DE69737815T2

DE69737815T2 - G-protein gekoppelter rezeptor mit vergrösserter, extrazellulärer domäne

Info

Publication number: DE69737815T2
Application number: DE69737815T
Authority: DE
Inventors: Richard D. San Diego YE
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1996-01-30
Filing date: 1997-01-30
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2017-01-31
Also published as: DK0948536T3; EP0948536B1; CA2244850A1; AU2256097A; US6521418B1; ES2287951T3; DE69737815D1; WO1997028188A1; AU733853B2; US20030187244A1; ATE364627T1; EP0948536A1; EP0948536A4

Description

Diese Arbeit wurde teilweise durch eine Forschungsförderung von den National Institutes of Health (GM46572) unterstützt. Die Regierung hat deshalb bestimmte Rechte an der Erfindung.
Hintergrund der Erfindung
Bei dem Gebiet der Erfindung handelt es sich um G Protein-gekoppelte Rezeptoren.
Die Rhodopsin-ähnlichen G Protein-gekoppelten Rezeptoren, bei denen es sich um die allergrößte Klasse von Zelloberflächenrezeptoren handelt, vermitteln eine große Vielfalt unentbehrlicher physiologischer Funktionen. Zum Beispiel vermitteln G Protein-gekoppelte Rezeptoren die chemotaktische Bewegung von Zellen, die eine adäquate Immunreaktion sicherstellt, übertragen die durch Hormone getragenen Signale und fangen externe Stimuli, wie zum Beispiel die Photonen, welche auf die Retina treffen, und die Geruchsmoleküle, welche auf das Nasenepithel treffen, ein (Probst et al., DNA Cell Biol. 11: 1–20, 1992). Alle G Protein-gekoppelten Rezeptoren enthalten sieben Domänen, die die Zellmembran hin und zurück überschreiten; die aus Protein bestehenden Schleifen, die sich zwischen diesen Transmembrandomänen bilden, dehnen sich in den extrazellulären und intrazellulären Raum aus. Die Schleifen, die sich extrazellulär ausdehnen, treten spezifisch mit Liganden in Wechselwirkung, insbesondere Peptid- und Proteinliganden, und die intrazellulären Schleifen treten mit G Proteinen an der inneren Oberfläche der Zellmembran in Wechselwirkung, wodurch sie die biochemische Kaskade anfangen, die das extrazelluläre Signal ins Innere der Zelle überträgt. Die dritte intrazelluläre Schleife von vielen G Protein-gekoppelten Rezeptoren, insbesondere von denjenigen, die als adrenerge und cholinerge Rezeptoren wirken, ist die größte intrazelluläre Struktur, und man denkt, dass sie für die Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und einem G Protein besonders wichtig ist (Lefkowitz et al., Cold Spring Harbor Symposia Quant. Biol. 53: 507–514, 1988).
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung präsentiert einen G Protein-gekoppelten Rezeptor, der eine vergrößerte extrazelluläre Schleife zwischen der vierten und fünften Transmembrandomäne hat. Eine den Rezeptor kodierende Nucleinsäure wurde aus einer menschlichen Granu lozytenzellbank isoliert und gegen das Polypeptid erzeugte Antikörper deckten die Expression in einer Vielfalt von Geweben, einschließlich Herz, Placenta und Lunge auf. Dieser Antikörper oder andere, die den erfindungsgemäßen G Protein-gekoppelten Rezeptor spezifisch binden, können bei der Diagnose von Erkrankungen oder Leiden verwendet werden, die mit einer Hochregulierung des Rezeptors assoziiert sind, die zum Beispiel stattfindet, wenn hämatopoetische Zellen differenzieren. Diese Erkrankungen schließen entzündliche und neurologische Erkrankungen, wie zum Beispiel die Alzheimer-Krankheit, ein. Die hierin beschriebenen Nucleinsäuren, Polypeptide und Antikörper können auch als therapeutische Mittel verwendet werden, um diese Erkrankungen durch Hemmen der Expression oder Aktivität des Rezeptors zu behandeln. Sie können auch bei der Behandlung von Fettleibigkeit verwendet werden.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der ausführlichen Beschreibung und aus den Ansprüchen ersichtlich sein. Obwohl Materialien und Verfahren, die den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, beim Ausüben oder Testen der Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Materialien und Verfahren nachstehend beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Bei 1 handelt es sich um eine Darstellung der Nucleotid-(obere Reihe; SEQ ID NO: 1) und abgeleiteten Aminosäuresequenz (untere Reihe; SEQ ID NO: 2) des cDNA-Klons AZ3B. Die Nucleotidsequenz wird vom ersten Initiationscodon (ATG) des längsten offenen Leserahmens aus positiv nummeriert; die nicht translatierte 5'-Sequenz wird negativ nummeriert. Mutmaßliche Transmembrandomänen sind schattiert und vorhergesagte N-Glycosylierungsstellen sind mit Kreisen markiert.
Bei 2 handelt es sich um einen Hydrophobizitäts-Plot, der unter Verwendung der Proteinsequenz von AZ3B erzeugt wurde. Der Hydrophobizitätsindex wird über der horizontalen Linie gezeigt, und der Hydrophilizitätsindex wird unterhalb der Linie gezeigt.
Bei 3 handelt es sich um ein Diagramm der vorhergesagten Anordnung des Proteins AZ3B in der Zellmembran. Die Reste 164–327 (gefüllte Kreise) bezeichnen eine Sequenz, die an die Carboxyltermini von Glutathion-S-Transferase (GST) und dem Maltose-bindenden Protein (MBP) fusioniert ist. Mutmaßliche N-gekoppelte Glycosylierungsstellen werden durch „CHO" angezeigt.
Bei den 4A und 4B handelt es sich um Photographien von Northern-Blots. In 4A wird AZ3B mRNA (Poly(A⁺)) in acht unterschiedlichen menschlichen Geweben analysiert. In 4B wird AZ3B Gesamt-RNA in undifferenzierten und differenzierten HL-60-Zellen analysiert.
Ausführliche Beschreibung
Wie vorstehend festgestellt wurde (und in den nachstehenden Beispielen weiter beschrieben wird), stellt die Erfindung isolierte Nucleinsäuren, die einen G Protein-gekoppelten Rezeptor mit einer vergrößerten extrazellulären Schleife zwischen der vierten und fünften Transmembrandomäne kodieren, sowie Fragmente davon bereit (siehe zum Beispiel die Nucleinsäure von 1 (SEQ ID NO: 1). Mit „vergrößerter extrazellulärer Schleife" ist eine Schleife gemeint, die größer als die vergleichbare extrazelluläre Schleife bekannter G Protein-gekoppelter Rezeptoren ist. Vorzugsweise besteht die vergrößerte Schleife aus mindestens 50 Aminosäureresten, stärker bevorzugt aus mindestens 100 Aminosäureresten und am stärksten bevorzugt aus mindestens 160 Aminosäureresten. Ein bevorzugtes Fragment der Nucleinsäure kodiert die gesamte vergrößerte extrazelluläre Schleife oder einen Teil davon (siehe zum Beispiel die Nucleotide 481–996 von 1). Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können natürlich vorkommende Sequenzen (wie in 1) oder Sequenzen enthalten, die sich von denjenigen unterscheiden, die natürlich vorkommen, aber aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes das gleiche Polypeptid kodieren (zum Beispiel das Polypeptid von SEQ ID NO: 2). Diese Nucleinsäuren können aus RNA oder DNA bestehen (zum Beispiel genomischer DNA, cDNA oder synthetischer DNA, wie zum Beispiel die durch Synthese auf Phosphoramidit-Basis produzierte) oder aus Kombinationen oder Modifikationen der Nucleotide innerhalb dieser Nucleinsäurearten bestehen. Zusätzlich kann die Nucleinsäure doppelsträngig oder einzelsträngig sein (d. h. entweder ein Sense- oder ein Antisense-Strang).
Mit „isolierter Nucleinsäure" ist eine Nucleinsäure gemeint, die von entweder der 5'- oder der 3'-kodierenden Sequenz getrennt ist, mit der sie im natürlich vorkommenden Genom eines Organismus unmittelbar zusammenhängt. Die Nucleinsäure ist nicht auf Sequenzen beschränkt, die Polypeptide kodieren; manche oder alle nicht kodierenden Sequenzen, die stromaufwärts oder stromabwärts von einer kodierenden Sequenz liegen, können auch eingeschlossen sein. Bei diesen isolierten Nucleinsäuren kann es sich zum Beispiel um cDNA oder genomische DNA-Fragmente handeln, die durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt oder durch Behandlung mit Restriktionsendonuclease erzeugt wurden, oder um ein Ribonucleinsaure(RNA)-Fragment, das durch in-vitro-Transkription hergestellt wurde.
Die isolierten erfindungsgemäßen Nucleinsäuren sind nicht auf diejenigen beschränkt, die natürlich vorkommen, und können somit Fragmente einschließen, die so im natürlichen Zustand nicht gefunden werden. Somit umfasst die Erfindung rekombinan te Moleküle, wie zum Beispiel diejenigen, bei denen eine Nucleinsäuresequenz (zum Beispiel die Sequenz von AZ3B) in einen Vektor (zum Beispiel einen Plasmid- oder einen Virusvektor) oder in das Genom einer heterologen Zelle (oder das Genom einer homologen Zelle, an einer anderen Position als der natürlichen chromosomalen Stelle) eingegliedert ist. Auf ähnliche Weise kann die Nucleinsäure einen Teil eines Hybridgens bilden, das zusätzliche Polypeptidsequenzen (zum Beispiel Sequenzen, die als „Marker" oder „Reporter" wirken) kodiert, die zum Beispiel verwendet werden können, um ein Fusionsprotein herzustellen. Beispiele für Marker- oder Reportergene schließen β-Lactamase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), Adenosindesaminase (ADA), Aminoglycosidphosphotransferase (neo^r, G418^r), Dihydrofolatreduktase (DHFR), Hygromycin-B-Phosphotransferase (HPH), Thymidinkinase (TK), lacZ (kodiert β-Galaktosidase) und Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (XGPRT) ein. Wie bei vielen der Standardverfahren, die mit der Ausübung der Erfindung assoziiert sind, werden dem Fachmann zusätzliche nützliche Reagenzien, zum Beispiel zusätzliche Sequenzen, offensichtlich sein, welche die Funktion eines Markers oder Reporters erfüllen können.
Nachweisen von Nucleinsäuren, die mit AZ3B cDNA hybridisieren
Die vorstehend beschriebene AZ3B cDNA-Sequenz kann verwendet werden, um zusätzliche Nucleinsäuren, mit der sie hybridisiert, nachzuweisen und zu isolieren. Diese Nucleinsäuren schließen zum Beispiel Nucleinsäuren ein, die homologe Rezeptoren in anderen Arten, Spleißvarianten der AZ3B Sequenz bei Menschen oder anderen Säugern oder verwandte Nucleinsäuren kodieren, die, indem sie einen G Protein-gekoppelten Rezeptor mit einer vergrößerten extrazellulären Schleife zwischen der vierten und fünften Transmembrandomäne kodieren, als Mitglieder dieser neuen Rezeptorfamilie klassifiziert werden würden. Demgemäß präsentiert die Erfindung Verfahren zum Nachweisen und Isolieren dieser Nucleinsäuren. Bei diesen Verfahren wird eine Probe (zum Beispiel eine Nucleinsäurebank, wie zum Beispiel eine cDNA- oder genomische Bank) mit einer für AZ3B spezifischen Sonde (zum Beispiel einem Fragment von SEQ ID NO: 1, das mindestens 12 Nucleotide lang ist) in Kontakt gebracht (oder „durchgemustert"). Die Sonde hybridisiert selektiv an Nucleinsäuren, die verwandte Polypeptide kodieren (oder an komplementäre Sequenzen davon). Weil das durch AZ3B kodierte Polypeptid mit anderen G Protein-gekoppelten Rezeptoren verwandt ist (zum Beispiel enthalten alle sieben Transmembrandomänen), wird der Begriff "selektiv hybridisieren" verwendet, um ein Ereignis zu bezeichnen, bei dem eine Sonde an Nucleinsäuren, die G Protein-gekoppelte Rezeptoren kodieren, die eine vergrößerte extrazelluläre Schleife haben (oder an komplementäre Sequenzen davon), in einem nachweisbar größeren Ausmaß als an Nucleinsäuren, die G Protein-gekoppelte Rezeptoren kodieren, die dieses kennzeichnende Merkmal nicht haben, (oder an komplementäre Sequenzen davon) bindet. Vorzugsweise handelt es sich bei der Sonde um eine „für AZ3B spezifische Sonde" und sie umfasst Nucleinsäuren, die an Nucleinsäuren, die G Protein-gekoppelte Rezeptoren mit einer vergrößerte extrazelluläre Schleife kodieren, (oder komplementäre Sequenzen davon) binden.
Die Entdeckung der AZ3B cDNA ermöglicht zum ersten Mal eine Herstellung von Nucleinsäuresonden, die spezifisch mit Nucleinsäuren hybridisieren, die G Protein-gekoppelte Rezeptoren innerhalb der AZ3B-Familie kodieren. Die Sonden, die mindestens 12 (zum Beispiel 15, 25, 50, 100 oder 200 Nucleotide) enthalten können, können unter Verwendung von einem von mehreren Standardverfahren hergestellt werden (siehe zum Beispiel Ausubel et al., vorstehend). Die Sonden können zum Beispiel unter Verwendung von PCR-Amplifikationsverfahren erzeugt werden; Primer können gestaltet werden, die eine für AZ3B spezifische Nucleinsäure (zum Beispiel eine Nucleinsäure in der vergrößerten extrazellulären Schleife) amplifizieren, die als Sonde verwendet werden kann, um eine Nucleinsäurebank zu durchmustern, wie vorstehend beschrieben, und dadurch Nucleinsäuren (innerhalb der Bank) nachzuweisen, die an die Sonde hybridisieren.
Von einer einzelsträngigen Nucleinsäure sagt man, dass sie an eine andere „selektiv hybridisiert", wenn sich aus ihnen ein Duplex bildet. Dies findet statt, wenn eine Nucleinsäure eine Sequenz enthält, bei der es sich um die Umkehrung und das Komplement der anderen handelt (diese gleiche Anordnung führt zu der natürlichen Wechselwirkung zwischen dem Sense- und dem Antisense-Strang von DNA im Genom und liegt der Konfiguration der „Doppelhelix" zugrunde). Vollständige Komplementarität der hybridisierenden Bereiche ist nicht erforderlich, damit sich ein Duplex bildet; es ist nur nötig, dass die Anzahl der gepaarten Basen ausreichend ist, um den Duplex unter den verwendeten Hybridisierungsbedingungen aufrechtzuerhalten.
Typischerweise haben die Hybridisierungsbedingungen niedrige bis mittlere Stringenz. Diese Bedingungen begünstigen spezifische Wechselwirkungen zwischen vollständig komplementären Sequenzen, ermöglichen aber auch, dass eine gewisse unspezifische Wechselwirkung zwischen weniger als perfekt passenden Sequenzen ebenfalls stattfindet. Nach der Hybridisierung können die Nucleinsäuren unter mittleren oder hohen Stringenzbedingungen „gewaschen" werden, um Duplexe zu dissoziieren, die durch eine gewisse unspezifische Wechselwirkung aneinander gebunden sind (die Nucleinsäuren, welche diese Duplexe bilden, sind somit nicht vollständig komplementär).
Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, werden die optimalen Waschbedingungen empirisch bestimmt, oft durch allmähliches Erhöhen der Stringenz. Die Parameter, die geändert werden können, um die Stringenz zu beeinflussen, schließen in erster Linie Temperatur und Salzkonzentration ein. Im Allgemeinen ist die Stringenz um so höher, je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Temperatur ist. Waschen kann bei einer niedrigen Temperatur (zum Beispiel Raumtemperatur) unter Verwendung einer Lösung, die eine äquivalente oder niedrigere Salzkonzentration wie die Hybridisierungslösung enthält, angefangen werden. Das anschließende Waschen kann unter Verwendung fortschreitend wärmerer Lösungen mit der gleichen Salzkonzentration ausgeführt werden. Als Alternative kann die Salzkonzentration verringert und die Temperatur im Waschschritt aufrechterhalten werden, oder die Salzkonzentration kann verringert und die Temperatur erhöht werden. Zusätzliche Parameter können auch verändert werden. Zum Beispiel verändert die Verwendung eines destabilisierenden Mittels, wie zum Beispiel Formamid, die Stringenzbedingungen.
