo muito preferido, as carraças pertencentes aos Ixodideos, tais como Rhipicephalus appendiculatus.

Estão incluidos como formas de realização da invenção, derivados das proteinas dos aspectos anteriormente descritos. Tais derivados podem incluir uma proteina ou polipéptido adicional fundido no seu terminal amina ou carboxilo ou adicionados internamente. 0 propósito do polipéptido adicional pode ser ajudar a detecção, expressão, separação ou purificação da proteina ou pode ser conferir à proteina propriedades adicionais, como desejado. Exemplos de parceiros de fusão potenciais incluem a β-galactosidase, transferase de glutationa-S, luciferase, uma marcação de poli-histidina, um fragmento de polimerase de T7 e um péptido de sinal de secreção.

As proteinas da presente invenção podem ser preparadas utilizando técnicas conhecidas de biologia molecular e quimica de proteinas. Os fragmentos de proteinas podem ser preparados através de síntese química, uma técnica que é especialmente útil para a criação de péptidos pequenos derivados da sequência da proteína completa, para utilização como imunogénios.

As proteínas da invenção podem ser preparadas na forma recombinante a através da expressão numa célula hospedeira. Tais métodos de expressão são bem conhecidos dos especialistas na técnica e muitas são descritas em detalhe por Sambrook et al., 1989, e Fernandez & Hoeffler, 1998. 7

Um aspecto posterior da invenção proporciona a utilização das proteínas, fragmentos de proteínas e equivalentes funcionais da invenção para inibir a triptase, tal como triptase de mastócitos, em mamíferos, e deste modo regular a sua acção e controlar os seus efeitos patológicos. Tais moléculas podem também ser utilizadas para inibir a tripsina, plasmina e, a um grau menor, calicreina no tecido. A invenção também inclui a utilização das proteínas, fragmentos de proteínas e equivalentes funcionais anteriormente descritos como agentes anti-inflamatórios. De um modo preferido, estas moléculas são proporcionadas como uma composição farmacêutica incluindo um transportador inerte. A proteina, fragmento de proteina ou equivalente funcional pode constituir o componente activo único da composição ou pode fazer parte de um pacote terapêutico, tal como um componente de cremes para administração tópica para mordidas de insectos, cobras ou escorpiões, ou para a pele afectada por dermatites. Também pode ser utilizado como uma molécula transportadora da triptase e de compostos relacionados com a triptase, em cremes, óleos, pós ou comprimidos, para proporcionar uma libertação lenta dos componentes ligados. A invenção também compreende a utilização das proteínas, fragmentos de proteínas e equivalentes funcionais da invenção para a quantificação dos niveis de triptase, de um modo preferido, niveis de triptase de mastócitos humanos, por exemplo, no sangue, fluido de lavagem nasal, tecidos ou produtos alimentares. Isto pode ser parte de um kit que compreende uma ou mais proteínas, fragmentos de proteínas ou equivalentes funcionais da invenção, juntamente com meios de detecção (por exemplo, triptase marcada radioactivamente, anticorpos, enzimas 8 tais como fosfatases alcalinas, peroxidases e luciferases) que permitem a quantificação precisa da triptase na amostra a ser testada. Tais kits podem assemelhar-se com os kits de radioimunoensaio ou de ELISA, com as proteínas da invenção actuando como moléculas de ligação, ao contrário de anticorpos direccionados contra a triptase ou contra moléculas relacionadas com a triptase. Um aspecto da presente invenção compreende tais kits incorporando as moléculas da presente invenção.

As proteínas, fragmentos de proteínas e equivalentes funcionais da invenção podem ser também utilizados para a detecção de células contendo triptase, e em particular para a detecção de mastócitos. Qualquer técnica comum da técnica pode ser utilizada em tal método de detecção e pode compreender técnicas imunocitoquímicas e histológicas, nas quais a proteína, fragmento de proteína ou equivalente funcional é utilizado em combinação com anti-soro (tal como anti-soro anti-TdPI), ou nas quais a molécula é acoplada directamente a um marcador ou corante, tal como FITC. Pode ser utilizada uma proteína completa, ou simplesmente um fragmento de ligação activo de modo a detectar o substracto. Noutra forma de realização, a proteína do tipo selvagem pode ser fundida quer geneticamente ou sinteticamente com outra proteína tal como uma fosfatase alcalina, luciferase ou peroxidase, de modo a facilitar a sua detecção. Outros métodos para detectar células ou amostras contendo triptase podem envolver técnicas de transferência (Towbin et al.r 1979), retardamento por gel, cromatografia de afinidade, ou qualquer um dos outros métodos apropriados que são utilizados na técnica. A invenção também compreende a utilização das proteínas, fragmentos de proteínas e equivalentes funcionais da presente 9 invenção ligados a um suporte para remover, purificar, isolar ou extrair a triptase, por exemplo, de tecidos corporais, sangue ou produtos alimentares. 0 suporte pode compreender qualquer material inerte apropriado e inclui géis, esferas magnéticas e outras, microesferas, colunas de ligação e resinas. A presente invenção também inclui a utilização das proteinas, fragmentos de proteinas e equivalentes funcionais da invenção como ferramentas no estudo da inflamação, processos relacionados com a inflamação ou outros processos fisiológicos envolvendo triptase. Estas moléculas podem também ser utilizadas como ferramentas para estudar posteriormente as caracteristicas e funções da própria MCT. Por exemplo, as moléculas podem ser utilizada para a inibição da triptase ou esgotamento em culturas de células ou em tecidos animais inflamados, de modo a estudar a importância da triptase nestes sistemas.

