DE69118637T2

DE69118637T2 - DNS und Polypeptide von tumorassoziiertem Antigen CO-029

Info

Publication number: DE69118637T2
Application number: DE69118637T
Authority: DE
Inventors: Hilary Koprowski; Alban Linnenbach; Stanislaw Szala
Original assignee: Wistar Institute of Anatomy and Biology
Current assignee: Wistar Institute of Anatomy and Biology
Priority date: 1990-08-31
Filing date: 1991-08-30
Publication date: 1996-10-31
Anticipated expiration: 2011-08-31
Also published as: US5668002A; CA2050451A1; DE69118637D1; EP0478146B1; EP0478146A1; ATE136585T1

Description

Die US-Regierung behält einige Rechte bei dieser Erfindung bei, welche unter der Förderungsnummer CA21124-11 von den National Institutes of Health gemacht wurde.

Hintergrund der Erfindung

Eine Anzahl von monoklonalen Antikörpern (mAkn) wurde aus der Immunisierung von Mäusen mit menschlichen Gastrointestinaltumorzellinien abgeleitet (Koprowski et al., Somat. Cell Genet., Bd. 5 (1979), 957-972; Steplewski et al., in Methods in Cancer Research, Hrsg. Busch et al. (Academic, New York), Bd. XX (1982), 285-316; Herlyn et al., J. Immunol. Meth., Bd. 73 (1984), 157-167; Gottlinger et al., Int. J. Cancer, Bd. 38 (1986), 47-53; Girardet et al., J. Immunol., Bd. 136 (1986), 1497-1503). Untersuchungen der von diesen monoklonalen Antikörpern erkannten Antigenstrukturen identifizierten eine Gruppe von Glykolipid- und Glykoprotein-Antigenen (Steplewski et al., in Methods in Cancer Research, Hrsg. Busch et al. (Academic, New York), Bd. XX (1982), 285-316). Das 40 kDa große Zelloberflächenglykoprotein (Ross et al., Hybridoma, Bd. 5 (1986), S21-S27), welches vom mAk CO17-1A (Herlyn et al., Hybridoma, Bd. 5 (1986), S3-S8) und mehreren anderen, unabhängig voneinander abgeleiteten monoklonalen Antikörpern erkannt wird (Gottlinger et al., Int. J. Cancer, Bd. 38 (1986), 47-53; Girardet et al., J. Immunol., Bd. 136 (1986), 1497-1503; Ross et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., Bd. 135 (1986), 297-303), ist eines der am besten charakterisierten Tumor-assoziierten Antigene. Es wurde gezeigt, daß ein anderes Zelloberflächenglykoprotein-Antigen, definiert als mAk CO-029 (früher bezeichnet als 1116NS-29) (Koprowski et al., Somat. Cell Genet., Bd. 5(1979), 957-972), ein 32 kDa großes Monomer ist (Sela et al., Hybridoma, Bd. 8 (1989), 481-491). Es wurde festgestellt, daß das CO-029-Antigen in Magen-, Dickdarm-, Mastdarm- und Pankreaskarzinomen exprimiert wird, jedoch nicht in den meisten normalen Geweben (Sela et al., Hybridoma, Bd. 8 (1989), 481-491). Es wurde gezeigt. daß der mAk CO-029 die Antikörper-abhängige, zellvermittelte Cytotoxizität in vitro vermittelt (Koprowski et al., Somat. Cell Genet., Bd 5 (1979), 957- 972). Jedoch wurde das CO-029-Antigen nicht strukturell charakterisiert, noch wurde seine codierende Sequenz isoliert.
Die kürzliche molekulare Klonierung von cDNA für Tumor-assozuerte Antigene lieferte Informationen über die Antigenstruktur und die Entwicklung der diese Antigene codierenden Gene. Es wurden cDNA-Klone für das durch den mak GA733 definierte Karzinom-assozuerte Antigen GA733-2 (Herlyn et al., Hybridoma, Bd. 5 (1986), S21-S27) isoliert (Szala et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 87 (1990), 3542-3546). Transfektionsexperimente mit einem GA733-2- cDNA-Klon haben gezeigt, daß er sowohl die GA733- als auch die CO17-1A-Epitope codiert (Szala et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 87 (1990), 3542-3546). Die Sequenzanalyse von GA733-2 ergab, daß es mit dem mak identisch ist, welcher als Tumor-assozuertes Antigen KSA definiert wurde (Strand et al., Cancer Res., Bd. 49 (1989), 314-317). Ein verwandtes Gen, GA733-1, wurde identifiziert und es wurde festgestellt, daß es eine Aminosäuresequenzhomologie von 50% mit dem GA733-2-Antigen aufweist (Szala et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 87 (1990), 3542-3546; Linnenbach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), 27-31). GA733-1 ist ein Gen mit wenigen Introns, für das gezeigt wurde, daß es in großen Mengen in Pankreaskarzinom-Zellinien transkribiert wird (Linnenbach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), 27-31). Die GA733-Antigenfamilie umfaßt Transmembranproteine vom Typ I mit unbekannter Funktion.
Auf dem Fachgebiet besteht der Bedarf für weitere klonierte Tumor-assoziierte Antigene. Die Klone können zur Bestimmung von Nucleinsäuresequenzen sowie zur Herstellung von Antigenpräparaten verwendet werden, welche als Impfstoffe zur Stimulierung der Produktion tumorhemmender Antikörper bei Krebspatienten nützlich sein können.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von das Tumor-assozuerte Antigen CO-029 codierenden DNA-Molekülen.
