ES2272301T3 - Inhibidor de triptasa. - Google Patents

Abstract

Una proteína recombinante que: i) muestra una homología de secuencia significativa con la secuencia de la proteína inhibidora de la proteasa derivada de garrapatas (TdPI) facilitada en la figura 1; o ii) es un fragmento activo de la secuencia de TdPI facilitada en la figura 1, en la que dicha homología de secuencia se define como que el 50% o más de los aminoácidos en la secuencia se conservan completamente como residuos idénticos a lo largo de toda la longitud de la proteína si se alinea la proteína con la secuencia de la figura 1, y en la que la proteína recombinante o fragmento activo inhibe la triptasa o tiene uno o más epítopos que pueden usarse para el desarrollo de vacunas que seleccionan como diana la secuencia de TdPI facilitada en la figura 1.

Description

Inhibidor de triptasa.

La presente invención se refiere a proteínas novedosas que se han identificado en garrapatas. Estas proteínas pueden usarse como componentes de vacunas, como inhibidores de la triptasa mastocitaria (denominada en lo sucesivo en el presente documento MCT), en la detección de mastocitos y en el aislamiento y purificación de MCT. La invención también se refiere al control de enfermedades y lesiones provocadas por parásitos en animales y seres humanos y al uso de las proteínas de la invención en el tratamiento de enfermedades y alergias.

La MCT humana es una endoproteasa que se almacena en los gránulos secretores de los mastocitos y, con la activación, se libera de los mastocitos como un tetrámero que se estabiliza por la heparina. La eliminación de heparina conduce a la disociación del complejo triptasa en monómeros enzimáticamente inactivos (Schwartz, 1994).

La triptasa es el principal componente mediador de proteína de los gránulos de mastocitos humanos, representando más del 20% de las proteínas celulares totales (Schwartz, 1994). MCT es un marcador específico de mastocitos, permitiendo su diferenciación de los basófilos.

Los mastocitos se encuentran en muchos tejidos pero están presentes en mayor número a lo largo de los revestimientos epiteliales del organismo, tales como la piel, vías respiratorias y tracto gastrointestinal. Los mastocitos se localizan a menudo en las proximidades de los vasos sanguíneos pequeños. Están implicados en una diversidad de estados fisiológicos y patofisiológicos, incluyendo inflamación aguda, hipersensibilidad inmediata, hipersensibilidad de tipo retrasado, regulación del crecimiento celular, defensa frente a la neoplasia y la sensación de dolor y picor (Liang et al, 1998). Los mastocitos también están implicados en estados inflamatorios crónicos y están implicados en interacciones neuroinmunitarias (Leon et al., 1994).

La triptasa mastocitaria es un mediador importante de la respuesta inflamatoria. Los experimentos (principalmente realizados in vitro) sugieren que desempeña papeles importantes en enfermedades tales como asma, psoriasis, enfermedad pulmonar intersticial, artritis reumatoide, gingivitis y periodontitis. La triptasa mastocitaria también se ha implicado en la tumorigénesis y la angiogénesis, debido a su potencial para activar la pro-urocinasa y la pro-estromelisina de metaloproteinasa de matriz. También se ha descrito que enzimas similares a triptasa participan en la activación e internalización de virus patógenos, tales como virus influenza, virus Sendai y virus de la inmunodeficiencia humana (Pohlig et al., 1996).

La triptasa humana se inhibe por la tripstatina (Katunuma et al., 1990, Adv. Enz Reg., 30: 377). La triptasa humana se inhibe mediante sustancias de poco peso molecular (por ejemplo, leupeptina y fluorofosfato de diisopropilo). Los cationes divalentes, tales como calcio, y benzamidina y sus derivados son inhibidores competitivos de la triptasa mastocitaria humana (Schwartz, 1994). Sin embargo, la triptasa humana, al contrario que la mayoría de otras serina esterasas, no se inhibe por los inhibidores clásicos de serina proteasas, tales como inhibidor de tripsina de la soja y aprotinina. Aún no se han notificado inhibidores endógenos que seleccionan como diana los sitios catalíticos de la triptasa mastocitaria. La actividad de la triptasa humana se inhibe por la lactoferrina y mieloperoxidasa (ambas derivadas de neutrófilos) y por antitrombina-III, todas las cuales son antagonistas de glucosaminoglucanos (sulfato de condroitina o heparina) que estabilizan el tetrámero de MCT (Alter et al., 1990; Cregar et al., 1999; Elrod et al., 1997). También se ha identificado el inhibidor de la proteasa de leucocito secretor (SLPI) como inhibidor de la triptasa (documento WO 96/08275).

Se ha descrito anteriormente un inhibidor derivado de la sanguijuela de la triptasa humana (LDTI). Se ha encontrado que una forma recombinante de esta proteína de tipo Kazal inhibe eficazmente 2 de los 4 sitios catalíticos de la triptasa tetramérica (Stubbs et al., 1997; Auerswald et al., 1994; Mülhahn et al., 1994; Sommerhoff et al., 1994, documento WO 95/03333).

Debido a la importancia conocida de MCT en la enfermedad de mamíferos y en la respuesta alérgica, hay una clara necesidad de inhibidores sumamente específicos y eficaces de esta proteína. Ahora se ha descubierto una proteína novedosa en una especie de garrapatas que puede inhibir la actividad de la triptasa mastocitaria humana.

Sumario de la invención

Según un primer aspecto de la presente invención se proporciona una proteína recombinante que muestra una homología de secuencia significativa con la secuencia de la proteína inhibidora de proteasa derivada de garrapatas (TdPI) facilitada en la figura 1, un fragmento activo de dicha proteína o un equivalente funcional de dicha proteína.

