MXPA02000677A - Proteinas inhibidoras. - Google Patents
Proteinas inhibidoras.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a una proteína recombinante, caracterizada porque:i) presenta una homología de secuencia significativa con la secuencia de la proteína inhibidora de proteasa derivada de garrapata (TdPI, por sus siglas en inglés) proporcionada en la figura 1;o ii) es un fragmento activo de la secuencia de TdPI proporcionada en la figura 1, en donde la homología de secuencia se define como 50%o más de los aminoácidos en la secuencia los cuales están completamente conservados como residuos idénticos a lo largo de la proteína si la proteína se alinea con la secuencia de la figura 1, y en donde la proteína recombinante o un fragmento activo inhibe triptasa o posee uno o más epítopos en el desarrollo de vacunas que tienen como objetivo la secuencia TdPI que se proporciona en la figura
Description
PROTEINAS INHIBIDORAS
DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a las nuevas proteínas que han sido identificadas en garrapatas. Estas proteínas pueden ser utilizadas como componentes de vacunas, como inhibidores de la triptasa de mastocitos (de aquí en adelante denominada como MCT) , en la detección de mastocitos y en el aislamiento y purificación de MCT. La invención también se refiere al control de las enfermedades y al daño provocado por los parásitos en animales y humanos y al uso de las proteínas de la invención en el tratamiento de las enfermedades y alergias. Todos los documentos mencionados en el texto y listados al final de esta descripción son incorporados por referencia en la presente. MCT humana es una endoproteasa que es almacenada en los gránulos secretores de los mastocitos y, después de la activación, es liberada de los mastocitos como un tetrámero que es estabilizado por la heparina. El retiro de la heparina conduce a la disociación del complejo de triptasa en monómeros enzimáticamente inactivos (Schwartz, 1994) . La triptasa es el componente principal mediador de las proteínas de los gránulos de los mastocitos humanos,
Ref. 135735 representando arriba del 20% de la proteína celular total (Schwartz, 1994) . MCT es un marcador específico de los mastocitos, que permite su diferenciación a partir de basófilos. Los mastocitos son encontrados en muchos tejidos pero están presentes en mayores números a lo largo de revestimientos epiteliales del cuerpo, tales como la piel, el tracto respiratorio y el tracto gastrointestinal. Los mastocitos son a menudo localizados en la proximidad de los vasos sanguíneos pequeños. Éstos están involucrados en una variedad de estados fisiológicos y patofisiológicos, incluyendo la inflamación aguda, hipersensibilidad inmediata, hipersensibilidad tardía, regulación del crecimiento celular, defensa contra la neoplasia y la sensación de dolor y comezón (Liang et al., 1998). Los mastocitos están también implicados en los estados inflamatorios crónicos y están involucrados en las interacciones neuroinmunes (León et al., 1994) . La triptasa de los mastocitos es un mediador importante de la respuesta inflamatoria. Los experimentos (principalmente realizados in vi tro) sugieren que ésta juega papeles importantes en enfermedades tales como asma, psoriasis, enfermedad intersticial del pulmón, artritis reumatoide, gingivitis y periodontitis . La triptasa de los mastocitos ha estado también implicada en la tumorigénesis y en la angiogénesis , debido a su potencial para activar la pro-urocinasa y la raetaloproteinasa de matriz pro-estromelisina . Se ha descrito también que las enzimas similares a la triptasa toman parte en la activación e internalización de los virus patógenos tales como el virus de la influenza, el virus Sendai y el virus de inmunodeficiencia humana (Pohlig et al., 1996). La triptasa humana es inhibida por las sustancias de bajo peso molecular (por ejemplo leupeptina y fluorofosfato de diisopropilo) . Los cationes divalentes, tales como calcio, y benzamidina y sus derivados son inhibidores competitivos de la triptasa de los mastocitos humanos (Schwartz, 1994) . No obstante, la triptasa humana de manera contraria a la mayoría de otras esterasas de serina, no es inhibida por inhibidores clásicos de las proteasas de serina, tales como la aprotinina y el inhibidor de tripsina de soya. Los inhibidores endógenos que se dirigen a los sitios catalíticos de la triptasa de los mastocitos tienen que ser todavía reportados. La actividad de la triptasa humana es inhibida por la lactoferrina y la mieloperoxidasa (ambas derivadas de neutrófilos) y por la antitrombina III, todas las cuales antagonizan los glucosaminoglucanos (sulfato de heparina o de condroitina) que estabilizan el tetrámero MCT (Alter et al., 1990; Cregar et al., 1999; Elrod et al., 1997) .
Un inhibidor derivado de sanguijuela, de la triptasa humana (LDPI) ha sido previamente descrito. Se ha encontrado que una forma recombinante de esta proteína tipo Kasal inhibe eficientemente 2 de los 4 sitios catalíticos de la triptasa tetramérica (Stubbs et al., 1997; Auers ald et al., 1994; Mühlhahn et al., 1994; Sommerhoff et al., 1994) . Debido a la importancia conocida de MCT en la enfermedad de los mamíferos y en la respuesta alérgica, existe una clara necesidad para inhibidores altamente específicos y efectivos de esta proteína. Una novedosa proteína ha sido ahora descubierta en una especie de garrapata que es capaz de inhibir la actividad de la triptasa de mastocitos humanos .