Ein anderes erfindungsgemäßes Ziel ist die Bereitstellung von DNA-Molekülen, welche zur Expression des Antigens CO-029 in angezüchteten Zellen verwendet werden können.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Ziel ist die Bereitstellung einer Sequenzanalyse des CO-029- Antigens zur Bestimmung der antigenisch wichtigen Bereiche des Moleküls
Ein Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Polypeptiden, welche im wesentlichen aus extrazellulären Domänen des Tumor-assoziierten Antigens CO-029 bestehen.
Ein anderes erfindungsgemäßes Ziel ist die Bereitstellung von Polypeptiden, welche mit CO-029 eine Immunreaktion eingehen.
Diese und andere Ziele der Erfindung werden durch eine oder mehrere der nachstehend beschriebenen Ausführungsformen bereitgestellt. Gemäß einer Ausführungsform wird ein Intron-freies DNA-Molekül bereitgestellt, welches ein Tumor-assozuertes Antigen codiert, wobei das Antigen mit dem monoklonalen Antikörper CO-029 eine Immunreaktion eingeht.
Nach einer anderen Ausführungsform wird ein Polypeptid bereitgestellt, welches im wesentlichen aus einer extrazellulären Domäne von CO-029 besteht.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird ein Präparat des CO-029-Antigens bereitgestellt, welches von anderen menschlichen Proteinen frei ist.
Bei einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden transformierte Zellen bereitgestellt, welche das CO-029-Antigen codierende DNA-Moleküle enthalten.
Diese und andere Ausführungsformen der Erfindung, welche nachstehend ausführlicher beschrieben werden, stellen dem Fachgebiet ein zusätzliches molekulares, kloniertes Tumor-assoziiertes Antigen bereit. Dies ermöglicht die unbegrenzte Produktion des Antigens in nicht-malignen Zellen un& die wirksame Verwendung des Antigens als die biologische Antwort modifizierendes Mittel zur Stimulierung der Immunsysteme bei menschlichen Krebspatienten zur Bekämpfung von Kolorektal-, Lungen- und anderen Karzinomen sowie Astrocytomen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt den Nachweis des CO-029-Antigens in transfizierten COS-Zellen durch einen Misch-Hämadsorptionstest (MHA). Die Zellen wurden mit dem mAk CO-029 inkubiert und im Anschluß daran mit einem Indikatorsystem umgesetzt, welches aus mit Maus-Antiserum gegen Schaf-Erythrocyten und Ziege-anti-Maus-IgG behandelnden Schaf-Erythrocyten bestand. (A): Unbehandelte COS-Zellen. (B): COS-Zellen 3 Tage nach der Transfektion mit CO-029-5-DNA.
Figur 2 zeigt den Western-Blot-Nachweis des CO-029-Antigens in transfizierten COS-Zellen. Alle Zellextrakte stammten von 5W948-Kolorektalkarzinom-Kontrol lzellen (Bahn 1), unbehandelten COS-Zellen (Bahn 2) und COS-Zellen 3 Tage nach der Transfektion mit CO-029-5-DNA (Bahn 3).
Figur 3 zeigt (A) die Sequenz der vollständigen CO-029-cDNA mit der vorhergesagten Aminosäuresequenz Der Ein-Buchstaben-Code wird verwendet. Die Positionen von 12 Cysteinresten (Kreise), eine potentielle N-gebundene Glykosylierungsstelle (gestrichelte obere Linie) und 4 hydrophobe Bereiche (fettgedruckte obere Linie) sind dargestellt. Die Konsensus-Sequenzen zur Initiation der Translation (unterstrichen). den mRNA-Wechsel (obere Linie) und die Poly(A)- Addition (gestrichelt unterstrichen) sind dargestellt. (Tafel B) stellt ein Kyte-Doolittle-Hydrophobizitätsdiagramm des CO-029-Antigens dar, welches die 4 hydrophoben Bereiche zeigt.
Figur 4 zeigt die Abgleichung CO-029-verwandter Sequenzen. Die CO-029-, ME491- und Sm23- Sequenzen sind in ihrer Gesamtheit dargestellt; der homologe Bereich der CD37-Sequenz wird gezeigt. Der Ein-Buchstaben-Code wird verwendet. Konservierte Cysteinreste sind in fetter Schrift dargestellt. Potentielle N-gebundene Glykosylierungsstellen (unterstrichen) und vorhergesagte transmembrane (Tm), extrazelluläre (Ex) und cytoplasmatische (Cy) Domänen werden veranschaulicht. Lücken (...) wurden eingefügt, um die Abgleichung zu erhöhen; eine Konsensus- Sequenz (Cons.) wurde berechnet.
Figur 5 zeigt Modelle für die CO-029-Familie der Membranantigene. (A) = CO-029-, ME491- und 5m23-Antigene. (B) = CD3 7-Antigen.
Figur 6 zeigt in Tafel A eine Northern-Blot-Analyse mit der CO-029-5-DNA-Sonde. Die mRNA wurde von der SW948-Kolorektalkarzinom-Zellinie (Bahn 1), der SW707-Rektalkarzinom-Zelllinie (Bahn 2), den Pankreaskarzinom-Zellinien Capan-2 (Bahn 3) und BXPC-3 (Bahn 4), den Melanom-Zellinien WM1158 (Bahn 5) und WM35 (Bahn 6) abgeleitet. In Tafel B wurde eine Hybridisierung mit einer Kontrollsonde aus dem Enolase-Gen durchgeführt.
Figur 7 zeigt die Bindung der monoklonalen Antikörper (mak) ME491 und CO-029 in einem Radioimmuntest (RIA) an eine Reihe von menschlichen Tumorzellinien. Die Ergebnisse sind nach der Subtraktion der unspezifischen mAk-P3-Bindung (üblicherweise 100-200 cpm) dargestellt.