Os parasitas metazoários, particularmente artrópodes e helmintas, são também fontes de doenças infecciosas e outros efeitos nocivos que possuem impactos importantes na medicina humana e veterinária. 0 controlo dos parasitas de artrópodes e helmintas actualmente consiste principalmente na utilização de químicos, tais como acaricidas e anti-helmínticos. Foram efectuadas tentativas para utilizar meios imunológicos de controlo através da utilização da tecnologia das vacinas. Tem existido algum sucesso na identificação de certos antigénios protectores como candidatos a potenciais vacinas, mas apenas alguns agora chegaram ao usufruto comercial, mais notávelmente para a larva pulmonar Dictyocaulus viviparous do gado e a carraça Boophilus microplus do gado. Apesar destes desenvolvimentos, existe uma contínua necessidade para as vacinas de parasitas metazoários e em particular para uma vacina 10 que pode ser utilizada através de uma larga amplitude de géneros de artrópodes e/ou helmintas. A presente invenção também proporciona por isso a utilização das proteínas, fragmentos de proteínas e equivalentes funcionais da invenção como imunogénios para a utilização como vacinas de parasitas metazoários e, em particular, como imunogénios protectores no controlo de doenças causadas por artrópodes e outros parasitas metazoários. Os candidatos apropriados para a vacinação incluem animais domesticados tais como gado, cabras, ovelhas, cães, gatos e outros animais que requerem protecção contra parasitas metazoários, especialmente carraças. A vacina pode incluir certos compostos para utilizar como adjuvantes. Os adjuvantes apropriados são bem conhecidos na técnica e incluem formulações de emulsões de óleo em água, adjuvantes de saponina, Adjuvante Completo de Freund (CFA) e Adjuvante Incompleto de Freund (IFA), citocinas e outras substâncias que actuam como agentes imunoestimuladores para aumentar a eficácia da composição.

De acordo ainda com um aspecto adicional da presente invenção, é proporcionada a utilização de uma proteína, fragmento de proteína ou equivalente funcional de acordo com os aspectos da invenção anteriormente descritos cuja expressão está associada com uma doença ou estado na preparação de uma vacina para vacinação dos mamíferos contra a referida doença ou estado.

Um aspecto adicional da invenção proporciona a utilização de uma proteína, fragmento de proteína ou equivalente funcional de acordo com os aspectos anteriormente descritos da invenção, numa quantidade terapeuticamente eficaz, opcionalmente em conjunto com um transportador farmaceuticamente aceitável na 11 preparação de um medicamento para o tratamento de um mamífero sofrendo de uma doença ou uma condição tal como asma, psoríase, uma doença intersticial do pulmão, artrite reumatóide, gengivite, periodontite, uma reacção alérgica, cancro ou qualquer outra condição mediada pela triptase.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção é proporcionada uma composição imunogénica compreendendo uma proteína, fragmento de proteína ou equivalente funcional dos aspectos da invenção anteriormente descritos, em conjunto com um transportador farmaceuticamente aceitável.

Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem qualquer transportador que não induz por si próprio a produção de anticorpos prejudiciais para os indivíduos recebendo a composição. Os transportadores apropriados são, macromoléculas metabolizadas lentamente, tipicamente grandes, tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, co-polímeros de aminoácidos, agregados de lípidos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas) e partículas de vírus inactivas. Tais transportadores são bem conhecidos para os especialistas na técnica. A composição pode ser utilizada como uma vacina e pode assim compreender opcionalmente um agente imunoestimulador (adjuvante), por exemplo, um adjuvante como referido anteriormente. De acordo com um aspecto adicional da invenção, é proporcionado um processo para a formulação de uma composição da vacina compreendendo disponibilizar uma proteína, fragmento de proteína ou equivalente funcional de acordo com os aspectos da invenção anteriormente descritos, em associação com um transportador farmaceuticamente aceitável, opcionalmente com um adj uvante. 12

De acordo com um aspecto adicional da invenção é proprocionada uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína, fragmento de proteína ou equivalente funcional dos aspectos anteriormente descritos da invenção. Tais moléculas incluem ADN de cadeia simples ou dupla, ADNc e ARN, bem como espécies sintéticas de ácidos nucleicos. De um modo preferido, as sequências de ácido nucleicos compreendem ADN. É aqui revelado um ADNc que codifica a TdPI a título de exemplo e sua sequência e a sequência de aminoácidos que este codifica são apresentadas na Figura 1 (os nucleótidos e aminoácidos são apresentados nas suas abreviaturas de uma letra de referência).

Uma molécula de ácido nucleico preferida de acordo com a invenção compreende uma sequência de nucleótidos idêntica ou complementar à sequência apresentada na Figura 1, ou uma sequência que é degenerada ou substancialmente homóloga com essa, ou que híbrida com esta sequência sob condições não restringentes, por exemplo 6 x SSC/50% de formamida à temperatura ambiente, e lavada sob condições de baixa restringência, por exemplo (2 x SSC à temperatura ambiente ou 2 x SSC, 42 °C ou, de um modo mais preferido, ligando sob condições de elevada restringência, e.g. 2 x SSC, 65 °C. (SSC = NaCl a 0,15 M, citrato de sódio a 0,015 M, pH 7,2).