Bei Reaktionen, bei denen Nucleinsäuren hybridisiert werden, variieren die Bedingungen, die verwendet werden, um einen vorgegebenen Stringenzspiegel zu erreichen. Es gibt keinen Satz von Bedingungen, der zum Beispiel ermöglicht, dass sich Duplexe von allen Nucleinsäuren bilden, die zu 85% miteinander identisch sind; die Hybridisierung hängt auch von einzigartigen Merkmalen jeder Nucleinsäure ab. Die Länge der Sequenz, die Zusammensetzung der Sequenz (zum Beispiel der Gehalt an Purin-ähnlichen Nucleotiden gegenüber dem Gehalt an Pyrimidin-ähnlichen Nucleotiden) und die Art der Nucleinsäure (zum Beispiel DNA oder RNA) beeinflussen die Hybridisierung. Ein zusätzlicher Gesichtspunkt ist, ob eine der Nucleinsäuren immobilisiert ist (zum Beispiel auf einem Filter).
Ein Beispiel für ein Fortschreiten von niedrigeren zu höheren Stringenzbedingungen ist das folgende, wobei der Salzgehalt als die relative Menge an SSC (einer Salzlösung, die Natriumchlorid und Natriumcitrat enthält; 2 × SSC ist eine 10-fach höhere Konzentration als 0,2 × SSC) angegeben wird. Nucleinsäuren werden bei 42°C in 2 × SSC/0,1% SDS (Natriumdodecylsulfat, ein Detergenz) hybridisiert und dann in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur gewaschen (für Bedingungen niedriger Stringenz); 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C (für Bedingungen mäßiger Stringenz); und 0,1 × SSC bei 68°C (für Bedingungen hoher Stringenz). Das Waschen kann unter Verwendung nur einer der angegebenen Bedingungen durchgeführt werden, oder jede der Bedingungen kann verwendet werden (zum Beispiel, indem jeweils 10–15 Minuten lang in der vorstehend aufgeführten Reihenfolge gewaschen wird). Eine Waschung oder alle Waschungen können wiederholt werden. Wie vorstehend erwähnt, variieren die optimalen Bedingungen und können empirisch bestimmt werden.
Die hybridisierten Nucleinsäuren können aus einer biologischen Zelle, wie zum Beispiel der Zelle eines Säugers, erhalten werden. Somit können die unter Verwendung von zum Beispiel der AZ3B cDNA-Sequenz nachgewiesenen Nucleinsäuren von einem Menschen, einer Maus, einer Ratte, einem Meerschweinchen, einer Kuh, einem Schaf, einem Pferd, einem Schwein, einem Kaninchen, einem Affen, einem Hund oder einer Katze stammen.
Sobald sie nachgewiesen sind, können die Nucleinsäuren durch eine von etlichen Standardtechniken (siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) isoliert werden.
Die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren können auch als Sonden verwendet werden, um biologische Gewebe oder Zellen zu identifizieren, die Gene exprimieren, die den erfindungsgemäßen G Protein-gekoppelten Rezeptor kodieren. Zellen, die diesen Rezeptor exprimieren, können durch Standardtechniken, wie zum Beispiel Northern-Blot oder RNAse-Protection-Analysen identifiziert werden. Die Genexpression kann durch das Durchführen von in-situ-Hybridisierung genauer auf bestimmte Zellen innerhalb eines Gewebes lokalisiert werden. Die Expression dieser Nucleinsäuren kann verwendet werden, um neurologische Erkrankungen zu diagnostizieren, insbesondere die Alzheimer-Krankheit und entzündliche Erkrankungen wie zum Beispiel Asthma, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung, cystische Fibrose, Sinusitis, Rhinitis, Atherosklerose, Glomerulonephritis, multiple Sklerose, Psoriasis und entzündliche Darmerkrankung.
Expression von AZ3B und AZ3B-ähnlichen Genprodukten
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren können in Vektoren, wie zum Beispiel Plasmid- oder Virusvektoren, eingefügt werden, was die Expression der Inserts erleichtert. Das exprimierte Polypeptid kann direkt als therapeutisches Mittel verwendet werden, oder es kann verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die wiederum therapeutisch nützlich sind. Demgemäß gehören Expressionsvektoren, welche die erfindungsgemäße Nucleinsäure enthalten, Zellen, die mit diesen Vektoren transfiziert sind, die exprimierten Polypeptide und Antikörper, die entweder gegen das ganze Polypeptid oder ein antigenes Fragment davon erzeugt werden, zu den bevorzugten Ausführungsformen.
Somit bedeutet, wie hierin verwendet, der Begriff „transfizierte Zelle" jede Zelle, in die (oder in deren Vorfahr) eine Nucleinsäure, die ein AZ36-ähnliches Polypeptid, d. h. einen G Protein-gekoppelten Rezeptor mit einer vergrößerten extrazellulären Schleife zwischen der vierten und fünften Transmembrandomäne, kodiert, mittels rekombinanter DNA-Techniken eingeführt worden ist.
Wie auf dem Fachgebiet wohlbekannt ist, kann eine Transfektion durch Expressionsvektoren vermittelt werden, die regulatorische Elemente, wie zum Beispiel Promotoren und/oder Enhancer enthalten, welche die Transkription der eingefügten Nucleinsäure in der Zelle erleichtern, Replikationsursprünge und andere Gene, wie zum Beispiel das Gen für Neomycinresistenz, das einen selektierbaren Marker kodiert, der Zellen, in denen er exprimiert wird, Resistenz gegen G418 verleiht und somit eine phänotypische Selektion der transfizierten Zellen gestattet. Fachleute könnten leicht bestimmen, ob ein regulatorisches Element zur Verwendung in einem vorgegebenen experimentellen Zusammenhang geeignet ist.
Im Allgemeinen können die erfindungsgemäßen Polypeptide durch Transfizieren geeigneter Wirtszellen mit der ensprechenden cDNA in einem geeigneten Expressionsvehikel hergestellt werden. Jedes von einer großen Vielfalt von Expressionssystemen kann verwendet werden; die genaue Wirtszelle ist nicht entscheidend. Zum Beispiel können G Protein-gekoppelte Rezeptoren, wie zum Beispiel der durch AZ3B kodierte Rezeptor, in einem prokaryotischen Wirt, wie zum Beispiel dem Bakterium E. coli, oder in einem eukaryotischen Wirt, wie zum Beispiel in einer Insektenzelle (zum Beispiel Sf21-Zellen) oder in Säugerzellen (z. B. COS-Zellen, NIH 3T3-Zellen oder HeLa-Zellen) hergestellt werden. Diese Zellen sind aus vielen Quellen, einschließlich der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhältlich.
Transkfektionsverfahren werden von Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1994) beschrieben und Expressionsvehikel können aus den allgemein bekannten, wie zum Beispiel den in Cloning Vectors: A Laboratory Manual (P. H. Pouwels et al., 1985, Erg. 1987) beschriebenen, gewählt werden.
Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Vektoren schließen auf T7 beruhende Vektoren zur Verwendung in Bakterien (siehe zum Beispiel Rosenberg et al., Gene 56: 125, 1987), den Expressionsvektor pMSXND zur Verwendung in Säugerzellen (Lee und Nathans, J. Biol. Chem. 263: 3521, 1988) und von Baculovirus abgeleitete Vektoren (zum Beispiel den Expressionsvektor pBacPAK9 von Clontech, Palo Alto, CA) zur Verwendung in Insektenzellen ein. Die Nucleinsäuren in derartigen Vektoren sind mit einem Promotor funktionell verbunden, der zum Beispiel beruhend auf dem Zelltyp ausgewählt ist, in dem Expression angestrebt wird. Zum Beispiel kann ein T7-Promotor in Bakterien verwendet werden, ein Polyhedrin-Promotor kann in Insektenzellen verwendet werden und ein Cytomegalovirus- oder Metallothionein-Promotor kann in Säugerzellen verwendet werden. Im Falle höherer Eukaryoten sind auch gewebespezifische und zelltypspezifische Promotoren erhältlich. Diese Promotoren werden wegen ihrer Fähigkeit, die Expression einer Nucleinsäure in einem vorgegebenen Gewebe oder Zelltyp innerhalb des Körpers zu steuern, so genannt. Fachleute haben Kenntnis von zahlreichen Promotoren und anderen regulatorischen Elementen, die verwendet werden können, um die Expression von Nucleinsäuren zu steuern.
Virusvektoren, die in der Erfindung verwendet werden können, schließen zum Beispiel Retrovirus-, Adenovirus- und mit Adenovirus assoziierte Vektoren, Vektoren aus Herpesvirus, Simian Virus 40 (SV40) und Rinderpapillomavirus ein (siehe zum Beispiel Gluzman (Hrsg.), Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Vorzugsweise handelt es sich bei dem Virus um ein Retrovirus.
Wie hierin verwendet bedeuten sowohl „Protein" als auch „Polypeptid" eine Kette von Aminosäureresten, unabhängig von Länge oder posttranslationaler Modifikation (z. B. Glycosylierung oder Phosphorylierung). Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden als „im Wesentlichen rein" bezeichnet, was bedeutet, dass sie mindestens 60 Gew.-% (Trockengewicht) des Polypeptids von Interesse ausmachen, z. B. eines Polypeptids, das die Aminosäuresequenz von AZ3B enthält. Vorzugsweise macht das Polypeptid mindestens 75 Gew.-%, stärker bevorzugt mindestens 90 Gew.-% und am stärksten bevorzugt mindestens 99 Gew.-% des Polypeptids von Interesse aus. Die Reinheit kann durch jedes geeignete Standardverfahren, Z. B. Säulenchromatographie, Polyacrylamidgelelektrophorese oder HPLC-Analyse gemessen werden. Bei dem Polypeptid kann es sich um ein natürlich vorkommendes, synthetisches oder rekombinantes Molekül handeln, das aus einem Hybrid mit einem Anteil, der zum Beispiel durch das ganze oder einen Teil des AZ3B Nucleinsäuremoleküls kodiert wird, und einem zweiten Anteil, der durch das ganze oder einen Teil eines zweiten Gens kodiert wird, besteht. Zum Beispiel kann das AZ3B Polypeptid an ein Hexahistidinanhängsel, um die Reinigung von bakteriell exprimiertem Protein zu erleichtern, oder an ein Hämagglutinin-Anhängsel, um die Reinigung von in eukaryotischen Zellen exprimiertem Protein zu erleichtern, fusioniert sein.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch chemisch synthetisiert werden (dieser Ansatz kann auf Polypeptide beschränkt sein, die ein kleines Fragment des G Protein-gekoppelten Rezeptors ausmachen), oder sie können gemäß biochemischen Standard-Reinigungsverfahren aus Geweben gereinigt werden, in denen sie natürlicherweise exprimiert werden.
Auch in der Erfindung eingeschlossen sind „funktionelle Polypeptide", die eine oder mehrere der biologischen Funktionen oder Aktivitäten des erfindungsgemäßen G Protein-gekoppelten Rezeptors besitzen. Diese Funktionen oder Aktivitäten werden nachstehend ausführlich beschrieben und umfassen biologische, morphologische oder phänotypische Änderungen in der Zelle. Ein funktionelles Polypeptid wird auch innerhalb des Umfangs der Erfindung in Betracht gezogen, falls es als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern dient, die spezifisch an den Rezeptor binden. Es gehört durchaus zu den Fähigkeiten von Fachleuten zu bestimmen, ob ein Polypeptid, unabhängig von der Größe, eine Funktion oder Aktivität des erfindungsgemäßen G Protein-gekoppelten Rezeptors beibehält. Die funktionellen Polypeptide können eine Modifikation der primären Aminosäuresequenz enthalten. Vorzugsweise bestehen diese Modifikationen aus konservativen Aminosäuresubstitutionen. Eine Sequenz, die konservative Aminosäuresubstitutionen enthält, unterscheidet sich von SEQ ID NO: 2 nur durch Substitutionen von einer Aminosäure durch eine andere derselben Klasse (zum Beispiel Substitution einer hydrophoben Aminosäure, wie zum Beispiel Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, durch eine andere; Substitution einer polaren Aminosäure durch eine andere, wie zum Beispiel Substitution von Arginin durch Lysin, Glutaminsäure durch Asparaginsäure oder Glutamin durch Asparagin). Substitutionen können das Ergebnis einer absichtlichen Manipulation der Sequenz, zum Beispiel durch ortsspezifische Mutagenese, sein oder sie können spontan auftreten. Auch eingeschlossen sind Additionen oder Deletionen von Aminosäureresten und nicht konservative Aminosäuresubstitutionen, vorausgesetzt, dass das Polypeptid mindestens eine Aktivität oder ein Epitop beibehält, die bzw. das für den erfindungsgemäßen G Protein-gekoppelten Rezeptor spezifisch ist. Zum Beispiel sind Polypeptide, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste von SEQ ID NO: 2 deletiert worden sind, eingeschlossen, so lange das Polypeptid zum Beispiel die Freisetzung von Histamin aus Basophilen oder Mastzellen in einem Ausmaß vermittelt, das mit dem des Polypeptids voller Länge vergleichbar ist. Die Gesamtgröße des Polypeptids ist irrelevant.
Herstellung von Antikörpern
Antikörper, wie zum Beispiel diejenigen, die in den vorstehend beschriebenen Kaninchen- und Maus-Antiseren enthalten sind („polyklonale Antikörper"), befinden sich auch innerhalb des Umfangs der Erfindung. Um Antikörper zu erzeugen, die spezifisch an den erfindungsgemäßen G Protein-gekoppelten Rezeptor binden, können die den
Rezeptor kodierenden Sequenzen voller Länge oder kann ein Teilstück der Sequenz davon als C-terminale Fusionsmoleküle mit Glutathion S-Transferase exprimiert werden (wie vorstehend beschrieben, siehe auch Smith et al., Gene 67: 31–40, 1988). Das Fusionsprotein, das einer vorhergesagten Größe entsprechen sollte, kann dann mit Glutathion-Sepharose-Kugeln gereinigt, mit Glutathion eluiert, auf Wunsch mit Thrombin (an einer gentechnisch erzeugten Spaltungsstelle) gespalten und bis zu dem Grad gereinigt werden, der zur Immunisierung von Kaninchen oder Mäusen notwendig ist.
Primäre Immunisierungen werden typischerweise in vollständigem Freund'schem Adjuvans durchgeführt und anschließende Immunisierungen („Auffrischungen") in unvollständigem Freund'schem Adjuvans verabreicht. Antikörpertiter werden durch Western-Blot- und Immunpräzipitations-Analysen unter Verwendung des Rezeptorproteinfragments des Fusionsproteins AZ3B-GST überwacht. Immunseren werden unter Verwendung von CNBr-Sepharose-gekoppelten Rezeptorproteinen affinitätsgereinigt. Die Spezifität des Antiserums kann unter Verwendung einer Palette nicht verwandter GST Fusionsproteine (wie zum Beispiel GST-p53) und GST-Trypsin (die durch PCR unter Verwendung veröffentlichter Sequenzen erzeugt werden können) bestimmt werden.
Alternativ dazu können monoklonale Antikörper unter Verwendung des hierin beschriebenen G Protein-gekoppelten Rezeptors oder eines Fragments davon und Standard-Hybridomtechnologie (siehe z. B. Kohler et al., Nature 256: 495, 1975; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511, 1976; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292, 1976; Hammerline et al., In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, New York, NY, 1981) hergestellt werden. Sobald sie hergestellt worden sind, können monoklonale Antikörper durch Western-Blot- oder Immunpräzipitations-Analysen auf ihre Fähigkeit hin getestet werden, den G Protein-gekoppelten Rezeptor spezifisch zu binden. Antikörper, die den erfindungsgemäßen Rezeptor spezifisch erkennen, werden zum Beispiel beim Bestimmen der Verteilung des Rezeptors in verschiedenen Geweben als nützlich betrachtet, um therapeutische Mittel abzuschätzen, die spezifisch mit dem Rezeptor in Wechselwirkung treten, einschließlich des natürlich vorkommenden Liganden des Rezeptors, und um den relativen Differenzierungszustand verschiedener Zellen zu bestimmen, die den erfindungsgemäßen G Protein-gekoppelten Rezeptor exprimieren.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen intakten monoklonalen und polyklonalen Antikörpern präsentiert die Erfindung verschiedene gentechnisch erzeugte Antikörper, humanisierte Antikörper und Fragmente von Immunglobulinmolekülen, wie zum Beispiel Fab-, Fab'-, (Fab')₂-, Fv- und SCA-Fragmente, die fähig sind, an ein Epitop eines AZ3B oder AZ3B-ähnlichen Polypeptids zu binden. Diese Antikörperfragmente, die eine gewisse Fähigkeit des Antikörpers, von dem sie abgeleitet sind, selektiv an das Antigen (z. B. ein AZ3B-Antigen) zu binden, beibehalten, können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren (siehe z. B. Harlow und Lane, vorstehend) hergestellt werden und werden im Folgenden weiter beschrieben.