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
De acuerdo a un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una proteína recombinante que muestra homología secuencial significativa con la secuencia de la proteína inhibidora de la proteasa derivada de garrapata (TdPI) dada en la Figura 1, un fragmento activo de dicha proteína o un equivalente funcional de la proteína. Como se utiliza en la presente, el término "homología de secuencia significativa" se entiende que incluye todas las proteínas que comparten una función común con TdPI y que muestran homología secuencial común u homología entre porciones que están presentes en las secuencias polipeptídicas . La homología completa
"significativa" se refiere al 50% o más de los aminoácidos en la secuencia que son completamente conservados como residuos idénticos si la proteína homologa es alineada con la secuencia de TdPI . Preferentemente, los alineamientos son obtenidos utilizando el comando del mejor ajuste (bestfit) de GCG (penalidad por creación de espacio vacío = 2.5; penalidad por extensión de espacio vacío = 0.5) (Genetics-Computer-Group, 1994) . Preferentemente, el grado de homología es al menos 60% a través de la longitud completa de la proteína. Más preferentemente, el grado de homología es al menos 70%, aún más preferentemente 75%, lo más preferentemente 80% o más. Incluida en este aspecto de la invención, se proporciona una proteína que comprende la secuencia identificada en la presente como la proteína inhibidora de la proteasa derivada de la garrapata (TdPI) , un fragmento activo de la misma o un equivalente funcional de la misma. Esta secuencia es dada en la Figura 1 anexa. Esta proteína fue identificada como codificada por un ADNc proveniente de una genoteca de glándula salival de garrapata. La proteína tiene un peso molecular de aproximadamente 13.5 kDa y parece pertenecer a la familia de los inhibidores de proteasa tipo Kunitz. La similitud secuencial con otros miembros de esta familia tal como la aprotinina y el inhibidor de inter-alfa-tripsina, es baja, pero el centro reactivo putativo y la posición de las cisteínas está en cierto grado conservada. El término "equivalente funcional" se utiliza en la presente para describir las proteínas que tienen una función análoga a la proteína TdPI, ya sea en inhibir la triptasa o en poseer uno o más epítopes que pueden ser utilizados en el desarrollo de vacunas que se dirigen a las proteínas que muestran homología secuencial significativa con TdPI. El término "equivalente funcional" también se refiere a las moléculas que son estructuralmente similares a la proteína TdPI identificada en la presente o que contienen estructura terciaria similar o idéntica. Este término también incluye los fragmentos de proteína que conservan la habilidad para inhibir la triptasa, preferentemente la triptasa de mastocitos humanos. La función análoga en la inhibición de la triptasa está preferentemente dirigida contra la actividad catalítica de la triptasa, preferentemente la triptasa de mastocitos, más preferentemente la triptasa de mastocitos humanos, está caracterizada por una Ki menor de 1 µ?, más preferentemente 100 nM, aún más preferentemente 20 nM, todavía más preferentemente menos de 10 nM, lo más preferentemente menos de 1 nM, como es evaluado utilizando cualquier ensayo estándar de inhibición de triptasa, tal como aquel descrito en la presente (ver sección titulada "Ensayos de inhibición de proteasa" en los Ejemplos siguientes) . Alternativamente, o además de poseer la actividad inhibitoria contra la triptasa, el "equivalente funcional" es utilizada en la presente para describir las proteínas que contienen epítopes que pueden ser utilizados en el desarrollo de vacunas contra las proteínas de la invención. Tales equivalentes funcionales, y también los fragmentos que contienen los epítopes adecuados, pueden ser utilizados para desarrollar vacunas dirigidas contra los parásitos que se alimentan de sangre, que se dirigen a los miembros de la familia de proteínas TdPI . Los equivalentes funcionales pueden por supuesto ser hechos más o menos inmunogénicos que la proteína o fragmento de proteína tipo silvestre, correspondiente, con el fin de adecuarse a una aplicación deseada. Por "tipo silvestre" se entiende el genotipo de origen natural que es característico de la mayoría de los miembros de una especie. Si las proteínas van a ser utilizadas en un régimen de vacunación para inducir la resistencia del hospedero a las proteínas del parásito, entonces las moléculas pueden ser modificadas para aumentar su inmunogenicidad. De este modo, es más probable que éstas promuevan una respuesta inmune en el hospedero vacunado.
Los equivalentes funcionales de las proteínas de la invención incluirán sustitución (es) , adición (es), inserción (es) y/o supresión (es) de aminoácidos simples o múltiples a partir de la secuencia de la proteína de tipo silvestre y sustituciones de los aminoácidos químicamente modificados, que no afectan la función o la actividad de la proteína de una manera adversa. Se pretende que este término también incluya las variantes biológicas naturales (por ejemplo las variantes alélicas o las variaciones geográficas dentro de todas las especies diferentes de las cuales son derivadas las proteínas de tipo silvestre) . Los fragmentos "activos" son aquellos que inhiben ya sea la triptasa, preferentemente la triptasa de mastocitos humanos, y/o que contienen uno o más epítopes que pueden ser utilizados en el desarrollo de vacunas contra las proteínas de la presente invención. Estas propiedades biológicas son descritas anteriormente. Preferentemente, las proteínas de este aspecto de la invención son derivadas de ectoparásitos que se alimentan de sangre, tales como mosquitos o las sanguijuelas, o de animales venenosos tales como arañas, escorpiones o serpientes. Más preferentemente, las proteínas son derivadas de las garrapatas, más preferentemente las garrapatas ixodide tal como Rhipicephalus appendiculatus .