De um modo preferido, as referidas sequências de ácido nucleico exibem pelo menos 60% de identidade com o ADNc que codifica TdPI, ou sequências de ADN das quais o produto da tradução (quer uma extensão parcial ou o produto da tradução completo) exibe pelo menos 60% ou mais de identidade com a 13 sequência da TdPI, quando alinhada, de um modo preferido, utilizando o comando bestfit do GCG (penalização por criação de um intervalo = 2,5; penalização por extensão de um intervalo = 0,5) (Genetics Computer Group, 1994). A invenção também inclui vectores de clonagem e de expressão contendo sequências de ADN deste aspecto da invenção. Tais vectores de expressão podem incorporar as sequências apropriadas de controlo transcricional e de tradução, por exemplo elementos intensificadores, regiões promotoras-operadoras, sequências stop de terminação, sequências de estabilidade de ARNm, codões de iniciação e terminação e sitios de ligação ribossomais, ligados em grelha com as moléculas de ácidos nucleicos da invenção.

Adicionalmente, pode ser conveniente fazer com que a proteina recombinante seja secretada a partir de certos hospedeiros. Consequentemente, os componentes adicionais de tais vectores podem incluir sequências de ácidos nucleicos que codificam sequências de sinalização e processamento da secreção.

Os vectores de acordo com a invenção incluem plasmídeos e virus (incluindo ambos bacteriófagos e virus de eucariotas), bem como outros transportadores de ADN linear ou circular, tais como aqueles utilizando elementos transponiveis ou tecnologia de recombinação homóloga. Muitos desses vectores e sistemas de expressão são bem conhecidos e documentados na técnica (Fernandez & Hoeffler, 1998). Os vectores virais particularmente apropriados incluem vectores baseados em baculovirus, adenovirus, e virus vaccinia. 14

Os hospedeiros apropriados para expressão recombinante incluem espécies procariotas utilizadas habitualmente, tais como E. coli, ou leveduras eucariotas que podem ser preparadas para expressar niveis elevados de proteínas recombinantes e que podem facilmente ser cultivadas em largas quantidades. As linhas celulares de mamíferos cultivadas in vitro são também apropriadas, particularmente quando se utilizam sistemas de expressão conduzidos por vírus. Outro sistema de expressão apropriado é o sistema de expressão em baculovírus que envolve a utilização de células de insectos como hospedeiras. Um sistema de expressão pode também constituir células hospedeiras que possuem o ADN codificado incorporado no seu genoma. As proteínas, ou fragmentos de proteínas podem também ser expressas in vivo, por exemplo em larvas de insectos ou em tecidos de mamíferos. É conhecido um número de técnicas que podem ser utilizadas para introduzir os vectores, de acordo com a presente invenção, em células procariotas em eucariotas. As técnicas de transformação ou de técnicas apropriadas estão bem descritas na literatura (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1991; Spector, Goldman & Leinwald, 1998). Em células eucariotas, os sistemas de expressão podem ser quer transientes (e.g. epissomais) ou permanentes (integração cromossomal) de acordo com as necessidades do sistema.

De acordo com a presente invenção, as moléculas de ácidos nucleícos podem também ser utilizadas para criar animais transgénicos não-humanos, particularmente animais roedores. Isto pode ser efectuado localmente através da modificação das células somáticas, ou pela terapia de linha germinativa para incorporar modificações que se podem herdar. 15 A invenção também inclui células hospedeiras procariotas ou eucariotas transformadas ou transfectadas, ou organismos transgénicos contendo uma molécula de ácido nucleico como anteriormente definida.

Um aspecto adicional da invenção proporciona um método de preparação de uma proteína, fragmento de proteína ou equivalente funcional da invenção, como anteriormente definido, que compreende cultivar uma célula hospedeira contendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção, sob condições através das quais a referida proteína é expressa e recuperar a referida proteína assim produzida. Vários aspectos e formas de realização da presente invenção serão agora descritos em maior detalhe a título de exemplo, com particular referência a uma proteína isolada a partir da carraça, Rhipicephalus appendiculatus.

Breve descrição das figuras A Figura 1 apresenta a sequência de ADNc e a sequência de aminoácidos inferida do clone 76-3 que codifica a TdPI. A Figura 2 apresenta um gel de poliacrilamida-SDS a 15% exibindo TdPIr, purificado através de cromatografia de afinidade de metais catiónica. A Figura 3 apresenta um alinhamento da TdPI com os domínios de Kunitz do inibidor da tripsina do colostro bovino (BovCol; Cechova, 1976), aprotinina (bovina) (Creighton & Charles, 1987), e o inibidor da via do factor tecidular de rato (TFPI-2; apenas 16 é apresentado o segundo domínio inibidor do factor Xa; Enjyoji et ai. , 1992). A Figura 4 apresenta um diagrama apresentando uma actividade inibitória relativamente fraca de TdPIr no tecido com calicreina. A Figura 5 apresenta as actividades da plasmina (esquerda) e tripsina (direita) na presença de quantidades crescentes de TdPIr como determinado através da medição da libertação de péptidos a partir da caseína marcada com resorufina. A Figura 6 apresenta a inibição da triptase humana recombinante (Promega) com TdPI. A Figura 7 apresenta um gel de agarose a 1,5% exibindo produtos de RT-PCR obtidos com extractos de sangue total de larvas (L) e ninfas (N) , e com extractos de glândulas salivares de adultos, R. appendiculatus machos e fêmeas.