(1) Ein Fab-Fragment besteht aus einem monovalenten Antigen-bindenden Fragment eines Antikörpermoleküls und kann durch Verdauung eines ganzen Antikörpermoleküls mit dem Enzym Papain hergestellt werden, um ein Fragment zu ergeben, das aus einer intakten leichten Kette und einem Anteil einer schweren Kette besteht.
(2) Ein Fab'-Fragment eines Antikörpermoleküls kann durch Behandeln eines ganzen Antikörpermoleküls mit Pepsin, gefolgt von Reduktion, erhalten werden, um ein Molekül zu ergeben, das aus einer intakten leichten Kette und einem Anteil einer schweren Kette besteht. Pro Antikörpermolekül, das auf diese Weise behandelt wird, werden zwei Fab'-Fragmente erhalten.
(3) Ein (Fab')₂-Fragment eines Antikörpers kann durch Behandeln eines ganzen Antikörpermoleküls mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion erhalten werden. Ein (Fab')₂-Fragment ist ein Dimer aus zwei Fab'-Fragmenten, die durch zwei Disulfidbindungen zusammengehalten werden.
(4) Ein Fv-Fragment ist als gentechnisch hergestelltes Fragment definiert, das die variable Region einer leichten Kette und die variable Region einer schweren Kette enthält, die als zwei Ketten exprimiert werden.
(5) Ein Einketten-Antikörper („SCA") ist ein gentechnisch hergestelltes einzelkettiges Molekül, das die variable Region einer leichten Kette und die variable Region einer schweren Kette enthält, die durch einen geeigneten, flexiblen Polypeptidlinker verbunden sind.