Tal como se usa en el presente documento, el término "homología de secuencia significativa" se pretende que incluya todas las proteínas que comparten una función común con TdPI y que muestran una homología de secuencia común u homología entre motivos que están presentes en las secuencias de polipéptidos. Homología global "significativa" se refiere al 50% o más de los aminoácidos en la secuencia que se conservan completamente como residuos idénticos si se alinea la proteína homóloga con la secuencia de TdPI. Preferiblemente, las alineaciones se obtienen usando el comando de mejor ajuste de GCG (penalización de creación de hueco = 2,5; penalización de extensión de hueco = 0,5) (Genetics-Computer-Group, 1994).

Preferiblemente, el grado de homología es de al menos el 60% a lo largo de toda la longitud de la proteína. Más preferiblemente, el grado de homología es de al menos el 70%, incluso más preferiblemente del 75%, lo más preferiblemente del 80% o más.

Se incluye en este aspecto de la invención una proteína que comprende la secuencia identificada en el presente documento como proteína inhibidora de proteasa derivada de garrapatas (TdPI), un fragmento activo de la misma o un equivalente funcional de la misma. Esta secuencia se facilita en la figura 1 adjunta. Esta proteína se identificó como codificada por un ADNc a partir de una biblioteca de glándulas salivares de garrapatas. La proteína tiene un peso molecular de aproximadamente 13,5 kDa y parece pertenecer a la familia de los inhibidores de proteasa de tipo Kunitz. La similitud de secuencia con otros miembros de esta familia tales como inhibidor de inter-alfa-tripsina y aprotinina es baja, pero el centro reactivo supuesto y la posición de las cisteínas se conserva en algún
grado.

El término "equivalente funcional" se usa en el presente documento para describir proteínas que tienen una función análoga a la de la proteína TdPI, o bien en inhibir la triptasa o bien en tener uno o más epítopos que pueden usarse en el desarrollo de vacunas que seleccionan como diana proteínas que muestran una homología de secuencia significativa con TdPI. El término "equivalente funcional" también se refiere a moléculas que son estructuralmente similares a la proteína TdPI identificada en el presente documento o que contienen estructura terciaria idéntica o similar. Este término también incluye fragmentos de proteína que conservan la capacidad para inhibir la triptasa, preferiblemente la triptasa mastocitaria humana.

La función análoga en inhibir la triptasa se dirige preferiblemente frente a la actividad catalítica de la triptasa, preferiblemente la triptasa mastocitaria, más preferiblemente la triptasa mastocitaria humana, se caracteriza por una Ki inferior a 1 \muM, más preferiblemente de 100 nM, aún más preferiblemente de 20 nM, aún más preferiblemente inferior a 10 nM, lo más preferiblemente inferior a 1 nM, tal como se evalúa usando cualquier ensayo de inhibición de la triptasa habitual, tal como se describe en el presente documento (véase la sección titulada "ensayos de inhibición de la proteasa" en los ejemplos a continuación).

Alternativamente, o además de tener actividad inhibidora frente a la triptasa, "equivalente funcional" se utiliza en el presente documento para describir proteínas que contienen epítopos que pueden usarse en el desarrollo de vacunas frente a las proteínas de la invención. Tales equivalentes funcionales, y también fragmentos que contienen epítopos adecuados, pueden usarse para desarrollar vacunas dirigidas frente a parásitos que se alimentan de sangre, que seleccionan como diana miembros de la familia de la proteína TdPI. Los equivalentes funcionales pueden hacerse, por supuesto, más o menos inmunogénicos que la proteína o fragmento de proteína de tipo natural correspondiente con el fin de adecuarse a una aplicación deseada. Por "tipo natural" se quiere decir el genotipo que se produce en la naturaleza que es característico de la mayoría de los miembros de una especie. Si las proteínas van a usarse en un régimen de vacunación para inducir resistencia a un huésped frente a proteínas de parásitos, entonces las moléculas pueden modificarse de modo que se mejore su inmunogenicidad. Por tanto, será más probable que provoquen una respuesta inmunitaria en el huésped vacunado.

Los equivalentes funcionales de las proteínas de la invención incluirán sustitución(ones), adición(ones), inser-
ción(ones) y/o deleción(ones) de aminoácidos únicas o múltiples de la secuencia de proteína de tipo natural y sustituciones de aminoácidos químicamente modificados que no afectan a la función o actividad de la proteína de una manera adversa. Este término también se pretende que incluya variantes biológicas naturales (por ejemplo, variantes alélicas o variaciones geográficas dentro de las diferentes especies de las que se derivan las proteínas de tipo
natural).

Fragmentos "activos" son aquellos que inhiben cualquier triptasa, preferiblemente la triptasa mastocitaria humana, y/o contienen uno o más epítopos que pueden usarse en el desarrollo de vacunas frente a las proteínas de la presente invención. Estas propiedades biológicas se describieron anteriormente.

Preferiblemente, las proteínas de este aspecto de la invención se derivan de ectoparásitos que se alimentan de sangre, tales como mosquitos o sanguijuelas, o de animales venenosos tales como arañas, escorpiones o serpientes. Más preferiblemente, las proteínas se derivan de garrapatas, lo más preferiblemente de garrapatas ixódidas tales como Rhipicephalus appendiculatus.

Los derivados de las proteínas de los aspectos descritos anteriormente de la invención se incluyen como realizaciones de la invención. Tales derivados pueden incluir una proteína adicional o polipéptido condensado en su extremo amino o carboxi-terminal o añadido internamente. El fin del polipéptido adicional puede ser ayudar a la detección, expresión, separación o purificación de la proteína o puede ser prestar a la proteína propiedades adicionales según se desee. Ejemplos de componentes de fusión potenciales incluyen \beta-galactosidasa, glutatión-S-transferasa, luciferasa, un marcador de polihistidina, un fragmento de T7 polimerasa y un péptido señal de secreción.

Las proteínas de la presente invención pueden prepararse utilizando técnicas conocidas de biología molecular y química de proteínas. Pueden prepararse fragmentos de proteínas mediante síntesis química, una técnica que es especialmente útil para la generación de péptidos cortos derivados de la secuencia de proteínas de longitud completa, para su uso como inmunógenos.