EXEMPLOS

Carraças

As carraças foram reproduzidas de acordo com Jones et ai., 1988. Todos os três estágios de desenvolvimento de R. appendiculatus foram alimentados com porquinhos-da-índia Dunkin Hartley. Quando não alimentadas, todas as carraças foram mantidas a 21 até 26 °C e a humidade relativa de 85%. 17 ADNc 0 clone 76, contendo o ADNc de TdPI, foi um dos vários clones escolhidos aleatoriamente a partir de uma biblioteca de expressão de glândulas salivares de R. appendiculatus em Lambda Zap II (Stratagene), que foi construída com ARNm de carraças que teriam sido alimentadas com porquinhos-da-índia Dunkin Hartley durante 2 dias (Paesen & Nuttall, 1996). 0 fagemídeo foi excisado in vivo e utilizado para gerar plasmídeo pBluescript SK (-) de cadeia dupla em células XLl-Blue (Short et al., 1988) . 0 plasmídeo foi purificado a partir de culturas de um dia para o outro (Goode & Feinstein, 1992) e desnaturado com alcali (Mierendorf & Pfeffer, 1987) anteriormente à sequenciação de acordo com Sanger & Coulson, 1975.

Foram determinadas as sequências completas de ambas as cadeias mais e menos da inserção 76-3. 0 iniciador em sentido directo (SI—>) (correspondendo aos nucleótidos 209 a 224), iniciador no sentido reverso (<—S2) (hibridando aos nucleótidos 255 a 271) e os iniciadores T3 (T3—>) e T7 (T7—») específicos de plasmídeo (estão sublinhadas as sequências do iniciador específicas da inserção ou os seus sítios de hibridação) são apresentados na Figura 1. Pl—> e P2<— indicam os sítios de iniciação utilizados na experiência de RT-PCR. A sequência obtida pela sequenciação do terminal N da proteína TdPIr está em itálico e negrito na Figura 1. O tracejado ondulado denota uma sequência de consenso ligada à heparina. A linha dupla indica um sítio de glicosilação putativo. O sinal de poliadenilação e a cauda poliA são 18 apresentados em letra do tipo negrito. A leucina indicada pelos asteriscos é uma metionina nos clones 76, 76-1 e 76-2.

Os dados da sequencia foram analisados utilizando o programa informático de análise de sequências - GCG [Genetics-Computer-Group, 1994 #14] . As pesquisas na base de dados de proteínas foram efectuadas no National Centre for Biotechnology Information (NCBI) utilizando o serviço em rede BLAST (Altschul et al., 1990).

Uma vez que o clone 76 foi sequenciado, a biblioteca foi sujeita de novo a rastreio para clones adicionais através de hibridação do ADN das protuberâncias das placas (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989). A sonda utilizada foi construída através de marcação do ADNc (excisado a partir de plasmídeo purificado utilizando AcoRI e Eco 01091) com iniciadores aleatórios com digoxigenina (Boehringer Mannheim). Foram isolados e sequenciados três clones positivos.

Expressão de proteína recombinante A TdPI (TdPIr) recombinante foi expressa como uma proteína marcada com histidina em células ováricas de Spodoptera frugiperda (S£21; Invitrogen) . A região codificante do ADNc de TdPI foi amplificada pela reacção da polimerase em cadeia (PCR), utilizando o iniciador no sentido directo 5'-GCAGGAGCTCGGCACGAG e o iniciador no sentido reverso 5' -TATGGATCCCAGGTCCAGGCTCTGTTCCG, adicionando deste modo um sítio Sac I a montante do codão de iniciação, e substituindo o codão de terminação com um sítio 19

Bam Hl. 0 PCR consistiu de 20 ciclos com um passo de desnaturação de 30 segundos (95 °C) , um passo de hibridação ao iniciador de 30 segundos (50 °C) e um passo de extensão de 30 segundos (72 °C) . 0 produto de PCR foi ligado entre os sítios

Sac I e Bam Hl do vector de transferência pAC129.1 (Livingstone & Jones, 1989), que foi modificado para que fosse adicionada uma marcação Gli-Ile-(His)6 no terminal carboxilo à proteína expressa. A co-transfecção das células Sf21 com o vector de transferência e baculovírus (BacPak6) e a amplificação do vírus recombinante foram como descrito por Kitts & Possee, 1993. A TdPIr foi expressa em meio TC 100 (Gibco BRL) contendo 10% de soro bovino fetal (Sigma).

Purificação da proteína recombinante

Sessenta horas após a infecção das células Sf21r o meio de cultura foi recolhido e a TdPIr foi precipitada através da adição de (NH4)2S04 (30 g por 100 mL de meio). O sedimento foi re-dissolvido em tampão fosfato de sódio a 50 mM (pH 8) contendo NaCl a 300 mM e glicerol a 10%. A TdPIr foi purificada utilizando uma coluna com agarose Ni-NTA (Qiagen), essencialmente de acordo com Janknecht et al., 1991. O tampão fosfato de sódio a 50 mM (pH 6,5) contendo NaCl a 300 mM e 10% de glicerol foi utilizado para lavar a coluna. A proteína marcada com histidina foi eluída utilizando imidazole a 200 mM em NaH2PO a 75 mM. Foi obtida purificação posterior através de cromatografia de baixa pressão utilizando um sistema da BioLogic (Bio-Rad) com uma coluna de troca catiónica HiTrap SP (Pharmacia Biotech) . O tampão de corrida foi Hepes a 50 mM, pH 8, com um gradiente linear de 0 até 250 mM de NaCl durante 1 hora; o caudal foi de 1 mL/min. Foram utilizados concentradores 20

Centricon 3 (Amicon) para a concentração dos eluídos e para a troca de tampão. A proteína purificada foi armazenada a -20 °C em PBS até à sua utilização. A concentração de proteína foi medida utilizando o Ensaio de Proteína da Bio-Rad e o Ensaio de Proteína Micro BCA (Pierce).