Ausführliche Beschreibung

Ein Intron-freies, das Tumor-assoziierte Antigen CO-029 codierende DNA-Molekül wurde kloniert und analysiert. Bei der Transfektion des DNA-Moleküls in COS-Zellen, welche das Antigen nicht exprimieren, synthetisieren die resultierenden Transfektanten ein das CO-029-Epitop tragendes Antigen (wie durch den monoklonalen Antikörper CO-029 definiert). Das in transfizierten COS-Zellen exprimierte Antigen ist durch einen Western-Blot nicht von jenem zu unterscheiden, welches in Zellen einer kolorektalen Zellinie exprimiert wird.
Die DNA-Sequenzierung des klonierten DNA-Moleküls zeigt ein Antigen mit einem Proteinmolekulargewicht von 26,044. Dies zeigt, daß bis zu 8 kDa des nativen Glykoprotein-Antigens auf eine Glykosylierung zurückgeführt werden können. Die vollständige Nukleinsäure und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen sind in Figur 3 dargestellt.
Erfindungsgemäße DNA-Moleküle und Polypeptide können alle oder einen Teil der in Figur 3 gezeigten Sequenzen enthalten. Bevorzugte Polypeptide behalten die Fähigkeit bei, an Antikörper zu binden, welche mit den extrazellulären Domänen von CO-029 eine Immunreaktion eingehen. Eine solche Bindung kann leicht durch die Induktion von Antikörpern gegen ein bestimmtes Polypeptid analysiert werden. Falls die Antikörper mit intakten Kolorektalkarzinomzellen eine Immunreaktion eingehen, welche das Antigen auf ihren Zelloberflächen exprimieren, stellt das Polypeptid ein extrazelluläres Epitop dar. Wie hier gelehrt, umfaßt eine solche extrazelluläre Domäne die mit 34 bis 57 numerierten Aminosäuren und eine andere umfaßt die Aminosäuren 110 bis 205. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung geht das Polypeptid mit dem monoklonalen Antikörper CO-029 eine Immunreaktion ein. Nach einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform ist ein Polypeptid kovalent an eine Aminosäuresequenz gebunden, welche die Sekretion des Polypeptids aus Zellen verursacht, in denen es synthetisiert wird. Solche Aminosäuresequenzen, Signalsequenzen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Erfindungsgemäße Polypeptide können von einer Glykosylierung frei sein. Solche glykosyherungsfreie Polypeptide können zum Beispiel in einem nicht-glykosylierenden Mikroorganismus wie E. coli oder in Gegenwart von Tunicamycin in Säugerproteine glykosylierenden Zellen synthetisiert werden. Alternativ können die Polypeptide beispielsweise unter Verwendung eines automatischen Synthetisierers gemäß der offengelegten Sequenz chemisch synthetisiert werden. Glykosylierte Polypeptide können in Säuger- und anderen höheren Eukaryontenzellen hergestellt werden.
Da die erfindungsgemäßen Polypeptide von rekombinante DNA-enthaltenden Organismen oder Zellen oder synthetisch hergestellt werden können, können sie völlig frei sein von anderen menschlichen Proteinen. Im Gegensatz dazu erreichen aus menschlichen Zellen isolierte native Antigene im allgemeinen keinen solchen Reinheitsgrad. Da die Polypeptide nicht aus malignen menschlichen Zellen isoliert werden müssen, wird das mit der Verabreichung des Polypeptids an Menschen, zum Beispiel als Injektionsmittel, assozuerte Risiko verringert.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können zur Induktion neuer Antitumor-Antikörper verwendet werden. Es kann wünschenswert sein, Antikörper zu isolieren, die mit anderen Epitopen des CO-029-Antigens als dem durch den monoklonalen Antikörper CO-029 definierten eine Reaktion eingehen. Alternativ kann die Isolierung von Antikörpern wünschenswert sein, welche mit dem gleichen Epitop eine Reaktion eingehen jedoch von CO-029 verschiedene Eigenschaften aufweisen, wie eine erhöhte oder verringerte Cytotoxizität. Die Polypeptide können auch wie vorstehend erwähnt als Injektionsmittel verwendet werden. Sie können als die biologische Antwort modifizierende Stoffe zur Stimulation des Immunsystems eines Krebspatienten verwendet werden, um das CO-029-Antigen exprimierende Tumoren zu bekämpfen.