De acuerdo a un segundo aspecto de la invención se proporciona una proteína recombinante derivada de un ectoparásito artrópodo que se alimenta de sangre, que inhibe la triptasa, un fragmento activo de la misma, o un equivalente funcional de la misma. Preferentemente, la proteína recombinante es derivada de una garrapata, más preferentemente una garrapata ixodide tal como Rhipicephalus appendiculatus . La actividad de estas moléculas en la inhibición de la actividad catalítica de la triptasa, preferentemente la triptasa de mastocitos, más preferentemente la triptasa de mastocitos humanos, está caracterizada por una Ki menor de 1 µ?, más preferentemente 100 nM, más preferentemente 20 nM, aún más preferentemente menor de 10 nM, lo más preferentemente 1 nM o menos. Los derivados de las proteínas de los aspectos anteriormente descritos de la invención son incluidos como modalidades de la invención. Tales derivados pueden incluir una proteína o polipéptido adicional fusionado en su extremo amino o carboxilo, o agregado internamente. El propósito del polipéptido adicional puede ser ayudar a la detección, expresión, separación o purificación de la proteína, o puede ser para otorgar las propiedades adicionales de la proteína, como se desee. Los ejemplos de socios de fusión potenciales incluyen ß-galactosidasa, glutation-S-transferasa, luciferasa, una etiqueta de polihistidina, un fragmento de polimerasa T7 y un péptido de señal de secreción. Las proteínas de la presente invención pueden ser preparadas utilizando técnicas conocidas de biología molecular y de química de proteínas. Los fragmentos de proteína pueden ser preparados mediante síntesis química, una técnica que es especialmente útil para la generación de péptidos cortos derivados de la secuencia proteica de longitud completa, para el uso como inmunógenos . Las proteínas de la invención pueden ser preparadas en forma recombinante mediante la expresión en una célula hospedera. Tales métodos de expresión son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y muchos son descritos con detalle por Sambrook et al., 1989, y Fernández & Hoeffler, 1998. Un tercer aspecto de la invención proporciona el uso de las proteínas, fragmentos de proteínas y equivalentes funcionales de la invención para inhibir una triptasa, tal como la triptasa de mastocitos, en mamíferos, con lo cual regula su acción y controla sus efectos patológicos. Tales moléculas pueden también ser utilizadas para inhibir la tripsina, la plasmina y, a un grado menor, la callicreína tisular. La invención también incluye el uso de las proteínas anteriormente descritas, los fragmentos proteicos y los equivalentes funcionales como agentes anti- inflamatorios . Preferentemente, estas moléculas son proporcionadas como una composición farmacéutica que incluye un portador inerte. La proteína, fragmento proteico o equivalente funcional pueden constituir el único componente activo de la composición, o pueden formar parte de un paquete terapéutico, tal como un componente de cremas para la administración tópica a las mordeduras de insectos, de serpientes o de escorpiones, o a la piel afectada por dermatitis. Ésta puede también ser utilizada como una molécula portadora para la triptasa y los compuestos relacionados a la triptasa, en cremas, aceites, polvos o tabletas, para proporcionar liberación lenta de los componentes asociados. La invención también comprende el uso de las proteínas, fragmentos de proteínas y equivalentes funcionales de la invención para la cuantificación de los niveles de triptasa, preferentemente los niveles de triptasa de mastocitos humanos, por ejemplo, en sangre, fluido de lavado nasal, tejidos o productos alimenticios. Ésta puede ser parte de un equipo que comprende una o más proteínas, fragmentos de proteína o equivalentes funcionales de la invención, junto con los medios de detección (por ejemplo triptasa radiomarcada, anticuerpos, enzimas tales como fosfatasas alcalinas, peroxidasas y luciferasas) que permiten la cuantificación precisa de la triptasa en la muestra que va a ser probada. Tales equipos pueden asemejarse a los equipos de radioinmunoensayo o de ELISA, con las proteínas de la invención que actúan como las moléculas de enlace, en vez de los anticuerpos dirigidos contra la triptasa o contra las moléculas relacionadas a la triptasa. Un aspecto de la presente invención comprende tales equipos que incorporan las moléculas de la presente invención. Las proteínas, los fragmentos de proteínas y los equivalentes funcionales de la invención pueden también ser utilizados para la detección de células que poseen triptasa, y en particular para la detección de los mastocitos. Cualquier técnica común en la materia puede ser utilizada en tal método de detección y puede comprender las técnicas inmunocitoquímicas e histológicas, en las cuales la proteína, el fragmento de proteína o equivalente funcional es utilizado en combinación con antisueros (tales como los antisueros anti-TdPI) , o en los cuales la molécula es directamente acoplada a un marcador o colorante, tal como FITC. Una proteína completa puede ser utilizada, o simplemente un fragmento de enlace activo, con el fin de detectar el sustrato. En otra modalidad más, la proteína de tipo silvestre puede ser fusionada ya sea genéticamente o sintéticamente a otra proteína tal como una fosfatasa alcalina, luciferasa o peroxidasa con el fin de facilitar su detección. Otros métodos para detectar las muestras o las células que contienen triptasa pueden involucrar técnicas de manchado o transferencia (Towbin et al., 1979), cromatografía de afinidad, de retardo de gel, o cualesquiera otros métodos adecuados que sean utilizados en la técnica. La invención también comprende el uso de las proteínas, los fragmentos de proteínas y los equivalentes funcionales de la presente invención enlazados a un soporte para retirar, purificar, aislar o extraer la triptasa, por ejemplo de los tejidos corporales, de la sangre o de los productos alimenticios. El soporte puede comprender cualquier material inerte adecuado e incluye geles, esferas magnéticas y otras esferas, microesferas , columnas de enlace y resinas. La presente invención también incluye el uso de las proteínas, los fragmentos de proteínas y los equivalentes funcionales de la invención como herramientas en el estudio de la inflamación, los procesos relacionados a la inflamación u otros procesos fisiológicos que involucran la triptasa. Estas moléculas pueden también ser utilizadas como herramientas para estudiar además las características y funciones de MCT misma. Por ejemplo, las moléculas pueden ser utilizadas para la inhibición de la triptasa o el agotamiento en los cultivos celulares o en los tejidos animales inflamados, con el fin de estudiar la importancia de la triptasa en estos sistemas.