Electroforese de Proteínas A electroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) foi realizada de acordo com Laemmli, 1970 . A Figura 2 apresenta um gel de poliacrilamida-SDS a 15% exibindo TdPIr, purificado através de cromatografia de afinidade de metais e troca de catiões. A proteína na faixa A tinha sido tratada com PNGase F (a proteína de 35 kDa no gel) anteriormente à electroforese. A faixa B contém TdPIr não tratada. As massas moleculares são apresentadas em kDa. A faixa C contém TdPIr não reduzida (nenhum agente redutor no tampão de aplicação). O peso molecular mais elevado ao qual a TdPIr corre sugeriria normalmente dimerização através das pontes persulfureto intramoleculares, mas a espectrometria de massa coloca a massa molecular em cerca de 13500 Da, contradizendo a formação de dímeros. A glicosilação ligada à asparagina foi estudada tratando a TdPIr com N-glicosidase F (PNGase F; New England BioLabs), seguida de SDS-PAGE. A PNGase F hidrolisa todos os tipos comuns de cadeias de Asn-glicano das glicoproteínas (Maley et al., 1989). 21 A Figura 3 apresenta um alinhamento da TdPI com os domínios de Kunitz do inibidor da tripsina do colostro bovino (BovCol; Cechova, 1976), aprotinina (bovina) (Creighton & Charles, 1987), e o inibidor da via do factor tecidular de rato (TFPI-2; apenas é apresentado o segundo domínio inibidor do factor Xa; Enjyoji et al., 1992). Estão também incluídos os domínios Kunitz do péptido TAP anticoagulante de carraça (Waxman et al., 1990) e os dois domínios na omitodorina (ornithl e ornith2; Van de Locht et al., 1996). O alinhamento da TdPI com os domínios Kunitz de vertebrados foi gerado utilizando os comandos "pileup" e "prettyplot" do GCG, seleccionando intervalos e pesos moleculares relativamente peguenos (1 e 0,03, respectivamente). O alinhamento foi então modificado, principalmente introduzindo intervalos extra, de modo a que os domínios do TAP e da omitodorina possam ser incluídos. A modificação foi largamente baseada no alinhamento dos últimos domínios com a aprotinina, como referido por Van de Locht et al., 1996. A seta indica o resíduo PI da ansa de ligação da aprotinina. Os asteriscos indicam as cisteínas envolvidas na formação de pontes persulfureto nos domínios Kunitz tradicionais.

Sequenciação do terminal N A sequência do terminal amina da TdPIr foi determinada na MRC Immunochemistry Unit do Departmento de Bioquímica da Universidade de Oxford, de acordo com Matsudaira, 1987. As amostras sujeitas a transferência por electroforese foram corridas num sequenciador de proteínas da Applied Biosystems 494A 'Procise' (Perkin-Elmer) utilizando um cartuxo "Mini-Blott" da Applied Biosystems. 22

Espectrometria de Massa A ESI-MS foi realizada num espectrómetro de massa VG BioQ triple quadropole atmosferic pressure equipado com interface de electrospray operando no modo de ião positivo. 0 instrumento foi calibrado com mioglobina de coração de cavalo (7 pmol/yL; massa molecular média de 16951,48 Da).

Ensaios de inibição de protease A elastase (tipo I de pâncreas de suíno), a-quimiotripsina, tripsina, trombina, plasmina, tecido com calicreína, plasma com calicreína, urocinase, aprotinina, n-succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida, Gli-Arg-p-nitroanilida, n-OC-benzoil-DL-Arg-p-nitroanilida e n-benzoil-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilida foram adquiridos na Sigma. 0 factor Xa e a triptase recombinante humana foram adquiridos na Promega e a caseína marcada com resorufina, inibidor da tripsina de soja, Chromozym TH e Chromozym X foram obtidos na Boehringer Mannheim. A actividade da triptase foi medida em microplacas de 96 poços, utilizando n-a-benzoil-DL-Arg-p-nitroanilida como substracto cromogénico e HEPES a 50 mM, pH 7,6, contendo NaCl a 120 mM, como tampão de reacção. Foram combinados 50 yL de tampão contendo 1 yL de stock de triptase (200 yg/mL) com 50 yL de solução de inibidor (várias concentrações). Após um período de 45 minutos de incubação a 37 °C, foram adicionados 50 yL da solução de substrato a 3 mM e o aumento em absorvência a 405 nm foi medido utilizando um leitor de placas Titertek Multiskan Plus MKII (ICN) . 23