Las proteínas de la invención pueden prepararse en forma recombinante mediante la expresión en una célula huésped. Tales métodos de expresión se conocen bien por los expertos en la técnica y muchos se describen en detalle por Sambrook et al., 1989, y Fernández y Hoeffler, 1998.

Un aspecto adicional de la invención proporciona el uso de las proteínas, fragmentos de proteínas y equivalentes funcionales de la invención para inhibir una triptasa, tal como triptasa mastocitaria, en mamíferos, para regular así su acción y controlar sus efectos patológicos. Tales moléculas también pueden usarse para inhibir la tripsina, plasmina y, en menor grado, la calicreína tisular.

La invención también incluye el uso de las proteínas descritas anteriormente, fragmentos de proteínas y equivalentes funcionales como agentes antiinflamatorios. Preferiblemente, estas moléculas se proporcionan como una composición farmacéutica que incluye un vehículo inerte. La proteína, fragmento de proteína o equivalente funcional puede constituir el único principio activo de la composición o puede formar parte de un paquete terapéutico, tal como un componente de cremas para administración tópica para picaduras de insecto, serpiente o escorpión, o para pieles afectadas por dermatitis. También puede usarse como molécula de vehículo para triptasa y compuestos relacionados con triptasa, en cremas, aceites, polvos o píldoras, para proporcionar liberación lenta de los componentes unidos.

La invención también comprende el uso de proteínas, fragmentos de proteínas y equivalentes funcionales de la invención para la cuantificación de los niveles de triptasa, preferiblemente niveles de triptasa mastocitaria humana, por ejemplo, en la sangre, líquido de lavado nasal, tejidos o productos alimenticios. Esto puede ser parte de un kit que comprende una o más proteínas, fragmentos de proteínas o equivalentes funcionales de la invención, junto con medios de detección (por ejemplo, triptasa radiomarcada, anticuerpos, enzimas tales como fosfatasas alcalinas, peroxidasas y luciferasas) que permiten la cuantificación precisa de la triptasa en la muestra que va a someterse a prueba. Tales kits pueden parecerse a kits de radioinmunoensayo o ELISA, actuando las proteínas de la invención como moléculas de unión, en vez de anticuerpos dirigidos frente a la triptasa o frente a moléculas relacionadas con la triptasa. Un aspecto de la presente invención comprende kits de este tipo que incorporan las moléculas de la presente invención.

Las proteínas, fragmentos de proteínas y equivalentes funcionales de la invención también pueden usarse para la detección de células que llevan triptasa, y en particular para la detección de mastocitos. Puede usarse cualquier técnica común en la técnica en un método de detección de este tipo y puede comprender técnicas inmunocitoquímicas e histológicas, en las que la proteína, fragmento de proteína o equivalente funcional se usa en combinación con antisueros (tales como antisueros anti-TdPI), o en las que la molécula se acopla directamente a un marcador o colorante, tal como FITC. Puede usarse una proteína entera, o simplemente un fragmento de unión activo con el fin de detectar un sustrato. En otra realización, puede condensarse la proteína de tipo natural o bien genéticamente o bien sintéticamente a otra proteína tal como una fosfatasa alcalina, luciferasa o peroxidasa con el fin de facilitar su detección. Otros métodos para detectar células o muestras que contienen triptasa pueden implicar técnicas de inmunotransferencia (Towbin et al., 1979), retardo en gel, cromatografía de afinidad, o cualquiera de los otros métodos adecuados que se utilizan en la técnica.

La invención también comprende el uso de las proteínas, fragmentos de proteínas y equivalentes funcionales de la presente invención unidos a un soporte para eliminar, purificar, aislar o extraer triptasa, por ejemplo de tejidos corporales, sangre o productos alimenticios. El soporte puede comprender cualquier material inerte adecuado e incluye geles, perlas magnéticas y de otro tipo, microesferas, columnas de unión y resinas.

La presente invención también incluye el uso de proteínas, fragmentos de proteínas y equivalentes funcionales de la invención como herramientas en el estudio de la inflamación y procesos relacionados con la inflamación u otros procesos fisiológicos que implican triptasa. Estas moléculas también pueden usarse como herramientas para estudiar adicionalmente las características y funciones de la propia MCT. Por ejemplo, las moléculas pueden usarse para la inhibición o depleción de la triptasa en cultivos celulares o en tejidos de animales inflamados, con el fin de estudiar la importancia de la triptasa en estos sistemas.

Los parásitos metazoarios, particularmente artrópodos y helmintos, también son fuentes de enfermedades infecciosas y otros efectos dañinos que tienen impactos principales en la medicina humana y veterinaria. El control de los parásitos artrópodos y helmintos se basa actualmente de manera principal en el uso de productos químicos tales como acaricidas y antihelmínticos. Se han realizado intentos para usar medios inmunológicos de control mediante el uso de tecnología de vacunas. Ha habido algo de éxito en identificar ciertos antígenos protectores como candidatos de vacunas potenciales, pero sólo unos pocos han llegado a dar fruto comercial, lo más notablemente para el gusano pulmonar del ganado Dictyocaulus viviparous y la garrapata del ganado Boophilus microplus. A pesar de estos desarrollos, hay una necesidad continuada de vacunas frente a parásitos metazoarios y en particular para vacunas que puedan usarse a través de una amplia variedad de géneros de artrópodos y/o helmintos.

Por tanto, la presente invención también proporciona el uso de proteínas, fragmentos de proteínas y equivalentes funcionales de la invención como inmunógenos para el uso como vacunas frente a parásitos metazoarios y en particular como inmunógenos protectores en el control de enfermedades provocadas por artrópodos y otros parásitos metazoarios. Candidatos adecuados para la vacunación incluyen animales domesticados tales como ganado, cabras, ovejas, perros, gatos y otros animales que requieren protección frente a parásitos metazoarios, especialmente garrapatas. La vacuna puede incluir ciertos compuestos para su uso como adyuvantes. Los adyuvantes adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen formulaciones de emulsión de aceite en agua, adyuvantes de saponina, adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA), citocinas, y otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para mejorar la eficacia de la composición.