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können an größere Einheiten, z.B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, zur Steigerung ihrer Immunogenität gekuppelt werden. Sie können auch mit auf dem Fachgebiet bekannten Adjuvanzien gemischt werden. Gemäß einer besonderen Ausführungsform wird das Polypeptid mit viralen Proteinen von Vaccinia gemischt. Dies wird einfach durch die Herstellung rekombinanter Vaccinia Virus-Genome erreicht, welche das CO-029- verwandte Polypeptid exprimieren. Das rekombinante Virus kann zum Beispiel in Nierenzellen von Hamsterjungen ("baby hamster kidney cells", (BHK)) gezüchtet und das rekombinante Virus in Menschen injiziert werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch mit anderen biologisch oder immunologisch aktiven Polypeptiden gemischt werden.
Erfindungsgemäße Polypeptide können auch diagnostisch zur Quantifizierung der in einer biologischen Probe vorhandenen Antigenmenge verwendet werden. Beispielsweise können definierte Polypeptidmengen in Tests zur kompetitiven Bindung mit gegen das Polypeptid gerichteten Antikörpern verwendet werden.
Die DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung können zur Expression der erfindungsgemäßen Antigene verwendet werden. Die DNA-Moleküle werden zur Transformation geeigneter menschlicher oder nicht-menschlicher Zellen, wie Maus, Affe, Hefe etc., verwendet. Verfahren zur Transformation und Vermehrung solcher Zellen in Kultur sind gut bekannt. Gemäß einer Ausführungsform wird das Antigen-codierende DNA-Molekül an einen Vektor gebunden, welcher in E. coli replizieren kann. Solche Vektoren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Nach einer anderen Ausführungsform veranlaßt das DNA-Molekül COS-Zellen ein Protein zu exprimieren, welches mit dem monoklonalen Antikörper CO-029 eine Immunreaktion eingeht. Eine solche Expression kann abhängig von dem zur Transfektion verwendeten Vektor stabil oder vorübergehend sein. Bereiche des CO-029-Gens können unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) isoliert werden. Beispielsweise kann der die große extrazelluläre Domäne codierende Bereich des Gens vermehrt und unter Verwendung von aus der offengelegten Sequenz konstruierten Primern isoliert werden. Dieser kann mit einer eine Signalsequenz codierenden DNA ligiert werden, so daß bei der Expression in einer rekombinanten Zelle die extrazelluläre Domäne exprimiert und aus der Zelle sezerniert wird. Geeignete Signalsequenzen sind auf dem Fachgebiet bekannt. DNA-Moleküle können auch als Sonden und Primer bei Polymerase-Kettenreaktionen oder Hybridisierungsstudien zur Quantifizierung der Expression der CO-029-MRNA in einer biologischen Probe verwendet werden. Eine solche Quantifizierung kann eine diagnostische oder prognostische Information über die Erkrankung des Patienten liefern. So können die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle kleiner als etwa 10 Nukleotide und als Sonden oder Primer nützlich sein, wenn sie spezifisch mit dem CO-029-Gen hybridisieren. Einige erfindungsgemäßen DNA- Moleküle sind nur so lang wie erforderlich ist, um ein Polypeptid zu codieren, welches mit Antikörpern eine Immunreaktion eingeht die unter Verwendung des gesamten CO-029-Antigens als Immunogen induziert wurden.
Die folgenden Beispiel veranschaulichen weitere Gesichtspunkte der Erfindung, sie begrenzen sie jedoch nicht auf diese besonderen Ausführungsformen