Foram pré-incubadas outras proteases com várias quantidades de inibidor de protease num volume total de 100 yL de tampão de protease (20 minutos; 37 °C) . A actividade de protease residual foi determinada adicionando os substratos apropriados (em 900 yL de tampão da protease) e medindo o grau da digestão. As actividades de tripsina, Ct-quimiotripsina, e elastase foram medidas em tampão A da protease (Tris-HCl a 0,1 M, glicerol a 10%, CaCl2 a 10 mM, pH 8) ; foram determinadas as actividades de plasmina, urocinase, calicreina, α-trombina e factor Xa em tampão B da protease (Tris-HCl a 50 mM, albumina de soro bovino a 0,1 mg/mL, NaCl a 150 mM, CaCl2 a 1 mM, pH 8), como descrito por Nakamura et al., 1987. A caserna marcada com resorufina foi utilizada como um substracto para a tripsina, α-quimiotripsina e plasmina, e a quantidade de péptido libertado foi medida para determinar a actividade da protease (Twining, 1984) . Os substratos de p-nitroanilida (pNA) foram utilizados para as actividades de elastase, calicreina, urocinase, α-trombina e factor Xa (n-succinil-Ala-Ala-Ala-pNA, n-benzoil-Pro-Phe-Arg-pNA, Gly-Arg-pNA, Chromozym TH e Chromozym X, respectivamente); a actividade da protease foi medida determinando o aumento da absorvência a 410 nm. A Figura 4 apresenta um diagrama exibindo a actividade inibidora relativamente fraca de TdPIr no tecido com calicreina. É apresentada a absorvência a 410 nm, a diferentes tempos, após a adição de 30 yg de substracto (n-benzoil-Pro-Phe-Arg-pNA) para as amostras de calicreina/antiprotease. Foi utilizado por amostra 0,5 u/mL de tecido com calicreina (1 mL de volume final) . A linha completa (♦—♦ ) indica a actividade de calicreina na ausência do inibidor de protease. A aprotinina utilizada a uma concentração de 0,75 μΜ inibe completamente a actividade da 24 calicreína (·----·) . Uma concentração dez vezes superior de

TdPIr [7,5 μΜ (0----0)] inibe fracamente 50% da actividade da calicreina. Outras concentrações de TdPIr utilizadas na experiência foram de 3,75 μΜ (Δ----Δ) e 0,75 μΜ (□---□). A Figura 5 apresenta as actividades da plasmina (esquerda) e tripsina (direita) na presença de quantidades crescentes de TdPIr como determinado medindo a libertação de péptido da caseína marcada com resorufina. A libertação de péptido na ausência do inibidor foi determinada para ser 100%, a hidrólise na ausência da protease corresponde a 0% de actividade. Os valores de TdPIr estão indicados pelos círculos abertos. Para calcular a concentração micromolar dos monómeros de TdPIr a partir dos dados em mg/mL obtidos com o ensaio de proteína, foram utilizadas ambas a massa molecular calculada de 12 kDa (O----O; assumindo nenhuma ligação do azul de Comassie à fracção de hidratos de carbono da glicoproteína) e a massa molecular (média) como determinado pela espectrometria de massa (13,5 kDa; 0—0). As concentrações correspondendo a uma inibição da plasmina de 50% são 0,097 μΜ para aprotinina (Δ—Δ), 0,23 μΜ para inibidor da tripsina de soja (-), 0,32 μΜ (O-O) e 0,43 μΜ (O----O) para monómeros de TdPIr. Os valores para a inibição da tripsina de 50% são 0,024 μΜ (Δ-Δ) , 0,026 μΜ (-), 0,033 μΜ (O-O) e 0,044 μΜ (Ο----Ο) . A Figura 6 apresenta a inibição da triptase humana recombinante (Promega) com TdPI. A pré-incubação da triptase humana recombinante com quantidades crescentes de TdPIr reduz rapidamente a actividade catalítica para cerca de 33% da actividade na ausência de inibidor (Vo: a velocidade de rotatividade do substrato medida sem a triptase presente; Vi: a velocidade com inibidor adicionado). 25

Reacção da polimerase-transcritase reversa em cadeia (RT- PCR)

As glândulas salivares foram excisadas a partir de carraças adultas não alimentadas, e a partir de carraças adultas que tinham sido alimentadas com porquinhos-da-índia durante 2, 4 e 6 dias. Cada amostra de tecido consistiu de 15 pares de glândulas. 0 ARN total foi isolado a partir destas glândulas utilizando o kit de extracção RNAce Total Pure (Bioline Ltd) e 1/30 da quantidade obtida (o equivalente a uma glândula) foi utilizado como um molde para RT-PCR (35 ciclos), utilizando o sistema Titan one tube RT-PCR (Boehringer Mannheim). A RT-PCR foi também realizada numa mistura de ARN de intestino, gónadas, glândulas sexuais acessórias e túbulos de Malpighi, retirados de carraças adultas alimentadas durante 2 dias. Os homogenatos do corpo total de larvas alimentas durante 3 dias e de ninfas alimentadas durante 3 dias foram submetidos ao mesmo procedimento; a quantidade de ARN utilizada para a reacção de PCR correspondeu com o extracto de 1 ninfa ou 2 larvas. As sequências dos iniciadores (PI e P2) estão sublinhadas na Figura 1. Para verificar se os produtos de RT-PCR foram derivados especificamente do ARNm de TdPI, os seus tamanhos foram comparados com o tamanho de um marcador que foi obtido por amplificação por PCR do ADN de plasmideo original, utilizando os mesmos iniciadores. A Figura 7 apresenta um gel de agarose a 1,5%, apresentando os produtos de RT-PCR obtidos com os extractos do corpo total de larvas (L) e ninfas (N) , e com extractos de glândulas salivares de R. appendiculatus adultos, machos e fêmeas. Os números correspondem com tempos diferentes do estágio de alimentação do adulto; 0 indica as amostras retiradas de carraças não 26 alimentadas; 2, 4 e 6 indicam 2, 4 e 6 dias de carraças alimentadas, respectivamente. A Faixa M apresenta como a um marcador de pesos moleculares obtido por produto de PCR com o mesmo conjunto de iniciadores (Fig. 1), mas utilizando o ADNc de TdPI como um molde, em vez de ARN.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> EVOLUTEC LTD