Según todavía un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de una proteína, fragmento de proteína o equivalente funcional según los aspectos descritos anteriormente de la invención cuya expresión se asocia con una enfermedad o estado, en la fabricación de una vacuna para vacunar al mamífero frente a dicha enfermedad o estado.

Un aspecto adicional de la invención proporciona el uso de una proteína, fragmento de proteína o equivalente funcional según los aspectos descritos anteriormente de la invención en una cantidad terapéuticamente eficaz, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable en la fabricación de un medicamento para tratar a un mamífero que padece una enfermedad o un estado tal como asma, psoriasis, una enfermedad pulmonar intersticial, artritis reumatoide, gingivitis, peridontitis, una reacción alérgica, cáncer o cualquier otro estado mediado por triptasa.

Según un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína, fragmento de proteína o equivalente funcional de los aspectos descritos anteriormente de la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier vehículo que no induce en sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Vehículos adecuados son normalmente macromoléculas grandes, que se metabolizan lentamente tales como proteínas, polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados de lípidos (tales como liposomas o gotitas de aceite) y partículas de virus inactivas. Tales vehículos se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. La composición puede usarse como una vacuna y por tanto puede comprender opcionalmente un agente inmunoestimulante (adyuvante), por ejemplo, un adyuvante tal como se hizo referencia anteriormente. Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un procedimiento para la formulación de una composición de vacuna que comprende poner una proteína, fragmento de proteína o equivalente funcional según los aspectos descritos anteriormente de la invención en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, opcionalmente con un adyuvante.

Según un aspecto adicional de la invención se proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína, fragmento de proteína o equivalente funcional de los aspectos descritos anteriormente de la invención. Tales moléculas incluyen ADN, ADNc y ARN de cadena sencilla o doble, así como especies de ácidos nucleicos sintéticos. Preferiblemente, las secuencias de ácidos nucleicos comprenden
ADN.

En el presente documento se describe a modo de ejemplo un ADNc que codifica para TdPI y su secuencia y la secuencia de aminoácidos para la que codifica se muestran en la figura 1 (los nucleótidos y aminoácidos se facilitan en sus abreviaciones de una letra habituales).

Una molécula de ácido nucleico preferida según la invención comprende una secuencia de nucleótidos idéntica, o complementaria, a la secuencia mostrada en la figura 1, o una secuencia que está degenerada o es sustancialmente homóloga con la misma, o que se hibrida con esta secuencia en situaciones no rigurosas, por ejemplo, 6 x SSC/formamida al 50% a temperatura ambiente, y se lava en condiciones de escaso rigor, por ejemplo, 2 x SSC a temperatura ambiente o 2 x SSC, 42ºC o, más preferiblemente, unión en condiciones de mayor rigor, por ejemplo, 2 x SCC, 65ºC. (SSC = NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M, pH 7,2).

Preferiblemente, dichas secuencias de ácidos nucleicos presentan al menos un 60% de identidad con respecto al ADNc que codifica para TdPI, o secuencias de ADN de las que el producto de traducción (o bien un tramo parcial o bien el producto de traducción completo) presenta al menos un 60% o más de identidad con la secuencia de TdPI, cuando se alinea, usando preferiblemente el comando de mejor ajuste de GCG (penalización de creación de hueco = 2,5; penalización de extensión de hueco = 0,5) (Genetics-Computer-Group, 1994).

La invención también incluye vectores de clonación y expresión que contienen secuencias de ADN de este aspecto de la invención. Tales vectores de expresión pueden incorporar las secuencias de control de traducción y transcripción apropiadas, por ejemplo, elementos potenciadores, regiones de promotor-operador, secuencias de detención de terminación, secuencias de estabilidad de ARNm, codones de inicio y detención o sitios de unión ribosómicos, unidos en el marco con las moléculas de ácido nucleico de la invención.

Adicionalmente, puede ser conveniente hacer que la proteína recombinante se secrete de ciertos huéspedes. En consecuencia, componentes adicionales de tales vectores pueden incluir secuencias de ácidos nucleicos que codifican para secuencias de tratamiento y señalización de la secreción.

Los vectores según la invención incluyen plásmidos y virus (incluyendo virus tanto bacteriófagos como eucarióticos), así como otros vehículos de ADN lineal o circular, tales como los que emplean elementos transponibles o tecnología de recombinación homóloga. Muchos de tales vectores y sistemas de expresión se conocen bien y están documentados en la técnica (Fernández y Hoeffler, 1998). Vectores víricos particularmente adecuados incluyen vectores basados en baculovirus, adenovirus y virus vaccinia.

Huéspedes adecuados para la expresión recombinante incluyen especies procarióticas usadas comúnmente, tales como E. coli, o levaduras eucarióticas que puede hacerse que expresen niveles altos de proteínas recombinantes y que pueden hacerse crecer fácilmente en grandes cantidades. Las líneas celulares de mamíferos que se hacen crecer in vitro también son adecuadas, particularmente cuando se usan sistemas de expresión dirigida por virus. Otro sistema de expresión adecuado es el sistema de expresión de baculovirus que implica el uso de células de insectos como huéspedes. Un sistema de expresión también puede constituir células huéspedes que tengan el ADN codificante incorporado en su genoma. También pueden expresarse proteínas o fragmentos de proteínas in vivo, por ejemplo, en larvas de insectos o en tejidos de mamíferos.

Se conocen una diversidad de técnicas y pueden usarse para introducir los vectores según la presente invención en células procarióticas o eucarióticas. Las técnicas de transfección o transformación adecuadas se describen bien en la bibliografía (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1991; Spector, Goldman y Leinwald, 1998). En las células eucarióticas, los sistemas de expresión pueden ser o bien transitorios (por ejemplo, episomal) o bien permanentes (integración cromosómica) según las necesidades del sistema.