Insbesondere präsentiert die Erfindung „neutralisierende" Antikörper. Mit „neutralisierenden” Antikörpern sind Antikörper gemeint, die eine der biologischen Aktivitäten des erfindungsgemäßen G Protein-gekoppelten Rezeptors stören. Diese Aktivitäten schließen Induktion der Kontraktion glatter Muskulatur, Induktion einer Histaminfreisetzung und Erhöhen der vaskulären Permeabilität ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise wird eine oder mehrere dieser Aktivitäten um mindestens 50%, stärker bevorzugt um mindestens 70% und am stärksten bevorzugt um mindestens 90% verringert. Vorzugsweise stört der neutralisierende Antikörper die Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und dem Liganden, an den er natürlicherweise bindet.
Antikörper können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren humanisiert werden. Zum Beispiel können monoklonale Antikörper mit einer gewünschten Bindungsspezifität kommerziell humanisiert werden (Scotgene, Schottland; Oxford Molecular, Palo Alto, CA). Vollständig menschliche Antikörper, wie zum Beispiel diejenigen, die in transgenen Tieren exprimiert werden, sind auch Merkmale der Erfindung (Green et al., Nature Genetics 7: 13–21, 1994; siehe auch US-Patente 5,545,806 und 5,569,825 ).
Fachleute können beim Herstellen verschiedener Antikörper oder Antikörperfragmente Anleitung aus den folgenden Veröffentlichungen erhalten. Ladner beschreibt Verfahren zum Herstellen von Antikörpern mit einer einzelnen Polypeptidkette ( US-Patente 4,946,778 und 4,704,692 ); Ward et al. beschreiben die Herstellung von als „Einzeldomänenantikörper" bezeichneten variablen Domänen der schweren Kette, die hohe Antigen-bindende Affinitäten haben (Nature 341: 544–546, 1989); McCafferty et al. zeigen, dass vollständige Antikörper V-Domänen auf der Oberfläche von fd-Bakteriophagen, die spezifisch an Antigen binden, präsentiert werden können und dass seltene Phagen (einer in einer Million) nach Affinitätschromatographie isoliert werden können (Nature 348: 552–554, 1990); Boss et al. beschreiben verschiedene Verfahren zum Herstellen von Immunglobulinen und immunologisch funktionellen Fragmenten davon, die mindestens die variable Domäne der schweren und leichten Kette einschließen, in einer einzelnen Wirtszelle ( US-Patent 4,816,397 ) und Cabilly et al. beschreiben Verfahren zum Herstellen chimärer Antikörper ( US-Patent 4,816,567 ).
Ferner kann der Antiköper an ein Immunotoxin konjugiert werden.
Man sagt, dass die Mitglieder eines Molekülpaares (z. B. eines Antikörper-Antigen-Paares) aneinander „spezifisch binden", falls sie mit höherer Affinität aneinander binden als an andere, unspezifische Moleküle. Zum Beispiel kann ein Antikörper, der gegen ein Antigen erzeugt worden ist, an das er effizienter bindet als an ein unspezifisches Protein, als spezifisch an das Antigen bindend beschrieben werden. (Auf ähnliche Weise kann eine Nucleinsäuresonde als spezifisch an ein Nucleinsäureziel bindend beschrieben werden, falls sie durch Basenpaarungswechselwirkungen einen spezifischen Duplex mit dem Zielmolekül bildet (siehe vorstehend).)
Verwendung der vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren, Polypeptide und Antikörper bei der Diagnose und Behandlung von entzündlichen Erkrankungen, neurologischen Erkrankungen und Fettleibigkeit
Es ist bestimmt worden, dass C3a den hierin beschriebenen Rezeptor bindet (Crass et al., Eur. J. Immunol. 26: 1944–1950, 1996; Ames et al., J. Biol. Chem. 271: 20231–20234, 1996). C3a wird (zusammen mit C4a und C5a) früh im Vorgang einer entzündlichen Reaktion freigesetzt, wenn das Komplementsystem aktiviert wird. Bei diesen drei Molekülen handelt es sich um starke proinflammatorische Moleküle. Sie helfen bei der Rekrutierung und Aktivierung von Leukozyten, die fremde Organismen eliminieren und dabei helfen, die Homöostase aufrechtzuerhalten. Von C3a ist bekannt, dass es eine Vielzahl entzündlicher Reaktionen, einschließlich Kontraktion glatter Muskulatur, Erhöhung der vaskulären Permeabilität, Chemotaxis von Eosinophilen, Induktion des oxidativen Bursts bei Neutrophilen und Eosinophilen und Histaminfreisetzung von IL3-behandelten Basophilen und Mastzellen von Ratten vermittelt (für eine Übersicht siehe Hugli, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 153: 181, 1990; Kohl et al. (Hrsg.), Complement in Health and Disease, Kluwer Academic Publishers, Lancaster, 1993). Zusätzlich ist festgestellt worden, dass es sich bei einem ursprünglich als „Acylierung stimulierender Faktor^„ bezeichneten Faktor, der menschliche Adipozyten und Hautfibroblasten aktiviert, um C3a handelt (Saldo et al., J. Chin. Invest. 92: 1543–1547, 1993; Cianflone et al., J. Biol. Chem. 264: 426–430, 1989). Dies bedeutet eine Expression des C3aR (d. h. des C3a-Rezeptors) im Fettgewebe und somit ein potenzielles Mittel, die Reaktion dieser Zellen auf C3a zu verändern, was sich wiederum als hilfreich beim Behandeln von fettleibigen Individuen erweisen kann.
Die Beziehung zwischen den Rezeptoren proentzündlicher Moleküle, besonders des C3aR und des C5aR, wie nachstehend in Tabelle 2 gezeigt wird, wurde durch Crass et al. bestätigt, die zu dem Schluss kamen, dass ihr Experiment „den C3aR als G Protein-gekoppelten Rezeptor identifiziert und seine Verwandtschaft mit den C5a- und fMLP-Rezeptoren unterstreicht".
Zahlreiche Wege zum Verändern der Expression oder Aktivität des C3aR sind dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel können lebende Zellen in vivo mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen transfiziert (oder in vitro transfiziert und anschließend an den Patienten verabreicht) werden. Zum Beispiel können Zellen durch Standardverfahren, die Liposom-, Polybren- oder DEAE Dextran-vermittelte Transfektion (siehe z. B. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413, 1987; Ono et al., Neurosci. Lett. 117: 259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298: 278, 1989), Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 7: 841, 1980), Calciumphosphat-Präzipitation (Graham et al., Virology 52: 456, 1973; Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Felgner et al., vorstehend), Mikroinjektion (Wolff et al., Science 247: 1465, 1990) oder geschwindigkeitsangetriebene Mikroprojektile („Biolistik") einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind, mit Plasmidvektoren transfiziert werden. Diese Verfahren können eingesetzt werden, um eine therapeutische Anwendung der erfindungsgemäßen Moleküle zu vermitteln. Zum Beispiel können Antisense-Nucleinsäuren verabreicht werden, um die Gentranskription zu hemmen; ohne Expression des Rezeptors selbst würde der C3a-Ligand, selbst wenn er im Überfluss vorhanden wäre, die vorstehend beschriebenen ungünstigen Reaktionen nicht hervorrufen (z. B. Kontraktion der glatten Muskulatur und der Luftwege, erhöhte vaskuläre Permeabilität und Freisetzung von Histamin). Verfahren zum Gestalten von Antisense-Nucleinsäuren und zu ihrem Einführen in Wirtszellen sind zum Beispiel in Weinberg et al. ( US-Patent 4,740,463 ) beschrieben worden. Alternativ dazu können Nucleinsäuren verabreicht werden, so dass eine Expression des Rezeptors in Geweben vorkommt, wo er normalerweise nicht exprimiert wird, oder in Geweben verstärkt wird, wo er normalerweise exprimiert wird. Diese Anwendung kann zum Beispiel verwendet werden, um Phagozytose zu stimulieren (d. h. um die Infiltration phagozytischer Zellen in ein Gewebe, wie zum Beispiel einen Tumor, zu verstärken). Vorzugsweise wird die therapeutische Nucleinsäure (oder das rekombinante Nucleinsäurekonstrukt) an der Stelle der Malignität oder Entzündung, auf das Gewebe in der weiteren Nachbarschaft einer Malignität oder Entzündung oder auf die Blutgefäße, die diese Gebiete versorgen, angewendet.
Idealerweise wird die Herstellung von AZ3B oder ähnlichen G Protein-gekoppelten Rezeptoren (d. h. G Protein-gekoppelten Rezeptoren mit einer vergrößerten extrazellulären Schleife zwischen der vierten und fünften extrazellulären Domäne) durch einen hierin beschriebenen Gentherapieansatz zu einem zellulären Rezeptorexpressionsspiegel führen, der dem normalen, zellulären Expressionsspiegel dieser Gene mindestens äquivalent ist. Fachleute werden erkennen, dass diese Therapien in Kombination mit traditionelleren Therapien, wie zum Beispiel Chirurgie, Strahlentherapie oder Chemotherapie, verwendet werden können.
Die Erfindung kann zum Herstellen eines Medikaments zum Behandeln eines Patienten, der eine Erkrankung oder ein Leiden hat, das durch einen G Proteingekoppelten Rezeptor mit einer vergrößerten extrazellulären Schleife zwischen der vierten und fünften Transmembrandomäne vermittelt wird, durch Verabreichen eines Reagens an den Patienten, das die Aktivität des Rezeptors moduliert, verwendet werden. Demgemäß präsentiert die Erfindung therapeutische Zusammensetzungen, welche dieses Reagens enthalten. Wie hierin beschrieben kann das Reagens aus einer Nucleinsäure, vorzugsweise einer „Antisense"-Nucleinsäure, oder aus einem Antikörper, einschließlich jeder der hierin beschriebenen Antikörperarten, bestehen. Andere nützliche Reagenzien schließen Moleküle ein, die an den Rezeptor binden, aber kein Signal über die Zellmembran hinweg übermitteln, in der sich der Rezeptor befindet. Das Reagens kann mit dem natürlichen Liganden des Rezeptors kompetieren (und dadurch eine Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und dem natürlichen Liganden verringern oder verhindern) oder es kann direkter mit dem natürlichen Liganden in Wechselwirkung treten, zum Beispiel während der Ligand sich innerhalb des Kreislaufsystems bewegt, auf eine derartige Weise, dass der Ligand den Rezeptor nicht so wirksam bindet, wie er es sonst (in Abwesenheit des Reagens) tun würde. Das Reagens kann auch die Aktivität des Rezeptors durch Verändern der Ereignisse modulieren, die stattfinden, nachdem der Rezeptor gebunden ist. Das Reagens kann zum Beispiel die Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und dem G Protein, mit dem er natürlicherweise in Wechselwirkung tritt, verändern oder die in den intrazellulären Domänen des Rezeptors vorliegenden Phosphorylierungsstellen verändern.
Von einer Erkrankung oder einem Leiden sagt man, dass sie bzw. es durch einen erfindungsgemäßen Rezeptor vermittelt wird, falls die mit ihr bzw. ihm assoziierten Symptome durch Binden des Rezeptors verursacht oder verschlimmert werden. Das Binden des Rezeptors muss nicht das anfängliche oder primäre Ereignis bei der Entwicklung der Erkrankung oder des Leidens sein. Es gehört durchaus zu den Fähigkeiten von Fachleuten zu bestimmen, ob eine Erkrankung oder ein Leiden durch ein bestimmtes zelluläres Ereignis vermittelt wird. Die Erkrankungen, die gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren behandelt werden können, schließen entzündliche Erkrankungen, wie zum Beispiel Asthma, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung, cystische Fibrose, Sinusitis, Rhinitis, Atherosklerose, Glomerulonephritis, multiple Sklerose und entzündliche Darmerkrankung ein. Bei der Erkrankung kann es sich auch um eine neurologische Erkrankung, wie zum Beispiel die Alzheimer-Krankheit, handeln. Zusätzlich kann das vorstehend beschriebene Verfahren bei der Behandlung von Fettleibigkeit angewendet werden. Wie hierin beschrieben können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren, Polypeptide und Antikörper auch bei der Diagnose dieser Erkrankungen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen können auch einen Träger oder Exzipienten enthalten, von denen Fachleuten viele bekannt sind. Exzipienten, die verwendet werden können, schließen Puffer (zum Beispiel Citratpuffer, Phosphatpuffer, Acetatpuffer und Bicarbonatpuffer), Aminosäuren, Harnstoff, Alkohole, Ascorbinsäure, Phospholipide, Proteine (zum Beispiel Serumalbumin), EDTA, Natriumchlorid, Liposomen, Mannitol, Sorbitol und Glycerin ein. Die erfindungsgemäßen Polypeptide oder Antikörper können auf jedem Standard-Verabreichungsweg einschließlich intraperitonealer, intramuskulärer, subkutaner oder intravenöser Verabreichung verabreicht werden. Es wird erwartet, dass der bevorzugte Verabreichungsweg intravenös sein wird.
Auf dem medizinischen Fachgebiet ist wohlbekannt, dass Dosierungen für jeden einzelnen Patienten von vielen Faktoren, einschließlich der allgemeinen Gesundheit, dem Geschlecht, dem Gewicht, der Körperoberfläche und dem Alter des Patienten, sowie von der bestimmten zu verabreichenden Verbindung, der Verabreichungszeit und dem Verabreichungsweg und von anderen gleichzeitig verabreichten Medikamenten abhängen.
Dosierungen für die erfindungsgemäßen Polypeptide und Antikörper werden variieren, aber eine bevorzugte Dosierung für eine intravenöse Verabreichung beträgt ungefähr 0,01 mg bis 100 mg/ml Blutvolumen. Eine Bestimmung der korrekten Dosierung innerhalb eines vorgegebenen therapeutischen Regimes gehört durchaus zu den Fähigkeiten eines Fachmanns auf dem Gebiet der Pharmakologie. Fachleuten wird bei ihrer Bestimmung einer adäquaten Dosierung durch frühere Untersuchungen geholfen. Zum Beispiel verabreichten Abraham et al. (J. Amer. Med. Assoc. 273: 934–941, 1995) TNF-α monoklonale Antikörper (TNF-α-MAb) in Dosen, die von 1 bis 15 mg/kg reichen. Der Antikörper wurde von allen Patienten gut toleriert, obwohl sie menschliche anti-Maus-Antikörper entwickelten; es entwickelten sich keine der Serumkrankheit ähnlichen Reaktionen, ungünstigen Hautreaktionen oder systemischen allergischen Reaktionen. Auf ähnliche Weise verabreichten Rankin et al. (Br. J. Rheumatol. 34: 334–342, 1995) eine einzelne intravenöse Dosis von 0,1, 1,0 oder 10 mg/kg eines gentechnisch hergestellten menschlichen Antikörpers, CDP571, der menschliches TNF-α neutralisiert. Beide Untersuchungen beschreiben ausführlich, wie man Patienten auswertet, die mit Antikörpern behandelt worden sind.