Los parásitos metazoarios, particularmente artrópodos y .helmintos, son también fuentes de enfermedades infecciosas y otras afecciones dañinas que tienen impactos mayores en medicina humana y veterinaria. El control de los parásitos artrópodos y helmintos actualmente confia principalmente en el uso de productos químicos tales como acaricidas y antihelmínticos. Han sido realizados intentos para utilizar medios inmunológicos de control a través del uso de tecnología de vacunas. Se ha tenido cierto éxito en la identificación de ciertos antígenos protectores como candidatos de vacuna potenciales, pero únicamente unos pocos han llegado a fructificar comercialmente, principalmente para el gusano pulmonar del ganado Dictyocaulus viviparous y la garrapata del ganado Boophilus icroplus. A pesar de estos desarrollos, existe una necesidad continua para vacunas contra parásitos metazoarios y en particular para una vacuna que pueda ser utilizada a través de una amplia gama de géneros de artrópodos y/o helmintos. La presente invención también proporciona por lo tanto el uso de las proteínas, los fragmentos de proteínas y los equivalentes funcionales de la invención como inmunógenos para el uso como vacunas contra parásitos metazoarios y en particular como inmunógenos protectores en el control de enfermedades provocadas por artrópodos y otros parásitos metazoarios. Los candidatos adecuados para la vacunación incluyen animales domésticos tales como reses, cabras, ovejas, perros, gatos y otros animales que requieren protección contra parásitos metazoarios, especialmente garrapatas . La vacuna puede incluir ciertos compuestos para el uso como adyuvantes . Los adyuvantes adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen formulaciones de emulsión aceite en agua, adyuvantes de saponina, Adyuvante Completo de Freund (CFA) y Adyuvante Incompleto de Freund (IFA) , citocinas, y otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimuladores para aumentar la efectividad de la composición. De acuerdo a un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para vacunar a un mamífero contra una enfermedad o condición, que comprende administrarle a un mamífero, una proteína, fragmento de proteína o equivalente funcional de acuerdo a los aspectos anteriormente descritos de la invención cuya expresión está asociada con la enfermedad o la condición. Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para tratar a un mamífero que sufre de una enfermedad o una condición tal como asma, psoriasis, una enfermedad pulmonar intersticial, artritis reumatoide, gingivitis, periodontitis , una reacción alérgica, cáncer o cualquier otra condición mediada por la triptasa, que comprende administrarle a dicho mamífero una proteína, fragmento de proteína o equivalente funcional de acuerdo a los aspectos anteriormente descritos de la invención, en una cantidad terapéuticamente efectiva, opcionalmente en conjunto con un portador farmacéuticamente aceptable. De acuerdo a un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína, fragmento de proteína o equivalente funcional de los aspectos anteriormente descritos de la invención, en conjunto con un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier portador que por sí mismo no induzca la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los portadores adecuados son típicamente macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos , ácidos polilácticos , ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, agregados lipidíeos (tales como gotitas de aceite o liposomas) y partículas virales inactivas. Tales portadores son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. La composición puede ser utilizada como una vacuna y puede de este modo comprender opcionalmente un agente inmunoestimulador (adyuvante) por ejemplo un adyuvante como se refirió anteriormente. De acuerdo a un aspecto adicional de la invención, se proporciona un proceso para la formulación de una composición de vacuna que comprende poner una proteína, fragmento de proteína o equivalente funcional de acuerdo a los aspectos anteriormente descritos de la invención, en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable, opcionalmente con un adyuvante. De acuerdo a un aspecto adicional de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína, fragmento de proteína o equivalente funcional de los aspectos anteriormente descritos de la invención. Tales moléculas incluyen ADN de una sola hebra o de doble hebra, ADNc y AR , así como las especies de ácido nucleico sintético. Preferentemente, las secuencias de ácido nucleico comprenden ADN. Un ADNc que codifica para TdPI se describe en la presente a manera de ejemplo, y su secuencia y la secuencia de aminoácidos que codifica se muestran en la Figura 1 (los nucleótidos y los aminoácidos son dados en sus abreviaturas estándares de una sola letra) . Una molécula preferida de ácido nucleico de acuerdo a la invención comprende una secuencia nucleotídica idéntica a o complementaria a la secuencia mostrada en la Figura 1, o una secuencia que es degenerada o sustancialmente homologa con ésta, o que se híbrida con esta secuencia bajo condiciones no estrictas, por ejemplo 6 x SSC/50% de formamida a temperatura ambiente, y se lava bajo condiciones de baja exigencia, por ejemplo (2 x SSC a temperatura ambiente, o 2 x SSC, a 42°C o, más preferentemente, el enlace bajo condiciones de más alta exigencia, por ejemplo 2 x SSC, 65°C. (SSC = cloruro de sodio 0.15 M; citrato de sodio 0.015 M, pH 7.2) . Preferentemente, las secuencias de ácido nucleico muestran al menos 60% de identidad al ADNc que codifica para TdPI, o las secuencias de ADN de las cuales el producto de traducción (ya sea un tramo parcial o el producto de traducción completo) muestra al menos 60% o más de identidad con la secuencia TdPI, cuando se alinea, preferentemente utilizando el comando de mejor ajuste de GCG (penalidad por creación de espacio vacío = 2.5; penalidad por extensión de espacio vacío = 0.5) (Genetics Computer Group, 1994) . La invención también incluye los vectores de clonación y de expresión que contienen las secuencias de ADN de este aspecto de la invención. Tales vectores de expresión pueden incorporar las secuencias de control transcripcional y traduccional apropiadas, por ejemplo los elementos aumentadores , las regiones promotoras -operadoras , las secuencias de detención de la terminación, las secuencias de la estabilidad del ARJKTm, los codones de inicio y de detención o los sitios de enlace al ribosoma, enlazados intraestructuralmente con las moléculas de ácido nucleico de la invención. Adicionalmente, puede ser conveniente provocar que la protelna recotnbinante sea secretada de ciertos huéspedes. En consecuencia, los componentes adicionales de tales vectores pueden incluir las secuencias de ácido nucleico que codifican para las secuencias de secreción, señalización y procesamiento . Los vectores de acuerdo a la invención incluyen plásmidos y virus (incluyendo los virus de bacteriófago y eucariótico) , así como otros portadores de ADN lineal o circular, tales como aquellos que emplean elementos transponibles o tecnología de recombinación homóloga. Muchos de tales vectores y sistemas de expresión son bien conocidos y documentados en la técnica (Fernández & Hoeffler, 1998) . Los vectores virales particularmente adecuados incluyen vectores basados en baculovirus, en adenovirus y en virus de la vaccinia. Los hospederos adecuados para la expresión recotnbinante incluyen las especies procarióticas comúnmente utilizadas, tales como E. coli, o levaduras eucarióticas que pueden ser elaboradas para expresar altos niveles de proteínas recombinantes y que pueden ser desarrolladas fácilmente en grandes cantidades. Las líneas celulares de mamífero desarrolladas in vitro son también adecuadas, particularmente cuando se utilizan sistemas de expresión impulsados por virus. Otro sistema de expresión adecuado es el sistema de expresión de baculovirus que involucra el uso de células de insecto como hospederos. Un sistema de expresión puede también constituir las células hospederas que tienen el ADN de codificación incorporado en su genoma. Las proteínas, o fragmentos proteicos pueden también ser expresados in vivo, por ejemplo en larvas de insecto o en tejidos de mamífero. Una variedad de técnicas son conocidas y pueden ser utilizadas para introducir los vectores de acuerdo a la presente invención en las células procarióticas o eucarióticas . Las técnicas adecuadas de transformación y transfección son bien descritas en la literatura (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1991; Goldman & Leinwald, 1998). En células eucarióticas, los sistemas de expresión pueden ser transitorios (por ejemplo episomales) o bien permanentes (integración cromosómica) de acuerdo a las necesidades del sistema . Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo a la presente invención pueden también ser utilizadas para crear animales transgénicos, particularmente animales roedores. Esto puede ser realizado localmente mediante modificación de las células somáticas, o mediante terapia de línea germinal para incorporar modificaciones heredables.