Las moléculas de ácido nucleico según la presente invención también pueden usarse para crear animales transgénicos no humanos, particularmente animales roedores. Esto puede realizarse localmente mediante modificación de células somáticas, o mediante terapia de línea germinal para incorporar modificaciones heredables.

La invención también incluye células huésped procarióticas o eucarióticas transformadas o transfectadas, u organismos transgénicos que contienen una molécula de ácido nucleico tal como se definió anteriormente.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para preparar una proteína, fragmento de proteína o equivalente funcional de la invención, tal como se definió anteriormente, que comprende cultivar una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico según la invención en condiciones mediante las cuales se expresa dicha proteína y recuperar dicha proteína así producida.

Ahora se describirán diversos aspectos y realizaciones de la presente invención en más detalle a modo de ejemplo, con referencia particular a una proteína aislada a partir de la garrapata, Rhipicephalus appendiculatus.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos inferida del clon que codifica para TdPI 76-3.

La figura 2 muestra un gel de poliacrilamida - SDS al 15% que muestra TdPIr, purificado por medio de cromatografía de afinidad a metales e intercambio catiónico.

La figura 3 muestra una alineación de TdPI con dominios de Kunitz del inhibidor de la tripsina de calostro bovino (BovCol; Cechova, 1976), aprotinina (bovina) (Creighton y Charles, 1987), y el inhibidor de la ruta del factor tisular de la rata (TFPI-2; sólo se muestra el segundo dominio que inhibe el factor Xa; Enjyoji et al., 1992).

La figura 4 muestra un diagrama que muestra la actividad inhibidora relativamente débil de TdPIr sobre calicreína tisular.

La figura 5 muestra las actividades de plasmina (izquierda) y tripsina (derecha) en presencia de cantidades en aumento de TdPIr según se determinan mediante medición de la liberación de péptido de la caseína marcada con resorufina.

La figura 6 muestra la inhibición de la triptasa humana recombinante (Promega) con TdPI.

La figura 7 muestra un gel de agarosa al 1,5% que muestra los productos de RT-PCR obtenidos con extractos de cuerpo completo de larvas (L) y ninfas (N), y con extractos de glándula salivar de R. appendiculatus adultos, machos y hembras.

Ejemplos Garrapatas

Se criaron garrapatas según Jones et al., 1988. Se alimentaron las tres fases de desarrollo de R. appendiculatus sobre cobayas Dunkin Hartley. Cuando no se alimentaban, se mantenían todas las garrapatas a de 21 a 26ºC y un 85% de humedad relativa.

ADNc

El clon 76, que contenía el ADNc de TdPI, era uno de varios clones escogidos aleatoriamente de una biblioteca de expresión de glándulas salivares de R. appendiculatus en Lambda Zap II (Stratagene), que se construyó con ARNm de garrapatas que se habían alimentado sobre cobayas Dunkin Hartley durante 2 días (Paesen y Nuttall, 1996). Se cortó el fagómido in vivo y se usó para generar plásmido pBluescript SK(-) de doble cadena en células XL1-Blue (Short et al., 1988). Se purificó el plásmido a partir de cultivos durante la noche (Goode y Feinstein, 1992) y se desnaturalizaron con álcali (Mierendorf y Pfeffer, 1987) antes de secuenciar según Sanger y Coulson, 1975.

Se determinaron las secuencias completas de las cadenas tanto positiva como negativa del inserto 76-3. El cebador directo (S1 \rightarrow) (correspondiente a los nucleótidos 209 a 224), cebador inverso (\leftarrow S2) (que se hibrida a los nucleótidos 255 a 271) y los cebadores específicos de plásmido T3 (T3 \rightarrow) y T7 (\leftarrow T7) (las secuencias de cebador específicas de inserto, o sus sitios de hibridación, están subrayadas) se muestran en la figura 1. P1\rightarrow y P2 \leftarrow representan los sitios de cebador usados en el experimento de RT-PCR.

La secuencia obtenida mediante secuenciación N-terminal de la proteína TdPIr está en negrita y cursiva en la figura 1. La ondulación representa una secuencia consenso de unión a heparina. La doble línea indica un sitio de glucosilación supuesto. La señal de poliadenilación y la cola poli-A se muestran en tipo de letra negrita. La leucina indicada por los asteriscos es una metionina en los clones 76, 76-1 y 76-2.

Los datos de secuencia se analizaron usando el software de análisis de secuencia de GCG [Genetics-Computer-Group, 1994 nº 14]. Las búsquedas en base de datos de proteínas se realizaron en el centro nacional de información biotecnológica (NCBI - National Centre for Biotechnology Information) usando el servicio de red BLAST (Altschul et al., 1990).

Una vez secuenciado el clon 76, se volvió a examinar la biblioteca para determinar clones adicionales mediante hibridación de ADN de transferencias de halos ("plaque lifts") (Sambrook, Fritsch y Maniatis, 1989). La sonda usada se construyó marcando aleatoriamente el cebador del ADNc original (cortado de plásmido purificado usando EcoRI y Eco0109I) con digoxigenina (Boehringer Mannheim). Se aislaron y secuenciaron tres clones positivos.

Expresión de proteína recombinante

Se expresó el TdPI recombinante (TdPIr) como proteína marcada con histidina en células de ovario de Spodoptera frugiperda (Sf21; Invitrogen). La región codificante del ADNc TdPI se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando el cebador directo 5'-GCAGGAGCTCGGCACGAG y el cebador inverso 5'-TATG
GATCCCAGGTCCAGGCTCTGTTCCG, añadiendo así un sitio Sac I en sentido 5' del codón de inicio, y sustituyendo el codón de detención con un sitio Bam HI. La PCR consistió en 20 ciclos con una etapa de fusión de 30 segundos (95ºC), una etapa de hibridación del cebador de 30 segundos (50ºC) y una etapa de extensión de 30 segundos (72ºC). El producto de PCR estaba ligado entre los sitios Sac I y Bam HI del vector de transferencia de pAC129.1 (Livingstone y Jones, 1989), que se modificó de modo que se añadió el marcador Gly-Ile-(His)_{6} carboxiterminal a la proteína expresada. Se realizó la transfección conjunta de células Sf21 con el vector de transferencia y baculovirus (BacPak6) y la amplificación del virus recombinante tal como se describió por Kitts y Possee, 1993. Se expresó TdPIr en medio TC 100 (Gibco BRL) que contenía suero bovino fetal al 10% (Sigma).