Identifizierung und Verabreichung von Verbindungen, welche die Aktivität von G Proteingekoppelten Rezeptoren mit vergrößerten extrazellulären Domänen modulieren
Die vorstehend beschriebene Isolierung von Nucleinsäuremolekülen (d. h. von denjenigen, die einen G Protein-gekoppelten Rezeptor mit einer vergrößerten extrazellulären Schleife zwischen der vierten und fünften extrazellulären Domäne kodieren) erleichtert auch die Identifizierung von Verbindungen, welche die Expression dieser Gene in vivo erhöhen oder senken können. Viele quantitative Standard-Genexpressionsassays können bei dieser Ausführungsform der Erfindung benutzt werden. Einige Beispiele für diese Assays werden nachstehend bereitgestellt.
Um Verbindungen zu identifizieren, welche die Expression von AZ3B (oder homologen Genen) modulieren, kann die Kandidatenverbindung (bei der es sich entweder um eine reine Verbindung oder einen Teil eines Gemisches handelt) in variierenden Konzentrationen zu dem Kulturmedium von Zellen gegeben werden, die den durch AZ3B (oder dessen Homolog) kodierten Rezeptor exprimieren. Die Expression von AZ3B wird dann zum Beispiel durch Northern-Blot-Analyse unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls als Sonde gemessen. Die Bildung von Duplexen aus der Sonde und den Zielsequenzen ist vorstehend beschrieben worden. Der Expressionsspiegel von AZ3B in Anwesenheit des Kandidatenmoleküls im Vergleich zum Expressionsspiegel in seiner Abwesenheit zeigt an, ob das Kandidatenmolekül die Expression von AZ3B beeinflusst oder nicht.
Alternativ dazu kann die Wirkung des Kandidatenmoleküls durch Messen des Proteinspiegels von AZ3B auf der Translationsebene abgeschätzt werden. Dies kann zum Beispiel durch Western-Blot Analyse oder Immunpräzipitation mit einem Antikörper durchgeführt werden, der den durch AZ3B kodierten G Protein-gekoppelten Rezeptor spezifisch bindet.
Falls es sich bei der modulatorischen Verbindung um eine hemmende Verbindung handelt, kann sie durch Kompetieren mit dem Liganden C3a um die beschränkte Anzahl von Rezeptoren auf der Zelloberfläche wirken. Diese Verbindungen können zum Beispiel durch Untersuchen der Bindung des Liganden C3a an den Rezeptor in Anwesenheit und Abwesenheit der Kandidatenverbindung identifiziert werden. Eine Verbindung, welche die Wechselwirkung unterbricht, die normalerweise zwischen C3a und dem erfindungsgemäßen G Protein-gekoppelten Rezeptor stattfindet, kann besonders nützlich beim Hemmen der Entzündung sein, die nach einer Komplementaktivierung stattfindet. Modulatorische Verbindungen, welche die Expression oder Aktivität des Rezeptors hemmen, können auch den Schweregrad oder die Häufigkeit asthmatischer Reaktionen, chronisch-obstruktiver Lungenerkrankungen, Bronchiektasen, Sinusitiden, Rhinitiden, cystischer Fibrosen und entzündlicher Darmerkrankungen, wie zum Beispiel Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, verringern.
Die vorstehend beschriebenen Kandidaten für modulatorische Moleküle können gereinigt, im Wesentlichen gereinigt werden, oder als ein Bestandteil eines Verbindungsgemisches (z. B. als Extrakt oder als von einer Zellkultur erhaltener Überstand) verbleiben. In einem Assay gemischter Verbindungen kann die Expression von AZ3B (entweder auf der mRNA- oder der Proteinebene) gegen fortschreitend kleinere Untergruppen des Pools von Kandidatenverbindungen getestet werden. Diese Untergruppen können zum Beispiel durch Standard-Reinigungstechniken, wie zum Beispiel HPLC oder FPLC, hergestellt werden, bis demonstriert wird, dass eine einzelne Verbindung oder eine minimale Gruppe von Verbindungen die Expression von AZ3B moduliert.
Alternativ dazu oder zusätzlich können modulatorische Kandidatenverbindungen durch Abschätzen ihrer Fähigkeit durchgemustert werden, eines der zellulären Ereignisse, die stattfinden, wenn der erfindungsgemäße G Protein-gekoppelte Rezeptor durch C3a gebunden wird, zu modulieren. Beispiele für diese Ereignisse schließen die Chemotaxis von Eosinophilen und die Freisetzung von Histamin aus Basophilen oder Mastzel len ein. Die chemotaktische Aktivität oder Histaminfreisetzung wird einfach in einem Standardassay in Anwesenheit und Abwesenheit der Kandidatenverbindung verglichen.
Kandidaten für modulatorische Verbindungen schließen Polypeptidmoleküle und Moleküle, bei denen es sich nicht um Polypeptide handelt, wie zum Beispiel diejenigen, die in Zellextrakten, Säugerserum, Wachstumsmedium, in dem man Säugerzellen hat wachsen lassen, oder synthetische Verbindungen ein. Sie schließen auch Nucleinsäuren ein, die aus einer AZ3B „Antisense"-Sequenz bestehen.
Modulatorische Verbindungen können mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittelträger oder Exzipienten gemäß herkömmlicher pharmazeutischer Praxis verabreicht werden und jeder geeignete Verabreichungsweg kann eingesetzt werden. Die Verabreichung kann zum Beispiel parenteral, intravenös, subkutan, intramuskulär, intrakranial, intraorbital, ophthalmisch, intraventrikulär, intrakapsulär, intraspinal, intracisternal, intraperitoneal, transmucosal oder oral sein. Die modulatorische Verbindung kann auf verschiedene Weisen gemäß dem entsprechenden Verabreichungsweg formuliert werden. Zum Beispiel können flüssige Lösungen zur Einnahme oder Injektion hergestellt werden; Gele oder Pulver können zur Einnahme, Inhalation oder topischen Anwendung hergestellt werden. Verfahren zum Herstellen derartiger Formulierungen sind wohlbekannt und können zum Beispiel in „Remington's Pharmaceutical Sciences" gefunden werden.
Transgene Tiere
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung nicht menschliche, transgene Tiere mit Zellen, die einen G Protein-gekoppelten Rezeptor mit einer vergrößerten extrazellulären Schleife zwischen der vierten und fünften Transmembrandomäne exprimieren. Besonders bevorzugt werden Tiere, die den in 1 gezeigten Rezeptor exprimieren. Derartige transgene Tiere stellen ein Modellsystem zur Untersuchung von Leiden oder Erkrankungen dar, die durch Binden des Rezeptors verursacht oder verschlechtert werden, und für die Entwicklung von therapeutischen Mitteln, welche die Aktivität des Rezeptors modulieren. Die erfindungsgemäßen transgenen Tiere können aus Tieren hergestellt werden, die den erfindungsgemäßen Rezeptor exprimieren, oder aus „Knockout"-Tieren, die den Rezeptor nicht exprimieren. Zum Beispiel können zuerst Knockout-Mäuse, die das Maushomolog des durch AZ3B (SEQ ID NO: 1) kodierten Rezeptors nicht exprimieren, erzeugt werden und Tiere von dieser Linie können weiter manipuliert werden, um das menschliche Homolog des Rezeptors zu exprimieren (durch „Gen-Knockout" erzeugte Tiere werden nachstehend weiter beschrieben). Die Expression des menschlichen Homologs kann durch Verwendung von gewebe- oder zelltypspezifischen regulatorischen Elementen in bestimmte Gewebe oder Zelltypen gesteuert werden. Viele derartige Elemente sind Fachleuten bekannt.
In diesem Zusammenhang bezeichnet der Begriff „Tier" alle Säuger außer Homo sapiens. Nutztiere (Schweine, Ziegen, Schafe, Kühe, Pferde, Kaninchen und dergleichen), Nagetiere (wie zum Beispiel Ratten, Meerschweinchen und Mäuse) und Haustiere (zum Beispiel Hunde und Katzen) befinden sich innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Mit „transgenem Tier" ist jedes Tier gemeint, das Zellen enthält, die eine genetische Information tragen, die direkt oder indirekt durch absichtliche genetische Manipulation auf der subzellulären Ebene erhalten wurde, wie zum Beispiel durch Mikroinjektion oder durch Infektion mit einem rekombinanten Virus erhaltene DNA. Somit handelt es sich bei erfindungsgemäßen Tieren um diejenigen mit einer oder mehreren Zellen, die ein rekombinantes DNA-Molekül enthalten. Es wird stark bevorzugt, dass dieses Molekül mit den Chromosomen des Tierers integriert wird, aber die Verwendung von DNA-Sequenzen, die extrachromosomal replizieren, zum Beispiel solche, die in künstliche Hefechromosomen eingebaut werden könnten, wird auch in Betracht gezogen.
Der Begriff „transgenes Tier" schließt auch Tiere ein, bei denen die genetische Information aufgenommen worden und in eine Keimbahnzelle integriert worden ist. Diese Tiere haben typischerweise die Fähigkeit, die genetische Information an ihre Nachkommen zu übertragen. Falls die Nachkommen in der Tat etwas oder alle genetische Information besitzen, die an das Elterntier abgegeben wurde, dann handelt es sich bei ihnen auch um transgene Tiere.
Vorzugsweise werden die transgenen Tiere der vorliegenden Erfindung durch Einführen von DNA, die den erfindungsgemäßen G Protein-gekoppelten Rezeptor kodiert, in einzellige Embryonen hergestellt, so dass die DNA stabil in die DNA von Keimbahnzellen im reifen Tier integriert ist und auf Mendelsche Weise vererbt wird. Es ist seit vielen Jahren möglich, heterologe DNA in befruchtete Säugereizellen einzuführen. Zum Beispiel können totipotente oder pluripotente Stammzellen durch Mikroinjektion, Calciumphosphat-vermittelte Präzipitation, Liposomenfusion, Retrovirusinfektion oder andere Mittel transfiziert werden. Die transfizierten Zellen werden dann in einen Embryo eingeführt (zum Beispiel in die Höhle einer Blastula) und in ein pseudo-schwangeres Weibchen eingepflanzt, dass fähig ist, die Embryonen auszutragen. Alternativ dazu können die transfizierten, befruchteten Eizellen direkt in das pseudo-schwangere Weibchen eingepflanzt werden. In einem bevorzugten Verfahren wird die geeignete DNA in den Pronucleus von Embryonen im Ein-Zell-Stadium injiziert und man lässt die Embryonen ihre Entwicklung in einem pseudo-schwangeren Weibchen vervollständigen.
Diese Techniken sind wohlbekannt. Zum Beispiel schließen Übersichtsartikel von Standard-Laborverfahren zur Mikroinjektion heterologer DNAs in befruchtete Säugereizellen ein: Hogan et al. „Manipulating the Mouse Embryo" (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9: 86, 1991; Palmiter et al., Cell 41: 343, 1985; Kraemer et al., "Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo" (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1985); Hammer et al., Nature 315: 680, 1985; Purcel et al., Science, 244:1281, 1986; Wagner et al., US-Patent 5,175,385 und Krimpenfort et al., US-Patent Nr. 5,175,384 .
Beispiele
Beispiel 1: Die cDNA Sequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenz von AZ3B
Ein Polypeptid, das eine neue Klasse von G Protein-gekoppelte Rezeptoren darstellt, wird hierin beschrieben. Es wird durch eine Nucleinsäure kodiert, die folgendermaßen von einer menschlichen Granulozyten-cDNA-Bank isoliert wurde.
Isolierung des cDNA-Klons AZ3B
Eine λgtII cDNA-Bank wurde mit mRNA aus differenzierten HL-60-Granulozyten hergestellt (Ye et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 180: 105–111, 1991) und mit einer [³²P]-markierten Sonde, bestehend aus 1,1 kb cDNA für einen menschlichen FPR (N-Formyl-Peptidrezeptor) (Boulay et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 168: 1103–1109, 1990) durchgemustert. Ungefähr 300.000 Plaque bildende Einheiten (pfus) wurden unter den folgenden Stringenzbedingungen durchgemustert: Hybridisierung bei 62°C mit 6 × SSC und 5 × Denhardt-Lösung, gefolgt von Waschen bei der gleichen Temperatur mit 2 × SSC.
Ein cDNA-Isolat wurde identifiziert, dass schwach mit der cDNA-Sonde für FPR zu hybridisieren schien. Dieses Isolat enthielt ein Insert von 1,45 kb und wurde AZ7.4 genannt. Das Insert von AZ7.4 wurde gemäß dem von Devereux et al. (Nucleic Acids Res. 12: 387–395, 1984) beschriebenen Verfahren sequenziert und man stellte fest, dass es einen am 3'-Ende mit einer EcoRI-Schnittstelle abgeschnittenen Leserahmen enthielt, vermutlich aufgrund der unvollständigen Methylierung der cDNA während der Konstruktion der Bank.
Die gleiche Bank wurde dann wieder unter vergleichbaren Stringenzbedingungen mit der AZ7.4 DNA als Sonde durchgemustert und drei positive λ Phagenisolate wurden aus 300.000 pfus identifiziert. Das Isolat mit dem längsten Insert, AZ3B, wurde durch Subklonieren und Sequenzieren weiter analysiert.
Analyse der cDNA-Sequenz von AZ3B
Das cDNA-Insert von AZ3B war 1970 Basenpaare lang und enthielt eine nicht translatierte 5'-Sequenz von 81 Basenpaaren, einen offenen Leserahmen von 1446 bp, ein Stopp-Codon und eine nicht translatierte 3'-Sequenz von 440 bp, die eine Strecke von 15 Adeninbasen enthielt (1). Das erste ATG wurde beruhend auf den folgenden Kriterien als das Initiationscodon zugeordnet: (1) die flankierende Sequenz erfüllt die Erfordernisse für Translationsinitiation durch eukaryotische Ribosomen, nämlich ein Purin in Position –3 und ein Guanin in Position +4, (2) es gibt ein Stopp-Codon im Leserahmen bei –10 bis –12 und (3) die flankierende Sequenz des nächsten ATG-Codons, 78 bp stromabwärts, ähnelt der Konsensussequenz für Translationsinitiation nicht. Die Nucleotidsequenz, von der hierin berichtet wird, ist bei der GenBank/EMBL Datenbank hinterlegt worden und ihr wurde die Hinterlegungsnummer U28488 zugeordnet (GenBank Version 88).
Die durch AZ3B kodierte Aminosäuresequenz
Beruhend auf der Zuordnung des ersten ATG-Codons, wie vorstehend beschrieben, kodiert der offene Leserahmen ein Protein von 482 Aminosäuren. Eine Hydrophobizitätsanalyse des vorhergesagten Proteinprodukts von AZ3B legte die Anwesenheit von sieben mutmaßlichen Transmembrandomanen nahe, ein Kennzeichen der G Proteingekoppelten Rezeptoren (2). Einzigartig für diesen mutmaßlichen Rezeptor ist die Anwesenheit eines ~172 Reste großen hydrophilen Segments, das eine große extrazelluläre Schleife zwischen der vierten und der fünften Transmembrandomäne bilden würde (2 und 3). Die Sequenz dieses Segments hat keine signifikante Homologie zu einem Protein in der Genbank (Version 88) oder den SWISS-PROT (Version 31) Nucleinsäure- und Proteinsequenzdatenbanken.