<120> PROTEÍNAS INIBIDORAS

<130> P022288WO <140> PGT/GB00/02791 <141 >2000-07-19 <150> GB9916913.8 <151 > 1999-07-19 <160> 10 <170> SeqWin99, versão 1.02 <21o> 1

<211 >490 <212> ADN <213> Rhicephalus appendiculatus <400> 1 gaaacctcat gggccgcact accctaatcg tcgccatcgt gctggtggct ttcgttgcaa 6 0 gcacactagg aaatgcctac cctaaagtgg aagaaagacg taacaggcct aattgggatt 1 20 ttgggaaaag gaaagaagag tgtaccgttc ctattggttg gagcgaacca gtaaaagggc 1 80 tttgcaaggc tagatttact aggtattact gcatggggaa ctgttgcaag gtatacgaag 2 40 gctgctacac aggaggctat tccagaatgg gtgaatgcgc gagaaattgt cccggcttca 3 00 aaagaccgac accagggttc agaccacggc acggactaga gaacggaaca gagcctggac 3 60 cttgaaacct cagataataa ttctccgaag acctcgatta tttcaccatg aggccgtttt 4 20 tttttccaca ataaaagcgg acaaggagaa catacatcat actgaaataa aataagaaac 4 80 caaaaaaaaa 4 90

<210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Rhicephalus appendiculatus <400>2 32

Met 1 Gly Arg Thr Thr 5 Leu Ile Vai Ala Ile 10 Vai Leu Vai Ala Phe 15 Vai Ala Ser Thr Leu 20 Gly Asn Ala Tyr Pro 25 Lys Vai Glu Glu Arg 30 Arg Asn Arg Pro Asn Trp Asp Phe Gly Lys Arg Lys Glu Glu Cys Thr Vai Pro 35 40 45 Ile Gly Trp 50 Ser Glu Pro Vai 55 Lys Gly Leu Cys Lys 60 Ala Arg Phe Thr Arg 65 Tyr Tyr Cys Met Gly Asn 70 Cys Cys Lys Vai 75 Tyr Glu Gly Cys Tyr 80 Thr Gly Gly Tyr Ser 85 Arg Met Gly Glu Cys 90 Ala Arg Asn Cys Pro 95 Gly Phe Lys Arg Pro 100 Thr Pro Gly Phe Arg 105 Pro Arg His Gly Leu 110 Glu Asn Gly Thr Glu Pro Gly Pro 115 <210> 3 <211 >56 <212> PRT <213> BosTaurus <400>3

Pro 1 Pro Asp Leu Cys 5 Gin Leu Pro Gin Ala 10 Arg Gly Pro Cys Lys 15 Ala Ala Leu Leu Arg 20 Tyr Phe Tyr Asn Ser 25 Thr Ser Asn Ala Cys 30 Glu Pro Phe Thr Tyr 35 Gly Gly Cys Gin Gly 40 Asn Asn Asx Asn Phe 45 Glu Thr Thr Glu Met 50 Cys Leu Arg Ile Cys 55 Glu

<210> 4 <211 >56 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400>4 33

Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu 1 5 Phe Met Thr Arg Tyr Phe Tyr 20 Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu 35 Glu Glu Cys Arg Asn Thr Cys 50 55

Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly 10 15

Asn Asn Gin Ser Lys Gin Cys Glu Gin 25 30

Gly Asn Ser Asn Asn Phe Glu Thr Leu 40 45

Glu <210> 5 <211 >56 <212> PRT <213> Bos taurus <400>5

Arg 1 Pro Asp Phe Cys 5 Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro 10 Cys Lys 15 Ala Arg Ile Ile Arg 20 Tyr Phe Tyr Asn Ala 25 Lys Ala Gly Leu Cys 30 Gin Thr Phe Vai Tyr 35 Gly Gly Cys Arg Ala 40 Lys Arg Asn Asn Phe 45 Lys Ser Ala Glu Asp 50 Cys Met Arg Thr Cys 55 Gly

<210>6 <211> 60 <212> PRT <213> Ornithodoros moubata <400>6

Tyr 1 Asn Arg Leu Cys 5 Ile Lys Pro Arg Asp 10 Trp Ile Asp Glu Cys 15 Asp Ser Asn Glu Gly 20 Gly Glu Arg Ala Tyr 25 Phe Arg Asn Gly Lys 30 Gly Gly Cys Asp Ser 35 Phe Trp Ile Cys Pro 40 Glu Asp His Thr Gly 45 Ala Asp Tyr Tyr Ser 50 Ser Tyr Arg Asp Cys 55 Phe Asn Ala Cys Ile 60

<210> 7 <211 >51 <212> PRT 34 <213> Ornithodoros moubata <400>7 Leu 1 Asn Vai Leu Cys 5 Asn Asn Pro His Thr 10 Ala Asp Cys Asn Asn 15 Asp Ala Gin Vai Asp 20 Arg Tyr Phe Arg Glu 25 Gly Thr Thr Cys Leu 30 Met Ser Pro Ala Cys 35 Thr Ser Glu Gly Tyr 40 Ala Ser Gin Hls Glu 45 Cys Gin Gin Ala Cys Phe 50