Beispiele

Beispiel 1: Immunselektion von cDNA-Klonen

Eine aus der SW948-Kolorektalkarzinom-Zellinie hergestellte cDNA-Bank (Szala et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Bd 87 (1990), 3542-3546) wurde in COS-Zellen durch das DEAE- Dextran-Verfahren eingeschleust (Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), 3365- 3369). COS-Zellen, welche das Antigen vorübergehend exprimieren, wurden durch "großflächiges Absuchen" ("panning") (Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), 3365- 3369) mit dem mak CO-029 selektiert. Episomale DNA wurde aus den großflächig abgesuchten Zellen gewonnen und auf Escherichia coli MC1061/P3-Zellen übertragen. Die rekombinante DNA wurde aus den E. coli-Zellen isoliert und weiter für CO-029-Sequenzen durch zwei weitere Immunselektionszyklen angereichert, wobei die Transfektionen der COS-Zellen (Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze) durch Sphäroplastenfusion (Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), 3365-3369) anstelle des DEAE-Dextran-Verfahrens durchgeführt wurden. Die erste Immunselektion der gesamten cDNA-Bank ergab 11.600 wirkstoffresistente Bakterienkolonien; 600 bzw. 2900 Kolonien wurden nach der zweiten bzw. dritten Selektion beobachtet.

Beispiel 2: Analyse der immunselektierten Klone

Zehn aus der letzten Selektion resultierende wirkstoffresistente Bakterienkolonien wurden statistisch ausgewählt und in Hinsicht auf die cDNA-Insertionsgröße durch Spalten an flankierenden Xhoi-Stellen analysiert. Sechs der zehn Klone enthielten 1,1 kb große cDNA-Insertionen. Die DNA wurde aus einer 1,5 ml-Bakterienkultur von einem der Klone, CO-029-5, präpariert. Ein Fünftel dieser DNA wurde in COS-Zellen durch das DEAE-Dextran-Verfahren eingeschleust. Nach einem vorübergehenden Expressionszeitraum von 3 Tagen wurden die Transfektanten mit einem monoklonalen Antikörper auf die Expression des CO-029-Epitops untersucht.
Die transfizierten Zellen wurden mit dem Misch-Hämadsorptionstest (MHA) analysiert, wie von Herlyn et al. beschrieben (Cancer Res., Bd. 40 (1980), 3602-3609). Im MHA unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers CO-029 wiesen 30% der transfizierten COS-Zellen eine rosettenförmige Gestalt auf (Figur 1B), während unbehandelte COS-Zellen nicht reagierten (Figur 1A). Zur Bestätigung dieses Ergebnisses wurde eine Western-Blot-Analyse mit einem mak bei COS- Zellen durchgeführt, die den CO-029-5-Klon vorübergehend exprimieren. Für die Western-Blot- Analyse wurden die Zellen in einem Puffer mit NP-40 (Ross et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., Bd. 135(1986), 297-303) lysiert und Aliquots von 40 µg des nicht-reduzierten, nichterhitzten, vollständigen Proteins wurden auf einem 12%igen SDS-Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterzogen (Laemmli, Nature (London), Bd. 227 (1970), 680-685). Die Proteine wurden durch Elektroblotting auf einen Nitrocellulosefilter übertragen, welcher mit dem affinitätsgereinigten monoklonalen Antikörper CO-029 in einer Konzentration von 1 µg/ml und dann mit einem affinitätsgereinigten Ziege-anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat und Substraten für die Farbentwicklung (Progema Biotech, Madison, WI) inkubiert wurde.
Die transfizierten Zellen exprimierten ein 27 bis 34 kDa großes Antigen (Figur 2, Bahn 3), welches die Eigenschaften des nativen, in SW948-Kontrollzellen exprimierten CO-029-Antigens aufweist. Beide Zelltypen exprimierten mehrere diskrete Formen von CO-029 mit einer Größe zwischen 27 und 34 kDa. Das Antigen wurde in unbehandelten COS-Zellen nicht nachgewiesen (Figur 2, Bahn 2). Folglich codiert der CO-029-5-Klon das durch den monoklonalen Antikörper CO-029 erkannte Epitop.