Purificación de proteína recombinante

Sesenta horas tras la infección de las células Sf21, se recogió el medio de cultivo y se precipitó TdPIr mediante adición de (NH_{4})_{2}SO_{4} (30 g por 100 ml de medio). Volvió a disolverse el sedimento en tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 8) que contenía NaCl 300 mM y glicerol al 10%. Se purificó TdPIr usando una columna de agarosa Ni-NTA (Qiagen), principalmente según Janknecht et al., 1991. Se usó tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 6,5) que contenía NaCl 300 mM y glicerol al 10% para lavar la columna. Se eluyó la proteína marcada con histidina usando imidazol 200 mM en NaH_{2}PO. 75 mM. Se obtuvo purificación adicional mediante cromatografía con baja presión usando el sistema BioLogic (Bio-Rad) con una columna de intercambio catiónico HiTrap SP (Pharmacia Biotech). El tampón de recorrido fue Hepes 50 mM, pH 8, con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 250 mM a lo largo de 1 hora; la velocidad de flujo fue de 1 ml/min. Se usaron concentradores centricon 3 (Amicon) para la concentración de los eluyentes y para el intercambio de tampón. Se almacenó la proteína purificada a -20ºC en PBS hasta su uso. Se midió la concentración de proteína usando el ensayo de proteínas de Bio-Rad y el ensayo de proteínas Micro BCA (Pierce).

Electroforesis de proteínas

La electroforesis de gel de poliacrilamida - dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) se realizó según Laemmli, 1970.

La figura 2 muestra un gel de poliacrilamida - SDS al 15% que muestra TdPIr, purificada por medio de cromatografía de afinidad a metales e intercambio catiónico. La proteína en el carril A se había tratado con PNGasa F (la proteína de \sim35 kDa sobre el gel) antes de la electroforesis. El carril B contiene TdPIr sin tratar. Las masas moleculares se facilitan en kDa. El carril C contiene TdPIr sin reducir (sin agente reductor en el tampón de carga). El peso molecular superior al que corre el TdPIr sin reducir sugeriría normalmente la dimerización mediante puentes disulfuro intramoleculares, pero la espectrometría de masas coloca la masa molecular a aproximadamente 13.500 Da, contradiciendo la formación de dímeros.

Se estudió la glucosilación unida a asparagina tratando TdPIr con N-glucosidasa F (PNGasa F; New England BioLabs), seguido de SDS-PAGE. PNGasa F hidroliza todos los tipos comunes de cadenas de Asn-glucano de las glucoproteínas (Maley et al., 1989).

La figura 3 muestra una alineación de TdPI con dominios de Kunitz del inhibidor de la tripsina de calostro bovina (BovCol; Cechova, 1976), aprotinina (bovina) (Creighton y Charles, 1987), y el inhibidor de la ruta del factor tisular de la rata (TFPI-2; sólo se muestra el segundo dominio que inhibe el factor Xa; Enjyoji et al., 1992). También se incluyen los dominios de Kunitz del péptido anticoagulante de garrapata TAP (Waxman et al., 1990) y los dos dominios ornithodorina (ornith1 y ornith2; Van de Locht et al., 1996). La alineación de TdPI con los dominios de Kunitz vertebrados se creó usando los comandos "pileup" ("apilamiento") y "prettyplot" ("gráfico completo") de GCG, seleccionando pesos de hueco y longitud relativamente bajos (1 y 0,03, respectivamente). Entonces se modificó la alineación, principalmente introduciendo huecos adicionales, de modo que pudieron incluirse los dominios de TAP y ornithodorina. La modificación se basó ampliamente en la alineación de los últimos dominios con aprotinina, tal como se notificó por Van de Locht et al., 1996. La flecha indica el residuo P1 del bucle de unión de aprotinina. Los asteriscos representan las cisteínas implicadas en la formación del puente de disulfuro en los dominios de Kunitz tradicionales.

Secuenciación N-terminal

Se determinó la secuencia amino-terminal de TdPIr en la unidad de inmunoquímica del MRC del departamento de bioquímica de la universidad de Oxford, según Matsudaira, 1987. Se hicieron pasar muestras electroinmunotransferidas sobre un secuenciador de proteínas Applied Biosystems 484A "Procise" (Perkin-Elmer) usando un cartucho Applied Biosystems "Mini-Blott".

Espectrometría de masas

Se realizó EM-ESI sobre un espectrómetro de masa a presión atmosférica de triple cuadrupolo VG BioQ equipado con una interfaz de electrospray que funcionaba en modo de ión positivo. Se calibró el instrumento con mioglobina de corazón de caballo (7 pmol/\mul; masa molecular promedio de 16.951,48 Da).

Ensayos de inhibición de la proteasa

Se compraron elastasa (tipo I, de páncreas porcino), \alpha-quimotripsina, tripsina, trombina, plasmina, calicreína tisular, urocinasa, aprotinina, n-succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida, Gly-Arg-p-nitroanilida, n-\alpha-benzoil-DL-Arg-p-nitroanilida y n-benzoil-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilida de Sigma. El factor Xa y la triptasa humana recombinante eran de Promega y la caseína marcada con resorufina, inhibidor de tripsina de la soja, cromozima TH y cromozima X se obtuvieron de Boehringer Mannheim.