La invención también incluye las células hospederas procarióticas o eucarióticas, transformadas o transíectadas, o los organismos transgénicos que contienen una molécula de ácido nucleico como se define anteriormente. Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para preparar una proteína, fragmento de proteína o equivalente funcional de la invención, como se define anteriormente, que comprende el cultivo de una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la invención bajo condiciones mediante las cuales dicha proteína es expresada y se recupera la proteína producida de este modo . Diversos aspectos y modalidades de la presente invención serán ahora descritos con más detalle a manera de ejemplo, con referencia particular a una proteína aislada de la garrapata Rhipicephalus appendiculatus. Se apreciará que la modificación del detalle puede ser realizada sin apartarse del alcance de la invención.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra la secuencia de ADNc y la secuencia inferida de aminoácidos del clon 76-3 que codifica para TdPI .
La Figura 2 muestra un gel de SDS-poliacrilamida al 15% que muestra rTdPl, purificado por medio de la cromatografía de afinidad de metal e intercambio catiónico. La Figura 3 muestra un alineamiento de TdPI con los dominios de Kunitz del inhibidor de tripsina de calostro bovino (BovCol; Cechova, 1976), aprotinina (bovina) (Creighton & Charles, 1987) , y el inhibidor de la vía del factor tisular de rata (TFPI-2; únicamente se muestra el segundo dominio inhibidor del factor Xa; Enjyoji et al., 1992) . La Figura 4 muestra un diagrama que ilustra la actividad inhibitoria relativamente débil de rTdPI sobre la calicreína tisular. La Figura 5 muestra las actividades de la plasmina (izquierda) y tripsina (derecha) en presencia de cantidades cada vez mayores de rTdPI como se determina mediante la medición de la liberación del péptido a partir de la caseína marcada con resorufina. La Figura 6 muestra la inhibición de la triptasa humana recombinante (Promega) con TdPI. La Figura 7 muestra un gel de agarosa al 1.5% que muestra los productos de RT-PCR obtenidos con los extractos del cuerpo completo provenientes de larvas (L) y ninfas (N) , y con extractos de glándulas salivales de hembras y machos adultos de R. appendiculatus.
EJEMPLOS Garrapatas
Las garrapatas fueron criadas de acuerdo a Jones et al., 1988. Las tres etapas de desarrollo de R. appendiculatus fueron alimentadas sobre cobayos Dunkin Hartley. Cuando no se alimentaban, todas las garrapatas fueron mantenidas de 21 a 26°C y con humedad relativa del 85%.
ADNc
El clon 76, que contiene el ADNc TdPI , fue uno de los varios clones aleatoriamente recogidos de una genoteca de expresión de glándula salival de R. appendiculatus en Lambda Zap II (Stratagene) , que fue construido con el ARNm proveniente de las garrapatas que habían estado alimentándose sobre los cobayos Dunkin Hartley por 2 días (Paesen & Nuttall, 1996) . El fagémido fue extirpado in vivo y utilizado para generar el plásmido pBluescript SK(-) de doble hebra en células XLl-Blue (Short et al., 1988). El plásmido fue purificado a partir de cultivos de toda la noche (Goode & Feinstein, 1992) y desnaturalizado con álcali (Mierendorf & Pfeffer, 1987) antes del secuenciamiento de acuerdo a Sanger y Coulson, 1975. Las secuencias completas de la hebra más y menos del inserto 76-3 fueron también determinadas. El cebador delantero (SI->) (correspondiente con los nucleótidos 209 a 224) ; cebador inverso (<-S2) (recociendo a los nucleótidos 255 a 271) y los cebadores específicos de plásmido T3 (T3- ) y T7 (<-T7) (las secuencias del cebador específico del inserto, o sus sitios de recocido, están subrayadas) se muestran en la Figura 1. Pl-> y P2<- denotan los sitios cebadores utilizados en el experimento de RT-PCR. La secuencia obtenida mediante el secuenciamiento N-terminal de la proteína rTdPI está en negritas en la Figura 1. La onda denota una secuencia de consenso de enlace a la heparina. La línea doble indica un sitio de glucosilación putativo. La señal de poliadenilación y la cola poli-A son mostradas en letra tipo negrita. La leucina indicada por el asterisco es una metionina en los clones 76, 76-1 y 76-2. Los datos secuenciales fueron analizados utilizando el programa de análisis de secuencia GCG [Genetics-Computer-Group, 1994 #14] . Las búsquedas en las bases de datos de proteínas fueron realizadas en el Centro Nacional para la Información de Biotecnología (National Centre for Biotechnology Information (NCBI) ) utilizando el servicio de la red BLAST (Altschul et al., 1990).
Una vez que el clon 76 fue secuenciado, la genoteca fue reseleccionada para los clones adicionales mediante hibridación de ADN de los crecimientos en placa (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989) . La sonda utilizada fue construida mediante marcación aleatoria con cebador del ADNc original (extirpado del plásmido purificado utilizando EcoRI y Eco0109I) con digoxigenina (Boehringer Mannheim) . Se aislaron y secuenciaron tres clones positivos.