Beispiel 3: DNA-Sequenzbestimmung und -Analyse

Beide Stränge des vollständigen cDNA-Klons CO-029-5 wurden durch das Didesoxynukleotidverfahren sequenziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 24 (1977), 5463-5467). Die Sequenzumsetzungen wurden mit der T7-DNA-Polymerase (Pharmacia, Piscataway, NJ) unter Verwendung von vektorspezifischen und CO-029-spezifischen Primern durchgeführt. Verdichtungen wurden durch Ersetzen von DGTP durch 7-Deaza-dGTP aufgelöst.
Die 1,1 kb große Sequenz von CO-029-5 zeigte einen offenen Leserahmen von 237 Aminosäuren, beginnend am 5'-proximalen ATG-Codon, welches nachweislich von Sequenzen flankiert wird, die der Konsensus-Sequenz für die Initiation der Translation entsprechen (Kozak, Nucleic Acids Res., Bd. 15 (1987), 8125-8147) (Figur 3A). Für CO-029 wird ein Proteinmolekulargewicht von 26,044 vorhergesagt. Folglich können bis zu 8 kDa des 27 bis 34 kDa großen CO-029-Glykoproteins auf eine Glykosylierung zurückgeführt werden (Sela et al., Hybridoma, Bd. 8 (1989), 481-491). Eine einzige potentielle, N-gebundene Glykosylierungsstelle wurde beobachtet (Figur 3A). Der nicht-translatierte 5'-Bereich besteht aus 138 Resten; der 232 Basen große nicht-translatierte 3'-Bereich enthielt eine Konsensus-Sequenz zur Poly(A)-Addition und zwei Sequenzen für den mRNA-Wechsel (Shaw et al.. Cell, Bd. 46(1986), 659-667) (Figur 3A).
Die Analyse der Verteilung hydrophober und hydrophiler Aminosäuren (Kyte et al., J. Mol. Biol., Bd. 157 (1982), 105-132) (Figur 3B) legt nahe, daß CO-029 ein integrales Transmembranprotein vom Typ III ist (Singer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. L4 (1987), 1960-1964). Es wurde festgestellt, daß vier hydrophobe Bereiche aus 25 Aminosäuren durch hydrophile Aminosäuren voneinander getrennt werden (Figuren 3A und B).
Die CO-029-Sequenz wurde auf eine Homologie durch die Suchversion 63 von Genbank mit dem Programm TFASTA (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85 (1988), 2444-2448) und Version 23 der NBRF-Protein-Datenbasis mit den Programmen FASTP (Lipman et al., Science, Bd. 227 (1985), 1435-1441) und FASTA (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85 (1988), 2444-2448) untersucht, Sequenzen mit optimierten Beurteilungen von > 100 wurden mit den Programmen ALIGN (Dayhoff et al., in Methods in Enzyms, Hrsg. Hirs et al. (Academic, New York), Bd. 91 (1983), 524-545) und LINE-UP (Devereux et al., Nucleic Acids Res., Bd. 12 (1984), 387-395) weiter untersucht.
Die Datenbasis-Analyse zeigte, daß das CO-029-Antigen mit dem menschlichen Melanom-assoziierten Antigen ME491 (Hotta et al., Cancer Res., Bd. 48 (1988), 2955-2962) und dem menschlichen Leukocyten-Antigen CD37 (Classon et al., J. Exp. Med. Bd 169 (1989), 1497-1502) verwandt war. Andere Forscher stellten fest, daß ME941 mit dem Sm23-Antigen des parasitischen Eingeweidewurms S. mansoni homolog ist (Wright et al., J. Immunol., Bd. 144 (1990), 3195- 3200). Die Analyse dieser Sequenzen mit dem Programm ALIGN zeigte, daß diese Homologien statistisch signifikant waren. Beispielsweise ergab der paarweise Vergleich der CO-029-Sequenz mit den ME941-, Sm23- und CD37-Sequenzen, mit einem Lückenpenalty von 40, Abgleichungsbeurteilungen, welche 34, 30 bzw. 18 SD-Einheiten über dem Mittelwert der Beurteilung von 100 statistischen Läufen lagen.
Eine Vielzahl von Sequenzabgleichungen zeigte, daß die Positionen der Cys- und Gly-keste in der CO-029-Familie besonders gut konserviert waren (Figur 4). Die Sequenzhomologie war in den durch eine Hydrophobizitätsanalyse vorhergesagten Transmembran- und Cytoplasmadomänen am größten (Kyte et al., J. Mol. Biol., Bd. 157 (1982), 105-132) (Daten nicht gezeigt). Diese Homologie war auch bei evolutionsgeschichtlich divergierenden Arten wie Homo sapiens und S. mansoni offensichtlich. Beispielsweise traten 10 aufeinanderfolgende Aminosäureübereinstimmungen in CO-029 und Sm23 beginnend bei Rest 74 der Abgleichung auf (Figur 4). Im Gegensatz zu den Transmembran- und Cytoplasmadomänen weisen die extrazellulären Domänen wahrscheinlich fortbestehende Insertionen und/oder Deletionen auf. Die Sequenzen der vorhergesagten extrazellulären Domänen divergierten mit Ausnahme der Positionen der Cys-Reste. Die Anzahl und Positionen der potentiellen, N-gebundenen Glykosylierungsstellen variierte unter diesen Antigenen, jedoch entsprachen alle Positionen den wichtigsten hydrophilen Domänen (Figur 4).
Zwei Klassen von Antigenen konnten innerhalb dieser Familie unterschieden werden. Es wurde festgestellt, daß CO-029-, ME941- und Sm23-Proteine sich in der Länge und der gesamten Homologie in etwa entsprechen (Figur 4). Im Gegensatz dazu war die Homologie von CD37 gegenüber CO-029, ME941 und Sm23 auf den NH&sub2;-endständigen Abschnitt dieser Antigene beschränkt (Figur 4).
Nimmt man für die CO-029-, ME941- und Sm23-Proteine vier transmembrane Domänen an und unter der Annahme, daß die Positionen der potentiellen, N-gebundenen Glykosylierungsstellen (Figur 4) die wichtigsten hydrophilen Domänen außerhalb der Zelle einbringen, wären diese Antigene so orientiert, daß sich die NH&sub2;- und COOH-terminalen Enden auf der Cytoplamaseite der Membran befinden würden (Figur 5A). Zwei extrazelluläre Domänen und drei kurze cytoplasmatische Domänen wurden vorhergesagt (Figuren 4 und SA). Der zu den anderen CO-029- verwandten Antigenen homologe Bereich von CD37 bestand aus drei Transmembran- und zwei Cytoplasmadomänen (Figuren 4 und 5B).