Se midió la actividad de triptasa en microplacas de 96 pocillos, usando n-\alpha-benzoil-DL-Arg-p-nitroanilida como sustrato cromogénico y HEPES 50 mM pH 7,6, que contenía NaCl 120 mM, como tampón de reacción. Se combinaron 50 \mul de tampón que contenían 1 \mul de disolución madre de triptasa (200 \mug/ml) con 50 \mul de disolución inhibidora (diversas concentraciones). Tras un periodo de incubación de 45 minutos a 37ºC, se añadieron 50 \mul de disolución de sustrato 3 mM y se midió el aumento de absorbancia a 405 nm usando un lector de placas Titertek Multiskan Plus MKII (ICN).

Se incubaron previamente otras proteasas con diversas cantidades de inhibidor de proteasa en un volumen total de 100 \mul de tampón de proteasa (20 minutos; 37ºC). Se determinó la actividad de proteasa residual añadiendo los sustratos apropiados (en 900 \mul de tampón de proteasa) y midiendo el grado de digestión. Se midieron las actividades de tripsina, \alpha-quimotripsina y elastasa en tampón de proteasa A (Tris.HCl 0,1 M, glicerol al 10%, CaCl_{2} 10 mM, pH 8); se determinaron las actividades de plasmina, urocinasa, calicreína, \alpha-trombina y factor Xa en tampón de proteasa B (Tris.HCl 50 mM, albúmina sérica bovina 0,1 mg/ml, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 1 mM, pH 8), tal como se describió por Nakamura et al., 1987. Se usó caseína marcada con resorufina como sustrato de tripsina, \alpha-quimotripsina y plasmina, y se midió la cantidad de péptido liberado para determinar la actividad de proteasa (Twining, 1984). Se usaron sustratos de p-nitroanilida (pNA) para las actividades de elastasa, calicreína, urocinasa, \alpha-trombina y factor Xa (n-succinil-Ala-Ala-Ala-pNA, n-benzoil-Pro-Phe-Arg-pNA, Gly-Arg-pNA, cromozima TH, y cromozima X, respectivamente); se midió la actividad de proteasa determinando el aumento de la absorbancia a 410 nm.

La figura 4 muestra un diagrama que muestra la actividad inhibidora relativamente débil de TdPIr sobre calicreína tisular. Se muestra la absorbancia a 410 nm en diferentes puntos de tiempo tras la adición de 30 \mug de sustrato (n-benzoil-Pro-Phe-Arg-pNa) a muestras de calicreína/antiproteasa. Se usaron 0,5 u/ml de calicreína tisular por muestra (1 ml de volumen final). La línea continua (\blacklozenge-\blacklozenge) indica actividad de calicreína en ausencia de inhibidor de proteasas. La aprotinina usada a una concentración de 0,75 mM inhibe completamente la actividad de calicreína (\medbullet- - - -\medbullet). Una concentración diez veces superior de TdPIr [7,5 \muM (\medcirc- - - -\medcirc)] apenas inhibe el 50% de la actividad de calicreína. Otras concentraciones de TdPIr usadas en el experimento fueron 3,75 \muM (\triangle- - - -\triangle) y 0,75 \muM (\boxempty- - - -\boxempty).

La figura 5 muestra las actividades de plasmina (izquierda) y tripsina (derecha) en presencia de cantidades en aumento de TdPIr según se determinan midiendo la liberación del péptido de la caseína marcada con resorufina. Se ajustó la liberación del péptido en ausencia de inhibidor para que fuese del 100%, la hidrólisis en ausencia de proteasa corresponde al 0% de actividad. Los valores para TdPIr se indican por círculos en blanco. Para calcular la concentración micromolar de monómeros de TdPIr a partir de los datos en mg/ml obtenidos con el ensayo de proteínas, se usaron tanto la masa molecular calculada de 12 kDa (\medcirc- - - -\medcirc; asumiendo ninguna unión de azul de Coomassie a la fracción de hidrato de carbono de la glucoproteína) como la masa molecular (promedio) tal como se determina mediante espectrometría de masas (13,5 kDa; \medcirc-\medcirc). Las concentraciones correspondientes con una inhibición de plasmina del 50% son de 0,097 \muM para aprotinina (\triangle-\triangle), 0,23 \muM para inhibidor de tripsina de la soja (\blacksquare-\blacksquare), 0,32 \muM (\medcirc-\medcirc) y 0,43 mM (\medcirc- - - -\medcirc) para monómeros de TdPIr. Los valores para una inhibición de tripsina del 50% son de 0,024 \muM (\triangle-\triangle), 0,026 mM (\blacksquare-\blacksquare), 0,033 \muM (\medcirc-\medcirc) y 0,044 \muM (\medcirc- - - -\medcirc).

La figura 6 muestra la inhibición de la triptasa humana recombinante (Promega) con TdPI. La preincubación de triptasa humana recombinante con cantidades en aumento de TdPIr reduce rápidamente la actividad catalítica hasta aproximadamente el 33% de la actividad en ausencia de inhibidor (V_{0}: la velocidad de renovación del sustrato medida sin triptasa presente; Vi: la velocidad con inhibidor añadido).

Reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR)

Se extirparon glándulas salivares de garrapatas adultas sin alimentar, y de garrapatas adultas que se habían alimentado sobre cobayas durante 2, 4 y 6 días. Cada muestra tisular consistía en 15 pares de glándulas. Se aisló ARN total de estas glándulas usando el kit de extracción RNAce Total Pure (Bioline Ltd) y se usó 1/30 de la cantidad obtenida (el equivalente a una glándula) como molde para la RT-PCR (35 ciclos), utilizando el sistema de RT-PCR de un tubo Titan (Boehringer Mannheim). También se llevó a cabo RT-PCR en ARN agrupado de intestinos, gónadas, glándulas sexuales accesorias y túbulos de Malpighi, tomados de garrapatas adultas alimentadas durante 2 días. Se sometieron homogeneizados de cuerpo completo de larvas alimentadas durante 3 días y ninfas alimentadas durante 3 días al mismo procedimiento; la cantidad de ARN usado para la reacción de PCR correspondía al extracto de 1 ninfa o 2 larvas. Las secuencias de cebadores (P1 y P2) están subrayadas en la figura 1. Para comprobar si los productos de RT-PCR derivaban específicamente de ARNm de TdPI, se compararon sus tamaños con el tamaño de un marcador que se obtuvo mediante amplificación por PCR del ADN de plásmido original, usando los mismos
cebadores.