<210> 8 <211 >54 <212> PRT <213> Ornithodoros moubata <400>8

Met 1 His Ser Ser Cys 5 Leu Gly Asp Pro Pro 10 Thr Ser Cys Ala Glu 15 Gly Thr Asp Ile Thr 20 Tyr Tyr Asp Ser Asp 25 Ser Lys Thr Cys Lys 30 Vai Leu Ala Ala Ser 35 Cys Pro Ser Gly Glu 40 Asn Thr Phe Glu Ser 45 Glu Vai Glu Cys Gin 50 Vai Ala Cys Gly

<210> 9 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador de PCR <400>9 gcaggagctc ggcacgag 1 8

<210> 10 <211 >29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 35 <223> Iniciador de PCR <400> 10 tatggatccc aggtccaggc tctgttccg 9

Lisboa, 18 de Outubro de 2006

Claims (28)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Proteína recombinante que: i) exibe homologia significativa da sequência com a sequência da proteína inibidora da protease derivada da carraça (TdPI) apresentada na Figura 1; ou ii) é um fragmento activo da sequência de TdPI apresentada na Figura 1, em que a referida homologia da sequência é definida como 50% ou mais dos aminoácidos na sequência sendo completamente conservada como resíduos idênticos ao longo do comprimento completo da proteína se a proteína está alinhada com a sequência da Figura 1, e em que a proteína recombinante ou fragmento activo inibe a triptase ou possui um ou mais epitopos que podem ser utilizados no desenvolvimento de vacinas que identificam a sequência de TdPI apresentada na Figura 1.
2. 2. Proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com a reivindicação 1 que funciona como um inibidor da triptase, de um modo preferido, da triptase de mastócitos humanos.
3. 3. Proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com qualquer das reivindicações 1-2 que contém um ou mais epitopos que podem ser utilizados no desenvolvimento de vacinas que identificam a proteína TdPI possuindo a sequência da Figura 1. 1
4. 4. Proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com a reivindicação 1, em que a referida homologia da sequência é 60% ou mais.
5. 5. Proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com a reivindicação 4, em que a referida homologia da sequência é 75% ou mais.
6. 6. Proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, compreendendo a sequência da TdPI apresentada na Figura 1.
7. 7. Proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, que inibe a triptase com um Ki inferior a 1 x 10~6 M, de um modo preferido, inferior a 1 x 10“7 M, de um modo mais preferido, inferior a 2 x 10~8 M, de um modo muito preferido, inferior a 1 x IO-9 M.
8. 8. Proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7 que inibe a actividade catalítica da triptase.
9. 9. Proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8 que inibe a triptase de mastócitos, de um modo preferido, triptase de mastócitos humanos.
10. 10. Proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que é derivada de uma carraça. 2
11. 11. Proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com a reivindicação 10 que é derivada da carraça Rhipicephalus appendiculatus.
12. 12. Proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que foi fundida geneticamente ou quimicamente com um ou mais péptidos ou polipéptidos.
13. 13. Proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que está ligada a um suporte, tal como uma resina.
14. 14. Composição farmacêutica compreendendo uma proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, em conjunto com um transportador farmaceuticamente aceitável.
15. 15. Composição de uma vacina compreendendo uma proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, opcionalmente em conjunto com um adjuvante.
16. 16. Processo para a formulação de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15 compreendendo disponibilizar uma proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11 em associação com um transportador farmaceuticamente aceitável. 3
17. 17. Proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11 para utilização como um fármaco.
18. 18. Molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
19. 19. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 18 possuindo a sequência de nucleótidos apresentada na Figura 1.
20. 20. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 18 que híbrida com uma molécula de ácido nucleico possuindo a sequência da Figura 1, sob condições de hibridação restringentes de 2xSSC, 65 °C, em que SSC possui NaCl a 0,15 M, citrato de sódio a 0,015 M, pH 7,2.
21. 21. Vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20 ou reivindicação 19.
22. 22. Vector da reivindicação 21 que é de base virai.
23. 23. Célula hospedeira transformada ou transfectada com o vector da reivindicação 21 ou da reivindicação 22.
24. 24. Animal transgénico não humano que foi transformado por uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20. 4
25. 25. Método de preparação de uma proteína recombinante ou fragmento de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, compreendendo a expressão de um vector de acordo com a reivindicação 21 ou reivindicação 22 numa célula hospedeira e cultivando a referida célula hospedeira sob condições em que a referida proteina recombinante ou fragmento de proteina é expressa, e recuperação da referida proteína recombinante ou fragmento de proteina assim produzida.
26. 26. Utilização de uma proteína recombinante ou fragmento de proteina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13 para: a detecção ou quantificação da triptase in vitro; para a eliminação ou remoção da triptase de um produto alimentar ou de uma cultura de células; ou para utilização in vitro como um agente anti-triptase.
27. 27. Utilização de uma proteína recombinante ou fragmento de proteina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12 na preparação de um medicamento para o tratamento de inflamação em humanos ou animais.
28. 28. Utilização de uma proteína recombinante ou fragmento de proteina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12 na preparação de uma vacina para a protecção contra doenças causadas por parasitas artrópodes ou metazoários. Lisboa, 18 de Outubro de 2006 5