Beispiel 4: CO-029-Expression in Tumorzellinien

Die Transkription des CO-029-Gens in menschlichen Tumorzellinien wurde durch RNA-Blotting untersucht. Zwei µg cytoplasmatische Poly(A)&spplus;-mRNA (Berger et al., Biochemistry, Bd. 18 (1979), 5143-5149) wurden auf einem 2,2 M Formaldehyd/1% Agarose-Gel einer Elektrophorese unterzogen (Lehrach et al., Biochemistry Bd 16 (1977), 4743-4751) und auf Nitrocellulose übertragen. Der CO-029-5-cDNA-Klon wurde nicktranslatiert und an den Filter in einer Lösung mit 50% deionisiertem Formamid und 5x SSC [20x SSC entspricht 3,0 M Natriumchlorid/0,3 M Natriumcitrat, pH 7,0] bei 42ºC über Nacht hvbridisiert. Der Filter wurde bei großer Stringenz in 0,1x SSC/0,1% SDS bei 65ºC gewaschen. Die Sonde wurde dann entfernt und der Filter wurde mit einer α-Enolase-cDNA-Kontrol Isonde hybridis iert (Giallongo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83(1986), 6741-6745).
Die Transkription des CO-029-Gens wurde in den SW948-Kolorektalkarzinom- und SW707- Rektalkarzinom-Zellinien nachgewiesen (Figur 6A, Bahnen 1 und 2). Das Fließgleichgewichtsniveau der CO-029-mRNA unterschied sich in diesen zwei Linien, während das Niveau der α-Enolase-MRNA etwa gleich blieb (Figur 68. Bahnen 1 und 2). Die Größe des vollständigen cDNA-Klons (Figur 3A) korreliert mit dem beobachteten 1,15 kb großen CO-029-Transkript. Zwei Pankreaskarzinom- und zwei Melanom-Zellinien waren für CO-029-mRNA negativ (Figur 6A, Bahnen 3 bis 6). CO-029-verwandte Transkripte wurden unter den hier angewendeten stark stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen nicht beobachtet.