Expresión de proteína recombinante
La TdPI recombinante (rTdPI) fue expresada como una proteína marcada con histidina en células de ovario de Spodoptera. frugiperda (Sf21; Invitrogen) . La región de codificación del ADNc de TdPI fue amplificada mediante la reacción en cadena con polimerasa (PCR) , utilizando el cebador delantero. 5' -GCAGGAGCTCGGCACGAG y el cebador inverso 5 ' -TATGGATCCCAGGTCCAGGCTCTGTTCCG, con lo cual se agrega un sitio Sac I con dirección hacia arriba (5') del codón de inicio, y reemplazando el codón de inicio con un sitio BamHI . La PCR consistió de 20 ciclos con un paso de fusión de 30 segundos (95°C) , un paso de recocido con cebador de 30 segundos (50 °C) y un paso de extensión de 30 segundos (72 °C) . El producto de PCR fue ligado entre los sitios SacI y BamHI del vector de transferencia pAC129.1 (Linvingstone & Jones, 1989) , que fue modificado de modo que se agregó un marcador de Gly-Ile- (His) 6 carboxilo-terminal a la proteína expresada. La co-transfección de las células Sf21 con el vector de transferencia y el baculovirus (BacPak6) y la amplificación de virus recombinante fue como se describe por Kitts y Possee, 1993. rTdPI fue expresado en el medio TC100 (Gibco BRL) que contenía 10% de suero fetal bovino (Sigma) .
Purificación de proteína recoinbinante
Sesenta horas después de la infección de las células Sf21, el medio de cultivo fue recolectado y la rTdPI fue precipitada mediante la adición de sulfato de amonio (30 g por 100 mi de medio) . El concentrado fue redisuelto nuevamente en amortiguador de fosfato de sodio 50 mM (pH 8) que contenía cloruro de sodio 300 mM y 10% de glicerol. RTdPI fue purificada utilizando una columna de agarosa Ni-NTA (Qiagen, principalmente de acuerdo a Janknecht et al., 1991. Se utilizó amortiguador de fosfato de sodio 50 mM (pH 6.5) que contenía cloruro de sodio 300 mM y 10% de glicerol para lavar la columna. La proteína marcada con histidina fue eluida utilizando imidazol 200 mM en fosfato diácido de sodio 75 mM. La purificación adicional fue obtenida mediante cromatografía de baja presión utilizando el sistema BioLogic (Bio-Rad) con una columna de intercambio catiónico HiTrap SP (Pharmacia Biotech) . El amortiguador de corrida fue Hepes 50 mM, pH 8, con un gradiente lineal de cloruro de sodio de 0 a 250 mM en 1 hora; la velocidad de flujo fue de 1 ml/minuto. Se utilizaron concentradores centricon 3 (Amicon) para la concentración de los eluidos y para el intercambio del amortiguador. La proteína purificada fue almacenada a -20°C en PBS hasta el uso. La concentración de la proteína fue medida utilizando el Ensayo de Proteína Bio-Rad y el Ensayo de Proteína Micro BCA (Pierce) .
Electroforesis de proteína
La electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) fue de acuerdo a Laemmli, 1970. La Figura 2 muestra un gel de poliacrilamida-SDS al 15% que muestra la rTdPI, purificada por medio de cromatografía de afinidad de metal e intercambio catiónico. La proteína en la banda A había sido tratada con la PNGasa F (la proteína de aproximadamente 35 kDa sobre el gel) antes de la electroforesis . La banda B contiene la rTdPI no tratada. Las masas moleculares se dan en kDa. La banda C contiene la rTdPI no reducida (sin agente reductor en el amortiguador de carga) . El más alto peso molecular al cual la rTdPI no reducida corre, podría normalmente sugerir la dimerización a través de puentes disulfuro intermoleculares, pero la espectroscopia de masa coloca la masa molecular en aproximadamente 13,500 Da, contradiciendo la formación de los dímeros . La glucosilación ligada a la asparagina fue estudiada mediante el tratamiento de rTdPI con N-glucosidasa F (PNGasa; New England BioLabs) , seguido por SDS-PAGE. La PNGasa F hidroliza todos los tipos comunes de cadenas de Asn-glucano provenientes de las glucoproteínas (Maley et al . , 1989) . La Figura 3 muestra un alineamiento de TdPI con los dominios de Kunitz del inhibidor de tripsina de calostro bovino (BovCol; Cechova, 1976), aprotinina (bovina) (Creighton & Charles, 1987) , y el inhibidor de la vía del factor tisular de rata (TFPI-2; únicamente el segundo dominio inhibidor del factor Xa es mostrado; Enjyoji et al., 1992). Los dominios de Kunitz del péptido TAP anticoagulante de rata ( axman et al., 1990) y los dominios de la ornitodorina (ornithl y ornith.2; Van de Locht et al., 1996) son también incluidos. El alineamiento de TdPI con los dominios de Kunitz de vertebrados fue creado utilizando los comandos "pileup" y "prettyplot" de GCG, eligiendo los pesos de espacio vacío relativamente bajo y de longitud (1 y 0.03, respectivamente) . El alineamiento fue luego modificado, principalmente mediante la introducción de espacios vacíos extra, de modo que los dominios TAM y de ornitodorina pudieron ser incluidos. La modificación estuvo basada en gran medida en el alineamiento de los últimos dominios con aprotinina, como es reportado por Van de Locht et al., 1996. La flecha indica el residuo Pl del rizo de enlace a la aprotinina. El asterisco denota las cisteínas involucradas en la formación del puente disulfuro en los dominios de Kunitz tradicionales.
Secuenciamiento N- terminal
La secuencia amino-terminal de rTdPI fue determinada en la Unidad de Inmunoquímica MRC del Departamento de Bioquímica de la Universidad de Oxford, de acuerdo a Matsudaira, 1987. Las muestras electotransferidas fueron corridas sobre un secuenciador de proteínas Applied Biosystems 494A "Procise" (Perkin-Elmer) utilizando un cartucho Applied Biosystems "Mini-Blott" .
Espectrometría de Masa
La ESI-MS fue realizada sobre un espectrómetro de masa a presión atmosférica, triple cuadrupolar VG BioQ equipado con una interfaz de electrorrocío operando en el modo de iones positivos. El instrumento fue calibrado con mioglobina de corazón de caballo (7 pmol/µ?; masa molecular promedio 16,951.48 Da).