Eine Analyse der Aminosäuresequenz identifizierte zwei potenzielle Stellen für eine N-gekoppelte Glycosylierung, eine in der vorhergesagten großen Schleife und die andere im Aminoterminus (1). Die abgeleitete Aminosäuresequenz von AZ3B wurde unter Verwendung des FASTA-Algorithmus mit allen Sequenzen in der SWISS-PROT Datenbank (Version 31) verglichen. Die Parameter der Suche nach verwandten Sequenzen wurden so gesetzt, dass Lücken von bis zu 3 Aminosäuren erlaubt waren. Die Namen der ähnlichsten Sequenzen, die alle G Protein-gekoppelte Rezeptoren darstellen, werden in Tabelle 1 angegeben.

SWISSPROT Zugangsnr.	Name der GPCR-Sequenz	verglichene AZ3B/GPCR-Sequenzen (# der Reste)	Identität
P21730	Menschlicher C5a-Rezeptor	22-163/36-177 (142)	47,9%
P25090	Menschliches FPR-Homolog (FPR2)	24-177/27-181 (155)	44,5%
P30992	C5a-Rezeptor aus Hund	2-165/17-180 (164)	43,9%
P30993	C5a-Rezeptor aus Maus	10-177/20-189 (170)	42,4%
P21462	Menschliches FPR	24-177/27-181 (155)	40,6%
P25089	Menschliches FPR-Homolog (FPRH2)	9-178/11-182 (172)	39,5%
P32303	Typ a Angiotensin-Rezeptor II aus Frosch	28-177/34-186 (153)	34,6%
Q04683	GPCR aus Burkitt's-Lymphom der Maus	342443/226-332 (107)	34,6%
P25930	NPY3 Rezeptor aus Rind	24-173/40-88 (151)	33,8%
P30938	Somatostatin-Rezeptor 5 aus Ratte	21-163/35-178 (144)	32,6%
P32302	GPCR aus menschlichem Burkitt's-Lymphom	323-443/204-330 (127)	32,3%
P25025	Menschlicher IL-8-Rezeptor B	25-172/45-191 (150)	31,3%

Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von AZ3B der Sequenz des menschlichen C5a-Rezeptors (47,9%) am ähnlichsten. AZ3B ist auch 44,5% identisch mit einem Homolog des N-Formyl-Peptidrezeptors (FPR), FPR2 (siehe Ye et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 184:582–589, 1991), und 40,6% identisch mit menschlichem FPR. Der höchste Grad an Sequenzhomologie existiert in einer Strecke von 170 Resten im Aminoterminus und in einer Strecke von 150 Resten im Carboxyterminus, mit Ausnahme des G Protein-gekoppelten Rezeptors aus Burkitt's Lymphom, wo Sequenzen in der sechsten und siebten Transmembrandomäne und der dritten extrazellulären Schleife die höchste Homologie zeigten (Tabelle 1). Sobald der Ligand für den G Protein-gekoppelten Rezeptor aus Burkitt's Lymphom identifiziert wird, wird es möglich werden zu bestimmen, ob die strukturelle Homologie zwischen diesem Rezeptor und AZ3B eine Ähnlichkeit der Ligandenerkennung reflektiert.
Die intrazellulären Domänen von AZ3B sind auch zu denen von FPR und C5aR homolog, was nahelegt, dass AZ3B an die gleichen oder ähnliche G Proteine wie diese Rezeptoren gekoppelt ist.
Trotz der Sequenzhomologie banden L-Zell-Fibroblasten, die transfiziert wurden, um das AZ3B Protein zu exprimieren, das Formylpeptid fMet-Leu-Phe oder C5a nicht nachweisbar, auch reagierten diese Zellen nicht mit einer Calcium-Mobilisierung auf fMet-Leu-Phe oder C5a. Im Gegensatz dazu banden transfizierte Zellen, die FPR oder C5aR exprimierten, fMet-Leu-Phe beziehungsweise C5a, und mobilisierten Calcium als Reaktion. Andere Chemoattraktoren, einschließlich des Blutplättchen-aktivierenden Faktors, MIP-1α, MCP-1, GROα, IL-8 und I-309 schafften es nicht, eine messbare Calcium-Mobilisierung in den mit AZ3B transfizierten Zellen zu stimulieren.
Expression von AZ3B und Herstellung von Antiseren
Kaninchen- und Maus-Antiseren wurden gegen Fusionsproteine hergestellt, welche die große extrazelluläre Schleife von AZ3B und Glutathion-S-Transferase (GST) beziehungsweise Maltose-bindendes Protein (MBP) enthielten (3). Genauer gesagt, diese Antiseren wurden gegen ein Expressionsprotein erzeugt, das durch Einfügen der AZ3B cDNA in den Expressionsvektor SFFV.neo (Fuhlbrigge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5649–5653, 1988) und stabiles Transfizieren der Maus-Fibroblasten-Zelllinie L2071 (erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, MD) erhalten wurde. Durch Färben mit polyklonalen Antikörpern, die anschließend gegen Fusionsproteine erzeugt wurden, die eine 164 Reste lange Strecke der zweiten extrazellulären Schleife von AZ3B enthielten, wurde gezeigt, dass die so erhaltene Zelllinie (L-AZ3) das transfizierte Protein exprimiert.
Beispiel II: Analyse der Expressionsmuster von AZ3B
Analyse der Verteilung von AZ3B auf der Zelloberfläche

Die Expression des Proteins AZ3B auf der Zelloberfläche wurde mit Durchflusszytometrie bestätigt und weiter untersucht. Die analysierten Zelltypen schlossen L-Zellen aus Maus (nicht transfiziert und mit AZ3B transfiziert), HL-60- und U-937-Zellen (nicht differenziert und differenziert, wie nachstehend beschrieben), Molt 4/8-Zellen, H-9-Zellen, Raji-Zellen, Neutrophile und Monozyten aus peripherem Blut und aus der Nabelvene entnommene Endothelzellen ein, wie in Tabelle 2 gezeigt wird. Die HL-60-Zellen wurden entweder mit Dimethylsulfoxid (DMSO, 1,3%, Vol./Vol.) 5 Tage lang oder Dibutyryl-cAMP (500 μM) 2 Tage lang differenziert. Die U-937-Zellen wurden mit Phorbolmyristatacetat (PMA; 0,1 μM) 16 Stunden lang differenziert. Die L-Zellen wurden stabil transfiziert, um das Protein AZ3B zu exprimieren. Die Zellen wurden mit Kaninchenantiseren oder Mausantiseren (in Tabelle 2 durch * angezeigt; bei einer Verdünnung von 1:200) 30 Minuten auf Eis inkubiert, dann drei Mal mit PBS gewaschen und mit FITC-konjugierten sekundären Ziegen anti-Kaninchen oder anti-Maus Antikörpern unter den gleichen Bedingungen inkubiert. In Tabelle 2 wird der relative Expressionsspiegel durch die Zeichen „–" und „+" angezeigt.