Beispiel 5: Antigenexpression in Tumorzellinien

Der [³H]Thymidin-Einbau wurde nach der Inkubation von Zellen mit gereinigten monoklonalen Antikörpern in einem chemisch definierten. serumfreien Medium bestimmt. Die Kolorektalkarzinom-Zellinie SW948 und die Melanom-Zellinie WM852 wurden in Platten mit 96 Vertiefungen in einer Konzentration von 1,5 x 10&sup4; Zellen/Vertiefung aliquotiert (100 µl). Aliquots der monoklonalen Antikörper CO-029 und ME491 (100 µl und 5 bis 250 µg/ml) wurden einem jeden Zelltyp 18 Stunden nach dem Beimpfen zugegeben. Nach 24 Stunden wurde eine jede Kultur während 18 Stunden mit 1 µCi [Methyl-³H]thymidin (48 Ci/mMol; 1 Ci = 37 CBq) radioaktiv markiert. Die Zellen wurden trypsiniert, mit einem automatischen Zellerntegerät (Skatron, Sterling, VA) gewonnen und die zellassozuerte Radioaktivität wurde in dreifacher Ausfertigung durch eine Flüssig-Szintillationszählung bestimmt.
Die CO-029- und ME941-Antigenexpression wurde in verschiedenen Tumorzellinien durch RIA verglichen. Mehrere Zellinien exprimieren diese Gene gleichzeitig (Figur 7). Der qualitative Hauptunterschied bei der Expression der zwei Gene war, daß Melanom-Zellinien das ME941- Antigen exprimierten, jedoch nicht das CO-029-Antigen.

Claims

1. Intron-freies DNA-Molekül, welches ein Tumor-assozilertes Antigen Codiert, welches Antigen mit dem monoklonalen Antikörper CO-029 eine Immunreaktion eingeht und die in der Fig. 3 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

2. Intron-freies DNA-Molekül nach Anspruch 1, worin das Tumor-assozilerte Antigen ein Protein-Molekulargewicht von 26.044 besitzt.

3. Intron-freies DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nucleinsäuresequenz des DNA-Moleküls in der Fig. 3 dargestellt ist.

4. Intron-freies DNA-Molekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches kovalent an einen Vektor gebunden ist, der in E. coli zur Replikation fähig ist.

5. Intron-freies DNA-Molekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches die Expression eines Proteins in GOS-Zellen verursacht, die mit dem monoklonalen Antikörper CO-029 eine Immunreaktion eingehen.

6. Intron-freies DNA-Molekül bestehend aus einer in der Fig. 3 dargestellten Nucleinsäuresequenz.

7. Intron-freies DNA-Molekül, das zu DNA hybridisiert, welche die in Fig. 3 dargestellte Sequenz besitzt.

8. Intron-freies DNA-Molekül, welches für eine extrazelluläre Domäne des CO-029-Antigens codiert und die Aminosäuresequenz des Antigens in der Fig. 3 dargestellt ist.

9. Polypeptid bestehend aus einer extrazellulären Domäne des CO-029-Antigens, wobei die Aminosäuresequenz des Antigens in der Fig. 3 dargestellt ist.

10. Polypeptid nach Anspruch 9, worin die Domäne die Aminosäuren 34 bis 57 von CO-029 aufweist.

11. Polypeptid nach Anspruch 9, worin die Domäne die Aminosäuren 110 bis 205 von CO-029 aufweist.

12. Polypeptid nach Anspruch 9, welches mit dem monoklonalen Antikörper CO-029 eine Immunreaktion eingeht.

13. Polypeptid nach Anspruch 9, das kovalent an eine Aminosäuresequenz gebunden ist, welche die Sekretion des Polypeptids aus Zellen verursacht.

14. Von anderen menschlichen Proteinen freies Präparat des CO-029-Antigens, bei dem das Antigen in nicht-menschlichen Zellen hergestellt worden ist, die mit einem DNA-Molekül nach Anspruch 1, welches das Antigen codiert, transformiert worden sind.

15. Mit dem DNA-Molekül von Anspruch 1,6,7 oder 8 transformierte Zellen.

16. Nicht-menschliche Zellen nach Anspruch 15.