La figura 7 muestra un gel de agarosa al 1,5% que muestra los productos obtenidos por RT-PCR con extractos de cuerpo completo de larvas (L) y ninfas (N), y con extractos de glándulas salivares de R. appendiculatus adultos, machos y hembras. Los números corresponden a diferentes puntos de tiempo de la fase de alimentación adulta; 0 indica muestras tomadas de garrapatas sin alimentar; 2, 4 y 6 indican garrapatas alimentadas de 2, 4 y 6 días, respectivamente. El carril M muestra como marcador de peso molecular, el producto de PCR obtenido con el mismo conjunto de cebadores (figura 1), pero usando el ADNc de TdPI como molde, en lugar de ARN.

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<120> PROTEÍNAS INHIBIDORAS

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<130> p022288WO

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<140> PCT/GB00/02791

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<141> 2000-07-19

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<150> GB9916913.8

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<151> 1999-07-19

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<160> 10

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<170> SeqWin99, versión 1.02

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<210> 1

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<211> 490

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<212> ADN

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<213> Rhipicephalus appendiculatus

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 118

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<212> PRT

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<213> Rhipicephalus appendiculatus

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<400> 2

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2

3

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<210> 3

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<211> 56

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 3

4

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<210> 4

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<211> 56

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 4

5

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<210> 5

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<211> 56

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 5

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6

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<210> 6

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<211> 60

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<212> PRT

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<213> Ornithodoros moubata

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<400> 6

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7

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<210> 7

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<211> 51

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<212> PRT

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<213> Ornithodoros moubata

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<400> 7

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8

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<210> 8

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<211> 54

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<212> PRT

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<213> Ornithodoros moubata

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<400> 8

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9

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<210> 9

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador de PCR

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<400> 9

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gcaggagctc ggcacgag

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18

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<210> 10

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador de PCR

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

tatggatccc aggtccaggc tctgttccg

\hfill

29

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Claims (28)

1. Una proteína recombinante que:

i)

muestra una homología de secuencia significativa con la secuencia de la proteína inhibidora de la proteasa derivada de garrapatas (TdPI) facilitada en la figura 1; o

ii)

es un fragmento activo de la secuencia de TdPI facilitada en la figura 1,

en la que dicha homología de secuencia se define como que el 50% o más de los aminoácidos en la secuencia se conservan completamente como residuos idénticos a lo largo de toda la longitud de la proteína si se alinea la proteína con la secuencia de la figura 1,

y en la que la proteína recombinante o fragmento activo inhibe la triptasa o tiene uno o más epítopos que pueden usarse para el desarrollo de vacunas que seleccionan como diana la secuencia de TdPI facilitada en la figura 1.

2. Proteína recombinante o fragmento de proteína según la reivindicación 1, que funciona como un inhibidor de la triptasa, preferiblemente de la triptasa mastocitaria humana.

3. Proteína recombinante o fragmento de proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que contiene uno o más epítopos que pueden usarse en el desarrollo de vacunas que seleccionan como diana la proteína de TdPI que tiene la secuencia en la figura 1.

4. Proteína recombinante o fragmento de proteína según la reivindicación 1, en la que dicha homología de secuencia es del 60% o más.

5. Proteína recombinante o fragmento de proteína según la reivindicación 4, en la que dicha homología de secuencia es del 75% o más.

6. Proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende la secuencia de TdPI facilitada en la figura 1.

7. Proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que inhibe la triptasa con una Ki inferior a 1 x 10^{-6} M, preferiblemente inferior a 1 x 10^{-7} M, más preferiblemente inferior a 2 x 10^{-8} M, lo más preferiblemente inferior a 1 x 10^{-9} M.

8. Proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que inhibe la actividad de la triptasa catalítica.

9. Proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que inhibe la triptasa mastocitaria, preferiblemente la triptasa mastocitaria humana.

10. Proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se deriva de una garrapata.

11. Proteína recombinante o fragmento de proteína según la reivindicación 10, que se deriva de la garrapata Rhipicephalus appendiculatus.

12. Proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se ha fusionado genética o químicamente a uno o más péptidos o polipéptidos.

13. Proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está unida a un soporte, tal como una resina.

14. Composición farmacéutica que comprende una proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Composición de vacuna que comprende una proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, opcionalmente junto con un adyuvante.

16. Procedimiento para la formulación de una composición farmacéutica según la reivindicación 15, que comprende poner una proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para su uso como producto farmacéutico.

18. Una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

19. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 18, que tiene la secuencia de nucleótidos facilitada en la figura 1.

20. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 18, que se hibrida con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia en la figura 1 en condiciones de hibridación rigurosas de 2 x SSC, 65ºC en la que SSC tiene NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M, pH 7,2.

21. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, o la reivindicación 19.

22. Vector según la reivindicación 21, que está basado en virus.

23. Una célula huésped transformada o transfectada con el vector según la reivindicación 21 o la reivindicación 22.

24. Un animal transgénico no humano que se ha transformado mediante una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20.

25. Método para preparar una proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende expresar un vector según la reivindicación 21 o la reivindicación 22 en una célula huésped y cultivar dicha célula huésped en condiciones en las que se expresa dicha proteína recombinante o fragmento de proteína, y recuperar dicha proteína recombinante o fragmento de proteína así producido.

26. Uso de una proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para la detección o cuantificación de triptasa in vitro; para la depleción o eliminación de la triptasa de un producto alimenticio o de un cultivo celular; o para el uso in vitro como un agente anti-triptasa.

27. Uso de una proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la inflamación en seres humanos o animales.

28. Uso de una proteína recombinante o fragmento de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la fabricación de una vacuna para la protección frente a enfermedades provocadas por parásitos artrópodos o metazoarios.