ZELLEN	EXPRESSIONSSPIEGEL
Mit AZ3B transfizierte L-Zellen der Maus	+++
Nicht transfizierte L-Zellen der Maus	-
HL-60	-
HL-60, mit DMSO differenziert	++
HL-60, mit dbcAMP differenziert	++
U-937	+
U-937, mit PMA differenziert	+++
Molt 4/8	-
H-9	-
Raji	+++
Neutrophile aus peripherem Blut	+++
Monocyten aus peripherem Blut*	+++
Endothelzellen aus der Nabelvene*	++

Wie in Tabelle 2 gezeigt wird, ist die Expression des Proteins AZ3B mit der terminalen Differenzierung von mehreren hämatopoetischen Zelllinien assoziiert. AZ3B wird auch mit relativ hohen Spiegeln in Neutrophilen und Monozyten exprimiert, wird aber in Endothelzellen aus der Nabelvene mit einem niedrigen Spiegel exprimiert. Die reichliche Expression des Proteins AZ3B in der Raji-Zelllinie aus Burkitt's Lymphom legt nahe, dass die Funktion des Proteins AZ3B nicht auf Granulozyten beschränkt ist.
Analyse der Gewebeverteilung von AZ3B durch Northern-Blot
Weitere Untersuchungen der Expression von AZ3B wurden durch Northern-Blot-Analysen durchgeführt, um die Verteilung dieses Proteins in verschiedenen Geweben zu untersuchen (4A und 4B). Eine Northern-Blot-Analyse wurde verwendet, um messenger-RNA (mRNA) folgendermaßen abzuschätzen. Poly(A)⁺-RNA (2 μg) aus acht verschiedenen menschlichen Geweben (Herz, Gehirn, Placenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas) wurden auf einem denaturierenden Gel, das Formaldehyd und 1,2% Agarose enthielt, aufgetrennt, durch Standardtechniken für Northern-Blotting auf eine Nylonmembran übertragen und durch Ultraviolettbestrahlung auf der Membran fixiert. Der Blot wurde mit Dextransulfat (10%) in 50% Formamid, 6 × SSC, 25 mM HEPES (pH-Wert 7,0) und 1 mM EDTA vorhybridisiert und hybridisiert. Die Hybridisierung wurde bei 42°C 16 Stunden lang mit einem 1,5 kb großen AZ3B-Insert (am 3'-Ende durch Verdauung mit EcoRI abgeschnitten) durchgeführt. Eine Analyse der Gesamt-RNA (20 μg) aus nicht differenzierten („U" in 4B) und differenzierten („D" in 4B) HL-60-Zellen wurde auch durchgeführt, im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben. Um sicherzustellen, dass eine äquivalente Menge jeder Probe vorlag, wurde 28S und 18S RNA gefärbt.
Diese Experimente zeigten auch, dass die Expression von AZ3B in differenzierten HL-60-Zellen induziert wird. Darüberhinaus wurde die AZ3B-Message in menschlichem Herzen, menschlicher Placenta und Lunge gefunden. In der Placenta wurde eine zweite Spezies von ~3,3 kb zusätzlich zu der ~2,1 kb großen Message gesehen, die in anderen vorstehend beschriebenen Zellen und Geweben gefunden wurde. Diese geringere Spezies kann ein anderes Gen oder ein Produkt differentiellen Spleißens darstellen.
Die hierin beschriebenen Untersuchungen zeigen an, dass es sich bei dem Proteinprodukt von AZ3B um einen G Protein-gekoppelten Rezeptor handelt, der ein einzigartiges strukturelles Merkmal besitzt; eine extrazelluläre Schleife, die ein Drittel des gesamten Rezeptors darstellt. Die Hydrophilität dieser Schleife impliziert, dass sie mit einem Peptid- oder Glycoproteinliganden in Wechselwirkung treten kann, der noch identifiziert werden muss. SEQUENZPROTOKOLL
Zusätzliche Ausführungsformen befinden sich innerhalb der folgenden Ansprüche.

Claims

Polypeptid, wobei das Polypeptid als G Protein-gekoppelter Rezeptor mit einer vergrößerten extrazellulären Schleife zwischen der vierten und fünften Transmembrandomäne gekennzeichnet ist, wobei die Schleife die Sequenz der Aminosäurereste 164 bis 327 von SEQ ID NO: 2 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, ferner umfassend Glutathion-S-transferase (GST) oder das Maltose-bindende Protein (MBP).
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die vergrößerte extrazelluläre Schleife eine N-gebundene Glycosylierungsstelle enthält.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid SEQ ID NO: 2 umfasst.
Polypeptid, das die Sequenz der Aminosäurereste 163–327 von 1 umfasst.
Isolierte Nucleinsäure, wobei die Nucleinsäure eine Sequenz umfasst, die das Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 5 kodiert.
Nucleinsäure nach Anspruch 6, wobei die Nucleinsäure SEQ ID NO: 1 umfasst, wobei „T" auch „U" sein kann.
Nucleinsäure, die selektiv an die Nucleinsäure nach Anspruch 7 hybridisiert und die mindestens 12 Nucleotide enthält.
Expressionsvektor, umfassend die Nucleinsäure nach Anspruch 6.
Expressionsvektor nach Anspruch 9, ferner umfassend ein regulatorisches Element, vorzugsweise ein regulatorisches Element, das eine gewebespezifische Expression steuert.
Expressionsvektor nach Anspruch 9, ferner umfassend ein Reportergen, vorzugsweise ein Reportergen, das aus der Gruppe, bestehend aus β-Lactamase, Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), Adenosindesaminase (ADA), Aminoglycosidphosphotransferase (neo^r, G418^r), Dihydrofolatreduktase (DHFR), Hygromycin-B-Phosphotransferase (HPH), Thymidinkinase (TK), lacZ (das β-Galaktosidase kodiert) und Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (XGPRT), ausgewählt ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem Vektor um ein Plasmid oder ein Virus handelt.
Expressionsvektor nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem Vektor um ein Retrovirus handelt.
Zelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 9.
Zeile nach Anspruch 14, wobei es sich bei der Zelle um eine eukaryotische, vorzugsweise einen Fibroblasten, handelt.
Nicht menschliches transgenes Tier, erzeugt aus der Zelle nach Anspruch 14.
Antikörper, der spezifisch an einen G Protein-gekoppelten Rezeptor bindet, wobei der Rezeptor eine vergrößerte extrazelluläre Schleife zwischen der vierten und fünften Transmembrandomäne hat, wobei die Schleife die Sequenz der Aminosäurereste 164 bis 327 von SEQ ID NO: 2 umfasst.
Antikörper nach Anspruch 17, wobei es sich bei dem Antikörper um einen polyklonalen Antikörper handelt.
Antikörper nach Anspruch 17, wobei es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Antikörper nach Anspruch 17, wobei der Antikörper humanisiert ist.
Verfahren zum Nachweisen eines G Protein-gekoppelten Rezeptors mit einer vergrößerten extrazellulären Schleife zwischen der vierten und fünften Transmembrandomäne, wobei die Schleife die Sequenz der Aminosäurereste 164 bis 327 von SEQ ID NO: 2 umfasst, in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem Antikörper nach Anspruch 17 unter Bedingungen umfasst, die dem Antikörper ermöglichen, spezifisch an den Rezeptor zu binden, wobei das Binden des Antikörpers die Anwesenheit des Rezeptors in der Probe anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die biologische Probe Hirngewebe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Hirngewebe von einem Patienten stammt, von dem vermutet wird, dass er eine neurologische Erkrankung, wie zum Beispiel die Alzheimer-Krankheit, hat.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die biologische Probe Haut, insbesondere Haut von einem Patienten, von dem vermutet wird, dass er Psoriasis hat, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die biologische Probe hämatopoetische Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die biologische Probe von einem Patienten stammt, von dem vermutet wird, dass er eine entzündliche Erkrankung, besonders eine aus der Gruppe, bestehend aus Asthma, chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung, cystischer Fibrose, Sinusitis, Rhinitis, Atherosklerose, Glomerulonephritis, multipler Sklerose und entzündlicher Darmerkrankung, gewählte entzündliche Erkrankung hat.
Verfahren zum Nachweisen einer Nucleinsäure, die selektiv an eine Nucleinsäure hybridisiert, die SEQ ID NO: 1 umfasst, wobei das Verfahren umfasst a) Kombinieren einer ersten Nucleinsäure, bestehend aus der Nucleinsäure nach SEQ ID NO: 1 oder Fragmenten davon, die mindestens 15 Nucleotide lang sind, mit einer zweiten Nucleinsäure unter Bedingungen, die eine Duplexbildung zwischen der ersten und zweiten Nucleinsäure ermöglichen, und b) Nachweisen der Duplexbildung.
Verfahren zum Herstellen eines G Protein-gekoppelten Rezeptors mit einer vergrößerten extrazellulären Schleife zwischen der vierten und fünften Transmembrandomäne, wobei die Schleife die Sequenz der Aminosäurereste 164 bis 327 von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei das Verfahren das Züchten der Zelle nach Anspruch 14 unter Bedingungen umfasst, die eine Expression des Rezeptors ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 28, ferner umfassend den Schritt, den Rezeptor, nachdem er durch die Zelle exprimiert wurde, zu isolieren.