Ensayos de inhibición de proteasa
La elastasa (tipo I, proveniente de páncreas porcino) , a-quimiotripsina, tripsina, trombina, plasmina, calicreína tisular, calicreína plasmática, urocinasa, aprotinina, n-succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida, Gly-Arg-p-nitroanilida, ?-a-benzoil -DL-Arg-p-nitroanilida y n-benzoil-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilida fueron adquiridas de Sigma. El factor Xa y la triptasa humana recombinante fueron de Promega y la caseína marcada con resorufina, el inhibidor de tripsina de soya, Chromozym TH y Chromozym X fueron obtenidos de Boehringer Mannheim. La actividad de triptasa fue medida en microplacas de 96 pozos, utilizando la n-a-benzoil-DL-Arg-p-nitroanilida como sustrato cromogenico y HEPES 50 mM pH 7.6, que contenía cloruro de sodio 120 mM, como amortiguador de reacción. 50 µ? de amortigudor que contenía 1 µ? de reserva de triptasa (200 g/ml) se combinó con 50 µ? de solución inhibidora (varias concentraciones) . Después de un periodo de incubación de 45 minutos a 37°C, se agregaron 50 µ? de 5 solución de sustrato 3 mM y se midió el incremento en la absorbancia a 405 nm utilizando un lector de placas Titertek Multiskan Plus MKII (ICN) . Otras proteasas fueron preincubadas con diversas cantidades de inhibidor de proteasa en un volumen total de
:.0 100 µ? de amortiguador de proteasa (20 minutos; 37°C) . La actividad de proteasa residual fue determinada mediante la adición de los sustratos apropiados (en 900 µ? de amortiguador de proteasa) y midiendo el grado de digestión. Se midieron las actividades de tripsina, de a-quimotripsina,
15 y elastasa en el amortiguador A de proteasa (Tris-HCl 0.1 M, 10% de glicerol, cloruro de calcio 10 mM, pH 8); las actividades de plasmina, urocinasa, calicreína, oc-trombina y factor Xa fueron determinadas en el amortiguador B de proteasa (Tris-HCl 50 mM, albúmina sérica bovina 0.1 mg/ml,
2:0 cloruro de sodio 150 mM, cloruro de calcio 1 mM, pH 8) , como se describe por Nakamura et al., 1987. La caseína marcada con resorufina fue utilizada como un sustrato para la tripsina, la a-quimotripsina y plasmina, y se midió la cantidad de péptido liberado para determinar la actividad de 5 proteasa (Twining, 1984) . Se utilizaron sustratos de p-nitroanilida (pNA) para las actividades de la elastasa, calicreína, urocinasa, a-trombina y factor Xa (n-succinil-Ala-Ala-Ala-pNA, n-benzoil-Pro-Phe-Arg-pNA, Gly-Arg-pNA, Chromozym TH, y Chromozym X, respectivamente) ; la actividad de proteasa fue medida mediante la determinación del incremento en la absorbancia a 410 nm. La Figura 4 muestra un diagrama que ilustra la actividad inhibitoria relativamente débil de rTdPI sobre la calicreína tisular. La absorbancia a 410 nm es mostrada a diferentes puntos de tiempo después de la adición de 30 g de sustrato (n-benzoil-Pro-Phe-Arg-pNA) a las muestras de calicreína/antiproteasa. Se utilizaron 0.5 µg/ml de calicreína tisular por muestra (volumen final de 1 mi) . La línea continua (?—?) denota la actividad de calicreína en ausencia del inhibidor de proteasa. La aprotinina utilizada a una concentración de 0.75 µ? inhibe completamente la actividad de la calicreína (· ·) . Una concentración diez veces más alta de rTdPI [7.5 µ? (O O)] inhibe escasamente
50% de la actividad de la calicreína. Otras concentraciones de rTdPI utilizadas en el experimento fueron 3.75 µ? (? ?) y 0.75 µ? (? ?) . La Figura 5 muestra las actividades de la plasmina (izquierda) y la tripsina (derecha) en presencia de cantidades cada vez mayores de rTdPI como se determinó mediante la medición de liberación del péptido a partir de la caseína marcada con resorufina. La liberación del péptido en ausencia del inhibidor fue ajustada para ser del 100%, la hidrólisis en ausencia de proteasa corresponde con 0% de actividad. Los valores para rTdPI son denotados por los círculos. Para calcular la concentración micromolar de los monómeros de rTdPI a partir de los datos en mg/ml obtenidos con el ensayo de proteína, se utilizaron la masa molecular calculada de 12 kDa (O O) ; asumiendo ausencia de enlace del azul de Coomasie a la fracción carbohidrato de la glucoproteína) y la masa molecular (promedio) como se determinó por espectrometría de masa (13.5 kDa; O—O). Las concentraciones correspondientes con una inhibición de plasmina de 50% son 0.097 µ? para aprotinina (?—?) , 0.23 µ? para el inhibidor de tripsina de soya (¦—¦) , 0.32 µ? (O—O) y 0.43 µ? (O O) para los monómeros de rTdPI . Los valores para la inhibición de tripsina del 50% son 0.024 µ? (?—?) ,
0.026 µ? (¦—¦) , 0.033 µ? (O—O) y 0.044 µ (O O). La Figura 6 muestra la inhibición de la triptasa humana recombinante (Promega) con TdPI . La preincubación de la triptasa humana recombinante con cantidades cada vez mayores de TdPI reduce rápidamente la actividad catalítica a aproximadamente 33% de la actividad en ausencia del inhibidor (V0: la velocidad de conversión del sustrato medida sin la triptasa presente; Vi: la velocidad con el inhibidor agregado) .
Reacción en cadena con polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR)
Las glándulas salivales fueron extirpadas de las garrapatas adultas no alimentadas, y de garrapatas adultas que habían sido alimentadas sobre cobayos por 2, 4 y 6 días. Cada muestra tisular consistió de 15 pares de glándulas. El ARN total fue aislado de estas glándulas utilizando el equipo de extracción RMAce Total Puré (Bioline Ltd) y 1/30 de la cantidad obtenida (el equivalente de una glándula) se utilizó como una plantilla para RT-PCR (35 ciclos) , utilizando el sistema de RT-PCR de un tubo, Titán (Boehringer Mannheim) . La RT-PCR fue también llevada a cabo sobre el ARN combinado proveniente de intestino, gónadas, glándulas sexuales accesorias y túbulos malpigianos, tomados de garrapatas adultas alimentadas por 2 días. Los homogeneizados del cuerpo completo de larvas alimentadas por 3 días y ninfas alimentadas por 3 días, fueron sometidos al mismo procedimiento; la cantidad de ARN utilizado por reacción de PCR correspondió con el extracto de 1 ninfa o 2 larvas. Las secuencias cebadoras (Pl y P2) están subrayadas en la Figura 1. Para verificar si los productos RT-PCR fueron específicamente derivados o no del ARNm de TdPI, sus tamaños fueron comparados al tamaño de un marcador que fue obtenido mediante amplificación por PCR del ADN plasmídico original, utilizando los mismos cebadores. La Figura 7 muestra un gel de agarosa al 1.5% que muestra los productos de RT-PCR obtenidos con los extractos de cuerpo entero de las larvas (L) y las ninfas (N) , y con extractos de glándula salival de machos y hembras adultas de R. appendiculatus. Los números corresponden con los diferentes puntos de tiempo de la etapa de alimentación de adulto; 0 denota las muestras tomadas de las garrapatas no alimentadas; 2, 4 y 6 indican las garrapatas alimentadas por 2, 4 y 6 días, respectivamente. La banda M muestra el marcador del peso molecular del producto de PCR obtenido con el mismo grupo de cebadores (Figura 1) , pero utilizando el ADNc de TdPl como una plantilla, en vez del ARN.
Referencias
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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (33)
1. Una proteína recombinante, caracterizada porque muestra homología secuencial significativa con la secuencia de la proteína inhibidora de proteasa derivada de garrapata (TdPI) dada en la Figura 1, un fragmento activo de dicha proteína o un equivalente funcional de la misma.
2. Una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque funciona como un inhibidor de la triptasa, preferentemente de la triptasa de mastocitos humanos.
3. Una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque contiene uno o más epítopes que pueden ser utilizados en el desarrollo de vacunas que se dirigen a las proteínas que muestran homología secuencial significativa con TdPI .
4. Una proteína recombinante, o fragmento de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la homología secuencial es definida como 50% o más de los aminoácidos en la secuencia que está completamente conservada como residuos idénticos si la proteína está alineada con la secuencia de la Figura 1, los alineamientos son obtenidos utilizando el comando del mejor ajuste de GCG (penalidad por creación de espacio vacío = 2.5; penalidad por extensión de espacio vacío = 0.5) .
5. Una proteína recombinante, o fragmento de proteína de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la homología secuencial es 60% o más.
6. Una proteína recombinante, o fragmento de proteína de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la homología secuencial es 75% o más.
7. Una proteína recombinante, o fragmento de proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque comprende la secuencia TdPI .
8. Una proteína recombinante, caracterizada porque es derivada de un ectoparásito artrópodo que se alimenta de sangre, que inhibe la triptasa, o un fragmento activo de dicha proteína o un equivalente funcional de dicha proteína .
9. Una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque funciona como un inhibidor de la triptasa, preferentemente de la triptasa de mastocitos humanos .
10. Una proteína recombinante , fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, caracterizada porque contiene uno o más epítopes que pueden ser utilizados en el desarrollo de vacunas que se dirigen a las proteínas que muestran homología secuencial significativa con TdPI.
11. Una proteína recombinante, o fragmento de proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque inhibe la triptasa con una Ki menor de 1 x 10"6 M, preferentemente menor de 1 x 10"7 M, más preferentemente menor de 2 x 10"8 , lo más preferentemente menor de 1 x 10~9 .
12. Una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizada porque inhibe la actividad de la triptasa catalítica.
13. Una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada porque inhibe la triptasa de mastocitos, preferentemente la triptasa de mastocitos humanos.
14. Una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque se deriva de una garrapata.
15. Una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque se deriva de la garrapata Rhipicephalus appendiculatus.
16. Una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque ha sido genética o químicamente fusionada a uno o más péptidos o polipéptidos .
17. Una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque está enlazada a un soporte, tal como una resina.
18. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en conjunto con un portador farmacéuticamente aceptable.
19. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, opcionalmente en conjunto con un adyuvante.
20. Un proceso para la formulación de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende el poner una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable.
21. Una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para el uso como un producto farmacéutico.
22. Un método para la prevención o tratamiento de una enfermedad en un sujeto, caracterizado porque comprende la administración al sujeto de una dosis efectiva de una composición de conformidad con la reivindicación 18 o la reivindicación 19.
23. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque codifica para una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16.
24. Una molécula de ácido nucleico, que tiene la secuencia dada en la Figura 1; caracterizada porque se híbrida con dicha secuencia nucleotídica bajo condiciones de hibridación estrictas, o que codifica para la expresión de una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16.
25. Un vector, caracterizado porque comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 23 o la reivindicación 24.
26. El vector de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque está basado en un virus.
27. Una célula huésped, caracterizada porque es transformada o transfectada con el vector de conformidad con la reivindicación 25 o la reivindicación 26.
28. Un animal transgénico, caracterizado porque ha sido transformado por una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 23 o la reivindicación 24.
29. Un método para la preparación de una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque comprende la expresión de un vector de conformidad con la reivindicación 25 o la reivindicación 26 en una célula huésped, y el cultivo de dicha célula huésped bajo condiciones donde la proteína recombinante, el fragmento de proteína o el equivalente funcional es expresado, y recuperando la proteína recombinante, fragmento de proteína o el equivalente funcional producido de este modo.
30. El uso de una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para la detección o cuantificación de la triptasa, para la eliminación o remoción de la triptasa de un producto alimenticio o de un cultivo de células como un agente anti-triptasa, o como un fármaco anti-inflamatorio.
31. El uso de una proteina recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de inflamación en humanos o animales.
32. Un método de vacunación de un mamífero contra una enfermedad, o de tratamiento de un mamífero que sufre de una enfermedad, caracterizado el método porque comprende la administración de una proteína recombinante, fragmento de proteína o equivalente funcional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, a dicho mamífero.
33. El uso de una proteína o fragmento de proteína seleccionado del grupo que consiste de inhibidor de la tripsina de calostro bovino, el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI-2), el dominio de Kunitz del péptido TAP anticoagulante de garrapata y los dos dominios en la ornitodorina como un inhibidor de triptasa.
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